UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA
AMANDA GUIMARÃES MORAES CAMARGO
AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE CELULAR EM HUMANOS INDUZIDA POR N-(FOSFONOMETIL)GLICINA E DEMAIS COMPONENTES DA FORMULAÇÃO DE USO COMERCIAL
Lorena 2018 AMANDA GUIMARÃES MORAES CAMARGO
AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE CELULAR EM HUMANOS INDUZIDA POR N-(FOSFONOMETIL)GLICINA E DEMAIS COMPONENTES DA FORMULAÇÃO DE USO COMERCIAL
Trabalho de conclusão de curso apresentado à Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo como requisito final para conclusão da Graduação do curso de Engenharia Ambiental.
Orientador: Prof. Dr Morun Bernardino Neto.
Lorena 2018
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE
Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema Automatizado da Escola de Engenharia de Lorena, com os dados fornecidos pelo(a) autor(a)
Camargo, Amanda Guimarães Moraes A / Amanda Guimarães Moraes Camargo; orientador Morun Bernardino Neto. - Lorena, 2018. 55 p.
Monografia apresentada como requisito parcial para a conclusão de Graduação do Curso de Engenharia Ambiental - Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo. 2018
1. Glifosato. 2. Toxicidade. 3. Herbicidas. 4. Saúde pública. I. Título. II. Neto, Morun Bernardino, orient.
AGRADECIMENTOS
À Deus, por estar sempre presente nos momentos abençoando e direcionando o melhor para minha vida. Aos meus pais, Nelson e Mônica, por me ensinarem a correr atrás dos meus sonhos e objetivos, por todo o suporte necessário para que eu pudesse realizar a faculdade e me dedicar integralmente aos estudos. Aos meus irmãos, Rodrigo e Rafaella, por serem referências pra mim. Ao meu namorado Guilherme, por toda paciência e apoio emocional. Ao meu orientador Prof Dr. Morun, pela paciência, pela dedicação, pela confiança no meu trabalho. Aos meus colegas do trabalho da UNESP, por me ajudarem a desenvolver a pesquisa, por todas as discussões científicas. À minha orientadora de Iniciação Científica, Gretta, e à minha amiga de estágio, Kely, pela confiança, pelos aprendizados. Agradecimento ao apoio dado pela Secretaria Municipal de Saúde da Prefeitura de Lorena, que disponibilizou as amostras de material biológico.
RESUMO A toxicidade celular proveniente de pesticidas utilizados na agricultura brasileira é um indicador de grande importância para a saúde do indivíduo e à saúde pública. Por meio da avaliação da citotoxicidade de eritrócitos é possível inferir o potencial de causar danos e de quebra da homeostase que um determinado toxicante apresenta. Diversos pesticidas já proibidos em outros países por levarem sérios danos ao meio ambiente e aos seres humanos, continuam liberados no Brasil. Nesse contexto, destaca-se o glifosato (N-fosfonometil-glicina) o mais vendido no país e um dos campeões de vendas no mundo. Por apresentar DL50 considerado baixo, o glifosato é tido como pouco tóxico e seguro quando usado dentro da recomendação. No entanto os efeitos tóxicos produzidos por uma formulação comercial vão além do componente ativo sendo que estabilizantes, dispersantes e conservantes não são totalmente livres de ação tóxica. Este trabalho visou avaliar a toxicidade celular em eritrócitos humanos induzida pelo glifosato e demais componentes da formulação de uso comercial. Para tal, o comportamento da fragilidade osmótica de eritrócitos na presença e ausência do toxicante foi avaliado graficamente por meio da dependência de lise celular em função da osmolaridade do meio. Os gráficos obtidos foram ajustados a uma sigmoide de Boltzmann. Esse trabalho obteve uma correlação forte, inversa e significativa do aumento da concentração da Hemoglobina com a diminuição da estabilidade eritrocitária.
Palavras-chave: herbicidas, toxicidade, glifosato, saúde pública.
Sumário
1 INTRODUÇÃO ...... 9
2 REVISÃO DE LITERATURA ...... 11
2.1 Regularização ...... 16
2.2 Toxicologia ...... 18
2.2.1 Toxicologia em crianças ...... 19
2.3 Formulação ...... 20
2.4 Glifosato ...... 21
2.4.1 Indenização ...... 25
2.5 MECANISMO DE AÇÃO ...... 25
2.5.1 Em Vegetais ...... 25
2.5.2 Em Animais ...... 25
2.6 FRAGILIDADE OSMÓTICA ERITROCITÁRIA (FOE) ...... 26
2.6.1 Estrutura da Membrana Plasmática ...... 26
2.6.2 Eritrócitos (células vermelhas) ...... 27
2.6.3 Teste de fragilidade osmótica eritrocitária ...... 28
3 OBJETIVOS ...... 30
3.1 Objetivo geral ...... 30
3.2 Objetivos específicos ...... 30
4 MATERIAL E MÉTODOS ...... 31
4.1 Considerações éticas ...... 31
4.2 Amostras de material biológico ...... 31
4.3 Reagentes ...... 32
4.4 Determinação da estabilidade de eritrócitos humanos na presença de glifosato 32
4.5 Determinação das curvas de transição de hemólise ...... 34
4.5.1 Determinação da concentração de glifosato ...... 35 4.6 Determinação de variáveis bioquímicas e hematológicas ...... 36
4.7 Análise estatística dos dados experimentais ...... 37
5 RESULTADOS ...... 38
5.1 Teste de fragilidade osmótica eritrocitária (FOE) ...... 38
5.2 Análise descritiva exploratória ...... 41
5.3 Teste de normalidade exploratória Shapiro Wilk ...... 43
5.4 Teste de comparação de dois grupos de Wilcoxon ...... 45
5.5 Matriz de correlações Teste de Spearman ...... 47
6 DISCUSSÃO ...... 48
7 Considerações finais ...... 50
8 Agradecimento ...... 50
REFERÊNCIAS ...... 51
LISTA DE FIGURAS Figura 1: Evolução da área plantada em milhões de hectares de arroz, feijão, cana de açúcar, soja e mandioca por ano...... 13 Figura 2 : Os 10 ingredientes ativos mais vendidos...... 22 Figura 3 - vendas de glifosato por ano ...... 23 Figura 4: Partes típicas de uma molécula fosfolipídica representada em (a) esquematicamente e em (b) por meio de fórmula estrutural condensada...... 27 Figura 5: Gráfico de osmose e ilustração de osmose em eritrócitos ...... 29 Figura 6: Amostras de material biológico...... 32 Figura 7:Bancada Experimental...... 33 Figura 8: (a) Banho termostatizado a 37,5 ˚C; (b) Adição de 20 µL de sangue em todos os tubos...... 33 Figura 9: Tubos eppendorfs com adição de sangue: (a) antes do banho termostatizado; (b) após o banho termostatizado...... 33 Figura 10: Centrifuga com capacidade máxima de 16 tubos: (a) Vista superior; (b) Equipamento aberto ...... 34 Figura 11: Leitura de sobrenadante no espectrofotômetro: (a) Leitura da absorbância em 540nm; (b) Cubeta e tubo de eppendorfs de uma amostra com lise; (c) Cubeta e tubo eppendorf de uma amostra sem lise...... 34 Figura 12: Glifosato e palavras chave...... 50
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LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1: Curva típica de dependência de lise eritrocitária em função da concentração de NaCl...... 35 Gráfico 2: Curva de fragilidade eritrocitária induzida pela variação da concentração de Roundup e concentração de NaCl constante em 0,9 g/dL...... 36 Gráfico 3:Curva de hemólise das dez amostras analisadas: (a) sem a presença de glifosato; (b) com glifosato...... 38 Gráfico 4:Curva de hemólise das três amostras analisadas com melhores ajustes de correlação (0,98; 0,99; 0,99): (a) sem a presença de glifosato; (b) com glifosato...... 39 Gráfico 5:Testes de comparação de dois grupos (com e sem caotrópico) de Wilcoxon: (a)teste de Wilcoxon para dx com e sem herbicida; (b) Teste Wilcoxon H50 com e sem herbicida ...... 46
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1 INTRODUÇÃO O uso de pesticidas na agricultura brasileira faz parte de um problema de saúde pública, devido sua toxicidade ao meio ambiente e ao homem. Os pesticidas, também conhecidos como agrotóxicos, defensivos agrícolas ou defensivos fitossanitários, têm como objetivo eliminar, prevenir ou mitigar pragas por meio de seus componentes ativos, entretanto as substâncias consideradas inertes e que fazem parte de sua formulação como estabilizantes, dispersantes e conservantes não são totalmente livres de ação tóxica. A determinação dos limites de segurança para uso dos pesticidas deve considerar os efeitos agudos e crônicos à saúde humana não apenas dos componentes ativos, mas também dos demais componentes das fórmulas comercializadas. Diversos pesticidas já proibidos em outros países por levarem a importantes danos ao meio ambiente e aos seres humanos, continuam liberados no Brasil. Algumas empresas multinacionais, que não vendem tais produtos nos seus países de origem, os comercializam no Brasil por serem liberados. Existem mais de 400 ingredientes ativos de pesticidas registrados no Brasil, sendo que alguns tiveram seu registro aprovado há décadas. Ademais, para o registro ser obtido apenas os efeitos tóxicos do princípio ativo isolado são considerados, o que não é factual pois a formulação comercial apresenta muitos outros compostos que, agindo simultaneamente, podem produzir efeitos sinérgicos, aditivos ou antagônicos. Considerando ainda que a mesma cultura costuma utilizar mais de um insumo agrícola, esses efeitos de interação entre as formulações, ficam potencializados. No período de 2007 a 2014 foram contabilizados no Ministério da Saúde 25 mil casos de intoxicação por pesticidas, cabe ressaltar que é estimado que para cada caso de intoxicação notificado outros 50 não são notificados, segundo a Organização Mundial de Saúde. No mesmo período foram contabilizados 1186 óbitos provenientes de intoxicação por pesticidas de uso agrícola. Conceito importante quando se trata de intoxicação por pesticidas é o LMR (Limite Máximo de Resíduos), definido como a quantidade máxima de resíduo de agrotóxico permitida em alimentos. Os LMRs brasileiros são maiores que o da União Europeia. Na plantação de soja, por exemplo, o LMR brasileiro é duzentas vezes maior que o limite europeu.
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O Brasil está entre os maiores consumidores mundiais de pesticidas e o glifosato (N-(fosfonometil)glicina) é um dos campeões de venda. A população tem convivido passivamente com a situação de insegurança alimentar por preocupar- se mais com a aparência dos alimentos do que com a presença de resíduos tóxicos neles. Destarte, é de interesse da saúde pública e políticas públicas governamentais que a toxicologia descritiva dos efeitos adversos celulares de todos os componentes das formulações comerciais desse produto sejam bem conhecidos. Os grupos mais suscetíveis a esses efeitos são trabalhadores, crianças, gestantes, lactentes e idosos. Esse trabalho objetiva contribuir com a avaliação da toxicologia descritiva dos efeitos adversos celulares do glifosato e demais componentes de sua formulação comercial em sujeitos de 1 a 15 anos.
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2 REVISÃO DE LITERATURA A transição da agricultura para agronegócio ocorreu a partir de 1950, quando os agricultores receberam financiamentos do governo e de empresas multinacionais. Essa transição ocasionou uma mudança na forma de produção, pois até então era um modelo diversificado (ANDRIOLI, 2016). Em 1970, ano em que o governo lançou o Plano Nacional de Defensivos Agrícolas (PNDA) e a Criação da Indústria Brasileira de Defensivos, ocorreu um incentivo ao uso de pesticidas por meio de crédito rural, dando início a uma era de desenvolvimento tecno-científico/químico-dependente (BRASIL, 2016). Nesse cenário, o governo também reduziu 60% do Imposto relativo à circulação de mercadorias - ICMS, de acordo com a cláusula primeira do Convênio 100/1997, do Conselho Nacional de Política Fazendária – Confaz (FEDERAL, 2018), isenção total do PIS/PASESP (Programa de Integração Social/Programa de Formação do Patrimônio do Servidor Público) e da Cofins (Contribuições para a Seguridade Social), de acordo com o Decreto Federal nº 5630/05 e isenção total do IPI (Imposto sobre Produtos Industrializados) ao comércio e à produção de pesticidas, estabelecida pelo Decreto 7.660/2011. O interesse do governo era focar em poucas matérias primas para exportação a fim de obter divisas para o país e abastecer o mercado interno com produtos importados. A mecanização da produção na agricultura disseminou uma mentalidade capitalista-industrial nas áreas rurais. Nesse momento da história acontece a mudança de uma produção coletiva sem fins lucrativos, para a concentração e centralização da produção com fins lucrativos. (ANDRIOLI, 2016) Em 1995, foi instituído o Programa Nacional de Fortalecimento da Agricultura Familiar (Pronaf) por meio da Resolução 2.141 (24/08/95), destinado ao apoio financeiro às atividades agropecuárias exploradas mediante emprego direto da força de trabalho do produtor e de sua família. Entretanto esse apoio está vinculado à aquisição de pesticidas na agricultura familiar. (CARNEIRO et al., 2015 e BRASIL, MDA 2015). Embora vários nomes sejam dados aos insumos agrícolas, somente o termo agrotóxico é reconhecido legalmente no Brasil. A lei nº 7.802/1989 define agrotóxico como:
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Produtos ou agentes de processos físicos, químicos ou biológicos, destinados ao uso nos setores de produção, no armazenamento e beneficiamento de produtos agrícolas, nas pastagens, na proteção de florestas, nativas ou plantadas, e de outros ecossistemas e de ambientes urbanos, hídricos e industriais, cuja finalidade seja alterar a composição da flora ou da fauna, a fim de preservá-las da ação danosa de seres vivos considerados nocivos, bem como as substâncias e produtos empregados como desfolhantes, dessecantes, estimuladores e inibidores de crescimento. (BRASIL, 1989)
O modelo do capital para a agricultura é o agronegócio, que é a relação intrínseca entre capital financeiro internacional (bancos), as empresas transnacionais e os latifundiários. Somados aos meios de comunicação de massa que tem a finalidade de propagar os “falsos positivos” do agronegócio. Esse modelo é formado pela produção intensiva de monocultivos. Para que essa produção seja possível, são utilizados pesticidas de forma intensiva, máquinas pesadas, comprometendo o solo, corpos hídricos e a biodiversidade. (CARNEIRO et al., 2015). Esse processo teve amplo respaldo dos governos na ditadura civil militar brasileira e ganhou mais força pós 1990 na dinâmica de privatização dos organismos governamentais. Garantindo um Estado máximo para o capital e mínimo para o povo (CARNEIRO, 2012). A arrecadação com a venda de pesticidas aumentou de 2 para 7 bilhões de dólares americanos entre 2001 e 2008, chegando a 8,5 bilhões, em 2011. Em 2009, o Brasil obteve a posição de maior consumidor mundial de pesticidas (INCA, 2015). O interesse econômico é notado em âmbitos do Legislativo, Judiciário, Executivo, da pesquisa e da mídia em detrimento da saúde púbica, o que corresponde a uma lógica primário-exportadora característica do país (PELAEZ et al., 2015). Atualmente, está em tramitação na câmara o Projeto de Lei 3200/2015(“PL 3200/2015”, 2015), do deputado Covatti Filho (PP-RS), com a finalidade de revogar as Leis nº 7.802, de 1989 e nº .974, de 2000. Esse PL desconsidera os critérios de classificação toxicológica de defensivos fitossanitários do Sistema Globalmente Harmonizado de Classificação e Rotulagem de Produtos Químicos (GHS), que foi adotado pela Organização das Nações Unidas, em 2002.(PAN, 2012). Outra PL com esse mesmo objetivo, de autoria do senador Blairo Maggi (SPART-MT), é a PL nº6.299/12 justificada pela dificuldade de colocar novos produtos no mercado, a proposta é revogar o Art. 3º e 9º da lei nº7.802/89. Concomitantemente, está em tramitação no Congresso Nacional a PL nº6.670/16 (BRASIL. CÂMARA DOS 12
DEPUTADOS, 2016), porém de autoria da Comissão de Legislação Participativa, para instituir a Política Nacional de Redução de Agrotóxicos (PNARA). Ou seja, dois projetos de lei de autoria de políticos visam facilitar o uso dos pesticidas, defensivos fitossanitários, ao passo que o projeto de lei de autoria da comissão de legislação participativa quer instituir uma política nacional de redução dos pesticidas. Essa contraposição deixa clara a luta política entre interesse econômico e a saúde pública. A criação de organismos geneticamente modificados surgiu como um elo essencial na conformação de grandes conglomerados transnacionais e na consolidação da cadeia de dependência química na agricultura industrial, no caso do Brasil o maior exemplo é a soja transgênica que aumentou exponencialmente as áreas plantadas, conforme apresentado na Figura 1. A soja transgênica é adaptada para sobreviver em diversos ambientes e ser resistente ao herbicida à base de glifosato. Por isso, a relação entre produção de transgênicos e venda de pesticidas são diretamente proporcionais.
Figura 1: Evolução da área plantada em milhões de hectares de arroz, feijão, cana de açúcar, soja e mandioca por ano. 40 ARROZ 36 FEIJAO CANA SOJA 32 MANDIOCA 28 24
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16 AREA (mi ha) 12 8 4 0
2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017 Fonte: IBGE – Pesquisa Agrícola Municipal, 2007 – 2017.
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A intenção do agronegócio no Brasil não é alimentar a população, nota-se que os alimentos essenciais não tiveram aumento na área de plantação nos últimos anos, pelo contrário acontece um declínio na área plantada de alimentos base (feijão, arroz, mandioca) ao passo que aumenta a área da plantação de soja. Atualmente, no Brasil, mais de 96% da soja, mais de 88% do milho e mais de 78% do algodão são transgênicos, e majoritariamente resistentes ao glifosato (Fábio, 2017). Essa diminuição da área de produção de alimentos tem como consequências desde a elevação de preço dos alimentos até a perda da soberania alimentar, colocando em risco o objetivo governamental de combater a miséria e a fome (CARNEIRO et al., 2015). Por isso, é comum que, as empresas que produzem sementes transgênicas também produzam os pesticidas, tornando-as com grande poder sobre a economia, política e o Estado, afetando a bioética e a soberania alimentar pela articulação de seus biopoderes e biopolíticas (ERNANI et al., 2012). A inserção de organismos geneticamente modificados (OGM) ou transgênicos na agricultura é uma ameaça à diversidade biológica, pode proporcionar deslocamento ou eliminação de espécies não domesticadas, exposição de espécies a novos patógenos ou agentes tóxicos, a geração de plantas daninhas ou pragas resistentes, a poluição genética, a erosão da diversidade genética e a interrupção da reciclagem de nutrientes e energia. Motivo pelo qual anteriormente à autorização do cultivo de OGM’s deveria ter sido realizado um estudo de avaliação de risco de efeitos diretos e indiretos na agricultura, ecologia e socioeconomia. (NODARI, RO; GUERRA, 2001) A estratégia de indústrias de pesticidas gera conflito de interesses, pois por motivação financeira, abre portas para a violação de direitos da cidadania, em detrimento da saúde e do bem-estar social. (CARNEIRO et al., 2015) Os incentivos fiscais são conhecidos como extrafiscalidade. A extrafiscalidade pode ocorrer de maneira positiva como é o caso de cigarros e bebidas que tem taxas maiores para desestimular o consumo por meio do aumento do preço, como também de maneira negativa porque ocorre a diminuição na arrecadação. (MELO; PATR, 2016) Entretanto, acredita-se que esse incentivo para práticas protetivas evita a poluição e degradação ambiental, compensando a extrafiscalidade. (CAVALCANTE; PACOBAHYBA, 1988)
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A extrafiscalidade no caso dos pesticidas é realizada de maneira inconstitucional, do ponto de vista ético e socioambiental, pois um comércio danoso ao meio ambiente está sendo estimulado. (MARA; MACEDO; PACOBAHYBA, 2011). A constituição federal brasileira de 1988 em seu artigo 225 diz:
Todos têm direito ao meio ambiente ecologicamente equilibrado, bem de uso comum do povo e essencial à sadia qualidade de vida, impondo-se ao Poder Público e à coletividade o dever de defendê-lo e preservá-lo para as presentes e futuras gerações. (BRASIL, 1988)
Não existe comissão ou grupo de trabalho, na estrutura do Confaz, que trate de questões ambientais e que avaliem o impacto da adoção de isenções fiscais (MARA; MACEDO; PACOBAHYBA, 2011). Não há como garantir um meio ambiente ecologicamente equilibrado, defendido e preservado para as futuras gerações nesse modo de produção agrícola, pois nesse modo há contaminação das águas, do ar, da chuva, dos alimentos, do leite materno, do sangue, da urina dos humanos e de outros animais (CARNEIRO et al., 2015). O Estado é ineficaz para monitorar e controlar os danos à saúde e ao meio ambiente proveniente dos pesticidas.(CARNEIRO et al., 2012) Os grupos desfavorecidos (em função de sua classe, gênero, grupo étnico) sofrem um processo de vulnerabilidade populacional. Esse processo não se refere apenas aos grupos de maior exposição, mas das dificuldades que tais grupos têm de reconhecer, tornar público e enfrentar os riscos, influenciando os processos decisórios que os afetam (Porto, 2007). Os grupos desfavorecidos se tornam invisíveis, por determinação e comodidade de quem está no poder (OLIVEIRA, 2014). O padrão de exploração dos recursos naturais e do trabalho humano na economia do agronegócio sugere uma dupla superexploração, na primeira década do século XXI. A primeira é a violação sistemática da norma ambiental florestal, comprovada pelo IBAMA, exigida sobre limites da área de reserva legal (florestal) e áreas de preservação permanente (mata ciliar, topos e encostas de morros) ocasionando com frequência a prorrogação de prazos de punição previstos em lei (Código Florestal). A segunda superexploração relacionada com a exploração dos recursos naturais estão o aumento físico de queimadas e desmatamentos, corroborando com o aumento da emissão de dióxido de carbono na atmosfera, e a
15 intensificação do uso de pesticidas, com fortes evidências de vários tipos de contaminação. Se forem somados os efeitos da emissão de dióxido de carbono, da redução da biodiversidade e da expansão acelerada do uso dos pesticidas, obtém- se um potencial de morbidades, ambiental e humana, que não são calculadas, porém provocam custos sociais (CARNEIRO, 2012). A carta abaixo foi elaborada pelos participantes do III Encontro Nacional de Agroecologia relata a necessidade de mudança na política com relação ao uso dos pesticidas:
O escandaloso aumento do uso de agrotóxicos, relacionado também com a liberação de sementes transgênicas, aparece nos alimentos, na contaminação de animais e plantas, solos, ar e das fontes e mananciais de água que servem de consumo humano. (...) Além de ser uma questão de saúde pública e de segurança nacional, os agrotóxicos ameaçam a vida no planeta. Por essa razão reafirmamos que não existe uso seguro de agrotóxicos. É necessário combater a ideia da existência de níveis aceitáveis de contaminação dos alimentos, da água e do corpo dos trabalhadores e trabalhadoras. Queremos o imediato fim da pulverização área e o banimento dos agrotóxicos proibidos em outros países. Exigimos o fim da isenção fiscal aos agrotóxicos e a destinação dos recursos arrecadados para o fortalecimento da agroecologia e a recuperação de ecossistemas degradados. Não aceitamos o relaxamento da legislação e tampouco o desmonte das instituições de regulação e controle dos agrotóxicos. São obrigações da Anvisa e do Ibama proteger a saúde da população e do ambiente. (...) Isso implica brecar a expansão do agronegócio sobre os territórios da agricultura familiar, camponesa, indígena e quilombola, bem como a demarcação de zonas livres de agrotóxicos e transgênicos (ANA, 2014, p.21). 2.1 Regularização O glifosato é regularizado pelas seguintes portarias/resoluções: Portaria nº10/85 (DOU14/03/85), Portaria nº 71/90 (DOU28/02/91), Autorização DOU17/12/91, Portaria nº10/92 (DOU24/01/92), Portaria nº 474/98 (DOU15/06/98), Portaria nº 888/98 (DOU27/11/98), Resolução RE nº93/00 (DOU04/08/00), Resolução RE nº347/02 (DOU31/12/02). (Sistema de Agrotóxicos Fitossanitários - AGROFIT) A Agência Nacional de Vigilância Sanitária é responsável por avaliar e classificar toxicologicamente os pesticidas. Estudos toxicológicos são realizados para calcular parâmetros de segurança, tais como Ingestão Diária Aceitável (IDA) de cada ingrediente ativo (IA) (SERRANO-CINCA; FUERTES-CALLÉN; MAR- MOLINERO, 2005). IDA é a dose diária aceitável ou ingestão diária aceitável que, ingerida diariamente durante toda a vida, parece não oferecer risco à saúde, de acordo com a Portaria nº 3, de 16 de janeiro de 1992, do Ministério da Saúde. A 16 unidade de medida é mg de agrotóxico por kg de peso corpóreo, segundo a Portaria 3/1992. A partir desse parâmetro de segurança a ANVISA define o Limite Máximo de Resíduo (LMR), quantidade máxima de resíduo de agrotóxico legalmente aceita no alimento (desde sua produção até seu consumo), e o Intervalo de Segurança (tempo entre a última aplicação de agrotóxico e a colheita ou comercialização) para avaliar o impacto na exposição antes de autorizar o uso de um ingrediente ativo na atividade agrícola. O cálculo da Ingestão Diária Máxima Teórica (IDMT), realizado pela agência é dado pela Equação 1, sendo o somatório do produto do Limite Máximo Residual vezes o alimento consumido, dividido pelo peso corpóreo. Equação 1: Cálculo de Ingestão Diária Máxima Teórica (퐿푀푅. 퐴푙푖푚푒푛푡표퐶표푛푠푢푚푖푑표) 퐼푀퐷푇 = ∑ (1) 푀푎푠푠푎 퐶표푟푝ó푟푒푎
Na plantação de café, no Brasil, o LMR permitido é dez vezes maior que o permitido na União Europeia, sendo 1 mg/kg e 0,1 mg/kg, respectivamente. Enquanto que na produção da cana de açúcar o limite permitido é vinte vezes maior do que na União Europeia (0,05 mg/kg EU e 1 mg/kg BR). Na soja, o limite é duzentas vezes maior que na união europeia, sendo 0,05 mg/kg na União Europeia e 10 mg/kg no Brasil (BOMBARDI, 2017). Entretanto, pode-se obter um agrotóxico com baixa toxicidade, mas não há como descartar os efeitos crônicos. A maioria dos estudos de avaliação da toxicidade é realizado com ingredientes ativos isolados, enquanto que os alimentos que são consumidos pela população podem trazer em sua matriz dezenas de ingredientes ativos (CARNEIRO et al., 2015). O Programa de Análise de Resíduos Agrotóxicos em Alimentos (PARA) tem a finalidade de estruturar um serviço para avaliar e promover a segurança dos alimentos em relação aos resíduos de pesticidas. É coordenado pela ANVISA juntamente com os órgãos estaduais e municipais de vigilância sanitária e laboratórios estaduais de saúde pública. Os resultados do programa permitem verificar se os alimentos comercializados no varejo apresentam níveis de resíduos de pesticidas dentro dos Limites Máximos de Resíduos (LMR) estabelecidos pela Anvisa; conferir se os pesticidas utilizados estão devidamente registrados no país
17 e se foram aplicados somente nos alimentos para os quais estão autorizados; estimar a exposição da população a resíduos de pesticidas em alimentos de origem vegetal e, consequentemente, avaliar o risco à saúde decorrente dessa exposição (SERRANO-CINCA; FUERTES-CALLÉN; MAR-MOLINERO, 2005). Os resultados do PARA evidenciam que a população brasileira em geral está exposta a pesticidas (BRASIL, 2016).
2.2 Toxicologia Toxicologia é a ciência que estuda os efeitos adversos de substâncias químicas sobre organismos vivos. Um veneno é definido como um agente capaz de produzir uma resposta prejudicial em um sistema biológico. De uma maneira geral, todas as substâncias químicas apresentam o potencial de produzir lesão ou morte dependendo da dose utilizada (WATKINS, 2012).
O termo DL50 corresponde à dosagem necessária para causar uma resposta letal de 50% da população investigada. Entretanto, outros fatores também precisam ser analisados. Alguns produtos químicos com baixa toxicidade podem apresentar efeitos cancerígenos ou teratogênicos mesmo que não exista evidência de toxicidade aguda (WATKINS, 2012). Os efeitos tóxicos podem ser imediatos ou retardados. A diferença está no tempo de resposta, os imediatos são observados logo após uma única dose, enquanto o retardado precisa de um tempo maior de administração de uma substância para que seja observado o efeito tóxico. Entre os efeitos tóxicos, eles são classificados como reversíveis ou irreversíveis (WATKINS, 2012). Substâncias químicas quando são administradas simultaneamente, podem provocar respostas diferentes no indivíduo devido ao efeito da interação química. Essa interação pode proporcionar um efeito aditivo, sinérgico, potenciação ou antagonismo. O efeito aditivo corresponde à soma dos efeitos de cada substância quando administradas isoladamente. O efeito sinérgico corresponde ao aumento dos efeitos das substâncias administradas simultaneamente. O efeito de potenciação corresponde a situação em que uma substância sem efeito tóxico quando combinada com outra substância química tóxica, produz um efeito muito mais tóxico. Antagonismo acontece quando as substâncias combinadas interferem no efeito uma da outra (WATKINS, 2012).
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2.2.1 Toxicologia em crianças Esse grupo de 0 à 15 anos é um grupo heterogêneo, no qual a suscetibilidade a exposição química pode variar ao longo dos estágios de crescimento e desenvolvimento. Essa população apresenta características diferentes em toda etapa do desenvolvimento que determinam diferentes formas e níveis de exposição do que da população adulta (MAZOTO et al., 2011). Crianças são mais suscetíveis a toxicologia devido às funções imaturas de seus organismos (MAIOR et al., 2017). Devido à ampla faixa etária das crianças, é improvável que uma única dose seja apropriada para toda a faixa etária (BATCHELOR; MARRIOTT, 2015). Os estudos em crianças são, na maioria dos casos, considerados antiéticos, resultando em dificuldades na obtenção de dados críticos de segurança toxicológica nessa faixa etária.(ERNEST et al., 2007) Essa falta de informação impõe riscos significantes a uma população já vulnerável. As características da suscetibilidade das crianças são provenientes desde o momento da exposição, como também em todo o processo da absorção, biotransformação, metabolização, eliminação e dos mecanismos de ação. (MAZOTO et al., 2011) Recém-nascidos, ingerem, em média, sete vezes mais água que um adulto, crianças entre um e cinco anos de idade comem três a quatro vezes mais e respiram duas vezes mais que um adulto (proporcionalmente com a massa corporal), tornando-as mais expostas às substâncias presentes na água, ar e nos alimentos. (LANDRIGAN et al., 2004). A taxa de ventilação respiratória em crianças é igual a 133 mL/min/kg peso/m² superficiepulmonar e para adultos é igual a 2 mL/min/kg peso/m² superficiepulmonar. Além disso, a permeabilidade da barreira epidérmica encontra-se ainda em desenvolvimento em bebês pré-termo, resultando em maior absorção percutânea das substâncias químicas (WHO, 2006). O maior volume de fluido extracelular de recém-nascidos leva à maior dissolução de substâncias hidrossolúveis. Da mesma forma, os recém-nascidos possuem um menor volume de gordura corporal quando comparado aos adultos, o que dificulta a dissolução de substâncias lipossolúveis. A capacidade de transporte das substâncias químicas por meio da ligação com proteínas plasmáticas é menor nos recém-nascidos devido à menor concentração de proteínas plasmáticas, em particular a albumina.(KEARNS et al., 2003)
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As crianças possuem maior fluxo sanguíneo para o cérebro e menor circulação sanguínea para os rins, até a idade de cinco meses; maior peso relativo do fígado; alvéolos pulmonares menores em tamanho e quantidade(INTERGOVERNMENTAL FORUM ON CHEMICAL SAFETY (IFCS) CHILDREN AND CHEMICAL SAFETY WORKING GROUP, 2005); taxa de filtração glomerular é um terço da taxa de adultos, o que significa que substâncias químicas permaneçam por mais tempo no organismo infantil; a imaturidade da barreira hemantoencefálica facilita a passagem de substâncias químicas para o sistema nervoso. (KOLLER et al., 2004) No período de gestação, a criança não sofre maior exposição do que a gestante. Entretanto, em algumas situações, o indivíduo que está se desenvolvimento pode ser mais sensível ao modo de ação de uma determinada substância química. A exposição intrauterina em altas concentrações pode ocasionar paralisia cerebral e epilepsia, e em baixas concentrações pode ocasionar déficits neuropsicológicos.(MAZOTO et al., 2011) O centro de Informação a Assistência Toxicológica de Santa Catarina (CIATox) relacionou várias revisões sistemáticas de bancos de dados e separou os efeitos dos pesticidas em crianças e os efeitos em adultos, mesmo em baixas doses. Em crianças são: baixo peso ao nascer, microcefalia, malformações congênitas, déficit de atenção em crianças, autismo, prematuridade, redução de QI de crianças, doenças respiratórias (asma e infecções respiratórias por repetição), câncer (linfoma não-Hodgkin, leucemias, câncer de mama, próstata, testículos e ovários), desregulação endócrina (infertilidade, disfunção sexual, disfunção tireoidiana), neurotoxicidade (depressão e suicídio, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, polineuropatia). (CIATox, 2018)
2.3 Formulação O ingrediente ativo não pode ser aplicado isolado por não ser quimicamente estável. Essa fórmula é uma mistura entre o I.A. combinado com solventes, surfactantes e ingredientes inertes para viabilização do armazenamento, transporte e aplicação. Os objetivos são: possibilitar a dispersão do formulado no veículo (geralmente água) que possibilite a distribuição uniforme do componente em uma
20 grande área, garantir facilidade de manuseio e armazenamento do produto formulado e aumentar a fitotoxicidade e reduzir a toxicidade, volatilidade e/ou fotodecomposição. (VIDAL, R. A.; MEROTTO JR., 2001) No caso do glifosato, o surfactante é responsável por aumentar a eficiência pelo aumento da retenção de gotas nas folhas de absorção foliar, a hidratação das folhas facilita a adsorção. Entretanto, a concentração deve ser estudada previamente, estudos toxicológicos, pois a adição de 1% p/v de dois tipos diferentes de surfactante reduziu a translocação de glifosato, em comparação à utilização sem adição do surfactante. Ao passo que a adição de apenas 0,1% p/v maximizou a translocação. (SHERRICK; HOLT; HESS, 1986) A formulação Roundup®, que é a mais utilizada, é composta de surfactante polioxietileno-amina, ácidos orgânicos de glifosato, sal de isopropilamina e água. O principal produto de decomposição é o ácido aminometilfosfônico (AMPA) e a o surfactante não iônico polioxietileno amina (POEA). (WILLIAMS; KROES; MUNRO, 2000)
2.4 Glifosato Glifosato (glyphosate) é o ingrediente ativo ou nome comum. O nome científico é N-(fosfonometil)glicina (n-phosphonomethyl-glycine). O glifosato é o ingrediente ativo do herbicida Roundup®. O herbicida glifosato, sal de isopropilamina de n-(fosfonometil)-glicina, é um aminofosfonato análogo ao aminoácido natural glicina, o qual ocupa o lugar deste aminoácido na síntese proteica. Seu nome é uma contração de glicina e fosfato.
A fórmula química bruta é C3H8NO5P, pertence ao grupo químico da glicina substituída. É amplamente utilizado na agricultura por ser considerado não tóxico por apresentar um DL50 baixo ( > 4g/kg). (WHO, 1994). A primeira fórmula a base de glifosato começou a ser vendida em 1974 e 20 anos depois já haviam mais de 90 herbicidas com esse IA. O glifosato é um herbicida não seletivo e ação sistêmica, de amplo espectro, provoca a morte do sistema radicular e de estruturas reprodutivas de plantas perenes, como rizomas, bulbos e tubérculos. Permite a semeadura de culturas imediatamente após a aplicação.(KRUSE; TREZZI, 2000).
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É utilizado na agricultura em aplicação pós-emergência das plantas infestantes nas culturas de algodão, ameixa, arroz, banana, cacau, café, cana-de- açúcar, citros, coco, feijão, fumo, mação, mamão, milho, nectarina, pastagem, pêra, pêssego, seringueira, soja, trigo e uva. Utilizado como maturador de cana-de- açúcar, na eliminação de soqueira no cultivo de arroz e cana-de-açúcar, em pós emergência das plantas infestantes em eucaliptos e pinus, controle de rebrota do eucalipto, dessecante nas culturas de aveia preta, azevém e soja. Também tem uso não agrícola, aplicação em margens de rodovias e ferrovias, áreas sob a rede de transmissão elétrica, pátios industriais, oleodutos e aceiros. O uso domissanitário é autorizado para jardinagem amadora. Para cada utilização existe uma concentração máxima permitida já estabelecida. (ANVISA, 2015) O glifosato é o herbicida com maior volume de produção em todo mundo. O consumo aumentou significativamente com o desenvolvimento de organismos geneticamente modificados, resistentes ao glifosato. A Figura 2 apresenta a relação dos 10 ingredientes ativos mais vendidos no Brasil no ano de 2016, em toneladas de ingrediente ativo, enquanto a Figura 3 apresenta a relação de vendas de toneladas de glifosato por ano, no período de 2009 a 2016. Figura 2 : Os 10 ingredientes ativos mais vendidos . 200000
180000
160000
140000
120000
100000
80000
Vendas (ton. IA) Vendas(ton. 60000
40000
20000
0
2,4-D Atrazina Acefato Mancozebe Oleo mineral Oleo vegetalCarbendazim Imidacloprido Glifosato e seus sais Dicloreto de paraquate Fonte: Ibama / Consolidação de dados fornecidos pelas empresas registrantes de produtos técnicos, pesticidas e afins, conforme art. 41Ingrediente do Decreto n° ativo 4.074/2002 (IA) .
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Notável a disparidade de vendas do glifosato em relação aos demais ingredientes ativos vendidos. Com 185.602,22 toneladas de ingredientes ativos vendidos em 2016 no Brasil, o glifosato e seus sais garantem a liderança de vendas.
Figura 3 - vendas de glifosato por ano no Bra sil.
200000
150000
100000
VENDAS (ton IA) 50000
0 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 ANO
Fonte: IBAMA.
Observa-se que de 2011 para 2012 houve um aumento considerável nas vendas que se manteve em alta até o último relatório publicado do Ibama. Atualmente, o glifosato está sendo reavaliado por análises toxicológicas que devem ser concluídas até 2019 (ANVISA,2017). A toxicidade da formulação comercial do glifosato foi discutida em um artigo (SAMSEL; SENEFF, 2013a) sugerindo que essa formulação é o contribuinte chave para epidemias de obesidade e de autismo nos Estados Unidos, bem como muitas outras doenças e condições, como Alzheimer, Parkinson, infertilidade, depressão e câncer. Alguns estudos relatam evidências de carcinogenicidade proveniente do glifosato em animais, considerando-o como provavelmente carcinogênico para humanos, grupo 2A (GUYTON et al., 2015). Essa classificação é definida pela Agência Internacional de Pesquisa Em Câncer, que faz parte da Organização Mundial da Saúde e é dividida nos seguintes grupos: Grupo 1 o agente é carcinogênico à humanos, Grupo 2A o agente provavelmente é carcinogênico à
23 humanos, Grupo 2B quando o agente é possivelmente carcinogênico à humanos, Grupo 3 quando o agente não é classificado e Grupo 4 quando o agente provavelmente não é carcinogênico à humanos. (International Agency for Research on Cancer, 2017). Autores já escreveram que o efeito da formulação comercial do glifosato é maior do que o glifosato isolado. Em 2009, Nora Benachour e Gilles-Eric Seralin realizaram um estudo feito com células placentárias e puderam concluir que as formulações comerciais alteram a permeabilidade das células humanas e apresentam toxicidade maior do que o ingrediente isolado. O glifosato isolado provoca apoptose sem danos à membrana, enquanto a formulação perturba as membranas celulares e mitocondriais e promove a necrose. Em células embrionárias, placentárias (BENACHOUR; SÉRALINI, 2009), como também em células de jovens e adultos (GASNIER et al., 2009) a formulação se mostrou mais tóxica do que o glifosato isolado. Um estudo americano com os seguintes dados: plantações de organismos geneticamente modificados, aplicação do glifosato e doenças epidemiológicas, correlacionou 22 doenças neste conjunto de dados de séries temporais. O coeficiente de correlação de Pearson foi muito significante (<10-5) entre a aplicação do glifosato e: hipertensão (R = 0,923), acidente vascular encefálico (R = 0,925), prevalência de diabetes (R=0,971), incidência de diabetes (R=0,935), obesidade (R=0,962), distúrbios no metabolismo de lipoproteínas (R=0,973), Alzheimer (R=0,917), demência senil (R=0,994), Parkinson (R=0,875), esclerose múltipla (R=0,828), autismo (R=0,989), doença inflamatória intestinal (R=0,938), infecção intestinal (R=0,974), doença renal em estágio final (R=0,975), insuficiência renal aguda (R=0,978), câncer de tireoide (R=0,988), câncer de fígado (R=0,960), câncer de bexiga (R=0,981), câncer de pâncreas (R=0,918), câncer de rim (R=0,973) e leucemia mieloide (R=0,878). (SWANSON et al., 2014) Pela legislação brasileira, substâncias que tenham efeitos crônicos não deveriam estar autorizadas. Pelo que já foi apontado no subtópico “Regularização” neste trabalho, o órgão regulador é impossibilitado de cumprir as exigências legais.(CARNEIRO et al., 2015)
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2.4.1 Indenização A maior fabricante de herbicidas à base de glifosato, Monsanto, foi condenada a indenizar ao jardineiro Dewayne Johnson que atribuiu a causa de seu câncer aos agrotóxicos Roundup e RangerPro, nos Estados Unidos. A justiça sentenciou que a empresa pague US$289 mi como indenização (BBC, 2018). Esse caso foi aberto em 2016 e recebeu prioridade devido à seriedade do linfoma não- Hodgkin’s desenvolvido no jardineiro que aplicava o pesticida em escolas até 30 vezes ao ano (BELLON, 2018).
2.5 MECANISMO DE AÇÃO 2.5.1 Em Vegetais O mecanismo de ação é a inibição da enzima 5enol-piruvilshiquimato- 3 - fosfato sintase (EPSPS). Esse IA é absorvido na região fotossintetizante das plantas, que apresentam clorofila, e desloca-se pelo floema para os tecidos meristemáticos. A reação condensa shiquimato – 3 – fosfato e fosfoenolpiruvato em 5 – enolpiruvilshiquimimato3- fosfato e fosfato inorgânico, na etapa pré-corismato da rota metabólica do shiquimato. Essa rota é a base para biossíntese de aminoácidos aromáticos essenciais como: fenilalanina, tirosina e triptofano. (JÚNIOR et al., 2010).
2.5.2 Em Animais Como os seres humanos ou qualquer mamífero não apresentam a via do shiquimato, ele é considerado não prejudicial a esses animais. Mas está presente em algas, bactérias, archaea, fungos, procariontes, unicelulares e organismos eucarióticos (RICHARDS et al., 2006). Sendo assim, as bactérias intestinais de humanos sofrem com a alteração na via do shiquimato. Além de ajudar na digestão, a microbiota intestinal sintetiza vitaminas, desintoxica xenobióticos e participa da homeostase do sistema imunológico e da permeabilidade do trato gastrointestinal. (LITTMAN; PAMER, 2011) O glifosato atua na inibição de enzimas de citocromo P540 (CYP). Essas enzimas são responsáveis por desintoxicar xenobióticos. Esta substância interrompe o processo metabólico interferindo nas vias do citocromo CYP. O citocromo CYP é conhecido como uma super-família de enzimas presentes na 25 maioria dos tecidos do corpo e são responsáveis por cerca de 75% das reações envolvidas no metabolismo de drogas e a oxidação de moléculas orgânicas. O impacto negativo sobre o corpo é insidioso e se manifesta lentamente com o tempo, à medida que a inflamação danifica os sistemas celulares em todo o corpo. A interferência das enzimas CYP atua sinergicamente com o rompimento da biossíntese de aminoácidos aromáticos pelas bactérias intestinais e, também, o comprometimento de sulfato sérico. (SAMSEL; SENEFF, 2013b) Em humanos, apenas pequenas quantidades (~ 2%) do glifosato ingerido são metabolizadas em ácido aminometilfosfônico (AMPA), e o restante entra na corrente sanguínea e é eventualmente eliminado pela urina. (WILLIAMS; KROES; MUNRO, 2000)
2.6 FRAGILIDADE OSMÓTICA ERITROCITÁRIA (FOE) 2.6.1 Estrutura da Membrana Plasmática A membrana é uma espécie de fronteira biológica que envolve a célula, define seus limites e funciona como uma barreira seletiva que permite a troca de algumas substâncias entre o interior e exterior, visto que o meio interior e exterior apresentem mesmas substâncias mas com diferentes concentrações, tais como Sódio, Cálcio, Glicose, Colesterol, entre outras (BRUCE, 2002). Os gradientes iônicos são determinados pelas atividades das proteínas e podem ser usados para sintetizar ATP e coordenar o transporte de solutos. Apesar de pequenas variações, todas as membranas biológicas são constituídas basicamente por uma fina camada de moléculas de lipídeos e proteínas unidas principalmente por interações não covalentes (ELISA et al., 2017). Todos os lipídeos da bicamada têm caráter anfifílico (parte solúvel em meio apolar e a outra, em polar), o qual é responsável pela formação bi-camada da membrana (KOHASIGAWA). As proteínas entram na célula e interferem em quase todas as funções da membrana, inclusive no transporte de moléculas específicas e síntese de ATP, por exemplo (ELISA et al., 2017). Os fosfolipídeos são os mais abundantes na bicamada. São caracterizados por uma cabeça polar, um grupo fosfato e duas caudas com cadeias hidrocarbonadas. Neles, as duas longas cadeias de ácidos graxos estão esterificadas com átomos de carbono do glicerol e o terceiro átomo de carbono do
26 glicerol está ligado a um grupo fosfato, o qual pode estar ligado a vários tipos de grupamento de cabeças, como é apresentado na Figura 4 (ELISA et al., 2017). Figura 4: Partes típicas de uma molécula fosfolipídica representada em (a) esquematicamente e em (b) por meio de fórmula estrutural condensada.
Fonte: ELISA et al., 2017.
A membrana biológica contém quantidades significativas de colesterol, que é um esterol. Ele possui uma configuração em anel rígida ligada à somente um grupo hidroxila polar e extensa superfície cíclica apolar. O colesterol é responsável por mudar as propriedades físicas (fluidez), permeabilidade e flexibilidade da membrana. Uma membrana plasmática de um eritrócito possui basicamente 23% de colesterol da composição total de lipídeos em massa. (ELISA et al., 2017). As membranas de animais não possuem a proteção da parede celular como as células vegetais e bacterianas e por isso a sua estrutura pode ser afetada por variações de concentração no meio. Essa ausência de proteção pode comprometer a fisiologia da célula quando em situações adversas no meio levando, até mesmo, à morte (MCNEIL; STEINHARDT, 2000).
2.6.2 Eritrócitos (células vermelhas) Eritrócitos são os elementos celulares mais frequentes no sangue, representam 95%. Eles apresentam forma de discos anucleados dotados de
Hemoglobina (Hb) carreadoras de Oxigênio (O2). Os eritrócitos transportam o 27
Oxigênio do pulmão para os tecidos periféricos e realizam o transporte de dióxido de carbono (CO2) para fora do organismo. Os eritrócitos são extensamente utilizados em estudos de determinação de estrutura, composição e comportamento da membrana devido à sua estabilidade. Ao sofrer hemólise por ação de qualquer fator ambiental, as células vermelhas liberam hemoglobina no meio, as quais podem ser quantificadas por espectrofotometria em 540 nm (A540nm). O valor de absorbância a A540 é proporcional ao percentual de lise dos eritrócitos (NETTO, 2009). O teste de fragilidade osmótica eritrocitária (FOE) é de baixo custo e de elevada eficiência para avaliar a estabilidade das membranas e células. 2.6.3 Teste de fragilidade osmótica eritrocitária A fragilidade osmótica eritrocitária é usada para medir a resistência dos eritrócitos à hemólise enquanto estão sendo expostos à vários níveis de concentração salina (0 a 0,9 g/dL de NaCl em água destilada). A incubação dos eritrócitos em 37°C por 24 horas aumenta a sensitividade do teste. (KHALID, 2015) Quando as células estão em um meio hipotônico elas aumentam de volume até atingir nível crítico, após o que são lisadas. A osmolaridade representa o número de partículas de uma solução por litro (NETTO, 2009). As soluções hipotônicas provocam osmose para dentro da célula, causando o aumento de volume celular até o rompimento; enquanto as soluções hipertônicas provocam osmose efetiva para fora da célula, resultando na redução do volume celular. A osmose é o fluxo de água através de uma membrana semipermeável (permeável ao solvente e impermeável ao soluto), por esse motivo o fluxo ocorre de onde a concentração de soluto é menor para onde a concentração do soluto é maior como é ilustrado na Figura 5.
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Figura 5: Gráfico de osmose e ilustração de osmose em eritrócitos
Fonte: Elsevier Inc, 2004.
Os danos causados à integridade dos eritrócitos e a hemólise, contribuem para patologias graves, incluindo disfunção endotelial, proteção tecidual, perda da homeostase cardiovascular, metabolismo de óxido nítrico (NO) e controle da reologia sanguínea (KUHN et al., 2017). Entre outros fatores conhecidos, o colesterol interfere na fragilidade osmótica e o aumento do colesterol diminui a fragilidade celular (SAGAWA, S; SHIRAKI, 1980).
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3 OBJETIVOS 3.1 Objetivo geral • Avaliar a toxicidade celular em humanos do pesticida n-(fosfonometil)-glicina e demais componentes da formulação de uso comercial
3.2 Objetivos específicos • Obter as curvas de fragilidade osmótica celular para cada sujeito sem e com a ação do caotrópico; • Relacionar os fatores individuais, variáveis do hemograma e do lipidograma à toxicidade observada; • Avaliar a dependência entre idade e sensibilidade à intoxicação pelo toxicante objeto desse trabalho.
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4 MATERIAL E MÉTODOS Material: Amostras de sangue, Cloreto de Sódio (NaCl), Formulação comercial de glifosato, Água destilada, Pipetas Automáticas de 1000 µL e 20 µL, ponteiras descartáveis para as pipetas, tubos Eppendorfs®, estante para tubos, base de isopor para banho termostatizado. Equipamentos: Banho termostatizado HAAKE DC10-B3, Centrífuga Bioeng 16 tubos, Espectrofotômetro UV-VIS QUIMIS®. 4.1 Considerações éticas Esse trabalho foi previamente submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa em Humanos (CEP) por meio da Plataforma Brasil e tão somente mediante autorização e obtenção do número de concessão relativo a esse projeto, que os trabalhos experimentais foram iniciados. O número de CAAE (certificado de apresentação para apreciação ética) é 99724718.1.0000.5467 e o número do parecer de aprovado 2.933.304.
4.2 Amostras de material biológico Amostras de sangue (3 mL) foram coletadas de sujeitos saudáveis, com idade entre 1 e 15 anos, no Laboratório Municipal de Análises Clínicas da Prefeitura de Lorena através de punção venosa após um período de jejum de 8-12 horas. Os sujeitos participantes foram codificados e permaneceram incógnitos, não podendo ser identificados até mesmo se os resultados da pesquisa pudessem beneficiá-los.
O sangue foi coletado em tubos evacuados contendo 50 μL de K3EDTA a 25 mmol/L e seguiu a rotina de análise do laboratório onde foram processados de modo totalmente automatizados o eritrograma em equipamento Pentra DF Nexus (Horiba Medical Ltda) e o lipidograma por equipamento BT 3000-plus (Biotecnica Instruments). O sangue total não usado e considerado material de descarte foi, em no máximo 24 horas da sua obtenção, cedido à Universidade de São Paulo para o estudo a que se propôs esse trabalho. O sangue total foi transportado em recipiente acondicionado em ambiente refrigerado e mantido entre 0ºC a 4ºC até o momento da análise. Os resíduos foram armazenados em descarpack para serem
31 incinerados juntamente com os resíduos biológicos do Laboratório Municipal de Análises Clínicas.
Figura 6: Amostras de material biológico
Fonte: Próprio autor.
4.3 Reagentes O reagente NaCl foi de grau ACS de pureza e obtido por meio do Laboratório de Engenharia Ambiental ligado ao Departamento de Ciências Básicas e Ambientais da EEL-USP. O herbicida utilizado foi o glifosato fabricado pela Citromax (São Lourenço do Oeste, SC, Brasil) contendo glifosato 48% obtida em lojas de produtos agropecuários no município de Lorena. 4.4 Determinação da estabilidade de eritrócitos humanos na presença de glifosato Dois conjuntos em duplicata de 8 tubos eppendorfs contendo 2 mL de solução foram preparados: um conjunto com 2 mL concentração de NaCl com concentrações entre 0,3 a 0,6 g.dL-1; o outro conjunto com 1 mL de concentração de NaCl com concentração entre 0,3 e 0,6 g.dL-1 e 1 mL de solução de glifosato com 25 µL/dL de concentração. Todos os tubos foram pré-incubados durante 15 minutos em banho termostatizado mantido a 37,5 °C. Após a adição de 20 μL de sangue total, os tubos foram selados, homogeneizados e incubados durante 30 min a 37,5 °C. Em seguida, após retirados do período de incubação, os tubos eppendorfs foram centrifugados durante 2 min a 1600 x g a temperatura ambiente, os sobrenadantes foram cuidadosamente removidos com uso de pipeta automática e submetidos à leitura de absorbância a 540 nm em espectrofotômetro UV-VIS.
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Figura 7:Bancada Experimental.
Fonte: Próprio Autor.
Figura 8: (a) Banho termostatizado a 37,5 ˚C; (b) Adição de 20 µL de sangue em todos os tubos.
(a) (b) Fonte: Próprio autor.
Figura 9: Tubos eppendorfs com adição de sangue: (a) antes do banho termostatizado; (b) após o banho termostatizado.
(a) (b) Fonte: Próprio autor.
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Figura 10: Centrifuga com capacidade máxima de 16 tubos: (a) Vista superior; (b) Equipamento aberto
(a) (b) Fonte: Próprio autor.
Figura 11: Leitura de sobrenadante no espectrofotômetro: (a) Leitura da absorbância em 540nm; (b) Cubeta e tubo de eppendorfs de uma amostra com lise; (c) Cubeta e tubo eppendorf de uma amostra sem lise.
(a) (b) (c) Fonte: Próprio autor.
4.5 Determinação das curvas de transição de hemólise Os gráficos de dependência de leitura de absorbância a 540nm versus concentração de NaCl (X) foram ajustados à regressão sigmoidal, de acordo com a equação de Boltzmann (Equação 2) Equação 2: Equação de Boltzmann 퐴푚á푥 − 퐴푚í푛 퐴540 = + 퐴푚í푛 1 + 푒(푋−퐻50)푑푋
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Onde Amáx e Amín representam o máximo e o mínimo de A540 nos, H50 é a concentração de NaCl capaz de promover 50% de hemólise e dX representa a amplitude de concentração de sal necessária para promover a lise da população total de eritrócitos, como está apresentado no Gráfico 1. As variáveis dX e H50 estão relacionadas à estabilidade da membrana de eritrócitos. Quanto menor o valor de dX, menor a estabilidade ou maior fragilidade osmótica dos eritrócitos, sendo que uma menor variação na concentração de sal foi necessária para promover a lise total. Por outro lado, quanto menor o valor de H50, maior a estabilidade e menor fragilidade osmótica dos eritrócitos, pois o ponto médio da transição de hemólise
(H50) ocorreu com uma menor concentração de solução salina. Consequentemente, a razão dX/H50 tem uma relação direta com a estabilidade osmótica dos eritrócitos.
Gráfico 1: Curva típica de dependência de lise eritrocitária em função da concentração de NaCl.
Fonte: PARAISO et al., 2017.
4.5.1.1 Concentração de glifosato investigada A concentração de glifosato escolhida para investigação foi baseada em um artigo dos autores Rodrigues et al. (2011) que realizou a curva da fragilidade eritrocitária com a variação da concentração de glifosato com a concentração de solução salina em 0,9 g/dL, conforme é mostrado no Gráfico 2.
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Gráfico 2: Curva de fragilidade eritrocitária induzida pela variação da concentração de Roundup e concentração de NaCl constante em 0,9 g/dL.
Fonte: RODRIGUES et al., 2011. Escolheu-se o valor de 25 µL/dL por estar numa região da curva de dx do gráfico. 4.6 Determinação de variáveis bioquímicas e hematológicas O hemograma e o lipidograma foram processados pelo Laboratório Municipal de Análises Clínicas da Prefeitura de Lorena e os valores de referência (sujeitos entre 0 e 15 anos) foram eritrócitos (RBC), 3,9 a 5,9 milhões de mm3; Hb 12,0-18,0 g/dL; hematócrito 35,6-48,6%; média do volume corpuscular (MCV), 76- 96 fl; corpuscular média hemoglobina (MCH), 27 - 31 pg; concentração média corpuscular de hemoglobina (MCHC), 32,9-36%; distribuição das células vermelhas largura (RDW), 12-15%; glicose (Glu), 60-99 mg/dL; albumina (HSA), 3,5 a 5,2 g/dL; contagem de plaquetas 150 a 400 mil/mm3; colesterol total (t-C), <150 (ótimo) e ≥ 170 mg/dL (alto); alta densidade colesterol de lipoproteína (HDL- C), <35 (baixa) e > 45 mg/dL (ideal), colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL-C), <100 (bom) e > 130 mg/dL (Alto); lipoproteína de muito baixa densidade (VLDL-C), até 42 mg/dL; e triglicerídeos (TG), <100 (ótimo) e > 130 mg/dL (alto).
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4.7 Análise estatística dos dados experimentais Os efeitos citotóxicos do glifosato foram avaliados graficamente por meio do Software OriginPro 9.5 (MicroCal™, Northampton, MA, EUA). Para avaliação da citotoxicidade induzida por glifosato, após obtenção dos parâmetros de toxicidade celular por meio dos testes FOE, os dados foram tratados por análise estatística descritiva e exploratória e comparados pelo Teste de U de Wilcoxon. Dados de variáveis individuais gênero e idade também foram obtidos de cada um dos sujeitos. A busca de correlação entre as variáveis do eritrograma, do lipidograma e variáveis individuais com os parâmetros de estabilidade celular também foram processadas por meio do teste de Rhô de Spearman. Em todos os testes foi usado o Software OriginPro 9.5 (MicroCal™).
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5 RESULTADOS 5.1 Teste de fragilidade osmótica eritrocitária (FOE) Primeiramente, foram determinadas as linhas de base de dependência da hemólise em função da concentração de NaCl de cada indivíduo a partir das leituras de absorbância a 540 nm da concentração de hemoglobina, ajustadas pela equação de Boltzmann. O Gráfico 3 apresenta as curvas de hemólise de todas amostras de material biológico diferentes em concentrações que variaram entre 0,3 g/dL a 0,6 g/dL de NaCl. Para uma melhor visualização, o Gráfico 4 apresenta apenas três amostras e mesma escala de gráfico para comparação. O herbicida utilizado parece diminuir a amplitude da concentração de sal necessária para promover a lise da população total dos eritrócitos.
Gráfico 3:Curva de hemólise das dez amostras analisadas: (a) sem a presença de glifosato;
(b) com glifosato. 1,3 1,3 Fit Curve 1 1,2 Fit Curve 1 1,2 Fit Curve 2 Fit Curve 2 1,1 1,1 Fit Curve 3 Fit Curve 3 1,0 Fit Curve 4 1,0 Fit Curve 4 Fit Curve 5 0,9 Fit Curve 5 0,9 Fit Curve 6 Fit Curve 6 0,8 0,8 Fit Curve 7 Fit Curve 7 0,7 0,7 Fit Curve 8 Fit Curve 8 0,6 Fit Curve 9 0,6 Fit Curve 9 Fit Curve 10 0,5 Fit Curve 10 0,5
0,4 0,4 Absorbância(540nm) Absorbância(540nm) 0,3 0,3 0,2 0,2 0,1 0,1 0,0 0,0
0,30 0,35 0,40 0,45 0,50 0,55 0,60 0,30 0,35 0,40 0,45 0,50 0,55 0,60 NaCl (g/dL) NaCl (g/dL) (a) (b) Fonte: Próprio Autor.
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Gráfico 4:Curva de hemólise das três amostras analisadas com melhores ajustes de correlação (0,98; 0,99; 0,99): (a) sem a presença de glifosato; (b) com glifosato.
1,2 Fit Curve 5 1,2 Fit Curve 5 Fit Curve 7 Fit Curve 7 Fit Curve 10 Fit Curve 10 1,0 1,0
0,8 0,8
0,6 0,6
0,4
0,4 Absorbância(540nm)
0,2 Absorbância(540nm) 0,2
0,0 0,0
0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 NaCl (g/dL) NaCl (g/dL) (a) (b) Fonte: Próprio autor.
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Tabela 1: Análise descritiva exploratória dos parâmetros Amax, Amin, dX, H50 e dX/H50 obtidos dos ajustes das curvas da dependência de hemólise em linha de regressão sigmoidal (n=10).
Sem herbicida Com herbicida
Amax Amin dX H50 dX/H50 Amax Amin dX H50 dX/H50
Mínimo 0,8223 0,038 0,0009 0,4367 0,0021 0,6831 0,0259 0,0062 0,4211 0,0136
Máximo 1,178 0,1521 0,0488 0,47 0,1062 1,2237 0,2192 0,0277 0,4698 0,0652
Amplitude Total 0,3557 0,1142 0,0478 0,0333 0,1041 0,5406 0,1933 0,0215 0,0488 0,0516
Mediana 1,0622 0,08 0,0187 0,4479 0,04 1,0444 0,0896 0,0117 0,4467 0,0268
Primeiro Quartil (25%) 0,982 0,0566 0,0118 0,44 0,0262 0,8136 0,0579 0,0079 0,4358 0,0176
Terceiro Quartil (75%) 1,1402 0,1003 0,0231 0,4585 0,0527 1,0831 0,1283 0,0175 0,4508 0,0389
Desvio Interquartílico 0,1581 0,0437 0,0113 0,0186 0,0265 0,2695 0,0703 0,0096 0,015 0,0213
Fonte: Próprio autor.
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5.2 Análise descritiva exploratória A população de sujeitos envolvidos no estudo possui características relativas ao eritrograma, lipidograma, parâmetros de estabilidade e idade e gênero, apresentados na Tabela 2. Os gêneros dos indivíduos analisados foram formados por 40% feminino e 60% masculino. A variação das idades entre as amostras foi de 4 a 15 anos com mediana em 8 anos. Os parâmetros do eritrograma estão, em média, dentro da normalidade. Os valores: mediana e valor máximo de colesterol, valor máximo e mediana de plaquetas, o valor máximo de VLDL e valor máximo e mediana de triglicérides estão maiores que o desejável.
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Tabela 2: Análise descritiva exploratória das variáveis do eritrograma e lipidograma da população (n=10).
Primeiro Terceiro Amplitude Mínimo Máximo Mediana Quartil Quartil Desvio Interquartílico Total (25%) (75%)
Idade (anos) 4 15 11 8 6,25 11 4,75
Hemácias (milhões/mm3) 4,3 5,57 1,27 4,775 4,62 5,12 0,5
Hemoglobina (mg/dL) 12,3 14,5 2,2 13,3 12,825 13,9 1,075
Hematócrito (%) 37,3 44,7 7,4 41,1 40,075 43,7 3,625
VCM (fL) 80,3 89,5 9,2 86,55 83,6 86,775 3,175
HCM (pg) 25,5 29,2 3,7 27,85 26,175 28,525 2,35
CHCM (%) 30,9 33,5 2,6 32,35 31,725 32,475 0,75
Plaquetas (103/mm3) 219 562 343 422,5 309,5 483,25 173,75 t-Colesterol 60 182 126 143 138,25 149,5 11,25
LDL (mg/dL) 30 101 71 67 55,75 71,5 15,75
HDL (mg/dL) 3 68 65 47 40,75 52,25 11,5
VLDL (mg/dL) 15 67 52 26,5 22 33 11
Triglicerídeos (mg/dL) 77 333 256 132,5 111,25 163,75 52,5
Fonte: Próprio autor.
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5.3 Teste de normalidade exploratória Shapiro Wilk A normalidade dos dados é verificação necessária para a escolha dos testes estatísticos de comparação adequados para os dados. Destarte, o teste de normalidade de Shapiro Wilk foi aplicado a todos os conjuntos de dados (Tabelas 3 e 4). O teste de normalidade Shapiro Wilk avalia se a variável aleatória se adere a distribuição normal contra a hipótese alternativa de que a variável aleatória não adere à distribuição Normal. A maneira mais fácil de tomar a decisão é observar o valor-p dos testes e comparar com o nível de significância adotado. Se o valor-p do teste for menor que o nível de significância escolhido, rejeita-se a hipótese de normalidade. Os resultados mostraram distribuição não significativamente diferente da normal para a maioria dos conjuntos de dados, entretanto as variáveis gênero, t-colesterol, VLDL e triglicérides não apresentaram normalidade e, por isso, o estudo optou por uma estratégia não paramétrica de análise.
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Tabela 3:Teste de normalidade Shapiro Wilk dos parâmetros de ajuste das curvas de dependência da hemólise em linha de regressão de sigmoidal na presença e ausência do herbicida (n=10). Sem herbicida Com herbicida
Amax Amin dX H50 dX/H50 Amax Amin dX H50 dX/H50
Média 1,0401 0,0831 0,0192 0,4503 0,0425 0,9831 0,0976 0,014 0,4442 0,0317
Desvio Padrão 0,1229 0,0345 0,0133 0,0116 0,0291 0,1971 0,0562 0,0079 0,0146 0,0186
W 0,9035 0,9609 0,9334 0,9204 0,9447 0,866 0,9244 0,8727 0,9538 0,8651
p 0,3 0,7699 0,4733 0,3977 0,5794 0,0944 0,421 0,1215 0,6858 0,0927 Fonte: Próprio autor.
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Tabela 4:Teste de normalidade Shapiro Wilk das variáveis do eritrograma e lipidograma da população (n=10).
Desvio Média W p Padrão
Idade (anos) 8,9 3,755 0,9388 0,5091
Gênero F (%) 0,4 0,5164 0,6402 0,0082
Hemácias (milhões/mm3) 4,879 0,4136 0,9224 0,4093
Hemoglobina (mg/dL) 13,36 0,7183 0,9558 0,7092
Hematócrito (%) 41,52 2,4156 0,9483 0,6214
VCM (fL) 85,32 3,0419 0,9168 0,3773
HCM (pg) 27,46 1,3962 0,9081 0,3269
CHCM (%) 32,19 0,7031 0,9489 0,6279
Plaquetas (103/mm3) 405,1 114,3799 0,9517 0,6609
t-Colesterol 141,3 32,9715 0,8109 0,0241
LDL (mg/dL) 65,4 18,8515 0,9631 0,7956
HDL (mg/dL) 45,3 18,0742 0,8783 0,154
VLDL (mg/dL) 30,5 15,0794 0,8223 0,0336
Triglicerídeos (mg/dL) 152,4 74,3448 0,818 0,03
Fonte: Próprio autor.
5.4 Teste de comparação de dois grupos de Wilcoxon O teste de Wilcoxon é uma prova não paramétrica destinada à comparar dois conjuntos de dados pareados cujos valores estejam em escala minimamente ordinal, sendo o correspondente não paramétrico ao teste t-Student pareado. O teste de comparação de ranks de Wilcoxon foi usado para comparar os valores dos parâmetros de estabilidade dX e H50 com a intenção de avaliar o impacto do caotrópico sobre a estabilidade celular. Os resultados não mostraram
45 diferenças significantes entre os valores de dx (p = 0,2411) e H50 (p = 0,2026) (Gráfico 5 e Tabela 5) Gráfico 5:Testes de comparação de dois grupos (com e sem caotrópico) de Wilcoxon: (a)teste de Wilcoxon para dx com e sem herbicida; (b) Teste Wilcoxon H50 com e sem herbicida
(a) (b)
Fonte: Próprio autor.
Tabela 5: Teste de comparação de dois grupos de Wilcoxon.
Resultados Wilcoxon dX H50 T = 16 15 Número de pares = 10 10 Z = 1,1722 1,2741 p-valor (bilateral) = 0,2411 0,2026 Fonte: Próprio autor.
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5.5 Matriz de correlações Teste de Spearman A busca de correlações entre as variáveis foi processada por meio do teste de correlação de Spearman (휌). O teste de correlações de Spearman é um teste livre de distribuição e tem o objetivo de avaliar o grau de associação linear entre duas variáveis sendo ainda capaz de considerar ligeiras fugas da linearidade. Por meio do coeficiente Rhô (휌) de Spearman é possível avaliar a existência de associação entre as variáveis bem como a força e o sentido dessa associação. Os resultados mostraram apenas uma correlação significante com os parâmetros de estabilidade dX e H50. Apenas a hemoglobina (Hb) no grupo intervenção teve relação significante (p = 0,0367) forte e inversa (ρ = -0,6975) com o parâmetro dX (Tabela 6). Correlações já conhecidas na literatura como a associação entre gênero, idade, Col-t, HDL, LDL e triglicerídeos com os parâmetros de estabilidade, não foram verificadas. Tabela 6:Correlações de Spearman entre os parâmetros de estabilidade dX e H50 com as variáveis do eritrograma, lipidograma e gênero e idade. Ausência do Presença do caotrópico caotrópico dX H50 dX H50 Spearman Gênero Corr. 0.35533 0.4264 0.54772 0.49747 Gênero Sig. 0.31364 0.21914 0.12687 0.14346 Spearman Idade (anos) Corr. 0.28049 -0.10976 -0.26892 -0.11586 Idade (anos) Sig. 0.43246 0.76278 0.48412 0.74994 Hemácias Spearman (mi/mm³) Corr. 0.09091 0.32121 -0.55 -0.21212 Hemácias (mi/mm³) Sig. 0.80277 0.36547 0.12498 0.55631 Spearman Hb (mg/dL) Corr. 0.29879 0.2622 -0.6975 -0.13415 Hb (mg/dL) Sig. 0.4017 0.46427 0.03672 0.71177 Spearman Ht (%) Corr. 0.29787 0.32827 -0.65 -0.1459 Ht (%) Sig. 0.4032 0.35442 0.05807 0.68756 Spearman VCM (fL) Corr. -0.05455 0.07879 0.35 0.04242 VCM (fL) Sig. 0.88104 0.82872 0.35582 0.90736 Spearman HCM (pg) Corr. -0.0304 -0.231 0.24268 0.02432 HCM (pg) Sig. 0.93357 0.52079 0.52924 0.94684
47
Spearman CHCM (%) Corr. 0.07927 -0.38415 0.03361 -0.08537 CHCM (%) Sig. 0.82768 0.27308 0.93159 0.81461 Plaquetas Spearman (10³/mm³) Corr. 0.05455 0.11515 0.23333 0.24848 Plaquetas (10³/mm³) Sig. 0.88104 0.75142 0.5457 0.48878 Spearman t-Col (mg/dL) Corr. 0.01824 0.28572 -0.38494 0.10942 t-Col (mg/dL) Sig. 0.96012 0.42357 0.3063 0.76348 Spearman LDL (mg/dL) Corr. -0.01818 0.23636 -0.38333 -0.11515 LDL (mg/dL) Sig. 0.96024 0.51089 0.30849 0.75142 Spearman HDL (mg/dL) Corr. -0.29787 -0.13982 -0.24268 0.01824 HDL (mg/dL) Sig. 0.4032 0.70006 0.52924 0.96012 Spearman VLDL (mg/dL) Corr. 0.2614 0.24316 0.00837 0.13374 VLDL (mg/dL) Sig. 0.46568 0.49843 0.98295 0.71262 Triglicerídeos Spearman (mg/dL) Corr. 0.27273 0.18788 0.01667 0.12727 Triglicerídeos (mg/dL) Sig. 0.44584 0.60322 0.96605 0.72606
Fonte: Próprio autor.
6 DISCUSSÃO A análise descritiva exploratória destacou alguns valores fora do intervalo de referência do laboratório, entretanto essas variações não induziram os resultados. Os resultados do teste de Shapiro Wilk mostraram distribuição não significativamente normal para conjuntos de dados já citados na literatura (BERNARDINO-NETO, 2011), amostras pequenas dificilmente conseguem provar normalidade (TORMAN; COSTER; RIBOLDI, 2012). Devido a isso optou-se por uma estratégia não paramétrica de análise, a qual não pressupõe que os dados tenham distribuição normal. O teste de Wilcoxon, não permitiu que fosse rejeitada a igualdade dos grupos (p>0,05), mas não se pode descartar os efeitos crônicos do pesticida analisado. A matriz de correlação de Spearman apresentou uma correlação forte, inversa e significante para Hemoglobina e dX. O autor Bernardino -Neto (2011), encontrou essa correlação, eliminou a influência de variáveis externas moduladoras e a correlação permaneceu.
48
Correlações esperadas já vistas na literatura entre dX e H50 com idade, gênero, colesterol total, HDL, LDL não foram encontradas e acredita-se que seja por causa do tamanho da amostra. Se reconhece que essa pesquisa teve limitação primordial de tempo. Foram nove meses de pesquisa teórica e prática, os testes não foram iniciados até a autorização do Comitê de Ética, não foi possível analisar mais indivíduos pelo tempo, não foi possível fazer os testes de fragilidade com a variação da concentração de glifosato conforme era previsto.
7 CONCLUSÃO Esse estudo não conseguiu provar que a concentração de glifosato de 25 µL/dL seja capaz de desestabilizar a célula, entretanto não se pode garantir que essa concentração não seja capaz de desestabilizar a célula em efeito crônico. Sugere-se que outros estudos sejam realizados.
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8 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Figura 12: Glifosato e palavras chave.
Fonte: Autoria própria.
A Figura 12 é o resultado de uma busca na base de dados Scopus com o termo Glyphosate, a partir dos documentos obtidos realizou-se uma exportação dos dados para o software VOSviewer para uma análise geral do assunto. O tamanho dos círculos e das letras correspondem a maior ou menor relação com o termo pesquisado, então observou-se a relação dos mais relacionados e foi a base de estudo para esse trabalho.
9 AGRADECIMENTO Agradecimento ao apoio dado pela Secretaria Municipal de Saúde da Prefeitura de Lorena.
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