DIVERSIDADE GENÉTICA E MORFO-ANATÔMICA DE Acrocomia Spp

INSTITUTO AGRONÔMICO CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA TROPICAL E SUBTROPICAL

DIVERSIDADE GENÉTICA E MORFO-ANATÔMICA DE Acrocomia spp. (ARECACEAE)

SUELEN ALVES VIANNA

Orientador: Carlos Augusto Colombo

Tese submetida como requisito parcial

para a obtenção do grau de Doutor em

Agricultura Tropical e Subtropical, área

de Concentração em Genética,

Melhoramento e Biotecnologia Vegetal.

Campinas, SP Julho de 2016

“A dúvida é o princípio da sabedoria.”

Aristóteles

ii AGRADECIMENTOS

“Nenhum dever é mais importante que a gratidão”. As pessoas aqui lembradas são dignas de agradecimentos por sua contribuição de forma direta ou indireta para a realização do presente trabalho. Algumas pela amizade, outras, por seu exemplo, por seu conhecimento e outras ainda pelo carinho e cumplicidade. Assim agradeço:

Ao Programa de Pós – Graduação em Agricultura Tropical e Subtropical / Instituto Agronômico de Campinas e ao Dr. Carlos Augusto Colombo pela oportunidade de desenvolver este estudo.

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela concessão da bolsa de estudos e financiamento do presente trabalho.

À Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), em especial à Dra. Sandra Maria Carmello Guerreiro pela orientação dos trabalhos de Anatomia e pelo apoio durante o curso. Aos funcionários e aos colegas do Laboratório de Anatomia Vegetal pelos ensinamentos.

Ao Dr. Walter José Siqueira pelos ensinamentos e à todos os funcionários e colegas do Departamento de Genética.

Ao Herbário IAC, em especial aos Doutores Roseli Buzanelli Torres e Luís Carlos Bernacci e aos funcionários Carla e “Bene” pelo apoio no recebimento de amostras, pelo apoio e amizade.

Ao Jardim Botânico Plantarum, em especial ao MSc. Harri Lorenzi pela permissão da coleta de amostras.

Ao Montgomery Botanical Center (MBC) pelo convite, financiamento, permissão de coleta de amostras da coleção de palmeiras e estrutura oferecidos para a realização de parte do trabalho de anatomia foliar. Em especial ao Dr. Larry Ronald Noblick pelos ensinamentos e apoio dados. À Dra. Tracy Monique Magelan pelo apoio e pela amizade durante minha estadia no MBC. Aos demais pesquisadores e funcionários do MBC.

Ao Farchild Tropical Botanical Garden, pelo uso do laboratório e pelas amostras cedidas do Herbário.

iii

Aos Doutores Mónica Moraes (Herbario Nacional de Bolivia), Andrew James Henderson (The New York Botanical Garden), Alex Carneiro Leal (Instituto Agronômico Paraná), Nilton Tadeu Vilela Junqueira (Embrapa Cerrados), Ricardo Soares Pimenta (Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Universidade Estadual Paulista), Maria Mercedes Arbo (Instituto de Botánica del Nordeste – UNNE), Francisco Gauberto Barros dos Santos (Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Ceará), ao MSc. Cristiano Cardoso Gomes e ao Herbario CAY pelo envio de amostras.

Aos Doutores Judas Tadeu de Medeiros Costa (Universidade Federal do Pernambuco), Eduardo Ribeiro dos Santos (Herbário Universidade Federal do Tocantins), Carlos Manuel Burelo Ramos (Universidad Juárez Autónoma de Tabasco) pelo apoio durante as coletas.

Às minhas queridas estagiárias Bruna Dias e Raissa Franchi por toda a ajuda dada para a realização do trabalho.

Ao Dr. Arnildo Pott com quem tanto aprendi. Fica aqui registrado mina grande admiração pelo profissional e pelo ser humano que és.

À Dra. Maria Imaculada Zucchi por todos os ensinamentos, pelo apoio e pela pessoa que é, e que tanto me ajudou durante ese período.

À MSc. Lúcia Pires Ferreira, pela orientação para realização dos trabalhos de genética e pela amizade. Fica registrada mina gratidão e meu respeito pela grande profissional e pessoa de coração enorme que és.

À Dra. Stella Maria Nucci, por todos os ensinamentos e pelo carinho sempre presentes.

Aos meus queridos amigos, Renata Kimie, Sara Rovaris, Margarete, Alex Mendonça, Brenda Díaz, Vivian Santos, Denis Bassi, Cema Viel, Bárbara Biazotti, Rosa Helena, Natácia Evangelista e tantos outros queridos amigos que contribuiram para realização deste trabalho e pelo apoio pessoal.

À minha querida mãe Rosângela Brusco Loesch, pelo apoio e carinho durante toda a minha vida.

iv SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS ...... viii-xi LISTA DE TABELAS ...... xii-xiii RESUMO ...... xiv ABSTRACT ...... xv 1 INTRODUÇÃO GERAL ...... 01-03 2 REVISÃO DE LITERATURA ...... 04-36 2.1 Aspectos taxonômicos, botânicos e área de ocorrência de Acrocomia spp...... 04-18 2.1.1 Acrocomia aculeata ...... 08-10 2.1.2 Acrocomia crispa ...... 10-11 2.1.3 Acrocomia emensis ...... 11-12 2.1.4 Acrocomia glaucescens ...... 13 2.1.5 Acrocomia hassleri ...... 13-14 2.1.6 Acrocomia intumescens ...... 14-15 2.1.7 Acrocomia media ...... 15-16 2.1.8 Acrocomia totai ...... 17-18 2.2 Utilização de Acrocomia spp...... 18-30 2.2.1 Biocombustíveis ...... 24-30 2.3 Aspectos da diversidade genética e marcadores moleculares ...... 30-33 2.4 Caracterização biométrica de frutos ...... 33 2.5 Caracterização morfoanatômica ...... 34-36 3. REFERÊNCIAS ...... 37-51 CAPÍTULO I Caracterização da diversidade molecular de Acrocomia Mart. (Arecaceae) ...... 52-113 RESUMO ...... 53 ABSTRACT ...... 54 1. INTRODUÇÃO ...... 54-58 2. MATERIAL E MÉTODOS ...... 58-72 2.1 Coleta do material botânico ...... 58-60 2.2 Seleção das amostras coletadas para utilização no estudo de diversidade ...... 60-67 2.3 Conservação e processamento do material botânico ...... 68 2.3.1 Extração de DNA total das folhas ...... 68 2.3.2 Extração de DNA total da amêndoa ...... 69 2.4 Seleção e otimização de iniciadores Inter Simple Sequence Reapts (ISSR) ...... 69-71

v 2.5 Análise dos dados ...... 71-72 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 72-98 3.1 Seleção e otimização dos iniciadores ISSR ...... 72-74 3.2 Diversidade e estrutura genética ...... 74 3.2.1 Acrocomia spp...... 74-80 3.2.2 Acrocomia intumescens ...... 80-85 3.2.3 Acrocomia totai ...... 85-90 3.2.4 Acrocomia aculeata ...... 91-98 4 CONCLUSÕES ...... 98 5 REFERÊNCIAS ...... 99-107 Anexos ...... 108-113 CAPÍTULO II Anatomia foliar como subsídio à taxonomia de espécies de Acrocomia Mart. (Arecaceae) ...... 114-149 RESUMO ...... 115 ABSTRACT 116 1 INTRODUÇÃO ...... 116-118 2 MATERIAL E MÉTODOS ...... 119-122 2.1 Coleta e preparo do material botânico ...... 119-121 2.2 Testes histoquímicos ...... 121 2.3 Microscopia eletrônica de varredura ...... 121 2.4 Análise dos dados fenotípicos ...... 121-122 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 122-142 3.1 Descrição anatômica ...... 122-128 3.2 Padrão de deposição de cera epicuticular ...... 128-130 3.3 Nervura central ...... 130-133 3.4 Margem ...... 133-134 3.5 Testes histoquímicos ...... 135 3.6 Análise dos dados fenotípicos ...... 135-140 3.7 Chave de identificação anatômica para as espécies estudadas de Acrocomia 141-142 Mart...... 4 CONCLUSÕES ...... 143 5 REFERÊNCIAS ...... 144-149 CAPÍTULO III Anatomia e histoquímica do mesocarpo de espécies de Acrocomia Mart. 150-174 (Arecaceae): Implicações taxonômicas e tecnológicas ......

vi RESUMO ...... 151 ABSTRACT ...... 152 1 INTRODUÇÃO ...... 152-156 2 MATERIAL E MÉTODOS ...... 156-158 2.1 Coleta e preparo do material botânico ...... 156-157 2.2 Testes histoquímicos ...... 158 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 158-168 3.1 Aspectos morfológicos dos frutos de Acrocomia spp...... 158-159 3.2 Descrição anatômica do mesocarpo ...... 159-161 3.3 Testes histoquímicos ...... 162 3.3.1 Lipídios totais ...... 162-163 3.3.2 Mucilagem ...... 164-165 3.3.3 Amido ...... 166-167 3.3.4 Compostos fenólicos ...... 167-168 4 CONCLUSÕES ...... 168 5 REFERÊNCIAS ...... 169-174 CAPÍTULO IV Caracterização biométrica de frutos de três espécies de Acrocomia Mart. 175-196 (Arecaceae) ...... RESUMO ...... 176 ABSTRACT ...... 177 1 INTRODUÇÃO ...... 177-179 2 MATERIAL E MÉTODOS ...... 180-181 2.1 Área de coleta e biometria dos frutos ...... 180-181 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 181-193 3.1 Caracterização biométrica dos frutos ...... 181-189 3.2 Caracterização biométrica das partes de frutos de Acrocomia intumescens ...... 190-193 4 CONCLUSÕES ...... 193 5 REFERÊNCIAS ...... 194-196 4 CONSIDERAÇÕES GERAIS ...... 197

vii LISTA DE FIGURAS

REVISÃO DE LITERATURA ...... 04-35 Figura 1 - Distribuição das espécies de A. nos diferentes biomas das Américas: A. aculeata (Aa), A. crispa (Ac), A. emensis (Ae), A. glaucescens (Ag), A. hassleri (Ah), A. intumescens (Ai), A. media (Am), A. totai (At)...... 07 Figura 2 - Acrocomia aculeata: a Palmeira, b Estipe, c Infrutescências, d Flor estaminada, e Flor pistilada, f Frutos com diferentes números de sementes, g Cores epicarpo, h Cores mesocarpo...... 09 Figura 3 - Acrocomia crispa: a Palmeira, b Estipe, c Espinhos na raque foliar, d Infrutescências, e Frutos...... 11 Figura 4 - Acrocomia emensis: a Palmeira, b Estipe, c Espinhos na raque foliar, d Infrutescências, e Frutos...... 12 Figura 5 - Acrocomia glaucescens: a Palmeira, b Estipe, c Folha, d Flor estaminada, e Flor pistilada, f Infrutescência...... 13 Figura 6 - Acrocomia hassleri: a Palmeira, b Rizoma, c Inflorescências, d Inflorescência em detalhe, e Infrutescência e frutos...... 14 Figura 7 - Acrocomia intumescens: a Palmeira, b Estipe, c Infrutescência, d Flor estaminada, e Flor pistilada, f Frutos, g Frutos com uma, duas e três sementes...... 15 Figura 8 - Acrocomia media: a Palmeira, b Infrutescência, c Estipe, d Fruto...... 16 Figura 9 - Acrocomia totai: a Palmeira, b Estipe, c Infrutescências, d Flores estaminadas, e Tríade de flores, f Frutos com diferentes cores epicarpo, g Cores mesocarpo...... 17 Figura 10 - “Viño de Coyol”: a Corte do estipe para retirada da seiva, b Seiva, c Extração da seiva, d Fabricação do “viño de coyol”, e Venda do produto, f Engarrafamento artesanal, g Bebida industrializada na Costa Rica...... 21 Figura 11 - Usos dos frutos de Acrocomia spp.: a Polpa desidratada ao sol, b Fabricação de farinha, c Bolo, d Picolé, e Óleo da amêndoa e da polpa, f Sabão, g Óleo da amêndoa para consumo humano, h Cosméticos, i Frutos frescos, j Polpa fatiada, k Mel com polpa, l Xarope à base da polpa...... 22 Figura 12 - Processamento, frações de rendimento, usos e aplicações de produtos e subprodutos de Acrocomia spp. (considerando cerca de 5% de perda durante o processamento)...... 23 Figura 13 - Previsão de consumo mundial de biocombustíveis por tipo entre 2006 e 2030...... 25 Figura 14 - Biocombustíveis x Combustíveis: processos que envolvem sua produção..... 26 Figura 15 - Produção de óleo (t.ha.ano-1) de quatro espécies de palmeiras e culturas tradicionalmente utilizadas para produção de biocombustíveis...... 29 CAPÍTULO I Caracterização da diversidade molecular de Acrocomia spp. (Arecaceae)

viii nas Américas ...... 52-113 Figura 1 - Mapa da área de ocorrência/países de ocorrência (em verde) e dos pontos de coleta de Acrocomia aculeata...... 59 Figura 2 - Mapa indicando a área de ocorrência (em verde) e os pontos de coleta de: a Acrocomia crispa, b A. emensis, c A. glaucescens, d A. hassleri, e A. intumescens, f A. totai...... 60 Figura 3 - Perfil de amplificação de marcadores ISSR com temperatura de anelamento de 58oC...... 73 Figura 4 - Perfil de amplificação de indivíduos de espécies de Acrocomia utilizando ISSR...... 74 Figura 5 - Diversidade genética das espécies de Acrocomia analisadas considerando o número total de bandas, o número de bandas polimórficas, número de bandas privadas e o índice de diversidade de Nei (com desvio padrão)...... 75 Figura 6 - Análise das coordenadas principais das espécies de Acrocomia baseado na matriz de distância de Nei...... 77 Figura 7 - Dendrograma obtido com método UPGMA, baseado na matriz de distâncias de Nei para as espécies analisadas de Acrocomia. Índice cofenético = 0,9555...... 78 Figura 8 - Diversidade genética das localidades analisadas de Acrocomia intumescens considerando o número total de bandas, o número de bandas polimórficas, o número de bandas privadas e o índice de diversidade de Nei (com desvio padrão)...... 81 Figura 9 - Análise das coordenadas principais de Acrocomia intumescens de diferentes localidades baseada na matriz de diversidade genética...... 83 Figura 10 - Análise das coordenadas principais de Acrocomia intumescens provenientes de cinco localidades baseada na matriz de distância de Nei (1972)...... 84 Figura 11 - Dendrograma obtido com método UPGMA, baseado na distância de Nei (1972) para diferentes localidades com ocorrência de Acrocomia intumescens. Índice cofenético = 0,9699...... 85 Figura 12 - Diversidade genética das localidades analisadas com ocorrência de Acrocomia totai, considerando o número total de bandas, o número de bandas polimórficas, o número de bandas privadas e o índice de diversidade de Nei (com desvio padrão)...... 86 Figura 13 - Análise das coordenadas principais de Acrocomia totai oriundas de diferentes locais baseada na distância genética de Nei (1972)...... 88 Figura 14 - Análise das coordenadas principais de Acrocomia totai de diferentes localidades baseada na distância genética de Nei (1972)...... 89 Figura 15 - Dendrograma obtido com método UPGMA, baseado na distância de Nei (1972), para diferentes localidades com ocorrência de Acrocomia totai. Índice cofenético = 0,9582...... 90 Figura 16 - Diversidade genética de 24 localidades com ocorrência de Acrocomia aculeata, considerando o número total de bandas, o número de bandas polimórficas, o número de bandas privadas e o índice de diversidade de Nei (com desvio padrão)...... 91 Figura 17 - Análise das coordenadas principais de 24 localidades com Acrocomia 94

ix aculeata baseada na distância genética de Nei (1972)...... Figura 18 - Análise das coordenadas principais de 43 localidades com Acrocomia aculeata baseada distância genética de Nei (1972)...... 95 Figura 19 - Dendrograma obtido com método UPGMA, baseado na distância de Nei (1972) para diferentes localidades com ocorrência de Acrocomia aculeata. Índice cofenético = 0,8247...... 96 CAPÍTULO II Anatomia foliar como subsídio à taxonomia de espécies de Acrocomia Mart. (Arecaceae) ...... 114-149 Figura 1 - Hábito de: a Acrocomia aculeata, b A. crispa, c A. intumescens, d A. totai, e A. emensis, f A. glaucescens, g A. hassleri com detalhe do rizoma...... 117 Figura 2 - Secção transversal do mesofilo: a Acrocomia aculeata, b A. crispa, c A. emensis, d A. glaucescens, e A. hassleri, f A. intumescens, g A. totai. Barra = 200 µm...... 123 Figura 3 - Acrocomia spp.: a Epiderme em vista frontal, b Epiderme e hipoderme em secção transversal, c Epiderme abaxial e estômatos, d Estômatos em secção transversal, e Tricomas em vista frontal, f Tricomas em detalhe em vista frontal, g Feixe vascular principal, h Feixe vascular secundário, i Feixe de fibra não vascular, j Corpos silicosos associados aos feixes de fibras não vasculares, k Mesofilo, l Bainha esclerenquimática, m Idioblasto com ráfides, Ráfides, o Células de expansão na nervura central, p Venação...... 124 Figura 4 - Acrocomia spp.: a Eletromicrografia de varredura de um feixe de fibras não vasculares com estegmatas associados paralelamente ao seu maior eixo, b Detalhe dos estegmatas, c Detalhe de um corpo silicoso arredondado com superfície espiculada (C). Barra = 10 u (A, B); 1 u (C)...... 127 Figura 5 - Padrões de deposição de cera epicuticular na face adaxial nos folíolos de: a Acrocomia aculeata, b A. crispa, c A. emensis, d A. glaucescens, e A. hassleri, f A. intumescens, g A. totai...... 129 Figura 6- Secções transversais da nervura dos folíolos de: a Acrocomia aculeata, b A. crispa, c A. emensis, d A. glaucescens, e A. hassleri, f A. intumescens, g A. totai. Barra = 200 µm...... 131 Figura 7 - Secções transversais mostrando a margem dos folíolos de: a Acrocomia aculeata, b A. crispa, c A. emensis, d A. glaucescens, e A. hassleri, f A. intumescens, g A. totai...... 134 Figura 8 - Análise de agrupamento obtida por distância euclidiana e UPGMA, baseada na presença e ausência de caracteres anatômicos distintos dos folíolos de Acrocomia spp...... 137 Figura 9 - Representação gráfica da organização das estruturas e tecidos do mesofilo de: a Acrocomia aculeata, b A. crispa, c A. emensis, d A. glaucescens, e A. hassleri, f A. intumescens e g A. totai...... 142 CAPÍTULO III Anatomia e histoquímica do mesocarpo de espécies de Acrocomia Mart. (Arecaceae): Implicações taxonômicas e tecnológicas ...... 150-174

x Figura 1 - Hábito das espécies reconhecidas em Acrocomia: a A. aculeata, b A. crispa, c A. intumescens, d A. media, e A. totai, f A. emensis, g A. glaucescens e h A. hassleri...... 153 Figura 2 - Preparo do fruto de Acrocomia spp. antes da pré-infiltração: a Serra-fita, b Pinça artesanal em madeira, c Detalhe da pinça com fruto, d Fatia da porção central do fruto...... 157 Figura 3 - Variação morfológica dos frutos de: a Acrocomia aculeata, b A. glaucescens, c A. intumescens, d A. totai, e A. crispa...... 159 Figura 4 - Secção do mesocarpo de: a Acrocomia aculeata, b A. crispa, c A. glaucescens, d A. intumescens e e A. totai. Barra: 1.0 mm...... 160 Figura 5 - Detalhe dos feixes vasculares em a, b Acrocomia intumescens e A. glaucescens, respectivamente, c Detalhe das cavidades de mucilagem individuais e d fundidas...... 161 Figura 6 - Oleossomos no mesocarpo de a Acrocomia intumescens, b Detalhe dos oleossomos em A. totai, c, d Olessomos em Elaeis guineensis...... 163 Figura 7 - Mucilagem em frutos de Acrocomia aculeata, com detalhe da cavidade produtora de mucilagem...... 164 Figura 8 - Secção do mesocarpo de Acrocomia intumescens: a detecção de amido com uso de Lugol, b Detalhe dos grãos de amido...... 166 Figura 9 - Acrocomia glaucescens: a compostos fenólicos detectados com cloreto férrico III, b Células com compostos fenólicos com coradas com azul de toluidina, c Célula com composto fenólico em detalhe, corada com azul de toluidina...... 167 CAPÍTULO IV

Caracterização biométrica de frutos de três espécies de Acrocomia Mart. (Arecaceae) ...... 175-196 Figura 1 - Área de ocorrência e pontos de coleta das espécies de Acrocomia em estudo...... 180 Figura 2 - Variação morfológica do número de sementes, a coloração epicarpo e mesocarpo de: a Acrocomia aculeata, b A. intumescens e c A. totai...... 182 Figura 3 - Distribuição de classes de dados de a diâmetro, b comprimento, c massa fresca e d massa seca de frutos de Acrocomia aculeata, A. intumescens e A. totai...... 183 Figura 4 - Características biométricas de frutos de Acrocomia aculeata, Acrocomia intumescens e Acrocomia totai...... 187 Figura 5 - Análise de agrupamento obtida por distância euclidiana e UPGMA, baseada nas características diâmetro, comprimento, massas fresca e seca de frutos das espécies estudadas de Acrocomia...... 188 Figura 6 - Indivíduos adultos de a Acrocomia aculeata, b A. intumescens e c A. totai, e detalhe dos estipes...... 189 Figura 7 - Partes do fruto de Acrocomia intumescens e indicação de sua contribuição (%) na massa fresca total...... 191

xi LISTA DE TABELAS

REVISÃO DE LITERATURA ...... 04-36 Tabela 1 - Lista de espécies de Acrocomia...... 05-06 Tabela 2 - Resumo dos usos das espécies de Acrocomia spp...... 19-20 Tabela 3 - Coeficientes técnicos das principais espécies oleaginosas potenciais para

produção de biocombustíveis no Brasil...... 28 CAPÍTULO I

Caracterização da diversidade molecular de Acrocomia spp. (Arecaceae) nas

Américas ...... 52-113 Tabela 1 - Locais de coleta das amostras utilizadas para o estudo de diversidade genética

de Acrocomia spp. Coordenadas geográficas: Latitude (Lat.), Longitude (Lon.),

Altitude (Alt.); Clima Zonal de acordo com a classificação de Köppen-Geiger

(CZ); Temperatura Media Anual (TMA, oC); Precipitação Média Anual (PMA,

mm) e Fitofisionomia...... 61-67 Tabela 2 - Lista dos iniciadores ISSR usados no estudo de determinação da temperatura de

anelamento em Acrocomia spp...... 70 Tabela 3 - Estimativas de diversidade genética das espécies de Acrocomia analisadas:

número de indivíduos (N); número de alelos (Na); índice de Shannon (I);

diversidade genética de Nei (HE) e porcentagem de locos polimórficos (P)...... 76 Tabela 4 - Análise de variância molecular para dois níveis hierárquicos de um conjunto

amostral de diferentes espécies de Acrocomia...... 77 Tabela 5 - Estimativas de diversidade genética de cinco localidades de Acrocomia 82 intumescens: número de indivíduos (N); número de alelos (Na); índice de

Shannon (I); diversidade genética de Nei (HE) e porcentagem de locos polimórficos (P)...... Tabela 6 - Análise de variância molecular para dois níveis hierárquicos de Acrocomia

intumescens provenientes de diferentes localidades...... 82 Tabela 7 - Estimativas de diversidade genética de seis localidades com ocorrência de

Acrocomia totai: número de indivíduos (N); número de alelos (Na); índice de

Shannon (I); diversidade genética de Nei (HE) e porcentagem de locos

polimórficos (P)...... 87 Tabela 8 - Análise de variância molecular para dois níveis hierárquicos de um conjunto

xii amostral de diferentes localidades com Acrocomia totai...... 87 Tabela 9 - Estimativas de diversidade genética de 24 localidades com ocorrência de

Acrocomia aculeata: número de indivíduos (N); número de alelos (Na); índice

de Shannon (I); diversidade genética de Nei (HE) e porcentagem de locos 92-93 polimórficos (P)...... Tabela 10 - Análise de variância molecular para dois níveis hierárquicos de 24 localidades 93 com ocorrência de Acrocomia aculeata...... ANEXOS do Capítulo I ...... 108-113 Tabela 1 - Lista dos materiais de Acrocomia aculeata, local da coleta, número de indivíduos e origem...... 108-112 Tabela 2 - Lista dos materiais das espécies de Acrocomia (exceto A. aculeata), local da coleta, número de indivíduos e origem...... 112-113 CAPÍTULO II

Anatomia foliar como subsídio à taxonomia de espécies de Acrocomia Mart.

(Arecaceae) ...... 114-149 Tabela 1 - Lista dos espécimes de Acrocomia selecionados para as análises de anatomia foliar...... 119-120 Tabela 2 - Média e desvio padrão de 19 caracteres da anatomia foliar das espécies estudadas de Acrocomia...... 136 Capítulo III

Anatomia e histoquímica do mesocarpo de espécies de Acrocomia Mart.

(Arecaceae): Implicações taxonômicas e tecnológicas ...... 150-174 Tabela 1 - Lista dos materiais de Acrocomia utilizados para realização das análises de 156 anatomia do fruto...... Tabela 2 - Caracterização morfológica dos frutos de diferentes espécies de Acrocomia...... 158 Tabela 3 - Localização dos compostos detectados no mesocarpo em espécies de Acrocomia...... 162

Capítulo IV

Caracterização biométrica de frutos de três espécies de Acrocomia Mart.

(Arecaceae) ...... 175-196 Tabela 1 - Características biométricas de frutos de Acrocomia aculeata, Acrocomia

intumescens e Acrocomia totai: limite inferior (LI), limite superior (LS), média,

desvio padrão (σ) e coeficiente de variação (CV%)...... 185-186 Tabela 2 - Resumo das características morfológicas de três espécies de Acrocomia...... 189 Tabela 3 - Valores da média, desvio padrão (σ), limite inferior (mínimo), limite superior

(máximo) e coeficiente de variação (CV%) de características biométricas de

frutos de Acrocomia intumescens coletados na região metropolitana do Recife,

PE...... 190-191 Tabela 4 - Matriz de coeficientes de correlações de Pearson das variáveis: diâmetro

externo transversal (DET), diâmetro externo longitudinal (DEL), massa fresca

do fruto inteiro (MFFI), massa fresca do epicarpo (MFEP), massa fresca do

mesocarpo (MFM), massa fresca do endocarpo (MFEN), massa fresca da

amêndoa (MFA) e percentagem da polpa (%POL)...... 193

xiii Diversidade genética e morfo-anatômica de Acrocomia spp. (Arecaceae)

RESUMO

Atrelado ao exponencial aumento da população mundial está a crescente demanda por água, alimentos e energia, sendo que boa parte da produção de alimentos e da captação e transporte de água requer energia. As fontes de energia mais utilizadas atualmente são de origem fóssil, recurso limitado e poluente. Assim, a busca por novas fontes de energia renovável torna-se necessária, abrindo amplas perspectivas para utilização de óleos de origem vegetal como substitutos aos combustíveis fósseis. Neste sentido, as palmeiras apresentam um grande potencial para produção de óleo, além de serem utilizadas como recurso de subsistência para muitos povos e apresentarem um grande potencial econômico devido à sua multiplicidade de usos. Dentre estas, destaca-se as palmeiras do gênero Acrocomia, por seu alto rendimento na produção de óleo, por ter ampla distribuição geográfica, ocorrendo de forma natural em boa parte do continente americano, em diferentes ambientes e, por apresentar potencial para indústria de alimentos, de madeira, de cosméticos e outros. A utilização destas palmeiras depende de sua domesticação a fim de aumentar a produção, manter a oferta da matéria-prima no mercado e obter um produto final padronizado e de qualidade. Para tal, pesquisas nas diversas áreas do conhecimento são necessárias. Sabendo da grande variação morfológica existente, e da falta de consenso sobre o número de espécies de Acrocomia, neste trabalho é apresentada uma análise do estudo de diversidade genética, da diversidade morfológica e da anatomia foliar de indivíduos provenientes de diferentes locais da área de ocorrência do gênero, a fim de contribuir para a diferenciação e a determinação do número de espécies em Acrocomia.

Palavras-chave: anatomia foliar, biocombustíveis, macaúba, marcadores moleculares, palmeiras

xiv ABSTRACT

Genetic and anatomical diversity of Acrocomia spp. (Arecaceae) - Linked to the exponential increase in the world population is growing demand for water, food and energy, and much of the food production and the capture and transport of water requires energy. The energy sources the most currently used are of fossil origin, limited and polluting resource. Thus, the search for new renewable energy sources becomes necessary, opening up broad prospects for the use of vegetable oils as substitutes for fossil fuels. The palm trees have great potential for the production of oil, besides being used as a subsistence resource for many people and present a great economic potential due to its various uses. The palm trees of Acrocomia genus stand out for their high performance in the production of oil, having wide geographical distribution, occurring naturally in much of the American continent, in different environments, and have the potential for food industry, wood, and other cosmetics. The use of these palm depends on its domestication order to increase production, maintain the supply of raw materials on the market and obtaining a standardized and quality final product, thus requiring research in various fields of knowledge. Knowing the existing large morphological variation, and the lack of consensus on the number of species Acrocomia, this work is presented a study of the analysis of genetic diversity of morphological diversity and leaf anatomy of individuals from different locations of the occurrence area of the genus to contribute to the differentiation and determination of the number of species in Acrocomia.

Key words: biofuels, leaf anatomy, macaúba, molecular markers, palm trees

xv 1 INTRODUÇÃO

Devido ao crescente aumento da população mundial, existe uma demanda progressiva pela produção de alimentos e de energia, sendo que boa parte da produção de alimentos no mundo requer energia.

A atual crise energética requer a busca por novas fontes de energia renovável, abrindo amplas perspectivas para utilização de óleos de origem vegetal como substitutos aos combustíveis fósseis. Alguns países já produzem biocombustíveis a partir de espécies vegetais e incentivam o aumento da produção e a busca por novas matérias-primas. No Brasil, a principal matéria-prima utilizada para produção de biocombustíveis é a soja, no entanto, o uso do óleo desta cultura para produção de biocombustível compete com a produção de grãos e do próprio óleo destinados à alimentação humana.

Neste sentido, as palmeiras apresentam um grande potencial para produção de óleo, além de serem utilizadas como recurso de subsistência para muitos povos e apresentarem um grande potencial econômico devido à sua multiplicidade de usos. No Brasil, existem extensos palmares nativos, a exemplo das palmeiras do gênero Acrocomia, que ocorrem em quase todo o território nacional. No entanto, sua exploração é realizada, em grande parte, de forma extrativista por comunidades tradicionais e rurais, e com baixa produtividade devido à falta de conhecimento sobre sua morfologia, fisiologia, taxonomia, aspectos produtivos, ecologia e diversidade genética.

As espécies de Acrocomia são utilizadas para diversos fins, sendo aproveitadas todas as suas partes, para alimentação humana, e animal, medicinalmente, construção, artesanato, carvoaria, indústria de cosméticos, como espécie ornamental e outros (Pott & Pott 1994, Salis & Matos 2009, Damasceno-Jr et al. 2010). Embora o maior interesse seja pela sua alta capacidade de produção de óleo, diversas comunidades rurais e tradicionais, principalmente nos estados do Mato Grosso do Sul e Pernambuco têm como fonte ou complemento de renda a comercialização dos frutos frescos inteiros, despolpados ou processados como farinha, doces, bolos, xaropes e outros.

De acordo com estimativas a macaúba, como é conhecida popularmente a espécie Acrocomia aculeata no Brasil, pode produzir 4 mil litros de óleo por hectare por ano. A título de comparação, a soja produz 420 litros, o girassol 890 litros e a mamona 1.320 litros, enquanto que o dendê pode chegar a 7,3 mil litros de óleo por hectare por ano (Secretaria Executiva de Agricultura do Estado do Pará 2005), muito embora esta última

1 opção agrícola é muito exigente em água, sendo cultivada em áreas com elevados índices pluviométricos. Some-se a isso o fato da macaúba ser espontânea e perene, com benefícios para o manejo e a conservação de solo, visto que uma vez plantada sua vida útil econômica excede 50 anos, como espécie pioneira abre caminho para a sucessão de outras espécies vegetais nativas, assegurando a conservação e recuperação ambiental, além de contribuir com sequestro de carbono e apresentar relevante contribuição para o armazenamento e ciclagem de nutrientes (Ferreira et al. 2013).

As espécies do gênero Acrocomia podem ser encontradas em áreas tropicais e subtropicais das Américas, ocorrendo em áreas desde o sul do México até norte da Argentina. No Brasil, sua área de ocorrência abrange todo o território nacional, exceto a região amazônica. Devido à sua extensa área de distribuição geográfica, contemplando climas, relevo, solos e formações vegetacionais diferenciadas, as populações naturais de Acrocomia spp. apresentam grande variação morfológica e variabilidade genética tanto dentro como entre populações (Nucci 2007, Roncal et al. 2008, Cicconini et al. 2013, Berton 2013, Lanes et al. 2014), o que tem causado desacordo quanto à classificação taxonômica das espécies do gênero. No Brasil, tem-se considerado, em geral, que as populações que ocorrem na região Nordeste são classificadas como A. intumescens, facilmente reconhecida pelo intumescimento no meio do estipe; as populações do Mato Grosso do Sul, sobretudo do Pantanal, como A. totai, em geral, com estipe liso e frutos pequenos, e A. aculeata, com a maior distribuição pelo país, ocorrendo em maiores densidades no estado de Minas Gerais, reconhecida principalmente pelo estipe coberto por espinhos e/ou pelos remanescentes da bainha das folhas já caídas, e também por apresentarem frutos maiores e maior teor de óleo, podendo ultrapassar os 70%.

Segundo Henderson et al. (1995), botânicos especialistas na classificação de palmeiras, existem apenas duas espécies para o gênero: A. aculeata (Jacq.) Lodd. ex Mart., de porte arbóreo, amplamente distribuída pelas Américas e a espécie A. hassleri (Barb. Rodr.) W.J. Hahn, espécie acaulescente restrita à parte do Cerrado do Brasil e Paraguai. No entanto, referências mais recentes aceitam um maior número de espécies para o gênero. Lorenzi et al. (2010), botânicos, sendo Kahn e Noblick botânicos de palmeiras, reconhecem a existência de cinco espécies além das duas descritas anteriormente, citando também a existência de A. emensis (Toledo) Lorenzi, espécie acaulescente, distribuída em áreas de Cerrado do Brasil, nos estados de São Paulo, Minas Gerais, Goiás, Paraná e Mato Grosso do Sul; A. glaucescens Lorenzi, espécie anã com distribuição em áreas de Cerrado

2 sobre solos arenosos nos estados de Mato Grosso e Goiás; A. intumescens Drude, de porte arbóreo, ocorrendo em parte do Nordeste; A. totai Mart., de porte arbóreo, com distribuição somente no estado de Mato Grosso do Sul e A. crispa (Kunth) C.F. Baker ex Becc., de porte arbóreo, endêmica de Cuba. O site The Plant List (2013), que lista todas as espécies de plantas conhecidas mundialmente, além das espécies citadas anteriormente, aceita a existência da espécie Acrocomia media O.F. Cook, de porte arbóreo, endêmica de Porto Rico e das Ilhas Virgens, somando assim um total de oito espécies atualmente reconhecidas para o gênero. As demais encontradas, a exemplo de A. sclerocarpa, são consideradas como sinonímias das espécies aceitas.

Embora com grande diversidade e potencialidade de usos, sobretudo para extração de óleo, foi constatada a falta de estudos com o gênero Acrocomia que possam subsidiar sua exploração sustentável para gerar benefícios de ordem social, econômica e ecológica para as comunidades envolvidas no seu extrativismo e para grandes proprietários que tenham interesse no seu plantio em escala comercial. A utilização das espécies de Acrocomia, qualquer seja sua finalidade, depende da sua domesticação da espécie para que se possa aumentar a produtividade, manter oferta do produto no mercado e obter produto final padronizado e de qualidade. Para tal, pesquisas nas diversas áreas do conhecimento, sobretudo da diversidade morfológica e genética das espécies são necessárias.

Sabendo da grande variação morfológica existente, principalmente entre populações de diferentes locais e da falta de consenso sobre o número de espécies de Acrocomia, neste estudo serão analisados os caracteres morfológicos e anatômicos de sete espécies do gênero a fim de subsidiar conhecimentos úteis à caracterização e identificação destas, a possibilidade dos frutos das outras espécies do gênero também serem úteis à produção de óleo, tal como A. aculeata, e o estudo da diversidade genética entre indivíduos provenientes de diferentes locais de sua área de ocorrência e das diferentes espécies.

2 REVISÃO DE LITERATURA

As palmeiras têm a maior diversidade morfológica dentro do grupo das monocotiledôneas, pertencentes às Arecaceae (antiga Palmae), sendo representadas atualmente por cerca de 2.700 espécies distribuídas em mais de 240 gêneros (Lorenzi et al. 2010, APG IV 2016). São as plantas mais características da flora tropical, constituindo um dos grupos ecologicamente mais importantes dentre as plantas, tendo praticamente todas as partes aproveitadas, desde para alimentação até o uso medicinal, com grande importância econômica pela variedade de aplicações e produtos obtidos, fornecendo recursos em abundância para muitos povos (Uhl & Dransfield 1987, Balick & Beck 1990, Ellison 2001).

Dentre as diversas palmeiras existentes, destacamos as espécies do gênero Acrocomia que se encontram distribuídas naturalmente em quase todo o território brasileiro e apresentam grande potencial econômico, sendo utilizadas como alimento para produção de cosméticos, de biocombustível e outros.

2.1 Aspectos taxonômicos, botânicos e área de ocorrência de Acrocomia spp.

O nome Acrocomia é de origem grega: akros – alto e kome – cabeleira, o que sugere a disposição das folhas na palmeira. O gênero pertence à subfamília Arecoideae, Tribo Cocoeae e Subtribo Bactridinae, a última sendo representada por gêneros de palmeiras espinescentes (Acrocomia, Aiphanes, Astrocaryum, Bactris e Desmoncus) com distribuição restrita às Américas, particularmente na América do Sul (Dransfield et al. 2008).

O gênero monotípico (na época) foi descrito por Martius em 1824, utilizando como espécie tipo Acrocomia sclerocarpa, chamada até então de Cocos aculeata, descrita inicialmente por Jacquin em 1763. Posteriormente, Bailey (1858-1954) publicou diversos trabalhos sobre Acrocomia, descrevendo várias espécies do gênero, aparentemente diferenciadas por seu local de ocorrência como se fossem endêmicas de cada região. Para Bailey existiam 29 espécies de Acrocomia distribuídas principalmente nos países da América Central (Tabela 01). No entanto, deve-se considerar que as descrições de todas as novas espécies do gênero realizadas por Bailey eram breves e vagas sem discussões sobre

4 as diferenças entre tais (Boer 1965). Outras espécies de Acrocomia foram descritas posteriormente em diferentes países das Américas (Tabela 01).

Acanthococos foi estabelecido por Barbosa Rodrigues em 1900 partir da espécie Acanthococos hassleri, proveniente da região central do Brasil. Em 1952, Toledo descreve uma nova espécie, então denominada como Acanthococos emensis. No ano de 1991, Acanthococos hassleri é transferida para Acrocomia hassleri e Acanthococos colocada como sinonímia de Acrocomia hassleri. No ano de 2010, Lorenzi et al. sugerem a revalidação do nome Acanthococos emensis e sua transferência para o gênero Acrocomia sob o nome de Acrocomia emensis, por se tratarem de espécies morfologicamente diferentes.

Tabela 01. Lista de espécies de Acrocomia.

Espécie Ano Local tipo descrição A. antiguana L.H. Bailey 1949 Antigua A. antioquensis Posada-Arango 1878 Colômbia A. armentalis (Morales) L.H. Bailey & E.Z. 1941 Cuba Bailey A. barrigae H. Cuadros 1984 Colômbia A. belizensis L.H. Bailey 1941 Belize A. christopherensis L.H. Bailey 1949 São Cristovão e Nevis A. chunta Covas & Ragonese 1941 Argentina A. crispa (Kunth) C.F. Baker ex Becc. 1912 Cuba A. cubensis Lodd. ex H. Wendl. Prov. Cuba A. emensis (Toledo) Lorenzi 2010 Brasil A. erioacantha Barb. Rodr. 1902 Brasil, RJ A. fusiformis (Sw.) Sweet 1826 Jamaica A. glaucescens Lorenzi 2009 Brasil A. glaucophylla Drude 1895 Brasil, DF A. globosa Lodd. ex Mart. 1896 Antilhas A. grenadana L.H. Bailey 1949 Granada A. hassleri (Barb. Rodr.) W.J. Hahn 1991 Brasil

A. horrida Lodd. ex Mart. 1896 Haiti A. hospes L.H. Bailey 1941 Estados Unidos A. ierensis L.H. Bailey 1941 Trinidad & Tobago A. intumescens Drude 1895 Brasil A. karukerana L.H. Bailey 1941 Guadalupe A. lasiospatha Mart. 1847 Brasil A. media O.F. Cook 1901 Porto Rico A. mexicana Karw. ex Mart. 1845 México A. microcarpa Barb. Rodr. 1891 Brasil A. minor Lodd. ex G. Don 1830 Trinidad A. mokayayba Barb. Rodr. - Brasil A. odorata Barb. Rodr. 1898 Brasil A. panamensis L.H. Bailey 1941 Panamá A. pilosa León 1940 Cuba A. quisqueyana L.H. Bailey 1941 Haiti *A. sclerocarpa Mart. 1824 Brasil A. sphaerocarpa Desf. 1829 América do Sul A. spinosa (Mill.) H.E. Moore 1963 América do Sul A. subinermis León ex L.H. Bailey 1941 Cuba A. tenuifrons Lodd. ex Mart. 1896 Haiti A. totai Mart. 1844 Argentina, Bolívia A. ulei Dammer 1915 - A. viegasii L.H. Bailey 1949 Brasil, SP A. vinifera Oerst. 1859 Costa Rica, Nicarágua A. wallaceana (Drude) Becc. 1912 Brasil A. zapotecis Karw. ex H. Wendl. 1878 Prov. México Fonte: The Plant List 2013, * Nomen illegitimum

O gênero Acrocomia é representado por espécies americanas e o seu número não é bem resolvido taxonomicamente. Provavelmente existe um número menor de espécies do que todas as descritas, conforme demonstrado listado na Tabela 01 (Dransfield et al. 2008). Para Henderson et al. (1995), existem apenas duas espécies do gênero: A. aculeata. e A. hassleri, a primeira de grande porte, amplamente distribuída ao longo das Américas

Central e do Sul, e a segunda, pequena, restrita a áreas do Cerrado do Brasil e parte do Paraguai. Já para Lorenzi et al. (2010), existem sete espécies no gênero Acrocomia, seis ocorrendo no Brasil: A. aculeata, A. intumescens e A. totai de porte arbóreo, diferenciadas principalmente pelas características do estipe, e A. hassleri, A. glaucescens, A. emensis de baixo porte, sendo diferenciadas principalmente pela altura da planta (0,3-0,4 /1,5-6,5 /0,4- 0,6 m, respectivamente). The Plant List (2013) considera a existência das sete espécies aceitas por Lorenzi et al. (2010) mais a espécie Acrocomia media com ocorrência apenas em Porto Rico e nas Ilhas Virgens (Figura 01).

At Ai

Ag Aa

Ah Ae

Figura 01. Distribuição das espécies de A. nos diferentes biomas das Américas: A. aculeata (Aa), A. crispa (Ac), A. emensis (Ae), A. glaucescens (Ag), A. hassleri (Ah), A. intumescens (Ai), A. media (Am), A. totai (At).

2.1.1 Acrocomia aculeata

Acrocomia aculeata é a espécie de maior expressão econômica do gênero. É uma palmeira nativa da América tropical e subtropical, que ocorre do México e Antilhas até ao Paraguai e Argentina (Henderson et al. 1995). No Brasil é considerada como a palmeira de maior dispersão, com ocorrência de povoamentos naturais em quase todo o território nacional, sendo encontrada em maiores concentrações nos estados de Minas Gerais e São Paulo.

De acordo com The Plant List (2013), Acrocomia aculeata possui 44 sinônimos, incluindo espécies de outros gêneros: Astrocaryum sclerocarpum H. Wendl, Bactris globosa Gaertn., Bactris minor Gaertn. (ilegítimo), Bactris pavoniana Mart., Cocos aculeata Jacq., Cocos fusiformis Sw., Palma mocaia Aubl., Palma spinosa Mill.

Por ser a espécie do gênero com maior distribuição ao longo da Américas, A. aculeata é conhecida em cada localidade por um ou mais nomes populares: cocoyol, coquito baboso, palma de coyol (México); cocoyal, coyol, coyoli palm, grugru palm, suppa palm (Belize); butter tree, grugru acrocomia, gru-gru palm, macaw palm, macaya oil, Paraguay palm (Pequenas Antilhas); coco guineé, corosse (Haiti), dinde, glou glou, glouglou, palmier glouglou (Dominica e Martinica); grougron (Barbados e São Vicente); palmiste épineux (Martinica); catey, corozo criollo (República Dominicana); grugru palm, prikcly palm, corozo (Puerto Rico); noix-dindé, palmier dindé (Guadalupe); maccafat, grugru palm (Jamaica); winepalm acrocomia, coyol (Costa Rica); coyol (Honduras e Panamá); corozo redondo, chicle monposino, tamaca (Colômbia); amankayo, tucuma, corozo de vino (Venezuela); corojo (Cuba); moucaya, noix de coyol (Guiana Francesa); palm bong (Suriname); totaí, totaí barrigudo, mbocayá, cayará (Bolívia); cayete, ocori coquito (Argentina e Paraguai); (Boer, 1965; Moraes, 2004; Grandtner, 2005). No Brasil, é conhecida por vários nomes, tais como: macaúba, macaúva, coco-de-catarro, macaibeira, mucajá, mucaia, chiclete-de-baiano (Lorenzi et al. 2010).

A macaúba é perenifólia, heliófita, ocorrendo em maiores densidades em áreas abertas, associadas a áreas de pastagem, também ocorrendo em florestas semideciduais e em locais com afloramentos rochosos. Embora seja comum sua ocorrência em áreas de Cerrado, indivíduos da espécie já foram observados ocorrendo naturalmente em áreas de Mata Atlântica, Cocais e Caatinga, em áreas altas e ao nível do mar (Vianna & Colombo 2013). A espécie é altamente resistente ao fogo e à seca (FAO 1986). Apresenta

8 aproximadamente 4 a 15m de altura, glabra, salvo a face dorsal dos folíolos glauco- tomentosos, estipe cilíndrico fusiforme, densamente aculeado e anelado. Possui 20 a 40 folhas aglomeradas no ápice do estipe, compostas pinadas, com 4 a 5 m de comprimento, crespas, pecioladas; folíolos alternos desigualmente distribuídos ao longo da raque, que pode conter numerosos espinhos. Inflorescências interfoliares e ramificadas, raque longa com vários ramos de igual tamanho, multifloros. Flores pistiladas na base das ráquilas, sempre formando tríades e flores estaminadas em grande número no ápice. Fruto drupa com 3,0 a 5,0 cm de diâmetro, globoso, epicarpo cartáceo; com coloração variada; mesocarpo, fibroso, mucilaginoso de coloração variada, de sabor adocicado; endocarpo ósseo fortemente aderido ao mesocarpo; semente com grande quantidade de endosperma, adnata ao endocarpo, podendo ocorrer até quatro sementes por fruto (Henderson et al. 1995, Lorenzi et al. 2010) (Figura 02). Segundo Moura (2007), o embrião apresenta forma de clava e encontra-se aderido ao endosperma.

a. b c. d

a f.

Fotos (g, h): Modificadas de Luiz H.C. Berton. Figura 02. Acrocomia aculeata: a Palmeira, b Estipe, c Infrutescências, d Flor estaminada, e Flor pistilada, f Frutos com diferentes números de sementes, g Cores epicarpo, h Cores mesocarpo.

Embora seja comum a ocorrência de protoginia, com flores pistiladas se tornando maduras antes das flores estaminadas, provavelmente como forma de evitar a autogamia, em algumas inflorescências ocorre sobreposição da maturação das flores pistiladas e estaminadas, o que caracteriza o sistema de reprodução misto da macaúba (Scariot et al. 1991). Nos locais onde as populações estão muito fragmentadas ou isoladas, ocorre maior taxa de endogamia, confirmando que a planta é monóica, autocompatível, e realiza autofecundação e ou cruzamento entre indivíduos aparentados; onde as populações estão menos isoladas ocorre menos endogamia, prevalecendo fecundação cruzada entre indivíduos diferentes, o que favorece o fluxo gênico e, consequentemente, o aumento da variabilidade genética da população (Cargnin et al. 2008). Com uso de marcadores microssatélites, Abreu et al. (2012) detectaram a ocorrência de 50% de cruzamentos em populações de A. aculeata oriundas do estado de São Paulo.

A polinização é realizada por coleópteros Curculionidae, Nitidulidae e Scarabaeidae, com polinização pelo vento ocorrendo em menores taxas (Scariot et al. 1991). A dispersão é realizada por animais selvagens, tais como o gambá, pequenos roedores, macacos e algumas espécies de aves como o sabiá e também por animais domésticos tais como bois, cavalos e porcos (Scariot 1998).

Devido à ampla distribuição geográfica, a fenologia da espécie varia de acordo com a região. Em geral, floresce e frutifica o ano todo, com maior intensidade na época chuvosa, ocorrendo a primeira frutificação em torno do quarto ou quinto ano após a germinação (Almeida et al. 1998). Segundo Scariot (1995), o número de frutos é resultante da taxa de pegamento das flores que em geral fica entre 25,4% e 28,9%, sendo influenciada, provavelmente, pela frequência da polinização.

2.1.2 Acrocomia crispa

A espécie cubana Acrocomia crispa possui cinco sinônimos: Acrocomia armentalis (Morales) L.H. Bailey & E.Z. Bailey, Astrocaryum crispum (Kunth) M. Gómez, Cocos crispa Kunth, Gastrococos armentalis Morales, Gastrococos crispa (Kunth) H.E. Moore. Popularmente é conhecida regionalmente como corozo, cuban belly palm, palmera barrigona cubana (Dransfield et al. 2008, The Plant List 2013).

A palmeira apresenta entre 5 e 7 metros de altura com estipe fino na base e mais grosso próximo à copa. O estipe é solitário, anelado coberto por espinhos grandes e de

10 coloração castanho-escuro. As folhas são verde-acinzentadas com espinhos brancos. A maior diferença entre A. aculeata e A. crispa se encontra no grau de adesão das sépalas das flores femininas e masculinas. Os frutos são globosos com 2 a 3 cm de diâmetro, uma única semente mais ou menos globosa, epicarpo e o mesocarpo de coloração amarelada ou alaranjada (Henderson et al. 1995). A espécie é endêmica de Cuba, ocorrendo normalmente em áreas com solos calcários por toda a ilha (Henderson et al. 1995, Dransfield et al. 2008) (Figura 03).

a b d

Foto: (d) Tracy Magellan (Researcher in Montgomery Botanical Center). Figura 03. Acrocomia crispa: a Palmeira, b Estipe, c Espinhos na raque foliar, d Infrutescências, e Frutos.

2.1.3 Acrocomia emensis

Planta subarbustiva, terrícola, geófita, acaulescente, muito espinescente, com 40 a 60 cm de altura, rizoma subterrâneo alongado às vezes coberto por alguns espinhos, folhas pinadas e arqueadas com sua base fixada no rizoma emergindo ao nível do solo com alguns espinhos marron-avermelhados e brilhantes, folíolos irregularmente distribuídos e dispostos em vários planos. Inflorescências tríades e flores estaminadas nos dois terços superiores imersas em alvéolos. Frutos globosos, pequenos com epicarpo coriáceo (Lorenzi et al. 2010, Leitman et al. 2015) (Figura 04).

a b

c d e

Fotos (c, d, e) Lorenzi et al. (2010) – Quadriculado foto e = 1 cm. Figura 04. Acrocomia emensis: a Palmeira, b Estipe, c Espinhos na raque foliar, d Infrutescências, e Frutos.

A espécie possui duas sinonímias: Acanthococos emensis e Acanthococos emensis var. pubifolia (The Plant List 2013). É conhecida popularmente como tucum-rasteiro, considerada rara, ocorrendo somente no Brasil, em áreas de Cerrado, nos estados de Goiás, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais, São Paulo e Paraná. Embora esteja bem distribuída geograficamente, devido à expansão das áreas destinadas à produção agropecuária, é considerada pelo Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA) como espécie em risco de extinção (Brasil 2015) e pela Lista Vermelha da Flora do Estado de São Paulo como espécie vulnerável (SMA-SP 2016). Na área onde ocorre em maior densidade, no município de Mogi Guaçu, SP, floresce no mês de outubro e apresenta frutos maduros no início do verão (Mantovani & Martins 1993, Lorenzi et al. 2010).

2.1.4 Acrocomia glaucescens

Palmeira espinescente, muito variável ao longo de sua área de distribuição quanto à altura, número e tamanho dos seus órgãos. Estipe cilíndrico ou irregular, frequentemente engrossado na parte mediana, folhas glaucas, bainha revestida de tomento aveludado de cor marrom com esparsos espinhos negros. Seu centro de endemismo parece ser a região do extremo sul do estado de Mato Grosso (Lorenzi et al. 2010) (Figura 05).

a b c. d

e f.

Figura 05. Acrocomia glaucescens: a Palmeira, b Estipe, c Folha, d Flor estaminada, e Flor pistilada, f Infrutescência.

2.1.5 Acrocomia hassleri

Espécie subarbustiva, terrícola, acaule, solitária, de 30 a 40 cm de altura, heliófila, levemente espinescente, rizoma com cerca de 30 cm abaixo da superfície, 4 a 7 folhas contemporâneas, pinadas, glaucas, espinescentes, folíolos entre 8 a 19 distribuídos regularmente em dois planos distintos formando um “V”. Inflorescências ramificadas, ocorrendo ao nível do solo ou pouco acima, curtas, com somente 3 a 5 ráquilas de 5 a 8 cm de comprimento. Frutos pequenos, medindo entre 1,6 a 2,0 cm. (Leitman et al. 2015, Lorenzi et al. 2010) (Figura 06).

a b d

c. e

Fotos: (b) http://www.plantillustrations.org/illustration.php?id_illustration=59652; (c, e) Lorenzi et al. (2010); (d) Emerson Rog, Disponível em: http://www.pacsoa.org.au/wiki/Acrocomia_hassleri. Quadriculado foto e = 1 cm.

Figura 06. Acrocomia hassleri: a Palmeira, b Rizoma, c Inflorescências, d Inflorescência em detalhe, e Infrutescência e frutos.

A espécie ocorre no Mato Grosso do Sul na região de fronteira com o Paraguai em cerrado aberto sobre solos arenosos (Lorenzi et al. 2010). No entanto, de acordo com Muller et al. (2003), a espécie também ocorre no Parque Estadual do Jalapão em Palmas, TO, estando as maiores populações associadas ao Cerrado, sobretudo, em áreas de campo sujo. Também há registro de ocorrência de populações da espécie no município de Mucugê, BA (Juncá et al. 2005). A espécie está em perigo de extinção de acordo com Lista vermelha da flora do estado de São Paulo no ano de 2016 (SMA-SP 2016).

2.1.6 Acrocomia intumescens

Palmeira com até 8 m de altura, sempre com estipe intumescido no terço médio, folhas pinadas, com folíolos dispostos em intervalos regulares ou agrupados em vários planos de inserção, bainha e pecíolo coberto por espinhos retos e negros. Inflorescências ramificadas, flores pistiladas na base das ráquilas formando tríades e flores estaminadas

14 imersas em alvéolos profundos nos dois terços superiores das ráquilas. Frutos de formato globoso a subgloboso com 3,7 a 5,5 de comprimento e 3,8 a 5,4 de largura, epicarpo lenhoso, coberto por tomento castanho ou levemente papiloso, brilhante na maturidade (Lorenzi et al. 2010) (Figura 07).

a b d e

c f

Figura 07. Acrocomia intumescens: a Palmeira, b Estipe, c Infrutescência, d Flor estaminada, e Flor pistilada, f Frutos, g Frutos com uma, duas e três sementes.

A espécie A. intumescens é endêmica da região nordeste do Brasil, ocorrendo principalmente em áreas de Mata Atlântica e dos chamados brejos de altitude (Paula, 1983; Lorenzi et al. 2010).

2.1.7 Acrocomia media

Palmeira com 8 a 10 m de altura, podendo chegar a 15 m, estipe solitário, cilíndrico ou ligeiramente fusiforme, densamente armado com longos espinhos negros, que podem cair deixando somente as cicatrizes da folha. Folhas numerosas, pecíolo curto, densamente espinescente com 3 a 4 m de comprimento, 45 a 60 folíolos medindo 55 a 70 de comprimento por 0,6 a 2 cm de largura, acuminado ou atenuado no vértice. Espata com até

60 cm de comprimento; densamente pubescente, marrom, com presença de alguns espinhos na superfície exterior. Inflorescência com cerca de 1,5 m de comprimento, pedúnculo curto e grosso, densamente espinescente. Ráquilas com 10 a 25 cm de comprimento, estando na parte basal as flores pistiladas e nos dois terços correspondentes a parte apical as flores estaminadas. As flores estaminadas medem cerca de 8 mm de comprimento, de cor amarelo pálido; as flores femininas são globosas com cerca de 10 mm de comprimento. Frutos globosos, levemente achatados nos pólos, medindo 3,5 a 4,5 cm de diâmetro; epicarpo liso, sem brilho, amarelado quando maduro. Acrocomia media difere de A. aculeata pela menor altura da planta, maior comprimento das folhas, folíolos mais curtos e espata menor. Também há diferenças no comprimento dos espinhos e no tipo de indumento (Proctor 2005) (Figura 08).

a b c

Fotos: Cailan Ramos. Disponível em http://www.pacsoa.org.au/wiki/Acrocomia_media

Figura 08. Acrocomia media: a Palmeira, b Infrutescência, c Estipe, d Fruto.

A espécie é endêmica de Porto Rico e das Ilhas Virgens, ocorrendo em solos secos a moderadamente úmidos em altitudes inferiores a 200 m. A palmeira é conhecida localmente como coroso ou palma de coroso (Proctor 2005).

Acrocomia media foi colocada como sinônimo de A. aculeata por Britton & P. Wilson no ano de 1923. No entanto, em 2012 foi reconhecida como espécie distinta de A. aculeata (The Plant List 2013).

2.1.8 Acrocomia totai

Palmeira com até 15 m de altura, estipe cilíndrico, liso com discreto anelamento, com espinhos castanho-escuros nas plantas jovens, desprovido dos remanescentes da bainha foliar. Folhas cobertas por espinhos em quase todas suas partes, apresentando abscisão nítida, folíolos irregularmente distribuídos e inseridos em planos diferentes, às vezes formando agrupamentos de 2 a 3 folíolos ao longo da raque. Inflorescência interfoliar, flores pistiladas somente na base das ráquilas, sempre formando tríades, os dois terços superiores somente com flores estaminadas. Frutos globosos, medindo de 2,5 a 3,5 cm de diâmetro, epicarpo castanho-amarelado e mesocarpo fibro-mucilaginoso (Lorenzi et al. 2010) (Figura 09).

a b d e

c f.

Figura 09. Acrocomia totai: a Palmeira, b Estipe, c Infrutescências, d Flores estaminadas, e Tríade de flores, f Frutos com diferentes cores epicarpo, g Cores mesocarpo.

Segundo Lorenzi et al. (2010), A. totai ocorre no sul de Mato Grosso do Sul, extremo oeste do Paraná e noroeste do Rio Grande do Sul, preferindo terrenos temporariamente alagados de várzeas úmidas, ocorrendo às vezes em áreas mais secas. Pelas descrições reportadas de Acrocomia da Bolívia e Argentina, acredita-se tratar da mesma espécie.

A dispersão é realizada por animais selvagens tais como as diferentes espécies de araras, cachorro-do-mato, anta, ema e outros (Pott & Pott 1994, Scariot 1998). A dispersão também é realizada por animais domésticos, principalmente pelo gado.

2.2 Utilização de Acrocomia spp.

Desde a antiguidade até os dias atuais, diversos povos utilizam as espécies de Acrocomia como recurso de subsistência. Morcote-Ríos & Bernal (2001), estudando arqueologia de palmeiras desde a região sul dos Estados Unidos até o sul do Uruguai, encontraram diversos vestígios no México e nos países das Américas Central e do Sul de Acrocomia spp., tendo sido o vestígio mais antigo, de endocarpos carbonizados, encontrado em um sítio arqueológico no estado do Pará, datando entre 11.200 – 9.200 a.C. Segundo os mesmos autores, as espécies eram utilizadas por apresentar frutos que podiam ser consumidos frescos, ter seu óleo extraído de maneira rápida e sem grandes complicações, ter uma casca que oferece ótima proteção à polpa e também pode ser facilmente retirada quando necessário e, o fator chave para os povos antigos, ter frutos que não fermentavam rapidamente, permitindo assim seu consumo durante um período de várias semanas. As características dos frutos de Acrocomia spp., configuravam assim, numa boa escolha de alimento durante as migrações. Lentz (1990) encontrou diversas evidências arqueobotânicas do uso dos frutos de Acrocomia pelos povos pré-colombianos no México e Panamá e evidências de que tais palmeiras foram disseminadas pelas migrações e seu cultivo por esses povos.

Atualmente, as espécies de Acrocomia são utilizadas para diversos fins (Tabela 02). As palmeiras apresentam potencial ornamental e em alguns locais já são utilizadas para tal fim, a exemplo da espécie A. intumescens muito utilizada no estado do Pernambuco em praças, passeios públicos e jardins particulares (Lima 1994, Moraes 2004, Silva 2012).

Tabela 02. Resumo dos usos das espécies de Acrocomia spp.

Parte da planta Forma de uso Categoria de uso Aplicação Palmeira Inteira Ornamental Passeios públicos, praças e outros Raiz Inteira Medicinal Contra diabetes, hepatite, icterícia Estipe Madeira Construção Ripas, calhas, mourões Fécula Alimentação Licor da fécula, humana pães, bolos Seiva Alimentação Bebida fermentada humana alcoólica, mel Medicinal Aumento fertilidade feminina Espinho Artesanato Agulha Meristema Alimentação Palmito apical humana Folha Fibra Artesanato Redes, linha de pesca, cestaria Inteira Alimentação animal Forragem Espata Artesanato Cesta, luminária Fruto Casca Alimentação animal Polpa Alimentação Fruto fresco, humana processado, óleo Medicinal Xarope, mel, tônico Alimentação animal Ração (torta) Óleo da polpa Indústria Biocombustível, saboaria Endocarpo Artesanato Bijuteria Carvão Construção civil Substituto à pedra brita Amêndoa Alimentação Fresca, torrada,

humana azeite Medicinal Emoliente Indústria Óleo comestível de boa qualidade, cosméticos, saboaria

A raiz em infusão é utilizada contra diabetes no México (Hernández et al. 2011), contra icterícia por caboclos no Amazonas (Amorozo & Gély 1988) e contra hepatite na Bolívia (Moraes 2004). Na Bolívia as raízes também são utilizadas para o processamento como farinha para o preparo de pães e bolos e licor (op. cit.).

O estipe é utilizado como calha, mourão ou ripas para a construção de cercas ou casas. Nos países da América Central é comum a utilização da seiva do estipe, que passa por processo de fermentação para fabricação de uma bebida alcoólica conhecida como “vinho de coyol” (Balick 1984, Lentz 1990). Na Costa Rica, diversas famílias tem como fonte de renda a extração da seiva e fabricação do “viño de coyol”, bebida tradicional da região (Bran 2013), sendo encontrada até enlatada (Figura 10). No México é produzido um licor chamado Taberna (Hernández et al. 2011). No Brasil a bebida é conhecida como chichá, e, se fervida gera um excelente mel (Corrêa 1984). A bebida produzida a partir do estipe é utilizada medicinalmente na Venezuela para aumentar a fertilidade feminina (Plotkin & Balick 1984). Os espinhos do estipe são usados pelas rendeiras como alfinetes (Almeida et al. 1998).

a b c

d e f g

Fonte: Bran, 2013. Figura 10. “Viño de Coyol”: a Corte do estipe para retirada da seiva, b Seiva, c Extração da seiva, d Fabricação do “viño de coyol”, e Venda do produto, f Engarrafamento artesanal, g Bebida industrializada na Costa Rica.

As folhas são utilizadas na cobertura de casas ou como matéria-prima para a obtenção de fibras destinadas à produção de linhas, cordas e redes. As folhas também são utilizadas como forragem (Moraes 2004). Segundo Pott (1986), as folhas possuem um teor de proteína bruta relativamente alta, o que explica sua utilização por moradores do Pantanal sul-matogrossense para alimentação de equinos e vacas de leite, em função da resposta em ganho de peso, aumento na produção de leite e melhoria no aspecto geral dos animais. O pecíolo das folhas é empregado para confecção de artesanatos diversos, tais como chapéus e cestos. O palmito é adocicado e pode ser consumido cru ou cozido (Moraes 2004, Damasceno Jr & Souza 2010).

A polpa dos frutos pode ser consumida fresca ou processada como farinha, sorvete, bolos e biscoitos, sendo ricos nutricionalmente, constituindo-se assim numa boa alternativa ao enriquecimento da alimentação humana. Medicinalmente, há relatos de que no Brasil a polpa é usada como fortificante e o óleo da polpa como analgésico (Ramos et al. 2008; Hernández et al. 2011). A concentração de óleo na polpa pode passar dos 70%, sendo rica em ácido oléico, interessante para produção de biodiesel e também na indústria de sabão. A espécie A. aculeata apresenta entre 33 a 78% de óleo na polpa seca (Conceição et al. 2012, Berton 2013, Lira et al. 2013), A. crispa possui 10 a 40% (Canavaciolo et al. 2013, Sierra-

Pérez et al. 2014). Acrocomia intumescens com 34 a 41% (Bora & Rocha, 2004; Conceição et al. 2012) e A. totai entre 26 e 33% (Hiane et al. 2005, Vianna et al. 2015). Araújo et al. (2014) estudou o óleo da espécie A. emensis, descobrindo que esta possui óleo de qualidade para produção de biocombustíveis (Figura 11).

a b c d

e f g h

i j k l

Figura 11. Usos dos frutos de Acrocomia spp.: a Polpa desidratada ao sol, b Fabricação de farinha, c Bolo, d Picolé, e Óleo da amêndoa e da polpa, f Sabão, g Óleo da amêndoa para consumo humano, h Cosméticos, i Frutos frescos, j Polpa fatiada, k Mel com polpa, l Xarope à base da polpa.

A torta resultante do processamento dos frutos pode ser empregada para alimentação animal, incluindo suínos, caprinos (Rufino et al. 2011), ovinos (Brandão 2013) e ruminantes em geral, especialmente para animais em crescimento, devido ao alto teor de fibras e energia na matéria seca (Barreto 2008). Também é comum o consumo de frutos frescos pelo gado bovino e suíno e, o consumo das folhas frescas pelo gado bovino e por equinos.

O endocarpo tem sido utilizado para produção de pequenos objetos artesanais, como bijuterias (Corrêa 1984), na construção civil como substituto da pedra brita ou para

22 produção de carvão de qualidade devido à alta densidade e poder calorífico que possui (Toledo 2010) gerando até 357 kg de carvão, 195 kg de alcatrão e 350 kg de pirolenhoso a cada tonelada de endocarpo carbonizado (Carvalho et al. 2011).

O endosperma (amêndoa) produz óleo de ótima qualidade, equivalente ao azeite de oliva, podendo ser utilizado tanto na alimentação humana como pela indústria de cosméticos, ceras e outros. O farelo da amêndoa, subproduto da extração do óleo, pode ser empregado na composição de rações animais, devido seu alto teor de proteína ou na alimentação humana na forma de doce tipo cocada ou consumidas torradas. O óleo da amêndoa em alguns locais no Brasil é utilizado como laxante; nas Antilhas, como emoliente e para o tratamento de doenças das articulações e, no México, contra vermes intestinais (Roig & Mesa 1945, Hernández et al. 2011). A amêndoa contém mais de 50% de óleo, sendo rico em ácido láurico, utilizado principalmente para fabricação de cosméticos e outros produtos de saponificação. Acrocomia aculeata possui entre 43 e 61% de óleo na amêndoa, A. intumescens entre 47 e 49% e A. totai entre 46 e 58% (Bora & Rocha 2004, Hiane et al. 2005, Conceição et al. 2012, Berton 2013, Lira et al. 2013).

A viabilidade do aproveitamento das espécies de Acrocomia é muito promissora tanto para extrativistas ou para pequenos e grandes agricultores já que diversos produtos podem ser gerados a partir destas palmeiras, visando o setor agroindustrial, mantendo a sustentabilidade do negócio. Segundo Poestch et al. (2012), a diversificação de produtos e ou negócios constitui uma característica importante para investidores a fim de diminuir o risco. Considerando, por exemplo, uma indústria que tenha como principal negócio a extração de óleo, diversos subprodutos são gerados, sendo que para todos os produtos e subprodutos já existem mercados locais ou internacionais estabelecidos (Figura 12).

Adaptado: Poestch et al. (2012). Figura 12. Processamento, frações de rendimento, usos e aplicações de produtos e subprodutos de Acrocomia spp. (considerando cerca de 5% de perda durante o processamento).

Além da utilização humana, as espécies de Acrocomia são consideradas importantes do ponto de vista ecológico, pois servem como recurso alimentar para diferentes espécies animais integrando, por exemplo, a dieta de araras, capivaras, antas, emas, os quais são os dispersores das sementes (Pott & Pott 1994); como também coloniza

áreas degradadas em favor da sua recuperação, além de imobilizar CO2 atmosférico, minimizando, assim, os impactos negativos causados pela emissão de gases (Cargnin et al. 2008, Ferreira et al. 2013).

2.2.1 Biocombustíveis

A maior parte da energia consumida no mundo provém de petróleo, carvão e gás natural, que são fontes limitadas e com previsões para o término de suas reservas, tornando-se essencial a busca por novas fontes de energia, renováveis e ecologicamente corretas (Trzeciak et al. 2008). A grande necessidade energética tem estimulado governos de vários países a um crescente uso e busca por novas fontes de biomassa vegetal para produção de energia. A produção de biocombustíveis derivados de fontes naturais e renováveis como os vegetais, além de suprirem a necessidade energética são melhores ao

24 meio ambiente, já que por sua utilização pode haver redução em até 78% das emissões poluentes de gás carbônico e de até 90% nas emissões de fumaça além de praticamente eliminar as emissões de óxido de enxofre (Nobre 2014).

Embora existam diversos tipos de bicombustíveis, somente o biodiesel e o etanol têm destaque em termos de volume de produção e consumo. O biodiesel é um combustível derivado de matérias-primas renováveis, como óleos vegetais, gorduras animais e efluentes pecuários, podendo ser obtido por diferentes processos tais como o craqueamento, a esterificação ou pela transesterificação. É biodegradável, não tóxico e emite baixo nível de monóxido de carbono para a atmosfera (MME 2015). O etanol também é derivado de biomassa, no entanto, de matérias-primas ricas em açúcares ou amido, tais como a cana-de- açúcar, cereais, beterraba e a fração biodegradável dos resíduos (Caseiro 2011).

A Agência Internacional de Energia (2008) alerta para o grande aumento na procura por biocombustíveis durante as próximas décadas, sobretudo nas regiões em desenvolvimento, a exemplo dos países do leste europeu e da Ásia, além do aumento pela procura do produto pelos países que atualmente já são os maiores consumidores de biocombustíveis no mundo, os países da América do Norte e da União Européia. Segundo Caseiro (2011), é previsto que os biocombustíveis em 2030 passem a representar 5% do total de combustíveis utilizados no transporte rodoviário, passando a sua procura de 24,4 Mtep em 2006, para 73,5 Mtep em 2015, e 118,5 Mtep em 2030, a um ritmo de crescimento médio anual de 6,8% (Figura 13).

Fonte: Caseiro (2011).

Figura 13. Previsão de consumo mundial de biocombustíveis por tipo entre 2006 e 2030.

No entanto, a demanda crescente por biocombustíveis gera a preocupação de sua produção de maneira sustentável. Embora apresente várias vantagens sobre os combustíveis de origem fóssil (Figura 14), alguns problemas existem e devem ser discutidos, dentre estes, a segurança alimentar. Atualmente, a maior parte da produção de matérias-primas para fins energéticos competem diretamente com a produção de alimentos, fibras e madeira pela utilização de espaço e recursos naturais, como também resultou no aumento dos preços das sementes, nos custos das rações animais e nos preços dos alimentos, já que a produção passou a ser destinada ao setor energético. Além disso, esta competição pode vir a causar uma diminuição do armazenamento de excedentes e, consequentemente, redução dos subsídios à exportação, uma vez que as colheitas disponíveis ou produtos florestais passem a ser utilizados para a produção de biocombustíveis (Caseiro 2011).

Fonte: Caseiro (2011).

Figura 14. Biocombustíveis x Combustíveis: processos que envolvem sua produção.

No Brasil, diversos programas já foram e estão sendo realizados a fim substituir o petróleo por energia derivada de biomassa vegetal, a exemplo do Plano de Produção de Óleos Vegetais para Fins Energéticos (Proóleo) de 1970, que tinha por objetivo promover a substituição de até 30% de óleo diesel com óleos vegetais de soja, amendoim, colza e girassol; do Programa Nacional do Álcool (Proálcool) criado em 1975, que consistiu em uma iniciativa do governo brasileiro para intensificar a produção de álcool combustível (etanol) em substituição à gasolina, e a Coque e Álcool de Madeira S.A. (Coalbra), empresa de economia mista vinculada ao Ministério da Agricultura, criada no ano de 1980 para produzir metanol de madeira.

Atualmente, encontra-se em vigência o Programa de Produção e Utilização do Biodiesel (PNPB), regulamentado pelo governo brasileiro em 2005 e que estabelece o uso de misturas crescentes de biodiesel ao diesel de petróleo em todo o território nacional. A partir de novembro de 2014 a adição de biodiesel passou a ser de 7%, e deve chegar a 10% em 2020, o que sinaliza concretamente o propósito do governo federal de incrementar a produção do combustível verde sustentável. Esta produção agregou, de 2008 a 2012, mais de R$ 12 bilhões ao Produto Interno Bruto (PIB) do país e gerou 86.112 empregos, incluindo a agricultura familiar. Segundo levantamento da APROBIO (2012), nos mesmos quatro anos o biodiesel fez a balança comercial brasileira economizar R$ 11,5 bilhões em importação de diesel mineral. Do ponto de vista ambiental, o biodiesel emite 57% menos gases poluentes que o diesel mineral. Com isso, são evitadas 12.945 internações por ano resultantes de doenças respiratórias e que sejam poupadas 1.838 vidas pela mesma razão (FGV 2012).

A principal matéria-prima para produção de biodiesel no Brasil provém da soja, com participação de 75% da demanda atual. Estima-se que a área plantada adicional necessária para atender ao percentual atual de mistura de biodiesel ao diesel de petróleo seria da ordem de 6 milhões de hectares, pois, de acordo com estimativas oficiais, foram necessários 4,3 bilhões de litros de biodiesel em 2015. Portanto, existe enorme descompasso entre a oferta e a necessidade de biodiesel e o grande desafio é conciliar a expansão de áreas agricultáveis com ocupação ordenada e sustentável do espaço agrícola, com vistas a atender a demanda energética e de alimentos, simultaneamente.

Mesmo no caso de culturas alternativas, não utilizadas para alimentação humana, como é o caso do Eucalyptus sp., outro problema que surge é o do desmatamento de grandes áreas para seu cultivo. Segundo Paula (1983), para se obter 1,0 kg de metanol são

27 necessários 2,4 kg de madeira, sendo a média por hectare 20 toneladas, seriam necessários 4.750.000 hectares, ou seja, 47.500 km2 de terras plantadas de Eucalyptus spp.

O Brasil possui a maior biodiversidade do mundo com uma flora de quase 50 mil espécies conhecidas (Brasil–Flora 2015), dentre estas, diversas espécies nativas apresentam potencial para produção de óleo muito superior às culturas tradicionalmente utilizadas, em especial as palmeiras, que podem gerar pelo menos, três vezes mais óleo, além do aproveitamento de seus subprodutos (Tabela 03).

Tabela 03. Coeficientes técnicos das principais espécies oleaginosas potenciais para produção de biocombustíveis no Brasil.

Área ocorrência Prod. frutos Óleo Rend. óleo no Brasil (kg.ha.ano-1) fruto (%) (t.ha.ano-1) Girassol Território nacional 1.600 42 7.500 (Helianthus annus L.) Mamona Território nacional 1.500 50 6.700

(Ricinus communis L.) Soja Principalmente Sul 2.200 18 400 e Centro-Oeste (Glycine max L. Merr.) Babaçu Região Amazônica, 15.000 6 900 Cocais e Mata (Orbignya spp.) Atlântica da BA Dendê Litoral sul da BA e 10.000 20 4.000 Região Amazônica (Elaeis guineensis Jacq.) Inajá Região Amazônica 1.900 10 740 (Maximiliana maripa (Aubl.) Drude) Acrocomia spp. Território nacional, 15.000 20 13.000 exceto Região Amazônica Fonte: Collares (2014), Lima (2011), Silva et al. (2007), MMA (2006), Müller (1980).

Dentre as espécies oleaginosas com potencial para produção de biocombustíveis destacam-se as espécies de Acrocomia, muito superior às espécies tradicionalmente utilizadas para este fim e com produção de óleo pouco inferior ao dendê (Elaeis guineensis Jacq.) (Tabela 03). Em relação ao dendê, as espécies de Acrocomia apresentam a vantagem de ocorrerem naturalmente em todo território nacional, em algumas áreas em grandes densidades com até 1.000 plantas.ha-1 (Brasil, 2014), com possibilidade de cultivo em outras regiões onde não ocorre naturalmente, diferentemente do dendê que requer

28 condições edafoclimáticas que limitam sua disseminação no território brasileiro, ficando restrito a áreas da Amazônia equatorial e sudeste da Bahia (Bastos 2000, Teixeira 2005, Lofrano 2008). É importante destacar que a capacidade produtiva da macaúba pode ultrapassar o dendê, lembrando que a produção atual é resultante somente do extrativismo e pouco conhecimento se tem sobre a palmeira. Por exemplo, Berton (2013), em trabalho realizado com diferentes genótipos de A. aculeata oriundos dos estados de São Paulo e Minas Gerais, encontrou indivíduos com potencial de produção de frutos de até 140 t.ha.ano-1,o que poderia render produção de óleo superior ao dendê (Figura 15).

Acrocomia aculeata = Macaúba), Babaçu = Orbignya spp., Dendê = Elaeis guineensis Jacq., Inajá = Maximiliana maripa (Aubl.) Drude.

Fonte: Collares (2014); Lima (2011); Silva et al. (2007); MMA (2006); Müller (1980).

Figura 15. Produção de óleo (t.ha.ano-1) de quatro espécies de palmeiras e culturas tradicionalmente utilizadas para produção de biocombustíveis.

Outro fator de grande importância a ser considerado na cadeia de produção de energia, em geral, é o balanço energético, quanto de energia é gasto para produzi-la e transportá-la. O transporte de energia à longa distância diminui consideravelmente o saldo energético, consequentemente aumentando o preço para o consumidor final. A melhor

29 alternativa para o aumento do saldo energético, com diminuição do preço do produto final, seria produzir e consumir a energia na mesma região, evitando assim o transporte de longas distâncias, por exemplo, cada estado produzindo sua própria energia a partir das espécies nativas ou cultivadas locais com potencial energético. Sob tal aspecto, as espécies de Acrocomia mais uma vez se destacam por estarem distribuídas em quase todo o território nacional, com possibilidade de cultivo em novas áreas.

Portanto, a biomassa para produção de energia é uma das principais alternativas energéticas de países com a geografia e dimensão do Brasil. O Plano Paulista de Energia (2012) oferece um conjunto de diretrizes e propostas de políticas públicas na área da energia e destaca a macaúba como opção de cultivo no Estado de São Paulo, com vistas à ocupação de áreas não adequadas para mecanização ou espaços subutilizados e a necessidade de ampliar a inclusão social em locais como os Vales do Paraíba, do Ribeira e do Paranapanema, nesse caso em sistemas agropastoris para recuperação de pastagens degradadas. Assim, o plantio da macaúba poderá representar em futuro próximo importante instrumento de desenvolvimento regional, não apenas para o Estado de São Paulo.

2.3 Aspectos da diversidade genética e marcadores moleculares

Por serem espécies nativas, de polinização aberta, com propagação por meio de sementes e com ampla distribuição geográfica, pressupõe-se que apresente elevada diversidade nas populações naturais. Grande variabilidade morfológica quanto ao porte da palmeira, indumento do estipe, tamanho e coloração da casca e da polpa dos frutos e outros pode ser observada tanto entre como dentro de populações de Acrocomia spp. (Berton 2013, Vianna et al. 2015).

A quantidade de variação genética presente numa população ou espécie em consequência de processos evolutivos corresponde à diversidade genética (IBPGR 1991), constituindo-se num importante instrumento de investigação para sistematas, ecólogos e melhoristas, pois permite verificar as afinidades e os limites entre as espécies, detectar modos de reprodução, estrutura familiar, estimar níveis de migração e dispersão nas populações e até mesmo auxiliar na identificação de restos de animais, plantas e produtos processados (Avise 1994). O estudo da diversidade genética de populações naturais compreende a descrição dos níveis de variação genética mantida dentro da população, bem

30 como a forma em que a variação genética é dividida entre e dentro das populações (Loveless & Hamrick 1987). Tais dados são úteis à proteção da biodiversidade, à conservação de germoplasma, como também para programas de melhoramento (Khanam et al. 2012).

Em relação ao melhoramento genético, a diversidade genética é sua base, pois fornece garantia de progresso genético futuro e segurança contra ameaças à produção agrícola tais como doenças ou mudanças climáticas. Quanto mais divergentes forem os parentais, maior a variabilidade resultante na população segregante e maior a probabilidade de reagrupamento dos alelos em novas combinações favoráveis (Gepts 2006).

Os marcadores moleculares podem fornecer importantes informações sobre a diversidade genética de plantas, permitindo diferenciar qualquer fenótipo molecular proveniente de um gene expresso ou de um segmento específico de DNA (Ferreira & Grattapaglia 1995), já que estes não são afetados pelo tipo de tecido vegetal, estádio de desenvolvimento, por fatores ambientais, pleiotropia ou epistasia (Agarwal et al. 2008). São específicos para cada indivíduo, grupo de indivíduos, espécies ou táxons mais elevados, sendo úteis tanto para análise de indivíduos como de populações (Wong 2009). Tais marcadores apresentam um potencial quase ilimitado para descobrir diferenças ao nível molecular, constituindo-se ferramentas poderosas para gerar informações sobre a relação dos diferentes táxons vegetais até mesmo de cultivares difíceis de distinguir morfologicamente (Haider et al. 2012).

Os marcadores moleculares podem ser classificados em dois grupos, os de hibridação e os de amplificação do DNA. Entre os marcadores baseados em hibridação estão o RFLP (Restriction fragment length polymorphism) e o VNTR (Variable number of tandem repeats) e os baseados em amplificação do DNA incluem marcadores do tipo RAPD (Random amplified of polymorphic DNA), SCAR (Sequence characterized amplified regions), microssatélites ou SSR (Single sequence repeats), AFLP (Amplified fragment length polymorphism) e SNP (Single nucleotide polymorphism) (Milach 1998).

Marcadores ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) possuem característica dominante, são altamente informativos e capazes de diferenciar indivíduos altamente aparentados, sendo importantes para as estimativas da base genética de populações vegetais tanto em programas de melhoramento como para conservação de espécies (Ansari et al. 2012). Apresentam um método baseado nos microssatélites, no entanto não

31 necessitam do conhecimento prévio do genoma (Preczenhak 2013). Por serem marcadores dominantes, não diferenciam os indivíduos heterozigotos dos homozigotos. No entanto, apresentam a vantagem de analisar diversos loci em uma única reação (op.cit.). A técnica de ISSR envolve amplificação de segmentos de DNA entre duas regiões de microssatélites idênticas. O ISSR-PCR utiliza um único primer com 16 a 25 pares de bases, este, formado por um di, tri, tetra ou penta nucleotídeos repetidos in tandem e dois a quatro nucleotídeos arbitrários degenerados na extremidade 3’ (Moraes-Filho 2014).

Segundo Preczenhak (2013), os ISSRs combinam a facilidade do RAPD com a robustez dos marcadores AFLP e SSR, sendo assim recomendados para análises de espécies evolutivamente relacionadas de forma confiável devido à sua abundância e dispersão no genoma. São marcadores de alta reprodutibilidade, apresentam loci polimórficos em quantidades satisfatórias e rapidez em seus resultados com custos razoavelmente menores em comparação aos outros marcadores (Rodrigues 2010). Esses marcadores de DNA podem contribuir significadamente em programas de melhoramento vegetal para seleção de genótipos a serem utilizados como genitores de novos cultivares, sendo também utilizados em estudos de diversidade genética e seleção assistida (Costa 2010).

Os primeiros estudos a utilizar marcadores ISSR foram publicados em 1994 por Zietkiewicz et al., e Gupta et al. Segundo revisão realizada por Wolfe & Liston (1998), os estudos iniciais envolvendo o uso de marcadores ISSR foram desenvolvidos em espécies cultivadas. Posteriormente, Wolfe et al. (1998 a, b) demonstraram a utilidade de marcadores ISSR para abordar questões de hibridização e especiação híbrida em Penstemon (Plantaginaceae) e a utilidade do método em populações naturais.

Marcadores ISSR têm sido usados para caracterização de germoplasma (Shasavar et al. 2007) e análises de diversidade genética de diversos taxa (Batista et al. 2008, Brandão et al., 2011, Ansari et al. 2012, Amorim et al. 2013, Preczenhak 2013, Ueno 2013), incluindo trabalhos de diversidade genética de palmeiras, a exemplo do trabalho desenvolvido por Rossi et al. (2014) com Buriti (Mauritia flexuosa L. f.), Hussein et al. (2005), Khierallah (2014) e Srivashtav et al. (2013) com a Tamareira (Phoenix dactylifera L.), Gaiero et al. (2009) com Butia sp. e Silva (2013) em trabalho desenvolvido com populações naturais de macaúba (A. aculeata) dos estados de Minas Gerias e São Paulo e o de Oliveira et al. (2012) com populações naturais do norte do estado de Minas Gerais. Roncal et al. (2007) utilizaram ISSRs para avaliar taxonomicamente variedades da

32 palmeira Geonoma macrostachys Mart. Tais marcadores também têm sido amplamente empregados no exame das relações sistemáticas e limites taxonômicos tal como o trabalho de Tian et al. (2004) que avaliaram três subespécies de Hippophae rhamnoides L. (Elaeagnaceae), o de Schrader & Graves (2004) que resolveram a sistematização de Alnus maritima Muhl. ex Nutt. (Betulaceae) com ISSR juntamente com dados morfológicos e, o trabalho de Barker & Hauk (2003) que avaliaram a espécie Sceptridium dissectum (Spreng.) Lyon (Ophioglossaceae).

2.4 Caracterização biométrica de frutos

A caracterização biométrica dos frutos é fundamental a fim de subsidiar informações para a conservação e exploração de recursos vegetais, já que tais dados permitem estimar a produtividade e diferenciar sementes para formar lotes mais homogêneos e, consequentemente uma maior uniformidade e vigor das mesmas (Moura et al. 2010). Ademais, constitui uma ferramenta útil à detecção da variabilidade genética dentro de populações de uma mesma espécie e das relações entre esta variabilidade e os fatores ambientais, informações passíveis de uso em programas de melhoramento genético (Carvalho et al. 2003, Moura et al. 2010). A biometria de frutos também pode gerar dados úteis à taxonomia e a estudos de dispersão e estabelecimento de plântulas (Cruz et al. 2001). A análise do fruto por partes (epicarpo, mesocarpo, endocarpo e endosperma, no caso da espécie em estudo) é de grande importância para seu consumo fresco ou para processamento.

Segundo Silva et al. (2007), espécies arbóreas tropicais apresentam diferenças marcantes quanto ao tamanho dos frutos, número e tamanho das sementes, no entanto, ainda são poucos os estudos referentes sobre o assunto. Os estudos de biometria de frutos envolvendo espécies de Acrocomia estão concentrados em A. aculeata, sendo ainda escassas informações sobre as demais espécies do gênero, que dentro de suas áreas de ocorrência constituem num importante recurso vegetal com grande potencial agroindustrial. Citam-se como exemplo os frutos das espécies A. intumescens e A. totai, ambos utilizados para alimentação, frescos ou processados, sendo que A. totai assim como A. aculeata também já vêm sendo utilizadas para extração de óleo biocombustível.

2.5 Caracterização morfoanatômica

Estudos de morfologia clássica, por vezes, não são suficientes para distinguir determinados táxons ou compreender determinado aspecto ou comportamento de um vegetal. O estudo da estrutura interna dos vegetais, denominada Anatomia Vegetal, pode auxiliar na compreensão de processos fisiológicos, ecológicos, taxonômicos e até mesmo as relações filogenéticas entre os diversos grupos vegetais. Os resultados morfogenéticos obtidos em estudos de cultura de tecidos e células vegetais in vitro, por exemplo, podem ser confirmadas por meio de análise anatômica, assim como estudos moleculares do desenvolvimento do vegetal podem ser realizados por meio de análises de anatomia com uso de técnicas de hibridização in situ (Appezzato-da-Glória & Carmello-Guerreiro 2012).

A anatomia foliar tem sido muito útil à taxonomia, permitindo a diferenciação até o nível de espécie. Segundo Cutler (1978), os padrões de arranjo do tecido vascular na folha, exceto quanto ao número destes, por exemplo, são controlados geneticamente, portanto não sofrem quase nenhuma variação ambiental, constituindo-se assim em um caracter útil à distinção taxonômica. Diversos trabalhos de anatomia já foram realizados com fins taxonômicos. Ceolin et al. (2007), analisando a epiderme foliar de plântulas de Geonoma schottiana e Euterpe edulis (Arecaceae), concluíram que a análise da micromorfologia da epiderme foliar de ambas as espécies permite a diferenciação taxonômica das mesmas de maneira rápida e precisa por meio do formato das células epidérmicas, demonstrando que o padrão celular epidérmico pode estar sob forte controle genético, o que sugere que esse padrão epidérmico é suficientemente estável e difere inter- especificamente, podendo prover caracteres taxonômicos adicionais e auxiliares na identificação de plantas em estágio vegetativo. Mantovani et al. (2009) demonstraram que a morfologia da nervura central ao longo da lâmina foliar, pode ser utilizada como caráter diagnóstico para taxonomia de Anthurium (Araceae). Arruda et al. (2010), estudando a micromorfologia foliar de seis espécies de Posoqueria (Rubiaceae), concluíram que estas espécies podem ser diferenciadas através de caracteres anatômicos da folha tais como a deposição de cera e a presença de tricomas. Noblick (2013), analisando a anatomia foliar de várias espécies de Syagrus (Arecaceae), elaborou uma chave de identificação somente com caracteres anatômicos, que pode ser facilmente utilizada até mesmo a partir de cortes manuais.

Aspectos anatômicos do fruto e semente podem ser usados em taxonomia. Renó et al. (2007) encontraram características úteis à taxonomia estudando frutos de Tecoma stans

(L.) Kunth, uma espécie de Bignoniaceae. Freitas (2013) encontrou caracteres úteis à taxonomia de frutos em quatro espécies de Apocynaceae.

Dados de anatomia vegetal também podem ser muito úteis às áreas de produção, e melhoramento vegetal, já que o principal foco de estudo destas áreas é o corpo como um todo ou parte do vegetal. As práticas de agricultura requerem atenção à relação existente entre o organismo vegetal e as diferentes práticas de manejo, pois a estrutura da planta está dinamicamente relacionada a tais práticas (Silva et al. 2005). Existe, por exemplo, uma importante relação entre a organização estrutural da planta e sua nutrição. Diferentes níveis de nutrientes disponíveis ao vegetal podem modificar sua estrutura a favor ou contra o mesmo. Corrêa et al. (2009), trabalhando com plantas de orégano (Origanum vulgare L.) submetidas a diferentes fontes e níveis de adubação orgânica, concluiu que a epiderme em ambas as faces, os parênquimas paliçádico e lacunoso e o limbo foliar são reduzidos com a elevação das doses de esterco bovino e de aves, e que o número de estômatos aumenta com a dosagem de ambos os adubos. Brito & Rodella (2001) demonstraram as relações entre a anatomia vegetal e qualidade de gramíneas forrageiras, devido ao fato de que a quantidade de celulose e lignina presentes na estrutura do vegetal influenciam diretamente na capacidade de digestão destas pelos microrganismos que habitam o rúmen de alguns animais. Cultivares com maior número de células parenquimáticas, maior índice de compactação destas e com paredes mais espessas têm demonstrado serem mais resistentes ao ataque de patógenos (Prabhpreet et al. 2000).

As técnicas histoquímicas permitem observar, por meio de reações de coloração, o tipo e a localização dos compostos químicos originários do metabolismo primário e secundário produzidos no tecido vegetal. Prychid & Rudall (1999) demonstraram que a presença/ausência e o tipo de cristais de oxalato de cálcio em Monocotiledôneas representam um útil caractere taxonômico. Reis et al. (2012) concluíram por meio de testes histoquímicos como o conteúdo lipídico do fruto de A. aculeata se modifica ao longo do seu desenvolvimento e que as cavidades secretoras presentes no mesocarpo originam-se pela coalescência de idioblastos rafídicos. Fatores ambientais, como a fertilidade do solo, a umidade e intensidade luminosa podem influenciar a estrutura e a distribuição de compostos secundários nos vegetais. Souza (2009), por meio de testes histoquímicos demonstrou que as folhas de A. aculeata expostas ao sol apresentam flavonóides e as de sombra não. Victório et al. (2011), investigando a anatomia foliar e a composição de compostos voláteis de Myrrhinium atropurpureum var. atropurpureum (Myrtaceae), por

35 meio de microscopia de luz e testes histoquímicos, localizaram metabólitos secundários na espécie, indicando a importância fitoterápica dessa planta.

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CAPÍTULO I

Caracterização da diversidade genética de espécies de Acrocomia Mart. (Arecaceae)

Suelen Alves Vianna1, Bruna Cristina Dias2, Raissa Franchi Oliveira3, Carlos Augusto Colombo4

1 Instituto Agronômico de Campinas (IAC) – Curso de Pós-Graduação em Agricultura Tropical e Subtropical 2 Pontifícia Universidade Católica de Campinas (PUCC) – Curso de Ciências Biológicas 3 Universidade de Sorocaba (UNISO) – Curso de Biotecnologia 4 IAC - Centro de Recursos Genéticos Vegetais

RESUMO

Nativas das Américas Tropical e Subtropical, as palmeiras do gênero Acrocomia possuem múltiplos usos e grande potencial econômico, sobretudo para produção de biodiesel. Devido à sua extensa área de ocorrência, contemplando diferentes ambientes, as populações de Acrocomia apresentam grande variação morfológica o que tem causado desacordo quanto à sua taxonomia e de sua distribuição geográfica. Considerando que existem poucas informações sobre a diversidade genética das espécies do gênero, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a diversidade genética de indivíduos Acrocomia provenientes de localidades distribuídas de toda sua área de ocorrência. Para tal, foram utilizados 19 iniciadores ISSR em um total de 147 indivíduos de 72 localidades de 14 países americanos. Foi encontrada maior variação dentro de espécies e dentro de localidades do que entre espécies e localidades. As análises indicaram a existência de diferentes para o gênero, como também o endemismo A. crispa em Cuba, A. glaucescens na região central do Brasil, A. intumescens em parte do nordeste brasileiro e A. media em Porto Rico. A análise realizada com indivíduos de A. aculeata indicou a possibilidade de existência de outros táxons e que o Brasil seja o centro de diversidade da espécie. Concluímos assim, dentre outros fatores que a realização de novos estudos, sobretudo a seleção de indivíduos para formação de bancos de germoplasma e melhoramento genético devem levar em consideração a existência de espécies distintas.

Palavras-chave: Acrocomia aculeata, Acrocomia intumescens, Acrocomia hassleri, Acrocomia totai, ISSR

ABSTRACT

Characterization of the genetic diversity of species Acrocomia Mart. (Arecaceae) - Native of the Americas Tropical and Subtropical the palm trees of Acrocomia genus have multiple uses and great economic potential, especially for the production of biodiesel. Because of its extensive area of occurrence, with different environments, populations of Acrocomia show great variation which has caused disagreement about its taxonomy and geographical distribution. Due to lack of information on the genetic diversity of the genus, the objective of this study was to evaluate the genetic diversity of Acrocomia individuals from locations distributed throughout its range. For this, we used 19 ISSR primers in a total of 147 individuals from 72 locations in 14 American countries. It found greater variation within species and within locations than between species and locations. The analysis indicated that different to the genus, as well as endemism A. crispa in Cuba, A. glaucescens in central Brazil, A. intumescens in the Brazilian Northeast and A. media in Puerto Rico. The analysis carried out with individuals of A. aculeata indicated the possibility of other taxa and that Brazil is the center of diversity of the species. We conclude that further studies, particularly for formation of germplasm banks and breeding should consider the existence of different species of the genus.

Keywords: Acrocomia aculeata, Acrocomia intumescens, Acrocomia hassleri, Acrocomia totai, ISSR

1 INTRODUÇÃO

As espécies do gênero Acrocomia podem ser encontradas em áreas tropicais e subtropicais das Américas, ocorrendo em áreas desde o sul do México até o norte da Argentina. No Brasil, sua área de ocorrência abrange todo o território nacional, exceto a região amazônica. Devido à sua extensa área de distribuição geográfica, contemplando climas, relevos, solos e formações vegetacionais diferenciadas, as populações naturais de Acrocomia spp. apresentam grande variação morfológica e variabilidade genética, tanto dentro como entre populações (Lanes et al. 2014, Berton 2013, Cicconini et al. 2013 Roncal et al. 2008, Nucci 2007), o que tem causado desacordo quanto à classificação taxonômica das espécies do gênero. No Brasil, tem-se considerado, em geral, que as populações que ocorrem

54 na região Nordeste são classificadas como A. intumescens, facilmente reconhecida pelo intumescimento no meio do estipe; as populações do Mato Grosso do Sul, sobretudo do Pantanal, como A. totai, em geral, com estipe liso e frutos pequenos e A. aculeata, com maior distribuição pelo país, ocorrendo em maiores densidades no estado de Minas Gerais, reconhecida principalmente pelo estipe coberto por espinhos e/ou pelos remanescentes da bainha das folhas já caídas, e também por apresentarem frutos maiores e maior teor de óleo, podendo ultrapassar os 70%.

Segundo Henderson et al. (1995), botânicos especialistas na classificação de palmeiras, existem duas espécies para o gênero: Acrocomia aculeata (Jacq.) Lodd. ex Mart., de porte arbóreo, amplamente distribuída pelas Américas, e A. hassleri (Barb. Rodr.) W.J. Hahn, espécie acaulescente restrita a parte do Cerrado do Brasil e Paraguai. No entanto, referências mais recentes aceitam um maior número de espécies para o gênero. Lorenzi et al. (2010), botânicos, sendo Kahn e Noblick botânicos de palmeiras, reconhecem a existência de cinco espécies além das duas descritas anteriormente, citando também a existência de A. emensis (Toledo) Lorenzi, espécie acaulescente, distribuída em áreas de Cerrado do Brasil, nos estados de São Paulo, Minas Gerais, Goiás, Paraná e Mato Grosso do Sul; A. glaucescens Lorenzi, espécie anã com distribuição em áreas de Cerrado sobre solos arenosos nos estados de Mato Grosso e Goiás; A. intumescens Drude, de porte arbóreo, ocorrendo em parte do Nordeste; A. totai Mart., de porte arbóreo, com distribuição somente no estado de Mato Grosso do Sul, e A. crispa (Kunth) C.F. Baker ex Becc., de porte arbóreo, endêmica de Cuba. O site The Plant List (2013), que lista todas as espécies de plantas conhecidas mundialmente, além das espécies citadas anteriormente, aceita a existência da espécie A. media O.F. Cook, de porte arbóreo, endêmica de Porto Rico e das Ilhas Virgens, somando assim um total de oito espécies atualmente reconhecidas para o gênero. As demais encontradas, a exemplo de A. sclerocarpa, são consideradas como sinonímias das espécies aceitas.

As espécies de Acrocomia são utilizadas para diversos fins, sendo aproveitadas todas as suas partes, de acordo com a parte, para alimentação humana e animal, medicinalmente, construção, artesanato, carvoaria, indústria de cosméticos, como espécie ornamental e outros (Pott & Pott 1994, Salis & Matos 2009, Damasceno Jr & Souza 2010). Embora o maior interesse seja pela sua alta capacidade de produção de óleo, diversas comunidades rurais e tradicionais, principalmente nos estados do Mato Grosso do Sul e do Pernambuco, têm como fonte ou complemento de renda a comercialização dos frutos frescos inteiros, despolpados ou processados como farinha, doces, bolos, xaropes e outros.

Referente à produção de óleo, produto mais visado nas espécies de Acrocomia, A. aculeata por exemplo, de acordo com estimativas, pode produzir 4 mil litros de óleo por hectare por ano. A título de comparação, a soja produz 420 litros, o girassol 890 litros e a mamona 1.320 litros, enquanto que o dendê pode chegar a 7,3 mil litros de óleo por hectare por ano. Ainda, de acordo com trabalho realizado por Berton (2013), com diferentes genótipos de A. aculeata oriundos do estado de São Paulo, foram encontrados indivíduos com potencial de produção de frutos de até 140 t.ha.ano-1 e rendimento de óleo de até 13 mil litros de óleo por hectare por ano, ultrapassando a produção do dendezeiro. Some-se a isso o fato da macaúba ser espontânea e perene, com ampla distribuição pelas Américas, ocorrendo naturalmente em áreas de Mata Atlântica, Cocais e Caatinga, em áreas altas e ao nível do mar (Vianna & Colombo 2013), com benefícios para o manejo e a conservação de solo, visto que uma vez plantada sua vida útil econômica excede 50 anos, como espécie pioneira abre caminho para a sucessão de outras espécies vegetais nativas, assegurando a conservação e recuperação ambiental, além de contribuir com sequestro de carbono e apresentar relevante contribuição para o armazenamento e ciclagem de nutrientes (Ferreira et al. 2013).

A espécie A. aculeata apresenta entre 33 e 78% de óleo na polpa (Conceição et al. 2012, Berton 2013, Lira et al. 2013), A. crispa possui de 10 a 40% (Canavaciolo et al. 2013, Sierra-Pérez et al. 2014). Acrocomia intumescens com 34 a 41% (Bora & Rocha 2004, Conceição et al. 2012) e A. totai entre 26 e 33% (Hiane et al. 2005, Vianna et al. 2015). Araújo et al. (2014) estudaram o óleo da espécie A. emensis, descobrindo que esta possui óleo de qualidade para produção de biocombustíveis.

A quantidade de variação genética presente numa população ou espécie em consequência de processos evolutivos corresponde à diversidade genética (IBPGR 1991), constituindo-se num importante instrumento de investigação para sistematas, ecólogos e melhoristas, pois permite verificar as afinidades e os limites entre as espécies, detectar modos de reprodução, estrutura familiar, estimar níveis de migração e dispersão nas populações e até mesmo auxiliar na identificação de restos de animais, plantas e produtos processados (Avise 1994). Tais dados são úteis à proteção da biodiversidade, à conservação de germoplasma como também para programas de melhoramento (Khanam et al. 2012). Os dados básicos para tais estudos são os chamados marcadores moleculares.

Os marcadores moleculares podem fornecer importantes informações sobre a diversidade genética de plantas, já que não são afetados por fatores ambientais e pelo estágio de desenvolvimento do vegetal. Tais marcadores apresentam um potencial quase ilimitado

56 para descobrir diferenças ao nível molecular, constituindo-se como ferramentas poderosas para gerar informações sobre a relação dos diferentes taxa vegetais até mesmo de cultivares difíceis de distinguir morfologicamente (Haider et al. 2012). Vários marcadores moleculares, tais como o “Polimorfismo no comprimento do fragmento de restrição” (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP), “Sequências simples repetidas” (Simple Sequence Repeats - SSR) e “Polimorfismo no comprimento de fragmentos amplificados” (Amplified Fragment Length Polymorphism - AFLP) têm sido desenvolvidos para o estudo de espécies vegetais.

Marcadores ISSR possuem característica dominante, são altamente informativos e capazes de diferenciar indivíduos altamente aparentados, sendo importantes para as estimativas da base genética de populações vegetais tanto em programas de melhoramento como para conservação de espécies (Ansari et al. 2012). Apresentam um método baseado nos microssatélites, no entanto, não necessitam do conhecimento prévio do genoma (Preczenhak 2013). São marcadores dominantes, ou seja, não diferenciam os indivíduos heterozigotos dos homozigotos, no entanto, apresentam a vantagem de analisar diversos locos em uma única reação (op.cit.). A técnica de ISSR envolve amplificação de segmentos de DNA entre duas regiões de microssatélites idênticas. O ISSR-PCR utiliza um único primer com 16 a 25 pares de bases, este formado por um di, tri, tetra ou penta nucleotídeos repetidos in tandem e dois a quatro nucleotídeos arbitrários degenerados na extremidade 3’ ou 5’ (Moraes-Filho 2014).

Segundo Preczenhak (2013), os ISSRs combinam a facilidade do RAPD com a robustez dos marcadores AFLP e SSR, sendo assim recomendados para análises de espécies relacionadas evolutivamente de forma confiável devido à sua abundância e dispersão no genoma. São marcadores de alta reprodutibilidade, apresentam locos polimórficos em quantidades satisfatórias e rapidez em seus resultados, com custos razoavelmente menores em comparação aos outros marcadores (Rodrigues 2010). Esses marcadores de DNA podem contribuir significadamente em programas de melhoramento vegetal para seleção de genótipos a serem utilizados como genitores de novas cultivares, sendo também utilizados em estudos de diversidade genética e seleção assistida (Costa 2010).

Marcadores ISSR têm sido usados para caracterização de germoplasma (Shasavar et al. 2007) e análises de diversidade genética de diversos taxa (Batista 2008, Brandão et al. 2011, Ansari et al. 2012, Amorim 2013, Preczenhak 2013, Ueno 2013), incluindo trabalhos de diversidade genética de palmeiras, a exemplo do trabalho desenvolvido por Rossi et al. (2014) com Buriti (Mauritia flexuosa L. f.), Hussein et al. (2005), Srivashtav et al. (2013), Khierallah (2014), com a Tamareira (Phoenix dactylifera L.), Gaiero et al. (2009) com Butia sp., e Silva (2013) em trabalho desenvolvido com populações naturais de macaúba (A. aculeata) dos estados de Minas Gerias e São Paulo, e o de Oliveira et al. (2012) com populações naturais do norte do estado de Minas Gerais. Roncal et al. (2007) utilizaram ISSRs para avaliar taxonomicamente variedades da palmeira Geonoma macrostachys Mart. Tais marcadores também têm sido amplamente empregados no exame das relações sistemáticas e limites taxonômicos, tal como o trabalho de Tian et al. (2004), que avaliaram três subespécies de Hippophae rhamnoides L. (Elaeagnaceae), o de Schrader & Graves (2004), que resolveram a sistematização de Alnus maritima Muhl. ex Nutt. (Betulaceae) com ISSR juntamente com dados morfológicos, e o trabalho de Barker & Hauk (2003), que avaliaram a espécie Sceptridium dissectum (Spreng.) Lyon (Ophioglossaceae).

Os estudos de diversidade genética de A. aculeata são escassos, utilizando em sua maioria amostras originárias dos estados de Minas Gerais e São Paulo. Trabalhos que envolvam indivíduos de outras localidades e das demais espécies do gênero não são encontrados. Diante da importância dos estudos de diversidade genética para o melhoramento vegetal e para o desenvolvimento de estratégias de conservação das espécies, o presente trabalho teve como objetivo analisar a diversidade genética de indivíduos de A. aculeata provenientes de toda a sua região de ocorrência (Américas), verificar a existência de coincidência geográfica entre a origem dos indivíduos e a diversidade, como também verificar a diferenciação entre as espécies atualmente reconhecidas.

2 MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Coleta do material botânico

O material fresco (folhas e frutos) foi coletado na coleção de palmeiras do Montgomery Botanical Center (MBC, Miami, Flórida, EUA), na coleção do Jardim Botânico do Instituto Plantarum (IP, Nova Odessa, SP, Brasil), pelo Instituto de Botánica del Nordeste - IBN (Corrientes, Argentina) e em vários locais da área de ocorrência das espécies de

Acrocomia. O material herborizado recebido foi enviado pelos herbários: Fairchild Tropical Garden (FTG), New York Botanical Garden (NYBG) e Herbier IRD de Guyane (CAY) (Tabelas 01 e 02 em anexo).

O material vegetal obtido de Acrocomia spp. soma um total de 469 indivíduos provenientes de 84 localidades, originário de 24 países das Américas do Norte, Central e do Sul e de 13 estados do Brasil. O detalhamento da origem das amostras pode ser visualizado nas Figuras 01 e 02.

Figura 01. Mapa da área de ocorrência/países de ocorrência (em verde) e dos pontos de coleta de Acrocomia aculeata.

a b c

d e f

Figura 02. Mapa indicando a área de ocorrência (em verde) e os pontos de coleta de: a Acrocomia crispa, b A. emensis, c A. glaucescens, d A. hassleri, e A. intumescens, f A. totai.

2.2 Seleção das amostras coletadas para utilização no estudo de diversidade

Devido ao grande número de indivíduos obtidos, foi realizada a seleção de um menor número de amostras procurando contemplar sua área de ocorrência. Assim, para o estudo de diversidade, foram selecionados indivíduos representantes das oito espécies atualmente reconhecidas de Acrocomia (The Plant List 2013), perfazendo um total de 147 amostras, provenientes de 72 localidades, abrangendo 14 países, e no Brasil, 13 estados e 45 municípios (Tabela 03).

Tabela 01. Locais de coleta das amostras utilizadas para o estudo de diversidade genética de Acrocomia spp. Coordenadas geográficas: Latitude (Lat.), Longitude (Lon.), Altitude (Alt.); Clima Zonal de acordo com a classificação de Köppen-Geiger (CZ); Temperatura Media Anual (TMA, oC); Precipitação Média Anual (PMA, mm) e Fitofisionomia.

Localidade Lat. Lon. Alt. CZ TMA PMA Fitofisionomia

(m) (oC) (mm)

Brasil

São Paulo

Cássia dos Coqueiros 21º16'58"S 47º10'11"O 890 Cfb 19,6 1500 Floresta Estacional

Dourado 22º06'00"S 48º19'03"O 706 Cwa 20 1328 Área de pastagem

Itapira 22º26'00"S 46º49'18"O 660 Cfa 20,2 1376 Morro, vegetação em recuperação, presença de Brachiaria.

Mogi Guaçu 22º22'15"S 46º56'38"O 640 Cwa 20,3 1344 Cerrado

Teodoro Sampaio 22º31'57"S 52º10'03"O 321 Aw 22,2 1179 Cerrado, área em recuperação

Rio de Janeiro

Guapimirim 22º32'14"S 42º58'55"O 48 Aw 23 1473 Área de pastagem em recuperação

Itaboraí 22º42'69,5"S 42º48'40,6"O 19 Aw 23,1 1267 Área de pastagem

Minas Gerais

Montes Claros 16º44'49,99"S 43º53'10,68"O Aw 22,7 1029 -

Patos de Minas 18º35'29"S 46º27'18,40"O Aw 22,8 1445 Cerrado

Ponte Joaquina Aw - - -

Serra da Canastra 20º7'15,27"S 46º39'11,30"O Cwb - - Cerrado

Paraná

Umuarama 23º47'55"S 53º18'48''O 430 Cfa 20,7 1512 Cerrado

Xambrê 23º44'10"S 53º29'24"O 418 Cfa 20,8 1430 Área de pastagem

Bahia

Barreiras 12º13'29,54"S 45º1'16,11"O Aw 24,9 1045 Cerrado

Ceará

Barbalha 07°18’18″S 39°18’7″O 814 Aw 25.5 1058 Floresta subcaducifólia

Baturité 4º19'1,76"S 38º53'33,64"O 410 Aw 25.8 1065 Floresta subperenifólia tropical

Fortaleza 3º45'39,23"S 38º31'1,49"O 1 Aw 26,3 1448 Área antropizada.

Guaramiranga 4º13'55,17"S 38º57'39,69"O 835 Aw 20,9 1560 Floresta subperenifólia tropical

Missão Velha 07º14'59"S 39º08'35"O 360 Aw 25.8 942 Floresta subcaducifólia

Maranhão

Itapecuru Mirim, MA 3º11'10,99"S 43º1'53,22"O 18 Aw 27,3 1632 Área pastagem, próximo a área alagada

Peritoró 4º31'13,51"S 44º3'13,86"O 112 Aw 27,4 1465 Cocais - Floresta

Pernambuco

Recife 08º49'5,29"S 48º19'24,1"O 1 Am 25.8 1804 Área antropizada.

Tocantins

Palmas 09º2'38"S 08º2'38"O 190 Aw 26,7 1760 Floresta Semidecidual Estacional com presença de Babaçu e Buritis.

Pará

Santo Antônio Tauá Am 26.8 2431 -

Goiás

Acreúna 17º22'40,80"S 50º23'16,80"O Aw 24,4 1462 Área de pastagem

Cachoeira Alta 18º49'36,9"S 50º52'27"O Aw 24,2 1521 Cerrado

Caldas Novas 17º44'38"S 48º37'33"O Aw 23,8 1347 Cerrado

Cristalina 16º46'08"S 47º36'50"O Cfb 20,1 1422 Cerrado

Jataí 18º09'46,4"S 51º25'51,0"O Aw 23,3 1541 Cerrado

Trindade 16º38'56"S 49º29'20"O Aw 23,2 1467 Cerrado

Brasília, DF 15º47'38"S 47º52'58"O Aw 21,1 1668 Cerrado

Mato Grosso do Sul

Bonito 21º9'53.28"S 56º26'39.99"O 272 Aw 23,7 1363 Cerradão

Chapadão do Sul 18º47'38"S 52º37'22"O Aw 22,7 1598 -

Cassilândia 16º28'16,6"S 54º38'13,5"O Aw 24,1 1521 -

Corumbá 19º21'4.54"S 57º33'49,07"O 132 Aw 25,4 1074 Área de pastagem

Ladário 19º00'18"S 57º36'07"O Aw 25,6 1084 Área de pastagem em recuperação

Ponta Porã 22º35'56,34"S 55º32'29,70"O 613 Cfa 21,3 1352 Área de pastagem

Porto Murtinho 21º33'40,66"S 57º48'40,33"O Aw 25,0 1282 Área de pastagem em recuperação

Terenos 20º26'31"S 54º51'36"O 192 Aw 23,8 1434 Área de pastagem em recuperação

Mato Grosso

Barra do Garças 15º44'43,8"S 56º36'57,6"O Aw 25,6 1585 Cerrado

Cáceres 16º2'21,3"S 57º38'43"O 153 Aw 26,3 1301 Área de pastagem

Primavera do Leste 15º34'38,1"S 54º11'26,8"O Aw 22,0 1784 Cerrado

Rondonópolis 16º28'15"S 54º38'09"O Aw 24,8 1527 Cerrado

Argentina

Corrientes, Capital 27º29'20"S 58º43'52"O 52 Cfa 21,7 1289 -

Paraguai

Canindeyú 24º11'01"S 55º16'48"O Cfa 21,1 1645 Cerradão e Cerrado

Paraguarí 26º2'48,9"S 56º52'25.2"O 300 Cfa 22,2 1457 Floresta – Área de pastagem

San Pedro 23º48'34"S 56º06'46"O 180 Cfa 22,8 1306 Cerrado

Bolívia

Trinidad, Prov. 14º30'36"S 64º34'12"O 230 Am 25,9 1891 - Marban, Beni

Guiana Francesa

Anse de Montabo, Ile 04º56'40"N 52º18'00"O 6 Am 26,5 3025 Ambiente aberto zona litorânea de Cayenne

Cuba

Camagüey 21º15'00"N 77º30'36"O 132 Aw 25,2 1400 -

Belize

San Ignácio, Cayo 17º06'04,2"N 89º04'40,8"O 97 Aw 25,1 1489 Sob morro com vegetação District secundária.

Honduras

La Sabana 15º18'00"N 88º0'00"O Am 24,5 1946 Floresta secundária com Orbignya cohune

Jamaica

Seaforth, Saint Thomas 17º55'48"N 76º27'00"O Am 25,9 1821 -

Porto Rico

Barceloneta 18º26'34"N 66º35'24"O 108 Af 25,7 1466 Floresta mesófila

Coamo 18º04'50,7"N 66º21'10,8"O 181 Aw 25,4 1075 Remanescente de Floresta mesófila

Ponce 18º03'31,5"N 66º37'31,8"O 191 Aw 26,2 935 Floresta mesófila

República Dominicana

San Domingo, Distrito 18º19'12"N 71º0'00"O 50 Am 25,7 1661 Vegetação secundária perturbada. Nacional Presença de Roystonea sp. e outras palmeiras.

Saint Lucia

Anse la Reye 13º56'02,4"N 61º02'40"O 102 Af 26,0 2007 Floresta estacional seca sobre topo de colina rochosa

Trinidad & Tobago

Mayaro, Trinidad 10º19'52,3"N 60º58'47,6"O 39 Af 26,1 1961 Floresta Estacional Seca

Mayaro, Trinidad 10º19'52,1"N 60º58'48,1"O 44 Af 26,1 1961 Sob penhasco (falésia) íngreme litorânea.

Saint George, Trinidad 10º39'51,9"N 61º23'56,5"O 296 Aw 26,1 1707 Floresta nativa e floresta cultivada de Pinus sp.

México

Cancún, Quintana Roo 21º5'24"N 86º29'24"O 9 Aw 25,5 1071 Área costeira

Ciudad del Carmen, 18º23'24.0"N 91º27'00"O 3 Aw 26,4 1499 Área costeira Campeche

Ek Balam, Yucatán 20º53'28"N 88º08'11"O Aw 25,4 1130 -

Veracruz 18º54'24,9"N 96º12'49"O Aw 25,4 1516 Área de pastagem

Fonte: http://pt.climate-data.org/

2.3 Conservação e processamento do material botânico

Quando realizada a coleta, foi feita a descrição da planta e do ambiente. As amostras de folíolos, quando possível, foram mantidas frescas e em laboratório, higienizadas, trituradas e congeladas. Quando as amostras foram coletadas em locais distantes, foram picadas, desidratadas e conservadas em sílica gel. As amostras de frutos foram mantidos em sacos de papel abertos ou em “sacos de laranja” para evitar fermentação e apodrecimento. Quando possível foram coletadas folhas inteiras e realizadas as devidas mensurações para herborização. Foi inserido um total de 26 exsicatas no Herbário IAC de diferentes espécies de Acrocomia, que podem ser visualizadas através do endereço eletrônico http://herbario.iac.sp.gov.br/. O Herbário IAC é o único no Brasil a ter em sua coleção exsicatas da espécie endêmica de Cuba, A. crispa, e da espécie endêmica de Porto Rico e das Ilhas Virgens, A. media.

2.3.1 Extração de DNA total das folhas

O material vegetal foi macerado em nitrogênio líquido e submetido ao protocolo de extração de DNA genômico total (Doyle & Doyle 1990). Aproximadamente 100 mg do material vegetal foram adicionados 800 μL de tampão CTAB [CTAB 2% (p/v); 1,4 M NaCl; 100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 20 mM EDTA, pH 8,0; β-mercaptoetanol 0,2% (v/v)], homogeneizados e então incubados a 65oC por 30 min. Após a incubação, foram adicionados 800 μL de clorofórmio : álcool isoamílico (24:1), homogeneizado e levado à centrífuga a 10.000 g por 10 minutos e recolhido o sobrenadante para um novo tubo. Ao sobrenadante recolhido, foi adicionado 70% (v/v) do volume coletado de isopropanol gelado, homogeneizado e deixado em repouso overnight. Em sequência, as amostras foram centrifugadas a 10.000 g por 5 min., descartado o sobrenadante e deixado secar o pellet. Após foram adicionados 500 μL de etanol 75%, (v/v) e os tubos levados a centrifuga a 10.000 g por mais 5 min. A seguir o etanol foi descartado, deixando secar o pellet à temperatura ambiente. Após a secagem, o DNA foi ressuspendido em 50 μL de TE (10 mM Tris-HCl; 1 mM de EDTA, pH 8,0) e armazenado a -20oC.

2.3.2 Extração de DNA total do endosperma

Como de algumas localidades foram recebidos somente frutos, houve necessidade de realizar a extração de DNA dos mesmos, para tal, as amêndoas foram picadas e posteriormente maceradas em nitrogênio líquido e então armazenadas em recipientes plásticos a -20oC. Foram testados três protocolos para extração de DNA genômico total das amêndoas, sendo utilizado o protocolo adaptado de Moreira et al. (2005). Para extração foram utilizados aproximadamente 150 mg da amostra com 900 μl de tampão de extração (200 mM Tris-HCl, pH 7,5; 288 mM NaCl; 25 mM EDTA; SDS 0,5%). Realizou-se homogeneização por 1 min. As amostras então foram levadas à centrifuga a 10.000 g por 4 min e transferido o sobrenadante para novo tubo e adicionado 10 μL de proteinase K -1 o (10mg.L ) + 10 μL 1 mM CaCl2 para remoção das proteínas e então incubado a 37 C por 30 min. Após resfriamento em temperatura ambiente, foram adicionados 900 μL de isopropanol e centrifugado a 10.000 g por 7 min para precipitação do DNA. Posteriormente, o sobrenadante foi descartado deixando secar o precipitado por 15 min. Após a secagem, o precipitado foi ressuspendido em 300 μL TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA) + 40 μL.mL-1 de RNAse (10 mg.mL-1) e incubado novamente a 37oC por 30 min e a seguir adicionado o mesmo volume de isopropanol e centrifugado a 10.000 g. Foi descartado o sobrenadante, deixando secar o precipitado. O DNA foi ressuspendido em 300 μL de TE.

A qualidade e a concentração do DNA de ambos os protocolos descritos foram determinadas em espectrofotômetro (NanoVue Plus) em comprimentos de onda de 260, 280 e 320 nm.

2.4 Seleção e otimização de iniciadores Inter Simple Sequence Repeats (ISSR)

Foram testados 27 iniciadores ISSR utilizando dois indivíduos de localidades distintas. Para otimização das reações de PCR foi utilizado um coquetel contendo 2 μL tampão PCR (1X), 2,4 μL MgCl2 (3 mM), 0,4 μL dNTP mix (0,2 mM), 0,2 μl Taq polimerase (1U – Sinapse©), 0,5 μL iniciador ISSR (0,25 mM) e 2 μL DNA diluído (20 ng.μl-1) e água Mili-Q q.s.p. para volume final de 20 μL (Tabela 04).

Tabela 02. Lista dos iniciadores ISSR usados no estudo de determinação da temperatura de anelamento em Acrocomia spp.

Iniciador Sequência (5’ – 3’) 1 AW3 GTG TGT GTG TGT GG 2 BECKY CAC ACA CAC ACA CAT C 3 CHRIS CAC ACA CAC ACA CAT G 4 DAT GAG AGA GAG AGA GAA G 5 GOOFY GTG TGT GTG TGT GTC C 6 JOHN AGA GAG AGA GAG AGY C 7 MANNY CAC CAC CAC CAC RC 8 MAO CTC CTC CTC CTC AC 9 OMAR GAG GAG GAG GAG GC 10 TERRY GTG GTG GTG GTG GC 11 7 CTC TCT CTC TCT CTC TAG 12 807 AGA GAG AGA GAG AGA GT 13 814 CTC TCT CTC TCT CTC TTG 14 836 AGA GAG AGA GAG AGA GYA 15 843 CTC TCT CTC TCT CTC TAA 16 844 CTC TCT CTC TCT CTC TRC 17 848 CAC ACA CAC ACA CAC ARG 18 856 ACA CAC ACA CAC ACA CYA 19 873 GAC AGA CAG ACA GAC A 20 889 DBD ACA CAC ACA CAC AC 21 898 CAC ACA CAC ACA AT 22 899 CAC ACA CAC ACA AG 23 834 AGA GAG AGA GAG AGA GYT 24 901 GTG TGT GTG TGT CA 25 902 GTG TGT GTG TGT AT 26 M1 CAA GAG AGA GAG A 27 M2 GGG CGA GAG AGA GAG AGA GA R = purina (A ou G) Y = pirimidina (T ou C)

As reações foram realizadas em termociclador modelo T100 - Bio-Rad de acordo com as seguintes condições de amplificação (i) 94oC por 4 min.; (ii) 94oC por 1 min., (iii) anelamento do iniciador a XoC por 1 min., (iv) 72 oC por 2 min., 39 ciclos dos passos ii – iv e extensão final a 72oC por 7 min. Os produtos da amplificação, juntamente com corante (azul de bromofenol + Gel Red 1:1) foram aplicados em gel de agarose a 2% (p/v) e então submetidos à eletroforese horizontal com tampão TBE 0,5X a uma voltagem de 100 V por cerca de 3 h. Para estimar o tamanho dos fragmentos foi utilizado o ladder GeneRuler DNA Ladder Mix (Thermo Scientific©). Ao final da eletroforese, o gel foi colocado sob luz ultravioleta para visualização dos fragmentos e captura da imagem com auxílio do fotodocumentador AlphaImager® HP System.

Em cada amplificação foi utilizado controle negativo a fim de identificar eventuais contaminações e um controle positivo para verificar a ocorrência de problemas relacionados com a reação.

2.5 Análise dos dados

O polimorfismo obtido pela técnica ISSR foi tabulado segundo presença (1) ou ausência (0) de bandas. Cada loco ISSR foi considerado um loco único e bi alélico, com um alelo amplificável e um alelo nulo. Como análises de diversidade genética foram calculados a diversidade genética de Nei (Nei 1973) e o índice de diversidade de Shannon (Shannon 1948), com o uso do programa Popgene 1.32 (Yeh et al. 1997) que assume que para dados de marcadores dominantes as populações estão em Equilíbrio de Hardy- Weinberg. Também foi realizada a Análise de Variância Molecular (AMOVA) com o uso do programa GenAlex 6.5 (Peakall & Smouse 2012).

Embora desenvolvido para análise de dados codominantes, o índice de diversidade de Nei é baseado na heterozigosidade esperada, no entanto, em marcadores dominantes esse conceito não é aplicável, tornando-se, então, uma medida de variabilidade genética 2 estimada por HE = 1 -∑pi , onde pi é a frequência de cada banda (0 ou 1) na população. O índice de Shannon, originalmente desenvolvido para estudos ecológicos a fim de determinar parâmetros de biodiversidade, em análises moleculares mostra o grau de certeza em que se prevê a proximidade genética entre indivíduos. Segundo Sun & Wong (2001) apud Rodrigues (2010), este índice é adequado para análise de marcadores dominantes, podendo ser utilizado para comparações entre espécies e entre populações da mesma

71 espécie. A expressão utilizada é H = - ∑ pi.log2 pi, sendo pi a frequência de uma dada banda.

A AMOVA considera as distâncias genéticas como desvios da média de um grupo, onde os quadrados desses desvios correspondem à variância, permitindo assim caracterizar a variação genética dentro e entre as populações, como também permite deduzir sobre a estrutura genética populacional (Excoffier et al. 1992).

A organização da diversidade genética foi analisada com o uso de coordenadas principais (PCoA), a partir das distâncias genéticas de Nei (1972) com o uso do software GenAlex 6.5 (Peakall & Smouse 2012). Os dendrogramas foram gerados a partir da matriz de distâncias genéticas de Nei com o método de agrupamento UPGMA (Unweighted Pair Group Method Arithemitc Averages) com uso do programa DARwin 6.0 (Perrier et al. 2014). A estabilidade dos agrupamentos foi testada empregando o procedimento de reamostragem por 1000 aleatorizações.

Devido à grande quantidade de indivíduos utilizados no presente trabalho, os dados obtidos foram divididos, para as devidas análises, em quatro “conjuntos amostrais”, uma considerando indivíduos das diferentes espécies do gênero, outra somente com indivíduos de A. aculeata, outra com A. intumescens e outra com A. totai. Foi considerada a existência de oito espécies (A. aculeata, A. crispa, A. emensis, A. glaucescens, A. hassleri, A. intumescens, A. media e A. totai) para estudo baseado na sua morfologia, observada pessoalmente, e a partir de informações publicadas sobre caracterização morfológica, diversidade genética e área de ocorrência (Henderson et al. 1995, Dransfield et al. 2008, Lorenzi et al. 2010, The Plant List 2013)

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 Seleção e otimização dos iniciadores ISSR

Dos 27 marcadores ISSR testados, 20 apresentaram bom padrão de amplificação e número de fragmentos. A partir destes, 19 foram selecionados e padronizados para análise das amostras de Acrocomia spp. Foi utilizada, após os devidos testes, a temperatura de anelamento de 58oC para todos os marcadores. Posteriormente, as amplificações foram realizadas novamente a fim de analisar a robustez e o índice de repetibilidade das bandas e dos marcadores (Figura 03).

Figura 03. Perfil de amplificação de marcadores ISSR com temperatura de anelamento de 58oC.

Os marcadores selecionados para o trabalho foram: 807, 834, 836, 843, 844, 848, 856, 873, 889, 899, 901, Aw3, Becky, Goofy, John, Manny, Mao, Omar e Terry. Os marcadores selecionados apresentaram bom padrão de amplificação e de polimorfismo nas amostras de A. aculeata das diferentes localidades e entre as espécies do gênero (Figura 04).

Nota: Aa = Acrocomia aculeata, Ac = A. crispa, Ae = A. emensis, Ag = A. glaucescens, Aga = A. glaucescens porte anão, Ah = A. hassleri, Ai = A. intumescens, At = A. totai e Asp = A. sp.

Figura 04. Perfil de amplificação de indivíduos de espécies de Acrocomia utilizando ISSR.

3.2 Diversidade e estrutura genética

3.2.1 Acrocomia spp.

As espécies de Acrocomia apresentaram de 79 a 95 bandas polimórficas, tendo A. media apresentado o menor número de bandas polimórficas e A. aculeata, o maior. A espécie A. aculeata, também apresentou o maior número de bandas privadas (05) dentre os espécies analisadas (Figura 05).

* Am = Acrocomia media; Aa = A. aculeata; At = A. totai; Ac = A. crispa; Ai = A. intumescens; Ah = A. hassleri; Ae = A. emensis; Ag = A. glaucescens.

Figura 05. Diversidade genética das espécies de Acrocomia analisadas considerando o número total de bandas, o número de bandas polimórficas, número de bandas privadas e o índice de diversidade de Nei (com desvio padrão).

A porcentagem de bandas polimórficas dentro das espécies variou de 23,88% (A. media) a 45,52% (A. hassleri), com valor médio de 34,51%. As estimativas do índice de Shannon obtidas para as diferentes espécies foram baixas, variando de 0,15 em A. media a 0,27 em A. hassleri. As estimativas de diversidade genética de Nei também foram baixas, variando de 0,10 em A. media a 0,18 em A. hassleri. Nota-se que a diferença entre os valores obtidos pelo índice de Shannon e da diversidade genética de Nei é devida à maior sensibilidade do índice de Shannon aos alelos que ocorrem em baixa frequência na população (Tabela 03).

Acrocomia media é uma espécie endêmica de Porto Rico e das Ilhas Virgens (The Plant List 2013), ou seja, ocorre em duas ilhas, o que pode gerar certo isolamento destas populações com as demais, o que foi evidenciado pelos menores valores de diversidade encontrados em comparação com as demais espécies analisadas (Tabela 05). As espécies A. hassleri, A. aculeata e A. glaucescens apresentaram as maiores estimativas de

75 diversidade, o que pode ser resultante da origem destes materiais, considerando que os indivíduos de cada uma dessas espécies foram coletados em localidades diferentes (Tabela 01).

Tabela 03. Estimativas de diversidade genética das espécies de Acrocomia analisadas: número de indivíduos (N); número médio de bandas (Na); índice de Shannon (I); diversidade genética de Nei (HE) e porcentagem de bandas polimórficas (P).

Espécies N Na I HE P (%)

A. media 03 1,24 0,15 0,10 23,88

A. aculeata 03 1,43 0,25 0,17 43,28

A. totai 03 1,31 0,19 0,13 30,60

A. crispa 03 1,34 0,19 0,12 33,58

A. intumescens 03 1,29 0,16 0,11 28,36

A. hassleri 03 1,46 0,27 0,18 45,52

A. emensis 03 1,29 0,18 0,11 28,36

A. glaucescens 03 1,45 0,25 0,17 42,54

A análise de variância molecular entre as espécies apresentou valor de ΦST de 0,246. Do total da variância genética molecular, apenas 25% foi decorrente da diferença entre as espécies, enquanto 75% foi resultante da variação dentro de cada espécie (Tabela 04). Acredita-se que os baixos valores obtidos entre espécies seja resultante do pequeno número de amostras utilizadas no presente estudo, assim como o maior valor dentro de cada espécie seja resultante da origem dos materiais, já que para a realização das análises foram utilizados três indivíduos de localidades distintas.

Tabela 04. Análise de variância molecular para dois níveis hierárquicos de um conjunto amostral de diferentes espécies de Acrocomia.

Fonte de variação GL1 SQ2 QM3 Componentes Variação variância total (%)

Entre espécies 7 236,92 33,85 5,57 25

Dentro de espécies 16 274,00 17,13 17,13 75

Total 23 510,92 22,70 100

ФST 0,246

1 Graus de liberdade; 2 Soma dos quadrados; 3 Quadrado médio

A análise de coordenadas principais (PCoA), obtida a partir da matriz de distâncias de Nei, demonstrou que 66,05% da variação obtida está concentrada nos seus dois primeiros eixos, revelando a existência de variabilidade genética entre as espécies analisadas, ocorrendo maior isolamento da espécie A. media, seguida por A. crispa e A. glaucescens. Este resultado foi consistente com o dendrograma, onde A. media aparece isolada, seguida por A. crispa e A. glaucescens.

* Am = Acrocomia media; Aa = A. aculeata; At = A. totai; Ac = A. crispa; Ai = A. intumescens; Ah = A. hassleri; Ae = A. emensis; Ag = A. glaucescens.

Figura 06. Análise das coordenadas principais das espécies de Acrocomia baseada na matriz de distância de Nei.

* Am = Acrocomia media; Aa = A. aculeata; At = A. totai; Ac = A. crispa; Ai = A. intumescens; Ah = A. hassleri; Ae = A. emensis; Ag = A. glaucescens.

Figura 07. Dendrograma obtido com método UPGMA, baseado na matriz de distâncias de Nei para as espécies analisadas de Acrocomia. Índice cofenético = 0,9555.

Os resultados do presente estudo corroboram a existência de oito espécies do gênero Acrocomia, sendo duas destas, A. media e A. crispa, coincidentes com a localização geográfica e a morfologia.

A espécie A. media foi descrita no ano de 1901, durante levantamento de palmeiras realizado em Porto Rico (Cook 1901). De acordo com o citado autor, a espécie diferia de A. aculeata por seu “hábito mais robusto e menor diâmetro do estipe”. Devido à falta de maiores informações e características consistentes que a diferenciasse, mais tarde foi colocada como sinonímia de A. aculeata. No entanto, recentemente, The Plant List (2013) retirou A. media da sinonímia de A. aculeata, reconhecendo-a como espécie distinta e endêmica de Porto Rico e Ilhas Virgens, baseado no trabalho de levantamento de palmeiras naquele país, realizado por Proctor (2005), que a diferencia de A. aculeata pela menor altura da planta, maior comprimento das folhas, folíolos mais curtos e espata menor, além de diferenças no comprimento dos espinhos e no tipo de indumento. Segundo o mesmo autor, A. media ocorre em ambientes de transição de seco para úmido, em altitudes inferiores a 200 m. Segundo Proctor (2005), existe a necessidade de ampliar o número de

78 indivíduos avaliados para que a descrição morfológica da espécie seja mais consistente, já que as informações existentes além de baseadas em poucos indivíduos também são muito antigas. O presente estudo indicou A. media como grupo distinto das demais espécies estudadas, inclusive de indivíduos provenientes da República Dominicana, ilha próxima a Porto Rico, assim, é reforçada a necessidade de estudo morfológico e molecular envolvendo maior número de indivíduos deste distinto grupo de Porto Rico e das Ilhas Virgens, como também das ilhas vizinhas, a fim de esclarecer sua taxonomia.

Acrocomia crispa, originalmente descrita como Cocos crispa Kunth, no ano de 1815 (Tropicos 2015), posteriormente foi colocada no gênero Astrocaryum (1893), mais tarde em Gastrococos (1968) e mais recentemente inserida em Acrocomia. Embora não tenha sido possível acessar as publicações onde há a explicação para mudança de gênero da espécie, acredita-se que tenha sido colocada em Bactridinae devido à presença de espinhos no estipe e nas folhas, característica desta subfamília, que é representada por gêneros de palmeiras espinescentes (Acrocomia, Aiphanes, Astrocaryum, Bactris e Desmoncus) com distribuição restrita às Américas, particularmente na América do Sul (Dransfield et al. 2008). Outras características morfológicas, tais como, tipo de fruto e flores, devem ter sido consideradas para sua inserção em Acrocomia. Não existem informações muito detalhadas sobre a morfologia e comportamento de A. crispa. Foi observado que a palmeira apresenta intumescimento na porção superior do estipe, folhas grandes com espinhos brancos e frutos pequenos com 2 a 3 cm de diâmetro, o que a diferencia das demais espécies do gênero. Além disso, a espécie é endêmica de Cuba, ocorrendo normalmente em áreas com solos calcários (Henderson et al. 1995, Dransfield et al. 2008). As análises realizadas no presente trabalho corroboram a distinção desta espécie das demais do gênero, como também coincide com sua localização geográfica, colocando-a em um grupo isolado das outras espécies (Figuras 06 e 07).

A espécie A. glaucescens foi descrita recentemente (Lorenzi et al. 2010), diferindo das demais espécies do gênero por apresentar porte variável, desde acaulescente até arbóreo (até 6,5 m), com menor número de folhas contemporâneas (3-10 contra 20-40), as quais também são menores (96-158 contra 190-260), inflorescência com menor comprimento (5-20 cm contra 50 a mais de 100 cm), poucos ramos florais, dentre outras características (op. cit.). Esta espécie possui distribuição restrita a uma pequena área ao sul do estado de Mato Grosso e sudoeste de Goiás, associada à vegetação de Cerrado sobre solos arenosos (Lorenzi et al. 2010). Os dados obtidos demonstraram a separação desta

79 espécie das demais analisadas (Figuras 06 e 07), indicando sua distinção das demais espécies de Acrocomia e sua ocorrência concentrada em uma pequena região do Brasil e restrita a solos arenosos.

Conforme observado nas Figuras 06 e 07, houve a aproximação, ou a formação de um grupo maior contendo os indivíduos de A. aculeata, A. emensis, A. hassleri, A. intumescens e A. totai. Embora estas espécies apresentem características morfológicas bem distintas, deve-se notar que, exceto A. aculeata (com ampla distribuição pelas Américas) e A. hassleri, que ocorre em parte do Brasil e no Paraguai, as demais espécies ocorrem somente no Brasil, sendo A. totai endêmica do estado do Mato Grosso do Sul e extremo norte do Paraná, A. intumescens endêmica de parte do Nordeste brasileiro e A. emensis restrita a áreas sob Cerrado dos estados de Goiás, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais, São Paulo e Paraná (Lorenzi et al. 2010). A ocorrência de um maior número como também o endemismo de algumas espécies de Acrocomia no Brasil pode sugerir que o Brasil seja o centro de origem do gênero. Todavia, é importante que novos estudos com maior número de indivíduos por espécie, número de localidades e outros tipos de marcadores moleculares sejam realizados a fim de resolver a taxonomia das espécies em Acrocomia e, considerando estudos moleculares, sua relação genética com outros gêneros de Bactridinae, sobretudo com Bactris.

3.2.2 Acrocomia intumescens

As amostras de A. intumescens provenientes de diferentes localidades apresentaram pequena variação quanto ao número de bandas polimórficas, tendo sido o menor número encontrado no material de Missão Velha, CE, com 77 bandas polimórficas, e o maior no de Baturité, CE, com 83 bandas polimórficas. O indivíduo analisado do município de Recife, PE, apresentou, em conjunto, o maior número de bandas privadas (15) dentre as localidades analisadas (Figura 08).

* REC_PE = Recife, PE; MIS_CE = Missão Velha, CE; FOR_CE = Fortaleza, CE; GUA = Guaramiranga, CE; BAT = Baturité, CE.

Figura 08. Diversidade genética das localidades analisadas de Acrocomia intumescens considerando o número total de bandas, o número de bandas polimórficas, o número de bandas privadas e o índice de diversidade de Nei (com desvio padrão).

A porcentagem de bandas polimórficas dentro das localidades com ocorrência de A. intumescens variou de 11,76% (Missão Velha, CE) a 36,13% (Recife, PE), com valor médio de 24,20%. As estimativas do índice de Shannon obtidas da análise das diferentes localidades variaram de 0,07 (Missão Velha, CE) a 0,22 (Recife, PE). As estimativas de diversidade genética de Nei ficaram entre de 0,04 para Missão Velha, CE, e 0,15 em Recife, PE (Tabela 05). Os baixos índices calculados, neste caso, podem ser resultantes do restrito número de indivíduos por localidade utilizados no estudo. Nota-se que no Recife, PE, foram encontrados os maiores índices de diversidade, conforme descritos anteriormente, o que pode indicar, considerando que A. intumescens é endêmica da região nordeste do Brasil (Lorenzi et al. 2010), que esta localidade seja seu centro de origem e de diversidade. De acordo com Mendes et al. (2007), o centro de origem é a região onde o ancestral silvestre de uma espécie distribui-se em estado nativo e apresenta maior diversidade genética para determinadas características, diminuindo a variabilidade conforme se desloca para periferia da distribuição, e o centro de diversidade é a região

81 geográfica onde pode ser encontrada uma concentração da diversidade genética de uma ou mais espécies.

Tabela 05. Estimativas de diversidade genética de cinco localidades de Acrocomia intumescens: número de indivíduos (N); número médio de bandas (Na); índice de Shannon

(I); diversidade genética de Nei (HE) e porcentagem de bandas polimórficas (P).

Localidades N Na I HE P (%)

Recife, PE 03 1,36 0,22 0,15 36,13

Missão Velha, CE 02 1,12 0,07 0,04 11,76

Fortaleza, CE 03 1,17 0,10 0,10 16,81

Guaramiranga, CE 03 1,31 0,19 0,13 31,09

Baturité, CE 03 1,26 0,16 0,11 25,21

A análise de variância molecular apresentou valor de ΦST de 0,354. Do total da variância genética molecular, 35% é resultado da variação entre as localidades e 65% da variação dentro de cada localidade (Tabela 06).

Tabela 06. Análise de variância molecular para dois níveis hierárquicos de Acrocomia intumescens provenientes de diferentes localidades.

Fonte de variação GL1 SQ2 QM3 Componentes Variação total variância (%)

Entre localidades 4 135,86 33,96 7,37 35

Dentro de localidades 9 121,00 13,44 13,44 65

Total 13 256,86 20,81 100

ФST 0,354

1 Graus de liberdade; 2 Soma dos quadrados; 3 Quadrado médio

A PCoA baseada na distância genética, analisando as diferentes localidades com ocorrência de A. intumescens, demonstrou que 72,47% da variação obtida está concentrada nos seus dois primeiros eixos, revelando a existência de variabilidade genética significativa entre localidades analisadas, indicando isolamento dos indivíduos oriundos do Recife, PE, e a proximidade entre os indivíduos das diferentes localidades do Ceará, com a formação de um grupo bem definido com indivíduos de Missão Velha, CE, e outro com indivíduos de Fortaleza, CE (Figura 09). A utilização da distância de Nei (1972) para geração da PCoA demonstra de forma mais clara a separação entre os indivíduos provenientes do Recife, PE dos indivíduos do Ceará, sendo que os dois primeiros eixos explicam 79,25% da variação existente entre as diferentes localidades (Figura 10).

* REC_PE = Recife, PE; MIS_CE = Missão Velha, CE; FOR_CE = Fortaleza, CE; GUA = Guaramiranga, CE; BAT = Baturité, CE.

Figura 09. Análise das coordenadas principais de Acrocomia intumescens de diferentes localidades baseada na matriz de diversidade genética.

* REC_PE = Recife, PE; MIS_CE = Missão Velha, CE; FOR_CE = Fortaleza, CE; GUA = Guaramiranga, CE; BAT = Baturité, CE.

Figura 10. Análise das coordenadas principais de Acrocomia intumescens provenientes de cinco localidades baseada na matriz de distância de Nei (1972).

O dendrograma obtido, a partir da matriz de distâncias de Nei (1972) entre as localidades avaliadas com ocorrência de A. intumescens confirmam as demais análises realizadas, separando os indivíduos do Recife, PE, das localidades do Ceará (Figura 11). Ou seja, as localidades mais próximas geograficamente foram mais próximas geneticamente. Morfologicamente, os indivíduos de A. intumescens da região do Recife, PE, apresentam características mais marcantes para descrição da espécie, sobretudo, maior intumescimento do estipe, comparativamente aos materiais do Ceará. Além disso, o clima destas regiões é diferenciado. De acordo com a classificação de Köppen-Geiger, o município de Recife, PE, apresenta clima Am, portanto, mais úmido comparativamente às localidades do Ceará que apresentam clima Aw, clima zonal caracterizado pela ocorrência de uma estação seca pronunciada. Sabendo que não existe consenso sobre o número de espécies para o gênero, e que A. intumescens para muitos é considerada sinonímia de A. aculeata, sugere-se que o Ceará possa ser uma região de transição, ocorrendo híbridos de A. aculeata (que ocorre em todos estados vizinhos, inclusive nas áreas mais secas do Pernambuco) com A. intumescens (típica da zona da mata e dos chamados brejos de altitude, áreas mais úmidas e com formação vegetacional mais densa).

* REC_PE = Recife, PE; MIS_CE = Missão Velha, CE; FOR_CE = Fortaleza, CE; GUA = Guaramiranga, CE; BAT = Baturité, CE.

Figura 11. Dendrograma obtido com método UPGMA, baseado na distância de Nei (1972) para diferentes localidades com ocorrência de Acrocomia intumescens. Índice cofenético = 0,9699.

3.2.3 Acrocomia totai

O número de bandas polimórficas variou entre as localidades com indivíduos de A. totai, sendo o menor número de bandas polimórficas no conjunto amostral de Ponta Porã, MS (86), e o maior em Porto Murtinho, MS (95). O maior número de bandas privadas (09) foi encontrado no conjunto amostral proveniente do município de Xambrê, PR. (Figura 12).

* PP_MS = Ponta Porã, MS; BON_MS = Bonito, MS; TER_MS = Terenos, MS; PM_MS = Porto Murtinho, MS; COR_MS = Corumbá, MS; XAM_PR = Xambrê, PR.

Figura 12. Diversidade genética das localidades analisadas com ocorrência de Acrocomia totai, considerando o número total de bandas, o número de bandas polimórficas, o número de bandas privadas e o índice de diversidade de Nei (com desvio padrão).

Dentre as localidades avaliadas com ocorrência de A. totai foi constatada a porcentagem de bandas polimórficas variando de 21,62% (Xambrê, PR) a 33,78% (Ponta Porã, MS), com valor médio de 27,48%. As estimativas do índice de Shannon obtidas foram baixas, variando de 0,14 em Xambrê, PR, a 0,21 em Ponta Porã, MS. As estimativas de diversidade genética de Nei também foram baixas, variando de 0,10 em Xambrê, PR a 0,14 em Ponta Porã, MS. Os baixos valores encontrados para as análises realizadas provavelmente são resultado dos poucos indivíduos por localidade utilizados no estudo (Tabela 07).

Tabela 07. Estimativas de diversidade genética de seis localidades com ocorrência de Acrocomia totai: número de indivíduos (N); número médio de bandas (Na); índice de

Shannon (I); diversidade genética de Nei (HE) e porcentagem de bandas polimórficas (P).

Localidades N Na I HE P (%)

Ponta Porã, MS 03 1,35 0,21 0,14 33,78

Bonito, MS 03 1,27 0,17 0,11 26,35

Terenos, MS 03 1,29 0,17 0,12 27,70

Porto Murtinho, MS 03 1,31 0,18 0,12 29,73

Corumbá, MS 03 1,26 0,15 0,11 25,68

Xambrê, PR 03 1,22 0,14 0,10 21,62

A análise de variância molecular indicou valor de ΦST de 0,296. Do total da variância genética molecular, 30% é resultado da variação entre as localidades e 70% da variação dentro de cada localidade.

Tabela 08. Análise de variância molecular para dois níveis hierárquicos de um conjunto amostral de diferentes localidades com Acrocomia totai.

Fonte de variação GL1 SQ2 QM3 Componentes Variação variância total (%)

Entre localidades 5 188,72 37,74 7.02 30

Dentro de 12 200,33 16,69 16,69 70 localidades

Total 17 389,07 23,71 23,71 100

ФST 0,296

1 Graus de liberdade; 2 Soma dos quadrados; 3 Quadrado médio

A variação encontrada com análise da PCoA baseada nas distâncias genéticas entre as diferentes localidades com ocorrência de A. totai demonstrou que 48,81% da variação

87 obtida está concentrada nos seus dois primeiros eixos, revelando a existência de variabilidade genética entre localidades analisadas e o isolamento dos indivíduos provenientes do município de Xambrê, PR, e a proximidade entre os indivíduos das diferentes localidades do Mato Grosso do Sul, com a formação de um grupo isolado com indivíduos de Corumbá, MS (Figura 13). A PCoA baseada nas distâncias de Nei (1972) comprova, com 85,39% da variação explicada pelos dois primeiros eixos, o isolamento do conjunto amostral oriundo de Xambrê, PR das localidades do Mato Grosso do Sul e, dentre as localidades do Mato Grosso do Sul, um grupo distanciado das demais localidades referente ao município de Corumbá (Figura 14).

* PP_MS = Ponta Porã, MS; BON_MS = Bonito, MS; TER_MS = Terenos, MS; PM_MS = Porto Murtinho, MS; COR_MS = Corumbá, MS; XAM_PR = Xambrê, PR.

Figura 13. Análise das coordenadas principais de Acrocomia totai oriundas de diferentes locais baseada na distância genética de Nei (1972).

* PP_MS = Ponta Porã, MS; BON_MS = Bonito, MS; TER_MS = Terenos, MS; PM_MS = Porto Murtinho, MS; COR_MS = Corumbá, MS; XAM_PR = Xambrê, PR.

Figura 14. Análise das coordenadas principais de Acrocomia totai de diferentes localidades baseada na distância genética de Nei (1972).

O dendrograma com as localidades de A. totai corrobora as demais análises, demonstrando a formação de um grande grupo representado por indivíduos de Mato Grosso do Sul e o isolamento de Xambrê localizado na região norte do estado do Paraná. Pode ser observada também a separação de Corumbá, MS, das demais localidades deste estado (Figura 15).

* PP_MS = Ponta Porã, MS; BON_MS = Bonito, MS; TER_MS = Terenos, MS; PM_MS = Porto Murtinho, MS; COR_MS = Corumbá, MS; XAM_PR = Xambrê, PR.

Figura 15. Dendrograma obtido com método UPGMA, baseado na distância de Nei (1972), para diferentes localidades com ocorrência de Acrocomia totai. Índice cofenético = 0,9582.

Lembra-se que a espécie A. aculeata ocorre, dentre outros, no estado de São Paulo e na região nordeste do Paraná (Von Lisingen & Cervi 2009), e que a espécie A. totai ocorre no Mato Grosso do Sul. O município de Xambrê fica no noroeste do estado do Paraná, próximo às divisas dos estados de Mato Grosso do Sul e de São Paulo, o que sugere que este município possa ser uma área de transição, com ocorrência de híbridos naturais entre as duas espécies citadas.

Quanto ao isolamento dos indivíduos de Corumbá, MS, das demais localidades do estado, necessita-se de um estudo de diversidade genética mais detalhado, com maior número de indivíduos deste município e de outros do estado. É de conhecimento que os indivíduos de Corumbá, MS, apresentam grande variabilidade morfológica dentro e entre populações (Vianna 2011, Vianna et al. 2015), como também há variação morfológica e na quantidade de óleo do fruto quando comparados indivíduos procedentes de Corumbá e Aquidauana, MS (Pantanal), com indivíduos de Campo Grande e São Gabriel do Oeste, MS (Cerrado) (Ciconini et al. 2013).

3.2.4 Acrocomia aculeata

O número de bandas polimórficas variou entre as localidades, ocorrendo de 1,34% a 49,54% bandas polimórficas (Santo Antônio do Tauá, PA e Teodoro Sampaio, SP, respectivamente). Não houve ocorrência de bandas privadas (Figura 16).

* Localidades no Brasil: TRI_GO = Trindade, GO, BRA_DF = Brasília, DF, ACR_GO = Acreúna, GO CAC_MT = Cáceres, MT, MC_MG = Montes Claros, MG, PM_MG = Patos de Minas, MG SCAN_MG = Serra da Canastra, MG, TS_SP = Teodoro Sampaio, SP, CC_SP = Cássia dos Coqueiros, SP, DOU_ SP = Dourado, SP, ITA_SP = Itapira, SP, IT_RJ = Itaboraí, RJ, GUA_RJ = Guaramirim, RJ, PER_MA = Peritoró, Maranhão, IM_MA = Itapecuru Mirim, MA, SAT_PA = Santo Antônio do Tauá, PA, PAL_TO = Palmas, TO, BAR_BA = Barreiras, BA; Outros países: MAY_TT = Mayaro, Trinidad & Tobago; COA_PRI = Coamo, Puerto Rico; PON_PRI = Ponce, Puerto Rico, COR_ARG = Corrientes, Argentina, VER_MX = Veracruz, México.

Figura 16. Diversidade genética de 24 localidades com ocorrência de Acrocomia aculeata, considerando o número total de bandas, o número de bandas polimórficas, o número de bandas privadas e o índice de diversidade de Nei (com desvio padrão).

Dentre as 24 localidades com ocorrência de A. aculeata analisadas foi constatada a porcentagem de bandas polimórficas, variando de 1,83% em Santo Antônio do Tauá, PA, a 49,54% em Teodoro Sampaio, SP, com valor médio de 31,23%. As estimativas do índice de Shannon obtidas variaram entre 0,04 a 0,30 nos municípios de Santo Antônio do Tauá,

PA e o Teodoro Sampaio, SP, respectivamente. As estimativas de diversidade genética de Nei variaram entre 0,02 a 0,21 em Santo Antônio do Tauá, PA, e o Teodoro Sampaio, SP, respectivamente. Os valores relativamente baixos encontrados provavelmente são resultantes do baixo número de indivíduos por localidade utilizados para o estudo (Tabela 09).

Tabela 09. Estimativas de diversidade genética de 24 localidades com ocorrência de Acrocomia aculeata: número de indivíduos (N); número médio de bandas (Na); índice de

Shannon (I); diversidade genética de Nei (HE) e porcentagem de bandas polimórficas (P).

Localidades N Na I HE P (%)

Acreúna, GO 03 1,28 0,18 0,12 28,44

Trindade, GO 03 1,24 0,14 0,10 22,02

Brasília, DF 03 1,41 0,23 0,17 41,28

Cáceres, MT 03 1,30 0,18 0,12 30,28

Montes Claros, MG 03 1,29 0,18 0,12 29,36

Patos de Minas, MG 03 1,24 0,14 0,10 23,85

Serra da Canastra, MG 03 1,24 0,13 0,10 23,85

Cássia dos Coqueiros, SP 03 1,42 0,25 0,17 40,37

Dourado, SP 03 1,36 0,21 0,15 35,78

Itapira, SP 03 1,23 0,14 0,10 22,94

Teodoro Sampaio, SP 03 1,50 0,30 0,21 49,54

Guapimirim, RJ 03 1,30 0,18 0,12 30,28

Itaboraí, RJ 03 1,45 0,27 0,19 44,95

Itapecuru Mirim, MA 03 1,45 0,26 0,18 44,95

Peritoró, MA 03 1,38 0,23 0,16 36,70

Santo Antônio do Tauá, PA 02 1,06 0,04 0,02 1,83

Palmas, TO 03 1,37 0,22 0,15 36,70

Barreiras, BA 03 1,21 0,12 0,10 21,10

Mayaro, Trinidad & Tobago 03 1,18 0,11 0,07 18,35

Saint George, Trinidad & 03 1,47 0,27 0,19 46,79 Tobago

Coamo, Porto Rico 03 1,15 0,10 0,06 14,68

Ponce, Porto Rico 03 1,28 0,17 0,11 28,44

Corrientes, Argentina 03 1,39 0,22 0,15 39,45

Veracruz, México 03 1,38 0,23 0,15 37,61

Os resultados da AMOVA demonstraram que o total da variância genética molecular é maior dentro (70%) do que entre as localidades estudadas (30%), com valor de

ΦST de 0,379.

Tabela 10. Análise de variância molecular para dois níveis hierárquicos de 24 localidades com ocorrência de Acrocomia aculeata.

Fonte de variação GL1 SQ2 QM3 Componentes Variação variância total (%)

Entre localidades 23 1120,92 48,74 10,60 38

Dentro de localidades 47 817,00 17,38 17,38 62

Total 70 1937,92 27,98 100

ФST 0,379

1 Graus de liberdade; 2 Soma dos quadrados; 3 Quadrado médio

A fim de representar melhor a amostragem de A. aculeata, foram realizadas duas análises de PCoA. A primeira considerou 71 indivíduos distribuídos de 24 localidades do Brasil e do exterior, com média de 03 indivíduos por localidade, o que permitiu a realização das análises anteriormente citadas que exigem o mínimo de dois indivíduos por localidade, e uma segunda considerando 90 indivíduos distribuídos em 43 localidades, sendo algumas destas localidades representadas apenas por um indivíduo.

A variação encontrada com análise da PCoA das 24 localidades para A. aculeata, baseada nas distâncias de Nei (1972), demonstrou que 51,03% da variação obtida está concentrada nos seus dois primeiros eixos, revelando a existência de variabilidade genética entre localidades analisadas e a separação entre as localidades brasileiras das localidades das Américas Central e do Norte e demais países da América do Sul (Figura 17). Também pode ser observado certo isolamento das amostras provenientes dos países da América Central (Porto Rico e Trinidad & Tobago).

Figura 17. Análise das coordenadas principais de 24 localidades com Acrocomia aculeata baseada na distância genética de Nei (1972).

Considerando 43 localidades com total de 90 indivíduos, a PCoA obtida concentra nos dois primeiros eixos 36,71% da variação, separando em dois grandes grupos os indivíduos provenientes de diferentes localidades do Brasil (em verde) dos demais países das Américas do Norte, Central e do Sul, havendo uma aproximação dos indivíduos oriundos dos países da América do Sul (Guiana Francesa, Paraguai e Bolívia, em vermelho) e dos indivíduos das diferentes localidades de Porto Rico (Figura 18).

* Localidades no Brasil: TRI_GO = Trindade, GO, BRA_DF = Brasília, DF, ACR_GO = Acreúna, GO, JAT_GO = Jataí, GO, CR_GO = Cristalina, GO, CAC_MT = Cáceres, MT, RON_MT = Rondonópolis, MT, PL_MT = Primavera do Leste, MT, BG_MT = Barra do Garça, MT, MC_MG = Montes Claros, MG, PM_MG = Patos de Minas, MG SCAN_MG = Serra da Canastra, MG, TS_SP = Teodoro Sampaio, SP, CC_SP = Cássia dos Coqueiros, SP, DOU_ SP = Dourado, SP, ITA_SP = Itapira, SP, IT_RJ = Itaboraí, RJ, GUA_RJ = Guaramirim, RJ, PER_MA = Peritoró, Maranhão, IM_MA = Itapecuru Mirim, MA, SAT_PA = Santo Antônio do Tauá, PA, PAL_TO = Palmas, TO, BAR_BA = Barreiras, BA; Outros países: MAY_TT = Mayaro, SG_TT = Saint George, Trinidad & Tobago; COA_PRI = Coamo, Puerto Rico; BAR_PRI = Barceloneta, Porto Rico, BELIZ = Belize, CARIB = Caribe, REP_DOM = República Dominicana, GUI_FRA = Guiana Francesa, PARAG = Paraguai, BOLIV = Bolívia, HOND = Honduras, JAMAI = Jamaica, PON_PRI = Ponce, Puerto Rico, COR_ARG = Corrientes, Argentina, VER_MX = Veracruz, México, EB_MX = Ek Balán, México, CAN_MX = Cancún, México.

Figura 18. Análise das coordenadas principais de 43 localidades com Acrocomia aculeata baseada distância genética de Nei (1972).

O dendrograma gerado, baseado nas distâncias de Nei (1972), considerando 43 localidades, demonstra a formação de dois grandes grupos, um composto em sua grande maioria com indivíduos provenientes de localidades brasileiras (em verde) e outro (em vermelho) com dos indivíduos oriundos de outros locais amostrados. Pode ser observada subestruturação do grupo vermelho em outros grupos, um destacado em azul com localidades predominantemente das Américas Central e do Norte, havendo uma aproximação dos indivíduos de duas localidades de Porto Rico e uma de Trinidad e Tobago

95 e outro grupo, destacado em amarelo, com as localidades da América do Sul (Paraguai, Bolívia e Guiana Francesa) e Central (Honduras, República Dominicana e Caribe) (Figura 19).

Figura 19. Dendrograma obtido com método UPGMA, baseado na distância de Nei (1972) para diferentes localidades com ocorrência de Acrocomia aculeata. Índice cofenético = 0,8247.

A aproximação das localidades de Porto Rico, como sua separação dos demais grupos, é mais uma indicação da ocorrência da espécie A. media neste país, conforme explicado anteriormente. A formação de um grande grupo aproximando somente indivíduos provenientes de localidades brasileiras (exceto uma localidade do exterior) apoia a hipótese de que o Brasil seja o centro de diversidade de A. aculeata. Em trabalho realizado com fósseis de palmeiras pelas Américas, Morcote-Ríos e Bernal (2001) encontraram os registros fósseis mais antigos de A. aculeata na região norte do Brasil, sugerindo que a espécie tenha sido levada da América do Sul para a América Central. Soma-se ao fato de que o gênero é provavelmente de origem sul-americana, o que é apoiado pela maior ocorrência dos diferentes gêneros de Bactridinae, subfamília à qual pertence, ser de origem sul americana (Dransfield et al. 2008). Além disso, exceto duas espécies (A. media e A. crispa), todas as outras do gênero ocorrem no Brasil, sendo três destas endêmicas: A. emensis, A. glaucescens e A. intumescens (Henderson 1995, Lorenzi et al. 2010).

Considerando a análise de variância molecular (AMOVA) de todas as análises realizadas com os indivíduos das diferentes espécies e das espécies A. intumescens, A. totai e A. aculeata (Tabelas 04, 06, 08 e 10 respectivamente), foi estimado que os menores valores da variância total (25%, 35%, 30% e 38%, respectivamente) está entre populações e que a maior diferenciação genética (75%, 65%, 70% e 62%, respectivamente) está no componente intrapopulacional. Os resultados são semelhantes ao trabalho realizado por Oliveira et al. (2012) com indivíduos de A. aculeata de populações de diferentes localidades da região norte do estado de Minas Gerais, que encontraram maior diversidade genética dentro (82,8%) do que entre populações (17,2%).

Segundo Zucchi (2002), a distribuição da variação genética em espécies de fecundação cruzada, monóica e ou dióica, de ciclo longo e clímax, é caracterizada por apresentar uma baixa variação entre populações ou localidades, sendo alta dentro da população. Os resultados obtidos estão de acordo com o padrão de distribuição observado para espécies arbóreas e com o esperado para espécies alógamas, ou de sistema misto, predominantemente alógamas. De acordo com Kageyama et al. (2003), a habilidade dos indivíduos em trocar genes, associadas ao fluxo gênico entre populações, reduzem as diferenças entre populações por deriva genética e seleção, reduzindo a diversidade genética entre populações.

Os valores de Фst encontrados (0,246; 0,354; 0,296; 0,379, respectivamente), considerando indivíduos das diferentes espécies: A. intumescens, A. totai e A. aculeata (Tabelas 04, 06, 08 e 10 respectivamente), são considerados altos. Valores de Фst calculados para diferentes espécies de palmeiras foram similares aos do presente trabalho. Oliveira (2005), trabalhando com indivíduos de açaí (Euterpe oleracea Mart.) de diferentes procedências, estimou valor de Фst de 0,305. Santos et al. (2015) encontraram Фst de 0,4048 em trabalho realizado com populações de babaçu (Attalea vitrivir Zona). Nucci et al. (2008), estudando populações de macaúba (A. aculeata) dos estados de Minas Gerais e São Paulo, estimaram valor de 0,2522. Os altos níveis de diferenciação genética calculados para as diferentes espécies de Acrocomia podem ser resultantes do fluxo gênico a pequenas distâncias. Segundo Scariot (1991), a polinização em A. aculeata é realizada por coleópteros Curculionidae, Nitidulidae e Scarabaeidae que não percorrem grandes distâncias.

Os resultados de diferenciação genética calculados para as diferentes espécies de Acrocomia apresentam maior variabilidade genética intrapopulacional. Assim, sugere-se que a fim de conservar a variabilidade existente, esta deve ser preservada nas várias populações ao longo de sua distribuição geográfica, permitindo desta maneira a manutenção da conservação da alta diversidade genética nas diferentes localidades.

4 CONCLUSÕES

As análises de diversidade molecular realizadas demonstraram a existência de variação dentro e entre cada espécie e localidade avaliados, que, em conjunto com informações sobre sua morfologia e de suas respectivas áreas de ocorrência, reforçam a existência de oito espécies de Acrocomia. Tal fato indica que a realização de novos estudos, sobretudo a seleção de indivíduos para formação de bancos de germoplasma e melhoramento genético, deve levar em consideração a existência de espécies distintas.

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107

ANEXOS

Tabela 01. Lista dos materiais de Acrocomia aculeata, local da coleta, número de indivíduos e origem.

Local de coleta No Origem indivíduos

AMÉRICA DO NORTE

México

Ciudad del Carmen, Campeche 01 Coleção viva MBC

Cancun, Quintana Roo 01 Coleta

Temozón, Yucatán 01 Coleta

Veracruz 15 Coleta

AMÉRICA CENTRAL

Antiqua & Barbuda

Antiqua 02 Herbário NYBG

Belize

Cayo District 01 Herbário FTG

Caribe

Anse la Reye, Saint Lucia 01 Herbário FTG

Costa Rica

Guanacaste, Nicoya 03 Herbário NYBG

Dominica

Coastal Hills 01 Herbário NYBG

El Salvador

San Salvador, San Salvador 01 Herbário NYBG

Haiti

Grand’Anse 01 Herbário NYBG

108

Tortue Island 01 Herbário NYBG

Toward Le Borgne 01 Herbário NYBG

Honduras

La Sabana 01 Herbário FTG

Jamaica

Constant Spring 01 Herbário NYBG

Malvern 02 Herbário NYBG

Seaforth, Saint Thomas 01 Herbário FTG

Martinique

Ducos 02 Herbário NYBG

Nicarágua

Granada 01 Herbário NYBG

Panamá

Panama City 01 Herbário NYBG

Puerto Rico

Barceloneta 01 Coleção viva MBC

Coamo 18 Coleção viva MBC

Ponce 04 Coleção viva MBC

República Dominicana

Santo Domingo, Distrito Nacional 01 Herbário FTG

Santo Domingo, Distrito Nacional 02 Herbário NYBG

Saint Lucia

Anse La Reye 01 Coleção viva MBC

São Cristovão & Nevis

Saint Kitts, Wingfield 01 Herbário NYBG

Trinidade & Tobago

109

Mayaro 04 Coleção viva MBC

Tunapuna, Saint George 10 Coleção viva MBC

AMÉRICA DO SUL

Argentina

Corrientes 10 Recebido IBN

Bolívia

Trinidad, Prov. Marban, Beni 01 Herbário FTG

Santa Cruz 01 Herbário NYBG

Guiana Francesa

Anse de Montabo, Ile de Cayenne 01 Herbário CAY

Paraguai

Paraguari 01 Herbário FTG

Suriname

Paramaribo, Cultuurtuin 01 Herbário NYBG

Venezuela

Sucre 01 Herbário NYBG

BRASIL

Sul

Paraná

Umuarama 08 Material recebido

Xambrê 01 Material recebido

Sudeste

Minas Gerais

Caldas Novas 01 Material recebido

Capitólio 02 Material recebido

Montes Claros 10 Material recebido

110

Patos de Minas 06 Material recebido

Ponte Alta 06 Material recebido

Serra da Canastra 06 Material recebido

Rio de Janeiro

Itaboraí 10 Coleta

Guapimirim 12 Coleta

São Paulo

Cassia dos Coqueiros 06 Material recebido

Dourado 06 Coleta

Itapira 08 Coleta

Presidente Epitácio 11 Material recebido

Teodoro Sampaio 07 Material recebido

Nordeste

Bahia

Barreiras 04 Material recebido

Maranhão

Peritoró 10 Coleta

BR Itapecuru Mirim - Rosário Coleta

Norte

Pará

Belém 01 Material recebido

Santo Antônio do Tauá 02 Material recebido

Santa Isabel 01 Material recebido

Sem localização 03 Material recebido

Tocantins

Palmas 10 Coleta

111

Centro Oeste

Goiás

Acreúna 08 Material recebido

Brasília 06 Material recebido

Cachoeira Alta 01 Material recebido

Cristalina 01 Material recebido

Jataí 01 Material recebido

Trindade 04 Material recebido

Mato Grosso

Barra do Garças 01 Material recebido

Cáceres 10 Coleta

Primavera do Leste 01 Material recebido

Rondonópolis 01 Material recebido

* “Material recebido” na tabela refere-se a amostras recebidas de outros colaboradores.

Tabela 02. Lista dos materiais das espécies de Acrocomia (exceto A. aculeata), local da coleta, número de indivíduos e origem.

Local de coleta No indiv. Origem

Acrocomia sp.

Corumbá, Mato Grosso do Sul 01 Coleta

Acrocomia crispa

Camagüey - Cuba 03 Coleta

Acrocomia emensis

Mogi Guaçu, São Paulo 02 Coleção viva IP

Mato Grosso - Brasil 02 Material recebido

Chapadão do Sul, Mato Grosso do Sul 03 Material recebido

112

Acrocomia hassleri

Ponta Porã, MS 02 Coleção viva IP

San Pedro, Paraguai 01 Herbário FTG

Canindeyú, Paraguai 01 Herbário FTG

Acrocomia glaucescens

Mogi Guaçu, São Paulo 02 Coleção viva IP

Mato Grosso 02 Material recebido

Chapadão do Sul, Mato Grosso do Sul 03 Material recebido

Acrocomia intumescens

Barbalha, Ceará 01 Material recebido

Baturité, Ceará 15 Coleta

Fortaleza, Ceará 04 Coleta

Guaramiranga, Ceará 10 Coleta

Missão Velha, Ceará 02 Material recebido

Exu, Pernambuco 03 Material recebido

Recife, Pernambuco 09 Coleta

Acrocomia totai

Anaurilândia, Mato Grosso do Sul 10 Material recebido

Bonito, Mato Grosso do Sul 10 Coleta

Cassilândia, Mato Grosso do Sul 01 Material recebido

Corumbá, Mato Grosso do Sul 15 Coleta

Ladário, Mato Grosso do Sul 07 Coleta

Ponta Porã, Mato Grosso do Sul 10 Coleta

Porto Murtinho, Mato Grosso do Sul 06 Material recebido

Terenos, Mato Grosso do Sul 10 Coleta

* “Material recebido” na tabela refere-se a amostras recebidas de outros colaboradores.

113

CAPÍTULO II

Anatomia foliar como subsídio à taxonomia de espécies de Acrocomia Mart. (Arecaceae)

114

Anatomia foliar como subsídio à taxonomia de espécies de Acrocomia Mart. (Arecaceae)

Suelen Alves Vianna 1*, Sandra Maria Carmello Guerreiro 2, Larry Ronald Noblick 3, Carlos Augusto Colombo 1

1 Instituto Agronômico de Campinas (IAC) – Curso de Pós-Graduação em Agricultura Tropical e Subtropical

2 Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) – Instituto de Biologia, Departamento de Biologia Vegetal

3 Montgomery Botanical Center (MBC)

4 Instituto Agronômico de Campinas (IAC) – Centro de Recursos Genéticos Vegetais

RESUMO

O gênero Acrocomia é um dos mais complexos ao nível taxonômico em Arecaceae. Não há consenso sobre o número de espécies do gênero. Foi realizado um estudo comparativo da anatomia e histoquímica foliar em sete espécies de Acrocomia, uma com ampla distribuição nas Américas (A. aculeata), cinco endêmicas de diferentes regiões do Brasil (A. emensis, A. glaucescens, A. hassleri, A. intumescens e A. totai) e uma endêmica de Cuba (A. crispa). Como caracteres unificadores das espécies estudadas de Acrocomia temos a presença de epiderme e hipoderme em ambas as faces dos folíolos cobertas por cutícula, presença de feixes de fibras não vasculares e feixes vasculares principais e secundários. É apresentada uma chave de características anatômicas das espécies estudadas. O contorno da margem, a distribuição dos feixes vasculares principais e dos feixes de fibras, o número de idioblastos com ráfides, o tamanho dos feixes vasculares dentre outras características podem ser utilizados para distinção das espécies estudadas de Acrocomia.

Palavras-chave: belly palm, bocaiúva, macaúba, morfologia vegetal, palmeira

115

ABSTRACT

Leaf anatomy as subsidy to the taxonomy of species of Acrocomia Mart. (Arecaceae) - Acrocomia is one of the most complex genera to understand in the Neotropical Arecaceae, and there is no consensus on the number of species in the genus. A comparative study of leaf anatomy was conducted on seven species of Acrocomia: one with a wide distribution in the Americas (A. aculeata), five endemic to different regions of Brazil, Bolivia and Paraguay (A. emensis, A. glaucescens, A. hassleri, A. intumescens and A. totai) and one endemic to Cuba (A. crispa). Characters that unify the species of Acrocomia include the following: epidermis covered with cuticle, hypodermis on both sides of the leaflets, nonvascular fiber bundles, and primary and secondary vascular bundles. The shape of the leaflet margin, the distribution of the primary vascular bundles and fiber bundles, the number of idioblasts with raphides and the size of the vascular bundles, along with other characteristics, were used to distinguish these species in Acrocomia.

Key words: belly palm, bocaiúva, macaúba, plant morphology, palm tree

1 INTRODUÇÃO

A família Arecaceae possui 240 gêneros e cerca de 2.700 espécies concentradas predominantemente nas regiões tropicais e subtropicais (Lorenzi et al. 2010). No Brasil são encontradas aproximadamente 200 espécies distribuídas em 40 gêneros (Silva & Potiguara 2008).

As palmeiras do gênero Acrocomia são comumente utilizadas para subsistência, desde os povos mais antigos em toda América tropical (Morcote-Ríos & Bernal 2001), além de serem exploradas comercialmente, principalmente para extração de óleo, como já ocorre, sobretudo, no Brasil e no Paraguai (Janick & Paull 2008). No Brasil, as espécies A. aculeata, A. intumescens e A. totai têm sido utilizadas para diversos fins, tais como o estipe para construção, as folhas para alimentação de gado bovino e equino, as fibras para confecção de linhas de pesca, o endocarpo como carvão de boa qualidade e substituto à pedra brita, as castanhas para extração de óleo comestível ou cosmético, e a polpa, para consumo fresco ou processado e para produção de óleo biocombustível (Pott & Pott 1994, Amaral et al. 2011, Salis & Matos 2009, Damasceno-Jr & Souza 2010, Vianna et al. 2013).

116

O gênero Acrocomia é um dos mais complexos ao nível taxonômico em Arecaceae. Pertence à subfamília Arecoideae, Tribo Cocoeae e Subtribo Bactridinae, a última sendo representada por gêneros de palmeiras espinescentes (Acrocomia, Aiphanes, Astrocaryum, Bactris e Desmoncus) com distribuição restrita às Américas, particularmente na América do Sul (Dransfield et al. 2008). Segundo Henderson et al. (1995), botânicos especialistas na classificação de palmeiras, existem duas espécies para o gênero: A. aculeata (Jacq.) Lodd. ex Mart., de porte arbóreo, amplamente distribuída pelas Américas, e a espécie A. hassleri (Barb. Rodr.) W.J. Hahn, acaulescente, restrita à parte do Cerrado do Brasil e Paraguai. No entanto, referências mais recentes aceitam um maior número de espécies para o gênero. Lorenzi et al. (2010), botânicos, sendo Kahn e Noblick botânicos de palmeiras, reconhecem a existência de cinco espécies além das duas descritas anteriormente, citando também a existência de A. emensis (Toledo) Lorenzi, acaulescente, distribuída em áreas de Cerrado do Brasil, nos estados de Goiás, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais, São Paulo e Paraná; A. glaucescens Lorenzi, anã com distribuição em áreas de Cerrado brasileiro sobre solos arenosos nos estados de Mato Grosso e Goiás; A. intumescens Drude, de porte arbóreo, ocorrendo em parte do Nordeste, associada à Mata Atlântica; A. totai Mart., de porte arbóreo, com distribuição somente no estado de Mato Grosso do Sul e A. crispa (Kunth) C.F. Baker ex Becc, de porte arbóreo, endêmica de Cuba (Figura 01).

a b c d

e f g

Ilustração de A. hassleri: Plant Illustrations (2015). Figura 01. Hábito de: a Acrocomia aculeata, b A. crispa, c A. intumescens, d A. totai, e A. emensis, f A. glaucescens, g A. hassleri com detalhe do rizoma.

117

Acrocomia aculeata, A. crispa, A. intumescens e A. totai apresentam porte arbóreo, podendo ser diferenciadas principalmente pelas características do estipe, dentre outras. Acrocomia aculeata possui estipe espinescente e geralmente coberto pelos remanescentes da base das folhas já caídas, com frutos de 3,0 a 5,0 cm de diâmetro; A. crispa apresenta um pequeno intumescimento no estipe espinescente próximo à copa, frutos pequenos com 1,0 a 2,5 cm de diâmetro e espinhos brancos na raque foliar; A. intumescens possui estipe intumescido, sendo espinescente quando jovem e inerme quando adulto, com frutos de 3,8 a 5,4 cm de diâmetro, e A. totai possui estipe inerme, às vezes espinescente e raramente coberto pelos remanescentes da base das folhas já caídas, com frutos de 2,5 a 3,5 cm de diâmetro (Lorenzi et al. 2010).

As espécies A. emensis e A. hassleri não apresentam estipe, e sim rizoma, sendo denominadas como acaulescentes, de acordo com as descrições de Lorenzi et al. (2010). A primeira possui 40-60 cm de altura, com espata e folha muito espinescente e com rizoma longo (30-80 cm de comprimento) e com frutos de 1,8-2,2 cm de diâmetro; e a segunda, apresenta entre 30-40 cm de altura, tendo espata e folha levemente espinescente e com rizoma curto (10-12 cm de comprimento) e frutos com 1,6-2,0 cm de diâmetro. A espécie A. glaucescens pode ocorrer na forma acaule ou apresentar estipe de até 6,5 m de altura, sem espinhos e com a cicatriz da bainha visível (Lorenzi et al. 2010).

As classificações publicadas para Acrocomia são baseadas apenas em caracteres morfológicos, portanto, a utilização de outras análises e ou técnicas que venham complementar tais dados podem ser de grande importância na compreensão das relações taxonômicas existentes, principalmente quando as características macromorfológicas não são suficientes.

A anatomia foliar tem sido muito útil à taxonomia permitindo a diferenciação até o nível de espécie. Segundo Parthasarathy (1968) e Tomlinson (1961, 2011), os caracteres anatômicos dos órgãos vegetativos em Arecaceae possuem valor diagnóstico para diferenciação interespecífica nesta família. Silva & Potiguara (2008) puderam diferenciar algumas espécies de Oenocarpus por meio de análise morfoanatômica dos folíolos. Millán & Kahn (2010) diferenciaram espécies de Astrocaryum e Hexopetion; Henderson (2013) diferenciou espécies em Leopoldinia, e Noblick (2013) pode diferenciar espécies de Syagrus.

Neste contexto, o presente estudo teve como objetivo caracterizar a anatomia foliar de sete espécies de Acrocomia visando demonstrar a diversidade anatômica foliar entre estas, contribuindo para a taxonomia do gênero.

118

2 MATERIAL E MÉTODOS

Consideramos como referência para classificação das espécies analisadas a descrição de Acrocomia publicada por Lorenzi et al. (2010), sendo: A. aculeata, A. crispa., A. emensis, A. hassleri, A. glaucescens, A. intumescens e A. totai.

2.1 Coleta e preparo do material botânico

A coleta do material botânico foi realizada nas coleções vivas do Montgomery Botanical Center (MBC), Coral Gables, FL, EUA e no Jardim Botânico do Instituto Plantarum (IP), Nova Odessa, SP, Brasil. Também foram utilizadas amostras de uma exsicata do Herbário do Fairchild Tropical Botanical Garden (FTG), Coral Gables, FL, EUA. Alguns espécimes foram coletados in situ (Tabela 01).

Tabela 01. Lista dos espécimes de sete espécies de Acrocomia selecionados para as análises de anatomia foliar.

Acrocomia Martius Acrocomia aculeata (MBC – 2007 0251) - Saint George, Trinidad & Tobago Acrocomia aculeata (MBC – 2003 0757 *A) – Ciudad del Carmen, México Acrocomia aculeata (IP) – Nova Odessa, São Paulo, Brasil Acrocomia aculeata (Jacq.) Lodd ex Mart. (Coleta) – Itaboraí, Rio de Janeiro, Brasil Acrocomia crispa (MBC - 96303*C) - Camagüey, Cuba Acrocomia crispa (MBC - 9389*A) - Camagüey, Cuba Acrocomia crispa (MBC - 9389*B) - Camagüey, Cuba Acrocomia emensis (IP – Planta 01) - Mogi Guaçu, São Paulo, Brasil Acrocomia emensis (IP – Planta 02) - Mogi Guaçu, São Paulo, Brasil Acrocomia glaucescens (IP – Planta 01) - Rondonópolis, Mato Grosso, Brasil Acrocomia glaucescens (IP – Planta 02) - Rondonópolis, Mato Grosso, Brasil Acrocomia glaucescens (Coleção viva – IP – Planta 03) - Rondonópolis, Mato Grosso Acrocomia hassleri (IP – Planta 01) - Ponta Porã, Mato Grosso do Sul Acrocomia hassleri (IP – Planta 03) - Ponta Porã, Mato Grosso do Sul, Brasil Acrocomia hassleri (FTG 118261) – Canendiyiu, Paraguai Acrocomia intumescens (MBC – 97810*A) - Recife, Pernambuco, Brasil Acrocomia intumescens (IP) - Escada, Pernambuco, Brasil

119

Acrocomia intumescens - Recife, Pernambuco, Brasil Acrocomia totai – Corumbá, Mato Grosso do Sul, Brasil – População 1 Acrocomia totai – Corumbá, Mato Grosso do Sul, Brasil – População 2 Acrocomia totai – Corumbá, Mato Grosso do Sul, Brasil – População 3

Foi coletado um folíolo do terço mediano de três folhas diferentes de cada espécime

(Tabela 01). O material foi fixado em FAA50 por 48 horas (Johansen 1940) e armazenado em álcool etílico 70%. Quanto ao material herborizado, foi retirado um pedaço de cerca de 2 cm para não prejudicar a exsicata, reidratado em uma solução a 5% de Contrad 70 ® por um período de 24 horas (Noblick 2013) e então fixado e armazenado conforme procedimento descrito anteriormente.

Posteriormente, foi retirada uma pequena amostra da margem e da nervura central do folíolo e então submetida à desidratação em série etílica. Após a desidratação, o material passou por uma pré-infiltração em quatro etapas em uma solução com diferentes concentrações de resina sintética (Historesin ® Leica) e álcool (1:3, 1:1, 3:1 e resina pura). O material ficou imerso nas três primeiras etapas por 15 dias e em resina pura por 30 dias. Após a etapa final de pré-infiltração o material foi emblocado em resina sintética, seccionado em micrótomo rotativo e corado com azul de toluidina 0,05% em tampão acetato 0,1 M. (pH 4,7) (O’Brien et al. 1964). As lâminas foram montadas temporariamente em água e as imagens capturadas com câmera digital (Olympus DP71) acoplada ao microscópio óptico (Olympus BX51). A descrição dos dados anatômicos obtidos seguiu a terminologia adotada por Tomlinson (1961) e Tomlinson et al. (2011).

Para o estudo da venação do folíolo, amostras com cerca de 2 cm dos folíolos foram submersos em tubos de ensaio contendo uma solução de NaOH a 5% e aquecidos a 55oC por quatro dias até relativo clareamento. Após, as amostras foram lavadas e clareadas em solução comercial de hipoclorito de sódio. Foi realizada nova lavagem, feita a coloração com safranina e montagem em solução de água-glicerina (1:1) entre lâmina e lamínula (Tomlinson et al. 2011).

Para análise da epiderme, foi retirada uma amostra de cerca de 3 cm do folíolo, tendo sido removidos, com auxílio de uma lâmina de barbear, a epiderme, a hipoderme e o mesofilo da face abaxial, para visualização da epiderme adaxial e vice-versa. Após a raspagem, as amostras foram clarificadas em solução comercial de hipoclorito de sódio, lavadas em água,

120 coradas com azul de toluidina a 0,01% e montadas em solução de água-glicerina (1:1) entre lâmina e lamínula (Tomlinson et al. 2011).

2.2 Testes histoquímicos

Quanto aos testes histoquímicos, foi utilizado Sudan IV glicerinado para detecção de lipídios totais (Pearse 1985), Lugol para detecção de amido (Gerlach 1984), Vermelho de Rutênio para detecção de substâncias pécticas, polissacarídeos e mucilagem ácida (Jensen 1962), Floroglucinol para detecção de lignina (Sass 1951) e Cloreto Férrico III para detecção de fenóis simples (Johansen 1940).

2.3. Microscopia eletrônica de varredura

Para análises de microscopia eletrônica de varredura, amostras de 0,5 cm dos folíolos fixados e conservados em álcool 70% foram desidratadas em série etílica e a seguir submetidos à desidratação pelo método de secagem ao ponto crítico com dióxido de carbono (Horridge & Tamm 1969). Posteriormente, as amostras foram montadas sobre suportes de alumínio (stubs) e passaram pelo processo de sputtering, sendo cobertas por uma camada de ouro (Castro 2002). As elétron-micrografias foram realizadas em microscópio eletrônico de varredura modelo Jeol modelo JSM 5800LV, operado a 10 kV, com escalas diretamente impressas nas imagens. A terminologia adotada para o tipo de deposição de cera epicuticular foi a de Barthlott et al. (1998).

2.4 Análise dos dados fenotípicos

A fim de diferenciar quantitativamente os tecidos e estruturas presentes em cada espécie do gênero em estudo, realizou-se a mensuração de 19 caracteres com auxílio do programa Image J, sendo estes: Espessura do mesofilo (1), Espessura da epiderme + hipoderme na face adaxial (2), Espessura da epiderme + hipoderme na face abaxial (3), Número de feixes vasculares principais (4), Comprimento dos feixes vasculares principais (5), Largura dos feixes vasculares principais (6), Espessura da bainha esclerenquimática dos feixes vasculares principais (7), Número de feixes vasculares secundários (8), Comprimento dos feixes vasculares secundários (9), Largura dos feixes vasculares secundários (10), Número de feixes de fibras não vasculares (11), Comprimento dos feixes de fibras não

121 vasculares (12), Largura dos feixes de fibras não vasculares (13), Comprimento do feixe vascular da margem (14), Largura do feixe vascular da margem (15), Espessura do feixe vascular da margem (16), Número de idioblastos (17), Comprimento dos idioblastos (18) e Largura dos idioblastos (19). Foi então realizada a descrição estatística dos dados, seguida pela análise de variância com pós-teste de Tukey, a fim de verificar a existência de diferenças entre as espécies estudadas.

A anatomia foliar das espécies de Acrocomia foi comparada quanto ao seu potencial diagnóstico para taxonomia com uso da análise de agrupamento. Foram analisados 77 caracteres anatômicos tanto descritivos (ex., tipo da deposição de cera epicuticular) quanto mensurados (ex. largura dos feixes vasculares principais) tabulados na forma de matriz binária descritos como presença (1) ou ausência (0) e então submetidos à análise de agrupamento, utilizando a distância euclidiana média e método UPGMA como algorítimo (Mantovani et al., 2010, Millán & Kahn 2010), com uso do programa PAST (Hammer et al. 2001), sendo considerada significativa se índice cofenético for superior a 0,7 (Valentin 2000). A estabilidade dos agrupamentos foi testada empregando o procedimento de reamostragem por 10000 aleatorizações bootstrap.

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Foram observadas diferenças relevantes entre os caracteres morfoanatômicos dos indivíduos das espécies estudadas de Acrocomia, que, além de descritas, foram demonstradas numericamente através de análises estatísticas.

3.1 Descrição anatômica

A epiderme e a hipoderme são semelhantes em todas as espécies de Acrocomia. A epiderme, tanto na face adaxial como na abaxial, em vista frontal é uniestratificada, apresenta células de formato hexagonal; paredes anticlinais retas espessadas e recobertas por cutícula (Figura 02 e Figura 03 B). Imediatamente abaixo da epiderme em ambas as faces é observada a hipoderme com uma única camada de células maiores que as da epiderme, sem espessamento de parede, normalmente sem cloroplastos, cujo maior comprimento da célula forma um ângulo reto com o maior comprimento da célula da epiderme (Figura 02 e Figura 03 A), caracteres comuns às Arecaceae (Tomlinson et al. 2011).

122

Os estômatos ocorrem em sua maioria na face abaxial dos folíolos sendo denominados hipoestomáticos; no entanto, nas espécies A. emensis, A. glaucescens e A. hassleri, os folíolos são anfiestomáticos, ou seja, é comum a ocorrência de estômatos em ambas as faces, sendo mais numerosos na face abaxial (Figura 02). No gênero em estudo, os estômatos são tetracíticos, organizados em fileiras longitudinais paralelas às nervuras e no mesmo nível das demais células epidérmicas (Figura 03 C). A presença de estômatos na em uma ou em ambas as superfícies do mesofilo e a localização destes em relação às demais células epidérmicas, no mesmo nível ou acima, podem ser características utilizadas para taxonomia (Henderson 2006).

Epiderm a Hipoder

Feixe vascular Feixe de fibra não vascular Estômat Feixe Microfeixe de fibra b vascular não vascular principal c

d e

f g

Figura 02. Secção transversal do mesofilo: a Acrocomia aculeata, b A. crispa, c A. emensis, d A. glaucescens, e A. hassleri, f A. intumescens, g A. totai. Barra = 200 µm.

123

Os tricomas ocorrem predominantemente na face abaxial, em maior ou menor número, dependendo da espécie de Acrocomia, sendo encontrados em maior quantidade em A. crispa, e em menor quantidade ou ausentes em A. emensis, A. hassleri e A. glaucescens. São multicelulares, ramificados com 1-5 ramificações (Figura 03 F).

a b c d b

e f g h

i j k l

m n o p

Figura 03. Acrocomia spp.: a Epiderme em vista frontal, b Epiderme e hipoderme em secção transversal, c Epiderme abaxial e estômatos, d Estômatos em secção transversal, e Tricomas em vista frontal, f Tricomas em detalhe em vista frontal, g Feixe vascular principal, h Feixe vascular secundário, i Feixe de fibra não vascular, j Corpos silicosos associados aos feixes de fibras não vasculares, k Mesofilo, l Bainha esclerenquimática, m Idioblasto com ráfides, Ráfides, o Células de expansão na nervura central, p Venação.

124

As espécies arbóreas A. aculeata, A. crispa, A. intumescens e A. totai apresentam folíolos com simetria dorsiventral, com 3 a 5 camadas de células parenquimáticas mais alongadas próximas à face adaxial e de 5 a 8 camadas de células parenquimáticas arredondadas mais próximas à face abaxial. (Figura 02). As espécies acaulescentes A. hassleri e A. emensis e a espécie de pequeno porte A. glaucescens apresentam folíolos com simetria isolateral, com células parenquimáticas de formatos semelhantes em todo o mesofilo (Figura 02). Notou-se que as espécies com simetria isolateral são anfiestomáticas e com feixes de fibras não vasculares distribuídos aleatoriamente por todo o mesofilo, ao contrário das espécies com simetria dorsiventral, que são hipoestomáticas e com feixes de fibras não vasculares distribuídos de forma organizada no mesofilo. Considerando estas características pode-se separar as espécies em dois grupos: acaulescentes e arbóreas. Embora o mesofilo dorsiventral seja considerado raro em Arecaceae (Henderson, 2006), são encontrados trabalhos com sua ocorrência mencionada para algumas espécies, à exemplo de Oenocarpus spp. e Cocos nucifera L. (Silva & Potiguara 2008, Araújo et al., 2013). No entanto, embora apresentem simetrias diferenciadas, segundo Tomlinson et al. (2011) as células mais arredondadas, próximas à face abaxial não podem ser denominadas como parênquima esponjoso ou lacunoso, já que estas não apresentam espaço intercelular conspícuo, exceto próximo às câmaras subestomáticas.

Foram observados idioblastos com ráfides envoltas por material mucilaginoso (Figura 03 M), ocorrendo em maior ou menor quantidade, tendo sido observado o maior número em A. emensis (2,10 ± 1,17) e também em A. hassleri (1,23 ± 0,98). A ocorrência de idioblastos em maior quantidade nestas espécies acaulescentes provavelmente atua como mecanismo de proteção contra herbivoria, considerando que estas espécies são acaules e, portanto, com suas folhas em contato direto ou muito próximas ao solo, o que favorece o ataque de animais. Segundo Franceschi & Horner-Jr. (1980) e Franceschi & Nakata (2005), tais estruturas possuem implicações na proteção das plantas, já que as os idioblastos com ráfides podem tornar as folhas e outros órgãos menos palatáveis, consequentemente, atuando como mecanismo protetor contra a herbivoria. Não foi notado padrão diferenciado na distribuição dos idioblastos no mesofilo.

Ao longo do mesofilo de todas as espécies estudadas estão distribuídos feixes vasculares, que podem ser divididos em principal, secundário e até terciário. Os feixes vasculares principais variam em número e tamanho entre as espécies estudadas e estão dispostos paralelamente em relação ao eixo longitudinal da lâmina foliar, caracterizando o

125 padrão de venação paralelódromo (Figura 03 P). Esses feixes são envoltos total ou parcialmente por uma ou mais camadas de fibras esclerenquimáticas e estas, por sua vez, envoltas por uma camada de células parenquimáticas. Acrocomia emensis possui o maior número de feixes vasculares principais (5,70 ± 0,57) e A. totai, o menor número (1,80 ± 0,79).

Os feixes vasculares secundários são envoltos, geralmente, por uma bainha parenquimática e raramente também por esclerenquimática (Figura 02 e Figura 03 H); variando em número e tamanho, sendo encontrado o maior número de feixes secundários em A. totai (8,40 ± 0,97).

Nas espécies de Acrocomia estudadas os feixes de fibras não vasculares ocorrem isoladamente distribuídos no mesofilo, com padrão diferenciado quanto ao número, tamanho, distribuição e localização de acordo com a espécie (Figura 02 e Figura 03 I). Nas espécies acaulescentes, A. emensis, A. hassleri e A. glaucescens, estes feixes ocorrem em maior número, são de tamanhos variados e com distribuição aleatória e irregular no mesofilo, o que resulta em folíolos mais rígidos e menos flexíveis que as demais espécies do gênero. Nas espécies arbóreas, A. aculeata, A. intumescens e A. totai os feixes de fibras possuem tamanho semelhante (dentro de cada espécie) e com distribuição em intervalos quase regulares e próximos à superfície abaxial (A. aculeata e A. intumescens) ou adaxial (A. totai). Em A. crispa foi observado o maior número de feixes de fibras não vasculares (30,33 ± 6,37), o que pode ser explicado pelo fato de que essa espécie é a única a apresentar um grande número de “microfeixes” de fibras não vasculares regularmente distribuídos logo abaixo da hipoderme adaxial, além dos feixes de fibras não vasculares maiores e regularmente distribuídos próximos à face abaxial. Os “microfeixes” constituem uma característica que diferencia A. crispa das demais espécies do gênero.

As diferenças na quantidade, no tamanho e no padrão de distribuição dos feixes vasculares secundários e dos feixes de fibras não vasculares nas espécies de Acrocomia estudadas podem ser utilizadas como diferenciadoras para o gênero. Segundo Cutler (1978), os padrões de arranjo do tecido vascular na folha, exceto quanto ao número destes, são controlados geneticamente, portanto não sofrem quase nenhuma variação ambiental, constituindo-se assim em um caractere útil à distinção taxonômica.

Todas as espécies de Acrocomia estudadas apresentam corpos silicosos com base reta alargada e porção superior cônica, denominados estegmatas, podendo ocorrer em fileiras contínuas ou descontínuas associados aos feixes de fibras não vasculares. Cada estegmata contém apenas um corpo de sílica. Embora seja possível sua observação em microscopia

126

óptica (Figura 03 J), a microscopia eletrônica de varredura possibilitou um maior detalhamento na visualização dos estegmatas, que ocorrem dispostos em fileiras longitudinais associados paralelamente aos feixes de fibras não vasculares, apresentando paredes espessadas, arredondados, com base mais larga e com uma concavidade central na qual se encontra um corpo de sílica, globoso e de superfície espiculada semelhante a uma drusa (Figura 04). Segundo Moller & Rassmussen (1984), a ocorrência e morfologia dos estegmatas são geneticamente determinadas e, portanto, pouco influenciadas pelo ambiente, consequentemente, com valor taxonômico. A presença de estegmatas no grupo das Liliopsidas, à qual pertence a família Arecaceae, constitui uma característica plesiomórfica (Chase et al. 2000) e o formato e a localização destes, observados no presente trabalho, é característica unificadora para a subfamília Arecoideae, à qual pertence o gênero em estudo (Dransfield et al. 2008, Silva & Potiguara 2008 e 2009, Tomlinson et al. 2011).

a b

Figura 04. Acrocomia spp.: a Eletromicrografia de varredura de um feixe de fibras não vasculares com estegmatas associados paralelamente ao seu maior eixo, b Detalhe dos estegmatas, c Detalhe de um corpo silicoso arredondado com superfície espiculada (C). Barra = 10 u (A, B); 1 u (C).

A presença de sílica em tecidos vegetais está relacionada com a proteção mecânica contra o ataque de insetos e patógenos (Paviani 1972, Kikuchi et al. 2007, Silva & Potiguara

127

2009), controle da transpiração excessiva e retenção de água (Hanberlandt 1925, Sangster 1977), prevenção do colapso tecidual em condições de seca (Metcalfe & Chalk 1983) e com o equilíbrio das trocas térmicas com o meio externo (Adatia & Besford 1986). As funções de controle da transpiração e retenção de água são importantes a todas as espécies do gênero, já que se encontram distribuídas em regiões quentes e mais secas (Lorenzi et al. 2010). A função de proteção contra ataque de patógenos e pragas é importante, sobretudo para espécies acaulescentes, que pelo seu porte tornam-se mais suscetíveis.

3.2. Padrão de deposição de cera epicuticular

Foi observado por microscopia eletrônica de varredura que ambas as faces dos folíolos apresentam cobertura de cera epicuticular, variando de uma fina camada até densa cobertura e com padrão de deposição diferenciado entre as espécies.

Na face adaxial, A. aculeata apresenta padrão de deposição de cera epicuticular na forma de estrias (Figura 05 A). Em A. crispa a cera é depositada em forma de pequenos grumos e de modo esparso, sendo possível observar o contorno das células da epiderme (Figura 05 B). Acrocomia emensis é a única espécie do gênero a apresentar deposição de cera na forma de fios formando um emaranhado sobre a superfície foliar, e ao redor do ostíolo a forma de deposição é em forma de projeções cilíndricas poligonais (Figura 05 C). Em A. glaucescens são encontrados dois tipos de deposição de cera, sobre os feixes vasculares ocorrem na forma de estrias e entre as nervuras ocorrem como projeções cilíndricas poligonais (Figura 05 D). Em A. hassleri a cera é depositada na forma de estrias e também como projeções cilíndricas poligonais no ostíolo; além disso, são observadas deposições esparsas de cera na forma de cristais (Figura 05 E). Acrocomia intumescens apresenta deposição de cera ocorrendo na forma de estrias e em pequenos grumos (Figura 05 F). Em A. totai foi observado depósito de cera ocorrendo na forma de escamas sobrepostas (Figura 05 G).

Quando observada a face abaxial, notamos que todas as espécies de Acrocomia apresentam deposição de cera epicuticular como projeções cilíndricas poligonais e fios. A quantidade de cera ocorre em tal quantidade que chega a obstruir os ostíolos.

128

a b

1400 x 10 kv 10 u 650 x 10 kv 10 u

c d

750 x 10 kv 10 u 1200 x 10 kv 10 u

e f

1200 x 10 kv 10 u 1200 x 10 kv 10 u

1200 x 10 kv 10 u

Figura 05. Padrões de deposição de cera epicuticular na face adaxial nos folíolos de: a Acrocomia aculeata, b A. crispa, c A. emensis, d A. glaucescens, e A. hassleri, f A. intumescens, g A. totai.

129

Todas as espécies estudadas apresentam grande quantidade de cera epicuticular, exceto A. crispa, que possui grumos esparsos. As espécies possuem padrão diferenciado do tipo de deposição ou ornamentação de cera epicuticular, podendo ser utilizada assim como característica adicional à diferenciação taxonômica em Acrocomia. Segundo Stace (1965) e Metcalfe & Chalk (1979), fatores ambientais podem ou não influenciar o tipo de disposição de cera. Alguns trabalhos verificaram padrão semelhante da ornamentação da cera epicuticular em plantas originadas de ambientes distintos (Metcalfe & Chalk 1979, Vieira & Gomes 1995, Mantovani et al. 1995), demonstrando que o fator diferenciador para tipo de deposição é a constituição genética da espécie e não o ambiente.

3.3 Nervura central

Nas espécies estudadas a nervura central em secção transversal apresenta-se mais proeminente abaxialmente. No limite do mesofilo com a nervura central, subjacente à epiderme abaxial na maioria das espécies de Acrocomia, ocorrem células parenquimáticas em paliçada com paredes espessadas, denominadas em palmeiras como tecido de expansão (Figura 06).

Em A. aculeata, na nervura central, foram observados dois feixes vasculares opostos com xilema voltado para dentro e floema voltado para a face externa do córtex, envoltos por 3 ou mais camadas de fibras esclerenquimáticas. O córtex é constituído por 2 a 3 camadas de células parenquimáticas. No limite entre a nervura e o mesofilo ocorrem 1 ou 2 camadas de células de expansão (Figura 06 A).

Acrocomia crispa apresenta nervura central com um feixe vascular maior próximo à face abaxial e outros dois menores paralelos mais próximos à face adaxial. Os feixes vasculares possuem xilema voltado para dentro e floema voltado para face externa do córtex. Estes são envolvidos por 3 a 6 camadas de fibras esclerenquimáticas. Entre os feixes vasculares ocorrem células parenquimáticas com paredes espessas próximas aos feixes vasculares, e as demais sem espessamento. O córtex é formado por 2 a 5 camadas de células. Foram observadas duas camadas de células de expansão na região entre o mesofilo e a nervura, sendo a primeira camada composta por células bem alongadas e a segunda camada com células menores (Figura 06 B).

130

a b

c d

e f

Figura 06. Secções transversais da nervura dos folíolos de: a Acrocomia aculeata, b A. crispa, c A. emensis, d A. glaucescens, e A. hassleri, f A. intumescens, g A. totai. Barra = 200 µm

131

Em A. emensis foram observados de 3 a 5 feixes distribuídos mais próximos ao córtex, são envolvidos externamente por 3 a 8 camadas de fibras esclerenquimáticas. O córtex apresenta de 3 a 10 camadas de células, sendo também observados vários feixes de fibras não vasculares desordenadamente dispersos. Entre a nervura e o mesofilo ocorrem 2 a 3 camadas de células de expansão (Figura 06 C).

Acrocomia glaucescens possui nervura central composta por um único feixe vascular centralizado, parcialmente coberto externamente por 5 a 7 camadas de fibras esclerenquimáticas e internamente por células parenquimáticas sem espessamento. O córtex apresenta de 2 a 3 camadas de células. No limite entre a nervura e o mesofilo foram observadas duas camadas de células de expansão alongadas (Figura 06 D).

Acrocomia hassleri apresenta nervura central com vários feixes vasculares desordenadamente distribuídos, estando alguns destes envolvidos por 1 a 2 camadas de fibras esclerenquimáticas individualmente e o conjunto de feixes envolvidos por mais de 10 camadas de fibras esclerenquimáticas. Entre os feixes vasculares ocorrem células parenquimáticas lignificadas desordenadamente distribuídas. O córtex é composto por 2 a 7 camadas de células parenquimáticas, sendo também observados vários feixes de fibras não vasculares. Entre a nervura e o mesofilo ocorrem três camadas de células de expansão, no entanto, pouco mais curtas e mais largas comparativamente às demais espécies (Figura 06 E).

Na nervura central em A. intumescens foram observados três feixes vasculares dispostos em semicírculo mais próximos à face abaxial e dois feixes vasculares paralelos localizados mais próximos à face adaxial, parcialmente envoltos por 1 a mais de 10 camadas de fibras esclerenquimáticas. Entre os feixes ocorrem células parenquimáticas sem espessamento. Os feixes vasculares possuem xilema voltado para dentro e floema voltado para a face externa do córtex. O córtex possui de 1 a 6 camadas de células parenquimáticas. Não foram observadas células de expansão (Figura 06 F).

Acrocomia totai possui nervura central com 3 a 5 feixes vasculares dispostos próximos ao córtex e dois feixes vasculares maiores dispostos na região central. Cada feixe, individualmente, é parcialmente envolto por 2 a 5 camadas de fibras esclerenquimáticas e, em conjunto, os feixes são envolvidos por 5 a mais de 10 camadas de fibras esclerenquimáticas. As células parenquimáticas que ocorrem entre os feixes vasculares não apresentam espessamento. O córtex é composto por 2 a mais de 10 camadas de células parenquimáticas, sendo também observados feixes vasculares secundários e feixes de fibras não vasculares. No

132 limite entre a nervura e o mesofilo foram observadas duas camadas de células de expansão alongadas (Figura 06 G).

Nas espécies de Acrocomia analisadas o padrão de distribuição dos tecidos e de estruturas anatômicas na região da nervura central permite a diferenciação das espécies estudadas. Outros trabalhos realizados (Glassman, 1972; D’Arcy & Keating, 1979; Silva & Potiguara, 2008) demonstraram que a anatomia da nervura central pode ser um caractere útil à identificação e separação de espécies pertencentes ao mesmo gênero. Como característica comum à maioria das espécies foi observada a presença de tecido de expansão no limite entre o mesofilo e a nervura central.

3.4 Margem

A margem do folíolo em A. aculeata é arredondada sem feixe vascular, ou quando presente é pequeno. As demais espécies do gênero apresentam margem quadrangular e um feixe vascular grande na margem. Esses feixes variam em tamanho e na quantidade de fibras esclerenquimáticas que os envolvem. As maiores médias do comprimento e largura (μm) do feixe da margem, em corte transversal, foram observadas em A. emensis (155,55 ± 11,62; 101,55 ± 6,59, respectivamente). O mesofilo, a epiderme e as demais estruturas presentes na margem são semelhantes ao restante do folíolo (Figura 07). Tal caractere pode ser um adicional à delimitação taxonômica de Acrocomia. Noblick (2013), Bieras & Sajo (2005) e Scatena et al. (2005), demonstraram que a morfoanatomia da margem do folíolo pode ser utilizada para diferenciação de espécies.

133

a b

c d

e f

Figura 07. Secções transversais mostrando a margem dos folíolos de: a Acrocomia aculeata, b A. crispa, c A. emensis, d A. glaucescens, e A. hassleri, f A. intumescens, g A. totai.

134

3.5 Testes histoquímicos

Compostos lipolíficos, tais como cutina, suberina e outros foram detectados em todas as espécies, sendo que a principal estrutura que apresentou reação positiva Sudan IV foi a cutícula, variando apenas na intensidade, sendo mais espessa em A. crispa, A. emensis e A. glaucescens. A cutícula, nas espécies estudadas pode ser encontrada em ambas as faces. O teste com Lugol foi negativo para todas as espécies, o que indica a ausência de amido nas folhas deste gênero. A reação ao teste com Vermelho de Rutênio foi positiva para todas as espécies em todas as estruturas, sendo mais intensa na parede periclinal interna da hipoderme de A. crispa, A. emensis e A. glaucescens. O reagente floroglucinol demonstrou a presença de lignina nas fibras de esclerênquima associadas aos feixes vasculares e nos elementos do tecido vascular, onde normalmente estão presentes, apresentando maior intensidade em A. emensis. Algumas células, maiores que as demais do parênquima, foram evidenciadas com o uso do cloreto férrico indicando a reação positiva para compostos fenólicos em geral nas espécies A. emensis, A. glaucescens e com maior intensidade em A. crispa.

3.6 Análise dos dados fenotípicos

Os testes estatísticos foram realizados como análise complementar à descrição anatômica, apontando diferenças significativas para a maior parte dos caracteres avaliados demonstrando numericamente as diferenças da anatomia foliar das espécies de Acrocomia avaliadas. Foi encontrada diferença significativa (p<0,05) entre as médias dos 19 caracteres submetidos à ANOVA com pós-teste de Tukey entre as espécies (Tabela 02).

Dentre as espécies estudadas A. emensis apresentou os maiores valores quanto ao número de feixes vasculares principais (5,70 ± 0,57), comprimento dos feixes vasculares principais (159,00 ± 20,95), largura dos feixes vasculares principais (90,30 ± 25,35), espessura da bainha esclerenquimática dos feixes vasculares principais (38,00 ± 11,96), comprimento dos feixes vasculares secundários (50,30 ± 11,36), largura dos feixes vasculares secundários (35,50 ± 5,80), comprimento do feixe vascular da margem (155,55 ± 11,62), largura do feixe vascular da margem (101,55 ± 6,59), espessura da bainha esclerenquimática do feixe vascular da margem (80,25 ± 11,97) e o maior número de idioblastos (2,10 ± 1,17).

135

Tabela 02. Média e desvio padrão de 19 caracteres da anatomia foliar das espécies estudadas de Acrocomia. Item Aa Ac Ae Ag Ah Ai At 1 129,00 ± 15,86b 111,50 ± 28,35c 162,50 ± 16,26a 156,00 ± 6,81a 169,17 ± 15,15a 135,17 ± 8,99b 122,10 ± 11,35bc 2 22,55 ± 7,05b 21,73 ± 3,69b 21,8 ± 21,5b 5,75 ± 2,35b 19,80 ± 7,53b 21,17 ± 5,59b 31,00 ± 6,58a 3 25,10 ± 5,81abc 25,80 ± 6,51ab 26,55 ± 5,78ab 21,05 ± 5,51bc 20,87 ± 8,27c 27,23 ± 5,69a 22,50 ± 3,35abc 5 2,20 ± 0,51c 5,17 ± 1,26b 5,70 ± 0,57a 3,75 ± 0,65b 3,57 ± 0,73b 3,55 ± 1,67b 1,80 ± 0,79c 5 82,55 ± 50,05cd 127, 83 ± 50,50ab 159,00 ± 20,95a 97,5 ± 16,50d 117,73 ± 32,60bc 82,80 ± 35,57d 102,50 ± 11,85cd 6 69,60 ± 22,50ab 88,57 ± 33,15a 90,30 ± 25,35ab 67,05 ± 12,20b 75,57 ± 28,50ab 59,07 ± 27,02b 83,00 ± 15,18ab 7 18,70 ± 8,07cd 22,08 ± 10,6cd 38,00 ± 11,96a 26,65 ± 10,89bc 30, 57 ± 11,59ab 7,53 ± 5,19e 15,10 ± 5,17de 8 5,55 ± 1,05d 7,5 ± 1,51ab 5,00 ± 0,72e 6,55 ± 0,76c 6,8 ± 0,85bc 5,55 ± 0,95d 8,50 ± 0,97a 9 26,50 ± 5,67c 35,20 ± 10,15ab 50,30 ± 11,36a 31,95 ± 6,16bc 31,17 ± 6,02bc 35, 23 ± 9,13ab 33,90 ± 9,68abc 10 25,75 ± 5,29b 30,67 ± 7,20ab 35,50 ± 5,80a 30,50 ± 6,55ab 31,57 ± 5,95a 33,70 ± 6,79a 31,00 ± 5,75ab 11 6,20 ± 1,36f 30,33 ± 6,37a 18,60 ± 1,88c 15,05 ±2,56d 21,80 ± 2,33b 7,55 ± 2,19ef 11,00 ± 1,70e 12 25,75 ± 6,80ab 22,23 ± 7,66b 28,10 ± 13,18ab 32,95 ± 8,66a 22,03 ± 8,10b 26,57 ± 9,75ab 29,00 ± 5,68ab 13 22, 90 ± 5,21ab 18,87 ± 7,27b 22,50 ± 9,77ab 29,15 ± 6,17a 17,93 ± 7,05b 25,23 ± 10,05a 25,10 ± 5,15ab 15 28,75 ± 29,71d 113,50 ± 37,56b 155,55 ± 11,62a 66,50 ± 61,18c 95,30 ± 51,30bc 106,00 ± 12,73b 87,50 ± 5,86bc 15 18,05 ± 18,85e 67,73 ± 22,58c 101,55 ± 6,59a 57,25 ± 9,93cd 51,53 ± 13,37d 71,00 ± 6,65bc 85,00 ± 5,16b 16 5,70 ± 6,21e 58,07 ± 23,53bc 80,25 ± 11,97a 51,35 ± 8,50d 56,10 ± 23,99cd 65,95 ± 19,18ab 57,00 ± 5,83bcd 17 0,95 ± 1,15bc 0,37 ± 0,56c 2,10 ± 1,17a 0,50 ± 0,50bc 1,23 ± 0,98b 1,35 ± 0,99ab 0,50 ± 0,70bc 18 26,65 ± 6,52abc 30,83 ± 7,71a 28,80 ± 9,18ab 25,05 ± 6,56bc 21,33 ± 3,63c 25,00 ± 5,25bc 29,60 ± 6,06ab 19 25,75 ± 5,92a 28,50 ± 6,06a 27,55 ± 23,80a 7,82 ± 7,01a 23,07 ± 5,75a 28,00 ± 5,11a 29,20 ± 7,58a Aa – Acrocomia aculeata, Ac – A. crispa; Ae – A. emensis, Ag – A. glaucescens, Ah – A. hassleri, Ai – A. intumescens, At – A. totai. * Letras iguais na mesma linha não diferem entre si estatisticamente pelo teste de Tukey (p = <0,005). Os valores dos itens de comprimento, largura e espessura são dados em µm. Espessura do mesofilo (1),

136

Espessura da epiderme + hipoderme na face adaxial (2), Espessura da epiderme + hipoderme na face abaxial (3), Número de feixes vasculares principais (5), Comprimento dos feixes vasculares principais (5), Largura dos feixes vasculares principais (6), Espessura da bainha esclerenquimática dos feixes vasculares principais (7), Número de feixes vasculares secundários (8), Comprimento dos feixes vasculares secundários (9), Largura dos feixes vasculares secundários (10), Número de feixes de fibras não vasculares (11), Comprimento dos feixes de fibras não vasculares (12), Largura dos feixes de fibras não vasculares (13), Comprimento do feixe vascular da margem (15), Largura do feixe vascular da margem (15), Espessura do feixe vascular da margem (16), Número de idioblastos (17), Comprimento dos idioblastos (18) e Largura dos idioblastos (19).

A análise dos 77 caracteres da anatomia foliar utilizados para da análise de agrupamento resultou na separação das espécies de Acrocomia analisadas conforme ilustrado na Figura 08 com índice cofenético de 0,8.

Figura 08. Análise de agrupamento obtida por distância euclidiana e UPGMA, baseada na presença e ausência de caracteres anatômicos distintos dos folíolos de Acrocomia spp.

As espécies de Acrocomia avaliadas mostraram-se distintas anatomicamente, fato que reforça a distinção taxonômica com base morfológica adotada no presente trabalho. A análise de agrupamento dividiu as espécies em dois grandes grupos, um com as espécies de

137 porte arbóreo (A. aculeata, A. crispa, A. intumescens e A. totai) e outro com as espécies acaulescentes e a espécie de baixo porte (A. emensis, A. hassleri e A. glaucescens), resultado muito interessante, já que esta análise que utilizou somente caracteres da anatomia foliar combinada com as observações morfológicas realizadas e a descrição das espécies aceitas por Lorenzi et al. (2010), que utilizam somente dados de morfologia (Figura 08). Destaca-se que as amostras utilizadas no presente trabalho são de diferentes origens, sendo a maior parte delas proveniente da coleção viva de dois jardins com ambientes diferenciados, além disso, quando possível, foram realizadas coletas em áreas nativas com outros tipos de ambiente, no entanto, a variação anatômica encontrada entre as espécies foi altamente significativa, demonstrando que as características avaliadas são controladas geneticamente, sofrendo pouca influência ambiental.

As espécies acaulescentes são caracterizadas principalmente por apresentar folíolos anfiestomáticos, ter um alto número de feixes de fibras não vasculares (23 a 31.800.µm-1) distribuídos desordenadamente no mesofilo. Por sua vez, as espécies de porte arbóreo apresentam folíolos hipoestomáticos e um menor número de feixes de fibras não vasculares distribuídos seguindo um padrão, conforme ilustrado na Figura 08.

Diversos trabalhos publicados com as palmeiras Acrocomia do Mato Grosso do Sul, região onde ocorre a espécie A. totai, a consideram como sinonímia de A. aculeata (Pott & Pott 1994, Scariot 1998, Hiane et al. 2005, Ciconini et al. 2013), assim como A. intumescens, espécie distribuída somente em algumas áreas da região Nordeste, também considerada como sinonímia de A. aculeata. No entanto, além das diferenças morfológicas existentes, os dados de anatomia foliar do presente trabalho reforçam a distinção das três espécies em questão.

O gênero monotípico foi descrito por Martius em 1825 utilizando como espécie tipo Acrocomia sclerocarpa, chamada até então de Cocos aculeata, descrita inicialmente por Jacquin em 1763. Posteriormente, Bailey (1858-1955) publicou diversos trabalhos sobre Acrocomia, descrevendo várias espécies do gênero, aparentemente diferenciadas por seu local de ocorrência como se fossem endêmicas de cada região. Para Bailey existiam 29 espécies de Acrocomia distribuídas principalmente nos países da América Central. Todavia, a descrição das novas espécies de Acrocomia realizadas por Bailey foram breves e vagas, sem discussões sobre as características morfológicas que as diferenciavam (Boer 1965). Outras espécies de Acrocomia foram descritas posteriormente em diferentes países das Américas (Tropicos 2015). The Plant List (2013) considera válida a existência de uma

138 oitava espécie de Acrocomia, A. media O.F. Cook, como endêmica da região de Porto Rico e das Ilhas Virgens, no entanto, não existem muitas informações a respeito da espécie. A descrição morfológica atual mais completa encontrada é de Proctor (2005), que a diferencia de A. aculeata pela menor altura das plantas, apresentando entre 5 a 10 m, podendo chegar a 15 m, folhas maiores e espatas menores. Porém, as informações morfológicas dadas não são suficientes para que A. media seja considerada diferente de A. aculeata, já que a variabilidade fenotípica da última espécie citada é grande, devido principalmente à sua ampla região de ocorrência. Nas áreas visitadas pelos autores com plantas tipicamente A. aculeata em várias localidades espalhadas pelas Américas, foram encontrados espécimes com a mesma descrição de A. media. Soma-se ao fato que, devido a essa notação de A. media como espécie válida, foram realizados cortes de indivíduos oriundos de duas localidades de Porto Rico (Coamo e Ponce) e estas, foram anatomicamente semelhantes à A. aculeata. Ainda, destaca-se que as plantas de Porto Rico encontram-se cultivadas no MBC, juntamente com os demais espécimes utilizados no presente estudo, reforçando o fato de que a variação morfológica encontrada pelo autor (Proctor, 2005) provavelmente é em função do ambiente.

Quanto às espécies acaulescentes, foram originalmente descritas em Acanthococos por Barbosa Rodrigues em 1900, utilizando como espécie tipo Acanthococos hassleri, proveniente da região central do Brasil. Em 1952, Toledo descreveu uma nova espécie, então denominada como Acanthococos emensis. No ano de 1991, Acanthococos hassleri é transferida para Acrocomia hassleri e Acanthococos emensis é colocada como sinonímia de Acrocomia hassleri. No ano de 2010, Lorenzi et al. sugerem a revalidação do nome Acanthococos emensis e sua transferência para o gênero Acrocomia sob o nome de Acrocomia emensis, por se tratarem de espécies morfologicamente diferentes. Porém, os mesmos autores relatam que adotaram o gênero Acanthococos como sinonímia de Acrocomia em função de estudos filogenéticos, ou seja, não pela morfologia e, embora tais estudos tenham analisado a relação entre os cinco gêneros de Bactridinae, muito conflito e ambiguidade ainda permanecem em sua filogenia. Fato é que as espécies Acrocomia emensis e Acrocomia hassleri são morfologicamente bem diferentes das demais espécies de Acrocomia. São as únicas espécies acaulescentes, com rizoma subterrâneo, com folhas emergindo ao nível do solo, de coloração glauca e folíolos mais espessos e rígidos. As secções transversais realizadas nos folíolos das duas espécies comprovaram a maior espessura do mesofilo (162,50 ± 16,26 e 169,17 ± 15,15, respectivamente)

139 comparativamente às demais espécies. A rigidez dos folíolos nas duas espécies acaulescentes é conferida pelo maior número de feixes não vasculares distribuídos por todo o mesofilo, maior número de idioblastos com ráfides e maior espessura da bainha esclerenquimática associada aos feixes vasculares principais, características significadamente maiores em relação às demais espécies de Acrocomia estudadas (Tabela 02).

A espécie A. crispa, anteriormente denominada Gastrococos crispa, difere de A. aculeata principalmente por apresentar pétalas conadas nas flores pistiladas, com as demais características morfológicas semelhantes e, por isso, transferida para o gênero Acrocomia. Outro fator que colaborou com a transferência de Gastrococos crispa para Acrocomia foi o estudo filogenético realizado por Gunn (2005), que resolveu um clado incorporando Gastrococos dentro de Acrocomia.

Em vista do exposto, acredita-se na existência de um maior número de espécies de Acrocomia do que as duas aceitas por Henderson et al. (2005), ao menos três a mais: A. crispa, A. intumescens e A. totai. As espécies acaulescentes A. emensis e A. hassleri, parecem realmente pertencer ao gênero Acanthococos, devido à grande diferença morfológica e anatômica existentes. No entanto, é necessária uma revisão taxonômica mais abrangente do gênero, com maior número de amostras de diferentes localidades, sobretudo oriundas das inúmeras ilhas da América Central onde a espécie validada como A. aculeata ocorre, e que outrora era denominada com outros nomes. Além da taxonomia clássica, é importante a utilização de outras técnicas, tais como estudos de anatomia foliar, floral e de frutos, caracterização polínica, estudos de diversidade genética e filogenéticos. O presente trabalho diferenciou sete espécies, constituindo-se numa importante contribuição para resolução taxonômica de Acrocomia, no entanto, reforçamos que um maior número de estudos devem ser realizados, principalmente devido ao fato de sua grande importância econômica e o início das pesquisas com melhoramento que estão sendo realizadas sem se ter o devido conhecimento sobre as diferentes espécies e, consequentemente, sua distribuição geográfica, o que pode prejudicar a conservação das populações nativas de cada espécie em seu habitat.

140

3.7 Chave de identificação anatômica para as espécies estudadas de Acrocomia Mart.

Para facilitar a identificação das espécies de Acrocomia, complementando os dados de morfologia, foi elaborada uma chave de identificação com baseada somente em caracteres anatômicos e a representação gráfica da distribuição das suas estruturas e tecidos (Figura 09).

1. Folíolo anfiestomático; feixes de fibras não vasculares distribuídos por todo o mesofilo ...... 2

1’. Folíolo hipoestomático; feixes de fibras não vasculares distribuídos próximos a uma ou duas das superfícies dos folíolos ...... 5

2. Superfície dos folíolos reta ...... A. emensis

2’. Superfície dos folíolos sinuosa ...... 3

3. Superfície dos folíolos muito sinuosa dada por constrições na altura dos feixes vasculares principais; feixes vasculares secundários distribuídos na porção intermediária do mesofilo; estômatos em grande número frequentemente ocorrendo aos pares ...... A. hassleri

3’. Superfície dos folíolos apenas levemente sinuosa, feixes vasculares secundários distribuídos mais próximos à face abaxial; estômatos distribuídos regular e isoladamente ...... A. glaucescens

5. Feixes não vasculares distribuídos apenas próximos à face adaxial; microfeixes de fibras não vasculares ausentes ...... A. totai

5’. Feixes de fibras não vasculares apenas próximos à face abaxial; microfeixes de fibras não vasculares, se presentes, apenas abaixo da hipoderme ...... 5

5. Microfeixes de fibras não vasculares presentes abaixo da hipoderme da face adaxial; feixes de fibras não vasculares intercalados por 1-3 feixes vasculares secundários ...... A. crispa

141

5’. Microfeixes de fibras não vasculares ausentes; feixes de fibras não vasculares intercalados por 1-2 feixes vasculares secundários ...... 6

6. Feixes de fibras não vasculares intercalados por um único feixe vascular secundário ...... A. aculeata

6’. Feixes de fibras não vasculares intercalados por 1-2 feixes vasculares secundários ...... A. intumescens

a b

c d

e f

Figura 09. Representação gráfica da organização das estruturas e tecidos do mesofilo de: a Acrocomia aculeata, b A. crispa, c A. emensis, d A. glaucescens, e A. hassleri, f A. intumescens e g A. totai.

142

4 CONCLUSÕES

As sete espécies estudadas apresentam grande variabilidade tanto ao nível morfológico quanto anatômico, com diferenças significativas na organização dos tecidos e no tamanho e número das estruturas presentes nos folíolos. Os resultados e discussões apresentados constituem uma contribuição pioneira e inédita para solucionar a taxonomia das espécies de Acrocomia, frente à diversidade deste gênero, sendo necessários outros estudos para o esclarecimento de sua taxonomia e filogenia. Sua resolução permitirá melhor entendimento sobre sua distribuição geográfica e, consequentemente, sobre a fenologia, polinização, dispersão, produção, aspectos químicos e fisiológicos de cada espécie, estudos estes tão importantes para o sucesso nos trabalhos de pré-melhoramento, que já estão sendo realizados, visando também a conservação das espécies em seus ambientes naturais.

143

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149

CAPÍTULO III

Anatomia e histoquímica do mesocarpo de espécies de Acrocomia Mart. (Arecaceae) - Implicações taxonômicas e tecnológicas

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Anatomia e histoquímica do mesocarpo de espécies de Acrocomia Mart. (Arecaceae) - Implicações taxonômicas e tecnológicas

Suelen Alves Vianna1, Sandra Maria Carmello Guerreiro2, Carlos Augusto Colombo3

1 Instituto Agronômico de Campinas (IAC) – Curso de Pós-Graduação em Agricultura Tropical e Subtropical 2 Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) – Instituto de Biologia, Departamento de Biologia Vegetal 3 Instituto Agronômico de Campinas (IAC) – Centro de Recursos Genéticos Vegetais

RESUMO

Foi realizada a descrição morfoanatômica e a análise histoquímica do mesocarpo de Acrocomia aculeata, A. crispa, A. glaucescens, A. intumescens e A. totai, palmeiras com múltiplas utilidades e com grande potencial econômico, sobretudo para extração de óleo. Foram selecionados frutos de A. aculeata com extremos para maior e menor teor de óleo, a fim de verificar a existência de relação entre a quantificação química do óleo e as estruturas produtoras de óleo. Foi constatada que a produção e a reserva do óleo nas espécies de Acrocomia são realizadas por organelas denominadas oleossomos, presentes nas células parenquimáticas do mesocarpo, não sendo possível sua quantificação e mensuração com uso de microscopia óptica. Outras substâncias tais como amido, mucilagem e compostos fenólicos foram detectadas, todas com potencial para uso industrial. Todas as espécies analisadas apresentam potencial para extração de óleo e como alimento funcional.

Palavras-chave: belly palm, bocaiúva, macaíba, macaúba, oleaginosa

151

ABSTRACT

Anatomy and histochemistry of mesocarp of species of Acrocomia Mart. (Arecaceae) - taxonomic and technological implications - We performed the morphoanatomical description and histochemical analysis of mesocarp Acrocomia aculeata, A. crispa, A. glaucescens, A. intumescens and A. totai, palm trees with multiple uses and with great economic potential, especially for oil extraction. We selected fruits of A. aculeata with higher and lower oil content, to check relationship between chemical quantification of oil and producing anatomical structures of oil. It was found that the production and oil reserves in species Acrocomia are performed by organelles called oleossomos, present in the parenchymal cells of the mesocarp, it is not possible quantification and measurement with the use of optical microscopy. Other substances such as starch, mucilage and phenolic compounds were identified, all with the potential for industrial use. All species analyzed have potential for oil extraction and as a functional food.

Key words: belly palm, bocaiúva, macaíba, macaúba, oleaginous plant

1 INTRODUÇÃO

As palmeiras do gênero Acrocomia Mart. estão amplamente distribuídas pelas Américas tropical e subtropical, sendo encontradas populações naturais desde o sul do México até o norte da Argentina. No Brasil, ocorre em todo o território nacional, exceto na região amazônica, contemplando climas, relevo, solos e formações vegetacionais diferenciadas. O gênero pertence à subfamília Arecoideae, tribo Cocoeae e subtribo Bactridinae, a última sendo representada por gêneros de palmeiras espinescentes (Acrocomia, Aiphanes Willd., Astrocaryum G. Mey., Bactris Jacq. ex Scop. e Desmoncus Mart.) com distribuição restrita às Américas, particularmente na América do Sul (Dransfield et al. 2008).

The Plant List (2013), que organiza os dados de todas as espécies conhecidas mundialmente, reconhece a existência de oito espécies para o gênero: A. aculeata (Jacq.) Lodd ex Mart., A. crispa (Kunth) C.F. Baker ex Becc., A. emensis (Toledo) Lorenzi, A. glaucescens Lorenzi, A. hassleri (Barb. Rodr.) W.J. Hahn, A. intumescens Drude, A. media O.F. Cook e A. totai Mart. (Figura 01).

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a b c d e

f g h

Figura 01. Hábito das espécies reconhecidas em Acrocomia: a A. aculeata, b A. crispa, c A. intumescens, d A. media, e A. totai, f A. emensis, g A. glaucescens e h A. hassleri.

Acrocomia aculeata, A. crispa, A. intumescens, A. media e A. totai, apresentam porte arbóreo, podendo ultrapassar os 10 m de altura, a espécie A. glaucescens é muito variável ao longo de sua área de distribuição quanto à altura, sendo encontrados indivíduos com 1,5 m até indivíduos com 6,5 m de altura, e as espécies A. emensis e A. hassleri não possuem estipe e sim rizoma subterrâneo, sendo consideradas palmeiras “acaulescentes” (Lorenzi et al., 2010).

As espécies de Acrocomia são utilizadas para diversos fins, podendo todas as suas partes ser aproveitadas, quer para subsistência quer para fins econômicos. As raízes são utilizadas medicinalmente, o estipe para construção e extração de fécula e seiva, as folhas são ótimas forrageiras para o gado bovino e equino ou para cobertura de casas, a espata é utilizada para fabricação de peças artesanais e seus frutos podem ser consumidos frescos ou processados com fins alimentares ou para extração de óleo para produção de biocombustíveis, cosméticos e outros (Pott 1986, Moraes 2004, Ramos et al. 2008 Conceição et al. 2012, Bran 2013, Berton 2013 Sierra-Pérez et al. 2014).

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O fruto é a estrutura resultante do desenvolvimento ou amadurecimento do ovário, tendo como função a proteção das sementes e sua dispersão, sendo constituído basicamente pelas sementes e pericarpo (Gonçalves & Lorenzi 2011, Souza et al. 2012). O pericarpo, segundo Spujt (1994), é originado da parede do ovário maduro excluindo a semente e pericarpo como o ovário maduro incluindo a semente. O pericarpo pode ser dividido em camadas, sendo estas, epicarpo, mesocarpo e endocarpo. No entanto, para Souza et al., (2012) a separação do fruto em diferentes partes deve ser utilizada apenas para fins didáticos, visto que entre estas existe uma relação de dependência estrutural, fisiológica e ecológica.

A classificação dos frutos em diferentes tipos possui grande importância para Taxonomia, permitindo a identificação de diferentes taxa. No entanto, devido ao fato de muitas das classificações botânicas se basearem apenas em dados morfológicos, erros ocorrem, o que ressalta a importância da realização de estudos de anatomia dos frutos como valiosa ferramenta à classificação do tipo de frutos e, consequentemente, à Taxonomia (Souza et al. 2012), como também podem fornecer valiosos dados para identificação de produtos de origem vegetal (Vaughan 1960). Um exemplo de classificação incorreta de fruto é citada por Araújo (2005), que encontrou na literatura a classificação para os frutos de Ocotea puberula (Rich.) Nees e Nectandra megapotamica (Spreng.) Mez definidos como baga, mas que de acordo com trabalho de ontogenia realizado por Souza et al. (2012), a origem das diferentes estruturas do fruto destas espécies são características do tipo drupa. Em Arecaceae existe grande variação dos frutos quanto ao tamanho, forma, cor, textura, composição e espessura do mesocarpo, número de sementes, variação do tipo de endosperma e posição do embrião (Dransfield et al. 2008), sendo popularmente chamados de “cocos” ou, se de menor tamanho, “coquinhos”, e as plantas que os produzem de “coqueiros” (Lorenzi et al. 2010). Podem ser do tipo baga quando o endocarpo é fino e do tipo drupa quando o endocarpo é pétreo e grosso (Vegas 2005, Dransfield et al. 2008). Em Acrocomia o fruto é do tipo drupa, com tamanho, coloração de epicarpo e mesocarpo variado; endocarpo pétreo fortemente aderido ao mesocarpo; semente com grande quantidade de endosperma sólido adnato ao endocarpo (Henderson et al. 1995, Dransfield et al. 2008; Lorenzi et al. 2010).

Segundo Dransfield et al. (2008), revisando trabalhos de anatomia de frutos em Arecaceae, notaram que as diferentes partes do fruto (epicarpo, mesocarpo e endocarpo) podem apresentar especializações na forma de estruturas e ou tecidos que determinam suas funções. Os mesmos autores citam o trabalho de Essig (1977), que encontrou características

154 no pericarpo que separam gêneros, subgêneros e espécies em Ptychospermatinae, e o trabalho de Essig & Young (1979), que separaram Arecinae em dois grupos com base na presença ou ausência de braquiesclereídes. Outro trabalho foi realizado por Vegas (2005), que pôde diferenciar espécies de Astrocaryum pelo uso de anatomia dos frutos. Assim, o conhecimento da anatomia dos frutos das palmeiras pode se constituir numa ferramenta útil para a taxonomia. A detecção de substâncias em frutos é de grande importância não só como característica que pode ser utilizada em taxonomia, como também para identificação de princípios ativos e outras substâncias, tais como óleos, que podem ser utilizados pela indústria (Dôres 2007). O valor comercial dos frutos e os tipos de processos industriais necessários, por exemplo, a extração de óleo, são determinados pela natureza e estrutura anatômica dos frutos (CETEC 1983). Umas das técnicas utilizadas para identificação de substâncias em vegetais é a histoquímica, que pela utilização de reagentes cito ou químico-histológicos permite observar diretamente nos tecidos vegetais os compostos químicos originários do metabolismo primário e secundário (Ascenção 2004, Dôres 2007). Ainda, de acordo com Pearse (1960), os testes histoquímicos revelam o caráter lipolífico (lipídios totais, lipídios insaturados, ácidos graxos e terpenóides) e ou hidrofílico (amido, pectinas, mucilagem, calose, proteínas, compostos fenólicos, ligninas, alcalóides e polissacarídeos) das substâncias ocorrentes nos vegetais. Dentre os vários usos das espécies de Acrocomia, destaca-se seu potencial para extração de óleo para produção de biocombustíveis, com potencial produtivo de 4.000-5.000 L.óleo.ha-1.ano-1, sem qualquer tipo de intervenção tecnológica. Vários trabalhos já foram realizados para determinar a quantidade e a qualidade do óleo dos frutos de A. aculeata (Amaral et al. 2011, Ciconini 2013, Berton, 2013), no entanto, não foram encontrados trabalhos avaliando o potencial de produção de óleo das outras espécies de Acrocomia, que podem ser úteis para tal finalidade. As demais espécies de Acrocomia, se apresentarem boa quantidade e qualidade de óleo, possuem vantagens sobre A. aculeata, por exemplo, A. intumescens não tem espinhos no estipe quando adultas, o que facilitaria seu manejo e colheita, e A. glaucescens é uma espécie de pequeno porte. Pretendeu-se com o presente trabalho verificar se as espécies Acrocomia crispa, A. glaucescens e A. intumescens apresentam óleo no mesocarpo, como também identificar em qual tecido e ou estrutura do mesocarpo onde esse óleo pode ser encontrado. Além disso, surgiu a hipótese da possibilidade de quantificar as estruturas produtoras de óleo no mesocarpo de cada espécie do gênero via microscopia óptica e, em caso afirmativo, testar a

155 correlação da quantificação feita por meio das análises anatômicas com a quantificação química.

2 MATERIAL E MÉTODOS

2.1. Coleta e preparo do material botânico Foram selecionados para o estudo frutos maduros de seis indivíduos de A. aculeata com valores extremos do teor de óleo, sendo três indivíduos com maior e três indivíduos com menor teor de óleo, a partir dos dados obtidos de uma avaliação realizada por Berton (2013), que quantificou o teor de óleo de um total de 32 plantas coletadas no estado de São Paulo. Tais frutos foram escolhidos para a realização dos cortes anatômicos a fim de verificar a existência de relação entre a quantidade de óleo a partir de dados de extração química e a quantidade de estruturas produtoras de óleo presentes no mesocarpo. Os frutos das demais espécies de Acrocomia foram analisados quanto à possiblidade de seu uso para extração de óleo por meio dos cortes histológicos. A relação dos espécimes utilizados pode ser visualizada na Tabela 01.

Tabela 01. Lista dos materiais de cinco espécies de Acrocomia utilizados para realização das análises de anatomia do fruto. Espécie Origem Local de Coleta Voucher ou Teor de No Amostra óleo (%) A. aculeata Lindóia, SP Lindóia, SP Planta 04 50,9 A. aculeata Santo Antônio da Posse, SP “Dobrado” Planta 06 44,12 A. aculeata Cajuru, SP “GIR” Planta 01 42,2 A. aculeata Lindóia, SP Lindóia, SP Planta 11 27,0 A. aculeata Itapira, SP “3 Nascentes” Planta 06 25,3 A. aculeata Itapira, SP “População anã” Planta 08 19,3 A. crispa Camagüey, Cuba MBC 96303*C - A. crispa Camagüey, Cuba MBC 9389*A - A. crispa Camagüey, Cuba MBC 9389*B - A. glaucescens Rondonópolis, MT Instituto Plantarum Planta 01 - A. intumescens Recife, PE Instituto Plantarum Planta 01 - A. intumescens Recife, PE Recife, PE Planta A - A. totai * Os teores de óleo foram determinados por Berton (2013). MBC: Montgomery Botanical Center, Miami, FL, EUA.

156

Os frutos selecionados foram fixados em FAA (Johansen, 1940) por 48 horas e armazenados em álcool etílico 70%. Posteriormente foi retirado um pequeno pedaço da parte central do fruto com auxílio de uma serra fita (Figura 02) e então desidratado em série etílica, com repouso de três horas em cada concentração de álcool. Após, o material passou por uma pré-infiltração em quatro etapas em uma solução com diferentes concentrações de resina sintética (Historesin ® Leica) e álcool (1:3, 1:1, 3:1 e resina pura). O material ficou imerso nas três primeiras etapas por 20 dias e em resina pura por 40 dias. Após a etapa final de pré- infiltração, o material foi emblocado em resina sintética, seccionado em micrótomo rotativo e corado com azul de toluidina 0,05% em tampão acetato 0,1 M (pH 4,7) (O’Brien et al. 1964). As lâminas foram montadas temporariamente em água e as imagens capturadas com câmera digital (Olympus DP71) acoplada ao microscópio óptico (Olympus BX51).

a b c

Figura 02. Preparo do fruto de Acrocomia spp. antes da pré-infiltração: a Serra-fita, b Pinça artesanal em madeira, c Detalhe da pinça com fruto, d Fatia da porção central do fruto.

Os frutos utilizados no estudo, total de cinco frutos de cada espécie, foram mensurados (cm) quanto ao seu diâmetro externo transversal (diâmetro), diâmetro externo longitudinal (comprimento), espessura do mesocarpo e espessura do endocarpo.

157

2.2 Testes histoquímicos

Quanto aos testes histoquímicos, foi utilizado Sudan IV glicerinado para detecção de lipídios totais (Pearse 1985), Lugol para detecção de amido (Gerlach 1984), Vermelho de Rutênio para detecção de substâncias pécticas, polissacarídeos e mucilagem ácida (Jensen 1962), Floroglucinol para detecção de lignina (Sass 1951), e Cloreto Férrico III para detecção de fenóis simples (Johansen 1940).

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 Aspectos morfológicos dos frutos de Acrocomia spp.

Existe variação das características biométricas dos frutos entre as espécies avaliadas neste estudo. As espécies A. aculeata, A. intumescens e A. totai, possuem frutos com maiores diâmetro e comprimento, espessura de mesocarpo e do endocarpo, respectivamente, comparativamente à espécie arbórea A. crispa e à espécie de baixo porte A. glaucescens, que apresentam os menores valores para as características avaliadas (Tabela 02 e Figura 03).

Tabela 02. Caracterização morfológica dos frutos de diferentes espécies de Acrocomia.

Espécie CF DF CrE CrM EM EE

A. aculeata 2,8-5,0 3,0-5,0 Variado Variado 0.5-1,1 0,35-0,65

A. crispa 1,6-2,2 1,7-2,2 Verde Não obs. 0,3-0,36 0,25-0,31

A. glaucescens 1,8-2,2 1,7-2,2 Verde - Pardo Amarelo claro 0,35-0,43 0,27-0,3

A. intumescens 3,1-4,5 3,1-4,5 Verde ou amarelo Amarelo 0,3-0,9 0,2-0,7

A. totai 2,0-4,1 2,3-4,3 Variado Variado 0,4-0,7 0,3-0,45

CF - Comprimento do fruto (cm); DF – Diâmetro do fruto (cm); CrE – Cor do epicarpo maduro; CrM – Cor do mesocarpo maduro; EM – Espessura do mesocarpo (cm); EE – Espessura do endocarpo (cm).

Neste caso, é importante ressaltar que o tamanho dos frutos não tem relação com o porte da planta, visto que a espécie A. crispa é de porte arbóreo e embora tenha cachos grandes, apresenta frutos pequenos (1,6-2,2 x 1,7-2,2 cm), semelhantes ao tamanho dos frutos de A. glaucescens (1,8-2,2 x 1,7-2,2cm), espécie de pequeno porte. O tamanho dos frutos em

158

Arecaceae é muito variável, com frutos com 0,4 cm em espécies de Geonoma Willd., a 50 cm de comprimento e 18 kg em Lodoicea Comm. ex DC. (Uhl & Dransfield 1987).

a b

c d

Escala: cm. Fotos a, b, c e d: Lorenzi et al. (2010). Foto e: The Palm Nuts Pages (2015).

Figura 03. Variação morfológica dos frutos de: a Acrocomia aculeata, b A. glaucescens, c A. intumescens, d A. totai, e A. crispa.

3.2 Descrição anatômica do mesocarpo

As espécies analisadas de Acrocomia apresentam a morfoanatomia do mesocarpo semelhante, não representando um caractere útil para taxonomia do gênero (Figura 04).

159

a b CM Pr

c d Ccf FV

Pr = células parenquimáticas, CM = cavidades de mucilagem, Ccf = célula com composto fenólico, FV = feixe vascular.

Figura 04. Secção do mesocarpo de: a Acrocomia aculeata, b A. crispa, c A. glaucescens, d A. intumescens e e A. totai. Barra: 1.0 mm.

160

O mesocarpo é formado em sua maior parte por células parenquimáticas arredondadas. Por todo o mesocarpo podem ser observadas grandes cavidades arredondadas, com paredes delgadas, irregularmente distribuídas e frequentemente encontradas fundidas formando grandes espaços com formas irregulares. Com os testes realizados não foi possível comprovar se essas cavidades (Figura 04 e Figura 05 c, d) são as responsáveis pela grande produção de mucilagem por esses frutos, pois o teste para polissacarídeos (vermelho de rutênio) não deu positivo. Rocha et al. (2011a) e Bouchet & Deysson (1974) observaram grandes canais que por vezes encontravam-se fundidos, sendo responsáveis pela produção de mucilagem em espécies de Malvaceae.

Por todo o mesocarpo também são encontrados feixes de fibras não vasculares e feixes vasculares, estando os últimos envolvidos por bainha esclerenquimática. Os feixes vasculares são de tamanho semelhante e encontram-se distribuídos irregularmente por todo o mesocarpo (Figura 05).

a b

FV FV

c d

CMF CM

FV = feixe vascular, CMI = cavidade de mucilagem, CMF = cavidades de mucilagem fundidas. Barra A, B: 100 µm. Barra C, D: 500 µm. Figura 05. Detalhe dos feixes vasculares em a, b Acrocomia intumescens e A. glaucescens, respectivamente, c Detalhe das cavidades de mucilagem individuais e d fundidas.

161

3.3 Testes histoquímicos

Os testes histoquímicos realizados também foram semelhantes quanto à presença e quantidade dos compostos testados nas diferentes espécies. Observou-se diferença somente na presença de amido detectada em maior quantidade em A. intumescens, seguida por A. aculeata e ausente nas demais espécies analisadas. Verificou-se maior quantidade de compostos fenólicos no mesocarpo de A. glaucescens. O resumo dos compostos localizados e sua intensidade encontra-se na Tabela 03.

Tabela 03. Compostos detectados no mesocarpo em espécies de Acrocomia.

Espécie Lipídios totais Amido Polissacarídeos Fenóis totais simples Acrocomia aculeata + + + / - - + Acrocomia crispa + + - - + Acrocomia glaucescens + + - - + + Acrocomia intumescens + + + - + / - Acrocomia totai + + - - + + + Grande quantidade; - Não observado; + / - Observado em alguns frutos e em outros não.

3.3.1 Lipídios totais

A maioria das células parenquimáticas do mesocarpo em todas as espécies estudadas contém óleo, conforme evidenciado pela reação positiva ao Sudan IV, assim, todas as espécies apresentam potencial para extração. O óleo ocorre nas células parenquimáticas do mesocarpo na forma de corpos lipídicos, também chamados oleossomos ou gotículas lipídicas, que podem apresentar tamanhos variados dependendo da espécie e ou do estágio da parte do fruto em estudo. Essas organelas realizam a síntese e armazenamento de triacilgliceróis (TAGs), encontrando-se associadas as proteínas que delimitam, ou seja, compartimentam a organela, sendo responsáveis pela reserva temporária e eficiente de carbono de alta energia (Horn et al. 2013, Ho et al. 2014).

No caso do presente trabalho, os oleossomos não puderam ser observados nas secções realizadas no mesocarpo, provavelmente devido ao processo de inclusão do material em resina sintética. Nos cortes manuais realizados em material somente fixado foi possível observar tais organelas, no entanto, devido à grande quantidade e sobreposição de oleossomos

162 presentes, não foi possível enxergar as células parenquimáticas individualmente, como também não foi possível realizar a contagem dos oleossomos (Figura 06). Todavia, se alterada a técnica de inclusão do material e o tipo de microscopia, é possível quantificar e até mesmo mensurar o tamanho dos oleossomos. Ho et al. (2014) realizaram a quantificação e a mensuração de oleossomos presentes no embrião, no mesocarpo e na amêndoa do dendezeiro (Elaeis guineensis Jacq.), encontrando diferenças entre a quantidade e tamanho de tais organelas, dependendo do tecido e seu estágio de desenvolvimento, porém, utilizando outras técnicas de fixação e inclusão e com uso de microscopia eletrônica de transmissão (Figura 06).

a b

c d

Barra: 100 µm. Imagens C, D: Ho et al. (2014).

Figura 06. Oleossomos no mesocarpo de a Acrocomia intumescens, b Detalhe dos oleossomos em A. totai, c, d Olessomos em Elaeis guineensis.

163

3.3.2 Mucilagem

Embora não tenha sido visualizada com o uso do Vermelho de Rutênio, a quantidade de mucilagem presente nos frutos de Acrocomia é muito elevada (Figura 07). Ainda que a mucilagem esteja concentrada em grandes cavidades no mesocarpo, devido à sua grande quantidade, ela pode permear o epicarpo, o que foi comprovado pelo fato de que o álcool onde os frutos estavam conservados se tornou viscoso.

Figura 07. Mucilagem em frutos de Acrocomia aculeata, com detalhe da cavidade produtora de mucilagem.

A mucilagem é uma substância macromolecular, um carboidrato complexo, de composição variada (polissacarídeos ácidos ou neutros) de acordo com a espécie, com propriedades hidrofílicas (Sáenz et al. 2004). Devido à sua grande capacidade de absorção de água, na presença da qual se torna viscosa, atua nos vegetais como um reservatório de água (Cárdenas et al. 1998), desempenhando importantes funções na fisiologia dos vegetais, tais como a diminuição da transpiração em climas secos, reserva de água, substância de reserva nutritiva e proteção contra ataque de pragas e patógenos (Fahn 1979, Alvarez et al. 1992, Rocha et al. 2011). A produção de mucilagem em grande quantidade nos frutos de Acrocomia spp. pode sugerir sua atuação como adaptação destas espécies a climas secos, onde são encontradas com maior frequência ou como característica química das espécies do gênero. Rocha et al. (2002), estudando espécies de Hibiscus (Malvaceae) em ambiente xérico, e Colonetti (2012), trabalhando com uma espécie de cacto, constataram o papel da mucilagem como substância de reserva e retenção de água. Já Silva & Potiguara (2009), analisando a histoquímica foliar de espécies de Oenocarpus (Arecaceae) da Amazônia, associaram a

164 ocorrência de mucilagem não como uma adaptação ecofisiológica, mas, provavelmente como característica daquele grupo de plantas.

Como não foi possível detectar mucilagem com o uso do Vermelho de Rutênio nas amostras do presente estudo, que é utilizado para detecção de polissacarídeos totais e mucilagem ácida (Jensen 1962), supõe-se que a mucilagem presente no mesocarpo das espécies de Acrocomia estudadas seja predominantemente neutra. Gregory & Baas (1989) apud Rocha et al. (2011) sugerem que os diferentes tipos de mucilagem exercem funções distintas, em que a reserva de água seria realizada pela fração ácida da mucilagem, que apresenta seu pico de produção durante os meses chuvosos, e a fração neutra da mucilagem seria responsável pela reserva de carboidratos, que tem pico de produção durante o os meses secos. Tal constatação reforça a hipótese da presença de mucilagem no mesocarpo das espécies de Acrocomia exercendo a função de reserva e retenção de água, que pode ser ainda mais justificável considerando o estudo bioquímico e anatômico do desenvolvimento de frutos de A. aculeata realizado por Reis et al. (2012) e Montoya (2013), em que ambos encontraram o maior acúmulo de mucilagem no mesocarpo na fase que antecede a abscisão natural dos frutos desta espécie. E deve-se destacar que a fase de abscisão dos frutos das espécies do gênero, indicando sua maturidade, ocorre durante os meses mais quentes do ano no Brasil.

Vale destacar que as mucilagens, devido à sua consistência viscosa em presença de água, possuem propriedades adesivas e espessantes, muito utilizadas pela indústria alimentícia no preparo de doces e geléias, e pela indústria farmacêutica com a finalidade de dar estabilidade a emulsões e pomadas, além de atuar como fibra dietética no organismo humano promovendo a redução do colesterol, o controle de glicose, a redução do risco de alguns tipos de câncer e diminuição dos sintomas da constipação crônica e hemorróidas (Colonetti 2012). Ou seja, os frutos das espécies de Acrocomia, além de seu uso para extração de óleo, devido à grande quantidade de mucilagem presente no mesocarpo também pode ser extraída e comercializada para diferentes segmentos da indústria. Ademais, o processo de demucilagem, ou seja, a extração de mucilagem do tecido vegetal, pode aumentar a rentabilidade da extração de óleo, conforme demonstrado por Speroni et al. (2015), que aumentou a eficiência da extração de óleo em grãos de linhaça (Linum usitatissimum L.) em 30% após processo de demucilagem.

165

3.3.3 Amido

O teste com Lugol foi positivo somente para A. intumescens e um dos indivíduos de A. aculeata. O amido nestas espécies foi observado nas células parenquimáticas do mesocarpo. Os amiloplastos encontram-se agrupados em esferas, o que também foi observado em trabalho realizado por Bonin et al. (2008) com amostras de A. aculeata oriundos de outra região do estado de São Paulo (Figura 08).

a b

CF = Célula com compostos fenólicos, GA = grãos de amido. Bar A: 200 µm. Bar B: 100 µm.

Figura 08. Secção do mesocarpo de Acrocomia intumescens: a detecção de amido com uso de Lugol, b Detalhe dos grãos de amido.

O amido é um polissacarídeo natural, pouco solúvel e de elevado peso molecular, formado por várias sequências de dois polissacarídeos, a amilose e a amilopectina. A amilose é um polímero linear e a amilopectina é uma macromolécula bastante ramificada de forma esférica a elíptica (Salisbury & Ross 1992). O formato dos grãos de amido pode ser diferenciado principalmente pela quantidade de amilose presente, já que quanto maior o teor de amilose em relação à amilopectina, mais esféricos são os grãos de amido (Bewley & Black 1994). Assim, devido ao formato esférico dos grãos de amido presentes nas espécies de Acrocomia estudadas, infere-se que as quantidades de amilose sejam superiores, semelhante ao trabalho realizado por Silva & Potiguara (2009) com espécies de Oenocarpus (Arecaceae), que também encontraram grãos de amidos esféricos no táxon estudado, corroborando, assim, estudos realizados por Tomlinson (1961) de que não existe diversidade morfológica de grãos de amido em Arecaceae, portanto, não se apresentando como um caractere útil à distinção taxonômica nesta família botânica.

166

De acordo com Reis (2012) e Montoya (2013), o acúmulo de amido em frutos de A. aculeata é realizado durante todas as fases de seu desenvolvimento, desde a fecundação do óvulo. Todavia, segundo Montoya (2013), a partir da 36ª semana após a antese há uma redução acentuada do teor de amido e partir dessa fase um aumento linear na produção e acúmulo de óleo, apresentando assim uma relação entre a degradação do amido e a síntese de ácidos graxos a partir desta fase, o que é explicado pelo fato de que a síntese e a reserva de óleo em tecidos vegetais está diretamente ligada à disponibilidade de reserva de polissacarídeos, a exemplo do amido (França et al. 1999). Sugere-se então que os frutos nos quais não foi detectado amido encontravam-se numa fase mais avançada, quando o amido reservado já havia sido utilizado para produção de óleo no mesocarpo.

3.3.4 Compostos fenólicos

Foram observadas células com compostos fenólicos em todas as espécies analisadas. Segundo Santos (2012), os compostos fenólicos presentes no mesocarpo de A. aculeata ocorrem dentro de idioblastos. A maior quantidade de idioblastos fenólicos ocorreu dentre as amostras analisadas em A. glaucescens (Tabela 03 e Figura 09). Os compostos fenólicos possuem ação antimicrobiana e exercem ação contra herbivoria (Swain 1959, Rocha et al. 2011b). Assim, podemos inferir que A. glaucescens apresenta maior quantidade de células com compostos fenólicos por ser uma espécie de porte baixo e, portanto, mais suscetível ao ataque de pragas e predação de seus frutos.

a b c

Bar A, B: 1000 µm. Bar C: 200 µm.

Figura 09. Acrocomia glaucescens: a compostos fenólicos detectados com cloreto férrico III, b Células com compostos fenólicos com coradas com azul de toluidina, c Célula com composto fenólico em detalhe, corada com azul de toluidina.

167

Quanto ao seu potencial econômico, os compostos fenólicos estão diretamente ligados ao valor nutricional, constituindo os antioxidantes mais abundantes nos vegetais, que pelo seu consumo podem amenizar os danos cumulativos que podem desencadear diversas doenças (Rocha et al. 2013). Alguns trabalhos realizados (Siqueira 2012, Rocha et al. 2013, Aragão 2014) demonstraram que A. aculeata se destaca pelo conteúdo de compostos fenólicos totais, demonstrando seu potencial para utilização para consumo fresco ou industrializado como alimento funcional.

A descrição da morfoanatomia do mesocarpo e a detecção dos principais compostos bioquímicos presentes representam uma importante contribuição sobre frutos de Arecaceae, que não têm número de estudos suficientes para o entendimento da organização estrutural dos órgãos vegetativos e, sobretudo, dos órgãos reprodutivos. São necessários estudos ontogenéticos dos frutos das demais espécies de Acrocomia e de A. aculeata de diferentes localidades para compreensão da origem, função e organização de cada tecido presente nos frutos. Se realizados, tais estudos podem gerar informações que talvez permitam sua utilização com fins taxonômicos, além de subsidiar conhecimentos necessários ao manejo dos frutos para extração de qualquer um dos seus compostos, para produção de sementes e com fins de melhoramento.

Os testes histoquímicos, além de demonstrarem o alto teor de óleo presente nas demais espécies, podendo também ser utilizadas para extração de óleo, como A. aculeata, evidenciaram a presença de outros compostos, tais como o amido, os compostos fenólicos e a mucilagem, que podem contribuir não somente na alimentação como também como matéria- prima para diferentes segmentos da indústria.

4 CONCLUSÕES

A morfoanatomia do mesocarpo das espécies de Acrocomia aqui analisadas é semelhante, portanto, não representa um caractere útil para taxonomia do gênero. O mesocarpo das espécies testadas contém óleo, mucilagem e compostos fenólicos. O óleo presente no mesocarpo ocorre dentro de organelas especializadas em sua produção, denominadas de oleossomos. A mucilagem presente no mesocarpo é responsável pela reserva de água no fruto. O amido exerce função de reserva até o início da maturação dos frutos, quando então passa a ser utilizado para produção de óleo. Todos os compostos detectados, além do óleo, são passíveis de utilização por diferentes segmentos da indústria.

168

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CAPÍTULO IV

Caracterização biométrica de frutos de três espécies de Acrocomia Mart. (Arecaceae)

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Caracterização biométrica de frutos de três espécies de Acrocomia Mart. (Arecaceae)

Suelen Alves Vianna1, Luiz Henrique Chorfi Berton2, Arnildo Pott3, Carlos Augusto Colombo2

1 Instituto Agronômico de Campinas (IAC) – Curso de Pós Graduação em Agricultura Tropical e Subtropical

2 IAC – Centro de Recursos Genéticos Vegetais

3 Universidade Federal de Mato Grosso do Sul (UFMS) – Centro de Ciências Biológicas, Departamento de Botânica

RESUMO

O gênero Acrocomia (Arecaceae) compreende oito espécies válidas, das quais seis ocorrem no Brasil, destas, três apresentam porte arbóreo e interesse comercial: A. aculeata, A. intumescens e A. totai. Objetivou-se caracterizar biometricamente os frutos destas três espécies de Acrocomia. Foram avaliados frutos de populações naturais de A. aculeata de Itapira, SP, de A. intumescens de Recife, PE, e de A. totai de Corumbá, MS. Observaram-se diferentes colorações de epicarpo e de mesocarpo de A. aculeata e A. totai, enquanto os frutos de A. intumescens são verde-claros ou amarelados. Os frutos de A. aculeata têm diâmetro considerado grande (3,9-4,6 cm) e na classe de massa seca “pesado” (26,3-33,5 g), A. intumescens intermediário (3,1–3,9 cm) e “leve” (11,5-18,8 g) e A. totai (95%) pequeno (2,2- 3,0 cm) e “muito leve” (4,1 -11,4 g). Conclui-se que há variação morfológica dentro e entre populações e entre as três espécies de Acrocomia, o que complementa os dados de morfologia das espécies e confirma a hipótese de que são espécies distintas. A espécie A. intumescens apresenta contribuição da polpa no fruto de aproximadamente 42%, havendo correlação entre o diâmetro e a massa fresca da polpa (r = 0,68; p<0,01), indicando o diâmetro como característica adequada para seleção indireta de frutos que apresentam maior quantidade de polpa e, consequentemente, maiores teores de óleo.

Palavras-chave: bocaiúva, diversidade morfológica, macaíba, macaúba, taxonomia

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ABSTRACT Biometric characterization of fruits of three species of Acrocomia Mart. (Arecaceae) - The Acrocomia (Arecaceae) genus comprises eight valid species, six occur in Brazil, these three have arboreal size and commercial interest: A. aculeata, A. intumescens and A. totai. This study aimed to characterize biometrically the fruits of these three species of Acrocomia. Were evaluated fruits of natural populations of A. aculeata from Itapira, SP, A. intumescens from Recife, PE and A. totai from Corumbá, MS. We observed different colors of epicarp and mesocarp in A. aculeata and A. totai, while the fruits of A. intumescens are pale green or yellowish. The fruits of A. aculeata showed diameter considered large (3.9-4.6 cm) and the highest dry mass (26.3-33.5 g), A. intumescens presented intermediate diameter (3.1–3.9 cm) and mass (11.5-18.8 g), and A. totai had the smallest diameter (2.2-3.0 cm) and mass (4.1- 11.4 g). We conclude that there morphological variation within and between populations and between the three species of Acrocomia, which complements the morphology data and confirms the hypothesis that are distinct species. The species A. intumescens presents pulp contribution fruit of approximately 42%, with correlation between the diameter and fresh weight of pulp (r = 0.68; p <0.01), indicating that the diameter is adequate characteristic for indirect selection of fruits which have a higher amount of pulp and higher oil content.

Key words: bocaiúva, macaíba, macaúba, morphological diversity, taxonomy

1 INTRODUÇÃO

O gênero Acrocomia é neotropical e o número de espécies não é bem resolvido taxonomicamente. De acordo com Henderson et al. (1995), apenas duas espécies são atribuídas ao gênero: A. aculeata (Jacq.) Lodd. ex Mart. e A. hassleri (Barb. Rodr.) W.J. Hahn, a primeira de grande porte, amplamente distribuída ao longo das Américas Central e do Sul, e a segunda, pequena, restrita a algumas áreas do Cerrado do Brasil e parte do Paraguai. Para Lorenzi et al. (2010) existem sete espécies no gênero, seis ocorrendo no Brasil: A. aculeata, A. intumescens Drude e A. totai Mart., de porte arbóreo, A. hassleri, A. glaucescens Lorenzi e A. emensis (Toledo) Lorenzi, de baixo porte, e A. crispa (Kunth) C.F. Baker ex Becc., de porte arbóreo, endêmica de Cuba. Ainda, de acordo com The Plant List (2013), são consideradas válidas todas as espécies citadas anteriormente mais A. media O.F. Cook.,

177 endêmica de Porto Rico e das Ilhas Virgens, também de porte arbóreo, de acordo com Proctor (2005) são plantas mais baixas, com folhas maiores e espatas menores comparativamente a A. aculeata.

Dentre as espécies reconhecidas, no Brasil, três são exploradas por extrativismo por apresentarem frutos de interesse comercial, sendo A. aculeata, popularmente conhecida como macaúba, com ocorrência em vários estados do Brasil; A. intumescens, localmente chamada de macaíba, endêmica da Região Nordeste, ocorrendo em áreas da chamada Zona da Mata e nos brejos de altitude, e A. totai, conhecida como bocaiúva, distribuída na maior parte do estado do Mato Grosso do Sul, associada a áreas de Cerrado e Pantanal.

As três espécies podem ser diferenciadas morfologicamente, principalmente pelas características do estipe, onde: A. aculeata possui estipe muito espinescente e presença dos restos da bainha foliar; A. totai apresenta menor número de espinhos e esporadicamente restos da bainha foliar; e A. intumescens possui espinhos somente quando jovem, apresentando intumescimento no meio do estipe e sem restos da bainha foliar.

O fruto é do tipo drupa, derivado de ovário súpero, caracterizado pela presença de endocarpo pétreo, mesocarpo (polpa) carnoso e epicarpo (casca) fino (Esau 1977). Os frutos das espécies de Acrocomia são globosos, apresentam epicarpo duro, fortemente aderido ao mesocarpo quando jovem, e em geral quebradiço, se desprendendo facilmente do mesocarpo quando maduro. O mesocarpo é mucilaginoso, com grande quantidade de fibras. O endocarpo é lenhoso e espesso (Dransfield et al. 2008, Lorenzi et al. 2010).

As três espécies em estudo (A. aculeata, A. intumescens e A. totai) são exploradas para consumo ou para fins comerciais. Os frutos de A. intumescens na Região Nordeste e os frutos de A. totai no estado de Mato Grosso do Sul são explorados por comunidades locais para consumo da polpa e da amêndoa (endosperma) frescos ou processados em diversos tipos de alimentos, tais como farinha, sorvete, bolo e outros. Alguns dos produtos produzidos são comercializados por essas comunidades como fonte ou complemento da renda familiar. A espécie A. aculeata tem sido explorada, principalmente no estado de Minas Gerais, para extração de óleo da polpa e da amêndoa, para produção de biocombustível e produtos cosméticos. Historicamente, o óleo de A. aculeata era usado para iluminação de importantes cidades do ciclo econômico da mineração, como Ouro Preto e Mariana, MG.

Embora A. aculeata seja atualmente a espécie mais utilizada para produção de biocombustíveis, contendo entre 37 e 78% de óleo no mesocarpo (Conceição et al. 2012;

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Berton 2013), as demais espécies também apresentam potencial para produção de óleo. Acrocomia intumescens apresenta entre 34 e 41% de óleo no mesocarpo (Bora & Rocha 2004, Conceição et al. 2012). A espécie A. totai apresenta teor de óleo no mesocarpo entre 14 e 31% (Hiane et al. 2005, Conceição et al. 2012, Ciconini et al. 2013).

Considerando que o potencial econômico das espécies de Acrocomia é baseado, principalmente, na exploração dos seus frutos, estudos de caracterização biométrica de frutos de diferentes espécies provenientes de diferentes regiões são de grande importância. Segundo Moura et al. (2010), a caracterização biométrica de frutos é fundamental para subsidiar informações para a conservação e exploração de recursos vegetais, já que tais dados permitem estimar a produtividade e diferenciar sementes para formar lotes mais homogêneos e, consequentemente, uma maior uniformidade e vigor das mesmas, como também se constitui numa ferramenta útil à detecção da variabilidade genética dentro de populações de uma mesma espécie e as relações entre esta variabilidade e os fatores ambientais, informações passíveis de uso em programas de melhoramento genético (Carvalho et al. 2003). As espécies arbóreas tropicais apresentam diferenças marcantes quanto ao tamanho dos frutos, número e tamanho das sementes (Silva et al. 2007). Segundo Uhl & Dransfield (1987), o tamanho dos frutos em Arecaceae é muito variável, com frutos medindo de 0,4 cm em espécies de Geonoma até frutos com 50 cm de comprimento e 18 kg em Lodoicea. Assim, a biometria de frutos pode ser útil à distinção taxonômica, já que persistem dúvidas sobre o número mais real de espécies para o gênero Acrocomia.

Os estudos de frutos envolvendo espécies de Acrocomia ainda são escassos. Assim, o presente trabalho foi realizado com objetivo de caracterizar biometricamente frutos das espécies A. aculeata, A. intumescens e A. totai, espécies com maior interesse comercial no Brasil, visando sua adoção como critério de seleção para fins de melhoramento genético, como também analisar A. intumescens com maior detalhamento, realizando estudos por partes do fruto e as correlações existentes, devido à escassez de informações sobre essa espécie de grande importância na região Nordeste.

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2 MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Área de coleta e biometria dos frutos Os indivíduos selecionados para o estudo são provenientes de diferentes regiões do Brasil, de acordo com a espécie (Figura 01). Os indivíduos de A. aculeata são provenientes de duas populações naturais em área de transição entre Cerrado e Mata Atlântica do município de Itapira, SP. Os indivíduos de A. intumescens foram coletados de uma população em área de Mata Atlântica na região metropolitana de Recife, PE, e as plantas de A. totai foram selecionadas de duas populações nativas do Pantanal no município de Corumbá, MS. Foram coletados 30 frutos ao acaso de dez indivíduos de cada população. Segundo Manfio et al. (2011), avaliação biométrica de quatro frutos em uma população é suficiente para compreensão das características estudadas.

Figura 01. Área de ocorrência e pontos de coleta das espécies de Acrocomia em estudo.

Os frutos foram mensurados quanto ao seu diâmetro externo longitudinal (comprimento) e diâmetro externo transversal (diâmetro), e pesados individualmente para determinação da massa fresca e da massa seca dada pela secagem até peso constante em estufa com circulação de ar a 58oC. A percentagem de umidade da polpa foi obtida pela diferença entre massa fresca e a massa seca, dividida pela massa fresca (Moura, 2010). Foi calculada a razão comprimento/diâmetro (C/D) dos frutos, sendo que a razão C/D < 1 indica o formato achatado, C/D > 1 indica formato ovóide e a razão C/D = 1 indica o formato globoso (Sacramento et al. 2003).

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Os dados obtidos foram analisados por meio de estatística univariada, abrangendo medidas de posição (média, mínimo e máximo) e medidas de dispersão (desvio padrão, coeficiente de variação), como também distribuição de frequência. Foi realizada análise de variância (ANOVA) com pós-teste de Tukey a 5% de probabilidade.

As características biométricas de frutos das espécies de Acrocomia estudadas foram comparadas quanto ao seu diagnóstico potencial para taxonomia e melhoramento, com uso da análise de agrupamento. Foram analisadas as quatro principais características relacionadas à produtividade: diâmetro externo transversal, diâmetro externo longitudinal, massas fresca e seca dos frutos. Os dados foram distribuídos em classes e tabulados na forma de matriz binária descritos como presença (1) ou ausência (0) e então submetidos à análise de agrupamento utilizando o algoritmo UPGMA e a distância euclidiana como medida da similaridade entre as unidades amostrais. A estabilidade dos agrupamentos foi testada empregando o procedimento de reamostragem por 10000 bootstraps.

Nos frutos de A. intumescens, além das análises acima descritas, foi analisada a correlação entre os dados do diâmetro, do comprimento e da matéria seca de cada parte do fruto (epicarpo, mesocarpo, endocarpo e endosperma), de um total de 100 frutos, calculando- se o coeficiente de correlação Pearson (r) e testada a sua significância com o teste t (Zar 1996).

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 Caracterização biométrica dos frutos

Os frutos de A. aculeata e A. totai apresentam diferentes colorações de casca e polpa, mesmo em indivíduos de uma mesma população. Os frutos de A. intumescens apresentaram menor variação e são, em geral, verde-claros ou amarelados na maturidade. É possível, também, perceber visualmente o contraste do tamanho entre os frutos das diferentes espécies (Figura 02).

181

a b c

Figura 02. Variação morfológica do número de sementes, a coloração epicarpo e mesocarpo de: a Acrocomia aculeata, b A. intumescens e c A. totai.

A fim de demonstrar graficamente a variabilidade das características biométricas de frutos dentro e entre as espécies de Acrocomia estudadas, cada característica mensurada foi avaliada considerando os dados das três espécies em conjunto e então determinadas classes de distribuição dos dados. Os dados da frequência absoluta são representados nos gráficos pelas colunas e a frequência relativa (%) da distribuição dos dados de cada característica dentro de cada espécie é representada pelas linhas (Figura 03).

182

a b

c d

Figura 03. Distribuição de classes de dados de a diâmetro, b comprimento, c massa fresca e d massa seca de frutos de Acrocomia aculeata, A. intumescens e A. totai.

Em relação ao diâmetro, a maioria dos frutos amostrados pertence à classe “grande”, medindo entre 4,0 e 4,7 cm. Apesar de ocorrer sobreposição de parte dos valores em alguns pontos da distribuição, é bem nítida a separação dos picos, ou seja, da maior frequência de cada característica biométrica dentro de cada espécie na distribuição. Pode-se observar que a maior parte dos frutos de A. aculeata (83,33%) tem diâmetro considerado grande, A. intumescens tem a maioria dos seus frutos (71,67%) com diâmetro intermediário (3,1 a 3,9 cm) e A. totai tem a maior parte dos frutos amostrados (95%) com pequeno diâmetro, com valores entre 2,2 e 3,0 cm (Figura 03 A).

183

Quanto ao comprimento, a maior parte dos dados ficou concentrada na classe “grande”, medindo de 3,9 a 4,6 cm. Como pode ser observado na Figura 03 B, houve sobreposição dos dados das espécies A. intumescens e A. totai, que tiveram boa parte dos seus frutos com tamanho “médio” (3,0 a 3,8 cm). No entanto, a maior frequência do comprimento dos frutos em A. totai (58.33%) ficou concentrada na classe “pequeno”, com frutos medindo entre 2,1 e 2,9 cm, e A. aculeata e A. intumescens com a maior parte dos frutos (73,33 e 56,67%, respectivamente) distribuídos na classe “grande”.

A maior parte dos frutos amostrados, considerando as três espécies em conjunto, apresentou massa fresca entre 16,5 e 26,2 g, sendo representados na classe “leve”. Houve sobreposição de parte dos frutos de A. aculeata e A. intumescens (43,33%) na classe de frutos com massa fresca “média”, com peso entre 26,3 e 35,9 g. Em A. totai os frutos ficaram distribuídos entre as classes “muito leve” (6,9 a 16,4 g) e “leve”, estando a maior parte concentrada na classe “leve” (53,33%). A maior parte dos dados de massa fresca de A. aculeata ficou concentrada na classe “pesado” (45%) com frutos pesando entre 40 e 45,5 g (Figura 03 C).

Embora seja observada sobreposição dos dados de massa seca na distribuição de classes, é bem evidente a formação de três picos, cada um indicando a maior frequência dos dados de massa seca determinados dentro de cada espécie (Figura 03 D). Acrocomia aculeata possui a maior parte dos frutos na classe “pesado” (55%), com peso na base seca entre 26,3 e 33,5 g. Acrocomia intumescens possui a maior frequência de frutos (71,67%) com peso entre 11,5 e 18,8 g concentrados na classe “leve”, e A. totai apresenta a maioria dos frutos na classe “muito leve” (78.33%), pesando entre 4,1 e 11,4 g.

A diversidade morfológica tanto dentro como entre as espécies de Acrocomia analisadas foi demonstrada com utilização da distribuição em classes das características biométricas avaliadas. A variabilidade dentro de cada espécie foi explicada pela presença de frutos em diferentes classes de cada característica avaliada. Por exemplo, A. aculeata tem frutos distribuídos em quatro das cinco classes estabelecidas para massa fresca (Figura 03 C). A variabilidade entre espécies é demonstrada graficamente pelos picos de distribuição das características biométricas dentro de cada espécie, a exemplo das classes de diâmetro que formam três picos, cada pico representando uma espécie, bem definidos, cada um abrangendo uma determinada classe de distribuição (Figura 03 A).

184

Os frutos de A. aculeata apresentam, em média, os maiores diâmetro e comprimento (4,13 ± 0.27 e 4,01 ± 0,29 cm, respectivamente), seguidos por A. intumescens (3,69 ± 0,29 e 3,88 ± 0,27 cm, respectivamente) e A. totai com o menor tamanho de fruto, em média com 2,72 ± 0,24 cm de diâmetro e 2,84 ± 0,30 cm de comprimento (Tabela 01).

A maior massa fresca média do fruto foi encontrada também nos indivíduos de A. aculeata (39,04 ± 7,06 g). Acrocomia intumescens possui massa fresca com valor médio de 29,08 ± 6,87 e A. totai, o menor valor médio de massa fresca (16,39 ± 4,16 g), quando comparado às demais espécies em estudo. Para massa seca também ocorre o maior valor médio para A. aculeata (26,69 ± 4,54 g), valor intermediário em A. intumescens (17,27 ± 3,33 g) e o menor valor de massa seca em A. totai (9,42 ± 2,83 g) (Tabela 01).

Tabela 01. Características biométricas de frutos de Acrocomia aculeata, A. intumescens e A. totai: limite inferior (LI), limite superior (LS), média, desvio padrão (σ) e coeficiente de variação (CV%).

LI LS Média σ CV%

Diâmetro externo longitudinal (cm) 3,44 4,62 4,01 0,29 7,28

Diâmetro externo transversal (cm) 3,35 4,72 4,13 0,27 6,50

Massa fresca do fruto inteiro (g) 23,55 55,16 39,04 7,06 18,09

Massa seca do fruto inteiro (g) 14,34 40,91 26,69 4,54 17,00

Acrocomia aculeata Acrocomia Umidade do fruto (%) 8,96 44,30 31,05 8,49 27,34

Razão C/D 0,83 1,09 0,97 0,05 4,67

Diâmetro externo longitudinal (cm) 3,10 4,40 3,88 0,27 7,08

Diâmetro externo transversal (cm) 3,20 4,25 3,69 0,29 7,86

Massa fresca do fruto inteiro (g) 18,94 54,92 29,08 6,87 23,61

Massa seca do fruto inteiro (g) 9,49 27,00 17,27 3,33 19,29

Umidade do fruto (%) 28,70 73,82 39,62 7,30 18,43

Acrocomia intumescens Acrocomia Razão C/D 0,95 1,26 1,05 0,06 5,52

185

Diâmetro externo longitudinal (cm) 2,07 3,65 2,84 0,30 10,66

Diâmetro externo transversal (cm) 2,17 3,30 2,72 0,24 8,90

Massa fresca do fruto inteiro (g) 6,89 25,40 16,39 4,16 25,39

Massa seca do fruto inteiro (g) 4,10 17,57 9,42 2,83 30,06

Acrocomia totai Acrocomia Umidade do fruto (%) 21,05 65,04 42,53 7,79 18,32

Razão C/D 0,74 1,43 1,05 0,10 9,41

* Razão C/D = razão comprimento/diâmetro.

Acrocomia aculeata apresenta razão C/D igual a 0,97 e A. intumescens e A. totai têm 1,05, ou seja, os frutos das três espécies em estudo apresentam frutos com razão C/D próxima a 1, evidenciando seu formato globoso (Tabela 01).

A quantidade de água nos frutos também variou entre as espécies, sendo que A. totai apresentou o maior teor (42,53 ± 7,79%), seguido por A. intumescens (39,62 ± 7,30) e a menor quantidade nos frutos de A. aculeata (31,05 ± 8,49) (Tabela 01). Os valores podem variar de acordo com o estágio de maturação dos frutos, forma de coleta e tempo de conservação dos mesmos.

Diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) foram detectadas entre as médias do comprimento, diâmetro, massa fresca e massa seca dos frutos, ou seja, os resultados obtidos rejeitam a hipótese de igualdade entre as médias, demonstrando a existência de variação biométrica entre as espécies, destacando-se que A. aculeata apresenta os maiores valores para todas as características biométricas citadas, A. totai, os menores valores e A. intumescens valores intermediários (Figura 04).

186

* Letras iguais não diferem estatisticamente a 5% de probabilidade (p < 0,05) pelo teste de Tukey.

Figura 04. Características biométricas de frutos de Acrocomia aculeata, A. intumescens e A. totai.

As quatro principais características biométricas dos frutos (diâmetro, comprimento, massas fresca e seca) utilizadas para da análise de agrupamento resultaram na separação das espécies de Acrocomia aqui estudadas, conforme ilustrado na Figura 05.

187

Figura 05. Análise de agrupamento obtida por distância euclidiana e UPGMA, baseada nas características diâmetro, comprimento, massas fresca e seca de frutos das espécies estudadas de Acrocomia.

A análise resultou na aproximação de A. aculeata e A. intumescens e separação de A. totai de ambas, o que pode ser explicado pelos valores notadamente mais baixos de todas as características biométricas avaliadas encontradas em A. totai. Nota-se na Figura 03 que A. totai apresenta os picos com as maiores frequências das amostras de cada característica avaliada bem separados das demais espécies e que A. aculeata e A. intumescens apresentam alguns picos de maior frequência dos dados semelhantes, como também a sobreposição de amostras numa mesma classe, a exemplo da distribuição de frequência dos dados de comprimento (Figura 03 B), em que as espécies A. aculeata e A. intumescens possuem a maior frequência na mesma classe “grande”.

Os dados de biometria dos frutos reforçam a classificação de Acrocomia realizada por Lorenzi et al. (2010). As principais características morfológicas que diferenciam as espécies estudadas de Acrocomia se encontram resumidas na Tabela 02 (Figura 06).

188

Tabela 02. Resumo das características morfológicas de três espécies de Acrocomia.

Esp. Porte Estipe Comp. Espinhos Cor fruto Diâmetro Ambiente Folha (m) fruto (cm) ocorrência

Aa Arbóreo Cilíndrico, reto, 1,9-3,0 Estipe e Variado 3,0-5,0 Associado (em com remanescentes folhas geral) a áreas da base das folhas secas e abertas já caídas

Ai Arbóreo Cilíndrico, com 2,4-3,0 Estipe de Esverdeado 3,1-4,5 Mata Atlântica intumescimento plantas Amarelo e Brejos de próximo ao meio do jovens claro Altitude estipe, liso

At Arbóreo Cilíndrico, reto, 2,0-2,6 Pode ou não Variado 2,3-4,3 Áreas secas e sem remanescentes ocorrer no abertas da base das folhas estipe e nas já caídas folhas

* Aa: Acrocomia aculeata, Ai: A. intumescens e At: A. totai. Os dados descritos são resultantes de nossas observações e da revisão de Acrocomia realizada por Lorenzi et al. (2010).

a b c

Figura 06. Indivíduos adultos de a Acrocomia aculeata, b A. intumescens e c A. totai, e detalhe dos estipes.

189

3.2 Caracterização biométrica das partes de frutos de Acrocomia intumescens

Os frutos da macaíba são utilizados na região Nordeste do Brasil principalmente para consumo da polpa (mesocarpo) fresca ou processada. De acordo com Bora e Rocha (2004), o óleo da macaíba é composto predominantemente por ácidos graxos insaturados (81%). O óleo da amêndoa possui elevado teor de ácido láurico (45,53%), podendo ser utilizado na indústria de cosméticos, e o óleo da polpa apresenta alto teor de ácido oléico (63,2%), podendo ser empregado na indústria alimentar, assim como para biodiesel.

Lembrando que para A. intumescens foram avaliados 100 frutos, considerando as diferentes partes, os frutos de macaíba apresentam comprimento médio (3,85 ± 0,25 cm) superior ao diâmetro (3,66 ± 0,27 cm), indicando o formato levemente ovalado, comprovado pela razão comprimento/diâmetro de 1,05 ± 0,06 cm (Tabela 03).

Tabela 03. Valores da média, desvio padrão (σ), limite inferior (mínimo), limite superior (máximo) e coeficiente de variação (CV%) de características biométricas de frutos de Acrocomia intumescens coletados na região metropolitana do Recife, PE.

Característica biométrica Média σ Mínimo Máximo CV % Diâmetro externo longitudinal (cm) 3,85 0,25 3,10 4,40 6,61 Diâmetro externo transversal (cm) 3,66 0,27 3,15 4,25 7,38 Espessura mesocarpo (cm) 0,54 0,11 0,35 0,90 21,16 Espessura do endocarpo (cm) 0,42 0,10 0,20 0,70 24,20 Largura do endosperma 1 (cm) 1,72 0,48 1,00 3,8 27,63 Largura do endosperma 2 (cm) 1,75 0,49 1,05 3,7 28,33 Massa fresca do fruto inteiro (g) 27,56 6,63 13,77 54,92 24,08 Massa fresca do epicarpo (g) 5,11 1,65 2,41 8,91 32,29 Massa fresca do mesocarpo (g) 10,13 3,30 0,70 19,37 32,56 Massa fresca do endocarpo (g) 7,17 2,22 1,46 12,41 30,99 Massa fresca do endosperma (g) 1,86 0,70 0,55 4,05 35,36 Massa seca do fruto inteiro (g) 16,64 3,27 9,49 27,00 19,66 Massa seca do epicarpo (g) 3,23 0,90 1,48 5,53 27,72 Massa seca do mesocarpo (g) 5,65 1,48 2,41 10,66 26,17 Massa seca do endocarpo (g) 6,35 1,30 4,04 9,19 20,52 Massa seca do endosperma (g) 1,41 0,42 0,43 2,45 29,74

190

% mesocarpo no fruto 36,96 6,55 16,87 61,42 17,73 % endosperma no fruto 6,99 2,77 1,98 16,29 39,61 % umidade mesocarpo 43,23 8,91 19,95 80,99 20,62 Razão C/D 1,05 0,06 0,95 1,26 5,43

A massa fresca do fruto inteiro apresentou média de 27,56 ± 6,63 g e a polpa 10,13 ± 3,30 g, correspondendo a 36,76% do fruto, o que destaca seu potencial extrativista para consumo, como fonte ou complementação da renda de pequenos produtores, como vem sendo realizado na região de ocorrência da espécie. O endosperma, outra parte do fruto utilizada para consumo e extração de óleo, apresentou massa média de 1,86 ± 0,70 g, correspondendo a 6,75% do fruto. Os valores do limite superior para as medidas das larguras 1 e 2 da amêndoa (3,8 e 3,7 cm) é explicado pela presença de dois endospermas em 12% dos frutos da amostra e de três endospermas em 3% da amostra, sendo que foram consideradas todos os endospermas encontrados para tabulação dos dados. Considerando as amostras com somente um endosperma, a largura média 1 foi de 1,59 ± 0,21 cm e a largura média 2 de 1,58 ± 0,19 cm. Os valores mínimos foram de 1,0 e 1,05 cm e o máximo igual a 2,0 cm para ambas as larguras. A representação da participação (%) de cada parte do fruto pode ser observada na Figura 07.

21,1% % 41,7%

29,5% % 7,7 %

Figura 07. Partes do fruto de Acrocomia intumescens e indicação de sua contribuição (%) na massa fresca total.

191

Em relação à massa seca, o fruto inteiro apresentou 16,64 ± 3,27 g. Destes, 3,23 ± 0,90 g correspondem à casca, 5,65 ± 1,48 g à polpa, 7,17 ± 2,22 g ao endocarpo, e 41 ± 0,42 g à amêndoa. Notou-se que a maior perda de peso pela secagem foi da polpa, que apresentou aproximadamente 43% de umidade. A menor percentagem de umidade foi encontrada no endocarpo, com valor médio aproximado de 18,5%, o que pode ser explicado por sua natureza lenhosa, composto por várias camadas de fibras (Reis et al., 2012), fibras essas, mortas na maturidade, apresentando somente a parede primária e secundária, portanto com baixo conteúdo de água presente. Os maiores valores do desvio padrão foram observados para percentagem de umidade na polpa (8,91), seguidos pela massa fresca do fruto inteiro (6,63) e pela percentagem de polpa (6,55), indicando maior variância amostral de tais características biométricas em relação às demais avaliadas.

A percentagem da amêndoa no fruto e a massa fresca da amêndoa apresentaram os maiores coeficientes de variação (39,61 e 35,36, respectivamente), explicado pelo fato de que parte dos frutos continham duas ou três amêndoas, aumentando assim a amplitude dos dados observados. Os dados da massa fresca da polpa, da casca e do endocarpo apresentaram alto CV% (32,56, 32,29 e 30,99, respectivamente), demonstrando a heterogeneidade da amostra quanto a tais características. As medidas do comprimento e diâmetro foram baixas (6,61 e 7,38 cm, respectivamente), demonstrando menor variabilidade quanto ao tamanho dos frutos.

A variabilidade biométrica tanto dentro como entre espécies pode ser decorrente de fatores ambientais, como exemplo da disponibilidade de água, fator essencial para a produção de frutos (Tabarelli et al. 2003). Porém, a variação encontrada nas dimensões dos frutos de A. intumescens possivelmente é resultante da variabilidade genética populacional, já que os frutos da amostra foram colhidos de uma população sob as mesmas condições edafoclimáticas. Assim, para confirmar e discutir melhor a variabilidade é necessário o estudo da estrutura genética de um maior número de populações da espécie.

Foi encontrada correlação significativa e positiva entre diâmetro e massa fresca do fruto inteiro, massa fresca da casca e massa fresca da polpa (p ≤ 0,01), massa fresca da casca e massa fresca do endocarpo, comprimento e massa fresca do fruto inteiro, massa fresca da casca e massa fresca da polpa (p ≤ 0,05) (Tabela 04). Assim, podemos inferir que frutos maiores são mais pesados e apresentam maior massa de casca, polpa e endocarpo. Porém, não foi encontrada correlação significativa da massa fresca da amêndoa com as demais características avaliadas, provavelmente devido a alguns frutos apresentarem endocarpo mais

192 pesado e, consequentemente, mais espesso, não permitindo o desenvolvimento de amêndoas com maiores dimensões.

A correlação entre massa fresca da casca com massa fresca da polpa e do endocarpo foi positiva e altamente significativa (p ≤ 0,01), indicando que frutos com casca mais pesada apresentam frutos com maior massa de polpa e de endocarpo (Tabela 04).

Tabela 04. Matriz de coeficientes de correlações de Pearson das variáveis: diâmetro externo transversal (DET), diâmetro externo longitudinal (DEL), massa fresca do fruto inteiro (MFFI), massa fresca do epicarpo (MFEP), massa fresca do mesocarpo (MFM), massa fresca do endocarpo (MFEN), massa fresca da amêndoa (MFA) e percentagem da polpa (%POL).

DET DEL MFFI MFEP MFM MFEN MFA %POL DET 1 ------DEL 0,7064** 1 ------MFFI 0,7447** 0,5466* 1 - - - - - MFEP 0,7048** 0,4595* 0,7629** 1 - - - - MFM 0,6862** 0,5087* 0,8245** 0,7031** 1 - - - MFEN 0,5228* 0,3592ns 0,5690** 0,5708** 0,5345* 1 - - MFA 0,3118ns 0,1537ns 0,2022ns 0,0701ns 0,1377ns -0,2940ns 1 - %POL 0,1470ns 0,1444ns 0,0981ns 0,1729ns 0,5210* 0,0232ns 0,0960ns 1 ** Significativo a 1%, * Significativo a 5% de probabilidade pelo teste t.

4 CONCLUSÕES

A avaliação de biometria de frutos revelou a existência de variação morfológica dentro e entre populações e significativamente entre as três espécies de Acrocomia, complementando os dados de morfologia das plantas como também que tais espécies são distintas. A biometria realizada em frutos da espécie A. intumescens é inédita e revela que a polpa tem importante contribuição, representando aproximadamente 42% da massa fresca total do fruto. Esses valores, associados a dados de qualidade nutricional, podem demonstrar que essa espécie pode ser uma importante fonte alimentícia por meio de extrativismo desta espécie.

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3 CONSIDERAÇÕES GERAIS

As metodologias abordadas no presente estudo (molecular, anatomia foliar e biometria dos frutos) apoiam a existência de 07 espécies para Acrocomia;

A chave gerada no trabalho de anatomia foliar pode auxiliar na identificação/distinção das espécies estudadas de forma rápida e econômica;

Das oito espécies atualmente reconhecidas, seis ocorrem no Brasil, e destas, três (A. emensis, A. glaucescens e A. intumescens) são endêmicas de diferentes regiões do Brasil;

Considerando que no Brasil ocorrem seis das oito espécies reconhecidas para o gênero, como também três espécies endêmicas, pode-se sugerir que o Brasil seja o centro de origem e de diversidade de Acrocomia.

Novos trabalhos com Acrocomia devem considerar a existência de diferentes espécies, que ocorrem em diferentes localidades, para planejar e discutir suas metodologias e seus resultados.

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