Revista CENIC. Ciencias Biológicas ISSN: 0253-5688 [email protected] Centro Nacional de Investigaciones Científicas Cuba

Gutiérrez Martínez, Ariadne; Nodal Flores, Carlos; Bucarano Lliteras, Isury; Goicochea Carrero, Eddy Toxicología aguda oral del extracto lipídico de crispa en ratones NMRI Revista CENIC. Ciencias Biológicas, vol. 47, núm. 1, enero-mayo, 2016, pp. 21-26 Centro Nacional de Investigaciones Científicas Ciudad de La Habana, Cuba

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Toxicología aguda oral del extracto lipídico de Acrocomia crispa en ratones NMRI

Ariadne Gutiérrez Martínez, Carlos Nodal Flores, Isury Bucarano Lliteras, Eddy Goicochea Carrero.

Departamento de Farmacología y Toxicología, Centro de Productos Naturales. Centro Nacional de

Investigaciones Científicas. Calle 198 entre 19 y 21, Atabey, Playa, Habana, Cuba.

[email protected]

Recibido: 5 de noviembre de 2015. Aceptado: 18 de febrero de 2016.

Palabras clave: ácidos grasos, Acrocomia crispa, D-005, ratones, toxicidad aguda. Key words: fatty acids, Acrocomia crispa, D-005, mice, acute toxicity.

RESUMEN. El D-005 es un extracto lipídico del fruto de A. crispa (palma corojo), que contiene una mezcla de ácidos grasos, principalmente láurico, oleico, mirístico y palmítico. El tratamiento con D-005 por vía oral redujo el agrandamiento prostático inducido por testosterona en ratas. Se realizó el ensayo de toxicidad del D-005 con el objetivo de determinar los efectos tóxicos del D-005 administrado por vía oral, a ratones NMRI de ambos sexos. Se utilizó el método de las clases de toxicidad aguda, administrando una dosis de 2 000 mg/kg de peso corporal. Luego de la única administración, los animales fueron observados diariamente durante 14 d. Las variables analizadas fueron: mortalidad y signos clínicos, peso corporal, consumo de alimento y observaciones macroscópicas. No existieron diferencias significativas en ninguna de estas variables entre el grupo tratado y el control en ninguno de los sexos. No se evidenció ningún efecto tóxico relacionado con el tratamiento. El D-005 presentó una toxicidad intrínseca baja, mostrando una toxicidad superior a los 2 000 mg/kg de peso corporal, dosis a la que no se evidenciaron signos indicativos de toxicidad en ninguno de los sexos, por lo que su toxicidad se puede declarar como no clasificable según el método de las clases de toxicidad aguda.

ABSTRACT. D-005 is a lipid extract from the fruits of A. crispa (corojo palm ) that contains a reproducible mixture of fatty acids, like lauric, oleic, mirystic and palmitic acids. Oral treatment with D-005 reduced prostate enlargement induced with testosterone in rats. The toxicity assay of D-005 was performed in order to determine the toxic effects of D-005 orally administered to NMRI mice from both sex. Oral acute toxicity of D-005 (2 000 mg/kg) was researched in accordance with the acute toxic class method. Animals after a single administration were observed daily during 14 d. Thus, data analysis of mortality, clinical observations, body weight, and gross pathological changes did not show significant differences between control and treated groups in any sex. No evidence of treatment-related toxicity was detected. The oral acute toxicity of D-005 was considered as unclassified according to the acute toxic class method, since a dose of 2 000 mg/kg did not induce deaths or signs of toxicity.

INTRODUCCIÓN La Hiperplasia Prostática Benigna (HPB) es una patología que puede afectar a los hombres fundamentalmente  50 años y cuya frecuencia aumenta con la edad.1 Consiste en un agrandamiento benigno de la próstata debido a un crecimiento excesivo y no controlado. Este crecimiento puede causar obstrucción y propicia el desarrollo de síntomas del tracto bajo urinario (STBU).2,3 La principal terapia farmacológica de la HPB la constituyen los inhibidores de la 5 -reductasa prostática,1,4-7 los 1,4,5,8,9 antagonistas de (ADR)-1, y la terapia combinada con ambos, recomendada en casos que presentan HPB severa o refractaria.10-12 El tratamiento de la HPB también incluye alternativas fitoterapéuticas, en especial los extractos lipídicos de los frutos de Serenoa repens (Saw palmetto) (ELSP) de la familia .13-16

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En Cuba existen numerosas palmas de la misma familia de Saw palmetto, dentro de las cuales se destaca la palma real (Roystonea regia), de cuyos frutos se ha obtenido un extracto lipídico (D-004) con efectos similares a los del ELSP.17- 20 La palma corojo presenta analogías en su origen taxonómico y en la composición química de los aceites obtenidos de sus frutos con el ELSP y el D-004, lo cual vislumbra la utilidad potencial del aceite de A. crispa en el manejo de la HPB. El D-005 es un extracto lipídico del fruto de A. crispa (palma corojo), palma endémica de la familia Arecaceae, que contiene una mezcla de ácidos grasos, principalmente láurico, oleico, mirístico y palmítico y en menores proporciones esteárico, caprílico, cáprico y palmitoleico.21,22 El tratamiento oral con D-005 durante 14 d resultó efectivo en reducir el agrandamiento prostático inducido por T en ratas.23 Además, el D-005 presentó efectos anti-inflamatorios en modelos in vitro, así como también mostró efectos antioxidantes in vivo.23,24 Ambos efectos podrían resultar beneficios adicionales sobre la próstata hipertrofiada. Tomando en consideración los efectos farmacológicos promisorios del D-005 en modelos de hiperplasia prostática e inflamación, los resultados negativos obtenidos en las evaluaciones del D-005 por el método de las clases en ratas y que los estudios agudos en una segunda especie roedora forman parte de la batería de pruebas que integran la primera etapa de la investigación de una nueva sustancia propuesta como medicamento; se evaluó la toxicidad del D-005 en ratones NMRI por el método de las clases de toxicidad aguda con el objetivo de clasificar la toxicidad aguda oral del aceite saponificado de los frutos de A. crispa (palma corojo) y determinar si la administración de dosis únicas produce afectaciones no reversibles, de modo que se detecten en los sobrevivientes.

MATERIALES Y MÉTODOS

Animales Se emplearon ratones NMRI procedentes del Centro de Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB, Cuba), adultos jóvenes de 6-7 semanas, de ambos sexos, cuyo peso corporal oscilaba entre 20-23 g al inicio del estudio. Se utilizó esta especie roedora por ser una de las más empleadas en los estudios agudos, por otra parte, de esta línea se tienen amplios conocimientos en nuestro laboratorio. Los animales se adaptaron durante siete días a las condiciones del laboratorio: temperatura 20-25 ºC, humedad entre 50-70 % y ciclos de luz- oscuridad de 12 h. El alimento que se les administró durante toda la experiencia fue pienso estándar para esta especie preparado en el CENPALAB. El acceso al agua y al alimento fue ad libitum. Toda la manipulación de los animales se realizó de acuerdo con los principios éticos para el uso de los animales de Laboratorio recomendados en los lineamientos internacionales y en la República de Cuba, plasmados en los Procedimientos Normalizados de Trabajo establecidos en el Centro de Productos Naturales. El protocolo de aprobación por el Comité de ética para el trabajo con animales de experimentación fue el 013/2014.

Sustancia de ensayo El material vegetal fue obtenido en mayo de 2014 en el municipio Playa de la Habana, a partir de diferentes ejemplares de A. crispa, autentificados por especialistas del herbario del Jardín Botánico Nacional y con número de introducción: 1982-1031. El D-005 es el aceite saponificado de los frutos de la A. crispa, suministrado por el Laboratorio de Química Extractiva del CPN, con su correspondiente información relativa a la pureza y a las condiciones de estabilidad (2 años). La sustancia es un líquido aceitoso, de color amarillo translucido, que fue almacenado en frasco ámbar de cristal y mantenido en lugares frescos y protegidos de la luz. Se utilizó el lote S100614 con un 92,07 % de pureza en función del contenido total de los ácidos grasos libres (caprílico 0,90 %, cáprico 2,20 %, láurico 36,43 %, mirístico 12,60 %, palmítico 8,10 %, palmitoleico 0,08 %, esteárico 2,67 % y oleico 29,07 %). La preparación de las soluciones se realizó 2 horas antes de la administración en función del peso corporal. El D-005 fue administrado en forma de emulsión usando Tween 65 (Sigma, USA) al 2 % como vehículo, el cual fue empleado en los estudios de farmacología experimental y de amplio uso en la industria farmacéutica, carente de toxicidad asociada. Se realizó una administración única mediante intubación gástrica, en ayunas, en el horario de la mañana. Se empleó la vía oral por ser la que coincide con la utilizada en la terapéutica y además fue la empleada en el resto de las evaluaciones de toxicología y farmacología preclínica realizadas. Además, esta vía es la recomendable en el caso de productos a administrar por vía oral en que no se conozcan todos los aspectos de su farmacocinética.

Grupos experimentales Teniendo en cuenta las evaluaciones farmacológicas y toxicológicas que se han realizado con esta sustancia en los cuales se han utilizado determinados niveles de dosis, sin que se haya manifestado ningún cuadro clínico indicativo de daño inducido por la sustancia, y las características propias de este método experimental se inició el estudio por la

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Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 47, No. 1, pp. 21-26, enero-mayo, 2016. mayor dosis recomendada para este ensayo (ensayo límite). Este método parte del concepto de un uso escalonado de dosis a partir de una dosis de partida, que en este caso fue de 2 000 mg/kg en machos y en hembras.25 Se distribuyeron los animales en dos grupos experimentales/sexo de tres animales cada uno. Un grupo recibió la emulsión de la sustancia en estudio (2 000 mg/kg) y el otro, volúmenes equivalentes del vehículo Tween 65/agua al 2 %.

Variables analizadas Al realizar la administración de la sustancia de ensayo se observaron los animales en diferentes intervalos: durante la primera y la segunda hora, entre las dos y las cuatro horas, entre cuatro y ocho horas y entre las ocho y las 24 h de la administración. A partir de las 24 h de la administración las observaciones se realizaron dos veces al día hasta completar los 14 d. Se registró la mortalidad y la presencia de los siguientes signos clínicos: alopecia, ataxia, nivel de actividad general, catalepsia, aspecto general, convulsiones, aspecto de la cola, apnea, aspecto de los ojos, disnea, aspecto de los genitales, edema en las patas, aspecto de las heces, epistaxis, aspecto de la orina, piloerección, características de la marcha, lesiones en la piel, nódulos o abscesos, reflejos, potosís palpebral, taquipnea, lagrimeo, salivación, sangrado ocular, temblores. El peso corporal se controló al inicio, a los siete días y al final de la experiencia. Los animales fueron pesados en una balanza CP3202P (Sartorius, Alemania). El consumo de alimentos se controló durante toda la experiencia. Fue calculado diariamente por diferencia de pesada entre alimento suministrado y alimento remanente.

Necropsia y examen histopatológico Pasados 14 días de la administración, se realizó la necropsia de todos los animales por dislocación cervical. Se realizó el análisis macroscópico de órganos y cavidades y se examinó el contenido de las cavidades abdominal, torácica y craneana.

Análisis estadístico El análisis del peso corporal y consumo de alimento se realizó de manera independiente para cada sexo mediante análisis de varianza (ANOVA). El nivel de significación establecido fue de p < 0,05. Todos los análisis se realizaron empleando el Statsoft for windows. StatSoft, Inc. (2003). STATISTICA (data analysis software system), versión 6.

RESULTADOS Y DISCUSION La administración de dosis orales únicas (2 000 mg/kg) de D-005 a ratones NMRI no produjo muertes durante el transcurso de la experiencia, ni se manifestaron signos indicativos de toxicidad en ninguno de los animales. Este estudio siguió el método de las clases de toxicidad aguda, que persigue brindar una aproximación sobre la toxicidad de la sustancia a investigar a partir de la administración única de un solo nivel de dosis previamente definido. Se consideró la naturaleza de la sustancia a evaluar y se realizó el ensayo con la dosis límite propuesta (2 000 mg/kg).25 Este tipo de estudio, desarrollado preferiblemente en roedores, centra su atención en la detección de signos clínicos indicativos de toxicidad, e incluye la realización de necropsia de los sobrevivientes a los 14 d de administrar la sustancia.25

Fig. 1. Efecto del D-005 en el consumo de alimentos de ratones NMRI machos.

En el peso corporal no existieron diferencias significativas entre animales tratados y controles en ninguno de los intervalos estudiados (Tabla 1). De manera similar se comportó el consumo de alimento (Figuras 1 y 2).

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Fig. 2. Efecto del D-005 en el consumo de alimentos de ratones NMRI hembras.

Estos resultados permiten definir que el aceite saponificado de los frutos de la A. crispa debe tener una toxicidad aguda superior a los 2 000 mg/kg en ratones NMRI y que, por tanto, según la metodología empleada su toxicidad es no clasificable.

Tabla 1. Efecto de dosis orales únicas de D-005 sobre el peso corporal de ratones NMRI Peso corporal (g) (X ± DE) Grupos n Dosis Machos Hembras (mg/kg) Inicio Final Inicio Final Control 6 0 22,67 ± 0,58 28,00 ± 1,73 20,67 ± 0,58 24,00 ± 0,00 D-005 6 2 000 22,67 ± 0,58 27,67 ± 2,08 20,67 ± 0,58 24,00 ± 4,36 X: media; DE: desviación estándar, n: número de animales por grupo

Durante la necropsia, se determinó no tomar muestras para estudio histopatológico, debido a que no ocurrieron muertes durante el estudio y las observaciones macroscópicas revelaron que ningún animal presentaba lesiones en sus cavidades y órganos. Existen diversos tratamientos para la HPB, si bien el tratamiento farmacológico es el más frecuente, e incluye, como alternativas fundamentales, los inhibidores de la 5 - reductasa prostática y los antagonistas de los receptores 1- adrenérgicos.1,4-9 Aunque estos fármacos son ampliamente indicados, se han encontrado experiencias adversas asociadas a su uso. Los inhibidores de la 5 -reductasa prostática producen disminución de la líbido, impotencia y trastornos de la eyaculación.1,5 Por su parte, en los bloqueadores de los ADR-1 sobresale la hipotensión ortostática.1,9 El ELSP, muy utilizado también para el tratamiento de la HBP, presenta buen perfil de seguridad y tolerabilidad.26 Los datos de su toxicología preclínica son pocos, pero los estudios realizados indican que el ELSP es una sustancia de baja toxicidad.27-31 Por otra parte, el extracto lipídico de R. regia, similar al ELSP y al de A. crispa muestra un bajo potencial de riesgo en su uso oral en humanos,32 este contiene una mezcla reproducible de ácidos grasos, fundamentalmente oleico, laúrico, mirístico, palmítico y linoleico,33 difiriendo del D-005 en sus proporciones de ácidos grasos. Dadas las similitudes en el origen taxonómico y en la composición química de los aceites obtenidos de los frutos de A. crispa, S. repens y R. regia, así como en los efectos farmacológicos de sus extractos en modelos experimentales de HP, era lógico suponer que su perfil de toxicidad fuese similar a los descritos para esas especies, cuyas dosis tóxicas agudas son mayores que 2 000 mg/kg de peso corporal.34-36

CONCLUSIONES El extracto lipídico del fruto de A. crispa (D-005) presenta una toxicidad intrínseca baja, mostrando una toxicidad por dosis orales únicas en ratones superior a los 2000 mg/kg de peso corporal, dosis a la que no se evidencian signos indicativos de toxicidad en ninguno de los sexos, por lo que su toxicidad se puede declarar como no clasificable según el método de las clases de toxicidad aguda.

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