Epidemiologia De L'anaplasmosi, Babesiosi I Besnoitiosi En Bovins A

Facultat de Veterinària Departament de Sanitat i d'Anatomia Animals

Epidemiologia de l’anaplasmosi, babesiosi i besnoitiosi en bovins a Catalunya

Tesi doctoral

Ignasi Garrido Castañé Juliol 2015

Facultat de Veterinària Departament de Sanitat i d'Anatomia Animals

Epidemiologia de l’anaplasmosi, babesiosi i besnoitiosi en bovins a Catalunya

Tesi doctoral

Memòria presentada per

Ignasi Garrido Castañé

Per optar al grau de Doctor

Sota la codirecció de Dr. Joaquim Castellà Espuny i na Dra. Ana Maria Ortuño Romero del Departament de Sanitat i d'Anatomia Animals de la UAB

La present tesi està adscrita al programa de doctorat en Medicina i Sanitat Animals

Dr. Joaquim Castellà Espuny Dra. Ana Maria Ortuño Romero

Doctorand: Ignasi Garrido Castañé

Juliol de 2015

A l'Ana, amb qui vull viure d'aventures

ABREVIATURES

CAT Card agglutination test DARP Departament d’Agricultura, Ramaderia, Pesca i Alimentació DNA Deoxyribonucleic acid EC Escleroconjuntival EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid ELISA Enzyme linked immunosorbant assay ELISAc ELISA de competició IC Interval de confiança IFI Immunofluorescència indirecta IFN-γ Interferó gamma IgG Immunoglobulina G IL Interleuquina IM Intramuscular ITS Internal transcribed spacer MSP Major surface protein NK Natural killer NO Nitric oxide OIE Oficina Internacional d'Epizoòties PCR Polymerase chain reaction PP Percentatge de positivitat RLB Reverse line blot RNA Ribonucleic acid rRNA Ribosomal ribonucleic acid SC subcutània TNF- Tumor necrosis factor alpha WB Western blot

ÍNDEX

Pàgina I. INTRODUCCIÓ GENERAL 3

II. OBJECTIUS 11

III. REVISIÓ DE L’ANAPLASMOSI BOVINA

1. Presentació general 15 1.1. Introducció 15 1.2. Història 15 1.3. Importància econòmica 17 1.4. Els paràsits 17 1.4.1. Classificació taxonòmica 17 1.4.2. Espècies d'Anaplasma d'interès en remugants 20 1.4.2.1. Anaplasma marginale 20 1.4.2.2. Anaplasma phagocytophilum 20 1.4.2.3. Anaplasma centrale 21 1.4.2.4. Anaplasma ovis 21 1.4.3. Morfologia 22 1.4.4. Distribució geogràfica 22 1.5. Els vectors 23 1.6. Cicle biològic 24 2. Epidemiologia i transmissió 26 2.1. Estabilitat i inestabilitat enzoòtica 26 2.2. Vies d'infecció de l'hoste vertebrat 26 2.2.1. Transmissió biològica 26 2.2.2. Transmissió mecànica 27 2.2.3. Transmissió transplacentària 29 2.3. Estudis de prevalença 29 3. Patogènia i clínica 31 3.1. Hemòlisi i anèmia 31

3.2. Quadre clínic i lesions 32 4. Resistència dels animals a Anaplasma 33 4.1. Immunitat 33 4.2. Resistència natural 34 4.2.1. Raça 34 4.2.2. Edat 35 4.3. Resistència específica 35 4.3.1. Soques i aïllats 35 4.3.2. Mecanismes d'evasió del sistema immune 36 4.3.2.1. Sistema de secreció tipus IV 36 4.3.2.2. Variació antigènica 37 5. Mètodes de diagnòstic laboratorial 39 5.1. Mètodes directes 39 5.2. Immunodiagnòstic 40 5.2.1. ELISA 40 5.2.2. Tècnica d'aglutinació en targeta 43 5.2.3. Cromatografia de flux lateral 43 5.2.4. Immunofluorescència indirecta 44 5.2.5. Dot-ELISA 44 5.2.6. Tècnica de fixació del complement 44 5.3. Mètodes moleculars 45 6. Premunició, quimioprofilaxis i vacunes 46 6.1. Vacunes a partir d'A. marginale 46 6.1.1. Vacunes vives 46 6.1.2. Vacunes atenuades 46 6.1.3. Vacunes inactivades 47 6.1.4. Vacunes recombinants 48 6.2. Vacunes vives d’A. centrale 48 6.3. Vacunes dirigides contra els vectors 49 6.4. Productes anaplasmicides emprats en la quimioprofilaxi 50

IV. REVISIÓ DE LA BABESIOSI BOVINA

1. Presentació general 55 1.1. Introducció 55 1.2. Història 56 1.3. Importància econòmica i sanitària 57 1.4. Els paràsits 58 1.4.1. Classificació taxonòmica 58 1.4.2. Morfologia 59 1.4.3. Les babèsies bovines 60 1.4.3.1. Babesia bigemina 60 1.4.3.2. Babesia bovis 61 1.4.3.3. Babesia divergens 62 1.4.3.4. Babesia major 63 1.4.3.5. Altres babèsies bovines 63 1.5. Els vectors 64 1.6. Cicle biològic 65 2. Epidemiologia i transmissió 67 2.1. Estabilitat vs inestabilitat enzoòtica 67 2.2. La circulació de l'agent entre els vectors 70 2.3. Persistència del paràsit en el vector 70 2.4. Estudis de prevalença 71 3. Patogènia i clínica 73 3.1. Alliberament de molècules 73 3.2. Hemòlisi i anèmia 73 3.3. Quadres clínics i lesions 74 4. Resistència a Babesia spp. 76 4.1. Immunitat 76 4.2. Resistència natural 81 4.2.1. Especificitat d'hoste 81 4.2.2. Raça 82

4.2.3. Edat 82 4.3. Resistència adquirida 83 4.3.1. Soques i antígens 83 4.3.2. Mecanismes d'evasió de la resposta immune 84 5. Mètodes de diagnosi laboratorial 85 5.1. Mètodes directes 85 5.2. Immunodiagnòstic 86 5.2.1. ELISA 86 5.2.2. Dot-ELISA 88 5.2.3. Fixació de complement 88 5.2.4. Immunofluorescència indirecta 89 5.2.5. Cultius in vitro de Babesia spp. 89 5.2.6. Test d'immunocromatografia 90 5.3. Tècniques moleculars 90 6. Premunició, quimioprofilaxi i vacunes 91 6.1. Vacunes atenuades 91 6.2. Vacunes dirigides contra els vectors 93 6.3. Productes babesicides emprats en la quimioprofilaxi 95

V. ESTUDI 1 99

VI. REVISIÓ DE LA BESNOITIOSI BOVINA

1. Presentació general 127 1.1. Introducció 127 1.2. Història 128 1.3. Importància econòmica i sanitària 129 2. Etiologia 130 2.1. Classificació taxonòmica 130 2.2. Besnoitia spp. en grans ungulats 132 2.2.1. Besnoitia besnoiti 132 2.2.2. Besnoitia tarandi 133

2.2.3. Besnoitia caprae 134 2.2.4. Besnoitia bennetti 134 2.3. Morfologia 136 2.3.1. Ooquists 136 2.3.2. Taquizoïts 136 2.3.3. Bradizoïts 137 2.3.4. Quist de Besnoitia 137 2.4. Cicle biològic 139 2.4.1. Hoste definitiu 139 2.4.2. Hoste intermediari 140 2.4.3. Descripció del cicle biològic 141 3. Distribució geogràfica 142 4. Epidemiologia 145 4.1. Prevalença 145 4.2. Transmissió 147 4.2.1. Contacte directe 147 4.2.2. Vehiculació per dípters hematòfags 147 4.2.3. Altres vies 148 4.2.4. El paper d’altres hostes en la transmissió 149 4.3. Factors relacionats amb l’hoste i el maneig dels animals 149 4.3.1. Raça 149 4.3.2. Edat 149 4.3.3. Sexe 150 4.3.4. Estacionalitat 150 4.3.5. Munta natural 151 4.3.6. Animals subclínics 152 4.4. Factors relacionats amb el paràsit 152 4.4.1. Aïllats 152 4.4.2. Nombre de paràsits 153 4.5. Factors relacionats amb insectes 153 4.5.1. Dípters hematòfags 153

4.5.2. Dípters no hematòfags 155 5. Clínica 156 5.1. Patogènia 156 5.2. Immunitat 158 5.3. Signes clínics 160 5.3.1. Fase aguda febril 160 5.3.2. Fase aguda d’edemes 161 5.3.3. Fase d’esclerodèrmia crònica 162 5.4. Lesions 164 5.4.1. Fase aguda 164 5.4.2. Fase crònica 165 6. Diagnòstic 165 6.1. Diagnòstic epidemiològic 165 6.2. Diagnòstic clínic 166 6.3. Diagnòstic laboratorial 167 6.3.1. Mètodes d'observació directe 167 6.3.1.1. Raspats i biòpsies 167 6.3.1.2. Histopatologia 168 6.3.1.3. Plaques de compressió per triquinoscòpia 168 6.3.2. Mètodes de detecció molecular 169 6.3.3. Mètodes immunològics 170 6.3.3.1. Immunofluorescència indirecta 170 6.3.3.2. ELISA 172 6.3.3.3. Western Blot 175 6.3.3.4. Tècniques d’aglutinació 176 6.3.3.5. Immunofluorescència directa 178 6.3.3.6. Immunohistoquímica 178 6.3.3.7. Altres tècniques diagnòstiques 178 7. Tractament 179 8. Control i profilaxi 180 8.1. Mesures de control en explotacions no infectades 181

8.2. Mesures de control en explotacions infectades 182 8.3. Mesures de control d'insectes 182

VII. ESTUDI 2 189

VIII. ESTUDI 3 207

IX. CONCLUSIONS 225

X. AGRAÏMENTS 229

XI. ANNEXES Annex I 233 Annex II 239

XII. BIBLIOGRAFIES Bibliografia d’hemoparasitosis 249 Bibliografia de besnoitiosi 299

I. INTRODUCCIÓ GENERAL

INTRODUCCIÓ GENERAL

El sector boví a Catalunya continua essent el tercer sector ramader més important per darrere del porcí i l’aviram tal i com s’observa amb les dades de l’últim cens agrari publicat (figura 1).

Equins Cabrum Conilles 0,6% 0,3% Ovins mares 2,2% 0,2% Bovins 11,8%

Aviram 22,9% Porcins 62%

2009

Figura 1. Distribució del nombre d’unitats ramaderes (%) segons els sectors ramaders. Font: Idescat.

Les dades més recents disponibles són de l’any 2013, on es van comptabilitzar 12.078 explotacions ramaderes a Catalunya, de les quals 4.106 corresponen a explotacions bovines (34%). Durant les últimes dècades el nombre d’explotacions totals ramaderes ha anat disminuint, com a la resta de la UE, a causa d’una modernització del sector cap a explotacions cada cop més competitives.

Catalunya representa un 4,3% en nombre d’explotacions bovines dins de l’Estat espanyol, tot i que pel que fa a nombre d’animals és la quarta Comunitat Autònoma en importància, amb un 10% del cens total de bovins a Espanya, per darrere de Castella i Lleó, Galícia i Extremadura.

Es pot dividir el sector boví en tres subcategories: els vedells menors de 12 mesos destinats a sacrifici (vedells d'engreix), les femelles de cria o reproductores d'aptitud

càrnia i els bovins lleters. L’augment del cens català és degut principalment a l’augment en el nombre de vedells d'engreix, com podem observar a la figura 2, ja que és la part del subsector amb més animals. En canvi, el cens boví dins el subsector de 'boví lleter' i el de 'femelles de cria' d’aptitud càrnia han anat decreixent durant els últims anys (figura 3).

850

750

650

550

450

350

250 Nombre de capsNombredebestiar de (en milers)

Cens bestiar boví Vedells d'engreix

Figura 2. Cens bestiar boví total a Catalunya i nombre de vedells d’engreix menors de 12 mesos destinats a sacrifici (en milers). Font: DARP

110

100

60 Nombre de capsNombredebestiar de (en milers) 50

Boví de carn Boví lleter

Figura 3. Nombre de femelles bovines segons l’aptitud (en milers). Font: DARP

Dins de Catalunya, el nombre de caps bovins més elevat el trobem a la província de Lleida, principalment en vedells d’engreix (figures 4 i 5). En quant a les vaques de producció lletera destaca primerament Girona, seguida de Lleida i Barcelona, Tarragona però ha disminuït dràsticament la seva producció lletera durant els últims anys (figura 6). En les vaques d’aptitud càrnia, les províncies de Girona, Lleida i Barcelona tenen un cens bastant similar (figura 7).

Fig.4 Caps de bestiar boví Fig.5 Vedells d'engreix

Tarragona Tarragona 11.194 Barcelona 8.974 2% Barcelona 149.027 2,6% 27% 82.300 24%

Girona Lleida Girona Lleida 136.909 192.342 59.574 266.736 24% 47% 56% 17,4%

Figura 4. Distribució del nombre de caps bovins per demarcacions en unitats de caps de bestiar i tant per cent (2013). Font: DARP. Figura 5. Distribució per demarcacions del nombre de vedells menors de 12 mesos destinats a sacrifici en unitats de caps de bestiar i tant per cent (2013). Font: DARP.

Fig.6 Vaques aptitud lletera Fig.7 Vaques aptitud càrnia

Tarragona Tarragona 8 0% 1.207 2% Barcelona Lleida Barcelona 20.777 22.849 22.548 Lleida 32% 31% 31% 20.472 31%

Girona 27.890 Girona 38% 22.457 35%

Figura 6. Distribució de femelles parides d’aptitud lletera per demarcacions en unitats de caps de bestiar i tant per cent (2013). Font: DARP. Figura 7. Distribució de femelles parides d’aptitud càrnia per demarcacions en unitats de caps de bestiar i tant per cent (2013). Font: DARP.

Una de les alternatives a la ramaderia tradicional és la ramaderia ecològica, orientada a millorar el benestar dels animals i obtenir una qualitat diferenciada. A Catalunya un 60% d'aquesta ramaderia correspon al ramat boví i la majoria d’explotacions d’aquest tipus les trobem a la zona de l’Alt Pirineu i l’Aran.

El boví de lídia requereix un tractament diferent del boví de carn. És un tipus de ramat molt important a Espanya però amb una situació delicada a Catalunya. D’una banda, són animals amb rusticitat i de cria en extensiu però que tenen implícita una dificultat en el maneig, amb un de cicle de producció llarg i en explotacions generalment familiars. I d’altra banda, qüestions tant culturals com legislatives han causat una disminució de les explotacions ramaderes dedicades a la raça de Lídia.

Amb la finalitat de controlar i eradicar malalties d’importància veterinària i en Salut Pública, anualment es realitzen les campanyes oficials de sanejament ramader. Durant l’any 2009, la col·laboració de la Unitat de Parasitologia del Departament de Sanitat i d’Anatomia Animals (UAB) amb el laboratori de Sanitat Ramadera (LSR) de Barcelona, va posar de manifest la presència d’hemoparasitosis en algunes explotacions de Catalunya. La manca d’informació prèvia sobre dues malalties importants com són l’anaplasmosi i la babesiosi, va fer plantejar-nos l’opció de realitzar un estudi sobre la seva presència i distribució.

Per a l’estudi es van utilitzar sèrums procedents de diferents campanyes de sanejament entre el 2010 i 2011 mantinguts en col·lecció a -20ºC i degudament etiquetats. Aquests sèrums i la corresponent base de dades d’explotacions bovines, van ser la font de mostres que es van utilitzar en l’estudi d’hemoparàsits.

Posteriorment, també es va creure convenient ampliar l’estudi incloent la besnoitiosi bovina, ja que tot i tractar-se d’una malaltia emergent en països veïns, encara no s’havia realitzat cap estudi epidemiològic a Catalunya.

Per a una millor comprensió del treball realitzat, la present memòria de tesi doctoral s’ha dividit en dos apartats. Una primera part tracta de l’estudi realitzat sobre la prevalença de l’Anaplasma spp. i la Babesia bigemina. La segona part, fa referència als estudis sobre Besnoitia besnoiti.

II. OBJECTIUS

OBJECTIUS

Amb la finalitat de contribuir a un millor coneixement de les malalties que afecten a la població bovina de Catalunya, es planteja el present treball, amb els objectius detallats a continuació:

1. Determinar la seroprevalença de les hemoparasitosis causades per Anaplasma spp. i Babesia bigemina en poblacions de bovins lleters, carnis i de lídia a Catalunya.

2. Conèixer la seroprevalença a Catalunya de la besnoitiosi causada per Besnoitia besnoiti en diferents poblacions bovines.

3. Estudiar, a partir de mostres d’escorxador, la relació entre la presència de quists de Besnoitia besnoiti i l’estat serològic dels animals mostrejats.

III. REVISIÓ DE L'ANAPLASMOSI BOVINA

1. Presentació general

1.1. Introducció

L'anaplasmosi bovina és una malaltia transmesa principalment per paparres. L'agent etiològic són les rickèttsies del gènere Anaplasma. L’espècie més important per als bovins és Anaplasma marginale, encara que hi ha altres espècies que també han estat diagnosticades al nostre país tant en bovins com a altres remugants.

Generalment, els animals que s'infecten sense una immunitat prèvia, passen per un quadre clínic agut amb febre, anèmia i icterícia. Si es recuperen, poden mantenir-se infectats de per vida de manera subclínica. En els casos on la malaltia s'estabilitza de manera endèmica, els animals que es mantenen infectats resten immunitzats i actuen com a hostes portadors, que són els que poden infectar les paparres i anar disseminant la infecció.

Factors com el canvi climàtic han fet augmentar les temperatures durant els últims anys, el que pot causar alteracions en les poblacions d'artròpodes. Els canvis en les dinàmiques poblacionals de les papares vectores de malalties com l'anaplasmosi podrien comportar alhora una alteració en la presentació clínica de la malaltia. Per això és important conèixer els factors claus tant de la malaltia com de la seva transmissió, per a poder establir les mesures de vigilància i control adients.

A Catalunya, no hi ha dades publicades sobre l'anaplasmosi bovina, de manera que establir una base sobre la que estudiar la malaltia resulta molt important. Per aquest motiu, els estudis epidemiològics són el primer pas a seguir.

1.2. Història

Es considera que una de les primeres descripcions d'Anaplasma es troba en els estudis de Smith i Kilborne (1893) sobre la febre de Texas als Estats Units. En ells es menciona la presència de “punts marginals” intraeritrocitaris, encara que s'atribueixen a estadis de Babesia bigemina.

L’any 1910 a Sud-àfrica, Theiler va descriure per primer cop que els cossos d'inclusió puntiformes localitzats a la perifèria dins l'eritròcit, eren els agents etiològics dels quadres d’anèmies observats en bovins. Els successius estudis de l'autor van acabar demostrant que Anaplasma i Babesia corresponien a dos organismes separats, encara que les coinfeccions fossin freqüents. El nom, Anaplasma marginale, prové de la manca de citoplasma i de la localització perifèrica a l'eritròcit.

Theiler (1911) també va identificar una espècie menys patògena que tenia una disposició més central dins l'eritròcit, a la que va anomenar Anaplasma centrale.

L'any 1926, Darlington va reconèixer per primer cop la malaltia al continent americà.

La primera descripció d'anaplasmosi bovina a l'Estat espanyol va ser per García (1934) a Sevilla.

España et al. (1959) mitjançant estudis amb microscòpia electrònica i de contrast de fases van descriure l'organisme com un protozou. Encara que finalment, A. marginale va ser classificat com a l'espècie representativa del gènere Anaplasma, dins l'ordre de les rickèttsies (Ristic i Kreier, 1974). Des de llavors, l'anaplasmosi bovina va ser àmpliament reconeguda arreu del Vell Món sobretot en les zones tropicals i subtropicals.

Finalment, Dumler et al. (2001) va reclassificar les famílies Rickettsiaceae i Anaplasmataceae, mitjançant a estudis moleculars, en la classificació taxonòmica utilitzada en l'actualitat.

*Estudis citats per Cordero del Campillo (1963), Ristic (1977), Kocan et al. (2010) i Pohl (2013).

1.3. Importància econòmica

La importància econòmica de l’anaplasmosi bovina es deriva de la pèrdua de produccions, avortaments i els casos de mortalitat que puguin aparèixer a l’explotació. En els països on l'anaplasmosi és endèmica, a les despeses anteriors, hi ha que afegir les de fàrmacs terapèutics, vacunes i tractaments insecticides i acaricides per a la lluita contra els vectors.

L'anaplasmosi bovina es troba inclosa dins les malalties transmissibles dels bovins del Codi Sanitari per als animals terrestres 2014 de l'Oficina Internacional d'Epizoòties (OIE 2014).

La importància en Salut Pública de l'anaplasmosi és deguda a Anaplasma phagocytophilum. Fins a l'actualitat, cap altre espècie d'Anaplasma s'ha descrit com a zooantroponòtica.

1.4. Els paràsits

1.4.1. Classificació taxonòmica

Segons l'estudi de Dumler et al. (2001), A. marginale pertany al phylum Proteobacteria, classe Alphaproteobacteria, ordre Rickettiales. La classificació dins l'ordre de les rickèttsies es mostra en la taula 1. Els organismes van ser classificats segons els estudis moleculars dels gens 16S rRNA i groESL, i les proteïnes principals de superfície (MSP).

Taula 1. Classificació taxonòmica de l'ordre Rickettsiales, segons Dumler et al. (2001).

Família Rickettsiaceae Gènere Rickettsia Gènere Orientia Família Anaplasmataceae Gènere Anaplasma Anaplasma marginale Anaplasma centrale Anaplasma ovis Anaplasma bovis Anaplasma phagocytophilum Anaplasma platys Aegyptianella Gènere Ehrlichia Gènere Neorickettsia Gènere Wolbachia

Els organismes classificats en la família Rickettsiaceae (gèneres Rickettsia i Orientia) són bactèries intracel·lulars obligades que es multipliquen lliurement dins el citoplasma de les cèl·lules hostes. Mentre que els organismes agrupats en la família Anaplasmataceae, tot i que també són organismes intracel·lulars obligats, es troben dins de vacúols formats a partir de la membrana de les cèl·lules infectades.

La taula 2 mostra de manera resumida les espècies d'Anaplasma amb interès per als remugants domèstics, esmentant la malaltia i altres hostes on s'han descrit. Els vectors que s'inclouen, corresponen a les espècies de paparres on s'ha descrit la presència de l'organisme, i segons els autors es consideren vectors potencials encara que no s'hagi demostrat la transmissió biològica. Tanmateix, molts estudis s'han realitzat als Estats Units i depenent de la zona geogràfica els vectors podrien ser diferents (de la Fuente et al., 2003; Scoles et al., 2006).

Taula 2. Espècies d'Anaplasma d'interès en els remugants domèstics.

Agent etiològic Malaltia Hoste Vector A. marginale Anaplasmosi bovina Remugants Ixodes ricinus, Ixodes persulcatus, Rhipicephalus sanguineus, Rhipicephalus bursa, Rhipicephalus (Boophilus) annulatus, Rhipicephalus turanicus, Hyyalomma m. marginatum, Haemaphysalis punctata7, Dermacentor marginatus3, Argas persicus, Ornithodoros lahorensis6

A. phagocytophilum Febre transmesa per Ovins I. ricinus, I. persulcatus, paparres I. trianguliceps, R. sanguineus, R. bursa1,2, Rhipicephalus Febre de pastura Bovins, 4 cérvols, pusillus , Haemaphysalis punctata1, bisons, 1 Haemaphysalis inermis , cabres Haemaphysalis concinna2, salvatges Hyalomma m. marginatum3, Anaplasmosi Humans Hyalomma lusitanicum4, granulocítica Dermacentor marginatus3 humana Anaplasmosi Equins, granulocítica equina llames, rosegadors Anaplasmosi Canins granulocítica canina A. centrale Anaplasmosi bovina Bovins I. ricinus, I. persulcatus, R. sanguineus, R. bursa, R. annulatus, Haemaphysalis sp.5

A. bovis Anaplasmosi Bovins, petits Hyalomma anatolicum mononuclear o mamífers excavatum, R. sanguineus, R. turanicus, agranulocítica 5 bovina Haemaphysalis sp. A. ovis Anaplasmosi ovina Remugants R. bursa, 5 domèstics i Dermacentor sp. silvestres Font: Kocan et al. (2004) i EFSA (2010). 1Merino et al. (2005), 2Barandika et al. (2008), 3Naranjo et al. (2006), 4Toledo et al. (2009), 5Rymaszewska i Grenda (2008), 6OIE (2012), 7de la Fuente et al. (2005a).

1.4.2. Espècies d'Anaplasma d'interès en remugants

1.4.2.1. Anaplasma marginale

Es considera l'espècie més important en el boví (Torina et al., 2008a) i és per tant en la que se centrarà la present revisió.

L'eritròcit és l’única cèl·lula de l'hoste vertebrat on està descrit que es troba A. marginale.

La distribució geogràfica d'A. marginale la trobem en les zones tropicals i subtropicals, i també en algunes zones temperades.

Estudis europeus realitzats en zones on coexisteixen diferents espècies d'anaplames, mostren que els bovins són els hostes principals d'A. marginale (Hornok et al., 2007; Torina et al., 2008a, 2008b, 2009).

S'han descrit infeccions apatògenes en ovelles i cabres així com en d'altres remugants silvestres com el búfal d'aigua (Bubalus bubalis), bisó americà (Bison bison), diferents espècies de cèrvids (Odocoileus spp., Cervus elaphus) o diversos antílops africans entre d'altres (Kuttler, 1984; de la Fuente et al., 2004a; Torina et al., 2012).

Les espècies de remugants silvestres poden actuar com a reservoris per als animals domèstics, jugant un paper important en la epidemiologia especialment aquelles zones en extensiu, ja que podrien compartir vectors (Kuttler, 1984; Chomel et al., 1994; de la Fuente et al., 2004b, 2005a, 2005b; Portillo et al., 2011).

1.4.2.2. Anaplasma phagocytophilum

En aquesta espècie també s'agrupen els organismes anteriorment classificats com Ehrlichia equi, Ehrlichia phagocytophila i l'agent causal de l'ehrlichiosi granulocítica humana (HGE). Actualment es considera que pot estar present arreu del món, encara que la distribució depèn de la presència de les paparres vectores.

Durant el seu cicle infecta leucòcits granulocítics, monòcits i macròfags tissulars.

A. phagocytophilum es troba localitzat principalment en les àrees on es presenta Ixodes ricinus, el seu vector principal (Scharf et al., 2011). A la Península Ibèrica, principalment es troba al País Basc (Barandika et al., 2008).

En quant a hostes, s’ha descrit en remugants domèstics, èquids, gossos, cérvols (Cervus elaphus), cabirols (Capreolus capreolus), petits mamífers i aus (de la Fuente et al., 2005b; Naranjo et al., 2006; Amusategui et al., 2006 i 2008; Barandika et al., 2007; Torina et al., 2009).

1.4.2.3. Anaplasma centrale

Es considera relativament benigne, afecta principalment a bovins i la seva virulència és clarament inferior a A. marginale (de Vos, 1991). Aquesta espècie també ha estat descrita únicament en eritròcits en l'hoste vertebrat.

A. centrale té una distribució cosmopolita (Inokuma et al., 2001). A Itàlia s'ha descrit el primer cas clínic d'anaplasmosi bovina causada per A. centrale a Europa (Carelli et al., 2008; Ceci et al., 2008). A la Península Ibèrica, també s'ha detectat en cérvols (Cervus elaphus) (Portillo et al., 2011).

1.4.2.4. Anaplasma ovis

És l'espècie que afecta als eritròcits de petits remugants domèstics i silvestres com ara cabirols (Capreolus capreolus) i el mufló canadenc (Ovis canadensis) (de la Fuente et al., 2006a i 2008a). Experimentalment els cérvols també en serien susceptibles (Zaugg et al., 1996).

Tot i que s'ha descrit aquest agent en una Ixodes ricinus sobre un boví (Hornok et al., 2012), es considera que el patogen no estableix una infecció persistent en bovins ja que no són susceptibles (Kocan et al., 2004). En estudis realitzats a Itàlia on s'han detectat diverses espècies d'Anaplasma en la mateixa regió, els bovins analitzats no han mostrat infecció a A. ovis en cap cas (Torina et al., 2008a, 2008b).

A Europa trobem referències de deteccions d'A.ovis a Itàlia, Hongria i Turquia (de la Fuente et al., 2005a; Hornok et al., 2007; EFSA, 2010).

1.4.3. Morfologia

Els anaplasmes són organismes puntiformes gram negatius. En l'hoste vertebrat es troben dins els eritròcits amb una mesura entre 0,2-1 m. S'agrupen en cossos d’inclusió localitzats en els marges de la cèl·lula. Mitjançant la microscòpia electrònica, es pot identificar que un cos d’inclusió està format per entre 4-8 subunitats o cossos inicials, de 0,3-0,4 μm de diàmetre cadascuna englobades dins d'un vacúol parasitòfor.

En el vector, existeixen dos morfotipus d'Anaplasma, la forma reticulada i la forma densa (Kocan et al., 2010). La forma reticulada (o vegetativa) es troba dins de vacúols formant colònies intracel·lulars en diferents teixits. Es multipliquen per fissió binària simple i poden arribar a agregar-se centenars d’organismes en una mateixa colònia. La forma densa és la fase següent a la forma reticulada, més arrodonida i amb una mesura similar de 0,5 i 0,8 μm. Se l’anomena forma “densa” per que conté una distribució més uniforme i compacta dels ribosomes i les fibril·les de DNA no resulten visibles (Kocan et al., 2004). Aquesta última forma és la infectiva per als vertebrats i a diferència de la forma reticulada prèvia, pot sobreviure extracel·lularment en el vector.

1.4.4. Distribució geogràfica

L’anaplasmosi bovina es troba present en les zones tropicals, subtropicals i temperades d'arreu del món. S'ha descrit al continent americà, sud d’Europa, Àfrica, Àsia i també al nord d’Austràlia (Aubry i Geale, 2011). El moviment d’animals infectats és una de les principals causes de dispersió de la malaltia (Kocan et al., 2009). L’establiment de la malaltia depèn de les característiques pròpies de cada zona (Guglielmone, 1995).

A Europa, A. marginale es troba principalment en les regions pròximes al Mediterrani tant en animals domèstics com silvestres. A més d'Espanya, s’ha descrit a Àustria

(Baumgartner et al., 1992), Suïssa (Hofmann-Lehmann et al., 2004) i Itàlia (Ceci i Carelli, 1999; Cringoli et al., 2002; de la Fuente et al., 2005a). En aquest últim cas, alguns autors consideren que podria estar en expansió degut a l'augment en el nombre de casos (Torina i Caracappa, 2007).

Els casos d’anaplasmosi bovina a Espanya inicialment es trobaven descrits a les regions de la meitat sud del país (Cordero del Campillo, 1963). Més recentment s'han descrit la presència d’anaplasmes a Castella la Manxa, tant en animals domèstics com silvestres (de la Fuente et al., 2004a, 2004b, 2005a; Naranjo et al., 2006). A la resta de la Península destaquen altres anaplasmes com A. phagocytophilum (García-Pérez et al., 2003; Oporto et al., 2003; Merino et al., 2005; Portillo et al., 2005; Amusategui et al., 2006; Barandika et al., 2008; Toledo et al., 2009).

1.5. Els vectors

Les paparres actuen com a vectors biològics de les diferents espècies d'Anaplasma. Unes vint espècies de paparres han estat considerades com a vectores arreu del món, principalment ixòdids, encara que alguns argàsids com Argas o Ornithodoros també s'han descrit com a vectors potencials (Kocan et al., 2004).

De les espècies de paparres que poden actuar com a vectores, a Catalunya se n'han descrit menys d'una desena (Estrada-Peña et al., 1995; Estrada-Peña, 2000). Entre els ixòdids trobem Dermacentor marginatus, Haemaphysalis inermis, H. punctata, H. sulcata, Ixodes ricinus, Rhipicephalus bursa, R. sanguineus i R. turanicus. I dels argàsids, Argas persicus.

Entre els ixòdids descrits trobem paparres de dos hostes com R. bursa. En aquesta espècie, les formes immadures (larves i nimfes) s'alimenten en el mateix hoste, cauen de l'hoste en fase de nimfa, muden a l'estadi adult i tornen a pujar a un altre hoste. Els estadis adults es poden trobar freqüentment ungulats i en la mateixa espècie animal poden trobar-se totes les fases de la paparra (monotropa). Són paparres adaptades als hàbitats de climes mediterranis, en zones de pastures de gramínies i poc freqüents en zones boscoses (Manilla, 1998).

La resta d'ixòdids són de tres hostes, on cada fase de la paparra puja a un hoste, realitza la ingesta de sang, cau a terra, muda a la següent fase i torna a pujar a un altre hoste fins arribar a la fase adulta i realitzar la posta en el terra. Encara que R. sanguineus ha estat descrita com a vector, la importància a la nostra zona en la transmissió d'A. marginale es desconeix ja que es tracta d'una espècie on l'hoste principal és el gos i ocasionalment afectaria a altres hostes. R. turanicus és una espècie que afecta freqüentment a bovins i les fases immadures solen trobar-se en hostes com petits mamífers (ditropa). Les espècies Haemaphysalis inermis i Ixodes ricinus són paparres que depenen d'un grau d'humitat constant per a la supervivència (Manilla, 1998; Dantas-Torres i Otranto, 2013), el que fa que a Catalunya la seva distribució es trobi limitada a les regions més al nord, encara que en quant a hostes, s'han descrit en un ampli rang de mamífers domèstics i silvestres. En canvi H. punctata i H. sulcata es troben més distribuïts arreu del territori, especialment per zones amb vegetació arbustiva i gramínies. D. marginatus es troba també distribuïda arreu del territori, en zones boscoses i de vegetació arbustiva on els adults s'alimenten d'ungulats domèstics i silvestres. i

El paper de les paparres argàsides probablement no sigui gaire important en la transmissió d'A. marginale, ja que A. persicus és una paparra endòfila que principalment afecta a gallines i els resultats en la transmissió van resultar variables (segons Kocan et al., 2004).

Diverses espècies de dípters hematòfags com tàvecs (Tabanus spp.) i mosques picadores (Stomoxys calcitrans i Haematobia irritans) podrien actuar com a transmissors mecànics d’A. marginale (Foil, 1989; Potgieter i Stoltsz, 2004; Hornok et al., 2008; Baldacchino et al., 2013).

1.6. Cicle biològic

La paparra que actua com a vector s'infecta quan ingereix eritròcits amb els cossos d’inclusió d’A. marginale. Mitjançant l’adhesina MSP1a, l’anaplasma entra en contacte a la membrana de les cèl·lules intestinals de la paparra i s’hi adhereix.

Segons s’ha observat en estudis in vitro, la cèl·lula hoste emet unes projeccions de la membrana cel·lular que engloben l’anaplasma i mitjançant un procés d’endocitosi queda finalment internalitzat en un vacúol. Dins aquest vacúol, Anaplasma passa a la seva forma reticulada. En aquesta forma, es multiplica per fissió binària formant colònies a les 48 hores de l’exposició cel·lular al patogen (Kocan et al., 2004). Inicialment, les cèl·lules diana són les cèl·lules epitelials i musculars de l’intestí de la paparra, encara que també poden trobar-se en les cèl·lules dels túbuls de Malpighi, fibres musculars, l’aparell reproductor i glàndules salivals, on també es multipliquen (Ge et al., 1996). Kocan et al. (2004) va observar unes colònies dins les cèl·lules intestinals que mesuraven de 4-10 µm i més petites, de 1-2 µm, a les glàndules salivals. Als tres dies de la invasió cel·lular, les formes reticulades es transformen en formes denses, que són les formes infectives (Kocan, 1995). Cap al quart dia, la membrana del vacúol que envolta la colònia es fusiona amb la membrana cel·lular, permetent l’alliberament de les formes denses sense lesionar la cèl·lula hoste. Les formes denses alliberades poden envair de nou altres cèl·lules de l’hoste, en les que es poden formar més de cinc colònies per cèl·lula. Dins les cèl·lules hostes, tornen a passar a la forma reticulada, es multipliquen i s’alliberen altre cop en la forma densa (Pruneau et al., 2014). Finalment, quan la paparra pica per ingerir sang, inocula la forma densa de l’anaplasma que es troba a les glàndules salivals a l'hoste vertebrat (Kocan et al., 2004).

Un cop en el boví, la invasió cel·lular s’inicia per l’adhesió mitjançant de la forma densa a la membrana cel·lular de l’eritròcit. En aquest procés hi intervenen les adhesines MSP1a i MSP1b (de la Fuente et al., 2001a i 2003). Posteriorment a l'adhesió, es produeix l'endocitosi junt formant un vacúol parasitòfor amb la pròpia membrana de l’eritròcit. En aquest vacúol es multipliquen per fissió binària fins a formar de 4 a 8 cossos inicials per cèl·lula infectada i s'alliberen per exocitosi. En aquest punt, s’estableixen cicles de mort eritrocitària, infecció i proliferació dels anaplasmes en nous eritròcits alhora d’un procés d’evasió del sistema immune mitjançant el canvi d'unes determinades proteïnes de superfície del patogen.

2. Epidemiologia i transmissió

2.1. Estabilitat i inestabilitat enzoòtica

En les malalties transmeses per paparres, un dels factors més importants en la seva epidemiologia és la relació que s'estableix entre l'hoste vertebrat, el patogen i els seus vectors.

L'establiment de la immunitat efectiva en la població depèn de diversos factors (veure punt 4.2. resistència natural). Si la majoria de la població és immune a la malaltia, es dóna una situació d'estabilitat enzoòtica (o endèmica) on no hi ha casos clínics però el patogen es troba disseminat per la població. En canvi, la inestabilitat implica que una part de la població no està immunitzada i presenta el risc d'emmalaltir.

Aquest concepte d'estabilitat enzoòtica va ser descrit inicialment per a malalties com la babesiosi però les similituds epidemiològiques fan que pugui ser utilitzat també per a l’anaplasmosi (Guglielmone i Mangold, 1987). L'establiment i el desenvolupament de l'estabilitat enzoòtica serà més profundament explicat en la corresponent revisió de Babesia (pàgina 67).

2.2. Vies d'infecció de l'hoste vertebrat

En A. marginale s'han descrit diferents vies de transmissió de la infecció cap als hostes vertebrats, les quals són comentades a continuació.

2.2.1. Transmissió biològica

Aquesta via de transmissió es considera la més freqüent. Scoles et al. (2005a) van descriure que la transmissió biològica per paparres es el doble d'eficient que la transmissió mecànica per Stomoxys calcitrans, ja que a més, permet la replicació i la persistència del patogen. Implica la ingestió dels eritròcits infectats per les paparres vectores, la proliferació del patogen dins la paparra i la seva posterior inoculació.

La transmissió en les paparres es dóna per via intraestadial (durant la mateixa fase evolutiva de la paparra) o transestadial (d’una fase a una altra, com ara de nimfa a adult) com a mètodes més comuns. Diversos autors destaquen el paper dels mascles en la transmissió (intraestadial) del patogen (Zaugg et al., 1986; Kocan, 1995). Segons Kocan et al. (2000), els mascles s'infecten després en un curt període d'ingestió i poden transmetre la infecció en altres animals.

En el cas d'A. marginale no s’ha descrit la via transovàrica (pas de la infecció de la femella als ous) i per tant, la persistència de la infecció en l’hoste vertebrat és fonamental per a la transmissió del patogen (Kocan et al., 2004; Suárez i Noh, 2011).

L'estudi de Kocan i de la Fuente (2003) va demostrar que la transmissió per co-feeding no era possible entre adults de Dermacentor variabilis.

2.2.2. Transmissió mecànica

La transmissió mecànica es produeix quan no es dóna cap procés d’amplificació o multiplicació de l’agent patogen. En aquest cas, els eritròcits infectats són transmesos des dels bovins infectats cap a d’altres bovins susceptibles a través de d’insectes picadors o per material contaminat (via iatrogènica).

Alguns autors suggereixen que en les condicions on no és factible la transmissió per paparres, la transmissió a través d’insectes hematòfags podria esdevenir la via més important (Foil, 1989; de la Fuente et al., 2001b). De la Fuente et al. (2001c) van demostrar que determinats aïllats d’A. marginale no resultaven infectius o transmissibles per paparres, però que en canvi, els aïllats es trobaven presents en condicions de camp, suggerint altres vies possibles. També podria esdevenir important en el cas que les poblacions de paparres vectores fossin limitades o inexistents, degut a tractaments acaricides o per canvis climatològics (Figueroa et al., 1998; Coronado, 2001; Kocan et al., 2009). No es descarta que la transmissió biològica i mecànica es donin de manera simultània.

Algunes espècies de tàvecs com Tabanus sulcifrons, T. lineola, T. fuscicostatus, T. mularis i T. pallidescens, almenys experimentalment, poden transmetre l’anaplasma (Foil, 1989). Probablement els tàvecs siguin els dípters més importants, tant per la seva major capacitat de vol com per les dimensions de l’aparell picador on poden quedar més restes de sang en comparació amb altres dípters hematòfags (Scoles et al., 2008a). De la Fuente et al. (2005b) van considerar que Atyotus loewianus i Tabanus nemoralis podrien jugar un paper en la transmissió entre el cicle domèstic i el silvestre a l'Estat espanyol.

El paper com a vectors dels dípters hematòfags en infeccions naturals encara es desconeix. En els estudis experimentals de Scoles et al. (2005a i 2008a) entre paparres del gènere Dermacentor i dípters com S. calcitrans i T. fuscicostatus, no es va detectar transmissió quan els dípters eren alimentats en hostes en la fase de rickettsèmia, mentre que les paparres alimentades en hostes en fase de persistència van infectar el 100% dels bovins. La variabilitat en la transmissió fa que la importància dels dípters com a vectors pugui ser diferent segons les característiques de cada regió (OIE, 2012).

Alguns autors han suggerit l'eventual paper que polls anoplurs (Linognathus vituli) poden desenvolupar en la disseminació de la malaltia (Hornok et al., 2010).

En el cas de la transmissió iatrogènica, es considera que la transmissió per material contaminat amb sang infectada, com ara agulles hipodèrmiques, podria representar una via de disseminació dins d’un mateix ramat (Rodríguez-Vivas et al., 2004; de la Fuente et al., 2005b; Reinbold et al., 2010a), però es considera poc viable en el cas de diferents explotacions. A més a més, es desconeix el nombre d’animals que poden infectar-se successivament així com les probabilitats d’infecció en nivells de rickettsèmia baixos (Kocan et al., 2000; Aubry i Geale, 2011).

2.2.3. Transmissió transplacentària

La transmissió transplacentària d’Anaplasma ha estat descrita en qualsevol moment de la gestació (Bock et al., 2003; Añez-Rojas et al., 2010; Maldonado et al., 2012; González-Grau et al., 2013).

Potgieter i Van Rensburg (1987) van detectar, mitjançant tècniques d’aglutinació en targeta que un 15,6% dels vedells nascuts de mares infectades presentaven Anaplasma. En el mateix estudi, el doble de vedells van néixer infectats quan la mare estava en fase de rickettsèmia en comparació a les mares en fase de persistència. Més recentment, Maldonado et al. (2012) detecten per PCR un 20,7% de vedells infectats nascuts de mares infectades.

Segons Kocan et al. (2003) aquesta via podria ser especialment important en algunes regions. Especialment els vedells nascuts de mares infectades, ja que neixen sense signes clínics destacables, actuant com a portadors (Potgieter i Van Rensburg, 1987; Añez-Rojas et al., 2010).

2.3. Estudis de prevalença

Tradicionalment es considera que l'anaplasmosi bovina es troba en les zones tropicals i subtropicals encara que també s’han descrit casos a les zones temperades.

A la taula 3 es presenten alguns dels estudis epidemiològics d'A. marginale realitzats, presentats segons la tècnica diagnòstica utilitzada.

Taula 3. Resum dels resultats (% positius) dels estudis epidemiològics publicats per a A. marginale.

Localització Tècnica Referència *ELISAc Altres Tècn. CAT IFI ELISA molec.

Espanya 61 20 De la Fuente et al., (Ciudad Real) 2005b

Europa Hongria 80,8 Hornok et al., 2008 Itàlia 0-3,2 Georges et al., 2001 Itàlia 60,9 Cringoli et al., 2002 Itàlia 86-88 Tassi et al., 2002 Itàlia 62-100 De la Fuente et al., 2005c Itàlia 57,2 9,8 Torina et al., 2007a Itàlia 55,3 15,8 Torina et al., 2007b Itàlia 26,7- Torina et al., 2008a 36,3 Itàlia 57 40-60 Torina et al., 2008b Itàlia 18,1 Ceci et al., 2014 Suïssa 56 Hofmann-Lehmann et al., 2004 Suïssa 0 Dreher et al., 2005b

Angola 38 Kubelová et al., 2012 Marroc 8,8 Sahibi et al., 1998 Àfrica Marroc 16,5 21,9 Ait Hamou et al.,2012 Moçambic 63 Alfredo et al., 2005 Moçambic 26 Marufu et al., 2010 Moçambic 76,5 Tembue et al., 2011a Nigèria 79,4 Ajayi i Dipeolu, 1986 Sud Àfrica 98,6 Dreyer et al., 1998 Sud Àfrica 86 60 Mtshali et al., 2007 Sudan 38,9 Salih et al., 2009 Sudan 6,1 Awad et al., 2011 Sudan 40-50 Malak et al., 2012 Tanzània 20-37 Swai et al., 2005 Zàmbia 41-77 Simuunza et al., 2011

India 48,7 Ashuma et al., 2013

Àsia Israel 94 78 Molad et al., 2006 Pakistan 31 Atif et al., 2013 Sumatra 82 Payne et al., 1988 Turquia 55,3 Birdane et al., 2006 Vietnam 28 Geurden et al., 2008

Bolívia 20,5 Carnique-Mas et al., 2000 Brasil 76,1 Yoshirae et al., 2003 Amèrica Brasil 97 94,8 Barros et al., 2005 Brasil 68,3 Guedes et al., 2008 Brasil 20-60 Barbosa-da Silva i da

Fonseca, 2013 Brasil 15 de Mendonça-Costa et al., 2013 Brasil 63 Souza Amorim et al., 2014 Carib 80 Knowles i Montrose, 1982 Carib 1-71 Camus i Montenegro- James, 1994 Costa Rica 57 Pérez et al., 1994 Costa Rica 37,2 Oliveira et al., 2011 Costa Rica 87,5 59,1 56,9 Shebish et al., 2012 Guatemala 87,5 Teglas et al., 2005 Mèxic 22 Teclaw et al., 1985 Mèxic 69,2 Cossío-Bayúgar et al., 1997 Mèxic 69,7 Rodríguez-Vivas et al., 2004 Puerto Rico 27,4 Urdaz-Rodríguez et al., 2009 USA 4,27- Hugh-Jones et al., 1988 5,64 USA 15,7 Coetzee et al., 2010 USA 15,2 Hairgrove et al., 2014 Veneçuela 22,4 Meléndez i Forlano, 1997 Veneçuela 95,4 Díaz et al., 2003

Austràlia 38,4 Sserugga et al., 2003 Tècn. molec.: anàlisi per tècniques moleculars.

* Degut a la freqüència d'ús de l'ELISA de competició, aquesta tècnica es presenta a la taula separat d'altres ELISA.

3. Patogènia i clínica

3.1. Hemòlisi i anèmia

En l'hoste vertebrat, A. marginale únicament infecta els eritròcits. La patogènia de la malaltia es deriva doncs de la fagocitosi que es dóna a la melsa i el fetge per part del sistema mononuclear fagocitari, que causa l'eliminació dels eritròcits infectats i l'aparició de l'anèmia (Mahan, 2003).

3.2. Quadre clínic i lesions

L'aparició dels signes clínics i la seva gravetat varia de manera important depenent de la forma clínica.

Segons la dosi infectiva, el període d'incubació varia entre 7-60 dies (Kocan et al., 2003). A partir d'aquest moment, la rickettsèmia s’incrementa de manera exponencial i s'inicia la fase aguda de la malaltia. Coincidint amb el pic de rickettsèmia cap a les dues setmanes, apareix l'hipertèrmia (40-41ºC). En aquesta fase, un 10-90% dels eritròcits poden esdevenir infectats depenent de la susceptibilitat de l'hoste i la soca d'A. marginale (Aubry i Geale, 2011). Tanmateix, es considera que almenys un 15% dels eritròcits han d’estar infectats per a que hi hagi manifestacions clíniques (Radostits et al., 2007).

El signe clínic principal és l'anèmia hemolítica extravascular. Sol estar acompanyada per icterícia, però sense hemoglobinúria ni hemoglobinèmia, a diferència de les babesiosis (de la Fuente et al., 2001c; Potgieter i Stoltsz, 2004). El valor de l'hematòcrit pot arribar a disminuir per sota del 20%.

Els signes generals que es poden observar durant aquesta fase són debilitat, anorèxia, letargia, deshidratació, incoordinació motora, taquicàrdia i taquipnea. En les femelles pot haver-hi disminució de la producció lletera i avortaments. En els mascles s'ha descrit una infertilitat temporal (Mahan, 2003; Aubry i Geale, 2011).

Durant la fase d'hemòlisi el pronòstic pot ser greu en els bovins adults (mortalitat de fins a 50-60%), en canvi en els joves la recuperació és més freqüent.

Si els animals sobreviuen de la fase aguda, es recuperen progressivament i desenvolupen la fase de persistència de la malaltia. Aquests bovins no arriben a eliminar el patogen, esdevenint portadors subclínics, amb una immunitat de per vida però resistents a les reexposicions a la mateixa soca. Un estat on es manté una infecció permanent a l'hoste, caracteritzada per baixos nivells de rickettsèmia, que de manera cíclica van augmentant degut a la variació antigènica fins que tornen a disminuir altre cop degut a la immunitat (Knowles et al., 1996; Palmer et al., 1999; French et al., 1999).

Les lesions destacables en l'anaplasmosi inclouen una marcada anèmia en mucoses, teixits subcutanis i musculatura, o que evolucionen a una icterícia més o menys generalitzada.

La sang presenta una consistència més fluida i s'observa esplenomegàlia, hepatomegàlia i distensió de la vesícula biliar. Poden aparèixer també hemorràgies petequials i equimosis especialment a miocardi, pericardi i renal (Coetzee et al., 2005).

En casos d'avortaments, els fetus poden presentar una lleugera hepatomegàlia amb lesions petequials junt amb d’altres lesions vasculars més lleus a melsa o pulmons.

4. Resistència dels animals a Anaplasma

4.1. Immunitat

La immunitat protectora enfront Anaplasma està relacionada amb la resposta cel·lular dels macròfags junt amb la resposta humoral per a la opsonització del patogen mitjançant títols alts d'IgG contra els epítops de MSP dels limfòcits B (Tebele et al., 1991; Palmer et al., 1999; Mahan, 2003).

Durant la infecció aguda, la primera barrera de defensa és la resposta immune innata mitjançant l'activació dels macròfags (Buening, 1976; Carson et al., 1976). Possiblement com succeeix amb altres bacteris, el DNA bacterià actua com a activador de les cèl·lules presentadores d’antigen (CAP) per a que s'estimuli la producció d' IFN-γ. L’ IFN-γ és una citoquina clau ja que modula tant la immunitat innata com l'adquirida tant a nivell cel·lular com humoral (Goff et al., 1998 i 2001), activa els monòcits (Goff et al., 1996; Stich et al., 1998) i regula la síntesi de IgG2 opsonitzants per part dels limfòcits B (Estes et al., 1994). Els macròfags activats produeixen l'òxid nítric (NO) que té la capacitat d'eliminar patògens.

Es considera que la immunitat humoral actua a partir de 2a setmana post infecció, mantenint oscil·lacions cícliques de rickettsèmia durant la infecció crònica. Les IgG van dirigides contra els antígens immunodominants, principalment de MSP2, tot i que també se n'han descrit cap a les altres proteïnes de superfície (Palmer et al., 1994;

Lopez et al., 2005). No s'han detectat anticossos específics contra eritròcits. Les IgG1 neutralitzen els anaplasmes extracel·lulars i les IgG2 actuen en la opsonització per a la fagocitosi. Han et al. (2010) van suggerir que en infeccions causades per A. marginale, els limfòcits TCD4+ desenvolupaven una mala memòria que feia que es produïssin uns títols de 3.000-100.000 tant d'IgG1 com d'IgG2 i no eliminessin la infecció. Probablement aquest fet sigui degut a la variació antigènica d'Anaplasma, que no permet l'esterilització de l'animal encara que la resposta immune generi contínuament noves IgGs dirigides contra els antígens de superfície, ja que es tracta d'una regió hipervariable (Eid et al., 1996; French et al., 1999). Degut a això, s'estableix una fase d'infecció crònica, que equival als successius pics de rickettsèmia i control que s'observen durant aquesta fase. L'estudi de Noh et al. (2010) no va trobar evidències del paper protector de les IgGs per a Anaplasma, indicant que segurament, encara no s'ha descrit clarament el paper dels anticossos en la immunitat protectora.

4.2. Resistència natural

4.2.1. Raça

Alguns estudis descriuen que els animals d’alta producció podrien ser més susceptibles que les races de Bos indicus (Ristic, 1968; Aguirre et al., 1988). En explotacions de B. indicus i bovins creuats, la taxa d’infecció amb A. marginale (així com Babesia spp.) i el nombre de paparres és inferior, degut a un nivell de resistència superior (Jonsson et al., 2008).

No obstant, altres estudis de susceptibilitat mostren uns resultats contradictoris. Bock et al. (1997) no observa diferències significatives al inocular amb soques virulentes d'A. marginale diferents grups d'animals purs i creuats de B. indicus i B. taurus. En l'estudi de Bock et al. (1999), es va tornar a avaluar a través de la transmissió per R. (B.) microplus, però els resultats tampoc van observar diferències entre els diferents animals, suggerint una susceptibilitat similar.

Alguns d'aquests autors coincideixen a descriure que els signes clínics resulten menys greus en B. indicus (Bock et al., 1997; Jonsson et al., 2008).

4.2.2. Edat

Els animals joves són més resistents que els adults. Els casos clínics en vedells de menys de sis mesos són rars i entre els 6-12 mesos els animals infectats acostumen a desenvolupar una malaltia lleu (Rubaire-Akiiki et al., 2004). La forma clínica aguda sol aparèixer a partir de l'any de vida. En els animals de més de dos anys d’edat, la malaltia pot comportar complicacions i ser fatal (Aubry i Geale, 2011).

El nombre d’animals infectats augmenta segons l’edat (Swai et al., 2005; Urdaz- Rodriguez et al., 2009; Atif et al., 2013) probablement degut a que augmenta temps exposició al patogen en els individus de més edat (Jonsson et al., 2008).

4.3. Resistència específica

4.3.1. Soques i aïllats

La diversitat de soques i aïllats geogràfics d’A. marginale descrits arreu del món mostren diferències en les característiques antigèniques, la virulència i la capacitat de transmissió per paparres (Rodríguez et al., 2000; de la Fuente et al., 2001c i 2003; Bock et al., 2003). Mentre que hi ha soques com la St.Maries dels Estats Units que es transmeten amb un nombre baix de picades de Dermacentor andersoni per que tenen una alta eficiència en la transmissió (Eriks et al., 1994; Scoles et al., 2005b; Agnes et al., 2010), altres soques com la Florida o Mississippi no són aparentment transmissibles per paparres (Ueti et al., 2007). Encara que aquestes diferències poden ser degudes a variacions genètiques entre aïllats, no hi ha estudis de seqüenciació disponibles que ho corroborin (Suarez i Noh, 2011). Les soques i aïllats que no són transmissibles per paparres tampoc resulten cultivables in vitro en cèl·lules de paparra (IDE8)(Kocan et al., 2004).

La genètica A. marginale és heterogènia dins les pròpies regions endèmiques possiblement per moviment de bovins i el manteniment dels diferents genotipus per mecanismes de transmissió independents (de la Fuente et al., 2005c). Sembla haver-hi

mecanisme d'exclusió de la infecció on només es troba un genotipus per animal (de la Fuente et al., 2002a i 2003). Alguns autors suggereixen que es podria donar aquest fenomen d'exclusió quan dues soques, o fins i tot espècies d'Anaplasma diferents, infecten el mateix hoste (Palmer et al., 2001; de la Fuente et al., 2002c). Tot i això, estudis posteriors han demostrat que era viable la infecció dels animals amb soques diferents (Palmer et al., 2004; Leverich et al., 2008; Bastos et al., 2010). La coinfecció de diferents espècies d'anaplasmes en bovins també ha estat descrita per altres autors com Shkap et al. (2008) per A. marginale i A. centrale, o en l'estudi de Hoar et al. (2008) amb la detecció d'A. marginale i A. phagocytophilum.

També s'ha descrit que quan els genotipus es troben filogenèticament distants poden coexistir en una mateixa regió geogràfica i podrien ser possibles diferents soques en un mateix animal (Palmer et al., 2004). Els mateixos genotipus s'han descrit en soques de Sud-àfrica, Amèrica i Europa (de la Fuente et al. 2005c).

Segons de la Fuente et al. (2001c i 2003), la virulència d’alguns aïllats podria estar relacionada amb la variació de l’activitat adhesiva de la MSP1a.

4.3.2. Mecanismes d'evasió del sistema immune

4.3.2.1. Sistema de secreció tipus IV

En els anaplasmes, l'evasió de la resposta cel·lular innata sembla estar relacionat amb la presència d'un sistema de secreció tipus IV (type IV secretion system, T4SS), que els permet l'alliberació de molècules que intervenen en la invasió cel·lular. Intracel·lularment, els organismes es poden multiplicar sense ser detectats. Aquest factor T4SS de virulència s'ha descrit en A. phagocytophilum, i encara que per A. marginale també s'ha descrit, es desconeix si té la mateixa funció (Gillespie et al., 2010).

4.3.2.2. Variació antigènica

L'evasió de la resposta immune adquirida per la variació antigènica es considera un dels mecanismes principals pel qual A. marginale persisteix en un hoste immunocompetent després de la infecció aguda (Palmer et al. 1999). En aquesta variació, les proteïnes de superfície o MSP (major surface protein) són claus, ja que són els epítops per a la resposta immune (de la Fuente et al., 2001c; Kocan et al., 2003).

Sis MSPs han estat identificades en el cas d'A. marginale: MSP1a, MSP1b, MSP2, MSP3, MSP4 i MSP5 (Palmer et al., 1999). La MSP1, MSP4 i MSP5 estan codificades per gens simples i no varien antigènicament durant la multiplicació de l’anaplasma. Mentre que la MSP2 i MSP3, estan codificades per famílies de multigens i són les més importants per al manteniment de la infecció per la seva variació en l'expressió gènica (Bowie et al., 2002; Brayton et al., 2003; Kocan et al., 2003; Palmer et al., 2009).

La MSP2 actua durant l'adhesió de l'anaplasma a la cèl·lula hoste però alhora indueix resposta immune protectora. El gen msp2, que sintetitza la MSP2, conté una regió hipervariable que és la responsable de les diverses composicions antigèniques (Barbet et al., 2000 i 2001; Brayton et al., 2002). Anaplasma conté múltiples regions del gen msp2, però només n’expressa una d’elles per a cada organisme individual d’A. marginale i la resta es mantenen com a pseudogens (Brayton et al., 2005). En cada cicle de rickettsèmia en el boví, hi ha una recombinació entre el gen expressat i els pseudogens de la mateixa família msp2, resultant en una nova expressió de proteïnes i per tant, una nova variació antigènica gràcies a aquesta regió hipervariable (French et al., 1999; Palmer et al., 2000; Barbet et al., 2000).

La variació en les propietats antigèniques també sembla dependre de la MSP3. Alguns autors suggereixen que el mecanisme de variació antigènica probablement resulta similar (Palmer et al., 1999; Futse et al., 2009).

Diversos autors han descrit que són els limfòcits TCD4+ els que reconeixen principalment els epítops de la regió hipervariable (French et al., 1999; Abbott et al., 2004; Zhuang et al., 2007). La interacció limfòcit T-cèl·lula B indueix una producció

d'IgGs específica ràpida a l'inici de la infecció, però els anaplasmes poden escapar del sistema immune gràcies als mecanismes esmentats.

La figura 1 mostra com a partir de les 5 setmanes, la infecció aguda remet gràcies als mecanismes de control i s'estableix la infecció persistent. Quan es desenvolupen les IgG específiques que permeten controlar la infecció, la regió hipervariable dels anaplasmes que s'escapen de la immunitat genera nous antígens no reconeguts i es dóna un pic de reemergència, entre 104 i 107 anaplasmes per mil·lilitre. Posteriorment, noves IgG es generen contra aquests epítops i la rickettsèmia torna a disminuir. Aquesta relació cíclica reemergència-control estableix el manteniment de la infecció i l'establiment d'animals portadors (Zaugg et al., 1986; Palmer et al., 1999; Han et al., 2010).

109

Co1 Co2

E1 E2 E3

Anaplasma marginale Anaplasma de sang ml per 10 Infecció aguda C1 C2 C3

5 10 15 20 Setmanes post infecció

Figura 1. Evolució dels nivells d'A. marginale en sang segons les setmanes post infecció. Després de la infecció aguda emergeixen cicles de rickettsèmies. En el primer cicle (C1) apareix una emergència de la rickettsèmia (E1) fins que posteriorment disminueix degut al control per les IgG protectores, i així succesivament en cicles indefinits. Modificat de Palmer et al. (1999).

Els animals immunitzats vacunalment amb MSP2 o MSP1a, desenvolupen una marcada proliferació dels limfòcits TCD4+ específics i l'alliberació de IFN-γ a l'inici de la infecció.

Però a partir de les tres setmanes post infecció, quan es desenvolupa el pic de rickettsèmia, aquests limfòcits TCD4+ disminueixen dràsticament de la circulació (Abbott et al., 2005; Han et al., 2008). L'estudi de Han et al. (2010) va detectar que aquesta disminució es podria donar degut a una resposta anormal en els limfòcits T de memòria, descartant altres hipòtesis com l'acúmul de limfòcits en teixits o una immunodepressió com es dóna en les infeccions per A. phagocytophilum. En canvi, segons va proposar Brown (2012), la disminució detectada de limfòcits TCD4+ podria ser deguda a l'apoptosi cel·lular, derivada d'una càrrega d'anaplasmes alta. De manera similar a com s'ha descrit en altres patologies cròniques, una càrrega de patògens alta pot produir l'esgotament dels limfòcits T (Abbott et al., 2005; Han et al., 2008; Kim i Ahmed, 2010). Els mecansimes d'apoptosi podrien estar relacinats amb l'IFN-γ, que activaria l'alliberació de molècules proapoptòtiques tant dels propis limfòcits TCD4+ com el TNF-, com pel NO alliberat pels macròfags. Tanmateix, fins a l'actualitat encara continua sent una incògnita com es desregulen els limfòcits TCD4+ durant les infeccions amb A. marginale i permeten l'evasió del sistema immune per al manteniment de la infecció.

5. Mètodes de diagnòstic laboratorial

5.1. Mètodes directes

Aquest tipus de diagnòstic es basa en la identificació morfològica dels anaplasmes en frotis de sang.

A diferència d'algunes babèsies, Anaplasma no s'acumula en capil·lars sanguinis i la recollida de mostra sanguínia es pot realitzar en grans vasos com ara la jugular. En animals morts es pot recollir la sang de fetge, ronyons, cor o pulmons. Es realitza l'extensió de la mostra de sang en un portaobjectes per a obtenir un frotis prim. Es fixa amb metanol i es tenyeix amb Giemsa. També es poden utilitzar colorants ràpids com el Diff-Quick. L’observació es realitza al microscopi òptic amb l'objectiu d'immersió (OIE, 2012).

La identificació dels cossos arrodonits, densos i menors d’1 μm localitzats en la perifèria dels eritròcits, són indicatius d’una infecció per A. marginale.

Els frotis gruixuts no es recomanen per Anaplasma ja que la sensibilitat es veu reduïda si es troben extracel·lularment.

El diagnòstic per mitjà de frotis sanguinis presenta una sensibilitat baixa quan la infecció en sang també ho és, es considera que el límit de detecció es troba en el 0,03% de rickettsèmia (Gale et al., 1996). Per tant, els frotis s'hauran de realitzar a partir de les 2-6 setmanes de la infecció. A més, tampoc es recomana aquesta tècnica durant processos greus d'anèmia o durant la fase subclínica de la malaltia o, lògicament, quan ja s’hagi instaurat un tractament (Eriks et al., 1989; Birdane et al., 2006; Fosgate et al., 2010).

També s'ha valorar la presència d’artefactes intraeritrocitaris com els cossos de Howell-Jolly que podrien donar falsos positius en el diagnòstic per frotis sanguini.

5.2. Immunodiagnòstic

En el cas d’A. marginale, la majoria de tècniques immunològiques descrites presenten una especificitat per sobre del 96% (Montenegro-James et al., 1990; Nielsen et al., 1996; Scoles et al., 2008b; Fosgate et al., 2010; Aubry i Geale, 2011) mentre que la sensibilitat resulta més variable (Fosgate et al., 2010). En general, tret que els animals hagin estat tractats prèviament o que siguin menors de dues setmanes, les dues tècniques serològiques actualment recomanades per al diagnòstic d’anaplasmosi són l'ELISA de competició o el test d'aglutinació en targeta (OIE, 2012).

5.2.1. ELISA

Per a la detecció d’A. marginale, Thoen et al. (1980) va descriure el desenvolupament d’un ELISA a partir d'antígens procedents d’eritròcits infectats a una dilució 1:40. Els resultats obtinguts van resultar molt similars a la prova de fixació de complement.

Actualment però, es coneix que la sensibilitat de la fixació de complement per a A. marginale varia entre el 20-70% i no es considera una tècnica de diagnòstic fiable. La manca de sensibilitat també va ser descrita per Barry et al. (1986) quan a partir d’eritròcits infectats experimentalment va desenvolupar un ELISA on alguns dels animals infectats no reaccionaven a la tècnica, alhora que un 14% dels casos presentava reaccions creuades amb B. bovis.

Posteriorment, es van desenvolupar altres ELISAs indirectes que van mostrar uns valors de sensibilitat del 87,3% i especificitat entre 98,4-99,6% (Duzgun et al., 1988; Nielsen et al., 1996). Tanmateix, es considera que la majoria d’estudis realitzats fins aleshores podrien no ser fiables. Alguns autors i publicacions es qüestionen la fiabilitat dels resultats degut a biaixos en la selecció de mostres, no haver avaluat la viabilitat dels anticossos utilitzats a llarg termini o la possibilitat de falsos positius degut a isoantígens dels eritròcits, de B. bigemina o de B. bovis (Duzgun et al., 1988; OIE, 2012).

L’ELISA indirecte també s'ha utilitzat per a la detecció d'IgG a partir de mostres de llet. Torioni de Echaide et al. (2005) va obtenir uns resultats del 98% de sensibilitat i 95% d’especificitat utilitzant com a antigen MSP5 recombinant.

A partir d'un estudi de Morzaria et al. (1999), utilitzant un antigen recombinant de MSP5, es va desenvolupar un kit comercial d'ELISA indirecte per a la detecció d'anticossos anti-A. marginale (citat per Svanova; Kocan et al., 2010). Amb aquesta tècnica la sensibilitat i especificitat es consideren superiors al 90% (segons Svanova), mostrant una sensibilitat superior entre els 4-7 dies després de la infecció. No obstant, no hi ha publicades dades comparatives amb altres tècniques ni estudis de reaccions creuades.

Una de les tècniques més utilitzades actualment és la tècnica d'ELISA de competició (ELISAc). En aquesta tècnica, els anticossos de l'animal entren en competència amb anticossos monoclonals per unir-se específicament a l'antigen adsorbit. L'aparició de color és indicatiu que la mostra problema és negativa, ja que els anticossos monoclonals s'hauran unit a l'antigen adsorbit a les plaques i mitjançant un conjugat anti-IgG, es desenvolupa el color al afegir el substrat.

Els anticossos monoclonals utilitzats (ANAF16C1), són específics contra l'epítop d'una MSP5 recombinant que es troba adsorbit a la placa d'ELISA. La MSP5 es troba conservada entre Anaplasma spp. (Torioni de Eschaide et al., 1998). La tècnica és prou sensible i específica per a la detecció d’animals infectats per Anaplasma (Hofmann- Lehmann et al., 2004; Strik et al., 2007), però a més d'A. marginale, els anticossos poden reconèixer A. centrale i A. ovis (Visser et al., 1992). Els estudis amb A. phagocytophilum donen resultats contradictoris pel que fa a possibles reaccions creuades amb aquesta tècnica (Dreher et al., 2005a; Strik et al., 2007). Habitualment no hi ha casos descrits de reaccions creuades amb ehrlichies, però recentment, Al- Adhami et al. (2011) ha detectat l'aparició de falsos positius de l’Ehrlichia sp. BOV2010 descrita al Canadà.

La primera descripció d'un ELISAc desenvolupat per al diagnòstic d'A. marginale va ser per Knowles et al. (1996). En l’estudi de transmissió experimental, la tècnica va detectar tots els vedells com a positius amb un cut-off establert en el 25% d'inhibició.

La tècnica es troba comercialitzada sota el nom Anaplasma antibody test kit cELISA®; VMRD Inc. Poullman, WA, USA. Segons el fabricant té una sensibilitat del 95% i una especificitat del 98% amb el cut-off establert al 30% d'inhibició (calculant el percentantge d'inhibició com a 100-[densitat òptica de la mostra x 100/densitat òptica del control negatiu]).

Alguns autors proposen que la sensibilitat, l'especificitat i les corbes ROC (Receiver Operating Characteristic), que s'utilitzen per a representar-les, són específiques de cada infecció i en conseqüència el cut-off també hauria de variar (Aubry i Geale, 2011). Coetzee et al. (2007), en un estudi experimental utilitzant el cut-off recomanat pel fabricant, van descriure una sensibilitat menor al 50% durant els primers 9 dies post infecció utilitzant el kit d’ELISAc comercial. Encara que va augmentar fins al 100% a partir dels 13 dies, mantenint-se fins al final de l'estudi als 156 dies de la infecció. Reinbold et al. (2010b) van realitzar un estudi als Estats Units amb el mateix kit per a determinar el cut-off negatiu a partir de comparacions amb PCR a temps real. Segons els autors, s'hauria d'establir entre 15-20% d'inhibició per a obtenir uns resultats de sensibilitat i especificitat entre 73-74% i 81-91% respectivament. I en els estudis de

Coetzee et al. (2010), es suggeria que degut als cut-offs establerts al Canadà, els valors entre el 30 i el 42% d'inhibició podrien ser dubtosos. Segons el que coneixem, no hi ha estudis del percentatge d'inhibició òptim per a la zona sud d'Europa.

Tot i les possibles limitacions, l'ELISAc continua valorant-se com una de les opcions vàlides per a l'anàlisi de gran quantitat de mostres ja que és una de les tècniques disponibles que es troba estandarditzada (Torioni de Echaide et al., 1998; Kocan et al., 2010; OIE, 2012).

Saliki et al. (1998) i Kocan et al. (2001) van desenvolupar un altre ELISAc utilitzant els mateixos anticossos monoclonals cap a MSP5, però l’antigen havia estat obtingut a partir de d’A. marginale purificats cultivats in vitro. La tècnica va ser utilitzada per a avaluar la resposta serològica a l’exposició vacunal dels animals, obtenint el doble de sensibilitat que la tècnica de fixació de complement amb la que es comparava.

5.2.2. Tècnica d'aglutinació en targeta (CAT)

O Card agglutination test. Segons Molloy et al. (1999), es considera una tècnica prou sensible i específica (98% i 98,6%, respectivament). Presenta els avantatges de poder obtenir un resultat en 30 minuts tant en el laboratori com en condicions de camp. No obstant, poden desenvolupar-se reaccions no específiques i la interpretació dels resultats pot tenir problemes de subjectivitat (Aubry i Geale, 2011; OIE, 2012). Els antígens s’obtenen a partir d’eritròcits infectats procedents d’un vedell esplenectomitzat.

5.2.3. Cromatografia de flux lateral

Nielsen et al. (2008) va descriure el desenvolupament d'aquesta tècnica de diagnòstic ràpid per a A. marginale a partir d'anticossos monoclonals que detecten IgG1 bovines i un antigen recombinant de MSP5. En comparació amb l'ELISAc comercial presenta uns valors del 94% en sensibilitat i 98% d'especificitat. La tècnica va ser estandarditzada i

avaluada amb mostres de camp i els resultats van continuar sent bastant similars a l'ELISAc (Nielsen et al., 2009).

5.2.4. Immunofluorescència indirecta

Tot i mostrar uns resultats similars a l'ELISAc (Ekici i Sevinc, 2011), en general les tècniques IFI per al diagnòstic d'anaplasmosi no són gaire utilitzades i acostumen a servir com a proves de confirmació. No poder analitzar alhora un gran volum de mostres i que també poden mostrar fluorescències inespecífiques o bé derivades d'altres espècies d'Anaplasma spp. fa que altres tècniques siguin més freqüents (OIE, 2012).

5.2.5. Dot-ELISA

En l'estudi de Montenegro-James et al. (1990) es va descriure el desenvolupament d'un Dot-ELISA que mostra uns bons resultats i presenta els avantatges de ser més ràpid, barat i simple de dur a terme que ELISA indirecte. Els resultats van mostrar una sensibilitat del 93% i una especificitat del 96%, sense detectar reaccions creuades amb Babesia bovis ni Babesia bigemina.

5.2.6. Tècnica de fixació del complement

Durant les últimes dècades aquesta tècnica havia estat considerada d'elecció i com a procediment estàndard (Boulanger et al., 1966). Tot i així actualment no és una tècnica recomanada per a detectar animals infectats crònicament degut a la variabilitat en sensibilitat (20-60%), la variabilitat de tècniques per a l'obtenció de l'antigen i la poca reproductibilitat (Bradway et al., 2001). Coetzee et al. (2007) van descriure que la sensibilitat de la tècnica únicament arribava al 100% durant el pic de rickettsèmia al dia 20 post infecció, mentre que l'ELISAc obtenia els mateixos resultats a partir del dia 13. Els autors també van destacar el risc d'obtenir falsos negatius durant els dies posteriors al pic, ja que la sensibilitat variava entre el 7,5 i 35,5%.

5.3. Mètodes moleculars

Els mètodes moleculars permeten la confirmació de l’agent etiològic fins i tot quan la rickettsèmia és insuficient per als mètodes directes. A diferència de les tècniques serològiques, permeten diferenciar entre infeccions actives de possibles deteccions d'anticossos residuals de vacunacions o infeccions prèvies. A més a més, evita la confirmació de les proves serològiques per inoculació de sang en vedells esplenectomitzats. Tot i això, moltes tècniques encara no han estat validades (Gale et al., 1996; Aubry i Geale, 2011).

Diversos autors han utilitzat tècniques de PCR amb bons resultats, com Eriks et al. (1989), que van desenvolupar tècniques per a RNA que podia detectar rickettsèmies de fins a 0,000025%.

En l'estudi de Figueroa et al. (1993), es descriu una tècnica de PCR multiplex per al diagnòstic conjunt d'A. marginale i també d'altres hemoparàsits freqüents com Babesia bovis i Babesia bigemina.

Gale et al. (1996) van descriure una tècnica de PCR seguida d'un ELISA per a detectar els productes amplificats de la primera. Van mostrar una sensibilitat de fins a 0,00015% (l'equivalent a 24 eritròcits infectats per μl de sang).

Encara que les tècniques han anat millorant amb la nested-PCR (Torioni de Echaide et al., 1998) on els límits estimats es trobaven en 30 eritròcits infectats per mil·lilitre de sang (0,000001%), la PCR a temps real (qPCR) es considera com la més recomanable (Courtney et al., 2004; Carelli et al., 2007; Decaro et al., 2008). Segons els autors, les qPCR desenvolupades presenten els avantatges de poder analitzar i quantificar diferents patògens alhora amb una concordança del 100% amb la nested-PCR.

En general, les tècniques moleculars desenvolupades permeten detectar un gen específic com el msp4 o msp1α (de la Fuente et al., 2001b; Lew et al., 2002) o bé la seqüència de la regió 16S rRNA que es considera la més sensible per a A. marginale (de la Fuente et al., 2005b; Reinbold et al., 2010b). No es recomana la detecció del gen msp5 per la conservació entre les diferents espècies d'anaplasmes i els problemes d'especificitat que podria presentar (Aubry i Geale, 2011).

Bekker et al. (2002) va desenvolupar una reverse line blot (RLB) a partir dels gens amplificats per PCR de la subunitat 16S del RNA ribosomal. La tècnica va permetre detectar específicament alhora tant piroplasmes, anaplasmes i ehrlichies de mostres bovines i de paparres, sense mostrar reaccions creuades entre les diferents espècies paràsites.

6. Premunició, quimioprofilaxis i vacunes

6.1. Vacunes a partir d'A. marginale

6.1.1. Vacunes vives

Les vacunes vives són obtingudes a partir de vedells esplenectomitzats que són infectats experimentalment amb soques seleccionades d'A. marginale. Posteriorment, s'inocula sang d'aquests vedells en altres bovins susceptibles seguit d'un tractament a dosis baixes de tetraciclines durant l'inici de la fase aguda. Els animals no desenvolupen la fase aguda de la malaltia però estableixen una infecció persistent que els immunitza (Wright, 1990). Tot i així, els bovins recentment vacunats requereixen un monitoratge constant per tal d'administrar l’antibiòtic a temps i evitar el risc tant de patir una infecció aguda com de reaccions adverses a la inoculació. A més a més, la immunitat podria no ser totalment efectiva si els bovins s'exposen a soques genèticament diferents, de manera que actualment és un tipus de vacuna no recomanada (Kocan et al., 2010).

6.1.2. Vacunes atenuades

L'atenuació d'A. marginale ha estat descrita mitjançant dues vies. Una ha estat mitjançant successius passis de l'organisme per hostes atípics com ovelles, cabres o cérvols (Welter i Ristic, 1972; Kuttler i Zaugg, 1988). D’altra banda, també a través de radiacions per raigs X, raigs gamma o Co60 (Welter i Ristic, 1972; Sharma i Bansal, 1986).

Encara que alguns estudis mostren que la vacuna ofereix bons resultats de protecció (Osorno et al., 1975; Kessler et al., 1998), algunes soques d’A. marginale no es van poder adaptar a ovins en alguns estudis (Rogers i Shiels, 1979) o bé la vacuna no va resultar immunitzant (Henry et al., 1983; Benavides et al., 2000), de manera que els resultats obtinguts amb aquestes vacunes són molt variables.

6.1.3. Vacunes inactivades

La vacunació a partir d'antígens extrets de l'anaplasmes intraeritrocitaris disminueixen el risc de transmetre altres patògens i no cal conservar-les en fred. No obstant, la immunització no sembla ser tan efectiva com les vacunes vives, necessiten de revacunacions anuals i la protecció creuada entre aïllats geogràfics està qüestionada (Kuttler et al., 1984; Rodríguez et al., 2000). També poden causar reaccions autoimmunes contra els propis eritròcits en vedells nascuts de femelles vacunades si l’antigen utilitzat no està purificat (Carson et al., 1976).

L'ús d'antígens d'anaplasmes cultivats in vitro en cèl·lules de paparra (IDE8) obre noves vies en el desenvolupament de vacunes inactivades (Blouin et al., 1998). De la Fuente et al. (2002b) van descriure que els bovins vacunats no desenvolupaven malaltia clínica encara que no es prevenia la infecció. L'estudi també va mostrar que aquests tipus de vacunes desenvolupa una resposta dirigida cap a MSP1b, diferent a les vacunes que utilitzen antígens d'anaplasmes intraeritrocitaris on la resposta és cap a MSP1a. Estudis més recents suggereixen l'ús d'altres proteïnes d'A. marginale com la HSP70 i SODB, així com les proteïnes de superfície MSP4 i MSP5, ja que semblen estar altament conservades entre soques distants i podrien ser uns bons immunògens (Palacios et al., 2014; Lis et al., 2015).

6.1.4. Vacunes recombinants

Els estudis amb vacunes on s'utilitzaven antígens recombinants, especialment de MSP1a, no semblaven desenvolupar uns resultats diferents en quant a les vacunes inactivades. Diversos autors consideren que només es desenvolupava una immunitat parcial i que es necessitaria avaluar la combinació de diversos antígens per a una resposta immune més efectiva (McGuire et al., 1994; Palmer i McElwain, 1995; Arulkanthan et al., 1999).

En els últims anys però, s'han estudiat l'ús d'altres proteïnes recombinants com a estimuladors de la immunitat. Les proteïnes VirB9 i VirB10 que formen part del T4SS o el factor d'elongació del RNA, EF-Tu, han demostrat ser immunògenes (López et al.,

2005). Detectant-se títols d'IgG2 de fins a 1.250 amb el EF-Tu quan s'utilitza com antigen vacunal (Araújo et al., 2008).

6.2. Vacunes vives d’A. centrale

Theiler (1911), va observar que la infecció amb A. centrale, disminuïa la gravetat de la clínica causada per A. marginale, encara que no en prevenia la infecció (citat per Shkap et al., 2002a).

Els estudis de Adams et al. (1989) i Shkap et al. (1991) van permetre confirmar que una espècie conferia protecció creuada sobre l’altra ja que els antígens immunodominants eren compartits.

Més endavant, es va demostrar que tot i que l’A. centrale utilitzat en la vacuna també realitzava variació antigènica de la MSP-2 de manera similar a A. marginale, els epítops que reconeixien els limfòcits TCD4+ eren els mateixos en ambdues espècies (Shkap et al., 2002a i 2002b).

La vacuna amb A. centrale continua sent un dels mètodes per immunitzar als bovins en les zones endèmiques com Austràlia, Àfrica, Israel i Amèrica del Sud (Kocan et al., 2003; Suárez i Noh, 2011). Encara que també s’han descrit casos on la immunització no ha estat eficaç (Wilson et al., 1980; Brizuela et al., 1998; Gohil et al., 2013). Shkap et al.

(2002a) van descriure que vacunar amb A. centrale estableix una infecció persistent als bovins, i per tant una immunitat, durant quatre anys. Tanmateix, altres autors suggereixen que aquesta immunitat podria ser de per vida (Kocan et al., 2003).

En general, la vacunació conjunta de Babesia bigemina, Babesia bovis amb A. centrale, no interfereix en la immunització i ofereix bons resultats (Dalgliesh et al., 1990; Kocan et al., 2003). Una de les vacunes disponibles a Austràlia conté 2,5x106 organismes de B. bigemina, 107 de B. bovis i 107 d’A. centrale per cada 2 ml. Presenta l'inconvenient de ser refrigerada i només té una vida útil de 4 dies (Standfast et al., 2003; Bock et al., 2004).

6.3. Vacunes dirigides contra els vectors

Una de les primeres va ser la que utilitzava l'antigen Bm86 que reduïa el nombre i la capacitat reproductiva de Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Va ser desenvolupada per a evitar malalties com la babesiosi que es transmet principalment per aquest vector, encara que també va mostrar tenir certa activitat sobre R. (Boophilus) annulatus (Canales et al., 2009 i 2010).

Els estudis d'Almazán et al. (2005a i 2005b) descriuen la molècula recombinant 4D8 d'Ixodes scapularis, que utilitzada com a antigen vacunal en bovins redueix la infestació de paparres, tant d'estadis immadurs com adults. Posteriorment, de la Fuente et al. (2006b) descriu l'ús d'aquesta molècula (anomenada com a subolesina) com antigen vacunal per a la protecció contra I. scapularis, Amblyomma americanum, Rhipicephalus sanguineus i Dermacentor variabilis. Els resultats van mostrar una degeneració de l'aparell digestiu i una reducció de més del 90% en l'ovoposició de les espècies de paparres analitzades (de la Fuente et al., 2006b i 2008b).

Més recentment, s'han publicat nombrosos estudis sobre la funció i la interacció de diferents molècules amb el cicle d'Anaplasma a les paparres, per tal de detectar altres proteïnes diana per al desenvolupament de noves vacunes. Algunes de les molècules més estudiades són les que es troben relacionades amb la infecció a les glàndules

salivals i el sistema immune del vector (Sukumaran et al., 2006; de la Fuente et al., 2007; Kocan et al., 2009; Sultana et al., 2010; Liu et al., 2011 i 2012).

6.4. Productes anaplasmicides emprats en la quimioprofilaxi

Els tractaments farmacològics contra l'anaplasmosi són efectius en la reducció de la rickettsèmia però difícilment permeten arribar a una esterilització total de l'animal. Això permet establir una infecció persistent i l'establiment de la immunitat. En els animals portadors on s'aconsegueix l'esterilització, semblen esdevenir susceptibles a una possible reinfecció amb la mateixa soca (Reinbold et al., 2010c).

Els fàrmacs més utilitzats tant per al tractament com per la quimioprofilaxi de l'anaplasmosi bovina són el dipropionat d'imidocarb i diferents tipus de tetraciclines.

L'imidocarb ha estat un dels fàrmacs d'elecció en el tractament de l'anaplasmosi bovina (McHardy i Simpson, 1974). Es suggereix que el seu mecanisme d’acció té a veure o bé la interferència en la producció/utilització de poliamines o bé en prevenir l'entrada d'inositol dins l'eritròcit infectat (EMEA, 2001). Es recomana una dosis de 3 mg/kg en administració única intramuscular (I.M.) o subcutània (S.C.). Però degut a la seva acció prolongada per la retenció en els teixits, la seva utilització en animals de consum està contraindicada a Europa i els Estats Units (Kahn, 2007). També s'ha descrit que l'administració de 5 mg/kg I.M. o S.C amb una segona dosi en 1 o 2 setmanes podia eliminar totalment la infecció, encara que segons la soca d'A. marginale podria haver-hi una diferència de susceptibilitat al fàrmac (Coetzee et al., 2006a).

En general, les tetraticlines tenen un efecte bacteriostàtic associat amb la inhibició de la síntesi de proteïnes (Coetzee et al., 2009). Diverses tetraciclines, oxitetraciclines i clortetraciclines han estat utilitzades per al tractament d'anaplasmosis. Es considera que el seu ús en estats inicials de la fase aguda (en un 15% d'hematòcrit) permeten la recuperació dels animals (Sevilla et al., 2002).

Les clortetraciclines administrades per via oral en dosis entre 4,4 o 11 mg/kg són suficientment efectives com per eliminar l'estat de portador (Coetzee et al., 2007; Reinbold et al., 2010c).

El Codi Sanitari per als animals terrestres de la OIE (2014) recomana l'ús d'oxitetraciclines parenterals durant 5 dies a una dosi de 22 mg/kg per a eliminar la infecció. No obstant, alguns estudis descriuen que el seu ús no esterilitza i l'efectivitat resulta variable. En l'estudi de Coetzee et al. (2005) on es va comparar diferents dosis, els animals encara no havien eliminat totalment la infecció després de dos mesos. Altres estudis amb les dosis recomanades, també van demostrar que el tractament no era totalment eficaç (Coetzee et al., 2006a; Reinbold et al., 2010c).

Altres tractaments a base d’enrofloxacina podrien tenir un efecte bacteriostàtic (Coetzee et al., 2006a). Es tracta d'una fluoroquinolona que inhibeix la DNA girasa de l'anaplasma que segons els estudis de Coetzee et al. (2006b), presenta bons resultats antibiòtics in vitro.

IV. REVISIÓ DE LA BABESIOSI BOVINA

1. Presentació general

1.1. Introducció

Diverses espècies de Babesia estan implicades en l’etiologia de la babesiosi bovina però Babesia bigemina i Babesia bovis són les més distribuïdes per la Península Ibèrica. Totes les babèsies es transmeten per paparres, principalment del gènere Rhipicephalus, causant uns quadres clínics de febre, anèmia, hemoglobinúria i icterícia en els bovins. El canvi climàtic, amb el conseqüent increment de les temperatures, ha comportat una variació de les dinàmiques poblacionals de diferents artròpodes, el que pot afectar de retruc, a la distribució i disseminació de les malalties de transmissió vectorial.

El cicle biològic de Babesia fa que la malaltia estigui íntimament relacionada amb el vector. S’estableix un equilibri entre l'hoste, el vector i el patogen que fa que a les zones endèmiques, els vedells que s’infecten resten portadors i immunitzats de per vida, de manera que rarament es descriuen processos aguts. Així doncs, la babesiosi sol manifestar-se com un procés debilitant, a causa de l'anèmia, que sovint passa desapercebut. Ara bé, quan aquell equilibri resulta alterat, és aleshores quan la babesiosi es manifesta clínicament. En el cas de les babesiosis bovines, podria relacionar-se amb l'aparició de futurs quadres clínics si no s'estableixen les mesures de vigilància i control adequades.

A Catalunya, hi ha una manca d'informació sobre la situació o l'evolució de les babesiosis bovines. De manera que no ens permet fer una estimació fiable del risc d'infecció que tenen els bovins. L'avaluació epidemiològica, esdevé en aquests casos un dels punts clau per al coneixement de la situació de la malaltia.

1.2. Història

Babés (1888) va descriure per primer cop uns organismes intraeritrocitaris en bovins, als que va anomenar Haematococcus bovis, relacionant-los amb els quadres de febre i hemoglobinúria que presentaven els animals.

Poc després, Smith i Kilborne (1893) van identificar l'agent etiològic de la febre de Texas dels bovins dels Estats Units anomenant-lo Pyrosoma bigeminum. Alhora, van descriure per primer cop que era possible la transmissió de patògens a través de vectors artròpodes. En aquest cas, per la paparra Rhipicephalus (Boophilus) annulatus.

Starcovici (1893) rebateja els organismes descrits. L’Haematococcus bovis identificat per Babés s’anomena Babesia bovis, i Pyrosoma bigeminum com a Babesia bigemina.

Des d'aleshores, les babesiosis es van anar describint arreu del món. Les noves descripcions comportaven diferents criteris de nomenclatura del gènere. Fins que finalment, Wenyon (1926) va descartar altres nomenclatures rebudes com Piroplasma, Nicollia, Nuttalia, Smithia, Rossiella, Babesiella o Microbabesia a favor d’un únic gènere Babesia, ja que les nomenclatures es basaven en criteris morfològics de diferents espècies però dins un mateix gènere.

La classificació taxonòmica de Babesia també va mostrar certa controvèrsia al llarg dels anys. Tant els estudis de Koch com els de Dennis a principis del segle XX demostraven una fase sexual a nivell intestinal en la paparra vectora que els va a portar a incloure les babèsies dins la classe Sporozoa.

Els estudis de Cheisin i Polyansky (1963) no van descriure la fase sexual en la paparra, i obviant la classificació anterior, van incloure Babesia dins l'ordre Piroplasmida, a la classe Sarcodina.

El 1964, un estudi de Rick va tornar a descriure unes fases de B. bigemina i B. bovis, similars a fases sexuals anteriorment descrites, en R. (Boophilus) microplus. No obstant, el Comitè de Taxonomia i Problemes Taxonòmics de la Societat de Protozoòlegs va classificar els piroplasmes com a amebes en el subphylum Sarcomastigophora.

Els estudis de Friedhoff entre els anys 1969-1972 va demostrar però, que tant Babesia com Theileria presentaven un complex apical.

D'aquesta manera, finalment Levine (1973) va acabar reclassificant els organismes dins el phylum Apicomplexa, classe Piroplasma, ordre Piroplasmida.

Les babesiosis descrites arreu del món, a més de la importància per a la ramaderia, també han mostrat el seu potencial zoonòtic en algunes espècies.

*Estudis citats per Mahoney (1977), Young i Morzaria (1986), Uilenberg (2006) i Schnittger et al. (2012).

1.3. Importància econòmica i sanitària

La importància econòmica de la babesiosi bovina deriva del gran nombre d'animals que es troben exposats a la infecció arreu del món, fet que representa pèrdues econòmiques directes i indirectes, a més de risc de zoonosis i limitacions en el comerç internacional.

Els costos econòmics dels animals malalts es deuen a les pèrdues en les produccions, avortaments, decomisos de vísceres a nivell d’escorxador i baixes a l'explotació per mort dels animals. També la prevenció de la malaltia juga un paper econòmic important en alguns països, degut a l'administració de fàrmacs terapèutics, tractaments acaricides o vacunes.

Cal considerar que la babesiosi també és important en Salut Pública, especialment a zones endèmiques en aquelles persones esplenectomitzades o immunodeprimides. Vàries espècies de Babesia s'han descrit amb potencial zoonòtic com ara B. microti, B. venatorum (Babesia sp. EU1), B. divergens i B. duncani (Schnittger et al., 2012) i també altres espècies recentment caracteritzades per tècniques moleculars, com ara la Babesia sp. CA1, CA3 i CA4 (Califòrnia), Babesia sp. KO1 (Corea), Babesia sp. MO1 (Missuri) i la Babesia sp. WA1 (Washington)(Herwaldt et al., 2003; Kim et al., 2007b; Schnittger et al., 2012; Zanet et al., 2014).

En relació al comerç internacional de bovins, l'Oficina Internacional d'Epizoòties (OIE) inclou la babesiosi bovina dins de les malalties transmissibles dels bovins del Codi Sanitari per als animals terrestres (2014).

1.4. Els paràsits

1.4.1. Classificació taxonòmica

Es troben classificades taxonòmicament dins el subregne Protozoa, phylum Apicomplexa, classe Aconoidasida, ordre Piroplasmida, família Babesiidae.

Actualment hi ha descrites més de 100 espècies diferents de Babesia (Schnittger et al., 2012), afectant un gran rang de mamífers domèstics i salvatges, aus i humans.

Les anàlisis filogenètiques del gen 18S rRNA han servit per intentar agrupar taxonòmicament les babèsies dins els Piroplasmida. Tot i així, la classificació dels piroplasmes es troba contínuament en revisió.

Criado-Fornelio et al. (2003) va proposar una classificació basada en cinc grups de piroplasmes. Schnittger et al. (2012), en va descriure sis línies monofilètiques principals diferenciades, però relacionades amb l'estudi anterior de Criado-Fornelio et al. (2003). En l'estudi del 2012, l'autor va classificar les babèsies bovines en el clade VI que correspon a Babesia sensu stricto, un grup on també es troben les babèsies dels cànids.

Les espècies identificades fins a la actualitat i que tenen interès veterinari es mostren a la taula 1.

Taula 1. Principals espècies de Babesia d’interès veterinari identificades. Classificades segons els hostes descrits i els vectors identificats.

Espècie Hoste Vector B. bigemina Boví, búfal, remugants silvestres Rhipicephalus spp. B. bovis Boví, búfal Rhipicephalus spp., Ixodes spp. B. divergens Boví, remugants silvestres, humans Ixodes ricinus B. major Boví, bisó Haemaphysalis punctata B. occultans Boví Hyalomma spp. B. ovata Boví Haemaphysalis longicornis B. orientalis Búfal Rhipicephalus spp. B. caballi Èquids Dermacentor spp., Hyalomma spp., Rhipicephalus spp. B. crassa Oví - B. motasi Oví, cabrum Haemaphysalis punctata, Rhipicephalus bursa B. ovis Oví, cabrum, cabra pirinenca, Rhipicephalus bursa mufló B. canis Gos Dermacentor reticulatus B. vogeli Gos Rhipicephalus sanguineus B. gibsoni Gos Haemaphysalis, Rhipicephalus sanguineus B. rossi Gos Hyalomma leachi B. perroncitoi Porc Rhipicephalus spp., Dermacentor spp. B. trautmanni Porc Rhipicephalus spp., Dermacentor spp. B. felis Fèlids - B. capreoli Cabirol, cérvol, isard Ixodes ricinus B. odocoilei Cèrvids, bou mesquer Ixodes scapularis B.venatorum Cabirol, humans Ixodes ricinus B. microti Rosegadors, humans Ixodes scapularis Fonts: Uilenberg (1995), Bock et al. (2004), Schoelkopf et al. (2005), Uilenberg (2006), Hoby et al. (2009), Malandrin et al. (2010), Zanet et al. (2014).

1.4.2. Morfologia

Babesia és un protozou de característiques pleomòrfiques. Generalment, dins els eritròcits de l'hoste vertebrat s'observen els merozoïts de Babesia com organismes arrodonits u ovalats sovint adoptant una forma piriforme, disposant-se en parelles o en múltiples de dos. La mesura d'aquestes formes piriformes varia segons l’espècie de Babesia. Les espècies de Babesia clàssicament s'han dividit en dos grups segons les seves dimensions intracel·lular, les babèsies grans (amb una mesura de 2,5 a 5 m) i les babèsies petites (d'una mida inferior a 2,5 m).

A nivell ultraestructural, el cos piriforme està rodejat d’una pel·lícula composta per tres capes: una membrana fina exterior, una interna més gruixuda i una capa de microtúbuls. La membrana interna acaba a la part més ample del paràsit on es troba el complex apical propi dels apicomplexes. A l’interior de Babesia també poden observar- se els orgànuls típics d'aquest phylum, les ròptries que són cossos llargs, i els micronemes, més nombrosos i petits.

1.4.3. Les babèsies bovines

1.4.3.1. Babesia bigemina

És una de les babèsies morfològicament més grans, mesurant fins a 5x2 m (Mehlhorn, 2008).

Els hostes principals de B. bigemina són els bovins. Tot i això, també ha estat descrita en altres remugants com ara búfals (Syncerus caffer), bisó americà (Bison bison), iak (Bos grunniens), cèrvids (Odocoileus virginianus, Mazama americana), gaseles (Gazella soemmerringii) i antílops mexicans (Boselaphus tragocamelus) (Penzhorn, 2006; Holman et al., 2011; da Silveira et al., 2011; Cárdenas-Canales et al., 2011; Saravanan et al., 2013). Recentment s'ha detectat B. bigemina en senglar per tècniques moleculars a Itàlia (Zanet et al., 2014).

Les paparres del gènere Rhipicephalus actuen com a vectors de B. bigemina. Les espècies implicades en la transmissió són Rhipicephalus (Boophilus) microplus, R. (Boophilus) annulatus, R. (Boophilus) decoloratus, R. evertsi i R. bursa. També es considera que Haemaphysalis punctata podria actuar com a vector.

Es troba àmpliament distribuïda per tots els continents, a les zones tropicals, subtropicals i algunes temperades.

A nivell europeu, B. bigemina s'ha descrit a Portugal (Caeiro, 1999), Itàlia (Cringoli et al., 2002; Georges et al., 2001), Grècia (Papadopoulos et al., 1996), Suïssa (Hilpertshauser et al., 2007).

A Espanya la majoria de descripcions les trobem a la zona centre i sud (Andalusia, Extremadura, Toledo i Salamanca) (Gubbels et al., 1999; Navarrete et al., 2002), al País Basc (García-Sanmartín et al., 2006) i a Menorca (Almería et al., 2001).

Al nostre país, B. bigemina junt amb B. bovis solen considerar-se com les espècies més importants en quan a patogènia i distribució.

La present revisió bibliogràfica de les babèsies bovines se centrarà en aquesta espècie, sempre que hi hagi dades específiques disponibles, ja que la seva detecció serà l'objectiu de l'estudi epidemiològic.

1.4.3.2. Babesia bovis

B. bovis és morfològicament més petita que B. bigemina, d'aproximadament 2,5 x 1,5 m (Mehlhorn, 2008).

Els hostes de B. bovis inclouen, a més dels bovins, els búfals, bisó americà (Penzhorn, 2006), diferents espècies de cèrvids (Capreolus capreolus, Cervus elaphus i Odocoileus virginanus) (Ramos et al., 2010; Holman et al., 2011; da Silveria et al., 2011) i també cavalls (Criado et al., 2006).

Algunes de les principals espècies de paparres vectores són comunes amb B. bigemina, aquestes són R. (Boophilus) microplus i R. (Boophilus) annulatus.

Es considera que la seva distribució a nivell europeu resulta molt similar a la de B. bigemina. A Itàlia va descriure's un brot de babesiosi causat per B. bovis d'animals procedents de França (citat per Cringoli et al., 2002).

A Espanya està descrita a Andalusia, Astúries, Castella i Lleó, Extremadura, Galícia, Madrid (Navarrete et al., 2002; García-Sanmartín et al., 2006) i Menorca (Almería et al., 2001).

Les infeccions típiques per B. bovis solen cursar amb uns nivells baixos de parasitèmia ja que els eritròcits infectats solen quedar retinguts a l'endoteli capil·lar (Mahoney, 1977).

Degut a això, a diferència de B. bigemina, poden aparèixer quadres greus de simptomatologia nerviosa.

1.4.3.3. Babesia divergens

És la Babesia més petita que afecta els bovins, mesurant uns 1,5 x 0,5 m. És característic d'aquesta espècie que els merozoïts intraeritrocitaris es disposin formant un angle obtús, "divergent".

Tot i que es considera una espècie zoonòtica, el seu poder patogen a veterinària és menor que les dues espècies anteriorment comentades. Principalment afecta a bovins encara que també ha estat descrita en cèrvids, especialment en zones comunes (Langton et al., 2003; Duh et al., 2005; García-Sanmartín et al., 2007; Zintl et al., 2011). D’altra banda, també s’ha descrit en conills americans (Sylvilagus), considerant a Ixodes dentatus com el vector (Goethert i Telford, 2003).

La distribució de B. divergens es troba limitada a les zones on hi ha presència del seu vector Ixodes ricinus. Principalment a Europa (L'Hostis, 1995; Blaschitz et al., 2008; Hornok et al., 2014; Zintl et al., 2014), encara que també s’ha descrit al nord d'Àfrica (Bouattour i Darghouth, 1996). Tanmateix, la distribució a Europa ha variat en funció de les zones durant els últims anys. Així, països com Hongria o Irlanda han detectat una menor incidència (Hornok et al., 2014; Zintl et al., 2014) mentre que altres zones com Noruega ha comunicat un increment en la incidència (Hasle et al., 2010). Els autors suggereixen que aquests canvis podrien estar relacionats amb el canvi climàtic, ja que l’augment de temperatures limitaria la distribució de la paparra vectora a zones cada cop més al nord.

A Espanya, es troba principalment a la meitat nord (País Basc, Cantàbria, Castella i Lleó i Madrid) (García-Sanmartín et al., 2006) encara que també s'ha descrit a Menorca (Ros-García et al., 2012b).

Es considera que B. divergens és menys patògena que B. bovis o B. bigemina, encara que el nivell de parasitèmia sol ser similar a la d'aquesta última.

1.4.3.4. Babesia major

Juntament amb B. bigemina, B. major és l'altre de les babèsies "grans" que pot afectar als bovins a Europa. Mesura uns 3 x 1,5 m i adopta una disposició d'angle agut (Urquhart et al., 1996).

El seu vector principal és Haemaphysalis punctata. Encara que també s'ha detectat en I. ricinus recollides sobre remugants silvestres, es desconeix el paper d'aquesta paparra en la transmissió biològica del patogen (Hilpertshauser et al., 2006).

La seva distribució està limitada al sud d'Anglaterra i a França (Brocklesby et al., 1973; L'Hostis et al., 1995; Criado-Fornelio et al., 2009); recentment també s’ha descrit a Hongria (Hornok et al., 2014).

A Espanya s’ha detectat al País Basc, Menorca, Andalusia, Badajoz i Salamanca (Navarrete et al., 2002; García-Sanmartín et al., 2006; Ros-García et al., 2012b).

En quant a patogènia, B. major es considera l’espècie menys patògena de totes les anteriors.

1.4.3.5. Altres babèsies bovines

En els bovins, també s'han descrit altres babèsies considerades poc patògenes. És el cas de B. occultans, considerada fins a l’actualitat una espècie apatògena descrita a l'Àfrica (Ros-García et al., 2011) i a Menorca (Ros-García et al., 2012b). És important destacar que recentment ha estat involucrada en un quadre clínic a Itàlia (Decaro et al., 2013).

Al continent asiàtic s'han detectat altres babèsies, com ara Babesia ovata en bovins del Japó. Babesia orientalis, que sembla estar més distribuïda pel continent asiàtic però que es considera apatògena pels bovins, només afectant als búfals. I per últim la Babesia sp. kashi descrita a la Xina (Luo et al., 2005).

1.5. Els vectors

Babesia spp. es transmet de manera biològica per la picada de paparres infectades, principalment ixòdides.

El coneixement de les espècies d'ixòdids presents en una zona ens indica quins patògens poden afectar els animals i així establir les mesures estratègiques adients per al seu control. De les espècies de Rhipicephalus considerades com a vectores de B. bigemina, només Rhipicephalus bursa ha estat descrita a Catalunya (Estrada-Peña et al., 1995; Estrada-Peña, 2000).

R. bursa és una paparra freqüent i que es troba distribuïda en tots els tipus d'hàbitats mediterranis (Papadopoulus et al., 1996; Sahibi et al., 1998; Castellà et al., 2001). Es tracta d'una paparra de dos hostes, o cicle dixè, que es desenvolupa en espais oberts (exòfila). És comú detectar tant les formes immadures com els adults alimentant-se en la mateixa espècie d'hoste (monotropa), generalment ungulats, tant domèstics com silvestres. Les zones geogràfiques que més afavoreixen R. bursa són àrees amb vegetació principalment de gramínies, de no gaire altitud. Es poden trobar en zones muntanyoses sense gran abundància d'arbres (Manilla, 1998). A la zona mediterrània, les larves de R. bursa són actives a la tardor i les nimfes un cop alimentades poden entrar en diapausa. Els adults són actius durant els períodes de temperatures càlides suaus, de primavera fins a meitat d'estiu (Manilla, 1998).

Tot i no considerar-se el vector principal, Haemaphysalis punctata també ha estat descrita a Catalunya (Estrada-Peña et al., 1995; Estrada-Peña, 2000). És una paparra exòfila i el seu cicle es desenvolupa en tres hostes, podent afectar un ampli rang de mamífers domèstics i silvestres. Les formes immadures també es poden trobar en aus des de l’estiu fins a la tardor. El seu cicle biològic és variable, entre 18 i 24 mesos, segons les condicions ambientals. Principalment es troba a zones amb vegetació d'arbusts, pastures de gramínies o matolls. Està adaptada a condicions relativament seques però no en zones boscoses denses (Manilla, 1998).

1.6. Cicle biològic

Babesia spp. té un cicle heteroxè en el que s'alternen la reproducció asexual i sexual al llarg de diferents fases.

Els hostes vertebrats s'infecten amb els esporozoïts de Babesia spp. quan la paparra els inocula junt amb la saliva. Mitjançant el complex apical, els esporozoïts infecten els eritròcits.

Un cop dins els eritròcits, es transformen en el trofozoït, que mitjançant un procés de fissió binària, es dividirà en dos merozoïts. Aquesta és la fase de multiplicació asexual o merogònia.

Segons Mackenstedt et al. (1995), s’identifiquen dos tipus de merozoïts a la sang dels bovins infectats amb B. bigemina. Uns merozoïts petits (2,7 x 1,2 m) que es multipliquen per fissió binària intraeritrocitàriament. Primerament, aquests merozoïts adopten una forma anellada uninuclear, que dividirà el nucli formant dos fases nuclears anellades constituint l'altre merozoït. Aquest segon merozoït és més ovalat, d'una grandària superior (4,5 x 1,7 m) i sembla ser diploide; podria tractar-se del precursor dels gamonts. Tot i així, no desenvolupen cap més fase fins que no són ingerits per la paparra. Ara bé, es pot produir la lisi dels eritròcits i els merozoïts resultants poden infectar d'altres eritròcits.

Babesia spp. utilitza antígens variables de la superfície dels merozoïts (VMSA), unes molècules de superfície per unir-se als eritròcits. Alguns d'aquests antígens de superfície com MSA-1, MSA-2 i la RAP-1 (proteïna associada a les ròptries-1) semblen tenir un paper en aquest contacte inicial paràsit-cèl·lula hoste. En el cas de B. bovis, aquests tres antígens semblen estar presents tant en els esporozoïts com en els merozoïts (Mosqueda et al., 2002a i 2002b).

En picar, la paparra vectora ingereix els eritròcits infectats amb merozoïts. La majoria de paràsits degeneren i moren dins la paparra, però uns quants sobreviuen (pregamonts) i continuen el seu desenvolupament fins a cossos radiats o gamonts (Chauvin et al., 2009). Aquesta és la fase de multiplicació sexual o gamogònia. Els cossos radiats són estructures de localització intestinal que foren descrites per Koch

(1906) i que les va anomenar strahlenkörper (citat per Weber i Friedhoff, 1977). Els cossos radiats de B. bigemina es troben en les primeres 20 hores de la ingesta i mesuren de 4-7 µm (Young i Morzaria, 1986). Aquests cossos radiats contenen unes prolongacions de fins a 8 µm, que són estructures citoplasmàtiques llargues i sostingudes per una agrupació de microtúbuls. Es poden arribar a observar de dos a més de deu d'aquestes prolongacions per a cada cos radiat (Weber i Friedhoff, 1977).

La fusió dels gamonts a la llum intestinal dóna lloc a la formació d'un zigot esfèric de 8- 10 m de longitud. El zigot s'invagina dins les cèl·lules de l'aparell digestiu de la paparra, sense arribar a formar un vacúol parasitòfor. Un cop dins, el zigot es transforma en una fase mòbil, l'ooquinet. Segons Chauvin et al. (2009), sembla ser que en aquest moment es podria desenvolupar una meiosi, ja que l'ooquinet és haploide (Mosqueda et al., 2004), i s'inicia la fase d'esporogònia. L'ooquinet s'allibera de les cèl·lules intestinals en forma de esporoquinet, també mòbil i de 14,3-16,9 m de llarg segons de l'espècie. Es distribueix a través de l'hemolimfa per altres teixits de la paparra com ara les cèl·lules dels túbuls de Malpighi, fibres musculars o cèl·lules ovàriques. La infecció dels oòcits permet la transmissió transovàrica que es manté al llarg de tota la vida de la paparra degut a successives fases d'esquizogònies.

Alguns esporoquinets arriben a les glàndules salivals de la paparra, abans o després de que la paparra es fixi per alimentar-se, on es formaran els esporozoïts. Els esporozoïts es formen en esporonts polimòrfics de 60-300 m de diàmetre. Cap als 7 dies després de fixar-se, les cèl·lules infectades de la paparra poden contenir milers d'esporozoïts piriformes ja infectius de B. bigemina (Mosqueda et al., 2004; Chauvin et al., 2009). La diferenciació dels esporozoïts s'inicia un cop la paparra parasita a l'hoste vertebrat degut diversos factors com la hipertròfia de les glàndules salivals o l'activitat metabòlica augmentada (Chauvin et al., 2009) o l'increment de temperatura (Dalgliesh et al., 1977, citat per Chauvin et al., 2009).

El període de prepatència des de que la paparra es fixa fins que infecta l'hoste és generalment d'entre 12-18 dies per a B. bigemina. Encara que si les paparres mascles transmeten el paràsit entre bovins propers, es pot escurçar de 6-12 dies (Bock et al., 2004).

La transmissió transplacentària ha estat descrita en bovins tant per B. bigemina com B. bovis (Neitz, 1956, citat per Yeruham et al., 2003), tot i que es considera rara i accidental i probablement sigui secundària a lesions placentàries prèvies (Yeruham et al., 2003).

2. Epidemiologia i transmissió

2.1. Estabilitat vs inestabilitat enzoòtica

Un factor clau en l'epidemiologia de la babesiosi és la relació dels vectors amb els seus hostes. Aquesta relació depèn de la biologia i les dinàmiques poblacionals de les paparres, ja que l'activitat del vector sobre l'hoste determina la presència d'infeccions o reinfeccions. Les variacions en el nombre de paparres infectades (taxa d'infecció en la paparra) i el nombre de paparres sobre l'hoste són factors que fan alterar la possibilitat d'infecció o reinfecció en un animal. Això és el que es coneix com a taxa d'inoculació, que es defineix com la probabilitat diària de que qualsevol animal d’una població s'infecti.

La taxa d'inoculació (h) es pot calcular mitjançant la fórmula h = m · a · b (Mahoney, 1977). On 'm' és el nombre de paparres que piquen un animal diàriament, 'a' la proporció de paparres infectades i ‘b’ la proporció de picades que infecten l’hoste eficaçment. En el cas de B. bovis i B. bigemina per als individus Bos taurus, ‘b’ es considera 1.

Aquest procediment però, involucra el recompte de paparres sobre l’hoste i determinar la seva taxa d’infecció. La taxa d'inoculació també es pot obtenir isolant-la de la fórmula I = 1 - e-ht (Mahoney, 1977). Aquesta fórmula representa la proporció d’animals joves infectats en qualsevol moment després del naixement. En aquesta fórmula 'I' és la proporció d'animals infectats, que es pot obtenir per proves diagnòstiques. 'h' equival a la taxa d'inoculació i 't' és l'edat mitjana dels animals.

La taxa d’inoculació té un valor predictiu ja que pot determinar el risc de babesiosi abans que la malaltia es desenvolupi. Segons la taxa d’inoculació poden esdevenir tres situacions:

- Si és suficientment elevada, es produeix l'estabilitat enzoòtica (àrea  de la figura 2). L'estabilitat enzoòtica es dóna quan tota la població (o més del 75%) està immunitzada degut a l'exposició natural a l'agent patogen abans que desaparegui la protecció innata. En aquest estat d'equilibri entre l'hoste, l'agent etiològic i el vector, no es donen casos clínics de la malaltia (o rarament) encara que la infecció es trobi disseminada per la població (L'Hostis i Seegers, 2002; Bock et al., 2004).

En cas de que la taxa d'inoculació estigui per sota del nivell d'estabilitat, es produeix la situació d'inestabilitat endèmica. En aquest cas, menys del 75% dels animals de la població es troben immunitzats i es poden donar dues situacions:

- Si la taxa d'inoculació descendeix per sota dels nivells mínims per a l'estabilitat enzoòtica, la infecció dels vedells no es produeix quan encara tenen immunitat i esdevindrà un risc alt de patir la malaltia (àrea  de la figura 2).

- En el cas que la taxa sigui encara més baixa (àrea  de la figura 2), una gran part de la població no té contacte amb el patogen i per tant no desenvolupa immunitat, no obstant, el risc de patir la malaltia serà baix. Ara bé, en cas que s’estableixi la infecció, la clínica és més greu que en els altres casos.

  INESTABILITAT ENDÈMICA  ESTABILITAT Alta incidència Baixa incidència Alta ENDÈMICA

Mortalitat

Anticossos

Baixa Alta Taxa inoculació Baixa

Títol d'anticossos Incidència de casos clínics Mortalitat

Figura 2. Model conceptual de les relacions entre la taxa d'inoculació, la incidència de la malaltia, la mortalitat en la població bovina i la seroprevalença. Modificat de L'Hostis i Seegers (2002).

Els casos d'inestabilitat es poden presentar en diferents situacions (Mahoney, 1977): introducció de paparres infectades a zones lliures de Babesia, introducció d'animals de zones lliures a àrees infectades amb Babesia o bé reducció de la població de les paparres vectores necessàries per establir el nivell de premunició.

Aquest últim cas pot ser degut a condicions climàtiques desfavorables per la supervivència o reproducció de les paparres. Això comporta que la taxa d'inoculació sigui inferior, els vedells no s’immunitzen i resten susceptibles. Tant bon punt es recuperen les condicions que són favorables per a les paparres, la seva població torna a augmentar, parasiten els animals i apareixeran animals malalts. Una altra causa de la reducció de la població de les paparres és l’establiment d’un control artificial d’ectoparàsits, com ara tractaments acaricides. Un cop més, en el cas que la situació reverteix i s’incrementa el nombre de paparres, la infecció es manifesta clínicament més greu.

2.2. La circulació de l'agent entre els vectors

Una de les vies d'infecció de les paparres és per ingestió de sang infectada amb merozoïts de Babesia de l'hoste vertebrat, tal i com s'ha descrit en el cicle biològic. Les paparres no infectades adquireixen la infecció per primer cop al alimentar-se d’un hoste parasitat, continuant el cicle biològic de la Babesia fins la fase d’esporozoït.

Una altra via correspon a la infecció vertical, en la que les paparres poden mantenir-se infectades i infectives durant varies generacions sense haver ingerit nous merozoïts. En aquesta via hi intervenen la transmissió transovàrica i transestadial, que permeten el manteniment de la infecció durant tots els estadis de la paparra (larva, nimfa i adult) i a tota la seva descendència.

La transmissió transovàrica es dóna quan l'esporoquinet de Babesia infecta els oòcits de la paparra femella i així es transmet cap a la progènie, constituint el primer pas per a la infecció vertical. S'ha descrit en les quatre babèsies més importants que afecten els bovins i els seus vectors (Young i Morzaria, 1986; Euzeby, 1990). Segons l’estudi de Büscher (1988), en R. (Boophilus) decoloratus la infecció per B. bigemina es va mantenir almenys dues generacions de paparres.

La transmissió transestadial correspon a la transmissió del paràsit d'un estadi a un altre de la paparra, essent el següent pas per a completar la via d’infecció vertical. En aquest cas, la infecció es transmet d’un estadi a un altre de la paparra (des de la larva fins a l’adult). En algunes espècies com B. microti, no està descrita la transmissió transovàrica i només es pot donar aquesta via.

2.3. Persistència del paràsit en el vector

Es considera que les paparres, com a vectores de Babesia, deuen haver desenvolupat uns mecanismes de control del paràsit per tal de que la seva supervivència no es vegi afectada degut al cicle del paràsit. En Haemaphysalis longicornis, s'han descrit dues molècules (longicine i longipaïna) que poden estar involucrades en el sistema defensiu de la paparra contra babèsies i theilèries (Tsuji et al., 2007 i 2008). Les dues molècules són sintetitzades a l'epiteli intestinal de la paparra. Estudis in vitro han demostrat que

inhibeixen la proliferació dels merozoïts de Theileria equi i de Babesia microti, tanmateix, no hi ha evidències in vivo de l’efecte en el cicle del paràsit (Chauvin et al., 2009).

2.4. Estudis de prevalença

La distribució de les diferents espècies de piroplasmes depèn clarament de la distribució del vector. En el cas de B. bigemina, la distribució és bàsicament mundial en les zones temperades. Els estudis de prevalença suposen un dels primers passos per a l'estudi de la malaltia en una zona determinada. En la taula 1 es resumeixen els resultats d'alguns dels estudis epidemiològics publicats fins a l'actualitat per a B. bigemina.

Taula 1. Resum dels resultats (% positius) dels estudis epidemiològics publicats per a B. bigemina.

Localització Tècnica Referència ELISA IFI Tècniques moleculars

Bèlgica 11-20 Lempereur et al., 2012 Espanya (Menorca) 6 Almería et al., 2001

Europa Espanya (Menorca) 6 Almería et al., 2002 Espanya (Menorca) 5,7 Almería et al., 2009 Espanya (Menorca) 17,2 Ros-García et al., 2012b Espanya (País Basc) 2,7 García-Sanmartín et al., 2006 Grècia 15,2 Papadopoulos et al., 1996 Itàlia 0 Sparagano et al., 2000 Itàlia 23,1 Crigoli et al., 2002 Itàlia 70-82 Tassi et al., 2002 Itàlia 27,5 7,7 Torina et al., 2007a Itàlia 17,4 Cassini et al., 2012 Itàlia 4,2 Ceci et al., 2014 Portugal 52 34 Silva et al., 2009 Portugal 0,9 Silva et al., 2010 Portugal 7,8 Gomes et al., 2013

Angola 1 Kubelová et al., 2012 Kènia 12-49 Gitau et al., 1997 Àfrica Kènia 90 Martins et al., 2008 Marroc 10,8 Sahibi et al., 1998 Moçambic 46 Marufu et al., 2010 Moçambic 76 Tembue et al., 2011b Nigèria 29,4 Ajayi i Dipeolu 1986 Sud-àfrica 62,42 Dreyer et al., 1998 Sud-àfrica 30 36,5 Terkawi et al., 2011 Sudan 51 Salih et al., 2008 Sudan 10,7 Salih et al., 2009 Sudan 0,3 Salih et al., 2007 Sudan 4 Awad et al., 2011 Sudan 25-50 Malak et al., 2012 Tanzània 27-43 Swai et al., 2005 Tunísia 4,3 M’ghirbi et al., 2008 Zàmbia 0-14,6 Simuunza et al., 2011

Filipines 6,4 Yu et al., 2013

Àsia India 0,6 Nair et al., 2011 Malàisia 16 Rahman et al., 2010 Pakistan 13 Durrani i Kamal 2008 Síria 18,84 21,74 15,46 Terkawi et al., 2012 Sri Lanka 30,1 Sivakumar et al., 2012 Tailàndia 69,1 75,8 Iseki et al., 2010 Tailàndia 21 Cao et al., 2012 Taiwan 0,6 Tsai et al., 2011 Turquia 0,77 Altay et al., 2008 Turquia 43 Ekici i Sevinc 2009 Vietnam 54 Geurden et al., 2008 Vietnam 3,5 Sivakumar et al., 2013 Vietnam 42,6 60 16 Li et al., 2014

Brasil 94,3 Madruga et al., 2001 Brasil 75,5 Barros et al., 2005 Brasil 99,2 Guedes et al., 2008 Amèrica Brasil 90,5 Da Trindade et al., 2010 Brasil 9,5 de Mendoza-Costa et al., 2013 Brasil 34 Souza-Amorim et al., 2014 Bolívia 32 Carrique-Mas et al., 2000 Carib 65 Knowles i Montrose 1982 Costa Rica 44-50 Pérez et al., 1994 Costa Rica 59,1 1,34 Shebish et al., 2012 Guatemala 90 29 Teglas et al., 2005 Veneçuela 8,5 Melendez et al., 1997

Austràlia 70,5 Sserugga et al., 2003

3. Patogènia i clínica

La patogènia de les babesiosis està relacionada amb l'alliberament de molècules actives per part del paràsit i la destrucció d'eritròcits.

3.1. Alliberament de molècules

Durant l'inici de la infecció, la cal·licreïna plasmàtica s’activa degut al dany cel·lular i esterases alliberades pel propi paràsit. Aquesta cal·licreïna plasmàtica causa l'alliberació de quinines responsables de l'augment de la permeabilitat vascular, vasodilatació i l'activació dels factors de coagulació.

El propi paràsit també allibera molècules actives (esterases i proteases) que eviten la degradació del fibrinògen, causant un increment dels nivells de fibrina responsable de l'aparició de microtrombus.

L'acció conjunta de la cal·licreïna i la fibrina afavoreixen la instauració d’un quadre de coagulació intravascular disseminada (CID). Aquesta coagulopatia condueix a l’establiment estasi circulatòria amb aparició d'edemes, anòxia tissular i shock (Mahoney, 1977).

3.2. Hemòlisi i anèmia

L'anèmia hemolítica que apareix en el decurs de la malaltia està causada per la destrucció dels eritròcits. Aquesta destrucció està causada per la multiplicació intraeritrocitària del paràsit, l’acció dels macròfags que fagociten tant els eritròcits infectats com els que no i per l'augment de la fragilitat osmòtica d’aquests.

Tanmateix, no totes les babèsies manifesten la mateixa patogènia. Així, la infecció per B. bovis no altera gaire la fragilitat eritrocitària (Mahoney, 1977) mentre que en el cas de B. bigemina tant els eritròcits infectats com els que no, poden presentar aquesta alteració que afavoreix la lisi cel·lular.

En B. bigemina, es considera que la patogènia està principalment relacionada per l'hemòlisi intravascular, essent la causa de coagulopaties, hipotensió i citoadherència (Bock et al., 2004). d’altra banda, s'ha descrit la presència de autoanticossos en les infeccions per B. bigemina i B. gibsoni, que podrien jugar un paper en la destrucció dels eritròcits no infectats (Goés et al., 2007).

La destrucció gradual dels eritròcits acaba desencadenant un quadre d’anèmia, causant l’anòxia i en conseqüència, lesions tissulars. En B. bigemina el pronòstic depèn del grau de parasitèmia ja que pot variar d'una infecció subclínica a aguda, on es poden presentar més del 40% d'eritròcits infectats. En canvi, la infecció per B. bovis presenta un pronòstic greu tot i que la parasitèmia en sang perifèrica sol ésser molt reduïda (0,2 - 0,04%) (Zintl et al., 2005).

3.3. Quadres clínics i lesions

El període d’incubació pot variar depenent de la via d’infecció i del nombre d’organismes inoculats, generalment oscil·la entre 2 i 8 dies.

Allred et al. (2007) va descriure que el grau de parasitèmia, en absència d'immunitat prèvia, redueix el període d’incubació però no afecta a la gravetat dels símptomes.

La febre (41 - 41,5ºC) sol aparèixer a causa de la parasitèmia aguda i té una durada de 3-7 dies. En aquest estadi l’animal també pot presentar apatia i anorèxia. En les vaques gestants s'han descrit quadres d'avortaments i en els mascles s'han observat períodes de disminució de la fertilitat de fins a 6 o 8 setmanes. Degut a la congestió de les mucoses durant aquest període febril, l’anèmia podria passar desapercebuda (Bock et al., 2004).

L'anèmia apareix en iniciar-se la síndrome hemolítica que va acompanyada d’hemoglobinúria, hemoglobinèmia i icterícia.

En el cas de B. bovis, la multiplicació del paràsit en les cèl·lules endotelials pot causar signes neurològics com tremolors i atàxia (Mahoney, 1977).

En els animals que es recuperen del pic inicial de parasitèmia (fase aguda), la febre torna als valors normals i l’animal recupera la gana. En aquest procés hi ha aparentment una eliminació del paràsit en sang perifèrica, però es tracta d’una eliminació parcial. L’animal entra en una fase subclínica de durada variable on es van repetint fluctuacions de nivells baixos de parasitèmia.

En les formes lleus de babesiosi, pot aparèixer febre entre 39-40ºC, anorèxia i depressió. No sol presentar-se hemoglobinúria ni hemoglobinèmia, però pot haver icterícia.

En el cas de B. bigemina, els animals que es recuperen de la fase aguda es mantenen com a portadors, mantenint-se infectius per a les paparres de 4 a 7 setmanes (Bock et al., 2004).

Les lesions més freqüents durant una babesiosi aguda corresponen a la congestió i un augment de la grandària dels òrgans abdominals, especialment la melsa. També s’observa icterícia, colecistitis amb la presència de bilis d’aparença granulosa i hemorràgies a epicardi i endocardi (Bock et al., 2004).

En les babesiosis subagudes la canal de l'animal s’observa pàl·lida i ictèrica amb diferents graus de congestió tissular.

A nivell microscòpic poden detectar-se focus necròtics al fetge on es pot detectar eritrofagocitosi. També congestió a pulmons, cor, melsa i limfonodes. En cas de parasitació per B. bovis, les lesions encefàliques s’observen com a dilatació dels espais perivasculars i edema intersticial.

4. Resistència a Babesia spp.

4.1. Immunitat

En general, es considera que la immunitat contra la infecció per B. bovis depèn d'una forta resposta innata basada en l'activació de macròfags, amb fagocitosi i alliberació de metabòlits tòxics.

Durant la infecció aguda en els animals sense contacte previ amb B. bovis, la primera barrera de defensa és la resposta immune innata a la melsa (figura 3). S’observà que vedells esplenectomitzats resistien la infecció causada per una soca homòloga però no en cas d’infeccions causades per soques heteròlogues (citat per Bock i de Vos, 2001). De fet, el mateix autor va demostrar que els animals esplenectomitzats desenvolupaven parasitèmies més elevades, suggerint que la melsa juga un paper clau en la immunitat enfront a Babesia (Callow, 1977; citat per Bock et al., 2004) tal i com ja havien considerat altres autors (Lohr, 1973; Wright i Keer, 1977). Christensson (1987) va observar que els vedells sense anticossos calostrals es mantenien resistents com que sí n’havien rebut, suggerint que la immunitat cel·lular tenia un paper clau en la resistència a la infecció.

D’altra banda, s’ha observat que determinades fraccions de membrana de les babèsies (Stich et al., 1998; Brown, 2001) es comporten de la mateixa manera que el DNA d’alguns bacteris, és a dir, com un potent activador de les cèl·lules presentadores d’antigen (CAP) estimulant la producció d'interleuquines (IL-12 i IL-18) (Goff et al., 2006b) per part de macròfags i cèl·lules dendrítiques. Aquestes interleuquines alliberades activen les cèl·lules natural killer (NK) de la melsa que responen amb una producció d'alts nivells d’interferó gamma (IFN-γ) (Estes et al., 1994; Shoda et al., 2000; García et al., 2004; Brown et al., 2006; Goff et al., 2006b). L’ IFN-γ és una citoquina clau ja que modula la immunitat innata i l'adquirida tant a nivell cel·lular com humoral (Goff et al., 1998 i 2001), activa els monòcits (Goff et al., 1996; Stich et al., 1998) i regula la síntesi de IgG2 opsonitzants per part dels limfòcits B (o cèl·lules B) (Estes et al., 1994).

Els monòcits activats/macròfags tenen dues funcions efectores primordials: d’una banda, produeixen òxid nítric (NO), que és un radical lliure extremadament reactiu, amb capacitat tant d’eliminar patògens com de danyar cèl·lules de l’hoste, desencadenant la lisi dels eritròcits infectats. Fins i tot s’ha observat que és capaç d’inhibir el desenvolupament d’altres paràsits intracel·lulars a més de Babesia, com ara Leishmania o Plasmodium, ja que en presència de NO els paràsits s’observen en la seva forma degenerada (o ‘forma crítica’) (Johnson et al., 1996; Stich et al., 1998). D’altra banda, fagociten els merozoïts lliures al torrent sanguini (vius o morts) així com els eritròcits infectats (Goff et al., 1984a i 2006b). A més a més, junt amb les cèl·lules dendrítiques, també produeixen una gran quantitat de citoquines reguladores com IL- 12, IL-15 i IL-18 que seran importants per a la resposta immune adquirida durant la fase crònica de la malaltia.

La resposta immunitària només és protectora si l'IFN- γ i la IL-12 es produeixen en els estadis inicials, previs a la producció de IL-10 (Goff et al., 2001). La IL-10 és alliberada per algunes cèl·lules mononuclears (Goff et al., 1998) i té un efecte immunosupressor, inhibint les funcions efectores dels macròfags i l'activitat dels limfòcits Th1, per tal de prevenir respostes inflamatòries prolongades que podrien danyar els teixits (Goff et al., 2001). Goff et al. (2001) observà que en els vedells infectats, els nivells de IFN-γ arribaven al seu màxim el dia 6 post infecció, en comparació als 11-13 dies en els adults mentre que la IL-10 començà a aparèixer al dia 7 post infecció assolint un nivell màxim al 10è dia, tant en vedells com en adults (Goff et al., 2002a). De manera que l'autor va concloure que en els individus adults, quan la producció d’ IFN-γ i IL-12 es produeix en paral·lel amb la IL-10, permet la proliferació del paràsit (Goff et al., 2001 i 2002a). En canvi, els vedells que són resistents a la infecció, produeixen IL-12, IFN-γ i NO prèviament a IL-10 (Goff et al., 2002a; Brown et al., 2006).

També hi intervé l’activació del sistema del complement que permet l'alliberació de substàncies vasoactives (C3a i C5a), afavorint la fagocitosi (C3b i C5b) i lisant els eritròcits infectats (C8 i C9) (Morilla, 1981).

La immunitat adquirida enfront B. bovis sembla estar relacionada amb l’activació de limfòcits TCD4+ específics d’antigen i l' IFN-γ (Brown et al., 2001). Els limfòcits Th1 alliberen IFN-γ i els Th2 secreten la IL-4, necessaris tant per a l'estímul dels limfòcits B que produeixen IgGs com per a l’activació dels monòcits (figura 3). Tanmateix, en funció de les citoquines alliberades, una via dels limfòcits pot inhibir l’altre (Goff et al., 2001 i 2002b).

Degut a que Babesia no té fases extracel·lulars en l'hoste vertebrat, la immunitat per limfòcits TCD8+ es creu que és menys important.

La resposta immune humoral no permet l’eliminació completa del paràsit però sembla ajudar a controlar la parasitèmia a través de la citotoxicitat cel·lular depenent d'anticossos. Segons l’estudi realitzat per Goff et al. (1984b) en el que van avaluar diferents Immunoglobulines, observà que la citotoxicitat estava mitjançada principalment per IgG1.

En relació a les IgM, s'han dissenyat estudis en vedells infectats per B. bigemina (O’Donoghue et al., 1985) i B. divergens (Christensson, 1987) i en ratolins infectats per B. microti (Chen et al., 2000). En general, les IgM es detecten cap al dia 7 post infecció, arribant a un pic entre els 12-22 dies per anar disminuint posteriorment. Es considera que aquesta resposta d'IgM transitòria, indicadora de fase aguda, podria ser utilitzada per al diagnòstic en fases inicials de la malaltia.

Figura 3. Vies i regulació de la immunitat efectora en l'hoste vertebrat durant la infecció amb B. bovis. Fletxes en color blau: alliberació/acció potenciadora. Fletxes discontínues taronges: acció inhibitòria. Adaptat i modificat de Chauvin et al. (2009).

Les IgG2 en canvi, semblen tenir una funció d’opsonització. Ajudarien a controlar la parasitèmia estimulant un augment de la fagocitosi un cop la infecció aguda s'ha resolt (Estes et al., 1994; Brown et al., 2001; Goff et al., 2002b). Altres funcions de la immunitat humoral, no del tot conegudes, són la neutralització de l’adherència dels merozoïts lliures als eritròcits i de la adherència dels eritròcits infectats amb B. bovis a les cèl·lules endotelials (Brown et al., 2006).

La immunitat adquirida és específica per a cada soca del paràsit (Mahoney et al., 1979). Mahoney et al. (1979) van descriure que en el cas de B. bovis, l’administració d’un sèrum hiperimmune o d'anticossos IgG1 i IgG2 a un animal mai exposat al paràsit, el protegeix de la infecció encara que l'animal estigui esplenectomitzat, probablement degut a que els anticossos específics administrats ja actuen com a opsonines per a incrementar la fagocitosi de la babèsia.

Les IgG enfront B. bigemina apareixen cap al dia 20 post infecció mentre que les anti-B. bovis apareixen cap al dia 10 (Guglielmone et al., 1997). En ambdues babèsies, la immunitat es manté durant quatre anys (Bock et al., 2004). Tanmateix, s'ha de considerar que la presència d'anticossos no és necessàriament indicatiu d'immunitat, simplement de contacte amb el paràsit.

Durant infecció crònica, la persistència de nivells baixos de parasitèmia sembla requerir l'activació de la resposta immune adquirida. Les cèl·lules mononuclears fagocitàries alliberen IL- 12, IL-15 i IL-18, que actuen sinèrgicament contribuint a l’estímul de la producció de IFN-γ per part de diferents limfòcits Tαβ (especialment els limfòcits TCD4+), els limfòcits Tγδ i les cèl·lules NK (Brown et al., 2001; Goff et al., 2006b). Amb aquesta altra via el control de la infecció també està mediat per la producció d’IgGs neutralitzants dirigides contra merozoïts extracel·lulars (Brown et al., 2001) i contra els antígens de superfície variables dels eritròcits infectats (VESA1) (Allred et al., 1994 i 2000).

Els bovins que sobreviuen a la infecció inicial, tant naturalment com per tractament farmacològic, esdevenen portadors i resistents a la malaltia clínica.

4.2. Resistència natural

4.2.1. Especificitat d'hoste

En general, les babèsies són molt específiques d'hoste en condicions naturals (Kania et al., 1995) i sovint és necessari esplenectomitzar els animals per a poder establir una infecció experimental en un altre tipus d’hoste (Mahoney, 1977). Encara que si es tracta d'hostes molt emparentats, és possible detectar la mateixa Babesia, com és el cas de B. bigemina o B. bovis que afecta diferents espècies de remugants com s'ha descrit anteriorment.

S'han descrit algunes excepcions respecte a l'especificitat d'hoste. De fet, Chauvin et al. (2009), considera que el rang d’hostes d'algunes babèsies podria ser menys restrictiu del que es pensava. En el cas de B. microti, es considera que pot afectar a vàries espècies de micromamífers i també a humans (Schnittger et al., 2012). B. divergens també s'ha descrit en un ampli rang de remugants domèstics i salvatges, rosegadors i primats (Garnham i Bray, 1959; Carcy et al., 2006; Malandrin et al., 2009). De fet, B. divergens i B. odocoilei presenten similituds en la seqüenciació amb B. venatorum (Babesia sp. EU1) que afecta a humans (Herwaldt et al., 2003; Häselbarth et al., 2007), com es dóna també amb la Babesia sp. KO1 que afecta a humans i babèsies que s'han aïllat d'ovelles (Kim et al., 2007b).

4.2.2. Raça

Els bovins Bos taurus semblen ser més susceptibles que els Bos indicus (Morilla, 1981; Parker et al., 1985; Duangjinda et al., 2013) a la infecció per Babesia. Es considera que aquest fet podria ser conseqüència de la pròpia selecció natural de les poblacions bovines locals. Degut a un llarg contacte amb les paparres, es desenvolupa una resistència contra elles, limitant-ne el nombre de paparres que maduren en l'hoste (Uilenberg, 1995).

Bock et al. (1995) va realitzar un estudi amb B. indicus purs, creuats 50% de B. indicus i B. taurus, creuats 25% de B. indicus i animals purs B. taurus. En el diagnòstic clínic de la malaltia va detectar que B. taurus era la que desenvolupava unes parasitèmies més elevades en comparació amb els altres grups, tant en infeccions amb B. bovis com B. bigemina.

4.2.3. Edat

S'ha descrit una relació inversa entre l'edat i la resistència a algunes babèsies, on els joves són més resistents que els adults. Aquesta relació s'ha descrit en vedells infectats per B. divergens (Christensson, 1989), B. bovis (Trueman i Blight, 1978) i B. bigemina (Latif et al., 1979).

Els vedells de menys de 9 mesos tenen una resistència innata a la malaltia causada per B. bovis i B. bigemina (Zintl et al., 2005) que va disminuint gradualment. Els bovins adults exposats per primer cop a la malaltia desenvolupen un quadre clínic més greu (Uilenberg, 1995). És el que es coneix com a resistència inversa a l'edat (Guglielmone et al., 1997).

S'ha descrit que en els vedells el pic de parasitèmia es dóna abans que en els adults, però tant l'anèmia com el nivell de parasitèmia són menors en els vedells. En aquests individus joves, la febre i l'hematòcrit es recuperen ràpidament i persisteixen parasitèmies baixes durant llargs períodes sense signes aparents (Trueman i Blight, 1978; Goff et al., 2003).

En els nounats, la protecció pot ser parcialment deguda als anticossos maternals adquirits via calostral i que tenen una durada de dos mesos. Tot i així, els individus joves romanen resistents més enllà dels dos mesos de persistència dels anticossos calostrals (Trueman i Blight 1978; Toye et al., 2013), indicant que hi hauria altres vies responsables d'aquesta resistència a més de la immunitat passiva.

Aquesta resistència immune dels individus més joves sembla ser un factor important per al manteniment de l'estabilitat enzoòtica (Zintl et al., 2005).

4.3. Resistència adquirida

4.3.1. Soques i antígens

Poden presentar-se diferències de virulència entre soques o aïllaments. Per exemple, es considera que la soca d'Àfrica de B. bigemina és més patògena que la que es troba a Austràlia (Mahoney, 1977). També s'ha descrit que diferents graus de virulència poden coexistir en la mateixa zona geogràfica (Uilenberg, 1995).

Entre diferents tipus de soques no s'ha descrit protecció creuada. Callow (1967) va observar que l'exposició d'animals esplenectomitzats que ja havien superat la infecció a la mateixa soca homòloga, va causar parasitèmies només en el 44% dels casos, però d'aquests animals, la majoria patien parasitèmies menys greus que els animals controls. No obstant, l'exposició a soques heteròlogues desenvolupava una marcada parasitèmia en tots els individus exposats.

En canvi, Wright et al. (1987) van descriure que bovins recuperats d'una infecció per B. bigemina, semblaven mostrar una certa resistència a l'exposició amb B. bovis. Els autors van suggerir que aquesta reacció creuada, podia ser deguda a una major quantitat d'antígens protectors detectats en la membrana de B. bigemina, encara que no es va descriure el mateix resultat protector de B. bovis cap a B. bigemina.

4.3.2. Mecanismes d'evasió de la resposta immune

Babesia spp. ha desenvolupat estratègies per tal d'evitar o limitar els efectes de la resposta immune per a poder persistir en l'hoste vertebrat i augmentar les probabilitats de ser transmeses.

En algunes espècies com B. bovis o Babesia sp. WA-1, una de les estratègies d’evasió de la resposta immune es basa en la seva capacitat d'adhesió a les cèl·lules endotelials (Dao i Eberhard 1996; Schetters et al., 1998; O’Connor i Allred, 2000). La citoadherència dels eritròcits infectats en els capil·lars evita el pas de les babèsies cap a la melsa on poden ser eliminades per la immunitat cel·lular. Aquesta citoadherència sembla estar causada per VESA1 (Variant Erythrocyte Surface Antigen 1), una proteïna que s'exporta cap a la superfície de l'eritròcit infectat i que està en contacte amb el sistema immune. La variació antigènica d'aquesta proteïna permet evadir el sistema immune de l'hoste mentre manté la capacitat de citoadherència (Allred, 1994; Allred et al., 2000 i 2001).

D’altra banda, els merozoïts intracel·lulars es troben parcialment protegits de la immunitat de l'hoste, però els que es troben lliures en el torrent sanguini resten exposats. En aquest cas, el sistema immune és evadit mitjançant la síntesi de proteïnes que actuen com antígens variables de superfície en els merozoïts (VMSA), responsables de l'adhesió a la superfície de l'eritròcit, actuant com antígens immunodominants envers la immunitat de l'hoste. Aquestes proteïnes difereixen d'una espècie a una altra i tenen un alt grau de polimorfisme antigènic intraespècie (Chauvin et al., 2009). En el cas de B. bovis, Goodger et al. (1986) van suggerir aquesta hipòtesi al comprovar que no hi havia diferències entre bovins vacunats amb antígens immunodominants i els animals no vacunats. En aquesta espècie de Babesia, també s’ha descrit l’evasió immune mitjançant la regió 1 (MSA-1) de la VMSA, que s'ha descrit com la immunodominant més variable i que no confereix protecció degut a la seva variabilitat (Leroith et al., 2005; Carcy et al., 2006). En canvi, les regions que no són tan variables com la proteïna associada a les ròptries (RAP-1) indueixen una immunitat parcial (Brown et al., 1998; Yokoyama et al., 2002; Mosqueda et al., 2002a).

5. Mètodes de diagnosi laboratorial

5.1. Mètodes directes

El diagnòstic parasitològic per mètodes directes està basat en la identificació morfològica de l’agent etiològic i la disposició espaial en els eritròcits. Es pot realitzar a partir de frotis sanguinis o de teixits tenyits amb Giemsa per a la observació en microscòpia òptica. Els frotis sanguinis poden ser prims o gruixuts.

Els frotis prims poden fer-se de sang perifèrica, on s’estén la gota de sang per la superfície del portaobjectes, recollida en tubs estèrils d'EDTA o heparina. Els frotis es deixen assecar a l'aire, es fixen en etanol i es tenyeixen amb Giemsa al 10%.

En els frotis gruixuts, la mostra de sang (uns 50 l) no s’estén pel portaobjectes ni s'aplica metanol, només s'asseca amb aire calent i es tenyeixen amb Giemsa al 10%. Això permet la lisi dels eritròcits i la concentració dels paràsits, essent més sensible que els frotis prims (Bock et al., 2004; OIE, 2010). La sensibilitat per als frotis gruixuts pot permetre detectar un paràsit per cada 106 eritròcits, però la diferenciació a nivell d’espècie es veu dificultada degut a la concentració (OIE, 2010).

La identificació i la càrrega de l’organisme mitjançant frotis sanguinis ajuda a considerar si el paràsit observat pot estar associat amb el quadre clínic detectat (Mahoney, 1977). Aquesta tècnica resulta especialment útil durant la fase de parasitèmia però quan un animal esdevé portador o bé en casos d’infeccions per determinades espècies de Babesia, la parasitèmia es manté molt baixa i en conseqüència, la sensibilitat de la tècnica disminueix de manera important (Eriks et al., 1989; Birdane et al., 2006). Aquest és el cas de les infeccions per B. bovis que en adherir-se a a les cèl·lules endotelials, presenten unes parasitèmies reduïdes (<1% dels eritròcits infectats), mentre que en infeccions per B. bigemina o B. divergens les parasitèmies poden afectar al 20-30% dels eritròcits. Per aquest motiu, quan la parasitèmia és baixa es recomana recollir la mostra en capil·lars sanguinis superficials on els eritròcits tendeixen a acumular-se, incrementant per tant la probabilitat de detectar algun eritròcit infectat (Aikawa et al., 1985; Bock et al., 2004). Mentre que

quan la parasitèmia és elevada, la mostra pot ser recollida de grans vasos com la jugular o la vena caudal.

El diagnòstic post-mortem pot fer-se a partir de frotis de ronyó, cor, melsa i fetge. Tanmateix, la diferenciació d’espècies de Babesia es complica a partir d’una hora de la mort de l’animal degut a canvis morfològics del paràsit (Mahoney, 1977).

Una altra tècnica de diagnòstic parasitològic de Babesia spp. es basa en la detecció d’esporoquinets en l'hemolimfa de paparres a partir de les 72 hores posteriors a la ingestió de sang d’un hoste infectat (Dipeolu i Amoo, 1984).

5.2. Immunodiagnòstic

Es consideren d’especial utilitat en aquells casos on no sigui viable la detecció directa de l'agent etiològic. En general, les tècniques serològiques més utilitzades per al diagnòstic de B. bigemina presenten uns valors a partir d’un 95% de sensibilitat i 92,5% d’especificitat (Molloy et al., 1998; Goff et al., 2008; Kim et al., 2008).

5.2.1. ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)

Inicialment les tècniques d’ELISA es van desenvolupar a partir d'antígens crus o parcialment purificats obtinguts a partir de sang d’animals infectats experimentalment.

L'ús d'aquestes proteïnes antigèniques per adherir-les a la fase sòlida de l’ELISA ha estat utilitzat en nombrosos estudis descrits per al diagnòstic de diferents espècies de babèsies com B. bigemina (O'Donoghue et al., 1985), B. bovis (Waltisbuhl et al., 1987; de Echaide et al., 1995), B. divergens (Purnell et al., 1976) i B. caballi (Weiland 1986). Ara bé, la gran variabilitat de resultats i els nombrosos casos de reaccions creuades entre babèsies van fer desestimar l’ús d’aquests tipus d’antígens. Waltisbuhl et al., (1987) també van descriure reaccions creuades amb Anaplasma.

Les tècniques d’ELISA van avançar en la utilització d’antígens recombinants i anticossos monoclonals. L’estudi de Böse (1995) va comparar els resultats obtinguts per al diagnòstic serològic de B. bovis mitjançant tècniques ELISA amb antígens semipurificats o recombinants. Amb l’ús d’aquests últims, s’eliminaven els falsos positius i també el soroll de fons (background) que dificultaven la lectura de resultats. Alhora, va permetre treballar amb antígens estandarditzats.

Posteriorment, van desenvolupar-se altres ELISAs indirectes per a la detecció de B. bigemina (Tebele et al., 2000; Bono et al., 2008). L'estudi de Tebele et al. (2000) va utilitzar un nou antigen recombinant, anomenat p200, un antigen propi d’una proteïna estructural del merozoït, que conté uns epítops (C1A) que fusionats amb la glutathione S-transferasa (GST) reaccionen específicament amb els anticossos enfront B. bigemina. L’ús d’aquest antigen va permetre detectar seroconversió als 14 dies post infecció i que es mantenia detectable fins als 228 dies. Posteriorment, aquest antigen recombinant seria utilitzat per a desenvolupar un kit d’ELISA comercial (B. bigemina-Ab Svanovir , Svanova) amb un 96% de sensibilitat i un 97,5% d’especificitat.

Els ELISA de competició (ELISAc) van ser desenvolupats per tal de millorar l’especificitat, ja que els anticossos específics de l’animal entren en competència amb els monoclonals, inhibint la seva unió, de manera que l’aparició de color és degut a la manca d’IgG específica en el sèrum problema boví, i per tant, seronegativitat.

Molloy et al. (1998) va desenvolupar a Austràlia un ELISAc que utilitzava un antigen purificat de merozoïts que eren reconeguts per anticossos monoclonals. Tot i que la sensibilitat fou del 95,7% i l'especificitat del 97% i no es van detectar reaccions creuades, l’ús d'antígens purificats feia que fos difícil d’estandarditzar.

Un altre ELISAc per a B. bovis va ser desenvolupat per Goff et al. (2003) als EUA a partir dels estudis de Kappmeyer (1999) en B. caballi. En aquest estudi Goff et al., van desenvolupar l’ELISAc partint de la premisa que l'epítop d’un tipus de proteïna associada a les ròptries (RAP-1) de B. caballi era molt similar al de B. bovis, i per tant, seria reconegut per un anticòs monoclonal específic. Estudis posteriors van validar la tècnica amb un 91% de sensibilitat i 100% especificitat (Goff et al., 2006a). L’efectivitat d’aquesta RAP-1 es comprovà en B. bigemina (Boonchit et al., 2006) i finalment, Goff

et al. (2008) van acabar desenvolupant un ELISAc per a B. bigemina però essent prou específica per no donar reaccions creuades amb B. bovis. Tanmateix, els valors de sensibilitat i especificitat variaven entre un 94,7% i 98,3% o un 87,2% i 100% respectivament, segons el % d’inhibició establert com a cut-off.

Actualment, els ELISAc desenvolupats per Molloy et al. (1998) i Goff et al. (2008) són els més utilitzats en el diagnòstic de rutina per a B. bigemina.

5.2.2. Dot-ELISA

5.2.3. Fixació de complement

És una tècnica que ha estat utilitzada per al diagnòstic de vàries espècies de Babesia tant B. bigemina i B. bovis com per a B. ovis, B. canis o B. caballi. Encara que en bovins l'especificitat es considera suficientment alta, ja que només presenta un 1-2% de falsos positius, la seva sensibilitat resulta molt variable (20-70%) (Cossio-Bayúgar et al., 1997; Bradway et al., 2001). En general, no resulta una tècnica fiable per al diagnòstic (OIE, 2010).

5.2.4. Immunofluorescència indirecta (IFI)

La IFI per a la detecció de Babesia va ser inicialment desenvolupada per Ristic el 1964, per a la detecció d'anticossos enfront B. caballi en cavalls portadors. Posteriorment, s'ha aplicat per a d'altres espècies com B. bigemina (Burridge et al., 1973), B. major (Morzaria et al., 1977), B. canis (Vercammen et al., 1995), B. microti (Krause et al., 1994) i B. divergens (Duh et al., 2007). Estudis amb B. bovis de Jonston et al. (1973) mostraven un 3-4% de falsos positius però amb una sensibilitat de fins a 98% (Mahoney 1977).

Encara que en general presenten una bona sensibilitat i especificitat (Mosqueda et al., 2012), la OIE (2010) no recomana la utilització de les tècniques d'IFI per al diagnòstic de les babesiosis bovines degut a les reaccions creuades entre B. bigemina i B. bovis.

5.2.5. Cultius in vitro de Babesia spp.

Estan basats en el mètode desenvolupat per (Levy i Ristic, 1980) on s’obté un cultiu de Babesia spp. a partir d’una mostra d’eritròcits parasitats.

S’han utilitzat per demostrar la presència d’hostes portadors a diferents espècies de babèsies (Holman et al., 1993). Encara que la parasitèmia detectable a través de cultius resulta variable (Böse et al., 1995), el mètode es considera amb un 100% d’especificitat. Tot i els resultats, l'aplicació en el diagnòstic es veu limitada degut al temps necessari per a la obtenció de resultats, utilitzant-se principalment per a atenuar la virulència de les soques de Babesia (Wright, 1990).

5.2.6. Test d'immunocromatografia (TIC)

Es basa en un immunoassaig ràpid basat en la migració de la mostra per unes tires de nitrocel·lulosa que permet la detecció d'anticossos específics anti-B. bigemina i B. bovis mitjançant antígens recombinants. Aquests antígens són proteïnes de superfície-2c per a B. bovis i la RAP-1 per a B. bigemina (Kim et al., 2007a). Permet també la detecció al mateix temps de les dues babèsies sense reaccions creuades aparents. Ha estat descrita amb una sensibilitat i especificitat del 96,7% i 92,5% per B. bigemina i de 96,7% i 91,3% per B. bovis (Kim et al., 2008).

5.3. Tècniques moleculars

La identificació de marcadors genètics específics ha permès el desenvolupament de diverses tècniques de PCR amb uns molt bons resultats en la detecció i diferenciació entre diferents espècies de babèsies.

Les primeres descripcions sobre PCR per a la detecció de babèsies bovines es van descriure per a les espècies més patògenes, per Fahrimal et al. (1992) en el cas de B. bovis, i el mateix any per Figueroa et al. en el cas de B. bigemina. L'any següent, es va descriure una tècnica de PCR multiplex per al diagnòstic de B. bovis, B. bigemina i A. marginale (Figueroa et al., 1993). En general, aquestes tècniques estan basades en la detecció dels gens de l'apocitocrom b (Fahrimal et al., 1992), el gen que codifica l'antigen de superfície del merozoït (Figueroa et al., 1992) o el gen 18S rRNA (Criado- Fornelio et al., 2003).

S'han desenvolupat altres tècniques moleculars com el nested-PCR (nPCR) i la PCR a temps real (qPCR), cada cop més sensibles i específiques amb uns nivells de detecció de parasitèmies cada cop més baixos (Almería et al., 2001; Oliveira-Sequeira et al., 2005; Costa Júnior et al., 2006; Buling et al., 2007). Les qPCR permeten quantificar la càrrega parasitària, el que pot ser útil en casos com el seguiment d'una infecció experimental, per avaluar l'eficàcia dels tractaments o estudiar el paper de portadors subclínics com a font d'infecció (Ros-García et al., 2012a).

Degut les limitacions de les tècniques moleculars per a la detecció de diversos patògens alhora, també destaca en el diagnòstic de les babesiosis la RLB (Reverse Line Blot Hybridization) que Gubbels et al. (1999) va desenvolupar per al diagnòstic de piroplasmosis d'una manera més eficient. En aquesta tècnica es combina l'amplificació per PCR amb una hibridació mitjançant sondes específiques per a cada agent patògen buscat. Ha estat considerada com una de les tècniques d'elecció per al diagnòstic de les piroplasmosis (Gubbels et al., 1999; Almería et al., 2002; Brígido et al., 2004; Oura et al., 2004; García Sanmartín et al., 2006; Ceci et al., 2014). Tot i que la tècnica de Luminex® descrita recentment, sembla millorar-ne els resultats i podria portar a noves vies en el diagnòstic múltiple (Ros-García et al., 2012a i 2012b).

6. Premunició, quimioprofilaxi i vacunes

6.1. Vacunes atenuades

El principi d'immunitat duradora que s'estableix després d'una infecció per Babesia ha estat utilitzat al llarg dels anys per tal de immunitzar als bovins mitjançant vacunes.

Les primeres vacunes utilitzades des de finals del segle XIX, requerien de l'ús de sang d'individus portadors, que havien superat la malaltia, per tal d'obtenir els organismes vius com a immunogens. Tot i aconseguir la immunitat desitjada, aquestes vacunes presenten el risc de transmissió d'altres agents infecciosos i la possibilitat d'una reversió virulenta de la soca. S'ha de considerar també que els bovins vacunats esdevenen portadors, ja que la infecció dura uns quants mesos i actuen com a potencials transmissors del paràsit (Allred, 2007; de Waal i Combrink, 2006).

Per això, generalment s'utilitzen vacunes ja estandarditzades amb soques atenuades de B. bigemina i B. bovis desenvolupades en individus esplenectomitzats (Standfast et al., 2003; de Waal i Combrink, 2006). Aquestes vacunes contenen eritròcits infectats amb soques determinades. Les soques s'obtenen a partir d'animals infectats de manera natural, que han superat la malaltia i resten com a portadors. Un tractament farmacològic selectiu elimina la presència d'altres hemoparàsits, i mitjançant passis del paràsit en vedells esplenectomitzats o per cultius in vitro es disminueix la seva

virulència. La viabilitat de les soques s'avalua exposant a l'animal vacunat amb soques heteròlogues virulentes i si resulten efectives es crioconserven per tal d'utilitzar-les com a soques estandarditzades (Jongersen et al., 1989; Bock et al., 2004). Tanmateix, els inconvenients que poden aparèixer degut a l'ús de vacunes vives són els mateixos que els descrits anteriorment (Pipano et al., 2002).

Bock i de Vos (2001) van realitzar un estudi per avaluar l'eficàcia i la durabilitat de la vacuna atenuada de B. bigemina i B. bovis disponible a Austràlia. Els resultats van mostrar que una sola inoculació en vedells de 6 a 9 mesos d'edat conferia una immunitat eficaç de fins a 4 anys en zones sense paparres.

Les vacunes es troben comercialitzades a països com Argentina, Uruguay, Sud-àfrica, Austràlia i Israel. Es presenten en forma de vacunes congelades, que permeten una vida útil de vacuna més llarga, i les refrigerades que poden ser més econòmiques en el cost de desenvolupament encara que la vida útil és curta (entre 4-7 dies). Les vacunes comercialitzades disponibles poden incloure B. bigemina, B. bovis i B. divergens per a la immunització contra aquestes babesiosis, amb o sense combinació amb Anaplasma centrale (Bock et al., 2004; de Waal i Combrink, 2006; OIE, 2010).

Les vacunes vives atenuades són un dels tipus més utilitzats ja que a més d'oferir una immunitat aproximadament el 95% dels animals, poden utilitzar-se en altres situacions. Com ara en brots de babesiosi, per tal d'evitar la infecció dels animals que encara no pateixen el brot i evitar la infecció dels animals susceptibles per la soca virulenta. També per immunitzar vedells si s'ha donat qualsevol tipus de condició que hagi alterat (tant disminuint com augmentant) la població de paparres i poden alterar l'estabilitat endèmica, o bé en la introducció d'animals no infectats en zones endèmiques (Bock et al., 2004).

La vacunació també comporta certs riscos. S'han descrit reaccions adverses especialment quan s'administren en individus més susceptibles com adults o vaques lleteres d'alta producció. No es recomana l'ús en vaques gestants pel risc d'avortament. I tampoc la revacunació, ja que s'ha observat casos d'anèmia autohemolítica en vedells que prenen calostre quan s'administra de manera repetida a la mare (de Waal i Combrink, 2006).

S'ha de considerar que degut a que són vacunes vives, poden perdre eficàcia si s'administren en combinació amb un tractament farmacològic contra les babèsies ja que la immunitat depèn de l'establiment de la infecció i l'estimulació antigènica en animal.

Les vacunes recombinants podrien esdevenir un bon mètode de control de les babesiosis. Tanmateix, encara resten incògnites per entendre completament el mecanisme immune del paràsit així com el problema que presenta la variació antigènica de Babesia alhora d'establir un antigen protectiu eficaç. Wright et al. (1992) va desenvolupar un estudi per avaluar la capacitat protectiva de diferents antígens de merozoït de B. bovis, però només va identificar dos antígens protectius encara que els resultats van resultar molt variables.

L'ús de vacunes a partir d'antígens obtinguts de B. bigemina o B. bovis cultivats in vitro s'han valorat com a una alternativa, especialment quan no es poden mantenir suficients animals portadors i lliures de malaltia per al desenvolupament de la vacuna. Tant antígens de superfície com exoantígens (antígens solubles alliberats al medi pel merozoït) han estat valorats com a immunogens. El seu ús però, està discutit ja que els paràsits cultivats semblen desenvolupar drifts antigènics si es cultiven per un temps llarg. La immunitat que otorguen també resulta variable segons els estudis publicats (Wright, 1990; Echaide et al., 1993; Montenegro-James et al., 1995; Bock et al., 2004).

6.2. Vacunes dirigides contra els vectors

La resistència de les paparres als principals acaricides utilitzats com els organofosoforats, ha estat documentada des de fa més de 30 anys (Trapaga, 1987; Rosario-Cruz et al., 2009). Per això, els estudis han anat dirigits cap a alternatives a l'aplicació d'acaricides, com ara l'ús de vacunes que afectin la supervivència de les paparres per tal d'evitar la transmissió. La utilització de paparres híbrides estèrils de R. (Boophilus) microplus i R. (Boophilus) annulatus no es van considerar viables degut a les dificultats de desenvolupament i cost econòmic (George, 1987).

El desenvolupament durant els anys 90 de vacunes recombinants bovines amb l'antigen Bm86 van demostrar tenir un efecte en la reducció del nombre i la capacitat reproductiva tant de R. (Boophilus) annulatus com de R. (Boophilus) microplus (Canales et al., 2009). Bm86 és una proteïna que es troba a la superfície de la paret intestinal de la paparra. Aquesta proteïna és utilitzada com a antigen ocult (antigen del vector que no és reconegut pels anticossos de l'hoste ja que no es troba exposat de manera habitual). La vacuna estimula la producció d'anticossos específics circulants que són ingerits per la paparra durant la ingesta. D'aquesta manera, es permet l'eliminació de la població de les paparres i alhora s'afavoreix que els tractaments acaricides necessaris per al control de vectors siguin menors (Vercruysse et al., 2007). La vacuna comercial basada en Bm86 va estar desenvolupada a Austràlia com a TickGARD (Willadsen et al., 1995) i a Cuba com Gavac (Canales et al., 1997). Encara que la variabilitat en els resultats ha fet que actualment només es comercialitzi la segona, a Nord-amèrica i Sud-amèrica, però amb una eficàcia discutida (Guerrero et al., 2012).

Més recentment, diferents estudis han caracteritzat altres molècules de paparra que poden interferir en l'adquisició o la transmissió de Babesia. La interferència del RNA (procés d'inhibició d'elements genètics mitjançant la regulació gènica) d'un receptor OspA (TROSPA), la calreticulina o el sèrum amiloide A, semblen reduir significativament la càrrega de B. bigemina en R. (Boophilus) microplus i R. (Boophilus) annulatus (Antunes et al., 2012). Encara que l'estudi amb una vacuna recombinant amb calreticulina no va mostrar evidències de la seva eficàcia (Antunes et al., 2015). L'estudi de Merino et al. (2011) amb una vacuna recombinant amb subolesina, també va mostrar uns resultats esperançadors, disminuint la infecció per B. bigemina a R. (Boophilus) microplus. Aquests resultats van ser confirmats posteriorment per de la Fuente i Merino (2013) amb l'ús de vacunes amb subolesina (i akirina) per al control de B. bigemina i anaplasmes entre d'altres, en diferents tipus d'artròpodes transmissors de malalties.

6.3. Productes babesicides emprats en la quimioprofilaxi

L'ús de fàrmacs contra Babesia no només resulta útil per a tractar els quadres clínics de babesiosi, sinó també per establir una quimioprofilaxi a través de la premunició.

El mateix fàrmac que s'utilitza per al tractament des de fa anys, el dipropionat d'imidocarb, és el que també serveix com a quimioprofilàctic, ja que és efectiu tractant i prevenint la babesiosi però sense interferir en el desenvolupament de la immunitat (Mehlhorn, 2008). L'acumulació de l'imidocarb als teixits fa que tingui una acció retardada que pot durar varies setmanes depenent de la dosi utilitzada. En bovins es recomanen dosis d'entre 1,2 - 2,4 mg/kg via subcutània per al tractament, però per a la protecció es recomanen dosis de 3 mg/kg per a adquirir una protecció de 4 setmanes per a B. bovis i de com a mínim 2 mesos per a B. bigemina (Bock et al., 2004; Mehlhorn, 2008).

Es pot administrar abans d'una infecció artificial (per inoculació de sang infectada) o bé abans de la transmissió natural per picada de paparra. En aquest últim cas, tant la infecció inicial com les reinfeccions durant el període de protecció del fàrmac generen una premunició però sense mostrar signes clínics. A més, per a que resulti eficaç, la taxa d'inoculació ha de ser suficientment alta com per infectar l'animal (Mahoney, 1977).

Altres fàrmacs també s'han descrit com a alternatives a l'imidocarb per a permetre el desenvolupament de premunicions en babesiosis bovines. El diaceturat de diminazè a dosis de 3,5 mg/kg intramuscular dóna una protecció de 2 setmanes per a B. bovis i de 4 setmanes per a B. bigemina (Bock et al., 2004; Mehlhorn, 2008).

Les tetraciclines de llarga durada (oxitetraciclines) seguides de la infecció amb Babesia també poden reduir el nivell de parasitèmia sense interferir en el desenvolupament de la immunitat (Bock et al., 2004; Mehlhorn, 2008).

V. ESTUDI 1- Seroprevalença de les hemoparasitosis causades per Anaplasma spp. i Babesia bigemina en la població bovina a Catalunya

Seroprevalença de les hemoparasitosis causades per Anaplasma spp. i Babesia bigemina en la població bovina a Catalunya

Introducció

L'anaplasmosi i la babesiosi bovina són malalties transmeses per paparres que es caracteritzen per cursar amb quadres de febre, anèmia i icterícia durant la fase aguda de la malaltia. Els animals que es recuperen i no eliminen la infecció esdevenen portadors amb nivells baixos de parasitèmia, actuant de font d'infecció per als vectors.

L'anaplasmosi bovina està causada per una rickèttsia (ordre Rickettsiales) d'àmplia distribució a les zones tropicals i temperades d’arreu del món. Rhipicephalus, Ixodes i Dermacentor són alguns dels gèneres de paparres que es descriuen com a vectors. D'altra banda, les babesiosis més importants són les causades per B. bigemina i B. bovis, transmeses per paparres del gènere Rhipicephalus i Ixodes.

La limitada informació a Catalunya sobre la distribució d’aquestes hemoparasitosis dificulta seguir-ne l’evolució. Tot i això, estudis en l’àrea mediterrània podrien fer pensar que també es trobessin establertes (Papadopoulos et al., 1996; Sahibi et al., 1998; de la Fuente et al., 2005b; Birdane et al., 2006; Torina et al., 2007b; Ros-García et al., 2012b). A Catalunya el clima principal és el Mediterrani, dividit segons les característiques pluviomètriques i de temperatura en: litoral/prelitoral, amb limitades precipitacions mitges anuals (500-700 mm) on la influència marítima manté unes temperatures suaus, el continental sec on les precipitacions són més reduïdes que l’anterior (400-500 mm), el continental humit que presenta major amplitud tèrmica i precipitacions més abundants (700 mm) i per últim, el pirinenc/prepirinenc amb precipitacions més elevades i principalment a l’estiu (900-1200 mm). A més, Catalunya també presenta la comarca de la Vall d’Aran que és d’influència Oceànica (o Atlàntica), amb unes precipitacions constants al llarg de l’any (900 mm) i amb temperatures més moderades que altres indrets Pirinencs. Aquesta variabilitat climatològica, i de vegetació, permet l’establiment de diverses espècies de paparres arreu del territori (Estrada-Peña et al., 1995; Estrada-Peña, 2000) que poden actuar com a vectors.

Els sistemes de maneig basats en la cria en extensiu afavoreixen el contacte dels bovins amb les paparres que es troben fora de l’explotació i per tant, la disseminació de les malalties. A més de conèixer la seroprevalença, el present estudi té com a objectiu avaluar diferents factors relacionats amb l’animal, el maneig i les explotacions, per tal de determinar quins d’ells es poden considerar com a factors de risc a Catalunya.

Material i mètodes

Disseny de l’estudi i mostreig

L'estudi es va realitzar a partir d’un total de 1285 mostres procedents d’una col·lecció de sèrums d’arreu de Catalunya. Dues localitzacions d’interès es van tenir en compte en la selecció de mostres aleatòria sobre la base de dades, la zona nord-oest (Vall d’Aran, Pallars Jussà, Pallars Sobirà i Alta Ribagorça) d’on s’hi van incloure 350 sèrums, i la zona sud (Ports de Tortosa-Beseit) incloent-ne 182. La resta de sèrums (753), es van seleccionar a partir del nombre de mostres necessàries calculat pel programari WinEpi amb el 99,5% de confiança i un marge d’error del 5%. Assumint una prevalença estimada del 50% sobre una població coneguda de l’any 2010 de 555.829 bovins catalans (idesCat). Les explotacions d’origen per a les 753 mostres van ser seleccionades en la base de dades a partir de la divisió climàtica de Catalunya (figura 1) per a disposar d’explotacions per a cada clima. Mitjançant el programari IBM SPSS Statistics v.20 es van seleccionar aleatòriament els sèrums sobre les explotacions disponibles.

A partir del qüestionari epidemiològic recollit en la realització de la col·lecció de sèrums, es van obtenir les dades pel que fa a l’animal (raça, aptitud, edat i sexe). Les dades sobre el maneig (si surt a pasturar) es van obtenir a través d’entrevistes i consultes epidemiològiques a persones relacionades amb cada explotació. I pel que fa a la localització de l’explotació, a partir de les coordenades geogràfiques es va determinar l’altitud i el clima, segons les dades disponibles a l'Atles Nacional de Catalunya (ICGC 2009).

100

Figura 1. Divisió climàtica de Catalunya segons l'Atles Nacional de Catalunya (ICGC 2009).

Estudi serològic - Anaplasma

Per a l’anàlisi es va utilitzar una tècnica d’ELISA de competició (ELISAc) comercial (Anaplasma antibody test kit cELISA , VMRD, Inc., Pullman, WA) seguint les instruccions del fabricant (veure Annex II: procediment 1). La lectura de la densitat òptica de l'ELISA es va realitzar utilitzant l’espectrofotòmetre Labsystems Multiskan RC utilitzant el filtre de 620 nm.

A partir de la densitat òptica es va calcular el percentatge d'inhibició segons la fórmula 100 - [(DO mostra*100)/( DO mitja controls negatius)]. El cut-off es va establir en ≥30% d'inhibició per a les mostres positives i segons les recomanacions del fabricant, els resultats s’obtenen en positiu/negatiu.

101

Estudi serològic - Babesia

L'anàlisi dels sèrums per a la detecció d'anticossos enfront Babesia bigemina es va realitzar mitjançant una tècnica d'ELISA indirecte comercial (B. bigemina-Ab Svanovir, Svanova Biotech, Uppsala, Sweden), seguint les instruccions del fabricant (veure Annex II: procediment 2). La lectura de la densitat òptica de l'ELISA es va realitzar utilitzant l’espectrofotòmetre Labsystems Multiskan RC utilitzant el filtre de 405 nm.

A partir de la densitat òptica es va calcular el percentatge de positivitat (PP) segons la fórmula (DO mostra/DO mitja controls positius)*100. Es van considerar com a mostres positives les que van obtenir un valor PP≥40, negatives les d'un PP≤25 i els valors intermedis es van considerar dubtosos. Aquests van ser reanalitzats un segon cop seguint el mateix procediment. Segons el procediment del fabricant, els resultats s’obtenen en positiu/dubtós/negatiu.

Anàlisi estadístic

Per a l'anàlisi estadístic dels resultats, es va dissenyar un model lineal generalitzat que utilitza equacions d'estimació generalitzades mitjançant el programari IBM SPSS Statistics v.20 (veure Annex I per al fonament i interpretació del model).

Degut a que la prova estadística necessita una variable dicotòmica (amb només dos resultats: positiu/negatiu), les mostres de sèrum amb un resultat dubtós es van eliminar de l'estudi estadístic, restant una població total de 1186 per a fer l’anàlisi estadístic. Els p-valors <0,05 van ser considerats com a significatius.

Resultats

Sèrums analitzats

De les 1285 mostres seleccionades, 724 sèrums van correspondre a bovins de carn, 379 de bovins lleters i 182 animals de lídia. El nombre d'explotacions van ser de 116

102

per als bovins carnis, 36 per les vaques lleteres i les 9 explotacions de lídia. La distribució de les explotacions d'origen dels sèrums es mostra a la figura 2.

Figura 2. Geolocalització de les 161 explotacions d'origen segons l'aptitud dels animals.

El nombre d’animals recollits per a cada factor (o variable) es mostren a la taula 1. Les variables contínues com l’edat o l’altitud van ser convertides a variables categòriques. L’edat es va agrupar en tres rangs amb un nombre similar de sèrums en: animals de fins a 2 anys (n=354), entre 3 - 6 anys (n=492) i a partir de 7 anys (n=439). I l'altitud de les explotacions (en metres) es va agrupar en: de 0-199, 200-499, 500-999 i 1000-1999.

El model estadístic es va realitzar tenint en compte per una banda la raça i l'aptitud per l'altra. Les races es van classificar en tres aptituds: aptitud càrnia (Bruna dels Pirineus, creuats de carn, Xarolesos, Salers, Blonde d’Aquitaine i altres), aptitud lletera (Frisones i creuats d’aquestes) i d’aptitud de lídia (raça Lídia junt amb els creuats de lídia). En

103

'altres' es van agrupar les races Pirinenca, Llemosina, Parda Alpina, Gasconne, Simmental, Rotbunte i Albera, ja que no arribaven a 5 individus per raça.

Estudi serològic

De les 1285 mostres analitzades, la seroprevalença obtinguda per a Anaplasma spp. va ser del 39,9 % (37,2 - 42,6%) (interval de confiança al 95%). En el cas de Babesia bigemina, la seroprevalença va ser del 54,4 % (IC 51,6 - 57,1).

A la taula 1 es mostren el nombre d'animals analitzats per a cada categoria i els resultats de les proves ELISA sobre el total de la població (n=1285).

Estudi serològic d’ Anaplasma spp.

La distribució dels resultats segons l'edat de l'animal es representen a la figura 3.

250

200

150

POS NEG 100

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Figura 3. Distribució dels resultats de l'ELISAc per a la detecció d'anticossos enfront a Anaplasma spp. (n= 1285).

104

Taula 1. Seropositius per a cadascun dels factors de les mostres analitzades (n=1285).

Factor Categoria n Nombre de % Nombre de % seropositius seropositius seropositius seropositius Anaplasma Anaplasma Babesia Babesia Raça Bruna 360 190 52,8 150 41,7 Frisona 369 51 13,8 225 61 Creuada 276 107 38,8 155 56,2 Lídia 132 76 57,6 77 58,3 Creuada de 50 45 90 42 84 Lídia Xarolesa 42 17 40,5 18 42,9 Salers 24 14 58,3 17 70,8 Blonde 10 3 30 5 50 d'Aquitaine Altres 22 10 45,5 10 45,5 Edat 0 - 2 354 87 24,6 169 47,7 (anys) 3 - 6 492 187 38 280 56,9 ≥ 7 439 239 54,4 250 56,9 Sexe Femella 1249 499 40 681 54,5 Mascle 36 14 38,9 18 50 Pastura No 393 95 24,2 201 51,1 Sí 892 418 46,9 498 55,8 Clima Oceànic 67 43 64,2 18 26,9 Med. pre- 533 218 40,9 267 50,1 /pirinenc Med. 149 53 35,6 94 63,1 continental sec Med. 148 38 25,7 97 65,5 continental humit Med. pre- 388 161 41,5 223 57,5 /litoral Província Lleida 541 231 42,7 249 46 Girona 272 65 23,9 154 56,6 Barcelona 215 52 24,2 123 57,2 Tarragona 257 165 64,2 173 67,3 Altitud 0 - 199 318 84 26,4 171 53,8 explotació 200 - 499 229 96 41,9 143 62,4 (metres) 500 - 999 429 208 48,5 237 55,2 1000 - 1999 309 125 40,5 148 47,9 n: nombre de mostres.

105

Estudi estadístic d’ Anaplasma spp.

Per a l'anàlisi estadístic tant d'Anaplasma spp. com de B. bigemina es van eliminar els animals que presentaven valors dubtosos, establint la població total per al model en n= 1186 sèrums.

El model estadístic detecta significatius els factors relacionats amb l'animal (raça i edat), de coinfecció (Anaplasma-Babesia) i localització geogràfica (clima, província i altitud) (taula 2).

El factor 'sexe' va ser eliminat del model ja que no es van detectar diferències significatives (p-valor >0,05).

106

Taula 2. Model estadístic: mitjanes ajustades (%) i error típic del model lineal generalitzat per a Anaplasma spp. (n=1186).

Factor Categoria n Mitjana Error Sig. Bonferroni ajustada típic (%) Raça Bruna 340 63 6,6 0,000* Frisona 339 19 3 Creuada 252 42 4,4 Lídia 122 44 7,4 Creuada de Lídia 47 60 14 Xarolesa 33 18 5,1 Salers 23 58 12 Blonde d'Aquitaine 10 19 10,2 Altres 20 60 14 Edat 0 - 2 332 29 4,7 0,000* (anys) 3 - 6 454 40 4,8 ≥ 7 400 51 4,9 Seropositiu No 487 36 4,7 0,027* Babesia Sí 699 44 4,9 Pastura No 357 41 5,9 0,577 Sí 829 38 4,0 Clima Oceànic 65 45 10,2 0,000* Med. pre-/pirinenc 498 24 5,4 Med. continental sec 136 48 7,9 Med. continental 130 30 8 humit Med. pre-/litoral 357 56 9,7 Província Lleida 509 26 4,2 0,000* Girona 253 37 6,7 Barcelona 192 29 6 Tarragona 232 69 7,3 Altitud 0 - 199 294 12 4,4 0,000* (metres) 200 - 499 205 41 6,7 500 - 999 397 66 4,8 1000 - 1999 290 52 6,6 n: nombre de mostres. Sig. Bonferroni: p-valor segons la correcció de Bonferroni (* factor significatiu).

107

Taula 3. Resultats del model lineal generalitzat per a Anaplasma spp. en el total de la població tenint en compte l'aptitud.

Població total (n= 1186) Factor Categoria n Mitjana Error típic Sig. ajustada (%) Bonferroni Edat (anys) 0 – 2 332 31 3,7 *0,000 3 – 6 454 44 3,6 ≥ 7 400 51 3,8 Aptitud Càrnia 669 47 2,7 *0,000 Lletera 348 15 2,2 Lídia 169 70 5,2 Seropositiu No 487 36 3,3 *0,001 Babesia Sí 699 47 3,6 Pastura No 357 40 4,5 0,483 Sí 829 43 2,7 Clima Oceànic 65 59 7,5 *0,005 Med. pre-/pirinenc 498 37 4,1 Med. continental sec 136 45 4,6 Med. continental 130 35 5,9 humit Med. pre-/litoral 357 33 2,8 n: nombre de mostres. Sig. Bonferroni: p-valor segons la correcció de Bonferroni (* factor significatiu).

A la taula 3 es mostra el resultat del model estadístic per a la població de n=1186. En aquesta taula s'agrupen les races segons les aptituds i s'eliminen factors com la província o l'altitud de l'explotació que no aporten dades significatives i el seu efecte es troba inclòs en el clima. En les taules 4,5 i 6 s'avaluen els mateixos factors per a cadascuna de les aptituds per separat.

108

Taula 4. Resultats del model lineal generalitzat per a Anaplasma spp. dels animals d'aptitud càrnia.

Aptitud càrnia (n= 669) Factor Categoria n Mitjana Error Sig. Bonferroni ajustada (%) típic Edat (anys) 0 – 2 154 37 4,3 *0,013 3 – 6 199 46 4,5 ≥ 7 316 52 3,8 Seropositiu No 316 42 3,6 0,198 Babesia Sí 353 48 3,8 Pastura No 143 37 4,7 *0,003 Sí 526 53 3,1 Clima Oceànic 65 56 7 *0,000 Med. pre-/pirinenc 391 38 3,3 Med. continental 60 66 6,6 sec Med. continental 53 25 5,9 humit Med. pre-/litoral 100 41 5 n: nombre de mostres. Sig. Bonferroni: p-valor segons la correcció de Bonferroni (* significatiu).

109

Taula 5. Resultats del model lineal generalitzat per a Anaplasma spp. dels animals d'aptitud lletera.

Aptitud lletera (n= 348) Factor Categoria n Mitjana Error Sig. ajustada (%) típic Bonferroni Edat (anys) 0 – 2 146 3 1,1 *0,022 3 – 6 180 10 2,8 ≥ 7 22 3 2,4 Seropositiu No 121 3 1,3 0,077 Babesia Sí 227 7 2,1 Pastura No 214 7 2,5 0,06 Sí 134 3 1,2 Clima Oceànic - - - *0,012 Med. pre- 95 12 4,3 /pirinenc Med. continental 69 1 0,8 sec Med. continental 77 10 3,7 humit Med. pre-/litoral 107 3 1,5 n: nombre de mostres. Sig. Bonferroni: p-valor segons la correcció de Bonferroni (* significatiu).

110

Taula 6. Resultats del model lineal generalitzat per a Anaplasma spp. dels animals d'aptitud de lídia.

Animals de lídia (n= 169) Factor Categoria n Mitjana Error Sig. ajustada (%) típic Bonferroni Edat (anys) 0 – 2 32 42 8,9 *0,000 3 – 6 75 61 6,6 ≥ 7 62 88 4,7 Seropositiu No 50 59 7,9 0,095 Babesia Sí 119 74 5 Pastura No - - - N.E. Sí 169 - - Clima Oceànic - - - N.E. Med. pre- - - - /pirinenc Med. continental - - - sec Med. continental - - - humit Med. pre-/litoral 169 - - n: nombre de mostres. Sig. Bonferroni: p-valor segons la correcció de Bonferroni (* significatiu). N.E.: paràmetre no estimat

111

Estudi serològic - Babesia bigemina

La distribució dels resultats segons l'edat dels animals es representa a la figura 4.

250

200

150 DUB POS 100 NEG

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Figura 4. Distribució dels resultats de l'ELISA per a la detecció d'anticossos enfront a Babesia bigemina (n= 1285).

Estudi estadístic - Babesia bigemina

Els resultats del model lineal generalitzat obtinguts per a cadascun dels factors analitzats es troben a la taula 7, sobre la població de n=1186.

Els resultats mostren diferències significatives dins els factors propis de l'animal (raça, edat), de coinfecció, factors de maneig (pasturar) i de localització geogràfica (clima, província).

112

Taula 7. Model estadístic: mitjanes ajustades (%) i error típic del model lineal generalitzat per a Babesia bigemina (n=1186).

Factor Categoria n Mitjana Error Sig. ajustada típic Bonferroni (%) Raça Bruna 340 51 6,5 0,000* Frisona 339 78 3 Creuada 252 62 4 Lídia 122 34 6,9 Creuada de Lídia 47 60 13,4 Xarolesa 33 37 10,2 Salers 23 76 9,7 Blonde d'Aquitaine 10 72 13,3 Altres 20 51 14,6 Edat 0 - 2 332 52 5,1 0,015* (anys) 3 - 6 454 59 4,6 ≥ 7 400 65 4,3 Seropositiu No 705 54 4,5 0,016* Anaplasma Sí 481 63 4,3 spp. Pastura No 357 49 5,2 0,000* Sí 829 68 3,7 Clima Oceànic 65 33 9,1 0,000* Med. pre-/pirinenc 498 58 6,3 Med. continental sec 136 74 5,5 Med. continental humit 130 73 6,9 Med. pre-/litoral 357 52 7,3 Província Lleida 509 40 5,4 0,000* Girona 253 57 6,3 Barcelona 192 47 6,5 Tarragona 232 84 4,2 Altitud 0 - 199 294 50 8,7 0,214 explotació 200 - 499 205 59 6 (metres) 500 - 999 397 59 4,7 1000 - 1999 290 67 5,3 n: nombre de mostres. Sig. Bonferroni: p-valor segons la correcció de Bonferroni (* significatiu).

Com en el cas d'Anaplasma spp., es van avaluar els mateixos factors segons l'aptitud dels animals, per al total de la població (taula 8), i per cada aptitud per separat (taules 9,10 i 11).

Eliminant els factors no significatius com el sexe dels animals, la província i l'altitud de les explotacions.

113

Taula 8. Resultats del model lineal generalitzat per a Babesia bigemina en el total de la població tenint en compte l'aptitud.

Total (n= 1186) Factor Categoria n Mitjana Error Sig. ajustada (%) típic Bonferroni Edat (anys) 0 – 2 332 50 3,8 *0,002 3 – 6 454 59 3,1 ≥ 7 400 65 3,5 Aptitud Càrnia 669 50 2,7 *0,000 Lletera 348 67 3,2 Lídia 169 58 5,7 Seropositiu No 705 53 3,2 *0,001 Anaplasma Sí 481 64 3 spp. Pastura No 357 51 4 *0,000 Sí 829 65 2,5 Clima Oceànic 65 27 6,2 *0,000 Med. pre-/pirinenc 498 54 3,5 Med. continental sec 136 71 4,6 Med. continental 130 76 4 humit Med. pre-/litoral 357 62 2,7 n: nombre de mostres. Sig. Bonferroni: p-valor segons la correcció de Bonferroni (* significatiu).

114

Taula 9. Resultats del model lineal generalitzat per a Babesia bigemina dels animals d'aptitud càrnia.

Aptitud càrnia (n= 669) Factor Categoria n Mitjana Error Sig. ajustada (%) típic Bonferroni Edat (anys) 0 – 2 154 41 4,4 *0,002 3 – 6 199 52 4,6 ≥ 7 316 59 3,7 Seropositiu No 346 48 3,7 0,197 Anaplasma Sí 323 54 3,8 spp. Pastura No 143 41 4,9 *0,001 Sí 526 60 3,2 Clima Oceànic 65 19 4,8 *0,000 Med. pre-/pirinenc 391 41 3,4 Med. continental 60 78 6,5 sec Med. continental 53 64 7 humit Med. pre-/litoral 100 54 5 n: nombre de mostres. Sig. Bonferroni: p-valor segons la correcció de Bonferroni (* significatiu).

115

Taula 10. Resultats del model lineal generalitzat per a Babesia bigemina dels animals d'aptitud lletera.

Aptitud lletera (n= 348) Factor Categoria n Mitjana Error típic Sig. ajustada (%) Bonferroni Edat (anys) 0 – 2 146 71 5,4 0,317 3 – 6 180 75 4,6 ≥ 7 22 84 8,1 Seropositiu No 304 69 4,7 *0,012 Anaplasma Sí 44 84 6,1 spp. Pastura No 214 74 5,3 0,078 Sí 134 81 5,3 Clima Oceànic - - - 0,159 Med. pre- 95 74 6,1 /pirinenc Med. continental 69 73 7,5 sec Med. continental 77 85 4,7 humit Med. pre-/litoral 107 76 6,3 n: nombre de mostres. Sig. Bonferroni: p-valor segons la correcció de Bonferroni (* significatiu).

116

Taula 11. Resultats del model lineal generalitzat per a Babesia bigemina dels animals d'aptitud de lídia.

Animals de lídia (n= 169) Factor Categoria n Mitjana Error Sig. ajustada (%) típic Bonferroni Edat (anys) 0 – 2 32 58 8,9 0,147 3 – 6 75 76 5,4 ≥ 7 62 64 7,8 Seropositiu No 55 58 7,7 0,095 Anaplasma Sí 114 74 4,7 spp. Pastura No - - - N.E. Sí 169 - - Clima Oceànic - - - N.E. Med. pre-/pirinenc - - - Med. continental - - - sec Med. continental - - - humit Med. pre-/litoral 169 - - n: nombre de mostres. Sig. Bonferroni: p-valor segons la correcció de Bonferroni (* significatiu). N.E.: paràmetre no estimat.

El model estadístic també ha avaluat que la coinfecció té una influència significativa si s'estudia la població general. De fet, un 25,9% dels animals estudiats presenten una coinfecció Anaplasma-Babesia.

117

Discussió

Les seroprevalences detectades van ser del 39,9% per a Anaplasma spp. i del 54,4% per a Babesia bigemina.

Es considera que les piroplasmosis bovines es troben disseminades per tota la Península Ibèrica, en especial a la zona centre i sud (Castellà i Almería, 2002; García- Sanmartín et al., 2006; Sánchez-Murillo et al., 2013), encara que la informació disponible per B. bigemina es troba limitada a Menorca (Almería et al., 2001, 2002 i 2009; Ros-García et al., 2012) i al País Basc (García-Sanmartín et al., 2006). En aquest últim estudi, la detecció de B. bigemina per RLB va ser del 2,7%. En canvi a Menorca, que té un clima Mediterrani litoral com part de Catalunya, la prevalença d’infecció de B. bigemina era aproximadament del 6% mitjançant tècniques de PCR i RLB (Almería et al., 2001, 2002 i 2009), encara que recentment amb l’ús de tècniques Luminex® s’ha observat un augment dels positius fins al 17,2% (Ros-García et al., 2012). Tanmateix, la informació sobre estudis serològics es troba molt limitada. A Catalunya, trobem estudis de babesiosis causades per B. ovis amb seroprevalences variables entre 6-58% en petits remugants domèstics (Ferrer et al., 1998a; Ferrer et al., 1998b) i un 12% en silvestres (Ferrer et al., 1998c; Marco et al., 2000) a la zona dels Ports de Tortosa- Beseit. Pel que fa a les anaplasmosis bovines, a l'Estat espanyol es descriuen seroprevalences del 76% per Anaplasma spp. (ELISAc) i deteccions d’A. marginale del 40% per PCR a Castella la Manxa (Naranjo et al., 2006). En aquesta Comunitat Autònoma també s’ha descrit un 10% de seroprevalença en cérvols obtinguda per ELISAc (de la Fuente et al., 2004a) i a Extremadura estan descrits de casos clínics en bovins en extensiu per A. marginale (Sánchez-Murillo et al., 2013). A Itàlia, on les hemoparasitosis són freqüents (Torina et al., 2007a i 2007b), les seroprevalences es mostren elevades (60%) mitjançant l'ELISAc enfront Anaplasma spp., mentre que les confirmacions per PCR es situen entre el 10-60% per A. marginale (Torina et al., 2007a i 2008b). En el cas de B. bigemina, Torina et al. (2007a) detecten seroprevalences del 27,5% per IFI i un 8% per confirmació en PCR. Aquests resultats suggereixen que les seroprevalences altes són indicatives de contacte amb els hemoparàsits (i per tant amb els vectors infectats), però que la infecció no sempre es troba present en tots els bovins.

118

Un dels factors importants en l'epidemiologia tant de l'anaplasmosi com de la babesiosi és l'edat dels animals. En el present estudi observem que el risc d'infecció en el total de la població s’incrementa amb l’edat de l’animal (Zintl et al., 2005; Swai et al., 2005; Birdane et al., 2006; Jonsson et al., 2008; Urdaz-Rodriguez et al., 2009; Cassini et al., 2012; Atif et al., 2013), probablement degut a un major temps d’exposició a les picades de paparres infectades. En el cas de la babesiosi però, els bovins lleters i els de lídia presenten una positivitat similar en tots els rangs d’edat (taula 10 i 11). Els estudis de Pérez et al. (1994) i Salih et al. (2008) també han descrit aquest cas en les babesiosis, considerant en el cas de Pérez et al. (1994), factors com l'estrès nutricional o un pic en la taxa d'inoculació. Gitau et al. (1997) també descriu que els vedells que es crien en extensiu estan més exposats a les paparres, i per tant, desenvolupen anticossos més elevats. En el present estudi, tot i que els animals de lídia sempre es crien en extensiu, no es podria descartar cap hipòtesi ja que no coneixem l'estat nutricional dels vedells o la presència de vectors.

La raça o l'aptitud dels bovins també es mostra significativa. En l'anaplasmosi, els bovins d'aptitud de lídia presenten una seropositivitat del 70% (taula 3). Aquests animals es crien en extensiu als Ports de Tortosa-Beseit (Tarragona), on s'ha descrit la presència de Rhipicephalus bursa (Ferrer et al., 1998b; Estrada-Peña, 2000), que pot actuar com a vector d'Anaplasma (Kocan et al., 2004; de la Fuente et al., 2005b). I els bovins lleters mostren la seropositivitat més baixa per a Anaplasma spp. (15%) probablement pel règim de cria en intensiu (Gitau et al., 1997; Urdaz-Rodríguez et al., 2009; Awad et al., 2011). Tot i això, en el cas de B. bigemina els resultats mostren tot el contrari. Sorprenentment, els bovins lleters presenten una seropositivitat (67%) superior a la resta de bovins analitzats (taula 8). Com s'ha esmentat anteriorment, factors d'estrès que afectin al sistema immunitari i taxes d'inoculacions elevades (Pérez et al., 1994; Salih et al., 2008) o la introducció de paparres a través del farratge a l'explotació (Swai et al., 2005) podrien ser factors a considerar tot i que no han estat avaluables en el nostre cas.

119

El maneig dels bovins també ha mostrat diferències segons el sistema de cria. En Anaplasma spp., sortir a pastura ha resultat significatiu en els bovins d'aptitud càrnia (taula 4) més a més, l'alta seropositivitat dels bovins de lídia es relaciona amb la cria exclusiva en extensiu. Aquest sistema de cria a més d'afavorir el contacte amb els vectors (Gitau et al., 1997; Urdaz-Rodríguez et al., 2009; Awad et al., 2011), també ho permet amb remugants silvestres que poden actuar de reservoris (de la Fuente et al., 2005b; Naranjo et al., 2006; Torina et al., 2012) i per tant, es considera un factor clau (Maloo et al., 2001; Rubaire-Akiiki et al., 2004; Swai et al., 2005; Urdaz-Rodríguez et al., 2009; Cassini et al., 2012). En els bovins lleters la seroprevalença de l'anaplasmosi és baixa, però mostra una tendència (p-valor=0,06) a ser més seropositiva quan no surten a pasturar (taula 5). Tot i que no coneixem si hi ha establert un control de vectors, alguns autors suggereixen el paper de dípters com Stomoxys calcitrans com a vectors d'Anaplasma (Potgieter i Stoltsz, 2004; Baldacchino et al., 2013). En el cas de la babesiosi, sortir a pasturar ha estat considerat com a significatiu en tots els casos (Mahoney, 1977; Tice et al., 1998; L'Hostis i Seegers, 2002; Bock et al., 2004).

En el cas dels factors relacionats amb la localització geogràfica de l'explotació, en Anaplasma spp. ha resultat significativa l’altitud, però es pensa que no té tanta influència ni importància en la transmissió de malalties transmeses per paparres (Estrada-Peña, comunicació personal), ja que principalment depèn de factors com el clima i la vegetació (Morley i Hugh-Jones, 1989; Estrada-Peña et al., 2008). En l'anaplasmosi, els tipus de climes que es valoren amb més risc per als bovins carnis són molt diferents, des de les temperatures càlides del Mediterrani continental sec, al fred i humit de l’Oceànic. Aquests resultats tant variables podrien suggerir que per a les paparres vectores, les condicions microclimàtiques de la zona siguin possiblement més importants per al manteniment de les seves poblacions (Morley i Hugh-Jones, 1989; Perez et al., 1994; Estrada-Peña, 2001). A més també s'ha de tenir en compte que la transmissió mecànica per dípters hematòfags és possible en Anaplasma, el que podria fer variar els resultats i fa que causi una malaltia menys previsible (Jonsson et al., 2008).

120

En B. bigemina, el clima Oceànic és manté amb menys seropositivitat en tots els grups, el que pot suggerir que el clima més fred i humit no afavoreix la presència de paparres com R. bursa (Papadopoulus et al., 1996; Manilla, 1998; Sahibi et al., 1998; Castellà et al., 2001).

Segons la classificació de Norval citada per Tice et al. (1998) ens podríem trobar, en general, davant una situació d'inestabilitat endèmica en el cas de les dues malalties ja que les seroprevalences detectades es troben entre 21-60%. En aquesta situació seria d'esperar que es presentessin casos clínics tant d'anaplasmosi com de babesiosi bovina de manera esporàdica a Catalunya. En aquestes situacions d'inestabilitat, la majoria d'animals són susceptibles a la infecció perque no han adquirit resistència ja que la taxa d'inoculació és baixa, i es crea un risc de patir quadres de malaltia clínica (Mahoney, 1977; L'Hostis i Seegers, 2002). Es desconeix però si els animals rebien algun tipus de tractament acaricida que alterés les dinàmiques poblacionals de les paparres.

El diagnòstic amb tècniques ELISA ha demostrat ser un eina eficaç per al diagnòstic de les hemoparasitosis (Tebele et al., 2000; Hofmann-Lehmann et al., 2004; Strik et al., 2007; Bono et al., 2008). El kit utilitzat enfront Anaplasma té una sensibilitat del 95% i una especificitat del 98% segons indica el fabricant i es considera una de les tècniques d'elecció (Torioni de Echaide et al., 1998; Kocan et al., 2010; OIE, 2012), però tot i això, només permet la identificació a nivell de gènere. Per tant, encara que es considera que A. marginale és l’espècie més important que afecta als bovins en zones on es troben diferents espècies d'anaplasmes (Hornok et al., 2007; Torina et al., 2008a i 2008b), no es poden descartar altres espècies. En el cas d’Anaplasma phagocytophilum, té com a vector Ixodes ricinus, que requereix unes condicions climatologia que només es troben al nord de Catalunya (Estrada-Peña, 2000). Anaplasma centrale resulta l’espècie menys patògena, però recentment s’ha descrit a Itàlia causant malaltia clínica en bovins (Carelli et al., 2008) i ha estat detectada en cérvols a la Rioja (Portillo et al., 2001). Alguns autors també suggereixen el paper de reservori dels cérvols en aquestes espècies d'anaplasmes (Portillo et al., 2001; de la Fuente et al., 2004a i 2004b).

121

En el cas de Babesia, la tècnica d'ELISA comercial utilitzada mostra segons el fabricant un 96% de sensibilitat i un 97,5% d’especificitat. Tot i així, la tècnica ha presentat 99 resultats dubtosos, que podrien ser deguts tant per títols no suficientment alts o per reaccions inespecífiques. Per tant, al no haver realitzat una prova de confirmació, caldria tenir en compte que a la Península Ibèrica han estat caracteritzades a nivell molecular altres babèsies a més de B. bigemina com són B. bovis, B. major, B. occultans i B. divergens (Navarrete et al., 2002; García-Sanmartín et al., 2006; Ros- García et al., 2012b) encara que com descriuen els autors, la seva distribució depèn de la presència de les paparres vectores.

Les coinfeccions entre hemoparàsits són freqüents (Cringoli et al., 2002; Torina et al., 2007a; Guedes et al., 2008; Salih et al., 2009; de Mendonça-Costa et al., 2013) i possiblement les diferències detectades en l'anàlisi estadístic més que significar un risc superior, estiguin relacionades a que els hemoparàsits comparteixen vectors.

En resum, les seroprevalences obtingudes en l'estudi reflecteixen que tant l'anaplasmosi com la babesiosi bovina es poden trobar distribuïdes al llarg del territori català, i que per tant, s'haurien de considerar a l'hora d'establir un diagnòstic diferencial i un control eficaç de vectors segons el sistema de cria i maneig dels animals per a cada explotació.

122

123

124

VI: REVISIÓ DE LA BESNOITIOSI BOVINA

125

126

1. Presentació general

1.1. Introducció

La besnoitiosi bovina és una malaltia parasitària causada per Besnoitia besnoiti, un protozou formador de quists tissulars.

Durant els últims anys, l’augment de casos clínics a Europa ha fet replantejar a les autoritats i els investigadors la importància de la malaltia i les mesures a establir-ne per al control. Els primers diagnòstics a França ja descrivien una malaltia principalment cutània que es va anar establint de manera endèmica al llarg dels anys. L’intercanvi d’animals subclínics, determinades mesures de maneig a l’explotació o l’activitat de determinats insectes són factors que probablement hagin afavorit la propagació arreu dels països intracomunitaris i la resta del món.

La primera descripció de besnoitiosi bovina a Espanya va ser per Juste et al. (1990) a Navarra i el País Basc. Des d’aquests vint-i-cinc anys, tot just en els últims deu anys s’inicia l’estudi i el seguiment de la malaltia arreu del país. Encara que en alguns punts no es té constància de la incidència de la malaltia, els estudis més recents confirmen també aquesta disseminació.

Generalment es tracta d’una malaltia cutània de curs crònic i baixa mortalitat, el que probablement ha fet que al llarg dels anys hagi estat una malaltia no gaire considerada. Però les pèrdues en produccions i fertilitat poden tenir unes conseqüències econòmiques importants per a les explotacions bovines en cas que apareguin brots de malaltia.

Un dels problemes de la malaltia és que quan s’ha instaurat a l’explotació no hi ha cap tractament completament eficaç, de manera que molts cops, els animals resten com a portadors i actuen com a propagadors del paràsit. Per tant, millorar en el coneixement de la malaltia així com en les mesures de control i prevenció, són mesures bàsiques per a evitar aquesta reemergència.

127

1.2. Història

Es creu que les primeres referències de la besnoitiosi bovina es troben a França, a finals del segle IV, quan Végèce descriu la fase crònica de la malaltia i l’anomena com a “Elefantiosi”.

A principis del segle XIX, Santin descriu l’evolució d’uns signes edematosos que podrien ser signes de queratitis i dermatitis furfuràcea en els bovins francesos afectats.

L’any 1840, els estudis de Gelle classificaven les lesions cròniques més greus com a elefantiosi lepròsica o tuberculosa.

Els estudis de Lafore (1843) permeten diferenciar una fase aguda i una crònica de la malaltia per primer cop a l’Escola Nacional Veterinària de Toulouse. Posteriorment, el mateix autor (1858) distingeix la fase inicial, d’estat i la fase declivi de la malaltia a partir de la qual evoluciona cap a la cronicitat o bé la mort de l’animal.

Cadéac, el 1884, descriu la malaltia com a “l’elefantiosi i anasarca dels bovins” del sud de França. Els seus estudis però, apuntaven cap a una etiologia bacteriana.

Finalment, van ser Besnoit i Robin (1912) els que aïllen el paràsit a partir de lesions cutànies, demostrant així l’agent causant de la malaltia. Els seus estudis revelen la presència de nombrosos quists de paret gruixuda, on s’engloben una gran quantitat d’espores, a la pell i els teixits subcutanis d’uns bovins afectats que provenien dels Pirineus. L’agent descrit es va classificar com a Sarcocystis sp. El mateix any, Marotel va anomenar el nou agent Sarcocystis besnoiti en honor als investigadors.

La primera descripció de la malaltia a la Península Ibèrica va ser l’any 1916, quan Franco i Borges van donar a conèixer que ja des del 1885 detectaven casos de canals bovines amb aspecte sorrenc en escorxadors de Portugal, a la regió d’Alentejo.

Cuillé, Chelle i Berlureau (1936) aconsegueixen transmetre la malaltia a bovins sans a través de la inoculació de la sang d’un boví en fase febril.

Hofmeyer (1945) va descriure per primer cop la besnoitiosi bovina al continent africà. Pols (1954), va estudiar la morfologia de l’agent etiològic per primer cop en la sang d’un animal i de quists en talls histològics. Bigalke (1962) va destacar la importància

128

dels quists oculars en el diagnòstic de la malaltia. Posteriorment, en un estudi experimental, el mateix autor aconsegueix la transmissió mecànica a través de vectors.

L’estudi de Peteshev et al. (1974) tanca experimentalment el cicle biològic del paràsit, establint el gat domèstic com a l’hoste definitiu que elimina els ooquists que seran infectius pels bovins, encara que posteriorment, cap altre estudi ho ha confirmat.

La primera descripció de la besnoitiosi bovina a Espanya es va realitzar per Juste et al. (1990) a Navarra i el País Basc, en animals que havien estat compartint pastures amb altres bovins provinents de França.

* Els estudis previs al 1970, són citats per Pols (1960), Legrand (2003) i/o Freudiger (2008)

1.3. Importància econòmica i sanitària

La importància econòmica de la besnoitiosi bovina està derivada de les pèrdues en les produccions i els problemes reproductius dels animals afectats. Els animals presenten pèrdua de pes i de la condició corporal, lesions cutànies que disminueixen el valor econòmic per a la producció de cuir, problemes reproductius com esterilitat transitòria/permanent en els mascles, avortaments o disminució de la producció lletera (Cortes et al., 2005; Olias et al., 2011; Álvarez-García et al., 2013).

La taxa de mortalitat sol estar situada a l’1%, tot i que en alguns casos pot superar el 10% (Jacquiet et al., 2010), amb una taxa de morbiditat superior al 80% en la mateixa explotació (Pols, 1960; Bigalke, 1968; EFSA, 2010).

Encara que l’impacte econòmic real de la malaltia no s’ha arribat a calcular, es considera que B. besnoiti pot causar un quadre clínic greu tant en la fase aguda com en la crònica (EFSA, 2010).

Fins a l’actualitat, no hi ha evidències que els paràsits del gènere Besnoitia siguin antropozoonòtics.

129

2. ETIOLOGIA

2.1. Classificació taxonòmica

El gènere Besnoitia es troba inclòs en el Phylum Apicomplexa, classe Coccidia, ordre Eucoccidiorida, família Sarcocystidae (NCBI, 2015).

Les anàlisi moleculars a partir de diferents subunitats del DNA ribosòmic (rDNA) i les regions ITS-1 (internal transcribed spacer-1) han mostrat que el gènere Besnoitia és monofilètic, formant un grup germà amb el clade on es troben altres gèneres de coccidis formadors de quists com Neospora, Toxoplasma i Hammondia (Ellis et al., 2000; Morrison et al., 2004).

Besnoitia akodoni Besnoitia darlingi Besnoitia oryctofelisi Besnoitia jellisoni

Besnoitia besnoiti Besnoitia bennetti Besnoitia tarandi

Figura 1. Arbre filogenètic de set espècies de Besnoitia segons l’anàlisi de l’ITS-1 (Adaptat de Dubey et al., 2004) on s'observen dos clades diferenciats. Resten B. caprae en el clade de grans ungulats i B. wallacei i B. neotomofelis en el d'altres animals.

130

Els estudis filogenètics dins el gènere Besnoitia han permès identificar deu espècies que s’han descrit en ungulats tant domèstics com silvestres, petits mamífers, marsupials i rèptils (figura 1). Les quatre espècies de Besnoitia de grans mamífers ungulats (taula 1) pertanyen a un clúster diferent de la resta d’espècies que afecten a petits mamífers i d'altres animals (Dubey et al., 2004; Jacquiet et al., 2010; Olias et al., 2011).

Taula 1. Espècies de Besnoitia descrites i hostes naturals identificats.

Espècie Hoste intermediari Hoste Localització definitiu Grans mamífers ungulats B. besnoiti Bovins - Europa, Àfrica, Israel, Kazakhstan, Corea del Sud, Veneçuela Nyus - Sud-àfrica Impales Cudús Búfals aquàtics Egipte 1 B. bennetti Cavalls - Sudan, França, Sud-àfrica Ases Sud-àfrica , Estats Units Mules Sud-àfrica Zebres Àfrica B. caprae Cabres domèstiques - Kènia, Iran, Nigèria 2,3 Cabres salvatges Iran B. tarandi Rens - Nord Amèrica, Europa, Àsia Caribús Nord Amèrica Cérvols muls Canadà Bous mesquers Canadà

Petits mamífers, marsupials i rèptils B. jellisoni Rosegadors - Estats Units, Sud-amèrica B. wallacei Rosegadors Gat Austràlia, Hawaii, Japó, domèstic Kènia B. darlingi Opòssums Gat Panamà, Estats Units domèstic Llangardaixos - Amèrica Central B. akodoni Rosegadors - Brasil B. neotomofelis Rosegadors Gat Estats Units domèstic B. oryctofelisi Conills Gat Argentina domèstic Modificat de Pols (1960) i Leighton i Gajadhar (2008); 1Ashmawy i Abu-Akkada (2014); 2Oryan i Azizi (2008), 3Oryan et al. (2014).

131

2.2. Besnoitia spp. en grans ungulats

2.2.1. Besnoitia besnoiti

Antigament havia rebut diferent nomenclatura com Sarcocystis besnoiti, Gastrocystis besnoiti, Globidium besnoiti o Isospora besnoiti.

Es considera que B. besnoiti pot afectar a tots els bovins en general. Tanmateix, s'han descrit diferències en els bovins domèstics i silvestres en relació a la virulència i el tropisme dels paràsits, suggerint que podrien formar part d'espècies diferents (Bigalke, 1968).

En els bovins silvestres, B. besnoiti ha estat descrita a l’Àfrica del Sud en cuduns (Tragelaphus strepsiceros), el nyu blau (Connochaetes taurinus) i en impales (Aepyceros melampus) (McCully et al., 1966).

Bigalke (1968) no va trobar diferències morfològiques ni immunològiques entre els aïllats de bovins, nyus i impales. L'estudi molecular d'Ellis et al. (2000) tampoc va trobar diferències entre les regions ITS-1 del rDNA de diferents aïllats de bovins i nyus. Per contra, a l'estudi de Le Blancq et al. (1986) van observar dues soques diferents per l'electroforesi de vuit enzims procedents de dos aïllats diferents (citat per Jacquiet et al., 2012).

De fet, s'han descrit diferències en bovins silvestres i domèstics en relació a la virulència i el tropisme dels paràsits aïllats, suggerint que podrien formar part d'espècies diferents (Bigalke, 1968). Les infeccions experimentals dels diferents aïllats de B. besnoiti acostumen a mostrar una virulència diferent quan s'inoculen a altres animals. Per exemple, l'aïllat que causa malaltia en antílops no desenvolupa quists a bovins ni a ovins (Bigalke, 1967 i 1968), a diferència de l'aïllat de boví, pot causar malaltia clínica i formació de quists en cabres, ovelles, nyus, conills i rosegadors (Pols, 1960; Bigalke, 1968). Pel que fa al tropisme, en el cas dels aïllats bovins, B. besnoiti sembla mostrar un major dermatotropisme mentre que l'aïllat de nyu mostra una tendència a parasitar les vísceres i alhora ser menys patògena (Bigalke, 1968).

132

2.2.2. Besnoitia tarandi

Va ser descrita per primer cop a Alaska per Hadwen (1922) en rens (Rangifer tarandus) com a Fibrocystis tarandi (segons Dubey et al., 2004). També ha estat descrita a la resta de la zona holàrtica del Canadà, Finlàndia, Suècia i Rússia (Olias et al., 2011). A la zona canadenca la besnoitiosi per B.tarandi està considerada una malaltia emergent (Kutz et al., 2012).

A més del ren europeu i l'americà (o caribú), també sembla poder afectar al cérvol mul (Odocoileus hemionus) i el bou mesquer (Ovibos moschatus) (Dubey et al., 2004).

Estudis comparatius semblen demostrar que B. tarandi és una espècie diferent de B. besnoiti. B. tarandi presenta diferències morfològiques únicament a nivell ultraesructural. En referència a la distribució, es considera que la besnoitiosi bovina no està present en zones de besnoitiosi en rens (Lewis, 1989). Biològicament, alguns rosegadors i lagomorfs són resistents a la infecció per B. tarandi però no a B. besnoiti (Dubey et al., 2003a i 2004).

L'estudi molecular d'Olias et al. (2011) però, no va trobar evidències genètiques suficients per considerar-les com a espècies diferents. Tot i això, la majoria d'autors coincideixen en que es necessiten més estudis i marcadors genètics per tal d'acabar de discernir si són espècies diferents o no.

Gutiérrez-Expósito et al. (2012) va observar reaccions serològiques creuades entre B. besnoiti i B.tarandi en remugants silvestres al Canadà. García-Lunar et al. (2014) van detectar diferències proteòmiques entre les dues espècies però no antígens espècie- específics, suggerint que podrien compartir un perfil antigènic que fos el responsable de les reaccions creuades observades.

La malaltia clínica que causa B. tarandi així com la localització tissular de les lesions, són molt similars a la malaltia bovina (Ducrocq et al., 2012).

133

2.2.3. Besnoitia caprae

S’ha descrit en cabres domèstiques i silvestres (Capra aegagrus) (Leighton i Gajadhar 2008).

Els estudis moleculars d’Ellis et al. (2000) suggerien que B. besnoiti i B.caprae no eren espècies diferents, ja que la regió ITS-1 del rDNA era similar entre elles. Dubey et al. tampoc no va observar diferències ultraestructurals entre totes dues espècies (Dubey et al., 2003a). Tanmateix, tot i la similitud en la seqüència de l'ITS-1, Namazi et al. (2011) va observar que la regió ITS-2 rDNA no coincidia totalment, el que podria justificar que fossin espècies diferents. A més, altres autors també van descriure diferències a nivell ultraestructural (Oryan i Azizzi, 2008; Oryan et al., 2014).

Pel que fa a les infeccions experimentals, els aïllats de B. caprae de Kenya no van ser infectius per a rosegadors, lagomorfs, èquids, bovins ni ovins (Bwangamoi et al., 1989; Ng'ang'a i Kasigazi, 1994b; Oryan et al., 2014) el que sembla diferenciar aquesta espècie de B. besnoiti. En l'estudi d'Oryan et al. (2010) però, un aïllat iranià sí que va resultar infectiu per a ratolins.

La besnoitiosi caprina està considerada enzoòtica a Kenya i l’Iran, excepcionalment també s’ha descrit un cas a Nigèria (Oryan et al., 2014). En zones d'Israel, el Kazakhstan o l'Uzbekistan també s’hi han descrit casos (Olias et al., 2011).

2.2.4. Besnoitia bennetti

Es va descriure per primer cop a França per Henry i Masson (1922). El 1927 va ser descrita per Going i Bennett al Sudan (citat per Pols, 1960).

És l'espècie causant de la besnoitiosi que afecta a cavalls, rucs i mules alhora que a zebres (Equus quagga).

Segons Pols (1960) i Bigalke (1968), estudis experimentals van demostrar una transmissió efectiva entre èquids de les soques sud-africanes. Però aquests aïllats no van resultar infectius per a bovins, rosegadors ni lagomorfs. Els aïllats dels Estats Units

134

utilitzats experimentalment, tampoc van resultar infectius per a ratolins o conills (Dubey et al., 2005).

Diversos estudis reflecteixen diferències moleculars suficients que fan suggerir que B. bennetti constitueix una espècie diferent de les altres (Leighton i Gajadhar, 2008) encara que les lesions tissulars són molt similars a les descrites en els bovins (Ness et al., 2012).

La besnoitiosi equina es troba bàsicament a l’Àfrica afectant a cavalls. Als Estats Units només ha estat descrita en rucs (Terrell i Stookey, 1973; Davis et al., 1997), i al continent europeu, tret de la primera publicació a França, no s'han descrit nous casos sobre la presència de la malaltia.

A més de les espècies de Besnoitia pròpies d’ungulats domèstics esmentades, s'ha detectat la presència d’anticossos enfront al paràsit en altres hostes ungulats, sense arribar a identificar l'espècie. En un estudi serològic, Gutiérrez-Expósito et al. (2012) va detectar anticossos a Besnoitia spp. en bisons (Bison bison) al Canadà. A Espanya, la presència de Besnoitia spp. s’ha detectat en un cérvol (Cervus elaphus) i un cabirol (Capreolus capreolus) a través de les tècniques immunològiques de referència (Gutiérrez-Expósito et al., 2013). A Egipte també s'ha detectat seropositivitat en el búfal aquàtic (Bubalus bubalis) (Ashmawy i Abu-Akkada, 2014).

En relació a la besnoitiosi clínica, els quadres cutanis han estat descrits en camells (Camelus dromedarius) a Kenya, en iacs (Bos mutus) a la regió del Tibet (Olias et al., 2011) i en un duiquer blau (Philantomba monticola) en captivitat als Estats Units (Foley et al., 1990).

135

2.3. Morfologia

2.3.1. Ooquists

Els ooquists són les fases de resistència que s’eliminen en les femtes de l’hoste definitiu. Els ooquists de B. besnoiti són el·lipsoïdals, d’entre 14-16 x 12-14 µm, i similars a altres de coccidis de la subfamília Toxoplasmatinae com Hammondia o Toxoplasma (Euzeby, 1987). No presenten micròpil i l'esporont de l'interior té un aspecte lleugerament granular i de color marronós. La seva esporulació és exògena. Un cop esporulen, presenten dos esporocists el·líptics amb quatre esporozoïts al seu interior.

Des de la primera descripció feta per Peteshev et al. (1974), els ooquists de B. besnoiti no s'han tornat a identificar en cap altre hoste.

2.3.2. Taquizoïts

Són les fases de multiplicació ràpida característiques de la fase aguda de la malaltia en l’hoste intermediari. Es multipliquen a l’endoteli vascular on es poden trobar en agrupacions anomenades pseudoquists.

Presenten una forma corbada i mesuren entre 5-9 x 2-5 µm (Kreier 1993). Pols (1960) en descriu dues morfologies, una forma ovalada amb un extrem lleugerament més punxegut que detecta en sang, i una forma més corbada com de 'plàtan' que es troba en els teixits.

Segons Basson et al. (1970) els taquizoïts es poden trobar circulant lliures pel torrent sanguini o bé fagocitats per algunes cèl·lules mononuclears. Schares et al. (2009) va descriure taquizoïts a l’interior de monòcits, macròfags i neutròfils.

136

2.3.3. Bradizoïts

Corresponen a la fase de multiplicació lenta en els teixits de l'hoste intermediari. Els bradizoïts de B. besnoiti es troben principalment en histiòcits i fibroblasts dins vacúols parasitòfors.

Mantenen la forma corbada de 'plàtan' característica i mesuren entre 6-7,5 x 1,9-2,3 m (Dubey et al., 2003a). A nivell ultraestructural s'identifiquen grànuls d'amilopectina que fa que siguin positius a la tinció de PAS, el que permet diferenciar-los dels taquizoïts (Dubey et al., 2003a, 2013).

En els bradizoïts d’algunes espècies de Besnoitia s'ha descrit la presència d’uns orgànuls anomenats 'cossos enigmàtics', que no es troben presents en altres coccidis de la família Sarcocytidae com Toxoplasma gondii (Dubey et al., 2003a). Aquests 'cossos enigmàtics' són estructures unides a la membrana, fusiformes i amb un nucli electrodens. S’han descrit en B.darlingi, B.tarandi i B.oryctofelisi (Dubey et al., 2002; Dubey i Lindsay, 2003b) mentre que no es troben presents en els bradizoïts de B. besnoiti, B.caprae ni B.bennetti (Dubey et al., 2003a).

2.3.4. Quist de Besnoitia

Els quists corresponen a l'estat de resistència del paràsit. En el cas de Besnoitia, engloben la cèl·lula hoste i els bradizoïts. Aquests quists poden arribar a mesurar fins a 1,5 mm, el que permet visualitzar-los fins i tot a ull nu, encara que generalment tenen una grandària entre 100-600 µm. Una altra característica dels quists de Besnoitia spp. és que tenen una paret quística de fins a 20 m de gruix. Això fa que tant estructuralment com morfològicament siguin diferents a altres paràsits de la mateixa família Sarcocystidae (Frenkel i Smith, 2003; Dubey et al., 2003a i 2013).

En totes les espècies de Besnoitia, els quists presenten una alta afinitat per la superfície de la dermis, mucoses i seroses. Dubey et al. (2013) va descriure la formació d’aquests quists principalment en cèl·lules com fibroblasts i histiòcits, tot i que també s’han trobat en miofibroblasts, cèl·lules endotelials o cèl·lules musculars llises.

137

En la morfologia dels quists s'identifiquen tres capes ben diferenciades (Figura 2):

1. La capa més externa correspon a la paret quística i hialina que engloba la cèl·lula hoste. Mesura entre 10-20 m de gruix. Prové de la reacció adventícia del teixit de l’hoste i està formada de filaments concèntrics longitudinals sense orgànuls diferenciables embolcallant tota la cèl·lula parasitada (Dubey i Lindsay, 2003b).

2. La capa intermèdia del quist correspon a la membrana cel·lular junt amb el citoplasma de la cèl·lula hoste. En aquesta capa s'observen diversos nuclis hipertrofiats i unes projeccions similars a pseudopodis que es dirigeixen cap a la capa més externa.

3. La capa més interna del quist correspon a la membrana del vacúol parasitòfor. Mesura aproximadament uns 0,2 µm de gruix. Dins d'aquest vacúol parasitòfor de la cèl·lula hoste es troben els bradizoïts multiplicant-se.

Figura 2. Desenvolupament de la fase quística de B. besnoiti. Adaptat de Bussiéras i Chermette (1992).

138

La infecció de la cèl·lula hoste per part del bradizoït indueix la hipertròfia i hiperplàsia d’aquesta cèl·lula, transformant-se generalment en una cèl·lula multinucleada. A diferència del bradizoït, el taquizoït no sembla induir la hipertròfia nuclear (Dubey et al., 2003b).

Un cop es forma el quist madur (vegeu taula 3 més endavant), els nuclis de la cèl·lula parasitada s’observen comprimits a la perifèria del citoplasma cel·lular degut al creixement de la massa de bradizoïts i la formació de la capa quística.

2.4. Cicle biològic

2.4.1. Hoste definitiu

L’hoste definitiu de B. besnoiti es desconeix.

L’estudi de Peteshev et al. (1974) al Kazakhstan, suggeria que tant el gat domèstic com el gat salvatge (Felis libyca) actuaven com a hostes definitius de B. besnoiti ja que eliminaven ooquists via femta quan s’alimentaven de teixits parasitats. El gat desenvolupa la fase sexual per a les espècies de Besnoitia amb cicle conegut, actuant de la mateixa manera que quan és infectat per altres paràsits de la família Sarcocystidae.

D’altra banda, Rommel et al. (1975) també va suggerir al gos com a hoste definitiu (citat per Olias et al., 2011).

Amb l’objectiu de descriure potencials hostes definitius, Diesing et al. (1988) van alimentar un ampli ventall de carnívors domèstics i salvatges, serps i voltors amb teixits de bovins infectats sense demostrar l’eliminació d’ooquists en cap cas.

Els estudis de Basso et al. (2011) tampoc van confirmar cap hoste definitiu. Tot i així, va suggerir que el gat podria ser susceptible a la infecció atès que va detectar seroconversió posterior a la ingestió de teixit infectat.

139

Estudis de seroprevalença portats a terme a França i Espanya no van trobar evidències d’anticossos específics enfront Besnoitia spp. en diverses espècies de carnívors silvestres (Berhault, 2008; Millán et al., 2012).

La impossibilitat de reproduir la fase intestinal en cap dels hostes estudiats fa que a dia d'avui no s'hagi confirmat l’hoste definitiu, i en conseqüència, tampoc el cicle biològic de B. besnoiti.

2.4.2. Hoste intermediari

Els bovins són els hostes intermediaris de B. besnoiti. Tanmateix, el paper d'altres espècies animals no es descarta, ja sigui per que no es coneix completament el cicle com per que a dia d’avui encara hi ha interrogants pel que fa a la identificació nivell molecular de les diferents espècies de Besnoitia que afecten als ungulats.

Gutiérrez-Expósito et al., (2013) van detectar quists de Besnoitia spp. en remugants silvestres i van considerar que podrien actuar com a reservoris.

Altres autors també suggereixen que els remugants silvestres o petits rosegadors poden tenir un rol encara desconegut en el cicle del paràsit (Mehlhorn et al., 2009; Castillo et al., 2009; Álvarez-García et al., 2013).

Una altre hipòtesi seria considerar que els ungulats domèstics poden actuar com a hostes accidentals dins d’un cicle pròpiament silvestre entre rosegadors i depredadors (Kiehl et al., 2010; Basso et al., 2011; Olias et al., 2011). Aquest cicle ja està descrit a la branca d'espècies de Besnoitia que afecten a petits mamífers, marsupials i rèptils. Però per ara, no hi ha evidències que aquestes espècies puguin ser infectives en bovins. En aquest sentit, cal fer referència a l'estudi de Ng'ang'a et al. (1994a) que no va demostrar infecció en bovins que havien ingerit ooquists esporulats de B.wallacei.

Algunes espècies de rosegadors han mostrat susceptibilitat a infeccions experimentals amb B. besnoiti, encara que només els conills havien mostrat seroconversió i alhora formació de quists (Pols, 1960; Bigalke, 1968; Shkap et al., 1987). Recentment però, l’estudi experimental de Basso et al. (2011) va detectar una espècie de talp (Microtus

140

arvalis) que va seroconvertir i es va poder demostrar molecularment la presència del paràsit en teixits.

Pel que fa a infeccions naturals, només han estat descrits quists de Besnoitia spp. en conills en àrees de besnoitiosi bovina a Kenya (Mbuthia et al., 1993) o bé en ratolins silvestres al nord de Rússia en un focus de besnoitiosi en rens (Nikolaevskii, 1968, citat per Olias et al., 2011).

2.4.3. Descripció del cicle biològic

Es considera que el cicle és de tipus coccidià heteroxè. En el que s’inclouen fases intestinals a l’hoste definitiu (esquizogònia i gametogònia), l’esporogònia exògena i fases tissulars a l’hoste intermediari.

A l’hoste intermediari, els esporozoïts són alliberats dels ooquists a la llum intestinal, envaeixen les cèl·lules endotelials dels vasos sanguinis i inicien la fase proliferativa. En aquesta localització, el paràsit es multiplica ràpidament per endodiogènia, agrupant-se en pseudoquists. La multiplicació intracel·lular dels taquizoïts provoca la lisi de la cèl·lula hoste i l’alliberació d’aquests al torrent sanguini on poden trobar-se durant 4-8 dies. Durant aquesta fase de parasitèmia, els taquizoïts es propaguen per l’organisme, envaint i lisant les cèl·lules endotelials dels capil·lars dels nòduls limfàtics, mucoses o pell. Per un procés encara desconegut, els taquizoïts penetren dins de les cèl·lules del teixit connectiu i es transformen en bradizoïts.

Per tal de continuar amb la descripció dels estadis durant el cicle biològic, es posa com a exemple el cas conegut de B.oryctofelisi. Quan el teixit parasitat és ingerit, els bradizoïts de l’interior dels quists s’alliberen a la llum intestinal i infecten les cèl·lules epitelials de la làmina pròpia de l’intestí prim. En aquest punt s’inicia la fase de reproducció asexual o esquizogònia. La cèl·lula hoste hipertròfia el seu nucli, l'esquizont es forma dins un vacúol parasitòfor i els merozoïts es multipliquen per endopoligènia. Els esquizonts es desenvolupen a diferents localitzacions segons l'espècie de Besnoitia (Dubey et al., 2003a). En el cas de B. wallacei es formen a l'ili mentre que en B.darlingi i B.oryctofelisi es desenvolupen en el jejú. Posteriorment, els

141

merozoïts són alliberats de nou a la llum intestinal, infecten novament les cèl·lules epitelials i desenvolupen la fase de reproducció sexual o gametogònia. S'inicia llavors la formació dels microgametòcits i macrogametòcits, que donaran lloc als microgamets i macrogamets respectivament. Un cop el microgamet fecunda el macrogamet es forma el zigot que acabarà formant l’ooquist. En 6-8 dies l'ooquist és eliminat en femtes al medi ambient sense esporular. L’esporogònia exògena es completa en 2-4 dies i forma dos esporocists dins l’ooquist, on cadascú conté els quatre esporozoïts infectius. La ingestió de l’ooquist esporulat per part d'un boví permet que a nivell de la llum intestinal, s’alliberin dels esporozoïts. Aquests envaeixen les cèl·lules endotelials dels vasos sanguinis iniciant la fase de taquizoït.

En aquelles espècies de Besnoitia on es coneix el cicle complet, com B. oryctofelisi, la transmissió es dóna per la ingestió dels quists tissulars per part del gat que actua com a hoste definitiu. En el cas de B. besnoiti, aquesta via es considera poc probable (Pols, 1960; Bigalke, 1968) ja que no s’ha descrit l'evolució del paràsit en cap hoste definitiu. Segons Frey et al. (2013) i Álvarez-García et al. (2013), la transmissió entre hostes intermediaris seria considerada la més important per a la disseminació del paràsit. Especialment la transmissió mecànica de bradizoïts d'un animal parasitat a un altre causant la infecció a través de les mucoses (Bigalke, 1968), on el contacte directe o els dípters hematòfags podrien tenir un rol destacat.

3. Distribució geogràfica

A Europa, la presència de B. besnoiti va estar restringida durant dècades a determinades zones de França, Portugal i Espanya. Recentment però, la besnoitiosi està considerada com una malaltia emergent a nivell europeu (EFSA, 2010) degut a l’augment del nombre de casos i la disseminació geogràfica com es descriu a continuació.

Els primers casos a Itàlia es van originar a partir d’animals importats de França, encara que en els últims anys ja han aparegut nombrosos casos en diverses explotacions arreu del país (Gottstein et al., 2009, citat per EFSA, 2010; Gollnick et al., 2010; Manualli et

142

al., 2011; Mutinelli et al., 2011; Gentile et al., 2012; Rinaldi et al., 2013). A Hongria el primer brot també es considera que va ser degut a la importació d’animals portadors provinents de França (Hornok et al., 2014). Els casos d’Alemanya van aparèixer en animals aparentment no importats (Mehlhorn et al., 2009; Rostaher et al., 2009; Schares et al., 2009). Altres estudis recents han descrit casos de besnoitiosi bovina a Suïssa i Croàcia (Basso et al., 2013; Álvarez-García et al., 2014a). I tot i que no va ser confirmat, a la frontera francesa amb Bèlgica també es va detectar un cas (Jacquiet segons EFSA, 2010).

En països europeus considerats enzoòtics, també han anat augmentant el nombre de casos diagnosticats. En el cas de França, s’han descrit nous casos a la zona del Massís Central i dels Alps francesos possiblement per la introducció de bovins provinents de les regions del sud (EFSA, 2010; Jacquiet et al., 2010). Brots recents han aparegut també al sud de Portugal degut probablement a l’adquisició de nous animals (Cortes et al., 2006b).

A Espanya, el primer cas publicat es va donar en bovins que pasturaven en terrenys compartits amb bovins francesos (Juste et al., 1990). A partir d’aquí, la prevalença de la besnoitiosi bovina sembla que ha anat en augment (figura 3), especialment en les zones endèmiques com Navarra (Irigoien et al., 2000; Zacarias, 2009 segons EFSA, 2010), País Basc (Castillo et al., 2009) i l'Aragó (Gutiérrez-Expósito et al., 2014). I s’ha estès a noves àrees properes com Castella i Lleó, Cantàbria, Comunitat Valenciana i la Rioja (Castillo et al., 2009), Castella la Manxa (Fernández-García et al., 2010), Extremadura i Andalusia (Calero-Bernal et al., 2014).

A Catalunya només hi ha publicat un cas de Besnoitia spp. en un cérvol i un altre en un cabirol procedent de la província de Lleida (Gutiérrez-Expósito et al., 2013). Tot i no haver-hi altres dades publicades, es considera que la malaltia es troba present degut a casos descrits esporàdicament (García de Jalón et al., 1995; Vidal et al., 2014).

143

Figura 3. Mapa de distribució dels casos de besnoitiosi bovina a la Península Ibèrica.

Els punts negres indiquen els casos descrits abans de 1990. Punts taronges des de 1991 fins l'actualitat. Font: Juste et al. (1990), García de Jalón et al. (1995), Cortés et al. (2006b), Castillo et al. (2009), Fernández-García et al. (2011), Álvarez-García et al. (2013), Álvarez-García et al. (2014a), Álvarez-García et al. (2014b), Calero-Bernal et al. (2014), Gutiérrez-Expósito et al. (2014).

En general, els nous casos apareguts a nivell europeu es donen a zones limítrofes amb països afectats i semblen estar derivats de les pràctiques d’intercanvi o de maneig dels animals.

Arreu del món, la besnoitiosi bovina també sembla anar en expansió actualment.

Des de les primeres descripcions, la presència de B. besnoiti s'ha propagat àmpliament pel continent africà. Ha estat detectada a Botswana, Swazilàndia, Sud-àfrica, Zimbabwe, Angola i Namíbia, R. D. del Congo, Camerun, Nigèria, Kenya, Tanzània, Uganda i Sudan (Provost, 1975; Njagi et al., 1998; Sambo et al., 2014). Recentment s’ha descrit a Egipte (Ashmawy i Abu-Akkada, 2014).

144

Es creu que la malaltia es manté a l’Orient Mitjà, a Israel i el Kazakhstan, així com en d'altres països del continent asiàtic com la República Xina i Corea del Sud (EFSA, 2010). Al continent americà únicament s'ha descrit a l’Amèrica del Sud, concretament a Veneçuela i el Brasil (Uzêda et al., 2014).

4. Epidemiologia

4.1. Prevalença

La manca d'estudis epidemiològics fa que en molts casos, la incidència i prevalença de la malaltia en zones endèmiques sigui encara desconeguda. Això comporta que les implicacions reals de la malaltia per a la salut i el benestar animal a Europa encara es desconeguin (EFSA, 2010).

En àrees enzoòtiques de besnoitiosi, la incidència clínica a l’any sol estar entre 1-10%, tot i que la seroprevalença es troba al voltant del 50% (Neuman, 1972; Goldman i Pipano, 1983). En canvi, en explotacions en zones emergents la incidència pot augmentar fins al 15-40%, amb un 80% de seroprevalença (Schares et al., 2009; Fernández-García et al., 2010).

La majoria d’estudis constaten que els animals es mantenen com a seropositius, amb una parasitació subclínica (Cortes et al., 2005; Fernández-García et al., 2010; Schares et al., 2010; García-Lunar et al., 2013a). Encara que Schares et al. (2010), van descriure casos d’animals on tot i presentar signes clínics es mantenien serològicament negatius.

A la taula 2 es resumeixen els principals estudis epidemiològics publicats.

145

Taula 2. Prevalences de besnoitiosi bovina (%) segons la tècnica diagnòstica utilitzada.

Localització ELISA IFI WB Quists EC Referència Austràlia 18,4 0 0 - Nasir et al., 2012 Brasil - 3,48 0 - Uzêda et al., 2014 Corea del Sud - - - 6 Lee et al., 1970 Espanya 44,5 48,6 - - Zacarias, 2009* (Navarra) Espanya 16 - - - Álvarez-García et al., (Navarra) 2014b Espanya (Castella- 90,5 - - 31,6 Fernández-García et la Manxa) al., 2010 Espanya (Castella- 63,7 - - - García-Lunar et al., la Manxa) 2011 Espanya (Osca) 49,2 - 52,3 - - - Gutiérrez-Expósito et al., 2014 França - - 29,8 - 89,5 8,8 - 22,8 Liénard et al., 2011 Israel - 56,3 - - Neuman, 1972 Israel - 50 - - Goldman i Pipano, 1983 Itàlia - 41,2 - Gollnick et al., 2010 Itàlia - 9,7 - Gentile et al., 2012 Itàlia 44,1 - - - Rinaldi et al., 2013 Nigèria - - 80,3 - Sambo et al., 2014 Portugal 36 – 70 - Cortes et al., 2006* Sud-àfrica - - - 8,5 Bigalke, 1968 Suïssa 13,2 2,1 0,01 0,001 Basso et al., 2013 ELISA: Enzyme Linked ImmunoSorbant Assay. IFI: Immunofluorescència indirecte. WB: Western Blot. Quist EC: quist escleroconjuntival. *segons EFSA (2010).

En els últims anys però, les dades de l'Estat espanyol reflecteixen la propagació de la malaltia arreu del territori com s'ha vist anteriorment (figura 3). La disseminació de la malaltia fora dels focus enzoòtics ha comportat l'aparició de brots epidèmics de besnoitiosi bovina com mostren els estudis de Fernández-García et al. (2010). Gràcies als recents estudis epidemiològics en les mateixes zones (taula 2), s'observa com la malaltia es va instaurant en algunes zones. Per exemple, el valor proper al 90% de seroprevalença establert durant l’aparició de brots clínics (Fernández-García et al., 2010), tendeix a disminuir en els estudis següents (García-Lunar et al., 2011).

146

4.2. Transmissió

La transmissió entre hostes intermediaris és la via de disseminació més important. A dia d'avui, la única via de transmissió coneguda per B. besnoiti és la transmissió horitzontal mecànica. Tant els taquizoïts com els bradizoïts s'han demostrat com estadis infectants per als bovins quan són inoculats via intravenosa o subcutània (Pols, 1960; Bigalke, 1968; Diesing et al., 1988; Basso et al., 2011).

Les vies més probables per a aquest tipus de transmissió són les que es comenten a continuació:

4.2.1. Contacte directe

Els estudis de Bigalke (1968) van demostrar que els bradizoïts eren capaços de penetrar les mucoses i arribar al torrent sanguini. Degut a això, es considera que el trencament dels quists subcutanis permetria l'alliberació dels bradizoïts i la seva transmissió per contacte a través de mucoses per ferides o microlesions (Gentile et al., 2012; Álvarez-García et al., 2013).

Es poden considerar situacions de risc la introducció d’animals portadors a l’explotació, la munta natural, compartir les pastures entre animals de diferents explotacions en extensiu o semi-extensiu (Juste et al., 1990) o fins i tot amb remugants silvestres (Gutiérrez-Expósito et al., 2013).

4.2.2. Vehiculació per dípters hematòfags

Una altra de les vies és a través de la inoculació de taquizoïts i/o bradizoïts per mitjà de dípters hematòfags, el que podria explicar l’estacionalitat en l’aparició dels signes clínics i la transmissió en distàncies curtes.

Bigalke (1968) va demostrar experimentalment que era possible la transmissió mecànica del paràsit entre bovins. Resumidament, va exposar bovins afectats en diferents estadis de la malaltia a diferents espècies de dípters hematòfags per avaluar la seva capacitat de transmissió a conills i bovins susceptibles. Entre els dípters estudiats va incloure tàvecs (Tabanocella denticornis, Atylotus nigromaculatus,

147

Haematopota albihirta i altres Tabanus sp.), la mosca tsé-tsé (Glossina brevipalpis), la mosca d’estable (Stomoxys calcitrans) i alguns mosquits (Culex sp. o Aedes sp.). En tots els casos, la transmissió de bradizoïts va resultar més efectiva que en el cas dels taquizoïts per a l’establiment de la infecció. Tot i això, l’autor va considerar que malgrat poder jugar un paper en l’epidemiologia de la malaltia, no devia ser la via principal ja que la majoria d’animals van manifestar infeccions lleus o subclíniques. Més recentment, Liénard et al., (2013) també va realitzar un estudi experimental per tal de discernir el paper de S. calcitrans. Primerament, alimentant les mosques en una sang enriquida amb taquizoïts cultivats in vitro per observar la capacitat de transmissió cap a altres cultius. I en l'altre part de l'estudi, detectant tant immunològicament com molecularment la presència del paràsit en diferents parts de l'aparell digestiu de les mosques que havien estat alimentades sobre bovins infectats crònicament. En tots dos casos la transmissió mecànica del dípter va ser efectiva.

4.2.3. Altres vies

Bigalke (1968) va considerar possible la transmissió iatrogènica tant de taquizoïts com de bradizoïts, però poc probable, degut a la baixa resistència del paràsit a l'exterior. Tanmateix, l'extracció de sang diària en l'estudi de Gollnick et al. (2012) es va considerar com una via significativa d'haver transmès el paràsit entre els animals estudiats.

No s'ha demostrat tampoc transmissió sexual a través de semen de toros crònicament parasitats (Bigalke, 1968; Kumi-Diaka et al., 1981; Esteban-Gil et al., 2014). Es considera que en la munta natural la transmissió de bradizoïts es dóna per microlesions.

Frey et al. (2013) consideren que la via vertical, de la mare al fetus, és poc probable. En l’estudi els autors únicament van detectar els quists de Besnoitia des del vestíbul fins a la vagina, i que per tant seria poc probable el contacte amb el fetus.

Fins a l'actualitat, cap estudi publicat ha suggerit el pas de taquizoïts per la via transplacentària.

148

4.2.4. El paper d’altres hostes en la transmissió

El paper de l'hoste definitiu en la transmissió de Besnoitia podria no ser tan important com es pensava. Prova d'això és la important expansió de B. besnoiti o B. tarandi com s'ha comentat anteriorment. Però en aquelles espècies de Besnoitia on sí que ha estat identificat el gat com a hoste definitiu, el seu rol com a propagador del paràsit també podria ser secundari. L'estudi de Dubey et al. (2002) amb B. darlingi proposa aquesta hipòtesi. Diversos gats van ser alimentats amb teixits parasitats però únicament dos animals van eliminar ooquists en femtes en molt baixa concentració. Aquest fet va fer reconsiderar a l'autor l’existència d’altres vies de transmissió en les que no està involucrat l'hoste definitiu.

4.3. Factors relacionats amb l’hoste i el maneig dels animals

4.3.1. Raça

Totes les races semblen ser susceptibles a la besnoitiosi ja que s’han descrit casos tant en bovins de races lleteres com càrnies (Jacquiet et al., 2010; Loste et al., 2011). En alguns estudis s’observa una prevalença superior en races de carn, en zones tradicionalment endèmiques com Israel (Goldman i Pipano, 1983) i també en zones considerades emergents com dins del territori espanyol (Fernández-García et al., 2012; Álvarez-García et al., 2014a).

Tot i aquests resultats, diversos autors suggereixen que aquesta prevalença està relacionada amb els factors ambientals i de maneig en animals d’aptitud càrnia més que no pas amb la raça pròpiament (Castillo et al., 2009; Álvarez-García et al., 2013).

4.3.2. Edat

Els bovins de totes les edats són receptius a la malaltia, tot i que rarament apareix en vedells menors de 6 mesos degut a l’efecte protector dels anticossos calostrals, tal i com van demostrar els estudis de Janitschke et al. (1984) i Shkap et al. (1994). L’edat

149

on sol ser més freqüent l’aparició de signes clínics és en individus entre els 2 i els 4 anys (Legrand, 2003; Freudiger, 2008).

També s’observa una relació directa entre la seroprevalença i l’edat, de manera que els títols d’anticossos augmenten amb l’edat de l’animal. De fet, es considera que és la conseqüència d’una major probabilitat d’entrar en contacte amb el patogen (Goldman i Pipano, 1983; Fernández-García et al., 2010; Liénard et al., 2011; Álvarez-García et al., 2014b, Gutiérrez-Expósito et al., 2014).

4.3.3. Sexe

Els dos sexes semblen ser receptius per igual. En alguns estudis però, es considera que els mascles podrien ser més susceptibles, amb lesions més greus que les femelles i presentant una mortalitat superior (Legrand, 2003; Freudiger, 2008; Jacquiet et al., 2010).

Tot i això, els estudis epidemiològics més recents no troben una relació significativa i no es sol considerar com a factor de risc dins l’explotació (Álvarez-García et al., 2014b; Gutiérrez-Expósito et al., 2014).

4.3.4. Estacionalitat

En la majoria dels brots europeus s’ha detectat un patró estacional, on l’emergència de la malaltia es relaciona amb el període càlid de l’any (Legrand, 2003; Gollnick et al., 2010; Gentile et al., 2012; Álvarez-García et al., 2014a).

L’estudi de Legrand (2003) a través d’enquestes epidemiològiques al sud de França durant els anys 1995-1998, va mostrar que el 80-90% dels casos es concentraven a l’estiu. Estudis desenvolupats a Sud-àfrica i a Israel, també reflectien que la majoria de nous casos apareixien durant els mesos més calorosos i humits de l’any (Bigalke i Prozesky, 2004).

150

No obstant, Freudiger (2008) en una regió epizoòtica dels Alps francesos durant tres anys, va mostrar que els casos clínics s’agrupaven entre març i octubre però disminuïen durant l’estiu. Segons l’autor, aquesta dada podria estar relacionada amb l’augment de temperatura durant aquells períodes estivals, que podria haver alterat l’activitat dels insectes vectors.

Es considera, que aquesta estacionalitat pot estar relacionada amb altres factors implícits del sistema de cria i de les dinàmiques poblacionals dels insectes picadors. Així doncs, en la cria en extensiu, els animals poden compartir pastures de muntanya entre explotacions diferents fet que facilita el contacte directe dels animals (Fernández-García et al., 2009a; Gollnick et al., 2010; Fernández-García et al., 2012; Gutiérrez-Expósito et al., 2013). I és també durant els períodes càlids de l’any quan es presenta una alta activitat dels insectes hematòfags que podrien actuar com a vectors (Fernández-García et al., 2010; Álvarez-García et al., 2013; Baldacchino et al., 2014).

4.3.5. Munta natural

Els quists de B. besnoiti poden estar presents superficialment a les mucoses tant de la vagina o del vestíbul vaginal, com de la mucosa del penis en els toros parasitats (Nobel et al., 1981; Rostaher et al., 2009). És per això que es considera probable que en sistemes de maneig amb munta natural, les eventuals microlesions facin possible la ruptura de quists i la transmissió de bradizoïts entre individus.

La munta natural afavoreix la disseminació del paràsit i sembla tenir un paper clau en la reemergència de la malaltia (Castillo et al., 2009; Gentile et al., 2012; Álvarez-García et al., 2013). Especialment important, tot i que no excloent, en aquelles explotacions on les condicions climàtiques o la zona geogràfica no són tan favorables per a la presència d’insectes vectors.

151

4.3.6. Animals subclínics

La presència i l’intercanvi d’aquests animals entre explotacions es considera un dels factors de risc més importants en la disseminació de la malaltia. Diversos estudis demostren que la majoria d’animals parasitats es mantenen seropositius (i infectats), sense signes clínics o lesions evidents, actuant per tant com a portadors asimptomàtics (Goldman i Pipano, 1983; Mehlhorn et al., 2009; Frey et al., 2013). Cortes et al. (2005), descriuen un brot de besnoitiosi a les 2 setmanes de la introducció d’un animal a l’explotació, possiblement portador, fora de l’època d’activitat dels insectes.

L’exposició repetida al paràsit, la dosi d’infecció o la pròpia variabilitat de la resposta immune de l’individu es consideren factors claus per a la presència de portadors subclínics (Liénard et al., 2011).

4.4. Factors relacionats amb el paràsit

4.4.1. Aïllats

Fins al moment no s’ha descrit la seqüenciació completa de B. besnoiti, però sí s’han especificat diversos aïllats geogràfics d’origen boví: BbSpain1 d'Espanya (Fernández- García et al., 2009a), Bb1Evora03 i Bb2Evora03 de Portugal (Cortes et al., 2006c), Bb- GER1 d'Alemanya (Schares et al., 2009), Bb-Italy1 d'Itàlia (Gentile et al., 2012) i BbIsrael d'Israel (Dubey et al., 2003 citat per Gutiérrez-Expósito et al., 2012) tots ells gairebé idèntics entre sí.

Alguns estudis indiquen variacions en quant al poder patogen segons l’aïllat (Bigalke, 1968; Basson et al., 1970; Cortes et al., 2006c; Basso et al., 2011).

En els cultius laboratorials s’ha observat que tot i que les espècies de Besnoitia són capaces de parasitar un rang ampli de cèl·lules de vertebrats i invertebrats, també hi ha variabilitat en factors com la taxa de replicació en diverses línies cel·lulars (Schares et al., 2009). Tot i haver-se realitzat cultius amb cèl·lules Vero (Shkap et al., 1987), els estudis de Cortes et al. (2006c) i Schares et al. (2009) semblen demostrar que si s'arriben a desenvolupar, els taquizoïts triguen a fer-ho entre 30-40 dies post infecció.

152

Fernández-García et al. (2009b) realitza cultius en cèl·lules MARC-145 a partir de bradizoïts de BbSpainB1, observant taquizoïts extracel·lulars a les 60 hores post infecció. En canvi, en l'estudi de Schares et al. (2009) el nivell de replicació superior es troba en les cèl·lules BHK21 per als taquizoïts i les cèl·lules NA42/13 per als bradizoïts, utilitzant l'aïllat Bb-GER1.

La fase del paràsit també afecta al cultiu in vitro. La replicació a partir de bradizoïts és fins a 100 cops més lenta que amb taquizoïts, ja que la transició fins a taquizoït necessita varis dies per completar-se (Schares et al., 2009).

4.4.2. Nombre de paràsits

Els estudis de Bigalke (1968) van demostrar que el nombre de paràsits inoculats afecta al curs de la malaltia. Com més cèl·lules parasitades hi ha, més greu és la malaltia clínica. Segons l'autor, la inoculació d’una càrrega parasitària elevada causava reaccions més greus. Tanmateix, la dosi infectant de l'inòcul no es va registrar.

4.5. Factors relacionats amb insectes

4.5.1. Dípters hematòfags

La presència de dípters picadors que podrien actuar com a potencials vectors mecànics s’ha associat amb la transmissió i disseminació de la besnoitiosi principalment entre individus de la mateixa explotació (Bigalke, 1967; Mehlhorn et al., 2009). Alguns autors relacionen la propagació de B. tarandi amb l’escalfament global, ja que indirectament afavoreix la disseminació d’insectes vectors i això també podria afavorir a B. besnoiti ( Jacquiet et al., 2010; Kutz et al., 2012).

Diferents espècies de dípters hematòfags, com ara S. calcitrans i tàvecs, han estat estudiades com a transmissors de B. besnoiti.

S. calcitrans, s’ha descrit com a vector mecànic de B. besnoiti tant en parasitacions experimentals com en proves de camp (Baldacchino et al., 2013; Liénard et al., 2013). És un dípter especialment important en explotacions de règim intensiu, encara que

153

també s'ha observat activitat exòfila. El seu comportament persistent alhora d’alimentar-se podria permetre la transmissió del paràsit entre hostes propers. No obstant, s’estimen necessàries entre 52.000 i 292.500 picades per a que la transmissió sigui possible (Bigalke, 1968; Scoles et al., 2005; Liénard et al., 2013) atès el volum reduït de sang disponible a l’aparell picador (0,4 nl), i en conseqüència, la càrrega parasitària.

Els tabànids en canvi, es consideren més eficaços en la transmissió ja que poden retenir un volum de sang superior (fins a 12,5 nl), la qual cosa afavoriria la transmissió (Scoles et al., 2008; Liénard et al., 2013). A més a més, degut a que els seus hostes d'elecció solen ser remugants, la transmissió de patògens entre les espècies domèstiques i silvestres podria veure’s garantida (Baldacchino et al., 2014).

Tot i això, la viabilitat de B. besnoiti en insectes picadors és reduïda. En el cas de S. calcitrans, es manté viable 1 hora i en el cas dels tabànids menys de 24 hores. Això explicaria el risc baix de disseminació a llargues distàncies (Bigalke, 1968).

Alguns autors assenyalen que la transmissió del paràsit és més probable quan les condicions climàtiques són òptimes per a mantenir una densitat alta de vectors (Liénard et al., 2011 i 2013). Aquest fet explicaria l’emergència de la malaltia entre finals de primavera i estiu, quan coincideix amb el període de màxima activitat dels dípters. D'aquesta manera, es suggereix que en aquests períodes els dípters podrien jugar un paper clau en la transmissió mecànica del paràsit cap a nous individus (Jacquiet et al., 2010).

Liénard et al. (2011) van observar que un 42% de les seroconversions positives es van donar durant la primavera, mentre que la resta de l'any el rang oscil·lava entre el 4 i l’11%. Aquest factor el van associar a la presència/absència de dípters a l'explotació. Segons els autors, l'absència de mosques picadores durant l'hivern es va considerar com la raó per la que tant la seroprevalença com la detecció de quists escleroconjuntivals descendissin, ja que el paràsit podria necessitar de reinfeccions.

El mateix any, Schares et al. (2011a) en un estudi d’avaluació de proves serològiques, van recollir mostres durant dos períodes de l’any, al novembre (moment posterior a

154

l'època de màxima activitat dels insectes) i a l'abril (moment posterior als mesos poc favorables per als insectes). Els autors van observar que la seroprevalença era superior durant el mes de novembre. Alhora, van detectar que els bovins simptomàtics (amb quists escleroconjuntivals o vaginals) presentaven una seroprevalença superior (67% abril, 79% novembre) a la detectada en individus asimptomàtics (34,5% abril, 65,5% novembre). Aquest increment en els individus simptomàtics, podria ser degut a que la presència de quists causa un estímul antigènic constant per tal de mantenir uns títols d’IgG superiors. I que el paper dels dípters hematòfags seria el d’aportar un altre estímul antigènic mitjançant la transmissió mecànica del paràsit, que es veu reflectit durant els mesos posteriors a l’època favorable per a ells, el que podria tenir relació amb l'estudi de Liénard et al. (2011).

Uns anys més tard, els resultats de Schares et al. (2013) semblen confirmar aquesta hipòtesi ja que obtenen uns resultats similars als estudis anteriorment esmentats. El nivell d'IgG detectat decreixia després dels mesos freds (novembre-abril) en els bovins asimptomàtics. Mentre que els animals simptomàtics (amb quists escleroconjuntivals o vaginals) mostraven una seroprevalença superior durant el mateix període de temps.

Fins a la actualitat, no s'ha descrit una transmissió biològica per insectes però alguns autors consideren que aquesta possibilitat no s’hauria d’excloure definitivament (Bigalke, 1968; Olias et al., 2011).

4.5.2. Dípters no hematòfags

Es desconeix el paper d’altres insectes com la mosca domèstica (Musca domestica) com a possibles transmissors mecànics (Bigalke, 1968). Tot i que podrien entrar en contacte amb secrecions on es trobi present el paràsit, la transmissió per contacte a través de l’aparell xuclador o les extremitats es considera molt poc probable en condicions de camp (Liénard et al., 2013).

155

5. Clínica

5.1. Patogènia

La invasió de la cèl·lula hoste en els apicomplexes és un procés actiu i es desenvolupa en tres fases: l'orientació del paràsit a la membrana cel·lular pel complex apical, la unió i la inducció d'una membrana parasitòfora i l'entrada del paràsit dins el vacúol (Morrissette i Sibley 2002).

L'orientació del paràsit amb la membrana cel·lular pel complex apical provoca una secreció seqüencial dels micronemes i les ròptries. Això provoca l'adhesió del paràsit i la modificació de l'estructura de la membrana cel·lular per a facilitar la invaginació del paràsit. El paràsit queda llavors englobat en una cavitat delimitada per la membrana parasitòfora.

Durant la fase aguda de la malaltia, el paràsit es troba en fase de taquizoït, proliferant en el citoplasma de les cèl·lules endotelials dels vasos sanguinis. Aquesta multiplicació causant hiperplàsia i inflamació perivascular en capil·lars sanguinis de la pell, subcutani, fàscies, testicles i diverses mucoses del tracte respiratori superior (Basson et al., 1970). La lisi de les cèl·lules on proliferen els taquizoïts provoca l'alliberació d'aquests al torrent sanguini (parasitèmia) i la seva distribució pels teixits.

Les lesions capil·lars causen microtrombosi i augment de la permeabilitat vascular, el que condiciona l’aparició d’edemes. Alhora, aquestes lesions vasculars poden promoure també l’aparició de petites hemorràgies i focus de necrosi en els teixits afectats degut a la manca de rec sanguini.

La reacció inflamatòria vascular comporta un augment de les cèl·lules del sistema mononuclear fagocitari en els teixits, com macròfags i histiòcits, on els taquizoïts també poden multiplicar-se (Basson et al., 1970).

Un cop els taquizoïts envaeixen els histiòcits, s'inicia la formació dels quists (taula 3). A partir del 8è dia post infecció s'inicia la hiperplàsia i hipertròfia de la cèl·lula hoste.

Els estudis de Basson et al. (1970) descriuen una fase subaguda on s'inicia la formació dels quists joves fins a l'estadi madur. L'autor descriu que durant aquesta fase poden

156

fusionar-se les parets dels quists propers formant conglomerats. S'ha descrit també la presència de quists septats, és a dir, quists originats d'una sola cèl·lula hoste però amb més d'un vacúol parasitòfor.

A partir dels 30 dies post infecció poden detectar-se quists necròtics. Generalment rodejats d'un infiltrat cel·lular de neutròfils, eosinòfils i limfòcits (Basson et al., 1970; Kumi-Diaka et al., 1981).

Taula 3. Evolució de la formació de quists de B. besnoiti (modificat de Basson et al., 1970).

Fase clínica Evolució del quist Dies post infecció Aguda Histiòcits hipertròfics 8 Fase quística primerenca (15-25 m) 11 Cèl·lules hipertròfiques multinucleades 16 Desenvolupament dels quists (30-100 m) 16-25 Subaguda Quists joves (>100 m) 26 Quists septats 30 Quists necròtics 30-77 Quists premadurs (300 m) 70 Crònica Quists madurs (>300 m) 71 Paret quística eosinòfila amb Hematoxilina-Eosina 385

Degut al seu tropisme, és molt freqüent trobar quists de B. besnoiti superficialment a la conjuntiva i l’escleròtica ocular, mucoses vaginals i penianes, mugrons, pell i subcutani. Diversos autors n'han descrit també en mucoses del tracte respiratori superior, testicles, fàscies i músculs. Ocasionalment ha estat detectat en melsa, fetge, cor, glàndules suprarenals o tendons (McCully et al., 1966; Basson et al., 1970; Nobel et al., 1981; Rostaher et al., 2009; Jacquiet et al., 2010; Manualli et al., 2011; Gentile et al., 2012).

Es desconeix si la formació dels quists durant la fase crònica de la malaltia és continua. Segons Bigalke (1968), la formació de nous quists s'atura un cop els taquizoïts desapareixen del torrent sanguini.

157

La viabilitat dels quists també està en discussió, mentre que alguns estudis han proposat que els quists poden mantenir-se viables fins a nou anys sense necessitat de reinfecció (Pols, 1960; Bigalke, 1968), altres descriuen que podrien romandre viables tota la vida de l’animal (Kumi-Diaka et al., 1981).

5.2. Immunitat

Es considera que els anticossos sèrics apareixen entre els 15 i 18 dies post infecció, amb un pic entre els 30 i 40 dies (Fouquet 2009; Álvarez-García et al., 2013).

Els estudis experimentals de Pols (1960) van indicar que la immunitat adquirida podria ser de fins a 36 mesos després de la infecció tant en el boví com en conills. Tanmateix, l'autor considera que la immunitat que s'estableix és permanent durant aquest temps, però no esterilitzant.

Sembla ser que la immunitat adquirida després de la infecció involucra tant la humoral com la cel·lular. Encara que possiblement la resposta cel·lular estaria més involucrada en aquests els mesos de protecció esmentats per Pols (1960). Estudis in vitro (Muñoz- Caro et al., 2014a i 2014b), suggereixen que davant d'una estimulació antigènica, les cèl·lules fagocítiques a més d'alliberar citoquines proinflamatòries també podrien alliberar un tipus de xarxes extracel·lulars que actuarien com a paranys. Aquestes xarxes estan formades per DNA, histones i altres pèptids i proteïnes que capturarien els taquizoïts i els eliminarien, bloquejant la seva invasió cel·lular. Els autors descriuen que tant els neutròfils com els monòcits secreten aquestes xarxes en presència de B. besnoiti. Tot i així, el paper d'aquestes xarxes la en la immunitat in vivo encara es desconeix. També s’ha observat que al voltant dels quists tissulars madurs pot haver-hi una reacció inflamatòria predominantment de limfòcits T i monòcits/macròfags activats (Frey et al., 2013).

No es coneix gaire sobre el paper de la immunitat humoral en la protecció contra B. besnoiti, encara que es va arribar a demostrar que les IgG poden ser transmeses a través del calostre. Janitschke et al. (1984) van descriure per primer cop aquesta via amb tècniques d'ELISA quan un dels vedells d'un mes d'edat, presentava un títol

158

d'anticossos de 1:2560. La confirmació amb tècniques d'immunofluorescència (IFI) van mostrar un títol de 1:320 en el mateix vedell. Posteriorment, Shkap et al. (1994) també descriu la presència d'anticossos calostrals en vedells de fins a 2 dies de vida, detectant un títol d'anticossos de fins a 1:1024 mitjançant les tècniques d'IFI. La immunitat calostral va ser detectable fins als 4 mesos de vida.

Recentment, Schares et al. (2013), en un estudi on va recollir mostres de sang des de l'inici de la fase febril fins a l'estat crònic, van detectar que la fase de la infecció determina el patró d'antígens reconeguts per immunoblot i ELISA. O dit d'una altra manera, que tant els taquizoïts com els bradizoïts presenten heterogenicitat antigènica, el que podria indicar un mecanisme d'evasió del sistema immune.

En el mateix estudi, els autors van analitzar l'avidesa (o avidity), força d'unió entre els anticossos i els epítops, de les IgG específiques per B. besnoiti. Els resultats van ser que després de la infecció, l'avidesa de les IgG contra antígens concrets augmenta lenta però progressivament. Bàsicament, la tècnica segueix el mateix protocol per a una tècnica d'ELISA però utilitzant també urea per tal de desprendre els anticossos amb una baixa avidesa per als antígens utilitzats. Els autors van descriure que l'animal amb una taxa d'avidesa elevada (major al 50,8%) als 32 dies de seroconvertir, no es va detectar DNA de B. besnoiti per PCR. Mentre que els bovins que havien desenvolupat quists escleroconjuntivals o vaginals, presentaven uns valors d'avidesa inferiors al 50,8%. Per altra banda, en l'animal amb una càrrega parasitària més elevada, la taxa d'avidesa elevada no es va mostrar per primer cop fins als 5 mesos. Per tant, una de les conclusions a les que van poder arribar els autors va ser que el desenvolupament de l'avidesa de les IgG resulta més lenta que el desenvolupament dels quists.

Schares et al. (2013) també van suggerir que la càrrega parasitària influïa sobre la resposta immune ja que els valors d'anticossos van ser superiors en animals amb càrregues altes. Un fet que ja havien suggerit anteriorment (Schares et al., 2011a), i que sembla estar d'acord amb la hipòtesi de que tant els taquizoïts com els bradizoïts exerceixen una estimulació contínua de la immunitat.

Per tant, d'aquests estudis es podria considerar que la persistència de la immunitat humoral depèn, en part, de la presència de quists. Aquests, serien els responsables de

159

l'estimulació antigènica contínua, essent possible que sense estimulació antigènica els anticossos desapareguin (l'Hostis, 2009, citat per Fouquet 2009). Generalment però, la majoria d'animals que presenten una besnoitiosi lleu i es recuperen, solen esdevenir portadors asimptomàtics seropositius, ja que la immunitat humoral és incapaç d'eliminar la infecció.

5.3. Signes clínics

La gravetat de la besnoitiosi pot variar entre lleu i greu depenent de factors encara no ben definits. La variabilitat individual de l'hoste (Schares et al., 2013) o la combinació de diferents factors de risc podrien ser algunes de les raons.

A nivell d’explotació els signes clínics que destaquen són la disminució en les produccions i els problemes reproductius (Pols, 1960; Kumi-Diaka et al., 1981; Fernández-García et al., 2009a). Generalment la mort dels animals es presenta en menys del 10% dels animals (Pols, 1960).

Segons la evolució dels signes clínics es diferencien dues fases: la fase aguda inicial, que s’inicia amb un estat febril seguida d’edemes generalitzats i la fase crònica posterior, on apareixen principalment les lesions cutànies.

5.3.1. Fase aguda febril

Després d’un període d’incubació d’entre dues setmanes i fins a dos mesos, la fase aguda s’inicia amb un estat febril (Álvarez-García et al., 2013). La hipertèrmia (de 40 fins a 42 ºC) és conseqüència de la parasitèmia i la proliferació dels taquizoïts a l’endoteli vascular. Sol tenir una durada de 3 a 10 dies.

Durant aquesta fase febril solen aparèixer taquicàrdia, taquipnea, depressió, anorèxia, disminució de la remuc, pèrdua de pes i ocasionalment limfadenomegàlia (Cortes et al., 2005; Jacquiet et al., 2010). Principalment, aquests signes clínics estan derivats de la congestió de la pell i les mucoses, sobretot en les regions del coll, la part medial de la regió femoral, regió perineal, pavellons auriculars i musell (Legrand, 2003).

160

Poden presentar-se també signes d'inflamació en la conjuntiva i la mucosa nasal, causant epífora i secrecions de serós a seromucós. A nivell ocular alguns animals poden desenvolupar també fotofòbia (Pols, 1960).

Encara que es considera bastant rar, les femelles gestants durant aquest període poden presentar avortaments a causa de la febre (Pols, 1960).

5.3.2. Fase aguda d’edemes

La febre durant aquesta fase va remetent. En general, la importància d'aquesta fase va en relació a la gravetat de la fase febril anterior.

Simultàniament, a conseqüència de les lesions i l'augment de la permeabilitat vascular, es formen edemes locals en els teixits. A l’exploració, aquests edemes destaquen com a zones amb calor i hiperestèsia, on la pell perd elasticitat. La localització es dóna principalment en zones declivis com les extremitats, coll, mames i escrot. L’edema a les articulacions és causant de dolor i pot limitar el moviment dels animals degut a la coixesa (Álvarez-García et al., 2013).

Seguidament els edemes es poden generalitzar arreu, el que es coneix com a anasarca. En casos més greus també poden presentar-se edemes alveolars i intersticials amb problemes respiratoris més evidents. En casos greus, la mortalitat sol ser inferior a l'1% dels casos.

En les vaques la producció lletera es veu disminuïda i els mugrons poden presentar una coloració violàcia a la base (Legrand, 2003).

Aquesta fase d’edemes pot durar entre 1-4 setmanes.

Durant les fases agudes, especialment en aquelles més lleus, els signes clínics poden passar desapercebuts o confondre’s amb altres patologies degut a que la majoria de signes clínics són inespecífics. L’estudi de Langenmayer et al. (2015) ha detectat una lleugera anèmia i leucopènia durant la fase aguda de la malaltia així com alteracions metabòliques inespecífiques derivades de l’anorèxia dels animals.

161

Es recomana per tant establir un diagnòstic diferencial amb altres malalties infeccioses com ara la llengua blava, la febre catarral maligne o la diarrea vírica bovina (Blowey i Weaver 2011).

5.3.3. Fase d’esclerodèrmia crònica

Els edemes previs es van reabsorbint progressivament, la temperatura de l'animal es considera normal i l’estat general dels animals tendeix a millorar (Legrand, 2003).

En aquesta fase els signes es basen sobretot en enduriment, plegament i hiperqueratosi (pell d’elefant) de la pell, en les zones anteriorment afectades pels edemes. En aquestes zones, es produeixen fissures, per on s’elimina un exsudat serosanguinolent, que al assecar-se dóna lloc a la formació de crostes. Apareixen freqüentment àrees alopèciques irregulars no pruriginoses, especialment allà on la càrrega parasitària és més elevada. En alguns casos també pot haver-hi pèrdua d’epidermis necròtica (Pols, 1960). Les àrees afectades per fissures poden ser focus d'infeccions secundàries com piodèrmia o miasi.

El signe patognomònic d’aquesta fase, si es presenta, són els quists madurs macroscòpics. Freqüentment es troben com a únic signe de la malaltia a la mucosa vaginal o de forma bilateral a l’escleròtica i la conjuntiva ocular a partir de la setmana 4 o 7 post infecció, (Pols, 1960; Bigalke, 1968; Fernández-García et al., 2010; Liénard et al., 2011).

En aquesta fase les lesions testiculars poden evolucionar cap a orquitis necrotitzant, atròfia i enduriment testicular bilateral (Cortes et al., 2005; Jacquiet et al., 2010; Álvarez-García et al., 2013). Durant aquesta fase també s’ha descrit el pas progressiu de oligospermia a azoospermia amb una disminució de la libido (Sekoni et al., 1992). La esterilitat pot ser transitòria o permanent, encara que segons Cortes et al. (2006a), la fertilitat no sempre es veu clarament afectada. S’han descrit quists a l’epidídim, a la paret dels vasos sanguinis del plexe pampiniforme i als tubs seminífers (Kumi-Diaka et al., 1981; Esteban-Gil et al., 2014).

162

En les femelles, els quadres d’avortaments també s’han descrit en aquesta fase (Cortes et al., 2005).

Frey et al. (2013) van descriure la remissió dels quists en alguns dels animals crònics que n’havien mostrat a la inspecció visual a nivell conjuntival o vaginal. L'estudi, portat a terme al llarg de dos anys en una zona endèmica, es va realitzar en base a inspeccions visuals per a la detecció de quists i successius anàlisis serològics. Inicialment, tots els animals eren seronegatius i no mostraven quists a la inspecció visual. En acabar l’estudi, tots van resultar seropositius però cap mostrava quists a la inspecció visual; tanmateix, se’n van detectar en algun moment de l'estudi en tots els animals. Per tal d'avaluar si els animals subclínics presentaven quists tissulars, es va sacrificar els animals, el que va permetre detectar quists en el tracte respiratori superior i la vagina.

En general, la majoria dels animals sobreviuen a la parasitació, però la recuperació és lenta i molts cops les lesions dèrmiques són permanents. Encara que sovint s’opta pel sacrifici degut al deteriorament de la condició corporal, les lesions cutànies irreversibles i la pèrdua de valor econòmic de l’animal.

La mortalitat durant la fase crònica, tot i que és poc freqüent, pot aparèixer en els casos més greus i és conseqüència de la hipertèrmia sostinguda i l'anorèxia.

Es recomana establir un diagnòstic diferencial a l’explotació amb sarna sarcòptica o psoròptica, micosis, dermatofil·losi (Dermatophilus congolensis), limfosarcoma cutani, hiperqueratosi idiopàtica o d’altres més inespecífics com fotosensibilitat o cremades cutànies (Blowey i Weaver 2011).

Els signes clínics de la besnoitiosi són progressius i la resposta de animal a la infecció és variable. Això fa que a nivell d’explotació pot veure’s una successió de diverses fases de malaltia en el mateix moment. Com es mostra a la taula 4 on trobem els principals signes que es van descriure en un brot de besnoitosi bovina a Guadalajara (Fernández- García et al., 2010).

163

Taula 4. Signes clínics observats en un brot de besnoitiosi a Guadalajara (Espanya), segons Fernández-García et al. (2010).

Nombre d’animals Percentatge Signes clínics (n = 358) 113 31,6 Quists escleroconjuntivals 91 25,4 Edema a papada i extremitats 74 20,7 Crostes a peülles i mugrons 66 18,4 Quists vulvars 48 13,4 Lesions cutànies (esclerodèrmia, hiperqueratosi) 22 6,14 Quists escleroconjuntivals sense altre símptoma 20 5,6 Alopècia 5 1,4 Coixesa i pèrdua de pes 1 0,3 Orquitis

Langenmayer et al. (2015) no van detectar alteracions específiques en l'hemograma ni l'anàlisi bioquímic en animals crònics. Els animals estudiats presentaven una anèmia lleu i hiperglobulinèmia.

5.4. Lesions

Les lesions macroscòpiques es van superposant als signes clínics.

5.4.1. Fase aguda

Durant aquesta fase les lesions són predominantment vasculars. S’ha descrit congestió, hemorràgies i petèquies més o menys generalitzades per tota la canal, encara que apareixen preferentment a la pell, conjuntiva, mucosa vaginal i de les vies respiratòries altes (Basson et al., 1970; Legrand, 2003).

També s’ha descrit l’aparició de pleuritis i peritonitis fibrinosa que es pot mantenir en la fase crònica de la malaltia. I finalment en les zones declivis l’aparició dels edemes anteriorment descrits.

164

Microscòpicament destaca la presència de taquizoïts principalment en histiòcits perivasculars amb infiltrat d'eosinòfils i cèl·lules mononuclears. També s’observa l’aparició de trombus, focus de necrosi i una hiperplàsia tant de l’endoteli vascular com del teixit connectiu adjacent degut a la proliferació dels taquizoïts.

5.4.2. Fase crònica

En aquesta fase destaca l’aparició de lesions cutànies especialment a la part inferior de les extremitats, cap i coll. La presència macroscòpica de nòduls blanquinosos prominents, corresponents als quists, és la lesió més característica, especialment els situats la mucosa vaginal i escleroconjuntival.

En els mascles també s'observen lesions testiculars com orquitis, epididimitis i focus de necrosi i calcificació dels tubs seminífers (Basson et al., 1970; Kumi-Diaka et al., 1981). Microscòpicament també s'ha descrit en els mascles necrosi dels túbuls seminífers amb azoospèrmia.

Microscòpicament solen visualitzar-se un gran nombre de quists de bradizoïts a la dermis i teixit subcutani, mucoses i fàscies musculars. Generalment els quists indueixen una resposta cel·lular mínima o pràcticament inexistent al seu voltant. Frey et al. (2013), va descriure la presència d'un infiltrat inflamatori de limfòcits, cèl·lules plasmàtiques i macròfags. En cas de ruptura del quist es produiria una reacció granulomatosa principalment eosinofílica (McCully et al. 1966).

6. Diagnòstic

6.1. Diagnòstic epidemiològic

Està basat en la recopilació i l'estudi dels determinants (factors o variables) que poden modificar la freqüència i distribució amb que la malaltia afecta els animals (Putt 1988). Trobem dos tipus de determinants, els intrínsecs i els extrínsecs.

165

La majoria dels determinants intrínsecs propis de B. besnoiti com la via de transmissió, la relació hoste-paràsit, la infectivitat, virulència o patogenicitat encara es desconeixen. Per sort, durant els últims anys els estudis han permès conèixer una mica més aquests determinants intrínsecs així com aquells que són propis de l'hoste (espècies susceptibles, raça, edat...).

El determinant extrínsec que podria tenir una certa importància per a la besnoitiosi bovina és el clima. Principalment per les modificacions en la dinàmica de les poblacions d'insectes que poden actuar com a vectors mecànics i dels que s'ha parlat anteriorment (Semenza i Menne 2009).

6.2. Diagnòstic clínic

Es basa en l'anàlisi i la síntesi de la informació obtinguda a través de l'anamnesi, la història clínica, la inspecció i exploració de l'animal.

Durant la fase aguda de la malaltia pot ser complicat establir un diagnòstic degut a la simptomatologia inespecífica i la seva curta durada.

En canvi, l'aparició de les lesions dèrmiques com ara alopècies i esclerodèrmies són més característiques de la fase crònica de la malaltia. Tot i així, sempre s'ha d'establir un diagnòstic diferencial amb altres malalties que cursen amb dermatitis i queratitis.

La detecció dels quists macroscòpics escleroconjuntivals o a la mucosa vulvar són característics de la besnoitosi i permeten un diagnòstic precoç. No obstant, la baixa sensibilitat en aquest procediment a nivell de camp fa que puguin donar-se falsos negatius. Liénard et al. (2011) van detectar una prevalença de la malaltia entre 10-20% a partir de quists diagnosticats en mucoses, mentre que per Western Blot la seroprevalença va resultar del 70-80%. Els mateixos autors també van descriure que els animals podien passar de presentar quists escleroconjuntivals en una exploració, a no presentar-ne cap en les exploracions successives per causes desconegudes.

166

6.3. Diagnòstic laboratorial

6.3.1. Mètodes d'observació directe

Es basen en la detecció de les fases del paràsit i la seva identificació morfològica per microscopia. En la bibliografia en trobem tres tipus:

6.3.1.1. Raspats i biòpsies

La realització de varis raspats profunds cutanis amb una cullereta (o curette) de Volkmann, en àrees lesionades de 3 cm x 3 cm, permet la recollida de mostres per a la identificació microscòpica de sarnes a partir de citologies (Visser et al., 2013). D'aquesta manera es podria establir un diagnòstic diferencial entre la besnoitiosi (si s'observen bradizoïts) i diferents tipus de sarnes, com la sarcòptica o la psoròptica. Tanmateix aquesta tècnica podria no ser gaire sensible ja que no concentra la mostra recollida.

Sannusi (1991) utilitza el raspat escleroconjuntival segons els treballs de Franc et al. (1987). Encara que la tècnica descrita el 1991 va ser a partir de globus oculars post- mortem, l'aplicació de col·liri anestèsic en els animals vius junt amb una correcta subjecció del cap de l'animal i un focus de llum adequat permetria també el raspat. Bàsicament, la tècnica es basa en realitzar un raspat amb bisturí o l'extrem afilat d'un portaobjectes sobre els quists visibles. Dipositar la mostra recollida en un altre portaobjectes net i concentrar-la en un punt per a facilitar-ne la detecció. Posteriorment, la mostra es pot fixar i tenyir amb les tècniques de tinció habituals per a frotis. L'examen de la mostra es realitza amb un microscopi òptic amb oli d'immersió.

El mateix autor també realitza raspats a partir de biòpsies cutànies. Eliminant l'epidermis, els raspats de la dermis són concentrats en un portaobjectes, fixats en alcohol 3 minuts i tenyits durant 30 minuts amb tinció de Giemsa 10%.

El raspat dels quists escleroconjuntivals requereix menys temps i resulta menys invasiu que les biòpsies cutànies, encara que requereix la immobilització de l'animal.

167

L'observació de bradizoïts seria indicatiu de besnoitosi. Encara que es recomanen altres tècniques per a la confirmació com ara les tècniques d'histopatologia (Sannusi, 1991).

6.3.1.2. Histopatologia

A partir de biòpsies cutànies, es poden realitzar també tècniques d'histopatologia per a la observació dels quists de bradizoïts en diferents teixits.

Kumi-Diaka et al. (1981) utilitzen blocs de pell, escrot i teixits vaginals, d'entre 0,5 - 1 mm de gruix i 1 mm de longitud. Les mostres de pell es van fixar en formalina al 10% i la resta en solució de Bouin durant 72 hores. Els blocs fixats van ser microtomitzats en seccions de 5 - 6 m, podent ser tenyits posteriorment amb Hematoxina-Eosina, tinció de Schiff (PAS) o tinció tricròmica de Masson (MT).

L'observació dels quists de bradizoïts en els diferents teixits és diagnòstic de besnoitiosi.

6.3.1.3. Plaques de compressió per triquinoscòpia

El diagnòstic de besnoitiosi també ha estat descrit utilitzant les plaques de compressió per a triquinoscòpia que es poden utilitzar per la detecció de Trichinella spp. (Álvarez- García et al., 2013; Frey et al., 2013). El diagnòstic es basa en la detecció dels quists a partir de biòpsies, especialment de pell o vulva.

Bàsicament, el material i la tècnica són molt similars al diagnòstic de triquinel·losi. Es disseccionen diverses mostres de teixit, o de biòpsia, d'uns 2 mm de gruix i es comprimeixen entre les dues plaques de vidre (OIE 2012). D'aquesta manera la mostra de teixit queda suficientment transparent com per poder-la observar al microscopi òptic i detectar-ne els quists.

168

Les diferents tècniques esmentades per a l'observació directa poden presentar certes limitacions, especialment en els animals que són portadors crònics amb un nombre baix de quists. Per això, la combinació d'aquestes junt amb les tècniques serològiques acostumen a donar uns bons resultats.

6.3.2. Mètodes de detecció molecular

L'amplificació d'un fragment específic del DNA de B. besnoiti permet una detecció acurada del paràsit.

Els organismes eucariotes com Besnoitia tenen dos regions espaiadores ITS (internal transcribed spacer), que no codifiquen DNA i es troben entre els gens rRNA 18S, 5.8S i 28S. La manca de pressió selectiva en aquestes regions ITS fa que hi hagi variabilitat en la composició i mida, el que permet identificar i diferenciar organismes similars (Kiehl et al., 2010).

L'estudi de Cortes et al. (2006c) va descriure l'ús de tècniques de PCR per a B. besnoiti basant-se en la regió ITS-1. Recentment, Namazi et al. (2011) van proposar incloure també la regió ITS-2, per tal d’augmentar la sensibilitat entre espècies de Besnoitia similars. Ja que segons els autors mentre que la seqüència ITS-1 dels aïllats de cabra procedents d'Iran són idèntics als aïllats bovins procedents d'Europa, la seqüència de l'ITS-2 difereix un nucleòtid entre alguns aïllats europeus.

Els principals avantatges d'aquestes tècniques, a més de les esmentades, és que es permeten detectar el paràsit a partir de mostres de sang tant en la fase aguda (García- Lunar et al., 2013a) com durant la fase crònica (Cortes et al., 2007a i Schares et al., 2011b), en aquest últim cas també es podrien utilitzar biòpsies de pell.

Seria recomanable combinar els mètodes moleculars amb els serològics en els casos on se sospiti que hi puguin haver animals en fase aguda, ja que en aquesta fase encara no s'han produït les IgG que poden detectar les tècniques serològiques. Schares et al. (2013) van descriure que el paràsit es pot detectar per qPCR en 1-3 dies posteriors a la instauració de la febre, mentre que per mètodes immunològics (combinació

169

d'immunofluorescència més immunoblot) els títols de IgG són detectables en els 7-8 dies posteriors a la febre.

Cortes et al. (2006c), Schares et al. (2011b) i Schares et al. (2013) van demostrar la detecció del paràsit en animals subclínics mitjançant tècniques moleculars.

D’altra banda, la detecció del paràsit en dípters hematòfags a partir de mostres de sang obtingudes de l'aparell picador i del tub digestiu, és indicatiu que l'insecte ha adquirit el paràsit durant la seva alimentació però no permet avaluar ni la viabilitat ni la capacitat infectiva del paràsit (García-Lunar et al., 2012; Liénard et al., 2013).

En l'estudi per a determinar hostes definitius potencials de B. besnoiti, Basso et al. (2011) van utilitzar una tècnica de PCR basada en els primers identificats per a coccidis (COC-1 i COC-2) per a determinar si DNA de coccidi es trobava en femtes. I posteriorment, de la mostra amplificada realitzar una altra PCR a partir de l'ITS-1 per a detectar B. besnoiti.

6.3.3. Mètodes immunològics

Aquestes tècniques són molt utilitzades en el diagnòstic de la besnoitiosi, especialment les tècniques de serologia per a la detecció d'anticossos. Resulten útils per detectar parasitacions subclíniques o quan tot i detectar signes compatibles, no es poden detectar quists degut a la sensibilitat limitada de les proves d’observació directa (Cortes et al., 2006b, Fernández-García et al., 2009a).

A continuació es passen a comentar algunes de les tècniques immunològiques més utilitzades.

6.3.3.1. Immunofluorescència indirecta (IFI)

Les tècniques d’IFI formen part, junt amb l’ELISA, de les tècniques més utilitzades al llarg del temps per al diagnòstic de la besnoitiosi. Estan basades en la reacció

170

específica antígen-anticòs que permet la detecció dels anticossos anti-B. besnoiti de l’animal i la visualització per fluorescència en el microscopi òptic.

L'estudi de Goldman i Pipano (1983) a Israel fa referència a l'ús de una tècnica d'IFI per a la detecció de B. besnoiti a partir sèrums de bovins carnis i lleters. Aquest estudi va permetre detectar que un 36% dels toros joves, que havien estat importats i considerats prèviament negatius, van adquirir la infecció després de pasturar menys d'un any amb bovins locals.

Janitschke et al. (1984) desenvolupen una altre IFI a Sud-àfrica utilitzant taquizoïts de B. besnoiti cultivats in vitro provinents d’aïllats de nyu com a antígens. Mostra uns resultats millors que l’estudi de Shkap et al. (1984) ja que permet detectar un 49,5% d'animals asimptomàtics com a positius. Tot i així, el test continua resultant menys sensible que la pròpia inspecció visual per a detectar quists escleroconjuntivals. En l’estudi, només un 82% dels animals que presenten aquests quists són considerats seropositius.

Segons els estudis de Shkap et al. (2002) i Cortes et al. (2006b) la tècnica ofereix uns bons resultats en quan a especificitat amb un cut-off establert a 1:256. Tot i això, l'últim autor va descriure un individu on el sèrum anti-N. caninum reaccionava amb l'antigen de B. besnoiti a un títol de 1:64.

El desenvolupament de nous antígens immunodominants ha permès millorar en el diagnòstic de les proves d'IFI, amb uns resultats comparables al Western Blot (WB) amb el cut-off establert a 1:100 (Fernández-García et al., 2009a). Considerant els títols d'anticossos superiors a 1:100 com a positius, l'estudi de Lenfant (2013) va obtenir uns valors de sensibilitat de 94,3% i una especificitat de 94,7% en comparació amb el WB.

L'estudi desenvolupat per Schares et al. (2010) van mostrar que l'IFI podria resultar més sensible que l'immunoblot, ja que va detectar animals amb títols de 1:100 i 1:200 que havien resultat negatius a l'immunoblot.

García-Lunar et al. (2013a) van publicar un article comparatiu de diferents tècniques on els valors de sensibilitat i especificitat de l'IFI desenvolupat per Schares et al. (2010) va obtenir un 90% i 86% respectivament. En el cas de l'IFI descrit per Fernández-García

171

et al. (2009a) el resultat va ser del 100% de sensibilitat i el 96,4% d'especificitat quan eren comparats amb el gold standard que havien desenvolupat (que equivalia a la mitja de tots els tests utilitzats junt amb la informació de si els animals mostraven malaltia clínica per a establir els controls positius).

Les tècniques actuals permeten una bona fiabilitat en el diagnòstic. Encara que presenten l’inconvenient de no poder analitzar un gran nombre de mostres alhora. El que fa que molts cops s’utilitzin com a tècniques de confirmació o per a l’anàlisi de poques mostres.

6.3.3.2. ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbant Assay)

Són tècniques especialment indicades per a screenings o per estudis epidemiològics. En cas d'avaluar animals valuosos per a l'explotació o en mostres amb un resultat dubtós es recomana emprar una tècnica de confirmació com el Western Blot.

Les primeres referències de diagnòstic de besnoitiosi per ELISA les trobem en l’estudi de Kaggwa et al. (1979) a l’Àfrica, tot i que els resultats obtinguts per IFI van ser considerats més sensibles (dades no disponibles; segons Sambo et al., 2014).

Shkap et al. (1984) realitzen un estudi serològic a Israel amb tècniques d’ELISA i IFI per tal d’identificar B. besnoiti. En l'estudi, utilitzen bradizoïts mantinguts en cultius cel·lular per a l'obtenció de l'antigen. Resumidament, a partir de la centrifugació de les cèl·lules del cultiu, el sediment es resuspèn en PBS i es passa per una columna de pols de cel·lulosa per purificar la mostra. Posteriorment es renta la solució tres cops amb PBS per centrifugació. Finalment l'antigen soluble s'obté per la lisi cel·lular per sonicació en diferents solucions hipotòniques i detergents. Per tal d'avaluar reaccions creuades analitza també de sèrums d’animals positius a anaplasmosi i piroplasmosi amb títols de fins a 1:16.000. En comparació amb la tècnica d'IFI, va obtenir uns resultats similars en quant a especificitat però millor sensibilitat en la prova d’ELISA.

El mateix any a Sud-àfrica, Janitschke et al. (1984) desenvolupen un ELISA utilitzant antígens en una dilució 1:800, provinents d’aïllats de nyu cultivats en cèl·lules Vero. En

172

els resultats obtinguts, tant sols va detectar un 69% dels animals amb quists escleroconjuntivals com a seropositius.

La importància i disseminació de la malaltia ha fet que es desenvolupin noves tècniques per tal d’obtenir uns resultats més fiables.

Cortes et al. (2006b), va desenvolupar la primera prova ELISA per a B. besnoitia a partir d’antígens somàtics provinents de taquizoïts purificats cultivats a laboratori a partir dels estudis inicials de Shkap et al. (1984) i segons els procediments descrits per al diagnòstic de Neospora caninum per ELISA (Gottstein et al., 1998). Utilitzant com a un conjugat de conill anti-IgG de boví. La prova va obtenir però, una reacció creuada amb un sèrum positiu a Toxoplasma gondii amb títols superiors als infectats amb B. benoiti. Aquest resultat va portar a suggerir que algunes IgG bovines podrien contenir alguna regió que pugui reconèixer inespecíficament a N. caninum o T. gondii. Tanmateix, els valors obtinguts en sensibilitat (87%) i especificitat (97,6%) es van considerar prou útils per al diagnòstic de bovins tant clínics com asimptomàtics.

En l'estudi de Fernández-García et al. (2009a) s'avaluen diferents antígens per tal de discernir quins antígens, tant de taquizoïts com de bradizoïts, poden resultar més immunodominants. Per primer cop s’identifiquen antígens de bradizoïts que podrien obrir una via per a diferenciar entre la malaltia aguda i la crònica quan no hi ha signes clínics evidents.

Es desenvolupa també un nou ELISA indirecte a partir de taquizoïts purificats d’un aïllat espanyol mantinguts in vitro (Fernández-García et al., 2010) utilitzant el mateix procediment que per N. caninum (Álvarez-García et al., 2002). Bàsicament, l'antigen soluble s'obté de purificar les mostres de taquizoïts amb passis per columnes de filtració amb PBS (pH 7,2) i la centrifugació de la solució. El sediment (2 x 109 de taquizoïts) es resuspèn amb una solució Buffer, es lisen els taquizoïts per sonicació, es centrifuguen i es determina la concentració del sobrenedant que serà utilitzat com a antigen soluble. Els resultats obtinguts amb diferents concentracions d'antigen (0,05, 0,1 o 0,2 μg/pouet) mostren una sensibilitat superior a l'estudi de Cortes et al. (2006b) i sense mostrar reaccions creuades amb altres apicomplexes. Posteriorment, aquest ELISA seria la base per al kit comercial INGEZIM BES 12.BES.K1  (INGENASA).

173

Degut al desenvolupament i comercialització de noves tècniques diagnòstiques, Schares et al. (2011a) estudia la primera versió comercial d'un altre ELISA, el PrioCHECK (Prionics), utilitzant diferents sèrums negatius, positius i d’animals infectats amb altres coccidis per comparar-ne els resultats amb altres tècniques immunològiques. Els resultats obtinguts van indicar una especificitat baixa tant amb mostres procedents d'infeccions experimentals com d'animals positius a N. caninum, de manera similar a altres estudis previs (Shkap et al., 2002; Schares et al., 2010). La sensibilitat en aquesta primera versió del kit comercial també va resultar especialment baixa en els animals sense quists tissulars observables (<35%).

La manca d’estandardització d'algunes tècniques descrites fa que en alguns casos els resultats obtinguts no siguin comparables. En un estudi interlaboratorial, es van comparar els resultats de tres kits d'ELISA indirecte actualment comercialitzats amb els d'altres tècniques immunològiques (García-Lunar et al., 2013a), obtenint els resultats presentats a la següent taula 5. En aquest cas, la versió analitzada del kit PrioCHECK (Prionics), correspon a la segona versió comercial del kit, la que es troba actualment disponible.

Taula 5. Resultats de sensibilitat i especificitat dels diferents kits ELISA comercials (García- Lunar et al., 2013a).

Kit comercial Sensibilitat (%) Especificitat (%) PrioCHECK Besnoitia Ab V2.0 (Prionics)  100 98,8 ID Screen Besnoitia indirect (IDVET)  97,2 100 INGEZIM BES 12.BES.K1 (INGENASA)  97,2 93

En aquest estudi interlaboratorial, es van utilitzar una gran varietat de mostres prèviament estandarditzades en diferents laboratoris, procedents d'animals amb infeccions naturals en cadascuna de les fases de la malaltia amb/sense signes clínics com amb infeccions amb d'altres paràsits de la família Sarcocystidae. En general es va considerar que tots els tests ELISA comercials obtenien uns bons resultats, tot i que la sensibilitat es reduïa quan els títols d'anticossos eren baixos, especialment durant la

174

fase aguda de la malaltia i en alguns animals, durant la fase crònica (Fernández-García et al., 2010; Schares et al., 2010).

Recentment, s’ha desenvolupat un nou test d'ELISA. En aquest, els antígens de B. besnoiti són altament específics (Schares et al., 2013) ja que es purifiquen mitjançant una cromatografia d’afinitat immune en dos columnes, de manera que s’eliminen els antígens reactius no específics passant les diferents regions proteiques per una columna amb anticossos anti-Neospora i es recullen els que tenen afinitat amb els anticossos anti-Besnoitia en una segona columna. Els resultats mostren un 100% de sensibilitat i un 99,8% d'especificitat amb aquesta prova Apure-BbELISA. Segons l'autor, també pot detectar la malaltia en els estadis inicials, a partir dels 7-8 dies després de l’inici de la febre.

6.3.3.3. Western Blot (WB)

Està considerada com la tècnica de referència o gold standard, per l'excel·lent sensibilitat i especificitat. Es recomana especialment per a la confirmació de casos dubtosos.

La primera tècnica de WB va ser desenvolupada per Cortes et al. (2006b) a partir dels estudis de Staubli et al. (2006) per a N. caninum, degut als problemes d'especificitat detectats amb les proves d'ELISA. La tècnica principalment es basa en la lisi de taquizoïts mitjançant diferents solucions, la migració de proteïnes amb una electroforesis en gel de poliacrilamida amb dodecilsulfat de tampó (SDS-PAGE), posteriorment es transfereixen per electroforesi cap a una membrana de PVDF (polyvinylidene fluoride) i es bloqueja la reacció amb una solució proteica. S'incuben les tires amb els sèrums problemes en una dilució 1:100 i la reacció dels anticossos bovins s’observa quan s’afegeix el conjugat anti-IgG i el substrat. L’estudi va permetre diferenciar un perfil típic d’antígens per a Besnoitia besnoiti amb tres àrees principals de reactivitat, on només una produïa una certa reactivitat amb N. caninum. La tècnica va poder elucidar entre els resultats dubtosos de l'ELISA mostrant una sensibilitat del

175

91% i una especificitat entre 96,4-100%. Alhora, té l'avantatge de permetre la detecció de diferents agents etiològics en un mateix hoste.

El WB desenvolupat per Fernández-García et al. (2009a) es va realitzar a partir de la tècnica emprada per al diagnòstic de N. caninum (Álvarez-García et al., 2002) utilitzant antígens de taquizoïts i bradizoïts, el que va permetre també detectar antígens immunodominants. La correlació WB - IFI va ser molt similar quan es va utilitzar l’antigen més immunodominant.

Schares et al. (2010) també desenvolupa un WB per al diagnòstic de B. besnoiti. Bàsicament, utilitza un procediment similar amb bandes d’antígens tant per taquizoïts com per bradizoïts en una dilució del sèrum a 1:200.

En l'estudi interlaboratorial de García-Lunar et al. (2013a) també es van comparar les diferents tècniques de WB utilitzades a nivell europeu. Tant les tècniques desenvolupades per Fernández-García et al. (2009a) com la de Schares et al. (2010) mostraren uns resultats molt similars, propers al 100% tant pel que fa a sensibilitat com a especificitat. Un WB desenvolupat per Liénard et al. (2011) a partir de l'estudi de Cortes et al. (2006b), va mostrar uns resultats similars en especificitat però menors en sensibilitat.

6.3.3.4. Tècniques d’aglutinació

El test aglutinació modificat per a B. besnoiti (B-MAT) descrit per Waap et al. (2011) pot detectar anticossos anti-B. besnoiti en sèrum boví. Estan basats en la incubació del sèrum amb suspensions de taquizoïts i mostren un 97,2% de sensibilitat i 99,3% d'especificitat.

Tanmateix, les tècniques serològiques presenten certes limitacions. Una d’elles és el temps a partir del qual els nivells d’anticossos específics a B. besnoiti es poden detectar. La variabilitat individual lligada, en part, a la manca d’informació sobre la resposta immune provocada pel paràsit o la dinàmica d’anticossos, fa que encara es

176

necessitin més estudis per avançar en el diagnòstic serològic (Álvarez-García et al., 2013).

Actualment, amb les tècniques disponibles és complicat detectar els animals seropositius durant la fase aguda de la malaltia degut al títol baix d’anticossos que encara hi ha en aquest estat (García-Lunar et al., 2013a). El mateix problema podria aparèixer també en els animals en que l’estimulació dels quists sobre la immunitat pot ser insuficient per a que sigui detectable. Schares et al. (2010) també va descriure casos d'animals anèrgics, clínicament positius però resultaven seronegatius.

Aquests punts porten cap a noves opcions a l'hora d'encaminar la investigació a noves tècniques com ara basar el diagnòstic en proteïnes específiques per a taquizoïts i bradizoïts (García-Lunar et al., 2013b). Fernández-García et al. (2009a) i Schares et al. (2010) ja van identificar diversos antígens immunodominants tant de taquizoïts com de bradizoïts. Aquests antígens permetrien diferenciar la fase del paràsit i per tant, diferenciar també entre la fase aguda i crònica de la malaltia, essent útil tant per a animals simptomàtics com asimptomàtics i aparentment, sense risc de reaccions creuades entre ells.

Els problemes d'especificitat són de fet, una altra de les limitacions de les tècniques serològiques actuals. Schares et al. (2013) van considerar que determinats antígens es poden compartir entre organismes de la mateixa família, el que sembla estar en concordança amb l’aparició d’un nombre baix de reaccions creuades de B. besnoiti i T. gondii o N. caninum (Goldman i Pipano, 1983; Shkap et al., 2002; Fernández-García et al., 2010; Schares et al., 2010 i 2011b). L'estudi de García-Lunar et al. (2013b) va ser el primer en identificar almenys cinc proteïnes que poden donar reaccions creuades entre B. besnoiti i N. caninum.

Les reaccions creuades podrien explicar perquè en països on no s'ha descrit B. besnoiti com Austràlia (Nasir et al., 2012) o al Brasil (Uzêda et al., 2014), s'han detectat casos d'individus amb una reactivitat serològica dubtosa a B. besnoiti. Tanmateix, també s’han de tenir en compte altres factors com ara la variabilitat individual de la resposta immune o les diferències antigèniques o de virulència dels diferents aïllats del paràsit.

177

6.3.3.5. Immunofluorescència directa (IFD)

Liénard et al. (2013) va desenvolupar aquesta tècnica per tal de detectar taquizoïts presents en sang. L’IFD va permetre detectar l’antígen de B. besnoiti en la cavitat abdominal de S. calcitrans 1 hora postingestió. No obstant, la prova molecular va mostrar una major sensibilitat en detectar el DNA parasitari també en l’aparell picador i fins a 24 hores després de la ingesta.

6.3.3.6. Immunohistoquímica

L'ús d'anticossos en aquesta tècnica permet la detecció i el seguiment del desenvolupament del paràsit a través dels talls histològics.

Frey et al. (2013) descriu amb bons resultats la utilització d'anticossos policlonals enfront antígens tant de taquizoïts i bradizoïts de B. besnoiti, a una dilució de 1:3000.

En els estudis realitzats per Dubey et al. (2003a i 2013) també es descriu l'ús d'anticossos policlonals dirigits contra antígens de bradizoïts per a B. besnoiti i B. oryctofelisi. L'autor també utilitza la combinació d'altres tincions dirigi des contra cèl·lules tissulars com l'avidina–biotina immunoperoxidasa o l'ús d'altres anticossos contra paràsits com T. gondii per tal de millorar la sensibilitat de la prova.

6.3.3.7. Altres tècniques diagnòstiques

L'evolució en el diagnòstic de la besnoitiosi bovina possiblement estarà marcada pel desenvolupament de nous marcadors genètics i la seqüenciació completa del paràsit. L'establiment d'altres tècniques que s'utilitzen per a d'altres paràsits de la família Sarcocystidae podria millorar-ne també la detecció. Les noves línees diagnòstiques que es podrien valorar en el futur inclouen tècniques moleculars com la RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) o MLMT (Multilocus Microsatellite Typing) així com l’espectrometria de masses MALDI- TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight) per a l'anàlisi de proteïnes (Olias et al., 2011).

178

7. Tractament

En l’actualitat no es disposa d’un tractament farmacològic eficaç per l'eliminació del paràsit ni tampoc per a la prevenció de la malaltia (Shkap et al., 1987; Cortes et al., 2007b, Álvarez-García et al., 2013).

Pols (1960) va analitzar l'acció de diverses sulfamides i antimalàrics. En l'estudi va utilitzar conills infectats experimentalment i els van tractar tant durant el període d'incubació com durant la fase aguda de la malaltia. Segons l'autor, cap canvi morfològic del paràsit va ser atribuïble a l'acció dels fàrmacs. Considerant l'efecte de 'no morir' com a recuperació, l'autor només descriu cert efecte amb la sulfamerazina (6 de 15 animals vius després del tractament) i la pentamidina (2 de 3 vius després del tractament). Tanmateix, l'autor relacionava la supervivència amb la resistència individual de l’animal o a una reducció de la virulència del paràsit degut als successius passis de l'aïllat més que no pas a un efecte antiparasitari dels fàrmacs.

L'estudi de Shkap et al. (1987) va descriure que únicament les oxitetraciclines de llarga durada resultaven efectives en rosegadors infectats experimentalment. Però amb resultats variables in vitro, ja que l'halofuginona va mostrar una major inhibició del creixement dels bradizoïts.

Cortes et al. (2007b) destaca l'efecte de la nitrozoxanida sobre els taquizoïts cultivats in vitro en cèl·lules Vero. L'autor descriu un increment del nombre de vacúols del citoplasma del paràsit junt amb una pèrdua de la integritat estructural de la membrana parasitòfora. El mateix efecte es descriu amb el derivat desacetilat (sense el grup nitro) de l'esmentat fàrmac, però amb l'avantatge que aquest derivat no té descrits efectes mutagènics.

Alguns autors recomanen l'administració de tractaments basats en sulfamides des de l'inici de la fase aguda (Jacquiet et al., 2010). Les dosis recomanades són de 200 mg/kg per la sulfadimerazina o 80 mg/kg de sulfadimetoxina, durant almenys 7 dies. El seu ús podria ser efectiu en la reducció de la gravetat dels símptomes però no aconsegueix esterilitzar l'hoste. L'ús de tetraciclines també està discutit i no està demostrada la seva eficàcia en proves de camp.

179

En general, el tractament recomanat és la separació dels animals malalts de la resta del grup i un tractament pal·liatiu simptomàtic (diurètics, antinflamatoris, antibioteràpia per a infeccions bacterianes secundàries...). També mesures de suport alimentari per intentar recuperar la condició corporal de l'animal, com pinso d’alta qualitat amb suplements vitamínics i minerals (Castillo 2005).

S’ha de tenir present però, que l'animal generalment no arriba a eliminar completament el paràsit ni a recuperar-se totalment de les lesions i que per tant, molts cops s’aconsella eliminar l’animal de l’explotació (Jacquiet et al., 2010).

8. Control i profilaxi

Fins a l’actualitat, no hi ha cap vacuna autoritzada a Europa. A Israel i Sud-àfrica es va comercialitzar una vacuna atenuada (Bigalke et al., 1974; Penzhorn et al., 1995; Bigalke i Prozesky 2004).

La vacuna desenvolupada a Sud-àfrica contenia 107 taquizoïts de B. besnoiti aïllats de nyu cultivats in vitro. Segons Bigalke i Prozesky (2004), una dosi de la vacuna protegeix de la forma clínica durant quatre anys. El mateix autor comenta que, en un estudi no publicat, el títol d'anticossos cap als antígens vacunals detectats per IFI, comencen a disminuir al cap de 180 dies. La vacuna no va resultar ser preventiva d'una infecció subclínica.

El desenvolupament de noves vacunes, queda en part condicionat en la caracterització de nous antígens específics del paràsit (Njagi et al., 2004).

Shkap et al. van realitzar diversos estudis per tal d'identificar nous antígens de B. besnoiti a partir de taquizoïts cultivats en el laboratori (Shkap et al., 1989 i 1990). Posteriorment, els autors desenvolupen un anticòs monoclonal que és capaç d'inhibir la multiplicació in vitro de B. besnoiti en 4-8 dies d'incubació (Shkap et al., 1995). Tanmateix, l'anticòs no va resultar ser neutralitzant en les proves in vivo amb rosegadors.

180

Njagi et al. (2004) també desenvolupa anticossos monoclonals dirigits contra antígens de membrana de taquizoïts de B. besnoiti. Els resultats de l'estudi mostren, a una dilució 1:2 del sèrum immune (amb títols d'anticossos de 1:5125), una reducció de fins al 90% el nombre de taquizoïts en el cultiu cel·lular.

Actualment però, encara no ha estat desenvolupada cap vacuna inactivada.

La manca de vacunes juntament amb la ineficàcia dels tractaments ha fet que l'objectiu principal sigui el diagnòstic precoç dels individus portadors asimptomàtics i les mesures de maneig necessàries per evitar la propagació de la malaltia (Álvarez- García et al., 2013).

Les mesures de control han de ser establertes segons les característiques de cada situació a l'explotació, com s'indiquen a continuació.

8.1. Mesures de control en explotacions no infectades

Per tal d'evitar l'entrada del paràsit, es recomana analitzar tots els animals prèviament a la seva entrada a l’explotació. Un control clínic i serològic de tots els bovins a partir dels 6 mesos d’edat i si és possible, repetir-ho a les 6 setmanes per detectar els falsos seronegatius en cas que encara no haguessin seroconvertit en el primer anàlisi (Lenfant et al., 2013).

En cas de trobar-se en una zona d’alta prevalença, evitar compartir pastures amb altres explotacions així com l'ús de mascles per a muntes naturals. En cas que les condicions de l’explotació no ho permetin, es recomana analitzar els animals al final de l'època de pastura abans de mantenir-los estabulats.

La detecció d'un positiu comporta l’eliminació de l'animal de l'explotació. En el supòsit que no fos possible, es recomana mantenir-los separats de la resta d’animals (Álvarez- García et al., 2014a).

Mantenir un sistema de control d'insectes també resulta essencial per a evitar la dispersió del paràsit dins l'explotació.

181

8.2. Mesures de control en explotacions infectades

Per evitar la dispersió de la malaltia, l'eliminació gradual dels animals seropositius ha resultat un sistema de control eficaç per a la besnoitiosi (Kumi-Diaka et al., 1981; Jacquiet et al., 2012).

Començant per substituir els animals que presentin els signes clínics més greus per d'altres seronegatius i mantenir-los separats de la resta del ramat. Jacquiet et al. (2012) va comprovar que en explotacions on la prevalença és baixa (<10%) l'eliminació selectiva dels animals positius pot resultar una mesura eficaç per a la eradicació del paràsit a nivell de granja.

L'establiment d'aquesta selecció exhaustiva a llarg termini juntament amb evitar qualsevol contacte entre animals d'explotacions diferents, semblen ser les mesures més efectives quan es considera la relació benefici/cost en aquells casos on la prevalença de l'explotació és elevada.

En general, les explotacions en règim intensiu faciliten aquestes pràctiques per al control de la malaltia. La inseminació artificial, el seguiment exhaustiu de les produccions i les pastures restringides a zones properes (o la manca d’elles) dificulten el contacte entre animals i faciliten el control la malaltia. En aquestes condicions, el control d'insectes mitjançant l’ús de repel·lents també resulta més eficaç i disminueix el nombre de picades que poden rebre els animals.

En canvi, en les explotacions en règim extensiu aquestes mesures són més difícils d’implantar i encara que la prevalença arriba a disminuir, la eradicació de la malaltia resulta més complicada (Álvarez-García et al., 2013).

8.3. Mesures de control d'insectes

El control d'insectes (o d'artròpodes en general) és recomanable en tots els casos, estigui present la malaltia a l'explotació o no, per tal de protegir als animals de les picades (Jacquiet et al., 2010). Tanmateix, la instauració d'aquest control sempre s'ha de realitzar en combinació amb d'altres mesures profilàctiques.

182

Generalment el control d'insectes que poden estar involucrats en la transmissió de malalties es pot dur a terme mitjançant estratègies de maneig, aplicació de pesticides i mètodes de lluita biològica.

Les mesures de maneig s’inclouen entre les més efectives per al control de les mosques en general. Bàsicament es basen en la neteja de les instal·lacions per tal d'evitar l'acumulació de femtes i restes de matèria vegetal que poden servir per a aliment de larves de mosca. Mesures de maneig com les rotacions de pastures, encaminades a substituir determinades pastures susceptibles a determinats insectes o el cultiu en franges de diferents espècies vegetals per tal de crear una diversitat d'hàbitats favorable per al control biològic podrien ser altres alternatives. També, el cultiu de determinades plantes prop de l’explotació com les que focalitzen els insectes o les que sintetitzen molècules repel·lents de manera natural es podrien considerar. No obstant, l’aplicació d’aquestes mesures depèn de les condicions de cada explotació.

Les mesures de control químic per al control d'insectes poden incloure tant substàncies atraients, com repel·lents o insecticides sobre els animals. La presentació dels tractaments també varia, desde pour-on, plaques auriculars, aerosols,.. Contra les mosques picadores es recomanen especialment els piretroides sintètics, ja que contenen un ampli poder residual sobre els animals. El seu mecanisme d'acció com a insecticides és interferint els canals de sodi dels axons nerviosos de l'insecte, resultant en una repolarització retardada del canal i una paràlisi eventual. Tot i això, degut al poc temps que necessita la mosca per a la ingestió de sang, el tractament aplicat sobre els animals podria tenir poc efecte. L'aparició de resistències a la permetrina ha estat descrita en S. calcitrans (Salem et al., 2012). Altres insecticides inclouen l'ús d'avermectines o organofosforats, tot i que aquests últims tenen una elevada toxicitat i la retenció en teixits en fa establir un període de supressió variable segons el producte.

També hi ha els mecanismes de control físics d'insectes, on s'inclouen totes aquelles barreres o trampes que impedeixen el contacte de l'insecte amb el seu hoste.

Pel que fa a mesures de control biològic, una de les més efectives seria afavorir la presència de depredadors naturals insectívors autòctons a la zona propera a

183

l'explotació. D'altres, com ara organismes parasitoids que ataquin diferents fases del cicle biològic dels insectes, com per exemple alguns gèneres de fongs entomopatogènics que afecten les pupes de mosca o pteromàlids com Spalangia cameroni, un tipus d'himenòpter endoparasitoide de S. calcitrans. Aquestes mesures obtenen resultats variables, no han estat provades al nostre país, presenten uns resultats a llarg termini a més de tenir un potencial impacte ecològic (Skovgård i Steenberg, 2002). Tanmateix, alguns autors consideren que pot ser una nova via de control (Hajek et al., 2007).

Per últim, s'han descrit també mesures de control parabiològic com ara l'ús de reguladors del creixement dels insectes (cyromazin, triflumuron). Són compostos químics que no eliminen l'insecte diana directament, sinò que interfereixen en el seu creixement i desenvolupament. Aquests mètodes encara necessiten més estudis ja que els resultats són molt variables i no està clar si realment són espècie-específics com inicialment es creia (Hagler, 2000; Salem et al., 2012).

184

185

186

VII. ESTUDI 2 - Seroprevalença de la besnoitiosi bovina a Catalunya

187

188

Seroprevalença de la besnoitiosi bovina a Catalunya

Introducció

La besnoitiosi bovina és una malaltia parasitària causada per Besnoitia besnoiti, un protozou formador de quists en els teixits.

L’augment de casos clínics a Europa durant els últims anys n'ha fet destacar la importància en el seguiment i el control de la malaltia. Es considera que factors com l’intercanvi d’animals portadors subclínics, determinades mesures de maneig a l’explotació o l’activitat d'insectes hematòfags probablement han afavorit la propagació de la malaltia.

Amb l'objectiu de millorar en el coneixement de la malaltia així com en els factors epidemiològics implicats, es presenta aquest estudi realitzat a partir de mostres de sèrum de bovins de diferents aptituds i sistemes productius a Catalunya.

Material i mètodes

Selecció del nombre i tipus de mostres

El nombre de sèrums per tal de determinar la seroprevalença va ser calculat utilitzant el sistema WinEpi, amb el 99,5% de confiança i un marge d’error del 5%. Es va assumir una prevalença desconeguda del 50% sobre una població coneguda de l’any 2010 de 555.829 bovins (idesCat). Segons el programari, un mínim de 788 mostres eren necessàries d’analitzar. Finalment es varen utilitzar 795 sèrums.

Els sèrums analitzats provenien d'una col·lecció de sèrums emmagatzemada al laboratori de la Unitat de Parasitologia. Atès que els animals de lídia tenen certes particularitats en la cria i el maneig, 162 dels sèrums inclosos a l'estudi van ser d'aquesta aptitud (raça de Lídia i creuats). La resta de mostres de sèrums van ser seleccionades a partir d’una base de dades on es van escollir primerament les

189

explotacions càrnies i lleteres del nord i sud de Catalunya, i posteriorment, la selecció aleatòria dels sèrums mitjançant el programari IBM SPSS Statistics v.20.

La informació recollida de cadascun dels sèrums durant la realització de la col·lecció de sèrums, va servir per a tenir la referència geogràfica de les explotacions i la informació sobre el sexe, raça i edat dels animals.

A partir de les coordenades geogràfiques de les explotacions, es va poder obtenir la classificació sobre el clima i l'altitud de cadascuna d’elles segons les dades disponibles a l'Atles Nacional de Catalunya (ICGC 2009) tal i com es va realitzar a l'estudi de seroprevalença d'hemoparasitosis. La informació sobre si els animals sortien a pasturar a l’exterior es va obtindre a través d’entrevistes i consultes epidemiològiques a persones relacionades amb cada explotació.

Estudi serològic

Els sèrums van ser analitzats amb la tècnica d’ELISA indirecte comercial PrioCHECK Besnoitia Ab v2.0® (Prionics) seguint les instruccions del fabricant (veure Annex II: procediment 3). Per a la lectura dels resultats, es va mesurar la densitat òptica (DO) amb l’espectrofotòmetre Labsystems Multiskan RC a 620 nm.

A partir de la densitat òptica es va calcular el percentatge de positivitat (PP) segons la fórmula (DO mostra/DO control positiu)*100. El cut-off va ser establert en PP≥15 per als positius segons les recomanacions del fabricant.

Anàlisi estadístic

L'anàlisi estadístic i el càlcul de l’efecte dels diferents factors, en relació amb els resultats serològics, es va desenvolupar amb un model lineal generalitzat que utilitza equacions d'estimació generalitzades mitjançant el programari IBM SPSS Statistics v.20. (Veure Annex I per al fonament i interpretació del model).

190

Resultats

Sèrums recollits

Dels 795 sèrums recollits, 294 van correspondre a bovins d'aptitud lletera, els 162 animals seleccionats d'aptitud de lídia i els 339 restants van ser bovins d'aptitud càrnia (12 de creuats, 303 Bruna dels Pirineus, 11 Salers i 13 d'altres). En 'altres' es van agrupar bovins de les races Simmental (4), Pirinenca (3), Llemosina (2) i Parda Alpina (4). Pel que fa al sexe dels animals, 771 sèrums van ser de vaques i 24 mascles.

La geolocalització de les 111 explotacions d’origen dels sèrums es mostren a la figura 1. Les explotacions corresponien a bovins de carn (n=80), llet (n=22), lídia (n=9).

Figura 1. Geolocalització de les explotacions d'origen segons l'aptitud dels animals.

191

A partir de les coordenades geogràfiques de les explotacions es va poder obtenir la informació tant del clima com de l'altitud dels municipis on es troben de cadascuna d’elles segons l'Atles Nacional de Catalunya (ICGC 2009), de la mateixa manera que s'havia realitzat amb l'estudi d'hemoparàsits.

Per a la realització de l’anàlisi estadístic es van agrupar diversos factors en variables categòriques. Per a l'edat es van diferenciar tres rangs amb un nombre similar de sèrums en: animals fins a 2 anys, entre 3 - 4 anys i a partir de 5 anys. L'altitud (en metres) de les explotacions es va agrupar en: de 0-199, 200-499, 500-999, 1000-1999.

Resultats de l'estudi serològic

Dels 795 animals analitzats, 508 van resultar seropositius que equival al 63,9% del total amb un interval de confiança (IC) del 95% de 60,5-67,3%. Pel que fa als subgrups bovins analitzats, els seropositius van correspondre a 201 de carn (59,3%), 178 d’aptitud lletera (60,5%) i 129 animals de lídia (79,6%).

A la figura 2 es representa la distribució del nombre d’animals segons l’edat junt amb els resultats obtinguts.

L’anàlisi estadístic realitzat als diferents factors analitzats amb el model lineal generalitzat va trobar diferències significatives en l'aptitud, l'edat, el clima i el fet de sortir a pasturar o no (p-valor <0,05). Els altres factors analitzats que varen resultar no significatius es van eliminar del model estadístic.

192

160

140

120

Nombred'animals 100

80 POS 60 NEG

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Edat (anys)

Figura 2. Distribució del nombre d’animals segons l’edat i els resultats classificats en positiu (POS) o negatiu (NEG).

193

Tal i com s’observa quan s’avalua el conjunt total dels bovins, l’aptitud dels animals presenta diferències significatives (taula 1). El model ens indica que la diferència estadística radica en el subgrup de lídia, que presenta un major de seropositivitat que els animals lleters.

L’edat dels animals és un altre factor que afecta la positivitat en el total de la població bovina. La seroprevalença augmenta de manera significativa segons s’augmenta el rang d’edat dels animals, oscil·lant entre 56-75 % de positivitat. Pel que fa als subgrups bovins, tant els de carn com els lleters mostren diferències significatives entre el rang d’edat més jove i els rangs superiors (taules 2 i 3). En canvi, en el subgrup de lídia no es mostren diferències significatives i els tres rangs d’edat mostren una positivitat elevada propera al 80% (taula 4).

Pel que fa al clima, la positivitat és significativament menor en el clima Oceànic en comparació amb la resta de climes (taula 1 i 2). Quan es disposa de dades comparables, el model no mostra diferències significatives entre els altres climes no Oceànics.

El factor “pastura” ha donat una diferència significativa quan es comparava si els animals sortien o no a pasturar. En el total de la població estudiada s’ha observat que els animals presenten més positivitat quan no surten a pasturar (73%). En el cas dels animals lleters també s’observa aquest cas, mentre que en els individus de races càrnies no sembla haver-hi diferències significatives. En els animals de lídia aquest factor no és avaluable ja que tots els animals es trobaven en extensiu.

194

Taula 1. Model estadístic: mitjana ajustada (%) i error típic del model lineal generalitzat per a Besnoitia besnoiti per al total de mostres analitzades.

Total (n= 795) Mitjana Error típic Sig. n ajustada Bonferroni (%) Edat 0 – 2 226 56 4,9 (anys) 3 – 4 224 65 4,2 *0,000 ≥ 5 345 75 3,5 Clima Oceànic 67 39 8,4 Med. pre-/pirinenc 420 72 4,2 *0,000 Med. continental 56 74 6 Med. pre-/litoral 252 74 3,6 Pastura No 137 73 4,9 *0,004 Sí 658 58 3,2 Aptitud Càrnia 294 64 4,4 Lletera 339 55 3,6 *0,002 Lídia 162 77 6,1 n: nombre de mostres. Sig. Bonferroni: p-valor segons la correcció de Bonferroni (* significatiu).

195

Taula 2. Resultats del model lineal generalitzat per a Besnoitia besnoiti dels animals d'aptitud càrnia.

Aptitud càrnia (n= 339) Mitjana Error típic Sig. n ajustada Bonferroni (%) Edat 0 – 2 83 31 9,7 (anys) 3 – 4 67 52 10,6 *0,000 ≥ 5 189 59 9,6 Clima Oceànic 67 31 9,7 Med. pre-/pirinenc 272 64 8,4 *0,000 Med. continental - - - Med. pre-/litoral - - - Pastura No 9 49 18,2 0,871 Sí 330 46 4,2 n: nombre de mostres. Sig. Bonferroni: p-valor segons la correcció de Bonferroni (* significatiu).

196

Taula 3. Resultats del model lineal generalitzat per a Besnoitia besnoiti dels animals d'aptitud lletera.

Aptitud lletera (n= 294) Mitjana Error Sig. n ajustada típic Bonferroni (%) Edat (anys) 0 – 2 108 57 5,1 3 – 4 114 59 4,9 *0,016 ≥ 5 72 75 5,3 Clima Oceànic - - - Med. pre-/pirinenc 148 63 4,3 0,957 Med. continental 55 66 6,8 Med. pre-/litoral 91 64 5,6 Pastura No 128 72 4 *0,005 Sí 166 55 4,8 n: nombre de mostres. Sig. Bonferroni: p-valor segons la correcció de Bonferroni (* significatiu).

197

Taula 4. Resultats del model lineal generalitzat per a Besnoitia besnoiti dels animals d'aptitud de lídia.

Animals de lídia (n= 162) Mitjana Error Sig. n ajustada típic Bonferroni (%) Edat (anys) 0 – 2 35 77 7,1 3 – 4 43 79 6,2 0,893 ≥ 5 84 81 4,3 Clima Oceànic - - - Med. pre-/pirinenc - - - N.E. Med. continental - - - Med. pre-/litoral 162 79 3,4 Pastura No - - - N.E. Sí 162 79 3,4 n: nombre de mostres. Sig. Bonferroni: p-valor segons la correcció de Bonferroni (* significatiu). N.E.: paràmetre no estimat.

198

Discussió

L'estudi ha revelat una seroprevalença alta (63,9%) en la població de bovins analitzats. Encara que no mostra uns valors tan elevats com els descrits en els estudis de zones epizoòtiques amb valors propers al 80% (Schares et al., 2009, Fernández-García et al., 2010). De fet, estudis recents a l’Estat Espanyol mostren una tendència a l'estabilització en zones inicialment considerades com enzoòtiques com és el cas d'Osca (d'un 50% aproximadament) o Castella la Manxa (63%)(García-Lunar et al., 2011; Gutiérrez-Expósito et al., 2014). A Catalunya s’han comunicat casos esporàdics en bòvids domèstics i silvestres però no es té constància d’estudis epidemiològics previs (García de Jalón et al., 1995, Vidal et al., 2014, Gutiérrez-Expósito et al., 2013).

Les mitjanes ajustades que estima el model estadístic mostren uns valors seropositivitat també superiors al 50% en els tres subgrups bovins analitzats. La seropositivitat del 55% detectada en el boví lleter podria indicar que es tracta del subgrup boví de menys risc entre els estudiats. La majoria d'estudis fan referència a animals en extensiu (Fernández-García et al., 2012; Álvarez-García et al., 2014a), tot i que també s'han descrit casos clínics en boví lleter (Loste et al., 2011) i es consideren que poden infectar-se de manera similar als de races càrnies (Jacquiet et al., 2010). Els bovins lleters analitzats són tots de raça Frisona, que són animals adaptats a un sistema de cria principalment en intensiu (tot i que en l'estudi s'han inclòs animals que surten a pastura) i amb inseminació artificial (Bigalke, 1968; Gentile et al., 2012; Álvarez-García et al., 2013) el que dificultaria la transmissió de la malaltia en comparació amb els altres subgrups.

En el cas dels bovins carnis la mitjana ajustada es manté similar a la prevalença total obtinguda del 64%, mentre que en el cas dels animals de Lídia la mitjana ajustada del 77% podria indicar que es tracta d'una població especialment exposada a Besnoitia.

Possiblement determinats factors de cria i maneig propis de cada subgrup boví tinguin una marcada influència sobre les seropositivitat més que en la pròpia susceptibilitat d'una raça o aptitud en concret (Goldman i Pipano, 1983, Álvarez-García et al., 2013). Dins dels bovins carnis analitzats un 90% aproximadament eren de la raça Bruna dels Pirineus, que basen la seva cria en extensiu amb un sistema de vall-port de muntanya i

199

la reproducció és bàsicament per munta natural (Bigalke, 1968; Gentile et al., 2012; Álvarez-García et al., 2013). Aquests factors podrien afavorir el contacte entre animals parasitats i sans tant de la mateixa explotació com d’explotacions diferents si comparteixen pastures (Juste et al., 1990, Jacquiet et al., 2010). També pot permetre el contacte entre animals silvestres (Gutiérrez-Expósito et al., 2013).

Els bovins de Lídia també es crien en extensiu i es podria donar el mateix cas que l’anterior. En aquests últims, s’utilitza la munta natural dirigida per lots de cubrició i podria afectar (Gentile et al., 2012; Álvarez-García et al., 2013), si el toro semental fos portador asimptomàtic si no es realitzen els controls sanitaris adequats (Cortes et al., 2006b).

L'edat de l'animal s'ha demostrat com a un dels factors que influeixen en l'aparició i el manteniment de la infecció. Es considera que la relació positiva entre l'edat i la seroprevalença és degut a la probabilitat d'entrar en contacte amb el paràsit (Goldman i Pipano, 1983, Fernández-García et al., 2010, Álvarez-García 2014). Aquest fet explica el progressiu augment de la seroprevalença detectada en l'estudi quan s'avaluen els diferents rangs d'edat, tant en el conjunt total de la població analitzada com en el subgrup lleter i carni (Goldman i Pipano, 1983, Fernández-García et al., 2010, Liénard et al., 2011; Álvarez-García et al., 2014b, Gutiérrez-Expósito et al., 2014). En canvi, en els animals de Lídia tots els rangs d’edat mostren un valor proper al 80% indicant que podria ser una població especialment exposada a la infecció degut al sistema de cria.

El clima afecta a la presència de vectors de la zona ja que les temperatures suaus solen ser les més òptimes per al desenvolupament dels dípters (Liénard et al., 2011). Els bovins de la Vall d'Aran (clima Oceànic) han mostrat una seropositivitat inferior (39%) a la resta de bovins estudiats. Aquesta zona presenta una pluviometria més elevada (mitja anual entre 800-1200 mm), hiverns més freds (mitja de gener de -3ºC a 2ºC) i estius més suaus (mitja d'agost entre 11ºC i 17ºC) que la resta del territori català (ICGC 2009). Es desconeix de quina manera poden influir aquestes condicions climàtiques sobre la població de dípters, tot i que la detecció la infecció suggereix la presència del paràsit (Cortes et al., 2006c, Schares et al., 2011b, Schares et al., 2013).

200

A més de la presència dels vectors, també s'ha de tenir en compte la probabilitat d'entrar en contacte que tenen els bovins amb ells. Per això es va voler avaluar si el factor de sortir a pasturar condiciona o té algun efecte en la seroprevalença de la malaltia. Es considera que els individus que surten a pastura poden tenir més risc ja que estan més exposats als vectors (Baldacchino et al., 2013, Baldacchino et al., 2014). Sorprenentment, els resultats de l'estudi han mostrat que en els bovins lleters que no pasturen (n= 128) presenten una positivitat significativament superior als que sí pasturen (n= 166). Podria estar en relació amb que poden mantenir contacte directe amb els altres animals estabulats i que Stomoxys calcitrans tendeix a trobar-se més freqüentment junt als animals estabulats, ja que les fases larvàries solen desenvolupar- se en substrats rics en matèria orgànica (Baldacchino et al., 2013), com serien els femers. D’aquesta manera els animals estabulats d’una zona endèmica podrien estar més temps en exposició amb aquests dípters picadors.

Tot i que s'ha comprovat que S. calcitrans pot actuar com a vector per a B. besnoiti, la capacitat vectorial a través de la seva picada encara s’ha de verificar en estudis de camp (Bigalke, 1968; Scoles et al., 2005, Liénard et al., 2011). Estudis recents han descrit augments de títols d’anticossos a l'inici de la primavera coincidint amb el període de màxima d'activitat d'aquestes mosques (Liénard et al., 2013).

No s’han trobat diferències significatives entre el sexe dels bovins i l'altitud on es troben les explotacions. El sexe dels individus no sembla estar relacionat amb la seroprevalença (Álvarez-García et al., 2014b, Gutiérrez-Expósito et al., 2014) cosa que sembla estar en concordança amb els resultats obtinguts en el present l'estudi. D'altra banda, l'altitud de l'explotació podria tenir una influència en els vectors que es puguin trobar a la zona. Altres estudis de seroprevalença publicats mostren resultats variables (Álvarez-García et al., 2014b, Gutiérrez-Expósito et al., 2014) ja que molts cops al factor altitud es troben associats d’altres com el sistema de cria o la presència de vectors.

Sens dubte, una altra qüestió a tenir en consideració en el resultat de l’estudi és el diagnòstic serològic. Una de les tècniques habitualment emprades és la tècnica d'ELISA indirecte (Basso et al., 2013, Rinaldi et al., 2013, Ashmawy et al., 2014, Hornok et al.,

201

2014), tanmateix, acostuma a utilitzar-se junt amb la tècnica gold standard, que és el Western Blot (WB). Les proves de WB desenvolupades per diferents estudis presenten uns valors propers al 100% tant pel que fa a sensibilitat com a especificitat, ja que detecten diverses bandes d’antígens immunodominants per a B. besnoiti, el que permet obtenir uns resultats molt fiables evitant les reaccions creuades (Fernández- García et al., 2009a, Schares et al., 2010, Liénard et al., 2011). La tècnica d'ELISA comercial PrioCHECK Besnoitia Ab V2.0  (Prionics) utilitzada, va mostrar una sensibilitat del 100% i una especficitat del 98,8% en un estudi recent on s'utilitzaven els aïllats BbSp-1 i Bb1Evora03, propis de la Península Ibèrica (García-Lunar et al., 2013a). El kit comercial permet la detecció d’anticossos enfront B. besnoiti mitjançant un conjugat anti-IgG bovina (Schares et al., 2011a). La detecció d'anticossos enfront B. besnoiti permet la detecció d'animals clínics i també subclínics (Goldman i Pipano, 1983, Mehlhorn et al., 2009, Frey et al., 2013) a partir de 15-18 dies post infecció un pic d’anticossos entre els 30 i 40 dies (Álvarez-García et al., 2013). És important detectar els animals subclínics ja que representen un risc per a la disseminació de la malaltia tant a nivell d'explotació com en l'intercanvi d'animals vius (EFSA, 2010, Hornok et al., 2014). En els bovins simptomàtics, aquells amb una càrrega parasitària superior són els que desenvolupen uns títols d’anticossos més elevats, probablement degut a l’estimulació antigènica contínua dels quists tissulars sobre la resposta immune (Schares et al., 2011; Frey et al., 2013, Esteban-Gil et al., 2014).

El present estudi serològic és el primer que es realitza sobre besnoitiosi bovina a Catalunya. Tanmateix la malaltia possiblement es mantingui de manera subclínica, com és típic en zones endèmiques, cosa que explicaria la descripció esporàdica de casos clínics (García de Jalón et al., 1995, Vidal et al., 2014).

La besnoitiosi bovina a Catalunya s’hauria d’incloure en el diagnòstic diferencial així com en els controls sanitaris previs al comerç i circulació d'animals, especialment amb països com França on l'intercanvi de bovins és habitual i la malaltia es troba en expansió.

202

203

204

VIII. ESTUDI 3 - Detecció de besnoitiosi bovina a partir de mostres d’escorxador

205

206

Detecció de besnoitiosi bovina a partir de mostres d’escorxador

Introducció

En el present estudi es va avaluar la presència de Besnoitia besnoiti a partir de mostres de sang i de globus oculars provinents d’animals sacrificats a la comarca de la Garrotxa (Girona). L’estudi serològic sobre besnoitiosi bovina realitzat prèviament en poblacions del nord i el sud de Catalunya va detectar una seroprevalença total d’aproximadament el 64%. Alguns dels sèrums analitzats prèviament es trobaven en l'àrea d'influència del clima mediterrani prepirinenc, on es van detectar animals seropositius. La comarca de la Garrotxa també es troba localitzada en la mateixa zona d'influència climàtica i el sistema de cria dels bovins, especialment els de carn, inclou la sortida a pastura. El que va fer plantejar la hipòtesi de si la besnoitiosi també es trobava present i si era possible identificar lesions compatibles en els animals. La lesió patognomònica de la malaltia és la detecció de quists escleroconjuntivals (d'ara endavant EC). Per això, es va considerar realitzar el present estudi a partir de la identificació de quists oculars i establir, si fos possible, la relació amb els resultats serològics dels mateixos animals.

Material i mètodes

Selecció del nombre i tipus de mostres

El nombre de mostres per tal de detectar la presència de lesions (quists EC) va ser calculat utilitzant el sistema WinEpi, amb el 99,5% de confiança. La prevalença mínima esperada de quists es va establir en el 3%, la meitat del percentatge de quists detectats més baix que es troba publicat (Lee et al., 1970, Fernández-García et al., 2010). Sobre una població coneguda de 563.866 bovins l’any 2013 (idesCat), el programari va determinar que un mínim de 174 mostres eren necessàries d’analitzar.

La recollida de mostres es va realitzar en dos escorxadors situats als termes municipals de Tortellà i de la Vall d’en Bas, a la comarca de la Garrotxa (Girona), entre els mesos de març i juny de 2014.

207

Per a cada animal es va enregistrar la informació sobre l’edat, el sexe, la raça i la procedència dels animals. Amb aquesta localització geogràfica de les explotacions es va poder obtenir la informació en quant al clima i l’altitud on es trobaven cadascuna d’elles (ICGC 2009).

En total, es van recollir mostres de 206 animals de sang i ulls. Durant el dessagnat de l’animal a la cadena de sacrifici, es van obtenir mostres de sang en tubs de 10 ml sense anticoagulant i amb EDTA. Mentre es realitzava la recollida de sang, es procedia a una inspecció visual de l'exterior de l'animal per a la detecció de lesions compatibles amb besnoitiosi. Posteriorment, al final de la cadena de sacrifici, es procedia a l’extracció d’un dels ulls del mateix animal que se n'havia extret sang i el seu emmagatzematge en un pot de recollida de mostres degudament identificat.

Després del trasllat al laboratori, es va procedir al dessuerat i la congelació de les mostres de sèrum i de sang en EDTA a -80ºC fins a la seva utilització. Les mostres oculars es guardaven en refrigeració a 4ºC fins al seu anàlisi en els 1-2 dies posteriors a la recollida.

Inspecció dels globus oculars

L’anàlisi es va basar primerament en un examen macroscòpic visual dels globus oculars per a detectar possibles lesions. Seguidament, es realitzava una altra inspecció mitjançant el microscopi estereoscòpic (15x). Posteriorment, es va procedir a la dissecció de tota la conjuntiva bulbar en seccions d'aproximadament 2 cm. Aquesta mesura permetia l'extensió suficient de la mostra, però sense formar plecs, quan es comprimien amb les plaques de compressió utilitzades per al diagnòstic de Trichinella. L'estudi es va realitzar al microscopi òptic a 40x i 100x. La resta del globus ocular va ser inspeccionat altre cop al microscopi estereoscòpic per a detectar possibles quists a la escleròtica.

Les formes quístiques compatibles amb la descripció de Dubey et al. (2003) es van considerar com a quists de Besnoitia.

208

Un cop examinades les mostres oculars, els ulls dels animals majors de 12 mesos es van congelar a -18ºC fins la finalització del procés de recollida i d’anàlisi de mostres per a la seva posterior eliminació a través del servei del PRIOCAT del CReSA. Les mostres d’ulls dels bovins d’una edat major o igual a 12 mesos van ser considerades com a material específic de risc (MER) tal com especifica el Reglament (CE) 999/2001 i han de ser eliminades segons el Reglament (CE) 1069/2009.

Estudi serològic

Els sèrums van ser analitzats amb l'ELISA indirecte comercial PrioCHECK Besnoitia Ab v2.0®(Prionics) seguint les instruccions del fabricant (veure Annex II: procediment 4). A partir de la densitat òptica (DO) es va calcular el percentatge de positivitat (PP) segons la fórmula ((DO mostra – DO control negatiu)/(DO control positiu – DO control negatiu))*100. Segons el fabricant, es va establir que el PP del controls positius era de 100. Els cut-offs era de PP<17 per a les mostres negatives i PP≥23 per a les positives segons les recomanacions del fabricant. Les mostres amb un PP entre 17 i 23 van ser considerades dubtoses i va procedir a reanalitzar-les seguint el mateix protocol. La lectura de la DO es va fer amb l’espectrofotòmetre Labsystems Multiskan RC a 620 nm.

Anàlisi estadístic

El tractament estadístic de les dades es va realitzar amb un model lineal generalitzat que utilitza equacions d'estimació generalitzades (veure Annex I). El model va ser realitzat mitjançant el programari IBM SPSS Statistics v.20.

209

Resultats

Resultats de les mostres recollides

Les 206 mostres analitzades van correspondre a les 73 explotacions representades en el mapa presentat (figura 1). De la comarca de la Garrotxa es varen recollir 119 mostres provinents de 22 explotacions diferents.

Figura 1. Geolocalització de les explotacions d’origen de les mostres.

Segons la localització geogràfica de les mostres, 67 mostres provenien d'una zona amb clima mediterrani prepirinenc i pirinenc, i les 139 restants d'un clima mediterrani prelitoral i litoral (ICGC 2009).

L'altitud de les explotacions es va agrupar segons si es trobaven de 0-199 metres (54 animals), 200-499 (45 animals), 500-999 (101 animals) o 1000-1999 (6 animals).

210

Pel que fa a la raça, 135 eren d’aptitud lletera (raça Frisona) i els 71 restants van ser d’aptitud càrnia on s’incloïen animals de la raça Bruna dels Pirineus (17), Xarolesa (5), Llemosina (15), creuada (30), Albera (2) i Parda Alpina (2). Per a l'anàlisi estadístic, les dues últimes races es van agrupar com a 'altres'.

En quant al sexe dels animals, es varen recollir 164 femelles i 42 mascles.

Els bovins es van agrupar en animals menors o igual a un any d’edat, entre 2 i 5 anys, i en majors de 6 anys d’edat. El nombre d'animals segon l’edat es pot veure representat més endavant a la figura 7.

Estudi dels globus oculars

No es va detectar cap boví amb lesions compatibles de besnoitiosi durant la recollida de mostres de sang. Durant la recollida dels ulls, no es van observar tampoc la presència de quists macroscòpics.

Al laboratori, es van detectar macroscòpicament 7 ulls positius, que presentaven un entre 1 i més de 100 quists per globus ocular. Els quists detectats mesuraven aproximadament 1 mm de diàmetre.

En l'estudi microscòpic dels ulls, es van detectar quists de Besnoitia en localització conjuntival en 8 dels 206 ulls recollits (3,9%). La detecció per plaques de compressió va permetre la identificació d'un quist en un altre animal.

Els 8 animals amb quists EC seran anomenats a partir d'ara com a individus de la 'A' a la 'H' (veure taula 3 més endavant).

Un dels globus oculars (A) presentava una alta càrrega de quists EC (figures 3, 4 i 5) i es va realitzar histopatologia per a observar-ne les estructures (figura 6).

211

Figura 3. Globus ocular de l'animal 'A'. S'observen nombrosos quists EC (fletxa horitzontal) i quists en la còrnia (fletxa vertical).

Figura 4. Quists corneals de Besnoitia de l'animal 'A' observats per plaques de compressió (100x). S'observen les parets quístiques englobant als bradizoïts de color marró.

212

Figura 5. Quists conjuntivals de Besnoitia de l'animal 'A' detectats mitjançant les plaques de compressió (40x). S'observen les parets quístiques refringents i els bradizoïts a l'interior de color marró.

Figura 6. Quists conjuntivals de Besnoitia de l'animal 'A' observats en un tall histològic (40x). Les mesures dels quists oscil·laven entre 350-550 m.

213

Els globus oculars en els que es van detectar quists EC, provenien de 7 explotacions diferents (figura 2). Els animals 'E' i 'F' provenien de la mateixa explotació.

Figura 2. Explotacions d'origen de les mostres amb quists EC.

Resultats de l’estudi serològic

La tècnica d’ELISA va detectar 61 animals seropositius, el que correspon al 29,6% dels bovins analitzats (Interval de Confiança entre 23,1-36,1%). 16 dels 206 animals analitzats van ser dubtosos per segon cop, tots ells de la raça Frisona. A la figura 7 es representen els resultats obtinguts pel que fa a la distribució del nombre d’animals per edats.

214

25 DUB 20 POS

Nombred'animals NEG 15

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Edat (anys)

Figura 7. Distribució del nombre d’animals segons l’edat i els resultats classificats en dubtós (DUB), positiu (POS) o negatiu (NEG).

La seroprevalença en els animals d’aptitud lletera va ser del 23,7%, mentre que en els d’aptitud càrnia fou del 40,8%.

L’anàlisi estadístic dels factors analitzats amb el model lineal generalitzat va trobar diferències significatives en la raça/aptitud i l’edat dels animals (taula 1). La resta de factors no significatius com el sexe, l'altitud i el clima es van eliminar del model estadístic.

215

Taula 1. Model estadístic: mitjanes ajustades (%) i interval de confiança (IC) de Wald al 95%, dels animals positius en per a cada factor

Mitjana IC Sig. (n total= 206) n ajustada (%) Bonferroni (%) Edat ≤ 1 any 65 13 5-28 2 a 5 anys 67 85 67-94 0,000* ≥ 6 anys 58 63 45-79 Raça Creuada 30 59 34-80 Frisona 119 13 7-22 Bruna 17 61 32-84 0,000* Xarolesa 5 72 21-96 Llemosina 15 57 23-86 Altres 4 64 32-87 n: nombre de mostres. Sig. Bonferroni: p-valor segons la correcció de Bonferroni (* significatiu).

Com s'observa en els resultats del model (taula 1), tots els rangs d’edat presenten diferències significatives en relació a la seropositivitat quan es comparen entre sí. Les mitjanes ajustades entre els diferents rangs són estadísticament significatives. Mentre que en el factor raça, les frisones presenten una seropositivitat estadísticament menor respecte a les races bovines creuades i la Bruna dels Pirineus.

Per tal d’avaluar les possibles interaccions entre l’edat i l’aptitud dels animals, s'agrupen els animals de raça Frisona (i 3 creuats lleters) en aptitud lletera i la resta de bovins en aptitud càrnia (taula 2). D'aquesta manera s’observa com els lleters entre 2 i 5 anys tenen una mitjana ajustada superior a la resta de rangs d’edat. I en el cas dels bovins d'aptitud càrnia, els animals a partir de 2 anys són els que presenten una positivitat superior (82 i 79%) respecte al grup de menys d’un any.

216

Taula 2. Model estadístic: mitjanes ajustades (%) i interval de confiança (IC) de Wald al 95%, dels animals positius en segons l'aptitud i el rang d’edat.

Rang d’edat ≤ 1 any 2 a 5 anys ≥ 6 anys Sig. Bonferroni Aptitud càrnia 13 (6-28) 82 (49-95) 79 (55-92) 0,000* (n=71) Aptitud 7 (2-25) 43 (31-56) 15 (7-30) 0,000* lletera (n=122) Sig. Bonferroni: p-valor segons la correcció de Bonferroni (* significatiu).

Pel que fa a la relació entre la serologia i la detecció de quists EC, tots els animals amb quists EC van resultar seropositius a la prova ELISA (taula 3, figura 8). De manera que podem observar que en només el 13% dels animals seropositius (8/61) van presentar quists al globus ocular. Un 3,9% dels animals estudiats (8/206).

Taula 3. Dades corresponents als 8 bovins que presenten quists EC i valor de PP en la tècnica d'ELISA.

Animal Raça Edat (anys) Nombre de quists PP A Bruna 4 >100 109,06 B Frisona 3 >50 159,11 C Creuada 1 9 52,82 D Creuada 1 6 143,96 E Llemosina 1 5 39,06 F Llemosina 1 4 49,47 G Bruna 9 1 92,13 H Xarolesa 14 1 76,45

A la figura 8 es presenta com els animals amb quists EC es troben en zones properes (o superiors) al valor de 100 PP que correspon al control positiu.

217

180 B PP 160 D 140

120 A

100 G H 80 C 60 F

40 E

0 0 50 100 150 200 nombre d'animals

Figura 8. Distribució del percentatge de positivitat (PP) dels sèrums analitzats. S'identifiquen els animals amb quists amb una sageta i la lletra corresponent a la referència de la taula 3. La línea vermella equival al cut-off (23PP) i la línea discontínua al valor del control positiu establert com a 100.

218

Discussió Els resultats confirmen la presència del paràsit a la zona nord de Catalunya tant en explotacions lleteres com de carn. Segons les dades obtingudes, un 29,6% dels bovins analitzats presenten anticossos anti-Besnoitia besnoiti però només el 3,9% dels animals analitzats presenten quists EC.

Aquests valors resten allunyats dels valors propers al 80% de seropositivitat que es detecten en estudis realitzats en zones pirineques d’Osca, considerades com a una de les àrees emergents de besnoitiosi (Fernández-García et al., 2010; Gutiérrez-Expósito et al., 2014). Però els resultats obtinguts podrien situar a l’àrea nord de Catalunya com a una zona amb poca presència de lesions. En àrees enzoòtiques la seroprevalença sol estar propera al 50% però l’evidència de signes clínics sol ser inferior al 10% dels animals (Goldman i Pipano, 1983; EFSA, 2010) cosa que concordaria amb les dades obtingudes si considerem 'presència de quists' com a signe clínic. No obstant, no es pot assegurar que ens trobem en una zona endèmica ja que els animals sacrificats a l'escorxador es troben principalment en el rang de 0-2 anys, i possiblement el resultat depengui de la distribució dels animals estudiats.

La baixa incidència dels signes clínics podria explicar la poca atenció que ha rebut la malaltia fins ara en aquesta zona del territori català així com el fet de que durant la inspecció dels animals estudiats, no s’observessin signes o lesions compatibles amb la besnoitiosi. La detecció dels signes clínics depèn de la fase de la malaltia. Durant la fase aguda els signes generalment són inespecífics i sovint passen desapercebuts o es confonen amb altres patologies (Cortes et al., 2005; Jacquiet et al., 2010; Álvarez- García et al., 2014a). Fet que pot succeir també en la fase crònica, ja sigui per la dificultat d’observar els quists oculars o bé per que s’ha observat que la càrrega parasitària està relacionada amb la gravetat de les lesions cutànies (Bigalke, 1968; Liénard et al., 2011). En estudis recents, s’ha observat que els bovins amb lesions evidents, i per tant amb una càrrega parasitària superior, desenvolupen uns títols d’anticossos més elevats, possiblement per l’estimulació antigènica contínua dels quists tissulars sobre la resposta immune (Schares et al., 2011; Frey et al., 2013; Esteban-Gil et al., 2014). En el present estudi, dos dels sèrums amb un PP superior al control positiu corresponen als animals que mostren un major nombre de quists.

219

Aquests animals possiblement tendeixen a desenvolupar respostes immunitàries més marcades i la tècnica d'ELISA estableix uns PP prop de valor de 100. Tanmateix, podrien aparèixer quists en localitzacions no oculars que no s’han pogut detectar (Frey et al., 2013) o bé, com passa en la majoria de casos, que els animals són portadors subclínics (Mehlhorn et al., 2009). Tenint en compte aquestes observacions, seria recomanable iniciar les mesures de control a l’explotació amb els animals amb les seroprevalences més elevades i possiblement eliminar-los del ramat.

D’acord amb altres investigacions, tots els animals del present estudi on es van detectar quists EC, van resultar seropositius (Liénard et al., 2011), tot i que també s’han descrit casos d’animals amb signes clínics que es diagnosticar com a seronegatius (Cortes et al., 2006b; Schares et al., 2010).

Estudis en zones emergents de la Península ibèrica han detectat una seropositivitat superior en les races d'aptitud càrnia (Fernández-García et al., 2012; Álvarez-García et al., 2014), com es confirma en el nostre estudi. Tot i això, diversos autors associen aquests resultats amb factors de risc relacionats amb el sistema de maneig com ara la cria en extensiu/semiextensiu o la munta natural (Castillo, 2009; Gentile et al., 2012; Álvarez-García et al., 2013).

En el nostre estudi, els animals joves (entre 9 i 12 mesos) presenten la seroprevalença més baixa. Una possible explicació és la davallada d’anticosos calostrals, ja que segons Janitschke et al. (1984) i Shkap et al. (1994) tenen una durada de fins als 6 mesos. Una altra hipòtesi és que encara no hi ha hagut contacte amb el patogen.

Observem una major seroprevalença a partir dels 2 anys d’edat (Legrand, 2003; Jacquiet et al., 2010) encara que en el ramat lleter la seroprevalença disminueix en el rang d’edat de més de 5 anys. Tot i que s’ha de tenir en compte que el nombre d’animals lleters majors de vuit anys és baix i podria esbiaixar els resultats.

En general, és més habitual trobar signes clínics en els individus entre els 2 i 4 anys d’edat (Legrand, 2003; Freudiger, 2008; Jacquiet et al., 2010). En el nostre cas, també els dos animals de 3 i 4 anys d’edat són els que presenten un nombre de quists més elevat a la resta.

220

El nombre d’animals que presenten quists a la conjuntiva ocular sol ser inferior al nombre de seropositius (Fernández-García et al., 2010; Liénard et al., 2011; Basso et al., 2013). En l'estudi de Fernández-García et al. (2010) realitzat en un brot epidèmic a Guadalajara, d’un 90,5% dels animals seropositius per ELISA, el 43% presentaven quists. A França, la seroprevalença es va detectar entre el 30-90% amb la presència de quists entre el 9-23%, respectivament (Liénard et al., 2011). Mentre que en l’estudi de Basso et al. (2013) realitzat a Suïssa amb bovins importats de França, només en un animal es va detectar quists EC, mentre que en WB es van diagnosticar 8 de 767 bovins.

Fins on coneixem, no hi ha cap article publicat sobre la troballa de quists a la còrnia ocular de bovins. Únicament en l’estudi de Pols (1960) s'han detectat quists corneals en ovelles inoculades experimentalment. En el nostre estudi, l’únic animal que mostra quists a la còrnia també és el que presenta un major nombre de quists EC. Encara que no ho vam poder comprovar, no es descarta que la parasitació es trobés generalitzada també en altres teixits (Frey et al., 2013).

La detecció macroscòpica de quists EC compta amb una alta especificitat però la observació microscòpica permet reduir els falsos positius en casos de nòduls limfoides conjuntivals amb aspecte similar (Ducrocq et al., 2012). Per altra banda, els estudis realitzats en caribú amb B. tarandii demostren una millora en la sensibilitat quan es fa l’estudi microscòpic dels globus oculars (Ducrocq et al., 2012), el que estaria en concordança amb el present estudi, ja que en la recollida de mostres a l'escorxador no es van observar quists EC. Tot i així, s’ha de tenir en compte que els quists poden tardar fins de 4 a 7 setmanes en desenvolupar-se (Pols, 1960; Bigalke, 1968; Fernández-García et al., 2010; Liénard et al., 2011). Així doncs, seria recomanable d'establir un seguiment a les explotacions infectades.

Els animals subclínics suposen un risc dintre de l’explotació, ja que els animals actuen com a portadors i per tant com a disseminadors de la malaltia. Com s’ha comprovat en la zona estudiada, hi ha bovins infectats i per tant cal suposar que es donen les condicions per a l’establiment i la propagació de la malaltia. Aquest fet implica que la besnoitiosi s’ha de tenir present tant en els diagnòstics diferencials com a l’hora de prendre mesures per a evitar-ne la seva disseminació.

221

222

IX. CONCLUSIONS

223

224

CONCLUSIONS GENERALS

1. Aquest treball és el primer estudi epidemiològic realitzat a Catalunya sobre la presència i distribució d’Anaplasma spp. i Babesia bigemina a la cabana bovina.

2. Els resultats de seroprevalença per a Anaplasma spp. és del 39,9% i del 54,4% enfront a Babesia bigemina. Els factors determinants en l’epidemiologia de les hemoparasitosis són l’edat i la cria en extensiu. En relació a l’edat, els bovins adults presenten una major seroprevalença. D’altra banda, la cria en extensiu afavoreix un major contacte amb les paparres vectores.

3. Donada la seroprevalença obtinguda per a l’anaplasmosi i babesiosi, s’haurien d’incloure en el diagnòstic diferencial de les malalties que cursen amb anèmia i icterícia en bovins.

4. Pel que fa a Besnoitia besnoiti, l’estudi aporta per primer cop informació sobre la presència del patogen en bovins de l’àrea del Pirineu-prepirineu i Ports de Tortosa- Beseit. Si tenim en compte els resultats de seroprevalença (64%), seria recomanable donar una major importància al diagnòstic de la besnoitiosi bovina.

5. La cria en extensiu es pot considerar un factor de risc, encara que en les explotacions de producció intensiva els resultats suggereixen que hi poden haver altres vies de transmissió.

6. La detecció macroscòpica de quists escleroconjuntivals, en condicions òptimes, és una tècnica diagnòstica fiable, ràpida i econòmica per al diagnòstic de Besnoitia. En el nostre estudi, d’un total de 61 animals seropositius, s’han detectat quists en 7 animals.

7. Les plaques de compressió milloren la sensibilitat i especificitat en el diagnòstic de quists de Besnoitia en comparació a l'estudi macroscòpic ja que s’han detectat 8 animals. Si el nombre de quists escleroconjuntivals és baix, podrien passar desapercebuts si no s'utilitzen tècniques de microscòpia.

225

226

X. AGRAÏMENTS

227

228

AGRAÏMENTS

M’agradaria donar les gràcies a cadascuna de les persones que durant la realització de la present tesi, han aportat ja sigui un granet de sorra o una mica més, per a que la tesi pogués tirar endavant. Potser me’n deixo algú, em sap greu, però tots hi esteu presents.

Primerament, al Dr. Joaquim Castellà i na Dra. Anna Ortuño, codirectors de la tesi, per mostrar suport en tot moment i les oportunitats brindades durant aquests anys a la Unitat de Parasitologia. Una (molt bona) experiència que no oblidaré mai.

A la resta de membres de la Unitat, que directament o indirectament també han col·laborat per al bon funcionament de la maquinària. Gràcies a en David, la Rosa i en Xavi.

No puc oblidar d’on provenen les mostres, part imprescindible per a la realització d’aquesta tesi d’aprofitament de recursos. Moltes gràcies a en Florenci Vivas, llavors cap del LSR de Barcelona i en Iscle Selga, cap del Servei de Coordinació i Gestió Territorial de la Catalunya central, per permetrem l’ús de les mostres del LSR de Barcelona. També a totes les “nenes” del laboratori, que durant aquells anys treballant allà, van respectar “el meu calaix de mostres” i pels bons moments.

A en Narcís Morera, veterinari responsable d’escorxadors de la Garrotxa, per permetre’ns l’accés als animals dels escorxadors.

A tots els ramaders, tècnics, veterinaris, familiars, amics, coneguts, funcionaris, personal d’escorxador...que en algun moment he requerit del seu temps per a complimentar dades i qüestionaris o recollir mostres.

A n'Oliver Valero del Servei d'Estadística Aplicada (UAB) pel suport estadístic amb l'ús del model lineal.

A na Teresa Rigau, per facilitar-me informació publicada a Anembe.

A n’Enric Vidal i el servei del PRIOCAT del CReSA per a permetre’ns l’eliminació del material MER.

No puc oblidar l’altre gran pilar que ha fet possible la present tesi, els familiars i els amics. Moltes gràcies a tots pel suport i els ànims durant tots aquests anys. Em quedaria curt de posar-me a explicar les aventures.

Gràcies als de casa, per ser-hi sempre i no fallar mai.

I per suposat a l’Ana, imprescindible en molts moments durant aquests anys.

229

230

XI. ANNEXES

231

232

ANNEX I: Fonament de l'anàlisi estadístic

En aquest annex s'explica de manera resumida i simplificada en què es basa el model estadístic utilitzat en els estudis.

El model lineal generalitzat (MLG)

És una generalització del mètode de regressió lineal on la variable resposta es troba relacionada linealment amb els factors (predictors categòrics com el sexe, aptitud,...) i les covariables (predictors d'escala com l'edat) mitjançant una funció d'enllaç.

Engloba diferents classes de models com regressió lineal, ANOVA, regressió de Poisson, models log-linials etc. Segons el tipus de variables s'utilitzarà un model o un altre.

El model lineal generalitzat està format per:

1. Component aleatòria:

Identifica la variable resposta i la seva distribució de probabilitat. Consisteix en una variable aleatòria Y amb observacions independents (y1,...,yn).

Els diferents tipus de distribució binomial, de Poisson o normal es poden incloure dins la família exponencial de distribucions

on Q() rep el nom de paràmetre natural.

2. Component sistemàtica:

Especifica les variables explicatives (independents o predictores) utilitzades com a efectes fixos a la funció predictora lineal.

Les variables xj es relacionen com 0 + 1x1 + ... + kxk

233

3. Funció d'enllaç:

És una funció del valor esperat de Y. Es denota Y com a  = E(Y) de manera que la funció enllaç especifica la funció g(·) que relaciona  amb el predictor lineal com a

g() = 0 + 1x1 + ... + kxk

D'aquesta manera, la funció d'enllaç g(·) relaciona les components aleatòria i sistemàtica.

Així que per a i = 1,...,N,

i = E (Yi)

En el nostre model, les observacions de Y són binàries i les identifiquem com a seropositiu (1) o seronegatiu (0) essent la component aleatòria Y  Bin (1,).

En el nostre cas, la funció d'enllaç és

 =logit(π)=log 

Bibliografia:

STAT 504 – Analysis of Discrete Data, 2015. Department of Statistics Online Programs. The Pennsylvania State University.

234

Els resultats del MLG els obtenim a l'SPSS presentats com a mitjanes estimades (o ajustades) per als nivells de factors i les interaccions dels factors.

Per exemple, en el cas del factor 'pastura' on '0' és no sortir a pasturar (cria en intestiu) i '1' és sortir a pastura (semiextensiu/extensiu):

Estimacions

Pastura Media Típ. Interval de confiança de Error Wald 95%

Inferior Superior

0 ,73 ,049 ,62 ,81

1 ,58 ,032 ,51 ,64

(I)Pastura (J)Pastura Diferencia de Típ. gl Sig. de mitjanes (I-J) Error Bonferroni

0 1 ,15a ,052 1 ,004

1 0 -,15a ,052 1 ,004

D'aquesta manera podem observar que en aquest cas, la variable resposta '0' (0,73) té una mitjana ajustada superior a la resposta '1' (0,58) de manera significativa (Nivell de significació amb la correcció de Bonferroni <0.05, presentat com 'Sig. de Bonferroni') i per tant, els que no surten a pastura tenen més probabilitat d'èxit, és a dir, més probabilitats de ser positius.

235

A continuació s'adjunta la sintaxi utilitzada per a la realització dels estudis.

Sintaxi utilitzada en el programari SPSS. MLG per a l'estudi d'Anaplasma:

GENLIN ANA_resultat (REFERENCE=FIRST) BY Clau_provincia Alçada_agrupades Edat_0a2_3a6_7 Pastura BAB_resultat Clima (ORDER=ASCENDING) /MODEL Clau_provincia Alçada_agrupades Edat_0a2_3a6_7 Pastura BAB_resultat Clima INTERCEPT=YES DISTRIBUTION=BINOMIAL LINK=LOGIT /CRITERIA METHOD=FISHER(1) SCALE=1 MAXITERATIONS=100 MAXSTEPHALVING=5 PCONVERGE=1E-006(ABSOLUTE) SINGULAR=1E-012 ANALYSISTYPE=3(WALD) CILEVEL=95 LIKELIHOOD=FULL /EMMEANS TABLES=Clau_provincia SCALE=ORIGINAL COMPARE=Clau_provincia CONTRAST=PAIRWISE PADJUST=BONFERRONI /EMMEANS TABLES=Alçada_agrupades SCALE=ORIGINAL COMPARE=Alçada_agrupades CONTRAST=PAIRWISE PADJUST=BONFERRONI /EMMEANS TABLES=Edat_0a2_3a6_7 SCALE=ORIGINAL COMPARE=Edat_0a2_3a6_7 CONTRAST=PAIRWISE PADJUST=BONFERRONI /EMMEANS TABLES=Pastura SCALE=ORIGINAL COMPARE=Pastura CONTRAST=PAIRWISE PADJUST=BONFERRONI /EMMEANS TABLES=BAB_resultat SCALE=ORIGINAL COMPARE=BAB_resultat CONTRAST=PAIRWISE PADJUST=BONFERRONI /EMMEANS TABLES=Clima SCALE=ORIGINAL COMPARE=Clima CONTRAST=PAIRWISE PADJUST=BONFERRONI /REPEATED SUBJECT=ID_animal SORT=YES CORRTYPE=INDEPENDENT ADJUSTCORR=YES COVB=ROBUST MAXITERATIONS=100 PCONVERGE=1e-006(ABSOLUTE) UPDATECORR=1 /MISSING CLASSMISSING=EXCLUDE /PRINT CPS DESCRIPTIVES MODELINFO FIT SUMMARY SOLUTION.

Sintaxi utilitzada en el programari SPSS. MLG per a l'estudi de Babesia:

GENLIN BAB_resultat (REFERENCE=FIRST) BY Clau_provincia Alçada_agrupades Edat_0a2_3a6_7 Pastura Clima ANA_resultat (ORDER=ASCENDING) /MODEL Clau_provincia Alçada_agrupades Edat_0a2_3a6_7 Pastura Clima ANA_resultat INTERCEPT=YES DISTRIBUTION=BINOMIAL LINK=LOGIT /CRITERIA METHOD=FISHER(1) SCALE=1 MAXITERATIONS=100 MAXSTEPHALVING=5 PCONVERGE=1E-006(ABSOLUTE) SINGULAR=1E-012 ANALYSISTYPE=3(WALD) CILEVEL=95 LIKELIHOOD=FULL

236

/EMMEANS TABLES=Clau_provincia SCALE=ORIGINAL COMPARE=Clau_provincia CONTRAST=PAIRWISE PADJUST=BONFERRONI /EMMEANS TABLES=Alçada_agrupades SCALE=ORIGINAL COMPARE=Alçada_agrupades CONTRAST=PAIRWISE PADJUST=BONFERRONI /EMMEANS TABLES=Edat_0a2_3a6_7 SCALE=ORIGINAL COMPARE=Edat_0a2_3a6_7 CONTRAST=PAIRWISE PADJUST=BONFERRONI /EMMEANS TABLES=Pastura SCALE=ORIGINAL COMPARE=Pastura CONTRAST=PAIRWISE PADJUST=BONFERRONI /EMMEANS TABLES=Clima SCALE=ORIGINAL COMPARE=Clima CONTRAST=PAIRWISE PADJUST=BONFERRONI /EMMEANS TABLES=ANA_resultat SCALE=ORIGINAL COMPARE=ANA_resultat CONTRAST=PAIRWISE PADJUST=BONFERRONI /REPEATED SUBJECT=ID_animal SORT=YES CORRTYPE=INDEPENDENT ADJUSTCORR=YES COVB=ROBUST MAXITERATIONS=100 PCONVERGE=1e-006(ABSOLUTE) UPDATECORR=1 /MISSING CLASSMISSING=EXCLUDE /PRINT CPS DESCRIPTIVES MODELINFO FIT SUMMARY SOLUTION.

Sintaxi utilitzada en el programari SPSS. MLG per a l'estudi de Besnoitia (Estudi I):

GENLIN Res_BESN (REFERENCE=FIRST) BY Clima Pastura Edat_0a4_5 (ORDER=ASCENDING) /MODEL Clima Pastura Edat_0a4_5 INTERCEPT=YES DISTRIBUTION=BINOMIAL LINK=LOGIT /CRITERIA METHOD=FISHER(1) SCALE=1 MAXITERATIONS=100 MAXSTEPHALVING=5 PCONVERGE=1E-006(ABSOLUTE) SINGULAR=1E-012 ANALYSISTYPE=3(WALD) CILEVEL=95 LIKELIHOOD=FULL /EMMEANS TABLES=Clima SCALE=ORIGINAL COMPARE=Clima CONTRAST=PAIRWISE PADJUST=BONFERRONI /EMMEANS TABLES=Pastura SCALE=ORIGINAL COMPARE=Pastura CONTRAST=PAIRWISE PADJUST=BONFERRONI /EMMEANS TABLES=Edat_0a4_5 SCALE=ORIGINAL COMPARE=Edat_0a4_5 CONTRAST=PAIRWISE PADJUST=BONFERRONI /REPEATED SUBJECT=ID_animal SORT=YES CORRTYPE=INDEPENDENT ADJUSTCORR=YES COVB=ROBUST MAXITERATIONS=100 PCONVERGE=1e-006(ABSOLUTE) UPDATECORR=1 /MISSING CLASSMISSING=EXCLUDE /PRINT CPS DESCRIPTIVES MODELINFO FIT SUMMARY SOLUTION.

237

Sintaxi utilitzada en el programari SPSS. MLG per a l'estudi de Besnoitia (Estudi II):

GENLIN resultat_ELISA (REFERENCE=FIRST) BY clau_raça clau_sexe Edat_0a1_2a5_6 Alçada_clau Clima (ORDER=ASCENDING) /MODEL clau_raça clau_sexe Edat_0a1_2a5_6 Alçada_clau Clima INTERCEPT=YES DISTRIBUTION=BINOMIAL LINK=LOGIT /CRITERIA METHOD=FISHER(1) SCALE=1 MAXITERATIONS=100 MAXSTEPHALVING=5 PCONVERGE=1E-006(ABSOLUTE) SINGULAR=1E-012 ANALYSISTYPE=3(WALD) CILEVEL=95 LIKELIHOOD=FULL /EMMEANS TABLES=clau_raça SCALE=ORIGINAL COMPARE=clau_raça CONTRAST=PAIRWISE PADJUST=BONFERRONI /EMMEANS TABLES=clau_sexe SCALE=ORIGINAL COMPARE=clau_sexe CONTRAST=PAIRWISE PADJUST=BONFERRONI /EMMEANS TABLES=Edat_0a1_2a5_6 SCALE=ORIGINAL COMPARE=Edat_0a1_2a5_6 CONTRAST=PAIRWISE PADJUST=BONFERRONI /EMMEANS TABLES=Alçada_clau SCALE=ORIGINAL COMPARE=Alçada_clau CONTRAST=PAIRWISE PADJUST=BONFERRONI /EMMEANS TABLES=Clima SCALE=ORIGINAL COMPARE=Clima CONTRAST=PAIRWISE PADJUST=BONFERRONI /REPEATED SUBJECT=ID_animals SORT=YES CORRTYPE=INDEPENDENT ADJUSTCORR=YES COVB=ROBUST MAXITERATIONS=100 PCONVERGE=1e-006(ABSOLUTE) UPDATECORR=1 /MISSING CLASSMISSING=EXCLUDE /PRINT CPS DESCRIPTIVES MODELINFO FIT SUMMARY SOLUTION.

238

ANNEX II: Protocols de les tècniques ELISA

1. Tècnica d’ELISA de competició comercial Anaplasma antibody test kit cELISA  (VMRD):

Preparació del conjugat:

- Diluir 1:100 el conjugat concentrat en buffer de dilució del conjugat.

Preparació de la solució de rentat:

Diluir 1:10 del concentrat de al solució de rentat en aigua destil·lada.

Preparació dels sèrums:

No es dilueixen.

Procediment de la tècnica:

- Temperar les plaques i reactius

- Transferir 70 µl de les mostres de sèrum i els controls, per duplicat, positius i negatius a la placa de transferència (A)

- Incubar durant 30 min a temperatura ambient (21-25ºC)

- Transferir 50 µl dels sèrums i els controls de la placa de transferència (A) a la placa tamisada amb antigen d’Anaplasma (B)

- Incubar 1 h a temperatura ambient

- Rentar 2 cops les plaques amb la solució de rentat (dilució 1:10 de la solució de rentat concentrada amb aigua destil·lada)

- Afegir 50 µl del conjugat diluït (dilució 1:100 del concentrat conjugat anticòs- peroxidasa amb el buffer de dilució del conjugat) a tots els pouets de la placa B

239

- Incubar 20 min a temperatura ambient

- Rentar 4 cops les plaques amb la solució de rentat

- Afegir 50 µl de la solució de substrat TMB a cada pouet de la placa B

- Incubar 20 min a temperatura ambient

- Aturar la reacció afegint 50 µl de la solució d’stop a cada pouet

- Realitzar la lectura de la placa amb un espectrofotòmetre a 620 nm

240

2. Tècnica d'ELISA indirecte comercial B. bigemina-Ab Svanovir  (Svanova Biotech):

Preparació de buffer PBS-Tween:

- Diluir 1:20 la solució concentrada de PBS-Tween en aigua destil·lada

Preparació del conjugat:

- Reconstituir el conjugat liofilitzat amb 11,5 ml de PBS-Tween Buffer

Preparació de les mostres:

- Els controls positius i negatius han de ser diluïts 1:100 en PBS-Tween Buffer

- Les mostres a analitzar també han de ser diluïdes 1:100 en PBS-Tween Buffer

Procediment de la tècnica:

- Temperar les plaques i reactius

- Prediluir les mostres de sèrum i els controls (dilució 1:100) amb el Buffer PBS-Tween diluït (dilució 1:20 del Buffer PBS-Tween concentrat amb aigua destil·lada)

- Afegir a la placa d’ELISA per duplicat, 100 µl dels controls positiu i negatiu prediluïts

- Afegir 100 µl de les mostres de sèrum prediluïdes a la placa d’ELISA

- Incubar la placa a 37ºC durant 30 min

- Rentar la placa 4 cops amb el Buffer PBS-Tween diluït

- Afegir 100 µl del conjugat reconstituït (conjugat liofilitzat amb 11,5 ml Buffer PBS- Tween)

- Incubar la placa a 37ºC durant 30 min

- Rentar la placa 4 cops amb el Buffer PBS-Tween diluït

- Afegir 100 µl de la solució de substrat TMB a cada pouet

241

- Incubar la placa 30 min a temperatura ambient

- Aturar la reacció afegint 100 µl de la solució d’stop

- Realitzar la lectura de la placa amb un espectrofotòmetre a 405 nm

242

3. Procediment de la tècnica d'ELISA indirecte comercial PRIOCHECK Besnoitia Ab v.2.0  (Prionics) per a l'estudi 2:

- Temperar les plaques i reactius

Preparació de les solucions:

- Controls:

Reconstituir les mostres control amb 150 l d'aigua desmineralitzada, 30 min abans del seu ús

- Dilucions del líquid de rentat:

Per a cada litre de solució de rentat afegir 950 ml d'aigua desmineralitzada + 50 ml del líquid concentrat de rentat + 1 ml d'additiu del líquid de rentat

- Conjugat:

Diluir la solució de conjugat concentrat a una dilució 1:30 amb el diluent de conjugat

Preparació de les mostres en una placa de dilució:

- Diluir les mostres de sèrum i els controls positiu, positiu dèbil i negatiu 1:10 amb el diluent de la mostra en una placa de dilució en pouets diferents.

243

Procediment de la tècnica d'ELISA:

- Afegir 10 l de la dilució dels controls de la placa de dilució a la placa d'ELISA en pouets diferents

- Afegir 90 l del diluent de la mostra a tots els pouets de la placa d'ELISA (dilució 1:10)

- Incubar les mostres de la placa d'ELISA a temperatura ambient durant 1 hora

- Rentar la placa 4 cops amb 300 l de la solució de la rentat

- Afegir 100 l del conjugat diluït a cada pouet

- Incubar les mostres de la placa d'ELISA a temperatura ambient durant 30 minuts

- Rentar la placa 4 cops amb 300 l de la solució de la rentat

- Afegir 100 l de substrat TMB

- Incubar la placa durant 15 minuts a temperatura ambient

- Afegir 100 l de solució d'stop

- Esperar durant 15 minuts abans de la lectura de la placa en un espectrofotòmetre a 450 nm.

244

4. Procediment de la tècnica d'ELISA indirecte comercial PrioCHECK  Besnoitia Ab 2.0 (Prionics) per a l'estudi 3:

- Temperar les plaques i reactius

Preparació de les solucions:

- Solució de rentat:

Diluir el líquid de rentat concentrat a una dilució 1:20 amb aigua desmineralitzada

- Conjugat:

Diluir el conjugat concentrat 1:30 amb el diluent de conjugat

Preparació de les mostres en una placa de dilució:

- En una placa de dilució, diluir les mostres de sèrum 1:10 amb la solució de dilució de les mostres

- Transferir 10 l de les mostres diluïdes a la placa de dilució a la placa d'ELISA

- Afegir 90 l del diluent de les mostres a cada pouet de la placa d'ELISA

- Afegir 10 l dels control positiu, positiu dèbil i negatiu en pouets diferents

- Incubar la placa d'ELISA a temperatura ambient durant 1 hora

- Rentar la placa 3 cops amb 300 l de la solució de la rentat

- Afegir 100 l del conjugat diluït a cada pouet

- Incubar la placa d'ELISA a temperatura ambient durant 30 minuts

- Rentar la placa 3 cops amb 300 l de la solució de la rentat

- Afegir 100 l de substrat TMB

- Incubar la placa durant 15 minuts a temperatura ambient

- Afegir 100 l de solució d'stop

- Esperar durant 15 minuts abans de la lectura de la placa en un espectrofotòmetre a 450 nm.

245

246

XII. BIBLIOGRAFIES

247

248

BIBLIOGRAFIA D' HEMOPARASITOSIS

Abbott, J.R., Palmer, G.H., Howard, C.J., Hope, J.C., Brown, W.C., 2004. Anaplasma marginale major surface protein 2 CD4+ T-cell epitopes are evenly distributed in conserved and hypervariable regions (HVR), whereas linear B-cell apitopes are predominantly located in the HVR. Infection and Immunity, 72 (12): 7360-7366.

Abbott, J.R., Palmer, G.H., Kegerreis, K.A., Hetrick, P.F., Howard, C.J., Hope J.C., Brown, W.C., 2005. Rapid and long-term disappearance of CD4+ T lymphocyte responses specific for Anaplasma marginale major surface protein-2 (MSP2) in MSP2 vaccinates following challenge with live A. marginale. The Journal of Immunology, 174: 6702-6715.

Adams, J.H., Shiels, I.A., de Vos, A.J., 1989. Heterologous antibody responses of calves to Anaplasma centrale and A. marginale. Veterinary Parasitology, 31 (1): 7-12.

Agnes, J.T., Herndon, D., Ueti, M.W., Ramabu, S.S., Evans, M., Brayton, K.A., Palmer, G.H., 2010. Association of pathogen strain-specific gene transcription and transmission efficiency phenotype of Anaplasma marginale. Infection and Immunity, 78 (6): 2446- 2453.

Aguirre, D.H., Bermúdez, A.C., Mangold, A.J., Guglielmone, A.A., 1988. Natural infection with Anaplasma marginale in cattle of the Hereford, Criolla, and Nelore breeds in Tucumán, Argentina. Revista Latinoamericana de Microbiología, 30 (1): 37- 41.

Aikawa. M., Rabbege, J., Uni, S., Ristic, M., Miller, L.H., 1985. Structural alteration of the membrane of erythrocytes infected with Babesia bovis. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 34 (1): 45-49.

Ait-Hamou, S., Rahali, T., Sahibi, H., Belghyti, D., Losson, B., Goff, W., Rhalem, A., 2012. Molecular and serological prevalence of Anaplasma marginale in cattle of North Central Morocco. Research in Veterinary Science, 93: 1318-1323.

Ajayi, S.A., Dipeolu, O.O., 1986. Prevalence of Anaplasma marginale, Babesia bigemina and B. bovis in nigerian cattle using serological methods. Veterinary Parasitology, 22: 147-149.

249

Al-Adhami, B., Scandrett, W.B., Lobanov V.A., Gajadhar, A.A., 2011. Serological cross- reactivity between Anaplasma marginale and Ehrlichia species in naturally and experimentally infected cattle. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 23: 1181- 1188.

Alfredo, A.A.N., Jonsson, N.N., Finch, T.M., Neves, L., Molloy, J.B., Jorgensen, W.K., 2005. Serological survey of Babesia bovis and Anaplasma marginale in cattle in Tete province, Mozambique. Tropical Animal Health and Production, 37: 121-131.

Allred, D.R., Cinque, R.M., Lane, T.J., Ahrens, K.P., 1994. Antigenic variation of parasite- derived antigens on the surface of Babesia bovis-infected erythrocytes. Infection and Immunity, 62 (1): 91-98.

Allred, D.R., Carlton, J.M.R., Satcher, R.L., Long, J.A., Brown, W.C., Patterson, P.E., O’Connor, R.M., Stroup, S.E., 2000. The ves multigene family of B. bovis encodes components of rapid antigenic variation at the infected erythrocyte surface. Molecular Cell, 5, 153-162.

Allred, D.R., 2001. Molecular technology and antigenic variation among intraerythrocytic hemoparasites: do we see reality? Veterinary Parasitology, 101 (3-4): 261-274.

Allred, D.R., 2007. Dynamics of anemia progression and recovery in Babesia bigemina infection is unrelated to initiating parasite burden. Veterinary Parasitology, 146: 170- 174.

Almazán, C., Blas-Machado, U., Kocan, K.M., Yoshioka, J.H., Blouin, E.F., Mangold, A.J., de la Fuente, J., 2005a. Characterization of three Ixodes scapularis cDNAs protective against tick infestations. Vaccine, 23 (35): 4403-4416.

Almazán, C., Kocan, K.M., Blouin, E.F., de la Fuente, J., 2005b. Vaccination with recombinant tick antigens for the control of Ixodes scapularis adult infestations. Vaccine, 23 (46-47): 5294-5298.

Almería, S., Castellà, J., Ferrer, D., Ortuño, A., Estrada-Peña, A., Gutiérrez, J.F., 2001. Bovine piroplasms in Minorca (Balearic Islands, Spain): a comparison of PCR-based and light microscopy detection. Veterinary Parasitology, 99: 249-259.

Almería, S., Castellà, J., Ferrer, D., Gutiérrez, J.F., Estrada-Peña, A., Sparagano, O., 2002. Reverse line blot hybridization used to identify hemoprotozoa in minorcan cattle. Annals of the New York Academy of Sciences, 969: 78-82.

250

Almería, S., Delgado-Neira, Y., Adelantado, C., Huguet, M., Vinent, J., Nicolàs, A., 2009. Mediterranean theileriosis and other tick transmitted piroplasmoses in cattle in Minorca (Balearic Islands, Spain): the effect of tick control on prevalence levels analyzed by Reverse Line Blot (RLB) macroarrays. Journal of Parasitology, 95 (3): 598- 603.

Altay, K., Aydin, M.F., Dumanli, N., Aktas, M., 2008. Molecular detection of Theileria and Babesia infections in cattle. Veterinary Parasitology, 158: 295-301.

Amusategui, I., Sainz, A., Tesouro, M.A., 2006. Serological evaluation of Anaplasma phagocytophilum infection in livestock in northwestern Spain. Annals of the New York Academy of Sciences, 1078: 487-490.

Amusategui, I., Tesouro, M.A., Kakoma, I., Sainz, A., 2008. Serological reactivity to Ehrlichia canis, Anaplasma phagocytophilum, Neorickettsia risticii, Borrelia burgdorferi and Rickettsia conorii in dogs from northwestern Spain. Vector-Borne and Zoonotic Diseases, 8 (6): 787-803.

Antunes, S., Galindo, R.C., Almazán, C., Rudenko, N., Golovchenko, M., Grubhoffer, L., Shkap, V., do Rosário, V., de la Fuente, J., Domingos, A., 2012. Functional genomics studies of Rhipicephalus (Boophilus) annulatus ticks in response to infection with the cattle protozoan parasite, Babesia bigemina. International Journal for Parasitology, 42: 187-195.

Antunes, S., Merino, O., Lérias, J., Domingues, N., Mosqueda, J., de la Fuente, J., Domingos, A., 2015. Artificial feeding of Rhipicephalus microplus female ticks with anti calreticulin serum do not influence tick and Babesia bigemina acquisition. Ticks and Tick-borne Diseases, 6: 47-55.

Añez-Rojas, N., Romero, O., Valbuena, H., Crisante, G., Rojas, A., Bolívar, A.M., Añez, N., 2010. Detección de transmisión transplacentaria de Anaplasma marginale en bovinos asintomáticos. Revista Científica, FCV-LUZ, 20 (4): 377-382.

Araújo, F.R., Costa, C.M., Ramos, C.A., Farias, T.A., Souza, I.I., Melo, E.S., Elisei, C., Rosinha, G.M., Soares, C.O., Fragoso, S.P., Fonseca, A.H., 2008. IgG and IgG2 antibodies from cattle naturally infected with Anaplasma marginale recognize the recombinant vaccine candidate antigens VirB9, VirB10, and elongation factor-Tu. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 103 (2): 186-190.

251

Arulkanthan, A., Brown, W.C., McGuire, T.C., Knowles, D.P., 1999. Biased immunoglobulin G1 isotype responses induced in cattle with DNA expressing msp1a of Anaplasma marginale. Infection and Immunity, 67 (7): 3481-3487.

Ashuma, Sharma, A., Singla, L.D., Kaur, P., Bal, M.S., Batth, B.K., Juyal, P.D., 2013. Prevalence and haemato-biochemical profile of Anaplasma marginale infection in dairy animals of Punjab (India). Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, 6 (2): 139- 144.

Atif, F.A., Khan, M.S., Roheen, T., Muhammad, F., Younus, M., Avais, M., Ullah, S., 2013. Seroprevalence of Anaplasma marginale infection among cattle from three districts of the northern Punjab, Pakistan. The Journal of Animal & Plant Sciences, 23(4): 995-998

Aubry, P., Geale, D.W., 2011. A review of bovine Anaplasmosis. Transboundary and Emerging Diseases, 58: 1-30.

Awad, H., Antunes, S., Galindo, R.C., do Rosário, V.E., de la Fuente, J., Domingos, A., El Hussein, A.M., 2011. Prevalence and genetic diversity of Babesia and Anaplasma species in cattle in Sudan. Veterinary Parasitology, 181: 146-152.

Baldacchino, F., Muenworn, V., Desquesnes, M., Desoli, F., Charoenviriyaphap, T., Duvallet, G., 2013. Transmission of pathogens by Stomoxys flies (Diptera, Muscidae): a review. Parasite, 20 (26): 1-13.

Barandika, J.F., Hurtado, A., García-Esteban, C., Gil, H., Escudero, R., Barral, M., Jado, I., Juste, R.A., Anda, P., García-Pérez, A.L., 2007. Tick-borne zoonotic bacteria in wild and domestic small mammals in northern Spain. Applied and Environmental microbilology, 73 (19): 6166-6171.

Barandika, J.F., Hurtado, A., García-Sanmartín, J., Juste, R. A., Anda, P., García-Pérez, A.L., 2008. Prevalence of tick-borne zoonotic bacteria in questing adult ticks from northern Spain. Vector-Borne and Zoonotic Diseases, 8 (6): 829-835.

Barbet, A.F., Lundgren, A., Yi, J., Rurangirwa, F.R., Palmer, G.H., 2000. Antigenic variation of Anaplasma marginale by expression of MSP2 mosaics. Infection and Immunity, 68 (11): 6133-6138.

Barbet, A.F., Yi, J., Lundgren, A., McEwen, B.R., Blouin, E.F., Kocan, K.M., 2001. Antigenic variation of Anaplasma Marginale: Major surface protein 2 diversity during cyclic transmission between ticks and cattle. Infection and Immunity, 69 (5): 3057-3066.

252

Barbosa-da Silva, J., da Fonseca, A.H., 2013. Analysis of the risk factors related to the immune humoral anti-Anaplasma marginale in dairy cattle. Semina: Ciências Agrárias, Londrina, 34 (2): 777-784.

Barros, S.L., Madruga, C.R., Araújo, F.R., Menk, C.F., de Almeida, M.A.O., Melo, E.P.S., Kessler, R.H., 2005. Serological survey of Babesia bovis, Babesia bigemina, and Anaplasma marginale antibodies in cattle from the semi-arid region of the state of Bahia, Brazil, by enzyme-linked immunosorbent assays. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 100 (6): 513-517.

Barry, D.N., Parker, R.J., de Vos, A.J., Dunster, P., Rodwell, B.J., 1986. A microplate enzyme-linked immunosorbent assay for measuring antibody to Anaplasma marginale in cattle serum. Australian Veterinary Journal, 63 (3): 76-79.

Bastos, C.V., Passos, L.M.F., Facury-Filho, E.J., Rabelo, E.M., de la Fuente, J., Ribeiro, M.F.B., 2010. Protection in the absence of exclusion between two Brazilian isolates of Anaplasma marginale in experimentally infected calves. The Veterinary Journal, 186: 374-378.

Baumgartner, W., Schlerka, G., Fumicz, M., Stöger, J., Awad-Masalmeh, M., Sculler, W., Weber, P., 1992. Seroprevalence survey for Anaplasma marginale-infection of Austrian cattle. Zentralblatt für Veterinärmedizin Reihe B, 39 (2): 97-104.

Bekker, C.P., de Vos, S., Taoufik, A., Sparagano, O.A., Jongejan, F., 2002. Simultaneous detection of Anaplasma and Ehrlichia species in ruminants and detection of Ehrlichia ruminantium in Amblyomma variegatum ticks by reverse line blot hybridization. Veterinary Microbiology, 89 (2-3): 223-238.

Benavides, E., Vizcaino, O., Britto, C.M., Romero, A., Rubio, A., 2000. Attenuated trivalent vaccine against babesiosis and anaplasmosis in Colombia. Annals of the New York Academy of Sciences, 916: 613-616.

Birdane, F.M., Sevinc, F., Derinbay, O., 2006. Anaplasma marginale infections in dairy cattle: clinical disease with high seroprevalence. Bulletin of the Veterinary Institute in Pulawy, 50: 467-470.

Blaschitz, M., Narodoslavsky-Gföller, M., Kanzler, M., Stanek, G., Walochnik, J., 2008. Babesia species occurring in austrian Ixodes ricinus ticks. Applied and Enviromental Microbiology, 74 (15): 4841-4846.

253

Blouin, E.F., Saliki, J.T., Kocan, K.M., Rodgers, S.J., 1998. Evaluation of Anaplasma marginale from tick cell cultura as an immunogen for cattle. Annals New York Academy of Sciences, 819: 253-258.

Bock, R.E., Blight, G.W., Kingston, T.G., de Vos, A.J., 1995. A survey of cattle producers in the Boophilus microplus endemic area of Queensland to determine attitudes to the control of and vaccination against tick fever. Australian Veterinary Journal, 72 (3): 88- 92.

Bock, R.E., de Vos, A.J. Kingston, T.G., McLellan, D.J., 1997. Effect of breed of cattle on innate resistance to infection with Babesia bovis, B. bigemina and Anaplasma marginale. Australian Veterinary Journal, 75 (5): 337-340.

Bock, R., Kingston, T.G., de Vos, A.J., 1999. Effect of breed of cattle on transmission rate and innate resistance to infection with Babesia bovis and B. bigemina transmitted by Boophilus microplus. Australian Veterinary Journal, 77 (7): 461-464.

Bock, R., de Vos, A.J., 2001. Immunity following use of Australian tick fever vaccine: a review of the evidence. Australian Veterinary Journal, 79 (12): 832-839.

Bock, R.E., deVos, A.J., Kingston, T.G., Carter, P.D., 2003. Assessment of a low virulence Australian isolate of Anaplasma marginale for pathogenicity, immunogenicity and transmissibility by Boophilus microplus. Veterinary Parasitology, 118: 121-131.

Bock, R., Jackson, L., De Vos, A., Jorgensen, W., 2004. Babesiosis of cattle. Parasitology, 129: 247-269.

Bono, M.F., Mangold, A.J., Baravalle, M.E., Valentini, B.S., Thompson, C.S., Wilkowsky, S.E., Echaide, I.E., Farber, M.D., Torioni de Echaide, S.M., 2008. Efficiency of a recombinant MSA-2c-based ELISA to establish the persistence of antibodies in cattle vaccinated with Babesia bovis. Veterinary Parasitology, 157: 203-210.

Boonchit, S., Alhassan, A., Chan, B., Xuan, X., Yokoyama, N., Ooshiro, M., Goff, W.L., Waghela, S.D., Wagner, G., Igarashi, I., 2006. Expression of C-terminal truncated and full-length Babesia bigemina rhoptry-associated protein 1 and their potential use in enzyme-linked immunosorbent assay. Veterinary Parasitology, 137: 28-35.

Böse, R., Jorgensen, W.K., Dalgliesh, R.J., Friedhoff, K.T., de Vos, A.J., 1995. Current state and future trends in the diagnosis of babesiosis. Veterinary Parasitology, 57 (1-3): 61-74.

254

Bouattour, A., Darghouth, M.A., 1996. First report of Babesia divergens in Tunisia. Veterinary Parasitology, 63 (1-2): 161-165.

Boulanger, P., Bannister, G.L., Avery, R.J., Gray, D.P., Barrett B.B., Ruckerbauer, G.M., 1966. Anaplasmosis: Comparison of complement fixation methods and study of the cattle population of Southern Alberta. Canadian Journal of Comparative Medecine and Veterinary Science, 30 (4): 102-106.

Bowie, M.V., de la Fuente, J., Kocan, K.M., Blouin, E.F., Barbet, A.F., 2002. Conservation of major surface protein 1 genes of Anaplasma marginale during cyclic transmission between ticks and cattle. Gene, 282: 95-102.

Bradway, D.S., Torioni de Echaide, S., Knowles, D.P., Hennager, S.G., McElwain, T.F., 2001. Sensitivity and specificity of the complement fixation test for detection of cattle persistently infected with Anaplasma marginale. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 13: 79-81.

Brayton, K.A., Palmer, G.H., Lundgren, A., Yi J., Barbe, A.F., 2002. Antigenic variation of Anaplasma marginale msp2 occurs by combinatorial gene conversión. Molecular Microbiology, 43 (5): 1151-1159.

Brayton, K.A., Meeus, P.F.M., Barbet, A.F., Palmer, G.H., 2003. Simultaneous variation of the immunodominant outer membrane proteins, MSP2 and MSP3, during Anaplasma marginale persistence in vivo. Infection and Immunity, 71 (11): 6627-6632.

Brayton, K.A., Kappmeyer, L.S., Herndon, D.R., Dark, M.J., Tibbals, D.L., Palmer, G.H., McGuire, T.C., Knowles, Jr., D.P., 2005. Complete genome sequencing of Anaplasma marginale reveals that the surface is skewed to two superfamilies of outer membrane proteins. Proceedings of the National academi of Sciences, 102 (3): 844–849

Brígido, C., Pereira-da Fonseca, I., Parreira, R., Fazendeiro, I., do Rosário, V.E., Centeno- Lima, S., 2004. Molecular and phylogenetic characterization of Theileria spp. parasites in autochthonous bovines (Mirandesa breed) in Portugal. Veterinary Parasitology, 123: 17-23.

Brizuela, C.M., Ortellado, C.A., Sanabria, E., Torres, O., Ortigosa, D., 1998. The safety and efficacy of Australian tick-borne disease vaccine strains in cattle in Paraguay. Veterinary Parasitology 76: 27-41.

255

Brocklesby, D. W., Sellwood, S.A., Harradine, D.L., Young, E.R., 1973. Babesia mayor in Britain: blood-induced infections in splenectomized and intact calves. International Journal for Parasitology, 3: 671-680.

Brown, W.C., Estes, D.M., Chantler, S.E., Kegerrei, K.A., Suarez, C.E., 1998. DNA and a CpG oligonucleotide derived from Babesia bovis are mitogenic for bovine B cells. Infection and Immunity, 66 (11): 5423-5432.

Brown, W.C., McElwain, T.F., Palmer, G.H., Chantler, S.E., Estes, D.M., 1999. Bovine CD4+ T-lymphocyte clones specific for rhoptry-associated protein 1 of Babesia bigemina stimulate enhanced immunoglobulin G1 (IgG1) and IgG2 synthesis. Infection and Immunity, 67 (1): 155-164.

Brown, W.C., Ruef, B.J., Norimine, J., Kegerreis, K.A., Suarez, C.E., Conley, P.G., Stich, R.W., Carson, K.H., Rice-Ficht, A.C., 2001. A novel 20-kilodalton protein conserved in Babesia bovis and B. bigemina stimulates memory CD4+ T lymphocyte responses in B. bovis-immune cattle. Molecular & Biochemical Parasitology , 118: 97-109.

Brown, W.C., 2001. Molecular approaches to elucidating innate and acquired immune responses to Babesia bovis, a protozoan parasite that causes persistent infection. Veterinary Parasitology, 101: 233-248.

Brown, W.C., Norimine, J., Knowles, D.P., Goff, W.L., 2006. Immune control of Babesia bovis infection. Veterinary Parasitology, 138: 75-87.

Brown, W.C., 2012. Adaptive immunity to Anaplasma pathogens and immune dysregulation: Implications for bacterial persistence. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases, 35: 241-252.

Buening, G.M., 1976. Cell-mediated immune response in anaplasmosis as measured by a micro cell-mediated cytotoxicity assay and leukocyte migration-inhibition test. American Journal of Veterinary Research, 37 (10): 1215-1218.

Buling, A., Criado-Fornelio, A., Asenzo, G., Benítez, D., Barba-Carretero, J.C., Florin- Christensen M., 2007. A quantitative PCR assay for the detection and quantification of Babesia bovis and B. bigemina. Veterinary Parasitology, 147: 16-25.

Burridge, M.J., Kimber, C.D., McHardy, N., 1973. Detection of antibodies to Babesia bigemina in dried blood samples using the indirect fluorescent antibody test. Annals of tropical medicine and parasitology, 67 (2): 191-195.

256

Büscher, G., 1988. The infection of various tick species with Babesia bigemina, its transmission and identification. Parasitology Research, 74 (4): 324-330.

Caeiro, V., 1999. General review of tick species present in Portugal. Parassitologia, 41 (1): 11-15.

Callow, L.L., 1967. Sterile immunity, coinfectious immunity and strain differences in Babesia bigemina infections. Parasitology, 57 (3): 455-465.

Camus E., Montenegro-James, S., 1994. Bovine anaplasmosis and babesiosis in the Lesser Antilles: risk assessment of an unstable epidemiologic situation. Veterinary Research, 25: 313-317.

Canales, M., Enríquez, A., Ramos, E., Cabrera, D., Dandie, H., Soto, A., Falcón, V., Rodríguez, M., de la Fuente, J., 1997. Large-scale production in Pichia pastoris of the recombinant vaccine Gavac against cattle tick. Vaccine, 15 (4): 414-422.

Canales, M., Almazán, C., Naranjo, V., Jongejan, F., de la Fuente, J., 2009. Vaccination with recombinant Boophilus annulatus Bm86 ortholog protein, Ba86, protects cattle against B. annulatus and B. microplus infestations. BMC Biotechnology, 9: 29.

Canales, M., Moreno-Cid, J.A., Almazán, C., Villar, M., de la Fuente, J., 2010. Bioprocess design and economics of recombinant BM86/BM95 antigen production for anti-tick vaccines. Biochemical Engineering Journal, 52: 79-90.

Cao, S., Aboge, G.O., Terkawi, M.A., Yu, L., Kamyingkird, K., Luo, Y., Li, Y., Goo, Y-K., Yamagishi, J., Nishikawa, Y., Yokoyama, N., Suzuki, H., Igarashi, I., Maeda, R., Inpankaew, T., Jittapalapong, S., Xuan, X., 2012. Molecular detection and identification of Babesia bovis and Babesia bigemina in cattle in northern Thailand. Parasitology Research, 111: 1259-1266.

Carcy, B., Précigout, E., Schetters, T., Gorenflot, A., 2006. Genetic basis for GPI-anchor merozoite surface antigen polymorphism of Babesia and resulting antigenic diversity. Veterinary Parasitology, 138 (1-2): 33-49.

Cárdenas-Canales, E.M., Ortega-Santos, J.A., Campbell, T.A., García-Vázquez, Z., Cantú- Covarrubias, A., Figueroa-Millán, J.V., DeYoung, R.W., Hewitt, D.G., Bryant, F.C., 2011. Nilgai antelope in northern Mexico as a possible carrier for cattle fever ticks and Babesia bovis and Babesia bigemina. Journal of Wildlife Diseases, 47 (3): 777-779.

257

Carelli, G., Decaro, N., Lorusso, A., Elia, G., Lorusso, E., Mari, V., Ceci, L., Buonavoglia, C., 2007. Detection and quantification of Anaplasma marginale DNA in blood samples of cattle by real-time PCR. Veterinary Microbiology, 124: 107-114.

Carelli, G., Decaro, N., Lorusso, E., Paradies, P., Elia, G., Martella, V., Buonavoglia, C., Ceci, L., 2008. First report of bovine anaplasmosis caused by Anaplasma centrale in Europe. Animal Biodiversity and Emerging Diseases: Annals of the New York Academy of Sciences, 1149: 107-110.

Carrique-Mas, J.J., Widdowson, M.A., Cuéllar, A.M., Ribera, H., Walker, A.R., 2000. Risk of babesiosis and anaplasmosis in different ecological zones of Santa Cruz Department, Bolivia. Veterinary Parasitology, 93: 29-38.

Carson, C.A., Sells, D.M., Ristic, M., 1976. Cell-mediated immunity in bovine anaplasmosis and correlation with protection induced by vaccination (a review). Veterinary Parasitology, 2: 75-81.

Cassini, R., Marcer, F., Frangipane di Regalbono, A., Cancrini, G., Gabrielli, S., Moretti, A., Galuppi, R., Tampieri, M.P., Pietrobelli, M., 2012. New insights into the epidemiology of bovine piroplasmoses in Italy. Veterinary Parasitology, 184: 77-82.

Castellà, J., Estrada-Peña, A., Almería, S., Ferrer, D., Gutiérrez, J., Ortuño, A., 2001. A survey of ticks (Acari: Ixodidae) on dairy cattle on the island of Menorca in Spain. Experimental and Applied Acarology, 25: 899-908.

Castellà, J., Almería, S., 2002. Etiología de las piroplasmosis. Bovis, 8: 21-26.

Ceci, L., Carelli, G., 1999. Tick-borne diseases of livestock in Italy: general review and results of recent studies carried out in the Apulia region. Parassitologia, 41 (1): 25-29.

Ceci, L., Decaro, N., Lorusso, E., Paradies, P., Elia, G., Martella, V., Buonavoglia, C., Carelli, G., 2008. First report of bovine anaplasmosis by Anaplasma centrale in Europe, molecular identification and phylogenetic analysis. Veterinary Research Communications, 32 (1): 263-266.

Ceci, L., Iarussi, F., Greco, B., Lacinio, R., Fornelli, S., Carelli, G., 2014. Retrospective study of hemoparasites in cattle in southern Italy by reverse line blot hybridization. The Journal of Veterinary Medical Science, 76 (6): 869-875.

258

Chauvin, A., Moreau, E., Bonnet, S., Plantard, O., Malandrin, L., 2009. Babesia and its hosts: adaptation to long-lasting interactions as a way to achieve efficient transmission. Veterinary Research, 40 (2): 37.

Chen, D., Copeman, D.B., Burnell, J., Hutchinson, G.W., 2002. Helper T cell and antibody responses to infection of CBA mice with Babesia microti. Parasite Immunology, 22: 81-88.

Chomel, B.B., Carniciu, M.L., Kasten, R.W., Castelli, P.M., Work, T.M., Jessup, D.A., 1994. Antibody prevalence of eight ruminant infectious diseases in California mule and black- tailed deer (Odocoileus hemionus). Journal of Wildlife Diseases, 30 (1): 51-59.

Christensson, D.A., 1987. Clinical and serological response after experimental inoculation with Babesia divergens of newborn calves with and without maternal antibodies. Acta Veterinaria Scandinavica, 28 (3-4): 381-392.

Christensson, D.A., 1989. Inverse age resistance to experimental Babesia divergens infection in cattle. Acta Veterinaria Scandinavica, 30(4): 453-464. Coetzee, J.F., Apley, M.D., Kocan, K.M., Rurangirwa, F.R., Van Donkersgoed, J., 2005. Comparison of three oxytetracycline regimens for the treatment of persistent Anaplasma marginale infections in beef cattle. Veterinary Parasitology, 127: 61-73.

Coetzee, J.F., Apley, M.D., Kocan, K.M., 2006a. Comparison of the efficacy of enrofloxacin, imidocarb, and oxytetracycline for clearance of persistent Anaplasma marginale infections in cattle. Veterinary Therapeutics, 7 (4): 347-360.

Coetzee, J.F., Apley, M.D., Kocan, K.M., Jones, D.E., 2006b. Flow cytometric evaluation of selected antimicrobial efficacy for clearance of Anaplasma marginale in short-term erythrocyte cultures. Jounal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics, 29 (3): 173- 183.

Coetzee, J.F., Schmidt, P.L., Apley, M.D., Reinbold, J.B., Kocan, K.M., 2007. Comparison of the complement fixation test and competitive ELISA for serodiagnosis of Anaplasma marginale infection in experimentally infected steers. American Journal of Veterinary Research, 68 (8): 872-878.

Coetzee, J.F., Kocan, K.M. Higgins, J.J., Apley, M.D., Jones, D.E., 2009. Ultrastructural and fluorochromatic changes of Anaplasma marginale exposed to oxytetracycline, imidocarb and enrofloxacin in short-term erythrocyte cultures. Veterinary Microbiology, 136: 45-53.

259

Coetzee, J.F., Schmidt, P.L., O’Connor, A.M., Apley, M.D., 2010. Seroprevalence of Anaplasma marginale in 2 Iowa feedlots and its association with morbidity, mortality, production parameters, and carcass traits. The Canadian Veterinary Journal, 51: 862- 868.

Cordero del Campillo, M., 1963. Anaplasmosis. Boletín Syva, 70: 64-81.

Coronado, A., 2001. Is Boophilus microplus the main vector of Anaplasma marginale? Technical note. Revista Científica, FCV-LUZ, 11 (5): 408-411.

Cossío-Bayúgar, R., Rodríguez, S.D., García-Ortiz, M.A., García-Tapia, D., Aboytes-Torres, R., 1997. Bovine anaplasmosis prevalence in northern Veracruz state, Mexico. Preventive Veterinary Medicine, 32: 165-170.

Costa-Júnior, L.M., Leite-Rabelo, E.M., Martins-Filho, O.A., Barbosa-Ribeiro, M.F., 2006. Comparison of different direct diagnostic methods to identify Babesia bovis and Babesia bigemina in animals vaccinated with live attenuated parasites. Veterinary Parasitology, 139: 231-236.

Courtney, J.W., Kostelnik, L.M., Zeidner, N.S., Massung, R.F., 2004. Multiplex real-time PCR for detection of Anaplasma phagocytophilum and Borrelia burgdorfeli. Journal of Clinical Microbiology, 42 (7): 3164-3168.

Criado, A., Martinez, J., Buling, A., Barba, J.C., Merino, S., Jefferies, R., Irwin, P.J., 2006. New data on epizootiology and genetics of piroplasms based on sequences of small ribosomal subunit and cytochrome b genes. Veterinary Parasitology, 142: 238-247.

Criado-Fornelio, A., Martínez-Marcos, A., Buling-Saraña, A., Barba-Carretero, J.C., 2003. Molecular studies on Babesia, Theileria and Hepatozoon in southern Europe Part II. Phylogenetic analysis and evolutionary history. Veterinary Parasitology, 114: 173-194.

Criado-Fornelio, A., Buling, A., Pingret, J.L., Etievant, M., Boucraut-Baralon, C., Alongi, A., Agnone, A., Torina, A., 2009. Hemoprotozoa of domestic animals in France: Prevalence and molecular characterization. Veterinary Parasitology, 159: 73-76.

Cringoli, G., Otranto, D., Testini, G., Buono, V., Di Giulio, G., Traversa, D., Lia, R., Rinaldi, L., Veneziano, V., Puccini, V., 2002. Epidemiology of bovine tick-borne diseases in southern Italy. Veterinary Research, 33: 421-428.

260

da Silveira, J.A.G., Rabelo, E.M.L., Ribeiro, M.F.B., 2011. Detection of Theileria and Babesia in brown brocket deer (Mazama gouazoubira) and marsh deer (Blastocerus dichotomus) in the State of Minas Gerais, Brazil. Veterinary Parasitology, 177: 61–66. da Trindade, H.I., de Araújo-Silva, G.R., Alves-Teixeira, M.C., Gonçalves-Sousa, M., Machado, R.Z., da Costa-Freitas, F.L., de Sousa-Almeida, K., 2010. Detection of antibodies against Babesia bovis and Babesia bigemina in calves from the region of Araguaína, State of Tocantins, Brazil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, 19 (3): 169-173.

Dalgliesh, R.J., Jorgensen, W.K., de Vos, A.J., 1990. Australian frozen vaccines for the control of babesiosis and anaplasmosis in cattle-A review. Tropical Animal Health and Production, 22 (1): 44-52.

Dantas-Torres, F., Otranto, D., 2013. Species diversity and abundance of ticks in three habitats in southern Italy. Ticks and Tick-Borne Diseases, 4 (3): 251-255.

Dao, A.H., Eberhard, M.L., 1996. Pathology of acute fatal babesiosis in hamsters experimentally infected with the WA-1 strain of Babesia. Laboratory investigation, 74 (5): 853-859.

De Echaide, S.T., Echaide, I.E., Gaido, A.B., Mangold, A.J., Lugaresi, C.I., Vanzini, V.R., Guglielmone, A.A., 1995. Evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay kit to detect Babesia bovis antibodies in cattle. Preventive VeterinaryMedicine, 24: 277-283. de la Fuente, J., Garcia-Garcia, J.C., Blouin, E.F., Kocan, K.M., 2001a. Differential adhesion of major surface proteins 1a and 1b of the ehrlichial cattle pathogen Anaplasma marginale to bovine erythrocytes and tick cells. International Journal for Parasitology, 31: 145-153. de la Fuente, J., Van Den Bussche, R.A., Kocan, K.M., 2001b. Molecular phylogeny and biogeography of North American isolates of Anaplasma marginale (Rickettsiaceae: Ehrlichieae). Veterinary Parasitology, 97: 65-76. de la Fuente, J., Garcia-Garcia, J.C., Blouin, E.F., McEwen, B.R., Clawson, D., Kocan, K.M., 2001c. Major surface protein 1a effects tick infection and transmission of Anaplasma marginale. International Journal for Parasitology, 31: 1705-1714.

261

de la Fuente, J., Van Den Bussche, R.A., Garcia-Garcia, J.C., Rodríguez, S.D., García, M.A., Guglielmone, A.A., Mangold, A.J., Friche-Passos, L.M., Barbosa-Ribeiro, M.F., Blouin, E.F., Kocan, K.M., 2002a. Phylogeography of new world isolates of Anaplasma marginale based on major surface protein sequences. Veterinary Microbiology, 88: 275-285. de la Fuente, J., Kocan, K.M., Garcia-Garcia, J.C., Blouin, E.F., Claypool, P.L., Saliki, J.T., 2002b. Vaccination of cattle with Anaplasma marginale derived from tick cell culture and bovine erythrocytes followed by challenge-exposure with infected ticks. Veterinary Microbiology, 89 (2-3): 239-251. de la Fuente, J., Garcia-Garcia, J.C., Blouin, E.F., Saliki, J.T., Kocan, K.M., 2002c. Infection of tick cells and bovine erythrocytes with one genotype of the intracellular ehrlichia Anaplasma marginale excludes infection with other genotypes. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, 9 (3): 658-668. de la Fuente, J., Garcia-Garcia, J.C., Blouin, E.F., Kocan, K.M., 2003. Characterization of the functional domain of major surface protein 1a involved in adhesion of the rickettsia Anaplasma marginale to host cells. Veterinary Microbiology, 91: 265-283. de la Fuente, J., Vicente, J., Höfle, U., Ruiz-Fons, F., Fernández de Mera, I.G., Van Den Bussche, R.A., Kocan, K.M., Gortazar, C., 2004a. Anaplasma infection in free-ranging iberian red deer in the region of Castilla-La Mancha, Spain. Veterinary Microbiology, 100: 163-173. de la Fuente, J., Naranjo, V., Ruiz-Fons, F., Vicente, J., Estrada-Peña, A., Almazán, C., Kocan, K.M., Martín, M.P., Gortázar, C., 2004b. Prevalence of tick-borne pathogens in ixodid ticks (Acari: Ixodidae) collected from European wild boar (Sus scrofa) and Iberian red deer (Cervus elaphus hispanicus) in central Spain. European Journal of Wildlife Research, 50: 187-196. de la Fuente, J., Torina, A., Caracappa, S., Tumino, G., Furlá, R., Almazán, C., Kocan, K.M., 2005a. Serologic and molecular characterization of Anaplasma species infection in farm animals and ticks from Sicily. Veterinary Parasitology, 133: 357-362. de la Fuente, J., Naranjo, V., Ruiz-Fons, F., Höfle, U., Fernández de Mera, I.G., Villanúa, D., Almazán, C., Torina, A., Caracappa, S., Kocan, K.M., Gortázar, C., 2005b. Potential vertebrate reservoir hosts and invertebrate vectors of Anaplasma marginale and A. phagocytophilum in central Spain. Vector-Borne and Zoonotic Diseases, 5 (4): 390-401.

262

de la Fuente, J., Torina, A., Naranjo, V., Caracappa, S., Vicente, J., Mangold, A. J., Vicari, D., Alongi, A., Scimeca, S., Kocan, K. M., 2005c. Genetic diversity of Anaplasma marginale strains from cattle farms in the province of Palermo, Sicily. Journal of Veterinary Medicine, 52: 226-229. de la Fuente, J., Torina, A., Naranjo, V., Nicosia, S., Alongi, A., La Mantia, F., Kocan, K.M., 2006a. Molecular characterization of Anaplasma platys strains from dogs in Sicily, Italy. BMC Veterinary Research, 2:24. de la Fuente, J., Almazán, C., Blas-Machado, U., Naranjo, V., Mangold, A.J., Blouin, E.F., Gortazar, C., Kocan, K.M., 2006b. The tick protective antigen, 4D8, is a conserved protein involved in modulation of tick blood ingestion and reproduction. Vaccine, 24 (19): 4082-4095. de la Fuente, J., Blouin, E.F., Manzano-Roman, R., Naranjo, V., Almazán, C., Pérez de la Lastra, J.M., Zivkovic, Z., Jongejan, F., Kocan, K.M., 2007. Functional genomic studies of tick cells in response to infection with the cattle pathogen, Anaplasma marginale. Genomics, 90: 712-722. de la Fuente, J., Ruiz-Fons, F., Naranjo, V., Torina, A., Rodríguez, O., Gortázar, C., 2008a. Evidence of Anaplasma infections in European roe deer (Capreolus capreolus) from southern Spain. Research in Veterinary Science, 84: 382-386. de la Fuente, J., Ruiz-Fons, F., Naranjo, V., Torina, A., Rodríguez, O., Gortázar, C., 2008b. Evidence of Anaplasma infections in European roe deer (Capreolus capreolus) from southern Spain. Research in Veterinary Science, 84 (3): 382-386. de la Fuente, J., Merino, O., 2013. Vaccinomics, the new road to tick vaccines. Vaccine, 31 (50): 5923-5929. de Mendonça-Costa, V.M., Barbosa-Ribeiro, M.F., Leite-Duarte, A.L., Mangueira, J.M., Almeida-Pessoa, A.F., Santos-Azevedo, S., Medeiros-de Barros, A.T., Riet-Correa, F., Bahia-Labruna, M., 2013. Seroprevalence and risk factors for cattle anaplasmosis, babesiosis, and trypanosomiasis in a Brazilian semiarid region. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, 22 (2): 207-213. de Vos, A.J., 1991. Distribution, economic importance and control measures for Babesia and Anaplasma. A: Recent developments in the control of anaplasmosis, babesiosis and cowdriosis. Proceeding of a workshop held at Ilrad. Dolan, T.T. (Ed). The international laboratory for research on animal diseases, Nairobi, Kenya.

263

de Waal, D.T., Combrink, M.P., 2006. Live vaccines against bovine babesiosis. Veterinary Parasitology, 138: 88-96.

Decaro, N., Carelli, G., Lorusso, E., Lucente, M.S., Greco, G., Lorusso, A., Radogna, A., Ceci, L., Buonavoglia, C., 2008. Duplex real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection and quantification of Anaplasma marginale and Anaplasma centrale. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 20 (5): 606-611.

Decaro, N., Larocca, V., Parisi, A., Losurdo, M., Lia, R.P., Greco, M.F., Miccolis, A., Ventrella, G., Otranto, D., Buonavoglia, C., 2013. Clinical bovine piroplasmosis caused by Babesia occultans in Italy. Journal of Clinical Microbiology, 51 (7): 2432-2434.

Díaz, D., Valera, Z., de Andrade, E., Parra, O., Escalona, F., Ramírez, R., 2003. Prevalencia de Anaplasma marginale en bovinos del sector La Piñata, municipio La Cañada de Urdaneta, estado Zulia, Veneçuela. Revista Científica, FCV-LUZ, 13 (3): 193- 198.

Dipeolu, O.O., Amoo, A., 1984. The presence of kinetes of a Babesia species in the haemolymph smears of engorged Hyalomma ticks in Nigeria. Veterinary Parasitology, 17 (1): 41-46.

Dreher, U.M., de la Fuente, J., Hofmann-Lehmann, R., Meli, M.L., Pusterla, N., Kocan, K.M., Woldehiwet, Z., Braun, U., Regula, G., Staerk, K.D.C., Lutz, H., 2005a. Serologic cross-reactivity between Anaplasma marginale and Anaplasma phagocytophilum. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, 12 (10): 1177-1183.

Dreher, U.M., Hofmann-Lehmann, R., Meli, M.L., Regula, G., Cagienard, A.Y., Stärk, K.D.C., Doherr, M.G., Filli, F., Hässig, M., Braun, U., Kocan, K.M., Lutz, H., 2005b. Seroprevalence of anaplasmosis among cattle in Switzerland in 1998 and 2003: No evidence of an emerging disease. Veterinary Microbiology, 107: 71-79.

Dreyer, K., Fourie, L.J., Kok, D.J., 1998. Epidemiology of tick-borne diseases of cattle in Botshabelo and Thaba Nchu in the Free State Province. The Onderstepoort Journal of Veterinary Research, 65 (4): 285-289.

Duangjinda, M., Jindatajak, Y., Tipvong, W., Sriwarothai, J., Pattarajinda, V., Katawatin, S., Boonkum, W., 2013. Association of BoLA-DRB3 alleles with tick-borne disease tolerance in dairy cattle in a tropical environment. Veterinary Parasitology, 196 (3-4): 314-320.

264

Duh, D., Petrovec, M., Bidovec, A., Avsic-Zupanc, T., 2005. Cervids as Babesiae hosts, Slovenia. Emerging Infectious Diseases, 11 (7): 1121-1123.

Duh, D., Jelovsek, M., Avsic-Zupanc, T., 2007. Evaluation of an indirect fluorescence immunoassay for the detection of serum antibodies against Babesia divergens in humans. Parasitology, 134 (2): 179-185.

Dumler, J.S., Barbet, A.F., Bekker, C.P.J., Dasch, G.A., Palmer, G.H., Ray, S.C., Rikihisa, Y., Rurangirwa, F.R., 2001. Reorganization of genera in the families Rickettsiaceae and Anaplasmataceae in the order Rickettsiales: unification of some species of Ehrlichia with Anaplasma, Cowdria with Ehrlichia and Ehrlichia with Neorickettsia, descriptions of six new species combinations and designation of Ehrlichia equi and ‘HGE agent’ as subjective synonyms of Ehrlichia phagocytophila. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 51: 2145-2165.

Durrani, A.Z., Kamal, N., 2008. Identification of ticks and detection of blood protozoa in friesian cattle by polmerase chain reacton test and estimation of blood parameters in district Kasur, Pakistan. Tropical Animal Health and Production, 40: 441-447.

Duzgun, A., Schuntner, C.A., Wright, I.G., Leatch, G., Waltisbuhl, D.J., 1988. A sensitive ELISA technique for the diagnosis of Anaplasma marginale infections. Veterinary Parasitology, 29: 1-7.

Echaide, I.E., de Echaide, S.T., Guglielmone, A.A., 1993. Live and soluble antigens for cattle protection to Babesia bigemina. Veterinary Parasitology, 51: 35-40.

EFSA Panel on Animal Health and Welfare (AHAW), 2010. Scientific opinion on geographic distribution of tick-borne infections and their vectors in Europe and the other regions of the Mediterranean basin. EFSA Journal, 8(9): 1723 1-280.

Eid, G., French, D.M., Lundgren, A.M., Barbet, A.F., McElwain T.F., Palmer, G.H., 1996. Expression of major surface protein 2 antigenic variants during acute Anaplasma marginale rickettsemia. Infection and Immunity, 64 (3): 836.

Ekici, O.D., Sevinc, F., 2009. Seroepidemiology of Babesia bigemina in cattle in the Konya Province, Turkey: endemic status. Bulletin of the Veterinary Institute in Pulawy, 53: 645-64.

Ekici, O.D., Sevinc, F., 2011. Comparison of cELISA and IFA tests in the serodiagnosis of anaplasmosis in cattle. African Journal of Microbiology Research, 5 (10): 1188-1191.

265

EMEA (European Agency for the Evaluation of Medicinal Products), 2001. Committee for Veterinary Medicinal Products. Imidocarb. Summary Report (2), EMEA/MRL/785 /01-FINAL. (accés 31/5/2013).

Eriks, I.S., Palmer, G.H., McGuire, T.C., Allred, D.R., Barbet, A.F., 1989. Detection and quantitation of Anaplasma marginale in carrier cattle by using a nucleic acid probe. Journal of Clinical Microbiology, 27 (2): 279-284.

Eriks, I.S., Stiller, D., Goff, W.L., Panton, M., Parish, S.M., McElwain, T.F., Palmer, G.H., 1994. Molecular and biological characterization of a newly isolated Anaplasma marginale strain. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 6: 435-441.

Estes, D.M., Closser, N.M., Allen, G.K., 1994. IFN-gamma stimulates IgG2 production from bovine B-cells costimulated with anti- and mitogen. Cellular Immunology, 154 (2): 287-295.

Estrada-Peña, A., Barral, M., Caeiro, V., Castellà, J., Fontanilla, F., García, N., García, P., García, A., Martínez-Estellez, M.A.H., Hueli, L., Moreno, J.A., Landerset, J.A, 1995. Catálogo geográfico de las garrapatas en la Península Ibérica. Ed. Mallinckrodt Veterinary. 97-101.

Estrada-Peña, A., 2000. Ixodoidea (Acarina) en la Península Ibérica. Ed. Virbac. 26-33.

Estrada-Peña, A., 2001. Distribution, abundance, and habitat preferences of Ixodes ricinus (Acari: Ixodidae) in Northern Spain. Journal of Medical Entomology, 38(3): 361Ð370

Estrada-Peña, A., Acevedo, P., Ruiz-Fons, F., Gortázar, C., de la Fuente, J., 2008. Evidence of the importance of host habitat use in predicting the dilution effect of wild boar for deer exposure to Anaplasma spp. PLoS ONE 3(8): e2999.

Euzeby, J., 1990. Babesia. A: Protozoologie medicale comparee. vol III. Hémosporidioses. Collection Fondation Marcel Merieux.

Fahrimal, Y., Goff, W.L., Jasmer, D., 1992. Detection of Babesia bovis carrier cattle by using polymerase chain reaction amplification of parasite DNA. Journal of Clinical Microbiology, 30 (6): 1374-1379.

266

Ferrer, D., Castellà, J., Gutiérrez, J.F, 1998a. Seroprevalence of Babesia ovis in sheep in Catalonia, northeastern Spain. Veterinary Parasitology, 79: 275-281.

Ferrer, D., Castellà, J., Gil, A., Prieto, D., 1998b. Seroprevalence of Babesia ovis in goats in Catalonia, Spain. Veterinary Record, 143: 536-537.

Ferrer, D., Castellà, J., Gutiérrez, J.F, Lavín, S., Marco, I., 1998c. Seroprevalence of Babesia ovis in Mouflon Sheep in Spain. Journal of Wildlife Diseases, 34(3): 637-639.

Figueroa, J.V., Chieves, L.P., Johnson, G.S., Buening, G.M., 1992. Detection of Babesia bigemina-infected carriers by polymerase chain reaction amplification. Journal of Clinical Microbiology, 30 (10): 2576-2582.

Figueroa, J.V., Chieves, L.P., Johnson, G.S., Buening, G.M., 1993. Multiplex polymerase chain reaction based assay for the detection of Babesia bigemina, Babesia bovis and Anaplasma marginale DNA in bovine blood. Veterinary Parasitology, 50: 69-81.

Figueroa, J.V., Alvarez, J.A., Ramos, J.A., Rojas, E.E., Santiago, C., Mosqueda, J.J., Vega, C.A., Buening, G.M., 1998. Bovine babesiosis and anaplasmosis follow-up on cattle relocated in a endemic area for hemoparasitic diseases. Annals of the New York Academy of Sciences, 849 (1): 1-10.

Foil, L.D., 1989. Tabanids as vectors of disease agents. Parasitology Today, 5 (3): 88-96. Fosgate, G.T., Urdaz-Rodríguez, J.H., Dunbar, M.D., Rae, D.O., Donovan, G.A., Melendez, P., Dobek, G.L., Alleman, A.R., 2010. Diagnostic accuracy of methods for detecting Anaplasma marginale infection in lactating dairy cattle of Puerto Rico. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 22: 192-199.

French, D.M., Brown, W.C., Palmer, G.H., 1999. Emergence of Anaplasma marginale antigenic variants during persistent rickettsemia. Infection and immunity, 67 (11): 5834-5840.

Futse, J.E., Brayton, K.A., Nydam, S.D., Palmer, G.H., 2009. Generation of antigenic variants via gene conversion: Evidence for recombination fitness selection at the locus level in Anaplasma marginale. Infection and immunity, 77 (8): 3181-3187.

Gale, K.R., Dimmock, C.M., Gartsidet, M., Leatch, G., 1996. Anaplasma marginale: Detection of carrier cattle by PCR-ELISA. International Journal for Parasitology, 26 ( 10): 1103-1109.

267

García, T.D., Figueroa, M.J.V., Ramos, A.J.A., Rojas, M.C.,Cantó, A.G.J., Falcón, N.A., Álvarez, M.J.A., 2004. Immune response to Babesia bigemina infection in pregnant cows. Annals of the New York Academy of Sciences, 1026: 298-301.

García-Pérez, A.L., Barandika, J., Oporto, B., Povedano, I., Juste, R.A., 2003. Anaplasma phagocytophila as an abortifacient agent in sheep farms from northern Spain. Annals of the New York Academy of Sciences, 990: 429-432.

García-Sanmartín, J., Nagore, D., García-Pérez, A.L., Juste, R.A., Hurtado, A., 2006. Molecular diagnosis of Theileria and Babesia species infecting cattle in Northern Spain using reverse line blot macroarrays. BMC Veterinary Research, 2: 16.

García-Sanmartín, J., Aurtenetxe, O., Barral, M., Marco, I., Lavin, S., García-Pérez, A.L., Hurtado, A., 2007. Molecular detection and characterization of piroplasms infecting cervids and chamois in Northern Spain. Parasitology, 134 (3): 391-398.

Garnham, P.C.C., Bray R.S., 1959. The susceptibility of the higher primates to piroplasms. The Journal of Protozoology, 6: 352-355.

Ge, N. L., Kocan, K.M., Blouin, E. F., Murphy, G. L., 1996. Developmental studies of Anaplasma marginale (Rickettsiales: Anaplasmataceae) in male Dermacentor andersoni (Acari: Ixodidae) infected as adults by using non-radioactive in situ hybridization and microscopy. Journal of Medical Entomology, 33: 911-920.

George, J.E., 1987. Technology for tick eradication. A: The eradication of ticks. Proceedings of the expert consultation on the eradication of ticks with special rference to Latin America. México, June 1987. FAO animal production and health paper, 75. Rome, 1989.

Georges, K., Loria, G.R., Riili, S., Greco, A., Caracappa, S., Jongejan, F., Sparagano, O., 2001. Detection of haemoparasites in cattle by reverse line blot hybridisation with a note on the distribution of ticks in Sicily. Veterinary Parasitology, 99: 273-286.

Geurden, T., Somers, R., Thanh, N.T.G., Vien, L.V., Nga, V.T., Giang, H.H., Dorny, P., Giao, H.K., Vercruysse, J., 2008. Parasitic infections in dairy cattle around Hanoi, northern Vietnam. Veterinary Parasitology, 153: 384-388.

Gillespie, J.J., Brayton, K.A., Williams, K.P., Quevedo-Diaz, M.A., Brown, W.C., Azad, A.F., Sobral, B.W., 2010. Phylogenomics reveals a diverse Rickettsiales type IV secretion system. Infection and Immunity, 78 (5): 1809-1823.

268

Gitau, G.K., Perry, B.D., Katende, J.M., McDermott, J.J., Morzaria, S.P., Young, A.S., 1997. The prevalence of serum antibodies to tick-borne infections in cattle in smallholder dairy farms in Murang’a District, Kenya; a cross-sectional study. Preventive Veterinary Medicine, 30: 95-IO7.

Góes, T.S., Góes, V.S., Ribeiro, M.F.B., Gontijo, C.M., 2007. Bovine babesiosis: Anti- erythrocyte antibodies purification from the sera of naturally infected cattle. Veterinary Immunology and Immunopathology, 116: 215-218.

Goethert, H.K., Telford, S.R., 2003. Enzootic transmission of Babesia divergens among cottontail rabbits on Nantucket Island, Massachusetts. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 69 (5): 455-460.

Goff, W.L., Wagner, G.G., Craig, T.M., 1984a. Increased activity of bovine ADCC effector cells during acute Babesia bovis infection. Veterinary Parasitology, 16: 5-15.

Goff, W.L., Wagner, G.G., Craig, T.M., Long, R.F., 1984b. The role of specific immunoglobulins in antibody-depenent cell-mediated cytotoxicity assays during Babesia bovis infection. Veterinary Parasitology, 14; 117-128.

Goff, W.L., Johnson, W.C., Wyatt, C.R., Cluff, C.W., 1996. Assessment of bovine mononuclear phagocytes and neutrophils for induced L-arginine-dependent nitric oxide production. Veterinary Immunology and Immunopathology, 55 (1-3): 45-62.

Goff, W.L., Johnson, W.C., Cluff, C.W., 1998. Babesia bovis immunity. In vitro and in vivo evidence for IL-10 regulaion of IFN- and iNOSa. Annals of the New York Academy of Sciences, 849: 161-180.

Goff, W.L., Johnson, W.C., Parish, S.M., Barrington, G.M., Tuo, W., Valdez, R.A., 2001. The age-related immunity in cattle to Babesia bovis infection involves the rapid induction of interleukin-12, interferon-g and inducible nitric oxide synthase mRNA expression in the spleen. Parasite Immunology, 23: 463-471.

Goff, W.L., Johnson, W.C., Tuo, W., Valdez, R.A., Parish, S.M., Barrington, G.M., Davis, W.C., 2002a. Age-related innate response in calves to Babesia bovis involves IL-12 induction and IL-10 modulation. Annals of the New York Academy of Sciences, 969: 164-168.

269

Goff, W.L., Johnson, W.C., Parish, S.M., Barrington, G.M., Elsasser, T.H., Davis, W.C., Valdez, R.A., 2002b. IL-4 and IL-10 inhibition of IFN-- and TNF--depenent nitric oxide production from bovine mononuclear phagocytes exposed to Babesia bovis merozoites. Veterinary Immonology and Immunopathology, 84: 237-251.

Goff, W.L., McElwain, T.F., Suarez, C.E., Johnson, W.C., Brown, W.C., Norimine, J., Knowles, D.P., 2003. Competitive enzyme-linked immunosorbent assay based on a rhoptry-associated protein 1 epitope specifically identifies Babesia bovis-infected cattle. Clinical and Diagnostic laboratory Immunology, 10 (1): 38-43.

Goff, W.L., Molloy, J.B., Johnson, W.C., Suarez, C.E., Pino, I., Rhalem, A., Sahibi, H., Ceci, L., Carelli, G., Adams, D.S., McGuire, T.C., Knowles, D.P., McElwain, T.F., 2006a. Validation of a competitive enzyme-linked immunosorbent assay for detection of antibodies against Babesia bovis. Clinical and Vaccine Immunology, 13 (11): 1212-1216.

Goff, W.L., Storset, A.K., Johnson, W.C., Brown, W.C., 2006b. Bovine splenic NK cells synthesize IFN- in response to IL-12-containing supernatants from Babesia bovis- exposed monocyte cultures. Parasite Immunology, 28: 221-228.

Goff, W.L., Johnson, W.C., Molloy, J.B., Jorgensen, W.K., Waldron, S.J., Figueroa, J.V., Matthee, O., Adams, D.S., McGuire, T.C., Pino, I., Mosqueda, J., Palmer, G.H., Suarez, C.E., Knowles, D.P., McElwain, T.F., 2008. Validation of a competitive enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Babesia bigemina antibodies in cattle. Clinical and Vaccine Immunology, 15 (9): 1316-1321.

Gohil, S., Herrmann, S., Günther, S., Cooke, B.M., 2013. Bovine babesiosis in the 21st century: Advances in biology and functional genomics. International Journal for Parasitology, 43: 125-132.

Gomes, J., Soares, R., Santos, M., Santos-Gomes, G., Botelho, A., Amaro, A., Inácio, J., 2013. Detection of Theileria and Babesia infections amongst asymptomatic cattle in Portugal. Ticks and Tick-borne Diseases, 4: 148-151.

González-Grau, H. E., da Cunha-Filho, N.A., Pappen, F.G., da Rosa-Farias, N.A., 2013. Transplacental transmission of Anaplasma marginale in beef cattle chronically infected in southern Brazil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, Jaboticabal, 22 (2): 189-193.

Goodger, B.V., Commins, M.A., Wright, I.G., Mirre, G.B., Waltisbuhl, D.J., White, M., 1986. Babesia bovis: vaccination trial with a dominant immunodiffusion antigen in splenectomised calves. Zeitschrift für Parasitenkunde, 72 (6): 715-22.

270

Gubbels, J.M., de Vos, A.P., van der Weide, M., Viseras, J., Schouls, L.M., de Vries, E., Jongejan, F., 1999. Simultaneous detection of bovine Theileria and Babesia species by reverse line blot hybridization. Journal of Clinical Microbiology, 37 (6): 1782-1789.

Guedes, D.S. Jr., Araújo, F.R., Silva, F.J., Rangel, C.P., Barbosa-Neto, J.D., Fonseca, A.H., 2008. Frequency of antibodies to Babesia bigemina, B. bovis, Anaplasma marginale, Trypanosoma vivax and Borrelia burgdorferi in cattle from the Northeastern region of the State of Pará, Brazil. Revista brasileira de Parasitologia Veterinária, 17 (2): 105-109.

Guerrero, F.D., Miller, R.J., Pérez de León, A.A., 2012. Cattle tick vaccines: Many candidate antigens, but will a commercially viable product emerge? International Journal for Parasitology, 42: 421-427.

Guglielmone, A.A. i Mangold, A.J., 1987. Anaplasmosis: situación actual en la Argentina. A: The eradication of ticks. Proceedings of the expert consultation on the eradication of ticks with special rference to Latin America. México, June 1987. FAO animal production and health paper, 75. Rome, 1989.

Guglielmone, A.A., 1995. Epidemiology of babesiosis and anaplasmosis in South and Central America. Veterinary Parasitology, 57: 109-119.

Guglielmone, A.A., Lugaresi, C.I., Volpogni, M.M., Anziani, O.S., Vanzini, V.R., 1997. Babesial antibody dynamics after cattle immunisation with live vaccines, measured with an indirect immunofluorescence test. Veterinary Parasitology, 70: 33-39.

Hairgrove, T.B., Craig, T.M., Budke, C.M., Rodgers, S.J., Gill, R.J., 2014. Seroprevalence of Anaplasma marginale in Texas Cattle. Preventive Veterinary Medicine, 116: 188-192.

Han, S., Norimine, J., Palmer, G.H., Mwangi, W., Lahmers, K.K., Brown, W.C., 2008. Rapid deletion of antigen-specific CD4+ T cells following infection represents a strategy of immune evasion and persistence for Anaplasma marginale. The Journal of Immunology, 181(11): 7759.

Han, S., Norimine, J., Brayton, K.A., Palmer, G.H., Scoles, G.A., Brown, W.C., 2010. Anaplasma marginale infection with persistent high-load bacteremia induces a dysfunctional memory CD4+T lymphocyte response but sustained high IgG titers. Clinical and Vaccine Immunology, 17 (12), 1881-1890.

Häselbarth, K., Tenter, A.M., Brade, V., Krieger, G., Hunfeld, K.P., 2007. First case of human babesiosis in Germany – Clinical presentation and molecular characterisation of the pathogen. International Journal of Medical Microbiology, 297: 197–204.

271

Hasle, G., Bjune, G.A., Christensson, D., Røed, K.H., Whist, A.C., Leinaas, H.P., 2010. Detection of Babesia divergens in southern Norway by using an immunofluorescence antibody test in cow sera. Acta Veterinaria Scandinavica, 52: 55.

Henry, E.T., Norman, B.B., Fly, D.E., Wichmann, R.W., York, S.M., 1983. Effects and use of a modified live Anaplasma marginale vaccine in beef heifers in California. Journal of the American Veterinary Medical Association, 183 (1): 66-69.

Herwaldt, B.L., Cacciò, S., Gherlinzoni, F., Aspöck, H., Slemenda, S.B., Piccaluga, P., Martinelli, G., Edelhofer, R., Hollenstein, U., Poletti, G., Pampiglione, S., Löschenberger, K., Tura, S., Pieniazek, N.J., 2003. Molecular characterization of a non–Babesia divergens organism causing zoonotic babesiosis in Europe. Emerging Infectious Diseases, 9 (8): 942-948.

Hilpertshauser, H., Deplazes, P., Schnyder, M., Gern, L., Mathis, A., 2006. Babesia spp. identified by PCR in ticks collected from domestic and wild ruminants in southern Switzerland. Applied and Environmental Microbiology, 72 (10): 6503-6507.

Hilpertshauser, H., Deplazes, P., Meli, M.L., Hofmann-Lehmann, R., Lutz, H., Mathis, A., 2007. Genotyping of Babesia bigemina from cattle from a non-endemic area (Switzerland). Veterinary Parasitology, 145: 59-64.

Hoar, B.R., Nieto, N.C., Rhodes, D.M., Foley, J.E., 2008. Evaluation of sequential coinfection with Anaplasma phagocytophilum and Anaplasma marginale in cattle. American Journal of Veterinary Research, 69 (9): 1171-1178.

Hoby, S., Mathis, A., Doherr, M.G., Robert, N., Ryser-Degiorgis, M.P., 2009. Babesia capreoli infections in alpine chamois (Rupicapra rupicapra), roe deer (Capreolus capreolus) and red deer (Cervus elaphus) from Switzerland. Journal of Wildlife Diseases, 45 (3): 784-753.

Hofmann-Lehmann, R., Meli, M. L., Dreher, U.M., Gönczi, E., Deplazes, P., Braun, U., Engels, M., Schüpbach, J., Jörger, K., Thoma, R., Griot, C., Stärk, K.D.C., Willi, B., Schmidt, J., Kocan, K.M., Lutz, H., 2004. Concurrent infections with vector-borne pathogens associated with fatal hemolytic anemia in a cattle herd in Switzerland. Journal of clinical microbiology, 42 (8): 3775-3780.

Holman, P.J., Waldrup, K.A., Droleskey, R.E., Corrier, D.E., Wagner, G.G., 1993. In vitro growth of Babesia bovis in white-tailed deer (Odocoileus virginianus) erythrocytes. The Journal of Parasitology, 79 (2): 233-237.

272

Holman, P.J., Carroll, J.E., Pugh, R., Davis, D.S., 2011. Molecular detection of Babesia bovis and Babesia bigemina in white-tailed deer (Odocoileus virginianus) from Tom Green County in central Texas, Veterinary Parasitology ,177: 298-304.

Hornok, S., Elek, V., de la Fuente, J., Naranjo, V., Farkas, R., Majoros, G., Földvári, G., 2007. First serological and molecular evidence on the endemicity of Anaplasma ovis and A. marginale in Hungary. Veterinary Microbiology, 122: 316-322.

Hornok, S., Földvári, G., Elek, V., Naranjo, V., Farkas, R., de la Fuente, J., 2008. Molecular identification of Anaplasma marginale and rickettsial endosymbionts in blood-sucking flies (Diptera: Tabanidae, Muscidae) and hard ticks (Acari: Ixodidae). Veterinary Parasitology, 154: 354-359.

Hornok, S., Hofmann-Lehmann, R., Fernández-de Mera, I.G., Meli, M.L., Elek, V., Hajtós, I., Répási, A., Gönczi, E., Tánczos, B., Farkas, R., Lutz, H., de la Fuente, J., 2010. Survey on blood-sucking lice (Phthiraptera: Anoplura) of ruminants and pigs with molecular detection of Anaplasma and Rickettsia spp. Veterinary Parasitology, 174: 355-358.

Hornok, S., Micsutka, A., Fernández-de Mera, I.G., Meli, M.L., Gönczi, E., Tánczos, B., Mangold, A.J., Farkas, R., Lutz, H., Hofmann-Lehmann, R., de la Fuente, J., 2012. Fatal bovine anaplasmosis in a herd with new genotypes of Anaplasma marginale, Anaplasma ovis and concurrent haemoplasmosis. Research in Veterinary Science, 92: 30-35.

Hornok, S., Mester, A., Takács, N., Fernández-de Mera, I.G., de la Fuente, J., Farkas, R., 2014. Re-emergence of bovine piroplasmosis in Hungary: has the etiological role of Babesia divergens been taken over by B. major and Theileria buffeli? Parasites & Vectors, 7: 434-437.

Hugh-Jones, M.E., Busch, D., Raby, C., Jones, F., 1988. Seroprevalence survey for Anaplasma card-test reactors in Louisiana, U.S.A., Cattle. Preventive Veterinary Medicine, 6: 143-153.

ICGC (Institut Cartogràfic i Geològic de Catalunya) 2009. Atlas Nacional de Catalunya. (accés 03/2009).

Inokuma, H., Terada, Y., Kamio, T., Raoult, D., Brouqui, P., 2001. Analysis of the 16S rRNA gene sequence of Anaplasma centrale and its phylogenetic relatedness to other Ehrlichiae. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, 8 (2): 241-244.

273

Iseki, H., Zhou, L., Kim, C., Inpankaew, T., Sununta, C., Yokoyama, N., Xuan, X., Jittapalapong, S., Igarashi, I., 2010. Seroprevalence of Babesia infections of dairy cows in northern Thailand. Veterinary Parasitology, 170: 193-196.

Johnson, W.C., Cluff, C.W., Goff, W.L., Wyatt, C.R., 1996. Reactive oxygen and nitrogen intemediates and products from polyamine degradation are Babesiacidal in vitro. Annals of the New York Academy of Sciences, 791: 136-147.

Jonsson, N.N., Bock, R.E., Jorgensen, W.K., 2008. Productivity and health effects of anaplasmosis and babesiosis on Bos indicus cattle and their crosses, and the effects of differing intensity of tick control in Australia. Veterinary Parasitology, 155: 1-9.

Jorgensen, W.K., de Vos, A.J., Dalgliesh, R.J., 1989. Infectivity of cryopreserved Babesia bovis, Babesia bigemina and Anaplasma centrale for cattle after thawing, dilution and incubation at 30°C. Veterinary Parasitology, 31: 243-251.

Kahn C.M., 2007. Manual Merck de veterinaria. Sisena edició. Merck&Co., Inc., USA.

Kania, S.A., Allred, D.R., Barbet, A.F., 1995. Babesia bigemina: Host factors affecting the invasion of erythrocytes. Experimental Parasitology, 80: 76-84.

Kappmeyer, L.S., Perryman, L.E., Hines, S.A., Baszler, T.V., Katz, J.B., Hennager, S.G., Knowles, D.P., 1999. Detection of equine antibodies to Babesia caballi by recombinant B. caballi rhoptry-associated protein 1 in a competitive-inhibition enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Clinical Microbiology, 37 (7): 2285-2290.

Kessler, R.H., Sacco, A.M.S., Madruga, C.R., Muller, M., Miguita, M., 1998. Teste crítico de vacinas atenuadas de Babesia bovis, B. bigemina e Anaplasma marginale em novilhas da raça Holandesa. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, 7: 1-5.

Kim, C., Alhassan, A., Verdida, R.A., Yokoyama, N., Xuan, X., Fujisaki, K., Kawazu, S.I., Igarashi, I., 2007a. Development of two immunochromatographic tests for the serodiagnosis of bovine babesiosis. Veterinary Parasitology, 148: 137-143.

Kim, J.Y., Cho, S.H., Joo, H.N., Tsuji, M., Cho, S.R., Park, I.J., Chung, G.T., Ju, J.W., Cheun, H.I., Lee, H.W., Lee, Y.H., Kim, T.S., 2007b. First case of human babesiosis in Korea: Detection and characterization of a novel type of Babesia sp. (KO1) similar to ovine Babesia. Journal of Clinical Microbiology, 45 (6): 2084-2087.

274

Kim, C.M., Conza-Blanco, L.B., Alhassan, A., Iseki, H., Yokoyama, N., Xuan, X., Igarashi, I., 2008. Development of a rapid immunochromatographic test for simultaneous serodiagnosis of bovine babesioses caused by Babesia bovis and Babesia bigemina. The American Journal of Tropical Medicine and hygiene, 78 (1): 117-121.

Kim, P.S., Ahmed, R., 2010. Features of responding T cells in cancer and chronic infection. Current Opinion in Immunology, 22 (2): 223-230.

Knowles, R.T., Montrose, M., 1982. Clinical and serological evidence of bovine babesiosis and anaplasmosis in St. Lucia. Veterinary Parasitology, 10: 307-311.

Knowles, D., Torioni de Echaide, S., Palmer, G., MCGuire, T., Stiller, D., MCElwain, T., 1996. Antibody against an Anaplasma marginale MSP5 Epitope common to tick and erythrocyte stages identifies persistently infected cattle. Journal of Clinical Microbiology, 34 (9): 2225-2230.

Kocan, K.M., 1995. Targeting ticks for control of selected hemoparasitic diseases of cattle. Veterinary Parasitology, 57: 121-151.

Kocan, K.M., Blouin, E.F., Palmer, G.H., Eriks, I.S., Edwards, W.L., 1996. Strategies to interrupt the development of Anaplasma marginale in its tick vector. The effect of bovine-derived antibodies. Annals of the New York Academy of Sciences, 791 (1): 157- 165.

Kocan, K. M., Blouin, E.F., Barbet, A.F., 2000. Anaplasmosis control: past, present, and future. Annals of the New York Academy of Sciences, 916 (1): 501-509.

Kocan, K.M., Halbur, T., Blouin, E.F., Onet, V., de la Fuente, J., Garcia-Garcia, J.C., Saliki, J.T., 2001. Immunization of cattle with Anaplasma marginale derived from tick cell culture. Veterinary Parasitology, 102: 151-161.

Kocan, K.M., de la Fuente, J., Guglielmone, A.A., Meléndez, R.D., 2003. Antigens and alternatives for control of Anaplasma marginale infection in cattle. Clinical Microbiology Reviews, 16 (4): 698-712.

Kocan, K.M., de la Fuente, J., 2003. Co-feeding studies of ticks infected with Anaplasma marginale. Veterinary Parasitology, 112: 295-305.

Kocan, K.M., de la Fuente, J., Blouin, E.F., Garcia-Garcia, J.C., 2004. Anaplasma marginale (Rickettsiales: Anaplasmataceae): recent advances in defining host– pathogen adaptations of a tick-borne rickettsia. Parasitology, 129: 285-300.

275

Kocan, K.M., Zivkovic, Z., Blouin, E.F., Naranjo, V., Almazán, C., Mitra, R., de la Fuente, J., 2009. Silencing of genes involved in Anaplasma marginale-tick interactions affects the pathogen developmental cycle in Dermacentor variabilis. BMC Developmental Biology, 9: 42.

Kocan, K.M., de la Fuente, J., Blouin, E.F., Coetzee, J.F., Ewing, S.A., 2010. The natural history of Anaplasma marginale. Veterinary Parasitology, 167: 95–107.

Krause, P.J., Telford, S.R., 3rd, Ryan, R., Conrad, P.A., Wilson, M., Thomford, J.W., Spielman, A., 1994. Diagnosis of babesiosis: evaluation of a serologic test for the detection of Babesia microti antibody. The Journal of infectious diseases, 169 (4): 923- 926.

Kubelová, M., Mazancová, J., Siroký, P., 2012. Theileria, Babesia and Anaplasma detected by PCR in ruminant herds at Bié province, Angola. Parasite, 19: 417-422.

Kuttler, K. L., 1984. Anaplasma infections in wild and domestic rumiants: a review. Journal of Wildlife Diseases, 20(1): 12-20.

Kuttler, K. L., Zaugg, J.L., Johnson, L.W. 1984. Serologic and clinical responses of premunized vaccinated and previously infected cattle to challenge exposure by two different Anaplasma marginale isolates. American Journal of Veterinary Research, 45: 2223-2226.

Kuttler, K.L., Zaugg, J.L., 1988. Characteristics of an attenuated Anaplasma marginale of deer origin as an anaplasmosis vaccine. Tropical Animal Health and Production, 20 (2): 85-91.

Langton, C., Gray, J.S., Waters, P.F., Holman, P.J., 2003. Naturally acquired babesiosis in a reindeer (Rangifer tarandus tarandus) herd in Great Britain. Parasitology Research, 89: 194-198.

Latif, B.M.A., Said, M.S., Ali, S.R., 1979. Effect of age on the immune resposte of cattle experimentally infected with Babesia bigemina. Veterinary Parasitology, 5: 307-314.

Lempereur, L., Lebrun, M., Cuvelier, P., Sépult, G., Caron, Y., Saegerman, C., Shiels, B., Losson, B., 2012. Longitudinal field study on bovine Babesia spp. and Anaplasma phagocytophilum infections during a grazing season in Belgium. Parasitology Research, 110: 1525-1530.

276

LeRoith, T., Brayton, K.A., Molloy, J.B., Bock, R.E., Hines, S.A., Lew, A.E., McElwain, T.F., 2005. Sequence variation and immunologic cross-reactivity among Babesia bovis merozoite surface antigen 1 proteins from vaccine strains and vaccine breakthrough isolates. Infection and Immunity, 73 (9): 5388-5394.

Leverich, C.K., Palmer, G.H., Knowles Jr., D.P., Brayton, K.A., 2008. Tick-borne transmission of two genetically distinct Anaplasma marginale strains following superinfection of the mammalian reservoir host. Infection and Immunity, 76 (9): 4066- 4070.

Levy, M.G., Ristic, M., 1980. Babesia bovis: Continuous cultivation in a microaerophilous stationary phase culture. Science, 207: 1218-1220.

Lew, A.E., Bock, R.E., Minchin, C.M., Masaka, S., 2002. A msp1α polymerase chain reaction assay for specific detection and differentiation of Anaplasma marginale isolates. Veterinary Microbiology, 86: 325-335.

L'Hostis, M., Chauvin, A., Valentin, A., Marchand, A., Gorenflot, A., 1995. Large scale survey of bovine babesiosis due to Babesia divergens in France. The Veterinary Record, 136 (2): 36-38.

L'Hostis, M., Seegers, H., 2002. Tick-borne parasitic diseases in cattle: Current knowledge and prospective risk analysis related to the ongoing evolution in French cattle farming systems. Veterinary Research, 33: 599-611.

Li, Y., Luo, Y., Cao, S., Terkawi, M.A., Lan, D.T., Long, P.T., Yu, L., Zhou, M., Gong, H., Zhang, H., Zhou, J., Yokoyama, N., Suzuki, H., Xuan, X., 2014. Molecular and seroepidemiological survey of Babesia bovis and Babesia bigemina infections in cattle and water buffaloes in the central region of Vietnam. Tropical Biomedicine, 31 (3): 406- 413.

Lis, K., Fernández-de Mera, I.G., Popara, M., Cabezas-Cruz, A., Ayllón, N., Zweygarth, E., Passos, L.M., Broniszewska, M., Villar, M., Kocan, K.M., Ribeiro, M.F., Pfister, K., de la Fuente, J., 2015. Molecular and immunological characterization of three strains of Anaplasma marginale grown in cultured tick cells. Ticks and Tick-Borne Diseases, 6 (4): 522-529.

Liu, L., Narasimhan, S., Dai, J., Zhang, L., Cheng, G., Fikrig, E., 2011. Ixodes scapularis salivary gland protein P11 facilitates migration of Anaplasma phagocytophilum from the tick gut to salivary glands. EMBO Reports, 12 (11): 1196-1203.

277

Liu, L., Dai, J., Zhao, Y.O., Narasimhan, S., Yang, Y., Zhang, L., Fikrig, E., 2012. Ixodes scapularis JAK-STAT pathway regulates tick antimicrobial peptides, thereby controlling the agent of human granulocytic anaplasmosis. The Journal of Infectiosus Diseases, 206 (8): 1233-1241.

Löhr, K.F., 1973. Susceptibility of non-splenectomized and splenectomized Sahiwal cattle to experimental Babesia bigemina infection. Zentralblatt für Veterinärmedizin, 20 (1): 52-56.

López, J.E., Siems, W.F., Palmer, G.H., Brayton, K.A., McGuire, T.C., Norimine, J., Brown, W.C., 2005. Identification of novel antigenic proteins in a complex Anaplasma marginale outer membrane immunogen by mass spectrometry and genomic mapping. Infection and Immunity, 73 (12): 8109-8118.

Luo, J., Yin, H., Liu, Z., Yang, D., Guan, G., Liu, A., Ma, M., Dang, S., Lu, B., Sun, C., Bai, Q., Lu, W., Chen, P., 2005. Molecular phylogenetic studies on an unnamed bovine Babesia sp. Based on small subunit ribosomal RNA gene sequences. Veterinary Parasitology ,133: 1-6.

Mackenstedt, U., Gauer, M., Fuchs, P., Zapf, F., Schein, E., Mehlhorn, H., 1995. DNA measurements reveal differences in the life cycles of Babesia bigemina and B. canis, two typical members of the genus Babesia. Parasitology Research, 81 (7): 595-604.

Madruga, C.R., Marques, A.P.C., Araújo, F.R., Miguita, M., Carvalho, C.M.E., Araújo, F.S., Umaki, A.C.S., Crocci, A.J., Queiróz, R.A., 2001. Evaluation of an ELISA for detection of antibodies to Babesia bigemina in cattle and it’s application in an epidemiological survey in Brazil. Pesquisa Veterinária Brasileira, 21 (2): 72-76.

Mahan, S.M., 2003. Antigenic variation in Anaplasma marginale and Ehrlichia (Cowdria) ruminantium. A: Antigenic variation. Craig, A. and Scherf, A. (Ed). Elsevier, London, UK.

Mahoney, D.F., 1977. Babesia of domestic animals. Parasitic protozoa. Vol. IV. (Ed.) J.P.Kreier. Academic press, Inc., New York. 1-52.

Mahoney, D. F., Kerr, J. D., Goodger, B. V., Wright, I.G., 1979. The immune response of cattle to Babesia bovis (Syn. B.argentina). Studies on the nature and specificity of protection. lnternational Journal for Parasitology, 9: 297-306.

Malak, A.K., Mpoke, L. Banak, J., Muriuki, R.A., Skilton, S., Odongo, D., Sunter, J., Kiara, H., 2012. Prevalence of livestock diseases and their impact on livelihoods in Central Equatoria State, southern Sudan. Preventive Veterinary Medicine, 104: 216-223.

278

Malandrin, L., Jouglin. M., Moreau, E., Chauvin, A., 2009. Individual heterogeneity in erythrocyte susceptibility to Babesia divergens is a critical factor for the outcome of experimental spleen-intact sheep infections. Veterinary Research, 40: 25.

Malandrin, L., Jouglin, M., Sun, Y., Brisseau, N., Chauvin, A., 2010. Redescription of Babesia capreoli (Enigk and Frieghoff, 1962) from roe deer (Capreolus capreolus): isolation, cultivation, host specifity, molecular characterisation and differentiation from Babesia divergens. International Journal of Parasitology, 40 (3): 277-284.

Maldonado, J., Coronado, A., Kowalski, A., Medina, J., 2012. Evidencia molecular de transmisión transplacentaria de Anaplasma marginale en becerros neonatos cebú de Venezuela. Zootecnia Tropical, 30(1): 109-114.

Manilla, G. 1998. Acari, Ixodida. Fauna d'Italia, vol. XXXVI, (Ed.) Calderini, Itàlia. pp 280.

Martins, T.M., Pedro, O.C., Rubina A. Caldeira, R.A., do Rosário, V.E., Neves, L., Domingos, A., 2008. Detection of bovine babesiosis in Mozambique by a novel seminested hot-start PCR method. Veterinary Parasitology, 153: 225-230.

Marufu, M.C., Chimonyo, M., Dzama, K., Mapiye, C., 2010. Seroprevalence of tick- borne diseases in communal cattle reared on sweet and sour rangelands in a semi-arid area of South Africa. The Veterinary Journal, 184: 71-76.

McGuire, T.C., Stephens, E.B., Palmer, G.H., McElwain, T.F., Lichtensteiger, C.A., Leib, S.R., Barbet, A.F., 1994. Recombinant vaccinia virus expression of Anaplasma marginale surface protein MSP-1a: effect of promoters, leader sequences and GPI anchor sequence on antibody response. Vaccine, 12 (5): 465-471.

McHardy, N., Simpson, R.M., 1974. Imidocarb dipropionate therapy in Kenyan anaplasmosis and babesiosis. Tropical Animal Health and Production, 6 (2): 63-70.

Mehlhorn, H., 2008. Enciclopedia of parasitology. 3rd edition. Springer. pp 144.

Meléndez, R.D., Forlano, M., 1997. Seroprevalence and incidence of babesiosis and anaplasmosis in a Carora breed herd from Venezuela. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, 6 (2): 105-109.

Merino, F.J., Nebreda, T., Serrano, J.L., Fernández-Soto, P., Encinas, A., Pérez-Sánchez, R., 2005. Tick species and tick-borne infections identified in population from a rural area of Spain. Epidemiology & Infection, 133: 943-949.

279

Merino, O., Almazán, C., Canales, M., Villar, M., Moreno-Cid, J.A., Galindo, R.C., de la Fuente, J., 2011. Targeting the tick protective antigen subolesin reduces vector infestations and pathogen infection by Anaplasma marginale and Babesia bigemina. Vaccine, 29: 8575-8579.

M’ghirbi, Y., Hurtado, A., Brandika, J., Khlif, K., Ketata, Z., Bouattour, A., 2008. A molecular survey of Theileria and Babesia parasites in cattle, with a note on the distribution of ticks in Tunisia. Parasitology Research, 103: 435–442.

Molad, T., Mazuz, M.L., Fleiderovitz, L., Fish, L., Savitsky, I., Krigel, Y., Leibovitz, B., Molloy, J., Jongejan, F., Shkap, V., 2005. Molecular and serological detection of A. centrale- and A. marginale-infected cattle grazing within an endemic area. Veterinary Microbiology, 113 (1-2): 55-62.

Molloy, J.B., Bowles P.M., Jeston P.J., Bruyeres, A.G., Bowden, J.M., Bock, R.E., Jorgensen, W.K., Blight, G.W., Dalgliesh, R.J., 1998. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay for detection of antibodies to Babesia bigemina in cattle. Parasitology Research, 84: 651-656.

Molloy, J.B., Bowles P.M., Knowles, D.P., McElwain, T.F., Bock, R.E., Kingston, T.G., Blight, G.W., Dalgliesh, R.J., 1999. Comparison of a competitive inhibition ELISA and the card agglutination test for detection of antibodies to Anaplasma marginale and Anaplasma centrale in cattle. Australian Veterinary Journal, 77 (4): 245-249.

Montenegro-James, S., Guillen, A.T., Ma, S.J., Tapang, P., Abdel-Gawad, A., Toro, M., Ristic, M., 1990. Use of the dot enzyme-linked immunosorbent assay with isolated Anaplasma marginale initial bodies for serodiagnosis of anaplasmosis in cattle. American Journal of Veterinary Research, 51 (10): 1518-1521.

Montenegro-James, S., Johnson, W.C., Golf, W.L., 1995. Development of conventional subunit vaccines for anaplasmosis and babesiosis. Veterinary Parasitology, 57: 255-266.

Morilla, A., 1981. Inmunología de la babesiosis. Ciencias veterinarias, 3: 239-275.

Morley, R.S., Hugh-Jones, M. E., 1989. The effect of management and ecological factors on the epidemiology of anaplasmosis in the Red River Plains and south-east areas of Louisiana. Veterinary Research Communications, 13: 359-369.

Morzaria, S.P., Brocklesby, D.W., Harradine, D.L., 1977. Evaluation of the indirect fluorescent antibody test for Babesia major and Theileria mutans in Britain. The Veterinary record, 100 (23): 484-487.

280

Morzaria, S.P., Katende, J., Musoke, A., Nene. V., Skilton, R., Bishop, R., 1999. Development of sero-diagnostic and molecular tools for the control of important tick- borne pathogens of cattle in Africa. Parassitologia, 41 (1): 73-80.

Mosqueda, J., McElwain, T.F., Palmer, G.H., 2002a. Babesia bovis merozoite surface antigen 2 proteins are expressed on the merozoite and sporozoite surface, and specific antibodies inhibit attachment and invasion of erythrocytes. Infection and Immunology, 70: 6448-6455.

Mosqueda, J., McElwain, T.F., Stiller, D., Palmer, G.H., 2002b. Babesia bovis merozoite surface antigen 1 and rhoptry-associated protein 1 are expressed in sporozoites, and specific antibodies inhibit sporozoite attachment to erythrocytes. Infection and Immunology, 70: 1599-1603.

Mosqueda, J., Falcon, A., Alvarez, J.A., Ramos, J.A., Oropeza-Hernandez, L.F., Figueroa, J.V., 2004. Babesia bigemina sexual stages are induced in vitro and are specifically recognized by antibodies in the midgut of infected Boophilus microplus ticks. International Journal for Parasitology, 34: 1229-1236.

Mosqueda, J., Olvera Ramírez, A., Aguilar Tipacamú G., Cantó, G.J., 2012. Current advances in detection and treatment of babesiosis. Current Medicinal Chemistry, 19: 1504-1518.

Mtshali, M.S., de la Fuente, J., Ruybal, P., Kocan, K.M., Vicente, J., Mbati, P.A., Shkap, V., Blouin, E.F., Mohale, N.E., Moloi, T.P., Spickett, A.M., Latif, A.A., 2007. Prevalence and genetic diversity of Anaplasma marginale strains in cattle in South Africa. Zoonoses and Public Health, 54: 23-30.

Nair, A.S., Ravindran, R., Lakshmanan, B., Kumar, S.S., Tresamol, P.V., Saseendranath, M.R., Senthilvel, K., Rao, J.R., Tewari, A.K., Ghosh, S., 2011. Haemoprotozoa of cattle in Northern Kerala, India. Tropical Biomedicine, 28 (1): 68-75.

Naranjo, V., Ruiz-Fons, F., Höfle, U., Fernández de Mera, I.G., Villanúa, D., Almazán, C., Torina, A., Caracappa, S., Kocan, K., Gortázar, C., de la Fuente, J., 2006. Molecular epidemiology of human and bovine anaplasmosis in southern Europe. Annals of the New York Academy of Sciences, 1078: 95-99.

Navarrete, I., Serrano, F.J., Reina, D., 2002. Babesiosis. A: Parasitología veterinaria. Cordero del Campillo, M. i Rojo Vázquez, F.A. McGraw-Hill Interamericana

281

Nielsen, K., Smith, P., Gall, D., de Eshaide, S.T., Wagner, G., Dajer, A., 1996. Development and validation of an indirect enzyme immunoassay for detection of antibody to Anaplasma marginale in bovine sera. Veterinary Parasitology, 67: 133-142.

Nielsen, K., Yu, W.L., Kelly, L., Bermúdez, R., Renteria, T., Dajer, A., Gutiérrez, E., Williams, J., Algire, J., de Eschaide, S.T., 2008. Development of a lateral flow assay for rapid detection of bovine antibody to Anaplasma marginale. Journal of Immunoassay & Immunochemistry, 29 (1): 10-18.

Nielsen, K., Yu, W.L., Kelly, L., Williams, J., Dajer, A., Gutierrez, E., Ramirez, C.G., Renteria, T., Bermudez, R., Algire, J., 2009. Validation and field assessment of a rapid lateral flow assay for detection of bovine antibody to Anaplasma marginale. Journal of Immunoassay and Immunochemistry, 30: 313-321.

Noh, S.M., Zhuang, Y., Futse, J.E., Brown, W.C., Brayton, K.A., Palmer, G.H., 2010. The immunization-induced antibody response to the Anaplasma marginale major surface protein 2 and its association with protective immunity. Vaccine, 28 (21): 3741-3747.

O'Connor, R.M., Allred, D.R., 2000. Erythrocyte surface antigen isoforms cells coselects for altered variant erythrocytes for adhesion to endothelial selection of Babesia bovis- infected. The Journal of Immunology, 164: 2037-2045.

O’Donoghue, P.J., Friedhoff, K.T., Vizcaino, O.G., Weyreter, H., 1985. The detection of IgM and IgG antibodies against Babesia bigemina in bovine sera using semi-defined antigens in enzyme immunoassays. Veterinary Parasitology, 18 (1): 1-12.

OIE 2010. Bovine babesiosis. A: Manual of Standards for Diagnostic, Tests and Vaccines, Fourth Edition, pp. 412–422. Paris, Oficina International d'Epizooties.

OIE, 2012. Bovine anaplasmosis. OIE Terrestrial Manual, 1: 589-600.

OIE, 2014. Terrestrial Animal Health Code 2014. Section 11, chapter 1. (accés 15/01/2015).

Oliveira, J.B., Montoya, J., Romero, J.J., Urbina, A., Soto-Barrientos, N., Melo, E.S.P., Ramos, C.A.N., Araújo, F.R., 2011. Epidemiology of bovine anaplasmosis in dairy herds from Costa Rica. Veterinary Parasitology, 177: 359-365.

Oliveira-Sequeira, T.C.G., Oliveira, M.C.S., Araújo Jr., J.P., Amarante, A.F.T., 2005. PCR- based detection of Babesia bovis and Babesia bigemina in their natural host Boophilus

282

microplus and cattle. International Journal for Parasitology, 35: 105-111.

Oporto, B., Gil, H., Barral, M., Hurtado, A., Juste, R.A., García-Pérez, A.L., 2003. A survey on Anaplasma phagocytophila in wild small mammals and roe deer (Capreolus capreolus) in northern Spain. Annals of the New York Academy of Sciences, 990: 98-102.

Osorno, M.B., Solana, P.M., Pérez, J.M., López, T.R., 1975. Study of an attenuated Anaplasma marginale vaccine in Mexico. Natural challenge of immunity in an enzootic area. American Journal of Veterinary Research, 36: 631-633.

Oura, C.A.L., Bishop, R.P., Wampande, E.M., Lubega, G.W., Tait, A., 2004. Application of a reverse line blot assay to the study of haemoparasites in cattle in Uganda. International Journal for Parasitology, 34: 603-613.

Palacios, C., Torioni de Echaide, S., Mattion, N., 2014. Evaluation of the immune response to Anaplasma marginale MSP5 protein using a HSV-1 amplicon vector system or recombinant protein. Research in Veterinary Science, 97 (3): 514-520.

Palmer, G.H., Munodzana, D., Tebele, N., Ushe, T., McElwain, T.F., 1994. Heterologous strain challenge of cattle immunized with Anaplasma marginale outer membranes. Veterinary Immunology and lmmunopathology, 42: 265-273.

Palmer, G.H., McElwain, T.F., 1995. Molecular basis for vaccine development against anaplasmosis and babesiosis. Veterinary Parasitology, 57 (1-3): 233-253.

Palmer, G.H., Rurangirwa, F.R., Kocan K.M., Brown, W.C., 1999. Molecular basis for vaccine development against the ehrlichial pathogen Anaplasma marginale. Parasitology Today, 15 (7): 281-286.

Palmer, G.H, Brown, W.C., Rurangirwa, F.R., 2000. Antigenic variation in the persistence and transmission of the ehrlichia Anaplasma marginale. Microbes and Infection, 2: 167-176.

Palmer, G.H., Rurangirwa, F.R., McElwain, T.F., 2001. Strain composition of the Ehrlichia Anaplasma marginale within persistently infected cattle, a mammalian reservoir for tick transmission. Journal of Clinical Microbiology, 39 (2): 631-635.

Palmer, G.H., Knowles Jr., D.P., Rodríguez, J.L., Gnad, D.P., Hollis, L.C., Marston, T., Brayton, K.A., 2004. Stochastic transmission of multiple genotypically distinct Anaplasma marginale strains in a herd with high prevalence of Anaplasma infection. Journal of Clinical Microbiology, 42 (11): 5381-5384.

283

Palmer, G.H., Bankhead, T., Lukehart, S.A., 2009. 'Nothing is permanent but change'- antigenic variation in persistent bacterial pathogens. Cellular Microbiology, 11 (12): 1697-1705.

Papadopoulos, B., Brossard, M., Made Pefid, N., 1996. Piroplasms of domestic animals in the Macedonia region of Greece. 2. Piroplasms of cattle. Veterinary Parasitology, 63: 57-66.

Parker, R.J., Shepherd, R.K., Trueman, K.F., Jones, G.W., Kent, A.S., Polkinghorne, I.G., 1985. Susceptibility of Bos indicus and Bos taurus to Anaplasma marginale and Babesia bigemina infections. Veterinary Parasitology, 17: 205-213.

Payne, R.C., Ward, D.E., Usman, M., Rusli, A., Djauhari, D., Husein, A., 1988. Prevalence of Bovine Haemoparasites in Aceh Province of Northern Sumatra: Implications for imported cattle. Preventive Veterinary Medicine, 6: 275-283.

Penzhorn, B.L., 2006. Babesiosis of wild carnivores and ungulates. Veterinary Parasitology, 138: 11-21.

Pérez, E., Herrero, M.V., Jimenez, C., Carpenter, T.E., Buening, G., 1994. Epidemiology of bovine anaplasmosis and babesiosis in Costa Rica. Preventive Veterinary Medicine, 20 (1-2): 23-31.

Pipano, E., Shkap, V., Kriegel, Y., Leibovitz, B., Savitsky, I., Fish, L., 2002. Babesia bovis and B. bigemina: Persistence of infection in friesian cows following vaccination with live antibabesial vaccines. The Veterinary Journal, 164: 64-68.

Pohl, A.E., 2013. Epidemiological study of tick-borne diseases in cattle in Minas Gerais, Brazil. Doktorarbeiten. Fakultät der Ludwig-Maximilians-Universität München.

Portillo, A., Santos, A.S., Santibáñez, S., Pérez-Martínez, L., Blanco, J.R., Ibarra, V., Oteo, J.A., 2005. Detection of a non-pathogenic variant of Anaplasma phagocytophilum in Ixodes ricinus from La Rioja, Spain. Annals of the New York Academy of Sciences, 1063: 333-336.

Portillo, A., Pérez-Martínez, L., Santibáñez, S., Santibáñez, P., Palomar, A.M., Oteo, J.A., 2011. Anaplasma spp. in wild mammals and Ixodes ricinus from the north of Spain. Vector-Borne and Zoonotic Diseases, 11 (1): 3-8.

284

Potgieter, F.T., van Rensburg, L., 1987. The persistence of colostral Anaplasma antibodies and incidence of in utero transmission of Anaplasma infections in calves under laboratory conditions. Onderstepoort Journal of Veterinary Research, 54 (4): 557-560.

Potgieter, F.T., Stoltsz, W.H., 2004. Bovine anaplasmosis. A: Coetzer, J. A. W.;Tustin, R. C. (Ed). Infectious diseases of livestock, 1: 594-616.

Pruneau, L., Moumène, A., Meyer, D.F., Marcelino, I., Lefrançois, T., Vachiéry, N., 2014. Understanding Anaplasmataceae pathogenesis using "Omics" approaches. Frontiers in Cellular and Infection microbiology, 4: 86.

Purnell, R.E., Hendry, D.J., Bidwell, D.E., Turp, P., 1976. Microplate enzyme linked immunosorbent assay for antibody to Babesia divergens in cattle. Veterinary Record, 99 (6): 102.

Radostits, O.M., Gay, C.C., Hinchcliff, K.W., Constable, P.D., 2007. Veterinary Medicine. A textbook of the diseases of cattle, horses, sheep, pigs and goats. 10th ed. WB Saunders. London. 1455-1459.

Rahman, W.A., Lye, Y.P., Chandrawathani, P., 2010. The seroprevalence of bovine babesiosis in Malaysia. Tropical Biomedicine, 27 (2): 301-307.

Ramos, C.M., Cooper, S.M., Holman, P.J., 2010. Molecular and serologic evidence for Babesia bovis-like parasites in white-tailed deer (Odocoileus virginianus) in south Texas. Veterinary Parasitology ,172: 214–220.

Reinbold, J.B., Coetzee, J.F., Hollis, L.C., Nickell, J.S., Riegel, C.M., Christopher, J.A., Ganta, R.R., 2010a. Comparison of iatrogenic transmission of Anaplasma marginale in Holstein steers via needle and needle-free injection techniques. American Journal of Veterinary Research, 71 (10): 1178-1188.

Reinbold, J.B., Coetzee, J.F., Sirigireddy, K.R., Ganta, R.R., 2010b. Detection of Anaplasma marginale and A. phagocytophilum in bovine peripheral blood samples by duplex real-time reverse transcriptase PCR assay. Journal of Clinical Microbiology, 48 (7): 2424-2432.

Reinbold, J.B., Coetzee, J.F., Hollis, L.C., Nickell, J.S., Riegel, C., Olson, K.C., Ganta, R.R., 2010c. The efficacy of three chlortetracycline regimens in the treatment of persistent Anaplasma marginale infection. Veterinary Microbiology, 145: 69-75.

285

Ristic, M., 1968. Anaplasmosis. A: The pathogens, the infections and the consequences. Weinman, D., Ristic, M., (Eds). Academic Press, USA, 473-542.

Ristic, M., 1977. Bovine anaplasmosis. Parasitic protozoa, vol. IV. Kreier, J.P. (Ed). Academic Press, Inc. London, UK.

Rodríguez, S.D., García-Ortiz, M.A., Hernández-Salgado, G., Santos-Cerda, N.A. Aboytes-Torres, R., Cantó-Alarcón, G.J., 2000. Anaplasma marginale inactivated vaccine: dose titration against a homologous challenge. Comparative Immunology, Microbiology & Infectious Diseases, 23: 239-252.

Rodríguez-Vivas, R.I., Mata-Mendez, Y., Pérez-Gutiérrez, E., Wagner, G., 2004. The effect of management factors on the seroprevalence of Anaplasma marginale in Bos indicus cattle in the Mexican Tropics. Tropical Animal Health and Production, 36: 135- 143.

Rogers, R.J. i Shiels, I.A., 1979. Epidemiology and control of anaplasmosis in Australia. Journal of the South African Veterinary Association, 50: 363-366.

Ros-García, A., M`Ghirbi, Y., Bouttor, A., Hurtado, A., 2011. First detection of Babesia occultans in Hyalomma ticks from Tunisia. Parasitology, 138 (5): 578-582.

Ros-García, A., Juste, R.A., Hurtado, A., 2012a. A highly sensitive DNA bead-based suspension array for the detection and species identification of bovine piroplasms. International Journal for Parasitology ,42: 207-214.

Ros-García, A., García-Pérez, A.L., Verdera, J., Juste, R.A., Hurtado, A., 2012b. Monitoring piroplasms infection in three cattle farms in Minorca (Balearic Islands, Spain) with previous history of clinical piroplamosis. Veterinary Parasitology, 190: 318- 325.

Rosario-Cruz, R., Almazan, C., Miller, R.J., Domínguez-García, D.I., Hernández-Ortiz, R., de la Fuente, J., 2009. Genetic basis and impact of tick acaricide resistance. Frontiers in Bioscience, 14: 2657-2665.

Rubaire-Akiiki, C., Okello-Onen, J., Nasinyama, G.W., Vaarst, M., Kabagambe, E.K., Mwayi, W., Musunga, D., Wandukwa, W., 2004. The prevalence of serum antibodies to tick-borne infections in Mbale District, Uganda: The effect of agro-ecological zone, grazing management and age of cattle. Journal of Insect Science, 4 (8): 1-8.

286

Rymaszewska, A., Grenda, S., 2008. Bacteria of the genus Anaplasma – characteristics of Anaplasma and their vectors: a review. Veterinarni Medicina, 53 (11): 573-584.

Sahibi, H., Rhalem, A.B., Berrag, B., Goff, W.L., 1998. Bovine babesiosis Seroprevalence and ticks associated with cattle from two different regions of Morocco. Annals of the New York Academy of Sciences, 849: 213-218.

Salih, D.A., El Hussein, A.M., Seitzer, U., Ahmed, J.S., 2007. Epidemiological studies on tick-borne diseases of cattle in Central Equatoria State, Southern Sudan. Parasitology Research, 101: 1035-1044.

Salih, D.A., Hassan, S.M., Julla, I.I., Kyule, M.N., Zessin, K-H., El Hussein, A. M., 2008. Distribution and application of ELISA for the seroprevalence of tick-borne diseases in Central Equatoria state, Sudan. Transboundary and Emerging Diseases, 55: 257-262.

Salih, D.A., Abdel Rahman, M.B., Mohammed, A.S. Ahmed, R., Kamal, S., El Hussein, A.M., 2009. Seroprevalence of tick-borne diseases among cattle in the Sudan. Parasitology Research, 104: 845–850.

Saliki, J.T., Blouin, E.F., Rodger, S.J., Kocan, K.M., 1998. Use of tick cell culture-derived Anaplasma marginale antigen in a competitive ELISA for serodiagnosis of anaplasmosis. Annals of the New York Academy of Sciences, 29 (849): 273-281.

Sánchez-Murillo, J.M., González López, M., Martínez Díaz, M., Reyes Galán, A., Sanz Jiménez, C., 2013. Piroplasmosis y anaplasmosis en las dehesas extremeñas. Resultados de los diagnósticos llevados a cabo durante el año 2012. Poster de congreso. Congreso Ibérico de la dehesa y el montado.

Saravanan, B.C., Das, S., Siju, S.J., Tewari, A.K., Sankar, M., Kataktalware, M.A., Ramesha, K.P., 2013. Babesia bigemina infection in yak (Poephagus grunniens L.): Molecular detection and characterization. Veterinary Parasitology ,194: 58-64.

Scharf, W., Schauer, S., Freyburger, F., Petrovec, M., Schaarschmidt-Kiener, D., Liebisch, G., Runge, M., Ganter, M., Kehl, A., Dumler, J.S., García-Peréz, A.L., Jensen, J., Fingerle, V., Meli, M.L., Ensser, A., Stuen, S., von Loewenich, F.D., 2011. Distinct host species correlate with Anaplasma phagocytophilum ankA gene clusters. Journal of Clinical Microbiology, 49 (3): 790-796.

Schetters, T.P., Kleuskens, J., Scholtes, N., Gorenflot, A., 1998. Parasite localization and dissemination in the Babesia-infected host. Annals of Tropical Medicine and Parasitology, 92 (4): 513-519.

287

Schnittger, L., Rodriguez, A.E., Florin-Christensen, M., Morrison, D.A., 2012. Babesia: A world emerging Review Article. Infection, Genetics and Evolution, 12 (8): 1788-1809.

Schoelkopf, L., Hutchinson, C.E., Bendele, K.G., Goff, W.L., Willette, M., Rasmussen, J.M., Holman, P.J., 2005. New ruminant hosts and wider geographic range identified for Babesia odocoilei (Emerson and Wright, 1970). Journal of Wildlife Diseases, 41 (4): 683-690.

Scoles, G.A., Broce, A.B., Lysyk, T.J., Palmer, G.H., 2005a. Relative efficiency of biological transmission of Anaplasma marginale (Rickettsiales: Anaplasmataceae) by Dermacentor andersoni (Acari: Ixodidae) compared with mechanical transmission by Stomoxys calcitrans (Diptera: Muscidae). Journal of Medical Entomology, 42 (4): 668- 675.

Scoles, G.A., Ueti, M.W., Palmer, G.H., 2005b. Variation among geographically separated populations of Dermacentor andersoni (Acari: Ixodidae) in midgut susceptibility to Anaplasma marginale (Rickettsiales: Anaplasmataceae) . Journal of Medical Entomology, 42 (2): 153-162.

Scoles, G.A., Mcelwain, T.F., Rurangirwa, F.R., Knowles, D.P., Lysyk, T.J., 2006. A Canadian bison isolate of Anaplasma marginale (Rickettsiales: Anaplasmataceae) is not transmissible by Dermacentor andersoni (Acari: Ixodidae), whereas ticks from two canadian D. andersoni populations are competent vectors of a U.S. strain . Journal of Medical Entomology, 43(5): 971-975.

Scoles, G.A., Miller, J.A., Foil, L.D., 2008a. Comparison of the efficiency of biological transmission of Anaplasma marginale (Rickettsiales: Anaplasmataceae) by Dermacentor andersoni Stiles (Acari: Ixodidae) with mechanical transmission by the horse fly, Tabanus fuscicostatus Hine (Diptera: Muscidae). Journal of Medical Entomology, 45: 109-114.

Scoles, G.A., Goff, W.L., Lysyk, T.J., Lewis, G.S., Knowles, D.P., 2008b. Validation of an Anaplasma marginale cELISA for use in the diagnosis of A. ovis infections in domestic sheep and Anaplasma spp. in wild ungulates. Veterinary Microbiology, 130: 184-190.

Sevilla, R.G., Corchero, E., Peña, J., 2002. Anaplasmosis. Bovis, 8: 77-84.

Sharma, S.P. i Bansal, G.C., 1986. Immune responses in cattle vaccinated with gamma- irradiated Anaplasma marginale. Indian Journal of Animal Sciences, 56: 490-493.

288

Shebish, E., Vemulapalli, R., Oseto, C., 2012. Prevalence and molecular detection of Anaplasma marginale, Babesia bovis and Babesia bigemina in cattle from Puntarenas Province, Costa Rica. Veterinary Parasitology, 188: 164-167.

Shkap, V., Pipano, E., McGuire, T.C., Palmer, G.H., 1991. Identification of immunodominant polypeptides common between Anaplasma centrale and Anaplasma marginale. Veterinary Immunology and Immunopathology, 29: 31-40.

Shkap, V., Molad, T., Brayton, K.A., Brown, W.C., Palmer, G.H., 2002a. Expression of major surface protein 2 variants with conserved T-cell epitopes in Anaplasma centrale vaccinates. Infection and Immunity, 70 (2): 642-648.

Shkap, V., Molad, T., Fish, L., Palmer, G.H., 2002b. Detection of the Anaplasma centrale vaccine strain and specific differentiation from Anaplasma marginale in vaccinated and infected cattle. Parasitology Research, 88: 546–552.

Shkap, V., Leibovitz, B., Krigel, Y., Molad, T., Fish, L., Mazuz, M., Fleiderovitz, L., Savitsky, I., 2008. Concomitant infection of cattle with the vaccine strain Anaplasma marginale ss centrale and field strains of A. marginale. Veterinary Microbiology, 130: 277-284.

Shoda, L.K.M., Palmer, G.H., Florin-Christensen, J., Florin-Christensen, M., Godson, D.L., Brown, W.C., 2000. Babesia bovis-stimulated macrophages express interleukin-1, interleukin-12, tumor necrosis factor alpha, and nitric oxide and inhibit parasite replication in vitro. Infection and Immunity, 68 (9): 5139-5145.

Silva, M.G., Henriques, G., Sánchez, C., Marques, P.X., Suarez, C.E., Oliva, A., 2009. First survey for Babesia bovis and Babesia bigemina infection in cattle from Central and Southern regions of Portugal using serological and DNA detection methods. Veterinary Parasitology, 166: 66–72.

Silva, M.G., Marques, P.X., Oliva, A., 2010. Detection of Babesia and Theileria species infection in cattle from Portugal using a reverse line blotting method. Veterinary Parasitology, 174: 199-205.

Simuunza, M., Weir, W., Courcier, E., Tait, A., Shiels, B., 2011. Epidemiological analysis of tick-borne diseases in Zambia. Veterinary Parasitology, 175: 331-342.

Sivakumar, T., Kothalawala, H., Abeyratne, S.A.E., Vimalakumar, S.C., Meewewa, A.S., Hadirampela, D.T., Puvirajan, T., Sukumar, S., Kuleswarakumar, K., Chandrasiri, A.D.N., Igarashi, I., Yokoyama, N., 2012. A PCR-based survey of selected Babesia and Theileria parasites in cattle in Sri Lanka. Veterinary Parasitology, 190: 263- 267.

289

Sivakumar, T., Lan, D.T.B., Long, P.T., Yoshinari, T., Tattiyapong, M., Guswanto, A., Okubo, K., Igarashi, I., Inoue, N., Xuan, X., Yokoyama, N., 2013. PCR detection and genetic diversity of bovine hemoprotozoan parasites in Vietnam. The Journal of Veterinary Medical Science, 75 (11): 1455-1462.

Souza-Amorim, L., Arias-Wenceslau, A., Santos-Carvalho, F., Souza-Carneiro, P.L., Rêgo- Albuquerque, G., 2014. Bovine babesiosis and anaplasmosis complex: diagnosis and evaluation of the risk factors from Bahia, Brazil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, 23 (3): 328-336.

Sparagano, O., Loria, G.R., Gubbels, M.J., de Vos, A.P., Caracappa, S., Jongejan, F., 2000. Integrated molecular diagnosis of Theileria and Babesia species of cattle in Italy. Annals of the New York Academy of Sciences, 916: 533-539.

Sserugga, J.N., Jonsson, N.N., Bock, R.E., More, S.J., 2003. Serological evidence of exposure to tick fever organisms in young cattle on Queensland dairy farms. Australian Veterinary Journal, 81 (3): 147-152.

Standfast, N.F., Bock, R.E., Wiecek, M.M., deVos, A.J., Jorgensen, W.K., Kingston, T.G., 2003. Overcoming constraints to meeting increased demand for Babesia bigemina vaccine in Australia. Veterinary Parasitology, 115: 213-222.

Stich, R.W., Shoda, L.K., Dreewes, M., Adler, B., Jungi, T.W., Brown, W.C., 1998. Stimulation of nitric oxide production in macrophages by Babesia bovis. Infection and Immunity, 66 (9): 4130-4136.

Strik, N.I., Alleman, A.R., Barbet, A.F., Sorenson, H.L., Wamsley, H.L., Gaschen, F.P., Luckschander, N., Wong, S., Chu, F., Foley, J.E., Bjoersdorff, A., Stuen, S., Knowles, D.P., 2007. Characterization of Anaplasma phagocytophilum major surface protein 5 and the extent of its cross-reactivity with A. marginale. Clinical and Vaccine Immunology, 14 (3): 262-268.

Suárez, C.E., Noh, S., 2011. Emerging perspectives in the research of bovine babesiosis and anaplasmosis. Veterinary Parasitology ,180: 109-125.

Sukumaran, B., Narasimhan, S., Anderson, J.F., DePonte, K., Marcantonio, N., Krishnan, M.N., Fish, D., Telford, S.R., Kantor, F.S., Fikrig, E., 2006. An Ixodes scapularis protein required for survival of Anaplasma phagocytophilum in tick salivary glands. The Journal of Experimental Medicine, 203 (6): 1507-1517.

290

Sultana, H., Neelakanta, G., Kantor, F.S., Malawista, S.E., Fish, D., Montgomery, R.R., Fikrig, E., 2010. Anaplasma phagocytophilum induces actin phosphorylation to selectively regulate gene transcription in Ixodes scapularis ticks. The Journal of Experimental Medicine, 207 (8): 1727-1743.

Svanova. SVANOVIR® A. marginale-Ab. Identifying Anaplasma marginale in cattle populations. Boehringer Ingelheim Svanova, Uppsala, Sweden. (accés 07/2014)

Swai, E.S., French, N.P., Karimuribo, E.D., Fitzpatrick, J.L., Bryant, M.J., Brown, P.E., Ogden, N.H., 2005. Spatial and management factors associated with exposure of smallholder dairy cattle in Tanzania to tick-borne pathogens. International Journal for Parasitology, 35: 1085-1096.

Tassi, P., Carelli, G., Ceci, L., 2002. Tick-borne diseases (TBDs) of dairy cows in a mediterranean environment. Annals of the New York Academy of Sciences, 969: 314- 317.

Tebele, N., McGuire, T.C., Palmer, G.H., 1991. Induction of protective immunity by using Anaplasma marginale initial body membranes. Infection and Immunity, 59 (9): 3199-3204.

Tebele, N., Skilton, R.A., Katende, J., Wells, C.W., Nene, V., McElwain, T., Morzaria, S.P., Musoke, A.J., 2000. Cloning, characterization, and expression of a 200-kilodalton diagnostic antigen of Babesia bigemina. Journal of Clinical Microbiology, 38 (6): 2240- 2247.

Teclaw, R.F., Romo, S. García, Z. Wagner, G.G., 1985. A serological survey for anaplasmosis in cattle in the mexican states of Nuevo León, Tamaulipas and Coahuila using card test. Preventive Veterinary Medicine, 3: 417-425.

Teglas, M., Matern, E., Lein, S., Foley, P., Mahan, S.M., Foley, J., 2005. Ticks and tick- borne disease in Guatemalan cattle and horses.Veterinary Parasitology, 131: 119-127.

Tembue, A.A.M., da Silva, J.B., da Silva, F.J.M., Pires, M.S., Divan-Baldani, C., Oliveira- Soares, C., Massard, C.L., da Fonseca, A.H., 2011a. Seroprevalence of IgG antibodies against Anaplasma marginale in cattle from south Mozambique. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, Jaboticabal, 20 (4): 318-324.

291

Tembue, A.A.M., Silva, F.J.M., Silva, J.B., Santos, T.M., Santos, H.A., Soares, C.O., Fonseca, A.H., 2011b. Risk factors associated with the frequency of antibodies against Babesia bovis and Babesia bigemina in cattle in southern Mozambique. Pesquisa Veterinária Brasileira, 31 (8): 663-666.

Terkawi, M.A., Thekisoe, O.M., Katsande, C., Latif, A.A., Mans, B.J., Matthee, O., Mkize, N., Mabogoane, N., Marais, F., Yokoyama, N., Xuan, X., Igarashi, I., 2011. Serological survey of Babesia bovis and Babesia bigemina in cattle in South Africa. Veterinary Parasitology, 182 (2-4): 337-342.

Terkawi, M.A., Alhasan, H., Huyen, N.X., Sabagh, A., Awier, K., Cao, S., Goo, Y.K., Aboge, G., Yokoyama, N., Nishikawa, Y., Kalb-Allouz, A.K., Tabbaa, D., Igarashi, I., Xuan, X., 2012. Molecular and serological prevalence of Babesia bovis and Babesia bigemina in cattle from central region of Syria. Veterinary Parasitology, 187 (1-2): 307-311.

Thoen, C., Blackburn, B., Mills, K., Lomme, J., Hopkins, M.P.,1980. Enzyme-linked immunosorbent assay for detecting antibodies in cattle in a herd in which anaplasmosis was diagnosed. Journal of Clinical Microbiology, 11 (5): 499-502.

Tice, G.A., Bryson, N.R., Stewart, C.G., Du Plessis, B., De Waal, D.T., 1998.The absence of clinical disease in cattle in communal grazing areas where farmers are changing from an intensive dipping programme to one of endemic stability to tick-borne diseases. Onderstepoort Journal of Veterinary Research, 65:169- 175.

Toledo, Á., Olmeda, A.S., Escudero, R., Jado, I., Valcárcel, F., Casado-Nistal, M.A., Rodríguez-Vargas, M., Gil, H., Anda, P., 2009. Tick-borne zoonotic bacteria in ticks collected from central Spain. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 81(1): 67-74.

Torina, A., Vicente, J., Alongi, A., Scimeca, S., Turlá, R., Nicosia, S., Di Marco, V., Caracappa S., de la Fuente, J., 2007a. Observed prevalence of tick-borne pathogens in domestic animals in Sicily, Italy during 2003–2005. Zoonoses and Public Health, 54: 8- 15.

Torina, A., Caracappa, S., 2007b. Anaplasmosis in cattle in Italy. Veterinary Research Communications, 31(1): 73-78.

Torina, A., Alongi, A., Naranjo, V., Estrada-Peña, A., Vicente, J., Scimeca, S., Marino, A.M.F., Salina, F., Caracappa, S., de la Fuente, J., 2008a. Prevalence and genotypes of Anaplasma species and habitat suitability for ticks in a mediterranean ecosystem. Applied and Environmental Microbiology, 74 (24): 7578-7584.

292

Torina, A., Alongi, A., Naranjo, V., Scimeca, S., Nicosia, S., Di Marco, V., Caracappa, S., Kocan, K. M., de la Fuente, J., 2008b. Characterization of Anaplasma infections in Sicily, Italy. Animal Biodiversity and Emerging Diseases, Annals of the New York Academy of Sciences, 1149: 90-93.

Torina, A., Alongi, A., Naranjo, V., Estrada-Peña, A., Vicente, J., Scimeca, S., Marino, A.M.F., Salina, F., Caracappa, S., de la Fuente, J., 2009. Prevalence of Anaplasma species and habitat suitability for ticks in Sicily. European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 15 (2): 57-58.

Torina, A., Agnone, A., Blanda, V., Alongi, A., D’Agostino, R., Caracappa, S., Marino, A.M.F., Di Marco, V., de la Fuente, J., 2012. Development and validation of two PCR tests for the detection of and differentiation between Anaplasma ovis and Anaplasma marginale. Ticks and Tick-borne Diseases, 3: 282-286.

Torioni de Echaide, S., Knowles, D.P., McGuire, T.C., Palmer, G.H., Suarez, C.E., McElwain, T.F., 1998. Detection of cattle naturally infected with Anaplasma marginale in a region of endemicity by nested PCR and a competitive enzyme-linked immunosorbent assay using recombinant major surface protein 5. Journal of Clinical Microbiology, 36 (3): 777-782.

Torioni de Echaide, S., Bono, M.F., Lugaresi, C., Aguirre, N., Mangold, A., Moretta, R., Farber, M., Mondillo, C., 2005. Detection of antibodies against Anaplasma marginale in milk using a recombinant MSP5 indirect ELISA. Veterinary Microbiology ,106: 287-292.

Toye, P., Handel, I., Gray, J., Kiara, H., Thumbi, S., Jennings, A., van Wyk, I.C., Ndila, M., Hanotte, O., Coetzer, K., Woolhouse, M., Mark Bronsvoort, M., 2013. Maternal antibody uptake, duration and influence on survival and growth rate in a cohort of indigenous calves in a smallholder farming system in western Kenya. Veterinary Immunology and Immunopathology, 155: 129-134.

Trapaga, J., 1987. La campaña contra la garrapata Boophilus spp. en México. Logros, problemas y perspectivas. A: The eradication of ticks. Proceedings of the expert consultation on the eradication of ticks with special rference to Latin America. México, June 1987. FAO animal production and health paper, 75. Rome, 1989.

Trueman, K.F., Blight, G.W., 1978. The effect of age on resistance of cattle to Babesia bovis. Australian Veterinary Journal, 54 (6): 301-305.

293

Tsai, Y-L., Chomel, B.B., Chang, C-M., Kassa, P.H., Conrad, P.A., Chuang, S-T., 2011. Bartonella and Babesia infections in cattle and their ticks in Taiwan. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases, 34: 179-187.

Tsuji, N., Battsetseg, B., Boldbaatar, D., Miyoshi, T., Xuan, X., Oliver, J.H.Jr., Fujisaki, K., 2007. Babesial vector tick defensin against Babesia sp. parasites. Infection and Immunity, 75 (7): 3633-3640.

Tsuji, N., Miyoshi, T., Battsetseg, B., Matsuo, T., Xuan, X., Fujisaki, K., 2008. A cysteine protease is critical for Babesia spp. transmission in Haemaphysalis ticks. PLoS Pathogens, 4 (5): e1000062.

Ueti, M.W., Reagan, J.O. Jr., Knowles, D.P. Jr., Scoles, G.A., Shkap, V., Palmer, G.H., 2007. Identification of midgut and salivary glands as specific and distinct barriers to efficient tick-borne transmission of Anaplasma marginale. Infection and Immunity, 75 (6): 2959-2964.

Uilenberg, G., 1995. International collaborative research: significance of tick-borne hemoparasitic diseases to world animal health. Veterinary Parasitology, 57: 19-41.

Uilenberg, G., 2006. Babesia—A historical overview. Veterinary Parasitology, 138: 3-10.

Urdaz-Rodríguez J.H., Fosgate, G.T., Alleman, A.R., Rae, D.O., Donovan, G.A., Melendez, P., 2009. Seroprevalence estimation and management factors associated with high herd seropositivity for Anaplasma marginale in commercial dairy farms of Puerto Rico. Tropical Animal Health and Production, 41: 1439-1448. Urqhart, G.M., Armour, J., Duncan, J.L., Dunn, A.M., Jennings, F.W., 1996. Veterinary Parasitology. Blackwell Publishing Professional; 2 edition.Scotland.244.

Vercammen, F., De Deken, R., Maes, L., 1995. Clinical and serological observations on experimental infections with Babesia canis and its diagnosis using the IFAT. Parasite, 2 (4): 407-410.

Vercruysse, J., Schetters, T.P., Knox, D.P., Willadsen, P., Claerebout, E., 2007. Control of parasitic disease using vaccines: an answer to drug resistance? Revue Scientifique et Technique (International Office of Epizootics), 26 (1): 105-115.

Visser, E.S., MCGuire, T.C., Palmer, G.H., Davis, W.C., Shkap,V., Pipano, E., Knowles, Jr., D.P., 1992. The Anaplasma marginale msp5 gene encodes a 19-kilodalton protein conserved in all recognized Anaplasma species. Infection and Immunity, 60 (12): 5139- 5144.

294

Waltisbuhl, D.J., Goodger, B.V., Wright, I.G., Commins, M.A., Mahoney, D.F., 1987. An enzyme linked immunosorbent assay to diagnose Babesia bovis infection in cattle. Parasitology Research, 73 (2): 126-131.

Weber, G., Friedhoff, K.T., 1977. Preliminary observations on the ultrastructure of supposed sexual stages of Babesia bigemina (Piroplasmea). Zeitschrift für Parasitenkunde, 53: 83-92.

Weiland, G., 1986. Species-specific serodiagnosis of equine piroplasma infections by means of complement fixation test (CFT), immunofluorescence (IIF), and enzyme- linked immunosorbent assay (ELISA). Veterinary Parasitology, 20 (1-3): 43-48.

Welter, C.L., Ristic, M., 1972. Anaplasmosis vaccines. United States patent no.3674860. Diamond laboratories, Inc. Iowa, United States.

Willadsen, P., Bird, P., Cobon, G.S., Hungerford, J., 1995. Commercialisation of a recombinant vaccine against Boophilus microplus. Parasitology, 110: 43-50.

Wilson, A.J., Parker, R., Trueman, K.F., 1980. Experimental immunization of calves against Anaplasma marginale infection: Obsevations on the use of living A. centrale and A. marginale. Veterinary Parasitology, 7: 305-311.

Wright, I.G., Kerr, J.D., 1977. Hypotension in acute Babesia bovis (= B. argentina) infections of splenectomized calves. Journal of Comparative Pathology, 87 (4): 531-534.

Wright, I.G., Goodger, B.V., Leatch, G., Aylward, J.H., Rode-Bramanis, K., Waltisbuhl, D.J., 1987. Protection of Babesia bigemina-immune animals against subsequent challenge with virulence Babesia bovis. Infection and Immunity, 55 (2): 364-368.

Wright, I.G., 1990. Immunodiagnosis of and immunoprophylaxis against the haemoparasites Babesia sp. and Anaplasma sp. in domestic animals. Revue scientifique et technique (International Office of Epizootics), 9 (2): 345-356.

Wright, I.G., Casu, R., Commins, M.A., Dalrymple, B.P., Gale, K.R., Goodger, B.V., Riddles, P.W., Waltisbuhl, D.J., Abetz, I., Berrie, D.A., Bowles, Y., Dimmock, C., Hayes, T., Kalnins, H., Leatch, G., McCrae, R., Montague, P.E., Nisbet, I.T., Parrodi, F., Peters, J.M., Scheiwe, P.C., Smith, W., Rode-Bramanis, K., White, M.A., 1992. The development of a recombinant Babesia vaccine. Veterinary Parasitology, 44: 3-13.

Yeruham, I., Avidar, Y., Aroch, I., Hadani, A., 2003. Intra-uterine infection with Babesia

295

bovis in a 2-day-old calf. Journal of Veterinary Medicine, 50: 60-62.

Yokoyama, N., Suthisak, B., Hirata, H., Matsuo, T., Inoue, N., Sugimoto, C., Igarashi, I., 2002. Cellular localization of Babesia bovis merozoite rhoptry-associated protein 1 and its erythrocyte-binding activity. Infection and Immunity, 70 (10): 5822-5826.

Yoshihara, E., Vidotto, O., Yamamura, M.H., Marana, E.R.M., Pacheco, R., Silveira, A.P., 2003. Studies of natural infection with Anaplasma marginale in nelore cattle in the Umuarama municipality, Paraná state, Brazil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, 12 (1): 21-26.

Young A.S., Morzaria, S.P., 1986. Biology of Babesia. Parasitology Today, 2 (8): 211-219.

Yu, L., Terkawi, M.A., Cruz-Flores, M.J., Claveria, F.G., Aboge, G.O., Yamagishi, J., Goo, Y-K., Cao, S., Masatani, T., Nishikawa, Y., Xuan, X., 2013. Epidemiological survey of Babesia bovis and Babesia bigemina infections of cattle in Philippines. The Journal of Veterinary Medical Science, 75 (7): 995-998.

Zanet, S., Trisciuoglio, A., Bottero, E., García-Fernández de Mera, I., Gortazar, C., Carpignano, M.G., Ferroglio, E., 2014. Piroplasmosis in wildlife: Babesia and Theileria affecting free-ranging ungulates and carnivores in the Italian Alps. Parasites & Vectors, 7: 70-76.

Zaugg, J.L., Stiller, D., Coan, M.E., Lincoln, S.D., 1986. Transmission of Anaplasma marginale Theiler by males of Dermacentor andersoni stiles fed on an Idaho field- infected, chronic carrier cow. American Journal of Veterinary Research, 47 (10): 2269- 2271.

Zaugg, J. L., Goff, W.L., Foreyt, W., Hunter, D.L., 1996. Susceptibility of elk (Cervus elaphus) to experimental infection with Anaplama marginale and A. ovis. Journal of Wildlife Diseases, 32 (1): 62-66.

Zhuang, Y., Futse, J.E., Brown, W.C., Brayton, K.A., Palmer, G.H., 2007. Maintenance of antibody to pathogen epitopes generated by segmental gene conversion is highly dynamic during long-term persistent infection. Infection and Immunity, 75 (11): 5185- 5190.

Zintl, A., Gray, J., Skerrett, H.E., Mulcahy, G., 2005. Possible mechanisms underlying age-related resistance to bovine babesiosis. Parasite Immunology, 27: 115-120.

296

Zintl, A., Finnerty, E.J., Murphy, T.M., de Waal, T., Gray, J.S., 2011. Babesias of red deer (Cervus elaphus) in Ireland. Veterinary Research, 42: 7.

Zintl, A., McGrath, G., O’Grady, L., Fanning, J., Downing, K., Roche, D., Casey, M., Gray, J.S., 2014. Changing incidence of bovine babesiosis in Ireland. Irish Veterinary Journal, 67: 19-25.

297

298

BIBLIOGRAFIA DE BESNOITIOSI

Álvarez-García, G., Pereira-Bueno, J., Gómez-Bautista, M., Ortega-Mora, L.M., 2002. Pattern of recognition of Neospora caninum tachyzoite antigens by naturally infected pregnant cattle and aborted foetuses. Veterinary Parasitology, 107: 15-27.

Álvarez-García, G., Frey, C.F., Ortega-Mora, L.M., Schares, G., 2013. A century of bovine besnoitiosis: an unknown disease re-emerging in Europe. Trends in Parasitology, 29 (8): 407-415.

Álvarez-García, G., Fernández-García, A., Gutiérrez-Expósito, D., Ruíz-Santa Quiteria, J.A., Aguado-Martínez, A., Ortega-Mora, L.M., 2014a. Seroprevalence of Besnoitia besnoiti infection and associated risk factors in cattle from an endemic region in Europe. The Veterinary Journal, 200 (2): 328-331.

Álvarez-García, G., Gutiérrez-Expósito, D., Jiménez-Meléndez, A., García-Lunar, P., Ortega-Mora, L.M., 2014b. Impacto de la besnoitiosis bovina y avances en su diagnóstico y control. Boletín de anembe, 103: 14-20.

Ashmawy, K.I., Abu-Akkada, S.S., 2014. Evidence for bovine besnoitiosis in Egypt—first serosurvey of Besnoitia besnoiti in cattle and water buffalo (Bubalus bubalis) in Egypt. Tropical Animal Health and Production, 46: 519-522.

Baldacchino, F., Gardès, L., De Stordeur, E., Jay-Robert, P., Garros, C., 2014. Blood- feeding patterns of horse flies in the French Pyrenees. Veterinary Parasitology, 199 (4): 283-288.

Basso, W., Schares, G., Gollnick, N.S., Rütten, M., Deplazes, P., 2011. Exploring the life cycle of Besnoitia besnoiti—Experimental infection of putative definitive and intermediate host species. Veterinary Parasitology, 178: 223-234.

Basso, W., Lesser, M., Grimm, F., Hilbe, M., Sydler, T., Trösch, L., Ochs, H., Braun, U., Deplazes, P., 2013. Bovine besnoitiosis in Switzerland: Imported cases and local transmission. Veterinary Parasitology, 198: 265-273.

Basson, P.A., McCully, R.M., Bigalke, R.D., 1970. Observations on the pathogenesis of bovine and antelope strains of Besnoitia besnoiti (Marotel, 1912) infection in cattle and rabbits. Onderstepoort Journal of Veterinary Research, 37 (2): 105-126.

299

Berhault, G., 2008. La besnoitiose à Besnoitia besnoiti: étude de réservoirs sauvages potentiels dans un foyer en Maine et Loire. Thèse d'exercice Médecine Vétérinaire, Nantes.

Bigalke, R.D., 1967. The artificial transmission of Besnoitia besnoiti (Marotel, 1912) from chronically infected to susceptible cattle and rabbits. Onderstepoort Journal of Veterinary Research, 34 (2): 303-316.

Bigalke, R.D., 1968. New concepts on the epidemiological features of bovine besnoitiosis as determined by laboratory and field investigations. Onderstepoort Journal of Veterinary Research, 35 (1): 3-138.

Bigalke, R. D., Schoeman, J. H.,McCully, R. M., 1974. Immunization against bovine besnoitiosis with a live vaccine preparated from a blur wildebeest strain of Besnoitia besnoiti grown in cell cultures. 1. Studies on rabbits. Onderstepoort Journal of Veterinary Research, 4: 1-6.

Bigalke, R.D., Prozesky, L., 2004. Besnoitiosis. A: Infectious diseases of livestock, volume one. Ed. Coetzer J.A.W., Tustin R.C. South Africa. 351-359

Blowey, R.W., A. David Weaver A.D., 2011. Infectious diseases. A: Color Atlas of Diseases and Disorders of Cattle (3rd Edition). Mosby. 221-245.

Bussiéras, J., Chermette, R., 1992. Parasitologie vétérinaire. Fascicule II, Protozoologie vétérinaire. Service de parasitologie. École Nationale Vétérinaire d'Alfort.

Bwangamoi, O., Carles, A.B., Wandera, J.G., 1989. An epidemic of besnoitiosis in goats in Kenya. Veterinary Record, 125: 461.

Calero-Bernal, R., Durán, F.E., Nieto, J.M., Martínez-Estéllez, M.A., 2014. Besnoitiosis bovina: otro problema reproductivo que emerge en Europa. Ganadería, 90: 34-38.

Castillo, J.A., 2005. Besnoitiosis bovina. ANEMBE. (accés 03/2014).

Castillo, J.A., Marcén, J.M., Ortega-Mora, L.M., Álvarez-García, G., 2009. La besnoitiosis bovina,presentada como una enfermedad emergente europea. Albeitar, 127: 24-25.

Cortes, H.C.E., Leitão, A., Vila-Vicosa, M.J., Ferreira, M.L., Caeiro, V., Hjerpe, C. A., 2005. Besnoitiosis in bulls in Portugal. Veterinary Record, 157 (9): 262-4.

300

Cortes, H.C.E., Chagas e Silva, J., Baptista, M.C., Pereira, R.M., Horta, A.E.M., Vasques, M.I., Barbas, J.P., Marques, C.C., Leitão, A., 2006a. Besnoitia besnoiti impact on fertility of cattle exploited in Mediterranean pastures (Alentejo). Animal products from the Mediterranean area. EAAP Publication, Wageningen Academic Publisher, 119: 323-329.

Cortes, H.C.E., Nunes, S., Reis, Y., Staubli, D., Vidal, R., Sager, H., Leitão, A., Gottstein, B., 2006b. Immunodiagnosis of Besnoitia besnoiti infection by ELISA and Western blot. Veterinary Parasitology, 141: 216-225.

Cortes, H.C.E., Reis, Y., Waap, H., Vidal, R., Soares, H., Marques, I., Pereira da Fonseca, I., Fazendeiro, I., Ferreira, M.L., Caeiro, V., Shkap, V., Hemphill, A., Leitão, A., 2006c. Isolation of Besnoitia besnoiti from infected cattle in Portugal. Veterinary Parasitology, 141: 226-233.

Cortes, H.C.E., Reis, Y., Gottstein, B., Hemphill, A., Leitão, A., Müller, N., 2007a. Application of conventional and real-time fluorescent ITS1 rDNA PCR for detection of Besnoitia besnoiti infections in bovine skin biopsies. Veterinary Parasitology, 146: 352- 356.

Cortes, H.C.E., Mueller, N., Esposito, Leitão, A., Naguleswaran, A., Hemphill, A., 2007b. In vitro efficacy of nitro- and bromo-thiazolyl-salicylamide compounds (thiazolides) against Besnoitia besnoiti infection in Vero cells. Parasitology, 134: 975-985.

Davis, W.P., Peters, D.F., Dunstan, R.W., 1997. Besnoitiosis in a miniature donkey. Veterinary Dermatology, 8: 139-143.

Diesing, L., Heydorn, A.O., Matuschka, F.R., Bauer, C., Pipano, E., de Waal, D.T., Potgieter, F.T., 1988. Besnoitia besnoiti: Studies on the definitive host and experiental infections in cattle. Parasitology Research, 75: 114-117.

Dubey, J.P., Lindsay, D.S., Rosenthal, B.M., Sreekumar, C., Hill, D.E., Shen, S.K., Kwok, O.C.H., Rickard, L.G., Black, S.S., Rashmir-Raven, A., 2002. Establishment of Besnoitia darlingi from opossums (Didelphis virginiana) in experimental intermediate and definitive hosts, propagation in cell culture, and description of ultrastructural and genetic characteristics. International Journal for Parasitology, 32: 1053-1064.

Dubey, J.P., Shkap, V., Pipano, E., Fish, L., Fritz, D.L., 2003a. Ultrastructure of Besnoitia besnoiti Tissue Cysts and Bradyzoites. Journal of Eukaryotic Microbiology, 50 (4): 240- 244.

301

Dubey, J.P., Lindsay, D.S., 2003b. Development and ultrastructure of Besnoitia oryctofelisi tachyzoites, tissue cysts, bradyzoites, schizonts and merozoites. International Journal for Parasitology, 33: 807-819.

Dubey, J.P., Sreekumar, C., Rosenthal, B.M., Vianna, M.C.B., Nylund, M., Nikander, S., Oksanen, A., 2004. Redescription of Besnoitia tarandi (Protozoa: Apicomplexa) from the reindeer (Rangifer tarandus). International Journal for Parasitology, 34: 1273-1287.

Dubey, J.P., Sreekumar, C., Donovan, T., Rozmanec, M., Rosenthal, B.M., Vianna, M.C.B., Davis, W.P., Belden, J.S., 2005. Redescription of Besnoitia bennetti (Protozoa: Apicomplexa) from the donkey (Equus asinus). International Journal for Parasitology, 35: 659-672.

Dubey, J.P., van Wilpe, E., Blignaut, D.J.C., Schares, G., Williams, J.H., 2013. Development of early tissue cysts and associated pathology of Besnoitia besnoiti in a naturally infected bull (Bos taurus) from South Africa. Journal of Parasitology, 99(3): 459-466.

Ducrocq, J., Beauchamp, G., Kutz, S., Simard, M., Elkin, B., Croft, B., Taillon, J., Côté , S.D., Brodeur, V., Campbell, M., Cooley, D., Cuyler, C., Lair, S., 2012. Comparison of gross visual and microscopic assessment of four anatomic sites to monitor Besnoitia tarandi in barren-ground caribou (Rangifer tarandur). Journal of Wildlife Diseases, 48(3): 732-738.

EFSA, 2010. Bovine besnoitiosis: An emerging disease in Europe. EFSA Journal, 8(2): 1499 1-14.

Ellis, J.T., Holmdahl, O.J.M., Ryce, C., Njenga, J.M., Harper, P.A.W., Morrison, D. A., 2000. Molecular phylogeny of Besnoitia and the genetic relationships among Besnoitia of cattle, wildebeest and goats. Protist, 151: 329-336.

Esteban-Gil, A., Grisez, C., Prevot, F., Florentin, S., Decaudin, A., Picard-Hagen, N., Berthelot, X., Ronsin, P., Alzieu, J.P., Marois, M., Corboz, N., Peglion, M., Vilardell, C., Liénard, E., Bouhsira, E., Castillo, J.A., Franc, M., Jacquiet, P., 2014. No detection of Besnoitia besnoiti DNA in the semen of chronically infected bulls. Parasitology Research, 113: 2355-2362.

Euzeby, J., 1987. Besnoitia. A:Protozoologie medicale comparee. Volume II: Myxozoa, Microspora, Ascetospora, Apicomplexa 1: coccidioses (sensu lato). Collection Fondation Marcel Merieux, France. 363-375.

302

Fernández-García, A., Álvarez-García, G., Risco-Castillo, V., Aguado-Martínez, A., Marugán-Hernández, V., Ortega-Mora, L.M., 2009a. Pattern of recognition of Besnoitia besnoiti tachyzoite and bradyzoite antigens by naturally infected cattle. Veterinary Parasitology, 164: 104-110.

Fernández-García, A., Risco-Castillo, V., Pedraza-Díaz, S., Aguado-Martínez, A., Álvarez- García, G., Gómez-Bautista, M., Collantes-Fernández, E., Ortega-Mora, L.M., 2009b. First isolation of Besnoitia besnoiti from a chronically infected cow in Spain. Journal of Parasitology, 95(2): 474-476.

Fernández-García, A., Álvarez-García, G., Risco-Castillo, V., Aguado-Martínez, A., Marcén, J.M., Rojo-Montejo, S., Castillo, J.A., Ortega-Mora, L.M., 2010. Development and use of an indirect ELISA in an outbreak of bovine besnoitiosis in Spain. Veterinary Record, 166: 818-822.

Fernández-García, A., Morales, A., Pereda, J.M., Aguado-Martínez, A., Marcén, J.M., Rojo-Montejo, S., Risco-Castillo, V., Álvarez-García, G., Ortega-Mora, L.M., 2011. Descripción de un brote de besnoitiosis bovina en el sistema central. ANEMBE. (accés 03/2014).

Fernández-García, A., Álvarez-García, G., Ruíz-SantaQuiteria, J.A., Aguado-Martínez, A., Ortega-Mora, L.M., 2012. Seroprevalencia y factores de riesgo asociados a la infección por Besnoitia besnoiti en el ganado bovino en una región endémica de Europa (Navarra, España). ANEMBE. < http://www.anembe.com/seroprevalencia-y-factores- de-riesgo-asociados-a-la-infeccion-por-besnoitia-besnoiti-en-el-ganado-bovino-en-una- region-endemica-de-europa-navarra-espana-c-oral-2012/> (accés 03/2014).

Foley, G.L., Anderson, W.I., Steinberg, H., 1990. Besnoitiosis of the reproductive tract of a blue duiker (Cephalophus monticola). Veterinary Parasitology, 36: 157-163.

Fouquet, C.M., 2009. La besnoitiose bovine: suivi épidémiologique de l’épizootie de la région PACA. Thèse d'exercice Médecine Vétérinaire, Ecole Nationale Vétérinaire de Lyon.

Frenkel, J.K., Smith, D.D., 2003. Determination of the genera of cyst-forming coccidia. Parasitology Research, 91: 384-389.

Freudiger, I., 2008. La besnoitiose bovine: étude épidémiologique de l’épizootie des Alpes-de-Haute-Provence et des Hautes-Alpes. Thèse d’exercice Médecine vétérinaire, Ecole Nationale Vétérinaire de Lyon.

303

Frey, C.F., Gutiérrez-Expósito, D., Ortega-Mora, L.M., Benavides, J., Marcén, J.M., Castillo, J.A., Casasús, I., Sanz, A., García-Lunar, P., Esteban-Gil, A., Álvarez-García, G., 2013. Chronic bovine besnoitiosis: Intra-organ parasitedistribution, parasite loads and parasite-associated lesions in subclinical cases. Veterinary Parasitology, 197: 95-103.

García de Jalon, J.A., Minguijón, E., Bolea, R.M., Pozatto, N., Ramos, J.J, Fernández de Luco, D., Barberan, M., de las Heras, M., 1995. Besnoitiasis bovina: elevada incidencia en el Pirineo. ITEA. Vol. extra 16, tomo II: 507-509.

García-Lunar, P., Ortega-Mora, L.M., Rojo-Montejo, S., Castillo, J.A., Álvarez-García, G., 2011. Actuación del veterinario ante un brote de besnoitiosis bovina. ANEMBE. (accés 03/2014).

García-Lunar, P., Ortega-Mora, L.M., Gutiérrez-Expósito, D., Benavides-Silvan, J., Castillo, J.A., Álvarez-García, G., 2012. Besnoitiosis bovina: de vieja desconocida a enfermedad re-emergente en Europa. Producción Animal, 269: 6-19.

García-Lunar, P., Ortega-Mora, L.M., Schares, G., Gollnick, N.S., Jacquiet, P., Grisez, C., Prevot, F., Frey, C.F., Gottstein, B., Álvarez-García, G., 2013a. An inter-laboratory comparative study of serological tools employed in the diagnosis of Besnoitia besnoiti infection in bovines. Transboundary and Emerging Diseases, 60: 59-68.

García-Lunar, P., Regidor-Cerrillo, J., Gutiérrez-Expósito, D., Ortega-Mora, L., Álvarez- García, G., 2013b. First 2-DE approach towards characterising the proteome and immunome of Besnoitia besnoiti in the tachyzoite stage. Veterinary Parasitology, 195: 24-34.

García-Lunar, P., Regidor-Cerrillo, J., Ortega-Mora, L.M., Gutiérrez-Expósito, D., Álvarez-García, G., 2014. Proteomics reveals differences in protein abundance and highly similar antigenic profiles between Besnoitia besnoiti and Besnoitia tarandi. Veterinary Parasitology, 205 (3-4): 434-443.

Gentile, A., Militerno, G., Schares, G., Nanni, A., Testoni, S., Bassi, P., Gollnick, N.S., 2012. Evidence for bovine besnoitiosis being endemic in Italy-First in vitro isolation of Besnoitia besnoiti from cattle born in Italy. Veterinary Parasitology, 184: 108-115.

Goldman, M., Pipano, E., 1983. Serological studies on bovine besnoitiosis in Israel. Tropical Animal Health and Production, 15: 32-38.

304

Gollnick, N.S., Gentile, A., Schares, G., 2010. Diagnosis of bovine besnoitiosis in a bull born in Italy. Veterinary Record, 166: 599.

Gollnick, N.S., Langenmayer, M.C., Scharr, J.C., Bauer, B., Schares, G., 2012. Transmission of Besnoitia besnoiti: Close contact of cattle plays key role. Comunicació oral. Proceedings Apicowplexa , 9.

Gottstein, B., Hentrich, B.,Wyss, R., Thur, B., Busato, A., Stark, K.D., Muller, N., 1998. Molecular and immunodiagnostic investigations on bovine neosporosis in Switzerland. International Journal of Parasitology, 28: 679-691.

Gutiérrez-Expósito, D., Ortega-Mora, L.M., Gajadhar, A.A., García-Lunar, P., Dubey, J.P., Álvarez-García, G., 2012. Serological evidence of Besnoitia spp. infection in Canadian wild ruminants and strong cross-reaction between Besnoitia besnoiti and Besnoitia tarandi. Veterinary Parasitology, 190: 19-28.

Gutiérrez-Expósito, D., Ortega-Mora, L.M., Marco, I., Boadella, M., Gortázar, C., San Miguel-Ayanz, J.M., García-Lunar, P., Lavín, S., Álvarez-García, G., 2013. First serosurvey of Besnoitia spp. infection in wild European ruminants in Spain. Veterinary Parasitology, 197: 557-564.

Gutiérrez-Expósito, D., Esteban-Gil, A., Ortega-Mora, L.M., García-Lunar, P., Castillo, J.A., Marcén, J.M., Álvarez-García, G., 2014. Prevalence of Besnoitia besnoiti infection in beef cattle from the Spanish Pyrenees. The Veterinary Journal, 200: 468-470.

Hagler, J.R., 2000. Biological control of insects. A: Insect pest management: Techniques for environmental protection. Jack E. Rechcigl, J.E., Rechcigl N.A.. Lewis Publishers. New York, USA. 208-231.

Hajek, A.E., McManus, M.L., Delalibera Jr., I., 2007. A review of introductions of pathogens and nematodes for classical biological control of insects and mites. Biological Control 41: 1-13.

Hornok, S., Fedák, A., Baska, F., Hofmann-Lehmann, R., Basso, W., 2014. Bovine besnoitiosis emerging in Central-Eastern Europe, Hungary. Parasites & Vectors, 7: 20.

ICGC (Institut Cartogràfic i Geològic de Catalunya) 2009. Atlas Nacional de Catalunya. (accés 07/2013).

305

Irigoien, M., Del Cacho, E., Gallego, M., López-Bernad, F., Quílez, J., Sánchez-Acedo, C., 2000. Immunohistochemical study of the cyst of Besnoitia besnoiti. Veterinary Parasitology, 91: 1-6.

Jacquiet, P., Liénard, E., Franc, M., 2010. Bovine besnoitiosis: Epidemiological and clinical aspects. Veterinary Parasitology, 174: 30-36.

Jacquiet, P., Alzieu, J.P., Liénard, E., Prévot, F., Grisez, C., Boulon, C., Franc, M.,. 2012. Is it possible to stop the spread of bovine besnoitiosis in areas of emergence? Comunicació oral. Proceedings Apicowplexa 2012, 8.

Janitschke, K., de Vos, A.J., Bigalke, R.D., 1984. Serodiagnosis of bovine besnoitiosis by ELISA and immunofluorescence tests. The Onderstepoort Journal of veterinary Research, 51: 239-243.

Juste, R.A., Cuervo, L.A., Marco, J.C., Oregui, L.M., 1990. La besnoitiosis bovina: ¿desconocida en España?. Medicina Veterinaria, 7(11): 613-618.

Kiehl, E., Heydorn, A.O., Schein, E., Al-Rasheid, K.A.S., Selmair, J., Abdel-Ghaffar, F., Mehlhorn, H., 2010. Molecular biological comparison of different Besnoitia species and stages from different countries. Parasitology Research, 106: 889-894.

Kreier, J.P, 1993. Besnoitia A: Parasitic protozoa. Second edition. Vol. 6. Academic Press Inc. 109-116.

Kumi-Diaka, J., Wilson, S., Sanusi, A., Njoku, C.E., Osori, D.I.K., 1981. Bovine besnoitiosis and its effect on the male reproductive system. Theriogenology, 16 (5): 523-530.

Kutz, S.J., Ducrocq, J., Verocai, G.G., Hoar, B.M., Colwell, D.D., Beckmen, K.B., Polley, L., Elkin, B.T., Hoberg, E.P., 2012. Parasites in ungulates of Arctic North America and Greenland: A view of contemporary diversity, ecology, and impact in a world under change. Advances in Parasitology, 79: 99-252.

Langenmayer, M.C., Scharr, J.C., Sauter-Louis, C., Schares, G., Gollnick, N.S., 2015. Natural Besnoitia besnoiti infections in cattle: hematological alterations and changes in serum chemistry andenzyme activities. BMC Veterinary Research, 13: 11-32

Lee, H.S., Bak, U.B., Moon, M.H., Shin, J.U., 1970. Studies of bovine besnoitiosis in Korea II. A survey on incidence in the enzootic region. The Korean Journal of Parasitology, 8 (3): 76-80.

306

Legrand, M., 2003. La besnoitiose bovine en Ariège. Thèse d'exercice, Médecine vétérinaire, Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse.

Leighton, F.A., Gajadhar, A.A., 2008. Besnoitia spp. and besnoitiosis. Protozoans, 3: 468-478.

Lenfant, F., 2013. Mise au point d’une technique de diagnostic sérologique par immunofluorescence indirecte de la Besnoitiose bovine à Besnoitia besnoiti. Thèse d'exercice, Médecine vétérinaire, Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse.

Lewis, R.J., 1989. Besnoitia infection in Woodland caribou. Canadian Veterinary Journal, 30: 436.

Liénard, E., Salem, A., Grisez, C., Prévot, F., Bergeaud, J.P., Franc, M., Gottstein, B., Alzieu, J.P., Lagalisse, Y., Jacquiet, P., 2011. A longitudinal study of Besnoitia besnoiti infections and seasonal abundance of Stomoxys calcitrans in a dairy cattle farm of southwest France. Veterinary Parasitology, 177: 20–27.

Liénard, E., Salem, A., Jacquiet, P., Grisez, C., Prévot, F., Blanchard, B., Bouhsira, E., Franc, M., 2013. Development of a protocol testing the ability of Stomoxys calcitrans (Linnaeus, 1758) (Diptera: Muscidae) to transmit Besnoitia besnoiti (Henry, 1913) (Apicomplexa: Sarcocystidae). Parasitology Research, 112: 479-486.

Loste, J.M., Zabala, J., Bautista, I., Castillo, J.A., 2011. Diagnóstico de besnoitiosis (Besnoitia besnoiti) en un explotación de vacuno lechero de la comunidad floral de Navarra. ANEMBE. (accés 03/2014).

Manuali, E., Lepri, E., Salamida, S., D’Avino, N., Mangili, P., Vitellozzi, G., Grelloni, V., Filippini, G., 2011. An outbreak of bovine besnoitiosis in beef cattle born in central Italy. Transboundary and Emerging Diseases, 58: 464-467.

Mbuthia, P.G., Gathumbi, P.K., Bwangamoi O., Wasike, P.N., 1993. Natural besnoitiosis in a rabbit. Veterinary Parasitology, 45: 191-198.

McCully, R.M., Basson, P.A., Van Niekerk, J.W., Bigalke, R.D., 1966. Observations on Besnoitia cysts in the cardiovascular system of some wild antelopes and domestic cattle. Onderstepoort Journal of Veterinary Research, 33: 245-275.

307

Mehlhorn, H., Klimpel, S., Schein, E., Heydorn, A.O., Al-Quraishy, S., Selmair, J., 2009. Another African disease in Central Europa: Besnoitiosis of cattle. I. Light and electron microscopical study. Parasitology Research, 104: 861-868.

Millán, J., Sobrino, R., Rodríguez, A., Oleaga, A., Gortazar, C., Schares, G., 2012. Large- scale serosurvey of Besnoitia besnoiti in free-living carnivores in Spain. Veterinary Parasitology, 190: 241-245.

Morrissette, N.S., Sibley, L.D., 2002. Cytoskeleton of Apicomplexan Parasites. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 66 (1): 21-38.

Morrison, D.A., Bornstein, S., Thebo, P., Wernery, U., Kinne, J., Mattsson, J.G., 2004. The current status of the small subunit rRNA phylogeny of the coccidia (Sporozoa). International Journal for Parasitology, 34: 501-514.

Muñoz-Caro, T., Silva, L.M.R., Ritter, C., Taubert, A., Hermosilla, C., 2014a. Besnoitia besnoiti tachyzoites induce monocyte extracellular trap formation. Parasitology Research, 113: 4189-4197.

Muñoz-Caro, T., Hermosilla, C., Silva, L.M.R., Cortes, H., Taubert, A., 2014b. Neutrophil extracellular traps as innate immune reaction against the emerging apicomplexan parasite Besnoitia besnoiti. PLOS One, 9 (3).

Mutinelli, F., Schiavon, E., Ceglie, L., Fasolato, M., Natale, A., Rampin, F., Carminato, A., 2011. Bovine besnoitiosis in imported cattle in Italy. Veterinary Parasitology, 178: 198.

Namazi, F., Oryan, A., Sharifiyazdi, H., 2011. Genetic characterization of the causative agent of besnoitiosis in goats in Iran on the basis of internal transcribed spacer rDNA and its comparison with Besnoitia species of other hosts. Parasitology Research, 108: 633–638.

Nasir, A., Lanyon, S.R., Schares, G., Anderson, M.L., Reichel, M.P., 2012. Sero- prevalence of Neospora caninum and Besnoitia besnoiti in South Australian beef and dairy cattle. Veterinary Parasitology, 186: 480-485.

NCBI (National Center for Biotechnology Information) taxonomy browser, 2015. National library of medicine. USA (accés 02/2015).

Ness, S.A.L., Peters-Kennedy, J., Schares, G., Dubey, J.P., Mittel, L.D., Mohammed, H.O., Bowman, D.D., Felippe, M.J.B., Wade, S.E., Shultz, N., Divers, T.J., 2012. Investigation of an outbreak of besnoitiosis in donkeys in northeastern Pennsylvania. Journal of the American Veterinary Medical Association, 240 (11): 1329-1337.

308

Neuman, M., 1972. Serological survey of Besnoitia besnoiti (Marotel 1912) infection in Israel by immunofluorescence. Zentralblatt für Veterinärmedizin Reihe B, 19: 391-396.

Ng’ang’a, C.J., Kanyari, P.W., Munyua, W.K., 1994a. Isolation of Besnoitia wallacei in Kenya. Veterinary Parasitology, 52: 203-206.

Ng’ang’a, C.J., Kasigazi, S., 1994b. Caprine besnoitiosis: studies on the experimental intermediate hosts and the role of the domestic cat in transmission. Veterinary Parasitology, 52: 207-210.

Njagi, O.N., Ndarathi, C.M., Nyaga, P.N., Munga, L.K., 1998. An epidemic of Besnoitiosis in cattle in Kenya. Onderstepoort Journal of Veterinary Research, 65: 133-136.

Njagi, O.N., Entzeroth, R., Nyaga P.N., Musoke, A.J., 2004. Monoclonal antibodies identify two neutralization-sensitive epitopes in Besnoitia besnoiti endocytes. Parasitology Research, 94: 247-253.

Nobel, T.A., Klopfer, U., Perl, S., Nyska, A., Neumann, M., Brenner, G., 1981. Histopathology of genital besnoitiosis of cows in Israel. Veterinary Parasitology, 8: 271- 276.

OIE, World Organisation for Animal Health, 2012. Trichinellosis. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. (accés 03/2014).

Olias, P., Schade, B., Mehlhorn, H., 2011. Molecular pathology, taxonomy and epidemiology of Besnoitia species (Protozoa: Sarcocystidae). Infection, Genetics and Evolution, 11: 1564-1576.

Oryan, A, Azizi, S., 2008. Ultrastructure and pathology of Besnoitia caprae in the naturally infected goats of Kerman, East of Iran. Parasitology Research, 102: 1171- 1176.

Oryan, A., Silver, I.A., Sadoughifar, R., 2014. Caprine besnoitiosis: an emerging threat and its relationship to some other infections of ungulates by Besnoitia species. Research in Veterinary Science, 97: 1-7.

Penzhorn, B.L., 1995. A novel vaccine for a novel problem: bovine besnoitiosis. International Veterinary Student, 4: 12-13.

309

Peteshev, V.M., Galuzo, I.G., Polomoshnov, A.P., 1974. Koshki-definitivnye khozyaeva besnoitii. Izvestiya Akademii Nauk Kazakskoi SSR, Seria Biologicheskaya, 1: 33-38. [Cats as definitive hosts of Besnoitia besnoiti]. Resum en: Veterinary Bulletin.

Pols, J.W., 1960. Studies on bovine besnoitiosis with special reference to the aetiology. Onder stepoort Journal of Veterinary Research, 28 (3): 265-356.

Provost, A., 1975. Note clinique: Un cas de globidiose cutanée bovine. Revue d'elevage et de medecine veterinaire des pays tropicaux, 28 (1): 13-15.

Putt, S.N.H., Shaw, A.P.M., Woods, A.J., Tyler, L., James, A.D., 1988. Veterinary epidemiology and economics in Africa. A manual for use in the design and appraisal of livestock health policy. Veterinary Epidemiology and Economics Research Unit, Department of Agriculture, University of Reading, England. (accés 09/2013).

Rinaldi, L., Maurelli, M.P., Musella, V., Bosco, A., Cortes, H., Cringoli, G., 2013. First cross-sectional serological survey on Besnoitia besnoiti in cattle in Italy. Parasitology Research, 112: 1805-1807.

Rostaher, A., Mueller, R.S., Majzoub, M., Schares, G., Gollnick, N.S., 2009. Bovine besnoitiosis in Germany. Veterinary Dermatology, 21: 329-334.

Salem, A., Bouhsira, E., Liénard, E., Melou, A.B., Jacquiet, P., Franc, M., 2012. Susceptibility of two european strains of Stomoxys calcitrans (L.) to Cypermethrin, Deltamethrin, Fenvalerate, λ-cyhalothrin, Permethrin and Phoxim. International Journal of Applied Research in Veterinary Medicine, 10 (3): 249-257.

Sambo, S.J., Ibrahim, N.D.G., Esievo, K.A.N., Kazeem, H.M., 2014. Prevalence of Besnoitia besnoiti antibodies in bovine sera and milk in Northern Nigeria. Sokoto Journal of Veterinary Sciences, 12 (1): 29-35.

Sannusi, A., 1991. A simple field diagnostic smear test for bovine besnoitiosis. Veterinary Parasitology, 39: 185-188.

Schares, G., Basso, W., Majzoub , M., Cortes, H.C.E., Rostaher, A., Selmair, J., Hermanns, W., Conraths, F.J., Gollnick, N.S., 2009. First in vitro isolation of Besnoitia besnoiti from chronically infected cattle in Germany. Veterinary Parasitology, 163: 315- 322.

310

Schares, G., Basso, W., Majzoub, M., Rostaher, A., Scharr, J.C., Langenmayer, M.C., Selmair, J., Dubey, J.P., Cortes, H.C., Conraths, F.J., Gollnick, N.S., 2010. Comparative evaluation of immunofluorescent antibody and new immunoblot tests for the specific detection of antibodies against Besnoitia besnoiti tachyzoites and bradyzoites in bovine sera. Veterinary Parasitology, 171: 32-40.

Schares, G., Basso, W., Majzoub, M., Rostaher, A., Scharr, J.C., Langenmayer, M.C., Selmair, J., Dubey, J.P., Cortes, H.C., Conraths, F.J., Haupt, T., Pürro, M., Raeber, A., Buholzer, P., Gollnick, N.S., 2011a. Evaluation of a commercial ELISA for the specific detection of antibodies against Besnoitia besnoiti. Veterinary Parasitology, 175: 52-59.

Schares, G., Maksimov, A., Basso, W., Moré, G., Dubey, J.P., Rosenthal, B., Majzoub, M., Rostaher, A., Selmair, J., Langenmayer, M.C., Scharr, J.C., Conraths, F.J., Gollnick, N.S., 2011b. Quantitative real time polymerase chain reaction assays for the sensitive detection of Besnoitia besnoiti infection in cattle. Veterinary Parasitology ,178: 208- 216.

Schares, G., Langenmayer, M.C., Scharr, J.C., Minke, L., Maksimov, P., Maksimov, A., Schares, S., Bärwald, A., Basso, W., Dubey, J.P., Conraths, F.J., Gollnick., N.S., 2013. Novel tools for the diagnosis and differentiation of acute and chronic bovine besnoitiosis. International Journal for Parasitology, 43: 143-154.

Scoles, G.A., Lysyk, T.J., Broce, A.B., Palmer, G.H., 2005. Relative efficiency of biological transmission of Anaplasma marginale (Rickettsiales: Anaplasmataceae) by Dermacentor andersoni Stiles (Acari: Ixodidae) compared to mechanical transmission by Stomoxys calcitrans (L.) (Diptera: Muscidae). Journal of Medical Entomology, 42: 668-675.

Scoles, G.A., Miller, J.A., Foil, L.D., 2008. Comparison of the efficiency of biological transmission of Anaplasma marginale (Rickettsiales: Anaplasmataceae) by Dermacentor andersoni Stiles (Acari: Ixodidae) with mechanical transmission by the horse fly, Tabanus fuscicostatus Hine (Diptera: Muscidae). Journal of Medical Entomology, 45: 109-114.

Sekoni, V.O., Sanusi, A., Abatan, M.O.I., Oyedipe, E.O., Rekwot, P.I., Eduvie, L.O., 1992. Loss of libido and terminal sterility in a friesian bull naturally infected with Besnoitia besnoiti in northern Nigeria; a case report. Theriogenology, 37 (2): 533-549.

Semenza, J.C., Menne, B., 2009. Climate change and infectious diseases in Europe. The Lancet Infectious Diseases,9: 365-375.

311

Shkap, V., Ungar-Waron H., Pipano E., Greenblatt C., 1984. Enzyme linked immunosorbent assay for detection of antibodies against Besnoitia besnoiti in cattle. Tropical Animal Health and Production, 16: 233-238.

Shkap, V., Pipano, E., Ungar-Waron, H., 1987. Besnoitia besnoiti: essais chimiothérapeutiques in vivo et in vitro. Revue d'elevage et de medecine veterinaire des pays tropicaux, 40 (3) : 259-264.

Shkap, V., Ungar-Waron, H., Pipano, E., 1989. Soluble antigens from cultura grown Besnoitia besnoiti endozoites. Veterinary Parasitology, 34 (1-2): 165-170.

Shkap, V., Ungar-Waron, H., Pipano, E., 1990. Identification and partial purification of soluble antigens from culture-grown Besnoitia besnoiti endozoites. Revue d'elevage et de medecine veterinaire des pays tropicaux, 43 (1): 63-68.

Shkap, V., Pipano, E., Marcus, S., Krigel, Y., 1994. Bovine besnoitiosis: transfer of colostral antibodies with observations possibly relating to natural transmission of the infection. Onderstepoort Journal of Veterinary Research, 61: 273-275.

Shkap, V., Pipano, E., Zwernemann, B., 1995. Activity of monoclonal antibody against Besnoitia besnoiti endozoites. Veterinary Research, 26 (4): 328-334.

Shkap, V., Reske, A., Pipano, E., Fish, L., Baszler, T., 2002. Immunological relationship between Neospora caninum and Besnoitia besnoiti. Veterinary Parasitology, 106: 35- 43.

Skovgård, H., Steenberg, G.T., 2002. Activity of pupal parasitoids of the stable fly Stomoxys calcitrans and prevalence of entomopathogenic fungi in the stable fly and the house fly Musca domestica in Denmark. BioControl, 47: 45-60.

Staubli, D., Nunez, S., Sager, H., Schares, G., Gottstein, B., 2006. Neospora caninum immunoblotting improves serodiagnosis of bovine neosporosis. Parasitology Research, 99(6):648-658.

Terrell, T.G., Stookey, J.L., 1973. Besnoitia bennetti in Two Mexican Burros. Veterinary Pathology, 10: 177-184.

Uzêda, R.S., Andrade, M.R., Corbellini, L.G., Antonello, A.M., Vogel, F.S., Gondim, L.F.P., 2014. Frequency of antibodies against Besnoitia besnoiti in Brazilian cattle. Veterinary Parasitology, 199: 242-246.

312

Vidal, E., Tolosa, E., Espinar, S., Pérez de val, B., Nofrarias, M., Alba, A., Allepuz, A., Grau-Roma, Ll., López-Soria, S., Martínez, J., Abarca, L., Castellà, J., Manteca, X., Casanova, M., Isidoro-Ayza, M., Galindo-Cardiel, I., Soto, S., Dolz, R., Majó, N., Ramis, T., Segalés, J., Chacon, C., Mas, Ll., Picart, Ll., Marco, A., Domingo, M., 2014. El servicio de apoyo a mataderos (SESC): Revisión de los seis primeros años de funcionamiento (2008-2013). Comunicació oral. XIX Simposio anual de AVEDILA. Zaragoza.

Visser, M., Lowenstein, M., Yoon, S., Rehbein, S., 2013. The treatment of bovine sarcoptic mange (Sarcoptes scabiei var. bovis) using eprinomectin extended-release injection. Veterinary Parasitology, 192: 359-364.

Waap, H., Cardoso, R., Marcelino, E., Malta, J., Cortes, H., Leitão, A., 2011. A modified agglutination test for the diagnosis of Besnoitia besnoiti infection. Veterinary Parasitology, 178: 217-222.

313

314