ALINE DINIZ CABRAL Sorodiagnóstico, isolamento e genotipagem de Toxoplasma gondii e investigação molecular de outros protozoários pertencentes à família Sarcocystidae em morcegos do estado de São Paulo São Paulo 2013 ALINE DINIZ CABRAL Sorodiagnóstico, isolamento e genotipagem de Toxoplasma gondii e investigação molecular de outros protozoários pertencentes à família Sarcocystidae em morcegos do estado de São Paulo Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Epidemiologia Experimental Aplicada às Zoonoses da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências Departamento: Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal Área de concentração: Epidemiologia Experimental Aplicada às Zoonoses Orientadora: Dra. Hilda Fátima de Jesus Pena São Paulo 2013 FOLHA DE AVALIAÇÃO Nome: CABRAL, Aline Diniz Título: Sorodiagnóstico, isolamento e genotipagem de Toxoplasma gondii e investigação molecular de outros protozoários pertencentes à família Sarcocystidae em morcegos do estado de São Paulo. Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduaçao em Epidemiologia Experimental Aplicada às Zoonoses da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências Data: _____/_____/_____ Banca examinadora Prof. Dr. ___________________________________________________________________ Instituição: _________________________ Julgamento: _______________________ Prof. Dr. ___________________________________________________________________ Instituição: _________________________ Julgamento: _______________________ Prof. Dr. ___________________________________________________________________ Instituição: _________________________ Julgamento: _______________________ Prof. Dr. ___________________________________________________________________ Instituição: _________________________ Julgamento: _______________________ Prof. Dr. ___________________________________________________________________ Instituição: _________________________ Julgamento: _______________________ Dedicatória A Deus, Por sempre ser meu amigo fiel, por ter dado a mim sabedoria, entendimento e oportunidade para o desenvolvimento deste trabalho. Ao Ronaldo, Meu esposo, amigo, amor, admiração e gratidão por toda compreensão, carinho, presença e incansável apoio ao longo deste trabalho. À Dagmar, Pelo exemplo, dedicação, educação, sustento, oração, refúgio, conselho, resumindo: Mãe. Agradecimentos À minha orientadora Dra. Hilda Fátima de Jesus Pena pela confiança, oportunidade, paciência, experiência, por todos os sábios ensinamentos, orientação, companheirismo, amizade e carinho com que fui recebida. À Profa. Dra. Solange Maria Gennari pela oportunidade e confiança dada a mim para a realização do doutorado. Ao Prof. Dr. Rodrigo Martins Soares pela dedicação, ensinamentos e parceria na realização deste trabalho. Ao Prof. Dr. Chunlei Su e toda sua equipe da Universidade do Tennessee pela parceria, oportunidade de treinamento e realização de parte deste trabalho em seu laboratório e pela hospitalidade durante minha permanência em Knoxville. A todos os professores do programa de pós-graduação em Epidemiologia Aplicada às Zoonose, em especial aos professores Dr. Marcelo B. Labruna, Dr. Leonardo J. Richtzenhain, Dr. Paulo E. Brandão, Dr. Fábio Gregori, Dr. Silvio A. Vasconcellos, Dr. José A. Jerez, Dr. Fumio H. Ito e Dr. Ricardo A. Dias pelos valiosos ensinamentos e companheirismo no dia a dia. Aos técnicos Pedro, Washington e Renato pela ajuda com os camundongos, materiais utilizados, companheirismo e dedicação. Aos amigos e colegas Sérgio N. Vitaliano, Andrea P. da Costa, Solange Oliveira, Ana B. Cassinelli e Herbert S. Soares, sou imensamente grata pela ajuda de todos vocês para a realização e conclusão deste trabalho. Aos secretários Danival, Cristina e Virgínia pela disposição em nos atender e ajudar sempre. Aos funcionários da Biblioteca da FMVZ/USP pela atenção e ajuda com as normas bibliográficas. À toda equipe do CCZ-SP pela colaboração, por ceder o laboratório e todo o material utilizado, em especial à Sandra, Maria Cecília, Ana Paula, Adriana, Lúcia Yai, Marli, Ângela, Mauro, Maria Adelaide e Luciana pelos ensinamentos, incentivo, companheirismo, colaboração e parceria neste trabalho. A todas as amigas que acompanharam de perto, morando juntas, dando sempre o apoio necessário nas alegrias e tristezas: Sandra, Beth, Camila, Amália e Vanessa. Pelo caloroso abrigo durante quase dois anos que Mara Lúcia me concedeu, a você o meu muito obrigada pois sempre foi uma mãezona cuidando e se importando com todas nós. Aos amigos e colegas do VPS e do Laboratório de Doenças Parasitárias Andrea, Chico, Gislene, Gustavo, Juliana, Jú, Tiago, Jonas, Fernanda, Arlei, João, Aline, Aliny, Michele, Amália, Felipe, Herbert, Danilo, Sérgio, Estela, Samanta, Gisele, Cíntia, Camila, Elisabeth, Nara e Daniela por sempre torcerem por mim. À toda minha família que sempre torceram e acompanharam minha jornada, em especial à minha avó Zilá que sempre deu o sustento em oração, aos tios, primos, irmãos (David e Zilá), cunhada, sogra, sobrinhas (Ana Laura e Ana Luisa), esposo Ronaldo e meus pais (David e Dagmar). A família sempre foi muito importante em minha formação e sempre será minha base e estrutura - instituição Divina. Aos meus queridos avôs (José e Anadir) "in memorian" que não puderam acompanhar o desfecho do meu doutorado pois partiram para um lugar bem melhor, mas sempre se orgulharam e torceram por meu sucesso. À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela concessão da bolsa de doutorado (Processo nº 2009/51889-2). Ao CNPq pelo financiamento deste projeto (Processo nº 470180/2010-2). "Nem olhos viram, nem ouvidos ouviram, nem jamais penetrou em coração humano o que Deus tem preparado para aqueles que o amam" (I Cor 2.9) "Não vos enganeis: de Deus não se zomba; pois aquilo que o homem semear, isso também ceifará" (Gl 6.7) RESUMO CABRAL, A. D. Sorodiagnóstico, isolamento e genotipagem de Toxoplasma gondii e investigação molecular de outros protozoários pertencentes à família Sarcocystidae em morcegos do estado de São Paulo. [Serodiagnosis, isolation and genotyping of Toxoplasma gondii and molecular investigation of other protozoa belonging to the Sarcocystidae family in bats from São Paulo state]. 2013. 181 f. Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2013. Os trabalhos existentes sobre protozoários pertencentes à família Sarcocystidae em morcegos são escassos e desatualizados. No Brasil, a ocorrência de Toxoplasma gondii é bem documentada nas espécies domésticas e no Homem, existindo relatos em diversos hospedeiros selvagens. Mundialmente, existe um grande interesse no conhecimento da variedade genética de T. gondii realizada por meio da Reação em Cadeia pela Polimerase – Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos de DNA gerados por Enzimas de Restrição (PCR-RFLP). No presente trabalho, objetivou-se pesquisar a frequência de ocorrência de anticorpos anti-T. gondii , isolar e caracterizar molecularmente T. gondii e investigar a presença de coccídios da família Sarcocystidae em morcegos de vida livre no estado de São Paulo. Um total de 1921 morcegos, provenientes de 15 municípios do estado de São Paulo, foi examinado durante o período de março de 2010 a março de 2011. Obteve-se 14,89% (28/188) de positividade para T. gondii na Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI ≥ 16) e 18,61% (35/188) no Teste de Aglutinação Modificado (MAT ≥ 25), com baixa concordância entre as técnicas utilizando o índice Kappa (K=0,046). De um total de 282 bioensaios em camundongos, foram obtidos dois isolados, sendo TgBatBr1 proveniente de Molossus molossus , insetívoro, macho e adulto, e TgBatBr2 proveniente de Desmodus rotundus , hematófago, macho e adulto, ambos causando 100% de mortalidade em camundongos. A genotipagem dos isolados e das amostras primárias de morcegos positivas para T. gondii foi feita por meio da PCR-RFLP com os marcadores SAG1, 5´3´SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, alt. SAG2, c22-8, c29-2, PK1, Apico, L358 e CS3, revelando os genótipos ToxoDB-RFLP #162 e #19, respectivamente, para os isolados TgBatBr1 e TgBatBr2. Para a investigação molecular dos sarcocistídeos foram utilizados primers que amplificam a região 18S do DNA ribossomal e as amostras positivas foram sequenciadas. A análise de sequências pôde ser realizada em 48 das amostras positivas para Sarcocystidae, encontrando-se 100% de identidade com T. gondii em quatro morcegos e também 100% de identidade com Neospora caninum , Hammondia hammondi , Cystoisospora ohioensis e Frenkelia glareoli em um morcego, respectivamente. Outras 39 amostras apresentaram identidade de 94-98% com outros sarcocistídeos e, provavelmente, devem ser novas espécies. Foi possível a genotipagem de amostras primárias positivas para T. gondii de um morcego insetívoro ( Eumops glaucinus ), correspondendo ao genótipo #69 e de outro morcego insetívoro ( E. glaucinus ), apresentando o genótipo #6, que corresponde ao Tipo BrI. Há uma necessidade de se investigar a importância dos morcegos como reservatórios de doenças infecciosas, podendo-se sugerir a inclusão do diagnóstico de T. gondii como diferencial para raiva. Ressalta-se também a importância do compartilhamento dos genótipos de T. gondii dos morcegos com hospedeiros terrestres e dos estudos sobre sarcocistídeos em morcegos, a fim de compreender melhor as relações parasita-hospedeiro. Palavras-chave: Epidemiologia,