CAMBIOS CELULARES EN EL SISTEMA NERVIOSO DEL ACOCIL Procambarus Clarkii EXPUESTO a DIFERENTES FOTOPERIODOS

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE CIENCIAS

CAMBIOS CELULARES EN EL SISTEMA NERVIOSO DEL ACOCIL Procambarus clarkii EXPUESTO A DIFERENTES FOTOPERIODOS

T E S I S

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: BIÓLOGA P R E S E N T A :

ALEJANDRA CORREA PÉREZ

DIRECTORA DE TESIS: DRA. ELSA GUADALUPE ESCAMILLA CHIMAL

2014

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Hoja de datos del jurado

1. Datos del alumno Correa Pérez Alejandra 15173397 Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Ciencias Biología 301006798

2. Datos del tutor Dra Elsa Guadalupe Escamilla Chimal

3. Datos del sinodal 1 Dra Ana Erika Rodríguez Martínez

4. Datos del sinodal 2 Dr René de Jesús Cárdenas Vázquez

5. Datos del sinodal 3 M en C Enrique Moreno Sáenz

6. Datos del sinodal 4 M en C Citlalli Fuentes Granados

7. Datos del trabajo escrito Cambios celulares en el sistema nervioso del acocil Procambarus clarkii expuesto a diferentes fotoperiodos 49 p. 2014

Agradecimientos

A mis padres, Ana Antonia y Roberto, por su paciencia y apoyo incondicional, casi todo se lo debo a ustedes.

A Héctor Ceceña por su amistad, comprensión, consejos, confianza, amor, apoyo y porque siempre ha estado a mi lado cuándo más lo he necesitado.

A mis hermanos, Marisela, Citlalli y Héctor, cuyo apoyo y ejemplo han sido fundamentales para mí.

A la Dra. Érika Rodríguez, el Dr. René Cárdenas, el Mtro. Enrique Moreno y la Mtra. Citlalli Fuentes por su amable revisión y valiosos comentarios.

A las autoridades de la Facultad de Ciencias; al H. Consejo Técnico; a la Directora, Dra. Rosaura Ruiz Gutiérrez; al Actuario Mauricio Aguilar González y, especialmente, a la Secretaria General, Dra. Catalina Elizabeth Stern Forgach, por las atenciones y el apoyo brindado.

A la Dra. María Luisa Fanjul, por haberme abierto las puertas del Laboratorio de Neurofisiología Comparada.

A la Dra. Rosalía Ridaura Sanz, a la Dra. Vivianne Marquina Fábrega, a la Dra. Diana E. Aguilar León y al Dr. Erasmo Martínez Cordero, por su ayuda e invaluables consejos.

A la Dra. Diana E. Aguilar León por su asesoría en la técnica de ELISA.

A mis “alumnos” Silvia Hansen Bernal, Suelem Moreno Pérez, Erick Oyarzabal Armendariz, Nancy Estefany Burgos Veneroso y Mariana Vazquez Sumano, por todo lo que de ellos aprendí.

Al Mtro. Marco Martínez, a la Biol. Rosa María Velázquez y al Mtro. Julio Prieto por su ayuda técnica.

A Patricia Arizmendi, encargada de los acociles y el material de laboratorio.

Al C.PR. Vicente García Cors por la beca otorgada.

A la Universidad Nacional Autónoma de México.

Este trabajo se realizó bajo la dirección de la Dra. Eisa Guadalupe Escamilla Chimal en el Laboratorio de Neurofisiología Comparada, a cargo de la Dra. María Luisa Fanjul Peña de Moles, en la Facultad de Ciencias, UNAM. Fue financiado por los proyectos CONACYT 118032 y PAPIIT IN222211.

1. RESUMEN ………………………………………………………………………………………………………………… 1

2. INTRODUCCIÓN ………………………………………………………………………………………………………… 3

2.1. Generalidades del modelo de estudio ……………………………………………………………………………... 3

2.1.1. Taxonomía y ecología ……………………………………………………………………………………….. 3

2.1.2. Anatomía …………………………………………………………………………………………………….. 4

2.1.3. Sistema nervioso …………………………………………………………………………………………….. 4

2.1.4. Ganglio cerebroide …………………………………………………………………………………………… 6

2.1.5. Tallos oculares ………………………………………………………………………………………………. 8

2.1.6. Glía …………………………………………………………………………………………………………… 10

2.2. Ritmos biológicos …………………………………………………………………………………………………… 11

2.3. Estrés oxidante ……………………………………………………………………………………………………… 12

2.4. Apoptosis ……………………………………………………………………………………………………………. 12

3. PLANTEAMIENTO Y JUSTIFICACIÓN DEL PROBLEMA ………………………………………………………… 15

4. HIPÓTESIS ………………………………………………………………………………………………………………… 17

5. OBJETIVOS ……………………………………………………………………………………………………………….. 18

5.1. General ……………………………………………………………………………………………………………… 18

5.2. Particulares …………………………………………………………………………………………………………. 18

6. MATERIAL Y MÉTODOS ……………………………………………………………………………………………….. 19

6.1. Animales y diseño experimental …………………………………………………………………………………… 19

6.2. Histología ……………………………………………………………………………………………………………. 20

6.3. Inmunofluorescencia ……………………………………………………………………………………………….. 20

6.4. Microscopía y digitalización de imágenes ………………………………………………………………………… 21

6.5. Procesamiento de muestras y estandarización de la técnica de ELISA ………………………………………… 21

6.6. Cuantificación de Caspasa-3 ………………………………………………………………………………………. 22

6.7. Cuantificación de GFAP …………………………………………………………………………………………… 23

6.8. Análisis estadístico ………………………………………………………………………………………………….. 23

7. RESULTADOS ……………………………………………………………………………………………………………. 24

7.1. Inmunofluorescencia ……………………………………………………………………………………………….. 24

7.2. ELISA ……………………………………………………………………………………………………………….. 30

8. DISCUSIÓN ………………………………………………………………………………………………………………... 34

9. CONCLUSIONES …………………………………………………………………………………………………………. 39

10. LITERATURA CITADA …………………………………………………………………………………………………. 40

1. RESUMEN

El acocil Procambarus clarkii es un crustáceo decápodo dulceacuícola proveniente de Norteamérica. Es considerado una especie invasora debido a la gran resistencia a cambios en diferentes parámetros ambientales y a la gran variedad de elementos que puede utilizar para su alimentación. Han sido reportados diferentes aspectos de los ritmos biológicos en esta especie, así como las respuestas oxidativas a los mismos. El objetivo de este trabajo consistió en determinar si diferentes fotoperiodos con fotofase larga provocan alteraciones en el tallo ocular y en el ganglio cerebroide de P. clarkii, ya que dichas estructuras son reconocidas hasta hoy como marcapasos circadianos putativos de la especie.

Se expuso a los animales a cuatro fotoperiodos diferentes: Luz-oscuridad (LO) 12:12, LO 16:08, LO 20:04 y oscuridad constante (OO). Posteriormente, se extrajeron los tallos oculares y el ganglio cerebroide para ser tratados con dos diferentes técnicas de inmunodetección, inmunofluorescencia con el fin de detectar la Proteína Ácidica Fibrilar Glial (GFAP, por sus siglas en inglés), Caspasa-3 y 4-hidroxinonenal (HNE), los cuales son marcadores de glía, muerte celular apoptótica y lipoperoxidación, respectivamente y Ensayo por Inmunoabsorción Ligado a Enzimas (ELISA, por sus siglas en inglés) para cuantificar GFAP y Caspasa-3.

Se observó la inmunopositividad y localización de GFAP, Caspasa-3 y HNE en el tallo ocular y el grupo celular 10 del ganglio cerebroide de P. clarkii. Asimismo, se cuantificó la concentración de GFAP y Caspasa-3. Los resultados mostraron posibles cambios diarios de GFAP y Caspasa-3, así como alteraciones producidas por los fotoperiodos con fotofase larga. Lo anterior se puso de manifiesto por el aumento de las concentraciones de GFAP y Caspasa-3 en los grupos experimentales, principalmente durante la fotofase. Dichos cambios resultaron ser independientes entre sí. También hubo presencia de lipoperoxidación en las células tapetales y los axones de las células retinulares, aunque no fue el estímulo que produjo la muerte celular. El ganglio cerebroide expuesto a los fotoperiodos experimentales LO 16:08 y

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LO 20:04 mostró la mayor cantidad de afectaciones, en comparación con el grupo control, cuando fue muestreado a las 15 h.

En general, los fotoperiodos con fotofase larga produjeron aumentos en las cantidades de células apoptóticas y de GFAP, independientes de lipoperoxidación, durante la fotofase.

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2. INTRODUCCIÓN

2.1 Generalidades del modelo de estudio.

2.1.1 Taxonomía y ecología.

Los acociles son los organismos más grandes y longevos entre los crustáceos dulceacuícolas de Norteamérica y constituyen una fuente de alimento para muchos peces (Momot et al., 1978). Muchos de los acociles de latitudes bajas tienen una longevidad corta, como las especies del género Procambarus que viven dos años o menos; mientras que otras especies de cambáridos que habitan en latitudes altas y ambientes fríos usualmente viven de 4 a 16 años, siendo la madurez también más tardía (Momot, 1984).

Procambarus clarkii (Decapoda, Astacidae) es el acocil de agua dulce más ampliamente distribuido en el mundo. Es una especie nativa de Louisiana, USA, que se utiliza en muchos países como recurso alimenticio (Perry y LaCaze, 1969) y se encuentra en todos los continentes, excepto en Oceanía (Laurent, 1986).

P. clarkii es abundante en aguas someras durante los periodos húmedos que inician en otoño y terminan en primavera, y el resto del tiempo se refugia en madrigueras que cava en zonas pantanosas o lodosas. Aunque puede establecerse en un amplio rango de condiciones ambientales, se desarrolla mejor en aguas con temperatura de 20-25 °C, 3 ppm de oxígeno disuelto, pH de 6.5 a 8.5 y 1 ppm de amoniaco total (Pillay y Kutty, 2005).

P. clarkii puede habitar en una amplia variedad de hábitats dulceacuícolas, incluyendo ríos, lagos, estanques, arroyos, canales, pantanos y ciénagas. Se adapta con facilidad a una amplia diversidad de condiciones acuáticas incluyendo salinidad moderada, bajos niveles de oxígeno, temperaturas extremas y contaminación (Cruz y Rebelo, 2007). P. clarkii se desarrolla bien en humedales poco profundos y cálidos, tanto en zonas naturales como en aquellas dedicadas a la agricultura, como en el sur y centro de Europa. Esta especie

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también se desarrolla en regiones frías, en las cuales prefiere estanques permanentes (Henttonen y Huner, 1999). Esta especie, al igual que muchos otros crustáceos, es utilizada frecuentemente como bioindicador en diversos sistemas acuáticos (Brouwer et al., 1997). Lo anterior, el amplio conocimiento de esta especie en términos anatómicos y cronobiológicos, su tamaño y la facilidad de su manejo en condiciones de laboratorio hacen de P. clarkii un buen modelo para el estudio de neurofisiología y ritmos biológicos.

2.1.2. Anatomía.

Como todos los crustáceos, P. clarkii (Fig. 1) tiene un exoesqueleto que cubre su cuerpo, el cual se divide en dos partes principales: el cefalotórax y el abdomen. El cefalotórax consiste de la región cefálica (o cabeza) y la región torácica, cubiertas por un exoesqueleto que recibe el nombre de caparazón. El abdomen se localiza detrás del cefalotórax y contiene seis segmentos, cada uno con un par de apéndices. La región cefálica tiene cinco pares de apéndices: las anténulas (responsables del equilibrio y los sentidos del tacto y gusto), las antenas largas (órganos involucrados en los sentidos del tacto, gusto y olfato), las mandíbulas (que trituran el alimento moviéndolo de un lado al otro de la boca) y dos pares de maxilas (el primer par sostiene el alimento sólido, lo desgarra y lo introduce a la boca; el segundo par ayuda a extraer el agua de las branquias) (Holdich, 2002). Las quelas son elongadas y el rostro tiene forma triangular. La cabeza es elongada y se estrecha en la parte frontal (Boets et al., 2009). Típicamente de color rojo oscuro, P. clarkii puede alcanzar hasta los 50 g de peso en 3-5 meses. Los adultos alcanzan una longitud de 5.5 a 12 cm (Henttonen y Huner, 1999).

2.1.2.1 Sistema nervioso.

El sistema nervioso central del acocil está compuesto por el cerebro, también llamado ganglio cerebroide, y el cordón nervioso ventral longitudinal, que se localiza debajo del tracto digestivo (Keim, 1915; Holdich y Reeve, 1988). Como en otros animales, el sistema

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nervioso del acocil está compuesto de tres principales tipos de neuronas: sensoriales, motoras e interneuronas, las cuales están asociadas al tejido glial. El soma de las neuronas se localiza en los órganos de los sentidos o en los ganglios. Estos últimos consisten de un neurópilo central, que incluye axones, dendritas y sinapsis, así como grupos periféricos de somas neuronales. Los ganglios están unidos entre sí por nervios conectivos longitudinales y comisuras transversales (Holdich, 2002).

Fig. 1. Anatomía externa de P. clarkii (ver texto). Tomado de BIODIDAC, http://biodidac.bio.uotawa.ca/.

Algunas partes del sistema nervioso del acocil han sido utilizadas como modelos en neurobiología (Holdich, 2002).

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2.1.2.2 Ganglio cerebroide.

El ganglio cerebroide está situado en la parte anterior del cefalotórax, conectado al ganglio subesofágico por dos nervios conectivos circumesoesofágicos. El ganglio subesofágico da origen al cordón nervioso ventral, que consiste de cinco ganglios torácicos y seis ganglios abdominales unidos entre sí por conectivos. Los ganglios derecho e izquierdo de cada segmento están fusionados formando una sola unidad. Los conectivos de ambos lados del cuerpo se hallan estrechamente unidos y sólo se encuentran separados entre los ganglios 3 y 5 (Holdich, 2002).

Del cerebro se originan cinco nervios pareados y dos nervios no pareados. Los nervios pareados incluyen el nervio óptico, el nervio oculomotor, el nervio antenular, el nervio antenal y el nervio tegumentario. Los nervios no pareados unen el cerebro con la red nerviosa del esófago. En el ganglio subesofágico se originan 11 nervios de cada lado. Siete nervios se dirigen a la glándula antenal, a la mandíbula, a la maxilula, al maxilar y a los maxilípedos 1-3; cuatro nervios se dirigen a los músculos dorsoventrales y longitudinales del tórax (Holdich, 2002).

El ganglio cerebroide del acocil comprende al menos 8,000 neuronas (Elofsson y Dahl, 1970) organizadas en neurópilos, grupos o cúmulos celulares periféricos y tractos neuronales. Los lóbulos accesorios son las estructuras más grandes del cerebro del acocil, en contraste con lo que se observa en otros decápodos. Los grupos celulares del cerebro están formados por el soma de interneuronas y motoneuronas antenulares, antenales y oculomotoras (Sandeman, 1982; Sandeman et al., 1992).

El ganglio cerebroide puede subdividirse en tres partes principales, protocerebro, deuterocerebro y tritocerebro (Fig. 2). El protocerebro está formado por dos partes, el protocerebro medial y el protocerebro lateral. El protocerebro lateral está formado por la médula terminalis y el cuerpo hemielipsoidal. El protocerebro medial está constituido por los neurópilos protocerebrales mediales anterior y posterior, el puente protocerebral y el cuerpo central (Sandeman et al., 1992). El protocerebro es responsable, principalmente, del

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procesamiento de la información visual y se cree que controla el sistema endócrino a través de neuronas que forman el complejo glándula sinusal-órgano X. El deuterocerebro incluye los lóbulos olfatorios, los lóbulos accesorios y los neurópilos antenulares, así como los grupos celulares asociados. Este segmento del cerebro es responsable del procesamiento y la integración de los estímulos olfatorios. El tritocerebro comprende los neurópilos antenulares y la comisura postesofágica (Holdich, 2002).

Fig. 2. Ganglio cerebroide del acocil (modificado de Sandeman et al., 1992). Nervios: NO, nervio oculomotor; NAI, nervio antenular I; NAII, nervio antenular II; NT, nervio tegumentario. NPMA, neurópilo protocerebral medio-anterior; PP, puente protoocerebral; CC, cuerpo central; LO, lóbulo olfatorio; NAL, neurópilo antenular lateral I; NAM, neurópilo antebular medial I; LA, Lóbulo accesorio; NCD, neurópilo de la comisura deutocerebral; NTGO, neurópilo del tracto globular olfatorio; NAn, neurópilo antenular II; Nt, neurópilo tegumentario. Tractos y comisuras: Tp, tracto protocerebral; TGO, tracto globular olfatorio; CE, conectivos esofágicos; los números representan los diferentes grupos celulares.

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2.1.2.3. Tallos oculares.

Los acociles tienen dos ojos compuestos bien desarrollados, uno en cada tallo ocular (Fig. 3), los cuales adquieren movimiento gracias a los músculos oculomotores. Los ojos compuestos consisten de múltiples subunidades llamadas omatidias, cada una con sus propios elementos ópticos. En P. clarkii, la retina no se encuentra completamente desarrollada en el momento de la eclosión pero se presenta una secuencia de diferenciación omatidial (Holdich, 2002).

Cada omatidia está compuesta de cuatro elementos principales: el aparato dióptrico, una retina fotosensible, pigmentos y células tapetales. El aparato dióptrico incluye una córnea externa, que es una forma transparente de la cutícula, debajo de la cual se encuentra el cristalino, que guía la luz a la retina. Cada unidad del cristalino está formada por cuatro células cuya parte central es transparente, las cuales están rodeadas por células que contienen los pigmentos distales (Holdich, 2002).

La retina consiste de siete células retinulares que contienen capas de microvellosidades formando el rabdómero, estructura que absorbe luz, los cuales a su vez forman el rabdomo. Los pigmentos fotosensibles se localizan en las membranas de las miles de microvellosidades (Hevers y Stieve, 1995). Las células retinulares contienen los pigmentos proximales. Los axones de las células retinulares pasan como un haz a través de huecos en la membrana basal y se proyectan hacia la lámina ganglionar. Las células tapetales se localizan basalmente entre los rabdómeros (Holdich, 2002).

La lámina ganglionar en el género Procambarus está compuesta por tres capas: la capa fenestrada, la capa nuclear y la capa plexiforme. La capa fenestrada es la más distal y se encuentra formada por procesos celulares y somas, se localiza justo por debajo de la membrana basal. La capa celular, como su nombre indica, se encuentra formada por somas neuronales y núcleos celulares. La capa plexiforme es la capa más proximal y está formada por fibras que conducen al quiasma externo de la lámina ganglionar. Los elementos retinulares terminan en diferentes niveles de la región sináptica formando estructuras

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largas e irregulares. Las células monopolares tienen una sola fibra axial con numerosos procesos laterales que se extienden a través de las regiones sinápticas. Mientras que los elementos horizontales se distribuyen lateralmente en la región sináptica más ampliamente que los procesos monopolares. La microscopía electrónica muestra que la zona terminal y los procesos monopolares están organizados formando unidades (cartuchos) en el nivel superficial de la región sináptica. Cada cartucho consiste de cuatro terminales alargadas, de tres axones retinulares y de cuatro a seis procesos monopolares. El arreglo en cartuchos no es evidente en niveles más internos (Elofsson y Dahl, 1970).

Fig. 3. A. Tallo ocular del acocil. R, retina; LG, lámina ganglionar; ME, membrana externa; MI, membrana interna; MT, médula terminal; CH, cuerpo hemihelipsoidal; TP, tracto protocerebral (Modificado de Fanjul-Moles et al., 2004). B. Diagrama de omatidias adaptadas a diferentes condiciones de iluminación con sus respectivas estructuras. (Modificado de Holdich, 2002).

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2.1.2.4. Glía

En invertebrados, las células gliales tienen una vasta variedad estructural y funcional. Estos tipos celulares varían de acuerdo a las estructuras en las cuales se presentan, a los diferentes estadios de vida del individuo, y entre diferentes grupos taxonómicos. Entre las funciones de la glía se incluyen soporte mecánico y protección de las neuronas, formación de barreras permeables, asociación con axones para acelerar la conducción de impulsos nerviosos, remoción de neuronas, absorción y liberación de neurotransmisores, provisión e intercambio de nutrientes y metabolitos con las neuronas, así como guía para neuronas que migran (Pentreath, 1989).

Los nervios conectivos centrales neurales y periféricos del acocil P. clarkii están rodeados por una lamela neural acelular, debajo de la cual hay una capa de glía especializada llamada perineuro. La glía puede presentarse asociada a los axones (células de Schwann) o permanecer relativamente libre en el espacio extracelular (Lane y Abbott, 1975).

La proteína ácida fibrilar glial (GFAP, por sus siglas en inglés) forma filamentos intermedios en células gliales maduras. En la década de 1990, esta proteína comenzó a utilizarse como un marcador estándar para la detección de tejido nervioso. Al ser una proteína del citoesqueleto, se considera al GFAP de gran importancia para modular el movimiento y la forma de las células gliales. Después de algún daño, sea éste resultado de trauma, enfermedad, desórdenes genéticos o daño químico, la glía sufre de astrogliosis. Este proceso se caracteriza por una rápida síntesis de GFAP y se detecta por medio de la inmunodetección con anticuerpos anti-GFAP. Debido a la función estructural de la GFAP, es común el uso de estos anticuerpos en estudios de desarrollo, daño y enfermedad en el sistema nervioso central.

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2.2 Ritmos biológicos.

Todos los organismos vivos experimentan el movimiento de la Tierra alrededor del Sol y los consecuentes ciclos día-noche y luz-oscuridad, además de las variaciones periódicas en la duración de la luz diurna y el lapso de la oscuridad que ocurren con los cambios estacionales. Debido a la ritmicidad del ciclo día-noche, la mayoría de las especies muestran cambios en su comportamiento y/o su fisiología que generalmente se originan en el organismo a través de un sistema conocido como reloj biológico. Este sistema permite a los individuos anticipar, y prepararse para los cambios en el ambiente físico, permitiendo que el organismo presente una o varias respuestas adecuadas en cada momento del día. El reloj circadiano es esencial para el mantenimiento de la homeostasis, así como para la sincronización de las respuestas del organismo con las señales ambientales externas (Vitaterna et al., 2001).

Los procesos fisiológicos de los organismos están regulados por un ritmo circadiano. La palabra circadiano se deriva del latín “circadiem” que significa “cercano a un día” (aproximadamente 24 horas). El ritmo circadiano es regulado por la longitud de onda, la intensidad, periodo y duración del estímulo luminoso (Cardinali et al., 1972; Brainard et al., 1983, 1986; Takahashi et al., 1984).

Los ritmos circadianos son controlados endógenamente por los marcapasos del mismo nombre. La magnitud del periodo es controlada por un oscilador circadiano (reloj) (Ikonomov et al., 1998).

Los ritmos fotoperiódicos requieren de receptores fotosensibles para detectar los ciclos ambientales de luz/oscuridad (LO). En el acocil se han identificado dos sistemas fotorreceptores además de los ojos compuestos: los fotorreceptores caudales en el sexto ganglio abdominal (Prosser, 1934; Wilkens y Larimer, 1972) y los del ganglio cerebroide (Bobkova et al., 2003; Sandeman et al., 1992).

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2.3 Estrés oxidante.

El estrés oxidante y los peróxidos lipídicos son producidos continuamente por una reacción en cadena de radicales libres. Los radicales libres producidos por oxígeno molecular se denominan especies reactivas del oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés) y ejercen sus efectos fisiológicos y patológicos por diversos mecanismos, como la activación de fagocitos y del sistema inmune en general, lipoperoxidación y transporte de electrones en las mitocondrias (Halliwell y Gutteridge, 2000). El estrés oxidativo ocurre cuando hay un desequilibrio entre las ROS generadas y su eliminación por el sistema de defensa antioxidante endógeno (Brown y Naidoo 2010).

El estrés oxidante es uno de los factores que contribuyen al incremento de la velocidad del ciclo celular y la consecuente muerte celular prematura, ocasionando desórdenes degenerativos así como problemas psiquiátricos (Bilici et al., 2001; Kuloglu et al., 2002; Tsaluchidu et al., 2008).

Entre los aldehídos que se originan por la peroxidación de los lípidos de la membrana celular, se cree que el 4-hidroxi-2-nonenal (HNE) es el responsable de los efectos citopatológicos que se presentan durante el estrés oxidante (Uchida et al., 1995). Los radicales libres y los aldehídos generados durante la lipoperoxidación tienen la capacidad de dañar membranas celulares, proteínas y ADN.

2.4 Apoptosis.

La muerte celular es el punto en el cual una célula se vuelve incapaz de recuperar su morfología y función, aun cuando los procesos que lleven a su eliminación sean evitados farmacológicamente. El proceso de muerte celular termina con la eliminación de la célula, que puede ocurrir mediante desintegración celular o por fagocitosis (Lipton, 1999). Existen dos tipos de muerte celular: apoptosis y necrosis. Estos procesos pueden ocurrir de manera independiente, secuencial o simultáneamente (Hirsch et al, 1997; Zeiss, 2003). En algunos

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casos, el tipo de estímulo y/o el grado de éste determinan si una célula muere por apoptosis o por necrosis. En bajas dosis, una gran variedad de estímulos como calor, hipoxia, radiación y drogas citotóxicas anticancerígenas pueden inducir apoptosis, mientras que los mismos estímulos en grandes dosis pueden ocasionar necrosis (Elmore, 2007).

La apoptosis es un proceso coordinado y dependiente de energía que involucra la activación de un grupo de cisteín proteasas llamadas “caspasas” y una compleja cascada de eventos que ocurren desde el inicio del estímulo hasta la eliminación total de la célula (Elmore, 2007). El término apoptosis fue usado por primera vez por Kerr, Wyllie y Currie en 1972 para describir una forma de muerte celular morfológicamente distintiva, aunque ciertos componentes del concepto de apoptosis fueron descritos explícitamente muchos años antes (Kerr et al., 1972; Paweletz, 2001; Kerr, 2002). El conocimiento del mecanismo involucrado en el proceso de apoptosis se ha adquirido de la investigación de la muerte celular programada que ocurre durante el desarrollo del nemátodo Caenorhabditis elegans (Horvitz, 1999). En este organismo, 1090 células son generadas durante la formación del gusano adulto, 131 de ellas sufren apoptosis o “muerte celular programada”. La apoptosis es reconocida y aceptada como un tipo distintivo e importante de “muerte celular programada”, la cual involucra la eliminación genéticamente determinada de células (Elmore, 2007).

La apoptosis ocurre durante el desarrollo y el envejecimiento como un mecanismo homeostático para mantener las poblaciones celulares en los tejidos. También es un mecanismo de defensa, durante reacciones inmunes o cuando las células son dañadas por enfermedad o agentes nocivos (Norbury y Hickson, 2001). Los crustáceos no poseen las respuestas adaptativas inmunes que generan memoria, las cuales se caracterizan por la producción de inmunoglobulinas, como ocurre en vertebrados (Du Pasquier, 2001). Sus respuestas inmunes celulares incluyen encapsulación, fagocitosis (Roth y Kurtz, 2009), formación de nódulos y apoptosis (Everet y McFadden, 1999). Durante la respuesta inmune, la apoptosis es el mecanismo más importante para remover células indeseadas y potencialmente dañinas (Sun y Shi, 2001).

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Aunque hay una gran variedad de estímulos y condiciones, tanto fisiológicas cómo patológicas, que pueden ocasionar apoptosis, no todas las células morirán en respuesta al mismo estímulo (Elmore, 2007).

La apoptosis se caracteriza por diferentes cambios morfológicos: disminución del volumen celular y pérdida de las características de adhesión, degradación de proteínas y fragmentación del ADN, condensación de la cromatina, fragmentación del núcleo, formación de los cuerpos apoptóticos (rodeados de membrana) y fagocitosis de éstos por macrófagos (Strasser et al., 2000). Los genes que controlan este proceso incluyen a la familia Bcl-2 (Kroemer, 1997).

Se conocen diversos estímulos que ocasionan apoptosis, como la deleción de factores de crecimiento, daño del ADN, aplicación de agentes quimioterapeúticos, etc (Berke, 1995; Collins et al., 1994). Aunque estos estímulos inician una cascada de eventos que resultan en la muerte celular apoptótica, difieren en la duración del tiempo que transcurre entre la exposición al estímulo y los primeros signos morfológicos de la apoptosis. La duración de este proceso depende del tipo celular, el tipo de estímulo y la fase de desarrollo de la célula. Todos los mecanismos de inducción convergen en la activación de una cascada proteolítica llevada a cabo por la familia de las caspasas (Martin y Green, 1995; Nagata, 1997). Durante la apoptosis, las caspasas son requeridas tanto para la eliminación de la célula (caspasas efectoras) así como para iniciar esta eliminación en respuesta a señales proapoptóticas (caspasas iniciadoras). La activación de la cascada proteolítica determina el inicio de la “fase de ejecución” del proceso de apoptosis, la cual es relativamente corta y presenta poca variación en su duración (Earnshaw, 1995). En esta fase actúan las caspasas iniciadoras (caspasas -8, -9 y -10). Las caspasas -3 y -7 participan en la porción distal de la cascada de proteasas apoptóticas, funcionando como efectoras (Salvensen y Dixit, 1997; Nicholson y Thornberry, 1997).

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3. PLANTEAMIENTO Y JUSTIFICACIÓN DEL PROBLEMA.

El fotoperiodo es un importante parámetro ambiental que induce alteraciones ampliamente documentadas cuando presenta fotofases largas (Aschoff, 1981). En peces se ha demostrado que la exposición a fotoperiodos artificiales actúa como un estresor, ocasionando un incremento en la mortalidad y lesiones necróticas en la piel (Valenzuela et al., 2001), así como modificando los niveles de cortisol (Leonardi y Klempau, 2003). Kirn y Schwabl (1997) reportaron que la muerte neuronal en canarios adultos es regulada por cambios estacionales de fotoperiodo. Por otro lado, Albarrán y colaboradores (2001) reportaron ritmos circadianos de melatonina, superóxido dismutasa y del estatus oxidante en pollos. Estos ritmos presentan picos de actividad a la misma hora y desaparecen al exponer a los animales a luz constante.

Benot y colaboradores reportaron variaciones circadianas del estatus antioxidante total (EOT) en ratas (1998) y en seres humanos (1999), el cual disminuye cuando los individuos son expuestos a luz durante la noche (luz continua en el caso de ratas y fotoperiodos con fotofase larga en humanos).

El acocil P. clarkii es un organismo nocturno que presenta ritmos circadianos e infradianos para adaptarse a los cambios de luz presentes a través del día y de las estaciones. Los ritmos circadianos de actividad y consumo de oxígeno están bien documentados en esta especie (Fingerman, 1955; Page y Larimer, 1975) y es posible que produzcan variaciones diarias en el estatus oxidante en el medio interno del animal, con fluctuaciones en los mecanismos antioxidantes que controlan y previenen la formación excesiva de especies reactivas del oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés). Existen cambios circadianos en el sistema antioxidante de glutatión en la hemolinfa (Durán-Lizárraga et al, 2007) así como en la retina, el ganglio cerebroide y el lóbulo óptico de P. clarkii (Fanjul-Moles et al., 2003).

Por lo tanto, si diferentes fotoperiodos con fotofase larga ocasionan cambios en el estatus oxidante de los marcapasos putativos del acocil P. clarkii, se observarán alteraciones

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celulares como aumento de muerte celular y en la cantidad de GFAP. El objetivo de este trabajo fue determinar si en células de los marcapasos putativos de P. clarkii, el ganglio cerebroide y el tallo ocular, diferentes fotoperiodos causan dichas respuestas, a través de la detección y cuantificación de GFAP y de Caspasa-3.

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4. HIPÓTESIS

Si fotoperiodos con fotofase larga ocasionan perturbaciones como el desfasamiento en los picos de actividad de diferentes antioxidantes, entonces es posible que se genere un aumento en la lipoperoxidación, en la muerte celular apoptótica y en la cantidad de GFAP en el ganglio cerebroide y en los tallos oculares del acocil P. clarkii.

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5. OBJETIVOS

5.1 General.

Determinar si diferentes fotoperiodos ocasionan daño y muerte celular apoptótica en el tallo ocular y en el ganglio cerebroide del acocil P. clarkii.

5.2 Particulares.

1) Identificar las estructuras del tallo ocular y del ganglio cerebroide de P. clarkii que tienen positividad a HNE, Caspasa-3 y GFAP.

2) Cuantificar la Caspasa-3 y GFAP en el ganglio cerebroide y en el tallo ocular.

3) Analizar si hay diferencias entre los organismos estudiados en el fotoperiodo control (LO 12:12) y los mantenidos en los fotoperiodos experimentales LO 16:08, LO 20:04 y oscuridad constante (OO).

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6. MATERIAL Y MÉTODOS

6.1 Animales y diseño experimental.

Se utilizaron 48 acociles adultos de la especie P. clarkii; colectados en Delicias, Chihuahua los cuales fueron aclimatados a las condiciones de laboratorio durante 15 días, en fotoperiodo LO 12:12 (encendido de la luz a las 7:00 h). Posteriormente, se distribuyeron en cuatro grupos con 12 animales cada uno. Estos grupos fueron sometidos, durante 15 días, a las siguientes condiciones de fotoperiodo, control o experimentales: (1) LO 12:12, (2) LO 16:08, (3) LO 20:04, (4) OO.

Seis animales de cada grupo fueron anestesiados en frío y se obtuvieron sus tallos oculares y ganglios cerebroides a las 03:00 y 15:00 h (Fig. 4), en presencia de la solución fisiológica de Van Harreveld (1936). La mitad de los tejidos fueron usados para las técnicas de inmunofluorescencia y la mitad restante para la técnica de ELISA.

Fig. 4. Diseño experimental. Las barras representan la duración del día mostrando la fotofase (blanco) y la escotofase (negro) en cada uno de las cuatro diferentes condiciones de fotoperiodo (LO 12:12, LO 16:08, LO 20:04 y DD). Se muestran las horas del día de inicio de fotofase y escotofase, así como las horas (recuadro) de la toma de muestras.

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6.2 Histología.

Los tejidos fueron fijados en solución de Bouin durante toda la noche. Posteriormente se lavaron en PBS durante 1:30 hrs y se deshidrataron en alcoholes de concentración gradual (50%, 70%, 96% y 100%), durante 20 minutos cada uno, para después ser aclarados en xilol durante 10 min. A continuación, se incubaron en Paraplast durante 12 h a 59 °C en una estufa, se incluyeron en bloques y se hicieron cortes histológicos longitudinales de 25 µm con un microtomo Leitz 1512. Los cortes se adhirieron a portaobjetos con grenetina en un baño de flotación (Lab. Line Instruments Inc.). Las laminillas se desparafinaron en xilol durante 15 minutos y se rehidrataron en alcoholes de concentración gradual (10 min en el alcohol al 100%, 10 min en el de 96%, 5 min en el de 70% y 5 min en el de 50%) y agua destilada.

6.3 Inmunofluorescencia.

Las laminillas se lavaron en PBS, se bloquearon a 4 °C con el bloqueador comercial Background Eraser (10% de suero de cabra en PBS, Biocare Medical) y se incubaron durante toda la noche con anticuerpo primario ratón anti-GFAP (GeneTex) 1:400. Al día siguiente, se colocaron las laminillas en la estufa a 59 °C durante dos minutos, se lavaron con PBS-Tween (PBST) al 10% durante 5 minutos y se incubaron durante toda la noche a 4 °C con un segundo anticuerpo primario anti-Caspasa-3 o anti-HNE (Biocare Medical), ambos producidos en conejo y en concentración 1:100. Al día siguiente, se lavaron las laminillas con PBST al 10% y se incubaron con los anticuerpos secundarios cabra anti- ratón y cabra anti-conejo conjugados con fluorescencia (DyLight 488 y 649, respectivamente; ambos de la marca GeneTex) diluidos 1:100, durante 2 h cada uno, a temperatura ambiente (TA). Finalmente, las laminillas se lavaron 3 veces durante 5 minutos con PBST al 10% y se colocaron con medio de montaje para fluorescencia Dako. Cabe mencionar que todos los anticuerpos se diluyeron en la solución Van Gogh (combinación de amortiguadores, estabilizadores, marca Biocare Medical).

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Para comprobar la especificidad de los anticuerpos, se realizaron controles negativos llevando a cabo el método arriba descrito pero omitiendo el anticuerpo primario o el secundario.

6.4 Microscopía y digitalización de imágenes.

Los cortes tratados con inmunofluorescencia se analizaron con un microscopio de análisis confocal y espectral FV10, marca Olympus, mediante los filtros de excitación-emisión 489-506 nm (Cy2) y 550-570 nm (TRITC). Las imágenes fueron capturadas con los objetivos de aumento 10X, 40X y 60X y una lente ocular con aumento de 10X. Las imágenes obtenidas se digitalizaron con el programa FV10 4.0 Viewer. En caso de requerirlo, se utilizaron cortes láser con un grosor de 3.6 µm. Las imágenes obtenidas se procesaron digitalmente con el programa Corel PhotoPaint 6.0.

6.5 Procesamiento de muestras y estandarización de la técnica de ELISA.

El ganglio cerebroide y el tallo ocular de cada individuo muestreado se colocaron por separado en 50 μL de PBS, se homogeneizaron y se centrifugaron a 4 °C, 20,000 g durante 20 min. Se colectaron los sobrenadantes y se almacenaron a -70 °C hasta su uso. Se determinó la concentración de proteína total en cada muestra por el método de Bradford (1976).

La cuantificación de Caspasa-3 y GFAP se realizó por medio de la técnica de ELISA. Para ello, se estandarizó la técnica considerando las siguientes variables: diluyentes, pH de los amortiguadores, concentraciones de Tween 20, temperatura y duración de incubación, diluciones de anticuerpos, péptidos control y muestras. Se consideraron variables adecuadas aquellas que al graficar la concentración del péptido control vs. la absorbancia a 450 nm, resultaran en una relación lineal.

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6.6 Cuantificación de Caspasa-3.

Se colocaron 100 μg de cada muestra, por duplicado, de ganglio cerebroide y de tallo ocular diluidas en amortiguador de fosfatos a pH 6.5 (volumen total de 100 µL) en microplacas para ELISA UltraCruz (Santa Cruz), y se incubaron durante 3 h a 37 °C y después durante toda la noche a 4 °C. Al día siguiente, se lavaron los pozos 3 veces con 300 μL de amortiguador de lavado (PBST 0.01%) por pozo y se incubaron durante 3 h a 37 °C con 125 μL de amortiguador de bloqueo (3% de albúmina en amortiguador de lavado). El amortiguador de bloqueo fue retirado y se lavaron las placas 3 veces con 300 μL de PBS. Se añadieron a cada pozo 100 μL de anticuerpo primario anti-Caspasa-3 (Biocare Medical) diluido 1:50 en amortiguador de dilución (leche descremada light Svelty en polvo al 1% en PBST al 1%) y se incubó la placa durante 3 h a 37 °C. El exceso de anticuerpo primario fue eliminado y se lavó la placa 6 veces con 300 μL de amortiguador de lavado por pozo. A cada pozo se añadieron 100 μL de anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano (HRP, marca GeneTex) 1:9,000 en amortiguador de dilución y se incubaron durante 3 h a 37 °C y luego durante toda la noche a 4 °C. Al día siguiente, el exceso de anticuerpo secundario fue removido y los pozos se lavaron 9 veces con 3% de leche en amortiguador de lavado y se incubaron con 100 μL del sustrato colorimétrico tetrametil bencidina (TMB; Thermo Scientific), durante 15-30 min a temperatura ambiente. Finalmente, a cada pozo se agregaron 100 μL de ácido fosfórico 2 M para detener la reacción del TMB con la HRP y se determinó la absorbancia a 450 nm en un lector de placas (BioTek Instruments).

Los datos obtenidos se ajustaron a una curva de calibración realizada con 8 concentraciones conocidas de Caspasa-3 (Cell Signaling): 0, 0.781, 1.156, 3.175, 6.25, 12.5, 25 y 50 pg/mL. En lugar de muestra, se colocaron 100 µL de las diluciones de Caspasa-3 y se colocaron los anticuerpos como se describe arriba

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6.7 Cuantificación de GFAP.

Se colocaron 60 μg de cada muestra, por duplicado, de ganglio cerebroide y tallo ocular diluida en amortiguador de fosfatos a pH 6.5 (volumen total de 100 µL) en microplacas para ELISA UltraCruz (Santa Cruz). Posteriormente, se incubaron durante 1 h a 37 °C, 2 h a temperatura ambiente (TA) y finalmente durante toda la noche a 4 °C. Al día siguiente, se lavaron los pozos con 200 μL de PBST y se bloquearon durante 2 h a TA con 125 μL de una solución filtrada de leche al 3% en PBST. La solución de bloqueo fue retirada y se lavaron las placas 3 veces con 200 μL de PBST. Se añadieron a cada pozo 100 μL de anticuerpo primario anti-GFAP (GeneTex) diluído 1:800 y se incubó la placa durante 2 h a TA, después durante toda la noche a 4 °C. El exceso de anticuerpo primario fue eliminado y se lavaron los pozos 3 veces con 200 μL de PBST. A cada pozo se añadieron 100 μL de anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con HRP (GeneTex) 1:2,500 y se incubaron durante 2 h a TA. El exceso de anticuerpo secundario fue removido, los pozos se lavaron 3 veces con PBST y se incubaron con 100 μL de TMB (Thermo Scientific), durante 15-30 min a TA. Finalmente, a cada pozo se le agregaron 50 μL de ácido fosfórico 2 M y se determinó la absorbancia a 450 nm.

Cabe mencionar que en este ensayo se utilizó PBST al 0.05% para los lavados y las diluciones de anticuerpos. En este último caso, se añadió leche descremada en polvo al 0.1%. La curva de calibración se realizó con las siguientes concentraciones del péptido control GFAP (GeneTex): 0, 43.75, 87.5, 175, 250, 500, 1,000 y 2,000 ng/mL.

6.8 Análisis estadísticos.

Los datos se analizaron por medio de un Análisis de Varianza (ANOVA) de una vía seguido de una prueba de contrastes de Scheffé. Posteriormente, se calculó el Índice de Correlación de Pearson con el fin de determinar una posible relación lineal entre los cambios en las concentraciones de Caspasa-3 y GFAP. Todos los análisis se realizaron con el programa estadístico SPSS 21.0.

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7. RESULTADOS

7.1 Inmunofluorescencia.

El tallo ocular y el ganglio cerebroide de P. clarkii mostraron inmunorreactividad tanto a Caspasa-3 como a GFAP, mientras que la inmunorreactividad a HNE sólo se encontró en el tallo ocular. Las omatidias mostraron fluorescencia en todos los casos, incluyendo en los tejidos control, que fueron incubados sin anticuerpo primario anti-GFAP o secundario anti- ratón conjugado con DyLight 488 (Fig. 5).

La inmunorreactividad a Caspasa-3 en el tallo ocular (Fig. 6) sólo se presentó en el perineuro adyacente a la médula externa. La intensidad del marcaje mostró variaciones siendo menor a las 3 h (escotofase) en la condición LO 16:08 y mayor durante las dos horas muestreadas de la condición OO. Además, este tejido también presentó inmunorreactividad a GFAP sin evidencia de co-localización con Caspasa-3.

La inmunorreactividad a GFAP en el tallo ocular (Fig. 7) se presentó en la lámina ganglionar (en las capas nuclear y plexiforme) y en la médula externa, con procesos gliales entre ambas estructuras. La excepción se halló durante las 15 h (fotofase) de la condición LO 20:04, en la que hubo ausencia de inmunorreactividad en la médula externa y, en cambio, se observaron procesos gliales entre las médulas externa e interna. En la lámina ganglionar, la inmunorreactividad mostró variaciones en intensidad, siendo aparentemente mayor durante las 3 h en la condición LO 20:04. En estas estructuras no se presentó inmunorreactividad a Caspasa-3.

El tallo ocular presentó inmunorreactividad a HNE (Fig. 8) en los axones de las células retinulares y, en algunos casos, en las células tapetales. En las células retinulares, la mayor intensidad se observó a las 3 h en la condición LO 16:08, mientras que estuvo ausente en los tejidos expuestos a OO y a las 3 h durante la condición LD 20:04. La inmunorreactividad a HNE en las células tapetales se detectó en los grupos LO 12:12 (3 h) y LO 20:04 (15 h). No se presentó co-localización con GFAP.

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El ganglio cerebroide presentó inmunorreactividad a GFAP en todas las condiciones y durante las dos horas muestreadas. La mayor intensidad se presentó durante las 3 h en todas las condiciones, mientras la Caspasa-3 se presentó sólo en el grupo celular 10 (Fig. 9). A diferencia del tallo ocular, en el ganglio cerebroide no se observaron procesos gliales. La inmunorreactividad a Caspasa-3 sólo se presentó a las 15 h en la condición LO 16:08 y a las 3h de LO 20:04, donde se halló co-localización de ambas proteínas.

Fig. 5. Controles negativos de inmunofluorescencia. A. Zona periférica a la médula externa (ME). B. Rabdómeros (R). C. Lóbulo olfatorio (LO), lóbulo accesorio (LAc) y grupo celular 10. D. Esquemas de localización de A, B y C. Barras de escala: 100 µm.

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Fig. 6. Microfotografías de las células con inmunorreactividad a Caspasa-3 (rojo) y GFAP (verde) en el tejido adyacente a la médula externa del tallo ocular de P. clarkii expuesto a diferentes fotoperiodos (A - H). Las 3 h corresponden a la fotofase y las 15 h a la escotofase en las condiciones LO. I. Esquema en el que se muestra la localización de células positivas de las microfotografías. Barra de escala: 20 µm.

Nota: En la imagen B no fue posible identificar el aumento ni el tejido. La imagen C no muestra señales anatómicas claras. La figura H mostró errores de transcripción sobre las condiciones experimentales.

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Fig. 7. Microfotografías que muestran la inmunopositividad a GFAP (en verde) en el tallo ocular de P. clarkii expuesto a diferentes fotoperiodos (A – H). Las 3 h corresponden a la fotofase y las 15 h a la escotofase en las condiciones LD. I. Esquema de localización de las microfotografías. LG, Lámina ganglionar; ME, médula externa. Las flechas indican procesos gliales en las fibras nerviosas entre la LG y la ME. Barras de escala: 30 µm.

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Fig. 8. Microfotografías que muestran la inmunopositividad a GFAP(verde) y a HNE (rojo) en el tallo ocular de P. clarkii expuesto a diferentes fotoperiodos (A – H). Las 3 h corresponden a la fotofase y las 15 h a la escotofase en las condiciones LD. I. Localización de la microfotografías A – H. R. rabdómeros; LG, lámina ganglionar; ACR, axones de la células retinulares; CT, células tapetales Barras de escala: 30 µm en B, C, D, G y H; 60 µm en E; 130 µm en el resto.

Nota: No se logró identificar el aumento de la figura B. La figura G mostró errores de transcripción sobre las condiciones experimentales.

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Fig. 9. Microfotografías que muestran la inmunopositividad a Caspasa-3 (rojo) y GFAP (verde) en el grupo celular 10 del ganglio cerebroide de P. clarkii (A – H). La flecha delgada indica la localización de Caspasa-3; las flechas gruesas indican colocalización de Caspasa-3 y GFAP. Las 3 h corresponden a la fotofase y las 15 h a la escotofase en las condiciones LO. I. Localización de la microfotografías A – H. Barra de escala: 120 µm, excepto B (30 µm), D y G (10 µm).

Nota: No se identifica el tejido de la figura C (posiblemente se trata de deuterocerebro).

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6.2 ELISA.

Las curvas de calibración para la técnica de ELISA de Caspasa-3 (R2 = 0.9628) y GFAP (R2 = 0.9853) se muestran en la Fig. 10.

Fig. 10. Curvas de calibración de ELISA para Caspasa-3 (A) y GFAP (B). La línea de tendencia de la concentración del péptido correspondiente se muestra en líneas continuas, mientras que el ajuste lineal (R2 ≥ 0.95) se presenta en líneas discontinuas.

La cuantificación de Caspasa-3 en el tallo ocular y el ganglio cerebroide de P. clarkii se muestra en la Fig. 11. El tallo ocular de los animales expuestos a los fotoperiodos LO 16:08, LO 20:04 y OO presentaron concentraciones de Caspasa-3 significativamente mayores que aquellos expuestos al fotoperiodo control LO 12:12, tanto a las 3 h como a las 15 h. El ganglio cerebroide presentó dicha diferencia sólo a las 15 h, durante la fotofase,

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mientras que en la escotofase no se observó diferencia significativa entre los fotoperiodos. En distintas horas del mismo fotoperiodo, se observaron diferencias en las concentraciones de Caspasa-3 en ambos tejidos mantenidos en condiciones de LO 16:08, siendo mayor a las 15 h (durante la fotofase); así como en el tallo ocular de los animales expuestos a OO, donde la concentración mayor se presentó a las 3 h.

La cuantificación de GFAP en el tallo ocular y el ganglio cerebroide de P. clarkii se muestra en la Fig. 12. El tallo ocular no presentó diferencias significativas entre los fotoperiodos ni entre las dos horas muestreadas. En el ganglio cerebroide, se presentó mayor concentración de GFAP en los fotoperiodos LO 16:08 y LO 20:04 que en LO 12:12 y OO, durante la fotofase. En distintas horas del mismo fotoperiodo, se observaron menores concentraciones de GFAP a las 15 h en el ganglio cerebroide de los animales mantenidos en condiciones de LD 12:12, LD 16:08 y OO (p ≤ 0.05).

El índice de correlación de Pearson no mostró relación lineal significativa (Fig. 13).

Fig. 11. Concentraciones de Caspasa-3 en el tallo ocular (A) y en el ganglio cerebroide (B) de P. clarkii expuesto a diferentes fotoperiodos. Los datos están expresados como el promedio ± el error estándar (e. e.) Las comparaciones estadísticas se realizaron por medio de un ANOVA de una vía seguido por una prueba de Scheffé (p ≤ 0.05). Las letras indican diferencias significativas entre distintas horas del mismo fotoperiodo y los asteriscos (*) indican diferencias entre el grupo control (LO 12:12) y los diferentes fotoperiodos (LO 16:08, LO 20:04 y OO).

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Fig. 12. Concentraciones de GFAP en el tallo ocular (A) y en el ganglio cerebroide (B) de P. clarkii expuesto a diferentes fotoperiodos. Los datos están expresados como el promedio ± e.e. Las comparaciones estadísticas se realizaron por medio de un ANOVA de una vía seguido por una prueba de Scheffé (p ≤ 0.05). Las letras indican diferencias significativas entre distintas horas del mismo fotoperiodo y los asteriscos (*) indican diferencias entre el grupo control (LO 12:12) y los diferentes fotoperiodos (LO 16:08, LO 20:04 y OO).

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Fig. 13. Análisis de correlación de Pearson. El eje y representa las concentraciones de Caspasa-3 y el eje x las concentraciones de GFAP en el tallo ocular (A y B) y en el ganglio cerebroide (C y D) a las 3 h, escotofase (izquierda) y a las 15 h, fotofase (derecha).

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8. DISCUSIÓN

Halberg (1964) y Pittendrigh (1961) reportaron que los órganos, glándulas y tejidos de los animales tienen ritmos circadianos sincronizados que pueden interactuar periódicamente entre sí. Estos ritmos son oscilaciones autosostenidas, con un periodo de aproximadamente 24 h, que se sincronizan a ciclos ambientales de luz-oscuridad y de temperatura para dar lugar a un estado metabólico normal en estos animales.

La exposición de los animales a períodos prolongados de luz puede alterar sus funciones. Por ejemplo, el incremento de la exposición luminosa, de aproximadamente 16-18 h de luz durante un año, altera las respuestas a la estacionalidad en mamíferos, incluyendo el humano (Wehr, 2001; Haim et al., 2005; Schernhammer y Schulmeister, 2004). Además, numerosos estudios han relacionado la exposición a la luz durante la noche con alteraciones como el cáncer (consecuencia de la disregulación hormonal), desórdenes metabólicos y disfunciones de los sistemas reproductor e inmune (Kloog et al., 2008; Haus y Smolensky, 2006; Navara y Nelson, 2007; Reddy y O’Neill, 2010; Nelson y Drazen, 2000; Vinogradova et al., 2010). Por otro lado, la luz artificial durante la noche puede tener implicaciones ecológicas serias, especialmente en animales nocturnos, al incrementar el riesgo de depredación, disminuyendo el consumo de alimento y alterando los patrones de migración (Beier, 2005).

En este trabajo se observaron alteraciones en los marcapasos putativos, el tallo ocular y el ganglio cerebroide, del acocil P. clarkii debido a la exposición de los animales a fotoperiodos con fotofase larga (LO 16:08 y LO 20:04). Los muestreos se realizaron a las 3 h (siendo esta hora el término de la mayor fotofase experimental de LO 20:04) y a las 15 h (después de medio ciclo circadiano), tomando en cuenta posibles variaciones diarias o circadianas, así como el número de horas de exposición a la luz. Las alteraciones producidas durante los diferentes fotoperiodos se vieron reflejadas en el aumento de muerte celular apoptótica y la expresión de GFAP. Sin embargo, las respuestas específicas de cada órgano variaron.

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El tallo ocular respondió a los diferentes fotoperiodos con la eliminación de las células dañadas mediante la apoptosis, sin embargo no hubo participación de células gliales. Esta respuesta se presentó durante las dos horas del día muestreadas (Fig. 6). No obstante, la muerte celular no se mostró en las estructuras principales del tallo ocular, solamente en el tejido circundante a la médula externa. Este tejido conforma el perineuro, responsable de brindar soporte trófico y de formar la barrara hematoencefálica (Heusser, 1996). El hecho de que la apoptosis se presentara en esta estructura y no en las estructuras que conforman en tallo ocular confirma su función protectora. Es posible que la muerte celular fuera causada por la producción de c-Fos, ya que se ha reportado su inducción por luz en componentes del sistema circadiano tanto en vertebrados como en invertebrados (Castel et al., 1997; Silver et al., 1996; Granados-Domínguez et al., 2003). Diversos estudios han sugerido a la proteína c-Fos como un mediador de muerte celular apoptótica inducida por condiciones antiproliferativas. Un incremento en la expresión de c-Fos y apoptosis se han observado en diferentes tipos celulares después de la exposición a drogas, a agentes químicos o a la falta de algún factor de crecimiento (Teng, 2000).

El ganglio cerebroide mostró una respuesta conjunta del sistema inmune (mediante apoptosis) y células gliales, que aumentaron su concentración de GFAP. Sin embargo, en contraste con el tallo ocular, estas diferencias se mostraron sólo durante la fotofase (Fig. 9). Esto podría reflejar el hecho de que el ganglio cerebroide es sensible al estrés fótico al presentar abundantes pigmentos, como las cromatoforotropinas, que pueden cambiar su estado redox durante la exposición a la luz (Rao, 1985). Al ser mayor el tiempo que el animal está expuesto a la luz, mayor su estado redox.

Cabe señalar que, si bien la técnica de inmunofluorescencia no mostró evidencia de células apoptóticas en todas las condiciones, la presencia y abundancia de Caspasa-3 fueron confirmadas mediante la técnica de ELISA. Dicha diferencia entre los resultados de ambas técnicas podría deberse a que el ELISA realiza la detección en homogeneizados de los órganos completos, mientras que para la inmunofluorescencia se utilizaron secciones de

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sólo 25 µm de cada órgano. Otro factor que podría jugar un rol importante es la corta duración de la apoptosis, la cual va de un período de 3-6 h (Kerr, et al., 1972).

Las diferentes respuestas observadas pudieron ser causadas por cambios en el estatus oxidante total, el cual se ha reportado que presenta ritmos circadianos en organismos como ratones y humanos (Benot et al., 1998; Benot et al., 1999). Estos ritmos podrían resultar alterados por los fotoperiodos largos aplicados en este trabajo; sin embargo, los resultados mostraron un aumento considerable de Caspasa-3 en el tallo ocular en condiciones de oscuridad constante. No se conocen alteraciones de este tipo provocadas por dicha condición, por lo que la diferencia encontrada en el acocil podría deberse a un corrimiento de fase en el ritmo de muerte celular, el cual es un fenómeno común en los ritmos circadianos que consiste en el adelanto o retraso de determinada fase en condiciones constantes (Dunlap, et al., 2004).

Cabe señalar que de acuerdo con los resultados del Índice de Correlación de Pearson realizado para las distintas respuestas mencionadas anteriormente (Fig. 13), éstas son independientes, pues no se halló ninguna correlación lineal entre ellas.

Por otra parte, las diferencias entre las proteínas cuantificadas a las 3 h y a las 15 h sugieren la presencia de variaciones diarias de Caspasa-3 en el tallo ocular, así como de Caspasa-3 y de GFAP en el ganglio cerebroide en las condiciones de LO 12:12 y LO 16:08. Lo anterior coincide con otro trabajo desarrollado por Rodríguez-Muñoz, (comunicación personal, 2 de noviembre de 2013) en el que reportó variaciones circadianas de GFAP en P. clarkii. Asimismo, se han reportado variaciones diarias de GFAP en el Núcleo Supraquiasmático de mamíferos, componente principal del marcapasos circadiano en el hámster (Lavialle y Serviere, 1993; Leone et al., 2006; Lindley et al., 2008), en ratas (Morín et al., 1989) y en ratones (Moriya et al., 2000).

En cuanto a las variaciones diarias en las concentraciones de Caspasa-3, si bien no se han reportado en otro trabajo, podrían estar relacionadas con los niveles de melatonina. La melatonina es una hormona secretada de manera circadiana en animales, plantas, algas y

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organismos unicelulares (Balzer y Hardeland, 1996) y se ha identificado como un agente antiapoptótico (Zhang et al, 2013; El-Missiry y Othman 2013). P. clarkii presenta ritmos circadianos de secreción de melatonina con una concentración mínima en CT8 (CT, tiempo circadiano, es el tiempo subjetivo interno de un organismo en el cual la duración del periodo circadiano se divide en 24 partes iguales, por convención CT0 corresponde al encendido de la luz) y máxima en CT20 (Balzer et al., 1997), correspondientes las 3 h y 15 h, respectivamente en este trabajo, en los cuales se observó el mismo comportamiento en los cambios de las concentraciones de Caspasa-3. Dado lo anterior, es probable que las variaciones circadianas de melatonina influyan en la variación circadiana o diaria de su actividad antiapoptótica y por lo tanto en variaciones diarias de la concentración de Caspasa-3.

En lo que respecta a las omatidias, éstas presentaron fluorescencia en todos los grupos, tanto controles como experimentales. Esto podría deberse a la fluorescencia natural en omatidias debido a la presencia de retinoles sensibles a la luz, como se ha observado anteriormente (Arikawa et al, 2001).

Si bien el ganglio cerebroide mostró mayores diferencias entre el grupo control y los grupos experimentales durante las 15 h, hasta el momento no es posible definir si hay mayor cantidad de daño durante una hora u otra. Esto se debe, en gran medida, a diferencias en la respuesta inmune de cada órgano y a las posibles oscilaciones fisiológicas a lo largo del día.

Por otro lado, la localización de la GFAP en el grupo celular 10 ha sido reportada anteriormente en esta especie (Rodríguez-Muñoz, comunicación personal, 2 de noviembre, 2013) así como en la langosta Cherax destructor (Sullivan y Beltz, 2005). En el grupo celular 10 se encuentran los somas de neuronas cuyos axones forman los lóbulos accesorio y olfatorio, siendo éste último ampliamente estudiado en el campo de la neurogénesis en crustáceos decápodos adultos (Beltz y Sandeman, 2003). Sullivan y colaboradores (2007) reportaron que las células precursoras que se diferencian en esta zona del ganglio cerebroide migran desde nichos neurogénicos a través de tejido glial que lo une al grupo

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celular 10. Debido a esta importante función, es de fundamental importancia la presencia de células gliales en el grupo celular 10 que provean el soporte trófico y la protección requerida para mantener la neurogénesis en el ganglio cerebroide de P. clarkii, lo cual es congruente con la presencia de glía en el grupo celular 10 en este trabajo.

Al igual que en el presente estudio, se ha reportado con anterioridad la presencia de células gliales en la lámina ganglionar de P. clarkii (Rodríguez-Muñoz, comunicación personal, 2 de noviembre,2013), así como en el cangrejo Ucides cordatus (Da Silva et al., 2003, 2004) y en el camarón Macrobranchium rosenbergii (Allodi et al., 2006). En este último, además se han reportado marcadores de glía en el perineuro y en la médula externa. La inmunopositividad a GFAP en la lámina ganglionar puede estar relacionada con el acoplamiento metabólico entre neuronas y células gliales, como sugirieron Tsacopoulos y colaboradores (1987).

Finalmente, cabe mencionar que aunque Campos y colaboradores (2002) detectaron daños en las células retinulares del cangrejo Ucides cordatus después de la exposición a radiación UV, la detección de lipoperoxidación por medio de anticuerpos anti-HNE no se había realizado en crustáceos expuestos a fotoperiodos con fotofase larga. La presencia de inmunopositividad a HNE en los axones de las células retinulares encontrada en P. clarkii podría deberse al gran componente lipídico (mielina) presente en esta zona.

La GFAP produjo efectos neuroprotectores en el grupo celular 10 del ganglio cerebroide. Lo anterior se evidenció por la co-localización de esta proteína con Caspasa-3, de manera que es tejido glial el que sufre de apoptosis durante la exposición a fotoperiodos de fotofase larga y no las neuronas.

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9. CONCLUSIONES

1. Se presentó inmunorreactividad a GFAP en la lámina ganglionaris y en el perineuro adyacente a la médula externa del tallo ocular de P. clarkii. El cerebro presentó inmunorreactividad a esta proteína en el grupo 10, así como a Caspasa-3. La inmunorreactividad a HNE sólo se presentó en los axones de las células retinulares y, en algunos casos, en las células tapetales.

2. La exposición a fotoperiodos con fotofase larga ocasionó efectos negativos en el tallo ocular y el ganglio cerebroide del acocil P. clarkii, reflejados por el incremento en las concentraciones de Caspasa-3 y GFAP, especialmente, durante la fotofase.

3. Es probable que existan variaciones diarias en las concentraciones de GFAP en el tallo ocular y el ganglio cerebroide y de Caspasa-3 en el tallo ocular de P. clarkii.

4. Las respuestas de Caspasa-3 y GFAP son independientes durante la exposición a fotoperiodos con fotofase larga.

5. Con los resultados obtenidos en este trabajo, se puede inferir que la muerte celular apoptótica observada en el tallo ocular y en el ganglio cerebroide en este caso no se origina por lipoperoxidación.

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