"Julio De Mesquita Filho" Faculdade De Ciências
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA "JULIO DE MESQUITA FILHO" FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS CÂMPUS DE ARARAQUARA Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES CICATRIZANTE E ANTI- INFLAMATÓRIA DE Casearia sylvestris Swartz EM ANIMAIS E IDENTIFICAÇÃO DOS MARCADORES QUÍMICOS ELAISE GONÇALVES PIERRI ORIENTADOR: Prof. Dr. ANDRÉ GONZAGA DOS SANTOS ARARAQUARA-SP 2013 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA "JULIO DE MESQUITA FILHO" FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS CÂMPUS DE ARARAQUARA Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES CICATRIZANTE E ANTI- INFLAMATÓRIA DE Casearia sylvestris Swartz EM ANIMAIS E IDENTIFICAÇÃO DOS MARCADORES QUÍMICOS ELAISE GONÇALVES PIERRI Defesa de tese apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas, Área de Pesquisa e Desenvolvimento de Fármacos e Medicamentos, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, UNESP, como parte dos requisitos para obtenção do Título de Doutor em Ciências Farmacêuticas ORIENTADOR: Prof. Dr. André Gonzaga dos Santos Araraquara 2013 FICHA CATALOGRÁFICA Elaborada Pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação Faculdade de Ciências Farmacêuticas UNESP – Campus de Araraquara Pierri, Elaise Gonçalves P622a Avaliação das atividades cicatrizante e anti-inflamatória de Casearia sylvestris Swartz em animais e identificação dos marcadores químicos / Elaise Gonçalves Pierri. – Araraquara, 2013 125 f. Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista. “Júlio de Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas Orientador: André Gonzaga dos Santos 1. Casearia sylvestris. 2. Salicaceae. 3. Diterpenos clerodânicos. 4. Casearinas. 5. Anti-inflamatório. 6. Cicatrizante. I. Santos, André Gonzaga dos, orient. II. Título. CAPES: 40300005 “...e nunca considerem seu estudo como uma obrigação, mas sim como uma oportunidade invejável de aprender, sobre a influência libertadora da beleza no domínio do espírito, para seu prazer pessoal e para o proveito da comunidade à qual pertencerá o seu trabalho futuro.” Albert Einstein DEDICATÓRIA Ao meu paizinho querido, Epaminondas, que tantas vezes apoiou e amparou os momentos mais importantes de minha vida e sempre incentivou este projeto e que agora se encontra na casa do PAI. Este trabalho é para você papai, que nunca me deixou desistir! A minha mãezinha, Clarice, pelo amor, colo e aconchego que tantas vezes precisei! Aos meus filhos queridos Ricardo, Vinícius e Isabella por nunca desistirem da mãe “sargento” deles! Vocês foram minha inspiração. Ao meu marido Eduardo Augusto que foi companheiro, paciente, dedicado, incentivador, amoroso, em muitos momentos patrocinador deste projeto, dedico a ele os louros de mais esta vitória. Aos meus irmãos Elaine, Elair, Eduardo Henrique e Roselaine que mesmo de longe sempre torceram por mim. Aos meus amigos e irmãos em Cristo das Equipes de Nossa Senhora de Araraquara (Equipe 12) que sempre oraram por mim nesta caminhada. Agradecimentos A DEUS, acima de tudo, pelo dom da vida e da sabedoria em viver! Aos animais pela existência e por possibilitar que o homem faça novas descobertas na ciência. Ao meu orientador Professor Dr. André Gonzaga dos Santos que desde o primeiro momento não hesitou em encarar mais este desafio. E também por sua amizade e dedicação que sempre demonstrou a seus alunos, formando não só cientistas, mas seres humanos com cabeça pensante. Continue assim professor, porque só assim poderemos deixar de herança um futuro melhor para nossos filhos e netos. A Professora Dra. Chung Man Chin pela “barriga de aluguel” no inicio deste projeto. Deixo aqui minha eterna gratidão. A minha grande amiga e irmã Professora Dra. Selma Lucy Franco do Laboratório de Farmacotécnica da Universidade Estadual de Maringá- PR, pelo apoio logístico, técnico, e por muitas vezes emocional durante mais esta caminhada. Serei eternamente grata a DEUS por você existir e participar de minha vida e do meu crescimento pessoal e espiritual. Ao Laboratório de Histologia e Patologia da Faculdade de Odontologia de Araraquara, especialmente ao Professor Dr. Cleverton Roberto de Andrade pelo auxílio esclarecedor. Ao Professor Aristeu Tininis do Instituto Federal de São Paulo localizado na cidade de Matão por permitir a utilização de seu laboratório para a realização das análises em CLAE-DAD. A Professora Dra. Luzmarina Hernandes do Laboratório de Histologia e Embriologia, Departamento de Ciências Morfológicas da Universidade Estadual de Maringá-PR, pelos ensaios de cicatrização. A minha “segunda filha”, Carla, aluna de iniciação científica que abraçou minha causa colaborando com os ensaios de inflamação. As estagiárias Juliana e Elaine que muito colaboraram com os ensaios de controle de qualidade. Aos técnicos Eduardo, Caio, Matheus, Rodrigo, Margarete e Angélica que muitas vezes socorreram no laboratório, meu MUITO OBRIGADO! Ao grupo LAPDESF pela parceria proporcionando o suporte para a realização desta pesquisa. Para não cometer injustiças esquecendo algum nome, agradeço à “família Lapdesf” por ter me adotado como “irmãzinha”. Aos meus amigos de laboratório Josiane, Ana Carolina, Poliana, Natália, Ana Paula, Flávio, Paulo Renato, Rafael e todos que fizeram parte de minha vida nestes três anos de caminhada. Ao Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP. A CAPES pela apoio financeiro. i ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1: Geração dos metabólitos do ácido aracdônico e seus papéis na inflamação. Os alvos moleculares das ações de alguns fármacos anti- inflamatórios são indicados por um X vermelho. Os agentes que inibem a produção de leucotrienos pela inibição da 5-lipoxigenase ou bloqueiam os receptores de leucotrienos não são mostrados. COX, Ciclo-oxigenase; HETE, ácido hidroxieicosatetraenoico; HPETE, ácido hidroperoxieicosatetraenoico ... 10 Figura 2: Visão geral das respostas de cura após lesão. A cura após lesão aguda pode ocorrer por regeneração que restaura a estrutura normal do tecido ou por reparo com formação de cicatriz. A cura na lesão crônica envolve formação de cicatriz e fibrose ........................................................................... 14 Figura 3: Esquema do corte histológico da pele .............................................. 16 Figura 4: Casearia sylvestris Swartz individuo adulto e detalhe de folhas e flores .................................................................................................................23 Figura 5: Estrutura química geral de diterpenos clerodânicos presentes nas espécies de Casearia ........................................................................................ 25 Figura 6: Extração em fase sólida a partir do extrato etanólico de folhas de C. sylvestris ........................................................................................................... 34 Figura 7: Distribuição granulométrica de folhas seca e pulverizadas de C. sylvestris. Média de 5 determinações ............................................................... 46 Figura 8: Cromatoplaca (sílica gel) das frações EFSCs1, 2, 3 e extrato etanólico (EEtCs) (5,0 mg/mL, metanol) e padrões de diterpenos: casearina X (cas X), B (cas B) e caseargrewiina F (casg F) (1,0 mg/mL, metanol) ............ 48 Figura 9: Cromatograma do EEtCs e espectro no UV da caseargrewiina F. Condições de análise descritas acima (item 4.4.2.2) ........................................ 49 Figura 10: Cromatograma da fração EFSCs2 e espectro no UV da caseargrewiina F. Condições de análise descritas acima (item 4.4.2.2) ........... 50 Figura 11: Cromatograma do padrão de caseargrewiina F e seu espectro no UV. Condições de análise descritas acima (item 4.4.2.2) ................................. 50 Figura 12: Cromatograma do padrão de casearina X e seu espectro no UV. Condições de análise descritas acima (item 4.4.2.2) ........................................ 51 Figura 13: Cromatograma do padrão de casearina B e seu espectro no UV. Condições de análise descritas acima (item 4.4.2.2) ........................................ 51 ii Figura 14: Curva de calibração para solução padrão de caseargrewiina F em metanol ............................................................................................................. 52 Figura 15: Cromatoplaca (sílica gel) das frações CCCs1-54 em duas fases móveis distintas: CCCs1-18 (FM I: hexano:acetato de etila:isopropanol 70:28:02) e CCCs16-54 (FM II: hexano:acetato de etila:isopropanol 60:37,3:2,7) ................... 55 Figura 16: Cromatogramas das frações CCCs nas condições descritas no item 4.4.3 .................................................................................................................. 55 Figura 17: Estrutura química da casearina J e principais correlações observadas nos mapas de contornos COSY (setas duplas) e HETCOR LR (setas simples) .................................................................................................. 58 Figura 18: Curva analítica para solução padrão de casearina J em metanol ... 60 Figura 19: Análise longitudinal do grupo controle que recebeu injeção subplantar de solução de carragenina (0,1 mL/pata) ........................................ 62 Figura 20: Análise longitudinal do grupo controle que recebeu injeção subplantar de solução salina (0,1 mL/pata)....................................................... 62 Figura 21: Efeito da administração de EEtCs (10mg/Kg, v.o.) e Indometacina (10mg/Kg, v.o.), sobre o edema de pata induzido por carragenina