CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA –CONCYT- SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA-SENACYT- FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYT- FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACIA UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA

INFORME FINAL

“Evaluación química, nutricional y biológica de cinco especies de basidiomicetos para el diseño y formulación de un producto con aplicación medicinal, cosmética y alimenticia”

PROYECTO FINDECYT/FODECYT 54-2017

Dra. Sully Margot Cruz Velásquez Investigador Principal

Guatemala, mayo 2020.

AGRADECIMIENTOS

La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología -FONACYT-, otorgado por la Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología -SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología –CONCYT-.

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OTROS AGRADECIMIENTOS

A la Universidad de San Carlos de Guatemala, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia por el aval institucional, la infraestructura brindada, materiales y equipo para la ejecución del proyecto.

Al Laboratorio de Investigación de Productos Naturales (LIPRONAT), y Depto de Farmacognosia y Fitoquímica de la Escuela de Química Farmacéutica por brindar la infraestructura, materiales y apoyo del personal que colaboró para la ejecución del proyecto.

Al Laboratorio de Productos Naturales Farmaya S.A. especialmente a Lic. Armando Cáceres por el apoyo, asesoría y colaboración brindada en el desarrollo de la investigación.

Al equipo de investigación por su compromiso, entrega y dedicación especialmente a Dra. Dora Elena Chang, Lic. Roberto Cáceres, Licda. Nereida Marroquín, Br. Libny Pernillo, Akassia Stefania Hengstenberg, Jaqueline Lourdes Alvarado Cárdenas.

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ÍNDICE

Página RESUMEN ABSTRACT 1 PARTE I I.1 INTRODUCCIÓN I.2 PLANTEAMIENTO DEL 1 PROBLEMA I.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS 4 I.3.1 Objetivos I.3.1.1 General I.3.1.2 Específicos I.3.1.3 Hipótesis I.4 METODOLOGIA 8 I.4.1 Las Variables 1.4.1.1 Variables dependientes 1.4.1.2 Variables Independientes I.4.2 Indicadores I.4.3 Estrategia Metodológica I.4.3.1 Población y Muestra I.4.4 El Método I.4.5 La Técnica Estadística I.4.6 Los Instrumentos a utilizar I.4.7 Cronogramas

PARTE II 20 MARCO TEÓRICO PARTE III 44 III. RESULTADOS III.1 Discusión de Resultados 65 PARTE IV IV.1 CONCLUSIONES 70 IV.2 RECOMENDACIONES 72 IV.3 REFERENCIAS 73 BIBLIOGRÁFICAS IV.4 ANEXOS 81 PARTE V V.1 INFORME FINANCIERO 99

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Índice de Tablas y Cuadros

Número Título de Tablas Página 1 Cronograma de actividades 25 2 Cronograma de desembolsos 26

Título de Cuadros 1 Información de colecta 51 2 Determinación de humedad 52 3 Cenizas totales y cenizas ácido insoluble 53 4 Determinación de mejor disolvente 54 5 Rendimiento de extracto 54 6 Identificación de cumarinas en material y extracto seco 55 7 Identificación de taninos en material fúngico y extracto 56 8 Identificacion de alcaloides en material fúngico y extracto 56 9 Cromatografía en capa fina de alcaloides en material fúngico 57 10 Identificación de saponinas en material fúngico 57 11 Cromatografía en capa fina de saponinas 58 12 Cromaografía en capa fina de flavonoides en extractos 59 13 Identificación de azúcares por CCF 60 14 Identificación de estándares de azúcares por HPLC 61 15 Detección de azúcares en extractos por HPLC 61 16 Cuantificación de azúcares en extractos por HPLC 62 17 Evaluación de la actividad antioxidante 63 18 Cuantificación de fenoles totales 64 19 Actividad antioxidante de base al poder reductor de hierro 64 (FRAP) 20 Evaluación de la actividad antiureasa por CCF en extractos 65 21 Porcentaje de rendimiento de aceite fijo 67 22 Composición nutricional de hongos 68 23 Evaluación de la actividad antibacteriana 69 24 Actividad citotóxica contra Artemia salina 69 25 Análisis de oligoelementos en muestras secas 70 26 Propuesta de productos en base a hongo fresco 71 27 Propuesta de productos en base a hongo seco y extracto 72

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RESUMEN

Los basidiomicetos también conocidos como macromicetos se consideran una fuente importante de productos naturales biológicamente activos. Por lo que la evaluación de la actividad biológica, composición química y nutricional de especies que crecen en zonas de alto endemismo o se cultivan en diferentes áreas rurales es importante para establecer su potencial para propiciar su conservación y su mejor aprovechamiento.

Es por ello que se evaluó la antioxidante, antimicrobiana, enzimática y citotóxica, composición nutricional y química de cinco basidiomicetos y se desarrollaron productos a base de extractos y material fúngico con fines nutricionales. De acuerdo a los resultados se evidención el potencial antioxidante y valor nutricional de las especies. Se presentaron rendimientos de extracción muy promisorios hasta un 63.72% en extactos etanólicos y 28.18 % en extractos acuosos en Boletus edulis. Se determinó la presencia de alcaloides, saponinas, flavonoides, azúcares (trehalosa, glucose y fructosa) mediante ensayos macro y semimicro, cromatografía en capa fina y cromatografía líquida. Se demostró el valor nutricional por la presencia de fibra cruda (6.74-49.22%), proteína cruda (18.20-57.41%), carbohidratos (1.59-55.21%), minerales (7.08- 20.97%), y grasas (1.09-6.44%). Se demostró la actividad antioxidante por tres diferentes métodos, la mayor actividad se presentó en Agaricus (DPPH CI 50 1.99 mg/mL, ABTS 5.82 mg/mL, FRAP 4.33 g Fe+2/g extracto) y B. edulis (DPPH 2.46 mg/mL, ABTS 4.87 mg/mL, FRAP 3.53 g Fe+2/g extracto), dicha actividad mostró relación con la presencia de fenoles totales. Por lo que se demuestra el potencial de los hongos a nivel nutricional para el fomento de la salud.

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ABSTRACT

Basidiomycetes also known as macromycetes are considered an important source of biologically active natural products. Therefore, the evaluation of the biological activity, chemical and nutritional composition of species that grow in areas of high endemism or are cultivated in different rural areas is important to establish their potential to promote their conservation and better use.

That is why the antioxidant, antimicrobial, enzymatic and cytotoxic, nutritional and chemical composition of five basidiomycetes was evaluated and products based on extracts and fungal material were developed for nutritional purposes. According to the results, the antioxidant potential and nutritional value of the species were evidenced. Very promising extraction yields were presented up to 63.72% in ethanolic extracts and 28.18% in aqueous extracts in Boletus edulis. The presence of alkaloids, saponins, flavonoids, sugars (trehalose, glucose and fructose) was determined by macro and semi-micro tests, thin layer chromatography and liquid chromatography. The nutritional value was demonstrated by the presence of crude fiber (6.74- 49.22%), crude protein (18.20-57.41%), carbohydrates (1.59-55.21%), minerals (7.08-20.97%), and fats (1.09-6.44%). Antioxidant activity was demonstrated by three different methods, the highest activity was found in Agaricus (DPPH CI 50 1.99 mg / mL, ABTS 5.82 mg / mL, FRAP 4.33 g Fe + 2 / g extract) and B. edulis (DPPH 2.46 mg / mL, ABTS 4.87 mg / mL, FRAP 3.53 g Fe + 2 / g extract), said activity was related to the presence of total phenols. So the potential of mushrooms at the nutritional level for the promotion of health is demonstrated.

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PARTE I

I.1 INTRODUCCIÓN

La extraordinaria biodiversidad fúngica de la región latinoamericana y especialmente la región mesoamericana, y la reducida información técnica y científica existente sobre su caracterización, actividad biológica o composición química, hace necesario realizar estudios sobre dichos recursos naturales poco explotados.

Es conocido que ciertos componentes macromoleculares aislados de hongos superiores, tales como polisacáridos, glicoproteínas, ácidos nucleicos, etc., poseen actividad antitumoral, antimicrobiana y antioxidante relacionada con la activación que provocan dichas sustancias de la respuesta inmunológica. Los polisacáridos antitumorales producidos por basidiomicetos han ido recibiendo en los últimos años una creciente atención, apareciendo en la literatura reportes sobre la obtención de β-glucanos, polisacáridos antitumorales aislados a partir de hongos comestibles o medicinales tales como Grifola frondosa, Polyporus confluens, Hericium erinaceum, Lentinus edodes y Coriolus versicolor.

Los basidiomicetos fueron usados como alimento, medicamento, y ritualmente por los mayas desde tiempos inmemorables, encontrándose evidencias arqueológicas de sus uso como los famosos hongos piedra. Desde mediados del siglo pasado se evidenció el consumo tradicional de basidiomicetos por la población, demostrándose en estudios posteriores un difundido uso en la población rural, por lo que se le llama una cultura micofílica, que aunado a una amplia diversidad de especies presentes, hace de este un tema prioritario para la investigación de nuestra diversidad y el planteamiento de su aprovechamiento racional, ya que son muy pocos los estudios químicos y farmacológicos que validen su uso popular y propiedades atribuidas.

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I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

I.2.1 Antecedentes en Guatemala

Los hongos comestibles se conocen desde tiempos inmemoriales. Se estima que cerca de 7,000 especies poseen varios grados de comestibilidad, y más de 3,000 especies de 31 géneros se consideran como las principales comestibles (Chang & Miles, 2004).

Los análisis de la composición de los hongos cultivados han revelado que los hongos comestibles son ricos en proteínas y carbohidratos, moderados en fibra y cenizas, y bajos en grasas. Su valor energético es bajo, y son una buena fuente de aminoácidos esenciales, vitaminas y minerales. El potasio y el fósforo son dos elementos dominantes en la porción mineral. Los hongos contienen una porción sustancial de tiamina, riboflavina, niacina y de vitamina B2. En 100g de proteína cruda hay 32 a 48g de nueve aminoácidos esenciales. De estos, la lisina es la más abundante, mientras que las cantidades de triptófano y metionina son bajas (Chang & Miles, 2004).

Estudios realizados: Se determinó la composición química (materia seca, proteína cruda, grasa cruda, carbohidratos totales y cenizas) y componentes no volátiles (azúcares solubles, aminoácidos libres, y 50-nucleótidos) de 10 populares especies de hongos silvestres comestibles (Agaricus campestris, Boletus edulis, Calocybe gambosa, Cantharellus cibarius, Cornucopioides Craterellus, clypeatum Entoloma, Flammulina velutipes, Macroleptiota procera, Morchella elata y Pleurotus ostreatus). Se encontró que todas las setas investigadas son fuentes de proteínas e hidratos de carbono totales. Además, el contenido de grasa fueron muy bajos y B. edulis (19,87 mg/g) mostró la mayor concentración de aminoácidos (Beluhan & Ranogajec, 2011).

Se determinó el contenido mineral fósforo (P), hierro (Fe), calcio (Ca), zinc (Zn), magnesio (Mg), potasio (K), sodio (Na), cobre (Cu) y manganeso (Mn) de treinta hongos comestibles silvestres de Turquía. El contenido de potasio se encontró que era más alto que las de los otros minerales en todas las setas. Las concentraciones de K, P y Cu estaban en concentraciones más altas en Suillus granulatus (Gençcelep, et al., 2009).

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La composición antioxidante y propiedades de 18 setas portuguesas (Clitocybe alexandri, Glaucopus Cortinarius, hepatica Fistulina, Hydnum repandum, Hygrophoropsis aurantiaca, Hypholoma capnoides, Laccaria amethystina, Laccaria laccata, Lactarius aurantiacus, Lactarius salmonicolor, Lepista inversa, Lepista sordida, Mycena rosea, Russula delica, Russula vesca, Suillus collinitus, Suillus mediterraneensis, Tricholoma sulphureum) fueron evaluados, a fin de contribuir a la caracterización general de estos productos. Se evaluó la capacidad antioxidante reduciendo la potencia y la inhibición de la peroxidación de lípidos medida en soluciones de liposomas. Además, se determinó la composición de tocoferoles por HPLC- fluorescencia. Las setas analizadas contienen poderosos antioxidantes tales como fenoles (0.51- 7,90 mg / g) y tocoferoles (0,02-8,04 lg / g). β-tocoferol fue el que se detectó en cantidades mayores. Todas las especies demostraron tener actividad antioxidante siendo más significativo para H. aurantiaca (Heleno, et al., 2010).

Se evaluó la actividad antioxidante in vitro y la actividad inhibitoria de acetilcolinesterasa (IACE) en Ganoderma lucidum, Schizophyllum commune, Hericium erinaceus, mostrando una alta capacidad antioxidante y compuestos fenólicos entre 6.19 a 63.51 mg equivalentes a ácido gálico/g y G. lucidum fue el que presentó mejor actividad como IACE (Abdullah, et al., 2011).

Se evaluó la actividad antioxidante de tres hongos de Portugal, Leucopaxillus giganteus, Sarcodon imbricatus y Agaricus arvensis, los extractos metanólicos mostraron capacidad antioxidante, L. giganteus presentó mayor contenido de compuestos fenólicos y mejor actividad con una concentración media mucho menor (Barros, et al., 2007). Se evaluó el contenido nutricional de diferentes especies de macromicetos encontrando un alto contenido de proteínas, bajo en grasa, alto contenido en compuestos fenólicos, polisacáridos y minerales como selenio, zinc, calcio, hierro, manganeso, cobre, sodio, potasio, calcio, evidenciando un alto potencial como alimento y medicamento (Diéz and Alvarez, 2001; Agrahar-Murugkar & Subbulakshmi, 2005; Barros et a., 2008, Trimmel & Kluthe, 1998). Siete setas silvestres comestibles de consumo habitual en las colinas de Khasi de Meghalaya se analizaron para su contenido de seca materia, proteína cruda, grasa, fibra y cenizas junto con los minerales (Ca, P, Fe, Mn, Cu, Zn, Na, K, Mg y Se), ácido ascórbico y el perfil de

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aminoácidos esenciales. El perfil de macronutrientes en general reveló que las setas eran ricas fuentes de proteína y tenía bajas cantidades de grasa. En general, la mayoría de los hongos estudiados tenían una buena cantidad de minerales, incluyendo minerales traza. En promedio, fenilalanina fue el aminoácido limitante (0,9 lg%), mientras que la mayor cantidad de CEA presente en los hongos estudió era leucina (704 lg%). Una porción de los hongos estudiados (250 g peso fresco) contenía un promedio de 6,12 g de proteína, 287 mg de calcio, 9,3 mg de hierro y 3,72 mg de zinc. Más importante es que tenían niveles bajos de grasa (0,712 g) y sodio (0,077 mg) (Agrahar-Murugkar & Subbulakshmi, 2005).

Estudios en Guatemala: La producción total de hongos comestibles en Guatemala ha sido estimada en 132,104 kg por año, incluyendo A. bisporus y A. bitorquis (51.9%), L. edodes (25.7%), y Pleurotus spp. (22.4%) (De León, 2003).

En los años 2004-2005 se ejecutó el primer proyecto de hongos en las zonas tropicales del país: Análisis de la Distribución y Composición de la subclase Himenomicetes (Macrohongos) dentro de las Clases Vegetales propuestas para la zona de influencia del parque Nacional Laguna Lachúa Cobán, Alta Verapaz (Proyecto AGROCYT -016-2004). En este periodo se colectó un total de 2,652 especímenes, pertenecientes a 546 morfo especies, reportando 31 especies y 10 géneros nuevos para el país.

Quezada (2005) realizó un análisis de la diversidad y distribución de macrohongos del ordenes Agaricales y Aphylloporales, en relación con los paisajes antropogénicos en la zona de influencia del Parque Nacional Laguna Lachúa, Cobán, Alta Verapaz en el cual concluyó que las familias del orden Agaricales que presentan una mayor disminución de morfoespecies debido a los cambios antropogénicos en los microhabitats de la zona de influencia son: Tricholomataceae, Entolomataceae, Lepiotaceae y Agaricacea. Los géneros Panaeolus, Coprinus, Psilocybe (Agaricales) y Pycnoporus y Schizophyllum comune (Aphylloporales) también son considerados indicadores de áreas perturbabas, ya que es común encontrarlas en las clases vegetales cultivo, Guamil 1, Guamil 2, Potreo y Potrero y Potrero Enguamilado (Quezada, 2005)

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López (2009), realizó un estudio sobre la distribución de Macrohongos (Agaricomycetes) en remanentes de bosque de la zona de influencia del Parque Nacional Laguna Lachuá, Cobán Alta Verapaz. En el cual concluyó que los órdenes más abundantes en los remanentes de bosque son Agaricales y Polyporales, de los que las familias más abundantes son: Tricholomataceae con un 48.82% y Polyporaceae con 7.06% (Quezada et al., 2009).

Se evaluó la composición de nutrientes y el contenido de fenoles totales, flavonoides y vitamina C en el hongo Agrocybe cylindracea recolectado en cuatro lugares diferentes del departamento de San Marcos, Guatemala: Aldea Santa Irene, Aldea Santa Rita y Cantón Tojchiná, del municipio de San Antonio Sacatepéquez, y el caserío Monterrey, Aldea Santa Teresa, del municipio de San Pedro Sacatepéquez. El análisis proximal de la muestra de Agrocybe cylindracea mostró que el hongo contiene, en porcentaje calculado sobre la muestra seca, 19.23% de proteína, 14.57% de fibra cruda, 1.24% de grasa cruda, 10.97% de ceniza y 41.29% de carbohidratos totales (Pinagel, 2009).

Se realizó el estudio de seis especies de hongos comestibles Armillariella polymyces, Boletus edulis, Cantharelus lateritius, Neolentinus ponderosus, Lactarius deliciosus y Amanita garabitoana, la actividad antimicrobiana, larvicida y citotóxica fue pobre en las seis especies a excepción de Amanita garabitoana (extracto acuoso) quien mostró actividad contra Staphylococcus aureus y Escherichia coli. El hongo A. polymyces mostró actividad inhibitoria sobre el sistema de complemento con una CI50 de 1.37 μg/mL y el extracto acuoso de B. edulis fue el único que mostró actividad estimuladora de la linfoproliferación a una concentración efectiva mínima (CEM) de 125 μg/mL (Paz, et al., 2011).

Se realizó la determinación de actividad antioxidante de extractos acuosos y etanólicos obtenidos de las especies de basidiomicetos comestibles: Agaricus aff. bisporus (J.E. Lange) Imbach, Agaricus brunnescens Peck, Armillariella polymyces (Pers.) Singer & Clémençon, Amanita garabitoana Tulloss, Halling & G.M. Muell., Boletus edulis Bull., Cantharellus lateritius (Berk.) Singer, Laccaria amethystina (Huds.) Cooke, Lactarius deliciosus (L.) Gray, Neolentinus ponderosus (O.K.Mill.) Redhead & Ginns, Pleurotus ostreatus (Jacq.) P. Kumm. Se

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determinó por medio de todas la técnicas (cualitativa y cuantitativas) que todas las especies presentan alguna actividad antioxidante. Los extractos acuosos mostraron mayor actividad antioxidante que los extractos etanólicos en todas las técnicas cuantitativas utilizadas. La especie que mostró mayor actividad antioxidante tanto en su extracto acuoso como etanólico fue B. edulis (Belloso, et al., 2012).

I.2.2 Justificación del trabajo de investigación

Los hongos han sido utilizados como alimento y medicina tradicional desde épocas prehispánicas e incorporados en la dieta de diversos grupos étnicos (Guzmán, 2008b). Los hongos comestibles poseen altos contenidos de proteínas, carbohidratos y vitaminas, y bajos en grasas (Colak et al., 2009). Actualmente, el interés de los hongos comestibles ha crecido significadamente debido a que han demostrado propiedades nutrimentales y medicinales que han sido utilizadas en tratamientos terapéuticos (Barros et al., 2008).

Adicionalmente, los hongos comestibles son considerados un recurso forestal no maderable ya que contribuyen a la conservación de bosques, y forman parte de la estructura y funcionamiento de los mismos, estando entonces vinculados a la prestación de servicios forestales, tales como: recreación, captura de agua y carbono, conservación de la biodiversidad y ecoturismo (Pilz y Molina, 2002).

Sin embargo, pocos son los trabajos realizados sobre la importancia de los hongos comestibles en la medicina moderna y su potencial en cosmética o biotecnológico a través de la producción de bioinoculantes de árboles forestales. Por ello, el objetivo de este trabajo es identificar especies de hongos comestibles comercializados en Guatemala con potencial medicinal, económico y biotecnológico, como preámbulo del uso de un recurso forestal no maderable que puede incorporarse en el desarrollo sustentable en las comunidades rurales y proponer un producto para darle valor agregado.

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I.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS

I.3.1 Objetivos

I.3.1.1 General Evaluar la actividad biológica, composición nutricional y química de cinco macromicetos para su aprovechamiento y conservación en el desarrollo como posibles alimentos funcionales, nutraceúticos, productos medicinales y cosméticos.

I.3.1.2 Específicos Caracterizar cinco basidiomicetos mediante estudios fitoquímicos para determinar su potencial medicinal en base a los metabolitos primarios y secundarios detectados.

Evaluar la actividad biológica de cinco basidiomicetos mediante técnicas in vitro como posibles agentes antioxidantes, antimicrobianos, antiureasa y citotóxicos para el desarrollo de productos medicinales y cosméticos.

Determinar la composición nutricional de cinco especies de basidiomicetos para seleccionar la especie más promisoria en el desarrollo de un producto con fines nutricionales, medicinales o cosméticos.

Diseñar y formular un producto en base a las especies de basidiomicetos más promisorios para su aplicación y posible comercialización.

Divulgar a las autoridades, actores sociales e instituciones en el campo de su competencia la información obtenida de la investigación.

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I.3.2 Hipótesis Al menos una de las especies de basidiomicetos presentan actividad biológica interesante para la propuesta de un producto.

I.4 METODOLOGIA I.4.1 Localización El proyecto se desarrolló en el Laboratorio de Investigación de Productos Naturales, en el Edificio T-10 laboratorio 106, ciudad Universitaria zona 12, ciudad de Gutemala. Las colectas se realizaron en cuatro departamentos de Guatemala los cuales fueron: San Marcos, Chimaltenango, Alta Verapaz y Sacatepéquez

I.4.2 Las Variables I.4.2.1 Variables dependientes Actividad biológica Tamizaje fitoquímico

I.4.2.2 Variables Independientes Extractos

I.4.3 Indicadores Extracción: rendimientos de extractos Actividad antioxidante: Inhibición de radical Tamizaje fitoquímico: presencia o ausencia de metabolitos Cuantificación de flavonoides y fenoles totales Análisis de minerales y azúcares Análisis proximal Citotoxicidad Actividad antibacteriana Actividad antitirosinasa Producto elaborado

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I.4.4 Estrategia Metodológica

I.4.4.1 Población y Muestra

Selección de las especies: Mediante criterios etnomicológicos y ecológicos (abundancia relativa de una especie determinada), se seleccionaron cinco macromicetos que se distribuyen en mercados locales o se cultivan en áreas rurales (Boletus edulis, Agaricus brunnescens, Amanita caesarea complex, Cantharellus lateritus, Armillaria polymyces y Ganoderma lucidum), los cuales en estudios anteriores mostraron la mejor actividad biológica para continuar con estudios de caracterización, explorar otras actividades y proponer un producto.

I.4.5 El Método La obtención y colecta del material se llevó a cabo en los lugares donde se encuentre en mayor abundancia el basidiomiceto seleccionado y donde se comercializa o cultiva. El material fue identificado por los especialistas de la Escuela de Biología y Química Biológica de la USAC. Se obtuvo una muestra representativa de cuando menos 250-500 g de material de los cuales se llevó a cabo la extracción y pruebas de laboratorio (estudio fitoquímico y ensayos biológicos).

Procesamiento y embalaje de las muestras: Las muestras fueron procesadas conforme a técnicas convencionales de secado y molienda. El almacenamiento, embalaje y transporte se realizó conforme a los principios botánicos aceptados.

6.7.3 Extracción: Del material vegetal a trabajar se obtuvieron extractos, siguiendo el método de extracción por percolación y concentración por rotaevaporador. Se realizó la extracción con un disolvente polar (agua y/o etanol), de acuerdo a protocolos establecidos de acuerdo a la actividad a evaluar.

6.7.4 Caracterización Química:

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El tamizaje (screening) fitoquímico es una de las etapas iniciales de la investigación fitoquímica, que permite determinar cualitativamente los principales grupos de constituyentes químicos presentes en una planta y a partir de allí, orientar la extracción y/o fraccionamiento de los extractos para el aislamiento de los grupos de mayor interés. Consiste en la extracción de la planta con disolventes apropiados y la aplicación de reacciones de coloración y análisis por cromatografía en capa fina. Debe permitir la evaluación rápida, con reacciones sensibles, reproducibles y de bajo costo.

Investigación de alcaloides: Ensayos macro y semimicro: Se pesó 1 g de material vegetal. Se agregaron 2 gotas de solución de hidróxido de amonio al 10% (p/v), luego se añadió 25 mL de metanol a 60°C. Se filtró con papel filtro Whatman 1 y acidificó el filtrado con ácido clorhídrico 2 N. La solución resultante se dividió en 4 tubos y evaluó de la siguiente manera:

Tubo 1: Se agregó 5 gotas del reactivo de Mayer’s. (Color blanco a crema). Tubo 2: 5 gotas del reactivo de Dragendorff. (Color rojo a naranja). Tubo 3: 5 gotas del reactivo de Wagner. (Color marrón). Tubo 4: testigo. Se utilizó como estándar soluciones al 1% de atropina y papaverina. Se observó durante 2 horas la existencia de precipitados, turbidez o precipitación de complejos en los tubos.

Cromatografía en capa fina: Se pesó 1 g de material vegetal seco y molido, se agregó 1 mL de hidróxido de amonio al 10% (p/v) y se extrajo con 5 mL de metanol. Se colocó en baño maría a 60°C durante 5 minutos. Se filtró y concentró. Se aplicó en una placa de silica gel 60 F254, utilizando como estándar una solución de atropina y papaverina al 1 % en metanol (10 μL). Fase móvil: tolueno-acetato de etilo-dietilamina (70:20:10); acetato de etilo-metanol-agua (100:13.5:10), cloroformo- dietilamina (90:10); acetona-agua-amonio concentrado (90:7:3) Detección: Sin tratamiento químico: UV 254nm fluorescencia, UV 365 nm algunos fluorescen azul o amarillo. Reactivo de Dragendorff: zonas cafés o naranjas en vis, los colores no son estables.

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Investigación de flavonoides y antocianinas: Ensayos macro y semimicro: Se extrajo 3 g de material vegetal pulverizado con 10 mL de etanol al 80 %, se filtró y concentró. Se enfrió a temperatura ambiente y se trituró el residuo con 15 mL de éter de petróleo hasta que la extracción fue incolora. Se disolvió el residuo con 30 mL de etanol al 80 %, se filtró y se dividió en 5 tubos:

Tubo 1: Se agregó 0.5 mL de ácido sulfúrico concentrado. Tubo 2: 3 a 5 gotas de cloruro férrico al 10 % (p/v). Tubo 3: 0.5 mL de ácido clorhídrico concentrado y se calentó en baño de maría por 5 minutos (prueba para leucoantocianinas). Tubo 4: magnesio metálico y 0.5 mL de ácido clorhídrico concentrado. Tubo 5: álcali a un extracto acuoso. Tubo 6: solución de ácido bórico en anhídrido acético. Tubo 7: testigo.

Se evaluaron las reacciones, cambios de color y/o formación de precipitado comparados con el testigo. Desarrollo inmediato de color flavonas y flavonoles (amarillo a rojo), flavanonoles (rojo a magenta), flavanonas (rojo, magenta, violeta, azul), isoflavonas (amarillo); isoflavononas, chalconas y auronas no dan coloración.

Cromatografía en capa fina: Se extrajó 1 g de material vegetal seco pulverizado con 10 mL de metanol por 5 minutos en baño de maría a 60°C. Se filtró la solución y se aplicó sobre las cromatoplacas de silica gel 60 F254. Como estándar se utilizó una solución de flavonoides al 0.05 % en metanol (10 μL). (Quercetina, rutina, ácido clorogénico, hiperósido). Fase móvil: acetato de etilo-ácido fórmico-ácido acético glacial-agua (100:11:11:27), n-butanol-ácido acético-agua (40:10:50); acetato de etilo-ácido fórmico-ácido acético glacial-etilmetilcetona-agua (50:7:3:30:10) Detección: Sin tratamiento químico: UV 254nm fluorescencia, zonas azules o amarillas. UV 365 nm, dependiendo la estructura fluorescen amarillo, azul o verde. Reactivo de Productos Naturales (NP/PEG). Fluorescencia intensa en UV-365 nm. Solución 1: solución metanólica al 1 % de difenilboriloxietilamina (NP). Solución 2: solución etanólica al 5 % de polietilenglicol 4000 (PEG).

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Investigación de cumarinas: Ensayos macro y semimicro: Se midió 5 mL de extracto vegetal metanólico, se agregó 1 mL de agua destilada hirviendo. Con un capilar se aplicaron 2 manchas en papel filtro. A una mancha se agregó 1 gota de hidróxido de potasio 0.5N, y se observó bajo luz UV de 365 nm (fluorescencia azul o verde: positivo). Cromatografía en capa fina: A 1 g de material vegetal se adicionó 10 mL de metanol y calentó 30 minutos en baño de maría. Se filtró y evaporó hasta 1 mL. Se aplicó 20 μL en una cromatoplaca de sílica gel 60 F254, se utilizó como estándar canela en metanol al 1 %, umbeliferona, ácido p-cumárico, cumarina.). Fase móvil: tolueno-acetato de etilo (93:7); tolueno-éter (1:1 saturado con 10% de ácido acético, 50 mL de tolueno y 50 mL de éter son mezclados durante 5 min con 50 mL de ácido acético al 10%, se filtró y se descartó la fase de abajo, y la mezcla de tolueno-éter). Detección: Sin tratamiento químico UV 254nm fluorescencia. UV 365 nm todas las cumarinas muestras una intensa fluorescencia azul o verde- azul. Solución etanólica de hidróxido de potasio al 5 o 10%. UV-365 nm fluorescencia azul o verde.

6.7.5 Evaluación de la actividad antioxidante: Método de por cromatografía en capa fina para evaluar la actividad atrapadora de radicales por DPPH: Se aplicó 10 μL de muestra y 5 μL del estándar antioxidante terc-butilhidroquinona (TBHQ) en una placa cromatográfica de silica gel 60F254. Se colocó la placa en una cámara de vidrio saturada previamente con acetato de etilo:ácido acético:ácido fórmico:agua (100:11:11:26). Se secó y asperjó con DPPH (1mg/mL en metanol). Resultados: Si los extractos presentan actividad antioxidante se observa la decoloración del DPPH en las bandas respectivas.

Método colorimétrico: DPPH es un radical libre utilizado para evaluar la actividad atrapadora de radicales de un compuesto o extracto vegetal (Ravishankara et al., 2002). Se preparó una serie de cuatro tubos de reacción por ensayo. Al primer tubo que es el blanco del control se le agregó 1 mL de una solución tampón de acetato y 2 mL de metanol. Al segundo tubo control, se le agregó 1 mL de tampón de acetato, 1.5 mL de metanol y 0.5 mL de solución metanólica de DPPH (0.0219 % p/v). Al tercer tubo, blanco del ensayo, se le agregó 1 mL de tampón de acetato, 1.4 mL de metanol, 0.1 mL de extracto de la muestra y 0.5 mL de solución de DPPH. Al cuarto tubo,

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ensayo, se le agregó 1 mL de tampón de acetato, 1.4 mL de metanol, 0.1 mL del extracto y 0.5 mL de solución de DPPH. Se realizó la lectura de la absorbancia en un espectrofotómetro (517 nm) contra el blanco respectivo. Se calculó el portentaje de disminución de la abs causado por el extracto (Abs b control–Abs e)/Abs control * 100 = % dis Abs. Se graficó la concentración del extracto (eje x) vrs % dis Abs (eje y). Se interpola el valor de CI50. La actividad antioxidante se expresa en términos de la concentración de inhibición al 50% (CI50) que es la concentración del extracto requerida para disminuir un 50% la absorbancia de DPPH (Lima, 2003).

Determinación del Poder Reductor de Hierro: Se disolvió 20mg de extracto metanólico y/o diclorometanico en 1ml de metanol. Se disolvió 15μg de ácido ascórbico en 1ml de agua destilada. Se mezcló 1ml del extracto, 1mL de tampón de fosfato (0.2M, pH 6.6) y 1mL de ferrocianuro de potasio (1%). Se incubó 20min a 50°C. A la mezcla reaccionante, se adicionó 1mL de ácido tricloroacético (10% p/v). Se centrifugó a 3000 rpm (10 min). Se mezcló 1.5mL del sobrenadante de la solución, 1.5mL de agua destilada y 0.375mL de cloruro férrico (0.1%). Se midió la absorbancia a 700nm Cálculos: ((Abs control-Abs Mx)/Abs control)*100 (Kosem & Moongkarndi, 2007).

Decoloración del radical catiónico del reactivo ácido 2,2’-azinobis-(acido-3- etilbenzotiazolina -6-sulfónico) ABTS. El procedimiento se basó en lo descrito por Re et al. (1999) y Vasco, Ruales & Kamal-Eldin, (2008) con algunas modificaciones. Se preparó el catión ABTS+ con la mezcla de la solución ABTS (7mM) y la solución de persulfato de potasio (2.45mM) con 18h previas de incubación. Luego se diluyó en etanol al 95% (1:30) a manera de obtener una absorbancia (Abs) de (0.70 ± 0.2) en una lectura en el espectrofotómetro a 734nm. La solución de trabajo se incubó durante 30 min a temperatura de 30°C. La dilución del extracto (3µL) se mezcló con 3mL de la solución de trabajo de ABTS. Se leyó la Abs en el espectofotómetro a 734nm en el minuto 1, 4 y 6 de la misma muestra de extracto. Se calculó el % Inh de la Abs por medio de la ecuación (1). Se interpretó según el valor de CI50, es decir, la concentración del extracto requerida para disminuir un 50% la absorbancia de ABTS. Los resultados se expresaron en TEAC (actividad antioxidante equivalente a Trolox), ya que representa la concentración de solución de Trolox que tiene la misma capacidad antioxidante que el extracto.

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Cuantificación de fenoles totales: Se realizó según la metodología de Lima (2003) con algunas variantes, utilizando el reactivo de Folin-Ciocalteu. Se preparó una curva patrón con 4mL de ácido gálico disuelto en agua (1:10) en concentraciones de 0.625-6.25mg/mL. Se agregó un blanco con 4.0mL de agua, 0.4mL de reactivo de Folin-Ciocalteu y 0.8mL de Na2CO3 al 10%. Se prepararon dos tubos de muestra del extracto, en el primer tubo se agregó 3.95mL de agua,

0.4mL de reactivo de Folin-Ciocalteu, 0.8mL de Na2CO3 al 10% y 50µL de muestra; al segundo tubo se agregó 3.90mL de agua, 0.4mL de reactivo Folin-Ciocalteu, 0.8mL de Na2CO3 al 10% y 100µL de muestra. Los tubos de reacción se agitaron en un vortex durante 30 seg, se calentaron de 90-100°C por 1 min. y se enfriaron. Se realizó la lectura en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 765nm. La cantidad de fenoles totales se expresó como µg equivalentes de ácido gálico por mg de extracto.

Análisis de Minerales: Se realizó una digestión con ácido sulfúrico y ácido nítrico y se calentó hasta que su contenido se torna de color negro. Posteriormente se realizó la digestión con ácido perclórico. Se realizó la lectura de las muestras en un espectrofotómetro de absorción atómica. Como control y aseguramiento de la calidad de la técnica se prepararon soluciones estándares de 1 ug/ml de los minerales a analizar a partir de una solución patrón de 100 ug/ml para construir una curva de calibración del equipo (Valenzuela, 2008).

Azúcares solubles en agua (Mono-, Oligo-, y Polisacáridos): Son de importancia por su actividad inmunomoduladora reportada en diversos géneros de hongos. Se realizó una hidrólisis ácida con TFA 2M a 100°C por 10 h. El producto, evaporado a temperatura ambiente, se disolvió con agua y se aplicó en la cromatoplaca y se reveló con nitrato de plata para detectar las manchas de carbohidratos o bandas (Waksmundzka-Hajnos, 2008)

Composición de Azúcares por medio de HPLC: El polvo seco (1.0g) se extrajo con 40mL de etanol al 80% por 30 min. La suspensión resultante se centrifugó a 15,000g por 10 min. El sobrenadante se concentró a 60°C a presión reducida y se desengrasó tres veces con éter etílico. Luego se concentró a 40°C, los residuos sólidos se disolvieron con agua para dar un volumen

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final de 5mL. Los azúcares solubles se determinaron utilizando HPLC, con una fase móvil de acetonitrilo:agua 7:3 (v/v) a un flujo de 1.25mL/min. Los resultados se expresaron en g/100g del peso seco, calculados como la normalización interna del área del pico. La identificación de los azúcares se realizó comparando los tiempos de retención relativos de las muestras con los de los estándares de diferentes azúcares (Barros et al, 2008,)

Análisis de Proteínas: Se redujo el tamaño de partícula utilizando un mesh-20. Las muestras para el análisis deben de ser homogéneas. No se requiere ninguna otra preparación especial.

Digestión: Se colocó la muestra (exactamente pesada) en un matraz Kjeldahl. Se añadió ácido sulfúrico (2.5mL) y la mezcla catalizadora (1.0g). Sulfato de amonio no volátil se forma de la reacción del nitrógeno con el ácido sulfúrico.

Neutralización y Destilación: El digerido se diluyó con agua. Un álcali que contiene tiosulfato de sodio se agregó para neutralizar el ácido sulfúrico. El amoniaco formado se destiló a una solución de ácido bórico que contiene los indicadores azul de metileno y rojo de metilo (AOAC Method 991)

6.7.6 Determinación de la bioactividad: Ensayo contra Artemia salina (camarón salino): La A. salina es un crustáceo cuyas larvas (nauplios) son sensibles a gran variedad de sustancias, la citotoxicidad de extractos sirve para dirigir el fraccionamiento bioguiado en forma rápida y simple, es una prueba útil aunque no es selectiva para ninguna molécula química.

La técnica consistió en la preparación de un medio salino adecuado, la colocación de huevos del crustáceo en dicho medio y eclosión. Se transfirió la mayor cantidad de nauplios vivos a un erlenmeyer con medio salino fresco. Se prepararon para cada sustancia de prueba 3 niveles de dilución (1000, 500 y 250 μg) y se colocaron por triplicado en 9 pozos de la microplaca, haciendo un volumen total por pozo de 100 μL de solución a ensayar. Posteriormente se agregaron a cada pozo 100 μL de medio salino conteniendo de 10 a 15 nuplios y 100 μL de medio salino. Se

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utilizaron 3 pozos como controles negativos los que se preparan en forma similar, utilizando como sustancia de prueba el medio de disolución de los extractos. Después de 24 horas se procedió a contar el número de sobrevivientes en cada dilución, del que por diferencia con el valor inicial, se calculó el número de muertos observados. La Concentración Letal Media (CL50) se calculó mediante una regresión no paramétrica utilizando el programa Finney para Basic.

Actividad antibacteriana: La medición de esta actividad se realizó por métodos de dilución, que sirve tanto para el tamizaje como para determinar la concentración inhibitoria mínima (CIM) que se requiere del agente antimicrobiano para inhibir al microorganismo. La CIM es la concentración más baja en la que no hay crecimiento visible en agar (placa), está basado en el descrito por Mitscher et al. (1972).

Se midió por el crecimiento de bacterias inoculadas en superficie de medios conteniendo moléculas bioactivas. El procedimiento ofrece una distribución homogénea del compuesto en el agar que consiste en preparar cajas de Agar Muller-Hinton (AMH) con 1.0 mg/mL del extracto (AMH-E). Se inocularon las bacterias en caldo, se incubaron 24 horas a 36°C, se diluyó 1:100 en agua destilada estéril, se inoculó con estrías por cuadruplicado (error < 0.05) en la superficie de AMH-E e incubó a 36°C por 24 horas. Este procedimiento se aplicó a levaduras, diluyendo el inóculo 1:10 e incubando a 48 horas. Se evaluó el crecimiento de bacterias (-) o su inhibición (+). Para la CIM se utilizaron diluciones decrecientes (1, 0.5, y 0.25 mg/mL), se consideran positivos los extractos activos a concentraciones <1 mg/mL. El tamizaje se efectuó con las siguientes cepas de microorganismos: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Salmonella typhi ATCC 14028, Mycobacterium smegmatis ATCC 607, Bacillus subtilis ATCC 6051, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Candida albicans ATCC 10231 y Cryptococcus neoformans C 13.

Actividad anti tirosinasa por cromatografía en capa fina Preparación de muestra y controles: Se disolvió 20mg de cada extracto metanólico y/o diclorometano en 1ml de acetona grado analítico (98%), se disolvió 1mg de ácido kojico en 1ml de agua destilada.

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Actividad: Se saturaron las cámaras cromatográficas con la fase móvil 20min antes de someter las placas. En la placa de silica gel se aplicaron 10μl de muestras y 5μl del control. Se dejó secar al aire las placas. Se colocaron las placas y se dejó eluir, posteriormente se roció L-tirosina (2mM). Se incubó a 25 ˚C por 10 min. Seguidamente se roció la placa con solución de tirosinasa (enzima) e incubó a 25˚C por 30 min. Se observó la coloración gris-purpura en la placa y zonas claras donde hubo inhibición de la enzima (Momtaz, et al., 2008).

Determinación por medio de ácido kójico (por espectrofotometría): Se disolvió 0.20 mg de L- tirosinasa en 10 mL de tampón de fosfatos, 20 mg de extractos y compuestos purificados en DMSO hasta obtener concentraciones de 25-400 μg/mL. Se aplicaron 70 μL de extractos y estándar + 30 μL de tirosinasa en placa de microtitulación de 96 pocillos. Se incubó a 37˚C por 60 min. Se añadió 110 μL del substrato (2 mM L-tirosina), e incubó a 37˚C por 15 min. Se midió el cambio de absorbancia a 492 nm y se calculó el porcentaje de inhibición.

Propuesta de un producto: Se seleccionó la especie más promisoria con mejores resultados de acuerdo a su análisis nutricional, capacidad antioxidante, antibacteriana, para la propuesta de un producto.

I.4.7 Los Instrumentos a utilizar Se utilizaron cuadernos para el registro de las actividades realizadas diariamente y resultados obtenidos, además de la documentación registrada en la bitácora del laboratorio. Se elaboraron informes mensuales y trimestrales para indicar el avance de la investigación. Se utilizó el equipo, materiales e infraestructura del Laboratorio de Investigación de Productos Naturales de la Facultad de Ciencias Química y Farmacia, para los análisis fitoquímicos, fisicoquímicos y espectrofotométricos y la evaluación de la actividad biológica.

I.4.8 Cronogramas

I.4.8.1 Cronograma de Actividades

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En la siguiente tabla se describen las actividades realizadas por trimestre.

Tabla 1. Cronograma de Actividades Actividades I II III IV V VI VII VIII Colecta del X x X material fúngico Secado y X x X molienda Extracción de x X x aceites esenciales Obtención de x X x x extractos etanólicos Caracterización x X fitoquímica Análisis x x X nutricional (azúcares y proteínas) Análisis de X x oligoelementos Evaluación de x x actividad antioxidante y antitirosinasa Evaluación de x x X actividad antibacteriana Evaluación de X x x actividad citotóxica Desarrollo de x x x producto Análisis e x interpretación de resultados

I.4.8.2 Cronograma de Desembolsos

La ejecución financiera del proyecto se realizó mediante presentación de requisiciones de compra y presentación de solicitudes de honorarios, hubo dificultad en la ejecución por el cambio de fideicomiso y falta de disponibilidad financiera por parte del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología por lo que no se logró la ejecución del 100%. La presentación de solicitudes de pagos

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a investigadores fue de forma trimestral, aunque los pagos no fueron realizados continuamente de manera trimestral, respecto a las compras aunque se presentaron las solicitudes en tiempo no hubo un proceso de seguimiento y control por lo que se compraron cuando había disponibilidad de fondos de una manera muy irregural y atrasada. A continuación se presenta el cronograma trimestral de compras y honorarios que en la mayoría de casos no fue posible su cumplimiento en el tiempo establecido

Tabla 2. Cronograma de ejecución financiera

I II III IV V VI VII VIII Pagos a X X X x x x x investigadores y auxiliares Compra de X x x reactivos y disolventes Compra de X x x útiles menores, suministros Compra de x equipo Alimento para x personas (actividad de capacitación)

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PARTE II

MARCO TEÓRICO

Los hongos (reino Fungi) son un grupo muy diverso de individuos con un papel ecológico importante como descomponedores de materia orgánica y simbionte de plantas vasculares (Guzmán, 1998). Contribuyen a la formación del suelo y al reciclaje de elementos en los ecosistemas. Se desarrollan en climas ecuatoriales subtropicales o tropicales, templados y aún en los fríos; y desde el nivel del mar, hasta altitudes de 4,000 msnm (Herrera, 1990).

Son organismos unicelulares o pluricelulares que se alimentan mediante la absorción directa de nutrientes presentes en su sustrato, junto con las bacterias, los hongos son los causantes de la putrefacción y descomposición de toda la materia orgánica (Herrera, 1990). Por su tipo de nutrición, que consiste en absorción a través de la membrana celular, depende íntimamente del sustrato donde viven y desdoblan materiales orgánicos tan complejos como lignina, celulosa y quitina (Guzmán, 1998).

Los hongos desempeñan una función importante en el equilibrio ecológico de la naturaleza en muchos aspectos. Los hongos simbióticos son indispensables para el buen desarrollo de muchas plantas, las que no prosperarían sin su asociación en forma de micorrizas. Los saprófitos, utilizan sustancias orgánicas inertes, muchas de ellas en descomposición, que pueden ser reservadas de otros organismos, productos de excreción y excrementos o restos de animales o vegetales. Otros hongos son parásitos que se desarrollan en otros organismos vivos. (Guzmán, 1998)

El grupo de los hongos se considera el segundo taxón más diversos, después de los insectos y el menos estudiado, estimándose que solamente se conoce el 4.6% de la diversidad mundial (Hawksworth et al., 1995). Tiene aproximadamente 103 órdenes, 484 familias, 4,979 géneros y unas 100,00 especies descritas (Alexopoulos, et al., 1996). Actualmente, se estima que el reino Fungi está constituido por 1.5 millones de especies, solo 70.000 de ellas han sido descritas, cerca del 50% de las especies de hongos existentes son comestibles en diferentes grados, y de los hongos descritos a nivel mundial, alrededor del 32% corresponden a hongos Basidiomicetos (Peng, y otros, 2017) Más de 3000 especies están 20

distribuidas en 31 géneros que son considerados como hongos comestibles primarios. De las 14.000 especies conocidas de hongos que son producidas a nivel industrial, 650 son medicinales con una amplia variedad de beneficios para la salud, pero solo 10 especies de estas son cultivadas a escala comercial. Alrededor del 10% de las especies conocidas pueden llegar a poseer componentes venenosos y 30 especies son consideradas letales. (Khatun, Islam, Cakilcioglu, & Chatterjee, 2012) (Sharma, 2015) (Linde, Luciani, Lopes, Silveira do Valle, & Colauto, 2017)

Los macromicetos son un gran grupo de macrohongos muy diversos y de gran importancia en la naturaleza debido a su papel dentro del ciclo del Carbono, y en la degradación de materiales recalcitrantes. Este grupo se compone de dos subdivisiones, los Basidiomicetos y los Ascomicetos, quienes tienen una distribución cosmopolita, encontrándose principalmente en lugares donde haya material orgánico en descomposición y agua, a una temperatura cercana a los 25°C. Los macromicetos tienen un ciclo celular que implica la formación de esporangios sexuales, en el caso de la subdivisión Ascomicotina son llamados Ascas, los cuales generan esporas conocidas como ascosporas. La unión de ascas conforma el cuerpo fructífero (Ascocarpos) de los Ascomicetos. En la subdivisón Basidiomicotina se representan hongos que en su ciclo biológico forman esporas conocidas como basidiosporas, las cuales a su vez son desarrolladas en los cuerpos fructíferos de los Basidiomicetos, conocidos como Basidiocarpos. (OrtizMoreno, 2010) Dichos hongos son considerados medicinales gracias al valor nutricional que exhiben por su alto contenido de carbohidratos, proteínas, aminoácidos libres, vitaminas, minerales esenciales y algunos elementos trazas. Además de esto son utilizados en la medicina por ser ricos en metabolitos secundarios como lectinas, compuestos fenólicos y polifenólicos, terpenoides, polisacáridos, entre otros. (Elsayed A, Enshasy, Wadaan, & Aziz, 2014) Igualmente presentan enzimas que tienen diferentes aplicaciones biológicas, como enzimas antioxidantes y enzimas lignolíticas que son de gran importancia biotecnológica, pues estas últimas logran degradar compuestos aromáticos, una vez el hongo que las excreta logra crecer en presencia de un sustrato recalcitrante. Algunas especies de estos hongos son empleadas en la industria y la medicina, por ejemplo, debido a sus componentes activos, caso especial de Psilocybe, hongo rico en Psilocibina, sustancia de acción psicotrópica que ocasiona alucinación a consumidores de este, y que ha sido utilizado desde tiempos prehispánicos. (Ortiz-Moreno, 2010)

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Los hongos constituyen un grupo de microorganismos de gran interés económico, industrial, y científico. Son organismos heterótrofos, por lo que la absorción de nutrientes es por vía saprofítica o como parásitos facultativos u obligados. Como saprofitos Intervienen en los ciclos naturales de circulación de nutrientes, destruyen plantas y restos de animales degradándolos a formas químicas simples, que posteriormente pasan a formar parte del suelo siendo absorbidas por las plantas. A esta actividad de los hongos es atribuible la mayor o menor fertilidad de la tierra; aunque el crecimiento saprofito de los hongos también puede ser dañino y causar numerosas pérdidas si ocurre en alimentos u otros artículos comerciales e industriales, como en el caso de la descomposición y generación de compuestos carcinogénicos como las micotoxinas en los cereales. Sin embargo, estos organismos también tienen múltiples beneficios, algunos de ellos en la alimentación y salud, al ser usados en procesos fermentativos de índole industrial como la elaboración de pan, quesos, cervezas, vinos, producción de antibióticos, enzimas, hormonas, proteína unicelular, inmunomoduladores, vitaminas y ácidos orgánicos; mientras que como parásitos, los hongos enferman a plantas, hombres y animales, la mayor parte de esos males son menos graves que los causados por otros microorganismos.

Los hongos son organismos eucariotas, pluricelulares o unicelulares, acidófilos, aerobios, anaerobios facultativos, con temperaturas de crecimiento en intervalos que comprenden entre los 0°C y 55ºC. La mayoría son inmóviles pero pueden tener células reproductoras móviles, no poseen clorofila por lo que no realizan fotosíntesis, siendo entonces quimiorganotróficos y requiriendo para ello de compuestos orgánicos como fuente de carbono y energía. Sus cuerpos son alargados o filamentosos, generalmente ramificados, de entre 5 a 10 µm de grosor, su reproducción puede ser de manera sexual o asexual llevando a la formación de esporas (cuyas características son importantes para la clasificación de los hongos), aunque en las levaduras este fenómeno se lleva a cabo mediante un proceso de gemación. Los filamentos poseen una pared celular la cual es de importancia taxonómica y antigénica, constituida por diversos compuestos, entre ellos polisacáridos como la quitina (N-acetil glucosamina); los cuales le confieren a esta una determinada rigidez. Los organismos fúngicos pueden ser afectados en su forma de crecimiento (levaduriforme, micelial, algodonosa entre otras) principalmente en los patógenos, al

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ser expuestos a diferentes condiciones de estrés ya sea nutricional o ambiental generando fenómenos de crecimiento como el dimorfismo bifásico y pleomorfismo. La mayoría de los hongos están formados de estructuras filamentosas alargadas llamadas hifas, las cuales son consideradas su unidad estructural y funcional que durante el crecimiento se incrementan en número y tamaño, formando el micelio, el cual de acuerdo a la función que realice puede ser considerado vegetativo (penetrando en el sustrato con la finalidad de absorber y transformar nutrientes) o reproductor (habitualmente extendiéndose en el aire y manteniendo las estructuras especializadas para la generación de esporas)

En la cultura medicinal tradicional China los hongos han sido utilizados abundantemente por siglos, para tratar condiciones como dolores regulares, fatiga asociada al envejecimiento celular, problemas cardiacos, enfermedades en los pulmones y parásitos intestinales, caso específico donde es utilizado el hongo Lentinula edodes (Shitake). Y si bien en varias culturas del mundo los macrohongos son empleados de manera empírica por conocedores de los mismos, existe también información científica que soporto el hecho de que varias de las condiciones mencionadas anteriormente en realidad pueden mejorar con el consumo regular de ciertos hongos o sus extractos. En especial, el hongo L. edodes ha sido estudiado a profundidad, y más puntualmente las propiedades de los compuestos químicos que lo conforman.

En un estudio presentado por el Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC, 2015), se menciona que la Lentina extraída del Skitake actúa como un adyuvante que estimula la producción de anticuerpos en ratones inyectados con una vacuna contra la Hepatitis B. Por otro lado, el hongo de repisa Ganoderma lucidum, conocido como Lingzhi en China y Reishi en Japón, es uno de los hongos medicinales más populares y tradicionales del mundo entero. Tal como con el hongo Shitake, se cree que el hongo Reishi puede ser empleado para tratar cáncer, problemas cardiovasculares y diabetes. A pesar de estas afirmaciones, es apresurado asegurar que estas especies pueden mejorar dichas condiciones, sin embargo, según investigaciones conducidas en otros hongos como Inonotus obliquus y Grifola frondosa, por lo menos es posible mencionar que todos ellos estimulan el crecimiento celular en cultivos de tejidos. (Money, 2016)

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Los estudios de hongos en Guatemala se clasifican en cuatro grupos: inventarios, taxonomía, etnomicológicos y ecológicos.

Estudio de Inventario: La primera colecta de macrohongos del país fue realizada por Sharp en 1948. Este autor citó diversas especies silvestres de venta en los mercados, como Amanita caesarea, Cantharellus cibarius y Schizophyllum commune (Sharp, 1948). En 1964, Lowy reportó 8 especies nuevas del orden Tremellales, asi como un género nuevo de la familia Tulasnellaceae (Morales, 2001). En 1983, Argueta reportó 27 géneros y 45 especies para los municipios de Mixco y San Juan Sacatepéquez (Argueta, 1993). En 1984, Sommerkamp publicó un trabajo sobre los macromicetos del Biotopo Universitario “Lic. Mario Dary Rivera” para la conservación del Quetzal, en Purulhá Baja Verapaz; reportando 51 géneros y 89 especies (Sommerkamp, 1984). En 1988 Sommerkamp realizó el estudio “Hongos Comestibles en los Mercados de Guatemala” apoyada por la Dirección General de Investigación (DIGI). El trabajo de Sommerkamp permitió la estandarización de la micoteca, el enriquecimiento de la biblioteca de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, la producción de material gráfico y la creación de la línea para la micología nacional. Sommerkamp encontró 21 especies comestibles pertenecientes a 17 géneros y 12 familias distintas (Sommerkamp, 1984).

En 1993, Aguilar realizó un estudio de macromicetos en la finca San Luis, en Escuintla, reportando géneros como Auriculara, Trametes, Trichaptum, Cantharellus, Pleurotus, Polyporus, Collybia, Higrophoropsis, Dacryopinax, Geastrum y Stereum entre otros (Aguilar, 1994). En 1995, Fuentes realizó una caracterización de macromicetos en el Astillero Municipal de San Pedro Sacatepéquez, San Marcos. En este estudio se reportó 23 géneros y 12 nuevos registrados para Guatemala (Fuentes, 1996).

Rizzo, en 1999 reportó 28 géneros y 37 especies para el parque Arqueológico Tikal Petén, de las cuales 20 especies constituyen nuevos registros para Guatemala (Rizzo, 1999). En el año 2000, Flores y Simonini, publicaron un artículo sobre Boletales de Guatemala en el que se enlistó 9 especies pertenecientes a 6 géneros, nombrando dos especies nuevas para la ciencia (Flores &

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Simonini, 2000). En el 2001, Márquez realizó un estudio de macromicetos en la Finca Aprisco, en Totonicapán, donde reportó 29 géneros y 5 nuevos registros para el país (Márquez, 2001).

Estudios Etnomicológicos:

Etnomicología se puede definir como un área de la etnobiología interesada en el estudio de las interrelaciones del hombre con los hongos que se desarrollan en su entorno, haciendo referencia a la influencia que estos organismos han tenido en las expresiones culturales del hombre a través del tiempo y en diferentes regiones geográficas (Estrada, 1989).

Los estudios etnomicológicos son los que más se han realizado en Guatemala especialmente en el área occidental del país. En 1970, Lowy publicó varios artículos haciendo referencia a las piedras hongo, que habían sido descritas previamente por Sapper en 1898 y por Borhegyi en 1957. En 1972, Lowy documentó el simbolismo de los hongos en algunos códices Mayas. Toda esta información se enfocó en torno a la etnomicología, haciendo especial referencia al uso de hongos alucinógenos (Lowy, 1972).

En 1974, Lowy publicó un artículo sobre la relación existente entre fenómenos naturales y los hongos, así como su significado mortal o divino para Amanita muscaria. En 1975 documentó la micofilia que prevalece entre los habitantes indígenas del país. Un año más tarde, colectó y registró por primera vez en Guatemala el hongo alucinógeno, Psilocybe mexicana, conocido popularmente como “Pajarito”. Los últimos artículos de Lowy continuaron describiendo aspectos mayas relacionados con los hongos (Lowy, 1972).

En 1984, Guzmán escribió sobre la importancia de los hongos comestibles entre los pobladores de Mesomérica, principalmente en las regiones con bosque pino-encino, reportando además la venta de Amanita caesarea en los mercados del país (Guzmán, 1998). En 1985 Guzmán, Torres y Logemann describieron la primera especie nueva para el país: Morchella guatemalensis, un hongo comestible encontrado en bosque de pino-encino en Chimaltenango (Guzmán, 1998). En 1987 Guzmán registró Psedofistulina radicata, como objeto de venta en el

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mercado local de Santiago Atitlán y reportó además la venta masiva de Schizophyllum commune en mercados del país (Guzmán, 1998). Torres, publicó sobre hongos alucinógenos en la cultura maya en la compilación “Etnomedicina de Guatemala” (Torres, 1984).

En 1990, Sommerkamp publicó los nombres populares que reciben los hongos comestibles que se venden en los mercados de las cabeceras departamentales del país, incluyendo algunos en idioma kaqchiquel y q´eqchi’ (Sommerkamp, 1984). En ese mismo año, Herrera investigó la nomenclatura de los hongos de la región de Cipotón, Sumpango, Sacatepéquez, en donde reportó la especie Ramaria flava como una especie comestible. En 1994, Ohi y Torres editaron el libro tilutado Piedras Hongo, describiendo las piedras hongo de museos y colecciones privadas y documentando la posible utilización de estas esculturas en la cultura Maya. En 1999, Flores y colaboradores publicaron los nombres en idioma mam de algunos hongos comestibles de la Sierra de los Cuchumatanes (Ohi & Torres, 1994).

En el 2001, Morales recabó importante información acerca del conocimiento que tienen los habitantes de Tecpán Guatemala, Chimaltenango, acerca de los hongos, en aspectos como el concepto, fenología, ecología, morfología, nomenclatura, clasificación tradicional y uso de los hongos locales. En este estudio se reportaron 38 nombres en idioma kaqchiquel y 21 en español. Además concluyó que los pobladores de esta región clasifican a los hongos como un grupo diferente a plantas y animales, y que los nombres de los mismos han sido asignados por analogía con los elementos del medio y algunos por metáfora (Morales, 2001).

El proyecto de investigación “Hongos Comestibles de Guatemala: Diversidad, Cultivo y Nomenclatura Vernácula” reportó hasta el año 2002, 70 especies de hongos comestibles en 21 comunidades del país. Este proyecto ha contribuido a incrementar el cepario de hongos comestibles de Guatemala; hasta la fecha se ha logrado aislar y mantener alrededor de 100 cepas de hongos comestibles nativos (Bran et al, 2001).

Con respecto al uso de basidiomicetos en la alimentación, el primer estudio en Guatemala fue publicado en 1948, donde se describe la venta en mercados de A. caesarea, C. cibarius y S.

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commune (Sharp, 1948). En 1983 se realiza un estudio de los macromicetos de venta en mercados de la ciudad de Guatemala y los municipios de Mixco y San Juan Sacatepéquez, detectándose especies de Cantharellus, Lactarius, Ramaria y Amanita (Argueta, 1983). Posteriormente, se describe una nueva especie de hongo comestible en Chimaltenango, M. guatemalensis (Guzmán et al., 1985) y el comercio de P. radicata en Santiago Atitlán (Guzmán, 1987).

Un estudio importante sobre los macromicetos comestibles de venta en Guatemala fue el realizado durante 1988-90 en las 22 cabeceras departamentales del país, en búsqueda de lugares de venta de hongos comestibles en los mercados locales. Este amplio estudio demostró la presencia de 18 especies correspondientes a 15 géneros de basidiomicetos, sobresaliendo 9 géneros que se detectaron en varios departamentos (Sommerkamp, 1990). Durante 2001-2002 se recolectaron 600 especímenes de hongos comestibles en 21 comunidades de 10 departamentos del país y 21 especies no descritas para Guatemala anteriormente (Bran et al., 2003).

Estudios Ecológicos:

En 1998, se realizó la descripción de los hongos ectomicorrícicos asociados a encino (Quercus sp.) en bosques de Tecpán Guatemala, Chimaltenango (Cáceres et al., 1999). En 1999 Flores, publicó los trabajos titulados “Hongos Ectomicorricicos asociados a Abies guatemalensis, Pinus rudis y Pinus ayacahuite de la Sierra de los Cuchumatanes y su aprovechamiento en la producción de planta forestal micorrizada” y “Hongos ectomicorrícicos asociados a Pinus en Poptún, Petén, Guatemala” (Flores et al., 2002). Otros estudios refieren se a la producción o síntesis de micorrizas entre hongos locales y diversas especies de pino (Flores et al., 2005). El estudio de los macromicetos en Guatemala se ha enfocado principalmente al de hongos comestibles, faltando mucho por hacer en el campo ecológico, fitoquímico y farmacológico de los mismos. Hasta la fecha, se han registrado aproximadamente 220 especies de macromicetos, pertenecientes a 92 géneros (Bran et al., 2001).

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Estudios químicos y farmacológicos:

Los basidiomicetos producen una amplia gama de productos naturales que abarca desde componentes estructurales con actividad antitumoral e inmunológicamente activos hasta agentes antimicrobianos, antifúngicos, antivirales, citostáticos, enzimas, reguladores de crecimiento y aromas.

Uno de los basidiomicetos más conocidos es el L. edodes, por ser el hongo comestible más cultivado en países como Japón, Corea y China y existir gran tradición de su uso como hongo medicinal. Por estos motivos este organismo ha sido ampliamente estudiado para definir los principios activos que provocan sus efectos medicinales. Chihara y col. en 1969 aislaron varias fracciones activas a partir de cuerpos fructíferos de Lentinus, las cuales correspondieron a polisacáridos (Chihara, et al., 1969). La caracterización estructural de las mismas evidenció la presencia en una de ellas de un glucano. A partir de estos primeros indicios se continuaron los estudios hasta lograr la formulación de un fármaco que se comercializa por la firma Ajinomoto con el nombre de Lentinan®. Estudios biológicos han demostrado que contra varios tumores experimentales, el Lentinan® prolonga la vida y reduce el tamaño del tumor. Su modo de acción se caracteriza no por efectos citotóxicos directos, sino por la activación mediada del hospedero de sus factores de defensa. Estudios clínicos han demostrado que en combinación con otras drogas incrementa la reducción del tamaño del tumor y prolonga la vida en pacientes con cáncer gástrico (Furue et al., 1981; Taguchi et al., 1985).

El T. versicolor perteneciente a la familia de los Poliporaceae ha sido usado como medicina en varias enfermedades malignas en China y Japón principalmente. A partir de cultivos miceliales de este hongo se aisló un complejo polisacárido-proteína altamente soluble en agua. Este compuesto se comercializa con el nombre de Krestin® (PSK), habiéndose evaluado en pacientes operados de cáncer colorectal y para el tratamiento combinado con quimioterapia, radioterapia y cirugía en pacientes con cáncer gastrointestinal, cérvico-uterino, de mamas y pulmonar (Ito, et al., 1979; Fujii et al., 1995).

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Los primeros trabajos empleando basidiomicetos, reportados por Florey en 1949, fueron los realizados por Anchel, Hervey y Wilkins en 1941, quienes examinaron extractos de cuerpos fructíferos y cultivos miceliales de más de 2,000 especies de hongos, detectando en los mismos diversas actividades antibióticas y cuyos resultados conllevaron al aislamiento e identificación del pleuromutilin, compuesto utilizado para el tratamiento de las enfermedades producidas por micoplasmas en el ganado vacuno.

A partir de los trabajos de Wakman con actinomicetos y del descubrimiento de que estos microorganismos eran mucho más fáciles de aislar y cultivar, y a su vez mucho más prolíferos en la producción de compuestos con aplicaciones médicas y veterinarias, el interés en los antibióticos producidos por basidiomicetos decreció considerablemente (Anke, 1989). Sólo recientemente, y gracias a los progresos alcanzados en la tecnología de las fermentaciones y recobrado de productos, así como al desarrollo de los métodos espectroscópicos para el análisis estructural, es que estos microorganismos recobran su interés como posible fuente de metabolitos secundarios bioactivos. Los compuestos con actividad antibiótica producidos por basidiomicetos han sido agrupados acorde a su naturaleza química, teniendo en cuenta la relación existente entre ésta y las diferentes actividades biológicas reportadas.

Los cuerpos fructíferos de algunas especies del Lactarius son considerados no comestibles debido a su sabor acre y picante; este sabor está determinado por la presencia de aldehídos sesquiterpénicos con marasmanos y lactaranos en su esqueleto, que se forman enzimáticamente a partir de ácidos grasos. Estos aldehídos insaturados poseen alta actividad antimicrobiana y mutagénica y parecen ser los principios activos responsables de la defensa química en plantas. En la especie de Lactarius flavidulus fue aislado un compuesto con actividad antimicrobial, llamado flavidulol (Takahashi et al., 1988). Lactarius es un género muy abundante en los bosques de pino y encino de Guatemala (Flores et al., 2005).

El merulidial, aislado de cultivos sumergidos de Merulius tremellosus posee fuerte actividad antifúngica, mutagénica y citotóxica. Su aldehído sesquiterpénico en forma cristalina inhibe la síntesis del DNA en células ECA (células de carcinoma ascítico de Ehrlich) (Sterner, et al.,1990).

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El hynophilin, el pleurotelol y el ácido pleurotélico son compuestos aislados de fermentaciones de Pleurotellus hypnophilus.

Mientras que el pleurotelol y el ácido pleurotélico pertenecen al grupo de los sesquiterpenoides, el hynophilin es un nuevo miembro de la familia de los hirsutanos a la cual pertenecen un gran número de los típicos metabolitos presentes en basidiomicetos. Estos tres antibióticos poseen alta actividad antimicrobiana y citotóxica (Anke, 1989). El collybial, aislado de una cepa de Collybia confluens, es un sesquiterpenoide que inhibe el crecimiento de bacterias grampositivas, y ha demostrado una potente actividad citotóxica (Toyota & Hostettmann, 1990).

Los diterpenos producidos por basidiomicetos poseen una estructura propia hasta ahora no encontrada en otras fuentes naturales. Toyota y Hostettmann en 1990 reportan el aislamiento a partir de Boletinus cavipes de una familia de ésteres diterpénicos con actividad antifúngica a los cuales denominaron cavipetin (Stärk et al., 1991). Asimismo, de cultivos de Lentinellus omphalodes, Stärk y col. en 1991 aislaron un antibiótico, al cual denominaron omphalone, un derivado activo de benzoquinonas También se ha aislado el fulvoferruginin, un sesquiterpenoide del hongo Marasmius fulvoferrugineus (Hegnauer, 1962, Klein et al., 1990).

Dentro de los compuestos con actividad antagonista en hongos superiores, los poliacetilenos son el grupo más ampliamente caracterizado. Más de 50 de estos compuestos insaturados con actividad antibiótica han sido aislados a partir de especies de Clitocybe, Coprinus, Cortinellus, Daedalea, Marasmius, Merulius, Pleurotus, Polyporus, Poria, etc. (Anke et al., 1980). Ejemplo de esto es el escorodinin, antibiótico obtenido de cultivos de Marasmius scorodonius que posee actividad antimicrobiana y una alta actividad antifúngica y citotóxica (Simon et al., 1995).

Muchos otros metabolitos con actividad antibiótica son obtenidos a partir de basidiomicetos que incluyen compuestos fenólicos, ácidos fenilglicoxídicos sustituidos, purinas, quinonas, derivados terpénicos, etc. (Benedict & Brady, 1972). El mucidin, las estrobilurinas, las oudemansinas y sus análogos sintéticos, son compuestos que constituyen una nueva familia de inhibidores de la respiración, cuyo mecanismo de acción se basa en la inhibición de la

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transferencia electrónica en el complejo bc1 de la cadena respiratoria mitocondrial. El mucidin, antibiótico-antifúngico aislado de cultivos miceliales del basidiomiceto Oudemansiella mucida, presenta alta actividad citotóxica frente a una gran variedad de bacterias y levaduras. Por sus propiedades ha sido utilizado en el tratamiento tópico de la dermatomicosis y bajo el nombre comercial de Mucidermin Spofa® se emplea en la terapia local de varias enfermedades micóticas de la piel; siendo éste el primer antibiótico aplicado clínicamente en la República Checa y a su vez el primer antibiótico producido industrialmente a partir de un cultivo de basidiomicetos (Musilek et al., 1969, Nerud & Musilek, 1976, Zouchova et al., 1982, Subik et al., 1974).

Las estrobilurinas, las oudemansinas y sus análogos sintéticos inhiben el crecimiento de células humanas y animales así como de una amplia variedad de hongos (Weber et al., 1990). Debido a su acción tan específica, estos antibióticos se han convertido en valiosas herramientas para la elucidación de los mecanismos de transferencia electrónica en los complejos bc1 de eucariotas de la cadena respiratoria.

El agaridin, compuesto bioactivo aislado de cuerpos fructíferos de Agaricus xanthodermus, presenta actividad antimicrobiana frente a bacterias tanto gram-positivo como gramnegativo y es el primer compuesto diazonio aislado en basidiomicetos (Dornberger et al., 1989). Del Lentinus adhaerens ha sido aislado un metabolito con actividad antitrombótica, el 2-metoxy-5-metyl-1,4- benzoquinona, el primero de este tipo aislado a partir de cultivos de basidiomicetos (Lauer et al., 1991).

Los cultivos miceliales de basidiomicetos son una fuente potencial de sustancias aromáticas. El rol de estos metabolitos aún no ha sido totalmente esclarecido, ya que algunos de estos compuestos presentan a su vez actividad antifúngica y pueden definir la función de los hongos como antagonistas ante otros microorganismos. Otros de estos compuestos son inductores de la germinación, crecimiento micelial o de la fructificación (Gross & Asther, 1989). Los terpenos son producidos por géneros tales como Clitocybe, Ischnoderma, Lactarius, Lentinus, Pleurotus, Phlebia, Polyporus, Trametes y Poria y son los responsables de las propiedades aromáticas de los aceites esenciales (Janssens et al., 1992, Breheret & Talou, 1997).

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Por otra parte, las lactonas son las causantes de los olores frutales en los cultivos miceliales de basidiomicetos, razón por la cual son muy cotizadas en el campo alimentario y de cosméticos (Gross & Asther, 1989).

Además se presentan otras estructuras como los alcoholes, aldehídos, ésteres, cetonas alifáticas y compuestos azufrados que determinan toda una serie de olores característicos en estos microorganismos. Ejemplo de esto lo constituyen los compuestos azufrados que provocan el olor aliáceo del Marasmius (Gmelin et al., 1976) y el aroma típico del hongo comestible L. edodes (Chen et al., 1984; 1986).

Estudios realizados con células humanas (HeLa) han evidenciado que el pigmento amarillo producido por cultivos superficiales del basidiomiceto Xerula melanotricha bloquea la incorporación del 14C-acetato y del 14C-ácido melavónico al colesterol, lo que avala su posible utilización como anticolesterolémico (Kuhnt et al., 1990). También se ha reportado recientemente la potencialidad del ácido phlebiacrysoico, aislado a partir de cultivos de Phlebia chrysocrea, de inhibir la síntesis de los leucotrienos (Marumoto et al., 1997).

Atsumi en 1990 reporta que cultivos filtrados del basidiomiceto Phellinus sp. muestran fuerte actividad inhibitoria frente a la β-glucosidasa. El aislamiento y elucidación estructural del principio activo evidenció la obtención de un nuevo compuesto al cual denominaron cyclophelitol (Atsumi et al., 1990).

Producción comercial y valor económico:

Actualmente, la producción mundial supera los 6.2 millones de toneladas de hongos frescos por año. Su valor económico aproximado supera los 30 billones de dólares. La tasa promedio de incremento anual es superior al 11%. Recientemente, la confirmación de propiedades medicinales en hongos, tanto en la fase vegetativa (micelio) como reproductora (cuerpo fructífero), así como el descubrimiento de sus mecanismos biológicos de acción, están promoviendo un impulso adicional a su desarrollo. Se estima que ya se generan operaciones comerciales de alto valor

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agregado superiores a los 6 billones de dólares en los mercados internacionales de la industria alimenticia, farmacéutica, y de perfumería y cosméticos.

Asimismo, se observa una creciente demanda de los productos derivados de hongos comestibles en Europa, Norteamérica y Japón, a través de nutracéuticos (suplemento dietético elaborado con compuestos bioactivos extraídos de alimentos naturales), cápsulas o tabletas con extractos purificados de hongos comestibles utilizados con propósitos terapéuticos, suplementos alimenticios y bebidas tonificantes. Una famosa compañía francesa (Ives Rocher) ha patentado y comercializado productos cosméticos revitalizadores de la piel de gran aceptación internacional, elaborados a base de extractos de shiitake ricos en lípidos, proteínas, vitaminas y oligoelementos (Serum végétal de shiitaké: loción, cremas diurna y nocturna, desmaquillador). A nivel mundial, después del champiñón (Agaricus), el segundo hongo comestible cultivado más importante es el shiitake, ya que se produjeron 1,534,000 toneladas métricas en 1997. Tan sólo durante el período 1985-1997, la producción mundial de shiitake se incrementó más del 327%, y actualmente continúa incrementándose a tasas superiores al 25% anual (Chang, 1999; Royse, 1997). La mayor parte (>98.5%) de esa producción comercial se genera en el Sureste de Asia, principalmente en China (87.1%), Japón (8.6%), Taiwán (1.7%) y Corea del Sur (1.1%) (Chang, 2002).

Importancia industrial:

En la industria mundial, los macromicetos (especialmente los Basidiomicetos) generan gran interés debido a la cantidad de aplicaciones que poseen. Pueden ser aplicaciones biotecnológicas como la producción de enzimas y bioremediación, o aplicaciones en la industria médica y alimentaria. Esto es atribuido a los componentes biológicos de cada especie, que principalmente por sus características químicas, les confiere diversos tipos de actividades, que posteriormente son aprovechadas en las industrias mencionadas con anterioridad.

Los Basidiomicetos son utilizados para lograr la conversión de residuos de la agroindustria en biomasa (el sustrato empleado en la producción de hongos es usado como fertilizante orgánico de alto valor, esto llevó al desarrollo del reciclamiento ecológico), o enzimas, que son empleadas

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para procesos de blanqueamiento o en la biodegradación de contaminantes xenobióticos. (Linde, Luciani, Lopes, Silveira do Valle, & Colauto, 2017).

Uno de los usos más explorados es la conversión de biomasa, cuyo principal componente es la lignocelulosa, que a su vez es la fuente renovable orgánica más abundante del suelo. Una gran cantidad de productos que están compuestos por celulosa, hemicelulosa y lignina provenientes de la agricultura son desperdiciados, y es aquí donde se encuentra el papel de los macromicetos u hongos filamentosos, que tienen la capacidad de descomponer estos materiales eficientemente, convirtiendo a dichos hongos en un pilar fundamental del ciclo del carbono en el planeta. Los hongos encargados de llevar a cabo esta tarea son conocidos como Hongos de la Podredumbre Blanca (WRF por sus siglas en inglés), capaces de romper la lignina (componente más recalcitrante de las paredes celulares) a CO2, gracias a su fuerte actividad oxidativa atribuida a un complejo enzimático inespecífico, actividad que es aprovechada en la industria textil y papelera.

En un estudio conducido por (Fonseca, Zapata, Villalba, & Fariña, 2015) en el bosque subtropical de Misiones en Argentina, se evaluó el potencial de varias cepas de hongos de la pudrición blanca nativas del lugar de estudio, para producir enzimas lignolíticas capaces de decolorar el licor negro Kraft de las cepas evaluadas, Coriolus versicolor v. antarcticus BAFC 266, Pycnoporus sanguineus BAFC 2126 y Phlebia brevispora BAFC 633, mostraron un gran potencial para producir fenoloxidasas.

Ganoderma applanatum cepa E, P. sanguineus BAFC 2126 y P. brevispora BAFC 633 presentaron una marcada actividad lacasa y peroxidasa. Trametes elegans BAFC 2127 y Trametes villosa, mostraron una alta actividad manganeso peroxidasa. En general, todas las cepas estudiadas generaron una decoloración variable dependiendo de la concentración utilizada, lo que indica su gran potencial biotecnológico en la degradación de componentes contaminantes gracias a su capacidad de producir enzimas lignolíticas.

El uso más común y antiguo que se le ha dado a los hongos es como fuente de alimento humano, esto se debe a que como se ha mencionado, son excelente fuente de nutrientes, son bajos

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en calorías y libres de colesterol. Según las estadísticas de la FAO, para el año 2013 se habían consumido 9.926.966 toneladas de hongos. Dos de los hongos más cultivados a nivel mundial son Agaricus bisporus y Pleurotus ostreatus. Probablemente el hongo comestible más famoso es Agaricus bisporus, también conocido como Portobello o Champiñón, su cultivo intenso no solo ha sido benéfico para la producción de alimento para la población mundial, sino también para el estudio de los microorganismos que infectan estos hongos. Lecanicillium fungicola, el agente causante de la Burbuja seca, parasita los cuerpos fructíferos de los basidiomicetos.

Patógenos bacterianos como Pseudomonas causan lesiones necróticas en los cuerpos fructíferos de dichos hongos. Existen micovirus que causan enfermedades en A. bisporus, como la enfermedad de la capa café, entre otros. Pleurotus ostreatus es el segundo hongo más cultivado del mundo, conocido como el hongo Ostra, cuyo cultivo inició durante la segunda guerra mundial como medida de subsistencia. (Mattos-Shipley, y otros, 2016). En la industria médica, los Basidiomicetos son fundamentales, así, especies como Grifola frondosa (Dicks.) Gray, Ganoderma lucidum (Curtis) P. Karst., Lentinula edodes (Berk.) Pegler., Pleurotus ostreatus (Jacq. Ex Fr.) P. Kumm., Volvariella volvacea (Bulliard ex Fries) Singer, y Agaricus subrufescens Peck., entre otras, se caracterizan por ser ricas en ß-D glucanos, proteoglicanos, terpenos, compuestos fenólicos, y esto les confiere propiedades antitumorales, antifúngicas, antivirales, etc. Por esta razón son especies utilizadas para el desarrollo de investigaciones de tipo médico. (Linde, Luciani, Lopes, Silveira do Valle, & Colauto, 2017).

En un estudio realizado por (Sánchez, JiménezPérez, & Liedo, 2015) se estudió el efecto de suplementos de hongos seleccionados de Pleurotus spp. en la longevidad de la mosca Mexicana de la fruta, Anastrepha ludens, además, se determinó la variabilidad de la capacidad antioxidante de 14 cepas de Pleurotus spp. El porcentaje de inhibición de radicales de DPPH varió entre 32.6% y 85.7%, y los fenoles totales variaron entre 30.6 y 143.3 mg/g. La cepa con la mayor capacidad antioxidante Pleurotus djamor ECS0142, y con la menor capacidad antioxidante Pleurotus ostreatus ECS1123, fueron seleccionadas para estudiar su efecto en la longevidad de la mosca Mexicana de la fruta. Cuando la concentración de hongo que se adicionaba a la dieta de las moscas estaba entre el 5-20%, disminuía la esperanza de vida de las mismas, mientras que

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cuando la dieta de las moscas era suplementada con 1% del hongo, la esperanza de vida aumentaba considerablemente. Esto demuestra que los hongos pueden ser benéficos para la salud, pero deben ser administrados en dosis razonables para cada organismo.

Nuevos metabolitos a partir de Basidiomicetos:

Los organismos fúngicos sintetizan una amplia gama de metabolitos secundarios de gran importancia económica, comercial y biotecnológica, como los antibióticos ciclosporinas, ácidos mevínicos, alcaloides y estatinas, entre otros. De todos ellos, la biosíntesis de antibióticos principalmente β-lactámicos ha tenido mayor atención en el campo bioquímico, genético e industrial, así como los mayores rendimientos de producción, principalmente en géneros Aspergillus, Penicillium y Acremonium. Las investigaciones realizadas alrededor del mundo consideran a los hongos como unidades biológicas eficientes de síntesis, en donde para incrementar la producción de un determinado metabolito hay que intervenir, no sólo en la ruta de biosíntesis, sino también sobre vías de secreción, transporte, regulación genética, etc., los cuales indirectamente pudieran ejercer un efecto en la primera, dando lugar a rendimientos adecuados del compuesto de interés (Gutiérrez, Casqueiro & Martin, 2000).

La generación de metabolitos secundarios y las propiedades químico-biológicas que presentan son un campo interesante para diversas industrias, ya que se les puede considerar como opciones de uso en áreas del procesamiento e inocuidad de los alimentos, control y sanidad agronómica, procesos de remoción del petróleo y cuidados del medio ambiente, y por supuesto la farmacéutica debido no sólo a su actividad antibiótica, sino también por la presencia de propiedades anticolesterolémicas, antiinflamatorias y antihiperglucémicas que normalmente muestran una elevada potencia y selectividad en diferentes sistemas biológicos. Hasta ahora la complejidad estructural, generalmente no permite su síntesis química en el laboratorio, de tal manera que se reemplace la fermentación como medio de obtención, por lo que los organismos fúngicos siguen siendo la ruta más práctica de obtención, enfocándose además la atención en la modificación y/o búsqueda de nuevos sistemas biológicos generadores, así como de condiciones optimas de cultivo para la producción y sobreproducción.

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Componentes estructurales con actividad biológica:

La gran cantidad de especies de basidiomicetos que existen en la naturaleza y que constituyen fuentes naturales potenciales de componentes bioactivos ha motivado en las últimas décadas el interés en estudiar estos organismos. Es conocido que ciertos componentes macromoleculares aislados de hongos superiores, tales como polisacáridos, glicoproteÌnas, ácidos nucleicos, etc., poseen actividad antitumoral, relacionada esta con la activación que provocan dichas sustancias de la respuesta inmunológica en el hospedero. Los polisacáridos antitumorales producidos por basidiomicetos han ido recibiendo en los últimos años una creciente atención, apareciendo en la literatura reportes sobre la obtención de β-glucanos solubles en agua y en álcali, polisacáridos antitumorales aislados a partir de hongos comestibles o medicinales tales como Grifola frondosa, Polyporus confluens, Hericium erinaceum, Lentinus edodes y Coriolus versicolor (Mizuno, Ohsawa, Hagiwara, & Kuboyama, 1986; Mizuno, 1999; Brizuela, García, Pérez, & Mansur, 1998).

Uno de los basidiomicetos más conocidos es el L. edodes, por ser el hongo comestible más cultivado en países como Japón, Corea y China y existir gran tradición de su uso como hongo medicinal. Por estos motivos este organismo ha sido ampliamente estudiado para definir los principios activos que provocan sus efectos medicinales. Chihara y col. en 1969 aislaron varias fracciones activas a partir de cuerpos fructíferos de Lentinus, las cuales correspondieron a polisacáridos (Chihara et al., 1969). La caracterización estructural de las mismas evidenció la presencia en una de ellas de un glucano lineal con enlaces β(1-3), poco soluble en agua y con peso molecular entre 950-1050 kDa. A partir de estos primeros indicios se continuaron los estudios hasta lograr la formulación de un fármaco que se comercializa por la firma Ajinomoto con el nombre de Lentinan®. Estudios biológicos han demostrado que contra varios tumores experimentales, el Lentinan® prolonga la vida y reduce el tamaño del tumor. Su modo de acción se caracteriza no por efectos citotóxicos directos, sino por la activación mediada del hospedero de sus factores de defensa. Estudios clínicos han demostrado que en combinación con otras drogas

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incrementa la reducción del tamaño del tumor y prolonga la vida en pacientes con cáncer gástrico (Furue, et al., 1981; Taguchi, et al., 1985).

El C. versicolor perteneciente a la familia de los Poliporaceae ha sido usado como medicina en varias enfermedades malignas en China y Japón principalmente. A partir de cultivos miceliales de este hongo se aisló un complejo polisacárido-proteína altamente soluble en agua y de peso molecular promedio de 94 kDa. Este compuesto se comercializa con el nombre de Krestin® (PSK), habiéndose evaluado en pacientes operados de cáncer colorrectal y para el tratamiento combinado con quimioterapia, radioterapia y cirugía en pacientes con cáncer gastrointestinal, cérvico-uterino, de mamas y pulmonar (Fujii, et al., 1995; Ito, Hidaka, & Sugiura, 1979).

Los antibióticos constituyen el grupo más importante de sustancias farmacéuticas sintetizadas por células microbianas. El mismo comprende además compuestos antitumorales y alcaloides. Los primeros trabajos empleando basidiomicetos, reportados por Florey (1951) fueron los realizados por Anchel, Hervey y Wilkins en 1941, quienes examinaron extractos de cuerpos fructíferos y cultivos miceliales de más de 2,000 especies de hongos, detectando en los mismos diversas actividades antibióticas y cuyos resultados conllevaron al aislamiento e identificación del pleuromutilin, compuesto utilizado para el tratamiento de las enfermedades producidas por micoplasmas en el ganado vacuno.

A partir de los trabajos de Wakman con actinomicetos y del descubrimiento de que estos microorganismos eran mucho más fáciles de aislar y cultivar y a su vez mucho más prolíferos en la producción de compuestos con aplicaciones médicas y veterinarias, el interés en los antibióticos producidos por basidiomicetos decreció considerablemente (Anke, 1989). Sólo recientemente y gracias a los progresos alcanzados en la tecnología de las fermentaciones y recobrado de productos, así como al desarrollo de los métodos espectroscópicos para el análisis estructural, es que estos microorganismos recobran su interés como posible fuente de metabolitos secundarios bioactivos. Los compuestos con actividad antibiótica producidos por basidiomicetos han sido agrupados acorde a su naturaleza química, teniendo en cuenta la relación existente entre ésta y las diferentes actividades biológicas reportadas

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El metabolismo secundario de los basidiomicetos es rico en terpenoides, especialmente sesquiterpenoides, muchos de los cuales poseen estructuras que hasta ahora sólo han sido detectadas en esta clase de microorganismos, mientras que otras están estrechamente vinculadas a los metabolitos de plantas. Mycena leaiana es un basidiomiceto de color naranja brillante, perteneciente a los Agaricales, del cual no existe mucha información acerca de la naturaleza química de sus pigmentos. Harttig y col. en 1990, reportan que en cultivos miceliales este microorganismo produce un compuesto con actividad antibiótica y citotóxica que se corresponde con el pigmento amarillonaranja predominante en el hongo. Los estudios químicos y espectroscópicos revelaron que el compuesto es un sesquiterpenoide derivado del fulveno, llamándolo leianafulveno. Los cuerpos fructíferos de algunas especies del Lactarius son considerados no comestibles debido a su sabor acre y picante; este sabor está determinado por la presencia en ellos de aldehídos sesquiterpénicos con marasmanos y lactaranos en su esqueleto, que se forman enzimáticamente a partir de ácidos grasos (Anke, Bergendorff & Sterner, 1989; Daniewski et al., 1996). Estos aldehídos insaturados poseen alta actividad antimicrobiana y mutagénica y parecen ser los principios activos responsables de la defensa química en plantas.

En la especie de Lactarius flavidulus fue aislado un compuesto con actividad antimicrobial, llamado flavidulol (Takahashi, Kusano, Ohta, & Nozoe, 1988). El merulidial, aislado de cultivos sumergidos de Merulius tremellosus posee fuerte actividad antifúngica, mutagénica y citotóxica. Su aldehído sesquiterpénico en forma cristalina inhibe la síntesis del DNA en células ECA (células de carcinoma ascítico de Ehrlich) (Sterner, Anke, Sheldrick, & Steglich, 1990). El hynophilin, el pleurotelol y el ácido pleurotélico son compuestos aislados de fermentaciones de Pleurotellus hypnophilus. Mientras que el pleurotellol y el ácido pleurotélico pertenecen al grupo de los sesquiterpenoides, el hynophilin es un nuevo miembro de la familia de los hirsutanos a la cual pertenecen un gran número de los típicos metabolitos presentes en basidiomicetos, estos tres antibióticos poseen alta actividad antimicrobiana y citotóxica (Anke, 1989).

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El collybial, aislado de una cepa de Collybia confluens, es un sesquiterpenoide que inhibe el crecimiento de bacterias grampositivas, y ha demostrado una potente actividad citotóxica. Los diterpenos producidos por basidiomicetos poseen una estructura propia hasta ahora no encontrada en otras fuentes naturales. Toyota y Hostettmann en 1990 reportan el aislamiento a partir de Boletinus capines de una familia de ésteres diterpénicos con actividad antifúngica a los cuales denominaron cavipetin. Asimismo, de cultivos de Lentinellus omphalodes, Stärk y col. en 1991 aislaron un antibiótico, al cual denominaron omphalone, un derivado activo de benzoquinonas.

También se ha aislado el fulvoferruginin, un sesquiterpenoide del hongo Marasmius fulvoferrugineus (Hegnauer, 1986). Dentro de los compuestos con actividad antagonista en hongos superiores, los poliacetilenos son el grupo más ampliamente caracterizado. Más de 50 de estos compuestos insaturados con actividad antibiótica han sido aislados a partir de especies de Clitocybe, Coprinus, Cortinellus, Daedalea, Marasmius, Merulius, Pleurotus, Polyporus, Poria, etc. (Anke, Kupka, Schramm, & Steglich, 1980). Ejemplo de esto es el escorodinin, antibiótico obtenido de cultivos de Marasmius scorodonius que posee actividad antimicrobiana y una alta actividad antifúngica y citotóxica (Simon, et al., 1995). Muchos otros metabolitos con actividad antibiótica son obtenidos a partir de basidiomicetos que incluyen compuestos fenólicos, ácidos fenilglicoxídicos sustituidos, purinas, quinonas, derivados terpénicos, etc. (Benedict & Brady, 1972).

El mucidin, las estrobilurinas, las oudemansinas y sus análogos sintéticos, compuestos que constituyen una nueva familia de inhibidores de la respiración, cuyo mecanismo de acción se basa en la inhibición de la transferencia electrónica en el complejo bc1 de la cadena respiratoria mitocondrial. El mucidin, antibiótico-antifúngico aislado de cultivos miceliales del basidiomiceto Oudemansiella mucida, presenta alta actividad citotóxica frente a una gran variedad de bacterias y levaduras. Por sus propiedades ha sido utilizado en el tratamiento tópico de la dermatomicosis y bajo el nombre comercial de Mucidermin Spofa® se emplea en la terapia local de varias enfermedades micóticas de la piel; siendo éste el primer antibiótico aplicado clínicamente en la República Checa y a su vez el primer antibiótico producido industrialmente a partir de un cultivo

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de basidiomicetos (Šubík, Behúň, Šmigáň, & Musilek, 1974; Zouchova, Wurst, Nerud, & Musilek, 1982).

Las estrobilurinas, las oudemansinas y sus análogos sintéticos inhiben el crecimiento de células humanas y animales así como de una amplia variedad de hongos (Weber, Anke, Bross, & Steglich, 1990). Debido a su acción tan específica, estos antibióticos se han convertido en valiosas herramientas para la elucidación de los mecanismos de transferencia electrónica en los complejos bc1 de eucariotas de la cadena respiratoria. El agaridin, compuesto bioactivo aislado de cuerpos fructÌferos de Agaricus xanthodermus, presenta actividad antimicrobiana frente a bacterias tanto gram-positivas como gram-negativas, y es el primer compuesto diazonio aislado en basidiomicetos (Domberger, Lich, & Zureck, 1989). Del Lentinus adhaerens ha sido aislado un metabolito con actividad antitrombótica, el 2-metoxy-5-metyl1,4-benzoquinona, el primero de este tipo aislado a partir de cultivos de basidiomicetos (Lauer, Anke, & Hansske, 1991).

La demanda de aromas para uso alimentario ha ido aumentando considerablemente durante las últimas décadas. La extracción a partir de materias primas naturales y la síntesis por vía química han sido las formas clásicas de producción. No obstante, en los últimos años se ha incrementado la tendencia a la obtención de los llamados compuestos "naturales" por la vía de síntesis y bioconversión de los microorganismos (Janssens, De Pooter, Schamp, & Vandamme, 1992; Schindler, 1982). Los cultivos miceliales de basidiomicetos son una fuente potencial de sustancias aromáticas.

El rol de estos metabolitos aún no ha sido totalmente esclarecido, ya que algunos de estos compuestos presentan a su vez actividad antifúngica y pueden definir la función de los hongos como antagonistas ante otros microorganismos. Otros de estos compuestos son inductores de la germinación, crecimiento micelial o de la fructificación (Gross & Asther, 1989). Los aromas en general se clasifican según su grupo químico. Los compuestos de anillo bencénico son numerosos, presentando propiedades aromáticas interesantes para la industria alimentaria (Berger, Neuhäuser, & Drawert, 1986), y su metabolismo está relacionado fundamentalmente con las propiedades ligninolíticas de los basidiomicetos (Wood, DeShazer, & Largent, 1988).

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Los terpenos son producidos por géneros tales como Clitocybe, Ischnoderma, Lactarius, Lentinus, Pleurotus, Phlebia, Polyporus, Trametes y Poria y son los responsables de las propiedades aromáticas de los aceites esenciales (Breheret, Talou, Rapior, & Bessiére, 1997). Por otra parte, las lactonas son las causantes de los olores frutales en los cultivos miceliales de basidiomicetos, razón por la cual son muy cotizadas en el campo alimentario y de cosméticos. Además de las estructuras anteriormente mencionadas, existen otras, como los alcoholes, aldehídos, ésteres, cetonas alifáticas y compuestos azufrados que determinan toda una serie de olores característicos en estos microorganismos. Ejemplo de esto lo constituyen los compuestos azufrados que provocan el olor aliáceo del Marasmius (Gmelin et al., 1976) y el aroma típico del hongo comestible L. edodes (Chen, Chen, Chen, & Wu, 1984; Chen, Liu, Wu, & Ho, 1986).

Enzimas, inhibidores y reguladores Una de las ventajas más significativas de los basidiomicetos lo constituye su amplio espectro de actividades enzimáticas, lo que conlleva a que estos microorganismos jueguen un papel importante en diversos sistemas biológicos. La obtención de un nuevo tipo de bilirubin-oxidasa con características muy apropiadas para su producción industrial a partir de Trachyderma tsunodae es reportada por Matsui en 1986. Dicha enzima permite la determinación cuantitativa de bilirubina en fluidos biológicos con resultados muy superiores a los obtenidos por determinación química. Cepas pertenecientes al género Lentinus, Oudemansiella, Coprinus, Auricularia, Poria, etc. producen una colesterol-oxidasa diferente a las conocidas hasta el momento, la cual se emplea en laboratorios clínicos para la determinación enzimática de colesterol (Matsui, Nakajima, & Taniguchi, 1984). Interesante resulta también la capacidad de producción de inhibidores de enzimas. Es conocido que la acción de muchos agentes farmacológicos está dada por su capacidad para inhibir determinadas enzimas y que además, numerosas enfermedades están asociadas a una excesiva o no regulada actividad enzimática, por lo que inhibidores de enzimas pueden aportar numerosas actividades farmacológicas beneficiosas. Estudios realizados con células humanas (HeLa) han evidenciado que el pigmento amarillo producido por cultivos superficiales del basidiomiceto Xerula melanotricha bloquea la incorporación del 14C-acetato y del 14C-ácido melavónico al colesterol, lo que avala su posible utilización como anticolesterolémico (Kuhnt et al., 1990).

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También se ha reportado recientemente la potencialidad del ácido phlebiacrysoico, aislado a partir de cultivos de Phlebia chrysocrea, de inhibir la síntesis de los leucotrienos (Marumoto et al., 1997). Atsumi en 1990 reporta que cultivos filtrados del basidiomiceto Phellinus sp. muestran fuerte actividad inhibitoria frente a la β-glucosidasa. El aislamiento y elucidación estructural del principio activo evidenció la obtención de un nuevo compuesto al cual denominaron cyclophelitol (Atsumi et al., 1990).

El 3,5-dicloro-4-metoxibencil alcohol, metabolito aislado de cultivos de Hypholoma sp., inhibe a concentraciones de 50 mg/mL la síntesis de las enzimas hidrolíticas. Investigaciones sobre su modo de acción revelaron que el mismo actúa en las primeras etapas de la ruta biosintética inducida por el ácido giberélico. Ensayos in vivo demostraron que la germinación de semillas de diferentes plantas es inhibida por este compuesto (Hautzel & Anke, 1990).

Algunos hongos y levaduras sintetizan y liberan diversos compuestos de naturaleza anfipática con propiedades tensoactivas, denominados biosurfactantes (BS), los cuales presentan en su estructura química grupos hidrofóbicos (ácidos grasos saturados e insaturados) e hidrofilícos (péptidos, aminoácidos, cationes, aniones) con la capacidad de reducir la tensión superficial de sistemas aceite-agua y aire-agua ubicándose en las interfases. La generación de estos compuestos permite al microorganismo productor tener la capacidad para emulsificar y solubilizar sustratos hidrofóbicos, aumentando su disponibilidad para el crecimiento y mantenimiento de los mismos. Los BS, son considerados moléculas complejas, clasificadas en base a sus diferentes estructuras químicas: glicolípidos, péptidos, lipopéptidos, poliméros, ácidos grasos y fosfolípidos (Muthusamy, et al., 2008; Jiménez, Medina & Gracida, 2010; Al-Araji, Rahman, Basri & Salleh, 2007). La biosíntesis de estos compuestos con actividad de superficie está influenciada por múltiples factores, que van desde el tipo de cepa productora, hasta por los inherentes a las condiciones de cultivo, que incluyen la naturaleza de la fuente de carbono, concentración de nitrógeno, fósforo, magnesio, hierro, manganeso, oxígeno, pH, temperatura y agitación, los cuales repercuten en el tipo, calidad y rendimientos de producción (Al-Araji, Rahman, Basri & Salleh, 2007).

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PARTE III

III. RESULTADOS

Se colectaron las especies de basidiomicetos en la región del occidente de Guatemala, la cual se vio afectada por la falta de lluvia y la reducción de los bosques húmedos. Para la adquisición de material se procedió a realizar giras de campo en diferentes meses del año 2015, durante esta actividad se visitaron mercados, colectores de hongos y productores. Los hongos fueron identificados y posteriormente deshidratados durante 2 días a 65°C, una vez secos se procedió a su empaque y entrega para la realización de las pruebas químicas y biológicas. Se logró el contacto con recolectores de la región, los cuales facilitaron algunas de las muestras y con una empresa productora de hongos, en el caso del hongo (Agaricus sp) portobello se adquirió en supermercados ya que no fue posible colectar en el campo por la falta de lluvia.

En el cuadro 1 se presentan los datos de las especies que se colectaron, es importante hacer notar que por el alto contenido de agua que presentan los basidiomicetos al momento de desecarlos, la cantidad colectada no superó los 500 g, mientras que en fresco se colectaron más de 5 kg. Es importante tomar en cuenta la humedad, ya que es otro factor limitante en la obtención de suficiente material para las pruebas biológicas, de caracterización de metabolitos primarios y secundarios. Cuadro 1. Información del Colecta

Boletus Amanita Cantharellus Armillaria Ganoderma Agaricus sp edulis caesarea complex lateritius polymyces lucidum Cantidad recolectada 22.0 28.6 24.0 20.0 18.0 1.0 fresca (Kg)

Cantidad recolectada 0.306 0.261 0.412 0.328 0.153 0.219 desecada (Kg) San Juan Ixchiguan, Sitio de Comalapa, Cobán, Alta San Juan San Chimaltenango Chimaltenango colecta Tecpán Verapaz Sacatepéquez Marcos Chimaltenango

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En el cuadro 2 se muestra la humedad final después del secado en las muestras colectadas, es de resaltar que la muestra a pesar de que se había deshidratado, presentaba una humedad por arriba del 10%, por lo que fue necesario secarlo en horno hasta obtener una humedad por debajo del 10%. Esta reducción de humedad también disminuyó el peso de la cantidad de muestra que ingresó para las pruebas de laboratorio, por lo que es necesario considerar dicho factor, al momento de la colecta para contar con la cantidad suficiente de material para todos los análisis que se necesitan realizar. Cuadro 2. Determinación de humedad

Especie Humedad Inicial (%) Humedad Final (%) Boletus edulis 13.78 6.25 Amanita caesarea complex 6.89 6.10 Cantharellus lateritius 10.53 7.02 Armillaria polymyces 10.61 6.90 Agaricus sp 10.45 9.25 Ganoderma lucidum 7.75 5.15

La determinación de cenizas totales se realizó en la mufla incinerando a 600°C por tres horas llevándose hasta peso constante, como se puede observar en el cuadro 3, el porcentaje de cenizas totales se encuentra por abajo del 1%; esto indica que el material presenta una cantidad baja de compuestos inorgánicos como sales o metales pesados que se eliminan durante el proceso de incineración.

Según los parámetros de calidad se establece que el porcentaje de cenizas totales no debe superar el 5%, se observó que las muestras presentaron un porcentaje superior siendo mayor en Cantharellus lateritius. Por la naturaleza de la muestra, la cual presenta un cuerpo fructífero que almacena gran cantidad de sustancias, como los minerales, o condiciones del suelo de cultivo, pueden ser factores que influyen en que la cantidad de cenizas totales se encuentre por arriba a lo establecido para drogas vegetales. Se determinaron las cenizas ácido insoluble, ya que los minerales que puedan estar presentes en la muestra se disuelven en el ácido, según la literatura en drogas vegetales dicho parámetro se debe encontrar en un porcentaje por abajo del 2%, se observó que todas la muestras presentaron valores menores al 1%.

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Cuadro 3. Cenizas totales y cenizas ácido insoluble

Especie Cenizas Totales (%) Cenizas Acido Insoluble (%) Boletus edulis 5.43±0.33 0.51±0.09 Amanita caesarea complex 11.67±0.15 0.68±0.08 Cantharellus lateritius 12.17±0.37 1.03±0.08 Armillaria polymyces 8.12±0.05 0.45±0.08 Agaricus sp 11.98±0.94 1.43±0.62 Ganoderma lucida 2.06±0.01 0.87±0.07

Para la elaboración de los extractos hidroalcohólicos fue necesario determinar cuál era el disolvente que extraía la mayor cantidad de sólidos. Como se observa en el cuadro de resultados 4, para Boletus edulis, el mejor solvente es etanol al 50%, ya que extrajo 3.2% de sólidos, igualmente A. polymyces presentó la mayor cantidad de sólidos con dicho disolvente.

En el caso de Amanita caesarea complex, C. lateritus y Ganoderma lucida, el mejor disolvente fue el etanol al 30%, ya que extrajo la mayor cantidad de sólidos totales; mientras que el solvente etanol al 95% fue el que menor cantidad de sólidos totales extrajo. La muestra de Agaricus el mejor solvente fue etanol al 95%, obteniendo una cantidad de sólidos por arriba del 2%. Esto indica que los metabolitos secundarios que poseen presentan alta polaridad.

Cuadro 4. Determinación de mejor disolvente

Concentración de Especie % de Sólidos etanol 95% 0.32 70% 1.53 Boletus edulis 50% 3.20 30% 1.69 95% 0.20 Amanita caesarea 70% 1.00 complex 50% 1.27 30% 1.42 95% 0.12 Cantharellus 70% 0.16 lateritius 50% 0.25 30% 0.30

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95% 0.66 70% 0.95 Armillaria polymyces 50% 1.28 30% 1.21 95% 2.16 70% 1.44 Agaricus sp 50% 1.73 30% 0.42 95% 0.36 70% 0.37 Ganoderma lucida 50% 0.32 30% 0.39

Como se observa en el cuadro 5, el mejor rendimiento se presentó en los extractos etanólicos, siendo el más alto el de Boletus edulis con 63.72%, lo cual se considera un buen rendimiento y a la vez se puede observar que en las especies contienen una gran cantidad de compuestos de características polares que fueron extraídos con el disolvente empleado.

El extracto acuso se realizó preparando una infusión en proporción 1:10, con posterior filtración y el filtrado se liofilizó. Se observa que el rendimiento del extracto acuoso es inferior al etanólico, lo que indica que la mayor cantidad de los metabolitos secundarios no presentan características polares muy elevadas, dando una mayor extracción con el disolvente hidroalcohólico. A pesar de que las grandes cantidades de material fúngico fresco al momento de deshidratarse y secarse se obtiene una cantidad muy pequeña, el rendimiento de los extractos obtenido si parece ser promisorio en la mayoría de las especies.

Cuadro 5. Rendimiento de extracto

Especie Disolvente % Rendimiento Etanol al 50% 63.72 Boletus edulis Agua 28.18 Etanol 30% 50.56 Amanita caesarea complex Agua 0.04 Etanol al 50% 36.5 Cantharellus lateritius Agua 0.34 Etanol al 50% 36.25 Armillaria polymyces Agua 0.46

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Etanol al 50% 33.72 Agaricus sp Agua 0.84 Etanol al 50% 16.52 Ganoderma lucida Agua 0.42

Se realizó la caracterización fitoquímica mediante ensayos macro y semimicro y cromatografía en capa fina, dentro de estas se realizó la prueba para cumarinas en el material fúngico y extractos etanólicos, observándose que ninguna de las muestras evaluadas presentó fluorescencia después del tratamiento con la solución de hidróxido de potasio en etanol al 10%, en comparación con el estándar utilizado.

Cuadro 6. Identificación de cumarinas en material fúngico y extracto seco

Especie Muestra Cumarinas Material fresco Ausente Boletus edulis Extracto etanólico Ausente Extracto acuoso Ausente Material fresco Ausente Amanita caesarea complex Extracto etanólico Ausente Material fresco Ausente Cantharellus lateritius Extracto acuoso Ausente Extracto etanólico Ausente Material fresco Ausente Armillaria polymyces Extracto acuoso Ausente Extracto etanólico Ausente Material fresco Ausente Ganoderma lucida Extracto acuoso Ausente Extracto etanólico Ausente Ácido p-cumarínico Estándar Presente

En el material fúngico no se detectaron taninos, ya que al realizar la evaluación en tubos, con los diferentes reactivos, no se evidenció formación de precipitado o cambio de color en ninguno de los tres tubos; por otra parte el extracto etanólico mostró cambio de color con el reactivo de

FeCl3, pero no se evidenció cambio con los otros reactivos por lo que dicho cambio se puede atribuir a la presencia de otros compuestos con estructura fenólica como flavonoides.

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Cuadro 7. Identificación de taninos en material fúngico y extracto seco mediante prueba de tubos

Gelatina Gelatina- Especie Muestra Testigo FeCl3 1% Sal Boletus edulis Amanita caesarea complex No se No se Cantharellus lateritius Material Solución No forma evidenció formó Armillaria polymyces Fúngico transparente precipitado cambio de precipitado Agaricus sp color Ganoderma lucida Boletus edulis Amanita caesarea complex Extracto Solución Cambio de No se Cantharellus lateritius No formó etanólico transparente color, formó Armillaria polymyces precipitado seco amarilla oscuro precipitado Agaricus sp Ganoderma lucida

Las muestras de material fúngico presentaron alcaloides, los cuales se evidenciaron en la prueba en tubos, observándose la formación de precipitado con los diferentes reactivos. Los extractos etanólicos no evidenciaron la presencia de alcaloides, ya que no se evidenciaron cambios con los reactivos utilizados para la identificación; lo cual pudo ser influenciado por el disolvente utilizado, el cual debe ser afín al metabolito a detectar.

Cuadro 8. Identificación de alcaloides en material fúngico y extracto etanólico, mediante prueba macrométrica de tubo

Material Fúngico Extracto Etanólico Especie Mayers Dragendorff Wagner Mayers Dragendorff Wagner Boletus edulis ------Amanita caesarea complex + + + - - - Cantharellus lateritius + + + - - - Armillaria polymyces - + - - - - Agaricus sp ------Ganoderma lucida ------Estándar de Atropina + + + + + + (-) Ausencia de precipitado, (+) Presencia de precipitado.

Se realizó la cromatografía en capa fina, en la misma se evidenció la presencia de un alcaloide en cada una de las muestras. Los alcaloides identificados presentan un Rf diferentes a los

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estándares empleados, lo que indica que son otro tipo de alcaloides que están presentes en la muestra. La especie de B. edulis no evidenció alcaloides por cromatografía en capa fina.

Cuadro 9. Cromatografía en capa fina de alcaloides en material fúngico

Especie Marca Color Rf Amanita caesarea complex 1 Café-anaranjado 0.61 Cantharellus lateritius 1 Café-anaranjado 0.64 Armillaria polymyces 1 Café-anaranjado 0.61 Estándar de atropina 1 Café-anaranjado 0.29 Estándar de antropina 1 Café-anaranjado 0.32

La prueba de formación de espuma para la identificación de saponinas, evidenció la presencia de dichos metabolitos en el material fúngico y en el extracto etanólico, ya que se formó espuma; algunas muestras en mayor cantidad que otras, pero estos metabolitos secundarios pueden estar relacionados con la acción biológica que presentan las especies.

Cuadro 10. Identificación de saponinas en material fúngico mediante prueba macrométrica de formación de espuma

Material Fúngico Extracto Etanólico Presencia de Altura de Presencia de Altura de Especie saponinas espuma (cm) saponinas espuma (cm) Boletus edulis + 0.3 + 0.4 Amanita caesarea complex ++ 1 ++ 1.2 Cantharellus lateritius ++ 1.5 ++ 1.5 Armilaria polymyces +++ 2 ++ 2.1 Agaricus sp - 0 - 0 Ganoderma lucida - 0 - 0 Estándar de saponinas +++++ 6.7 +++++ 6.7 (Control positivo) Agua (Control negativo) - 0 - 0

En base a los resultados positivos de la prueba de formación de espuma, se realizó la cromatografía en capa fina, con la misma se logró determinar que las muestras presentan diferentes tipos de saponinas, ya que cada una de ellas presentó diferentes bandas, cada una de las muestras de material fúngico presenta una marca con color y Rf muy similar al del estándar. Se observa que hay una gran variedad de saponinas en las muestras, siendo B. edulis la que más

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saponinas presenta. Por otra parte en los extractos etanólicos se observa una menor cantidad de saponinas, dos de las muestras no evidenciaron la presencia de saponinas; esto indica que el solvente de extracción no es afín para lograr detectar las saponinas del material fúngico, por lo que si se desean extraer las saponinas se debe pensar en otro tipo de solvente para extraer las saponinas.

Cuadro 11. Cromatografía en capa fina de saponinas

Material fúngico Extracto etanólico Muestra Factor de Factor de Marca Color Marca Color retención retención 1 Morado 0.06 1 Morado 0.05 2 Amarillo 0.09 2 Morado 0.84 3 Morado 0.14 4 Morado 0.26 Boletus edulis 5 Morado 0.44 6 Morado 0.55 7 Morado 0.60 8 Morado 0.92 1 Morado 0.12 ------2 Morado 0.16 Amanita caesarea 3 Morado 0.35 complex 4 Morado 0.45 5 Morado 0.61 1 Morado 0.09 ------Cantharellus 2 Morado 0.16 lateritius 3 Morado 0.20 1 Morado 0.09 1 Verde 0.07 Armillaria 2 Morado 0.16 2 Verde 0.84 polymyces 3 Morado 0.25 4 Morado 0.41 Estándar de 1 Morado 0.14 1 Morado 0.14 saponinas al 1% Estándar de 1 Verde 1 Verde 0.11 diosgenina

La cromatografía en capa fina permitió evidenciar la presencia de flavonoides en los extractos etanólicos; el que mayor cantidad de flavonoides presentó fue Boletus edulis, siendo los mismos distintos a los estándares que se emplearon.

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Cuadro 12. Cromatografía en capa fina para identificación de flavonoides en extractos etanólicos

Especie Marca Color Rf 1 Celeste 0.44 Boletus edulis 2 Celeste 0.53 3 Celeste 0.60 1 Morada 0.40 Amanita caesarea complex 2 Morada 0.56 Cantharellus lateritius 1 Morada 0.74 Armillaria polymyces 1 Verde 0.75 Rutina 1 Naranja 0.53 Quercetina 1 Amarilla 0.81 Ácido clorogénico 1 Verde 0.75 Ácido cafeico 1 Celeste 0.82 Hiperosido 1 Naranja 0.43

La prueba de identificación de azucares evidenció que todas las muestras presentan de tres a cuatro bandas que se relacionan con azúcares; este metabolito primario es de interés ya que está relacionado con el valor nutricional que las muestras tienen además del aroma y sabor dulce que se percibe en las diferentes especies de estudios.

Como se observa en el cuadro de resultados los estándares que posiblemente estén presentes en las muestras son fucosa, arabinosa y ácido galacturónico; ya que en base a los valores de Rf, se encuentran muy cercanos a los determinados en las bandas evidenciadas en las muestras, así como la coincidencia del color.

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Cuadro 13. Identificación de azúcares en material seco por medio de cromatografía en capa fina.

Especie No. de banda Color Rf 1 Gris 0.16 2 Gris 0.29 Boletus edulis 3 Gris 0.42 4 Rojo 0.55 1 Gris 0.21 Amanita caesarea complex 2 Gris 0.44 3 Rojo 0.49 1 Gris 0.16 2 Gris 0.38 Cantharellus lateritius 3 Gris 0.41 4 Rojo 0.55 1 Gris 0.29 Armilaria polymyces 2 Gris 0.42 3 Rojo 0.48 1 Gris 0.18 Agaricus sp. 2 Gris 0.28 3 Gris 0.42 Estándares Fucosa 1 Rojo 0.49 Xilosa 1 Gris 0.51 Arabinosa 1 Gris 0.42 Ramnosa 1 Rojo 0.59 Dextrosa 1 Gris 0.38 D-glucosa 1 Gris 0.38 Melibiosa 1 Gris 0.14 0.05 1 Gris Maltosa 6 2 Gris 0.39 Fructosa 1 Gris 0.38 Ácido galacturónico 1 Gris 0.15

Para la identificación y cuantificación de azúcar por cromatografía líquida de alta resolución y detección mediante índice de refracción (HPLC/IR) se elaboraron curvas de calibración con 9 estándares; así como la determinación de los tiempos de retención para cada uno como se observa en el cuadro 14 cada uno de los estándares presentaron tiempo de retención diferentes lo que permite la identificación de los azúcares que puedan estar presentes en los extractos.

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Cuadro 14. Identificación de estándares de azúcares por HPLC No. Estándar Tiempo de retención (min) 1 Trehalosa 3.71 2 Glucosa 3.81 3 Fructosa 3.98 4 Lactosa 4.89 5 Galactosa 5.59 6 Xilosa 7.63 7 Ramnosa 8.16 8 Maltosa 8.68 9 Sucrosa 8.88

En los seis extractos de hongos analizados se logró la identificación de trehalosa en todas las muestras, glucosa y fructosa solo se identificaron en cuatro extractos; los demás estándares se encuentran ausente en las muestras.

Cuadro 15. Detección de azúcares en extractos por HPLC

Azúcares

Extractos de hongos

alosa

h

Xilosa

Lactosa

Sucrosa

Maltosa

Glucosa

Fructosa

Ramnosa

Galactosa Tre

Amanita complex (et) + + + ------Amanita complex (ac) + + ------Boletus edulis (et) + + + ------Cantharellus lateritus (et) + ------Cantharellus lateritus (ac) + ------Ganoderma lucida (et) + ------(+) Presencia de azúcar, (-) ausencia de azúcar, (ac) acuoso, (et) etanólico

La cuantificación de azúcares muestra que los valores más altos se encuentran en la muestra de Amanita siendo la trehalosa la que se encuentra en mayor cantidad, seguida de la glucosa y en menor cantidad fructosa.

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Cuadro 16. Cuantificación de azúcares en extracto por HPLC (%)

Muestra Repetición Trehalosa Glucosa Fructosa 1 0.26 0.16 0.08 Amanita caesarea 2 0.24 0.16 0.09 complex (etanólico) 3 0.28 0.14 0.08 1 0.15 0.10 --- Amanita caesarea 2 0.18 0.10 --- complex (acuoso) 3 0.14 0.13 --- 1 0.12 0.11 0.10 Boletus edulis 2 0.15 0.14 0.10 (etanólico) 3 0.19 0.23 0.09 1 0.21 ------Cantharellus lateritus 2 0.19 ------(etanólico) 3 0.19 ------1 0.21 ------Cantharellus lateritus 2 0.21 ------(acuoso) 3 0.21 ------1 0.24 ------Ganoderma lucida 2 0.23 ------(etanólico) 3 0.19 ------

Con los resultados positivos de la prueba cualitativa, se prosiguió a realizar la cuantificación de la actividad antioxidante por la técnica micrométrica de DPPH, en donde se observó que los extractos etanólicos presentaron la mayor actividad. Agaricus y B. edulis presentaron una buena actividad antioxidante por DPPH (CI50 1.99 y 2.46mg/mL respectivamente), ninguno de los extractos superaron a los estándares pero su valor está cercano al valore reportado por el estándar de rutina.

La prueba con el radical de ABTS, permite evaluar la actividad antioxidante de compuestos con características más apolares, se observó un comportamiento similar en las muestras; las muestras que presentaron una mayor actividad en base a DPPH también lo evidenciaron en ABTS, lo que demuestra las correlaciones entre los resultados en dos pruebas distintas.

Los valores de CI50 de los extractos acuosos, determinados por ABTS fueron menores a los de DPPH, este resultado tiene coherencia con por la naturaleza de los compuestos polares presentes en el extracto acuso que se detectan mejor con el método de ABTS.

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Cuadro 17. Evaluación de la actividad antioxidante

ABTS CCF con DPPH Especie Solvente CI 50 DPPH CI 50 (mg/mL) (mg/mL) Etanol +++* 2.46±0.10 6.18±0.17 Boletus edulis Acuoso +++ 2.63±0.07 4.87±0.21 Amanita caesarea Etanol +++ 2.63±0.01 12.93±1.73 complex Acuoso ++ N.D N.D Etanol ++ > 20 > 20 Cantharellus lateritius Acuoso ++ > 20 > 20 Etanol ++ > 20 13.27±0.60 Armilaria polymyces Acuoso ++ 17.07±0.05 15.17±1.26 Etanol +++* 1.99±0.10 5.82±0.17 Agaricus sp Acuoso +++ 2.83±0.07 6.97±0.21 Etanol + 13.33±0.01 18.63±1.89 Ganoderma lucida Acuoso + 19.43±0.01 18.76±0.98 Rutina +++ 0.167±0.006 0.85 ± 0.04 Quercetina +++ 0.075±0.001 0.10 ± 0.015 Estándares Vitamina C +++ 0.088±0.011 0.21 ± 0.01 Trolox +++ 0.115±0.001 0.30 ± 0.013 TBHQ +++ 0.115±0.001 0.19 ± 0.01

Se puede observar que la cantidad de fenoles totales se encuentra relacionada con la actividad antioxidante; ya que B. edulis presentó la mejor actividad antioxidante de las dos muestras y tiene la mayor cantidad de fenoles, hay una mayor cantidad de compuestos fenólicos en el extracto acuso que en el etanólico; pero la actividad antioxidante según DPPH del etanólico fue superior, por lo que se puede determinar que en el extracto acuoso hay más compuestos fenólicos pero no todos ejercen una acción antioxidante.

En los extractos de C. lateritius se observa la menor cantidad de fenoles en ambos tipos de extractos, esto concuerda con el hecho que dichos extractos son los que menor cantidad de actividad antioxidante reportaron según DPPH y ABTS.

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Cuadro 18. Cuantificación de fenoles totales en extracto expresado como ácido gálico

Especie Solvente µg de ácido gálico/g de extracto Etanol 22.12±0.68 Boletus edulis Acuoso 29.95±0.97 Etanol 17.87±0.53 Amanita caesarea complex Acuoso 4.62±0.19 Etanol 11.61±0.32 Cantharellus lateritius Acuoso 8.52±0.22 Etanol 6.24±0.19 Armilaria polymyces Acuoso 17.71±0.52 Etanol 20.02±0.58 Agaricus sp Acuoso 25.59±0.77 Etanol 26.24±0.91 Ganoderma lucida Acuoso 14.36±0.56

Se empleó otra técnica para evaluar la actividad antioxidante de los extractos, midiendo su capacidad para reducir el estado de oxidación de una molécula; empleando como molécula oxidada el ión férrico y midiendo la capacidad para reducirlo a ión ferroso, a esta técnica se le conoce como poder reductor de hierro (FRAP por sus siglas en ingles). Según como se observa en el cuadro 15 los extractos de B. edulis son lo que mejor actividad la presentan ya que por son lo que por gramo de extracto forman mayor cantidad de gramos de ión ferroso a partir del ión férrico; pero no supera la actividad presentada por los estándares. Estos datos concuerda con lo observa en las pruebas de DPPH y fenoles totales.

Así mismo se puede observar la relación de miligramos de cada uno de los estándares en gramo de extracto según la reducción de hierro; se observa que los extractos de B. edulis son los que mayor relación tienen con los estándares, lo que concuerda con los resultados obtenidos en la evaluación de la actividad antioxidante.

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Cuadro 19. Actividad antioxidante de los extractos en base al poder reductor de hierro.

Especie Extracto g Fe+2 formado/g extracto Etanol 3.53±0.12 Boletus edulis Acuoso 3.25±0.16 Etanol 2.62±0.11 Amanita caesarea complex Acuoso 0.32±0.01 Etanol 0.68±0.04 Cantharellus lateritius Acuoso 0.42±0.03 Etanol 3.32±0.11 Armilaria polymyces Acuoso 1.10±0.02 Etanol 4.33±0.21 Agaricus sp Acuoso 1.25±0.16 Etanol 0.98±0.01 Ganoderma lucida Acuoso 0.22±0.03

Vitamina C 30.75±1.88 Quercetina 66.03±7.08 Trolox 23.19±1.60

TBHQ* Estándar 36.57±1.74

Las primeras pruebas realizadas por cromatografía en capa fina evidencia que los extractos etanólicos presentan la capacidad de inhibir la enzima ureasa, lo que se nota por decoloración del reactivo revelador. Estas primeras pruebas permiten evidenciar el potencial biológico que pueden presentar los extractos al inhibir esta enzima y pensar su posible uso como coadyuvante en el tratamiento de infecciones por Helicobacter pylori, la cual emplea dicha enzima como mecanismo de defensa. Aún falta hacer la comparación con estándares para determinar si la actividad es similar o mayor a la que presentan los estándares.

Cuadro 20. Evaluación de la actividad antiureasa por CCF en extractos etanólicos de hongos

Especie Banda Color Rf Boletus edulis 1 Blanco 0.5 Amanita caesarea complex 1 Blanca 0.5 Cantharellus lateritius 1 Blanca 0.5 Armilaria polymyces 1 Blanca 0.5 Agaricus sp ------Ganoderma lucida ------Ácido clorogénico 0.1% (10µL) 1 Blanca 0.65 Interpretación: (+ posee poca actividad), (++ posee moderada actividad), (+++ posee buena actividad), (- no posee bastante actividad)

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Se realizó una extracción de aceite fijo de los hongos, como se puede observar en el cuadro de resultado los porcentajes se encuentran entre 1.87 hasta el 4.5%, siendo el mayoritario el de Boletus edulis, dando un porcentaje interesante de rendimiento que se puede emplear en la formulación de productos.

Cuadro 21. Porcentaje de rendimiento de Aceite fijo

Especie Porcentaje de Rendimiento Boletus edulis 4.5% Amanita caesarea complex 4.3% Cantharellus lateritius 2% Armilaria polymyces 2% Agaricus sp 1.87% Ganoderma lucida 2.1%

Se realizó la composición nutricional de los hongos y se observa el alto contenido de fibra curda en la especie Boletus edulis, este análisis proporciona una visión general del valor nutricional que aportan estos hongos comestibles en la alimentación.

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Cuadro 22. Composición nutricional de hongos

Materia Extracto Proteína Extracto Libre Muestra Estado Agua Fibra cruda % Cenizas seca total etéreo cruda de Nitrógeno Fresco 17.83-17.84 82.15-82.17 1.78-1.79 40.42-40.44 31.51-31.52 7.10-7.12 19.15-19.16 Boletus edulis Seco ------2.17-2.19 49.20-49.22 38.34-38.38 8.64-8.66 1.59-1.61 Amanita Fresco 17.21-17.25 82.75-82.79 4.46-4.50 29.39-29.43 33.75-33.76 11.69-11.70 20.64-20.66 caesarea Seco ------5.40-5.44 35.52-35.54 40.77-40.81 14.13-14.15 4.11-4.13 complex Cantharellus Fresco 9.41-9.43 90.57-9.59 3.82-3.84 10.76-10.80 25.40-25.42 18.99 40.95-41.05 lateritius Seco ------4.22-4.24 11.88-1.92 28.04-28.06 20.97 34.82-34.90 Armilaria Fresco 6.98-7.02 92.98-93.02 1.09-1.11 6.74-6.78 18.20-18.22 18.75 55.17-55.21 polymyces Seco ------1.16-1.20 7.24-7.28 19.56-19.60 20.16 51.80-51.82 Fresco 16.29-16.35 83.65-83.71 1.30-1.34 9.38-9.48 48.00-48.02 11.97-11.99 29.23-29.33 Agaricus sp Seco ------1.55-1.59 11.20-11.32 57.33-57.41 14.30-14.32 15.45-15.51 Ganoderma Fresco 15.51-15.75 89.75-89.99 5.46-5.50 28.39-28.43 31.91-32.32 7.08-7.12 18.15-18.16 lucida Seco ------6.40-6.44 32.52-32.54 28.44-28.46 22.97 37.82-37.90

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Como se observa en el cuadro de resultados 23 ninguna de las seis muestras analizadas presentó la capacidad para inhibir el crecimiento bacteriano, lo que evidencia que su capacidad antibacteriana es muy escasa y si la tiene la misma es a una concentración mayor de 1mg/mL, la cual es la concentración de punto de corte del estudio.

Cuadro 23. Evaluación de la actividad antibacteriana

Extracto Extracto A B C D E F G H Etanólico ------Boletus edulis Acuoso ------Etanólico ------Amanita caesarea complex Acuoso ------Etanólico ------Cantharellus lateritius Acuoso ------Etanólico ------Armilaria polymyces Acuoso ------Etanólico ------Agaricus sp Acuoso ------Etanólico ------Ganoderma lucida Acuoso ------(-) Sin actividad, (+) Con actividad Staphylococcus aureus = A, Salmonella = B, Mycobacterium smegmotis = C, Bacillus subtilis = D, Pseudomona aeruginosa = E, Candida albicans = F, Bacillus subtilis subsp. Spizizenii = G, Escherichia coli = H.

Se observa que las muestras no ocasionaron la muerte de los nauplios en sus diferentes concentraciones, por lo que se considera sin actividad citotóxica.

Cuadro 24. Actividad citotóxica contra Artemia salina 50 25 0.12 % DL 50 Muestra Extracto 100µL µL µL µL Mortalidad (mg/mL) Boletus edulis Etanólico 0/10* 0/10 0/10 0/10 0 >1 Amanita caesarea Etanólico 0/10* 0/10 0/10 0/10 0 >1 complex Cantharellus Etanólico 0/10* 0/10 0/10 0/10 0 >1 lateritius Armilaria Etanólico 0/10* 0/10 0/10 0/10 0 >1 polymyces Agaricus sp Etanólico 0/10* 0/10 0/10 0/10 0 >1 Ganoderma lucida Etanólico 0/10* 0/10 0/10 0/10 0 >1 * Muertos/Vivos

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Cuadro 25. Análisis de oligoelementos en muestras secas

% Ppm Muestra N P K Ca Mg Na Cu Zn Fe Mn Boletus 6.00±0.42 1.49±0.06 5.04±0.10 0.12±0 0.11±0.01 1300±50 28.33±5.77 66.67± 12.58 38.33± 2.89 6.67± 2.89 edulis Amanita caesarea 3.04±0.29 0.87±0.16 5.10±0.16 0.12±0.01 0.12±0.01 266.67±14.43 31.67±5.77 71.67±10.4 185±20 11.67±2.89 complex Cantharellus 3.19±0.61 1.34±0.09 5.37±0.13 0.27±0.03 0.13±0.01 375± 43.30 15±0 95±10 138.33±25.66 46.67±5.77 lateritius Armilaria 2.1 ± 0.1 0.4 ± 0.01 1.9 ± 0.2 0.2 ± 0.09 0.2 ± 0.02 101.7 ± 10.4 11.7 ± 2.9 31.7 ± 2.9 26.7 ± 2.9 11.7 ± 5.7 polymyces Agaricus sp 2.5 ± 0.1 0.3 ± 0.01 1.8 ± 0.3 0.8 ± 0.2 0.3 ± 0.03 83.3 ± 7.6 10.0 ± 0.0 30.0 ± 0.0 33.3 ± 5.8 21.7 ± 7.6 Ganoderma 3.8 ± 0.1 0.4 ± 0.01 2.2 ± 0.3 0.4 ± 0.08 0.3 ± 0.03 90.0 ± 13.2 10.0 ± 0.0 23.3 ± 2.8 40.0 ± 10.0 21.7 ± 2.9 lucida

Trabajando en conjunto con la Escuela de Nutrición se realizó la propuesta de cinco platillos empleando el hongo fresco, de igual manera se trabajo con extractos y material seco lo cual permitió diversificar las formas de preparación de los hongos y tener otras alternativas de la incorporación de los hongos comestibles, en diferentes platillos tradicionales, con la ventaja que utilizando el material seco se puede conservar por más tiempo y en el caso del extracto se obtiene una mayor concentración de los metabolitos extraídos, aprovechando el valor nutricional y antioxidante.

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Cuadro 26. Propuesta de productos en base a hongo fresco

Alimento Muestra Ingredientes Procedimiento Relleno Cocer las papas con un 150 g papa poco de sal. 5.0 g margarina Machacar las papas 100 g hongos con una pizca de 20 g zanahoria pimienta 10 g chile pimiento Rallar la zanahoria y 10 g cebolla picar el chile pimiento, 6.5 g tomate cebolla y toomate. Tacos de hongo 2.0 g ajo Picar y sofreír los ½ cda aceite. hongos con ajo Masa. Mezclar todos los 3 tz. Vegarina ingredientes 1 tz. Mazeca Preparar las tortillas y 2 tz. Agua rellenar Freir los hongos hasta dorar. 20g de cebolla Sofreír la cebolla y el 2.0g de ajo ajo 2 cda aceite Batir huevo, empanizar Hongo empanizado 5 cda vegarina los hongos Hongos enteros Freír los hongos con

1 huevo aceite. 100g hongos Calentar agua con la 750ml leche leche, en agua tibia, 375ml agua mezclar la vegarina 50g vegarina hasta no tener grumos. 1 cda sal Hervir. 30g cebolla En un sartén sofreír la Sopa de hongo 2 g ajo cebolla, ajo y hongos 5 g pimiento con la mantequilla y un 17 g mantequilla poco de sal y pimienta. Laurel Colocar el sufrito en la mezcla liquida y dejar hervir por 7 minutos. 3 tz. Vegarina Sofreír los hongos, 1 tz. Mazeca cebolla y ajo 2 tz. Agua Preparar la mezcla para 100 g hongos tortillas Pupusas de hongo 10 g cebolla Rellenar y freir. 2 g ajo 5 g margarina Queso Oaxaca Aceite

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Cuadro 27. Propuesta de productos en base a hongo seco y extracto

Productos Propuestos Horchata Dip Caramelo ½ libra de arroz quebrado 100 gramos de queso 100 gramos de 2 onzas de canela entera crema azúcar morena. 2 onzas de pepitoria 1 bolsita de sal de ajo 0.25 gramos de 2 onzas de ajonjolí 1 bolsita de sal de cebolla extracto etanólico de 3 gramos de hongo 1 bolsita de pimienta en hongo (Boletus (Boletus edulis) en polvo polvo edulis)

Ingredientes 1 litro de agua 0.3 gramos de hongo Azúcar al gusto (Boletus edulis) en polvo

Poner el arroz en agua por Mezclar el creso crema Fundir el azúcar a 6 horas para remojar. agregar el hongo y fuego directo y con Tostar la canela, pepitoria homogenizar. agitación constante. y ajonjolí. Sazonar al gusto con la sal Ya fundida Por aparte toscar un poco de cebolla, ajo y pimienta. incorporar el el hongo en polvo. Servir con gallegas o extracto con Licuar todos los nachos. agitación y evitando

Procedimiento ingredientes. que se pegue. Agregar al agua, endulzar Colocar en el molde.

al gusto.

Imagen Imagen

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III.1 Discusión de Resultados

En Guatemala gracias a las distintas zonas de vida del país, existe una gran diversidad de hongos y un consumo heredado por tradición, lo cual es notorio en la población campesina del altiplano. Un estudio reporta alrededor de 220 especies de hongos de las cuales 56 (25.4%) son comestibles, también se determinó que solo se conocen algunos de los hongos comestibles de 29 municipios del país (Bran et al., 2002).

Los hongos más conocidos y apreciados por su comestibilidad en diferentes localidades estudiadas en Guatemala se mencionan: Amanita caesarea-complejo, Cantharellus cibarius, Lactarius deliciosus y Lactarius indigo, lo cual concuerda con los resultados obtenidos de los mercados de las 21 cabeceras departamentales del país (Sommerkamp 1990a). Los géneros con mayor número de especies reportadas son: Helvella, Morchella, Amanita, Auricularia, Cantharellus, Collybia, Laccaria, Lactarius, Pleurotus y Ramaria, cada uno con no menos de 3 especies. Debido a los diversos hábitats que han sido estudiados, se determinó que especies como Armillariella polymyces, Hydnum repandum, Pleurotus djamor, Pseudofistulina radicata y Schizophyllum commune, entre otros, tienen una distribución más amplia en el país, la cual sólo se conocía parcialmente debido al escaso número de exploraciones realizadas (Guzmán 1987, Sommerkamp 1990a, Morales 2001, Flores 2002; Molares, Bran, Cáceres & Flores, 2003).

En el presente estudio se colectaron cinco hongos Boletus edulis proveniente de San Marcos, Amanita caesarea complex, Cantharellus lateritius, Agaricus sp, colectados en Chimaltenango, Armillaria polymyces colectado en Alta Verapaz y Ganoderma lucidum un hongo cultivado por una empresa en Sacatepéquez. Se deshidrataron para evitar su degradación hasta obtener una humedad menor al 10%, posteriormente se determinó las cenizas totales, obteniéndose porcentajes por debajo del 12%, siendo los más altos C. lateritius, Agaricus sp y A. caesarea complex, lo cual concuerda con Lalotra y colaboradores que reportaron un estudio en cinco hongos (Amanita rubescens var. rubescens, Boletus edulis, Geopora arenicola, Morchella deliciosa y Sparassis crispa) los cuales presentaron contenidos de cenizas en promedio de 9.9 % (Lalotra, Bala, Kumar & Sharma, 2018). Otros estudios reportan valores de cenizas entre 5.8-11.0% (Khan, Khan, Hossain, Tania, & Udin, 2009) y entre 6.5-32.5% (Konuk, Afyon, & Yagiz, 2006).

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De acuerdo a los resultados obtenidos en la extracción se observó que los extractos etanólicos presentaron los mayores rendimientos, siendo B. edulis el más alto (63.72%). Zabastin y colaboradores (2016) reportaron en hongos colectados en Rumania los rendimientos de extractos etanólicos para B. edulis (14.69%) y C. cibarius (9.50%) y en extractos hidrometanólicos (24.31% y 31.69% respectivamente), lo cual evidencia un mejor rendimiento en los extractos etanólicos de hongos colectados en Guatemala.

Rezaeian & Purianfar (2018) reportaron el rendimiento del extracto diclorometano: metanol de Agaricus sp el cual obtuvieron un rendimiento de 17%, comparado con nuestro estudio se obtuvo con etanol al 50% un rendimiento del 33.72%, lo cual evidencia que el disolvente incluye en el porcentaje de rendimiento. Cör y colaboradores (2016) reportaron el rendimiento de extractos de diferentes disolventes en G. lucidum obteniendo rendimientos de 1.42 a 19.13%, siendo el más alto en extractos acuosos, comparado con nuestro estudio el rendimiento del extracto acuoso fue mucho menor, sin embargo al comparar el extracto etanólico cultivado en Guatemala se presentó un mayor rendimiento (16.52%), comparado con el extracto etanólico de Slovenia (6.16%), lo cual demuestra que la región geográfica es un factor extrínseco que afecta los rendimientos de extracción.

De acuerdo a los resultados obtenidos en la caracterización fitoquímica se observó la presencia de alcaloides, saponinas y flavonoides en todas las especies estudiadas, no se evidenció la presencia de cumarinas ni taninos, lo cual concuerda con otros estudios que han reportado dichos metabolitos secundarios como en Boletus edulis el cual se ha reportado la presencia de polisacáridos, flavonoides, polifenoles (ácido protocatéquico, ácido p-hidroxibenzoico), sesquiterpenos y triterpenoides (Guo et al., 2020; Sarikurkcu, Tepe, & Yamac, 2008; Tao et al., 2015; Wang et al., 2014). C. cibarius ha reportado la presencia de ácidos fenólicos (ácido protocatéquico, ácido p- hidroxibenzoico, ácido vainillínico, ácido sinapico, ácido cinámico), esteroides, ácidos grasos, carotenoides (Pang & Sterner, 1991) y compuestos indólicos, Armillaria melea también ha reportado presencia de ácido fenólicos (ácido protocatéquico y ácido sinapico) (Muszyńska, Sułkowska-Ziaja, & Ekiert, 2013).

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De especies de Agaricus se han reportado compuestos como ergosterol y β-glucanos los cuales han sido considerados marcadores ubicuos (Levitz, 2010). Se han descrito compuestos fenólicos en A. bispours tales como ácido gálico, cafeíco, ferúlico, p-coumaric, miricetina, catequinas, ácido cinámico y ácidos protocatequicos, se han identificado compuestos indólicos, derivados de benzoquinona, respecto a la presencia de carbohidratos se ha reportado en fuctosa, manitol y trehalosa (Cherno, Osolina, & Nikitina, 2013; Muszyńska, Kała, Rojowski, Grzywacz, & Opoka, 2017). Un estudio fitoquímico en Ganoderma lucidum reportó la presencia de flavonoides, fenoles, polisacáridos, terpenoides y taninos, no presentó antraquinonas ni esteroides en el material fresco (Tulsawani, Sharma & Rautela, 2019). Orole (2016) reportó los metabolitos identificados en dos extractos (acetato de etilo y hexano) obtenidos del cuerpo fructífero tales como fenoles, flavonoides, saponinas, terpenoides, glicósidos y esteroles. Otro estudio reportó los metabolitos presentes en extractos acuosos y extractos de acetato de etilo, cloroformo, hexano y diclorometano de dos especies de Ganoderma obtenidos de India los cuales fueron saponinas, terpenoides y taninos (Rajesh & Dhanasekaran, 2014). Las diferencias presentadas pueden atribuirse a la región geográfica donde se colectan las muestras y al tipo de extracto evaluado.

Respecto a la actividad antioxidante evaluada por tres métodos diferentes (DPPH, ABTS y FRAP), se observó la mayor actividad en los extactos etanólicos, especialmente en Agaricus y Boletus, los cuales presentaron la mayor cantidad de fenoles totales, lo cual concuerda con lo reportado en la literatura. En extractos de B. edulis se ha reportado actividad antioxidante por DPPH (99.35 µg/mL), .OH

O2 (1169. 62 µg/mL) y ABTS (543.26 µg/mL), el cual se ha relacionado con la presencia de los polifenoles (Lei et al., 2019). Los extractos metanólicos de A. bisporus han reportado un potencial antioxidante principalmente por la presencia de ergotioneina, α y β-tocoferol, compuestos fenólicos, lectinas, β-glucanos, arginina, ácidos grasos, oligoelementos (Muszyńska, Kała, Rojowski, Grzywacz, & Opoka, 2017). A. caesarea reportó actividad antioxidante (DPPH 6.15 %), C. cibarius (30.48%), B. edulis (48:06%) los cuales se ha correlacionado con la presencia de ácido ascórbico, flavonoides, ácido clorogénico, ácido cinámico y β-glucanos lo cual revela el potencial nutracéutico de los hongos (López-Vázquez et al., 2017). Amanita ha reportado diversos compuestos (fenoles,

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taninos, flavonoides, vitamina C, ácido fítico, licopeno, β-caronteno) e importante actividad antixodante (Greeshma et al., 2018). Se ha reportado la presencia de compuestos fenólicos en C. cibarius tales como pirogalol, ácido p-OH- benzoico, catequina, ácido cafeíco, ácido trans-cinápico, ácido benzoico, resveratrol, ácido trans cinámico, ácido gálico, ácido homogenstísico, ácido p-coumárico, demostrando una gran cantidad de compuestos fenólicos, los cuales están relacionados con la actividad antioxidante la cual fue evaluada por el método DPPH (CI 50 4.48 mg/mL), capacidad quelante de ion ferroso (CI 50 0.37 mg/mL), poder reductor a 700 nm (0.364) e inhibición de la oxidación lipidica (13.00%) (Ayvaz, 2019).

Respecto a la actividad antiureasa se observó inhibición en cuatro de las especies fúngicas por método cualitativo. Ayvaz (2019) reportó actividad enzimática en extracto metanólicos de hongos comestibles (Lactarius deliciosus, L. pyrogalus y Cantharellus cibarius) contra acetilcolinesterasa, butirilcolinesterasa, tirosinasa y ureasa a concentraciones de 0.5 mg/mL, la cual está relacionada con los compuestos fenólicos y flavonoides, evidenciando potencial.

Respecto al análisis proximal se pudo observar una importante cantidad de fibra cruda en material fresco y seco en Boletus edulis (40.42 y 49.20% respectivamente), la mayor cantidad de proteínas en Agaricus (48.00 y 57.33%), la menor cantidad de grasa en A. polymices (1.09 y 1.16%) y la mayor cantidad de carbohidratos (55.17 y 51.80%), en cenizas C. lateritus presentó la mayor cantidad (18.99 y 20-27%) y en el análisis de minerales presentó la mayor cantidad de Zn (95 ppm) y Mn (46.67 ppm), mientras que A. caesarea complex presentó la mayor cantidad de Fe (185 ppm) y Agaricus la mayor cantidad de Ca (0.8 ppm). En A. bisporus se ha reportado la presencia de Cu (25-125 mg/kg), Mg (1150-2275 mg/kg), Fe (200-400 mg/kg), Ca (460-990 mg/kg), Zn (54.81-112.75 mg/kg), Se (0.053-0.150 mg/kg) (Muszyńska et al., 2016).

Rajarathnam & Sashirekha (2003) reportaron la composición nutricional de hongos comestibles los cuales presentarón promedios de 63% de carbohidratos, 25% de proteínas, 4% de grasas y 8% de minerales representado como cenizas totales sobre base seca. En el grupo Boletus, Agrocybe

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aegerita, A. bisporus, Pleurotus eryngii y ostreatus han reportado un total de fibra de 5.5.-42.6% sobre materia seca en el cual los β-glucanos son los principales polisacáridos junto con la quitina, estos han reportado capacidad de estimular la respuesta inmunomoduladora y modulación humoral y celular lo cual puede respresentar candidatos promisorios como agentes farmacológicos como antiinfecciosos, antimutagénicos, antitumorales y anticoagulantes. El contenido de cenizas reportado va de 6-10.5% sobre base seca, los principales constituyentes en las cenizas son potasio, fósforo, magnesio, calcio, cobre, hierro y zinc (Alzand, Bofaris & Ugis, 2019).

Según los resultados obtenidos no se observó actividad antimicrobiana en los extractos evaluados sin embargo estudios previos han reportado actividad antimicrobiana de extractos secos de A. bisporus contra Staphylococcus aureus (CIM 5 mg/mL), Pseudomonas aeruginosa (CIM 15 mg/mL) la cual se ha relacionado con la presencia de quitosan y polisacáridos de alto peso molecular. Se ha mostrado actividad contra Micrococcus luteus, Micrococcus flavus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Candida albicans, y Candida tropicalis (Muszyńska et al., 2016; Öztürk et al., 2011), dichas diferencias se puede atribuir a factores intrínsecos (genéticos, ontológicos, fenológicos) y extrínsecos (método de extracción empleado, tipo de extracto).

Basados en los resultados presentados relacionados a la actividad antioxidante y composición química se evidencia el potencial de los hongos como productos de valor dietario, también de utilidad en la agricultura, medicina y cosmética.

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PARTE IV.

IV.1 CONCLUSIONES

4.1.1 Se evaluó la actividad biológica, composición nutricional y fitoquímica de cinco macromicetos para su aprovechamiento y conservación, desarrollando diferentes formas de consumir los cuerpos fructíferos como alimentos funcionales.

4.1.2 Se determinó el disolvente que extraía la mayor cantidad de sólidos para optimizar la extracción en la cual el alcohol al 50% fue el disolvente con mayor capacidad extractiva para todas las especies fúngicas evaluadas.

4.1.3 Los extactos etanólicos fueron los que presentaron el mayor rendimiento de extracción (16.52- 63.72%), mientras que los extractos acuosos presentaron menores rendimientos (0.04- 28.18 %), siendo la especie Boletus edulis la que presentó los mayores rendimientos.

4.1.4 Se caracterizaron cinco basidiomicentos mediante estudios fitoquímicos detectando la presencia de alcaloides (1 banda), saponinas (3-8 bandas), flavonoides (1-3 bandas), azúcares (3-4 bandas).

4.1.5 Todas los extractos presentaron trehalosa (0.12-0.28%), siendo el mayoritario Amanita caesarea complex; tres extractos presentaron glucosa (0.10-0.23%) y dos presentaron fructosa (0.08-0.10%) siendo el mayoritario B. edulis.

4.1.6 Se determinó la composición nutricional evidenciándose la presencia de fibra cruda (6.74- 49.22%), proteína cruda (18.20-57.41%), carbohidratos (1.59-55.21%), minerales (7.08-20.97%), y grasas (1.09-6.44%).

4.1.7 Se evaluó la actividad antioxidante en los extractos de las especies fúngicas por tres diferentes métodos evidenciándose la mayor actividad en Agaricus (DPPH CI 50 1.99 mg/mL, ABTS 5.82

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mg/mL, FRAP 4.33 g Fe+2/g extracto) y B. edulis (DPPH 2.46 mg/mL, ABTS 4.87 mg/mL, FRAP 3.53 g Fe+2/g extracto).

4.1.8 Se determinó la cantidad de fenoles totales en las especies fúngicas (6.24-29.95 µg de ácido gálico/g de extracto) siendo B. edulis el que presentó la mayor cantidad seguido de G. lucida (26.24 µg de ácido gálico/g de extracto).

4.1.9 Se evaluó la actividad antiureasa determinándose inhibición enzimática en cuatro especies por métodos cualitativos, ninguna de las especies evidenció actividad antibacteriana contra ocho cepas evaluadas y en la prueba de citotoxidad contra Artemia salina todos los extractos mostraron una

DL50 mayor a 1 mg/mL.

4.1.10 Se desarrollaron diferentes productos a base de material fúngico seco y extractos para su consumo como alimento funcional siendo el más promisorio Boletus edulis para su posible comercialización.

4.1.11 Se realizaron tres eventos para divulgar a las autoridades, actores sociales e instituciones en el campo de su competencia la información obtenida de la investigación.

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IV.2 RECOMENDACIONES

4.2.1 Se recomienda realizar fraccionamientos de los extractos más activos para continuar con la evaluación biológica.

4.2.2 Explorar el potencial farmacológico de los extractos etanólicos y metabolitos secundarios detectados en las especies fúngicas.

4.2.3 Continuar con el desarrollo y formulación de productos nutraceúticos, medicinales y cosméticos a base de los extractos derivado de las actividades mostradas.

4.2.4 Continuar con el estudio de otras especies de hongos por el potencial mostrado y la tradición de consumo especialmente en áreas rurales.

4.2.5 Promover el cultivo de hongos para consumo como alimento por el valor nutricional que presentan.

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IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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IV.4 ANEXOS

1) Información sobre precios y puntos de colecta de cada uno de los hongos en estudios.

Boletus edulis Es uno de los hongos más consumidos en la alta cocina, su valor puede estar entre los 50 a 100 euros el kilo fresco y hasta 25 euros la onza seca. En Guatemala es consumido por los habitantes de las regiones de San Marcos y Huehuetenango, su precio puede alcanzar los Q100.00 la libra, un ejemplar adulto puede llegar a pesar hasta 4 libras. La Unidad de Biodiversidad de Hongos de la Universidad de San Carlos de Guatemala, en 1998 apoyo a Asociaciones de San Marcos a la comercialización de B. edulis, logrando un producto empacado que se vendió a Q25.00 la onza seca.

Amanita caesare complex Comúnmente conocido en Guatemala como “Hongo de San Juan”, es uno de los primero hongos que aparecen al iniciar la época de lluvia, recibe su nombre en castellano por su crecimiento próximo a la fecha de celebración religiosa del día de San Juan, celebrado el 24 de junio en diversas regiones del país.

Agaricus sp Es una de las especies más consumidas a nivel mundial, dependiendo de la especie cultiva podemos observar en el mercado diferentes presentaciones la más común es el Champiñón, siendo otras variedades que han tenido un alto potencial de consumo como los Criminis o el Portobello.

Dada la gran aceptación que el Portobello tiene actualmente, se decidió para su estudio, existen en Guatemala empresas que se dedican a su producción, por lo que se contacto a una de ellas para la adquisición de aproximadamente 10 libras del producto, el cual esta calendarizado para su entrega en el mes de Julio. El precio de este hongo alcanza en los supermercados los Q45.00 la libra.

Cantharellus sp complex Son especies de alto consumo en el país, conocido popularmente como “Anacate”, su precio en los mercados puede alcanzar los Q45.00 a 50.00 la libra. Es apreciado por su esquicito sabor y textura, preparado en diferentes guisos y acompañamientos, un plato puede tener un precio de Q60.00 a Q80.00.

Lactarius indigo

Es un hongo apreciado por la población guatemalteca, aparece durante la época de lluvia y es conocido en algunas regiones del país como “Xaras o Tolores”, se comercializa mezclada con L. deliciosus, que se diferencia por ser de un color naranja, mientras que L. indigo como su nombre lo indica es de un color azul.

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A pesar de crecer en las mismas regiones que L. indigo su abundancia es menor, por lo que se evaluó la posibilidad de sustituirlo por uno de mayor abundancia, en base a los muestreos realizados en los principales mercados de los Departamentos de Sacatepequéz, Chimaltenango, Quetzaltenango y San Marcos.

2) Monografía

Boletus edulis Boletus edulis Bulliard:Fries sensu lato (Boletaceae) Sinonimias Boletus bulbosus

Tubiporusesculentus Boletus solidus

Otros nombres populares Crema, esponjita, pambazo, pana terekua, panteko, panza, panza de buey, teapiti, calabaza, vitriato, boleto comestible, panb´uk, hongo pierna de cerdo, pie gordo. Uso Es una seta comestible. Es de los hongos silvestres más valorados por los (1) consumidores. Debido a su corto período de vida de anaque por su alto contenido de humedad y su naturaleza estacional, el desecado es un método útil para extender su disponibilidad (García, Sanjuán, Bon, Carreres, & Mulet, 2005). Se le ha atribuido posibles efectos positivos en lumbago, dolor de pierna, huesos, tendones y leucorrea (Medinilla, 2008). A diferencia de otros hongos B. edulis puede ser secado y cocinado a (2) temperaturas de autoclave sin una pérdida significativa de su sabor distintivo. Por esta razón su demanda en preparados de sopa y estofados por chefs alrededor del mundo. B. edulis también es usado en la medicina tradicional de China. Por ejemplo es el ingrediente principal de shujin wan, un remedio tradicional herbolario hecho en la provincia de Taiyuan, el cual se dice que estimula la circulación sanguínea y relaja los músculos y articulacines (Hall, Lyon, Wang, & Sinclair, 1998). (1) y (2) Boletus edulis seco. Procedencia: San Marco, Guatemala. Fotografías por: Libny Pernillo 82

Descripción botánica Boletus edulis posee un estípite muy ancho, que incluso cuando el hongo aún es joven, llega a ser más ancho que el propio sombrero del hongo; y con ausencia de escamas finas. Cuando el sombrero del hongo se encuentra totalmente abierto, puede llegar a medir hasta unos 20 centímetro aproximadamente. Boletus edulis en Guatemala produce carpóforos de gran tamaño en cualquiera de las áreas donde crece en el país, además el píleo posee tonalidades anaranjadas en cuerpos fructíferos maduros. Reportes sobre la fenología de la especie en México, indican que la producción de cuerpos fructíferos está asociada principalmente a bosques de coníferas, comprende los meses de junio, julio y agosto y posee características organolépticas excelentes (Maldonado, 2010).

Hábitat

B. edulis es encontrado desde el norte de Escandinavia hasta el sur de Italia y Marruecos, y por toda Asia y Norte América incluyendo México en un amplio rango de hábitats (Hall, Lyon, Wang, & Sinclair, 1998). La distribución de los boletales, orden al cual pertenece la familia Boletaceae, en América es más amplia en el norte del continente, pues se ha observado que el número de especies disminuye a medida que se avanza hacia Sudamérica. Se encuentran en toda América incluyendo la región del Caribe. Debido a que la mayoría de los boletales son simbiontes ectomicorrícicos obligados, su distribución biogeográfica depende de la distribución de sus plantas hospederas. Algunos huéspedes para B. edulis incluyen Abies, Castanea, Castanopsis, Fagus, Keteleeria, Lithocarpus, Pinus, Picea, Quercus, and Tsuga (Hall, Lyon, Wang, & Sinclair, 1998). En Norteamérica y en partes de Centroamérica, los boletales están asociados con miembros de Betulaceae (abedules y alisos), Fagaceae (robles, encinos y hayas), Pinaceae (pino, abetos) y Salicaceae (sauces). En el Neotrópico, miembros de Fabaceae (leguminosas) Nyctaginaceae y Polygonaceae son los hospederos ectomicorrícicos predominantes (Hernández, 2013). Aparece desde finales de verano, hasta final del otoño, bajo frondosas o coníferas. Prefiere suelos ácidos. Suele crecer en grupos de varios ejemplares más o menos dispersos, más abundante en sustratos procedentes de la degradación de areniscas y conglomerados de cuarcitas con areniscas, así como granitos. Los suelos deben ser ácidos o subácidos (Zurimendi & Alves, s.f.) Es una seta que puede crecer desde la primavera hasta el otoño, pero más abundantemente cuando la estación ya esta avanzada. Es típica de los bosques de pino (Medinilla, 2008)

Composición química

Posee saponinas, principios amargos, flavonoides y azúcares reductores (Paz, 2011).

El extracto metanólico presenta 8850 mg/kg fenoles totales, 31.3 mg/g de proteínas, 4.3 % de fibra cruda, 96.3 mg/kg de cinc, 34.4 mg/kg de cobre, 54,4 mg/kg de manganeso y 812 mg/kg de hierro (Lalotra, Bala, Kumar y Sharma, 2016).

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La concentración de compuestos aromáticos como alcoholes insaturados y cetonas con ocho átomos de carbono es elevada y son responsables del aroma en hongos frescos como cocinados (Miharina, 2007)

La forma química del Zn en cuerpos fructosos macrofungícos no es muy conocida. Sin embargo, se han detectado metalotioninas como proteínas en B. edulis (Collin-Hansen, Yttri, Andersen, Berthelsen, & Steinnes, 2002).

Slejkovec, et al. (2000) encontró compuestos de Selenio: Selenito, selenocistina y selenometionina en B. edulis. Además de los selenocompuestos mencionados, Wilburn, Vonderheide, Soman, y Caruso (2004) encontraron selenometilselenocisteína.

Según Kalac, (2009) la composición aproximada del cuerpo fructoso en porcentaje de materia seca es la siguiente: Proteína cruda (26.5%), lípidos (2.8%), ceniza (5.3%), fibra (0.0%), carbohidratos (65.4%). En referente al porcentaje total de de lípidos (2.8%), el 9.8% es ácido palmítico, el 2.7% ácido esteárico, el 36.1% ácido oleico, el 42.2% es ácido linoleico y el 0.2% es ácido linolénico.

Palacios, et al. (2011) encontraron que la concentración de compuestos fenólicos totales en B. edulis era de 5.5 mg/g, mientras que la concentración de flavonoides totales fue de 2 mg/g. Según Sarikurkcu, Tepe, & Yamac (2008) es uno de los hongos comestibles con más alto contenido fenólico.

Propiedades medicinales demostradas El hongo más estudiado del género Boletus es Boletus edulis. B. edulis, demostró actividad estimuladora de la linfoproliferacion a una concentración efectiva mínima (CEM) de 125 ug/ml (Paz, 2011). Su extracto metanólico mostró una baja actividad antimicrobiana en comparación con otras especies. Sin embargo Barros, Cruz, Baptista, Estevinho, & Ferreira, (2008) reportaron una CIM = 5ug/mL contra Staphylococcus aureus, más baja que la ampicilina CIM= 6.25 ug/mL. Cabe resaltar que las bacterias grampositivas más suceptibles a la acción inhibitoria de los hongos son Staphylococcus aureus, Bacillus cereus y Bacillus subtilis. En cuanto a bacterias gramnegativas, Pseudomonas aeruiginosa fue inhibida por extractos de B. edulis (Alves, et al, 2012).

Una nueva lectina ha sido aislada de los cuerpos fructífieros de B. edulis, nombrada como BEL (B. edulis lectin), la cual inhibe selectivamente la proliferación de varias líneas celulares malignas. La lectina fue caracterizada estructuralmente como un homotetramero de una secuencia de 142 aminoácidos (Bovi, et al., 2011). Los polisacáridos A y B aislados de los cuerpos fructíferos de B. edulis se ha encontrado que tienen propiedades antiinflamatorias y vasoprotectoras en ratas macho de Wistar a las cuales se les indujo el proceso inflamatorio con carragenina en la cavidad pleural (Grzybek, Czarnecki, Szafranek, & Kaczmarek, 1992)

También se encontró que el polisacárido BEP, purificado de B. edulis administrado a ratones con tumor renal tiene actividad inmunomodulatoria y podría ser empleado como un agente terapeútico en la prevención del cáncer renal (Wang, Sun, Wu, Yang, & Tan, 2014).

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Efectos tóxicos de B. edulis Contra Artemia salina posee una concentración letal media mayor a 1 mg/ml (Paz, 2011). En España se estudió el contenido de selenio en varias setas comestibles, encontrando para B. edulis 52.7 mg/kg, concluyendo que su consumo debería ser moderado (Melgar, Díaz & García, 2009)

Algunas especies de macromicetos contienen altas concentraciones de metales tóxicos tales como cadmio (Cd) y mercurio (Hg), el consumo de hongos silvestres es reconocido como una fuente considerable de Cd y Hg en humanos. Collin, Pederson, Andersen, y Steinnes (2007) presentaron la primera evidencia de péptidos de la familia fitoquelatina que son responsables de la unión de una gran fracción de Cd en el cuerpo fructífero del macromiceto B. edulis expuesto a un exceso de metales.

Falandysz, Frankowska, & Mazur, (2007) basados en una encuesta de campo y en datos disponibles de B. edulis de varios sitios de Europa, establecieron el límite para el contenido total de mercurio de suelo no contaminado no debería exceder las 20 ug/g de en una solo estípite o carpoforo.

En el estudio de Helbling, Bonadies, Brander, & Pichler (2002) los hallazgos indican que Boletus edulis puede causar una alergia alimentaria mediante IgE debido a la digestión de la proteína de 75 kDa. Sin embargo Roncarolo, Minale, Mistrello, Voltolini, & Falagiani (1998), postularon que las reacciones adversas a la ingestión de B. edulis es debida a una deficiencia de trehalasa, una enzima requerida para el metabolismo de la trehalosa, un componete presente en los hongos.

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Grzybek, J., Czarnecki, R., Szafranek, J., & Kaczmarek, J. (1992). Evaluation of Anti-Inflammatory and Vasoprotective Actions of the Polysaceharides Isolated from Fruit Bodies of Boletus edulis. Planta Med, 58(1), 641. Hall, I., Lyon, A., Wang, Y., Sinclair, L. (1998). Ectomycorrhizal fungi with edible fruiting bodies 2. Boletus edulis. Economw Botany 52(1), 44-56. Hernández, L. (2013). Descripción microscópica y determinación de 8 especiesdel orden Boletales recolectadas como primer registro en Guatemala. (Tesis pregrado). Universidad de San Carlos de Guatemala, Guatemala. Helbling, A., Bonadies, N., Brander, K., & Pichler, W. (2002). Boletus edulis: a digestion-resistant allergen may be relevant for food allergy. Clin Exp Allergy, 32(5), 771-775. doi: 10.1046/j.1365-2222.2002.01400.x Kalac, P. (2009). Chemical composition and nutritional value of European species of wild growing mushrooms: A review. Food Chemistry 113, 9–16. doi:10.1016/j.foodchem.2008.07.077 Maldonado, M. (2010). Determinación y comparación de las microestructuras de Boletusedulis sensu lato de Guatemala con respecto a las microestructuras de BoletusedulisdeEuropa. (Tesis pregrado). Universidad de San Carlos de Guatemala, Guatemala. Medinilla, B. (2008). Informe Final Proyecto Fodecyt No. 41-2006: Evaluación biológica y fitoquímica de cinco hongos nativos de Guatemala. Melgar, M., Díaz, J., García, M. (2008). Acumulación de selenio en setas silvestres comestibles. CyTA: Journal of food, 7, (3), pp. 217-223 Misharina, T., et.al. (2007). TheComposition of VolatileComponents of Cepe (Boletusedulis)and OysterMushrooms (Pleurotusostreatus). AppliedBiochemistry and Microbiology, 45, (2), 187– 193 Palacios, I., et al. (2011). Antioxidant properties of phenolic compounds occurring in edible mushrooms. Food Chemistry 128, 674–678. doi:10.1016/j.foodchem.2011.03.085 Paz, M. (2011). Informe Final Proyecto Fodecyt No. 30-2007: Composición química y actividad inmunomoduladora y biocida de basidiomicetos comestibles en Guatemala. Roncarolo, D., Minale, P., Mistrello, G., Voltolini, S., & Falagiani, P. (1998). Food allergy to Boletus edulis. J Allergy Clin Immunol. 101, 850-851. Sarikurkcu, C., Tepe, B., & Yamac, M. (2008). Evaluation of the antioxidant activity of four edible mushrooms from the Central Anatolia, Eskisehir – Turkey: Lactarius deterrimus, Suillus collitinus, Boletus edulis, Xerocomus chrysenteron. Bioresource Technology 99, 6651–6655. doi:10.1016/j.biortech.2007.11.062. Slejkovec, Z., et al. (2000). Preliminary study on the determination of selenium compounds in some selenium-accumulating mushrooms. Biol Trace Elem Res, 75, 139–155 Wang, D., Sun, S., Wu, W., Yang, S., & Tan, J. (2014). Characterization of a water-soluble polysaccharide from Boletus edulisand its antitumor and immunomodulatory activities on renal cancerin mice. Carbohydrate Polymers, 105, 127–134. http://dx.doi.org/10.1016/j.carbpol.2013.12.085 Wilburn, R., Vonderheide, A., Soman, R., & Caruso, J. (2004). Speciation of selenium in the mushroom Boletus edulis by high-performance liquid chromatography coupled to inductively coupled plasma-mass spectrometry with a collision cell. Appl Spectr, 58, 1251–1255. Zurimendi, P., Alves, F. (s.f.) Tema 2.1 Hongos Comestibles. Universidad de Valladolid.

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3) Fotos de colecta de material fúngico

Ejemplares de B. edulis.

Venta de Hongo de San Juan en el mercado Municipal de Tecpán Guatemala.

Venta de Hongo de San Juan, en el mercado Municipal de San Juan Comalapa.

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Venta de hongos en el Km 94, Tecpán Guatemala.

4) Fotos de Boletus edulis ya colectados y desecados

5) Material fúngico de Amanita caesarea complex.

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6) Material fúngico de Cantharellus lateritius complex.

7) Material fúngico de Armilaria polymyces

8) Material fúngico de Pleurotus eryngii y Ganoderma lucida

9) Montaje de la prueba del mejor solvente de Amanita caesarea complex.

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10) Elaboración de extractos por rotavaporación

11) Determinación de la prueba del mejor solvente de Amanita caesarea complex.

12) Determinación de cenizas totales

13) Extracto seco de Amanita caesarea complex.

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14) Extracción de aceite fijo en hongos

15) Determinación de cumarinas en material y extracto seco de Boletus edulis.

Determinación de cumarinas en material y extracto seco de Amanita caesarea complex.

Fluorescencia en estándar de cumarina

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Identificación de cumarinas en extractos etanólicos de hongos.

Boletus edulis, Armilaria polymyces, Amanita caesarea complex, Cantharellus lateritius. . 16) Identificación de alcaloides, prueba en tubo

17) Cromatografía en capa fina de identificación de alcaloides

A: Amanita caesarea complex; B: Boletus edulis; C: Cantharellus lateritius; D: Armilaria polymyces; An: Antropina; AT: Atropina

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18) Prueba de espuma para identificación de saponinas

19) Cromatografía en capa fina de identificación de saponinas

Material fúngico Extracto etanóllico

(I) (II) (I) A: Amanita caesarea complex; B: Boletus edulis; C: Cantharellus lateritius; D: Armilaria polymyces; 1%: Saponina al 1%, diosgenina (II) BO= Boletus edulis, Am=Amanita caesarea complex, CA= Cantharellus lateritius, TZ= Armilaria polymyces. ESTÁNDARES= diosgenina, saponinas.

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20) Cromatografía en capa fina de identificación de flavonoides en extractos etanólicos

BO= Boletus edulis, Am=Amanita caesarea complex, CA= Cantharellus lateritius, TZ= Armilaria polymyces. ESTÁNDARES= rutina, quercetina, acido clorogenico, acido cafeico, hiperósido.

21) Cromatografía en capa fina de azucares en material seco de hongos

SJ=Amanita caesarea complex, TZ= Armilaria polymyces, CA= Cantharellus lateritius, BO= Boletus edulis, PO= Agaricus sp. ESTÁNDARES= Fucosa, Xilosa, Arabinosa, Rhamnosa, Dextrosa, Glucosa, Melibiosa, Fructosa y Ácido galacturónico.

22) Determinación de actividad antioxidante por DPPH

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23) Cuantificación de fenoles totales en extracto seco de Boletus edulis.

24) Actividad antiureasa en capa fina en extractos etanólicos de hongos

25) Fotografías de la evaluación de la actividad antibacteriana

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26) Tubos de prueba de estandarización de reducción de hierro

27) Curva de sulfato ferroso en el montaje del método de reducción de hierro para evaluación de la actividad antioxidante.

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28) Curvas de estándares en reducción de hierro Grafica # 1 Curva de quercetina en reducción de hierro

Grafica # 2 Curva de Trolox en reducción de hierro

Grafica # 3 Curva de TBHQ en reducción de hierro

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29) Elaboración de alimentos a partir de hongos fresco Pleurotus eryngii

Alimentos elaborados a partir de hongo Pleurotus eryngii: Tacos, dobladas, sopa, picado y empanizado de hongo / Base seca obtenida del análisis químico proximal para análisis de oligoelementos.

30) Capacitación en generalidades y uso de HPLC para identificación de azúcares

Fuente: RGH, ciudad de Guatemala

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PARTE V

V.1 INFORME FINANCIERO

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