CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE RIZÓBIOS Clitoria Fairchildiana R
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CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE RIZÓBIOS Clitoria fairchildiana R. A. Howard Maura Santos Reis de Andrade da Silva Rio de Janeiro 2015 MAURA SANTOS REIS DE ANDRADE DA SILVA CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE RIZÓBIOS Clitoria fairchildiana R. A. Howard Trabalho de Conclusão de Curso, TCC, apresentado ao curso de Graduação de Ciências Biológicas da UEZO como parte dos requisitos para a obtenção do grau de bacharel. Orientador: Dr. Ederson da Conceição Jesus Co-orientador: Dr. Sergio Miana de Faria Rio de Janeiro Julho de 2015 Dedico este trabalho a Deus e a todos que de alguma forma estiveram ao meu lado para a concretização deste sonho. AGRADECIMENTOS A Deus acima de tudo, pois sei que sua bondade e misericórdia me acompanham em todos os dias da minha vida e que sem Ele eu não teria chegado até aqui. Á minha querida mãe, Ubiranilce Santos, pela compreensão em todos os momentos, pelas suas orações e ao amor demonstrado todos os dias através de suas palavras e apoio. Ao meu pai, João Batista, que torceu e vibrou com cada conquista e que sempre esteve ao meu lado. Aos meus irmãos, Camilla, Carolina, Natália e Vitor, pelo carinho, incentivo e amizade verdadeira. Ás minhas tias Isanir e Idalete, onde a peculiaridade começa pelos nomes, assim como no amor e dedicação aos seus sobrinhos. Sou muito sortuda! Aos meus grandes amigos adquiridos na Embrapa, Claúdio Pereira e Roberto Carlos, que os conselhos e camaradagem foram genuínos em todas as horas. Ao Joel Quintino, onde a bondade e a sede de ajudar ao próximo foram sempre um exemplo para mim Aos meus queridos orientadores, Ederson Jesus e Sergio de Faria, por me mostrarem o caminho da pesquisa e pela incrível oportunidade em conhecê-los. Ao Ronaldo Figueiró, pelo empenho em cada detalhe e por ensinar a semear caminhos e colher conquistas e realizações Aos meus colegas e professores da UEZO, em especial, Felipe Processi, Thiago Fonseca, Thiogo Paulo, Ricardo Torres e Liliana Lemos. Ás minhas grandes amigas, Liandra Alvarez e Isabelly Santos, por fazerem essa caminhada mais leve e divertida, na qual a companhia foi sempre o combustível para seguirmos em frente. Ao grupo RAD do laboratório de leguminosas florestais da Embrapa Agrobiologia, principalmente a eles, Adriana, Fernando, Marcelo, Khadidja , Iohann, Jairo e Pedro. Ás minhas grandes amigas, Amanda, Jéssica e Larisse por estarem a tanto tempo ao meu lado e por me incentivarem a seguir em frente Aos meus amigos do CEFETEQ , Dandara, Isabelle , Milton e Larissa , tudo começou com vocês, todo apoio e amizade sempre será lembrado. Ao Braulinho e a Bianca, que são os melhores alunos do mundo. À Embrapa Agrobiologia, pelo apoio a realização desse trabalho. À FAPERJ, pelo apoio financeiro. Á toda minha família, A todos, os meus sinceros agradecimentos! “Não to mandei Eu? Esforça-te, e tem bom ânimo; não temas, nem te espantes; porque o Senhor teu Deus é contigo, por onde quer que andares.” Josué 1:9 RESUMO Clitoria fairchildiana R. A. Howard é uma leguminosa arbórea, de formação secundária, nativa da Amazônia brasileira. Esta espécie é amplamente utilizada como planta ornamental em várias regiões do Brasil devido a presença de flores e de sua grande copa, que fornece sombra, dando origem a um dos seus nomes populares, "sombreiro". Além disso, C. fairchildiana nodula com rizóbios, e essa simbiose tem um papel importante da inserção de espécies vegetais a novos ambientes. A análise desses simbiontes tem o potencial de contribuir para aumentar o conhecimento sobre a ecologia e taxonomia de rizóbios, incluindo a descrição de novas espécies. O objetivo deste estudo foi caracterizar rizóbios isolados de nódulos de C. fairchildiana coletado no Pará , em uma de suas regiões de origem, e no Sudeste do Brasil, onde foi introduzida. Rizóbios foram isolados a partir de cinco plantas inoculadas com o solo do estado do Pará, na região amazônica, e de três plantas inoculadas com o solo do estado de Minas Gerais, na região Sudeste. Após o isolamento, as bactérias incluídas neste estudo tiveram sua capacidade de induzir a nodulação em leguminosas confirmados pela re-inoculação. A análise de BOX-PCR agrupou os isolados de acordo com sua origem, indicando uma relação entre a localização geográfica e a taxonomia dos rizóbios nodulando C. fairchildiana. Quatorze isolados foram escolhidos com base na análise de BOX-PCR e tiveram seus genes 16S rRNA e nodC sequenciados. Os isolados foram classificados como pertencentes aos gêneros Bradyrhizobium, Burkholderia e Delftia. C. fairchildiana foi capaz de estabelecer simbiose com várias espécies de bactérias nodulíferas de dois diferentes gêneros, caracterizando-a como uma leguminosa promíscua. Palavras-chave: Taxonomia de Rizóbios. Sequenciamento . Nodulação.Leguminosas arbóreas ABSTRACT Clitoria fairchildiana R. A. Howard is a legume tree, native from secondary formations of the Brazilian Amazon. This species was extensively used as an ornamental plant in several other regions of Brazil due to its flowers and large canopy, which provides shadow, giving origin to one of its common names, “sombreiro”. C. fairchildiana nodulates with rhizobia, but its symbiosis has not been extensively studied yet. The examination of their symbionts has the potential to contribute to increase the knowledge about the ecology and taxonomy of rhizobia, including the description of new species. The objective of this study was to characterize rhizobia isolated from nodules of C. fairchildiana collected in their region of origin, and in the Southeast of Brazil, where it was introduced. Rhizobia were isolated from five plants inoculated with soil from Pará State, in the Amazon region, and from three plants inoculated with soil from Minas Gerais State, in the Southeast region. Besides, nodules were sampled from specimens of C. fairchildiana in the state of Rio de Janeiro. All bacteria included in this study had their ability to induce nodulation in legumes confirmed by their re-inoculation .The BOX- PCR analysis grouped the isolates accordingly to their origin, indicating a relationship between geographic location and the taxonomy of rhizobia nodulating C. fairchildiana. Fourteen isolates where chosen based on a BOX-PCR analysis and their 16S rRNA and nodC genes were sequenced. The isolates were classified as belonging to the genera Bradyrhizobium, Burkholderia and Delftia. C. fairchildiana was able to establishing symbiosis with various species of bacteria nodulating two different genera, and thus characterizing it as a promiscuous legume. Keywords: Rhizobial taxonomy. Sequencing. Nodulation. tree legumes LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 - Perfis de BOX-PCR para bactérias isoladas de nódulos de Clitoria fairchildiana coletados de plantas provenientes de Minas Gerais (MG) e do Pará (PA).. .......................... 19 Figura 2 - Árvore filogenética baseada em sequências do gene 16S rRNA de bactérias isoladas de nódulos de Clitoria fairchildiana coletados de plantas provenientes de Minas Gerais (MG) e do Pará (PA).O método utilizado para construção da árvore foi o Neighbor- Joining, com 2000 replicatas de bootstrap. O modelo evolucionário utilizado foi o de Tamura-3-parâmetros com sítios invariáveis..........................................................................20 Figura 3 – Árvore filogenética baseada em sequências do gene nodC de bactérias isoladas de nódulos de Clitoria fairchildiana coletados de plantas provenientes de Minas Gerais (MG) e do Pará (PA).O método Neighbor-Joining foi utilizado para construção da árvore, com 2000 replicatas de bootstrap. As distâncias foram calculadas pelo método de correção de Poisson. As análises foram realizadas com o programa MEGA6. ...... Erro! Indicador não definido.1 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 11 2. REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................................... 122 2.1. Sombreiro (Clitoria fairchildinana R. A. Howard) ......................................................... 122 2.2. A importância da Fixação Biológica de Nitrogênio ..................................................... 112 2.3. Diversidade genética dos rizóbios ..................................................................................... 13 3. OBJETIVO ........................................................................................................................... 15 4. METODOLOGIA ................................................................................................................. 15 4.1. Origem dos isolados .......................................................................................................... 15 4.2. Extração de DNA e análise molecular ............................................................................... 16 4.3. Precipitação ....................................................................................................................... 17 4.4. Sequenciamento e montagem dos contigs ......................................................................... 17 4.5. Alinhamentos e análises filogenéticas ............................................................................... 17 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................................... 18 6. CONCLUSÃO ...................................................................................................................... 23 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................