II JORNADAS BIENALES DE JÓVENES INVESTIGADORES EN PROTEÓMICA La organización de las Jornadas y la edición de este número especial han corrido a cargo de los siguientes investigadores:
Ana María Maldonado Alconada (Universidad de Córdoba) Sira Echevarría Zomeño (Universidad de Córdoba) Raquel González (Universidad de Córdoba) Jesús Vázquez (CBM-SO, UAM, Madrid)
Montse Carrascal (CSIC-UAB, Barcelona) Ángel García (Universidad de Santiago de Compostela) Marina Gay (CSIC-UAB, Barcelona) Antonio Marcilla (Universidad de Valencia) Salvador Martínez (CNB-CSIC) Pablo Martínez-Acedo (CBM-SO-UAM ) Antonio Martínez-Ruiz (Hospital de La Princesa, Madrid) Angela Moreno (IAS-CSIC, Córdoba) Pedro Navarro (CBM-SO-UAM) Ana Oleaga (CSIC, Salamanca)
Miren J. Omaetxebarría (Universidad País Vasco) Aida Pitarch (Universidad Complutense Madrid) Manuel Rodríguez (Universidad de Córdoba) Eva Rodríguez-Suarez (CIC-Biogune) Cristina Ruíz (INIBIC –A Coruña) Luis Valledor (Universidad de Oviedo) Federico Valverde (CSIC Sevilla)
3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 5
Sede social: Instituto de Biomedicina de Valencia, C.S.I.C. c/. Jaime Roig, 11. 46010 Valencia 7HO )D[ C.I.F.: G-97465629. Nº. Registro Nacional de Asociaciones: 584180.
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Junta Directiva: PROTEÓMICA Fernando J. Corrales. Presidente CIMA - Universidad de Navarra, Pamplona [email protected] Revista de la Sociedad Española Fernando Vivanco. Vicepresidente de Proteómica Universidad Complutense, Fundación Jiménez Díaz, Madrid [email protected] Manuel M. Sánchez del Pino. Número 5, Febrero 2010 Secretario Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia [email protected] EDITORES RESPONSABLES: Eliandre de Oliveira. Tesorera Jesús V. Jorrín Plataforma de Proteómica, Parc Cientific Jesús Vázquez de Barcelona [email protected] COMITÉ EDITORIAL: Vocales Juan Pablo Albar Ignacio Casal. Juan J. Calvete CIB, CSIC, Madrid [email protected] Montserrat Carrascal Concha Gil. Ignacio Casal Universidad Complutense de Madrid Fernando Corrales [email protected] Ángel García Juan Pablo Albar. Concha Gil CNB, UAM, CSIC, Madrid [email protected] Ana María Maldonado Alconada Jesús Jorrín. Antonio Martínez Ruiz Universidad de Córdoba Lucía Monteoliva [email protected] Ángela Moreno Jesús Vázquez. CBMSO,CSIC-UAM, Madrid Eliandre de Oliveira [email protected] Manuel Sánchez del Pino Juanjo Calvete. Fernando Vivanco IBV, CSIC, Valencia [email protected] Ángel García. CORRESPONDENCIA EDITORIAL: Universidad de Santiago de Compostela Jesús V. Jorrín Novo (Dpto. de Bioquímica y Biología [email protected] Molecular, Universidad de Córdoba. Campus de Lucía Monteoliva. Rabanales, Ed. Severo Ochoa (C6), 14071 Córdoba. Universidad Complutense de Madrid E-mail: [email protected]) [email protected] Montserrat Carrascal. IIBB, CSIC, IDIBAPS, Barcelona EDITA: [email protected] SEPROT 6 3527(Ï0,&$1Ò0(52129,(0%5(
PROTEÓMICA. Revista de la Sociedad Española de Proteómica
Editada por: Sociedad Española de Proteómica
Periodicidad: Semestral (dos números por año, enero-febrero y julio-septiembre).
Contenidos: se publicarán artículos originales, comunicaciones breves, artículos de revisión, artículos de difusión, tutoriales, opiniones, notas, resumen de tesis doctorales, y comentarios sobre cualquier aspecto relacionado con la proteómica. Se priorizarán artículos originales sobre aspectos metodológicos o de apli- cación al estudio de sistemas biológicos. Incluye información sobre nuestra Sociedad, personas, grupos e instituciones que la componen.
Idioma: será el castellano, aunque se admiten contribuciones en otras lenguas, preferentemente inglés.
Distribución: España y Latinoamérica, aunque pretendemos que tenga un carácter internacional mediante la distribución a otros países. Se enviarán, sin coste alguno, a los socios de la SEProt, Unidades y Servicios, así como a instituciones y organizaciones públicas o privadas miembros de la sociedad o con actividad relevante en el campo de la proteómica.
Publicación: habrá una versión impresa, y una versión “on-line” que aparecerá en la página web de la SE- Prot y de la Universidad de Córdoba.
Editores responsables: Jesús V. Jorrín Novo y Jesús Vázquez
Comité editorial: Juan Pablo Albar, Juan J. Calvete, Montserrat Carrascal, Ignacio Casal, Fernando Corra- les, Ángel García, Concha Gil, Ana María Maldonado Alconada, Antonio Martínez Ruiz, Lucía Monteoliva, Ángela Moreno, Eliandre de Oliveira. Manuel Sánchez del Pino y Fernando Vivanco
Correspondencia Editorial: Jesús V. Jorrín Novo Dpto de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Córdoba. Campus de Rabanales, Ed. Severo Ochoa (C6), 14071 Córdoba. E-mail: [email protected]
Instrucciones a los autores: http://www.cbm.uam.es/seprot/
Envío de los manuscritos: Mediante correo electrónico ([email protected]).
I.S.S.N.: 1888-0096 Depósito Legal: CO-1005-07 Edita: SEPROT (Sociedad Española de Proteómica) www.cbm.uam.es/seprot
Imprime: Argos Impresores S.L. Córdoba. 3527(Ï0,&$1Ò0(52129,(0%5( 7
Ë1',&('(&217(1,'26
Editorial Jesús V. Jorrín Novo 17
Las II Jornadas para Jóvenes Investigadores en Proteómica, Córdoba 2010 Jesús Vázquez, Ana M. Maldonado-Alconada, Sira Echevarría-Zomeño, Raquel González 18
1. BIOINFORMÁTICA Mesa redonda sobre herramientas en bioinformática Salvador Martínez-Bartolomé, Pedro Navarro, Alex Campos, Marco Trevisán-Herraz, Juan Antonio Vizcaíno, Alberto Medina 20
$QHZYHUVDWLOH¿OHWUDQVODWRUIRU3URWHRPLFVVWDQGDUGV Alberto Medina, Salvador Martínez-Bartolomé, J. Pablo Albar 21
Open-source bioinformatics solutions for the analysis of mass spectrometry-based proteomics data: pipelines and quantitation Alexandre R. Campos 22
Java API for MIAPE generation Emilio Salazar, Miguel A. López, Salvador Martínez-Bartolomé, Alberto Medina, J. Pablo Albar 25
7KH 3URWHRPLFV ,GHQWL¿FDWLRQV GDWDEDVH 35,'( LWV DVVRFLDWHG WRROV DQG WKH ProteomeXchange consortium Juan Antonio Vizcaíno, Florian Reisinger, Richard Côté, Henning Hermjakob 26
Proteopathogen, una base de datos de proteínas para el estudio de la interacción Candida albicans – hospedador Vital Vialás, Rubén Nogales-Cadenas, César Nombela, Alberto Pascual-Montano, Concha Gil 28
Bioinformatics tools for inferring immune-related functions from proteomic data Gema Sanz, Ángeles Jiménez, Ángela Moreno, Juan J. Garrido 30
%,20$5&$'25(6<3$72/2*Ë$6+80$1$6 3URWHLQWDUJHWVRIR[LGDWLYHVWUHVVLQGXFHGE\+XQWLQJWRQGLVHDVHLQKXPDQEUDLQ (YDOXDWLRQRIDQ+'PLFHPRGHO 7HW+' M. Alba Sorolla, Isidre Ferrer, José Lucas, Joaquim Ros, Elisa Cabiscol 32
,GHQWL¿FDFLyQ PHGLDQWH SURWHyPLFD GH SRVLEOHV ELRPDUFDGRUHV SODTXHWDULRV HQ síndrome coronario agudo 8 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52
Andrés F. Parguiña, Isaac Rosa, Lilián Grigorian-Shamagián, Elvis Teijeira- Fernández, Jana Alonso, Rosa Agra, José Ramón González-Juanatey, Ángel García 35
$QiOLVLVGHODH[SUHVLyQGLIHUHQFLDOGHSURWHtQDVHQHOVXHURGHUDWRQHV&%/ VLOYHVWUHV UHVSHFWR D UDWRQHV &%/ GH¿FLHQWHV SDUD &' XWLOL]DQGR XQD FROHFFLyQFRPELQDWRULDGHKH[DSpSWLGRV ProteoMiner \HOHFWURIRUHVLV' Antonio Rosal, Sonia García-Rodríguez, Esther Zumaquero, Pilar Navarro, Mercedes Zubiaur, Jaime Sancho 37
'HYHORSLQJ050$VVD\VIRU3HSWLGH4XDQWLWDWLRQ The MIDASTMZRUNÀRZDQG QtrapTM technology Antonio Serna 38
,QWHOOLJHQW8VHRI5HWHQWLRQ7LPHIRU+LJKHU2UGHU0XOWLSOH5HDFWLRQ0RQLWRULQJ Multiplexing . Scheduled MRM™ Algorithm Antonio Serna 40
2EHVLGyPLFD FDUDFWHUL]DFLyQ GHO VHFUHWRPD GHO WHMLGR DGLSRVR GH GLIHUHQWHV ORFDOL]DFLRQHVDQDWyPLFDV Arturo Roca-Rivada, Jana Alonso, Omar Al-Massad; Luisa María Seoane, Felipe Casanueva, María Pardo 40
7RS'RZQSURWHRPLFDQDO\VLVRI&6)SURWHLQVIURP$/6SDWLHQWV Claudio Diema, Alex Campos, Núria Omeñaca, Eliandre de Oliveira, Joan Guinovart, Jacques Borg, Marta Vilaseca 43
2SWLPXPPHWKRGGHVLJQHGIRU'',*(RIDUWHULDOLQWLPDDQGPHGLDLVRODWHGE\ laser microdissection Fernando de la Cuesta, Gloria Alvarez-Llamas, Irene Zubiri, Aroa Sanz- Maroto, Alicia Donado, Luis. Rodriguez-Padial, Angel Garcia-Pinto, María González-Bardera, Fernando Vivanco 45
,GHQWL¿FDFLyQ GH SpSWLGRV HVSHFt¿FRV GH FiQFHU FRORUUHFWDO PHGLDQWH HO XVR GH librerías de fagos T7 impresas en microarrays Ingrid Babel, Rodrigo Barderas, Victor Moreno, Ivan Cristobo, Gabriel Capellá, Ignacio Casal 46
'%OXH1DWLYH6'63$*(DQDO\VLVRIPXOWLSURWHLQFRPSOH[HVRIKXPDQHU\WKURF\WH membrane Irene Zubiri, Gloria Álvarez-Llamas, Fernando de la Cuesta, María González-Barderas, Fernando Vivanco 48
5HJXODWLRQ RI HSLWKHOLDOPHVHQFK\PDO WUDQVLWLRQ LQ FRORQ FDQFHU E\ Į GLK\GUR[\YLWDPLQ' DSURWHRPLFVDSSURDFK Iván Cristobo, María Jesús Larriba, Vivian De los Ríos, Ingrid Babel, Rodrigo Barderas, Alberto Muñoz, Ignacio Casal 49
&RPSUHKHQVLYHSURWHRPLFDQDO\VLVRIKXPDQHQGRPHWULDOÀXLGDVSLUDWH 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 9
Juan Casado-Vela, Eva Rodriguez-Suarez, Ibon Iloro, Amagoia Ametzazurra, Nere Alkorta, Juan A. García-Velasco, Roberto Matorra, Begoña Prieto, Sandra González, Daniel Nagore, Laureano Simón, Felix Elortza 50
,GHQWL¿FDWLRQRIELRPDUNHUVLQFRORUHFWDOFDQFHU SUH SRVWFKHPRWKHUDS\ E\ 1XFOHLF $FLGV 3URJUDPPDEOH 3URWHLQ 0LFURDUUD\V 1$33$ L),6+ DQG 613V approaches María González, Raquel Bartolomé, Jose María Sayagues, María González, Ana Laura Moro, Elena Andrada, Sahar Sibani, Josh LaBaer, Jacinto García, Alberto Orfao, Manuel Fuentes 53
'HWHFWLRQRISURVWDWHFDQFHUE\XULQH3URWHRPLFV Marina Rigau, Nuria Colome, Juan Morote, Mª Carme Mir, Carlos Ballesteros, Marta Garcia, Miguel Abal, Francesc Canals, Jaume Reventós, Andreas Doll 54
1DQR/&PDVVVSHFWURPHWU\EDVHGSURWHRPLFDQDO\VLVRIVHUXPDQGV\QRYLDOÀXLG samples from osteoarthritis patients Patricia Fernández-Puente, Jesús Mateos, Carolina Fernández-Costa, Cristina Ruiz- Romero, Francisco J. Blanco 56
)XQFWLRQDO3URWHRPLFV %HDGV±EDVHGDUUD\V\VWHPIRUELRPDUNHUGLVFRYHU\ Raquel Bartolomé, María González-González, Jose M. Sayagües, Fridtjof Lund- Johansen, Alberto Orfao, Manuel Fuentes 58
Anticuerpos a la carta combinando expresión in vitro de proteínas, tecnología de despliegue en fagos y arrays de anticuerpos Rodrigo Barderas, Ingrid Babel, Iván Cristobo, José Ignacio Casal 59
9DOLGDWLRQRI3(')DVDSRWHQWLDOELRPDUNHUIRU16&/& Sonia Blanco-Prieto, Nuria Sánchez-Otero, Ana M. Rodríguez-Piñeiro, M. Isabel Botana-Rial, Francisco J. Rodríguez-Berrocal, María Páez de la Cadena 61
8WLOL]DFLyQ GH 3URWHR0LQHU SDUD HO DQiOLVLV SURWHyPLFR GH PXHVWUDV GH OtTXLGR VLQRYLDO /6 GHSDFLHQWHVFRQRVWHRDUWULWLV Sonia García-Rodriguez, María D. Pérez-Mezcua, Antonio Rosal-Vela, Victoria Longobardo, Antonio Larios, Pilar Navarro, Raquel Largo, Gabriel Herrero-Beaumont, Jaime Sancho, Mercedes Zubiaur 63
Estudio de la Estenosis Aórtica Valvular desde un punto de vista proteómico Tatiana Martin-Rojas, Felix Gil-Dones, Luis F. Lopez-Almodovar, Fernando de la Cuesta, Gloria Álvarez-Llamas, Fernando Vivanco, Luis R.. Radial, María G. Barderas 64
0HWDEROLFODEHOOLQJRISULPDU\FXOWXUHKXPDQFDUWLODJHFHOOVWRDQDO\]HWKHHIIHFW RI,QWHUOHXNLQȕLQWKHH[WUDFHOOXODUPDWUL[PHWDEROLVP Valentina Calamia, Beatriz Rocha, Patricia Fernández, Jesús Mateos, Cristina Ruiz- Romero, Francisco J Blanco 66
,GHQWL¿FDWLRQRIGLIIHUHQWLDOSURWHLQVLQOLYHUFHOOVXSRQGHSOHWLRQRISURKLELWLQ 10 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52
Virginia Sánchez-Quiles, Enrique Santamaría, Laura Sesma, Fernando J. Corrales 68
,QWURGXFWLRQWR/XFLG3URWHRPLFV6\VWHPDQHZVROXWLRQIRUSHSWLGHDQGSURWHLQ SUR¿OLQJ DQG LGHQWL¿FDWLRQ FRPELQLQJ 5HWHQWDWH &KURPDWRJUDSK\ WR 0$/', 72)DQG72)72)0DVV6SHFWURPHWU\ Francesco Tortorella 70
02',),&$&,21(632675$'8&&,21$/(6 /LTXLG&KURPDWRJUDSK\²(OHFWURQ7UDQVIHU'LVVRFLDWLRQDQGLRQPRELOLW\VWXGLHV RQD472)PDVVVSHFWURPHWHU Keith Compson, James Langridge, Jeffery Brown, Steven Pringle, Iain Campuzano, Richard Chapman 71
6WUDWHJLHVIRUSURWHRPLFDQDO\VLVRIEORRGJO\FDWHGSURWHLQV María Ramírez-Boo, Feliciano Priego-Capote, Alexander Scherl y Jean-Charles Sanchez 72
+3/&)RVIR&KLSXQDQXHYDWHFQRORJtDSDUDHODQiOLVLVVHOHFWLYRGHIRVIRSpSWLGRV PHGLDQWH/&06 Isidro Masana. Reinout Raijmakers, Shabaz Mohammed, Albert Heck, Dayin Lin 75
,GHQWL¿FDWLRQRIDQHZSKRVSKRU\ODWLRQVLWHLQ()WUDQVFULSWLRQIDFWRU Nerea Osinalde, Miren Josu Omaetxebarria, Kerman Aloria, Ana M. Zubiaga, Asier Fullaondo, Jesús M. Arizmendi 77
(VWDEOHFLPLHQWRGHXQÀXMRGHWUDEDMRHIHFWLYRHQODFDUDFWHUL]DFLyQFXDOLWDWLYD\ cuantitativa del fosfoproteoma David Ovelleiro, Montserrat Carrascal, Joaquin Abian 79
$SUR[LPDFLRQHVPHWRGROyJLFDVSDUDHOHVWXGLRGHOHVWDGRUHGR[ WLROGLVXOIXUR GH proteínas en muestras vegetales Sira Echevarría-Zomeño, Per Hägglund, Birte Svensson, Ana M. Maldonado Alconada, Jesús V. Jorrín Novo 81
'HFLSKHULQJ WKH 61LWURV\ORPH RI Arabidopsis thaliana during the defense response Ana M. Maldonado-Alconada, Sira Echevarría-Zomeño, Christian Lindermayr, Jörg Durner, Jesús V. Jorrín-Novo 83
&DUDFWHUL]DFLyQ GH 6JOXWDWLRQLODFLyQ GH SURWHtQDV D QLYHO GH SURWHRPD 'L¿FXOWDGHV Esperanza Morato, Sira Echevarría Zomeño, Anabel Marina 85
La inhibición de la síntesis de óxido nítrico durante la colestasis inducida experimentalmente reduce la lesión hepatocelular al facilitar la homeostasis de nitrosotioles Laura M. López-Sánchez, Fernando J. Corrales, Montserrat Barcos, Isabel Espejo, Juan R. Muñoz-Castañeda, Antonio Rodríguez-Ariza 86 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 11
'HVDUUROORGHPHWRGRORJtDVSDUDODGHWHFFLyQGHPRGL¿FDFLRQHVSRVWUDGXFFLRQDOHV HQ FLVWHtQDV 6QLWURVLODFLyQ \ R[LGDFLyQ PHGLDQWH DSUR[LPDFLRQHV SURWHyPLFDV EDVDGDVHQPDUFDMHÀXRUHVFHQWH\HOHFWURIRUHVLVELGLPHQVLRQDO Daniel Tello, Rubén Fernández-Rodríguez, Antonio Martínez-Ruíz 90
$QDO\VLVRIUHYHUVLEOHDQGLUUHYHUVLEOHSURWHLQPRGL¿FDWLRQVXSRQR[LGDWLYHVWUHVV in Schizosaccharomyces pombe by proteomic approaches Sarela García-Santamarina, Susanna Boronat, Elena Hidalgo 91
La lipoproteína lipasa de rata se nitra in vivo en respuesta a la administración de lipopolisacárido Albert Casanovas, Montserrat Carrascal, Joaquín Abián, Miquel Llobera, M. Dolores López-Tejero 91
$SSOLFDWLRQRIL75$4UHDJHQWVWRUHODWLYHO\TXDQWLI\WKHUHYHUVLEOHUHGR[VWDWHRI cysteines Brian McDonagh, C. Alicia Padilla, J. Antonio Bárcena 93
3527(Ï0,&$&8$17,7$7,9$ 6ROXFLRQHV D 5HWRV $QDOtWLFRV HQ 3URWHyPLFD &XDQWLWDWLYD \ 9DOLGDFLyQ GH Biomarcadores Isidro Masana 94
/XFHV\VRPEUDVGHODFXDQWL¿FDFLyQFRQL75$4 María luz Valero, Virginia Rejas, Manuel Mateo Sánchez del Pino 96
L75$4EDVHGTXDQWLWDWLYHDQDO\VLVRISURWHLQPL[WXUHVZLWKODUJHIROGFKDQJHDQG dynamic range Juan Casado-Vela, María José Martínez-Esteso, Eva Rodríguez, Eva Borrás; Felix Elortza, Roque Bru-Martínez 98
(YDOXDWLRQRI06EEDVHGSURWHLQTXDQWL¿FDWLRQPHWKRGV Kerman Aloria, Miren Josu Omaetxebarria, Mikel Azkargorta, Johannes P. C. Vissers, Asier Fullaondo, Jesús M. Arizmendi 99
'HVDUUROOR GH XQ 0RGHOR (VWDGtVWLFR 8QLYHUVDO SDUD 3URWHyPLFD &XDQWLWDWLYD 0HGLDQWH0DUFDMH,VRWySLFR(VWDEOH Marco Trevisan-Herraz, Pedro Navarro, Elena Bonzon-Kulichenko, Pablo Martínez- Acedo, Daniel Pérez-Hernández, Estefanía Núñez, María Luisa Hernáez, Enrique Calvo, Montserrat Carrascal, Marina Gay, Inmaculada Jorge, Dolores Gutiérrez, Joaquín Abian, Concha Gil, Juan Miguel Redondo, Jesús Vázquez 101
/DEHOIUHH4XDQWLWDWLYH$SSURDFKHVLQ&6)%LRPDUNHU'LVFRYHU\ Alex Campos, Jacques Borg, Claudio Diema, Marta Vilaseca, Eliandre Oliveira 103
A comparison of quantitative proteomics methodologies on a differential experiment on test samples 12 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52
Joan Josep Bech-Serra, Núria Colomé, Marta Monge, Francesc Canals 105
7ULSOH 4XDGUXSROH 0DVV 6SHFWURPHU\%DVHG 3HSWLGH $VVD\V 8VLQJ ,QWHOOLJHQW 650 L650 Reiko Kiyonami, Alan Schoen, Amol Prakash, Huy Nguyen, Scott Peterman, Vlad Zabrouskov, Andreas Huhmer, Sarah Robinson, Martin Hornshaw, Madalina Oppermann, Nathalie Selevsek, Bruno Domon 107
3527(Ï0,&$0,&52%,$1$<'(3$5È6,726 5.1 Aspectos generales Problemas en el análisis proteómico de muestras procedentes de organismos ‘raros’ María Luz Valero, Javier Ortiz, Esther Dionís, Laura Cantero, Manuel Mateo Sánchez del Pino. 108
5.2 Proteómica de Microorganismos A) Proteómica de Bacterias Preparación de extractos proteicos bacterianos para el análisis de glicoproteínas PHGLDQWHJHOHVELGLPHQVLRQDOHV\FURPDWRJUDItDVGHD¿QLGDG Alfonso Olaya, Lidia Gómez-Gascón, Manuel J. Rodríguez-Ortega 108
Métodos de enriquecimiento de glicoproteínas bacterianas para su posterior DQiOLVLV\FDUDFWHUL]DFLyQPHGLDQWHHVSHFWURPHWUtDGHPDVDV Lidia Gómez-Gascón, Alfonso Olaya y Manuel J. Rodríguez-Ortega 110
Análisis de la enterotoxina A de Staphylococcus aureus HQ OHFKH SRU LRQL]DFLyQ PHGLDQWHGHVRUFLyQSRUOiVHUDVLVWLGDSRUPDWUL]DFRSODGDDHVSHFWURPHWUtDGH PDVDVGHWLHPSRGHYXHOR MALDI-TOF Isabel Sospedra, Carla Soler, Jose Miguel Soriano, Jordi Mañes 112
Comparación de dos técnicas proteómicas aplicadas al análisis de las proteínas de membrana de Mycoplasma genitalium Noemí Párraga-Niño, Núria Colomé, Francesc Canals, Jaume Piñol, Josep Antoni Pérez Pons, Enrique Querol, Mario Ferrer-Navarro 115
Comparative proteomic analysis of collection and clinical-isolate strains of Stenotrophomonas maltophilia Mario Ferrer-Navarro, Elias Mongiardini, Gerard Torrent, Raquel Planell, Ana Calderón, Teresa Falgueras, Isidre Giber, Xavier Daura 116
B) Proteómica de Hongos Análisis comparativo del proteoma de una cepa industrial de Saccharomyces cerevisiae en dos condiciones de cultivo Carlos Luna, Teresa García-Martínez, Miguel Curto, Juan Carlos Mauricio 118
Estudio proteómico comparativo de células de Saccharomyces cerevisiae libres y ELRLQPRYLOL]DGDV 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 13
Teresa García-Martínez, Juan Carlos Mauricio 119
(VWXGLR FRPSDUDWLYR GHO SHU¿O SURWHLFR GH FHSDV VLOYHVWUH %< \ PXWDQWH WUN GHSaccharomyces cerevisiae en condiciones de ayuno en K+ Miguel Curto, Clara Navarrete, Luis Valledor, María Luisa Hernández, José Ramos, Jesús Jorrín 121
$QiOLVLV PHGLDQWH '',*( GH OD LQWHUDFFLyQ FRQ VDQJUH GH XQD FHSD GH Saccharomyces cerevisiae potencialmente patógena aislada de suplementos dietéticos Carolina Hernández-Haro, Lucía Monteoliva, Gloria Molero, Concha Gil, María Molina 123
Análisis comparativo de diferentes aproximaciones para el estudio del proteoma de Saccharomyces cerevisiae Dolores Gutiérrez, Mª Luisa Hernaéz, Montserrat Martínez-Gomariz, María Posada, Concha Gil 124
Applying proteomic technologies to dissect molecular aspect of phytopathogenic fungi, a Botrytis cinerea approach Francisco Javier Fernández-Acero, Carlos Garrido, María Carbú, Victoria E. González- Rodríguez, Jesús Manuel Cantoral 126
*HOEDVHG SURWHRPLF DQDO\VLV RI Botrytis cinerea. The VLPSOHVW '( UHYHDOV differences in virulence-related protein abundance among strains Raquel González-Fernández, Inmaculada Redondo, Jesús V. Jorrín-Novo 128
Proteomic approach to Botrytis cinerea survival structures Victoria E. González-Rodríguez, Carlos Garrido, Maria Carbú, Jesús Manuel Cantoral, Francisco Javier Fernández-Acero 130
3HU¿OVHUROyJLFRGHODUHVSXHVWDGHDQWLFXHUSRVIUHQWHDOLQPXQRPDGHCandida en el pronóstico de las candidiasis invasivas Aida Pitarch, César Nombela, Concha Gil 131
$QiOLVLV SURWHyPLFR GH OD PDWUL] H[WUDFHOXODU 0( GH ELRSHOtFXODV IRUPDGDV por mutantes del hongo Candida albicansSDUDJHQHVTXHFRGL¿FDQSURWHtQDVTXH contienen el dominio CFEM rico en cisteína y genes implicados en glicosilación Rosario Blanes, Ana M. Pérez, Amelia Murgui, Manuel Casanova, Ángel Domínguez, José P. Martínez 133
Expresión diferencial de proteínas del citoesqueleto del macrófago tras la interacción con Candida albicans 3UREOHPDVHQODQRUPDOL]DFLyQGHODVPXHVWUDV Jose Antonio Reales-Calderón, Mª Luisa Hernáez, Mª Dolores Gutiérrez, Gloria Molero, Concha Gil 135
5.3 Proteómica de Parásitos 14 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52
3UREOHPiWLFDHQODLGHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDVGHSDUiVLWRV Javier Sotillo, Ana Pérez García, María Trelis, Dolores Bernal, Carla Muñoz-Antolí, José Guillermo Esteban, Rafael Toledo, Antonio Marcilla 136
/DV WpFQLFDV GH SURWHyPLFD DSOLFDGDV DO HVWXGLR GH ODV UHODFLRQHV SDUiVLWR KRVSHGDGRUHQODGLUR¿ODULRVLVDQLPDO\KXPDQD Javier González-Miguel, Rodrigo Morchón-García, Ana Oleaga, Mar Siles-Lucas, Ricardo Pérez-Sánchez, Fernando Simón 138
,GHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDVGHNeospora caninum implicadas en procesos de invasión y virulencia Virginia Marugán-Hernández, Javier Regidor-Cerrillo, Gema Álvarez-García, Fiona Tomley, Adriana Aguado-Martínez, Mercedes Gómez-Bautista, Luís Miguel Ortega-Mora 140
$SOLFDFLyQ GH HFXDOL]DGRUHV GH SURWHtQDV SDUD OD LGHQWL¿FDFLyQ GH DQWtJHQRV minoritarios de la saliva de Ornithodoros moubata Ricardo Pérez-Sánchez, Ana Oleaga, Mar Siles-Lucas, Verónica Díaz-Martín, Eduardo de la Torre Escudero, Ana Hernández-González, Raúl Manzano-Román 143
,GHQWL¿FDFLyQ SURWHyPLFD \ DQiOLVLV ELRLQIRUPiWLFR GH SURWHtQDV VHFUHWDGDV SRU HOSURWR]RRSDUiVLWRTrypanosoma cruziSHUWHQHFLHQWHVDODIDPLOLD0$63 Mucin associated Surface Proteins Luis Miguel De Pablos ,Gloria González, Víctor Seco Hidalgo, Isabel María Díaz Lozano, Antonio Osuna 145
([SHULPHQWDOWKHRUHWLFVWXG\RISHSWLGH¿QJHUSULQWVLQLeishmania parasites M. Auxiliadora Dea-Ayuela, Riccardo Concu, Lázaro G. Perez-Montoto, Eugenio Uriarte, Francisco Bolás-Fernández, Florencia Ubeira, Humberto González-Díaz 147
3527(Ï0,&$9(*(7$/<$1,0$/ 8ELTXLWLQDFLyQGHSURWHtQDVQXFOHDUHVHQODVHxDOL]DFLyQGHOD\XQRGHIRVIDWRHQ plantas Marina Trigueros, Mónica Rojas-Triana, Maria Luisa Irigoyen, Javier Paz-Ares, Vicente Rubio 149
3URWHRPHSUR¿OHDQDO\VLVRIMedicago truncatula leaves in response to Uromyces striatus Mª Ángeles Castillejo, Jesús V. Jorrín, Diego Rubiales 150
Análisis proteómico del desarrollo sexual mediado por anteridiógeno en el JDPHWR¿WRGHOKHOHFKRBlechnum spicant Virginia Menéndez, Luis Valledor, Ángeles Revilla, Helena Fernández 152
Proteome regulation and epigenetic code during Pinus radiata needle maturation Luis Valledor, María Jesús Cañal, Christof Lenz, Roberto Rodríguez, Jesús Jorrín 153
(VWXGLRGHODUHVSXHVWDDOHVWUpVKtGULFRHQGRVSREODFLRQHVGHHQFLQD Quercus 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 15
ilex subsp. ballota >'HVI@ 6DPS PHGLDQWH XQD DSUR[LPDFLyQ GH SURWHyPLFD comparativa basada en electroforesis bidimensional José Valero Galván, Rafael Mª Navarro Cerrillo, Ma Cristina Romero Rodríguez, David Ariza, Jesús Jorrín Novo 156
'HVDUUROOR\RSWLPL]DFLyQGHOSURFHVRGHH[WUDFFLyQGHSURWHtQDV\HOHFWURIRUHVLV bidimensional en fruta de hueso Esther Giraldo Ramos, Amelia Díaz Méndez, Alfredo García Sánchez 158
Comparative proteomic analysis of Arabidopsis wild-type and Fawrky1 transgenic SODQWV WR FKDUDFWHUL]H WKH IXQFWLRQ RI WKH VWUDZEHUU\ Fragaria x ananassa )D:5.< SURWHLQ DQG LWV $UDELGRSVLV KRPRORJ $W:5.< WZR SRVLWLYH regulators of resistance Alba Ruíz-Ramos, Francisco Amil-Ruíz, Juan Muñoz-Blanco, José Luis Caballero, Ana M. Maldonado Alconada 160
(OHVWXGLRFRPSDUDWLYRSURWHyPLFR\WUDQVFULSWyPLFRGHODUHVSXHVWDDD]~FDUHVHQ Arabidosis thaliana PXHVWUDXQDUHODFLyQHQWUHHOPHWDEROLVPR\HOGHVDUUROORÀRUDO Marina Ribeiro-Pedro, Fátima Ezzahra Said, María Teresa Ruiz, José María Romero, Federico Valverde 162
$',*(SURWHRPLFDQDO\VLVRIZKHDWÀDJOHDIWUHDWHGZLWK7(55$625%IROLDU a free amino acid-based biostimulator María JoséMartinez-Esteso, MayteVilella-Antón, Susana Sellés-Marchart, Anna Botta- Català, Rafael Piñol-Dastis , Roque Bru-Martinez 164
+LJKWKURXJKSXW ELRORJLFDO DQG IXQFWLRQDO DQDOLV\V RI LQWHUDFWLRQV DPRQJ tetraspanin associated proteins in T Limphocytes using second generation proteomics techniques Daniel Pérez-Hernández, Elena Bonzón-Kulichenko, Pablo Martínez-Acedo, Pedro J. Navarro, Estefanía Núñez, Marco Trevisan-Herraz, María Yáñez-Mo, Mónica Sala- Valdés, Mª Ángeles Ursa, Francisco Sánchez-Madrid, JesúsVázquez 167
8VHRI3URWHR0LQHULQ9HWHULQDU\5HVHDUFK Anna Marco, Gemma Rovira, Anna Bassols 168
La Proteómica como vía para determinar el origen animal de los productos cárnicos Miguel Ángel Sentandreu, Paul D. Fraser, Enrique Sentandreu, Leticia Mora, Peter M. Bramley 170
3pSWLGRVLQKLELGRUHVGHOD(Q]LPD&RQYHUWLGRUDGH$QJLRWHQVLQD,JHQHUDGRVHQOD digestión in vitro de la carne de cerdo Elizabeth Escudero, Miguel Angel Sentandreu, Keizo Arihara, Fidel Toldrá 172
3pSWLGRVGHULYDGRVGHODWURSRQLQD7JHQHUDGRVHQMDPyQFXUDGR Leticia Mora, Miguel Angel Sentandreu, Fidel Toldrá 175
Instrucciones a los Autores 177
3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 17
EDITORIAL
Proteómica y las Jornadas caminan y deben caminar de la mano
(OQ~PHURFLQFRHVPRQRJUi¿FR\UHFRSLODORVWUDEDMRVSUHVHQWDGRVHQODV³,,-RUQDGDV Bienales de Jóvenes Investigadores en Proteómica”. El proyecto, concebido por Jesús Váz- quez, tuvo su bautizo en Barcelona, en febrero de hace dos años, y su organización corrió a cargo de Montse Carrascal y Marina Gay (Proteómica 1, febrero 2008). La segunda edición se traslada a Córdoba, donde podremos recordar con nostalgia y cariño el periodo 2003-2005, el que transcurrió entre la primera reunión formal de proteómica en nuestro país (I Jornadas sobre Proteómica UCO-2003) y el I Congreso de la recién creada SEProt. Como siempre, ¡bienvenidos a esta vuestra casa! Este número aúna dos de los objetivos prioritarios de nuestra Junta directiva para el próximo periodo, las Jornadas para Jóvenes Investigadores y la revista Proteómica, lo que, como co-editor responsable de la segunda, no deja de ser una enorme satisfacción. Estoy convencido que el éxito de ambos proyectos, en especial de la revista, va a depender, en gran medida, de ese caminar juntos. Ya, desde esta editorial, quiero hacer una llamada al grupo de Jóvenes Investigadores de la Sociedad para que os incorporéis al Comité Editorial. He sido un observador privilegiado, y actor pasivo, del devenir de las Jornadas, desde que Jesús Vázquez promovió e impulsó la idea. El excelente trabajo realizado por Anita lo he podido seguir día a día; a pesar de sus continuos desasosiegos, siempre tuve claro, tanto por el proyecto en sí como por su forma de ser y dedicación, que sería un éxito, tanto en el plano FLHQWt¿FRFRPRHQHOVRFLDO'HVGHDTXt$QLWDPLPDVVLQFHURDJUDGHFLPLHQWR\FDULxRWDQWR a nivel personal como en nombre de la Sociedad. Este agradecimiento y cariño ha de hacerse extensivo a Ángela Moreno, la persona que siempre está sin querer estar, y a Jesús Vázquez, el único senior al que dan cabida entre los jóvenes, posición que se ha ganado con creces. Los proyectos no son sólo de una, dos, o tres persona, sino de un buen equipo, y el de las Jornadas no es una excepción. Anita ha contado con la inestimable ayuda de Mª Carmen Molina Ruiz, Sira Echevarría Zomeño y Raquel González, y, ¡como no¡ de María Teresa Montero, al frente de OD6HFUHWDUtD7pFQLFD3HURWRGRHOORQRVLJQL¿FDUtDQDGDVLQHOH[FHOHQWHWUDEDMRHLQLFLDWLYDGH los coordinadores de las diferentes sesiones, y de, lo último aquí, pero primero de las Jornadas, los investigadores que han presentado, como norma general, excelentes trabajos. A todos vosotros, muchísimas gracias!
Jesús V. Jorrín Novo 18 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52
Las II Jornadas de Jóvenes Investigadores en Proteómica, Córdoba 2010
Jesús Vázquez, Ana M. Maldonado-Alconada, Sira Echevarría-Zomeño, Raquel González
A raíz del éxito de las “I Jornadas Bienales de que se celebrarán en Córdoba los días 11 y 12 de Proteómica para Jóvenes Investigadores” (Sitges febrero de 2010. TXHGyFODUDPHQWHMXVWL¿FDGDODFHOHEUDFLyQ de este evento en los años alternos a los congresos Tras la reunión de la JD en marzo del 2009, en la como parte de las actividades de la Sociedad Espa- que se aprobó la candidatura de Córdoba, comenzó ñola de Proteómica. De hecho, las Jornadas respon- R¿FLDOPHQWHODRUJDQL]DFLyQGHHVWDV-RUQDGDV7RGD den a uno de los principales objetivos de la SEProt: la información en relación a las mismas, que ha ODRUJDQL]DFLyQGHFRQJUHVRVFLHQWt¿FRVFRQHO¿Q ido actualizando a medida que se concretaban los de promover la comunicación entre los grupos que contenidos de las sesiones, se puede encontrar en usamos la Proteómica. Como bien sabéis, la carac- la dirección http://www.jjip.fundecor.es/, a la que terística diferencial de estas Jornadas respecto a los se puede acceder también a través de la página web congresos convencionales radica en el énfasis en de la Sociedad. En línea con el espíritu de las mis- contemplar aspectos prácticos y técnicos al mismo mas y sus objetivos, se hizo hincapié en el carácter QLYHOTXHORVFLHQWt¿FRV\HQODDSXHVWDGHOD-'SRU ÀH[LEOHGLQiPLFR\SDUWLFLSDWLYRGHHVWHHYHQWR/D los socios “jóvenes” para organizar este evento. Es- acogida fue excelente y hemos recibido multitud WDPRVWUHPHQGDPHQWHDJUDGHFLGRVSRUVXFRQ¿DQ]D de propuestas sobre posibles sesiones temáticas, y su apoyo constante. formas de organizarlas y para participar como coor- dinadores de las mismas. $O¿QDOL]DUHO&RQJUHVRGH3DPSORQD IHEUHUR 2009) presentamos con mucha ilusión la candidatura Una vez recogida la “lluvia de ideas” el Pro- para celebrar las “II Jornadas de Jóvenes Investiga- JUDPD&LHQWt¿FRVHHVWUXFWXUyHQODVVHLVVHVLRQHV dores en Proteómica” en la Universidad de Córdo- temáticas que se detallan a continuación, cada una ba, un centro con una trayectoria conocida a nivel de ellas coordinadas por expertos en el área (entre nacional e internacional por los esfuerzos realizados paréntesis): Biomarcadores y Patologías Humanas en esta área y que ha jugado un papel fundamental (Ángel García de la Univ. de Santiago de Compos- en el desarrollo de la Proteómica en España. Ade- tela y Cristina Ruíz del INIBIC, A Coruña); Bio- más de ser la sede de congresos y de cursos rela- informática (Salvador Martínez de Bartolomé del cionados con la Proteómica, cabe recordar razones CNB-CSIC y Pedro Navarro del CBMSO-CSIC); sentimentales e históricas que ligan Córdoba a la Proteómica Microbiana y de Parásitos (Aída Pitarch Proteómica. Fue en Córdoba, en febrero de 2003, de la Univ. Complutense, Antonio Marcilla de la donde tuvo lugar el Congreso constituyente de la Univ. de Valencia, Ana Oleaga del CSIC, Salaman- Sociedad Española de Proteómica, y también fue ca y Manuel Rodríguez de la UCO); Proteómica Ve- Córdoba la que albergó en 2005 nuestro primer con- getal y Animal (Luis Valledor de la Univ. de Oviedo greso, que coincidió con la creación de la European y Federico Valverde del CSIC Sevilla); Proteómica Proteomics Association. Cuantitativa (Miren J. Omaetxebarría de la Univ. País Vasco y Eva Rodríguez-Suarez del CIC Biogu- En esta ocasión, una vez más, hemos contado QH \0RGL¿FDFLRQHV3RVWUDQVGXFFLRQDOHV 0DULQD con el apoyo incondicional del Vicerrectorado de Gay y Montse Carrascal del CSIC/UAB, Antonio Investigación de la Universidad de Córdoba. Que- Martínez-Ruiz del Hospital de La Princesa y Pablo remos dar las gracias especialmente al Profesor D. Martínez-Acedo del CBMSO-CSIC). Enrique Aguilar Benítez de Lugo, Vicerrector de 3ROtWLFD&LHQWt¿FDSRUVXD\XGDSDUDOD¿QDQFLD- En esta ocasión hay que destacar una novedad FLyQGHHVWHHYHQWR\SRUFHGHUQRVHOHGL¿FLRGHO HQUHODFLyQDOIRUPDWRGHODVVHVLRQHVFLHQWt¿FDV\D rectorado como sede de estas Jornadas. Sin duda, que los coordinadores han tenido total libertad para ODORFDOL]DFLyQ\ODEHOOH]DGHHVWHHGL¿FLRVXSRQHQ organizar sus sesiones de la forma que han consi- un aliciente más para participar en las “II Jornadas derado más apropiada. Además de comunicaciones Bienales de Jóvenes Investigadores en Proteómica” orales seleccionadas por los coordinadores, habrá 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 19
paneles, mesas redondas con expertos en cada área, recen publicados en forma de resúmenes extendidos y debates y foros de discusión en los que se tratarán en este número de Proteómica. De nuevo, ello ha temas concretos sugeridos y votados previamente sido posible gracias a la labor de revisión y edición por los socios. Cualquiera que sea el formato de las llevada a cabo por los coordinadores. Está previsto sesiones, se ha intentado dar libertad total a los coor- que una vez celebradas las Jornadas, los temas de dinadores y se ha considerado prioritario contemplar discusión y debate y las conclusiones obtenidas se- WLHPSRVX¿FLHQWHSDUDODGLVFXVLyQ\HOGHEDWHHQ UiQUHÀHMDGRVHQXQQ~PHURSRVWHULRUGHODUHYLVWD línea con el espíritu del evento. Como viene siendo habitual en los eventos or- Aunque en el momento de escribir esta reseña ganizados por la Sociedad, las casas comerciales no estaba cerrado el plazo de inscripción, a día de han respondido con gran generosidad y entusiasmo. hoy el número de participantes en estas Jornadas Su participación va mucho más lejos de la aporta- supera los 150. Hemos recibido 88 comunicaciones, ción económica, pero este año queremos agradecer distribuidas entre las diferentes sesiones temáticas, especialmente la ayuda que nos han brindado en enviadas tanto por grupos con una trayectoria de HVWHVHQWLGRFRQVLGHUDQGRODDFWXDOVLWXDFLyQ¿QDQ- investigación en proteómica, como por laboratorios ciera. Muchas gracias por su generosa participación que comienzan a hacer sus primeras incursiones en D7KHUPR6FLHQWL¿F$JLOHQW7HFKQRORJLHV:DWHUV HOiUHD$WHQRUGHOQ~PHUR\GHODFDOLGDGFLHQWt¿FD Applied Biosystems, Bio-Rad, Isogen, Bruker, de los resúmenes recibidos, podemos augurar el Beckman-Coulter-Izasa, Sigma y Nucliber. Applied éxito de estas Jornadas. Que será el resultado del Biosystems patrocina el premio a la mejor comu- entusiasmo de los socios y del excelente trabajo que nicación (de entre todas la presentadas, tanto en han llevado a cabo los coordinadores de las sesiones formato póster como comunicación oral) y Thermo FLHQWt¿FDVFRQWDFWDQGRFRQORVLQYHVWLJDGRUHVSDUD 6FLHQWL¿FGRQDUiHOSUHPLRDORVRUJDQL]DGRUHVGH que participen y envíen sus comunicaciones, y ha- la mejor sesión, ambos dotados de 300€. Queremos ciendo una investigación exhaustiva de cuales son agradecer a todas las casas comerciales el apoyo las novedades, los retos y las limitaciones técnicas inestimable que nos brindan. en sus áreas respectivas. Tenemos que mencionar que, dado el alto índice de participación, uno de los De nuevo queremos transmitir nuestro agrade- principales problemas a los que hemos tenido que cimiento a la JD por su respaldo incondicional, con hacer frente durante la organización ha sido “llegar Fernando Corrales a la cabeza, y a Ángela Moreno a un acuerdo” sobre la distribución del tiempo asig- cuya ayuda ha sido imprescindible. Muchas gracias nado a cada sesión. En el momento de escribir este también a Mª Carmen Molina por su ayuda y su resumen estamos todavía intentando resolver esta empeño en que todos se lleven un recuerdo im- FXHVWLyQ\HVSHUHPRVTXHHO3URJUDPD&LHQWt¿FR borrable de Córdoba. Esperamos que esta edición GH¿QLWLYRVDWLVIDJDDWRGRVSRULJXDO tenga como mínimo el mismo éxito que la anterior. El buen hacer y el entusiasmo demostrado por todos Convencidos de que el éxito de estas Jornadas los participantes nos hace creer que así será. Es un depende también de la difusión de sus contenidos, placer y un honor recibiros a todos en Córdoba los tal y como ocurrió en la anterior edición, éstos apa- días 11 y 12 de febrero. 20 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52
1. BIOINFORMÁTICA
Coordinadores: Salvador Martínez-Bartolomé y Pedro Navarro
Mesa redonda sobre herramientas en bioinformática
Salvador Martínez-Bartolomé1, Pedro Navarro2, Alex Campos3, Marco Trevisan-Herraz2, Juan Antonio Vizcaíno4, Alberto Medina1
1ProteoRed – Laboratorio de proteómica del Centro Nacional de Biotecnología – CSIC, Madrid. 2Laboratorio de química de proteínas del Centro de Biología Molecular Severo Ochoa – CSIC, Madrid. 3Plataforma de 3URWHyPLFD3DUF&LHQWL¿FGH%DUFHORQD4(0%/2XWVWDWLRQ(XURSHDQ%LRLQIRUPDWLFV,QVWLWXWH:HOOFRPH Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge, UK.
El desarrollo y aparición de nuevas tecnologías Todas estas cuestiones que surgen alrededor de la aplicadas a la proteómica han dado lugar a un cre- proteómica y la bioinformática nos han hecho pensar cimiento espectacular de datos experimentales. La que un formato de mesa redonda podría ser ideal en captura, el almacenamiento, el procesamiento y el unas jornadas que pretenden ser un espacio de inter- análisis de estos datos es, en numerosas ocasiones, cambio de información entre los proteómicos y bioin- un cuello de botella que debemos solucionar para formáticos españoles. En dicha mesa redonda preten- seguir avanzando en el campo. demos plantear los problemas que más nos preocupan a los proteómicos y que pueden ser resueltos, al menos Pese a que, paralelamente, han aumentado los en parte, por medio de recursos bioinformáticos. Por proyectos de desarrollo de herramientas y servicios ello, se realizó una encuesta, cuyos resultados se mues- bioinformáticos aplicados a la proteómica, es muy tran a continuación (Figura 1), para elegir de entre unos difícil conocer todos los recursos disponibles. Mu- temas propuestos, los que resultan más interesantes chos de estos proyectos son de software libre [http:// SDUDODFRPXQLGDGFLHQWt¿FDSURWHyPLFD8QDYH]UHFR- www.ms-utils.org/wiki/pmwiki.php/Main/Software- pilados los prácticamente 200 votos que se recibieron, List], y por tanto, disponibles de forma gratuita, resultaron destacados tres temas principales: herra- la mayoría de las veces, a través de Internet. La mientas de biología de sistemas, estadística en proteó- aparición de la proteómica de segunda generación mica cuantitativa y software libre en proteómica. y los análisis a gran escala ha permitido los llama- dos estudios de biología de sistemas, cuyos análisis serían imposibles de hacer sin herramientas bioin- formáticas adecuadas. Por otro lado, es destacable también el avance en los últimos años de nuevas técnicas de marcaje isotópico y label-free que per- miten realizar estudios de proteómica cuantitativa. En dichos análisis, es necesario seguir metodologías estadísticas rigurosas para minimizar la detección de falsos cambios de expresión. Numerosos grupos de investigación se resisten a utilizar herramientas no comerciales, o desconocen la existencia de una alter- nativa. Otro problema existente relativo al manejo de Figura 1. Número de votaciones obtenidas en la encuesta los datos en proteómica es el intercambio de dichos con la que se sondearon los temas más interesantes para datos entre diferentes plataformas, laboratorios y la comunidad proteómica española. Los temas propuestos herramientas. Es por ello por lo que el desarrollo de fueron: “herramientas de biología de sistemas”, “análisis estándares se hace crucial, y es necesario conocer las de resultados en proteómica cuantitativa”, “software libre en proteómica”, “combinación de motores de búsqueda”, herramientas existentes que permiten la conversión “estándares en informes de experimentos en proteómica” y entre los formatos propietarios y los estándares. “estándares de formato de datos en proteómica”. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 21
Para la sesión hemos buscado personas con la database) [1], ha participado en estudios de minería VX¿FLHQWHH[SHULHQFLD\FRQRFLPLHQWRVFRPRSDUD de datos de espectrometría de masas y es participan- ser las personas de referencia en el debate sobre te en el desarrollo de estándares de la iniciativa de dichos temas: HUPO-PSI [2]. Alberto Medina (CNB-CSIC), pionero de la Cada uno de ellos realizará una muy pequeña proteómica computacional en España, con dilatada introducción de los temas propuestos, y seguida- experiencia en temas relacionados con la biología mente se aprovechará la mayor parte del tiempo de de sistemas como la búsqueda de anotaciones y los la sesión en el intercambio de información entre los repositorios de información biológica y proteómica, asistentes y nuestros “expertos”. así como en temas relacionados con estándares. Creemos que entre los cuatro forman una mesa Alex Campos (PCB), experimentado usuario de muy interesante y esperamos que podamos propor- herramientas de software libre aplicadas a la pro- cionar una sesión fructífera para todos. teómica, así como de estándares y herramientas de conversión de formato de datos. Referencias Marco Trevisan (CBMSO-CSIC), uno de los GHVDUUROODGRUHVGHXQVRIWZDUHGHFXDQWL¿FDFLyQGH [1] Vizcaino JA, Cote R, Reisinger F, Foster JM, uso gratuito para instituciones públicas y conocedor Mueller M, Rameseder J, et al. A guide to the de los problemas a resolver con la estadística en la 3URWHRPLFV,GHQWL¿FDWLRQV'DWDEDVHSURWHRPLFV data repository. Proteomics 2009;9:4276-83. FXDQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDV [2] Orchard S, Hermjakob H y Apweiler R. The Juan Antonio Vizcaíno (EMBL-EBI) integrante proteomics standards initiative. Proteomics del proyecto PRIDE (35RWHRPLFV,'(QWL¿FDWLRQV 2003;3:1374-6.
$QHZYHUVDWLOH¿OHWUDQVODWRUIRU3URWHRPLFVVWDQGDUGV
J. Alberto Medina-Aunon1,2, Salvador Martínez-Bartolomé1,2, J. Pablo Albar1,2
1Proteomics Facility, National Center for Biotechnology (CNB-CSIC), 2Spanish Proteomics Institute (ProteoRed).
Information derived by proteomics experiments the Internet (http://www.proteored.org/). This tool such as sample preparation and separation, mass has been designed using common graphics libraries VSHFWURPHWU\SURWHLQLGHQWL¿FDWLRQHWFLVUHSUH- and latest XML parsers offering a friendly and easy sented using different and sometimes incompre- LQWHUIDFHDYRLGLQJFRPSOH[FRQ¿JXUDWLRQGLDORJV KHQVLEOH¿OHIRUPDWVUHVXOWLQJQRWYHU\VXLWDEOH Currently, the application is able to manage the for daily life. To deal with this problem, several IROORZLQJ¿OHIRUPDWVSURWHRPLFVVWDQGDUGV 0,$- initiatives have been developed: HUPO-PSI MIAPE PE Gel, MS and MSI documents (MS Excel and and XML-based formats [1], XML-based reposi- XML format), GelML, and PRIDE. tory: PRIDE [2], etc... All of them are contributing effectively within a Proteomics scope, but some To illustrate this innovative work we realized lacks regarding the translation between some of the two tests, both of them based on the translation previous schemas are still confusing. between GelML and MIAPE Gel schemas. Input ¿OHVZHUHFUHDWLQJIURP +83236,0LFURVRIW In order to contribute to this situation, we have Excel template and 2) ProteoRed MIAPE web site developed a new Sun Java application accessible on (www.proteored.org). Both schemas are perfectly 22 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52
complementary: MIAPE Gel presents a lot of infor- The described work results a proper corresponden- mation according to protocols, methods and images ce between both formats, allowing a complete transla- and GelML could exchange this information with tion between MIAPE Gel and GelML schemas. other bioinformatics tools. In spite of the fact that both present a great combination, some problems appeared during the transformation. For instance, References 0,$3(SUHVHQWVDOLQHDOVFKHPDZHOOGH¿QHGSL- [1] Martens L, Orchard S, Apweiler R and Herm- peline- whereas GelML is a FUGE based one, divi- jakob H. Human proteome organization proteo- ding the information along several linked sections. mics standards initiative: data standardization, Furthermore, any assumption can be done about the a view on developments and policy. Mol Cell cardinality of the relationships between both exam- Proteomics 2007; 6: 1666-1667. SOHV)LQDOO\WKHVHLVVXHVPDGHXVWRGH¿QHDVHWRI [2] Jones P, Côté RG, Martens L, QuinnAF, Taylor FRQ¿JXUDWLRQ¿OHVWRGULYHWKHWUDQVIRUPDWLRQ CF, Derache :+HUPMDNRE H and Apweiler R. PRIDE: a public repository of protein and SHSWLGHLGHQWL¿FDWLRQVIRUWKHSURWHRPLFVFRP- munity; Nucl Acid Res. 2006; 34 (Database issue): D659-D663.
Figure 1. Translation between proteomics standards will be easier.
Open-source Bioinformatics Solutions for the Analysis of Mass Spectrometry- based Proteomics Data: Pipelines and Quantitation
Alexandre R. Campos
Proteomics Platform, Barcelona Science Park, Barcelona, Spain
The proteomics community has been generating ticularly, I focus on available platforms and pipelines, openly available software framework for systematic and software for MS-based quantitation. proteomic data analyses and management. Processing and analysis of proteomics data involves a complex, 1. Platforms and Pipelines for LC-MS and PXOWLVWDJHSURFHVVLQFOXGLQJUDZ¿OHSUHSURFHVVLQJ LC-MS/MS Data Analysis peptide assignment to MSMS experimental spectra, SURWHLQLGHQWL¿FDWLRQDQGIXUWKHUYDOLGDWLRQDQGLQ :LWKWKHDGYHQWRIQHZJHQHUDWLRQRIPDVVVSHF- some cases, MS-based quantitation. Here, I list a trometers arose the necessity of developing new number of freely available and open-source compu- bioinformatics solutions for mining large data sets. tational tools for the analysis of proteomics data. Par- In the past years, we have witnessed a dynamic 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 23
software development process that embraces va- source C++ library for LC-MS data management and rious functionalities of data analysis process such analysis. The individual applications of TOPP can as the preprocessing of MS data, evaluation and be grouped into several distinct packages: import/ assignment of MS/MS spectra to peptide sequen- H[SRUWVLJQDOSURFHVVLQJLGHQWL¿FDWLRQTXDQWLWDWLRQ ces, comparison and quantitation of multiple LC- and analysis. Importing data into TOPP is handled MS experiments. The burgeoning of proteomics with the FileConverter, which converts several com- data has fostered the development of a number of monly used MS formats into each other. Supported public domain proteomics pipelines that integrate formats are mzML, mzData, mzXML, among other a number of open-source, cross-platform tools pro- formats. TOPP shares most of the features provided viding a pluggable development framework for the by other pipelines; in addition, TOPP provides a set SURWHRPLFVVFLHQWL¿FFRPPXQLW\,QWKHIROORZLQJ of computationaltools for signal preprocessing (e.g., VHFWLRQV,EULHÀ\JRRYHUVRPHRIWKHVHSURMHFWV denoising, baseline correction, and smoothing), and processing (e.g., peak picking, deisotoping, centroi- ding, and feature extraction). 7KH7UDQV3URWHRPLF3LSHOLQH 733 http:// tools.proteomecenter.org/software.php 3URWHLRV6RIWZDUH(QYLURQPHQW 3UR6( The TPP is a collection of integrated tools for http://www.proteios.org/ LC-MS/MS data analysis, developed at the Seattle Proteome Center (SPC). The suite includes tools ProSE was initially created as a repository for for conversion of instrument vendor’s raw data to proteomics data, and just recently has been exten- mzXML or mzML formats; conversion of spectral ded to automate some data assembly and reporting. search engine (Mascot, X!Tandem, Sequest, Phenyx, 3UR6(UXQVRQ7RPFDWVHUYHUDQGSURYLGHVD:HE OMSSA) results to pepXML format; and statistical LQWHUIDFHIRUGDWDDFFHVVDQGDQDO\VLV:KDWPDNHV validation of search engine results at the peptide- and ProSE different from other platforms is the availa- protein-level with PeptideProphet and ProteinPro- bility of a programming interface for method deve- phet, respectively (and iProphet to combine multiple lopers to write extensions and plug-ins. Extensions search results). TPP also supports quantitation analy- and plug-ins make ProSE a highly customizable pla- sis for MS1 and MS2 labeling techniques. tform. One can for instance carry out batch searches LQ2066$DQG;7DQGHPYLDWKH:HELQWHUIDFH and then automatically upload the results to ProSE. &3$6 KWWSV ZZZODENH\RUJSURMHFW In addition, data can be extracted into dedicated da- home/begin.view tabase tables for further work with the results, such The Computational Proteomics Analysis Sys- DV¿OWHULQJSURWHLQLQIHUHQFHDQGFRPELQDWLRQRI search results. tem (CPAS) is implemented as a Tomcat web-based application for mining LC-MS/MS proteomic expe- riments. CPAS is distributed with X!Tandem search 6. Software for Analysis of MS-based Quan- engine and the PeptideProphet and ProteinProphet titative Proteomics Data validation tools; in addition, it can be also used with other search engines, including Mascot and Sequest. In the past years, MS-based quantitation has 7KH0606DQDO\WLFPRGXOHHQDEOHVXVHUVWR¿OWHU emerged as a promising core technology for pro- sort, customize, compare, and export experiment WHRPLFVSUR¿OLQJ-DIIHHWDO>@KDYHFODVVL¿HGWKH UXQV&3$6FDQDOVREHFRQ¿JXUHGWRSHUIRUP4RU available MS platforms for quantitative proteomics XPRESS quantitation analyses. In contrast to TPP, into three categories: 1) identity-based methods that CPAS helps manage information about biological rely on peptide analysis by data-dependent LC-MS/ samples and preparation protocols. 06DQGSURWHLQLGHQWL¿FDWLRQE\GDWDEDVHVHDUFKLQJ 2) pattern-only methods that focus on production of MS-derived protein patterns, and 3) hybrid identi- 4. TOPP - OpenMS Proteomics Pipeline ty/pattern-based methods use pattern recognition http://open-ms.sourceforge.net/TOPP.php algorithms to ex post facto assign the identity of LC-MS peaks against databases of peptide sequen- TOPP is a customizable collection of several ce, mass, and retention time built from multiple small applications, based on OpenMS, an open- 24 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52
Table 1. Summary of tools for MS-based quantitative proteomics data analysis. format format System Type of Type Software Language Interface? Operating quantitation Input spectra LGHQWL¿FDWLRQ Input peptide Graphical User
DTASelect or MS1, MS2 and Census MS1/MS2 or mzXML Java Yes /2:a pepXML Label-free (Id) MS1, MS2 and MSQuant Instrument vendor rawe Mascot results .NET Yes :LQ Label-free (Id) XCalibur .rawe (high SILAC and label- MaxQuant Mascot results .NET Yes :LQ resolution) free (Id) XPRESS mzXML pepXML MS1 C++ Yesb /2:a ASAPRatio mzXML pepXML MS1 C++ Yesb /2:a Multi-Q mzXML pepXML MS2 .NET Yes :LQ iTracker .mgf or .dta none MS2 Perl No /2:a Matlab or /2:a Quant .mgf Mascot .dat MS2 Yes .NET (Matlab) Libra mzXML pepXML MS2 C++ Yesb /2:a APEX none pepXML Label-free (SC) Java Yes /2:a SuperHirn mzXML pepXML Label-free (HIP) C++ No /2:a Feature list (e.g., PEPPeR PEPPeR .txt format Label-free (HIP) Perl Yesc /2:a msInspect) Label-free (Id, HIP, msInspect mzXML pepXML Java Yes /2:a AMT) IDEAL-Q mzXML pepXML Label-free (HIP) .NET Yes :LQ msBID mzXML pepXML Label-free (Id) Java,Perl No /2:a MS1, MS2 and TOPP mzML TOPP adapters C++ Yes /2:a Label-free (Id) PNNL 'HFRQ/6¿OHVd or X!Tandem or Label-free (AMT) .NET Yes /2:a pipeline mzXML Sequest a The acronym L.O.W. refers to Linux, OSX and Windows b Using TPP graphical user interface c Using GenePattern graphical user interface d 'HFRQ/6¿OHVFDQEHH[WUDFWHGIURPP];0/RUDQXPEHURILQVWUXPHQWYHQGRU¶VUDZIRUPDW e 7RFRQYHUWLQVWUXPHQWYHQGRU¶VUDZIRUPDWWKHYHQGRU¶V06DQDO\VLVVRIWZDUHPXVWEHLQVWDOOHG Label-free methods: SC (Spectral Counting); Id (Identity-based); HIP (hybrid identity/pattern-based); and AMT (accurate mass and time) MS1: methods based on precursor intensity or area (e.g., 15N, 18O, SILAC) MS2: methods based on reporter ions in MS/MS (e.g., iTRAQ, TMT)
experiments. As MS-based quantitation remains a Reference UDSLGO\GHYHORSLQJ¿HOGZLWKPDQ\GLIIHUHQWH[SH- rimental approaches, a large number of open-source [1] Jaffe JD, Mani DR, Leptos KC, Church GM, (or freely available (academic)) software has been Gillette MA y Carr SA. PEPPeR, a platform for experimental proteomic pattern recognition. Mol GHYHORSHGDQGPDGHDYDLODEOHIRUWKHVFLHQWL¿F Cell Proteomics 2006;5:1927-41. community (Table 1). 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 25
Java API for MIAPE Generation
Emilio Salazar Donate, Miguel Ángel López García, Salvador Martínez-Bartolomé, J. Alberto Medina-Aunon, Juan Pablo Albar
ProteoRed, Proteomics Facility, Centro Nacional de Biotecnología (CNB), Consejo Superior de ,QYHVWLJDFLRQHV&LHQWt¿FDV &6,& ( 0DGULG6SDLQ
The HUPO- PSI (Human Proteome Organiza- is via the abstract entity Miape, which includes the WLRQ±3URWHRPLFV6WDQGDUG,QLWLDWLYH DLPVWRGH¿- information available about the experiment, regar- ne community standards for data representation in dless if it has been generate via XML, manually or proteomics to facilitate data comparison, exchange it has been retrieved from the database. DQGYHUL¿FDWLRQ>@ Moreover, the API allows the user to convert One of these standards is the MIAPE-speci- the data from one module to another, favoring the ¿FDWLRQV>@0,$3(WKH0LQLPXP,QIRUPDWLRQ exchange of information in very different formats. About a Proteomics Experiment, contains the ba- sic reporting guidelines for proteomics. Although, The modules are: these guidelines are an invaluable support for ex- 7KHDatabase Manager module: retrieves/sto- periments due to its acceptance by the proteomics res documents from the ProteoRed Database, UHVHDUFKHUVDQGMRXUQDOVWKHOHYHORIIXO¿OOPHQWIRU a relational database which has, so far, more every experiment requires a time consuming duty than 700 documents. However, this module from the user side. can be easily extended to be used in other The Miape JAVA API (Application Program- Databases (relational or not). ming Interface) developed by the CNB-ProteoRed 7KHXMLPRGXOHLVDEOHWRSDUVH¿OHVIURP Proteomics Bioinformatics Support group provi- different XML formats to generate the MIA- des the user with a powerful, platform-independent PE documents. programmatic interface to store, retrieve and export MIAPE documents in different formats. The libra- 7KHFactory module creates a document ma- ries and the documentation are freely available at nually by programmatically adding the infor- www.proteored.org/miape-api mation to the document. The language of the API is Java, an object-orien- ted language, massively used in professional and academia environments due to its maintainability and ÀH[LELOLW\DVZHOODVLWVSODWIRUPLQGHSHQGHQFH The aim of the API is to be integrated into third party software to automatically generate a MIAPE, decreasing the amount of extra work which this normally involves. So far, the user must manually submit this information independently, using the semi-automatic MIAPE generator tool [3], which allows the user to create a MIAPE, using templates with some initial information. The API is divided in several independent mo- dules, which can be extended for customization, Figure 1. The different modules of the Miape JAVA API and (see Figure 1). The interaction between the modules their interactions. 26 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52
References [1] Kaiser J. Proteomics. Public-private group maps [3] Martínez-Bartolomé S, Medina-Aunon JA, Jones out initiatives. Science 2002;296:827. AR, Albar JP. “Semi-automatic tool to describe, store and compare proteomics experiments ba- >@ 7D\ORU&)3DWRQ1:/LOOH\.6%LQ]3$-XOLDQ sed on MIAPE compliant reports”. Proteomics RK, Jr., Jones AR, et al. The minimum informa- (in press) 2009. tion about a proteomics experiment (MIAPE). Nat Biotechnol. 2007; 25:887-93.
7KH3URWHRPLFV,GHQWL¿FDWLRQVGDWDEDVH 35,'( LWVDVVRFLDWHGWRROVDQGWKH ProteomeXchange consortium
Juan Antonio Vizcaíno, Florian Reisinger, Richard Côté, Henning Hermjakob
(0%/(%,:HOOFRPH7UXVW*HQRPH&DPSXV+LQ[WRQ&DPEULGJH8QLWHG.LQJGRP
Abstract ebi.ac.uk/ols DQGWKH3URWHLQ,GHQWL¿HU&URVV5H- ferencing system [3] (PICR, http://www.ebi.ac.uk/ 7KH3URWHRPLFV,GHQWL¿FDWLRQV'DWDEDVH 35,- Tools/picr). OLS provides convenient and powerful DE, http://www.ebi.ac.uk/pride) has become one of access to a large number of biomedical ontologies the main repositories of mass spectrometry derived and controlled vocabularies (CVs). PRIDE takes proteomics data. In this communication we will advantage of OLS to store, structure, and present summarize the main capabilities of the PRIDE sys- any and all metadata annotations on experiments, tem, including its associated tools. Finally, we will proteins, peptides and mass spectra. introduce the ProteomeXchange consortium, as a The PICR tool on the other hand, is built to over- collaborative approach to share proteomics data bet- come one of the most recurrent problems in proteo- ween the most important proteomics repositories. mics: the existence of heterogeneous and changing 7KH35,'(3URWHRPLFV,GHQWL¿FDWLRQVGDWDEDVH LGHQWL¿HUVRUDFFHVVLRQQXPEHUVUHIHUULQJWRWKHVDPH (http://www.ebi.ac.uk/pride) at the European Bio- protein in different databases. PICR is used to map informatics Institute (EBI) provides users with the DOOWKHVXEPLWWHGSURWHLQLGHQWL¿FDWLRQVLQ35,'( ability to explore and compare mass spectrometry to all known accession numbers for those proteins in the most important protein databases (including (MS) based proteomics experiments that reveal de- UniProt, IPI, Ensembl and RefSeq, among others). tails of the protein expression found in a broad range 7KHUHIRUHSURWHLQLGHQWL¿FDWLRQVLQ35,'(WKDWZHUH of taxonomic groups, tissues and disease states [1]. originally derived from different databases, or from PRIDE stores three different kinds of information: different time points of the same database, thus be- SHSWLGHDQGSURWHLQLGHQWL¿FDWLRQVGHULYHGIURP06 come fully comparable. In addition to these two es- or MS/MS experiments, MS and MS/MS mass spec- tablished tools, a new application called Database on tra as peak lists, and any and all associated metadata. Demand [4] (DoD, http://www.ebi.ac.uk/pride/dod) PRIDE is now the recommended submission point has recently been added to the PRIDE toolkit. This for proteomics data for several journals such as Na- tool allows custom sequence databases to be built in ture Biotechnology, Nature Methods, Molecular and order to optimize the results from search engines for Cellular Proteomics, and Proteomics. gel-free proteomics experiments.
1. PRIDE associated tools 2. ProteomeXchange Consortium PRIDE relies heavily on two additional tools: One of the reasons why proteomics data sharing the Ontology Lookup Service [2] (OLS, http://www. is not a universal fact yet is the heterogeneity of the 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 27
existing proteomics repositories, each repository References having a major focus. This is why the ProteomeX- change consortium was founded [1]. The current [1] Vizcaíno JA, Côté R, Reisinger F, Foster J, members and the way they interact are represented Mueller M, Rameseder J, et al. A guide to the in Figure 1. Guidelines for ProteomeXchange sub- 3URWHRPLFV,GHQWL¿FDWLRQV'DWDEDVHSURWHRPLFV data repository. Proteomics 2009;9:4276-83. PLVVLRQVDUHEHLQJ¿QDOL]HG http://www.proteomex- change.org), and include three mandatory data types [2] Côté RG, Jones P, Martens L, Apweiler R. that will have to be included per submission: ins- and Hermjakob H. The Ontology Lookup WUXPHQWRXWSXW¿OHV UDZGDWDSHDNOLVWV DVVR- Service: more data and better tools for con- FLDWHGPHWDGDWDDQGSHSWLGHSURWHLQLGHQWL¿FDWLRQV trolled vocabulary queries. Nucleic Acids Res A large scale ProteomeXchange pilot submission : has already been performed containing data from [3] Côté RG, Jones P, Martens L, Kerrien S, Rei- the HUPO Plasma Proteome Project 2 (PPP 2) [5]. singer F, Lin Q, et al7KH3URWHLQ,GHQWL¿HU Therefore, certain experiments in PRIDE (experi- Cross-Referencing (PICR) service: reconciling ment accession numbers 8172-8544, http://www. SURWHLQLGHQWL¿HUVDFURVVPXOWLSOHVRXUFHGDWD- ebi.ac.uk/pride/ppp2_links.do FRQWDLQOLQNVWR¿OHV bases. BMC Bioinformatics 2007;8:401. stored in the Tranche repository in the “Experiment [4] Reisinger F. and Martens L. Database on De- View” page. For these experiments, it is therefo- mand – an online tool for the custom generation re already possible to get the original raw data or of FASTA formatted sequence databases. Pro- VHDUFKHQJLQHRXWSXW¿OHVZKLFKDUHQRWVWRUHGDV teomics 2009;9:4421-4. such in the PRIDE system. [5] Omenn GS, Aebersold R. and Paik YK. 7(th) +832:RUOG&RQJUHVVRI3URWHRPLFV ODXQ- ching the second phase of the HUPO Plasma Proteome Project (PPP-2) 16-20 August 2008, Amsterdam, The Netherlands. Proteomics 2009;9:4-6.
Figure 1. 6XPPDU\¿JXUHRIWKH3URWHRPH;FKDQJHFRQVRU- WLXPGDWDÀRZ'DWDVXEPLVVLRQVDUHVHQWWRWKHFRQVRUWLXP via PRIDE or NCBI Peptidome. The ProteomeXchange partners then ensure data are distributed internally, ulti- mately giving users the ability to access the data from any participant database. 28 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52
Proteopathogen, una base de datos de proteínas para el estudio de la interacción Candida albicans – hospedador
Vital Vialás1, Rubén Nogales-Cadenas2, César Nombela1, Alberto Pascual-Montano2, Concha Gil1,3
1 Departamento de Microbiología II, Facultad de Farmacia, Universidad Complutense de Madrid. 2 De- partamento de Arquitectura de Computadores y Automática, Facultad de Ciencias Físicas, Universidad Complutense de Madrid. 3 8QLGDGGH3URWHyPLFD8&03DUTXH&LHQWt¿FRGH0DGULG)DFXOWDGGH)DUPDFLD Universidad Complutense de Madrid
Existen en la actualidad repositorios públicos en ros corresponden a trabajos de interacción Candida la web para el almacenamiento y gestión de datos – macrófago [1,2] de los cuales el primero incluye SURWHyPLFRVDVtFRPREDVHVGHGDWRVHVSHFt¿FDVGH SURWHtQDVLGHQWL¿FDGDVGHCandida y el segundo, hongos. Sin embargo, ninguno de ellos está enfoca- 38 proteínas de macrófago. El tercer estudio es un GRHVSHFt¿FDPHQWHDOiUHDGHLQYHVWLJDFLyQGHKRQ- conjunto de experimentos destinados a la extracción gos patógenos y su interacción con el hospedador y HLGHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDVGHPHPEUDQD\SURWHt- contiene además datos experimentales proteómicos. nas con anclaje GPI [3] de C. albicans. En este contexto presentamos Proteopathogen, una base de datos orientada a recopilar datos experimen- Además de la información experimental, y con tales proteómicos y a facilitar el almacenamiento y el objetivo de proporcionar una visión más amplia acceso a un amplio rango de información, abarcando de los datos, se recuperó información relevante de ÀXMRVGHWUDEDMRHQ3URWHyPLFDGHVGHODGHVFULS- bases de datos en la web. Se obtuvieron de CGD ción del experimento que lleva a la preparación de >@LGHQWL¿FDGRUHVVLQyQLPRVRUWyORJRVHQ Sac- la muestra hasta los parámetros de espectrometría charomyces cerevisiae, anotaciones de Gene Onto- GHPDVDV\ORVSpSWLGRVTXHDSR\DQODVLGHQWL¿FD- logy y anotaciones para las proteínas de Candida, ciones. Proteopathogen está actualmente enfocado mientras que en el caso de proteínas de macrófagos hacia Candida albicans y su interacción con macró- murinos, la información equivalente se obtuvo de fagos, sin embargo, datos experimentales relativos UniProt [5] y de Mouse Genome Database [6]. Tam- a otras especies de hongos patógenos y células de bién se recuperaron de KEGG [7], e información de mamíferos pueden ser adecuados para la inserción estructuras de PDB [8] en la base de datos. Proteopathogen es públicamente En cuanto a la arquitectura de la aplicación, accesible en http://proteopathogen.dacya.ucm.es. la estructura básica consiste en una base de datos Candida albicans es un hongo patógeno opor- MySQL gestionada por la plataforma de desarrollo tunista presente habitualmente en las mucosas hu- web Ruby on Rails que permite crear las tablas y manas. En individuos inmunocomprometidos puede relaciones entre los datos, manejar las consultas y proliferar excesivamente y provocar candidiasis, mostrar las páginas. una micosis muy extendida y en ocasiones fatal. En El contexto experimental es tratado en Proteo- este sentido, abordar estudios proteómicos sobre pathogen jerárquicamente, mostrando una aproxi- la interacción de Candida con células del sistema mación general del estudio, en donde se detallan inmune es clave para mejorar nuestra comprensión DXWRUHVWtWXORGHODSXEOLFDFLyQHLGHQWL¿FDGRU del proceso de infección y puede suponer un paso de PubMed, y dentro de esa descripción general, inicial en investigación básica para el futuro desa- los experimentos concretos que dan lugar a las rrollo de métodos de diagnóstico, vacunas y fárma- LGHQWL¿FDFLRQHV cos antifúngicos. La información sobre una proteína particular se Respecto a la recopilación de información con- muestra dividida en secciones (Figura 1). En la sec- tenida en Proteopathogen, se han incluido datos co- ción titulada Protein Basic Information se muestran rrespondientes a tres experimentos. Los dos prime- el número de acceso de Uniprot, descripción de la 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 29
proteína, especie, evidencia de la existencia, nombre Por último, y para mejorar la interactividad con HVWiQGDUGHOJHQLGHQWL¿FDGRUHVGHEDVHVGHGDWRV el usuario, Proteopathogen incluye un formulario HVSHFt¿FDVGHRUJDQLVPRRUWyORJRV\VHFXHQFLD para el envío de datos. Éstos serán revisados por En la sección Experiments se listan aquellos expe- XQDGPLQLVWUDGRU\XQDYH]YHUL¿FDGRVSRGUiQVHU ULPHQWRVHQTXHVHKDLGHQWL¿FDGRODSURWHtQDHQ incluidos en la base de datos. particular. Además, y en los casos que las anotacio- nes estén disponibles, se muestran una o más de las siguientes secciones: anotaciones de Gene Ontology Referencias con las correspondientes referencias, rutas de KEGG [1] Fernández-Arenas E, Cabezón V, Bermejo C, y CGD, e información estructural de PDB. Arroyo J, Nombela C, Diez-Orejas R, et al. Integrated genomic and proteomic strategies bring new insight into Candida albicans res- ponse upon macrophage interaction. Mol Cell Proteomics 2007; 6: 460-478. [2] Martínez-Solano L, Nombela C, Molero G, Gil C. Differential protein expression of murine macrophages upon interaction with Candida albicans. Proteomics 2006; 6: 133-144. [3] Cabezón V, Llama-Palacios A, Nombela C, Mon- teoliva, L, Gil C. Analysis of Candida albicans plasma membrane proteome. Proteomics 2009; 12, 9(20):4770-4786. [4] Arnaud MB, Costanzo MC, Skrzypek MS, Binkley G, Lane C, Miyasato SR, et al. The Candida Genome Database (CGD), a commu- nity resource for Candida albicans gene and protein information. Nucleic Acids Res 2005; 33:358-363. En todos los casos, las proteínas aparecen rela- cionadas con los experimentos a los que pertenecen [5] UniProt Consortium. The Universal Protein de forma que se puede enlazar con la información Resource (UniProt). Nucleic Acid Res 2008; UHODWLYDDODLGHQWL¿FDFLyQ(VWRVGDWRVFRPSUHQ- 36: 190-195. den, por una parte parámetros comunes a todas las [6] Bult C, Eppig JT, Kadin JA, Richardson JE, SURWHtQDVLGHQWL¿FDGDVHQFDGDH[SHULPHQWRLQFOX- Blake JA The Mouse Genome Database (MGD): yendo la base de datos de la búsqueda, software de mouse biology and model systems. Nucleic DQiOLVLVHQ]LPDGHGLJHVWLyQPRGL¿FDFLRQHV¿MDV\ Acids Res 2008;36: 724-728. variables y máximo número permitido de cortes no [7] Kanehisa M, Araki M, Goto S, Hattori M, efectuados. Por otra parte también están presentes Hirakawa M, Itoh M, et al. KEGG for linking ORVGDWRVTXHVHUH¿HUHQDFDGDLGHQWL¿FDFLyQGRQGH genomes to life and the environment. Nucleic se muestran la secuencia de los péptidos, su masa Acids Res 2008; 36: 480-484. observada y masa teórica y la puntuación. >@ %HUPDQ+0:HVWEURRN-)HQJ=*LOOLODQG La interfaz pública de Proteopathogen ofrece *%KDW71:HLVVLJ+HWDO7KH3URWHLQ'DWD múltiples formas de consultar el contenido. Es posi- Bank. Nucleic Acids Res 2000; 28: 235-242. ble navegar por la lista de experimentos y visualizar rápidamente la lista de proteínas pertenecientes a cada uno de ellos, pero también se puede utilizar el formulario de búsqueda. Éste acepta varios tipos de LGHQWL¿FDGRUHV\DGHPiVSHUPLWHUHDOL]DUE~VTXHGDV por texto libre, recuperando una lista de proteínas que muestren coincidencias. 30 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52
Bioinformatics tools for inferring immune-related functions from proteomic data
Gema Sanz, Ángeles Jiménez, Ángela Moreno, Juan José Garrido
Genómica y Mejora Animal, Departamento de Genética, Universidad de Córdoba, Campus de Rabanales, 14071 Córdoba, Spain
The development of functional genomics tech- The aim of this study was 2-fold. Firstly, nologies has lead to the generation of large amounts it was intended to identify novel proteins invol- of data that needs to be structured for easier in- ved in the swine neutrophils response to LPS by terpretation and full exploitation of the knowled- using a 2-dimensional gel electrophoresis (2-DE) ge hidden in huge databases. This is only possible approach. Despite of the rise of new technologies ZKHQZHDSSO\HI¿FLHQWDQDO\VLVWRROVLQRUGHUWR in quantitative differential proteomics, 2-DE and discover new techniques for data storage, querying, matrix-assisted laser-desorption ionization time of extracting and mining. ÀLJKWPDVVVSHFWURPHWU\ 0$/',72)06 DUH still the most widespread methods for proteomics In the present study, we use an experimental mo- studies [3]. The differences in protein expression del of response to infection, based in the exposure of after LPS treatment may lead to the elucidation neutrophils to LPS from Salmonella typhimurium. Neutrophil activation by LPS involves the production RISURWHLQIXQFWLRQVRUSDWKZD\VRILQÀDPPDWRU\ of reactive oxygen intermediates, release of lipid processes, which could be involved in immune res- mediators and cytokines, adhesion, and phagocytosis. ponse against bacterial pathogens. And secondly, it However, recent studies indicate that a robust trans- used bioinformatics tools such as Ingenuity Pathway criptional response, mainly of cytokines, occurs in Analysis (IPA, www.ingenuity.com) and Cytoscape neutrophils after LPS stimulation, suggesting that this (www.cytoscape.org), to analyze how these altered LQÀDPPDWRU\FHOOVGRPXFKPRUHWKDQMXVWUHOHDVLQJ proteins interact in a cellular context to perform mediators and bactericidal agents [1, 2]. certain biological functions.
Figure 1. %LRIXQFWLRQVDQGGLVHDVHVVLJQL¿FDQWO\DOWHUHGWKURXJKWKHWLPHFRXUVH. Differentially expressed proteins were sub- jected to statistical analysis with a Student´s T-test and those categories with p < 0.05 were listed. The number of proteins in each category is shown at the right side of the bars. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 31
Blood samples were collected at the slaughter- Differentially expressed proteins in each time- KRXVHIURP¿YH,EHULDQKHDOWK\SLJVDQGQHXWURSKLOV point were subjected to BiNGO plugin of Cytosca- were isolated with Dextran sedimentation and cen- pe [4] in order to elucidate the relationship among trifugation through Ficoll-Paque. For LPS stimula- the altered GO functions through the time course tion, the neutrophils were incubated for 6, 9 and 18 LQDXQL¿HGFRQFHSWXDOIUDPHZRUN7KHUHVXOWVRI hours in presence or absence of 100 ng/ml LPS. Pro- WKLVDQDO\VLVDUHVKRZQLQ)LJXUH%ULHÀ\LPPX- teins were solubilized and the extracts were pooled ne related functions such as killing and apoptosis and six replicate 2-DE gels for condition (untreated are conserved both at 6 and 18 hours. Similarly, cells and treated with LPS) were analysed by 2-DE. cellular metabolism was also altered through the The LPS-induced changes in proteins was subjected time course. to statistical analysis with a Student’s t test after FKHFNLQJQRUPDOLW\E\WKH:LONV6KDSLURWHVWDQG In conclusion, LPS stimulation alters the patterns those spots with p< 0.05 were analyzed by MALDI of protein expression in neutrophils, and the present TOF-TOF (MS/MS). UHVXOWVUHSUHVHQWWKH¿UVWFRPSUHKHQVLYHVWXG\WR better understanding a complex biological event such The number of differentially expressed proteins as the swine innate immune response. Bioinformatics in neutrophils after LPS treatment varied through the provides many tools for analyzing protein data sets time-course. Up today, 44 and 31 proteins for 6 and 18 by visually exploring biological networks, including KRXUVZHUHLGHQWL¿HGUHVSHFWLYHO\'DWDDQDO\VLVZLWK well-known examples such as IPA and Cytoscape. IPA revealed that several immune response-related Since these tools can integrate graph drawing, infor- IXQFWLRQVVXFKDVLQÀDPPDWRU\DQGUHVSLUDWRU\GLVHD- mation visualization, network analysis and biology, se, cellular movement and organization or cell death we can use them to interpret our results from a pro- were altered during the time-course (Figure 1). teomic approach in an easy way.
Figure 2. BiNGO analysis for 6 and 18 hours. Nodes represent biological functions categories and edges represent the LQWHUDFWLRQDPRQJWKHP6WDWLVWLFDOVLJQL¿FDQFHRIHDFKFDWHJRU\LVVKRZQDVJUH\VFDOHZKHUHEODFNLVWKHPRVWVLJQL¿FDQW function. Node weight indicates the number of interactions.
References Oligonucleotide Microarrays and Proteomics. CHEST 2002; 121: 75S-76S. [1] Malcolm KC, Arndt PG, Manos EJ, Jones DA, \:RUWKHQ*60LFURDUUD\DQDO\VLVRIOLSRSR- [3] Monteoliva L y Albar JP. Differential proteo- lysaccharide-treated human neutrophils. Am mics: An overview of gel and non-gel based J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2003; 284: DSSURDFKHV%ULH¿QJVLQ)XQF*HQRPLFVDQG L663-L670. Proteomics 2004; 3: 220-239. >@ )HVVOHU0%0DOFROP.&'XQFDQ0:\:RU- [4] Maere S, Heymans K and Kuiper M. BiNGO: then GS. Lipopolysaccharide Stimulation of the a Cytoscape plugin to assess overrepresenta- Human Neutrophil: An Analysis of Changes in tion of Gene Ontology categories in Biologi- Gene Transcription and Protein Expression by cal Networks. Bioinf Applic Note 2005; 16: 3448-3449. 32 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52
2. BIOMARCADORES Y PATOLOGÍAS HUMANAS
Coordinadores: Ángel García y Cristina Ruiz
Protein targets of oxidative stress induced by Huntington disease in human brain
Evaluation of an HD mice model: Tet/HD94
M. Alba Sorolla1, Isidre Ferrer2, José Lucas3 Joaquim Ros1, Elisa Cabiscol1
1Departament de Ciències Mèdiques Bàsiques, Universitat de Lleida, Spain. 2Institut de Neuropatologia, Servei d’Anatomia Patològica, IDIBELL-Hospital de Bellvitge, Universitat de Barcelona, Spain. 3Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CSIC-UAM), C/Nicolás Cabrera, 1 Campus Cantoblanco, Universidad Autónoma de Madrid, Spain.
Huntington disease (HD) is an inherited neuro- doxal 5-phosphate kinase, potentially leading to a degenerative disorder characterized by degeneration reduction in PLP availability. PLP is a cofactor of of neurons affecting the striatum and the cortex. The enzymes involved in neurotransmitter metabolism disease involves expansion of CAG trinucleotide (GABA production). repeats in the huntingtin gene codifying for gluta- mines in the htt protein [1]. The main goal of this work is to study protein oxidation in post-mortem tissue samples (stria- tum) from individuals affected of HD. Moreover, a conditional HD mouse model is used to evalua- te whether similar proteins are affected in these mice (Tet/HD94) [2]. These mice express a polyQ sequence of 94 glutamines under the control of a doxycycline-regulatable promoter and resembles the human phenotype. Protein oxidation by reactive oxygen species can generate carbonyl groups on the side-chain of several amino acids and these groups can be deri- vatized by 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH) and GHWHFWHGE\:HVWHUQEORW>@:HSHUIRUPHGD' gel electrophoresis analysis followed by anti-DNP :HVWHUQEORWLQRUGHUWRLGHQWLI\R[LGL]HGSURWHLQV in human brain post-mortem samples obtained from Figure 1. Oxyproteome analysis of human samples. Compa- striatum of HD patients compared to samples of rative analysis revealed several spots with increased oxida- age and sex-matched controls (Figure 1). A com- WLRQOHYHOVLQ+',GHQWL¿FDWLRQZDVSHUIRUPHGDQGSURWHLQV listed in Table 1. parison between 8 control-HD pairs was made and spots that showed a ratio of oxidation level HD/ The results from Tet/HD94 mice show that pro- control > 1.5 (once normalized for protein amount) tein oxidation is increased in HD94 expressing mice ZHUHLGHQWL¿HGE\30)RU0606 7DEOH 7KH (gene on) in striatum, while no differences are ob- most interesting result was the oxidation of pyri- served in cortex and cerebellum (Fig 2). Also, there 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 33
Table 1. ,GHQWL¿FDWLRQRIR[LGL]HGSURWHLQVLQ+'
ACCESSION MOLECULAR SPOT PROTEIN GENE *OXIDATION NUMBER 0$66 '$ 1 112,76
2 Transitional endoplasmic 9,02 VCP P55072 89322 3 UHWLFXOXP$73DVH 9&3 423,73 4 50,50 5 7,38 +HDWVKRFNFRJQDWHN'D 6 HSC71 P11142 70898 1,64 protein 7 2,53 ĮDPLQRDGLSLFVHPLDOGHK\GH ALDH7A1 P49419 55332 dehydrogenase
Cytosol aminopeptidase LAP3 P28838 56131 8 3,40
T-complex protein 1 subunit beta CCT2 P78371 57452
9 5,41 10 ĮHQRODVH ENO1 P06733 47169 1,79 11 4,88 12 1 * 1 * GLPHWK\ODUJLQLQH 1,90 DDHA1 O94460 31122 13 dimethylaminohydrolase1 1,82
14 3\ULGR[DONLQDVH PDXK O00764 35080 2,42
15 47,01 3\UXYDWHNLQDVHLVRHQ]\PHV0 16 PKM2 P14618 57937 15,26 M2 17 4,86
18 ATP synthase subunit alpha ATP5A1 P25705 59751 2,32
*O\FHUDOGHK\GHSKRVSKDWH 19 GAPDH P04406 36053 2,28 dehydrogenase
Cytochrome b-c1 complex subunit 20 UQCRC2 P22695 48413 7,93 2, mitochondrial
Citrate synthase, mitochondrial CS O75390 51680
&UHDWLQHNLQDVHXELTXLWRXV CKMT1A P12532 47007 mitochondrial
&UHDWLQHNLQDVHVDUFRPHULF 21 CKMT2 P17540 47474 7,51 mitochondrial
Fructose-biphosphate aldolase A ALDOA P04075 39395
*The oxidation level is estimated as a ratio between HD and control oxidation signal, divided by the ratio of their protein amount. 34 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52
is an evident decrease in the pyridoxal 5-phosphate As a conclusion, the human oxyproteome ex- kinase levels in the HD94 expressing mice (gene periments show a clear energetic failure and PLP on), that is recovered after 5 months of doxycycline metabolism disruption. Moreover, these evidences treatment (gene off), reaching the levels of control are also observed in the mice model, leading to the mice. Moreover, this protein seems to be more oxi- hypothesis that possible interventions to increa- dized in the “gene on” mice (Figure 3). se PLP availability and energy production can be taken in account.
References [1] Huntington’s Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleo- tide repeat that is expanded and unstable on Huntington’s disease chromosomes. Cell 1993; 72: 971-983. [2] Yamamoto Ai, Lucas JJ and Hen R. Reversal of Neuropathology and Motor Dysfunction in a Conditional Model of Huntington disease. Cell 2000; 101:57-66. >@ /HYLQH5/:LOOLDPV-$6WDGWPDQ(5DQG Shacter, E. Carbonyl assays for determination RIR[LGDWLYHO\PRGL¿HGSURWHLQV0HWKRGV(Q- Figure 2. Protein oxidation in Tet/HD94 mice. All mice zymol. 1994; 233: 346-357. were 24 months old. C: control mice; HD: “gene on” mice; HD+doxy: “gene on” for 19 months + “gene off” for 5 months (doxycycline treatment).
)LJXUHLevels and oxidation of pyridoxal 5-phosphate NLQDVHLQ7HW+' PLFH$PSOL¿HGVHFWLRQVRIZHVWHUQEORW anti-PDXK and anti-DNP from 2D gel separation of tissue extracts from striatum of Tet/HD94 mice. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 35
,GHQWL¿FDFLyQPHGLDQWHSURWHyPLFDGHSRVLEOHVELRPDUFDGRUHVSODTXHWDULRVHQ síndrome coronario agudo
Andrés F. Parguiña1, Isaac Rosa1, Lilián Grigorian-Shamagián2, Elvis Teijeira-Fernández2, Jana Alonso2, Rosa Agra2, José Ramón González-Juanatey2, Ángel García1
1Dpto de Farmacología; Universidad de Santiago de Compostela, Santiago de Compostela. 2Complexo Hospitalario Universitario de Santiago, Santiago de Compostela
Introducción el electrocardiograma (SCASEST) frente al de un grupo control constituido por 10 individuos con La activación plaquetaria y la formación del cardiopatía isquémica crónica estable. La toma de trombo juegan un papel fundamental en el sín- muestra de los pacientes con SCASEST se hizo en drome coronario agudo (SCA), principal causa tres puntos: al ingreso (menos de 24 horas desde el de muerte en Europa. El SCA es una enfermedad inicio del evento agudo), a los 5 días y a los 6 meses. crónica que se desarrolla durante la vida del indi- Los grupos se cotejaron de manera que no hubiese viduo a causa de la lenta acumulación de placa de GLIHUHQFLDVVLJQL¿FDWLYDVHQHGDGVH[R\WUDWDPLHQ- ateroma en las arterias (aterosclerosis). La placa tos. Las plaquetas se procesaron en menos de dos de ateroma se va endureciendo poco a poco ence- horas tras la extracción sanguínea. Tras extraer las rrando en su interior un núcleo lipídico rodeado proteínas, éstas se separaron mediante electroforesis SRUXQDFDSDGHQVD\¿EURVDTXHSXHGHGHELOLWDUVH bidimensional (2-DE). La primera dimensión fue en debido a una serie de razones patológicas y llegar a tiras de gradiente inmovilizado de pH (4-7, 24 cm). romperse dando lugar a la formación de un coágu- Se escogió esa franja de pI porque análisis anterio- lo. Si este coágulo llega a bloquear las arterias co- res que hemos llevado a cabo han demostrado que la URQDULDVSXHGHUHGXFLURLQFOXVRLPSHGLUHOÀXMRGH mayor parte de las proteínas plaquetarias detectables sangre al corazón (isquemia). Debido a esta falta mediante 2-DE se encuentran en dicha región del de oxígeno en el corazón el paciente, dependiendo proteoma [2]. La segunda dimensión fue en geles del de la gravedad, puede sufrir desde dolor al hacer 10% de poliacrilamida. Los geles fueron teñidos con ejercicio (angina estable [AE]) hasta una situación SYPRO Ruby, y escaneados en un Typhoon 9410 aguda como una angina inestable (AI) o un infarto (GE Healthcare). Las imágenes fueron analizadas de miocardio (IM). Las plaquetas juegan un papel utilizando el software Ludesi REDFIN (Suecia). fundamental en la patogénesis de la aterosclerosis y el SCA [1]. De hecho, la mayoría de las terapias existentes para tratar esta enfermedad interrumpen Resultados la activación plaquetaria. Dado que las plaquetas carecen de núcleo, la proteómica es una herramien- En cada gel se detectaron más de 2300 spots. ta fundamental para su estudio. Por todo ello, el Tras el análisis diferencial, se detectaron 55 spots estudio del proteoma plaquetario en el contexto del correspondientes a proteínas que variaban entre los evento agudo podría ayudar a descubrir biomarca- grupos SCASEST y control (p<0.05 y variaciones dores o dianas terapéuticas que contribuyan a un GHLQWHQVLGDG! )LJXUD /DVSURWHtQDVLGHQWL¿- mejor tratamiento/diagnóstico de la enfermedad. cadas mediante espectrometría de masas (MALDI- Ese ha sido el objetivo del presente trabajo. TOF/TOF), correspondían a 30 genes diferentes. Los resultados fueron validados mediante western blot. /DPD\RUtDGHODVSURWHtQDVLGHQWL¿FDGDVSHUWHQHFHQ Métodos a 3 grupos funcionales: señalización, citoesqueleto y ruta de secreción/vesículas. Esto concuerda con la Basándonos en nuestra experiencia en proteómi- idea de que existe una mayor activación plaquetaria ca de plaquetas [2-5], hemos utilizado la 2-DE para en pacientes con SCASEST y fue respaldado por la comparar el proteoma de 18 pacientes con síndrome disminución del número de diferencias en el día 5 coronario agudo sin elevación del segmento ST en tras el ingreso (26 spots diferentes) y a los 6 meses 36 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52
(2 spots diferentes). Algunas de las proteínas identi- Agradecimientos ¿FDGDVHVWiQLQYROXFUDGDVHQODUXWDGHVHxDOL]DFLyQ GHODLQWHJULQDĮ,,EȕTXHHVXQRGHORVSULQFLSDOHV AG es investigador Ramón y Cajal del Dpto responsables del proceso de activación plaquetaria. de Farmacología de la Universidad de Santiago de Es el caso de ILK, Src y talin. En la mayoría de los Compostela; AFP es becario FPI del mismo depar- FDVRVODVGLIHUHQFLDVVHGHELHURQDPRGL¿FDFLRQHV WDPHQWR/RVDXWRUHVDJUDGHFHQOD¿QDQFLDFLyQGHO post-traduccionales. También se detectó una menor Ministerio de Ciencia e Innovación de España (ref. presencia de proteínas secretadas en pacientes SCA- SAF2007-61773), la Consellería de Educación de SEST lo que podría deberse al proceso de secreción la Xunta de Galicia y la Fundación de Investigación que sufren las plaquetas tras activarse. Se observó Médica Mutua Madrileña. como la tendencia era que estas últimas proteínas estuviesen en mayor cantidad en el plasma pobre en Bibliografía plaquetas de los pacientes SCASEST. [1] Lindemann S, Krämer B, Seizer P y Gawaz 03ODWHOHWVLQÀDPPDWLRQDQGDWKHURVFOHURVLV Journal of thrombosis and haemostasis 2007;5 Suppl 1:203-11. [2] García A, Prabhakar S, Brock CJ, et al. Exten- sive analysis of the human platelet proteome by two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. Proteomics 2004;4:656-68. [3] García A, Prabhakar S, Hughan SC, et al. Differential proteome analysis of TRAP- activated platelets: involvement of DOK-2 and phosphorylation of RGS proteins. Blood 2004;103:2088-95. [4] García A, Senis YA, Antrobus R, et al. A global Figura 1. Imagen representativa del proteoma de plaquetas proteomics approach identifies novel phos- resaltando los 55 spots que varían entre pacientes SCASEST phorylated signaling proteins in GPVI-activated y controles crónicos. platelets: involvement of G6f, a novel platelet Grb2-binding membrane adapter. Proteomics 2006;6:5332-43. Conclusión [5] Senis YA, Antrobus R, Severin S, Parguiña AF, Se ha empleado satisfactoriamente la proteómica 5RVD,=LW]PDQQ1:DWVRQ63\*DUFtD$ GHSODTXHWDVEDVDGDHQ'(SDUDLGHQWL¿FDUSUR- Proteomic analysis of integrin alphaIIbbeta3 out- teínas –provenientes de 30 genes diferentes– que va- side-in signaling reveals Src-kinase-independent rían entre pacientes SCASEST y controles crónicos. phosphorylation of Dok-1 and Dok-3 leading to En próximos estudios investigaremos el papel de las SHIP-1 interactions. Journal of thrombosis and SURWHtQDVLGHQWL¿FDGDVHQODSDWR¿VLRORJtDGHO6&$\ haemostasis 2009;7:1718-26. exploraremos su uso potencial como biomarcadores para el tratamiento y/o prognosis de la enfermedad. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 37
Análisis de la expresión diferencial de proteínas en el suero de ratones C57BL/6 VLOYHVWUHVUHVSHFWRDUDWRQHV&%/GH¿FLHQWHVSDUD&'XWLOL]DQGRXQDFR- OHFFLyQFRPELQDWRULDGHKH[DSpSWLGRV ProteoMiner \HOHFWURIRUHVLV'
Antonio Rosal, Sonia García-Rodríguez, Esther Zumaquero, Pilar Navarro, Mercedes Zubiaur, Jaime Sancho
Departamento de Biología Celular e Inmunología, Instituto de Parasitología y Biomedicina “López-Neyra”, CSIC, Armilla (Granada)
Introducción nuestro trabajo previo [1]. El análisis diferencial se realizó utilizando el software PDQuest Advan- La tecnología asociada al ProteoMiner permite ced versión 8.0.1. reducir el rango dinámico del proteoma sérico au- mentando la concentración de las proteínas poco abundantes y diminuyendo simultáneamente la con- Resultados centración de las proteínas más abundantes, consi- guiéndose una mayor diversidad de especies protei- A partir de volúmenes relativamente de suero µ cas. Una desventaja es que en su formato tradicional relativamente pequeños (200 l o 10 mg de proteína se necesita partir de una concentración de proteínas total) se obtenía un rendimiento de alrededor del relativamente grande, impidiendo su utilización FRQVX¿FLHQWHFDQWLGDGGHSURWHtQDSDUDDQiOL- cuando el material de partida es escaso. En este sis posteriores por 2-D tradicional o 2-D DIGE (la estudio se ha utilizado esta técnica en combinación presencia de Urea y CHAPS en el buffer de eluido con la separación de proteínas por electroforesis en permite la utilización de la técnica 2-D DIGE si JHOHV'y'HLGHQWL¿FDFLyQSRUHVSHFWURPHWUtD previamente se ajusta el pH a 8.0-8.5 con 1 M Tris). de masas, para el análisis de la expresión diferen- (OSHU¿OGHEDQGDVREWHQLGDVHQJHOHV'RHOGH cial de proteínas en sueros de ratones B6 silvestres spots en geles 2-D de los eluidos del ProteoMiner HQFRPSDUDFLyQFRQUDWRQHVGH¿FLHQWHVSDUD&' eran claramente diferentes del de los sueros sin frac- (CD38ko) a partir de volúmenes de sangre relativa- cionar o de las proteínas no unidas a las columnas, mente pequeños (100-200 µl). aunque proteínas mayoritarias como albúmina o las inmunoglobulinas eran todavía detectables. La solución II es superior a la solución I en cuanto Material y métodos al número, la resolución y la calidad de los spots REWHQLGRVDVtFRPRVXSRVWHULRULGHQWL¿FDFLyQSRU El kit ProteoMiner de pequeña capacidad para HVSHFWURPHWUtDGHPDVDV6HLGHQWL¿FDURQSURWHtQDV análisis por geles 2-D (Bio-Rad) fue utilizado séricas que están en un rango de concentración que siguiendo las instrucciones del fabricante. Las va desde µg/L hasta g/L, lo que demuestra que esta proteínas eluidas de las columnas de hexapépti- tecnología permite detectar proteínas presentes en µ dos se separaron en geles 1-D (30 g) o 2-D (50 un amplio rango dinámico de concentración. µg). Para la separación en geles 2-D se utilizó el sistema Protean IEF (Bio-Rad) en la primera dimensión y el sistema CRITERION (Bio-Rad) Conclusiones en la segunda (1). Para la primera dimensión se compararon dos soluciones diferentes: Solución La utilización del ProteoMiner en combinación I (7M Urea, 2 M Thiourea, 1% ASB-14, 40 mM FRQJHOHV'WLQFLyQFRQ6<3525XE\HLGHQWL¿- Tris, 2 mM TBP y 0.2% Anfolitos) o Solución cación de las proteínas por MS y posterior secuen- II (8 M Urea, 2% CHAPS, 50 mM DTT, 2 mM FLDFLyQGHSpSWLGRVHVSHFt¿FRVSRU0606SHUPL- TBP y 0.2% Anfolitos). Los geles se tiñeron con WHLGHQWL¿FDUXQPD\RUQ~PHURGHSURWHtQDVSRFR 6<3525XE\/DLGHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDVSRU abundantes, pero reteniendo una representación de MS o MS/MS se realizó de forma idéntica a la de todas las proteínas de partida en sueros de ratón. 38 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52
La utilización de volúmenes reducidos de suero o Referencias plasma (100-200 µl) no es un impedimento para un análisis diferencial de expresión por técnicas 2-D [1] Pavon EJ, Munoz P, Lario A, Longobardo V, DIGE, SELDI-TOF o LC-MS. Carrascal M, Abián J, et al. Proteomic analysis of plasma from patients with systemic lupus erythematosus: increased presence of haptoglo- bin alpha2 polypeptide chains over the alpha1 isoforms. Proteomics 2006; 6: 282-92.
Developing MRM Assays for Peptide Quantitation: The MIDASTMZRUNÀRZDQG QtrapTM technology
Antonio Serna Sanz
Applied Biosystems
,QWKH¿HOGRISURWHRPLFVPRVWRIWKHLQIRU- discovery and characterization of peptides and mation needed on biological samples of interest proteins are necessary. extends beyond just the identity of the protein. 2QFHWKHSURWHLQLGHQWL¿FDWLRQLVPDGHIURPD The information known about the sample, such variety of MS and orthogonal experiments, a more as the protein sequence or a hypothesized post- in-depth study is necessary to characterize iso- WUDQVODWLRQDO PRGL¿FDWLRQ DOORZV PRUH VSHFL¿F IRUPVVLWHVRISRVWWUDQVODWLRQDOPRGL¿FDWLRQRU questions to be addressed. Normal information even sites of cleavage after activation or secretion. dependent acquisition techniques will not always Additionally, constructing methods to determine detect the components of interest if they are of low WKHSUHVHQFHRIDVSHFL¿FSURWHLQRUSHSWLGHLQD abundance, or are poorly amenable to MS analysis. A more hypothesis-driven acquisition approach is complex mixture is of greater importance as the TM ¿HOGRIELRPDUNHUGLVFRYHU\DQGYDOLGDWLRQJURZV often more effective such as the MIDAS wor- Robust and sensitive techniques for this targeted NÀRZ )LJXUHDQG 7KHXWLOLW\DQGSRZHURIWKLV approach is explored here.
Figure 1. Schematic of the Multiple Reaction Monitoring (MRM) scan for high selectivity and sensitivity. Q1 is set to trans- mit only the parent m/z of the peptide , the collision energy is optimized to produce a diagnostic charged fragment of this peptide in Q2, and Q3 is set to transmit this diagnostic fragment only. Because of the short dwell times required (10-50 ms) and the ability to change rapidly between MRM transitions, many components (transitions) in a mixture can be monitored simultaneously in a single LC/MS/MS run. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 39
TM 1. Key Features of the MIDAS Wor- is detected by MRM, an Enhanced Resolution (ER) NÀRZRQWKH475$3TM and 5500 Q scan can be performed to obtain accurate charge and TRAPTM Systems m/z information, and then MS/MS is performed. In many cases the detection of an MRM transition can ([WUHPHO\KLJKVHOHFWLYLW\DQGVHQVLWLYLW\IRU EHVXI¿FLHQWIRUFRQ¿UPDWLRQEXWWKH0606GDWD detecting peptides in complex mixtures. can provide additional validation of identity. +LJKVHQVLWLYLW\DQGKLJKTXDOLW\0606IRU FRQ¿UPDWLRQRISHSWLGHVHTXHQFH 0XOWLSOH5HDFWLRQ0RQLWRULQJ 050 FDQ provide quantitative information between samples.
)LJXUH. MRM Initiated Detection and Sequencing using TM the MIDAS :RUNÀRZ7KHVHQVLWLYLW\DQGVSHFL¿FLW\RIDQ MRM scan can be used as a survey scan for Information Figure 2: Creating a reliable MRM-based method for peptide 'HSHQGHQW$FTXLVLWLRQ ,'$ WRµGLJGHHSHU¶LQWRDELROR- quantitation is an iterative procedure that takes input from gical sample. The MRM scan detects the peptide at high various sources. Choosing which peptides, and then which VHQVLWLYLW\DQGWULJJHUVDIXOOVFDQ0606IRUFRQ¿UPDWLRQ fragment ions, can be based on either 1 previously acquired of peptide identity. MS/MS data or from 2 non-MS based techniques and pepti- de fragmentation prediction. The next step is to 3 create an TM LQVWUXPHQWVSHFL¿FPHWKRG 050WULJJHUHG0606PHWKRG 3. Applications of the MIDAS RWKHUZLVHNQRZQDVD0,'$6:RUNÀRZPHWKRG DQGWKHQXVH :RUNÀRZ this method to 4 acquire data. The selected MRM transitions 7DUJHWLQJORZOHYHOSKRVSKRU\ODWLRQVLWHVRQ are then 5 evaluated for their suitability for quantitative measu- rements (i.e.signal/noise, intensity, etc.) and the MS/MS is eva- DSURWHLQRINQRZQVHTXHQFHWRLGHQWLI\RUFRQ¿UP OXDWHGIRUKRZZHOOLWFRQ¿UPVWKHSHSWLGH,'7KLVSURFHVVLV PRGL¿FDWLRQORFDWLRQ 6 repeated until 7 a set of MRM transitions are generated that reliably identify the peptides and can be used for quantitation. 9DOLGDWLQJZHDNSURWHLQLGHQWL¿FDWLRQVE\VSH- FL¿FDOO\REWDLQLQJPRUH0606RQDGGLWLRQDOSHSWL-
TM des for that protein 2. The MIDAS :RUNÀRZ 'HWHFWLRQRIORZOHYHOSURWHLQVLQFRPSOH[ Typically in an information dependent acqui- mixtures sition (IDA), peaks are selected from full scan MS - data, and are then used for dependent MS/MS ex- 4XDQWLWDWLRQRISURWHLQVSHSWLGHVZLWKDFFRP periments. The MRM scan can also be used as sur- SDQ\LQJ0606IRULGHQWLW\FRQ¿UPDWLRQ YH\VFDQZKLFKHQDEOHVWKHXVHUWRLQÀXHQFHWKH choice of precursor ion selection for MS/MS. In Conclusions combination with ab initio prediction of theoreti- FDOIUDJPHQWVDQGPRGL¿FDWLRQVRILQWHUHVW050 The unique hybrid nature of the triple quadru- driven IDA provides all of the advantages of MRM poles linear ion traps 4000 Q TRAP® and 5500 Q sensitivity, S/N gains, and high selectivity, with full TRAP® systems allow for targeted powerful wor- VFDQ0606GDWDIRUFRQ¿UPDWLRQDQGHYHQGD- NÀRZV&RPELQLQJWKHVSHFL¿FLW\DQGVHQVLWLYLW\RI tabase searching. Figure 3 highlights the general Multiple Reaction Monitoring (MRM) with the high schema utilized in these experiments. Since each quality MS/MS allows for the targeted discovery of MRM transition is rapid, many of these can be com- SHSWLGHVDQGSRVWWUDQVODWLRQDOPRGL¿FDWLRQV*RRG bined in a single survey scan spanning hundreds of MS/MS can be obtained on peptides at extremely SRWHQWLDOSHSWLGHVDQGPRGL¿FDWLRQV$IWHUDSHDN low amounts on column (1 amol), easily track. 40 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52
Intelligent Use of Retention Time for Higher Order Multiple Reaction Monitoring Multiplexing – Scheduled MRM™ Algorithm
Antonio Serna Sanz
Applied Biosystems
The utility of Multiple Reaction Monitoring In this work, the unique combination of triple (MRM) on triple quadrupole based MS systems quadrupole and ion trapping capabilities of the hybrid for biomarker verification/validation studies is triple quadrupole - linear ion trap mass spectrometer currently an active area of investigation, driven (QTRAP® System) has been utilized to create 100s by the well known sensitivity and selectivity at- RIKLJKTXDOLW\VSHFL¿F050WUDQVLWLRQVIRUPXOWLSOH tributes of this type of MS approach. As more peptides to many plasma proteins. Iterative analysis extensive protein panels need to be monitored SURYLGHGUDSLGUH¿QHPHQWRI050SDUDPHWHUVZL- in a targeted way across multiple samples, hig- thout requiring synthetic peptides. Intelligent use of her MRM multiplexing is becoming essential for retention time using new acquisition software enables throughput. The challenges of assay develop- many more MRM transitions to be included in a ment and running these large scale studies are single acquisition method, while maintaining good becoming better understood, the need for rapid peak area reproducibility. The analytical reproduci- assay development, the need for higher multi- bility of the MRM method developed was found to plexing and the need for more robust assays are be extremely high, even in plasma, with the majority some of the key challenges. of peptides being measured with %CV<10.
Obesidómica: caracterización del secretoma del tejido adiposo de diferentes localizaciones anatómicas
Arturo Roca-Rivada1,2,3; Jana Alonso 4; Omar Al-Massadi1,2,3; Luisa María Seoane1,2, Felipe Casanueva1,2,3, María Pardo1,2
1Ciber Fisiopatología de la Obesidad y Nutrición; 2Laboratorio de Endocrinología Molecular y Celular, Complexo Hospitalario Universitario de Santiago (CHUS/SERGAS); 3 Departamento de Medicina (Univer- sidade de Santiago de Compostela); 4 Laboratorio de proteómica, Instituto de Investigaciones Biómédicas (CHUS/SERGAS)
En los últimos años el tejido adiposo ha pasado moléculas llamadas adipokinas, implicadas en di- de considerarse un órgano inerte con función exclu- ferentes aspectos de la regulación del metabolismo. siva de almacén y movilización de ácidos grasos a Sin embargo, las adipokinas descubiertas hasta aho- FDOL¿FDUVHFRPRHOyUJDQRHQGRFULQRPiVJUDQGH\ ra no llegan a explicar convincentemente los com- dinámico del cuerpo. Desde el descubrimiento de la plejos mecanismos reguladores de la homeostasis leptina como principal hormona reguladora secre- energética ni el desarrollo de los procesos asociados tada por el tejido adiposo, han ido surgiendo más a la obesidad u otros desórdenes alimentarios. Bajo 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 41
este contexto es necesaria la búsqueda de nuevas del secretoma de grasa visceral, 87 de subcutánea señales secretadas por este órgano para una mejor y 91 de gonadal. comprensión de su funcionamiento [1]. Hace tan solo unos pocos años que se empezó a aplicar las técnicas proteómicas al estudio del tejido DGLSRVR VLQHPEDUJRGHELGRDGLYHUVDVGL¿FXOWDGHV técnicas innatas a la naturaleza de este tejido, se ha avanzado poco comparado con estudios similares para otro tipo de tejidos. Los estudios sobre la se- creción del tejido adiposo son recientes y escasos y hasta la fecha no se ha realizado un estudio compa- rativo entre los secretomas de los distintos tipos de depósitos grasos [1].
Objetivos 1. Optimización y puesta a punto de las técni- cas de proteómica para aplicar al estudio de tejido adiposo procedente de distintos depósitos grasos; 2. Realización de un mapa de referencia de la se- creción de tejido adiposo visceral, subcutáneo y JRQDGDO ,GHQWL¿FDFLyQ\FDUDFWHUL]DFLyQGHSUR- WHtQDVVHFUHWDGDVHVSHFt¿FDVGHFDGDWHMLGRJUDVR 4. Estudio diferencial de los secretomas de los tres GHSyVLWRVJUDVRVHQGLIHUHQWHVHVWDGRV¿VLROyJLFRV y nutricionales (ad libitum, ejercicio, anorexia y Figura 1. Proteínas comunes secretadas por los tres depósi- tos grasos. Localización en el secretoma de grasa visceral REHVLGDG 9DOLGDFLyQ\HVWXGLR¿VLROyJLFRGH SURWHtQDVLGHQWL¿FDGDVGHLQWHUpV
El 58% de las proteínas de grasa visceral corres- Métodos pondieron a proteínas secretadas, el 54% en sub- cutánea y el 45% en gonadal (Tabla 1 y 2). Se han Se ha usado como modelo experimental ratas detectado adipokinas clásicas como la adiponectina macho Sprague Dawley en condiciones ad libitum y el retinol-binding protein 4, así como proteínas para la realización de los mapas de referencia. Los todavía no asociadas a este tejido que están siendo explantes de tejido adiposo se incubaron in vitro y validadas. los secretomas resultantes se concentraron y preci- pitaron para ser sometidos a electroforesis bidimen- sional y espectrometría de masas (MALDI-TOF/ Conclusiones 72) /DVSURWHtQDVLGHQWL¿FDGDVVHKDQFDUDFWHUL- ]DGR\FODVL¿FDGRVHJ~QODEDVHGHGDWRV8QL3URW\ El análisis de los secretomas de tejido adiposo el software del servidor SecretomeP 2.0 atendiendo muestra patrones de secreción diferente dependien- a la presencia/ausencia de péptido señal (SignalP) o do de la localización anatómica en condiciones ad su adherencia a una ruta de secreción no clásica. El libitum (Tabla 2). También se muestra la utilidad de estudio de expresión diferencial se está realizando ODSURWHyPLFDSDUDODLGHQWL¿FDFLyQGHDGLSRNLQDV con el software Ludesi REDFIN 3, Sweden. ya conocidas implicadas en diversos procesos meta- bólicos, así como de proteínas con funciones no tan conocidas en este tejido. El siguiente paso será hacer Resultados un estudio diferencial bajo diferentes condiciones ¿VLROyJLFDV Hemos completado los tres primeros objetivos HLGHQWL¿FDGRXQWRWDOGHSURWHtQDVGLIHUHQWHV 42 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52
Tabla1. &ODVL¿FDFLyQGHODVSURWHtQDVLGHQWL¿FDGDVSRU0$/',72)72)GHORVWHMLGRVDGLSRVRVYLVFHUDOVXEFXWiQHR\ gonadal según los criterios: Proteínas totales, tipo de secreción y proteínas comunes entre los tres depósitos grasos.
Visceral Subcutánea Gonadal 3URWHtQDVLGHQWL¿FDGDVWRWDOHV 91 Proteínas secretadas totales 109 47 49 SignalP Ruta de secreción no clásica Proteínas comunes 27 Proteínas secretadas comunes 15
Tabla 2. 3URWHtQDVVHFUHWDGDVFRPXQHVDORVWUHVGHSyVLWRVJUDVRV'HODVSURWHtQDVVHFUHWDGDVHLGHQWL¿FDGDVSRU MALDI-TOF/TOF sólo 15 son comunes a los tres tipos de depósitos grasos.
Nº Spot Secretome P2.0 Nombre Proteína Nº Acceso
1 SignalP N'DJOXFRVHUHJXODWHGSURWHLQ *53B5$7
2 SignalP Serum albumin $/%8B5$7
SignalP Calreticulin &$/5B5$7
4 Alpha-enolase (12$B5$7
5 Gamma-enolase (12*B5$7
6 SignalP Guanine deaminase *8$'B5$7
7 0.512 Actin, gamma-enteric smooth muscle $&7+B5$7 SignalP Cathepsin D &$7'B5$7 9 SignalP 3URWHLQGLVXO¿GHLVRPHUDVH 3',$B5$7 10 0.575 L-lactate dehydrogenase A chain /'+$B5$7 11 0.797 Fatty acid-binding protein, adipocyte )$%3B5$7 12 SignalP Transthyretin 77+ 15 SignalP Serotransferrin 75)(B5$7 Agradecimientos Referencias CIBERobn (ISCIII), FIS (ISCIII), Merk-Serono [1] Breitling R. Robust signaling networks of the y Fundación MM. A.R. está contratado por el pro- adipose secretome. Trends in Endocrinol Metab grama Lucas Labrada (Xunta de Galicia); L.M.S. 2009; 20: 1-7. y M.P. son investigadoras del SNS Miguel Servet (SERGAS/ISCIII). 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 43 Top-Down proteomic analysis of CSF proteins from ALS patients Claudio Diema1, Alex Campos2, Núria Omeñaca1, Eliandre de Oliveira2, Joan Guinovart3, Jacques Borg4, Marta Vilaseca1 1Mass Spectrometry Core Facility, 3 Metabolic engineering and diabetes therapy, Institute for Research in Biomedicine, Barcelona, Spain. 23URWHRPLF3ODWIRUP6FLHQWL¿F7HFKQLFDO6HUYLFHV%DUFHORQD6FLHQFH3DUN Spain. 4Medical Faculty Jacques Lisfranc, Jean Monnet University, Saint-Étienne, France Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a form ted to liquid chromatography- mass spectrometry of motor neuron disease. ALS is a progressive, fatal, (LC-MS) analysis. In detail, Top-Down analysis was neurodegenerative disease caused by the degeneration performed by online LC-nanoESI-MS coupling on a of motor neurons, the nerve cells in the central ner- /74)78OWUD 7KHUPR6FLHQWL¿F ZLWKVLPXOWDQHRXV vous system that control voluntary muscle movement. fraction collection using the Triversa Nanomate (Ad- Diagnosis is achieved with clinical evaluation, as well YLRQ%LR6FLHQFHV $%LR6XLWHS3KHQ\O :DWHUV as electromyography and neuroimaging. However, a 10 µm RPC 2.0 x 75 mm column with a 5-80% ACN VLJQL¿FDQWQXPEHURISDWLHQWVDUHPLVGLDJQRVHGRU gradient over 60 min (100 µl/min) was used for intact diagnosed after a long delay. Therefore, it is crucial protein separations. A 1/250 part from the column WR¿QGSRWHQWLDOELRPDUNHUVWRLPSURYHHDUO\DQG eluent was injected directly to the mass spectrome- reliable diagnosis. Using a Bottom-Up analysis and ter through the Triversa Nanomate using nanoESI LVREDULFTXDQWL¿FDWLRQRIFHUHEURVSLQDOÀXLG &6) chip technology (on line LC-nanoESI-MS, dynamic IURP$/6SDWLHQWVZHUHFHQWO\LGHQWL¿HGDSDQHORI Top-Down) and the rest of the eluent was fraction differentially expressed proteins (Borg et. al, submit- collected in a multi-well plate through the same Na- ted). In the present study we applied Top-Down pro- nomate. According to data obtained by dynamic WHRPLFVWRH[DPLQHPRGL¿FDWLRQVRIWKHVHSURWHLQVLQ 7RS'RZQWKHVSHFL¿FUHWHQWLRQWLPHVRIP]LRQV &6)VDPSOHV3RVWWUDQVODWLRQDOPRGL¿FDWLRQV 370 RILQWHUHVWZHUHYLVXDOL]HG DIWHUZDUGVWKHVHVSHFL¿F and various isoforms of targeted proteins from control fractions containing ions of interest were infused into and sporadic ALS (SALS) were characterized. the MS from the multi-well plate and analyzed by static Top-Down. Protein fragments were obtained ALS has largely unknown pathogenesis that ty- by applying CID or ECD and/or IRMPD on selected pically result in death within a few years from diag- intact proteins ions according to our interest of iden- nosis [1]. There are currently no effective therapies WL¿FDWLRQ370VWXGLHV From 500 to 1000 microscan for ALS. Clinical diagnosis usually takes several averaging was necessary to increase signal to noise months to complete and the long delay between ratio (S/N) and obtain informative fragment spectra symptom onset and diagnosis, limits the possibilities from infused fractions. Obtained data was processed for effective intervention and clinical trials [2]. The E\3URVLJKW3& 7KHUPR6FLHQWL¿F establishment of protein biomarkers for ALS may aid an earlier diagnosis, facilitating the search for In this work, we focused mainly in 4 proteins na- effective therapeutic interventions and monitoring med apolipoprotein A1, cystatin C, ȕ-microglobulin GUXJHI¿FDF\GXULQJFOLQLFDOWULDOV and ȕ-microglobulin short isoform. Our goal was to identify by Top-Down proteomics A truncated isoform of apolipoprotein A1 (Apo PTMs and isoform variants of targeted CSF proteins in A1) was observed in both control and SALS sam- ALS patients and controls, with the aim of using them ples. An isoform of -128 a.m.u of this truncated DVDGLDJQRVLVWRRO:HIRFXVHGRQSURWHLQVZKLFKZHUH Apo A1 form was also detected in both samples found differentially expressed in our previous studies and fragment analysis was consistent with K-10 of CSF from ALS patients (Borg et. al, submitted). deletion (natural variant; K missing in Marburg/ Munster 2 isoform). Short and major isoforms of In order to achieve this goal, the following work- ȕPLFURJOREXOLQZHUHHQFRXQWHUHG6HYHUDOIUDJ- ÀRZZDVDSSOLHG )LJXUH &6)SURWHLQVDPSOHV PHQWVLQGLFDWHGDPRGL¿FDWLRQRIUHVLGXHDWSR- were precipitated with acetonitrile [3] and submit- 44 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Figure 1. :RUNÀRZDSSOLHGIRULGHQWL¿FDWLRQDQGFKDUDFWHUL]DWLRQRISRWHQWLDOELRPDUNHVIRU$/6 sition 22 (pyroglutamic acid formed from Gln), a The isoform variants and PTMs detected in this glycosylation at Ser4 or Ser2 and a phosphorylation work, showed the potential of Top-Down applied in in the short isoform. Moreover, further analysis of ELRPDUNHU¿HOG1HYHUWKHOHVVWKHVHUHVXOWVPXVWEH cystatin C protein showed a truncated isoform, an validated in order to use them as a diagnosis tool for oxidation of the Met14 and a phosphorylation. Table ALS using and independent methodology. 1 summarized PTMs characterized by Top-Down. Protein samples collected in multi-well plate at re- Acknowledgements: The authors would like to tention times of interest were pooled and digested acknowledge Michaela Scigelova and Vlad Zabrous- ZLWKVSHFL¿FHQ]\PH7KHVHSHSWLGHVZHUHDQDO\]HG NRYIURP7KHUPR6FLHQWL¿FIRUWKHLUDVVLVWDQFH:H DSSO\LQJQDQR/&0606DQGWKHLGHQWL¿HGSURWHLQV thank Mark Baumert and Kees Vlak from Advion FRQ¿UPHGWKHUHVXOWVREWDLQHGE\7RS'RZQ Biosciences for technical support and advice. Table 1. Summary of the PTMs characterized by Top-Down methodology. ret. Major isoform detected Protein Intact mass** PTMs times control ALS Apo A1 31.2-31.7 30758.93 27933.43 27933.43 t, -128.09, missing K107 or term Q 28061.47 28061.40 28061.40 truncated Apo A1(t) 28224.44 t, +162.9, glycation 28384.48 28386.63 ß-microglobulin 24.8-25.2 13705.91 13752.83 13871.84 13871.82 13928.86 13928.84 ß-microglobulin 21.2-21.9 11721.78 11721.78 -17.02, pyro-Glu from Q (short isoform) 11741.02 11801.76 11801.76 -17, +79.96 phosphorylation 11883.84 -17, +162.05, Glc at S2/4 cystatin C 23.5-24.5 15789.08 13334.56 13334.48 13334.48 truncated cystatin C (t) 13350.56 13350.56 t, +15.99, M(O) 13413.51 13413.51 t, +79.96, phosphorylation 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 45 References [1] Rowland L.P., Shneider N.A. Amyotrophic late- [3] Abdi F, Quinn JF, Jankovic J et al. Detection of ral sclerosis. N. Engl. J. Med, 2001; 344:1688– biomarkers with a multiplex quantitative pro- 1700. WHRPLFSODWIRUPLQFHUHEURVSLQDOÀXLGRISDWLHQWV with neurodegenerative disorders. J Alzheimers [2] Ryberg H and Bowser R. Protein biomarkers for Dis. 2006; 9:293-348. amyotrophic lateral sclerosis. Expert Review of Proteomics, 2008: 5: 249-262. Optimum method designed for 2D-DIGE of arterial intima and media isolated by laser microdissection Fernando de la Cuesta1, Gloria Álvarez-Llamas1, Irene Zubiri1, Aroa Sanz-Maroto1, Alicia Donado2, Luis Rodríguez-Padial4, Ángel García-Pinto2, María González-Barderas*5, Fernando Vivanco1,6 1Department of Immunology. Fundación Jiménez Díaz, Madrid, Spain. 2Cardiac Surgery Unit. Hospital Gregorio Marañon, Madrid, Spain. 3Department of Pathology. Hospital Virgen de la Salud, Toledo, Spain. 4Department of Cardiology. Hospital Virgen de la Salud, Toledo, Spain. 5Department of Vascular Physio- pathology. Hospital Nacional de Paraplejicos, SESCAM, Toledo, Spain. 6Department of Biochemistry and Molecular Biology I, Universidad Complutense, Madrid, Spain. Introduction for 2-DE analysis of human arterial layers. First of all, a spin column chromatographic step with Pro- Tissue proteomic studies on atherosclerosis tein Desalting Spin Columns (Pierce) was assayed have traditionally focused on whole artery extracts in order to minimize negative effects from remai- from biopsy or necropsy origin. Arterial intima and ning stain. In addition, different lysis buffers were media layers are both involved in atherosclerotic WHVWHGWRDVVXUHHI¿FLHQWH[WUDFWLRQRIDUWHULDOOD\HUV development. In the present work, we describe an proteome, which is problematic due to highly acidic optimum method which employs the combination P\R¿ODPHQWSURWHLQVDQGSUHVHQFHRIFDOFLXP of Laser Microdissection and Pressure Catapul- ting (LMPC) and 2D-DIGE saturation labelling to investigate the human intima and media sub- Results proteomes isolated from atherosclerotic (coronary and aorta) or non-atherosclerotic (preatherosclero- Concerning staining methods, both hematoxilin tic coronary) arteries. and cresyl violet were found to negatively affect protein extraction and IEF. A chromatographic spin column step prior to saturation DIGE labelling im- Methods proved substantially 2-DE gels, permitting the use of both stains for human arterial layers proteomic Coronary biopsies from patients undergoing analysis. Ethanol solved cresyl violet minimizes bypass surgery and coronary and aorta necropsies proteases action and facilitates visualization of arte- were immediately washed in saline and freezed em- rial tissue. For this reasons this stain was chosen for bedded with OCT. Intima and media were isolated further analysis. Optimal DIGE labelling conditions by LMPC with a Microbeam System (PALM Micro- were set at 1nmol TCEP and 2nmol Dye, so that free laser). Several methods for staining (hematoxilin, dye deleterious effects were minimized. The addi- cresyl violet), protein extraction and DIGE labelling tion of SDS, and in a higher extend DTT, on lysis were tested in order to achieve the better protocol EXIIHUVLJQL¿FDQWO\LQFUHDVHGSURWHLQVROXELOL]DWLRQ 46 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 particularly on high molecular weight proteins as and media extracts, respectively. Although some visualized on 2-DE gels. Finally, LMPC method proteins are common between layers, due to similar was checked by LC-MS/MS to assure correct layers FHOOW\SHVSUHVHQW GLIIHUHQWLDOSURWHLQVDUHVSHFL¿F LVRODWLRQDQGSURWHLQVZHUHLGHQWL¿HGIURPLQ of contractile phenotype of VSMCs in the media and solution digested preatherosclerotic coronary intima proliferative in the intima. ,GHQWL¿FDFLyQGHSpSWLGRVHVSHFt¿FRVGHFiQFHUFRORUUHFWDOPHGLDQWHHOXVRGH librerías de fagos T7 impresas en microarrays Ingrid Babel1, Rodrigo Barderas1, Victor Moreno2, Ivan Cristobo1, Gabriel Capellá2, Ignacio Casal1 1 Laboratorio de proteómica funcional. Centro de Investigaciones Biológicas (CIB) Madrid. 2 Instituto Ca- talán de Oncología (ICO) Barcelona El cáncer colorrectal (CCR) es el cáncer con IDJRVSDUDLGHQWL¿FDUDXWRDQWLFXHUSRVDVRFLDGRVD mayor mortalidad en España por su tardía diagnosis. CCR. Se construyeron cuatro librerías de fagos que $FWXDOPHQWHODKHUUDPLHQWDGHFODVL¿FDFLyQGHO contenían cDNA de tejido de pacientes con CCR, &&5 FODVL¿FDFLyQGH'XNHV VHEDVDHQREVHUYD- que fueron cribadas con sueros de pacientes con ciones histopatológicas como pueden ser la invasión &&5SDUDLGHQWL¿FDUDTXHOORVSpSWLGRVGHVSOHJDGRV de la capa muscular intestinal, los nódulos linfáticos HQODVXSHU¿FLHGHORVIDJRVUHFRQRFLGRVSRUDXWRDQ- adyacentes o la progresión metastática. Aunque se WLFXHUSRVHVSHFt¿FRVGH&&56HLPSULPLHURQXQ han realizado diversos estudios genómicos usando total de 1536 fagos T7 en soportes de nitrocelulosa microarrays de DNA no se ha conseguido obtener y tras su cribado con 15 sueros normales y 15 tumo- XQDPHMRUFODVL¿FDFLyQ>@/DLGHQWL¿FDFLyQGH UDOHVVHLGHQWL¿FDURQIDJRVLQPXQRJpQLFRVTXH proteínas que puedan revelar diferencias en los es- diferenciaban entre pacientes con CCR e individuos tadios de diferenciación neoplásica sería muy im- sanos. El punto de corte del False Discovery Rate portante para el conocimiento de la enfermedad, un se ajustó a 0.22. De los fagos que mostraron mayor mejor diagnostico del CCR y para el descubrimiento reactividad en pacientes que en sueros control, úni- de nuevas dianas terapéuticas. Aunque se han iden- camente 55 fagos presentaron una secuencia única. WL¿FDGRPXFKDVSURWHtQDVFRPRGLIHUHQFLDOPHQWH expresadas en CCR utilizando diferentes técnicas /DLQPXQRUHDFWLYLGDGVHYHUL¿FyPHGLDQWH(/,- proteómicas [3] hasta ahora se han descrito muy SA utilizando 5 fagos elegidos por su homología con una proteína conocida. Dichos 5 Fagos con- SRFDVFRPRPDUFDGRUHVH¿FLHQWHVGH&&5 tenían secuencias homólogas a MST1, SLC33A1, Los autoanticuerpos presentes en el suero de SREBF2, SULF1 y GTF2i. MST1 se describió pacientes con cáncer son biomarcadores indicativos como una proteína reactiva a autoanticuerpos de GHODHQIHUPHGDGSRUTXHODVSURWHtQDVPRGL¿FDGDV pacientes con CCR en nuestro estudio previo rea- antes o durante la formación del tumor pueden in- lizado con microarrays de proteínas humanas [7]. ducir una respuesta inmune una vez liberadas [4-6]. Por otra parte, en un análisis de expresión diferen- Así, la caracterización de la respuesta inmune en cial de genes SULF1 se observó sobreexpresada en pacientes con cáncer constituye una nueva alterna- CCR [8]. Mediante ensayo de ELISA utilizando una WLYDSDUDODLGHQWL¿FDFLyQGHELRPDUFDGRUHVHVSHFt- colección de 96 sueros, 50 de pacientes con cáncer ¿FRVGH&&5~WLOHVSDUDVXGLDJQRVLVWHPSUDQD colorrectal y 46 de individuos sanos, se obtuvieron curvas de ROC (Receiver Operating Characteristic) En este estudio, hemos usado una estrategia pro- con áreas debajo de la curva entre 0.57 y 0.63. Sin teómica alternativa a los microarrays de proteinas embargo, su poder discriminatorio aumentó hasta recombinantes basada en el uso de microarrays de XQDHVSHFL¿FLGDG\VHQVLELOLGDGGH\ 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 47 respectivamente, con un área debajo de la curva Referencias de 0.81 tras realizar diferentes combinaciones de marcadores. Además, el uso de la proteína completa [1] Birkenkamp-Demtroder K, Christensen LL, Ole- sen SH, Frederiksen CM, Laiho P, Aaltonen LA, 067DXPHQWDEDODHVSHFL¿FLGDGKDVWDXQ Laurberg S, Sørensen FB, Hagemann R, ØRntoft (área debajo de la curva de 0.86). Un estudio de TF. Gene expression in colorectal cancer. Cancer competición entre MST1 y el fago correspondiente Res 2002; 62: 4352-63. preincubando el suero con la proteína recombinante redujo la unión de las IgG al fago MST1 hasta un [2] Zou TT, Selaru FM, Xu Y, Shustova V, Yin J, 40%, indicando que el péptido desplegado en la su- 0RUL<6KLEDWD'6DWR):DQJ62ODUX$ SHU¿FLHGHOIDJRHVXQHStWRSRLPPXQRGRPLQDQWHGH Deacu E, Liu TC, Abraham JM, Meltzer SJ. la proteína completa. Por otra parte, mediante wes- Application of cDNA microarrays to generate a tern blot se determinó que la presencia de autoanti- molecular taxonomy capable of distinguishing cuerpos correlacionaba con una mayor expresión de between colon cancer and normal colon. Onco- las proteínas en líneas celulares de cáncer de colon gene 2002; 21: 4855-62. y de muestras tumorales. [3] Barderas R, Babel I and Casal J.I Colorectal cancer proteomics, molecular characterization (QUHVXPHQHQHVWHWUDEDMRKHPRVYHUL¿FDGR and biomarker discovery. Proteomics Clin. App un panel de péptidos desplegados en fagos que res- 2009; 4: 1-20. ponden a autoanticuerpos de pacientes con CCR y que poseen capacidad diagnóstica de la enfermedad. [4] Anderson KS, LaBaer J. The sentinel within: exploiting the immune system for cancer bio- Finalmente, se han encontrado las mismas proteínas markers. J Proteome Res 2005; 4: 1123-33. reactivas a autoanticuerpos en diversas estrategias SURWHyPLFDVORTXHFRQ¿UPDODFRQYHQLHQFLDGHO [5] Chapman C, Murray A, Chakrabarti J, Thorpe despliegue de péptidos en Fagos T7 para la iden- $:RROVWRQ&6DKLQ8%DUQHV$5REHUWVRQ WL¿FDFLyQGHELRPDUFDGRUHV~WLOHVHQFOtQLFDSDUD J. Autoantibodies in breast cancer: their use as diagnosis y tratamiento de cáncer colorrectal. an aid to early diagnosis. Ann Oncol. 2007; 18: 868-73. [6] Soussi T p53 Antibodies in the sera of patients with various types of cancer: a review. Cancer Agradecimientos Res 2000; 60: 1777-88. Rodrigo Barderas, PhD, tiene un contrato post- [7] Babel I, Barderas R, Díaz-Uriarte R, Martínez- doctoral de perfeccionamiento del FIS. Este tra- Torrecuadrada JL, Sánchez-Carbayo M, Casal JI. bajo se ha realizado gracias al Programa de Bio- ,GHQWL¿FDWLRQRIWXPRUDVVRFLDWHGDXWRDQWLJHQV tecnología del Ministerio de Educación y Ciencia for the diagnosis of colorectal cancer in serum BIO2006-07689. using high density protein microarrays. Mol Cell Proteomics 2009; 8: 2382-95. [8] Madoz-Gúrpide J, López-Serra P, Martínez- Torrecuadrada JL, Sánchez L, Lombardía L, Casal JI Proteomics-based validation of genomic data: applications in colorectal cancer diagnosis. Mol Cell Proteomics 2006; 5: 1471-83. 48 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 2D Blue native SDS-PAGE analysis of multiprotein complexes of human erythrocyte membrane Irene Zubiri1, Gloria Álvarez-Llamas1, Fernando de la Cuesta1, María González-Barderas2, Fernando Vivanco1,3 1Department of Immunology, Fundación Jiménez Díaz,Madrid, Spain.2Department of Vascular Pathophysiology. Hospital Nacional de Paraplejicos, Toledo, Spain.3 Department of Biochemistry and Molecular Biology, Universidad Complutense Madrid Introduction Results Patients with chronic kidney disease in haemo- Membrane proteins complexes solubilization dialysis present low quality erythrocytes, showing was carried out by testing two different detergents KLJKHU ULJLGLW\:H K\SRWKHVL]H WKDW PHPEUDQH (digitonin and Triton X-100) at various concentra- VWUXFWXUHPD\SOD\DUROHLQWKHÀH[LELOLW\RIHU\WUR- tions (0.1-10% and 0.5-2 %, respectively). Solubi- cytes. Blue Native Polyacrylamide Gel Electropho- lization was always performed for 1 h. 4% Digitonin resis (BN-PAGE) is an electrophoretic technique UHVXOWHGWREHWKHEHVWRSWLRQLQWHUPVRI¿UVWGLPHQ- for high resolution separation of membrane protein sion resolution, as it was the lowest detergent con- complexes in the mass range of 10KDa to 10MDa. centration at which the highest number of distinct Here we describe a methodology to perform BN- bands can be observed without disturbance from the PAGE of erythrocyte membrane complexes fo- detergent in excess. Prior to the second dimension, llowed by a second dimension of tricine-SDS page protein complexes disruption into individual pro- for isolating and identifying individual proteins teins was optimized by treating the strips with SDS/ forming these complexes. ҟPHUFDSWRHWKDQROVROXWLRQWHVWHGDWYDULRXVFRP- SRVLWLRQV 6'6 ҟPHUFDSWRHWKDQRO 12% SDS treatment for 1h prior to load the strip on Methods the second dimension provided a higher number of Erythrocytes were isolated from plasma after protein spots detected; however, further increase maturation, washed in 5mM Na HPO pH 8, 1mM of SDS amount negatively affected resolution. 1% 2 4 ȕPHUFDSWRHWKDQROZDVXVHGDVLWVYDULDWLRQGLG EDTA and 0.9% NaCl and lysed in 5mM Na2HPO4 pH 8, 1mM EDTA and 1mM PMSF. Membrane pe- QRWVKRZDQ\FKDQJHV,GHQWL¿FDWLRQRIHU\WKURF\WH llets were frozen at -80º C in 50 mM imidazole / HCl membrane protein complexes isolated and analy- and 10% glycerol (pH 7) or immediately analyzed. zed by 2D-BN-PAGE is being carried out by mass For BN-PAGE, samples were centrifuged and pe- spectrometry. llets were solubilized in 50 mM sodium chloride, 50 mM imidazole, 2 mM 6- aminohexanoic acid, 1mM References EDTA (pH 7) and the appropriate detergent. After centrifugation, 5 µl of 5% glycerol and Coomassie >@ :LWWLJ,%UDXQ+3 6FKDXPOJJHU+%OXHQD- G-250 in a detergent/dye ratio of 8:1 were added to tive PAGE. Nature protocols 2006; 1:418–428. the supernatant. Membrane complexes were run in [2] Hermann Schägger. Tricine- SDS-PAGE. Nature 4-13% acrylamide gradient gels. The second dimen- protocols 2006; 1:16-22. sion was run in 10% tricine-SDS/PAGE and a silver VWDLQLQJSURWRFROZLWKPRGL¿FDWLRQVZDVXVHGIRU tricine gels [1, 2]. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 49 5HJXODWLRQRIHSLWKHOLDOPHVHQFK\PDOWUDQVLWLRQLQFRORQFDQFHUE\Į GLK\GUR[\YLWDPLQ' DSURWHRPLFVDSSURDFK Iván Cristobo1, María Jesús Larriba2, Vivian De los Ríos3, Ingrid Babel1, Rodrigo Barderas1, Al- berto Muñoz2, José Ignacio Casal1 1 Functional Proteomics Laboratory, Centro de Investigaciones Biológicas, Consejo Superior de Investigacio- QHV&LHQWt¿FDV0DGULG2 Department of Cancer Biology, Instituto de Investigaciones Biomédicas “Alberto 6ROV´&RQVHMR6XSHULRUGH,QYHVWLJDFLRQHV&LHQWt¿FDV8QLYHUVLGDG$XWyQRPDGH0DGULG0DGULG3 Pro- teomics and Genomics Facility, Centro de Investigaciones Biológicas, Consejo Superior de Investigaciones &LHQWt¿FDV0DGULG Epithelial-mesenchymal transition (EMT) is a >Į 2+ '@DQGLWVDQDORJVDVSUHYHQWLYHDQG typical feature of cells undergoing proliferation and WKHUDSHXWLFDQWLFDQFHUDJHQWV>@Į 2+ ' it is a fundamental process in the early stages of car- GUDVWLFDOO\DOWHUVWKHJHQHH[SUHVVLRQSUR¿OHRIPDQ\ cinoma invasion and metastasis [1-3]. It is a process cell types, inhibiting the proliferation and promoting characterized by loss of cell adhesion, repression of the differentiation to a normal adhesive epithelial E-cadherin expression, and increased cell mobility phenotype of human colon cancer cells [6]. (Figure 1). In this study we have investigated the regula- WLRQDQGELRORJLFDODFWLYLW\RIĮ 2+ 'LQ (07RIFRORQFDQFHUFHOOV:HSUHVHQWHYLGHQFH of the direct regulation of a number of proteins by Į 2+ 'LQFRORQFDQFHUFHOOV 6:$'+FRORQFDQFHUFHOOVZHUHWUHDWHG ZLWKĮ 2+ 'IRUDQGKRXUV1XFOHDU extracts of treated and non-treated cells were used by triplicate for a proteomic analysis. Proteins were labeled with CyDye Fluor for their subsequent sepa- ration by 2D-DIGE. Comparative analysis of protein expression patterns was performed with Progenesis 6DPH6SRWVDQG/XGHVL5HG¿QVRIWZDUH'LIIHUHQWLD- OO\H[SUHVVHGSURWHLQVZHUHLGHQWL¿HGE\PDVVVSHF- trometry (MS) MALDI-TOF/TOF and subsequently validated by western-blotting. An average of 1600 spots was detected on 2D- DIGE gels. A total of 31 and 19 spots were found to be differentially expressed at 8 hours with Lu- desi and Progenesis software (p <0.05; fold-change >1.2), respectively; and a total of 84 and 71 spots at 48 hours (p <0.05; fold-change >1.3). A 36% Figure 1. Epithelial-mesenchymal transition. During EMT of overlapping in spot detection was found bet- epithelial cells lose polarity and cell-cell contacts, become ween the 2 software. By MS and MS/MS were migratory, and divide at a faster rate. The cells can intra- XQHTXLYRFDOO\LGHQWL¿HGDQGSURWHLQVIURP vasate into lymph or blood vessels, allowing their passive treatment at 8 and 48 hours, respectively. These transport to distant organs. proteins were mainly involved in DNA and RNA There is an increasing interest in the active vi- regulation, affecting cell morphology, cell assem- bly, cell organization as well as cellular repair. A WDPLQ ' PHWDEROLWH ĮGLK\GUR[\YLWDPLQ ' 50 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 number of these proteins were further validated by tofori G. A causal role for E-cadherin in the ZHVWHUQEORWWLQJFRQ¿UPLQJSUHYLRXVUHVXOWV transition from adenoma to carcinoma. Nature 1998; 392: 190-193. In summary, we have investigated the regulation DQGELRORJLFDODFWLYLW\RIĮ 2+ 'LQ(07RI >@ 9OHPLQFN[.9DNDHW/-U0DUHHO0)LHUV: colon cancer cells. Through the use of proteomics van Roy F. Genetic manipulation of E-cadherin expression by epithelial tumor cells reveals an in- WRROVZHKDYHLGHQWL¿HGQXPHURXVSURWHLQVZKRVH vasion suppressor role. Cell 1991; 66: 107-119. H[SUHVVLRQOHYHOVZHUHDOWHUHGZLWKĮ 2+ ' treatment, and some of them have been further va- [4] Deeb KK, Trump DL, Johnson CS. Vitamin lidated. Our results show evidence of the direct role D signalling pathways in cancer: potential for RIĮ 2+ 'WUHDWPHQWLQ(07LQFRORQFDQFHU anticancer therapeutics. Nat Rev Cancer 2007; through the transcriptional regulation of a number of 7: 684-700. genes mainly related to cell morphology, cell assem- [5] Lappe JM, Travers-Gustafson D, Davies KM, bly, cell organization as well as cellular repair. Recker RR, Heaney RP. Vitamin D and calcium supplementation reduces cancer risk: results of a randomized trial. Am J Clin Nutr 2007; 85: References 1586-1591. [1] Peinado H, Olmeda D, Cano A. Snail, Zeb and [6] Palmer HG, Gonzalez-Sancho JM, Espada J, bHLH factors in tumour progression: an alliance Berciano MT, Puig I, Baulida J, et al. Vitamin against the epithelial phenotype? Nat Rev Can- D(3) promotes the differentiation of colon car- cer 2007; 7: 415-428. cinoma cells by the induction of E-cadherin and the inhibition of beta-catenin signaling. J Cell >@ 3HUO$.:LOJHQEXV3'DKO86HPE+&KULV- Biol 2001; 154: 369-387. &RPSUHKHQVLYHSURWHRPLFDQDO\VLVRIKXPDQHQGRPHWULDOÀXLGDVSLUDWH Juan Casado-Vela1†, Eva Rodriguez-Suarez1†, Ibon Iloro1†, Amagoia Ametzazurra2, Nere Alkorta1, Juan Antonio García-Velasco3, Roberto Matorras 4,5, Begoña Prieto4,5, Sandra González5, Daniel Nagore2, Laureano Simón2, Felix Elortza1* 1Proteomics Unit, CIC bioGUNE, CIBERehd, ProteoRed, Technology Park of Bizkaia, Derio, Spain, 2Pro- teomika S.L.; Technology Park of Bizkaia. Derio, Spain. 3Instituto Valenciano de Infertilidad, Madrid, Spain. 4Hospital de Cruces, Barakaldo, Spain. 5Instituto Valenciano de Infertilidad, Bilbao, Spain Abstract trophoresis (SDS-PAGE) followed by HPLC-MS/ MS analysis. Finally, two dimensional polyacryla- 7KHHQGRPHWULDOÀXLGLVDQRQLQYDVLYHVDPSOH mide gel electrophoresis (2D-PAGE) followed by which contains numerous secreted proteins repre- MALDI-TOF/TOF analysis. The combination of the VHQWDWLYHRIHQGRPHWULDOIXQFWLRQ:HVKRZKHUH WKUHHVWUDWHJLHVOHGWRWKHVXFFHVVIXOLGHQWL¿FDWLRQ IRUWKH¿UVWWLPHDQLQGHSWKDQDO\VLVRIWKHSURWHLQ of 803 different proteins. An extensive description content of the EFA using proteomic techniques [1]. RIWKHHQGRPHWULDOÀXLGSURWHRPHZLOOKHOSSURYLGH To achieve this objective, three different but com- the basis for a better understanding of a number of plementary strategies were used. First, in solution diseases and processes, including endometriosis, digestion followed by reverse phase high-perfor- HQGRPHWULDOFDQFHUDQGHPEU\RLPSODQWDWLRQ:H mance liquid chromatography coupled to tandem believe that the thorough catalogue of proteins pre- mass spectrometry (HPLC-MS/MS); second, pro- sented here can serve as a valuable reference for the tein separation by denaturing one dimensional elec- study of embryo implantation and for future biomar- 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 51 Figure 1. 6FKHPDWLFYLHZRIWKHWKUHHVWUDWHJLHV $%DQG& IROORZHGIRUWKHDQDO\VLVRIHQGRPHWULDOÀXLGDVSLUDWH ker discovery involved in pathologic alterations of te we used three different methodological strategies endometrial function. (A, B and C) that combine chromatographic and gel separation methods, as depicted in Figure 1. The integrated proteomic approaches used here led, Communication IRUWKH¿UVWWLPHWRDWKRURXJKLGHQWL¿FDWLRQRIWKH catalogue of proteins present in EFA. 7KHHQGRPHWULDOÀXLGLVDFRPSOH[ELRORJLFDO ÀXLGZKLFKLVLQGLUHFWFRQWDFWZLWKWKHHQGRPH- trial cavity and contains a multitude of proteins and proteolytic enzymes secreted from the endome- trium. Currently the diagnosis of endometrial disea- ses such as endometriosis is achieved by invasive methods that often include laparoscopic surgery XQGHUJHQHUDODQDHVWKHVLD7KHHQGRPHWULDOÀXLG can be collected by aspiration in a painless manner using non-invasive methods. Interest in the protein content of endometrial secretions has gained much momentum in recent years and has been suggested to play a key role in the embryo implantation pro- cess. Therefore, differential proteomics of the en- GRPHWULDOÀXLGDVSLUDWHSURWHRPHFRXOGJLYHDQHZ insight to understand the mechanisms involved in the onset of endometrial pathologies and the process of embryo implantation [2]. Figure 2. Venn diagram comparing the number of proteins :LWKWKHDLPRIDFKLHYLQJDWKRURXJKGHVFULS- LGHQWL¿HGDIWHUWKHDQDO\VLVRIHQGRPHWULDOÀXLGDVSLUDWH WLRQRIWKHSURWHRPHRIWKHHQGRPHWULDOÀXLGDVSLUD- with the three different strategies (A, B and C). 52 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Table 1. 3URWHLQV LGHQWL¿HG LQ HQGRPHWULDO ÀXLG DVSLUDWH ()$ LQYROYHG LQ HQGRPHWULDO DOWHUDWLRQV RU LQ HPEU\R implantation. Protein description references vulvar cancer vulvar Endometriosis / e ctopic endometrium endometrial cancer / endometrial cancer embryo implantation Matrix metalloproteinase 9 X Kyama et al. Fertil. Steril. , 89, 301-310. Tissue inhibitor of matrix metal- X Kyama et al. Fertil. Steril. , 89, 301-310. loproteinase Chun-yan et al. Chin. Med. J. . 121, 927-931. Annexin A1 X Ametzazurra et al. Human Repr. 2009, 24, (4), 954-965 Lenhard et al. Clin. Chem. Lab. Med. 2009, 537-542. Mol et al. Fertil Steril. , 70, 101–1108 Mucin 16 / CA125 X X Moore et al. Ultrasound Obstet Gynecol. 2002, 20, 630-634. Gupta et al. 2006, 13, 126-134. Cyclophilin A/ peptidyl-prolyl cis- X Li et al. Mol. Cell. Proteomics. 7, 1810-1823. trans isomerase A ,QWHUOHXNLQ XXLuo et al. Reprod. Immunol. 2006, 72, 108-117. De Souza et al. Mol. Cell. Proteomics. 2007, 6, 1170-1182. 3\UXYDWHNLQDVH00 X De Souza et al. Proteomics. 2005, 5, 270-281. De Souza et al. J. Proteome Res. , 7, 3525-3534 Alpha 1-antitrypsin/ DeSouza et al. Mol. Cell. Proteomics. 2007, 6, 1170-1182. Alpha-1 protease inhibitor/ X DeSouza et al. Proteomics. 2005, 5, 270-281. Serpin 1 +HÀHUet al. Int. J. Cancer. 1999, 83, 167-170. Fatty acid-binding protein X Li et al. Int. J. Cancer. , 123, 2377-2383. Vimentin X ten Have et al. Proteomics Clin. Appl.. 2007, 1, 1243-1251. +HDWVKRFNSURWHLQ Vitamin D binding protein X Ferrero et al. J. Soc. Gynecol. Investig. 2005. 12, 272-277 Carbonic anhydrase 1 X Zhang et al. Fertil. Steril. 2006, 86, 274-282 +HDWVKRFNSURWHLQ Annexin A2 X Fowler et al. Proteomics. 2006, 7, 130-142. Peroxiredoxin 2 Apolipoprotein A1 Mucin 1 X Achache et al. Hum. Reprod. Update. 2006, 12, 731-746. 3URWHLQ6$ Apolipoprotein A-1 X Ferrero et al. JPR. 2007, 6, 3402-3411 Alpha 1-antitrypsin 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 53 Moesin Beta-actin Tubulin beta chain F-actin capping protein subunit beta WD repeat protein 1 +HDWVKRFNSURWHLQEHWD Rho GDP-dissociation inhibitor 1 and 2 VLJPDDQGJDPPD X Ametzazurra et al. Human Repr. 2009, 24, 4, 954-965 Glycodelin Beta-2-glycoprotein 1 Sialic acid synthase Alcohol dehydrogenase [NADP+] Glutathione transferase omega-1 5LERVHSKRVSKDWHS\URSKRVSKRNL- nase II 3RO\ U& ELQGLQJSURWHLQ Ferritin heavy chain The three different strategies followed for EFA Ametzazurra, A., Alkorta, N., Garcia-Velasco, J. DQDO\VLV $%DQG& OHGWRWKHLGHQWL¿FDWLRQRI A., Matorras, R., Prieto, B., Gonzalez, S., Nago- 391, 489 and 191 proteins, respectively (Figure 2). re, D., Simon, L., and Elortza, F. Comprehensive Combining the three strategies, we successfully SURWHRPLFDQDO\VLVRIKXPDQHQGRPHWULDOÀXLG LGHQWL¿HGSURWHLQV7RFRQFOXGHWKHPRVWUH- aspirate. J Proteome Res 2009; 8: 4622-32. OHYDQWSURWHLQVLGHQWL¿HGLQ()$DQGLQYROYHGLQ [2] Boomsma, C. M., Kavelaars, A., Eijkemans, M. endometrial alterations or in embryo implantation J., Amarouchi, K., Teklenburg, G., Gutknecht, according to the literature are shown in Table 1. D., Fauser, B. J., Heijnen, C. J., and Macklon, N. 6&\WRNLQHSUR¿OLQJLQHQGRPHWULDOVHFUHWLRQV a non-invasive window on endometrial recepti- References vity. Reprod.Biomed.Online. 2009; 18: 85-94. [1] Casado-Vela, J., Rodríguez-Suárez, E., Iloro, I., ,GHQWL¿FDWLRQRI%LRPDUNHUVLQ&RORUHFWDO&DQFHU SUH SRVWFKHPRWKHUDS\ E\1XFOHLF$FLGV3URJUDPPDEOH3URWHLQ0LFURDUUD\V 1$33$ L),6+DQG SNPs approaches María González1, Raquel Bartolomé1, Jose María Sayagues1, María González1, Ana Laura Moro1, Elena Andrada1, Sahar Sibani2, Josh LaBaer2, Jacinto García3, Alberto Orfao1, Manuel Fuentes1,2 1Centro de Investigación del Cáncer. Universidad de Salamanca-CSIC. Salamanca. Spain. 2Harvard Institute of Proteomics. Harvard Medical School. Boston. USA. 3Departamento Cirugía. Hospital Clínico Universitario. Salamanca. Spain Biomarkers, particularly those with strong po- markers is to exploit patients’ own immune sys- sitive and negative predictive value, have many po- tems, which produce humoral responses to cancer tential uses in the diagnosis and treatment of cancer, antigens released by their tumors due to alterations including monitoring treatment success, indicating in protein expression, mutation, degradation, or lo- disease progression and detecting early disease. calization. Antibodies to tumor antigens have been 2QHSRWHQWLDOO\SRZHUIXODSSURDFKWR¿QGLQJELR- detected as early as several years before the clinical 54 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 DSSHDUDQFHRIFDQFHU$OWKRXJKWKHVSHFL¿FLW\IRU transcribed and translated in situ as needed at the these responses is high, typically only 5-20% of pa- time of the assay. NAPPA has been used successfu- tients demonstrate a response to any given antigen, lly to map the pairwise protein interactions of the which has limited the usefulness of single antigen human DNA replication complex. Here, we propose responses as biomarkers. The recent development adapting the NAPPA protein microarray technology of protein microarrays may offer an ideal tool for IRUXVHLQWKHUDSLGDQGHI¿FLHQWVFUHHQLQJRIVHUD screening for immune response to tumor antigens. from cancer patients for antibodies to 1000 known These arrays offer the advantage that hundreds to and potential tumor antigens in a multiplex format thousands of different proteins can be printed and in order to better characterize the immune response screened simultaneously and only require a few to known tumor antigens, identify new informative microliters of serum per assay. tumor antigens and evaluate the value of using pat- terns of tumor antigen immune responses as biomar- Prof. LaBaer’s group (Harvard Institute of Pro- kers in Colorectal Cancer. For the validation of the teomics) has developed a novel method for produ- possible biomarkers found in 20 different patients cing protein microarrays called nucleic acid progra- SUH SRVWFKHPRWKHUDS\ FXUUHQWO\ZHDUHXVLQJ mmable protein arrays (NAPPA) that avoids the need iFISH and SNPs approaches with the main goal to to express and purify the proteins by substituting the correlate genomics and functional proteomics. printing of cDNAs on the arrays, which are then Detection of Prostate Cancer by Urine Proteomics Marina Rigau1, Núria Colome3, Juan Morote2, Mª Carme Mir2, Carlos Ballesteros2, Marta Garcia1, Miguel Abal1, Francesc Canals3, Jaume Reventós1, Andreas Doll1 1Unitat de Recerca Biomèdica, Institut de Recerca. 2Servei d’Urologia. 3Laboratori de Proteòmica, Institut de Recerca. Hospital Vall d’Hebron, Barcelona Introduction Objective 3URVWDWHVSHFL¿FDQWLJHQ 36$ VHUXPPHDVXUH- :HVRXJKWWRGHWHUPLQHDSURWHRPLFSUR¿OHLQ ment in combination with a digital rectal examinati- urine able to distinguish between the presence and on (DRE) and transrectal ultrasound-guided biopsy absence of PCa. (TURS) is currently the gold standard for prostate cancer (PCa) screening in Europe [1]. Nevertheless, 36$DQG'5(ODFNVLJQL¿FDQWVSHFL¿FLW\DQGELRSV\ 0DWHULDO 0HWKRGV lacks ideal sensitivity (12-30% false negatives) [2, :HXVHGDFRPELQDWLRQRISURWHRPLFWHFKQRO- 3]. Therefore additional biomarkers are needed to ogies in aged matched post-Digital Rectal Exam supplement or potentially replace the currently used (DRE) urine supernatants specimens to identify dif- diagnostic techniques. As the secreted products from ferentially expressed proteins in patients with PCa. both, normal prostate epithelial cells as well as PCa )LUVWO\ZHGHSOHWHG KLVWRORJLFDOFRQ¿UPHG3&D cells, can be detected in the urine of men, their use as urine samples and 9 control samples (age-matched DSUR[LPDOERG\ÀXLGWRGHWHFW3&DLVYHU\DWWUDFWLYH patients with the typical background of benign pros- since they could be the best compromise between WDWHKLSHUSODV\ %3+ DWURSK\DQGFKURQLFLQÀDP- a minimal invasive technique accepted by a wider mation) using ProteoMiner (BioRad), a novel deple- range of the male population and the possibility to tion technique that reduces the level of the most obtain enough cells for a correct diagnosis [4, 5]. abundant species, while strongly concentrating the more dilute and rare ones. Then, Two-dimensional 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 55 Figure 1. 3URWHLQLGHQWL¿FDWLRQE\SURWHRPLFFRPSDUDWLYHDQDO\VLV $ 3URWHR0LQHUGHSOHWLRQWHFKQLTXHRYHUYLHZ % 2D-DIGE experiment design, comparison of 9 urine PCa samples against 9 urine control samples. (C) Example of a representive gel of the DIGE experiment. (D) Example of up-expressed spot in PCa samples. (E) IPA network interaction RIRYHUH[SUHVVHGSURWHLQVSRWV UHG¿JXUHV DQGXQGHUH[SUHVVHGSURWHLQVSRWV JUHHQ¿JXUHV ) 050WUDQVLWLRQVRID WU\SWLFSHSWLGHGHULYHGIURPRQHRIWKHFDQGLGDWHELRPDUNHUSURWHLQV * 050EDVHGDEVROXWHTXDQWL¿FDWLRQRIDSHSWLGH abundance using a labeled synthetic peptide as internal standard. gel-based proteomic approach (2D-DIGE) coupled Conclusions with matrix assisted laser desorption/ionization ti- PHRIÀLJKWPDVVVSHFWURPHWU\ 0$/',72)06 These data demonstrate the ability of proteo- and database mining experiment were performed to mic analyses to reveal novel biomarkers for PCa identify novel biomarkers of PCa in urine. Finally, in urine, an important step forward in advancing we validated the candiadate biomarkers using Multi- accurate diagnosis which is currently the bottleneck ple Reaction Monitoring (MRM)-based assays, con- for the ability to cure patients from PCa. MRM is ducted by Liquid chromatography in conjunction emerging as a technology that ideally complements with triple quadrupole mass spectrometry (LC-MS/ the discovery capabilities of shotgun strategies by MS) in a bigger cohort of urine samples. LWVXQLTXHSRWHQWLDOIRUUHOLDEOHTXDQWL¿FDWLRQRI analytes of low abundance in complex mixtures, such urine samples[6]. These biomarkers could be Results used to develop a a simple diagnostic test (probably similar to the ELISA, either multiplex or strips, :HLGHQWL¿HGDSURWHRPLFSUR¿OHRISRWHQ- reactive to the 4-5 molecules most representative of tial biomarkers (16 down and 10 up-expressed) WKHGLIIHUHQWLDOSUR¿OH WREHXVHGLQWKHKRVSLWDODQG for the detection of PCa in urine. Ingenuity pat- outpatient routines. hways analysis (IPA) showed that the majority of these proteins are secreted components of several ZHOONQRZQIXQFWLRQDORIFDQFHUDQGLQÀDPPDWL- References RQQHWZRUNVOLNH1)Ʉ%3'*)%ȕDQG36$:H performed MRM-based assays for 15 candidate >@ &DWDORQD:-6PLWK'65DWOLII7/'RGGV biomarkers to quantify these in a sample set of 50 .0HWDO0HDVXUHPHQWRISURVWDWHVSHFL¿F antigen in serum as a screening test for prostate urine supernatants (Figure 1). cancer. N Engl J Med 1991; 324: 1156-1161. 56 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 [2] Cervera Deval, J., Morales Olaya, F. J., Jornet WLPHRIÀLJKWPDVVVSHFWURPHWU\WRGLVFULPLQD- Fayos, J., Gonzalez Anon, M., [Diagnostic value te between prostate cancer and benign lesions. of the second prostate biopsies in males of risk. Oncol Rep 2009; 21: 73-79. 6WXG\VWUDWL¿HGE\YDOXHRI36$@$FWDV8URO [5] M’Koma, A. E., Blum, D. L., Norris, J. L., Ko- Esp 2004; 28: 666-671. yama, T., et al., Detection of pre-neoplastic and [3] Raber, M., Scattoni, V., Salonia, A., Consonni, QHRSODVWLFSURVWDWHGLVHDVHE\0$/',SUR¿OLQJ P., Rigatti, P., [Repeated ultrasound-guided of urine. Biochem Biophys Res Commun 2007; transrectal prostate biopsy in patients with 353: 829-834. negative histologic test]. Arch Ital Urol Androl [6] Lange, V., Picotti, P., Domon, B., Aebersold, 2000; 72: 197-199. R., Selected reaction monitoring for quanti- [4] Okamoto, A., Yamamoto, H., Imai, A., Ha- tative proteomics: a tutorial. Mol Syst Biol takeyama, S., et al., Protein profiling of 2008; 4: 222. post-prostatic massage urine specimens by surface-enhanced laser desorption/ionization NanoLC/mass spectrometry-based proteomic analysis of serum and synovial ÀXLGVDPSOHVIURPRVWHRDUWKULWLVSDWLHQWV Patricia Fernández-Puente, Jesús Mateos, Carolina Fernández-Costa, Cristina Ruiz-Romero, Francisco J Blanco Osteoarticular and Aging Research Lab, Nodo Asociado de Proteo-Red. INIBIC-Hospitalario Universitario A Coruña, Xubias 84, 15006 - A Coruña, SPAIN Introduction dant proteins were removed from crude serum and SF using the Immunodepletion column ProteoPrep® 20 Osteoarthritis (OA) is the most common rheu- (Figure 1), according to manufacturer’s instructions matic pathology, characterized mainly by cartilage (Sigma Aldrich). Depletion of abundant proteins was degradation [1]. Despite its high prevalence, the checked by SDS-PAGE separation of the proteins and diagnosis methods currently available are limited LGHQWL¿FDWLRQLQD0$/',72)72)V\VWHP and lacked of sensitivity. Therefore, there is a con- (ABI). For both serum and SF depleted samples, pro- siderable interest pointed in the characterization of tein concentration was determined using a nanoDrop QHZVSHFL¿F2$ELRPDUNHUVLQELRORJLFDOÀXLGV,Q LQVWUXPHQW )LVKHU7KHUPR6FLHQWL¿F86$ this work we set up a nLC-MALDI-MS method for OA biomarker search in complex mixtures, with the b) Pre-fractioning of the samples: For serum sam- aim of obtaining a standardized protocol for serum ples, digestion of the depleted fractions was done DQGV\QRYLDOÀXLG 6) SURWHLQSUR¿OLQJ with trypsin, and the peptides obtained were frac- tionated by strong cation exchange (SCX) liquid chromatography in a HP 1200 system (Agilent), Methods using a PolySulfoethyl column (PolyLC). SF pro- a) Sample preparation and immunodepletion: teins were separated by SDS-PAGE, using 10% Serum and SF samples were obtained from OA pa- acrylamide gels. The gel lanes were divided into 12 tients and control donors. Prior to protein depletion, sections, excised and proteins were in-gel digested SF was treated with hyaluronidase. The 20 most abun- with trypsin following standard procedures. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 57 WUDQVSRUW SURFHVVHV )LJXUH $QHI¿FLHQW depletion of the 20 most abundant proteins was ve- UL¿HGDVRQO\RIWKHVHSURWHLQVFRXOGEHLGHQWL¿HG in the samples. Nevertheless, still a number of other typically abundant serum proteins such as comple- ment proteins and apolipoproteins were found. Figure 1. &KURPDWRJUDPRIWKHDI¿QLW\GHSOHWLRQRIWKH Figure 2. )XQFWLRQDOFODVVL¿FDWLRQRISURWHLQVLGHQWL¿HGLQ most abundant proteins from human plasma. Inset shows a (A) serum and (B) SF from OA patients. 6'63$*(RIWKHGLIIHUHQWIUDFWLRQV6HUXPÀRZWKURXJK fraction (low abundant proteins); 2. Serum bound fraction %\WKHVHFRQGDSSURDFKZHLGHQWL¿HGGL- (high-abundant proteins); 3. Untreated serum. fferent proteins in SF samples from OA donors. As c) NanoLC-MS/MS analysis: The serum and expected, many of these (76%) were also found in SF peptide fractions were desalted using PorosR2 serum. Some of those had been previously sugges- home-made columns (ABI). Each dried fraction ted as putative OA biomarkers, such as Gelsolin, Fi- was re-dissolved and injected on a precolumn (Pep- bronectin, Clusterin or Serum Amyloid P protein. As Map100), and peptides were desalted and loaded to happened with serum, the most abundant functional D&FROXPQ ,QWHJUD¿W&3URWHRSHS,,1HZ JURXSRISURWHLQVLGHQWL¿HGLQ6)ZDVLQYROYHGLQ Objetive, USA) to perform the separation. Fractions the immune response (Figure 2), but we also found were collected from the NanoLC, mixed with matrix in this case many proteins related with metabolism, and spotted onto a MALDI plate using a MALDI transport, cellular proliferation and signalling. In- Spotter/Micro-Fraction Collector (SunChrom). MS terestingly, we found in the group of 21 proteins spectra were acquired for each fraction in a 4800 VSHFL¿FDOO\LGHQWL¿HGLQ6)DQXPEHURISURWHLQV MALDI-TOF/TOF instrument (ABI). that are directly involved in cartilage extracellular matrix (ECM) synthesis, that are listed in Table 1. d) 3URWHLQ,GHQWL¿FDWLRQDQG'DWDEDVH6HDUFK: 3URWHLQLGHQWL¿FDWLRQZDVFDUULHGRXWXVLQJWKH3UR- WHLQ3LORWVRIWZDUHY $%, 2QO\SURWHLQVLGHQWL¿HG Conclusions ZLWKDWOHDVW FRQ¿GHQFHRUD3URW6FRUHRI :HKDYHVWDQGDUGL]HGWZRDSSURDFKHVIRUWKH were reported. A Global False discovery Rate (FDR) LGHQWL¿FDWLRQRISURWHLQVLQKXPDQELRORJLFDOÀXLGV of 1% was calculated independently with PSPEP sot- after depletion of the 20 most abundant proteins of ware. SwissProt database was used to determine the plasma. These procedures have allowed us to des- SXWDWLYHFHOOXODUIXQFWLRQRIWKHLGHQWL¿HGSURWHLQV FULEHWKHSURWHLQSUR¿OHVRIVHUXPDQG6)IURP2$ SDWLHQWV'HVSLWHWKHKLJKVLPLODULWLHVRIERWKSUR¿- Results OHVZHIRXQGPRUHMRLQWVSHFL¿FSURWHLQVLQ6)2XU data point out the usefulness of these approaches for :HKDYHVWDQGDUGL]HGWZRDOWHUQDWLYHSURWR- OA biomarker discovery, although further studies cols for the proteomic analysis of human biological HPSOR\LQJVWDEOHLVRWRSHODEHOOLQJZLOOSUR¿WIURP ÀXLGVRQHHPSOR\LQJOLTXLGFKURPDWRJUDSK\DQG TXDQWL¿FDWLRQRIWKHSRWHQWLDOPDUNHUVWKDWKDYH the other SDS-PAGE as pre-fractionation method. EHHQLGHQWL¿HGLQWKLVZRUN 8VLQJWKH¿UVWDSSURDFKZHZHUHDEOHWRLGHQ- tify 105 different proteins in human serum from References OA patients. These proteins are involved mainly in the immune response (33%), proteolysis (22%) and [1] Blanco FJ. Catabolic events in osteoarthritic carti- lage. Osteoarthritis and Cartilage 1999; 7:308-9. 58 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Table 1. 3URWHLQVLGHQWL¿HGVSHFL¿FDOO\LQ6)IURP2$SDWLHQWVWKDWDUHGLUHFWO\LQYROYHGLQFDUWLODJH(&0V\QWKHVLV Acc. No.|Abbr. Name Cellular role P01033|TIMP1 Metalloproteinase inhibitor 1 Prevents ECM degradation P16112|PGCA Aggrecan core protein ECM component P49747|COMP Cartilage oligomeric matrix protein ECM component Q15113|PCOC1 Procollagen C-endopeptidase enhancer 1 Collagen synthesis Q92954|PRG4 Proteoglycan-4 ECM component Q9H9S5|FKRP Fukutin-related protein Glycoprotein synthesis Q9NQ79|CRAC1 Cartilage acidic protein 1 Cartilage component )XQFWLRQDO3URWHRPLFV %HDGV±EDVHGDUUD\V\VWHPIRU%LRPDUNHU'LVFRYHU\ Raquel Bartolomé1, María González-González1, Jose M. Sayagües1, Fridtjof Lund-Johansen2, Alberto Orfao1, Manuel Fuentes1 1Centro de Investigación del Cáncer. Universidad de Salamanca-CSIC. Spain. 2Immunology Institute. University of Oslo. Norway. Despite the immense progress in Molecular Bio- with different antibodies against target proteins. A logy and Genetics, only a small fraction of the pro- wide range of available dyes could potentially be teome is understood at biochemical level. Currently, used to generate complex color codes that are analy- a development of new methodological strategies in ]HGE\VWDQGDUGÀRZF\WRPHWUHV high-throughput format is needed for applications in Proteomics, such as Biomarker and Drug Discovery In the experimental process a lysate of B cells studies. These new methodologies must be able to is fractioned by size exclusion chromatography analyze simultaneously hundreds or thousands of (FPLC) and incubated with a 1300 populations proteins in order to evaluate functionality, stability, array. Each population has a code of dyes and is interactions, relative abundance, post-transduction VSHFL¿FIRUDSDUWLFXODUWDUJHWSURWHLQ7KHODEHOLQJ PRGL¿FDWLRQVHWF of these target proteins with phycoerythrin (PE) DOORZVWKHGHWHFWLRQE\ÀRZF\WRPHWU\ Our group has developed a microspheres array (Bead-based Array System, BBAS) that allow the This methodology is capable of giving infor- simultaneous analysis of numerous sera and intrace- mation about the amount of protein present in each llular proteins. The method consist of having diffe- fraction, in addition to protein state (soluble, mem- rent populations of spheres, colored by surface- la- brane protein, monomeric vs multimeric, phos- EHOLQJZLWKGLIIHUHQWÀXRUHVFHQFHG\HVDQGFRXSOHG phorylated, coupled with other proteins in functio- nal complexes …). 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 59 Anticuerpos a la carta combinando expresión in vitro de proteínas, tecnología de despliegue en fagos y arrays de anticuerpos Rodrigo Barderas, Ingrid Babel, Iván Cristobo, José Ignacio Casal Laboratorio de Proteómica Funcional. Centro de Investigaciones Biológicas, c/ Ramiro de Maeztu, 9 28040 Madrid Los anticuerpos constituyen una importante he- (Herceptin) en cáncer de mama. De hecho, los anti- rramienta para determinar la compartimentalización cuerpos constituyen aproximadamente el 50% de los celular y la función de sus proteínas diana y para el medicamentos aprobados por la FDA y la EMEA. análisis de interacciones proteína-proteína. Actual- mente, los anticuerpos se utilizan para el diagnósti- El objetivo de este trabajo consistió en el de- co de enfermedades mediante inmunoensayos como sarrollo de un nuevo método de obtención de an- ELISA, arrays de anticuerpos,… y, para el tratamien- ticuerpos in vitro utilizando solo 5 µg de proteína to de enfermedades, como por ejemplo el anti-HER2 mediante la combinación de diferentes técnicas pro- Figura 1. (VTXHPDGHH[SUHVLyQSXUL¿FDFLyQ\VHOHFFLyQGHDQWLFXHUSRVDODFDUWD/DVSURWHtQDVVHH[SUHVDURQLQYLWUR \SXUL¿FDURQXVDQGREROLWDVPDJQpWLFDV'\QDEHDGV7$/21$OWHUQDWLYDPHQWHODVSURWHtQDVVHHOX\HURQ\GLDOL]DURQ frente a PBS para su marcaje con AlexaFluor 647 o, se utilizaron para la selección de anticuerpos recombinantes usando las librerías de scFvs humanas Mehta I y II. 60 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 WHyPLFDV H[SUHVLyQ\SXUL¿FDFLyQGHSURWHtQDVLQ scFvs podría convertirse fácilmente en un sistema vitro, selección utilizando Despliegue en Fagos y, de alto rendimiento para obtener anticuerpos mo- ¿QDOPHQWHLGHQWL¿FDFLyQGHDQWLFXHUSRVUHFRPEL- noclonales frente a cualquier antígeno. El proceso nantes mediante el cribaje de array de anticuerpos completo requiere solo 5µg de proteínas, solucio- con la proteína marcada con AlexaFluor 647. nando el cuello de botella habitual para la obtención de anticuerpos, dado que se necesitan grandes canti- La aplicación de esta metodología nos ha per- dades de proteína para la inmunización de animales mitido obtener anticuerpos monoclonales huma- \SDUDHOFULEDMHHLGHQWL¿FDFLyQGHORVDQWLFXHUSRV nos recombinantes (scFvs) frente a cuatro proteínas HVSHFt¿FRVGHFDGDSURWHtQD(OQXHYRSURFHGLPLHQ- -tiorredoxina, GFP, p53 y STK4- de diferente masa to descrito nos permitió obtener anticuerpos frente molecular (10-70 kDa), siendo p53 y STK4 proteí- a las cuatro proteínas utilizadas en el estudio STK4, nas difíciles de expresar. El proceso de expresión, p53, GFP y tiorredoxina que presentaban funciona- SXUL¿FDFLyQ\VHOHFFLyQGHORVDQWLFXHUSRVDSDUHFH lidad tras su impresión en arrays de nitrocelulosa resumido en la Figura 1. El procedimiento completo DUUD\VGHDQWLFXHUSRV \HQ(/,6$LQPXQRÀXRUHV- incluye diferentes pasos. El primer paso consiste cencia e inmunodetección en membrana. en la expresión de las proteínas in vitro utilizando YHFWRUHVFRGL¿FDQWHVSDUDODVSURWHtQDVFRPRIXHQWH En resumen, esta nueva aproximación podría ser de DNA y un sistema de expresión in vitro (Roche) usada para la obtención de anticuerpos humanos de que permite realizar la transcripción y la traducción DOWDD¿QLGDG~WLOHVHQGLDJQRVLVGHSDWRORJtDV±GDGD HQXQVRORSDVR/DSXUL¿FDFLyQDKRPRJHQHLGDGGH su funcionalidad en arrays de anticuerpos– e incluso las proteínas se realizó utilizando bolitas magnéticas FRQ¿QHVWHUDSpXWLFRVVLHODQWtJHQRXVDGRHQODVHOHF- Talon, mediante el Tag de Histidinas que incorporan ción de los anticuerpos fuese una diana terapéutica. las proteínas en su extremo C-terminal. El segundo paso consistió en la selección de los anticuerpos mo- noclonales recombinantes, que se realiza en solución Agradecimientos utilizando las proteínas unidas a las bolitas magnéti- Rodrigo Barderas, PhD, tiene un Contrato Post- cas y la librería de anticuerpos humanos Mehta I y doctoral de Perfeccionamiento del FIS. Este tra- II [1-3]. En total, se realizaron 4 rondas de selección bajo se ha realizado gracias al Programa de Bio- y se picaron 200 colonias individuales procedentes tecnología del Ministerio de Educación y Ciencia de la 3ª y 4ª ronda de selección de anticuerpos frente BIO2006-07689. a cada proteína. Así, se testaron 400 clones indivi- GXDOHV\FORQHVHQWRWDOSDUDLGHQWL¿FDUVF)YV frente a cada proteína. Finalmente, el tercer paso Referencias FRQVLVWLyHQODLGHQWL¿FDFLyQGHODVVF)YVHVSHFt- ¿FDVGHFDGDSURWHtQDTXHVHUHDOL]yLPSULPLHQGR >@ 6XL-/L:0XUDNDPL$7DPLQ$:RQJ6. arrays de nitrocelulosa con los 1600 clones dife- Moore MJ, et al., Potent neutralization of severe rentes usando un robot de impresión Omnigrid. La acute respiratory syndrome (SARS) coronavi- selección de los clones positivos se realizó cribando rus by a human Mab to S1 protein that blocks los arrays de anticuerpos impresos en nitrocelulosa receptor association. Proc Natl Acad Sci USA. 2004;101:2536-2541. con las proteínas expresadas in vitro marcadas con HOÀXRUyIRUR$OH[D)OXRU)LQDOPHQWHODVVF)YV [2] Barderas R, Desmet J, Timmerman P, Meloen LGHQWL¿FDGDVVHWHVWDURQSRU(/,6$LQPXQRGHWHF- 5&DVDO-,$I¿QLW\PDWXUDWLRQRIDQWLERGLHV FLyQHQPHPEUDQDHLQPXQRÀXRUHVFHQFLD assisted by in silico modeling. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008;105:9029-9034. Creemos que esta nueva metodología para ob- [3] Barderas R, Shochat S, Timmerman P, Holles- tener anticuerpos monoclonales humanos recombi- telle MJ, Martínez-Torrecuadrada JL, Höppener nantes por combinación de la expresión in vitro de -:HWDO'HVLJQLQJDQWLERGLHVIRUWKHLQKLELWLRQ proteínas, el uso de librerías de anticuerpos humanos of gastrin activity in tumoral cell lines. Int J desplegados en fagos y microarrays de anticuerpos Cancer 2008;122:2351-2359. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 61 9DOLGDWLRQRI3(')DVDSRWHQWLDOELRPDUNHUIRU16&/& Sonia Blanco-Prieto1, Nuria Sánchez-Otero1, Ana M. Rodríguez-Piñeiro1, M. Isabel Botana-Rial2, Francisco J. Rodríguez-Berrocal1, María Páez de la Cadena1* 1 Dpto. Bioquímica, Universidad de Vigo, As Lagoas Marcosende s/n 36310 Vigo (Spain). 2 Servicio de Neumología, CHUVI, Vigo (Spain) ,QWKHVHDUFKIRUPRUHHI¿FLHQWELRPDUNHUVIRU whereas in pleural effusion (Figure 2) the pattern non-small cell lung cancer (NSCLC) we combined was opposed as the manifested by DIGE analysis. prefractionation techniques and protein separation This discrepancy could be explained considering by differential in-gel electrophoresis (2D-DIGE), to the superior sensitivity of antibody reactions and the TXDQWLI\SURWHLQFKDQJHVEHWZHHQELRORJLFDOÀXLGV great enrichment in PEDF levels achieved after pre- (serum and pleural effusion) from NSCLC subjects IUDFWLRQDWLRQWKDWZRXOGPDVNWKHVLJQL¿FDQWGLIIH- and benign controls (pneumonia and tuberculosis rences found by DIGE methodology. Another reason individuals, respectively). might be the existence of more PEDF isoforms not distinguishable by 1D separation. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) was WKHVROHSURWHLQLGHQWL¿HGLQERWKÀXLGVDVGLIIHUHQ- tially expressed in NSCLC patients. PEDF is a 50 kDa secreted glycoprotein that exhibits a duality with regards to apoptosis and survival [1]. PEDF has been reported to be present in serum at a con- centration of 5 µg/mL [2], corroborating a relative success in mining down the proteome. It could be concluded that although immnunodepletion of KLJKDEXQGDQFHVSHFLHVLPSURYHVSURWHLQSUR¿OLQJ and several relevant proteins were revealed, most RIWKHSURWHLQVLGHQWL¿HGVWLOOFRUUHVSRQGWRPR- derate and highly abundant ones. Two arguments PD\EHH[SRVHG ¿UVWWKHLPSRVVLELOLW\RIFRYHULQJ the dynamic range of plasma and plasma-derived Figure 1. 1D immunodetection of PEDF on serum depleted samples.,PPXQRTXDQWL¿FDWLRQRI3(')LQJHOVUHVROYLQJ ÀXLGVDQGVHFRQGWKHJDSEHWZHHQWKHEURDGHU 10 µg of protein (B) was not consistent between cancer and linearity of DIGE in comparison with the reached control subjects, when dilution of the samples was perfor- LQ06LGHQWL¿FDWLRQDVPDQ\RIWKHXQLGHQWL¿HG PHG $ 3(')OHYHOVSURYHGWREHVLJQL¿FDQWO\LQFUHDVHGLQ spots corresponded to the less intense. Our study NSCLC. Lanes 1, 3, 5, 7: NSCLC samples, lanes 2, 4 ,6, 8: revealed one PEDF spot altered in serum with an pneumonia samples. LC: lung cancer; B: benign. average fold increase of 1.4 in NSCLC samples, These two hypothesis were tested. First, 1D- while in the case of pleural effusion there were two EORWVZHUHUHSHDWHGGLOXWLQJWKHVDPSOHV¿Q- altered forms showing changes of 1.5 and 2 fold ding in serum the same pattern initially obtained in increase in lung cancer patients. 2D gels: a 1.5 fold increase in PEDF expression in The next step after discovering a potential bio- cancer patients (p = 0.043) (Figure 1). For pleural PDUNHULVWKHFRQ¿UPDWLRQRIWKHYDULDWLRQREVHUYHG effusion (Figure 2), although a slight overall increase on 2D gels; thus, immunodetection of PEDF was was seen in NSCLC, the pattern was not repetitive. FDUULHGRXWLQ'EORWV:KHQJRIGHSOHWHGSUR- To assess if there were variations in other PEDF tein were resolved results were contradictory: in the isoforms not visualized on DIGE gels the molecule case of serum (Figure 1) the tendency was an eleva- ZDVVSHFL¿FDOO\LPPXQRGHWHFWHGLQ'EORWV)RU ted expression in NSCLC though levels were over- ERWKÀXLGVDZLGHSOHWKRUDRILVRIRUPVZDVPDQL- lapped between cancer and benign control samples, fested with more than 12 spots detected (Figure 3), 62 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 which expanded about 1 pH unit. This variability Literature concerning PEDF expression on lung DJUHHVZLWKWKHREVHUYHGE\>@IRUSXUL¿HGKXPDQ cancer is not conclusive, with a described reduc- 3(')DQGLVFDXVHGE\SRVWWUDQVODWLRQDOPRGL¿FD- tion at the transcript level in lung tissues compared tions. In serum all the isoforms observed displayed to normal specimens [3]. However, when protein a higher intensity in NSCLC, while for pleural effu- OHYHOZDVH[DPLQDWHGWKHSUR¿OHZDVUHYHUVHGIRU sion a mixed pattern was generated with an average adenocarcinoma type, the one we analised, with 1.3 fold increase in NSCLC. 18/33 specimens overexpressing PEDF. The overall increase showed by our work could be a response of PEDF anti-angiogenic capability to counteract VEGF induced vasopermeability. $¿QDOVWHSLQWKHSDWKZD\RIGLVFRYHULQJELR- markers is to corroborate this discrimination by feasible and highly sensitive methods (commonly ELISAs) that could be implemented in the clinical setting. This requires that the differential expression observed in fractionated proteomes should hold a parallel comparison on crude samples, regarding different histological types. Figure 2. 1D immunodetection of PEDF on depleted pleural References effusions. Blotting of 10 µg of protein (B) displayed a ten- [1] Fernandez-Garcia NI, Volpert OV, Jimenez dency to increased PEDF levels on benign samples, while B. Pigment epithelium-derived factor as a repetition on diluted fractions partially reverse this pattern, although no statistically differences were achieved. Lanes multifunctional antitumor factor. J Mol Med 1, 3, 5, 7: NSCLC samples, lanes 2, 4 ,6, 8: tuberculosis 2007;85:15-22. samples. MPE: malignant pleural effusion; BPE: benign [2] Petersen SV, Valnickova Z, Enghild JJ. Pigment- pleural effusion. epithelium-derived factor (PEDF) occurs at a physiologically relevant concentration in human EORRG SXUL¿FDWLRQDQGFKDUDFWHUL]DWLRQ%LR- chem J 2003;374:199-206. >@ =KDQJ/&KHQ-.H<0DQVHO5(-LDQJ:* Expression of pigment epithelial derived factor is reduced in non-small cell lung cancer and is linked to clinical outcome. Int J Mol Med 2006;17:937-44. )LJXUH2D immunodetection of PEDF. Both in depleted serum (left) and pleural effusion (right) several PEDF iso- IRUPVFRXOGEHGHWHFWHG,PPXQRTXDQWL¿FDWLRQUHYHDOHGGLIIH- rent variations between benign- and malignant-origin samples, though most of the spots showed increased values in tumor- GHULYHGÀXLGV/& OXQJFDQFHU % EHQLJQ 03( PDOLJQDQW pleural effusion; BPE: benign pleural effusion; Normal Qty: normalized quantity (by total density in each blot). 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 63 Utilización de ProteoMiner para el análisis proteómico de muestras de líquido VLQRYLDO /6 GHSDFLHQWHVFRQRVWHRDUWULWLV Sonia García-Rodriguez1, María Dulce Pérez-Mezcua1, Antonio Rosal-Vela1, Victoria Longobardo2, Antonio Larios2, Pilar Navarro1, Raquel Largo3, Gabriel Herrero-Beaumont3, Jaime Sancho1, Mercedes Zubiaur1 1Departamento de Biología Celular e Inmunología, Instituto de Parasitología y Biomedicina López-Neyra (IPBL-N), CSIC, Granada. 2Servicio de Proteómica, IPBL-N, CSIC, Granada. 3Servicio de Reumatología, Fundación Jiménez-Díaz, Madrid Introducción raron en un mismo gel 1-D, NOVEX (Invitrogen), 4-12%, 10 pocillos, buffer MES. Los geles se tiñe- ProteoMiner o Combinatorial Peptide Ligand URQFRQ6<3525XE\aKUV7$VH¿MDURQHQ Libraries (CPLL) [1] actualmente están compuestas 10% de metanol/7% de ácido acético, 60 min. TªA de una gran variedad de hexapéptidos sintetizados, y se lavaron con agua bidestilada y se escanearon que actúan de ligandos para las proteínas de las en un Typhoon. muestras. Y están siendo actualizadas como herra- mientas de gran utilidad para el mapeo de proteomas de distintos organismos. Esta herramienta permite Resultados el objetivo de reducir del rango dinámico de con- centraciones en diversos tipos de muestras, como El análisis de imagen de los geles en el Typhoon plasma y suero, disminuyendo la concentración de indicó que a igual concentración de proteínas, las las proteínas más abundantes y el enriquecimien- muestras eluidas después del ProteoMiner presen- to en proteínas menos abundantes, de cara a una taron una disminución de proteínas más abundantes LGHQWL¿FDFLyQGHHVWDV~OWLPDVFRPRSDVRSUHYLRD cómo albúmina e inmunoglobulinas y se observa un posterior análisis proteómico [2]. Proteínas me- también una mejor distribución de proteínas, prin- nos abundantes en las muestras biológicas son pote cipalmente de masa molecular <50 kDa bien sepa- cialmente de gran interés para el estudio de nuevo radas que no se observaban en las muestras no tra- biomarcadores de enfermedad. El ProteoMiner que tadas. Como primera aproximación se ha realizado se ha utilizado en este trabajo es el distribuido por ODLGHQWL¿FDFLyQGHGLVWLQWDVSURWHtQDVSRUKXHOOD BioRad y se basa en una librería de hexapéptidos in- peptídica, mediante MALDI-TOF. Las bandas de los movilizados en una matriz en forma de bolitas y en geles se picaron mediante un picador automático (3 XQVRSRWHFURPDWRJUi¿FR/DOLEUHUtDFRQWLHQHJUDQ - 4 spots/banda/pocillo). Las proteínas se reducen, variedad de hexapéptidos sintetizados, que actúan alcalinizan, se pasan a una placa de 96 pocillos y se de ligandos para las proteínas de las muestras. procede a la digestión con tripsina. Los péptidos se eluyeron mediante centrifugación usando de 5-10 ȝODOYY$&1 DFHWRQLWULOR \YY(O Material y Métodos análisis se espectros se analiza por MASCOT en 1&%,QU\6ZLV3URW6ZLVV3URWS VFRUHGH Se ha utilizado el ProteoMiner con el objetivo 6HLGHQWL¿FDURQSRU06SURWHtQDVGLIHUHQWHV GHLGHQWL¿FDUQXHYDVSURWHtQDVHQ/6GHSDFLHQWHV en un total de 3 líquidos sinoviales de las cuales 19 con Osteoartritis. Las muestras se trataron con hia- aparecían exclusivamente en los eluidos del Proteo- luronidasa (10 U/ml LS, 1h, agitación, 500 rpm, Miner y 29 preferentemente y/o exclusivamente en 37 ºC, en Thermomix-Eppendorf, centrifugación los LS no procesados, siendo éstas representantes 100g, 5 min., 4ºC) [3]. 10 mg de muestra se trata- de las proteínas más abundantes: albúmina sérica, ron con ProteoMiner. La recuperación de proteínas alfa-2-macroglobulina, alfa-1-antitripsina, haptog- observadas fue inferior al 1/50 del material inicial. lobina, etc. Por el contrario 15 de las 19 proteínas µ 50 g de muestra de LS tratado con hialuronidasa TXHVHLGHQWL¿FDURQH[FOXVLYDPHQWHHQORVHOXLGRV µ y 50 g muestra eluida tras el ProteoMiner se sepa- del ProteoMiner tenían masas moleculares de 10-30 64 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 kDa, siendo 3 de ellas fragmentos de proteínas más 04046 (J.S. y M.Z.). Ministerio Educación y Ciencia grandes, posiblemente productos de degradación. (MEC)-Ministerio Ciencia e Innovación (MICINN) Proyecto: SAF-2008-03685 (J.S. y M.Z.). CSIC- Beca JAE Intro a M.D.P.-M. Conclusiones En este primer abordaje se ha demostrado que Referencias HO3URWHR0LQHUHVXQDKHUUDPLHQWDPX\H¿FD]SDUD conseguir el enriquecimiento en proteínas menos [1] Righetti PG y Boschetti E. The ProteoMiner and abundantes en líquidos sinoviales de pacientes con the FortyNiners: searching for gold nuggets in RVWHRDUWULWLVLGHQWL¿FiQGRVHQXHYDVSURWHtQDVTXH the proteomic arena. Mass Spectrom Rev 2008; SXHGHQWHQHUUHODFLyQFRQSURFHVRVLQÀDPDWRULRV 27: 596-608. latentes o menos obvios que en otras patologías [2] Boschetti E y Righetti P G. The ProteoMiner articulares como la artritis reumatoide. in the proteomic arena: a non-depleting tool for discovering low-abundance species. J Proteo- mics 2008; 71: 255-264. Agradecimientos [3] Herrero-Beaumont G, Guerrero R, Sanchez- Ministerio Sanidad y Consumo-ISCIII-FIS, Pernaute O, Acebes, C, et al. Cartilage and bone Proyecto: FIS06/1502 (M.Z.). CSIC; Proyecto: ELRORJLFDOPDUNHUVLQWKHV\QRYLDOÀXLGRIRV- PI-200820I216 (M.Z.). Junta de Andalucía (J.A.), teoarthritic patients after hyaluronan injections in Consejería Innovación Ciencia y Empresa y Con- the knee. Clin Chim Acta 2001; 308: 107-115. sejería Educación y Ciencia. Proyecto: PC08-CTS- Estudio de la Estenosis Aórtica Valvular desde un punto de vista proteómico Tatiana Martin-Rojas1, Félix Gil-Dones1, Luis F. López-Almodovar2, Fernando de la Cuesta3, Glo- ria Álvarez-Llamas3, Fernando Vivanco3, Luis R. Padial4, María G. Barderas1,5 1Laboratorio Fisiopatología Vascular, Hospital Nacional de Parapléjicos, SESCAM, Toledo, 2Unidad de Ci- rugía Cardiaca, Hospital Virgen de la Salud, SESCAM, Toledo, 3Departamento de Inmunología, Fundación Jiménez Díaz, Madrid,, 4Unidad de Cardiología, Hospital Virgen de la Salud, SESCAM, Toledo, 5Unidad de Proteómica, Hospital Nacional de Parapléjicos, SESCAM, Toledo En la actualidad diversos autores han señalado SDWRORJtDMXQWRFRQODLGHQWL¿FDFLyQGHQXHYRVELR- que la estenosis aórtica degenerativa comparte los marcadores pronóstico, diagnóstico y terapéuticos. mismos factores de riesgo que la enfermedad coro- naria. Además, de compartir características histoló- La estenosis aórtica (EA) degenerativa es una gicas con las placas ateroscleróticas, lo cual sugiere enfermedad de elevada prevalencia en los países TXHODFDOFL¿FDFLyQGHODYiOYXODDyUWLFDHVXQSUR- desarrollados y es la responsable del mayor número FHVRFUyQLFRLQÀDPDWRULRVLPLODUDODDWHURVFOHUR- de reemplazos valvulares aórticos. En la actualidad, sis. La existencia de datos discordantes con esta diversos autores han señalado que comparte los mis- teoría hace necesario el estudio de esta patología mos factores de riesgo que la aterosclerosis1. Por mediante la aplicación de nuevas técnicas proteó- ello, parece esencial profundizar en el conocimiento micas (2D-DIGE, LC-MS/MS, etc), con el objetivo de la patogenia de la EA degenerativa como paso de conseguir nuevos datos que puedan contribuir a previo para establecer medidas de prevención de la comprensión de los procesos implicados en esta dicha enfermedad. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 65 En la actualidad, el estudio de proteínas indi- viduales, aún siendo esencial, ha sido desplazado por las estrategias proteómicas que permiten el aná- lisis global de las proteínas de una muestra2. Las nuevas tecnologías (MALDI-TOF/TOF, LC-MS, DIGE, MS-IMAGIN…) caracterizan miles de espe- FLHVPROHFXODUHVHQFDGDDQiOLVLV\JHQHUDQSHU¿OHV FRQMXQWRVTXHUHÀHMDQODVLWXDFLyQJHQHUDOGHXQD muestra 3. Debido a que las proteínas que componen las válvulas aórticas son esenciales para el correcto IXQFLRQDPLHQWRGHHVWDVVXLGHQWL¿FDFLyQ\FDUDFWH- rización mediante herramientas proteómicas es vital SDUDFRQRFHUPiVVREUHOD¿VLRORJtDGHODYiOYXOD aórtica y las posibles patologías de ésta. Tras la aprobación de la realización del estudio por el Comité Ético del Hospital Virgen de la Salud (SESCAM, Toledo) y solicitar el correspondiente consentimiento informado se incluyeron en el es- tudio pacientes (n=8) que fueron ingresados en la Unidad de Cirugía del mismo hospital y que fueron sometidos a cirugía de reemplazo valvular aórtico. Como controles se utilizaron válvulas aórtias sanas (n=8) procedentes de necropsias realizadas en el Departamento de Anatomía Patológica del Hospital Figura 1. (A) Gel 2-DE con las proteínas de diferencia Virgen de la Salud (Toledo). entre EA y controles. (B) Validaciones de algunas de las proteínas diferencialmente expresadas realizadas mediante Las válvulas fueron homogeniezadas en tampón Inmunohistoquímica (izquierda) y Western-blot (derecha). de extracción4, centrifugadas y el sobrenadante ob- C)&ODVL¿FDFLyQSRU*UXSRV)XQFLRQDOHV de las proteínas tenido correspondiente al extracto proteico se cuan- LGHQWL¿FDGDVXVDQGR'(\0$/',72)72)FRPELQD- do con LC-MS/MS. WL¿FyFXDQWL¿FDGRVLJXLHQGRHOPpWRGR%UDGIRUG Lowry. Posteriormente se llevó a cabo el análisis proteómico mediante electroforesis bidimensional diferencial (2D-DIGE). Las proteínas fueron mar- cadas siguiendo las instrucciones de la casa comer- cial (GE.Healthcare). Se llevó a cabo la primera \VHJXQGDGLPHQVLyQ\¿QDOPHQWHODVLPiJHQHV de los geles se capturaron mediante el escáner de ÀXRUHVFHQFLD7\SKRRQ *(+HDOWKFDUH (O análisis de las imágenes se realizó con el programa DeCyder v6.5 (GE.Healthcare) que detectó 51 man- chas proteicas diferencialmente expresadas con p< 0.05 entre válvulas aórtica sin estenosis y válvulas aórticas con estenosis. Estas manchas proteicas fue- ron recortadas de los geles, teñidos previamente con tinción plata, digeridas con tripsina y analizadas con el espectrómetro de masas 4800 Plus MALDI-TOF/ TOF Analyzer (Applied Biosystems), seguido de una búsqueda de datos. Las 51 manchas proteicas Tabla 1. 3URWHtQDVLGHQWL¿FDGDVSRUHVSHFWURPHWUtDGH correspondían a 18 proteínas diferentes (Tabla 1), masas (MALDI TOF/TOF) mostrando diferentes niveles de expresión diferencial entre válvulas aórticas sanas y válvu- TXHVHFODVL¿FDURQDWHQGLHQGRDVXIXQFLyQ\VH las aórticas con estenosis, analizadas mediante DeCyder YDOLGDURQPHGLDQWH:%H,+& software v 6.5 con p< 0.05. 66 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Agradecimientos [2] Odile Carrette, Pierre R Burkhard, Jean-Charles 6DQFKH] 'HQLV)+RFKVWUDVVHU6WDWHRIWKH Beca Esteve de la Sociedad Española de Cardio- art two-dimensional gel electrophoresis: a key logía. Instituto de Salud Carlos III (FIS PI070537), tool of proteomics research. Nature Protocols Fondo de Investigación Sanitaria de Castilla la Man- 1, - 812 - 823 (2006). cha (FISCAM, PI2008/08), Fondo de Investiga- [3] F. Vivanco, L.R Padial, V. M. darde, F de la ción Sanitaria de Castilla la Mancha (FISCAM, Cuesta, G. Alvarez-Llamas, N. Diaz-Prieto, et PI2008/28), Redes Temáticas de Investigación Coo- al. Proteomic biomarkers of atherosclerosis. perativa (RD06/0014/1015). Biomarkers Insights 2008:3, 101-113. [4] Tatiana Martín-Rojas, Félix Gil Dones, Luis Referencias F. López-Almodovar, Rocío Juárez-Tosina, Fernando de la Cuesta, Gloria Álvarez-Llamas, [1] Butany J, Collins MJ, Demellawy DE et al. Mor- Sergio Alonso-Orgaz, Fernando Vivanco, Luis SKRORJLFDODQGFOLQLFDO¿QGLQJVLQVXUJLFDOO\ Rodríguez-Padial, y María G. Barderas. Ob- excised native aortic valves. Can J Cardiol 2005; tención de un protocolo óptimo para el análisis 21:747-55. proteómico de válvulas aórticas humanas sanas y estenóticas. Rev Esp Cardiol. 2010;63. Metabolic labelling of primary culture human cartilage cells to analyze the effect RI,QWHUOHXNLQȕLQWKHH[WUDFHOOXODUPDWUL[PHWDEROLVP Valentina Calamia, Beatriz Rocha, Patricia Fernández, Jesús Mateos, Cristina Ruiz-Romero, Francisco J. Blanco Osteoarticular and Aging Research Lab, Nodo Asociado de Proteo-Red. INIBIC-Hospitalario Universitario A Coruña, Xubias 84, 15006 - A Coruña, SPAIN Introduction of matrix metalloproteinases while inhibiting the expression of genes encoding essential components ,QWHUOHXNLQȕ ,/ȕ LVDSURLQÀDPPDWRU\ of the cartilage extra cellular matrix (ECM). cytokine that acts as an arthritic mediator with the capacity to drive the key pathways typically :HKDYHUHFHQWO\XVHG'(WHFKQRORJ\WRGHV- associated with osteoarthritis (OA) pathogenesis. cribe the intracellular proteome of normal and OA This degenerative joint disease, characterized by human chondrocytes [2-3]. In the present work, articular cartilage degradation, involve in its initial we have standardized the stable isotope labelling stages an increased cellular proliferation and syn- by amino acids in cell culture (SILAC) technique thesis of matrix proteins, proteinases, growth fac- on primary culture human articular chondrocytes, WRUVF\WRNLQHVDQGRWKHULQÀDPPDWRU\PHGLDWRUV DQGKDYHDSSOLHGIRUWKH¿UVWWLPHWKLVVWUDWHJ\IRU by cartilage cells. Therefore, research has focused studying the chondrocyte extracellular matrix me- on the chondrocyte (the unique cell type of carti- tabolism in basal conditions and under the effect of lage) as the cellular mediator of OA pathogenesis. WKHSURLQÀDPPDWRU\F\WRNLQH,/ȕ Chondrocytes of OA patients, as well as synovial FHOOVSURGXFHLQFUHDVHGOHYHOVRILQÀDPPDWRU\ Methods F\WRNLQHVVXFKDV,/ȕ>@7KLVF\WRNLQHVKLIWV the biology of the chondrocytes towards articular Cartilage obtained from patients undergoing jo- cartilage degradation by increasing the expression int replacement was provided by the Tissue Bank at 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 67 CHU A Coruña. The study was approved by the lo- Results cal Ethics Committee. Chondrocytes released from cartilage by enzymatic digestion were recovered Chondrocytes are responsible of the synthesis DQGSODWHGDWORZGHQVLW\LQ6,/$&'0(0)OH[ of cartilage ECM components, but in primary cul- (Invitrogen) supplemented with antibiotics, glucose WXUHWHQGHDVLO\WRGHGLIIHUHQWLDWHLQWR¿EUREODVWV and 10% FBS. In the case of light media, standard A method for obtaining a complete labelling of the L-lysine (146 mg/L) and L-arginine (28 mg/L) were proteins avoiding the cellular de-differentiation used, while in the heavy media isotope-labelled KDVEHHQGHYHORSHG:HKDYHPLQLPL]HGWKH$UJ 13 concentration in order to render it metabolically L-lysine ( C6), and isotope-labelled L-arginine 13 15 unfavourable as a precursor for Pro synthesis, and ( C6, N4) were used. Titration assays were per- formed to minimize the problematic conversion of YHUL¿HGWKDWWKHVHUHVWULFWHGFRQGLWLRQVGRQRWFRP- heavy Arg to Pro in chondrocyte cell culture. Cell promise cell proliferation, viability and expression proliferation and cell viability was tested by cell of chondrocyte markers such as Collagen II, which count and Trypan Blue dye exclusion. Real-time is a proline-rich protein. PCR analyses were carried out to verify the expres- Collection and proteomic analysis of the pro- sion of Collagen II, a typical marker of chondrocyte teins secreted by the chondrocytes allowed the cells, under the conditions of study. LGHQWL¿FDWLRQRIDQXPEHURISURWHLQVWKDWKDGEHHQ Chondrocytes were used at week 2-3 in primary previously related with OA pathogenesis, such as culture (P1), after making them quiescent by incu- matrix metalloproteinases and cathepsins. Interes- bation in a medium containing 0% FBS for 24h. WLQJO\PRVWRIWKHSURWHLQVLGHQWL¿HGDUHFDUWLODJH Cells were then washed thoroughly and incubated ECM components (27%) (Figure 2), clearly showing in serum-free medium with ,/ȕDWQJP/IRU the usefulness of secretome analysis for the study of 48 hours. Then, conditioned media were collected (&0PHWDEROLVP:HFRXOGDOVR¿QGDKLJKQXPEHU DQGWKHLUSURWHLQVZHUHFRQFHQWUDWHGDQGTXDQWL¿HG of growth factors, matrix remodelling proteins and (Figure 1). cytokines (6 of them that are known to be involved LQWKHLQÀDPPDWRU\UHVSRQVH WKDWDUHVHFUHWHGE\ ,/ȕWUHDWHGFKRQGURF\WHVLQGLFDWHGWKRVHFHOOXODU SDWKZD\VWKDWDUHLQGXFHGE\WKLVSURLQÀDPPDWRU\ cytokine in cartilage cells. Figure 2. )XQFWLRQDOFODVVL¿FDWLRQRIWKHSURWHLQVLGHQWL¿HG Figure 1. ([SHULPHQWDOZRUNÀRZIRUWKHGLIIHUHQWLDOVHFUHWR- in this work. me analysis of chondrocytes by SILAC and nanoLC-MS/MS. Heavy and light samples were mixed 1:1, and 4 Conclusions ȝJRIHDFKPL[HGVDPSOHZHUHLQVROXWLRQUHGX- ced, alkylated and digested with trypsin. Peptide :HKDYHVWDQGDUGL]HGWKH6,/$&WHFKQLTXHIRU PL[WXUHVZHUHGHVDOWHGDQG¿OWHUHGWKURXJKD& the proteomic analysis of human primary cartilage microcolumn, and column eluates were subjected cells, and we have applied this technology for stu- to nano-LC-MS analysis using a Tempo nanoLC G\LQJWKHHIIHFWRIWKHSURLQÀDPPDWRU\F\WRNLQH equipped with a C18 column, and a 4800 MALDI- ,/ȕDNH\PROHFXOHLQWKH2$SURFHVVRQWKH TOF/TOF mass spectrometer (Applied Biosystems). chondrocyte secretome. The obtained information 7KHLGHQWL¿FDWLRQDQGTXDQWL¿FDWLRQRISURWHLQVZDV will increase knowledge about OA pathogenesis, carried out with Protein Pilot software. and already points out a number of possible markers of the disease. 68 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 References articular chondrocytes: a novel tool for the study of osteoarthritis and other rheumatic diseases. >@ %ORP$%YDQGHU.UDDQ30YDQGHQ%HUJ:% Proteomics. 2005;5(12):3048-59. Cytokine targeting in osteoarthritis. Curr Drug Targets. 2007;8(2):283-92. [3] Ruiz-Romero C, Carreira V, Rego I, Remeseiro S, Lopez-Armada MJ, Blanco FJ. Proteomic [2] Ruiz-Romero C, Lopez-Armada MJ, Blanco FJ. analysis of human osteoarthritic chondrocytes Proteomic characterization of human normal reveals protein changes in stress and glycolysis. Proteomics. 2008;8(3):495-507. ,GHQWL¿FDWLRQRIGLIIHUHQWLDOSURWHLQVLQOLYHUFHOOVXSRQGHSOHWLRQRISURKLELWLQ Virginia Sánchez-Quiles, Enrique Santamaría, Laura Sesma, Fernando J. Corrales Division of Hepatology and Gene Therapy, Proteomics Unit. Centre for Applied Medical Research (CIMA), University of Navarra. 31008, Pamplona, Spain Introduction cell counting and with the Cell Proliferation Reagent :67 5RFKH ,QRUGHUWRH[SORUHWKHPROHFXODU Prohibitin (Phb) is a multifunctional protein mechanisms involved in the response of PLC cells participating in a plethora of essential cellular to impaired Phb1 activity we used a combination of functions, such as cell signalling, apoptosis, survival DIGE and mass spectrometry analyses. To increase and proliferation, playing a central role in the main- WKHHI¿FLHQF\RIWKHSURFHVVF\WRVROLFDQGPLFUR- tenance of liver homeostasis through the regulation somal subcellular fractions were isolated (Qproteo- of central proteins involved in these processes by me Cell Compartment Kit, from Qiagen). Enriched means of protein-protein interaction mechanisms. cytosolic and microsomal fractions from siGL and ,QWKHOLYHUGH¿FLHQWSURKLELWLQDFWLYLW\SDUWLFLSDWHV siPHB cells were compared by DIGE analysis. Di- in the progression of non-alcoholic steatohepatitis IIHUHQWLDOVSRWVGHWHFWHGDQGTXDQWL¿HGE\'H&\GHU (NASH) and obesity, according to mechanisms that ZHUHLGHQWL¿HGE\QDQR/&(6,0606 472) still must be elucidated. Phb1 plays an essential role in hepatic functions such as inhibition of cell proliferation [1, 2] and response to anti-cancer [3] or Results carcinogenic agents [4]. Down-regulation of Phb1 is an early event in the development of NASH and Phb1 levels were reduced by 80% upon siRNA hepatocellular carcinoma (HCC) in experimental VLOHQFLQJ$SRSWRVLVZDVTXDQWL¿HGDQGDEVRUEDQFH mouse models and humans [5]. All these data su- was 3-fold increased in siPHB cells indicating the ggest that Phb1 may play a prominent role in the SURDSRSWRWLFHIIHFWRI3KEGH¿FLHQF\ )LJXUH' progression of HCC. In addition, Phb silencing severely compromised the capacity of PLC cells to proliferate in a semisolid substrate, an inherent property of transformed cells Materials and Methods that is related with their metastatic capacity (Figure 1C). Both cell counting and formazan production Phb1 expression was silenced in the human UHYHDOHGDVLJQL¿FDQWUHGXFWLRQRIWKHSUROLIHUDWLRQ +&&FHOOOLQH3/&35)XVLQJVSHFL¿FVL51$V rate of siPHB cells when compared with the control (siGL, control cells; siPHB, treated cells). Phb1 siGL cells (Figure 1A and B). levels were analysed by immunodetection assay. $SRSWRVLVZDVTXDQWL¿HGZLWKWKH&HOO'HDWK'HWHF- DeCyder analysis of DIGE of cytosolic and tion Kit (Roche). Cell proliferation was estimated by microsomal fractions found 76 and 25 spots diffe- 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 69 rentially represented (T test < 0.05) in siPHB with E\:HVWHUQEORW¿JXUH% LQVL3+%FHOOVVXJ- respect to siGL cells. MS/MS analysis allowed gest ER stress that, in turn, might participate in the WKHLGHQWL¿FDWLRQRIDQGXQLTXHSURWHLQVLQ apoptotic response of PLC cells to Phb1 silencing. the cytosolic and microsomal fractions respecti- In agreement to this hypothesis, we found increa- vely (Table 1). sed CHOP levels, PARP cleavage and activation of caspase 12 and downstream caspase 7 (Figure 2A). ER stress might result from proteasome malfunction leading to the accumulation of miss-folded polypep- tide chains in the cell. Phb1 silencing induced down- regulation of proteasome activator complex subunit DQGVWDWKPLQ DVYHUL¿HGE\:HVWHUQEORW)LJXUH 2B) suggesting impairment of proteasome activity. 'H¿FLHQWSURWHDVRPHDFWLYLW\ZDVHYLGHQFHGE\WKH accumulation of ubiquitinated proteins upon Phb silencing (Figure 2B). Figure 1. Cell growth and survival upon Phb1 silencing. Conclusions Phb1 silencing in human hepatoma cell line PLC/PRF5 leads to an increase of apoptotic rate and an impaired cell proliferation. Down-regulation of Figure 2. Molecular targets mediating the cellular response &DOUHWLFXOLQ(5S DQG(UOLQ IXUWKHUFRQ¿UPHG WR3KEGH¿FLHQF\ Table 1,GHQWL¿FDWLRQRISURWHLQVFRUUHVSRQGLQJWRWKHGLIIHUHQWLDOVSRWVDVVLJQHGE\VL*/YHUVXVVL3+%'(JHOLPDJH analysis. 70 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 References hepatoma Huh-7 cells. Cancer Lett 2009; 282: 48-54. [1] McClung JK, Danner DB, Stewart DA, Smith JR, Schneider EL, Lumpkin CK, et al. Isolation [4] Leonard JF, Courcol M, Mariet C, Charbonnier of a cDNA that hybrid selects antiproliferative A, Boitier E, Duchesne M, et al. Proteomic mRNA from rat liver. Biochem Biophys Res FKDUDFWHUL]DWLRQRIWKHHIIHFWVRIFOR¿EUDWHRQ Commun 1989; 164: 1316-1322. protein expression in rat liver. Proteomics 2006; 6: 1915-1933. >@ 6XQ40LDR0-LD;*XR::DQJ/ Introduction to Lucid Proteomics System, a new solution for peptide and protein SUR¿OLQJDQGLGHQWL¿FDWLRQFRPELQLQJ5HWHQWDWH&KURPDWRJUDSK\WR0$/', TOF and TOF/TOF Mass Spectrometry Francesco Tortorella Lucid Sales Manager Europe, Bio-Rad Laboratories Bio-Rad Laboratories 7KHVSHFL¿FLW\RIWKH3URWHLQ&KLSDUUD\VXUIDFHV permits sample cleanup directly on the arrays, ma- The Lucid Proteomics System provides a novel king the process compatible with crude biological means for top-down proteomic analysis of complex samples (such as neat urine) and harsh elution buffer biological samples by combining the separation components (salts, urea, etc.) that are not normally power of SELDI ProteinChip arrays with high-re- compatible with MS analysis. solution MALDI-TOF and MALDI-TOF/TOF mass spectrometry. 6HYHUDOH[DPSOHVRISXUL¿FDWLRQVWUDWHJLHVDQG LGHQWL¿FDWLRQVZLOOEHGHVFULEHG 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 71 02',),&$&,21(632675$'8&&,21$/(6 Coordinadores: Marina Gay, Montserrat Carrascal, Antonio Martínez-Ruiz y Pablo Martínez-Acedo Liquid chromatography—electron transfer dissociation and ion mobility studies on a QTOF mass spectrometer Keith Compson,James Langridge, Jeffery Brown, Steven Pringle, Iain Campuzano, Richard Chapman :DWHUV&RUSRUDWLRQ:\WKHQVKDZH0DQFKHVWHU8. ETD (Electron Transfer Dissociation) is a MS/ 2nd generation collision induced dissociation (CID) MS technique in which precursor cations are reac- ions prior to mass analysis in the TOF. ted with radical reagent anions to induce fragmen- tation. Electron transfer from anion to cation, pro- Bovine serum albumin (BSA) tryptic peptides motes fast and randomised dissociation compared (250fm and 50fm) were separated by nanoAcqui- to collision induced dissociation (CID) and hence ty UPLC and a selection of triply charged precur- ETD product ion spectra contain predominantly sor masses were subsequently selected to generate “c” and “z” type ions and post translational mo- LC-ETD spectra. Data were acquired at 1 spectra/ GL¿FDWLRQVRIWHQUHPDLQLQWDFWSURYLGLQJYDOXDEOH second and the fragment ions were database sear- sequence information. ched with all spectra matching to BSA with high probability. High quality data was observed at the Here we show how ETD can be implemented 50fm injection level, with ETD data acquired at 1 DQGSHUIRUPHGRQDK\EULG4,0672) :DWHUV spectra/second. Synapt) where a supply of reagent from a sealed ampule is delivered to the intermediate pressure re- Cleavage was observed at almost every amide gion of the nano ESI source and a high voltage dis- bond in the peptide backbone, yielding easy-to-inter- charge pin was added to the ion source to generate pret sequence ladders of c and z-ions. This coupled the reagent anions. Analyte cations were generated with the inherent mass measurement accuracy and using the standard nanospray source via infusion or resolution of the oa-TOF mass analyser makes the nanoACQUITY UPLC system. For ETD, the ion data easily amenable to de novo sequencing. The source polarity and the quadrupole set mass were signal intensity of the fragment ions seemed to di- sequentially switched to deliver anions and cations minish with decreasing m/z, as previously reported. LQWRWKH75$3WUDYHOOLQJZDYH 7:$9( LRQJXLGH In addition to the ETD experiments the mass spec- where they reacted to form ETD product ions. Pro- trometer can acquire alternate scans in CID, and as duct ions were optionally separated by ion mobility such data will be compared and contrasted between LQWKH,067:$9(LRQJXLGHRUZHUHDFFHOHUDWHG ETD and CID on a variety of peptides produced and LQWRWKH75$16)(57:$9(LRQJXLGHWRFDXVH separated by nanoscale chromatography. 72 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Strategies for proteomic analysis of blood glycated proteins María Ramírez-Boo1, Feliciano Priego-Capote2, Alexander Scherl1, Jean-Charles Sanchez1 1 Biomedical Proteomics Research Group, Dpt. of Structural Biology and Bioinformatics, University Medi- cal Center, Geneva, Switzerland. 2 Dpto. de Química Analítica, Universidad de Córdoba, Spain. $PRQJSRVWWUDQVODWLRQDOPRGL¿FDWLRQV 370V A set of innovative approaches for analysis of of proteins, non-enzymatic glycation is one of the glycated proteins is here presented by application to less frequently studied in proteomics. Glycated pro- blood samples [8]. Qualitative analysis was carried teins are formed by a non-enzymatic reaction bet- out by tandem mass spectrometry (MS) after en- ween reducing carbohydrates (e.g., glucose, fructo- GRSURWHLQDVH*OX&GLJHVWLRQDQGERURQDWHDI¿QLW\ se, ribose or derivatives such as ascorbic acid) with chromatography (BAC) for isolation of glycated pep- amino groups located in N-terminal position or in ly- tides. For this purpose, two MS operational modes sine and arginine residues (Figure 1) [1]. Analytical were used: HCD-MS2 and CID-MS3 by neutral loss guidelines required to succeed in the characterization scan (monitoring two selective neutral losses typical of glycated proteins at qualitative levels have been RISHSWLGHVPRGL¿HGE\JOXFRVHDWWDFKPHQW UHFHQWO\SURSRVHG>@,WLQYROYHVWKHLGHQWL¿FDWLRQ and 84.04 Da). Quantitative analysis was based on the 13 of glycated proteins as well as the elucidation of su- labelling of proteins with C6-glucose incubation in gar attachment sites. Nevertheless, there is a demand order to evaluate the native glycated proteins labelled 12 for quantitative proteomic strategies that could be with C6-glucose. As glycation is chemo-selective, it potentially applied for glycation assessment. One of is exclusively occurring in potential targets for in vivo WKHDUHDVWKDWFRXOGEHQH¿WIURPWKHVHVWUDWHJLHVLV PRGL¿FDWLRQV7KLVDSSURDFKQDPHG*O\FDWLRQ,VRWR- WKHFOLQLFDO¿HOGGXHWRWKHFUXFLDOUROHRIJOXFRVHDV pic Labelling (GIL), enabled to differentiate glycated an energy source in humans, being the main circu- peptides labelled with both isotopic forms resulting lating sugar and, thus, the most relevant molecule in from enzymatic digestion by MS (6 Da mass shift per terms of protein glycation. In fact, there are clinical glycation site) as shown in Figure 2. evidences relating glycation and pathological condi- tions associated to hyperglycaemia such as diabetes :LWKWZRGLIIHUHQWSXUSRVHVWKLVVWUDWHJ\KDV mellitus, renal failure or aging [5-7]. been applied to human plasma and lysates from Figure 1. Scheme of the glycation process (Maillard reaction). 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 73 Figure 2. %RWWRPXSSURWHRPLFVZRUNÀRZVXVHGIRUTXDQWLWDWLYHDQDO\VLVRIJO\FDWHGSURWHLQVVKRZLQJWKHODEHOOLQJZLWK light and heavy glucose. 74 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 HU\WKURF\WHV7KH¿UVWRQHZDVEDVHGRQWKHFKDUDF- ¿OLQJRIQRQHQ]\PDWLFDOO\JO\FDWHGSURWHLQVLQ terization of the native glycated proteome, incuba- human plasma and erythrocyte membranes. J. 13 Proteome Res. 2008; 7, 2025-2032. ting the clinical samples with C6-glucose prior to DQDO\VLVZLWKWKHFRQYHQWLRQDOSURWHRPLFVZRUNÀRZ [3] Zhang, Q., Petyuk, V. A., Schepmoes, A. A., exposed above. Fifty glycated proteins with identi- Orton, D. J., Monroe, M. E., Feng, Y., Smith, R. ¿FDWLRQRIVXJDUDWWDFKPHQWSRVLWLRQVZHUHGH- D., Metz, T. O. Analysis of non-enzymatically tected in the analysis of human plasma. Concerning glycated peptides: neutral-loss-triggered MS3 UHGEORRGFHOOVJO\FDWHGSURWHLQVZLWKLGHQWL¿FD- versus multi-stage activation of tandem mass tion of 54 glycation sites were detected without any spectrometry. Rap. Comm. Mass Spectrom. protein pre-fractionation step. These proteins are 2008; 22, 3027-3034. representative targets to compare between samples [4] Zhang, Q., Ames, J. M., Smith, R. D., Baynes, with different glycaemic states and monitor the gly- -:0HW]72$SHUVSHFWLYHRQWKH0DLOODUG caemic control. The second task was focused on the reaction and the analysis of protein glycation assessment of glucose stimuli at different concen- by mass spectrometry: probing the pathogenesis trations (0, 5, 10, 30 and 50 mM glucose) in human of chronic disease. J. Proteome Res. 2009; 8, SODVPD)RUWKLVSXUSRVH¿YHSODVPDDOLTXRWVZHUH 754-769. independently incubated with 0, 5, 10, 30 and 50mM - 12C -glucose for 24 h and, subsequently mixed with >@ %D\QHV-:7KHUROHRI$*(VLQDJLQJ FDX 6 sation or correlation. Exp. Gerontol. 2001; 36, a plasma aliquot incubated with 30mM 13C -glucose 6 1527-1537. for 24 h. Proteomic analysis of these pools has re- vealed additional information about the biological [6] Brownlee, M. Biochemistry and molecular cell effect of different hyperglycemia conditions and the biology of diabetic complications. Nature 2001; kinetic of glycation. 14, 813-820. [7] Hipkiss, A. R. Accumulation of altered proteins and ageing: causes and effects. Exper. Gerontol. References 2006; 41, 464-473. [1] Maillard, L. C. Action des acides amines sur le [8] Priego-Capote F., Scherl$0OOHU0:DULGHO sucres: formation des mélanoidines per voie mé- P., LisacekF., Jean-Charles SanchezJ-C. Glyca- thodique. C. R. Acad. Sci. 1912; 154, 66-68. tion Isotopic Labelling (GIL) with 13C-reducing [2] Zhang, Q., Tang, N., Schepmoes, A. A., Phillips, Sugars for Quantitative Analysis of Glycated Pro- L. S., Smith, R. D., Metz, T. O. Proteomic pro- teins in Human Plasma MCP, 2009, in press. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 75 HPLC-FosfoChip una nueva tecnología para el análisis selectivo de fosfopéptidos mediante LC/MS Isidro Masana1. Reinout Raijmakers2, Shabaz Mohammed2, Albert Heck2, Dayin Lin3 1Agilent Technologies–Barcelona. 2Biomolecular Mass Spectrometry and Proteomics Group, Bijvoet Center and Utrecht Institute for Pharmaceutical Sciences –Utrecht–Netherlands. 3Agilent Technologies :DOGEURQQ*HUPDQ\ La fosforilación de proteínas es uno de los más QHFHVDULRVFUHDQUHWRVHQFXDQWRDVX¿DELOLGDGUR- LPSRUWDQWHVPHFDQLVPRVGHPRGL¿FDFLyQSRVWWUDGXF- bustez y reproducibilidad. La automatización de las cional (PTM) para regular la función de las proteínas etapas de enriquecimiento y de separación analítica, en las células. Miles de procesos biológicos, inclu- son la mejor manera de conseguir una buena repro- yendo la proliferación, migración y apoptosis celular, ducibilidad, inyección a inyección y entre distintos implican pasos de fosforilación. Uno de los principales ODERUDWRULRV(OQXHYRFKLSPLFURÀXtGLFR 3KRVSKR- HVIXHU]RVHQSURWHyPLFDYDGLULJLGRDODLGHQWL¿FDFLyQ chip es un HPLC-Chip reutilizable diseñado para y comprensión de los fosfoproteomas en las células. enriquecimiento y análisis fosfopeptídico [1-2] que SHUPLWHODDXWRPDWL]DFLyQGHHVHÀXMRGHWUDEDMR El enriquecimiento selectivo de péptidos y proteínas fosforiladas es necesario para conseguir El chip consiste en una multicapa de poliimida una mejor cobertura del fosfoproteoma. El enfoque laminada que contiene una zona de enriquecimien- Figura 1. Diseño del FosfoChip: (A). El FosfoChip incorpora una columna de enriquecimiento encapsulada con: RP-TiO2-RP. (B). Posición de carga para enriquecimiento de péptidos. (C). Etapa de separación de péptidos a través de columna analítica. basado en dióxido de titanio es un método parti- to con partículas de dióxido de titanio (TiO2), cularmente robusto y automatizable con una gran ÀDQTXHDGDDDPERVODGRVSRUPDWHULDOGHIDVH D¿QLGDGSRUORVIRVIRSpSWLGRV1RREVWDQWHODVP~O- reversa C18 (ver Figura 1). La zona de enriqueci- tiples micro-válvulas, conexiones y micro-capilares miento está conectada a la columna de separación 76 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 de fase reversa que acaba en una punta integrada siguiente etapa, los fosfopéptidos se desorben del de nanoelectrospray. TiO2 con un tampón de elución básico, atrapándose en RP2. Finalmente, se realiza un gradiente para A través del “Chip-cube” (la interfase al MS separar los fosfopéptidos en la columna analítica. del HPLC-Chip), una micro-válvula conecta direc- WDPHQWHHOQDQRFURPDWyJUDIRFRQODVXSHU¿FLHGHO En el modo dual (fosforilados y no fosforilados), chip. Ello crea un sello de alta presión y cero vo- previamente a la separación de los fosfopéptidos, se lumen muerto, y permite la automatización de la lleva a cabo un gradiente de elución de los pépti- carga de muestras, desalinización, elución desde la dos retenidos en RP1 dirigiéndolos a la columna SUHFROXPQDGHHQULTXHFLPLHQWR\VHSDUDFLyQ¿QDO analítica para separar los péptidos no fosforilados en la columna analítica mediante un gradiente de la (los fosforilados permanecen retenidos en el TiO2). concentración de solvente orgánico del eluyente. El Finalmente en un segundo gradiente se realiza la se- FosfoChip se complementa con un kit de reactivos paración de los péptidos fosforilados (previa elución para el análisis de fosfopéptidos en cualquier siste- de estos de la columna de TiO2 a la RP2 como se ma HPLC-Chip/MS (Agilent QTOF/QqQ/TOF/Q). indicaba en el párrafo anterior). El kit incluye una mezcla acondicionadora y un estándar para saturar todos los potenciales puntos Parte experimental de adsorción de fosfopéptidos del HPLC. Un lisado de proteínas de células de osteosarcoma El conjunto de columna de enriquecimiento em- U2OS humano se redujo, alquiló y se digirió con tripsi- paquetada con RP1-TiO2-RP2, permite en un sólo na. Los péptidos resultantes se fraccionaron por croma- experimento la retención y análisis por separado WRJUDItD6&;\ȝJGHODIUDFFLyQTXHWHyULFDPHQWH de péptidos fosforilados y no fosforilados. El chip contenía la mayoría de péptidos ionizados con 1 sola puede operar en dos modos diferentes, según intere- carga neta (conocida por contener la mayoría de fosfo- sen o no los péptidos no fosforilados. En el primer péptidos), se analizó con un Agilent HPLC-Chip/MS modo, cuando sólo interesan fosfopéptidos, la gran conectado a un Q-TOF Agilent-6520 y se compararon mayoría de los péptidos se atraparán inicialmente en los resultados obtenidos mediante el FosfoChip y un RP1. La elución posterior de péptidos con solvente HPLC-Chip standard mediante MS/MS automático. orgánico los arrastrará hasta la fase TiO2, donde sólo se retendrán los fosfopéptidos, desechándose El 90% de la señal total se encontró en el los péptidos no fosforilados (no retenidos). En la ³ÀRZWKURXJK´ )LJXUD ODIUDFFLyQQRUHWHQLGD Figura 2. Comparación análisis de fosfopéptidos fracción SCX de péptidos mono-cargados de osteosarcoma U2OS huma- no: (A) con HPLC-Chip estándar. (B) FosfoChip:fracción no retenida en TiO2 (C) FosfoChip: Fracción retenida en TiO2 IRVIRSpWLGRV ' 1~PHURGHIRVIRSpSWLGRV~QLFRVLGHQWL¿FDGRVFRQ6SHFWUXP0LOO 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 77 en TiO2. El análisis de la fracción retenida en TiO2, Referencias con el motor Spectrum Mill y la base de datos hu- PDQD,3,SHUPLWLyODLGHQWL¿FDFLyQGHIRV- [1] Mohammed S, et al. Chip-Based Enrichment and fopéptidos. En contraste, sólo 11 fosfopéptidos se NanoLC/MS/MS Analysis of Phosphopeptides IURP:KROH/\VDWHV-3URWHRPH5HV LGHQWL¿FDURQFXDQGRODPLVPDPXHVWUDVHDQDOL]y 1565-71. con el HPLC-Chip estándar. Como era de esperar, los componentes mayoritarios no fosforilados, en- [2] Raijmakers R, Mohammed S, J.R Heck A. PDVFDUDURQODLGHQWL¿FDFLyQGHORVIRVIRSpSWLGRV Lin D., Masana I., HPLC-FosfoChip: análisis en muestras en las que no se realizó el paso de en- selectivo de Fosfopéptidos por LC/MS. Lifes- riquecimiento/ separación en TiO2. Ello es debido cienceslab 2009; 5 :30-35. a la falta de tiempo para adquirir en un pico cro- PDWRJUi¿FRORVHVSHFWURVGH0606GHSpSWLGRV minoritarios (como los fosforilados), cuando estos coeluyen con diversos péptidos mayoritarios y se trabaja en Auto-MS/MS. ,GHQWL¿FDWLRQRIDQHZSKRVSKRU\ODWLRQVLWHLQ()WUDQVFULSWLRQIDFWRU Nerea Osinalde1, Miren Josu Omaetxebarria1, Kerman Aloria2, Ana M. Zubiaga3, Asier Fullaondo3, Jesus M. Arizmendi1 1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of the Basque Country, Leioa, Spain. 2Proteomics Core Facility-SGIker (ProteoRed), University of the Basque Country, Leioa, Spain. 3Department of Genetics, Physical Anthropology and Animal Physiology, University of the Basque Country, Leioa, Spain. The E2F transcription factor family (E2F1-8) Introduction is required for the regulation of a number of genes involved in several essential cellular processes. E2Fs (E2F1-8) play a central role in cell cycle It is for that reason that the activity of E2Fs must progression, DNA damage repair, apoptosis, cell be carefully controlled. Reversible phosphoryla- differentiation and development. Each of this family tion is one of the main regulatory mechanisms members are known to regulate more than one cellu- controlling the activity of proteins that has also lar process depending on the stimuli they are subjec- been described for E2Fs. Several phosphorylation ted to. For instance, E2F1-dependent transcription is events have already been described for E2F1 but essential for cell proliferation but depending on the WKHRQHVGHVFULEHGVRIDUDUHLQVXI¿FLHQWWRFRP- cellular context can also trigger cell death. That is pletely understand how this transcription factor is why E2F-dependent transcription needs to be tightly regulated. In order to identify new phosphorylation regulated. Transcriptional activity of each E2F is sites, E2F1 was immunoprecipitated and following modulated at various levels. Not only protein-pro- tein interaction and subcellular localization but also protease mediated digestion was loaded onto TiO2 microcolumns. The enriched fractions were analy- SRVWWUDQVODWLRQDOPRGL¿FDWLRQVVXFKDVDFHW\ODWLRQ zed by LC-MS/MS. This methodology allowed the and phosphorylation have been proven to regulate LGHQWL¿FDWLRQRIDQHZ()SKRVSKRU\ODWLRQVLWH DQGGHWHUPLQHWKHVSHFL¿FUROHVRI()V)RULQV- not described to date. tance, it is known that the DNA binding capacity 78 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 of E2F1 is reduced when Ser375 is phosphorylated +'06PDVVVSHFWURPHWHU :DWHUV LQWHUIDFHGWRD [1] while phosphorylation of Ser31 and Ser364 fo- 1DQR$FTXLW\83/&6\VWHP :DWHUV 7KHVDPSOH llowing DNA damage has been reported to stabilize was loaded onto a Symmetry 300 C18 precolumn. E2F1 itself and also promote its apoptotic pathway The precolumn was connected to a BEH130 C18 co- [2]. However it cannot be ruled out the possibility to OXPQ :DWHUV 0DVFRWVHDUFKHQJLQH http://www. ¿QGPRUHSKRVSKRU\ODWLRQHYHQWVLQ() matrixscience.com ZDVXVHGIRUSURWHLQLGHQWL¿- cation. Bioinformatics: Phosphorylation site- and To gain a better understanding of how E2F1 motif-prediction tools were used. Netphos 2.0 [4] is regulated, we looked for new phosphorylation and Phosida [5] were used for the prediction of pu- events it may suffer. Immunoprecipitation of E2F1 tative phosphorylation sites in E2F1. Additionally, followed by LC-MS/MS analysis of TiO enriched 2 Phosida was used for kinase prediction of putative SKRVSKRSHSWLGHV )LJXUH OHGWRWKHLGHQWL¿FDWLRQ phosphorylation sites. http://www.cbs.dtu.dk/servi- of a novel phosphorylation site for E2F1. ces/NetPhos/ and http://www.phosida.com/ Results and discussion $QHZSKRVSKRU\ODWLRQVLWHZDVLGHQWL¿HGIRU E2F1. Manual validation of the spectra allowed the assignment of the phosphorylation to residue Ser307 (Figure 2). Figure 1. Strategy for the analysis of phosphorylation in E2F1. E2F1 was immunoprecipitated, protease-digested and Figure 2. 0606VSHFWUDRIWKHLGHQWL¿HGSKRVSKRSHSWLGH the resulting peptides were enriched by TiO and analyzed for E2F1 transcription factor. Among the four possible phos- 2 301 by LC-MS/MS. phorylable residues for the phosphopeptide ETVGGIS- PGKTPSQE315, it was possible to assign the phosphorylation site to residue Ser307. Materials and methods Bioinformatic analysis was also performed to Immunoprecipitation of E2F1 transcription predict possible phosphorylation sites in E2F1. Ac- factor: A cell extract from 293T cells overexpres- cording to NetPhos 2.0 predictor, the phosphoryla- sing E2F1 was incubated with an antibody against WLRQSUHGLFWHGVFRUHIRUWKHLGHQWL¿HGVLWHLQ() E2F1. After washing, proteins were eluted with is 0.997, which reinforces our result. Moreover, 0.1M glycine pH 2.5 at 25ºC O/N. Samples were phosphorylation database Phosida predicted that the neutralized with 1.5M TrisHCl pH 8.8. In-solution kinase involved in the phosphorylation of Ser307 digestion of the immnoprecipitated fractions: Pro- would be CDK2. It has already been described that tein eluates were reduced with dithiothreitol, alkyla- E2F1 can form a stable complex with cyclinA/CDK2 ted with iodoacetamide and digested O/N at 25ºC and that CDK2 can phosphorylate E2F1 regulating with GluC. Titanium Dioxide (TiO2) enrichment this way its DNA-binding activity [1]. of phosphorylated peptides: Preparation and use of TiO microcolumns for phosphopeptide enrichment 2 $FNQRZOHGJHPHQWV was performed essentially as previously described by Larsen et al., 2005 [3]. LC-MS/MS: Titanium N.O. is a recipient of University of the Basque enriched fractions were analyzed in a SYNAPT Country fellowship for PhD studies. This work has 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 79 been funded by Etortek and Saiotek grants from the In- [3] Larsen MR, Thingholm TE, Jensen ON, Roeps- dustry Department of the Basque Government. Proteo- torff P and Jørgensen TJ. Highly selective enri- mics Core Facility-SGIker is supported by UPV/EHU, chment of phosphorylated peptides from peptide MICINN, GV/EJ, ESF and ProteoRed agencies. mixtures using titanium dioxide microcolumns. Mol Cell Proteomics 2005;4:873-86. [1] Peeper DS, Keblusek P, Helin K, Toebes M, Van der Eb AJ and Zantema A. Phosphorylation of a [4] Blom N, Gammeltoft S and Brunak S. Sequence and structure-based prediciton of eukaryotic VSHFL¿FFGNVLWHLQ()DIIHWVLWVHOHFWURSKRUH- tic mobility and promotes pRB-binding in vitro. protein phosphorylation sites. J Mol Biol Oncogene 1995;10:39–48. 1999;294:1351-62. [5] Gnad F, Ren S, Cox J, Olsen JV, Macek B, Oroshi >@ /LQ:&/LQ)7DQG1HYLQV-56HOHFWLYHLQ- duction of E2F1 in response to DNA damage, M and Mann M. PHOSIDA (phosphorylation mediated by ATM-dependent phosphorylation. site database): management, structural and Genes Dev 2001;15:1833-44. evolutionary investigation, and prediction of phosphosites Genome Biology 2007;8:R250. (VWDEOHFLPLHQWRGHXQÀXMRGHWUDEDMRHIHFWLYRHQODFDUDFWHUL]DFLyQFXDOLWDWLYD y cuantitativa del fosfoproteoma David Ovelleiro, Montserrat Carrascal, Joaquin Abian /3&6,&8$%,,%%&6,&(GL¿FLR0&DPSXV8$%%HOODWHUUD%DUFHORQD6SDLQ La determinación de puntos de fosforilación en /DHYDOXDFLyQGHODFRQ¿DQ]DHQODLGHQWL¿FD- proteínas es una de las áreas de la proteómica con ción de fosfoproteínas en base al número de mayor interés en la actualidad. Los últimos avances SpSWLGRVLGHQWL¿FDGRVQRVLHPSUHHVSRVLEOH HQODLQVWUXPHQWDFLyQ\HQODVWpFQLFDVGHSXUL¿FDFLyQ dado que en las etapas de enriquecimiento gran están permitiendo la detección de formas fosforiladas parte de los péptidos no fosforilados se elimi- de péptidos a muy bajas concentraciones y con gran nan. La información analítica reportada debe ¿DELOLGDG/DFDUDFWHUL]DFLyQGHOGHQRPLQDGRIRVIR- por tanto tener en cuenta todas las proteínas a proteoma hace posible la obtención de instantáneas las que apuntan estos péptidos únicos, tanto a del estado de fosforilación de un determinado orga- efectos cualitativos como cuantitativos. QLVPR\VXFXDQWL¿FDFLyQHQGLIHUHQWHVHVWDGRV1R obstante, debido a las utilización de métodos de en- (OQ~PHURGHPRGL¿FDFLRQHVDWHQHUHQFXHQ- ULTXHFLPLHQWR\DORVEDUULGRVHVSHFt¿FRVXWLOL]DGRV WDGXUDQWHODLGHQWL¿FDFLyQGHORVHVSHFWURVGH en el análisis por espectrometría de masas, el análisis IUDJPHQWDFLyQ DOPHQRVPRGL¿FDFLRQHVYD- 2 de los datos generados aumenta sensiblemente en riables para S/T/Y en MS , y dos más para S/T 3 complejidad respecto a otros análisis proteómicos en MS ) y las características espectrales de los clásicos. Es por tanto necesario el establecimiento de fosfopéptidos (pérdida preponderante del grupo XQÀXMRGHWUDEDMRHVSHFt¿FRSDUDIRVIRSURWHyPLFD fosfato) facilitan la aparición de falsos positivos. con objeto de responder a las diversas necesidades La utilización de bases de datos señuelo nos per- que las técnicas involucradas requieren. mite obtener una estimación de la proporcion de falsos positivos en el conjunto de fosfopéptidos validados (FDR o False Discovery Rate) [4, 5]. 1. Peculiaridades de los datos obtenidos en 8QHOHPHQWRFODYHHQODDVLJQDFLyQGHSXQ- ODLGHQWL¿FDFLyQGHIRVIRSpSWLGRV WRVGHIRVIRULODFLyQHVODFRUUHFWDLGHQWL¿FDFLyQ En el analisis de fosfopéptidos mediante técni- GHODPLQRiFLGRPRGL¿FDGRFXDQGRH[LVWDPiV cas de shotgun proteomics deben tenerse en cuenta de una alternativa posible. En estos casos, los las siguientes consideraciones: buscadores en base de datos como SEQUEST, 80 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 3KHQ\[ X 2066$ VXHOHQ WHQHU GL¿FXOWDGHV FLyQ\FXDQWL¿FDFLyQGHIRVIRSpSWLGRVDVtFRPRHO para distinguir entre las distintos posiciones de almacenamiento de la información obtenida en cada fosforilación y pueden dar lugar a asignaciones paso en un único formato de almacenamiento llama- incorrectas. Por este motivo son precisos análi- do ³SKRV¿OH´. Dicho formato de almacenamiento VLVDGLFLRQDOHVHVSHFt¿FRVFRQREMHWRGHYDOLGDU permite una fácil conversión a formatos usables por estas asignaciones o corregirlas. Entre los méto- el investigador (ie. Excel) o la exportación de la in- dos descritos para estos análisis [6,7], uno de los formación a una base de datos como Lymphos [10]. más populares es la puntuación Ascore. Referencias 2. Formatos para el almacenamiento de información [1] Nesvizhskii A. I. and Aebersold, R.. Interpreta- tion of Shotgun Proteomic Data. The Protein Inference Problem. Mol. Cell Proteomics 2005; 4:1419-1440. >@ :LONLQV05$SSHO5'9DQ(\N-(HW al., Guidelines for the next 10 years of proteo- mics. Proteomics 2006; 6: 1, 4-8. [3] Reiter L, Claassen M, Schrimpf , S.P., et al. Pro- WHLQLGHQWL¿FDWLRQIDOVHGLVFRYHU\UDWHVIRUYHU\ large proteomics datasets generated by tandem mass spectrometry. Mol. Cell Proteomics 2009. [4] Elias, J.E. and Gygi, S.P. Target-decoy search VWUDWHJ\IRULQFUHDVHGFRQ¿GHQFHLQODUJHVFDOH SURWHLQLGHQWL¿FDWLRQVE\PDVVVSHFWURPHWU\ Nat. Methods 2007; 4: 207-214. [5] Xiuxia Du.et al. Linear Discriminant Analysis- Based Estimation of the False Discovery Rate IRU3KRVSKRSHSWLGH,GHQWL¿FDWLRQV-3URWHRPH Res. 2008 ; 7 : 2195-2203. [6] Beausoleil, S. A., Villen, J., Gerber, S. A., et al. A probability-based approach for high-throughput protein phosphorylation analysis and site localiza- Figura 1. ,QIRUPDFLyQJHQHUDGDHQHOÀXMRGHWUDEDMR\ tion. Nat. Biotechnol. 2006; 24: 1285-1292. contenida en el archivo de almacenamiento phosFile. [7] Ruttenberg, B.E., Pisitkun, T., Knepper, M.A. El formato estándard más utilizado para alma- and Hoffert, J.D. PhosphoScore: An Open- cenar la información analítica en proteómica es el Source Phosphorylation Site Assignment Tool XML. Uno de los estándares más recientes de archivo for MSn Data. J. Proteome Res. 2008; 7: 3054- XML para el almacenamiento de datos analíticos es 3059. el mzIdentML [8]. Sin embargo, la complejidad y [8] Orchard S, Jones P, Taylor C, et al. Proteomic diversidad de la información recopilada en un expe- data exchange and storage: the need for common rimento proteómico hacen que estos estándares sean standards and public repositories. Methods Mol KR\SRUKR\LQVX¿FLHQWHVSRUORTXHHVQHFHVDULR Biol. 2007; 367: 261-70. evaluar otras alternativas de almacenamiento. Por [9] Carrascal, M., Ovelleiro, D., Casas, V. et al. otra parte, es también importante establecer un pro- Phosphorylation Analysis of Primary Human cedimiento para la incorporación de la información T Lymphocytes Using Sequential IMAC and experimental utilizando diferentes MIAPE asociadas Titanium Oxide Enrichment. J. Proteome Res. al experimento, teniendo especial importancia aquí 2008; 7: 5167–5176. el modelo MIASPPE [9] (“Minimum Information About Sample Preparation for a Phosphoproteomics [10] Ovelleiro D, Carrascal M, Casas V and Abian J. Lym- Experiment”). En la Figura 1 se presenta el esquema PHOS: design of a phosphosite database of primary JHQHUDOGHOÀXMRGHWUDEDMRXWLOL]DGRHQODLGHQWL¿FD- human T cells. Proteomics 2009; 9: 3741-51. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 81 $SUR[LPDFLRQHVPHWRGROyJLFDVSDUDHOHVWXGLRGHOHVWDGRUHGR[ WLROGLVXOIXUR de proteínas en muestras vegetales Sira Echevarría-Zomeño1, Per Hägglund2 P, Birte Svensson2, Ana María Maldonado Alconada1, Jesús V. Jorrín Novo1 1 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Grupo de Bioquímica y Proteómica Vegetal y Agrícola, Universidad de Córdoba, España. 2 Department of Systems Biology, Technical University of Denmark, Lyngby, Denmark Resumen FRPRELRWLQDRVXVFRQMXJDGRVDQWtJHQRVRÀXRUR- FURPRV PRQREURPRELPDQHÀXRUHVFHtQD LLL SXUL- Para el estudio del estado redox (tiol-disulfuro) ¿FDFLyQRVHSDUDFLyQSRUFURPDWRJUDItDRHOHFWURIR- de las proteínas, se utilizan técnicas de bioquímica UHVLV\LY FXDQWL¿FDFLyQHLGHQWL¿FDFLyQPHGLDQWH clásica y de proteómica, incluidas aquellas de segun- análisis de imagen y espectrometría de masas. da generación (DIGE, ICAT), basadas en el marcaje HVSHFt¿FRGHUHVWRVGHFLVWHtQD'LFKDVWpFQLFDVGH Las técnicas de proteómica cuantitativa de segun- proteómica se han empezado a usar en el estudio de GDJHQHUDFLyQTXHLPSOLFDQHOPDUFDMHHVSHFt¿FRGH los mecanismos que median procesos de desarrollo y restos de cisteína, tales como DIGE o ICAT, se han respuesta a estreses en humanos, mamíferos, organis- empezado a utilizar en estudios del estado redox de mos modelo tales como Escherichia coli, y en menor proteínas en diversos sistemas como mamíferos [5], medida en plantas. Sin embargo, su potencial dista bacterias [6] y en menor medida, en plantas [7]. Para mucho de ser totalmente explotado. El objetivo de caracterizar el estado redox de las proteínas en Arabi- este trabajo es el de optimizar el uso de las técnicas dopsis thaliana, en nuestro grupo se están optimizan- DIGE e ICAT para el estudio del proteoma redox, uti- do las técnicas redox-DIGE y oxICAT. Estas técnicas lizando Arabidopsis thaliana como sistema modelo. se basan en el marcaje diferencial de los residuos oxi- La aplicación de estas técnicas ha puesto de mani- dados y los reducidos. En nuestro caso, este marcaje ¿HVWRVXXWLOLGDGSDUDODFDUDFWHUL]DFLyQGHOHVWDGR se llevó a cabo en la misma muestra, en lugar de en redox de las proteínas, pero también a demostrado la GRVPXHVWUDVGLIHUHQWHV(OÀXMRGHWUDEDMRVHJXLGRVH importancia de incluir en los experimentos controles detalla en la Figura 1. La preparación de la muestra adecuados para cada paso del protocolo. se llevó a cabo a pH ácido, lo que evita intercambios tiol-disulfuro y oxidaciones espontáneas, que se dan Se conoce como proteoma redox al conjunto de a pHs 7-9 [8]. Para poder utilizar los dos agentes proteínas susceptibles de cambiar su estado de oxido- en el mismo tubo de ensayo, fue necesario eliminar rreducción en respuesta a algún estímulo. Estas modi- el exceso de reactivo en cada paso del proceso. En ¿FDFLRQHVTXHDIHFWDQSULQFLSDOPHQWHDORVUHVLGXRV el experimento, se incluyeron controles en los que de cisteína, pueden ser irreversibles (como la oxida- las muestras se redujeron completamente desde el ción a ácido cisteico), lo que conlleva la pérdida de principio, de manera que sólo uno de los reactivos actividad biológica, o reversibles, en los que el grupo marcadores debería detectarse en los resultados. tiol se puede oxidar a puente disulfuro (cisteína-cis- WHtQD 'LFKDVPRGL¿FDFLRQHVUHYHUVLEOHVFRQVWLWX\HQ La aplicación de ambas técnica puso de ma- mecanismos de regulación de la actividad, vida media QL¿HVWRODXWLOLGDGGHODVPLVPDVSDUDGLVFULPLQDU y patrón de interacción de la proteína [1-4]. entre residuos oxidados y reducidos. Sin embargo, a la vista de los resultados de los controles con En un experimento típico dirigido a la caracteriza- PXHVWUDVUHGXFLGDV QRPRVWUDGRV ODH¿FLHQFLD ción del proteoma redox, se utilizan técnicas basadas del proceso de marcaje es menor de la esperada, HQJHO\FURPDWRJUi¿FDVHLQFOX\HQHWDSDVGHL H[- demostrando que la inclusión de este tipo de con- tracción proteica, ii) marcaje de tioles libres median- troles es de gran importancia para evaluar la validez te agentes tiol-reactivos (iodoacetamida, maleimida, del experimento y corregir el error generado por el glutatión) unidos a algún tipo de elemento marcador, marcaje residual. 82 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Figura 1. Esquema de las técnicas redox-ICAT (A) y redox-DIGE (B). Tras la extracción proteica, los marcajes se realizaron con ambos agentes en el mismo tubo de ensayo. Referencias [5] Hurd TR, Prime TA, Harbour ME, Lilley KS y Murphy MP. Detection of reactive oxygen [1] Forman HJ y Torres M. Redox signaling in species-sensitive thiol proteins by redox di- macrophages. Mol Aspects Med 2001;22:189- fference gel electrophoresis: implications for 216. mitochondrial redox signaling. J Biol Chem [2] Klatt P y Lamas S. Regulation of protein 2007;282:22040-51. function by S-glutathiolation in response to [6] Leichert LI, Gehrke F, Gudiseva HV, Blackwell oxidative and nitrosative stress. Eur J Biochem 7,OEHUW0:DONHU$.HWDO4XDQWLI\LQJ 2000;267:4928-44. changes in the thiol redox proteome upon oxi- [3] Bonetto V y Ghezzi P, 7KLROGLVXO¿GHR[LGRUHGXF- dative stress in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A tion of protein cysteines: old methods revisited for 2008;105:8197-202. proteomics en Redox Proteomics: from protein [7] Hagglund P, Bunkenborg J, Maeda K y Svensson PRGL¿FDWLRQVWRFHOOXODUG\VIXQFWLRQDQGGLVHDVHV %,GHQWL¿FDWLRQRIWKLRUHGR[LQGLVXO¿GHWDUJHWV (editores: Dalle-Donne Isabella, Scaloni Andrea using a quantitative proteomics approach based \%XWWHU¿HOG'$OODQ -2+1:,/(< 6216 RQLVRWRSHFRGHGDI¿QLW\WDJV-3URWHRPH5HV LTD.(2ª), Hoboken, New Jersey 2006, p. 976. 2008;7:5270-6. [4] Bardwell JC. Building bridges: disulphide >@ &UHLJKWRQ7('LVXO¿GHERQGIRUPDWLRQLQSUR- bond formation in the cell. Mol Microbiol teins. Methods Enzymol 1984;107:305-29. 1994;14:199-205. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 83 Deciphering the S-Nitrosylome of Arabidopsis thaliana during the defense response Ana M. Maldonado-Alconada1, Sira Echevarría-Zomeño1, Christian Lindermayr2, Jörg Durner2, Jesús V. Jorrín-Novo1 1Agricultural and Plant Biochemistry and Proteomics Research Group, Dept. of Biochemistry and Molecular Biology, University of Cordoba, Spain. 2Institute of Biochemical Plant Pathology, Helmholtz Zentrum München - German Research Center for Environmental Health, D-85764 Neuherberg, Germany The biological effects of nitric oxide (NO) are (500 µM) was used to generate S-nitrosothiols in mainly mediated through S-nitrosylation of cysteine vitro and the treatment with the reducing agent DTT WKLROV:HKDYHXVHGWKHELRWLQVZLWFKPHWKRGFRP- (20mM) was performed as a control that the labe- bined with mass spectrometry analysis to identify lling observed corresponds to originally S-nitrosyla- targets of S-nitrosylation in Arabidopsis thaliana ted proteins. Biotinylated proteins were visualized cell suspension cultures and leaves challenged with by immunoblotting using anti-biotin antibody and the pathogenic bacteria Pseudomonas syringae pv. ZHUHSXUL¿HGE\DI¿QLW\FKURPDWRJUDSK\RQDQHX- tomato. The NO targets belong to different functio- travidin matrix, and bound proteins were eluated nal categories, and include proteins previously with 100 mM β-mercaptoethanol. For protein iden- LGHQWL¿HGLQSODQWVDQGPDPPDOVDVZHOODVQRYHO WL¿FDWLRQWKHSXUL¿HGSURWHLQVZHUHWU\SVLQGLJHVWHG targets. Our data support the idea that NO orches- and subjected to LC/MS/MS analysis using a Sur- trates the whole plant physiology through covalent veyor/MicroAS HPLC system in tandem with an PRGL¿FDWLRQRISURWHLQV /74PDVVVSHFWURPHWHU 7KHUPR)LVKHU6FLHQWL¿F USA). The MS/MS spectra obtained were analysed One of the earliest events occurring in plants using the Bioworks 3.2 software (ThermoFisher following pathogen infection is a strong oxidative 6FLHQWL¿F86$ DQGWKH6(48(67VHDUFKHQJLQH burst and increases in the NO level being the co- (Thermo, MA), against a non-redundant NCBI and rrect intracellular balance between these molecules MSDB databases and their reverse, allowing for va- crucial for the establishment of resistance [1, 2]. ULDEOHF\VWHLQHPRGL¿FDWLRQE\β-mercaptoethanol The reversible covalent binding of NO to a speci- and organism restriction to Arabidopsis. The FDR ¿FF\VWHLQHUHVLGXH 6QLWURV\ODWLRQ LVWKHPDLQ value was adjusted to 1% taking as a reference the mechanism by which NO exerts its function and Xcorr values obtained from the search using the VHYHUDOFDQGLGDWHVKDYHEHHQLGHQWL¿HGLQSODQWV reverse database (DCn >0.1). [3, 4]. In order to uncover the role of this type of PRGL¿FDWLRQGXULQJEDVDOUHVLVWDQFH WKH¿UVWOLQHRI The results obtained indicate more intense labe- active defense in plants) and R-mediated resistance ling following P. syringae infection, especially those DVWURQJIRUPRIUDFHVSHFL¿FUHVLVWDQFH ZHDLP from PstavrRpt2- treated samples. In addition more to identify S-nitrosylated proteins in Arabidopsis 6QLWURV\ODWHGSURWHLQVZHUHSXUL¿HGIURPOHDYHV plants and cell extracts challenged with virulent Pst or cells challenged with P.syringae compared to and avirulent Pst avrRpt2. control and non-treated samples. This indicates that leaves and cells undergoing a defense reaction con- Protein extracts were subjected to the biotin tain higher levels of S-nitrosothiols, which is con- switch method converting S-nitrosylated Cys to sistent with the increased NO production during the biotinylated Cys [3]. Extracts (10 mg for protein incompatible interaction [2]. SXUL¿FDWLRQDQGµg for detection of biotinylated SURWHLQV ZHUH¿UVWLQFXEDWHGZLWKP0PHWK\O 7KH12WDUJHWSURWHLQVLGHQWL¿HGFRYHUED- methanethionsulfonate (MMTS) and 2.5% SDS for sically any process of cellular physiology and inclu- blocking free cys residues. Treatment with GSNO de cytoskeleton proteins (11%), enzymes involved 84 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 in carbon and nitrogen mobilization (41%), patho- $FNQRZOHGJHPHQWV gen- and stress-related proteins (10%), enzymes of the antioxidant defense system (6%) and signaling 7KLVZRUNZDVFDUULHGRXWZLWK¿QDQFLDOVX- and regulating proteins (14%). The majority of the pport from the Spanish “Ministerio de Educación NO targets were not exclusive to a given treatment, \&LHQFLD´3URMHFW%,2 :HWKDQN,Q- which is in agreement with the dynamic nature of maculada Redondo for her technical assistance.The S-nitrosylation, and suggests that the right balance MS analysis was conducted at the Proteomics Unit between both redox states are needed for the correct (SCAI) at Cordoba University. SEZ is supported by function of the protein. a by a grant from the the Spanish “Ministerio de Educación y Ciencia”. Comparison of S-nitrosylation targets in animal V\VWHPV>@ZLWKWKHSURWHLQVLGHQWL¿HGLQWKLV work and in previous studies in plants [4] reveals References common targets between animals and plants. About [1] Durner J and Klessig DF. Nitric oxide as a signal RIWKHSURWHLQVLGHQWL¿HGKHUHUHSUHVHQWQRYHO in plants. Curr Opin Plant Biol. 1999; 2: 369- potential targets for S-nitrosylation, while others 74. KDYHEHHQLGHQWL¿HGLQSUHYLRXVVWXGLHVLQDQLPDOV and plant systems. [2] Delledonne M, Zeier J, Marocco A and Lamb C. Signal interactions between nitric oxide and These results provide clues on the possible NO reactive oxygen intermediates in the plant hy- targets during basal and R-mediated resistance, and persensitive disease resistance response. Proc VXJJHVWWKDW12VSHFL¿FPRGL¿FDWLRQRIWKHVHHQ- Natl Acad Sci U S A. 2001; 98: 13454-9. zymes allows the coordinated modulation of redox [3] Lindermayr C, Saalbach G and Durner J. Pro- signalling and orchestrates the outcome of compa- WHRPLFLGHQWL¿FDWLRQRIVQLWURV\ODWHGSURWHLQV WLEOHDQGLQFRPSDWLEOHLQWHUDFWLRQV:KLOHZHDUH in Arabidopsis. Plant Physiol 2005; 137: 921- planning to identify the cys residues involved and 930. SHUIRUPPXWDWLRQDOVWXGLHVZLWKSXUL¿HGSURWHLQV [4] Lindermayr C and Durner J. S-Nitrosylation in and transgenic of selected candidates, we have plants: pattern and function. J Proteomics. 2009; conducted infection experiments with Arabidopsis 73:1-9. loss-of-function insertion mutants for redox- and defense-related genes. The differential behaviour [5] Hao G, Derakhshan B, Shi L, Campagne F and of these mutants from wild-type control plants in Gross SS. SNOSID, a proteomic method for both, compatible and incompatible interactions, and LGHQWL¿FDWLRQRIF\VWHLQH6QLWURV\ODWLRQVLWHVLQ the monitoring of the progress of disease symptoms complex protein mixtures. ProcNatl Acad Sci U provide evidence that these mutants are compro- S A. 2006; 103: 1012-1017. mised in the activation of basal and R-mediated [6] Martínez-Ruiz A and Lamas S. Detection and defense responses. proteomic identification of S-nitrosylated proteins in endothelial cells. Arch. Biochem. Biophys. 2004; 423: 192–199. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 85 Caracterización de S-glutationilación de proteínas a nivel de proteoma. 'L¿FXOWDGHV Esperanza Morato López1, Sira Echevarría Zomeño2, Anabel Marina Ramírez1 1 Servicio de Proteómica. C.B.M. “Severo Ochoa”. CSIC-UAM 2 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Universidad de Córdoba La S-glutationilación no solo es una respuesta SpSWLGRVLGHQWL¿FDGRVFRQXQ;FRUU!IXHPX\ celular al estrés oxidativo, también es un mecanis- similar (aproximadamente 200), así como fueron mo para la regulación postraduccional dinámica de similares los valores de este parámetro entre los proteínas reguladoras, estructurales y metabólicas. péptidos de ambas muestras. Analizamos de modo Estudios recientes han demostrado su implicación manual los espectros MS/MS con mejores puntua- en la regulación de la señalización y rutas metabó- FLRQHVVLQFRQ¿UPDUQLQJXQDJOXWDWLRQLODFLyQHQOD licas de sistemas celulares [1, 2]. Por todo ello se muestra NI, pero demostrando S-glutationilación están desarrollando métodos analíticos y proteómi- para la muestra NI+GSH. Las conclusiones prelimi- cos que permitan la caracterización de estas modi- nares de estos resultados son que este abordaje no ¿FDFLRQHVGRQGHODSULQFLSDOOLPLWDFLyQDQLYHOGH SHUPLWHOD³DXWRPDWL]DFLyQ´HQODLGHQWL¿FDFLyQGH espectrometría de masas que hemos encontrado en glutationilaciones en proteomas ya que no es posible nuestro laboratorio es la “calidad” de los espectros establecer un punto de corte, puesto que espectros de fragmentación MS/MS. con el mismo valor de Xcorr pueden ser asignados FRPRLGHQWL¿FDFLRQHVFRUUHFWDVRLQFRUUHFWDV(O Recibimos en nuestro laboratorio unas mues- estudio en profundidad de los espectros MS/MS da tras para la caracterización de glutationilaciones. una explicación a este hecho y es la “idiosincrasia” (OREMHWLYRGHOWUDEDMRHUDODLGHQWL¿FDFLyQGHVLWLRV GHORVPLVPRVSDUDHVWHWLSRGHPRGL¿FDFLyQ/D de glutationilación de proteínas en el proteoma de gran mayoría son especies M+3H+, probablemente Arabidopsis thaliana tras la infección con la cepa debido a que en el glutatión el enlace entre el as- no virulenta de Pseudomonas syringae. Disponía- pártico y la cisteína es tal que queda expuesto un mos del proteoma no infectado (NI), del proteoma nuevo extremo -NH2 susceptible de protonación. incubado 4 h con un placebo (MgCl) y del proteo- Esto acompleja el patrón de fragmentación a la par ma infectado 4 h con la cepa de P. syringae. De que, en péptidos grandes, se pierde la zona alta del cada proteoma disponíamos de tres condiciones: sin espectro (m/z > 2000). Son espectros con un alto agente reductor, tratada con glutatión (GSH) y tra- nivel de “background” cuando los valores de Xcorr tada con glutatión disulfuro (GSSH). Comenzamos no son > 4, y se asemejan mucho a espectros de el trabajo con las tres condiciones de la muestra NI, “contaminantes”. Este hecho hace que un espec- para lo cual confeccionamos tres geles SDS-PAGE, tro con mal aspecto que no se corresponda con el UHVSHFWLYDPHQWHFRQHO¿QGHGLJHULUODPXHVWUD péptido candidato tenga la misma puntuación, en en gel concentrador y, de esta manera, limpiar el ocasiones, que el que si se corresponde. Dentro del proteoma [3] (el tampón de muestra no contenía “background” podemos encontrar fragmentos proce- beta-mercaptoetanol ni DTT). Los péptidos obte- dentes del glutatión [4] como pérdida del glutámico, nidos tras las digestiones se analizaron mediante de todo el glutatión o de parte del mismo, pero no LC-MS empleando un espectrómetro de masas LTQ todos los fragmentos del espectro se pueden asignar 7KHUPR)LVKHU6FLHQWL¿F 3DUDODLGHQWL¿FDFLyQGH a este patrón extra de fragmentación. péptidos se empleó el software SEQUEST (Thermo )LVKHU6FLHQWL¿F LQFOX\HQGRODJOXWDWLRQLODFLyQ En consecuencia, las puntuaciones obtenidas FRPRPRGL¿FDFLyQYDULDEOH empleando SEQUEST son, mayoritariamente, ba- jos, aún en las asignaciones correctas, lo que hace Al analizar los resultados observamos un alto muy difícil establecer un criterio de calidad que es Q~PHURGHJOXWDWLRQLODFLRQHVLGHQWL¿FDGDVWDQWRHQ LPSUHVFLQGLEOHSDUDHOHVWXGLRGHPRGL¿FDFLRQHV la muestra NI como en la NI+GSH. El número de 86 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 a gran escala. El examen manual de los espectros regulatory device from bacteria to humans”. sería impensable, solo factible cuando estudiamos Trends in Biochemical Sciences 2008; 34, PRGL¿FDFLRQHVSDUDXQDSURWHtQD~QLFD 2:85-96. Quizás, un mayor conocimiento del mecanismo [3] Bonzon-Kulichenko E, Pérez-Hernández D, de fragmentación de estos péptidos pueda dar lugar Núñez E, Martínez-Acedo P, Navarro P, Trevi- san-Herraz M, Ramos MC, Sierra S, Martínez- DXQDPHMRUDHQODLGHQWL¿FDFLyQFRUUHFWDGHORV Martínez S, Ruiz-Meana M, Miró-Casas E, mismos y, de esta forma, hacer posible el estudio de García-Dorado D, Redondo JM, Burgos JS, HVWDPRGL¿FDFLyQDQLYHOGHSURWHRPD Vázquez J. “A robust method for quantitative high-throughput analysis of proteomes by 18O Referencias labeling”. Mol Cell Proteomics, 2009 (en revisión). [1] Dalle-Donne I, Rossi R, Giustarini D, Colombo >@ %RUJHV&5*HGGHV7-:DWVRQ-7.XKQ R, Milzani A. “S-glutathionylation in protein D.M. “Dopamine biosynthesis is regulated by UHGR[UHJXODWLRQ´)UHH5DGLFDO%LRORJ\ S-glutathionylation. Potential mechanism of Medicine 2007; 43:883-898. tyrosine hydroxylase inhibition under oxidative [2] Dalle-Donne I, Rossi R, Colombo G, Giustarini stress”. J Biol Chem 2002; 277:48295-48302. D, Milzani A. “Protein S-glutathionylation: a La inhibición de la síntesis de óxido nítrico durante la colestasis inducida experimentalmente reduce la lesión hepatocelular al facilitar la homeostasis de nitrosotioles Laura M. López-Sánchez1, Fernando J. Corrales2, Montserrat Barcos3, Isabel Espejo3, Juan R. Muñoz-Castañeda1, Antonio Rodríguez-Ariza1 1Hospital Universitario Reina Sofía. Unidad de Investigación, IMIBIC, Córdoba, 2Universidad de Navarra, Hepatology and Gene Therapy Unit, Pamplona, 3Hospital Universitario Reina Sofía. Servicio de Análisis Clínicos, Córdoba Introducción (SMT, 25 mg/Kg) o con ácido tauroursodeoxicólico (TUDCA, 50 mg/Kg). La función hepática y NO Las intervenciones que faciliten el metabolismo plasmático se analizaron mediante ensayos bioquí- del óxido nítrico (NO) en etapas colestásicas tempra- micos. La proliferación ductular se determinó en nas pueden ayudar a mantener el estado redox de las cortes teñidos con hematoxilina-eosina y se con- proteínas hepáticas. Además, escasos estudios han ¿UPyFRQLQPXQRWLQFLyQHVSHFt¿FD FLWRTXHUDWLQD explorado la participación de la S-nitrosilación de GHFRODQJLRFLWRVPDGXURV/D¿EURVLVKHSiWLFD proteínas y el metabolismo de nitrosotioles (SNO) se determinó mediante tinción con tricrómico de en la lesión hepatocelular por colestasis. Masson. Se analizó la expresión de la bomba ex- portadora de productos conjugados (Mrp2), afectada Metodología en diversos modelos experimentales de colestasis, mediante western blot, y la de iNOS y la enzi- 6HGLYLGLHURQUDWDVPDFKR:LVWDU J HQ PDQLWURVRJOXWDWLyQUHGXFWDVD *6125FRGL¿FDGD 4 grupos (n=10): operación simulada (OS), ligadura por el gen ADH5 en humanos) por RT-PCR. Las del conducto biliar (BDL), y ratas BDL tratadas SURWHtQDV6QLWURVLODGDVVHGHWHFWDURQ\SXUL¿FDURQ con el inhibidor de síntesis de NO S-metilisotiourea con el método “biotin-switch”, una aproximación 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 87 metodológica que permite el marcado selectivo de Después de 7 días, el inhibidor de iNOS fue las nitrosoproteínas con biotina, en el que los tioles mucho mas efectivo que TUDCA en reducir la le- libres se bloquean con metil metanotiosulfonato, a sión hepatocelular, con una disminución de enzimas continuación los SNO son reducidos selectivamente hepáticas y de bilirrubina circulantes (Figura 1) y FRQDVFRUEDWR\¿QDOPHQWHORVWLROHVQXHYDPHQWH XQJUDGRVLJQL¿FDWLYDPHQWHPHQRUGHSUROLIHUDFLyQ formados reaccionan con HPDP-biotina. Las pro- GXFWXODU\¿EURVLVSHULSRUWDO>@$PERVWUDWDPLHQ- teínas biotiniladas se detectaron mediante un anti- tos recuperaron los niveles basales del transportador FXHUSRDQWLELRWLQDRSXUL¿FDURQXWLOL]DQGRHVWUHS- canalicular Mrp2 cuya expresión se inhibe durante WDYLGLQD\VHLGHQWL¿FDURQSRUDQiOLVLVSURWHyPLFR la colestasis (Figura 2), pero sólo el tratamiento con HPLC acoplado a ESI-MS/MS. FRQ607GLVPLQX\yVLJQL¿FDWLYDPHQWHORVHOHYDGRV niveles plasmáticos de NO y de proteínas hepáticas S-nitrosiladas en las ratas BDL (Figuras 3 y 4). La Resultados expresión de GSNOR hepática, que regula la ho- meostasis de SNO y los niveles de proteínas S-nitro- siladas, mostró un acusado descenso en ratas BDL, que se recuperó tras el tratamiento con SMT, pero no FRQ78'&$ )LJXUD 6HLGHQWL¿FDURQSURWHt- nas hepáticas que se encontraban S-nitrosiladas en ratas BDL (Tabla 1), incluyendo enzimas mitocon- driales que participan en la síntesis de ATP y el me- tabolismo de ácidos grasos, dos procesos que se ven alterados en colestasis. Además, dos de las proteínas LGHQWL¿FDGDVIXHURQOD6DGHQRVLOPHWLRQLQDVLQWHWD- sa (también llamada metionina adenosiltransferasa, MAT), y la betaína-homocisteina S-metiltransferasa (BHMT), dos importantes enzimas implicadas en el ciclo de la metionina cuya alteración es frecuente- Figura 1. Marcadores séricos de función hepática en ratas mente observada en procesos colestásicos. BDL. )LJXUDProducción de NO y expresión del gen Nos2 en ratas BDL. Figura 2. Expresión de la proteína Mrp2 en ratas BDL. Figura 4. Detección de proteínas S-nitrosiladas en ratas BDL. *Lisado hepático incubado in vitro con GSNO. 88 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Tabla 1. 3URWHtQDV6QLWURVLODGDVLGHQWL¿FDGDVPHGLDQWH/&0606HQOLVDGRVGHKtJDGRVGHUDWDV%'/ Número de Número Cobertura de Nombre de la proteína Localización acceso NCBI de péptidos VHFXHQFLD Proteínas del citoesqueleto ĮDFWLQD P62738 1 10 Cit 7XEXOLQDFDGHQDȕ$ P04691 1 4 Cit Enzimas metabólicas S-adenosil metionina sintetasa tipo 1 P13444 1 6 Cit Aldehido deshidrogenasa, microsomal P30839 2 5 RE $73VLQWDVDVXEXQLGDGĮ P15999 1 2 Mit Betaina-homocisteina S-metil-transferasa 2 Q68FT5 1 4 Cit Carbamoil-fosfato sintasa 1 P07756 13 20 Mit Carboxilesterasa 3 precursor P16303 3 7 RE Dihidroxiacetona quinasa Q4KLZ6 2 6 RE 10-formiltetrahidrofolato deshidrogenasa P28037 2 3 Cit Fructosa-bifosfato aldolasa B P00884 3 11 Cit Glutamato deshidrogenasa 1 P10860 1 5 Mit Hidroximetilglutaril-CoA sintasa P22791 3 17 Mit 3-cetoacil-CoA tiolasa P13437 1 8 Mit L-lactato deshidrogenasa, cadena A P04642 1 6 Cit Acido graso CoA ligasa, cadena larga 1 P18163 2 9 Mit Malato deshidrogenasa P04636 1 21 Mit Piruvato carboxilasa mitocondrial precursor P52873 2 6 Mit Chaperonas moleculares +63 ȕ P34058 1 6 Cit PDI P04785 2 9 RE Riboforina 1 P07153 2 7 RE (Q]LPDVGHGHWR[L¿FDFLyQ Glutatión S-transferasa Mu 1 P04905 2 28 Cit Glutatión S-transferasa Mu 2 P08010 3 22 Cit Proteínas de señalización )DFWRUGHHORQJDFLyQĮ P62632 1 4 Cit Otras Albúmina de suero, precursor P02770 3 12 Sec 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 89 Figura 5. Actividad GSNOR hepática y expresión del gen Adh5 en ratas BDL. Conclusiones Referencias 1XHVWURVUHVXOWDGRVDSR\DQHOEHQH¿FLRWHUD- [1] López-Sánchez LM, Corrales FJ, Barcos M, Es- péutico de inhibir la síntesis de NO, en un contexto pejo I, Muñoz-Castañeda JR, Rodríguez-Ariza colestásico, al facilitar la homeostasis de nitroso- A. Inhibition of nitric oxide synthesis during tioles. y proporcionan dianas de S-nitrosilación que induced cholestasis ameliorates hepatocellular posibilitarán el desarrollo de nuevas terapias en do- injury by facilitating S-nitrosothiol homeos- lencias colestásicas. tasis. Lab Invest. 2009 Oct 5. DOI: 10.1038/ labinvest.2009.104. Agradecimientos Financiado por FIS PI 07/0159 90 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 'HVDUUROORGHPHWRGRORJtDVSDUDODGHWHFFLyQGHPRGL¿FDFLRQHVSRVWUDGXFFLRQDOHV HQFLVWHtQDV 6QLWURVLODFLyQ\R[LGDFLyQ PHGLDQWHDSUR[LPDFLRQHVSURWHyPLFDV EDVDGDVHQPDUFDMHÀXRUHVFHQWH\HOHFWURIRUHVLVELGLPHQVLRQDO Daniel Tello, Rubén Fernández-Rodríguez, Antonio Martínez-Ruíz Hospital Universitario de La Princesa, Madrid, España Las especies reactivas de oxígeno (ROS) y ni- se ha conseguido correlacionando el aumento en la trógeno (RNS) pueden jugar un papel fundamental VHxDOFRUUHVSRQGLHQWHDODÀXRUHVFHtQDFRQHOSD- en mecanismos de señalización celular en diversos trón de proteína total marcada con un reactivo que SURFHVRV¿VLRSDWROyJLFRV(QWUHORVPHFDQLVPRV detecta proteína total en solución neutra (Lucy-565), moleculares por los que actúan, van cobrando im- de forma que pudiéramos obtener ambos patrones SRUWDQFLDYDULRVWLSRVGHPRGL¿FDFLyQUHYHUVLEOH ÀXRUHVFHQWHVGHIRUPDVLPXOWiQHDHQHOPLVPRJHO en cisteínas entre ellas la nitrosilación, tiolación y formación de ácido sulfénico, además de la forma- Este tipo de metodología proteómica la estamos FLyQGHSXHQWHVGLVXOIXURHVSHFt¿FRV'HELGRDHOOR DSOLFDQGRDODGHWHFFLyQHLGHQWL¿FDFLyQGHSURWHt- en los últimos años se ha puesto gran interés en la QDVFRQFLVWHtQDVR[LGDGDVHQODUHVSXHVWD¿VLROyJLFD aplicación de diferentes métodos proteómicos para a hipoxia en diversos sistemas celulares. Se ha sus- ODGHWHFFLyQHLGHQWL¿FDFLyQGHHVWDVPRGL¿FDFLRQHV WLWXLGRHOPDUFDGRUÀXRUHVFHQWHPDOHLPLGDÀXRUHV- postraduccionales “nitroxidativas”. ceína por Bodipy-FL, el cual presenta carga neta neutra, con lo que se elimina el desplazamiento en la El método de “biotin switch” abrió paso a la migración de las proteínas en el isoelectroenfoque. LGHQWL¿FDFLyQSURWHyPLFDGHSURWHtQDV6QLWURVLOD- Para observar diferencias pequeñas entre diferentes GDV\VHKDPRGL¿FDGRGHVSXpVSDUDGHWHFWDURWUDV condiciones estamos aplicado una metodología ba- PRGL¿FDFLRQHVHQFLVWHtQDV'LFKRPpWRGRVHEDVD VDGDHQGRVÀXRUyIRURV/DVPXHVWUDVVHPDUFDQFRQ HQODVXVWLWXFLyQGHODPRGL¿FDFLyQ QLWURVRWLROR Bodipy-FL o Bodipy-TMR y se cargan en el mismo cisteína oxidada) por biotina, previa reducción es- gel bidimensional. Sin embargo, el análisis detallado SHFt¿FDGHOWLROR[LGDGR DVFRUEDWRHQHOFDVRGH de los resultados en ambos esquemas, para relacio- nitrosotioles y DTT en el caso de cisteínas oxida- narlos con el patrón de proteína total, requiere de un das). Una evolución del clásico “biotin switch” es el cambio en los protocolos de análisis respecto a los GHQRPLQDGR³ÀXRUHVFHQFHVZLWFK´HQHOFXDOVHKD paquetes de software preparados para los esquemas VXVWLWXLGRODELRWLQDSRUXQÀXRUyIRURFRQFDSDFLGDG habitualmente utilizados. para reaccionar con tioles libres. +HPRVGHVDUUROODGRXQPpWRGRGH³ÀXRUHVFHQFH Referencias VZLWFK´FRQPDOHLPLGDÀXRUHVFHtQDFRPRPDUFD- dor, y empleando electroforesis bidimensionales, [1] Tello D, Tarín C, Ahicart P, Bretón-Romero R, SDUDODLGHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDV6QLWURVLODGDVOR /DPDV60DUWtQH]5XL]$$³ÀXRUHVFHQFH TXHQRVKDSHUPLWLGRLGHQWL¿FDUSURWHtQDVVHQVLEOHV switch” technique increases the sensitivity a nitrosocisteína (CysSNO) en células endoteliales RISURWHRPLFGHWHFWLRQDQGLGHQWL¿FDWLRQRI S-nitrosylated proteins. Proteomics 2009; in y denotar la importancia de la ruta de la tiorredoxina press. Published online with DOI 10.1002/ reductasa en la eliminación de nitrosotioles en ma- pmic.200900070. FUyIDJRVDFWLYDGRV>@(QHVWHFDVRODLGHQWL¿FDFLyQ 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 91 $QDO\VLVRIUHYHUVLEOHDQGLUUHYHUVLEOHSURWHLQPRGL¿FDWLRQVXSRQR[LGDWLYHVWUHVV in Schizosaccharomyces pombe by proteomic approaches Sarela García-Santamarina, Susanna Boronat, Elena Hidalgo Departament de Ciències Experimentals i de la Salut. Universitat Pompeu Fabra · -. Reactive oxygen species (ROS) (H2O2, OH , O2 ) By 1D electrophoresis, we observe that rever- generated as a consequence of the oxygen metabolism VLEOHGLVXO¿GHERQGIRUPDWLRQLVLQFUHDVHGXSRQ in aerobic organisms, have important roles in cell sig- both stresses, and in the case of H2O2 treatment, nalling. However, if they reach concentrations beyond the kinetics correlates with oxidative activation of homeostatic levels they generate a situation of oxida- the S. pombe H2O2VHQVRU3DS:HDOVRVKRZKRZ tive stress where damages to cellular components are shifting the growth of the mutant strains from an produced. In the case of H2O2, even physiological le- anaerobic condition to an aerobic one results in vels may produce a chronic low level of stress, which differential irreversible carbonylation of proteins. progressively drives the cell into the aging process. :HDUHH[WHQGLQJWKHVHVWXGLHVWRWKHSURWHRPHOHYHO WRLGHQWLI\WKHWDUJHWSURWHLQVRIERWKVWUHVVHV:H In order to understand the consequences of an KDYHHVWDEOLVKHGDPRGL¿FDWLRQRIWKH,&$7SUR- oxidative stress situation in the cell, it is important WRFROWRTXDQWLI\WKHH[WHQWRIUHYHUVLEOHPRGL¿HG to unravel which are the primarily biological targets cysteines. In addition, we have established a 2D of ROS and which are the consequences of such electrophoresis approach to identify targets of car- reactivity. Here we report the study of different ty- ERQ\OPRGL¿FDWLRQVSURGXFHGE\R[LGDWLYHVWUHVV SHVRIPRGL¿FDWLRQVWKDW526SURGXFHLQSURWHLQVLQ This would allow us to study the consequences of Schizzosacharomyces pombe, under exogenous oxi- LUUHYHUVLEOHDQGUHYHUVLEOHSURWHLQPRGL¿FDWLRQVDQG dative stress, by adding H O to the culture media, 2 2 their biological relevance after situations of intrinsic and also under endogenous oxidative stress, using and extrinsic oxidative stresses. mutant strains defective for ROS scavengers. La lipoproteína lipasa de rata se nitra in vivo en respuesta a la administración de lipopolisacárido Albert Casanovas1, Montserrat Carrascal2, Joaquín Abián2, Miquel Llobera1, M. Dolores López- Tejero1 1Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, Facultat de Biologia, Universitat de Barcelona, Barcelona, España. 2CSIC/UAB Proteomics Laboratory, IIBB-CSIC-IDIBAPS, Universitat Autònoma de Barcelona, Bellaterra, España. La lipoproteína lipasa (LPL) juega un papel (LPS) provoca una inhibición de la actividad LPL central en el metabolismo lipídico hidrolizando los tisular a nivel postranscripcional [1,2] y un aumento triacilgliceroles (TAG) plasmáticos. Una de las res- de la producción de óxido nítrico (NO). Estudios puestas metabólicas características a la infección es anteriores han propuesto una relación causa/efecto la hipertrigliceridemia, que es consecuencia, al me- entre el aumento de la síntesis de NO y la dismi- nos en parte, de la disminución de la actividad LPL nución de actividad LPL tisular [2] aunque no se de los tejidos. La administración de lipopolisacárido ha determinado si esta interacción es directa o está 92 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 mediada por otros factores. En este trabajo hemos alta para este modo de barrido. Este análisis permitió estudiado la potencial nitración in vivo de la LPL en detectar 8 residuos nitrados in vitro en la LPL bovina respuesta a la administración de LPS en rata. (Figura 1). El alto grado de homología entre la LPL bovina y la de rata permitieron el uso de los espectros La administración de LPS produce un aumento MS/MS de péptidos nitrados de la LPL bovina como de los TAG circulantes, de la expresión de la óxido espectros de referencia para el análisis de una poten- nítrico sintasa inducible, de la producción de NO y cial nitración in vivo de la LPL de rata en respuesta a una disminución generalizada de la actividad LPL en la administración de LPS. Para el estudio de la LPL tejidos. De manera preliminar evaluamos la sensibi- GHUDWDPHGLDQWHKHUUDPLHQWDVSURWHyPLFDVSXUL¿FD- lidad de la LPL a la nitración, tratando in vitro LPL mos parcialmente la enzima a partir de homogenado bovina con peroxinitrito, una especie reactiva del GHFRUD]yQPHGLDQWHFURPDWRJUDItDGHD¿QLGDGDKH- QLWUyJHQR 516 /DQLWUDFLyQGHWLURVLQDVVHKDGH¿- parina-Sepharose y resolvimos isoformas de pI de la nido como un marcador de la interacción de proteínas LPL mediante electroforesis en 2 dimensiones, como con RNS. Así, la nitración de la LPL bovina tratada describimos en trabajos anteriores [3]. Las isoformas con peroxinitrito se determinó mediante Western blot de pI de la LPL se recortaron del gel, se digirieron DQWLQLWURWLURVLQD\PHGLDQWHODLGHQWL¿FDFLyQSRU con tripsina y los péptidos obtenidos se analizaron espectrometría de masas en tándem (MS/MS) de mediante MS/MS secuencial siguiendo una lista de VHFXHQFLDVHVSHFt¿FDVGHOD/3/TXHFRQWHQtDQWLUR- LRQHVSUHGH¿QLGD )LJXUD (VWHDQiOLVLVOOHYyDOD sinas nitradas. Para la localización de nitrotirosinas LGHQWL¿FDFLyQGHWUHVUHVLGXRVGHWLURVLQDQLWUDGRVin mediante espectrometría de masas se compararon vivo (en las posiciones 94, 164 y 316) en la LPL de tres estrategias distintas de fragmentación MS/MS: corazón de rata tratada con LPS (Figura 1). (1) MS/MS dependiente de datos de los péptidos más abundantes, (2) MS/MS dependiente de datos de (VWHHVWXGLRHVHOSULPHURHQLGHQWL¿FDUUHVLGXRV SpSWLGRVSUHVHQWHVHQXQDOLVWDGHLRQHVSUHGH¿QLGD nitrados en la LPL, tanto in vivo como in vitro, y y (3) MS/MS secuencial siguiendo una lista de iones demuestra que la LPL es una diana de las RNS en el SUHGH¿QLGD )LJXUD contexto de la endotoxemia [4]. Así, estos resultados sugieren que la nitración puede constituir un meca- nismo nuevo de regulación de la actividad LPL ti- sular y abren las puertas a futuros estudios dirigidos DODQiOLVLVGHHVWDPRGL¿FDFLyQHQRWUDVVLWXDFLRQHV en las que se ha propuesto que la LPL puede estar regulada por NO. Referencias [1] Gouni I, Oka K, Etienne J y Chan L. Endotoxin- induced hypertriglyceridemia is mediated by Figura 1. Alineación de las secuencias de la LPL bovina y suppression of lipoprotein lipase at a post-tran- de rata y localización de las tirosinas nitradas detectadas. scriptional level. J Lipid Res 1993;34:139-46. En la secuencia se indican las tirosinas nitradas detectadas [2] Picard F, Kapur S, Perreault M, Marette A y HQOD/3/ERYLQD SXQWDVGHÀHFKDQHJUDV \HQOD/3/GH Deshaies Y. Nitric oxide mediates endotoxin- UDWD SXQWDVGHÀHFKDEODQFDV XWLOL]DQGRXQDHVWUDWHJLDGH fragmentación MS/MS secuencial sobre un listado de iones induced hypertriglyceridemia through its action SUHGH¿QLGR(QJULVVHLQGLFDODPi[LPDFREHUWXUDHVSHUD- on skeletal muscle lipoprotein lipase. FASEB J ble con el listado de iones barridos, mientras que la cober- 2001;15:1828-30. tura detectada experimentalmente se muestra en negrita. El [3] Casanovas A, Carrascal M, Abián J, López-Te- péptido señal se indica en cursiva. Los aminoácidos están numerados empezando por el extremo N-terminal de la pro- jero MD y Llobera M. Discovery of lipoprotein teína madura. LPLb, LPL bovina; LPLr, LPL de rata. lipase pI isoforms and contributions to their cha- racterization. J Proteomics 2009;72:1031-9. La primera estrategia de fragmentación ofreció la [4] Casanovas A, Carrascal M, Abián J, López- máxima cobertura de secuencia, mientras que el ter- Tejero MD y Llobera M. Lipoprotein lipase is cer método permitió detectar un mayor número de nitrated in vivo after lipopolysaccharide challen- tirosinas nitradas, mostrando una sensibilidad más ge. Free Radic Biol Med 2009;47:1553-60. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 93 Application of iTRAQ reagents to relatively quantify the reversible redox state of cysteines Brian McDonagh, C. Alicia Padilla, J. Antonio Bárcena Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Córdoba, Instituto Maimónides de Investigación Biomédica de Córdoba (IMIBIC), Spain The dynamic nature of the proteome ensures that relative quantity of a protein between two samples the cell is able to respond to environmental, genetic, does not tell us anything about the functional state biochemical and pathological perturbations. How of the protein itself, this is especially important in the proteome responds to these stimuli is of con- reference to redox proteins that contain thiol swit- siderable interest as it can relate to the cells stress ches and are susceptible to activation or inactiva- response and can take the form of post-translational WLRQ:HKDYHXVHGWKHUHGR[VHQVLWLYH\HDVWHQ]\PH PRGL¿FDWLRQVDQGLQWHUSURWHLQLQWHUDFWLRQVZLWK alcohol dehydrogenase, which has a decrease in the subsequent effects on translation and transcription. number of free thiols and loss of activity in response Improvements in mass spectrometry has lead to the to oxidative stress. This protein contains two cystei- development of a number of techniques to quantify ne containing tryptic peptides that are amenable to the abundance of proteins within any given sample, 06DQDO\VLV:HKDYHDSSOLHGL75$4WHFKQRORJ\ WKHVHLQFOXGHLVRWRSHFRGHGDI¿QLW\WDJV ,&$7 to these peptides to relatively quantify the reversible stable isotope labelling of amino acids in cell cul- redox state of cysteine peptides both in a control and ture (SILAC) isobaric tags for relative and absolute test state, in a single analysis. TXDQWL¿FDWLRQ L75$4 +RZHYHUPHDVXULQJWKH 94 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 4. PROTEÓMICA CUANTITATIVA Coordinadores: Miren J. Omaetxebarría y Eva Rodríguez-Suárez Soluciones a Retos Analíticos en Proteómica Cuantitativa y Validación de Biomarcadores Isidro Masana Agilent Technologies – Barcelona /DFXDQWL¿FDFLyQGHSpSWLGRV\SURWHtQDVHVWiDG- 2º Al efectuar MS/MS en el espacio, la sensibili- quiriendo cada vez una mayor importancia en proteó- dad del proceso de detección en un QqQ no se mica. A medida que se van descubriendo potenciales ve reducida por la coelución con otros péptidos FDQGLGDWRVDELRPDUFDGRUHVVXFRQ¿UPDFLyQ\YDOLGD- mayoritarios. Con respecto a sistemas basados ción -cada vez más- requiere herramientas analíticas HQUHDOL]DU0606HQHOWLHPSR FRQ¿QDPLHQWR FDSDFHVGHFXDQWL¿FDUGHFHQDVFHQWHQDVGHSpSWLGRV atrapado temporal de los iones en un espacio), concretos, en un gran número de muestras con muy los QqQ proporcionan una mayor y más robusta elevada sensibilidad y reducido tiempo de análisis. sensibilidad - menos “entorno dependiente”- La nano-cromatografía líquida acoplada a espectro- pues ésta sólo se ve afectada por cambios en la metría de masas con la tecnología de triple cuadru- respuesta debida a interacciones en el proceso de polo (nano-LC/MS-QQQ) en su modalidad de MRM ionización de péptidos coeluyentes. En sistemas (“Multiple Reaction Monitoring”) proporciona hoy EDVDGRVHQHOFRQ¿QDPLHQWRGHLRQHVDGHPiV en día la mayor sensibilidad, robutez y selectividad es habitual perder sensibilidad en la detección SDUDODFXDQWL¿FDFLyQGH³FRPSXHVWRVGLDQD´ ³WDUJHW de péptidos minoritarios cuando éstos coeluyen compounds”) en muestras complejas. La modalidad con otros de mayoritarios o contaminantes del MRM también ofrece una alta precisión y un tiempo sistema; éstos generan una saturación de cargas GHFLFORPX\UiSLGRSDUDSRGHUFXDQWL¿FDUKDVWDXQRV en el espacio de atrapado de los iones que redu- pocos miles de péptidos en un solo análisis. Todo ello ce la sensibilidad (por reducción en el tiempo de la convierte en la tecnología ideal para aplicaciones acumulación o cambio en la m/z medida). cuantitativas y especialmente para la validación de marcadores biológicos con alto rendimiento. 'HVGHHOSXQWRGHYLVWDFURPDWRJUi¿FRORVVLV- temas basados en nano-cromatografía (como p.e. el sistema HPLC-Chip/MS) [1] serán los que mayor Retos analíticos: elevada sensibilidad sensibilidad proporcionen. Una buena cromatografía será también importante para minimizar las posibles Comparando equipos de igual gama, los QqQ en supresiones en la ionización, y reducir así efectos MRM son capaces de proporcionar sensibilidades del adversos de la matriz de la muestra o coeluciones orden de 20 veces mejores que otros sistemas de MS/ con péptidos mayoritarios. Otra posibilidad es la de MS que siempre proporcionan el espectro completo. utilizar sistemas de preconcentración selectiva del &RQ4T4VHSXHGHQOOHJDUDFXDQWL¿FDUGHVGHQLYHOHV tipo de péptidos de interés; destaca el nuevo HPLC/ muy bajos de atomoles con buena repetibilidad (Fi- Fosfo-Chip [2-3] que incluye una precolumna de gura 1). Su mayor sensibilidad se debe a: óxido de titanio y permite automatizar la precon- 1º La total focalización de la detección por MRM centración selectiva de los péptidos fosforilados y en sólo los iones precursores y producto de inte- su análisis por separado del resto de péptidos no rés (estos se irán programando en el tiempo). fosforilados (que suelen estar presentes a concen- traciones mucho más elevadas). 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 95 Figura 1. &XDQWL¿FDFLyQFRQ7ULSOH&XDGUXSRORGHDPRODIPROGHSHUR[LGDVDHQVXHURKXPDQR MRM péptido ALELFR2+ (480.3 Î 630.4). Desde el punto de vista de preparación de mues- QDQRÀXMRORVEDVDGRVHQGLYLVLyQGHÀXMRVXHOHQVHU WUDVXDGHFXDGDVLPSOL¿FDFLyQD\XGDDPHMRUDUPX\ los que proporcionan volúmenes de retardo del gra- considerablemente la sensibilidad. Eliminar proteínas diente más pequeños (en algunos sólo unos pocos mayoritarias [4], fraccionar las proteínas o péptidos centenares de nL) y permiten análisis más rápidos. por pI (Offgel Electroforesis) [5], por cromatografía (mRP-C18, SCX,..) o con los tradicionales geles son Otro punto a considerar es la rapidez del detec- herramientas todas ellas muy útiles. Eliminar las 14 WRU3DUDXQDEXHQDFXDQWL¿FDFLyQVHUHTXHULUiQXQRV proteínas mayoritarias~94% proteína total (Hu-14 10-15 puntos de medida a lo largo del pico (mínimo Column) y luego fraccionar la fracción de proteínas HQIXQFLyQGHODQFKRGHOSLFRFURPDWRJUi¿- minoritarias por pI con un sistema de Offgel Electro- FR\GHOQGHSpSWLGRVFRHOX\HQWHVDFXDQWL¿FDUVH foresis, que permite recoger directamente la muestra SRGUiGH¿QLUHOWLHPSRPi[LPRGHPRQLWRUL]DFLyQ en solución líquida (compatible con LC/MS) con de cada transición. Los QqQ más rápidos permiten elevada resolución (hasta 0,1 unidades pI), es muy medir hasta +200 transiciones MRM distintas por útil para separar isoformas y facilitar el estudio de segundo, unas 20 veces más rápido que el resto de PRGL¿FDFLRQHVSRVWWUDGXFFLRQDOHV sistemas MS/MS que, a lo sumo, suelen llegar a 10 MS/MS por segundo y limitan el nº de péptidos FRHOX\HQWHVTXHVHSXHGHQFXDQWL¿FDU Retos Analíticos: Rapidez La elevada variabilidad de los sistemas bioló- Referencias gicos conlleva tener que evaluar un elevado nº de individuos de cada una de las poblaciones sujetas a [1] Fortier M, Bonneil E, Goodley P, Thibault P. - estudio, que exigirá el uso de métodos optimizados ,QWHJUDWHG0LFURÀXLGLF'HYLFHIRU0DVV6SHF trometry-Based Proteomics and Its Application SDUDXQDQiOLVLVUiSLGRUREXVWR\FRQVX¿FLHQWHVHQ- to Biomarker Discovery Programs. Anal. Chem. sibilidad de los péptidos de interés. Para ello convie- 2005; 77: 1631-1640. ne disponer de sistemas de nano-cromatografía rá- pidos; capaces de proporcionar un mínimo volumen >@ 0RKDPPHG6.UDLF]HN.3LQNVH0:/HPHHU de retardo del gradiente, para evitar que el cambio S, Benschop JJ, Heck AJ. Chip-Based Enrich- de composición del eluyente tarde mucho tiempo ment and NanoLC-MS/MS Analysis of Phos- (5-10min) en llegar a columna y retrase todo el SKRSHSWLGHVIURP:KROH/\VDWHV-3URWHRPH cromatograma (primeros péptidos eluyendo al cabo Res. 2008; 7(4): 1565-71. de 10-15min). De los diversos tipos de sistemas de [3] Raijmakers R, Mohammed S, J.R Heck A. 96 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Lin D., Masana I., HPLC-FosfoChip: análisis [5] Hubner N.C., Ren S., Mann M. Peptide separa- selectivo de Fosfopéptidos por LC/MS. Lifes- tion with immobilized pI strips is an attractive al- cienceslab 2009; 5 :30-35. ternative to in-gel protein digestion for proteome analysis. Proteomics 2008; 8(23-24):4862-72. [4] Björhall K, Miliotis T, Davidsson P. Comparison of different depletion strategies for improved re- [6] Kandasamy K, Pandey A, Molina H. Evalua- solution in proteomic analysis of human serum. tion of Several MS/MS Search Algorithms for Proteomics 2005; 5: 307–317. ETD Experiments. Anal. Chem. 2009: 81 (17): 7170–7180. /XFHV\VRPEUDVGHODFXDQWL¿FDFLyQFRQL75$4 María Luz Valero, Virginia Rejas, Manuel Mateo Sánchez del Pino Laboratorio de Proteómica. Centro de Investigación Príncipe Felipe. Avda. Autopista del Saler 16. 46012 Valencia /DFXDQWL¿FDFLyQGHODVGLIHUHQFLDVHQWUHGRV problemas debidos al exceso de reactivos, como la RPiVHVWDGRV¿VLROyJLFRVGHXQVLVWHPDELROyJLFR formación de precipitados y la obturación de los es una de las tareas más importantes y difíciles en VLVWHPDVFURPDWRJUi¿FRV proteómica. En los últimos años se están desa- Una vez elegidas y disponibles las muestras a UUROODQGRPpWRGRVGHFXDQWL¿FDFLyQEDVDGRVHQOD espectrometría de masas como complemento a las analizar hemos de ponerlas en un medio adecuado técnicas más clásicas basadas en 2D PAGE. Los para el análisis. En general, la precipitación es el métodos más populares utilizan marcajes isotópicos método más usado en este paso. Para la elección del medio para redisolver las proteínas hay que tener en diferenciales siendo uno de los más utilizados el cuenta que sea compatible con los tratamientos de sistema iTRAQ (Applied Biosystems). reducción, alquilación y digestión. Además, para Para obtener la máxima información de un experi- el marcaje posterior ha de evitarse la presencia de mento iTRAQ es fundamental un adecuado diseño del aminos reactivos en el medio y de otros posibles mismo. Según el problema biológico que queramos QXFOHy¿ORVFRPRWLROHV&RQHVWDVUHVWULFFLRQHVHQ abordar será necesario utilizar un número de replicas ocasiones es difícil disolver la muestra, siendo ne- ELROyJLFDVVX¿FLHQWHSDUDGLVFHUQLUODVYDULDFLRQHVLQ- cesaria una puesta a punto para cada tipo de extracto trínsecas a la muestra [1; 2] de las debidas al problema proteico. Tras disolver la muestra es necesario reali- biológico en estudio. En el caso de experimentos com- ]DUXQDFXDQWL¿FDFLyQ¿DEOHGHODFDQWLGDGWRWDOGH plejos con elevado número de réplicas que impliquen proteína presente en cada muestra. varios experimentos iTRAQ será necesario introducir en todos los experimentos un estándar interno que permita posteriormente un análisis global de todas las Marcaje y separación de los péptidos muestras presentes en el estudio. Las muestras marcadas diferencialmente se combinan y se elimina el exceso de reactivos y com- Preparación de la muestra puestos que podrían potencialmente interferir con la cromatografía líquida o el análisis de MSMS de los Una vez se dispone de un diseño experimental péptidos. En la mayoría de aplicaciones es necesa- claro el primer paso es la preparación de las mues- rio prefraccionar la mezcla de péptidos ya que las tras. En nuestra experiencia es mejor partir de la muestras suelen ser demasiado complejas para un mayor cantidad de proteína recomendada para evitar único análisis LCMSMS. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 97 Hay diferentes métodos de separación de pépti- 3RURWURODGRDOUHDOL]DUODFXDQWL¿FDFLyQKDGH dos que pueden aplicarse en este punto. La elección tenerse en cuenta que se ha podido introducir un de uno u otro dependerá del tipo de péptidos que error experimental diferente en la manipulación de queramos separar y de la disponibilidad de equipos. cada muestra, así como la pureza de los distintos En el laboratorio habitualmente realizamos croma- reactivos usados. Ha de comprobarse también que tografía C18RP a pH básico [3; 4], cromatografía QRVHKDQXWLOL]DGRSDUDFXDQWL¿FDUSpSWLGRVTXH SCX y, más recientemente, también mediante IEF pertenezcan a varias proteínas (isoformas) o cuya [5] en gradientes de pH inmovilizados (3-10NL, asignación sea dudosa. 7 cm, GE). En todos los casos se prefraccionan de 200 a 400 µg de péptidos y suele ser necesario una Si todo esto se realiza adecuadamente la técnica tratamiento posterior de limpieza y/o concentración nos permitirá disponer de un elevado número de antes del análisis por LCMSMS. SURWHtQDVFXDQWL¿FDGDVHQXQSHULRGRGHWLHPSR razonable. Fragmentación de los péptidos Referencias Para el análisis por MSMS de los péptidos mar- cados es necesario ajustar los parámetros respecto >@ $QGHUVRQ1/ $QGHUVRQ1*7KHKXPDQ plasma proteome: history, character, and diag- a los que utilizaríamos para los péptidos no mar- nostic prospects. Mol Cell Proteomics 2002; cados. En el caso de los espectrómetros de masas 1: 845-67. QTOF de ABI (QStar) este ajuste es muy sencillo, y consiste en incrementar los valores de intercept de [2] Molloy MP, Brzezinski EE, Hang J, McDowell la ecuación |CE|0=(slope)*(m/z)+(intercept) usada 07 9DQ%RJHOHQ5$2YHUFRPLQJWHFKQLFDO para calcular la energía de colisión para cada ión. El variation and biological variation in quantitative incremento es mayor para los péptidos derivatizados proteomics. Proteomics 2003; 3: 1912-9. con iTRAQ 4 plex que con iTRAQ 8plex. Con otro >@ 'RZHOO-$+H\GHQ:9 /L/5DWQHXURSHS- tipo de espectrómetros de masas su puesta a punto tidomics by LC-MS/MS and MALDI-FTMS: es más compleja [6]. Enhanced dissection and extraction techniques coupled with 2D RP-RP HPLC. Journal of pro- teome research 2006; 5: 3368-75. Análisis de resultados [4] Tenorio-Laranga J, Valero ML, Mannisto PT, Con los péptidos analizados se ha de proceder 6DQFKH]GHO3LQR0 *DUFLD+RUVPDQ-$ DODLGHQWL¿FDFLyQ\FXDQWL¿FDFLyQGHODVSURWHtQDV Combination of snap freezing, differential pH presentes en las muestras. El hecho de que ambas two-dimensional reverse-phase high-perform- determinaciones se realicen simultáneamente su- ance liquid chromatography, and iTRAQ tech- pone una gran ventaja respecto a los sistemas de nology for the peptidomic analysis of the effect FXDQWL¿FDFLyQEDVDGRVHQODVHSDUDFLyQGHODVSUR- of prolyl oligopeptidase inhibition in the rat brain. Analytical biochemistry 2009; 393: 80-7 WHtQDVHQJHO/DLGHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDVVHKDFH de manera convencional indicando simplemente la [5] Cargile BJ, Sevinsky JR, Essader AS, Ste- PRGL¿FDFLyQTXtPLFDXWLOL]DGD SKHQVRQ-/-U %XQG\-/,PPRELOL]HGS+ JUDGLHQWLVRHOHFWULFIRFXVLQJDVD¿UVWGLPHQVLRQ (OKHFKRGHTXHODFXDQWL¿FDFLyQVHUHDOLFHD separation in shotgun proteomics. J Biomol Tech nivel de MSMS hace que las relaciones S/N sean 2005; 16: 181-9. mejores. En este punto cabe destacar que según el [6] Bantscheff M, Boesche M, Eberhard D, Matthie- instrumento utilizado en el análisis el rango lineal VRQ76ZHHWPDQ* .XVWHU%5REXVWDQGVHQ- para la determinación de estas áreas será diferente. VLWLYHL75$4TXDQWL¿FDWLRQRQDQ/742UELWUDS 3DUDODFXDQWL¿FDFLyQVHXWLOL]DQWRGRVORVHVSHFWURV mass spectrometer. Mol Cell Proteomics 2008; DVLJQDGRVDSpSWLGRVFRQXQDFRQ¿GHQFLDDGHFXDGD 7: 1702-13. y en los que haya sido posible medir las áreas de los iones reporteros con bajo error. 98 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 iTRAQ-based quantitative analysis of protein mixtures with large fold change and dynamic range Juan Casado-Vela1, María José Martínez-Esteso2, Eva Rodriguez1, Eva Borrás3, Felix Elortza1, Roque Bru-Martínez2 1Proteomics Platform. CIC bioGUNE, CIBERehd, ProteoRed. Technology Park of Bizkaia, Building 800. Derio, Spain. 2Grupo de Proteómica y Genómica Funcional de Plantas. Departamento de Agroquímica y Bioquímica. Facultad de Ciencias. Universidad de Alicante. Spain. 3Servicio Proteómica. Universidad Pompeu Fabra. Parc de Recerca Biomèdica de Barcelona. Dr Aiguader 88. 08003 Barcelona, Spain Quantitation of changes in protein abundance is key to discovering novel biomarkers. Currently, reverse phase liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) can be used to quantify changes in protein expression levels. Nevertheless, quantitative analysis of protein mixtures by HPLC-MS/MS is still hampered by the wide range of protein expression levels, the high dy- namic range of protein concentrations and the lack of reliable quantitation algorithms. In this context, we describe two different samples (4-protmix and 8-protmix) suitable for relative protein quantitation using isobaric Tags for Relative and Absolute Quan- Figure 1. Schematic view of the preparation of the titation (iTRAQ). Using the 4-protmix, relative pro- 4-protmix. tein changes of up to 24-fold were measured. The 8-protmix allowed the quantitation of the relative protein changes in a mixture of proteins within the range of two orders of magnitude in concentration and 10-fold differences in relative abundance. The two reference samples proposed here (4-pro- tmix and 8-protmix) cover a wide range of protein fold changes and protein concentrations, respecti- vely, which can be used to optimize the settings used during acquisition with different mass spectrometers and to test the performance of different quantitation algorithms used for iTRAQ experiments. Three technical replicates corresponding to 800 fmol of 4-protmix and 8-protmix were analyzed by Figure 2. Schematic view of the preparation of the HPLC-MS/MS using two platforms, a ChipLC cou- 8-protmix. pled to a 6530 Q-ToF (Agilent Technologies) and a 1200 nano-HPLC (Agilent Technologies) coupled to As shown here, we were able to detect up to DQ/742UELWUDS 7KHUPR)LVKHU6FLHQWL¿F $VDUH- 24-fold changes in protein ratios. The standard de- sult, the analysis of the 4-protmix and the 8-protmix YLDWLRQ ı ZDVW\SLFDOO\ORZHUWKDQEXWUDQJHG OHGWRWKHVXFFHVVIXOLGHQWL¿FDWLRQDQGTXDQWLWDWLRQRI IURPı WRı 7KHKLJKHVWıFRUUH- all proteins in the samples (Tables 1 and 2). sponded to the highest protein fold change in our samples (24-fold). 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 99 Table 1. 4-protmix iTRAQ protein relative quantitation. A: ChipLC coupled to a 6530 Q-ToF and analysed using MASCOT. B: 1200 nanoHPLC coupled to LTQ Orbitrap and analysed using Proteome Discover. Table 2. 8-protmix iTRAQ protein relative quantitation measured with LTQ Orbitrap and analysed using Proteome Discover. In conclusion, we described two different sam- of the proteome of a typical biological sample falls ples suitable for iTRAQ analysis that can be used to within the fold change and dynamic range windows assess the performance of different mass spectrome- of these two samples. ters and quantitation algorithms. A considerable part Evaluation of MSEEDVHGSURWHLQTXDQWL¿FDWLRQPHWKRGV Kerman Aloria1, Miren Josu Omaetxebarria2, Mikel Azkargorta2*, Johannes P. C. Vissers4, Asier Fullaondo5, Jesus M. Arizmendi1,2 1 Proteomics Core Facility-SGIker (ProteoRed). University of the Basque Country. Leioa, Spain. 2 Department of Biochemistry and Molecular Biology. University of the Basque Country. Leioa, Spain. 3 Proteomics Core Facility. CIC bioGUNE. Derio, Spain. 4 :DWHUV&RUSRUDWLRQ0DQFKHVWHU8QLWHG.LQJGRP5 Department of Genetics, Physical Anthropology and Animal Physiology. University of the Basque Country. Leioa, Spain * Current address: Proteomics Core Facility. CIC bioGUNE. Derio, Spain /&06EDVHGSURWHLQTXDQWL¿FDWLRQPHWKRGV isotope labeling methodologies, which are sample- have recently gained popularity as powerful tech- number and sample-type dependant and require nologies capable of addressing protein expression special labeling chemistries, label-free approaches analysis in complex samples. As an alternative to afford greater experimental design and less sample 100 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 manipulation. A relatively new label-free approach and 428 in ECOLI_2 samples. 257 proteins in based on MSE or data independent acquisition mode (&2/,BDQGLQ(&2/,BZHUHLGHQWL¿HGLQ was applied in this study [1, 2]. Unlike the traditio- RUPRUHUHSOLFDWHVRIWKHPZHUHLGHQWL¿HG nal LC-MS/MS strategy, no precursor ion selection in both samples (Figure 2. A, B) and therefore, re- and fragmentation is applied and the acquisition ODWLYHO\TXDQWL¿HG%RWKTXDQWL¿FDWLRQDSSURDFKHV method is based on alternating the collision energy comparative analysis of estimated absolute amount of sequential scans applied to the gas cell between and ion current (probability) based, accurately de- low and elevated states (Figure 1). MSE based acqui- termined the relative protein ratio of the eukaryotic sition collects information on all the isotopes of all proteins spiked into an E. coli protein matrix (ta- charge-states of the eluting peptide precursor across EOH :HDOVRXVHGWKLVDSSURDFKIRUWKHUHODWLYH the chromatographic peak width. MSE provides ac- TXDQWL¿FDWLRQRIWRWDOSURWHLQH[WUDFWVIURP:7DQG curate mass data for precursor and product ions E2F2-/- T lymphocytes. 736 proteins were iden- ZKLFKDUHXVHGIRUSURWHLQLGHQWL¿FDWLRQDQGDOVR WL¿HGDQGZHUHFRQVLGHUHGIRUTXDQWL¿FDWLRQ precursor ion intensity measurement for relative purposes. Obtained results indicate that both quan- SURWHLQTXDQWL¿FDWLRQ)XUWKHUPRUHDEVROXWHSUR- WL¿FDWLRQDSSURDFKHVHTXDOO\GHWHUPLQHSURWHLQH[- tein amount can be estimated by comparing the top pression trends although numerical ratios can vary three ionising peptides of each protein with a known due to differential handling of protein isoforms and amount of an internal standard [3]. In this study we differences in statistical analyses (data not shown). evaluated the utility of estimated absolute quanti- Overall we can conclude that label-free LC-MSE ¿FDWLRQDQGFRPSDUDWLYHDQDO\VLVRILRQFXUUHQWV type of analysis has proven to be a robust and repro- IRUWKHSXUSRVHRIUHODWLYHSURWHLQTXDQWL¿FDWLRQRQ GXFLEOHDSSURDFKIRUUHODWLYHSURWHLQTXDQWL¿FDWLRQ data acquired using the data independent acquisition in complex samples. Furthermore, relative quanti- method. Our results indicate that MSE based label- ¿FDWLRQEDVHGRQHVWLPDWHGDEVROXWHTXDQWL¿FDWLRQ IUHHTXDQWL¿FDWLRQLVDUREXVWDQGDUHSURGXFLEOH and on ion current comparison consistently measu- DSSURDFKIRUUHODWLYHSURWHLQTXDQWL¿FDWLRQLQFRP- red protein expression ratios. plex samples. Table 1. Expected and experimental ratios obtained for Two mixtures (ECOLI_1 and ECOLI_2) of di- ALBU_BOVIN, ENO1_YEAST and PGYM_RABIT proteins. gested ADH1_YEAST, PGYM_RABIT, ENO1_ Ratio Ratio based <($67DQG$/%8B%29,1SURWHLQV :DWHUV&RU- based on Expected on absolute poration) were prepared at a relative molar ratio for Protein comparative ratio TXDQWL¿FDWLRQ each protein of 1:1, 1:0.5, 1:2 and 1:8 respectively ion current albu_ and spiked into a digested E. coli cytosolic protein 8.0 6.95 7.61 PL[WXUH :DWHUV&RUSRUDWLRQ 'DWDLQGHSHQGHQW bovin eno1_ acquisition analyses were performed with a na- 2.0 1.91 2.04 noAcquity UPLC system interfaced to a SYNAPT yeast pgym_ +'06 :DWHUV&RUSRUDWLRQ PDVVVSHFWURPHWHU 0.5 0.54 0.55 rabit and samples were run in quintuplicate. Data were SURFHVVHGVHDUFKHGDQGTXDQWL¿HGERWKDEVROXWH and relative, with a beta release of ProteinLynx Glo- balSERVER v2.4 software. Absolute protein quan- WL¿FDWLRQZDVFRQGXFWHGZLWKDVWDQGDUGSURWHLQ added to the sample (ADH_YEAST) and its amount SURYLGHGWRWKHLGHQWL¿FDWLRQVRIWZDUH$EVROXWH protein values were used to express relative quanti- ¿FDWLRQUHVXOWVEHWZHHQGLIIHUHQWVDPSOHV7KHUHOD- WLYHTXDQWL¿FDWLRQVRIWZDUHSHUIRUPVDFRPSDULVRQ between different samples based on deconvoluted peptide intensities and probabilistic relative protein TXDQWL¿FDWLRQLVVXEVHTXHQWO\FDOFXODWHG In this analysis a total of 525 different proteins Figure 1. Schematic of MSE mode of analysis ¿JXUHIURP ZHUHLGHQWL¿HG SURWHLQ)'5 LQ(&2/,B Waters Corporation). 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 101 This work was supported by grants from the Basque Government Department of Industry (Etor- tek and Saiotek to J.M.A.). Proteomics Core Faci- lity-SGIker is supported by UPV/EHU, MICINN, GV/EJ, ESF and ProteoRed agencies. [1] Silva JC, Denny R, Dorschel CA, Gorenstein MV, Kass IJ, Li GZ, et al. Quantitative proteomic analysis by accurate mass retention time pairs. Anal Chem 2005;77:2187-200. [2] Li GZ, Vissers JP, Silva JC, Golick D, Gorenstein MV and Geromanos SJ. Database searching and accounting of multiplexed precursor and product ion spectra from the data independent analysis of simple and complex peptide mixtures. Pro- teomics 2009;9:1696-719. [3] Silva JC, Gorenstein MV, Li GZ, Vissers JP and Figure 2. *UDSKLFDOUHSUHVHQWDWLRQRILGHQWL¿HGSURWHLQV. A. *HURPDQRV6-$EVROXWHTXDQWL¿FDWLRQRISUR- 1XPEHURISURWHLQVLGHQWL¿HGLQ(&2/,BDQG(&2/,BSHU teins by LCMSE: a virtue of parallel MS acqui- number of replicates. B. Venn diagram of overlapping proteins sition. Mol Cell Proteomics 2006;5: 144-56. LGHQWL¿HGLQRUPRUHUHSOLFDWHVLQ(&2/,BDQG(&2/,B Desarrollo de un Modelo Estadístico Universal para Proteómica Cuantitativa Mediante Marcaje Isotópico Estable Marco Trevisan-Herraz1, Pedro Navarro1, Elena Bonzon-Kulichenko1, Pablo Martínez-Acedo1, Daniel Pérez-Hernández1, Estefanía Núñez1, María Luisa Hernáez2, Enrique Calvo4, Montserrat Carrascal3, Marina Gay3, Inmaculada Jorge1, Dolores Gutiérrez2, Joaquín Abian3, Concha Gil2, Juan Miguel Redondo4 , Jesús Vázquez1 1Laboratorio de Química de Proteínas y Proteómica, Centro de Biología Molecular “Severo Ochoa” (CSIC- UAM), Madrid (CBMSO). 2Departamento de Microbiología II, Facultad de Farmacia, Universidad Complutense de Madrid (UCM). 3Laboratorio de Proteómica, Instituto de Investigaciones Biomédicas de Barcelona (IIBB- CSIC) (IDIBAPS). 4Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares, Madrid (CNIC) Aunque en la actualidad existen diferentes mé- lineal [1]. La validez de este modelo, que consi- todos de marcaje isotópico para la realización de dera por separado las fuentes de error debidas a la estudios de proteómica cuantitativa, los modelos es- manipulación de la muestra, la preparación de los tadísticos para el tratamiento de los datos obtenidos SpSWLGRV\ODFXDQWL¿FDFLyQSRUHOHVSHFWUyPHWURGH están todavía muy poco desarrollados. La mayoría masas, ha sido demostrada en experimentos masivos de los modelos asumen distribuciones normales de de hipótesis nula [1] y ha sido validada en varios los datos y la existencia de varianzas homogéneas, modelos biológicos de diferente naturaleza [2]. En que no se han demostrado en la práctica. En el la- el presente trabajo hemos abordado un proyecto boratorio de J. Vázquez hemos desarrollado recien- cooperativo a gran escala entre varios grupos de in- temente un nuevo modelo estadístico jerárquico de vestigación con el objetivo de extrapolar dicho mo- efectos aleatorios para el análisis de los datos de delo estadístico, de forma general, a los métodos de expresión diferencial obtenidos por marcaje con marcaje isotópico más comunes (SILAC y iTRAQ), 18O/16O y espectrometría de masas de trampa iónica y a otros espectrómetros de masas. 102 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Figura 1. Descripción del software que conforma la plataforma QuiXoT. Como modelo biológico se ha empleado un espectrómetros de masas utilizados, obteniéndose único cultivo celular de Saccharomyces cerevisiae, distribuciones que superan los test de normalidad control (muestra A), marcado con aminoácidos SI- a nivel de medida, a nivel de péptido y a nivel de * LAC (A ) o tratado con H2O2 (B) (UCM), y se han proteína. El modelo global ha sido implementado realizado experimentos comparativos a gran escala en la plataforma informática QuiXoT, en la que se A vs B y A vs A mediante 18O/16O y iTRAQ, y A* han desarrollado interfaces para la entrada de datos vs B y A* vs A mediante SILAC. Las muestras se obtenidos por los diferentes motores de búsqueda, digirieron en el CBM utilizando un nuevo método equipos y métodos de marcaje (Figura 1). de gel concentrante [2] y los péptidos resultantes se marcaron y separaron en 24 fracciones mediante El análisis de los datos arroja unas varianzas la técnica Off-gel [2]. Las fracciones fueron anali- a nivel de péptido que son consistentemente se- zadas usando un LTQ (CBM, IDIBAPS) en modo mejantes para todos los métodos de marcaje pos- convencional o PQD, un LTQ-Orbitrap (CNIC) y digestión, mientras que en el caso de SILAC la un MALDI-TOF-TOF (UCM). Cada uno de los varianza es prácticamente nula. Por otra parte, la H[SHULPHQWRVSHUPLWLyODFXDQWL¿FDFLyQGHHQWUH varianza a nivel de medida en modo MS (SILAC, 18 \SpSWLGRV/DH¿FLHQFLDGHPDUFDMH O) es algo menor en el Orbitrap en relación con el por 18O se determinó usando el método cinético LTQ, aumentando considerablemente en el modo [3]. Los resultados de los experimentos de hipótesis PQD-MS/MS (iTRAQ) en el LTQ. Finalmente la nula se utilizaron para el modelado de los pesos varianza a nivel de proteína es muy baja y similar estadísticos y para el análisis de normalidad de las en todos los casos. Estos resultados demuestran la poblaciones a los diferentes niveles, según descri- coherencia del modelo y establecen por primera bimos previamente [1]. vez un marco de referencia estadístico común para comparar las prestaciones relativas de los diferentes Nuestros resultados demuestran que el mode- equipos y métodos de marcaje. Este modelo, por lo estadístico jerárquico es válido, de forma uni- RWUDSDUWHGHYXHOYHLQIRUPDFLyQVREUHOD¿DELOLGDG versal, para todos los tipos de marcaje y todos los de los cambios de expresión obtenidos y ofrece un 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 103 estricto control sobre las posibles fuentes de error by 18O/16O labeling and linear ion trap mass del experimento. spectrometry: application to the study of vas- cular endothelial growth factor-induced angio- El desarrollo de un modelo estadístico de validez genesis in endothelial cells Mol Cell Proteomics universal y de una plataforma informática común 2009;8:1130-49. permite por primera vez el análisis sistemático y la [2] Bonzón-Kulichenko E, Pérez-Hernández GHWHFFLyQGHFDPELRVGHH[SUHVLyQVLJQL¿FDWLYRV D, Martínez-Acedo P, Núñez E, Navarro P, de forma semiautomática en cualquier experimento Trevisan-Herraz M, et al. A robust method for de expresión diferencial a escala masiva mediante quantitative high-throughput analysis of pro- técnicas de marcaje isotópico estable. teomes by 18O labeling Mol Cell Proteomics 2009;En revisión. References [3] Ramos-Fernández A, López-Ferrer D y Vázquez J. Improved method for differential expression [1] Jorge I, Navarro P, Martinez-Acedo P, Nunez E, proteomics using trypsin-catalyzed 18O labeling Serrano H, Alfranca A, et al. Statistical model ZLWKDFRUUHFWLRQIRUODEHOLQJHI¿FLHQF\0RO&HOO to analyze quantitative proteomics data obtained Proteomics 2007;6:1274-86. /DEHOIUHH4XDQWLWDWLYH$SSURDFKHVLQ&6)%LRPDUNHU'LVFRYHU\ Alex Campos1, Jacques Borg2, Claudio Diema3, Marta Vilaseca3, Eliande Oliveira1 1Proteomics Platform, Barcelona Science Park, Barcelona, Spain. 2Neurochemistry Lab, Faculty of Medicine, Saint Etienne, France. 3Mass Spectrometry Core Facility, Institute for Research in Biomedicine, Barcelona, Spain Mass Spectrometry (MS) has emerged as one of this problem, enrichment techniques and orthogonal the most promising core technologies for discovery fractionation strategies are routinely applied in pro- of diagnostic, prognostic and therapeutic protein teomics studies prior to MS analysis. Biomarkers biomarkers. Despite its rapid technological deve- of “interest” could be enriched with the selection of lopments, MS-based assays have also raised major a biological material that is in close proximity with concerns regarding its reproducibility, sensibility the disease source. In this regard, the cerebrospinal and throughput, and hence its potential application ÀXLG &6) LVDWUHDVXUHWURYHIRUELRPDUNHUGLVFR- in the clinical and regulatory settings. To address very in neurological diseases. Because of its direct these concerns, we explore relevant quality assu- contact with the brain’s extracellular space, CSF is rance benchmarks for MS-based quantitative CSF a valuable reporter of processes that occur in the ELRPDUNHUGLVFRYHU\:HDUJXHWKDWWKHURDGWRDUH- central nervous system. Although CSF shares some SURGXFLEOHDQGVXI¿FLHQWO\UREXVWELRPDUNHUGHYH- RIWKHSURWHLQFRQWHQWRIEORRGWKHERQD¿GHORFDOO\ lopment technology entails the understanding of the produced brain’s proteins are found in higher con- limits of each process, including sample handling, centration in the CSF compared to blood [1]. instrument setup, and bioinformatics tools. Platforms combining removal of high abun- Despite the increasing clinical interest in bio- dance proteins using multi-component immuno- ÀXLGVDVVRXUFHIRUELRPDUNHUGLVFRYHU\LWVGLVWLQF- depletion systems (IDS) followed by multidimen- WLYHQDWXUHLPSDUWVVLJQL¿FDQWFKDOOHQJHVIRUFXUUHQW sional protein/peptide fractionation are currently proteomics technologies. The immense dynamic the mainstay of unbiased proteomic biomarker dis- range of human plasma proteins, which spans 10 to covery. At the present, a number of commercial 12 orders of magnitude, poses a major limiting fac- IDS are available for highly selective removal of WRUIRULQGHSWKSURWHRPLFVSUR¿OLQJ7RRYHUFRPH most abundant human plasma proteins. To the best 104 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Figure 1. Distribution of the APEX values (left side) for the CSF proteome following depletion with IgY-HSA or IgY-14, and no depletion (y-axis on log scale). Pie charts (right side) depict the CSF protein content in context of their abundance. (HSA, KXPDQVHUXPDOEXPLQ &FRPSOHPHQW &67&\VWDWLQ& /$0$/DPLQLQĮDQG0$&)0LFURWXEXOLQDFWLQ Figure 2. AMT quality control metrics. (A) 2D display of the CSF AMT database. (B) 3D perspective plot of the peptide matches between IgY14-depleted sample and the AMT database (axis: mass and retention time error). (C) Heatmap of simi- larity score between LC-MS features of IgY14-depleted sample and AMT database. Best alignment is found using a dynamic programming algorithm that determines the transformation function with maximum likelihood. of our knowledge, all commercial IDS have been ted and undepleted samples in the context of protein devised to deplete plasma (or serum) samples and content stoichiometry and achieved dynamic range LWVSHUIRUPDQFHLQRWKHUELRÀXLGVKDVQRWEHHQHYD- (Figure 1). Our results show that IDS originally de- luated yet. To address this problem, we carried out vised to deplete blood’s most abundant proteins are CSF depletion (in triplicate) using either Sigma’s GH¿FLHQWLQGHSOHWHWKHPRVWDEXQGDQW&6)SURWHLQV Seppro systems designed to immunodeplete HSA :HWKHUHIRUHSURSRVHDOLVWRIWDUJHWSURWHLQ PRVW (IgY-HSA) or the 14 most abundant proteins (IgY- abundant) to be depleted in CSF for downstream /DEHOIUHHFRPSXWDWLRQDOO\PRGL¿HGVSHFWUDO 06SUR¿OLQJ )LJXUH±WRSSLHFKDUW counting method for Absolute Protein EXpression (APEX) measurements was used to assess the deple- The advent of a new generation of robust MS instruments with very high resolution and mass ac- 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 105 curacy has inspired the development of new quan- GHQW&6)SURWHLQLGHQWL¿FDWLRQV )LJXUH ,QFRQ- titative approaches [2]. In particular, label free hy- clusion, hybrid identity/pattern-based approaches brid identity/pattern-based approaches have gained are amenable for high throughput quantitative pro- SRSXODULW\LQWKHELRPDUNHUGHYHORSPHQW¿HOG>@ teome analyses in biomarker discovery pipelines. Such approaches use pattern recognition algorithms to ex post facto assign the identity of LC-MS peaks against databases of peptide sequence, mass, and References retention time built from multiple experiments. Here [1] Zougman, A et al. Integrated Analysis of the we employ the accurate mass and time (AMT) stra- Cerebrospinal Fluid Peptidome and Proteome. tegy to identify and quantify peptides/proteins from J Proteome Res 2007; 7: 386-399. unfractionated CSF samples using msInspect pla- WIRUP>@2XUDQDO\VLVZRUNÀRZH[WHQGVDQGFRP- [2] Mueller, LK et al. An Assessment of Software Solutions for the Analysis of Mass Spectrometry ELQHVH[LVWLQJRSHQVRXUFHSODWIRUPVIRU/&í06 Based Quantitative Proteomics Data. J Proteome 06 7UDQV3URWHRPLF3LSHOLQH DQG/&í06 PV,QV- Res 2008; 7: 51-61. pect) data analysis. A peptide accurate mass and LC elution time AMT database was initially generated [3] Jaffe, J et al. PEPPeR, a Platform for Experi- using MS/MS following extensive multidimensional mental Proteomic Pattern Recognition. Mol Cell LC separations to provide the basis for subsequent Proteomics 2006; 5:1927-1941. SHSWLGHLGHQWL¿FDWLRQV2XU&6)$07GDWDEDVHFRQ- [4] May, D et al. A Platform for Accurate Mass and tains >2,000 entries from a total number of ~7,500 Time Analyses of Mass Spectrometry Data. J LGHQWL¿HGSHSWLGHVZKLFKWUDQVODWHVLQWRFRQ¿- Proteome Res 2007; 6: 2685-2694. A comparison of quantitative proteomics methodologies on a differential experiment on test samples Joan Josep Bech-Serra, Núria Colomé, Marta Monge, Francesc Canals Laboratori de Proteòmica, Programa de Recerca en Oncologia Mèdica. Institut de Recerca. Hospital Vall d’Hebron, Barcelona 7KH¿HOGRISURWHRPLFVLQFOXGHVDZLGHQXPEHU come reproducibility problems inherent to the 2D of technologies aimed to the analysis of large number procedure and internal standardization of spot vo- of proteins, representing ideally the entire proteome, lume measurements, providing a robust quantitative in the same experiment. In its early stages , mass comparison technique. Alternatively, a number of spectrometry-based proteomics was successfully gel-free quantitative techniques can be used. Some used to the qualitative characterization of complex of them are based on non-isobaric isotope labeling, mixtures of proteins, leaving the quantitative aspects such as ICAT, ICPL or SILAC labeling methodo- in a secondary role, essentially because of the lack logies, the quantitative data being obtained from of suitable technologies for quantitative analysis of the from the MS data, by integrating extracted ion such complex mixtures. However, in the last years, chromatograms of the heavy-light peptide pair mas- a wide number of strategies have been developed ses. A second group which includes iTRAQ or TMT LQRUGHUWRJLYHWRWKHSURWHRPLFV¿HOGUREXVWWRROV reagents is based on isobaric labeling that introduce to obtain reliable quantitative data. Those strategies different reporter fragments in the derivatized pep- include both 2D-gel based and non-based methodo- tides. Quantitative data is in this case obtained at ORJLHV,QWKH¿UVWJURXS'',*(PHWKRGRORJ\LV the MS-MS level, from the relative intensities of EDVHGRQWKHODEHOLQJZLWKGLIIHUHQWÀXRURFKURPHV the reporter fragment ions. Finally, a third group enabling the simultaneous separation of different of label-free methods uses different approaches for samples in the same 2D-gel, which allows to over- quantitative comparison of LC-MS data. 106 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 In order to evaluate and compare the perfor- This should result in a more comprehensive quan- mance of different quantitative proteomics methods, titative information, since all tryptic peptides will we have prepared a set of two test samples to be be derivatized at the N-terminus. The weakness of compared quantitatively. The samples consist on a this strategy is that digestion of the two samples matrix of cytoplasmatic E. Coli proteins, of medium has to be run independently, which can introduce complexity (around 100 proteins), to which four technical bias. To minimize the problem of a pos- standard mammalian proteins have been spiked in sible imbalance, both labeling schemes are run in different amounts, ranging from the fmol to the parallel on sample aliquots. This way the balance pmol level per microgram of total protein.. The ra- correction derived from the protein level labeling tios of the spiked proteins between the two samples experiment can be used to normalize the data from have been chosen to range form 1.5:1 to 5:1. the second experiment. These samples have been analyzed by different ICPL labeled samples have been analyzed in methodologies (Figure 1): four independent LC-MS runs in order to assess reproducibility. - 2D-DIGE, using four technical replicas of each sample on a 4 2D-gel experiment. - iTRAQ Labeling. The samples have been analyzed using an 8-plex iTRAQ reagent, using four - Labeling with ICPL reagents at the protein different reporter masses for each of the samples, level, followed by tryptic digestion and analysis and analyzed by LC-MALDI. by LC-MS. This is the standard procedure for this methodology, but has the drawback that only lysine - Label-free quantitation. Four LC-MS runs of a FRQWDLQLQJSHSWLGHVZKLFKKDYHEHHQPRGL¿HGE\ tryptic digest of each sample have used to quantitati- the reagent can be used for quantitation. This results vely compare the two samples using Progenesis LC- RIWHQLQDODUJHSDUWRIWKHLGHQWL¿HGSURWHLQVODFNLQJ MS software for alignment and statistical analysis quantitative information. of the LC-MS maps. - Labeling with ICPL at peptide level. In order The results of all the quantitative proteomics to overcome this problem, we have explored an methods used have been evaluated in terms of accu- alternative procedure introducing the ICPL labeling racy and reproducibility, and their performance and step after tryptic digestion of the protein mixtures. robustness is discussed. Figure 1. 6FKHPHRIWKHPHWKRGVFRPSDUHGIRUWKHUHODWLYHTXDQWL¿FDWLRQRIWZRWHVWVDPSOHV 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 107 Triple Quadrupole Mass Spectromery-Based Peptide Assays Using Intelligent 650 L650 Reiko Kiyonami1, Alan Schoen1, Amol Prakash1, Huy Nguyen1, Scott Peterman1, Vlad Zabrouskov1, Andreas Huhmer1, Sarah Robinson1, Martin Hornshaw1, Madalina Oppermann 1, Nathalie Selev- sek2, Bruno Domon2 1 7KHUPR)LVKHU6FLHQWL¿F2 ETH Zurich, Switzerland 650WUDQVLWLRQVVLPXOWDQHRXVO\H[FHHGWKHGH¿QHG Introduction intensity threshold. For large scale screening expe- riments, the dynamic exclusion was used to trigger The commonly used SRM technique provides secondary acquisition only once for each peak for sensitive and precise quantitative results by moni- SURYLGLQJVXI¿FLHQWVWUXFWXUDOLQIRUPDWLRQWRFRQ- toring one or several primary SRM transitions per ¿UPWKHFRPSRXQG¶VLGHQWLW\ZLWKRXWSHUWXUELQJWKH targeted compound. Recently this technique was TXDQWL¿FDWLRQREWDLQHGZLWKWKHSULPDU\650OLVW H[WHQGHGWRVLPXOWDQHRXVO\FRQ¿UPWKHLGHQWLW\DQG quantify multiple compounds in one HPLC/MS run by monitoring eight or more SRM transitions per Results and discussion compound. The bottleneck of this approach is that only a limited number of compounds can be targeted The technique was applied to quantify preci- in one run because of the time required to monitor VHO\DQGFRQ¿UPLGHQWLW\RISHSWLGHVLQFRPSOH[ each transition. The newly developed instrument biological samples, including yeast cell lysates, FRQWUROVRIWZDUHFDQXVHWKHVSHFL¿FLW\RIDVPDOO and pesticides in orange oil. By monitoring mul- subset of SRM transitions to simultaneously quan- tiple transitions, it is possible to use very low in- WLI\DQGLQWHOOLJHQWO\WULJJHUWKHIXOOOLVWIRUFRQ¿U- tensity thresholds to accurately trigger the data mation, thereby allowing the analysis of up to 1000 dependent SRM scan. The trigger is the leading compounds in a single LC-MS run. edge of the LC peak and relatively independent of the LC peak intensity. Using known LC peak wi- dths, the strongest intensity point to obtain the data Experimental dependant scan is easily anticipated. Instead of a A triple quadrupole mass spectrometer equipped full product ion scan, high quality SRM spectra with a nanoLC pump and a nanospray source was monitor eight or more transitions at that point. The used. The intelligent SRM method utilizes SRM resulting eight spectra are assembled into a pseudo VSHFL¿FLW\LQWZRZD\V7KH¿UVWLVFRPSRXQGVSH- full scan MS/MS spectra that can be used for con- FL¿FTXDQWL¿FDWLRQXVLQJDWLPHEDVHG650DFTXL- ¿UPLQJWKHLGHQWLW\RIWKHSHSWLGHVE\PDWFKLQJ sition, which monitors several primary transitions them to reference spectra stored in a library. Using for each compound. The second is a data dependent a constant cycle time allows enough points across SRM acquisition, which monitors both those pri- the peaks from the primary SRM scans for precise mary and additional secondary transitions and is TXDQWL¿FDWLRQ:LWKWKLVDSSURDFKWKHLQVWUXPHQW triggered only when the intensities of all primary LVDEOHWRFRQ¿UPDQGTXDQWLI\PRVWWDUJHWHGSHS- tides in the low attomol range. 108 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 5. PROTEÓMICA MICROBIANA Y DE PARÁSITOS Coordinadores: Aída Pitarch, Antonio Marcilla, Ana Oleaga y Manuel Rodríguez 5.1 Aspectos generales Problemas en el análisis proteómico de muestras procedentes de organismos ‘raros’ María Luz Valero1, Javier Ortiz2, Esther Dionís1, Laura Cantero1, Manuel Mateo Sánchez del Pino1 1Laboratorio de Proteómica. Centro de Investigación Príncipe Felipe. Avda. Autopista del Saler 16. 46012 Valencia. 2SCSIE. Universitat de Valencia /RVPpWRGRVDFWXDOHVGHLGHQWL¿FDFLyQGHSUR- Citrus) o especies marinas de alto interés económico teínas se basan generalmente en la comparación de (2353 entradas para Clavicipitaceae). la información de MS (o MS/MS) obtenida con la información de secuencias de proteínas que existe En muchos casos es necesario recurrir a la se- en diferentes bases de datos. cuenciación de novo que requiere de espectros de MS/MS de gran calidad y es costosa en cantidad de Aunque algunas bases de datos incluyen un ele- muestra y tiempo de análisis, por lo que su aplica- vado número de proteínas, como por ejemplo NCBI bilidad es limitada. con aproximadamente 8500000 secuencias, no todos los organismos están representados por igual. Así, Aún así existen algunas estrategias que pueden apli- en NCBI existen 508911 proteínas humanas y el carse en el caso de disponer sólo de información de MS número decae drásticamente hasta 110313 para rata, y MS/MS parcial. En algunos casos pueden utilizarse un organismo ampliamente utilizado en experimen- herramientas químicas para la mejora de los espectros tación. Y el número es mucho menor para otros de MS/MS. Mientras que en otros las herramientas son organismos de alto interés como parásitos (54542 bioinformáticas, y nos permitirán obtener más informa- entradas para Trematoda), vegetales (13955 para ción de las diferentes bases de datos existentes. 5.2 Proteómica de Microorganismos A) Proteómica de Bacterias Preparación de extractos proteicos bacterianos para el análisis de glicoproteínas PHGLDQWHJHOHVELGLPHQVLRQDOHV\FURPDWRJUDItDVGHD¿QLGDG Alfonso Olaya, Lidia Gómez-Gascón, Manuel J. Rodríguez-Ortega Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Facultad de Veterinaria, Universidad de Córdoba Resumen nas. Sin embargo, su estudio mediante electroforesis ELGLPHQVLRQDO\FURPDWRJUDItDVGHD¿QLGDGELHQ Las glicoproteínas bacterianas, por sus funcio- mediante la química de la hidrazida y del ácido nes y localización, son potenciales dianas para vacu- aminofenilborónico o bien mediante reconocimien- 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 109 WRSRUOHFWLQDVSUHVHQWDQXQDVHULHGHGL¿FXOWDGHV gel de agarosa al 1% y espectrofotometría, y la de como la presencia de ADN o azúcares libres en la azúcares libres mediante la reacción de Fehling y el muestra respectivamente. Para intentar solventarlas método de la antrona. nos centramos en la optimización del proceso de obtención de extractos proteicos totales, tanto en 1) Rotura en presencia de tampón de rehidratación cuanto a calidad como a rapidez. de 2-DE (Urea 7M, Tiourea 2M, Tritón X-100 &+$36'77P0 /DH¿FLHQFLD La glicosilación bacteriana es un proceso recien- de rotura y rendimiento de obtención de proteí- temente descrito y del cual todavía existen muchas nas es grande. Sin embargo, al no poder descar- incógnitas. Todas las glicoproteínas procarióticas tarse la fracción en la que se ha incubado con descritas, en función de su localización, pueden cla- mutanolisina (y que contiene proteínas de unión VL¿FDUVHHQFLQFRJUDQGHVWLSRV GHSDUHGFHOXODU a pared, liberadas por la acción de la enzima), DVRFLDGDVDPHPEUDQDDVRFLDGDVDOSLORRÀDJHOR el tampón se diluye. Otros inconvenientes son glicoproteínas secretadas y exoenzimas, y celulares que las proteínas resuspendidas en este tampón (cuya localización en la célula no está muy clara y se no pueden ser tratadas enzimáticamente en so- cree que, más bien, son contaminaciones citoplasmá- lución y permanecen los azúcares y el ADN. ticas) [1]. Esto, junto con sus funciones [1], que po- Para eliminar los contaminantes anteriores debe QHQGHPDQL¿HVWRFRQWDFWRFRQHOKRVSHGDGRUHQHO cambiarse de tampón mediante, por ejemplo, proceso de infección, convierte a las estas moléculas precipitación de proteínas, con la consecuente en potenciales dianas para vacunas, nuestro principal SpUGLGDGHSURWHtQDV8OWUD¿OWUDUSDUDGLDOL]DU objetivo para estirpes del género Streptococcus. es imposible al formarse cristales de urea en la membrana, que la obstruyen y da lugar a una Dos de las aproximaciones que se están llevando gran pérdida de proteínas. a cabo son la electroforesis bidimensional (2-DE) en geles de poliacrilamida y las cromatografías de 2) Rotura en tampón Tris 50 mM pH 8 tras trata- D¿QLGDGEDVDGDVHQODTXtPLFDGHODKLGUD]LGDODGHO PLHQWRFRQPXWDQROLVLQD/DH¿FLHQFLDGHURWXUD iFLGRDPLQRIHQLOERUyQLFR\HQODDOWDHVSHFL¿FLGDG y obtención de proteínas es menor. Sin embar- hacia las glicoproteínas que exhiben las lectinas [2]. go presenta una serie de ventajas con respecto al anterior tampón, como que las muestras se Los principales problemas que nos encontramos obtienen en un tampón más apto para las cro- en la 2-DE tienen que ver con el enfoque de las pro- PDWRJUDItDVGHD¿QLGDG\GHSHQGLHQGRGHOSUR- teínas debido a la presencia de ADN, que provoca tocolo en concreto, también para la 2-DE. 2A) desenfoque horizontal y vertical de las proteínas, Precipitación con Tricloroacético [3]. Da lugar y la propia naturaleza altamente hidrofóbica de las a un rendimiento en la recuperación de proteína glicoproteínas asociadas a membranas. En cuanto total bajo. 2B) Rotura a pH 10 e incubación a las cromatografías nos encontramos con el pro- con Benzonasa [3] a pH 8, 500 U/ml a 37ºC, blema por contaminación con azúcares libres que 1,5 h. Se elimina el ADN por completo pero no LQWHU¿HUHQHQODD¿QLGDGGHODVJOLFRSURWHtQDVSRU ORVD]~FDUHV6LQHPEDUJRVHSXHGHXOWUD¿OWUDU la hidrazida y el ácido aminofenilborónico. En base fácilmente. 2C) Incubación con espermina [4] a estos problemas hemos de conseguir una prepara- 5 mM tras subir el pH de la muestra a 10 antes FLyQGHODPXHVWUDH¿FLHQWHHQFXDQWRDOUHQGLPLHQWR de la rotura y añadir 20 mM de EDTA. En estas de obtención de proteínas, pureza, medio en las que condiciones la ratio proteína recuperada/ADN se encuentren éstas y rapidez. en las muestras es muy bueno. Sin embargo, al Para optimizar el método de extracción de pro- tratarse de una molécula cargada, la 2-DE se ve teínas totales hemos probado una serie de protoco- comprometida y, aunque el efecto que tendría los, con variaciones desde sus fuentes originales sobre los distintos análisis glicoproteicos no se para adaptarlos a nuestros organismos. Tras cultivar ha ensayado aún, este hecho obliga a cambiar las bacterias se resuspenden en distintos tampones GHWDPSyQPHGLDQWHSRUHMHPSORXOWUD¿OWUD- µ para romper por ultrasonidos (10 ciclos de 20 se- ción. 2D) Incubación con DNAasa I (4 g/ml) µ gundos) tras tratamiento con mutanolisina (150 U/ y RNAasa (4 g/ml) [5] a 37ºC, 1,5 h. Con es- ml, a 37ºC, O/N) debido al grosor de la pared celular tas concentraciones se sigue observando restos de los estreptococos. La presencia de ADN en las de ADN, siendo además necesario un paso de muestras se comprueba mediante electroforesis en OLPSLH]DGHD]~FDUHV( 3XUL¿FDFLyQGHSURWHt- 110 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 nas con Fenol/Cloroformo/Alcohol Isoamílico Referencias (25:24:1 v/v/v) [3]. La cantidad de proteínas recuperadas es baja. [1] Raj K. Upreti Manoj K., y V. Shankar. Bacterial glycoproteins: Functions, biosíntesis and appli- 5RWXUDFRQ75,5HDJHQW 6LJPD /DH¿FLHQFLDGH cations. Proteomics 2003; 3: 363-379. rotura es buena, sin embargo, la cantidad de proteí- [2] Balanova L., Hernychova L., Bilkova Z. Bioa- nas recuperadas tras seguir el protocolo es baja. nalytical tools for the discovery of eukaryotic Para aumentar la resolución y el enfoque de glycoproteins applied to the análisis of bacterial glycoproteins. Expert Rev. Proteomics 2009; las proteínas en 2-DE se están ensayando, en los 6(1), 75-85. extractos totales potencialmente más idóneos para nuestro estudio, el detergente ASB-14, el DeStreak >@ $QWRQLROL3%DFKL$)DVROL(5LJKHWWL3(I¿- y el método de cargado de las tiras de IPG mediante cient removal of DNA from proteomic samples “cup loading”. prior to two-dimensional map análisis. Journal of Chromatography A, 1216 2009; 3606-3612. >@ &KRH:\0LGGHOEHUJ$6HOHFWLYH3UHFLSLWD- Agradecimientos tion of DNA by Spermine during the Chemical (VWHWUDEDMRKDVLGR¿QDQFLDGRSRUHOSUR\HFWR Extraction of Insoluble Cytoplasmic Protein. SAF2008-00733 del Ministerio de Ciencia e Inno- Biotechnol. Prog. 2001; 17: 1107-1113. vación, Gobierno de España. >@ (QFKHYD9*KDUELD6:DLW5%HJXP6\ Shah H. Comparison of extraction procedures for proteome analysis of Streptococcus pneu- moniae and a basic reference map. Proteomics 2006; 6: 3306–3317. Métodos de enriquecimiento de glicoproteínas bacterianas para su posterior análisis y caracterización mediante espectrometría de masas Lidia Gómez-Gascón, Alfonso Olaya, Manuel J. Rodríguez-Ortega Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Facultad de Veterinaria. Universidad de Córdoba Resumen PHGLDQWHGLYHUVDVFURPDWRJUDItDVGHD¿QLGDGSDUDHO HQULTXHFLPLHQWR\SXUL¿FDFLyQGHJOLFRSURWHtQDVGH 8QDGHODVIRUPDVPiVFRPXQHVGHPRGL¿FDFLR- bacterias del género Streptococcus. nes postraduccionales de proteínas es la glicosilación. Se estima que más del 50% de las proteínas conoci- En contra de lo que estaba establecido hasta das, así como el 80% de las proteínas de membrana, hace unos años, recientemente se ha demostrado que están glicosiladas. En contra de lo que se creía, se ha los procariotas producen glicoproteínas [1]. Estas demostrado que los procariotas también poseen gli- SDUHFHQHVWDUDVRFLDGDVDODVXSHU¿FLHGHOPLFUR- coproteínas. Las glicoproteínas bacterianas parecen organismo, lo que sugiere que están implicadas en HVWDUDVRFLDGDVDODVXSHU¿FLHGHOPLFURRUJDQLVPR la interacción con el hospedador y por tanto, con la Este hecho sugiere por tanto que están implicadas capacidad patógena del microorganismo. Hay dos ti- en la interacción de la bacteria con el hospedador y pos de glicosilación en procariotas: N-glicosilación, por tanto puede existir una relación directa con la ca- en la cual los glicanos están unidos a un residuo de pacidad patógena del microorganismo. El objeto de asparagina, y O-glicosilación, en la cual está unido a este estudio consiste en desarrollar una metodología, un residuo de serina, treonina o tirosina [1,2]. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 111 Para el enriquecimiento de glicoproteínas, los zona. Para ello se está poniendo a punto una croma- métodos que hemos utilizado se basan en croma- tografía con una resina de hidrazida (Bio-Rad). En WRJUDItDVGHD¿QLGDGXVDQGROHFWLQDVDVtFRPROD primer lugar las muestras se oxidan con peryodato química de la hidrazida y del ácido aminofenilbo- sódico, y después la muestra se hace pasar por la rónico [1,3]. resina para permitir la formación de los enlaces hidrazona. El resto de proteínas no glicosiladas se /DVOHFWLQDVVRQSURWHtQDVTXHVHXQHQHVSHFt¿- eliminan mediante lavados. Posteriormente las gli- camente a motivos oligosacarídicos, reconociendo coproteínas se digieren con tripsina y se recogen cada una a un subgrupo de especies de glicanos. mediante lavados los péptidos generados, que co- Para asegurar el reconocimiento del mayor nú- rresponden a las proteínas glicosiladas, quedando mero de glicoproteínas, se está poniendo a punto los glicopéptidos unidos a la resina. Los N-glicopép- una batería de lectinas: Canavalia ensiformis lec- tidos pueden recuperarse de la resina digiriendo con tin (ConA), que reconoce principalmente residuos la glicosilasa PNGasa F, ya que esta enzima corta deĮPDQRVD\ĮJOXFRVD Ulex europaeus lectin el sitio de unión del glicano a la asparagina. Para 8($ UHFRQRFHUHVLGXRVGHĮ/IXFRVD Triti- OLEHUDUORV2JOLFRSpSWLGRVVHUHDOL]DȕHOLPLQDFLyQ cum vulgaris lectin :*$ UHFRQRFH grupos N- con dimetilamina al 26%, que convierte las serinas y acetilglucosamina (GlcNAc) y ácido siálico; Ara- treoninas glicosiladas en alanina y ácido 2-aminobu- chis hypogaea lectin $+ UHFRQRFHȕJDO ! tírico respectivamente [1-2-3,6]. Tras hacer pasar la galNAc; y Bandeiraea simplivifolia lectin (BC-1) tripsina por la resina para digerir las proteínas rete- UHFRQRFHĮJDODFWRVD\ĮJDO1$F nidas y analizar los péptidos mediante nano-LC/MS/ Los extractos proteicos se separaron mediante 06VHLGHQWL¿FDURQPXFKDVSURWHtQDVFLWRSODVPiWLFDV en principio no esperadas. electroforesis en gel de poliacrilamida al 12%, y pos- WHULRUPHQWHVHWUDQV¿ULHURQDPHPEUDQDVGHQLWURFH- lulosa, las cuales se bloquearon con gelatina al 3%, se hibridaron con cada una de las cinco lectinas, se incu- baron con estreptavidina-HRP y se revelaron mediante quimioluminiscencia. [1,2,4]. Resultados preliminares han indicado hasta ahora que tanto la ConA como la AH son las lectinas que reconocen un mayor número de glicoproteínas ya que revelan un mayor número de bandas a partir de extractos totales (Figura 1). Figura 2. Gel teñido con Coomassie de proteínas obtenidas WUDVSXUL¿FDUFRQiF$PLQRIHQLOERUyQLFRH[WUDFWRVWRWDOHV de Streptococcus pneumoniae. Calles de izquierda a dere- FKD HOXLGRÀRZWKURXJKH[WUDFWRWRWDO El tercer método consistió en la cromatografía GHD¿QLGDGXVDQGRODTXtPLFDGHOiFLGRDPLQRIH- nilborónico, que forma enlaces covalentes con los grupos cis-diol de residuos de glucosa, manosa y galactosa en condiciones de alcalinidad, dando lu- gar a diésteres, siendo estos enlaces reversibles en Figura 1. Blotting con lectinas de extractos totales de Strep- condiciones ácidas. Se usó como tampón de unión tococcus pneumoniae. Calles de izquierda a derecha: ConA, A.H., WGA, UEA-I, BC-I. a la resina taurina 50 mM /NaOH, pH 8.7 + 20 mM MgCl2, y de elución igual al anterior pero con 50 El segundo método de enriquecimiento está ba- mM Tris/HCl, pH 7.5 [1, 2, 5]. El eluido se separó sado en la química de la hidrazida [6], mediante la mediante electroforesis en gel de poliacrilamida cual dicho grupo funcional reacciona con los grupos al 12% (Figura 2), y las bandas se analizaron por cis-diol de los residuos de azúcares, previamente 0$/',72)06LGHQWL¿FiQGRVH~QLFDPHQWHSUR- oxidados a aldehídos, para formar un enlace hidra- teínas citoplasmáticas. Además, el eluido se digirió 112 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 en solución con tripsina y se analizó mediante ESI- [3] Greis K. et al. Selective Detection and Site- MS/MS, dando también como resultado principalmente $QDO\VLVRI2*OF1DF0RGL¿HG*O\FRSHSWLGHV proteínas citoplasmáticas. by B-Elimination and Tandem Electrospray Mass Spectrometry. Analytical Biochemistry 1996; 234: 38-49. Agradecimientos >@ .DML+HWDO/HFWLQDI¿QLW\FDSWXUHLVRWRSH (VWHWUDEDMRKDVLGR¿QDQFLDGRSRUHOSUR\HFWR coded tagging and mass spectometry to identify SAF2008-00733 del Ministerio de Ciencia e Inno- N-linked glycoproteins. Nature biotechnology vación, Gobierno de España. 2003; v.21, n.6. >@ 0R]DQR$HWDO%RURQLFDFLGOHFWLQDI¿QLW\ chromatography.1.Simultaneous glycoprotein Referencia binding with selective or combined elution. Anal [1] Balonova L., et al. Bioanalytical tools for the Bioanal Chem. 2007; 389: 2097-2102. discovery of eukaryotic glycoproteins applied >@ =KDQJ+HWDO,GHQWL¿FDWLRQDQGTXDQWL¿FDFLRQ to the analysis of bacterial glycoproteins. Expert of N-linked glycoproteins using hydrazide che- Rev. Proteomics 2009; 6 (1): 75-85. mistry, stable isotope labeling and mass spectomr- [2] Capote F.P. y Sanchez J.C.. Strategies for proteo- try. Nature biotechnology. 2003; v. 21, n. 6. mic amalysis of non-enzymatically glycated pro- WHLQV:LOH\LQWHU6FLHQFH '2, mas.20187. Análisis de la enterotoxina A de Staphylococcus aureus en leche por ionización mediante desorción por láser asistida por matriz, acoplada a espectrometría de PDVDVGHWLHPSRGHYXHOR 0$/',72) Isabel Sospedra, Carla Soler, Jose Miguel Soriano, Jordi Mañes Departamento de Medicina Preventiva y Salud Pública, Ciencias de la Alimentación, Toxicología y Medicina Legal. Facultad de Farmacia. Universitat de València Resumen utilizada demostrando la utilidad del método de análisis utilizado. Las bacterias del género Staphylococcus son mi- croorganismos de amplia distribución, causantes Staphylococcus aureus es una bacteria patógena, de numerosas intoxicaciones alimentarias debido, de amplia distribución en la naturaleza, asociada a en gran medida, a su capacidad de producir entero- infecciones generalizadas y brotes alimentarios [1]. toxinas. La enterotoxina del serotipo A es la que con $OJXQDVHVSHFLHVGHHVWD¿ORFRFRVVRQSURGXFWRUDV más frecuencia aparece en los brotes de intoxica- de una familia de proteínas no glicosiladas de bajo ción alimentaria. En el presente trabajo se desarrolla peso molecular (Mr 22-31.000) conocidas como en- una técnica de análisis de muestras de leche por terotoxinasHVWD¿ORFyFLFDV 6(V Estas enterotoxi- MALDI-TOF para la detección de la enterotoxina nas son causa de intoxicaciones alimentarias por la $HVWD¿ORFyFLFD(VWHPpWRGRSUHVHQWDFRPRYHQ- ingesta de productos contaminados, principalmente tajas sobre las técnicas actualmente utilizadas su de origen cárnico y lácteo [2-3] destacándose la en- JUDQHVSHFL¿FLGDG\HOHYDGDUDSLGH]/RVUHVXOWDGRV terotoxina A [4], que es la que con mayor frecuencia obtenidos mostraron la efectividad de la extracción se asocia a brotes de intoxicación alimentaria y que es extremadamente potente. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 113 El presente trabajo pretende detectar la presencia ¶/GHiFLGRĮFLDQRKLGUR[\FLQDPLFRFRPR de enterotoxina A en muestras de leche utilizando un matriz, preparado a saturación en una mezcla de método de extracción rápido y sencillo y detección DFHWRQLWULORiFLGRWULÀXRURDFpWLFR¶DO por MALDI TOF. (TA 0’1%) y diluido 1:2 en TA 0’1%. Las muestras (0’5 µL) fueron analizadas en un Espectrómetro de 6HXWLOL]ySDWUyQGHHQWHURWR[LQD$SDUDIRUWL¿- 0DVDVGHWLSR0$/',72) 5HÀH[,9GH%UXNHU car a dos niveles diferentes 1 ml de leche procedente 'DOWRQLFV /DLGHQWL¿FDFLyQGHODVSURWHtQDVVH de supermercados locales. La extracción de la en- realizó utilizando el motor de búsqueda MASCOT terotoxina se llevó a cabo por precipitación de las (Matrixscience, UK). caseínas de la leche con diclorometano (DCM)/H2O 5% ácido acético y centrifugación (6000 rpm). Las proteínas contenidas en el sobrenadante se separaron por electroforesis 1D-SDS-PAGE en gel de poliacri- lamida al 10% y se tiñeron con azul de Coomassie. Las zonas del gel que contenían la enterotoxina (25- 30KD) se cortaron y fueron sometidas a digestión WUtSWLFDFRQOD¿QDOLGDGGHREWHQHUORVIUDJPHQWRV peptídicos correspondientes a la enterotoxina A. Figura 1. Imagen del aislamiento de la enterotoxina A de La digestión en gel se realizó siguiendo una las proteínas del suero de la leche en gel de poliacrilamida adaptación de protocolos estandarizados [5] con teñido con azul de Comassie. PRGL¿FDFLRQHVPHQRUHV3RVWHULRUPHQWHVHSUHSDUD- /D)LJXUDPXHVWUDODH¿FDFLDGHOPpWRGRGHH[- ron las muestras en MTP AnchorChip (BrukerDalto- tracción junto con la separación por electroforesis nics), mediante la técnica de doble gota seca (depó- en gel para aislar la enterotoxina de la matriz láctea. sito de matriz y evaporación de la misma; depósito de la muestra y evaporación de la misma), utilizando Los resultados obtenidos tras la digestión tríptica Tabla 1. 6HFXHQFLDVSHSWtGLFDVLGHQWL¿FDGDVSRU0$/',72)WUDVODGLJHVWLyQWUtSWLFDGHHQWHURWR[LQD$GH6WDSK\ORFRF- cus aureus. Rango de [M + H]+ [M + H]+ Secuencia de péptidos péptidos calculada observada 16-27 1229.65 1230.67 SELQGTALGNLK 28-35 1119.51 1120.55 QIYYYNEK 42-55 1741.87 1742.92 ESHDQFLQHTILFK 56-74 2305.02 2306.10 *))7'+6:<1'//9')'6. 104-118 1650.71 1651.76 TACMYGGVTLHDNNR 124-134 1281.73 1282.75 .93,1/:/'*. 125-134 1153.64 1154.69 93,1/:/'*. 135-144 1127.61 1128.65 QNTVPLETVK 148-160 1512.81 1513.84 KNVTVQELDLQAR 149-160 1384.72 1385.75 NVTVQELDLQAR 167-178 1433.64 1434.66 YNLYNSDVFDGK 218-233 1912.88 1913.94 TINSENMHIDIYLYTS 114 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 de las bandas del gel y el análisis de los péptidos Agradecimientos por MALDI-TOF aparecen en la Figura 2, donde se muestran los fragmentos de enterotoxina A pro- Los autores agradecen a la Conselleria de Sa- cedentes de la leche junto con el espectro obtenido nitat el soporte de esta investigación. Generalitat del patrón. En la muestra de leche sólo aparecen 8 Valenciana (072/2009). GHORVIUDJPHQWRVLGHQWL¿FDGRVHQHOSDWUyQSHUR HVWRVVRQVX¿FLHQWHVSDUDFRQ¿UPDUODSUHVHQFLDGH Referencias enterotoxina A (Tabla1). Con el método propuesto VHFRQVLJXHXQDEXHQDSXUL¿FDFLyQ\DLVODPLHQWR [1] Pesavento, G., Ducci, B., Comodo, N., Nostro, GHODHQWHURWR[LQD$DVtFRPRXQDLGHQWL¿FDFLyQ $/$QWLPLFURELDOUHVLVWDQFHSUR¿OHRIStaphylo- precisa de su presencia en muestras de leche. coccus aureus isolated from raw meat: a research for methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Food Control .2007; 18: 196-200. >@ &KLDQJ</LDR:)DQ&3DL:&KLRX C., Tsen, H. PCR detection of Staphylococcal enterotoxins (SEs) N, O, P, Q, R, U, and survey of SE types in Staphylococcus aureus isolates from food-poisoning cases in Taiwan. Int. J. Food Microbiol. 2008; 121: 66-73. [3] Ikeda, T., Tamate, N., Yamaguchi, K., Makin S. Mass Outbreak of Food Poisoning Disease Caused by Small Amounts of Staphylococcal Enterotoxins A and H. Appl. Environ. Micro- biol., 2005; 71:2793-2795. >@ 'LQJHV02UZLQ3 6FKOLHYHUW3([RWR[LQV Figura 2. Espectros de masas MALDI-TOF de las digestio- of Staphylococcus aureus. Clin Microbiol Rev. nes con tripsina. (A) Espectro correspondiente a patrón de 2000; 13: 16-34. WR[LQDHVWD¿ORFyFLFD$ % (VSHFWURFRUUHVSRQGLHQWHDOD enterotoxina A aislada de la muestra de leche. >@ $QGUHM6KHYFKHQNR0DWWKLDV:LOP2OH9RUP and Matthias Mann Mass, Spectrometric Sequen- cing of Proteins from Silver-Stained Polyacryla- mide Gels, Anal. Chem. 1996; 68: 850-858. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 115 Comparación de dos técnicas proteómicas aplicadas al análisis de las proteínas de membrana de Mycoplasma genitalium Noemí Párraga-Niño1, Núria Colomé2, Francesc Canals2, Jaume Piñol1, Josep Antoni Pérez Pons1, Enrique Querol1, Mario Ferrer-Navarro3 1Laboratorio de Biología Molecular, Instituto de Biotecnología y Biomedicina, Universidad Autónoma de Barcelona (IBB-UAB). 2Instituto de Investigación del Hospital Universitario Vall d’Hebrón. 3Laboratorio de Biología Computacional y Proteómica, Instituto de Biotecnología y Biomedicina, Universidad Autónoma de Barcelona (IBB-UAB) Los micoplasmas representan uno de los siste- los principales problemas de la electroforesis bidi- mas biológicos más simples descritos hasta el mo- mensional es la baja representación de proteínas de mento y son un buen ejemplo de célula mínima PHPEUDQD&RQHOREMHWLYRGHLGHQWL¿FDUSURWHtQDV autoreplicativa. Este género se caracteriza por la au- de membrana de M. genitalium se han aplicado dos sencia de pared celular y por presentar un genoma de metodologías proteómicas diferentes con su posterior reducido tamaño. Las infecciones causadas por Mi- comparación. Las metodologías utilizadas en este coplasmas suelen estar asociadas al sistema uroge- estudio han sido el fraccionamiento de las proteínas nital y al tracto respiratorio, provocando en muchos hidrofóbicas en Tritón X-114 y posterior 2DE, y el casos infecciones crónicas. Mycoplasma genitalium, PDUFDMHHVSHFt¿FRGHODVUHJLRQHVH[SXHVWDVHQOD el microorganismo de estudio en este trabajo, infecta membrana con biotina, su captura con estreptavidina el sistema urogenital humano provocando cervicitis LQPRYLOL]DGD\ODSRVWHULRULGHQWL¿FDFLyQPHGLDQWH en mujeres y uretritis en hombres. Es sabido que en LC-MS/MS. La aplicación de estas técnicas ha per- muchos microorganismos patógenos la patogenici- PLWLGRQRVyORLGHQWL¿FDUSURWHtQDVGHPHPEUDQDGH dad reside en proteínas expuestas en la membrana. este microorganismo sino también comparar ambos (QXQHVWXGLRSUHYLRVHGH¿QLyHOSHU¿OSURWHLFR métodos para poder discutir las ventajas e inconve- de Mycoplasma genitalium mediante 2DE. Uno de nientes de cada uno de ellos. 116 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Comparative proteomic analysis of collection and clinical-isolate strains of Stenotrophomonas maltophilia Mario Ferrer-Navarro1, Elias Mongiardini1, Gerard Torrent1, Raquel Planell1, Ana Calderón3, Teresa Falgueras,3 Isidre Gibert,1 Xavier Daura1,2 1Institut de Biotecnologia i de Biomedicina (IBB), Universitat Autònoma de Barcelona (UAB), E-08193 Cerdanyola del Vallès (Barcelona). 2Catalan Institution for Research and Advanced Studies (ICREA), E-08010 Barcelona. 3Hospital Municipal de Badalona, Badalona Serveis Assistencials, E-08911 Badalona (Barcelona) Stenotrophomonas maltophilia is a Gram-nega- centrifuged. DIGE labeling: Samples were labeled tive pathogen with emerging nosocomial incidence as follows: Clinical strains with Cy3 (green), ATCC [1]. It has been associated with several clinical syn- 13637 strain with Cy5 (red) and the internal stan- dromes, primarily in relation to the opportunistic in- dard with Cy2 (Blue). 50 µg of each sample were fection of immunocompromised patients. Although mixed and the resulting 150 µg were loaded onto not an inherently virulent pathogen, its ability to the IPG strips. 2-D Gel Electrophoresis: The IPG colonise respiratory-tract epithelial cells and med- strips were 24cm long and the pH range was from 3 ical-device surfaces makes it a ready coloniser of to 10 lineal and 4 to 7. The sample was loaded with hospital settings. the cup-loading system. The second dimension was performed in 12.5% polyacrylamide gels. Gels were Antibiotic treatment of S. maltophilia is greatly performed in triplicate for statistical analysis. Image hampered by extensive drug resistance [2]. Besides analysis: Images were acquired immediately using PRUHVSHFL¿FUHVLVWDQFHPHFKDQLVPVLWVFDSDFLW\ a Typhoon scanner (GE Healthcare) and the image WRIRUPELR¿OPVFRQIHUVWKHEDFWHULXPDGGLWLRQDO analysis was carried out with Samespots software protection in front of the immune system, antibiotics (Nonlinear dynamics). In-Gel Tryptic Digestion: and disinfectants [3]. After image analysis silver staining of the gels was The genomes of two different strains have been performed. The selected spots were excised from recently sequenced and compared [4] but no expres- the acrylamide gel, and immediately destained and sion-pattern studies have been performed yet. In this digested. MALDI-MS Analysis:ȝORIVDPSOHZDV communication, we present a comparative proteome PL[HGZLWKȝORI+&&$7KLVPL[WXUHZDVDQD- analysis of four strains with different infective ca- O\]HGZLWKDQ8OWUDÀH[0$/',72) %UXNHU )RU pacities, ATCC 13637 and the new clinical isolates PMF analysis, the MASCOT search engine (Matrix M30, UV74 and E77. Science) was used with the following parameters: one missed cleavage permission, 50 ppm measure- PHQWWROHUDQFHDQGDWOHDVW¿YHPDWFKLQJSHSWLGH 0DWHULDOV 0HWKRGV masses. In the searches, methionine oxidation and cystein carbamidomethylation were taken into ac- FRXQWDVYDULDEOHPRGL¿FDWLRQV Bacterial strains and growth Three new S. maltophilia strains were isolated. Conclusions M30 from a patient with decubitus ulcer. E77 from sputum and UV74 from patient with a vascular ul- A differential expression analysis of the proteo- cer .ATCC 13637 and clinical isolated S. malto- mes of newly isolated clinical strains of S. malto- philia strains were cultured in LB media to reach philia and the laboratory strain ATCC 13637 has exponential growth. Total protein extract: 20ml of been performed (Figure 1). Eye-inspection of the gel culture were washed with PBS and resuspended in images readily suggests the existence of substantial lysis solution (8M urea, 2M thiourea, 2.5% CHAPS, differences between the two proteomes under the ex- 2% ASB-14, 40mM Tris-HCL pH 8.8, 0.5% IPG). SHULPHQWDOFRQGLWLRQV7KHLGHQWL¿FDWLRQRIGLIIHUHQ- Then, samples were disrupted by sonication and tially expressed proteins in these strains shall provide 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 117 the basis for the interpretation of their phenotypic LQIHFWLRQ2WKHULGHQWL¿HGSURWHLQVDUHLQYROYHGLQ differences at a biomolecular level, with a special protein synthesis (Spot nº 3, 4, 5, 13 and 17) and in focus on infection and resistance mechanisms. amino acid metabolism (spot nº 12, 15 and 20). $FNQRZOHGJHPHQWV AntiPathoGN is supported by funding under the Seventh Research Framework Programme of the European Union (ref. HEALTH-F3-2009-223101). The Authors thank Francesc Canals, from Unitat de Proteòmica of Hospital Vall d’Hebron for his valua- ble advice on image adquisition. References >@ /RRQH\:-01DULWDDQG.0KOHPDQQ Stenotrophomonas maltophilia: an emerging Figure 1. DIGE of the M30 and the ATCC 13637 S. malto- opportunist human pathogen. The Lancet Infec- philia strains tious Diseases 2009; 9:312. On average, around 1500 spot features were [2] Nicodemo, A. C., and J. I. Paez.. Antimicrobial detected on each analytical gel. Statistical analysis therapy for Stenotrophomonas maltophilia in- of gels allowed the detection of about 300 spots with fections. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2007; VLJQL¿FDQWFKDQJHVEHWZHHQWKHFOLQLFDOLVRODWHVDQG 26:229-37. $7&&VWUDLQV:HKDYHLGHQWL¿HGGLIIHUHQWLDOO\ [3] Doroti de, O.-G., D. A. Monique, R. Mónica, C. expressed proteins. Interestingly, some of these pro- G. S. A. Ana, A. Norma, B. M. Marina, and A. teins (Spot nº 9, 16 and 21) are involved in the fatty G. Jorge. Fimbriae and adherence of Stenotro- acid metabolism. Moreover, a protein involved in phomonas maltophilia to epithelial cells and to the poliketide sugar unit biosynthesis has also been abiotic surfaces. Cellular Microbiology 2003; LGHQWL¿HG 6SRWQ 7KHXSUHJXODWLRQRIWKHVH 5:625-636. proteins in the some of the clinical strains suggests [4] Rocco, F., E. De Gregorio, B. Colonna, and P. a different membrane lipopolysaccharide composi- P. Di Nocera. Stenotrophomonas maltophilia WLRQZKLFKLQWXUQFRXOGEHUHODWHGZLWKELR¿OP genomes: A start-up comparison. International formation and pathogenesis. A number of proteases Journal of Medical Microbiology In Press, Co- are upregulated in the clinical strains (Spot nº 2, 14, rrected Proof. 22 and 23) that could also be potentially relevant to 118 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 B) Proteómica de Hongos Análisis comparativo del proteoma de una cepa industrial de Saccharomyces cerevisiae en dos condiciones de cultivo Carlos Luna1, Teresa García-Martínez1, Miguel Curto2, Juan Carlos Mauricio1 1Departamento de Microbiología. 2Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Universidad de &yUGRED&DPSXVGH5DEDQDOHV(GL¿FLR6HYHUR2FKRD La levadura Saccharomyces cerevisiae es uno de \'77P0 /DFXDQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDVVH los organismos modelo utilizados en Biología Mole- determinó mediante el método Bradford [2]. IEF- cular, y además es un organismo que tiene un gran 2D: Se utilizaron tiras con gradientes de pH inmo- valor comercial. La mayoría de los estudios sobre vilizados (IPG) de 17 cm, de gradiente no lineal proteómica de levadura se ha realizado sobre cepas 3-10, (Bio-Rad). Se rehidrataron pasivamente du- de laboratorio, y existen pocos datos sobre levaduras rante 2 horas con 500 µg de proteína en 300 µL de de interés industrial. Saccharomyces cerevisiae es tampón de solubilización (Urea 8M; 2% CHAPS; un microorganismo anaerobio facultativo. Durante 0,5% tampón IPG 5-8, 3-10, 30 mM DTT, y azul el proceso de fermentación, la levadura se adapta de bromofenol 0.01%) [3]. Las tiras se cargaron ¿VLROyJLFDPHQWHDGLVWLQWRVHVWUHVHVFRPRVRQHOH- en IEF CELL (Bio-Rad) para ser enfocadas por su vada presión osmótica, agotamiento de la fuente de SXQWRLVRHOpWULFRFRQXQSURJUDPDHVSHFt¿FR/RV carbono como la glucosa y la aparición de etanol, geles de poliacrilamida al 13% fueron sometidos que le es tóxico. Durante la fermentación alcohólica, a electroforesis en PROTEAN II CELL. Los geles &KHQJ\FRODERUDGRUHV>@KDQLGHQWL¿FDGRHQ]LPDV fueron teñidos con azul de coomassie G-250 durante implicadas en las rutas de las pentosas fosfato, gli- 24 h por el método descrito por Mathesius y cola- colisis, gluconeogénesis, biosíntesis del glicerol y boradores [4]. Las imágenes fueron adquiridas con también proteínas de choque térmico. El objetivo de un densitómetro GS-800 calibrado y se analizaron HVWHHVWXGLRKDVLGRFRPSDUDUHOSHU¿OSURWHyPLFR con el software PDQuest 8.0.1 (Bio-Rad). Se calcu- de una levadura industrial en dos medios de cultivo: laron los puntos isoelétricos según la distribución medio fermentativo con glucosa y medio oxidativo de las tiras, y los pesos moleculares según el patrón con glicerol y etanol. GHSHVRVREWHQLGRV\UHÀHMDGRVHQORVJHOHVFRQORV marcadores correspondientes. Ciertos spots obteni- La levadura Saccharomyces cerevisiae G1, ais- dos tanto en fermentación como en medio oxidativo lada de un vino de la D.O Montilla-Moriles, creció están secuenciados mediante MALDI-TOF/TOF en en dos condiciones: en un medio fermentativo, me- el Centro de Genómica y Proteómica - Unidad de dio completo YPD compuesto por 17% de glucosa, Proteómica - Facultad de Farmacia. Universidad 1% de extracto de levadura, 2% peptona bacterioló- &RPSOXWHQVHGH0DGULG3DUTXH&LHQWt¿FRGH0D- gica; y en un medio oxidativo formado por 0.67% de drid (UCM-PCM). YNB, ácido glutámico 10mM, 1% de glicerol y 15% de etanol. Finalizado el experimento, las células de Hemos obtenidos 477±20 spots en geles de fer- levadura se recogieron por centrifugación a 3.000 mentación. En el caso geles de medio oxidativo se x g a 4º C durante 10 minutos. Posteriormente, se KDQFXDQWL¿FDGRVSRWVWRWDOHV realizó una lisis física con bolas de vidrio y una lisis química con 20 ml totales de tampón de extracción 6HKDQLGHQWL¿FDGRVSRWVTXHHVWiQSUH- compuesto por tampón Tris 100 mM, a pH 8,0, sentes tanto en los geles correspondientes al medio PMSF 1mM, EDTA1 mM, DTT2 mM, y un cóctel de fermentación como en los geles pertenecientes al de inhibidores de proteasas (Roche). El extracto medio oxidativo, éstos son los spots comunes. de proteínas se precipitó con TCA-Acetona-DTT Se ha observado que la expresión de los spots en 0.07% durante 24 horas a -20ºC. Se resuspendió en geles de medio oxidativo está mucho menos acen- tampón de solubilización (Urea 8M, 2% CHAPS 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 119 tuada que en los geles de fermentación, así como Referencias que el número total de spots expresados es menor que en el caso de fermentación. [1] Cheng JS, Qiao B, Yuan YJ. Comparative proteome analysis of robust Saccharomyces Se ha comprobado que las proteínas en ambos cerevisiae insights into industrial continuous and geles bidimensionales pertenecen fundamentalmen- batch fermentation. Appl Microbiol Biotechnol te a la glicolisis, gluconeogénesis y biosíntesis de 2008; 81:327-338. glicerol. Por otro lado, se han encontrado proteínas [2] Bradford MM. A rapid and sensitive method expresadas en medio oxidativo que no están pre- for the quantitation of microgram quantities of sentes en medio de fermentación. Estas proteínas protein utilizing the principle of protein-dye se relacionan con el estrés oxidativo y actualmente binding. Anal Biochem 1976;72:248-254. están siendo estudiadas. La mayoría de las proteí- [3] Kolkman A, Slijper M, J.R. Heck A. Develop- QDVFXDQWL¿FDGDVVHHQFXHQWUDQHQODEDVHGHGDWRV ment and application of proteomics technologies de SwissProt de Saccharomyces cerevisiae (www. in Saccharomyces cerevisiae. Trends in Biote- expasy.ch/sprot). chnol 2005; 23:12. >@ 0DWKHVLXV8.HLM]HUV61DWHUD+$:HLQPDQ Agradecimientos JJ, Djordjevic MA, Rolfe BG. Establishment of a root proteoma reference map for the model (VWHWUDEDMRKDVLGR¿QDQFLDGRSRUHO0LQLVWHULR legume Medigaco trunculata using the ex- de Ciencia e Innovación (INIA) proyecto RTA2008- pressed sequence tag database for peptide mass 00056-C02-02 y FEDER. ¿QJHUSULQWLQJ3URWHRPLFV Estudio proteómico comparativo de células de Saccharomyces cerevisiae libres y bioinmovilizadas Teresa García-Martínez, Juan Carlos Mauricio 'HSDUWDPHQWRGH0LFURELRORJtD8QLYHUVLGDGGH&yUGRED&DPSXVGH5DEDQDOHV(GL¿FLR6HYHUR2FKRD Tradicionalmente, la levadura Saccharomyces ce- de este trabajo ha sido realizar un estudio proteómico revisiae se ha usado en alimentación, principalmente comparativo entre las células de levadura en forma por su producción de etanol en bebidas alcohólicas libre y en forma bioinmovilizada en el medio de for- durante miles de años. La avanzada biotecnología de mación de las biocápsulas de levadura. las células inmovilizadas en procesos fermentativos de interés aporta una serie de ventajas técnicas y Los microorganismos usados en este estudio han económicas frente a los sistemas convencionales de sido una cepa de Saccharomyces cerevisiae var. ca- células libres [1]. Nuestro grupo de investigación ha pensis G1, aislada de un vino bajo crianza biológica puesto a punto un sistema de bioinmovilización que de la D.O. Montilla-Moriles y un hongo, Penicillium consiste en una co-inmovilización espontánea de un chrysogenum H3, aislado del ambiente. El medio KRQJR¿ODPHQWRVR Penicillium chrysogenum H3) y de cultivo y las condiciones en las que se produjo la una levadura (Saccharomyces cerevisiae G1), en au- bioinmovilización fueron: medio YNB que contiene sencia de compuestos químicos de unión y de sopor- ácido glucónico como fuente de carbono, amonio WHVH[WHUQRVPHGLDQWHODFUHDFLyQDUWL¿FLDOPHQWHGH como fuente de nitrógeno y tamponado a pH 7. Dos condiciones adecuadas para favorecer una simbiosis matraces Erlenmeyer de 250 mL con 150 mL de me- [2]. Al inmovilizado creado, que son esferas huecas dio de formación de biocápsulas se inocularon con 6 de ambos microorganismos, lo hemos denominado 4 x 10 células de G1/mL y un asa de siembra del “biocápsulas de levadura”, y éstas pueden ser apli- hongo H3. Se incubaron a 28ºC en un agitador orbital cadas a diversos procesos fermentativos. El objetivo a 200 rpm durante 7 días, formándose durante este 120 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 tiempo las biocápsulas de levadura. Para el estudio de en el nivel de proteínas de las células inmovilizadas las células de levadura libres se procedió de la misma puede ser debido a que la levadura reduzca su sín- PDQHUDVLQODLQRFXODFLyQGHOKRQJR¿ODPHQWRVR/DV WHVLVSRUTXHYLYHDH[SHQVDVGHOKRQJR¿ODPHQWRVR células de levadura inmovilizadas se extrajeron del en forma de simbiosis. La totalidad de las proteínas inmovilizado por rotura mecánica y agitación vigo- FXDQWL¿FDGDVVHHQFXHQWUDQHQODEDVHGHGDWRVGH rosa en una solución de NaCl 100 mM, posteriormen- SwissProt de Saccharomyces cerevisiae y en ambos te las células de levadura se separaron de las hifas casos abundan las proteínas de la glicolisis. En célu- SRUGRV¿OWUDFLRQHVVXFHVLYDV SULPHURSRUXQ¿OWUR las bioinmovilizadas, se observa una disminución de Millipore de 180 µm y después por otro de 30µm). proteínas básicas de bajo peso molecular. En la actua- Ambos tipos de células de levadura se recogieron por lidad, se está continuando con el análisis de proteínas centrifugación a 3000 x g a 4º C durante 10 minutos. de estos geles en estas dos condiciones ensayadas. La lisis celular tanto de las células de levadura libres como las procedentes del inmovilizado se realizó En conclusión, el análisis proteómico de ambos en un Vórtex- Genie2 con DTT, bolas de vidrio, y geles bidimensionales muestra una disminución im- los tampones 1 y 2 necesarios para la extracción de portante del número de spots en las células de leva- las proteínas. Tampón 1: SDS (5%); TRIS-HCl (0.5 GXUDFRLQPRYLOL]DGDVFRQHOKRQJR¿ODPHQWRVR/D M); pH 7.5 y tampón 2: Thiourea (2 M); urea (7 M); mayor disminución corresponde a proteínas básicas CHAPS (4 %); DTT (1%); Pharmalite 3-10 (2 %) [3]. de bajo peso molecular. La precipitación de proteínas se hizo con Tricloroacé- tico (TCA) al 10% diluido en acetona fría. La con- Agradecimientos centración de proteínas de los extractos celulares se determinó mediante el método descrito por Bradford (VWHWUDEDMRKDVLGR¿QDQFLDGRSRUHO0LQLVWHULR [4]. Se realizó una electroforesis bidimensional: para de Ciencia e Innovación (INIA) proyecto RTA2008- la primera dimensión se utilizaron tiras IPG de 17 00056-C02-02 y FEDER. cm, con gradiente de pH no lineal +N3-10 (Bio-Rad) fueron rehidratadas con 150 µg de proteína en 300 µL de tampón de solubilización. El isoelectroenfoque se Referencias llevó a cabo en un PROTEAN IEF CELL (Bio-Rad) µ [1] Kourkoutas Y, Bekatorou A, Banat IM, Marchant a una corriente constante de 50 A per tira hasta 40 R, Koutinas AA. Immobilization technologies 000 Vh. Para la segunda dimensión (SDS-PAGE), las and support materials suitable in alcohol be- proteínas se separaron en geles al 13% de poliacrila- verages production: a review. Food Microbiol mida en un PROTEAN II CELL. Los geles corrieron 2004;21:377-397. a una corriente constante a 60 mA per gel. Los ge- les preparativos fueron teñidos con CBB G-250 [5] [2] Peinado RA, Moreno JJ, Villalba JM, Gonzá- lez-Reyes JA, Ortega JM, Mauricio JC. Yeast 0HUFN*HUPDQ\ /DLGHQWL¿FDFLyQGHODVSURWHtQDV biocapsules: A new immobilization method se realizó en la Unidad de Proteómica, de la UCO, and their applications. Enz Microb Technol miembro de ProteoRed, usando MALDI-TOF para 2006;40:79-84. VXLGHQWL¿FDURQHQOD%DVHGH'DWRVGH6ZLVV3URW\ Trembl del Proteoma de Levaduras de S.cerevisiae, [3] Khoudoli GA, Porter IM, Blow JJ, Swedlow, R. (www.expasy.ch/sprot). Los geles se analizaron me- Optimisation of the two-dimensional gel electro- diante el programa PD-Quest 8.0.1 (Bio-Rad). phoresis protocol using the Taguchi approach. Proteome Sci 2004;2:6. Después de 7 días, la levadura libre en el medio [4] Bradford MM. A rapid and sensitive method de formación de biocápsulas solamente se dividió una for the quantitation of microgram quantities of vez (una generación), lo que era de esperar puesto que protein utilizing the principle of protein-dye este medio no es fermentativo para la levadura. Sin binding. Anal Biochem 1976;72:248-254. embargo, la levadura inmovilizada creció algo más, VHJXUDPHQWHDH[SHQVDVGHOKRQJR¿ODPHQWRVR >@ 0DWKHVLXV8.HLM]HUV61DWHUD+$:HLQPDQ JJ, Djordjevic MA, Rolfe BG. Establishment El número de spots encontrados en los geles de of a root proteoma reference map for the model las células libres de levadura fue aproximadamente legume Medigaco trunculata using the expres- del doble de los observados en los geles de las células sed sequence tag database for peptide mass de levadura inmovilizadas. Esta gran disminución ¿QJHUSULQWLQJ3URWHRPLFV 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 121 (VWXGLRFRPSDUDWLYRGHOSHUILOSURWHLFRGHFHSDVVLOYHVWUH %< \ PXWDQWH WUN GHSaccharomyces cerevisiae en condiciones de ayuno en K+ Miguel Curto1, Clara Navarrete2, Luis Valledor3, María Luisa Hernández4, José Ramos2, Jesús Jorrín1 1 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Córdoba, 14071 Córdoba, España. 2Departamento de Microbiología, Universidad de Córdoba, Córdoba, España. 3 Departamento de Biología de 2UJDQLVPRV\6LVWHPDVÈUHDGH¿VLRORJtDYHJHWDO8QLYHUVLGDGGH2YLHGR2YLHGR(VSDxD4Departamento GH0LFURELRORJtD,,)DFXOWDGGHIDUPDFLD8QLYHUVLGDG&RPSOXWHQVHGH0DGULG3DUTXH&LHQWt¿FRGH Madrid (UCM-PCM). Madrid, España. ClK) de K+ en el medio [2]. Se realizaron extraccio- Resumen nes de proteínas [3] y geles bidimensionales (IEF en Se ha llevado a cabo el estudio comparativo del el rango de pH 5-8; SDS-PAGE 12 %; tinción con proteoma de las cepas silvestre (BY4741) y mutante &RRPDVVLHFRORLGDO >@GH:7\trk1,2 a 0 (control), + (trk1,2) de Saccharomyces cerevisiae en condiciones 30, 60, 180 y 300 tras la eliminación del K . Se de- limitantes de K+, utilizando electroforesis bidimen- tecto un descenso progresivo con el tiempo de ayuno sional acoplada a MS. En respuesta al ayuno en tanto en el contenido en proteínas del extracto como K+ se observó un marcado descenso del contenido en el número de spots resueltos, siendo este efecto en proteínas en extractos celulares y del número de más acusado en la cepa mutante que en la silvestre spots en geles bidimensionales, tanto en la variedad (Figura 1). Se picaron los spots que mostraron dife- silvestre como la mutante. Los spots que presentaron rencias cualitativas o cuantitativas, estadísticamente diferencias cualitativas o cuantitativas, estadística- VLJQL¿FDWLYDVHQWRWDOVHVRPHWLHURQDGLJHVWLyQ tríptica, analizándose los péptidos resultantes por PHQWHVLJQL¿FDWLYDVHQWUHFHSDVVHDQDOL]DURQSRU espectrometría de masas (MALDI-TOF-TOF). Tras MS (MALDI-TOF-TOF). Tras la búsqueda en bases de datos (UniProtKB-SwissProt; limitada a la taxo- ODLGHQWL¿FDFLyQPHGLDQWHE~VTXHGDHQEDVHGHGDWRV (UniProtKB-SwissProt; limitada a la taxonomía de nomía de Saccharomyces cerevisiae (Baker’s yeast)) Saccharomyces cerevisiae (Baker’s yeast)) las proteí- XWLOL]DQGRHOVRIWZDUH0$6&27>@VHLGHQWL¿FDURQ nas se agruparon de acuerdo a su función. El ayuno 171 proteínas, que se agruparon según su función en potasio causó una disminución en enzimas del (Figura 2). El ayuno en potasio causó una disminu- metabolismo energético y del metabolismo de ami- ción en enzimas del metabolismo energético y del noácidos, así como a proteínas de respuesta a estrés. metabolismo de aminoácidos, así como a proteínas GHUHVSXHVWDDHVWUpV(QWUHODVSURWHtQDVLGHQWL¿FD- Este trabajo forma parte del proyecto TRANS- das, las relacionadas con el estrés y/o reacciones de LUCENT (http://www.translucent-network.org/), defensa, metabolismo de nucleótidos y transcripción, cuyo objetivo es analizar los mecanismos im- fueron las que presentaron mayores cambios entre plicados en la homeostasis catiónica [1] usando cepas, siendo más abundantes en la cepa silvestre. como sistema modelo S. cerevisiae. Mediante una aproximación de proteómica de expresión diferen- cial basada en electroforesis bidimensional, se ha Agradecimientos LQWHQWDGRLGHQWL¿FDUFDPELRVHQHOFRQWHQLGRHQ Agradecemos el trabajo desarrollado, por la Dra. proteínas como resultado de la doble mutación en Hanna Sychrova (Departamento del transporte de ORVJHQHVTXHFRGL¿FDQSURWHtQDVWUDQVSRUWDGRUDVGH + PHPEUDQD,QVWLWXWRGH¿VLRORJtD5HSXEOLFD&KHFD K (TRK1 y TRK2) [1], y en condiciones de ayuno Praga), con las cepas de S. cerevisiae usadas en este + en K . En un trabajo preliminar, el proteoma de las trabajo. Así como al proyecto “Gene interaction dos cepas (silvestre y doble mutante) se comparó en networks and models of cation homeostasis in Sa- las fases exponencial y estacionaria de la curva de ccharomyces cerevisiae –TRANSLUCENT” por crecimiento, con concentraciones óptimas (50 mM ¿QDQFLDUHVWHWUDEDMR 122 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Referencias [1] Rodríguez-Navarro A y Ramos J. Dual system for potassium transport in Saccharomyces ce- revisiae. Journal of bacteriology, 1984; 159: 940-45. [2] Curto M, Ramos J, Gutierrez L, Gil C, Jorrin J, Proteome analysis of Saccharomyces cerevisiae wild and potassium transport-affected mutant strains. Joint congreess of the spanish society and the latin american human proteome organi- zation. 2009 ; Pamplona. [3] Damerval C, De Vienne D, Zivy M, Thiellement H. Technical improvements in two-dimensional Figura 1. A. Contenido en proteínas en extractos de la cepa silvestre y doble mutante a distintos tiempos tras la elimi- electrophoresis increase the level of genetic nación de K+ del medio. B. Número de spots resueltos en variation detected in wheat-seedling proteins. dichos extractos, en el rango de pH 5-8 y Mr 6-95 KDa. Electrophoresis, 1986; 7: 52–54. >@ 0DWKHVLXV8.HLM]HUV*1DWHUD6+$:HLQPDQ JJ, Djordjevic MA, Rolfe BG. Establishment of a root proteome reference map for the model le- gume Medicago truncatula using the expressed VHTXHQFHWDJGDWDEDVHIRUSHSWLGHPDVV¿QJHU- printing. Proteomics 2001; 1: 1424–40. [5] Perkins DN, Pappin DJC, Creasy DM, Cottrell JS. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis, 1999; 20: 3551-67. Figura 2. Agrupación funcional de las proteínas afectadas por el ayuno en potasio. A. Cepa silvestre; B. Doble mutan- te. Datos expresados en porcentaje. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 123 Análisis mediante 2D-DIGE de la interacción con sangre de una cepa de Saccharomyces cerevisiae potencialmente patógena aislada de suplementos dietéticos Carolina Hernández-Haro, Lucía Monteoliva, Gloria Molero, Concha Gil, María Molina Departamento de Microbiología II, Facultad de Farmacia (UCM). Plaza Ramón y Cajal s/n, Madrid, Spain. La levadura Saccharomyces cerevisiae es co- estándar interno con Cy2 y se separaron en 9 geles nocida por su papel en la elaboración de pan y de TXHWUDVODGHWHFFLyQGHÀXRUHVFHQFLDVHDQDOL]DURQ bebidas alcohólicas tales como el vino, la cerveza con el módulo BVA (Biological Variation Analysis) o la sidra. Además, esta levadura es también con- del software DeCyder. Se realizaron comparaciones sumida en forma de suplementos dietéticos y de entre cepas y entre tiempos de interacción con san- probióticos lo que implica el consumo de las células gre mediante análisis 2-ANOVA detectándose: 43 GHOHYDGXUDYLYDV/RVHIHFWRVEHQH¿FLRVRVHQHO manchas proteicas de expresión diferencial al com- hospedador derivados de este consumo son conoci- parar los distintos tiempos (2-ANOVA-condición dos; sin embargo, no se han estudiado los posibles WLHPSR GHODVFXDOHVVHKDQLGHQWL¿FDGR efectos indeseables, sin duda debido a que S. cerevi- 25, 391 manchas proteicas al comparar las 2 cepas siae se ha considerado siempre un microorganismo (2-ANOVA-condición cepa < = 0.05) de las cuales seguro para uso alimentario. En los últimos años, VHKDQLGHQWL¿FDGR \PDQFKDVSURWHLFDVDO la bibliografía clínica muestra que la incidencia de comparar las distintas cepas en los distintos tiempos infecciones causadas por S. cerevisiae ha aumenta- (2-ANOVA-interacción < = 0.05) de las cuales se GRGHPDQHUDVLJQL¿FDWLYDHQSDFLHQWHVLQPXQRGH- KDQLGHQWL¿FDGR (QWUHHVWDVSURWHtQDVVHHQ- primidos [1], por lo que actualmente S. cerevisiae cuentran proteínas metabólicas, chaperonas y ATP se incluye en el grupo de “patógenos oportunistas sintasas. Además, podemos destacar que entre las emergentes” [2-3]. Para estudiar la posible relación SURWHtQDVGHH[SUHVLyQGLIHUHQFLDOLGHQWL¿FDGDVWDP- entre la ingesta de células vivas de S. cerevisiae, bién se encuentran proteínas de la sangre. Esto po- a través del consumo de suplementos dietéticos y dría ser debido a una fuerte unión de estas proteínas probióticos, y las infecciones en humanos, se probó DODVOHYDGXUDV$FWXDOPHQWHVHHVWiQLGHQWL¿FDQGR la virulencia de diferentes cepas en modelo murino el resto de las proteínas de expresión diferencial. de infección sistémica observándose un 50% de muerte de ratones con una de las cepas, por lo que se Carolina Hernández Haro es becaria FPI del planteó el análisis de los posibles rasgos de virulen- 0,&,11(OWUDEDMRHVWi¿QDQFLDGRSRUHOSUR\HFWR cia asociados a estos S. cerevisiae patógenos [4]. El AGL2006-12710-C02-02/ALI de la DGICYT del REMHWLYRGHHVWHWUDEDMRHVODLGHQWL¿FDFLyQGHSUR- MEC. Proyecto coordinado con el grupo de inves- teínas potencialmente implicadas en la virulencia, tigación de las Dras. Amparo Querol y Mª Teresa para lo cual se ha realizado un estudio comparativo Fernández-Espinar del IATA (Valencia). de la expresión diferencial mediante el sistema 2D- DIGE de proteínas de extractos citoplasmáticos de Referencias una cepa procedente de dichos suplementos dieté- ticos caracterizada como virulenta y una cepa de [1] Enache-Angoulvant A y Hennequin C. Invasi- laboratorio avirulenta. Las muestras se obtuvieron ve Saccharomyces infection: a comprehensive tras la interacción de las células de levadura con review. Clin Infect Dis 2005;41:1559-68. sangre humana a distintos tiempos (0, 1.5 y 3 horas) [2] Murphy A y Kavanagh K. Emergence of Sac- a 37ºC y en condiciones semiaeróbicas. Se utilizó la charomyces cerevisiae as a human pathogen, sangre humana debido a que la diseminación de la Implications for biotechnology. Enz Microbial levadura en el torrente sanguíneo constituye una eta- Technol 1999;25:551-7. pa esencial para el desarrollo de infección sistémica. [3] Muñoz P, Bouza E, Cuenca-Estrella M, Eiros J M, Los extractos de proteína de tres réplicas biológicas Pérez M J, Sánchez-Somolinos M et al. Saccharo- VHPDUFDURQFRQORVÀXRURFURPRV&\R&\\HO myces cerevisiae fungemia: an emerging infectious 124 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 disease. Clin Infect Dis 2005;40:1625-34. strains from Saccharomyces cerevisiae species as a possible origin of systemic infection. Int J [4] De Llanos R, Querol A, Permán J, Gobernado Food Microbiol 2006;110:286-90. M y Fernández-Espinar M T. Food and probiotic Análisis comparativo de diferentes aproximaciones para el estudio del proteoma de Saccharomyces cerevisiae Dolores Gutiérrez1, Mª Luisa Hernaéz1, Montserrat Martínez-Gomariz1, María Posada1, Concha Gil2 18QLGDGGH3URWHyPLFD8QLYHUVLGDG&RPSOXWHQVHGH0DGULG3DUTXH&LHQWt¿FRGH0DGULG 8&03&0 2Departamento de Microbiología II. Facultad de Farmacia. Universidad Complutense de Madrid En los últimos años el gran desarrollo de los La técnica de separación mediante isoelectroen- espectrómetros de masas y las técnicas de fraccio- foque en solución resuelve proteínas o péptidos en namiento de péptidos y proteínas ha permitido el función de su punto isoeléctrico (pI). Las fracciones estudio de muestras complejas de proteínas. A pesar resultantes están en solución lo que permite aco- de ello aún estamos lejos de conseguir el análisis plarlas a un segundo paso de fraccionamiento como completo de proteomas o subproteomas. cromatografía líquida y su posterior análisis por espectrometría de masas en tandem (MS/MS). Esta Saccharomyces cerevisiae es un organismo mo- metodología parece altamente efectiva y reproduci- delo desde el inicio en proteómica, para estimar la EOHVLHQGRLQFOXVRFRPSDWLEOHFRQODFXDQWL¿FDFLyQ capacidad real de una tecnología dada en el estudio de proteínas por marcaje con iTRAQ [3]. profundo de un proteoma. Además, cuando esta levadura esta creciendo en fase logarítmica hay evi- En este trabajo hemos diseñado cuatro aproxi- dencias de que más de 4500 proteínas son expresa- maciones proteómicas diferentes en los que se das en un amplio rango dinámico, desde 100 copias combinan diversas técnicas de fraccionamiento y por célula para aquellas proteínas menos abundantes análisis por espectrometría de masas para comparar hasta millones de copias por célula para las proteí- la capacidad de las distintas estrategias para la ca- nas más abundantes. En la actualidad, se ha cubierto racterización del proteoma de esta levadura (Figura más del 50% de su proteoma, aplicando diferen- 1). Los experimentos se detallan a caontinuación: tes combinaciones de fraccionamiento y diferentes equipamientos de espectrometría de masas [1] Experimento 1: Proteínas intactas son separadas mediante isoelectroenfoque, utilizando tiras de 12 La electroforesis bidimensional en geles de cm con un rango de PH de 3-10 con una resolución poliacrilamida (2D-PAGE) ha demostrado amplia- de 0.6, seguido de digestión tríptica de cada fracción mente su utilidad en la capacidad de separación de y nano-RP-HPLC acoplada on-line a ESI-MS/MS proteínas aportando gran información acerca del (LTQ) y off-line a MALDI-MS/MS (4800 MALDI- contenido proteico celular [2]. Sin embargo, pre- 72)72)GH$SSOLHG%LRV\VWHPV SDUDODLGHQWL¿FD- senta algunas desventajas importantes, como la ción de proteínas. Experimento 2: Digestión tríptica limitada cantidad de muestra que se puede cargar del extracto proteico seguido de separación de los en el gel, y la inadecuada resolución de proteínas péptidos según pI mediante Off-Gel usando las mis- hidrofóbicas o de elevado peso molecular. Alter- mas tiras que para la separación de proteínas. Las di- QDWLYDPHQWHODVWpFQLFDVFURPDWRJUi¿FDVSDUDOD ferentes fracciones se separaron mediante RP-HPLC separación de péptidos y proteínas permiten reducir acoplado a MS/MS de la misma manera que en el la complejidad de la muestra y aumentar el número experimento 1. Experimento 3: Digestión de proteí- GHSURWHtQDVLGHQWL¿FDGDV nas seguida de cromatografía bidimensional off-line (SCX y nano-RP-HPLC) acopladas a espectrometría 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 125 Figura 1. Esquema de trabajo de los cuatro experimentos de masas en tandem en la misma forma que los ex- Agradecimientos perimentos anteriores. Experimento 4: Separación de proteínas mediante SDS-PAGE. Se corta el gel en El análisis proteómico se ha realizado en la Uni- 12 bandas, cada una de éstas se digiere por separado dad de Proteómica de la UCM-PCM, miembro de y los péptidos extraídos se analizan mediante nano- Proteored. RP-HPLC y espectrometría de masas en tandem como se ha detallado anteriormente. Referencias /D¿QDOLGDGGHHVWHHVWXGLRHVFRPSDUDUHO [1] de Godoy LM, Olsen JV, de Souza GA, Li G, efecto de las cuatro estrategias en relación a la Mortensen P y Mann M. Status of complete LGHQWL¿FDFLyQ GHO SURWHRPD GH S. cerevisiae y proteome analysis by mass spectrometry: SILAC analizar la capacidad de las distintas técnicas de labeled yeast as a model system. Genome Biol fraccionamiento para detectar proteínas de baja 2006;7:R50. abundancia. Este estudio nos facilitará información para decidir cuál es la aproximación de elección, [2] Perrot M, Moes S, Massoni A, Jenoe P y con la tecnología que disponemos, para el análisis Boucherie H. Yeast proteome map (last update). Proteomics 2009;9:4669-73. de mezclas complejas. [3] Chenau J, Michelland S, Sidibe J y Seve M. Peptides OFFGEL electrophoresis: a suitable pre-analytical step for complex eukaryotic sam- ples fractionation compatible with quantitative iTRAQ labeling. Proteome Sci 2008;6:9. 126 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Applying proteomic technologies to dissect molecular aspect of phytopathogenic fungi, a Botrytis cinerea approach Francisco Javier Fernández-Acero, Carlos Garrido, María Carbú, Victoria E. González-Rodríguez, Jesús Manuel Cantoral Laboratory of Microbiology, Marine and Environmental Sciences Faculty, University of Cádiz, Pol. Río San Pedro s/n, Puerto Real, 11510, Cádiz, Spain Abstract crop, such as B. tulipae, B. squamosa or B. fabae, pathogen to tulips, bean and onions respectively. Two dimensional gel electrophoresis (2-DE) However, B. cinerea is able to attack more than 200 plus mass spectrometry (MS) have been widely used species, including tomatoes, strawberries and gra- to study the proteome of a good number of tissues, pes, three of the most important crops in Andalusia. plants, animals or microorganisms. However, few 7KLVIXQJXVKDVJUHDWÀH[LELOLW\SUHIHUDEO\LVDEOH of them have been carried out to study the proteome to attack fruit (grapes, strawberries, tomatoes, etc.), of phytopathogenic fungi. These organisms are res- ÀRZHUVEXWDOVRLVDEOHWRDWWDFNVWHPVOHDYHVDQG ponsible of several plant diseases in different crops seeds. Moreover, it is also capable to attack many around the world, causing very important economic different plants (grapevine, tomato, Arabidopsis, losses to the farmers. There are several reasons to roses, etc.), in different organs of the same plant explain the lack of proteomic studies describing fun- (fruits, leaves, petals and other structures of the gal plant pathogen proteomes. The main aim of this same plant). Furthermore, the disease may appear work is to tackle the strategies to overcome these directly “in planta” or during storage and distribu- SUREOHPVLHE\WKHPRGL¿FDWLRQRISURWHLQH[WUDF- tion of fruits. These data show the relevance of this tion protocols, or using microbiology techniques to pathogen that is being currently considered as a mo- decrease the analytical variability. del organism in all those experimental approaches to the study of plant-pathogen interaction. Main text The fact that there are only few reports on the proteome of phytopathogenic fungi is mainly due Fungal plant pathogens are one of the main res- WRSUREOHPVVXFKDVWKHGLI¿FXOW\LQREWDLQLQJIXQ- ponsible of farmer losses. By way of example, the gal protein extracts or the lack of available fungal annual consumption of fungicides against phytopa- protein databases [2]. An effective protein extrac- thogenic fungus Botrytis cinerea (Botrycides) moves tion is a key step for obtaining a good resolution about 10% of global fungicide market, which would avoiding streaking in the 2-DE gels. It will allow mean 540 million per year [1]. Moreover, the losses us to remove contaminants (i. e. nucleid acid, salts, increase with the value of agricultural losses, quan- lipids, pigments) which may disturb the proteins WL¿HGEHWZHHQDQGPLOOLRQ(XURVSHU\HDU focusing. However, it is especially relevant when The losses caused by B. cinerea in French vineyards WKHELRORJLFDOVRXUFHLVD¿ODPHQWRXVIXQJXVGXH are between 15% and 40% per year, depending on to its richness in cell wall polysaccharides, and the weather conditions. In Holland, B. cinerea produces mechanical resistance of the fungal cell wall. This DORVVLQÀRZHUFURSVDQGLQ6SDLQ problem has been overcome by using phenol ba- in the strawberry crops. Annual average expenditure sed protocol [3]. On the other hand, the amount of on fungicides against Botrytis, is around 3 million genomic resources is increasing continuously, and Euros in tomato crops, 2 million in strawberry and DERXWIXQJDOJHQRPHSURMHFWVDUHEHLQJ¿QLVKHG 3 million in grapewine crops (BASF, personal com- (Broad Institute, MIT, Harvard). This information is munication). The genus Botrytis is an ascomycetes FUXFLDOWRJHWVLJQL¿FDQWQXPEHURISRVLWLYHSURWHLQ ¿ODPHQWRXVIXQJXVZKLFKLQFOXGHVDODUJHQXPEHU LGHQWL¿FDWLRQKLWV,QVSLWHRIWKHVHSUREOHPVVHHPWR of pathogenic species capable of infecting a variety be overcame, there are still some points that become of crops. Some species are able to infect a single 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 127 FULWLFDODSURWHRPLFDSSURDFKWR¿ODPHQWRXVIXQJDO References proteome. In spite of other aspects, we are especia- OO\LQWHUHVWHGLQWZRPDMRU¿HOGV L WRGHFUHDVHWKH [1] UIPP, Union des Industries de la Proteccion des levels of variability founded in these studies, and (ii) Plantes, Boulogne 2002. WRLQFUHDVHWKHEHQH¿WREWDLQHGIURPWKHODUJHOLVWRI [2] Fernández-Acero FJ, Carbú M, Garrido C, Va- LGHQWL¿HGSURWHLQV llejo I and Cantoral JM. Proteomic Advances in Phytopathogenic Fungi. Curr Proteomics Calculations of analytical and biological varia- 2007;4:79-88. bility are directed to quantify the variations associa- ted with the 2-DE experiments and differences in the [3] Fernández-Acero FJ, Colby T, Harzen A, Can- toral JM and Schmidt J. Proteomic analysis level of protein expression between independent re- of the phytopathogenic fungus Botrytis cin- plicates [4]. The averages of analytical and biologi- erea during cellulose degradation. Proteomics FDOFRHI¿FLHQWVRIYDULDQFHDUHXVHGWREHFDOFXODWHG 2009;9:2892-902. [5]. Only those changes consistently present in all the extract replicates, whose quantitative differences [4] Fernández-Acero FJ, Carbú M, Garrido C, are higher than the corresponding biological and Collado IG, et al. Screening Study of Potential analytical variance, should be considered [2]. In Lead Compounds for Natural Product-based spite of the levels obtained in fungal approaches are Fungicides Against Phytophthora Species. J. similar to the obtained variability in plant or micro- Phytopathol 2006;154:616-21. RUJDQLVPVWXGLHV>@:HKDGXVHGPRQRFRQLGLDO [5] Jorge I, Navarro RM, Lenz C, Ariza D, et al. isolates in attempt to decrease these levels, but the The Holm Oak leaf proteome: Analytical and UHVXOWVUHPDLQKLJK2QWKHRWKHUKDQGWKH¿QDO biological variability in the protein expression results obtained in a proteomic approach use to be OHYHODVVHVVHGE\'(DQG3URWHLQLGHQWL¿FDWLRQ DODUJHOLVWRILGHQWL¿HGSURWHLQV7KHUROHRIHDFK tandem mass spectrometry de novo sequencing protein is also discussed for its biological relevance, and sequence similarity searching. Proteomics or used “in further studies”. This information is very 2005;5:222–34. important and interesting, but if we apply our own [6] Fernández-Acero FJ, Jorge I., Calvo E, Vallejo and particular “optics”, we assume the risk of infor- I, et al. Proteomic analysis of phytopathogenic mation losses in other parallel biological process. As fungus Botrytis cinerea as a potential tool for an interesting tool is the website PANTHER (Pro- identifying pathogenicity factors, therapeutic tein ANalysis THrough Evolutionary Relationships; targets and for basic research. Arch of Microbiol ZZZSDQWKHUGERUJ WKDWDOORZVWKHFODVVL¿FDWLRQ 2007;187:207–15. RILGHQWL¿HGSURWHLQVLQGLIIHUHQWFDWHJRULHVDFFRU- >@ +XDQ;+DQJ Gel-based proteomic analysis of Botrytis cinerea. The simplest 1-DE reveals differences in virulence-related protein abundance among strains Raquel González-Fernández, Inmaculada Redondo, Jesús V. Jorrín-Novo Agricultural and Plant Biochemistry and Proteomics Research Group, Dept. of Biochemistry and Molecular Biology, University of Córdoba, Spain Botrytis cinereaLVDSK\WRSDWKRJHQLF¿ODPHQWRXV B. cinerea strains used were B05.10 (from Prof. fungus, which infects more than 200 plant species [1], Dr. Paul Tudzynski lab, Münster, Germany), CECT FDXVLQJVLJQL¿FDQW\LHOGORVVHVLQDQXPEHURIFURSV 2100, 2850, 2996 and 20518 (from Spanish Type Cul- There are a number of isolates of B. cinerea that differ ture Collection) and BOLC (provided by Dr. Angel LQWKHLUYLUXOHQFHDJDLQVWVSHFL¿FFURSV>@,QWKHODVW Villegas from IAS, Córdoba, Spain, and isolated from few years, B. cinerea has been adopted as an impor- lentil infected plants). Three independent (biological) tant model system in molecular phytopathology fungi UHSOLFDWHVHDFKRQHFRUUHVSRQGLQJWRP/ÀDFNV studies [1]. In the post-genomics era, Proteomics has FRQWDLQLQJP/RIPRGL¿HG&]DSHN'R[PLQLPDO became in a powerful tool which can contribute to un- medium (2% w/v sucrose, 0.3% w/v NaNO3, 0.1% w/v derstand biology, infection strategies, and lyfe cycle K2HPO4, 0.05% w/v KCl, 0.05% w/v MgSO4·7H2O, of this fungus, to identify virulence factors, and, on pH 5.0) were inoculated with mycelium taken from the bases of them, to develop crop protection strate- solid cultures grown on cellophane membrane with gies. Up to date only a few proteomics studies have potato dextrose agar. The cultures were grown for 6 been published on this organism [3-7]. In this work, days at 21ºC with agitation (120 rpm) in darkness. we present a preliminary gel-based proteomic analysis 0\FHOLD ZHUH KDUYHVWHG E\ ¿OWUDWLRQ7KH SURWHLQ of mycelium extracts from six different strains of B. precipitation method used was TCA/acetone-phenol/ cinerea:HXVHGDVVWDUWLQJSRLQWRQHGLPHQVLRQDO methanol for recalcitrant tissues described in [8]. Fif- HOHFWURSKRUHVLV '( DQGSURWHLQLGHQWL¿FDWLRQE\ teen µg of protein were subjected to SDS-PAGE [9], MALDI-TOF/TOF. This work is part of an Euro- using the Criterion System (Bio-Rad) with precast Cri- pean research project (BOTBANK EUI2008-03686) terion Stain Free Gels, Tris-HCl, 4-20% linear gradi- within Plant-KBBE, intended at develop a collection ent (Bio-Rad). The protein band pattern was analyzed of mutants of B. cinerea and validate the creation of using the Image Lab software (Bio-Rad). The bands this library with the characterization of the mutant were cutted out and digested with trypsin. The MS of lines whose infectious cycle is affected. tryptic peptides was analyzed in a 4800 Proteomics Figure 1. SDS-PAGE of mycelium protein extracts of six different strains of B. cinerea.,GHQWL¿HGSURWHLQVDUHLQGLFDWHGE\ DUURZV81 XQLGHQWL¿HGSURWHLQ 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 129 Analyzer MALDI–TOF/TOF mass spectrometer (Ap- thogenic fungus Botrytis cinerea during cellulose plied Biosystems). The 3 most abundant peptide ions degradation. Proteomics 2009;9:2892-902. were subjected to MS/MS analysis. A PMF search [4] Fernandez-Acero FJ, Jorge I, Calvo E, Vallejo and a combined search (+MS/MS) were performed in I, Carbu M, Camafeita E, Garrido C, Lopez JA, nrNCBI database of proteins using MASCOT. Jorrin J y Cantoral JM. Proteomic analysis of phytopathogenic fungus Botrytis cinerea as a )LJXUHVKRZVWKHSURWHLQSUR¿OHRIWKHP\F- potential tool for identifying pathogenicity fac- elium extract from the six strains studied (B05.10, tors, therapeutic targets and for basic research. 2100, 2850, 2996, 20518 and BOLC). There were Arch Microbiol 2007;187:207-15. VLJQL¿FDWLYHTXDOLWDWLYHDQGTXDQWLWDWLYHGLIIHUHQFHV LQWKHSURWHLQSUR¿OHDPRQJVWUDLQV6HYHUDOSURWHLQV [5] Fernandez-Acero FJ, Jorge I, Calvo E, Vallejo I, ZHUHLGHQWL¿HGE\0$/',72)72)0606DQDO- Carbu M, Camafeita E, Lopez JA, Cantoral JM y ysis (Figure 1). Some of them have been reported Jorrin J. Two-dimensional electrophoresis protein to be involved in pathogenicity in B. cinerea or in SUR¿OHRIWKHSK\WRSDWKRJHQLFIXQJXV Botrytis other phytopathogenic fungi, such as malate dehy- cinerea. Proteomics 2006;6S1:S88-96. drogenase [5], woronin body major protein [10], [6] Shah P, Atwood JA, Orlando R, El Mubarek H, peptidyl-prolyl cis-trans isomerase (PPI) [11] and Podila GK y Davis MR. Comparative proteomic PIC5 protein [12], or implicated in fungal growth analysis of Botrytis cinerea secretome. J Proteo- and differentiation, such as nucleoside diphosphate me Res 2009;8:1123-30. kinase [13]. The abundance of these proteins was [7] Shah P, Gutierrez-Sanchez G, Orlando R y Berg- different among isolated (Figure 1). mann C. A proteomic study of pectin-degrading enzymes secreted by Botrytis cinerea grown in :RUNLVQRZLQSURJUHVVLQGLIIHUHQWGLUHFWLRQV liquid culture. Proteomics 2009;9:3126-35. i) analysis of spores and culture media in wild-type strains; ii) analysis of mutants, obtained by Agro- >@ :DQJ:9LJQDQL56FDOL0\&UHVWL0$XQL- bacterium tumefaciens-mediated transformation versal and rapid protocol for protein extraction (ATMT) and affected in infectious cycle; and iii) from recalcitrant plant tissues for proteomic use of 2-DE, and LC-based proteomic approaches. analysis. Electrophoresis 2006;27:2782-6. [9] Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage $FNQRZOHGJHPHQWV T4. Nature 1970;227:680-5. This work was supported by the Spanish “Mi- [10] Soundararajan S, Jedd G, Li X, Ramos-Pamplona nisterio de Ciencia e Innovación” (BOTBANK 0&KXD1+\1DTYL1,:RURQLQERG\IXQFWLRQ Proyect: EUI2008-03686), the “Junta de Andalu- in Magnaporthe griseaLVHVVHQWLDOIRUHI¿FLHQW cía” and the “Universidad de Córdoba” (AGR 164). pathogenesis and for survival during nitrogen Thanks to Consuelo Gómez from SCAI (Córdoba, starvation stress. Plant Cell 2004;16:1564-74. 6SDLQ IRUSURWHLQLGHQWL¿FDWLRQ [11] Viaud M, Brunet-Simon A, Brygoo Y, Pradier JM y Levis C. Cyclophilin A and calcineurin functions investigated by gene inactivation, cy- References closporin A inhibition and cDNA arrays appro- aches in the phytopathogenic fungus Botrytis >@ (ODG<:LOOLDPVRQ%7XG]\QVNL3\'HOHQ N. Botrytis: biology, pathology and control. cinerea. Mol Microbiol 2003;50:1451-65. Springer, 2004. [12] Gioti A, Simon A, Le Pecheur P, Giraud C, [2] Choquer M, Fournier E, Kunz C, Levis C, Pradier JM, Viaud M y Levis C. Expression Pradier J.M, Simon A y Viaud M. Botrytis SUR¿OLQJRIBotrytis cinereaJHQHVLGHQWL¿HV cinerea virulence factors: new insights into a three patterns of up-regulation in planta and an necrotrophic and polyphageous pathogen. FEMS FKBP12 protein affecting pathogenicity. J Mol Microbiology Letters 2007;277:1-10. Biol 2006;358:372-86. [3] Fernandez-Acero FJ, Colby T, Harzen A, Cantoral [13] Lin X, Momany C y Momany M. SwoHp, a nu- JM y Schmidt J. Proteomic analysis of the phytopa- cleoside diphosphate kinase, is essential in Asper- gillus nidulans. Eukaryot Cell 2003;2:1169-77. 130 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Proteomic approach to Botrytis cinerea survival structures Victoria E. González-Rodríguez, Carlos Garrido, Maria Carbú, Jesús Manuel Cantoral, Francisco Javier Fernández-Acero Laboratory of Microbiology, Marine and Environmental Sciences Faculty, University of Cádiz, Pol. Río San Pedro s/n, Puerto Real, 11510, Cádiz, Spain Abstract sclerotia. Both, conidia and sclerotia, were homo- genized by using FastPrep Instrument (Q-BIOgene, The ascomycete Botrytis cinerea is a phytopatho- Valencia, USA), 12 cycles of 30 second and 6.0 of genic fungus infecting a high number of crops, causing speed. Protein extraction was developed following VLJQL¿FDQW\LHOGORVVHVLQWKHVHFURSVLQ$QGDOXVLD Fernandez-Acero et al [2]. Protein concentration (Spain). In the last few years, B. cinerea has been was determined by using the RC-DC Protein Assay adopted as an important model system in molecular (Bio-Rad). 2-DE was developed following Fernan- phytopathology. Several approaches have been applied dez-Acero et al [2] using Immobilized pH gradient to this fungus to unravel its mechanisms of infection. (IPG) strips (Bio-Rad, 7 cm,) 3-10 or 5-8 linear pH These studies have revealed the complexity and wide gradient (Figure 1). variety of infection strategies used by B. cinerea. This study presents an initial approach to characterize the proteins content of two principal structures of resistan- ce: conidia and sclerotia, which constitutes the princi- SDOLQRFXOXPRIWKHIXQJXVLQWKH¿HOGV$IWHU'( the majority of the spots were found from 5 to 8 of pI values, presenting a Mr from 14 to 105 kDa. After SURWHLQLGHQWL¿FDWLRQZLOOEHGRQHRXUPDLQDLPLVWR ¿QGWKRVHSURWHLQVLQYROYHGLQSULPDU\SODQWOHVLRQ Main text Botrytis cinerea Pers. Fr. is a phytopathogenic DVFRP\FHWHWKDWFDXVHVVLJQL¿FDQW\LHOGORVVHVLQD substantial number of crops. In the last years, many Figure 1. '(JHOIURPWKH¿UVWSURWHRPLFDSSURDFKWRFRQL- dia (left) and sclerotium (right), showing the protein separa- research advances regarding the infection process WLRQLQ,3* XS DQGGHGH¿QLWLYH,3* GRZQ developed by this pathogen have been made. Lately, SURWHRPLFVWHFKQRORJLHVKDYHDOORZHGWKHHI¿FLHQW Obtained proteins from ungerminated conidial FKDUDFWHUL]DWLRQDQGLGHQWL¿FDWLRQRIDODUJHQXP- suspension showed that most of the stained spots ber of proteins from B. cinerea [1-3]. However, a were allocated between pI 5 and 8. The distribution special interest is focused in those proteins involved of the spots attending to its molecular weight (Mr) in the initial steps of plant infection process due to was found from 14.7 to 105.7 kDa. Those spots these proteins are excellent candidates for fungicide presented in all the three replicates were used to design or targets to design diagnosis techniques. calculate the analytical variability of the experiment. Conidial suspensions (1 x 108 cond/mL) were One hundred and eight spots were used obtaining obtained from 15 days B. cinerea 2100 (Spanish % CV average of 42.05 %, which is similar to our type culture collection) malt agar plates following previous experiments. Two dimensional gels from Carbu et al [4]. Sclerotia were obtained from B. Sclerotia present more diverse content. In spite that cinerea strain 992.1-89 (University of Cádiz cul- both structures show similar pI distribution, the ture collection) maintained during 30 days in malt molecular weight was between 3.1 to 158.8 kDa, agar, at 22ºC to obtain a stock of well maturated showing a wider distribution. The obtained % CV 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 131 result was 44.61% by using 205 protein spots. This [2] Fernández-Acero FJ, Colby T, Harzen A, Cantoral UHSRUWVKRZVWKH¿UVWSURWHRPLFDSSURDFKWRB. cine- JM, Schmidt J. Proteomic analysis of the phytopa- rea conidial germination, representing its initial step. thogenic fungus Botrytis cinerea during cellulose Moreover, our initial results with sclerotia seem to degradation. Proteomics 2009;9:2892-902. coincide with the previous studies with Sclerotinia [3] Fernández-Acero FJ, Jorge I, Calvo E, Vallejo sclerotiorum [5] presenting a mayor protein with 34- I, et al. Proteomic analysis of phytopathogenic 36 kDa and 3 isoforms with a pI of 6.2, 6 and 5.8. fungus Botrytis cinerea as a potential tool for Our gels show 6 isoforms with a Mr about 41 kDa, identifying pathogenicity factors, therapeutic and a pI of 5.23, 5.51, 5.65, 5.81, 5.94 and 6.19 as targets and for basic research. Arch Microbiol a mayor component. In spite of the observed diffe- 2007;187:207–15. rences and waiting the results from MALDI TOF/ [4] Carbú M, Fernández-Acero FJ, Garrido C, Re- TOF, we assume that our protein is the same, a Ssp1 bordinos L, et al. Estudio de la competitividad de protein involved in sclerotia development. Botrytis cinerea en viñedos del marco vitivinñi- cola de Jerez. Tecnología del Vino 2004;34-8. References [5] Russo GM, Van Etten JL. Synthesis and loca- OL]DWLRQRIDGHYHORSPHQWVSHFL¿FSURWHLQLQ [1] Fernández-Acero FJ, Jorge I, Calvo E, Vallejo I, sclerotia of Sclerotinia sclerotiorum. J Bacteriol et al. Two-dimensional electrophoresis protein 1985;163:696-703. SUR¿OHRIWKHSK\WRSDWKRJHQLFIXQJXVBotrytis cinerea. Proteomics 2006;6:S88-96. 3HU¿OVHUROyJLFRGHODUHVSXHVWDGHDQWLFXHUSRVIUHQWHDOLQPXQRPDGHCandida en el pronóstico de las candidiasis invasivas Aida Pitarch, César Nombela, Concha Gil Departamento de Microbiología II, Facultad de Farmacia, Universidad Complutense de Madrid Las candidiasis invasivas son infecciones de &RQHO¿QGHLGHQWL¿FDU\YDOLGDUXQQXHYRPp- notable morbilidad y mortalidad, en pacientes se- todo de pronóstico para las candidiasis invasivas, veramente inmunocomprometidos y enfermos crí- se combinó la tecnología SERPA con análisis bio- ticos [1]. El hallazgo de nuevos biomarcadores de informáticos para examinar, en un estadio precoz de pronóstico para estas infecciones oportunistas puede LQIHFFLyQORVSHU¿OHVVHUROyJLFRVGHODUHVSXHVWDGH suponer un nuevo camino para tomar decisiones anticuerpos frente al inmunoma de Candida en 45 terapéuticas más precisas e individualizadas que pacientes con candidiasis invasivas que tuvieron un podrían a su vez mejorar la evolución clínica de es- desenlace fatal o favorable. tos pacientes. Para esta búsqueda, pueden ser útiles técnicas globales de alto rendimiento tales como la Análisis de conglomerados jerárquicos bidimen- inmunoproteómica clásica o el análisis del proteo- sionales y del componente principal de los patrones ma serológico (SERPA) [2]. Diferentes estrategias de reactividad de anticuerpos séricos frente a 31 SERPA (basadas en electroforesis bidimensional proteínas inmunogénicas de Candida separaron con seguida de “western-blotting” y espectrometría de precisión pacientes con estas micosis oportunistas masas) han permitido el descubrimiento de varios en dos grupos con pronósticos diferentes (aquellos biomarcadores clínicos y dianas terapéuticas para que sobrevivieron de los que fallecieron durante estas micosis oportunistas [2-5]. el proceso infeccioso). Estos subgrupos fueron in- GHSHQGLHQWHVGHODVFDUDFWHUtVWLFDVGHPRJUi¿FDV 132 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 y clínicas de la población de estudio. Análisis su- cia y Tecnología (proyecto BIO-2009-07654) por las pervisados con validaciones cruzadas permitieron D\XGDV¿QDQFLHUDVUHFLELGDV LGHQWL¿FDUXQSDQHOGHFLQFRDQWLFXHUSRVFRPROD mejor combinación para predecir el pronóstico de ODVFDQGLGLDVLVLQYDVLYDV6XUREXVWH]VHFRQ¿UPy Referencias en otro grupo de pacientes con estas micosis oportu- [1] Pfaller MA y Diekema DJ. Epidemiology of nistas. Este panel permitió determinar, en un estadio invasive candidiasis: a persistent public health precoz de infección, el riesgo de un pronóstico fatal problem. Clin Microbiol Rev 2007;20:133-63. en pacientes con estas infecciones invasivas, así FRPRGH¿QLUJUXSRVGHSDFLHQWHVHQDOWRULHJRTXH [2] Pitarch A, Nombela C y Gil C, The Candida immunome as a mine for clinical biomarker SXHGHEHQH¿FLDUVHGHWHUDSLDDQWLI~QJLFD0RGH- development for invasive candidiasis: From los de regresión logística indicaron que este panel biomarker discovery to assay validation en Pa- proporcionaba un poder discriminatorio adicional thogenic Fungi: Insights in Molecular Biology sobre factores de pronóstico conocidos para estas (editores: San-Blas G. y Calderone R.A.), Cais- infecciones invasivas. WHU$FDGHPLF3UHVV:\PRQGKDP8.SS (VWRVUHVXOWDGRVSRQHQGHPDQL¿HVWRTXHVH 103-42. puede predecir el pronóstico en pacientes con can- [3] Pitarch A, Jiménez A, Nombela C y Gil C. Se- didiasis invasivas mediante la evaluación de un nú- rological proteome analysis to identify systemic mero relativamente pequeño de biomarcadores. Si candidiasis patients in the intensive care unit: VHFRQ¿UPDHQHVWXGLRVGHFRKRUWHVSURVSHFWLYRV Analytical, diagnostic and prognostic validation multicéntricos, éstos serán de enorme utilidad para of anti-Candida enolase antibodies on quanti- WRPDUGHFLVLRQHVWHUDSpXWLFDVPiVHVSHFL¿FDVHLQ- tative clinical platforms. Proteomics Clin Appl dividualizadas. 2008;2:596-618. [4] Pitarch A, Jiménez A, Nombela C y Gil C. De- coding serological response to Candida cell wall Agradecimientos immunome into novel diagnostic, prognostic, Los autores expresan su más sincero agradeci- and therapeutic candidates for systemic candi- diasis by proteomic and bioinformatic analyses. PLHQWRDOD&iWHGUD([WUDRUGLQDULD0HUFN6KDUS Mol Cell Proteomics 2006;5:79-96. Dohme (MSD) en Genómica y Proteómica, a la Red Española para la Investigación en Enfermedades [5] Pitarch A, Abian J, Carrascal M, Sánchez M, Infecciosas (REIPI) del Ministerio de Salud y Con- 1RPEHOD&\*LO&3URWHRPLFVEDVHGLGHQWL¿- sumo e Instituto de Salud Carlos III – FEDER (pro- cation of novel Candida albicans antigens for yecto RD06/0008/1027), a la Comunidad de Madrid diagnosis of systemic candidiasis in patients (proyecto S-SAL-0246/2006 DEREMICROBIA- with underlying hematological malignancies. NA-CM), y a la Comisión Interministerial de Cien- Proteomics 2004;4:3084-106. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 133 $QiOLVLVSURWHyPLFRGHODPDWUL]H[WUDFHOXODU 0( GHELRSHOtFXODVIRUPDGDVSRU mutantes del hongo Candida albicansSDUDJHQHVTXHFRGL¿FDQSURWHtQDVTXHFRQ- tienen el dominio CFEM rico en cisteína y genes implicados en glicosilación Rosario Blanes1, Ana M. Pérez1, Amelia Murgui2, Manuel Casanova1, Ángel Domínguez3, José P. Martínez1 1Departamento de Microbiología y Ecologia, 2Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Farmacia, Universitat de València/Estudi General (UVEG), Valencia, e 3Instituto de Microbiología Bio- química, Universidad de Salamanca, Salamanca (España) Introducción PGA10 (también designado como RBT51 y HPB1) y WAP1, que forman biopelículas muy frágiles y con Candida albicans es un hongo patógeno oportu- poca capacidad de adherencia al sustrato (Figura nista capaz de producir graves infecciones sistémi- 1) frente a lo observado en la cepa parental CAI4- cas en indivíduos inmunocomprometidos. Entre los URA3 (Fig. 1) [4]. Por otro lado, dado que los re- C. albicans DWULEXWRVELROyJLFRVTXHOHFRQ¿HUHQD sultados descritos en la bibliografía [5] indican que su potencial patogénico, la capacidad de formar el componente mayoritario presente en la ME de las biopelículas parece jugar un papel esencial. Las biopelículas formadas por C. albicans son carbohi- biopelículas son comunidades celulares altamente dratos, también se consideró interesante determinar organizadas con una compleja estructura tridimen- la capacidad de formar biopelículas de mutantes de sional, adheridas a un sustrato sólido (biológico o - no biológico), en la que las células se encuentran HVWHKRQJRGH¿FLHQWHVHQJOLFRVLODFLyQ(QFRQFUH embebidas en una matriz exocelular (ME) formada to se estudiaron mutantes para los genes MNN9 y por polisacáridos, proteínas y otros componentes ALG5, que al igual que en el caso anterior formaron minoritarios. La ME juega un papel crítico en el biopelículas muy frágiles y con poca capacidad de mantenimiento de la integridad estructural de las adherencia al sustrato (Figura 1). biopelículas y en la protección de las células frente a factores externos adversos como el sistema inmuni- tario y/o el tratamiento con antimicrobianos [1]. Por lo tanto, un mejor conocimiento a nivel molecular y funcional de los constituyentes mayoritarios de la ME podría ser esencial en el desarrollo de nuevas estrategias para el diagnóstico, prevención y control de las candidiasis [2]. La formación de biopelículas es un proceso bio- Figura 1. Aspecto macroscópico de las biopelículas forma- lógico muy complejo durante el cual las células das por las diferentes cepas de C. albicans analizadas. fúngicas deben establecer múltiples interacciones con el entorno ambiental. En este contexto, se ha descrito la presencia en C. albicans de una familia Material y métodos de proteínas que contienen un dominio formado por 8 cisteínas, denominado CFEM (common in Biopelículas de 48 h formadas por las cepas de several fungal extracellular membrane proteins), y C. albicans analizadas fueron tratadas con etanol al TXHSXHGHQDFWXDUFRPRUHFHSWRUHVGHVXSHU¿FLH 60% durante 60 min. Los extractos etanólicos resul- en transducción de señales, y como moléculas de WDQWHVIXHURQFRQFHQWUDGRVPHGLDQWHOLR¿OL]DFLyQ adhesión en las interacciones huésped-parásito [3]. valorándose su concentración proteica mediante el Nuestro grupo dispone de una colección de cepas método de Bradford [6]. Seguidamente se determi- FRQPXWDFLRQHVHQJHQHVTXHFRGL¿FDODVtQWHVLVGH nó el patrón polipeptídico asociado a cada extracto proteínas de la familia CFEM, en concreto los genes mediante electroforesis bidimensional en geles de 134 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 poliacrilamida del 12% (en la segunda dimensión). análisis proteómico por espectrometría de masas /RVSHU¿OHVSURWHLFRVVHPXHVWUDQHQOD)LJXUD (MALDI/MALDI-TOF). Referencias [1] Branda SS, Vik S, Friedman L y Kolter R. Bio- ¿OPV WKHPDWUL[UHYLVLWHG7UHQGV0LFURELRO 2005;13:20-6. [2] Thomas DP, Viudes A, Monteagudo C, Lazzell AL, Saville SP, López-Ribot JL. A proteomic- EDVHGDSSURDFKIRUWKHLGHQWL¿FDWLRQRICandida albicans protein components present in a subunit vaccine that protects against disseminated can- didiasis. Proteomics 2006;6:6033-41. [3] Kulkarni RD, Kelkar HS, Dean RA. An eight- cysteine-containing CFEM domain unique to a group of fungal membrane proteins. Trends Figura 2. Análisis mediante electroforesis bidimensional Biochem Sci 2003;28:118-21. en geles de poliacrilamida de los extractos obtenidos por tratamiento con etanol al 60% de las biopelículas formadas [4] Pérez A, Pedrós B, Murgui A, Casanova M, por las diferentes cepas de C. albicans estudiadas y que se /ySH]5LERW-/0DUWtQH]-3%LR¿OPIRUPDWLRQ muestran en la Fig. 1. by Candida albicans mutants for genes coding fungal proteins exhibiting the eight-cysteine- containing CFEM domain. FEMS Yeast Res Resultados y Conclusiones 2006;6:1074-84. El análisis comparativo de los diferentes extrac- [5] Baillie GS y Douglas LJ. Matrix polymers of WRVKDSXHVWRSXVRGHPDQL¿HVWRODH[LVWHQFLDGH CandidaELR¿OPVDQGWKHLUSRVVLEOHUROHLQELR- diferencias cualitativas y cuantitativas en los respec- ¿OPUHVLVWDQFHWRDQWLIXQJDODJHQWV-$QWLPLFURE WLYRVSHU¿OHVSURWHLFRV )LJXUD GHWHFWiQGRVHHV- Chemother 2000;46:397-403. pecies que se expresan diferencial y/o mayoritaria- [6] Bradford, M.M. A rapid and sensitive method mente en la ME de la cepa parental (CAI4-URA3) o for the quantitation of microgram quantities of de las cepas mutantes para los genes PGA10, WAP1, protein utilizing the principle of protein-dye MNN9 y ALG5. La identidad de estos polipéptidos binding. Anal Biochem 1976;72:248-54. está siendo investigada en estos momentos mediante 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 135 Expresión diferencial de proteínas del citoesqueleto del macrófago tras la interacción con Candida albicans: Problemas en la normalización de las muestras Jose Antonio Reales-Calderón1, Mª Luisa Hernaez2, Mª Dolores Gutiérrez2, Gloria Molero1, Concha Gil1,2 1Departamento de Microbiología II. Facultad de Farmacia. Universidad Complutense de Madrid. 2Unidad GH3URWHyPLFD8QLYHUVLGDG&RPSOXWHQVHGH0DGULG3DUTXH&LHQWt¿FRGH0DGULG 8&03&0 Abstract fracción por cromatografía líquida, aumentando el Q~PHURGHSURWHtQDVLGHQWL¿FDGDV\UHYHODQGRTXH El estudio del citoesqueleto de macrófagos mu- en la muestra extraída con el kit había muy pocas rinos en la interacción con Candida albicans resulta proteínas propias de citoesqueleto. de gran interés por los importantes cambios que ocu- rren en una célula fagocítica tras entrar en contacto con un “cuerpo extraño”. La fagocitosis conlleva Obtención de las muestras de citoesqueleto alteraciones en el citoesqueleto de actina, tubulina y miosina y de las proteínas que se asocian a ellas Utilizando protocolos de extracción más espe- $US &RURQLQD:$63:$9(« (VWXGLRV Ft¿FRVSDUDSURWHtQDVGHFLWRHVTXHOHWRHOHJLPRVHO previos basados en la obtención de subproteomas GHVFULWRSRU)XQFKDO>@OLJHUDPHQWHPRGL¿FDGR'L- de macrófagos utilizando una extracción secuencial cho método se basa en la utilización independiente de y analizados mediante 2D-DIGE, nos ha permitido dos tampones con diferente concentración de sales: observar un gran número de proteínas en la frac- un tampón con alto contenido en sales (High-salt), ción enriquecida en citoesqueleto que aumentan su FRQHOFXDOVHH[WUDHODIUDFFLyQHQULTXHFLGDHQ¿OD- expresión tras interaccionar con C. albicans. Sin mentos intermedios de citoesqueleto; y otro de bajo HPEDUJRVyORSURWHtQDVSXGLHURQVHULGHQWL¿FDGDV contenido en sales (Low-salt), con el que se extraen &RQREMHWRGHLGHQWL¿FDUXQPD\RUQ~PHURGHSUR- IXQGDPHQWDOPHQWH¿ODPHQWRVLQWHUPHGLRVWXEXOLQDV teínas hemos puesto a punto un método más especí- actinas y proteínas asociadas al citoesqueleto. ¿FRSDUDODH[WUDFFLyQ de proteínas de citoesqueleto. El análisis preliminar de las muestras por cro- Utilizando esta estrategia nos hemos encontrado con que se produce un aumento considerable en la can- PDWRJUDItDOtTXLGDSXVRGHPDQL¿HVWRXQHQULTXHFL- tidad de proteína tras la interacción en comparación miento muy importante en proteínas de citoesquele- FRQHOFRQWUROGL¿FXOWDQGRODQRUPDOL]DFLyQGHODV to con respecto a la fracción extraída con el kit. muestras a analizar. Extracción de las muestras de iTRAQ Resultados Previos Se realizó la extracción de proteínas de citoes- Estudios previos de nuestro laboratorio de las queleto con estos dos tampones, partiendo de un proteínas presentes en diferentes subproteomas ob- número constante de macrófagos, y realizamos 3 tenidos por extracción secuencial con el kit Pro- UpSOLFDVELROyJLFDV$OFXDQWL¿FDUREVHUYDPRVXQ teoExtract® Subcellular Proteome Extraction Kit aumento considerable (150%) de la cantidad de pro- de Calbiochem y analizadas por DIGE, mostraron teína de citoesqueleto en las muestras extraídas con muchas proteínas con expresión diferencial en la el tampón High-salt procedentes de macrófagos que fracción enriquecida en citoesqueleto. Sin embar- habían interaccionado con C. albicans con respecto JRSRFDVSURWHtQDVSXGLHURQVHULGHQWL¿FDGDVSRU a los macrófagos control. Dichas diferencias en la encontrarse en muy baja concentración (Reales- cantidad de proteína no se producían en las muestras Calderón J. A.; Martínez-Solano L.; Molero G.; extraídas con el tampón Low-salt, como se puede Gil C.; resultados no publicados). Se analizó esta observar en la Figura 1. 136 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Vamos a comenzar el análisis de las muestras extraídas con el tampón Low-salt, el cual no plantea problemas de concentración y después se procederá al análisis de las muestras extraídas con el tampón High-salt, donde hay un aumento del 150% de las proteínas tras la interacción con la levadura. Agradecimientos Figura 1. Geles monodimensionales teñidos con Coomasie Coloidal de muestras enriquecidas en proteínas de citoes- Los autores expresan su agradecimiento a la queleto. Izquierda: Tampón High-salt; Derecha: Tampón Low-Salt. Cnt: Macrófagos control; Int: Macrófagos tras Comisión Internacional de Ciencia y Tecnología la interacción con C. albicans. SUR\HFWR%,2 SRUODVD\XGDV¿QDQ- cieras recibidas. Para realizar el iTRAQ habría que igualar la concentración de las muestras antes de marcar. Si lo hiciéramos con las muestras extraídas con el tam- Referencias pón High Salt, estararíamos aumentando las con- [1] Funchal C, de Almeida LM, Oliveira Loureiro S, centraciones de las proteínas de la muestra de los Vivian L, de Lima Pelaez P, Dall Bello Pessutto macrófagos control, alterando los resultados de la F, et al. In vitro phosphorylation of cytoskeletal FRPSDUDFLyQ&RQHOREMHWRGHFXDQWL¿FDUHVWDH[- proteins from cerebral cortex of rats. Brain re- presión diferencial tan importante, hemos decidido search 2003;11:111-8. igualar en el número de células de partida en todos ORVFDVRV\UHVXVSHQGHUHQHOPLVPRYROXPHQ¿QDO antes de marcar con iTRAQ. 3URWHyPLFDGH3DUiVLWRV 3UREOHPiWLFDHQODLGHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDVGHSDUiVLWRV Javier Sotillo1, Ana Pérez García1, María Trelis1, Dolores Bernal2, Carla Muñoz-Antolí1, José Guillermo Esteban1, Rafael Toledo1, Antonio Marcilla1 1Departamento de Biología Celular y Parasitología, Facultat de Farmàcia, Universitat de València. 2Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultat de Biologia, Universitat de València El principal problema al que se enfrentan los pueden usarse bases de datos de otros parásitos para investigadores que trabajan en proteómica parasita- ODLGHQWL¿FDFLyQGHELGRDODIDOWDGHKRPRORJtDHQWUH ria es la falta de genomas completos de los parási- proteínas. Ha de tratarse de proteínas conservadas tos estudiados. Tan solo se encuentran disponibles que mantengan una cierta homología entre dife- los de Schistosoma mansoni y Schistosoma japo- rentes géneros de parásitos. Además, en el caso de nicum, [1,2], además de numerosas entradas de SchistosomaFDVLODPLWDGGHSURWHtQDVLGHQWL¿FDGDV DNA depositadas en bases de datos. El hecho de que de sus transcriptomas no tienen función conocida o existan tantas entradas de Schistosoma en bases de VRQLQFOXVRHVSHFLHHVSHFt¿FDV>@ GDWRVGHSURWHtQDVKDSRVLELOLWDGRODLGHQWL¿FDFLyQ de numerosas proteínas de otros trematodos como En el caso de Echinostoma, no sólo no se tiene los echinostomátidos [3]. Sin embargo, no siempre el transcriptoma entero, sino que existen muy pocas 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 137 ESTs. Tan solo existe una biblioteca de ESTs dis- nostomátidos como la enolasa, la GST, la GAPDH, ponible para Echinostoma parensei. Además, esta la aldolasa o la Hsp-70 [3,6]. biblioteca puede considerarse muy pobre con 358 secuencias depositadas si la comparamos con otros Sin embargo, sigue siendo de vital importancia trematodos como Fasciola hepatica o Schistosoma el dedicar tiempo y esfuerzo en la secuenciación haematobium (con más de 15000 ESTs cada uno). de nuevas EST o de genomas completos de pará- &XDQGRVHLQWHQWDLGHQWL¿FDUHOSURWHRPDGHE. capro- VLWRVTXHD\XGHQDODLGHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDV ni, sólo un pequeño porcentaje de las moléculas anali- y que puedan ser de utilidad en la investigación ]DGDVVRQLGHQWL¿FDGDVFRUUHFWDPHQWH )LJXUD con otros parásitos del mismo orden. Además de la secuenciación genómica, también las herramientas Otra de las limitaciones con la que se encuen- bioinformáticas podrían contribuir al progreso en tran los investigadores que trabajan en proteómica proteómica parasitaria. Figura 1. 3RUFHQWDMHVGHLGHQWL¿FDFLyQSRU3URWHLQ3LORWGHSURWHtQDVGH(FKLQRVWRPDFDSURQL. Debido a la poca información ~WLOHQODVEDVHVGHGDWRVVyORVHORJUDLGHQWL¿FDUHOGHWRGRVORVSpSWLGRVFXDQGRVHXVDXQFXWRII! parasitaria es la escasez de material parasitario. Agradecimientos Los estudios de proteínas se encuentran limitados por la sensibilidad de la espectometría de masas, y, (OSUHVHQWHHVWXGLRIXH¿QDQFLDGRSRUHOSUR- en última instancia, dependen en gran medida de la yecto CGL-2005-0231/BOS del Ministerio de cantidad y calidad de material disponible. Debido Educación y Ciencia (España) y FEDER (EU), a la costosa obtención de materiales procedentes los proyectos GV07/006, GVPRE/2008/049 y GHOSDUiVLWRVHKDFHPX\GLItFLOODLGHQWL¿FDFLyQGH PROMETEO/2009/081 de la Conselleria d’Educació proteínas parasitarias. Para la mayoría de parásitos de la Generalitat Valenciana. Este trabajo ha sido (incluido Echinostoma) es muy difícil su cultivo in llevado a cabo mientras el primer autor (J.S.) era vitro, y se depende únicamente de su obtención a EHQH¿FLDULRGHXQDEHFDSUHGRFWRUDOGHO0LQLVWHULR SDUWLUGHKRVSHGDGRUHVGH¿QLWLYRV$GHPiVFRPR de Educación y Ciencia (Spain) y el segundo autor la mayoría tienen ciclos complejos donde intervie- de las becas BC06-284 y BC08-098 de la Universi- nen varios hospedadores intermediarios, además tat de València. GHOKRVSHGDGRUGH¿QLWLYRSRFRVLQYHVWLJDGRUHV pueden disponer del ciclo completo en su labora- Referencias torio, habiéndose de conformar con las muestras que les llegan de otros laboratorios, hospitales o [1] Berriman M, Haas BJ, LoVerde PT, :LO- pacientes aislados. son RA, Dillon GP et al. The genome of the blood fluke Schistosoma mansoni. Nature Una de las posibles soluciones que pueden ayu- 2009;460:352-8. GDUHQODLGHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDVHVXVDUDQWL- cuerpos heterólogos en diferentes técnicas como la [2] Schistosoma japonicum Genome Sequencing de western-blot. Gracias a la mayor sensibilidad de and Functional Analysis Consortium, Zhou esta técnica respecto de las tinciones de geles, se Y, Zheng H, Liu F, +X:, :DQJ=4, Gang L, minimiza la limitación por falta de material en la Ren S. The Schistosoma japonicum genome re- veals features of host-parasite interplay. Nature LGHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDV$XQTXHHVWDWpFQLFDVyOR 2009;460:345-51. se pueda usar con proteínas altamente conservadas y pueda ser una técnica muy cara en algunos casos [3] Sotillo J, Valero L, Sánchez del Pino MM, (si se emplean diferentes anticuerpos comerciales), Fried B, Esteban JG, Marcilla A, Toledo R. KDVHUYLGRSDUDLGHQWL¿FDUPXFKDVSURWHtQDVGHHFKL- ,GHQWL¿FDWLRQRIDQWLJHQLFSURWHLQVIURPEchi- 138 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 nostoma caproni (Trematoda) recognized by >@ :LOVRQ5$$VKWRQ3'%UDVFKL6'LOORQ*3 Mouse immunoglobulins M, A and G using an Berriman M, Ivens A. “Oming” in on schis- immunoproteomic approach. Parasite Immunol tosomes: prospects and limitations for post- 2008;30:271-79. genomics. Trends Parasitol 2003;23:14-20. [4] Verjovski-Almeida S, DeMarco R, Martins EAL, [6] Bernal D, Carpena I, Espert A, De la Rubia JE, Guimaraes PEM, Ojopi EPB et al. Transcriptome (VWHEDQ-*7ROHGR50DUFLOOD$,GHQWL¿FDWLRQ analysis of the acoelomate human parasite Schis- of proteins in excretory/secretory extracts of tosoma mansoni. Nat Genet 2003;35:148-57. Echinostoma friedi (Trematoda) from chronic and acute infections. Proteomics 2006;9:2835-43. Las técnicas de proteómica aplicadas al estudio de las relaciones parásito/ KRVSHGDGRUHQODGLUR¿ODULRVLVDQLPDO\KXPDQD Javier González-Miguel1, Rodrigo Morchón-García1, Ana Oleaga2, Mar Siles-Lucas2, Ricardo Pérez-Sánchez2, Fernando Simón1 1Laboratorio de Parasitología, Facultad de Farmacia, Universidad de Salamanca. 2Laboratorio de Parasitología, IRNA Salamanca (CSIC) Resumen nódulo pulmonar benigno que puede confundirse con cáncer en radiología. La comprensión de las En el presente trabajo se emplean técnicas de UHODFLRQHVSDUiVLWRKRVSHGDGRUHQODGLUR¿ODULRVLV electroforesis 2D, western blot y espectrometría de precisa de datos sobre las moléculas del parásito y masas para analizar la existencia de una base mole- el papel que desempeñan, tanto en el estímulo de cular en las relaciones que 'LOR¿UDOLDLPPLWLV esta- los mecanismos patológicos e inmunes, como de blece con sus diferentes hospedadores. Se han iden- los mecanismos de supervivencia. Las técnicas de WL¿FDGRVLPLOLWXGHV\GLIHUHQFLDVHQODVPROpFXODV proteómica son una herramienta muy útil para iden- parasitarias que parecen jugar un papel fundamental WL¿FDUGLFKDVPROpFXODV\DQDOL]DUVXVIXQFLRQHV en dichas relaciones, en cada hospedador. En el presente trabajo, el proteoma de D. immitis y los inmunomas obtenidos en cada hospedador, se relacionan los datos biológicos y clínicos de la 'LUR¿ODULDLPPLWLV es el agente causante de la enfermedad en cada uno de ellos. GLUR¿ODULRVLVFDUGLRSXOPRQDUFDQLQD\IHOLQD\GH ODGLUR¿ODULRVLVSXOPRQDUKXPDQD7DQWRHOGHVD- Se utilizó un extracto antigénico soluble de ver- rrollo del parásito, como las implicaciones clínicas, mes adultos de D. immitis (DiSB). El proteoma son diferentes en cada uno de sus 3 hospedado- de D. immitis fue obtenido mediante electroforesis res. En el perro los vermes adultos de D. immitis 2D del extracto DiSB. Las proteínas se tiñeron con pueden vivir durante más de 7 años produciendo QLWUDWRGHSODWDRVHWUDQV¿ULHURQDPHPEUDQDVGH PLFUR¿ODULDV\ODHQIHUPHGDGWLHQHJHQHUDOPHQWH nitrocelulosa para la realización del western blot 2D, un desarrollo crónico. En el gato los adultos vi- en las que se incubaron con pools de sueros de los ven solamente 2 años y las infecciones son siempre diferentes hospedadores infectados y de controles DPLFUR¿ODUpPLFDV/DSDWRORJtDWLHQHXQFXUVRLP- sanos. Los spots que contenían proteínas inmunó- previsible y habitualmente agudo. En el hombre, genas, se escindieron manualmente de los geles 2D D. immitis no alcanza el estado adulto. En algunas y fueron enviadas al Servicio de Proteómica del ocasiones, vermes preadultos se alojan en una rama &1,&SDUDVXFRUUHVSRQGLHQWHLGHQWL¿FDFLyQSRU de la arteria pulmonar, donde embolizan y causan un espectrometría de masas [1]. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 139 Tras la electroforesis 2D, el extracto DiSB resol- y la principal enzima de la glicolisis anaerobia, la vió más de 400 spots, la mayor parte con pIs entre lactato deshidrogenasa, es tan solo bloqueada por 5 y 8, y con un amplio intervalo de PMs (10-170 gatos y humanos. kDa). Los western blot 2D revelaron, en los casos de análisis con sueros de perros, gatos y humanos con GLUR¿ODULRVLVXQWRWDOGH\spots de D. immitisGHORVFXDOHV\IXHURQLGHQWL¿FD- dos y se correspondieron con 19, 32 y 23 proteínas, respectivamente. A continuación, se determinó la fun- ción molecular y el proceso biológico en el que están LPSOLFDGDVODVSURWHtQDVLGHQWL¿FDGDVVHJ~QODVEDVHV de datos Gen Ontology y Swiss-Prot/UniProt. La mayor parte de las proteínas inmunógenas LGHQWL¿FDGDVSHUWHQHFtDQDWUHVJUXSRVIXQFLRQDOHV (Figura 1), que son fundamentales en las relaciones SDUiVLWRKRVSHGDGRUHQODGLUR¿ODULRVLV SURWHtQDVGH choque térmico (Hsps), enzimas del metabolismo energético y enzimas redox. Como se observa en la Figura 1. Procesos biológicos en los que están implicadas tabla 1, dentro de las Hsps y las enzimas redox, los las proteínas inmunógenas del extracto DiSB reconocidas gatos reconocen más proteínas que los humanos, y por perros, gatos y humanos. Datos expresados como por- estos últimos a su vez, más que el hospedador cani- centaje del total de proteínas reconocidas por cada hos- pedador. Los grupos funcionales discutidos en el presente no. Por otra parte, desde el punto de vista del meta- trabajo se hallan recuadrados. bolismo energético, la ruta glicolítica del parásito es ampliamente inhibida por los tres hospedadores, no Estos resultados sugieren que las diferencias obstante, D. immitis es un fermentador homoláctico biológicas y clínicas existentes entre los diferentes Tabla 1. Proteínas inmunógenas del extracto DiSB reconocidas por perros, gatos y humanos en los grupos funcionales de proteínas de choque térmico, enzimas del metabolismo energético y enzimas redox. Función Proteína Perros Gatos Humanos Hsp 70 X X X Proteínas de sHsp X X choque térmico Proteína OV25-1 X X sHsp p27 X Enolasa X X X Fructosa-bisfosfato aldolasa X X X GAPDH X X X Triosa-fosfato isomerasa X X X Enzimas del Fosfoglicerato mutasa X X X metabolismo energético Fosfoglicerato quinasa X X Glucosa-fosfato isomerasa X X Lactato deshidrogenasa X X Fumarasa X X Aldo/queto oxidorreductasa X X X Tiorredoxina peroxidasa X Precursor de Glutatión peroxidasa X Enzimas redox Glutatión transferasa X Hipotética oxidorreductasa FAD dep. X X Precursor de transglutaminasa X X Disulfuro isomerasa X 140 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 hospedadores de D. immitis tienen una base mole- Referencias cular. El acortamiento del ciclo vital de los vermes de D. immitis en el gato y el humano, con respecto [1] Oleaga A, Pérez-Sánchez R, Pagés E, Marcos- a lo que ocurre en el perro, podría relacionarse con $W[XWHJL&6LPyQ),GHQWL¿FDWLRQRILPPXQR- reactive proteins from the dog heartworm (Diro- una mayor capacidad para bloquear con anticuerpos, ¿ODULDLPPLWLV GLIIHUHQWLDOO\UHFRJQL]HGE\WKH algunas proteínas fundamentales implicadas en los sera from dogs with patent or occult infections. mecanismos de generación de energía y de evasión Mol Biochem Parasitol 2009;166:134-141. de la respuesta inmune por parte del parásito. ,GHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDVGHNeospora caninum implicadas en procesos de invasión y virulencia Virginia Marugán-Hernández1, Javier Regidor-Cerrillo1, Gema Álvarez-García1, Fiona Tomley2, Adriana Aguado-Martínez1, Mercedes Gómez-Bautista1, Luís Miguel Ortega-Mora1 1SALUVET. Departamento de Sanidad Animal. Facultad de Veterinaria. Universidad Complutense de Madrid.2Division of Microbiology. Institute for Animal Health. Reino Unido La neosporosis bovina es una de las principales Los extractos proteicos empleados fueron ob- causas de fallo reproductivo en el ganado bovino a tenidos a partir de taquizoítos -fase de replicación nivel mundial [1]. Neospora caninum, agente etioló- rápida- mantenidos en cultivos celulares de células gico de esta enfermedad, es un protozoo intracelular 0$5&\SRVWHULRUPHQWHSXUL¿FDGRVPHGLDQWH obligado perteneciente al phylum Apicomplexa y re- columnas desaladoras PD-10. ODFLRQDGR¿ORJHQpWLFDPHQWHFRQToxoplasma gondii. ([LVWHXQDGLYHUVLGDGLQWUDHVSHFt¿FDGHPRVWUDGD OBJETIVO 1: La técnica DIGE fue empleada entre aislados de N. caninum desde el punto de vis- en el estudio comparativo de expresión proteica ta genético [2] y fenotípico (patogenicidad in vivo, diferencial de aislados que presentaron diferencias tasas de crecimiento e invasión in vitro) (Regidor- de patogenicidad: dos aislados virulentos (Nc-Liv Cerrillo y col., manuscrito enviado). y Nc-Spain7) y uno naturalmente atenuado (Nc- Spain1H). Se realizaron seis réplicas de geles y que Por otra parte, en la invasión de la célula hos- fueron analizadas con el software DeCyder v6.0. pedadora están implicadas tres tipos de organelas Las manchas proteicas con una abundancia relativa secretoras, micronemas, roptrias y gránulos densos. mayor o menor que 1,3 con una p < 0,05 (t de Stu- En concreto, las roptrias han sido descritas como dent) fueron consideradas diferencialmente expresa- factores de virulencia en T. gondii [3]. Se ha iden- das. Algunas de estas manchas fueron escindidas del WL¿FDGRXQJUDQQ~PHURGHSURWHtQDVGHURSWULDVHQ gel para su posterior análisis por MALDI-TOF. T. gondii mientras que en N. caninum únicamente NcROP2 ha sido caracterizada [4]. 2%-(7,92 3DUDODLGHQWL¿FDFLyQGHODVSURWHt- nas de roptrias se obtuvieron fracciones enriquecidas Por todo ello, el objetivo del presente estudio fue en organelas secretoras a partir de los taquizoítos de UHDOL]DUXQDQiOLVLVGLIHUHQFLDOGHORVSHU¿OHVGHH[- Nc-Liv mediante fraccionamiento subcelular. Sobre presión proteica entre distintos aislados de N. cani- las fracciones enriquecidas en roptrias se llevó a cabo num para dilucidar los mecanismos implicados en la ODLGHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDVORFDOL]DGDVHQXQUDQJR virulencia del parásito. Por otro lado, se procedió a la de peso molecular de 37 a 250 kDa, mediante nano- LGHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDVURSWULDVSRWHQFLDOPHQWHUH- cromatografía líquida acoplada a espectrometría de lacionadas con los procesos de invasión y virulencia. masas en trampa iónica LQT linear. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 141 En ambos estudios proteómicos se empleó el y en la invasión. Además, se observó una mayor algoritmo MASCOT frente a las bases de datos del abundancia de la proteína de membrana NcPDI, y NCBI nr y ToxoDB v5.1 para llevar a cabo las iden- de aquellas de organelas como NcMIC1, NcROP8 WL¿FDFLRQHVSURWHLFDV y NcNTPasa en aquellos aislados más virulentos, todas ellas relacionadas con los mecanismos de in- vasión y proliferación. Resultados y conclusiones OBJETIVO 2: A partir de las fracciones subce- OBJETIVO 1: Un total de 124 manchas pro- lulares enriquecidas en roptrias se obtuvo un amplio teicas mostraron una expresión diferencial. Nueve Q~PHURGHLGHQWL¿FDFLRQHV 7DEOD $OJXQDVGHODV al comparar Nc-Liv y Nc-Spain1H, 50 al hacerlo nuevas proteínas, denominadas “ROP”, presentaron con Nc-Liv y Nc-Spain 7 y 65 entre Nc-Spain7 y homólogos en T. gondii, si bien no siempre estaban Nc-Spain1H. A partir de ellas se consiguió la iden- situadas en el mismo locus. Por otra parte, la apa- WL¿FDFLyQGH PDQFKDVFRUUHVSRQGLHQWHVDSUR- rición de una serie de kinasas y fosfatasas indica teínas que se detallan en la Tabla 1. Entre ellas, se la existencia de posibles factores de virulencia, y observaron variaciones en algunas isoformas de las ODLGHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDV³521´LQGLFDUtDOD proteínas actina y miosina dependientes del aisla- existencia de la “unión móvil” durante el proceso do, implicadas ambas en la motilidad del parásito de invasión, tal como ocurre en T. gondii. Tabla 1. Proteínas de roptrias de N. caninum. pI/Mr Identidad Nº Secuencia Proteína N'D Abundancia Función péptidos 1$FFHVR Teórico Captación NcSp7>NcSp1H* NTPase 5,56/69,6 34 21 NCLIV 145870 de purinas- 1F/LY1F6S+ virulencia NcSp7>NcSp1H Síntesis de aspartyl-tRNA synthetase 5,95/62,8 48 13 NCLIV 082700 1F/LY1F6S+ proteínas microneme-associated NcSp7>NcSp1H 4,79/50,1 46 18 gi 17226315 Invasión protein (NcMIC1) 1F/LY1F6S+ NcSp7>NcSp1H Síntesis de elongation factor 2 5,93/94 38 29 NCLIV 081030 1F/LY1F6S+ proteínas glucose-6-phosphate NcSp7>NcSp1H 8,59/112,6 21 17 NCLIV 010690 Metabolismo dehydrogenase 1F/LY1F6S+ NcSp7>NcSp1H Invasión- ROP8 6,29/43,2 66 23 NCLIV 000700 1F/LY1F6S+ proliferación NcSp7 glycine NcSp7 SURWHLQGLVXO¿GH NcSp7>NcSp1H Plegamiento de 5,18/53,2 62 26 NCLIV 051400 isomerase NcLiv>NcSp1H proteínas NcSp7 6-phosphogluconate NcSp7>NcSp1H 6,28/55,2 45 24 NCLIV 140400 Metabolismo dehydrogenase NcLiv=NcSp1H NcSp7 * >LQGLFDXQLQFUHPHQWRVLJQL¿FDWLYRHQODDEXQGDQFLDGHODSURWHtQDHQWUHORVDLVODGRVGHQRWDODWHQGHQFLDGH LQFUHPHQWRHQODH[SUHVLyQ S! & Resultados mostrados por la isoforma mayoritaria. 142 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 (VWHHVWXGLRKDSHUPLWLGRLGHQWL¿FDUXQDVHULHGH tituir un nuevo arsenal de dianas terapéuticas e inmu- proteínas potencialmente implicadas en procesos de QRSUR¿OiFWLFDVIUHQWHDODLQIHFFLyQSRUN. caninum. invasión y virulencia. Estas proteínas podrían cons- Tabla 2. 3URWHtQDVLGHQWL¿FDGDVH[SUHVDGDVGHIRUPDGLIHUHQFLDOHQWUHDLVODGRVGH1FDQLQXP Mismo Identidad Proteína de N. caninum Homólogo en T. gondii 3RVLWLYRV locus surface protein rhoptry rhoptry 1 SI 65.9 28 38 ROP8 ROP8 NO 348 43 64 rhoptry antigen rhoptry protein 5 SI 213 53 67 surface protein rhoptry rhoptry protein 5 SI 282 51 63 rhoptry antigen rhoptry 1 NO 70.5 29 38 Rhoptry neck protein 4 rhoptry neck protein 4 SI 902 65 78 conserved hypothetical pro- rhoptry neck protein 2 SI 2209 72 81 tein hypothetical protein rhoptry neck protein 3 SI 3262 78 88 hypothetical protein rhoptry neck protein 8 SI 4298 82 91 hypothetical protein protein kinase SI 758 80 89 acid phosphatase acid phosphatase SI 741 88 92 mitogen-activated protein Protein kinase domain pro- NO 99 27 46 kinase-related tein Subtilisin-like serine pro- subtilisin-like protein SI 373 62 73 tease TgSUB1 subtilase family serine pro- subtilisin SI 1123 57 67 tease, serine/threonine protein serine/threonine protein SI 2265 69 82 phosphatase, phosphatase Subtilisin-like serine pro- subtilisin-like serine protease SI 1193 100 100 tease Agradecimientos [2] Regidor-Cerrillo, J., Pedraza-Diaz, S., Gomez- Bautista, M., Ortega-Mora, L. M., Multilocus Agradecemos a Rick Oakes y Vanesa Navarro microsatellite analysis reveals extensive genetic su excelente apoyo técnico. El trabajo proteómico diversity in Neospora caninum. J. Parasitol. ha sido realizado por el Servicio de Proteómica 2006; 92:517-524. UCM-PCM, miembro de la red ProteoRed. VMH [3] Saeij, J. P., Boyle, J. P., Coller, S., Taylor, S. et HVWi¿QDQFLDGDSRUXQDD\XGD)3,GHO0,&,11(O al., Polymorphic secreted kinases are key viru- SUHVHQWHWUDEDMRKDVLGR¿QDQFLDGRSRUHOSUR\HFWR lence factors in toxoplasmosis. Science 2006; AGL 2007-60132/GAN. 314:1780-1783. [4] Debache, K., Guionaud, C., Alaeddine, F., Me- Referencias vissen, M., Hemphill, A., Vaccination of mice with recombinant NcROP2 antigen reduces [1] Dubey, J. P., Schares, G., Ortega-Mora, L. M., mortality and cerebral infection in mice infec- Epidemiology and control of neosporosis and ted with Neospora caninum tachyzoites. Int. J. Neospora caninum. Clin. Microbiol. Rev. 2007; Parasitol. 2008; 38: 1455-1463. 20: 323-367. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 143 $SOLFDFLyQGHHFXDOL]DGRUHVGHSURWHtQDVSDUDODLGHQWL¿FDFLyQGHDQWtJHQRV minoritarios de la saliva de Ornithodoros moubata Ricardo Pérez-Sánchez, Ana Oleaga, Mar Siles-Lucas, Verónica Díaz-Martín, Eduardo de la Torre Escudero, Ana Hernández-González, Raúl Manzano-Román Laboratorio de Parasitología Animal. IRNASA. CSIC. Salamanca Resumen vestigación de vacunas antigarrapata como método alternativo de control. El extracto salival (SGE) de la garrapata Orni- thodoros moubata contiene una proteína antigénica En trabajos anteriores nuestro equipo inició el (Om44) de interés para el desarrollo de una vacuna desarrollo de una vacuna anti-O. moubata inmuni- anti-O. moubata. Om44 es minoritaria en el SGE, zando cerdos con un extracto proteico de glándulas ORTXHGL¿FXOWDVXGHWHFFLyQHLGHQWL¿FDFLyQ(OWUD- salivales (SGE) de este argásido. El SGE indujo una tamiento del SGE con un ecualizador de proteinas respuesta inmunitaria capaz de reducir hasta en un permite concentrar a Om44 hasta niveles perfecta- 70% las tasas de alimentación y reproducción del ar- mente detectables en geles 2D teñidos con plata e gásido. El antígeno inductor de esta respuesta es una LGHQWL¿FDUDODVSURWHtQDVSUHVHQWHVHQHOVSRWFR- proteína de 44 kDa (Om44) que se une a la molécula rrespondiente, aunque para ello haya que recurrir a P-selectina del hospedador, lo que previsiblemente la secuenciación de novo por estar O. moubata muy bloquea las respuestas hemostáticas mediadas por poco secuenciada. la P-selectina y permite a la garrapata completar la ingesta de sangre [1]. Ornithodoros moubataHVXQDUJiVLGRHQGy¿OR africano que se refugia en el interior de las madri- Consecuentemente, nuestro siguiente objetivo gueras de los animales salvajes, de las pocilgas IXHODLGHQWL¿FDFLyQGH2PFRPRSDVRSUHYLR domésticas e incluso de las viviendas humanas. para su clonación y obtención en forma recombi- Figura 1. SGE sin ecualizar separado en geles 2D (12% acrilamida, pH 3-10) teñidos con plata (A) y Sypro rubi (B). Western blot con suero de cerdo vacunado con SGE (C). Sus principales hospedadores son los facoceros, los QDQWH$ERUGDPRVGLFKDLGHQWL¿FDFLyQPHGLDQWHXQD cerdos y las personas, a los que puede transmitir estrategia proteómica clásica: separación del SGE graves enfermedades como la Peste porcina africa- en geles 2D, localización del spot correspondiente na y la Fiebre recurrente humana. La eliminación a Om44 y análisis del mismo por espectrometría de esta garrapata del medio sinantrópico puede de masas. Esta estrategia se enfrentó con dos pro- facilitar el control de las citadas enfermedades. blemas. El primero es que Om44 es minoritaria en Los inconvenientes del uso de acaricidas en la el SGE y, aunque su spot sí se detecta en western lucha contra las garrapatas han favorecido la in- blot 2D usando sueros de cerdos vacunados, no es 144 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 visible en geles 2D teñidos con plata o con Sypro teína. Los resultados de la secuenciación de novo Rubi (Figura 1). Para solucionar este problema, el de los péptidos procedentes del spot de la Om44 SGE se trató con un equalizador de proteínas [2] VHPXHVWUDQHQODWDEOD6HKDQLGHQWL¿FDGR utilizando el kit ProteoMiner Protein Enrichment proteínas, lo cual plantea un nuevo problema: ¿cuál (Bio-Rad). El SGE ecualizado se resolvió en geles de ellas es la proteína Om44?. Teniendo en cuenta 2D y se analizó en western blot 2D, lo que permitió parámetros proteómicos, como el score, pI y peso localizar y cortar el spot correspondiente a la Om44 molecular, y biológicos, como su localización cito- (44 kDa, pI 6,8), claramente visible ahora en geles plasmática, pensamos que enolasa o actina pueden 2D teñidos con plata (Figura 2). VHU2P(OUHVWRGHODVSURWHtQDVLGHQWL¿FDGDV quizá sean contaminaciones, aunque no podemos Solucionado el primer problema, el segundo al descartar que algunas de ellas tengan un homólogo que nos enfrentamos fue que O. moubata está aun en O. moubata con un peso molecular y pI compa- muy poco secuenciado, como ocurre en general con tibles con los del spot analizado. RWUDVJDUUDSDWDV>@(VWRGL¿FXOWDODLGHQWL¿FDFLyQ por comparación de huellas peptídicas y espectros de fragmentación, obligándonos a recurrir a la se- cuenciación de novo de péptidos trípsicos de Om44. El inconveniente de la secuenciación de novo es que es caro y sus resultados no siempre garantizan la LGHQWL¿FDFLyQ>@/DYHQWDMDHVTXHODVVHFXHQFLDV peptídicas de novo pueden utilizarse como base para el diseño de oligonucleótidos con los cuales abordar ODDPSOL¿FDFLyQ\FORQDMHGHOF'1$FRGL¿FDQWHGH Figura 2. SGE equalizado separado en geles 2D (12% Om44 sin conocer a priori la identidad de la pro- acrilamida, pH 5-8) teñidos con plata (A). Western blot con suero de cerdo vacunado con SGE (B). Tabla 1. 3URWHtQDVLGHQWL¿FDGDVSRUVHFXHQFLDFLyQGHQRYRDSDUWLUGHOVSRWFRUUHVSRQGLHQWHD2P Numero Proteína pI / MW Péptido Score Función de acceso teóricos 6.73 / Glucólisis, P06733 Enolasa. Homo sapiens 239VVIGMDVAASEFFR252 175,5 47024 Fibrinolisis 20AGFAGDDAPR29 94,6 5.29 / 4/*: Actina. Ornithodoros moubata 217LCYVALDFEQE- Estructural 41793 MATAASSSSLEK239 1 $73VLQWKDVHVXEXQLWĮPLWR- 9.16 / P25705 520EIVTNFLAGFEA531 80,8 Síntesis de ATP condrial precursor. H. sapiens 59750 Heterogeneous nuclear ribonu- 9.27 / Procesamiento y P09867 56GFGFVTYATVEEVDAAMNAR75 55,1 cleoprotein A1. Bos taurus 34196 transporte de RNA Elongation factor-1. Ixodes 111NMITGTSQADCAVLIVAAGT- 9.13 / Biosíntesis de pro- B7Q349 52,6 scapularis GEFEAGISK129 50753 teínas 1 Elongation factor 5.04 / P15252 43SGPLQPGVDIIEGPVK58 50,4 Alérgeno Hevea brasiliensis 14721 6.09 / P81605 1 Dermcidin. Homo sapiens 43ENAGEDPGLAR53 50,2 Antimicrobiano. 11283 1 HTH-type transcriptional reg- 5.66 / Regulación de la P0ACT0 162RAAIIMR168 42,8 ulator acrR. Escherichia coli 24766 trancripción 1 Chaperone containing Chaperona 6.24 / P40227 T-complex protein 1 subunit z. 433AQLGVQAFADALLIIPK449 42,0 Plegamiento de 58024 Homo sapiens proteínas Estructural. Vimentin-1/2 5.16 / P24789 99AEMIELNDR107 40,9 Filamentos cit- Xenopus laevis 52844 oesqueleto 1 Translation initiation factor 9.65 / Biosíntesis de pro- Q98QV2 141ELGIDTLNR149 40,3 IF-3. Mycoplasma pulmonis 23283 teínas 1 Posibles contaminantes 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 145 Agradecimientos [2] Righetti PG, Bochetti E, Lomas L y Citterio A. 7UDEDMR¿QDQFLDGRSRUOD-XQWDGH&DVWLOOD\ Protein Equalizer Technology: The quest for a de- León (CSI07A08). mocratic proteome. Proteomics 2006;6:3980-92 [3] Francischetti IMB, Sá-Nunes A, Mans BJ, San- Referencias tos, IM y Ribeiro JMC. The role of saliva in tick feeding. Front Biosci 2009;14:2051-88 [1] García-Varas S, Manzano-Román R, Fernádez- [4] Oleaga A, Escudero-Población A, Camafeita E Soto F, Encinas-Grandes A, Oleaga A y Pérez- y Pérez-Sánchez R. A proteomic approach to 6iQFKH]53XUL¿FDWLRQDQGFKDUDFWHUL]DWLRQ WKHLGHQWL¿FDWLRQRIVDOLYDU\SURWHLQVIURPWKH of a P-selectin binding molecule from the argasid ticks Ornithodoros moubata and Orni- salivary glands of Ornithodoros moubata that thodoros erraticus. Insect Biochem Mol Biol induces protective anti-tick immune responses 2007;37:1149-59. in pigs. Int J Parasitol 2009, doi:10.1016/j. ijpara.2009.08.011 ,GHQWL¿FDFLyQSURWHyPLFD\DQiOLVLVELRLQIRUPiWLFRGHSURWHtQDVVHFUHWDGDVSRU el protozoo parásito Trypanosoma cruziSHUWHQHFLHQWHVDODIDPLOLD0$63 Mucin associated Surface Proteins Luis Miguel De Pablos ,Gloria González, Víctor Seco Hidalgo, Isabel María Díaz Lozano, Antonio Osuna Instituto Biotecnología. Universidad de Granada. Grupo de Parasitología Bioquímica y Molecular Resumen tarse potencialmente como posibles lugares que esti- mularan la generación de una respuesta inmune celular El agente causal de la tripanosomiasis o enfer- frente a T. cruzi. Como conclusión, consideramos que medad de Chagas es el protozoo parásito Trypano- ODVSURWHtQDV0$63LGHQWL¿FDGDVSXHGHQVHUSRWHQ- soma cruzi. Dicho parásito es un organismo intra- ciales antígenos inmunógenos y posibles herramientas celular obligado que utiliza una enorme cantidad de diagnósticas para evaluar una respuesta humoral frente tipos celulares para multiplicarse. Durante el proce- a éstas durante el transcurso de la enfermedad. so de entrada e invasión celular, T. cruzi secreta una serie de proteínas encargadas del reconocimiento Trypanosoma cruziHVXQSURWR]RRÀDJHODGR de la célula hospedadora y la posterior entrada del perteneciente al Orden Kinetoplástida y agente etio- protozoo en ella. lógico de la tripanosomiasis americana o enferme- dad de Chagas, estimándose en unos 16-18 millones (QHOSUHVHQWHWUDEDMRVHGHVFULEHODLGHQWL¿FDFLyQ las personas infectadas principalmente en Centro y de dos proteínas pertenecientes a la familia MASP Sudamérica [1, 2]. La familia MASP (Mucin Asso- (Mucin Associated Surface Protein) secretadas tras dos ciated Surface Protein) descrita por primera vez tras horas de interacción célula-parásito. Las secuencias de el desarrollo y posterior publicación de los datos del estas proteínas poseen las características básicas de la genoma de T. cruzi, constituye una extensa familia familia MASP con dos regiones hidrofóbicas en los génica que representa el 6% del genoma del parásito extremos N- y C- terminal y una región central en el aproximadamente [3]. Las MASPs, pueden mos- cual existen sitios para la N-glicosilación. Tras mapear WUDUPRGL¿FDFLRQHVSRVWWUDGXFFLRQDOHVVLPLODUHVD epítopos de tipo MHC-I en las secuencias encontramos las de las mucinas, describiéndose como proteínas varias regiones en las proteínas que podrían compor- N-glicosiladas [4]. Las aproximaciones proteómi- 146 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 cas realizadas, muestran como la expresión de las posiciones conservadas para esta familia, generán- MASPs es pequeña en comparación con el número dose un panel de péptidos potencialmente positivos de genes encontrados. Si bien no se conocen los para ser expuestos por moléculas MHC-I. mecanismos que han permitido la expansión de la familia de las MASPs en T. cruzi, la presión in- La obtención en el medio de interacción célula- mune pudiera constituir la fuerza inductora que ha parásito de dos miembros pertenecientes a la familia provocado la amplia presencia de genes masp en el MASP indica que proteínas pertenecientes a esta fa- genoma del trypanosomatidos. milia son capaces de secretarse y de poseer una posi- ble implicación en la entrada del parásito en la célula Se estudió el medio de interacción célula-pará- hospedadora. Además los epítopo encontrados de- sito, incubándose durante dos horas la fase trypo- muestra como estas secuencias están potencialmente mastigota metacíclica de T. cruzi con células Vero implicadas en la generación de una respuesta inmune HQPRQRFDSD8QDYH]SXUL¿FDGRHOPHGLRVHVHOHF- celular frente al parásito. Por tanto, la familia MASP cionaron diferentes bandas en geles de SDS-PAGE será en un futuro objeto de nuestros estudios tanto XQLGLPHQVLRQDOHVSDUDVXSRVWHULRULGHQWL¿FDFLyQ como posible diana terapéutica como herramientas mediante espectrometría de masas (MALDI-TOF diagnósticas debido a su clara exposición al sistema y MALDI-TOF-TOF) y análisis mediante trampa inmunitario durante una infección por T. cruzi. iónica de los péptidos fragmentados. 8QDYH]LGHQWL¿FDGDVODVVHFXHQFLDVPHGLDQWH Referencias los motores de búsqueda Mascot y proteome disco- ver, estas se analizaron en busca de motivos estruc- >@ :RUOG+HDOWK2UJDQL]DWLRQ&RQWURORI&KDJDV turales mediante el paquete de software bioinfor- disease 2002; 905: 1-109. mático de ExPASy (http://www.expasy.ch/tools/). [2] Tarleton RL, Reithinger R, Urbina JA, Kitron Además se realizó un mapeo de epítopos para éstas, U. y Gürtler RE. The Challenges of Chagas utilizando los programas BIMAS y SYFPEITHI. Disease-Grim Outlook or Glimmer of Hope? PloS Med 2007; 4: 1852-1857. 7UDVHODQiOLVLVSURWHyPLFRLGHQWL¿FDPRVGRV nuevas proteínas pertenecientes a la familia MASP [3] El-Sayed NM, Myler PJ, Bartholomeu DC, de T. cruzi. Estas proteínas poseen pesos molecula- Nilsson D, Aggarwal G, Tran AN, Ghedin E E, - res de 52 kDa y 5 kDa, siendo secretadas durante el :RUWKH\$'HOFKHU$/\%ODQGLQ*7KHJH nome sequence of Trypanosoma cruzi, etiologic proceso de invasión celular por parte del parásito. agent of Chagas disease. Science 2005; 309: Tras la búsqueda de motivos estructurales encontra- 409–415. mos que existían dos regiones N- y C- terminal alta- mente hidrofóbicas, un lugar para N-Glicosilación [4] Bartholomeu, DC, Cerqueira GC, Lea AA, daRo- y en el caso de la proteína de 52 kDa un lugar de FKD:'3DLV)%0DFHGR&'MLNHQJ$7H[HLUD unión a ATP/GTP (P-loop). SMR y El-Sayed NM. Genomic organization DQGH[SUHVVLRQSUR¿OHRIWKHPXFLQDVVRFLDWHG Estas proteínas poseen potenciales epítopos de surface protein (masp) family of the human clase MHC-I principalmente en los extremos de pathogen Trypanosoma cruzi. Nucleic Acids las secuencias coincidiendo con las regiones más Res 2009; 1–11. hidrofóbicas de éstas. Los epítopos se sitúan en las 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 147 ([SHULPHQWDOWKHRUHWLFVWXG\RISHSWLGH¿QJHUSULQWVLQLeishmania parasites M. Auxiliadora Dea-Ayuela1, Riccardo Concu2, Lazaro G. Perez-Montoto3, Eugenio Uriarte3, Francisco Bolás-Fernández4, Florencia Ubeira2, Humberto González-Díaz2 1Faculty of Experimental and Health Sciences, Department of Chemistry, Biochemistry and Molecular Biology, Cardenal Herrera University, 46113, Moncada, Valencia, Spain. 2Faculty of Pharmacy, Department of Microbiology and Parasitology, 3Faculty of Pharmacy, Department of Organic Chemistry University of Santiago de Compostela, 15782 Santiago de Compostela, Spain. 4Faculty of Pharmacy, Department of Parasitology, Complutense University, 28040, Madrid, Spain Abstract In order to predict protein function we used WKH(OHFWURVWDWLFNDQG+,173RWHQWLDOVȝN7KHVH The number of protein and peptide structures values were used as inputs to construct the QSAR parasites, their hosts, and other organisms, relea- model. The average general potentials depend on the sed to Protein Data Bank (PDB) and Gen Bank wi- absolute probabilities pk(j) and the total potential thout functional annotation has increased. Using with which the amino acid j-th interact with the rest Proteomics tools such as MASCOT, we can perform of amino acids. All calculations were carried out function annotation of these proteins if we have with our in-house software MARCH-INSIDE [3]. Mass Spectra (MS) outcomes and there are in data- bases known template proteins with known function and high similarity scores if not these methods may Results not succeed. Consequently, there is a high demand for Quantitative Structure-Activity Relationships The model predicts EC for 106 out of 151 (QSAR) equations to predict these functions from (70.2%) oxidoreductases, 178/178 (100%) transfera- SURWHLQ'VWUXFWXUHDQGRUVHTXHQFH:HWUDLQHG ses, 223/223 (100%) hydrolases, 64/85 (75.3%) lya- and validated a new 3D-QSAR equation based on a ses, 74/74 (100%) isomerases and 100/100 (100%) 0DUNRY&KDLQ0RGHO 0&0 WKDWFODVVL¿HVSURWHLQ ligases, as well as 745/811 (91.9%) non-enzymes. by their possible mechanism of action according :HDOVRJLYHDQH[DPSOHLOOXVWUDWLQJWKHVWXG\3HS- WR(Q]\PH&ODVVL¿FDWLRQ (& QXPEHU[1] using a tide Mass Fingerprints (PMFs) of new protein se- LeishmaniaSHSWLGHPDVV¿QJHUSULQWVPRGHO7KH quences of parasites proteins when traditional alig- methodology proposed here is essentially new, and nment search procedures fail. First, we obtained the enables prediction of all EC classes with a single 2D-Electrophoresis (2DE) localization of the spot equation without the need for an equation for each for a new protein from Leishmania infantum:H class or nonlinear models with multiple outputs. In also give MALDI TOF MS characterization and addition, the model may be used to predict whether results of MS MASCOT search and detected that all one peptide presents a positive or negative contribu- templates with possible enzyme or any other action tion of the activity of the same EC class. have low similarity score and/or unknown function. Then, we decided to carry out prediction with our 46$50&0PRGHORIWKHFRQWULEXWLRQWRVSHFL¿F Materials and methods enzyme action of 29 peptides found in the PMF of the new query protein. As the QSAR bases on 3D Stationary promastigotes proteins of the Leis- information, we had to predict previously possible hmania infantum strain LEM75 were analyzed by 3D structures of these peptides using Molecular Dy- two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis namic (MD) methods. Some of the more interesting (2D-PAGE) employing an immobilized linear pH peptides were predicted with positive contribution 4-7 gradient for isoelectric focusing. Proteins were WRVRPHVSHFL¿FHQ]\PHDFWLRQV ZKLFKFRLQFLGHG visualized by silver stain and spots of interest were ZLWKDGGLWLRQDO%/$67DOLJQPHQW¿QGLQJV excised from preparative 2D gels, and then analyzed by MALDI-TOF and/or MALDI-TOF/TOF mass spectrometry. [2] 148 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Conclusion References This combined strategy may be used to identify [1] C.o.B. Nomenclature, Enzyme Nomenclature. and predict peptides of proteins from parasite and/ [2] Dea-Ayuela MA, Rama-Iñiguez S, Bolás-Fer- or their hosts when classic proteomics tools fails; nández F. Proteomic analysis of antigens from which may be of interest in drug or vaccine develo- Leishmania infantum promastigotes. Proteomics SPHQWDQGRUGUXJWDUJHWLGHQWL¿FDWLRQ 2006;6:4187-94. [3] González-Díaz H, González-Díaz Y, Santana L, Ubeira FM, Uriarte E. Proteomics, networks and connectivity indices. Proteomics 2008;8:750-78. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 149 6. PROTEÓMICA VEGETAL Y ANIMAL Coordinadores: Luis Valledor y Federico Valverde Ubiquitinación de proteínas nucleares en la señalización del ayuno de fosfato en plantas Marina Trigueros, Mónica Rojas-Triana, Maria Luisa Irigoyen, Javier Paz-Ares, Vicente Rubio Departamento de Genética Molecular de Plantas. Centro Nacional de Biotecnología-CSIC. Campus de la UAM. Cantoblanco. Madrid (OSpSWLGRXELTXLWLQD 8E HVXQPRGL¿FDGRU Pi en plantas implica el control de la acumulación postraduccional implicado en prácticamente todos de proteínas reguladoras mediado por la ruta de ubi- los aspectos de la biología celular de los eucariotas quitinación y degradación por el proteosoma (UPS). [1]. La ubiquitinación, mediada por enzimas E3 3URSRQHPRVGRVHVWUDWHJLDVFRQHO¿QGHHYDOXDUHO 8EOLJDVDHVSHFt¿FDVIXQFLRQDJHQHUDOPHQWHFRPR papel regulador de la ruta UPS en la regulación de una señal de marcaje de proteínas para su poste- la respuesta a dicho estrés; una dirigida, analizan- rior degradación vía el proteosoma. Sin embargo, do el efecto que tiene la sobreexpresión de las 5 la Ub también está implicada en la regulación de (8EOLJDVDVLGHQWL¿FDGDVHQHOSURWHRPDQXFOHDU la función de proteínas a través de cambios en su bajo distintos aportes de Pi. La otra, mas genérica, capacidad para interaccionar con otras proteínas o WUDWDQGRGHLGHQWL¿FDUSURWHtQDVUHJXODGRUDVFX\D sustratos, control de su localización subcelular o de acumulación dependa de la concentración de Pi en VXVXVFHSWLELOLGDGSDUDVHUGLDQDGHRWUDVPRGL¿FD- el medio y de la presencia/ausencia de inhibidores ciones postraduccionales [1]. del proteosoma. Durante el desarrollo de este con- greso se mostrarán nuestros avances más recientes En plantas, la Ub está asociada a diversos proce- siguiendo ambas aproximaciones. sos de señalización y respuesta a estrés, incluyendo el ayuno de fosfato [2]. Este último es un nutriente esencial para el desarrollo de cualquier organismo. Referencias La implicación de la Ub en el control de la homeos- tasis de Pi se basa en parte en la caracterización [1] Ulrich H. Mutual interactions between the del gen PHO2 de Arabidopsis. Este gen controla la SUMO and ubiquitin systems: a plea of no distribución de Pi entre la raíz y la parte aérea de la contest. Trends Cell Biol. 2005;15: 525-532. planta [3]. La proteína PHO2 es similar a enzimas [2] Downes B. And Vierstra R.D. Post-translational con actividad E2/E3 Ub ligasa, aunque su función regulation in plants employing a diverse set of bioquímica y sus posibles proteínas diana se desco- polypeptide tags. Biochem. Soc. Trans. 2005;33: QRFHQ3RURWUDSDUWHQXHVWURJUXSRKDLGHQWL¿FDGR 393-399. 5 E3 Ub ligasas nucleares cuya expresión depende >@ %DUL53DQW%'6WLWW0\6FKHLEOH:5 del aporte de Pi al medio y que afectan a la expre- PHO2, MicroRNA399, and PHR1 Define a sión de genes de respuesta al ayuno de Pi. Estos Phosphate-Signaling Pathway in Plants. Plant resultados sugieren que la señalización del ayuno de Physiol. 2006;141: 988-999. 150 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Proteome profile analysis of Medicago truncatula leaves in response to Uromyces striatus Mª Ángeles Castillejo1, Jesús V. Jorrín2, Diego Rubiales1 1 2 Departamento de Agronomía y Mejora, IAS (CSIC), Córdoba. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, ETSIAM, Universidad de Córdoba Summary and the images were analysed with the PD-Quest software (BioRad). Those spots that showed statis- The two-dimensional electrophoresis (2-DE) WLFDOO\VLJQL¿FDQWGLIIHUHQFHV S LQLQWHQVLW\ OHDISURWHLQSUR¿OHRIIRXU0HGLFDJRWUXQFDWXODJH- were considered for further analysis. Differential notypes displaying different phenotypes in response spots were excised from gels and digested with trip- to rust (Uromyces striatus) inoculation has been stu- sin. Peptide fragments from digested proteins were died. Quantitative as well as qualitative differences then subjected to mass spectrometry. A PMF (pepti- were observed between non-inoculated and inocu- GHPDVV¿QJHUSULQWLQJ VHDUFKZDVSHUIRUPHGRYHU lated plants. Differential spots were analyzed by non-redundant MSDB database using the MAS- MALDI-TOF/TOF mass spectrometry and a total of COTsearch engine. SURWHLQVZHUHLGHQWL¿HGEHORQJLQJWRWKHIXQFWLR- nal category of metabolism with a high proportion being photosynthetic and stress-related proteins. Results and Discussion Differences in rust responses among genotypes Introduction were evident 48 hpi (table 1). Of the appressoria successfully formed on a stoma, less were able to Alfalfa rust (U. striatus) is an important disease penetrate the stoma and form a substomatal vesicle of worldwide distribution, being particularly dama- (SV) on F11.008 and Paraggio than on the other ge- ging in alfalfa (Medicago sativa) grown for seed notypes. Differences were also found in the rate of SURGXFWLRQ>@:HKDYHFKRVHQM. truncatula as a KDXVWRULDIRUPDWLRQZKLFKZDVVLJQL¿FDQWO\ORZHU more tractable biological system to study the pro- in F11.008 and Paraggio genotypes. However units teomic response to rust. Genotypes were selected associated with host cell necrosis was markedly based on its differential responses to U. striatus infec- higher in Grc.098. Of a total of 37 differential spot tion [1, 2]: A17, susceptible; Grc.098 showing post- SURWHLQVEHWZHHQWUHDWPHQWVZHUHLGHQWL¿HGDIWHU haustorial resistance; F11.008 and Paraggio showing 0$/',72)72)DQGGDWDEDVHVHDUFK:HIRXQG pre-haustorial resistance. Leaf proteins from non-ino- an increase of stress-related proteins in pre-hausto- culated and rust inoculated M. truncatula plants were ULDOJHQRW\SHV WDEOH¿JXUH DQGWZRSURWHLQVEH- extracted and resolved by 2-DE, and the differential longing to other functional categories (glycine-rich spots were analyzed by mass spectrometry. RNA binding protein and malate dehydrogenase) which have been involved in transcriptional regu- Methodology lation by different effectors related to plant defense UHVSRQVHV>@:HFRQFOXGHWKDWWKHH[SUHVVLRQRI M. truncatula seedlings were inoculated when proteins was different in relation to susceptibility/ the third trifoliate leaf was completely expanded. resistance of the genotypes studied at early stage of Leaves were collected 48 hours post inoculation the infection and the clear increase of stress-related (hpi) for microscopic observations [1]. For proteo- proteins only in the genotypes with pre-haustorial mics analyses, inoculated and non-inoculated plants resistance makes us suspect that these proteins may were sampled 24 and 48 hpi. Proteins from leaf be involved in the stop of parasite development be- tissue were TCA/acetone extracted [3] and resolved fore forming haustoria. by 2-DE. Gels were silver and SyproRuby stained 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 151 Table 2. ,GHQWL¿HGSURWHLQVWKDWFKDQJHGLQUHVSRQVHWR8VWULDWXVLQRFXODWLRQ a Molecular Medicago truncatula genotypes function AI *UF ) Paraggio RuBisCO small RuBisCO small RuBisCO small subunit (4) 0DODWHGHK\GURJHQDVH>Ĺ@ FKDLQ>Ĺ@ FKDLQ >Ļ@ >Ļ@ RuBisCO large RuBisCO activase Metabolism VXEXQLW>Ļ@ >Ĺ@ Ferredoxin-NADP UHGXFWDVH>Ĺ@ Nucleic acid Elongation factor Glycine-rich RNA Glycine-rich RNA binding binding/ Tu, chloroplast ELQGLQJSURWHLQ>Ĺ@ SURWHLQ>Ĺ@ Transcription SUHFXUVRU>Ļ@ Glutathione peroxidise Ascorbate peroxidase >Ĺ@ Defense and [new] stress-related *OXWDWKLRQHWUDQVIHUDVH>Ĺ@ a ,QSDUHQWKHVHVLQGLFDWHQXPEHURIWLPHVWKLVSURWHLQKDVEHHQLGHQWL¿HG >Ĺ@LQGLFDWHLQFUHDVHDQG>Ļ@GHFUHDVHLQ intensity of protein. $FNQRZOHGJPHQWV The authors thanks to European Union Gra- in Legumes Integrated Project, Spanish project AGL2008-01239/AGR and Andalusian project P07- $*5IRU¿QDQFLDOVXSSRUW References [1] Rubiales D and Moral A. Mechanisms of resis- tance against alfalfa rust (Uromyces striatus) in Medicago truncatula. Eur J Plant Pathol 2004; 110:239-243. [2] Kemen E, Hahn M, Mendgen K and Struck C. Figure 1. 2DE image gel of M. truncatula leaves proteome. Different resistance mechanisms of Medicago $UURZVLQGLFDWHVLGHQWL¿HGSURWHLQV $3; DVFRUEDWHSHUR[L- dase), EF-Tu (elongation factor Tu), FR (ferredoxin-NADP truncatula ecotypes against the rust fungus reductase), GP (glutathione peroxidise), GRP (glycine-rich Uromyces striatus. Phytopathology 2005; RNA binding protein), GST (glutathione transferase), MA 95:153-157. (malate dehydrogenase), RUB (RubisCo), RUBa (RubisCo [3] Damerval C, de Vienne D, Zivy M and Thie- activasa). llement H. Technical improvements in two- Table 1. Microscopical analysis of the early development of dimensional electrophoresis increase the level U. striatus on M. truncatula x of genetic variation detected in wheat-seedling proteins. Electrophoresis 1986;7:52-54. Appr. Number of [4] Maurino VG, Saigo M, Andreo CS and Drinco- penetrated Colonies Genotypes haustoria/ vich MF. Non-photosynthetic ‘malic enzyme’ forming SV whit necrosis colony (%) from maize: a constituvely expressed enzyme that responds to plant defence inducers. Plant A17 75.0 a 1.8 a 0 b Mol Biol 2001; 45:409–420. Grc.098 76.1 a 1.5 a 51 a [5] Amey RC, Schleicher T, Slinn J, Lewis M, Ma- F11.008 42.3 b 1.0 b 0 b cdonald H, et al. Proteomic analysis of a com- Paraggio 31.8 b 0.03 c 0 b patible interaction between Pisum sativum (pea) and the downy mildew pathogen Peronospora x Values with letters in common in each column are not sig- viciae. Eur J Plant Pathol 2008; 122:41-55. QL¿FDQWO\GLIIHUHQW S /6'WHVW 152 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Análisis proteómico del desarrollo sexual mediado por anteridiógeno en el JDPHWR¿WRGHOKHOHFKRBlechnum spicant Virginia Menéndez, Luis Valledor, Angeles Revilla, Helena Fernández Area de Fisiología Vegetal, Departamento B.O.S. Facultad de Biología. Universidad de Oviedo Los helechos actuales son un legado genético ducción de masculinidad. A este medio se añadieron de gran valor. Se trata de plantas vasculares con una JDPHWR¿WRVGHGtDVGHHGDG\WUDVXQSHULRGR organización primitiva cuyo ciclo vital consta de de cultivo de 20 dias, se caracterizaron (estado de una fase gametofítica (haploide) y otra esporofítica desarrollo, órganos sexuales) y se compararon con (diploide), que se hallan separadas en el espacio y en JDPHWy¿WRVGHOPLVPRRULJHQFXOWLYDGRVHQPHGLR HOWLHPSR/DIRUPDFLyQGHOHVSRUR¿WRVHSURGXFHHQ de cultivo sin anteridiógeno (Control). HOVHQRGHXQJDPHWR¿WRTXHHVXQDHVWUXFWXUDPRU- fológicamente muy sencilla y también muy vulnera- $PERVWLSRVGHJDPHWR¿WRVVHWULWXUDURQHQQL- ble a factores ambientales. La reproducción sexual trógeno líquido (50 mg de peso seco por muestra) y en este conjunto de especies implica la formación de ODSURWHtQDVHSXUL¿FyPHGLDQWHH[WUDFFLyQIHQyOLFD órganos sexuales femeninos (arquegonios) y mascu- seguida de precipitación en acetato de amonio en linos (anteridios) en distintas secuencias cronológi- metanol descrito por Carpentier [6]. La concentra- cas. Una de estas secuencias implica la formación ción de proteínas se midió por medio de Bradford inicial de órganos femeninos seguida de la forma- y las muestras se almacenaron a -80ºC hasta que ción de los órganos masculinos que es controlada se realizó el isoelectroenfoque. Para ello se utili- por la presencia de un sistema anteridiógeno. Este zaron 10 tiras de 24 cm con un rango de pH 3-10 sistema inductor se ha relacionado tradicionalmente no lineal, que fueron rehidratadas todas a la vez de con las giberelinas [1], aunque en Blechnum spicant forma pasiva con 550 µg de proteína en 450 µL de aún no se conoce su naturaleza química exacta [2-4]. tampón de solubilización. El isoelectroenfoque se (QDXVHQFLDGHHVWDVVXVWDQFLDVHOJDPHWR¿WRHVKHU- realizó siguiendo las recomendaciones del fabrican- mafrodita (Ceratopteris) o femenino (Blechnum), y te (GE Healthcare). Una vez terminado el enfoque éste, una vez alcanzada la madurez, producirá y se- las tiras fueron equilibradas posteriormente alma- cretará activamente anteridiógeno que actuará sobre cenadas a -80ºC. ORVJDPHWR¿WRVHQGHVDUUROORLQGXFLHQGRHQHOORV La segunda dimensión SDS-PAGE se llevó a la masculinidad. Este mecanismo está destinado a cabo en geles de poliacrilamida al 13%. Posterior- evitar la autofecundación. mente se tiñeron con azul de Coomassie coloidal (OJDPHWy¿WRGHOKHOHFKRTXHDSHQDVFRQVWDGH G-250 durante 20 horas (3 veces) siguiendo el pro- una única capa de células y no presenta interacciones tocolo de Mathesius et al. [7]. Las imágenes de los con el tejido esporofítico, se presenta como un siste- geles se adquirieron con un densitómetro y se ana- ma experimental ideal para profundizar en el estudio lizaron con software PDQuest 8 (Biorad). Tras una de procesos del desarrollo sexual en plantas. revisión manual, se contabilizaron 581 spots bien re- sueltos. Solo se consideraron spots que aparecieran En este trabajo, se han empleado por primera en al menos 3 de los 5 geles. Se asignaron valores vez técnicas proteómicas para estudiar la expresión perdidos empleando el algoritmo KNN aplicado de GLIHUHQFLDOGHSURWHtQDVHQWUHJDPHWR¿WRVTXHVHKDQ forma secuencial (R environment). Posteriormente desarrollado en presencia y en ausencia de sustan- se normalizó la intensidad de los spots y, para re- cias con acción anteridiógena. ducir la dependencia de la media y la varianza, se realizó una transformación logarítmica. Tras aplicar En primer lugar se extrajeron anteridiógenos de XQDSUXHEDWFRQĮ VHGH¿QLHURQVSRWV FXOWLYRVGHJDPHWR¿WRVDGXOWRVVLJXLHQGRHOPpWRGR como diferencialmente expresados. de Yamauchi [5], y posteriormente se añadieron a medio de cultivo MS para generar un sistema de in- 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 153 Se aplicó un análisis de componendes principales and gender in the gametophyte of Blechnum a todos los spots, permitiendo el PC2 la separación de spicant L. Plant Cell Tiss Org 2006; 86:47-53. las muestras en dos grupos. Teniendo en cuenta los [4] Menéndez V, Revilla MA, Bernard P, Gotor análisis uni y multivariables se seleccionaron para su V, and Fernández H (2006) Gibberellins and LGHQWL¿FDFLyQDTXHOORVORVVSRWVTXHPRVWUDURQXQ antheridiogen on sex in Blechnum spicant L. p-valor más bajo en el caso de la prueba T, y aquellos Plant Cell Rep 25:1104-1110. FRQFRH¿FLHQWHVGHFRUUHODFLyQPD\RUHVGHSDUD [5] Yamauchi T, Oyama N, Yamane H, Murofushi los componentes principales 1-3. N, Schraudolf H, Pour M, Furber M, Mander /DLGHQWL¿FDFLyQGHORVVSRWVGLIHUHQFLDOHVSHU- /,GHQWL¿FDWLRQRI$QWKHULGLRJHQVLQLygodium mitió describir por primera vez en helechos las circinatum and Lygodium flexuosum. Plant rutas metabolicas cuya expresión varía en relación Physiol 1996; 111:741-5. con el desarrollo sexual dependiente de la acción >@ &DUSHQWLHU6&:LWWHUV(/DXNHQV.'HFNHUV3 del anteridiógeno. Swennen R and Panis B. Preparation of protein extracts from recalcitrant plant tissues: An evalu- ation of different methods for two-dimensional Referencias gel electrophoresis analysis. Proteomics 2005; 5:2497-507. [1] Yamane H. Fern antheridiogens. Int Rev Cytol 1998; 184:1-32. >@ 0DWKHVLXV8.HLM]HUV*1DWHUD6+$:HLQ- man JJ, et al. Establishment of root proteome [2] Fernández H, Bertrand AM, Sierra MI, Sánchez- reference map for the model legume Medicago Tamés R. An apolar GA-like compound respon- trunculata using the expressed sequence tag data- sible for antheridiogen in Blechnum spicant. EDVHIRUSHSWLGHPDVV¿QJHUSULQWLQJ3URWHRPLFV Plant Growth Regul 1999; 28:143-4. 2001; 1:1424-40. [3] Menéndez V, Revilla MA, Fernández H. Growth Proteome regulation and epigenetic code during Pinus radiata needle maturation Luis Valledor1, Maria Jesus Cañal1, Christof Lenz3, Roberto Rodríguez1, Jesús Jorrín3 1Plant Physiology. I.U.B.A. University of Oviedo.C/ Cat. Rodrigo Uria s/n, E-33071 Oviedo, Spain. 2Applied Biosystems Deutschland, Frankfurter Strasse 129-B, Darmstadt, Germany. 3Biochemistry and Molecular Biology. University of Córdoba. Campus de Rabanales. E-14071 Córdoba, Spain Needle differentiation is a very complex process the differential expression levels of histone epigene- which leads to the formation of a mature photosyn- tic marks, being the levels of acetylated Histone H4 thetic organ. This fact implies important changes in and Histone H3K43m, associated to gene expression, protein accumulation and gene expression which higher in immature needles whereas the Histone must be regulated, amongst others, by epigenetic H3K93m was only found in mature needles (Figure PHFKDQLVPV:HKDYHFRPSDUHGVRPHHSLJHQHWLF 1c). This could be explained by the fact that chro- PRGL¿FDWLRQV '1$PHWK\ODWLRQ+LVWRQH+.3m, matin needs to be altered and restructured during the Histone H3K93m and acetylated Histone H4) present differentiation to regulate gene expression [1]. in immature (1 month old) and mature (12 month old) Pinus radiata needles (Figure 1a), determining To determinate which genes and proteins DWLVVXHVSHFL¿F'1$PHWK\ODWLRQ )LJXUHE DQG showed as differential during needle development 154 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Figure 1. a) Mature (top) and immature (bottom) needle fascicles. b) Immunodetection of 5-mdC. In 3D view the intensity RIHDFKÀXRUHVFHQFHSRLQWLVUHSUHVHQWHGODUJHUYHUWLFDOEDUVLQGLFDWHKLJKHUÀXRUHVFHQFHLQWHQVLW\F 5HSUHVHQWDWLYHEORWV VKRZLQJWKHTXDQWL¿FDWLRQRI$F++.3m and H3K93m on protein extracts from immature (I) and mature (M) scions. The left lane corresponds to Coomassie stained MW standards. we have also characterized and compared proteome differentially expressed pathways associated with and transcriptome of immature and mature needles. needle maturation. Energy metabolism pathways, Immature needles are characterized by a low tissue with photosynthetic and oxidative phosphorylation differentiation and high morphogenetic capability related proteins and genes, were overexpressed in whereas mature needles are a specialized photos- mature needles. Amino acid metabolism, transcrip- ynthetic organ, which do not show morphogenetic tion and translation pathways were overexpressed in FDSDELOLWLHV'(SUR¿OHVGHWHUPLQHGIROORZLQJD immature needles. Interestingly, stress related pro- previously described protocol [2], showed variations teins and defense mechanisms were characteristic in the relative abundance of 280 spots from a total of immature tissues, a fact that may be linked to the of 856 that were studied whereas transcriptomic trees’ need to defend the needles in young stages or analyses (substractive library building and deter- the higher growth rate and morphogenetic compe- mination of differential expression by macroarray tence exhibited by this tissue [3]. and real time PCR) resulted in the description of 176 differentially expressed genes in immature and From these functional groups we have selected mature needles. The joint analysis of proteomic and ¿YHJHQHVUHODWHGWRSKRWRV\QWKHVLV RBCA), re- transcriptomic data that was performed provided gulation of gene expression (MSI1, CSDP2), leaf a broad overview of differentially expressed ge- elongation (CYP78A7) and stress (SHM4) to further nes and proteins associated with needle maturation. LQYHVWLJDWHLWVVSHFL¿F'1$PHWK\ODWLRQ$OORIWKH- Some spots and genes related to photosynthesis and VHJHQHVVKRZHGGLIIHUHQWLDOKLVWRQHPRGL¿FDWLRQV oxidative phosphorylation were overexpressed in detected by Chromatin Immunoprecipitation, fur- mature needles. On the other hand immature needles thermore CYP78A7 and CSDP2 showed a sequence were characterized by the overexpression of bios- ULFKLQ&S*LQLWVSURPRWHUDQG¿UVWH[RQ6SHFL¿F ynthesis-, cell division- and differentiation-related DNA methylation patterns related to tissue differen- proteins [3]. A joint data analysis of proteomic and tiation were found for CSDP2>@7KLVLVWKH¿UVW transcriptomic results provided a broader view over GHVFULSWLRQRIDVSHFL¿FJHQHUHJXODWLRQEDVHGRQ epigenetic mechanisms in conifers. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 155 Figure 2. Master gel combining spots of B1 and B12 protein extracts (a). Three sections of the 2-DE gels showing two repre- sentative B1 and B12 gels (b). Red and green arrows up and down accumulated spots, respectively, while black arrows point spots only detected in one kind of protein extract. )LJXUHCSDP2 showed a differential methylation pattern of cytosines. The callus tissue, without any methylated cytosines, showed the highest expression level of this gene and the higher proportion of AcH4 and H3K43m (all epigenetic marks associated with gene expression). One of these marks, H3K43m, was lost in mature needles, the tissue which showed the lowest expression level. (Valledor et al., in preparation) References R, Cañal MJ, Jorrin J. The 2-DE proteome of Pinus radiata needle tissue: analytical, biological [1] Valledor L, Meijon M, Hasbún R, Cañal MJ, YDULDELOLW\DQGSURWHLQLGHQWL¿FDWLRQ-3URWHRPH Rodriguez R. Variations in DNA methylation, Res 2008; 7: 2616-31. acetylated histone H4, and methylated histone H3 during Pinus radiata needle maturation in [3] Valledor L, Jorrín JV, Rodríguez JL, Lenz C, relation to the loss of in vitro organogenic ca- Rodriguez R, Cañal MJ. Combined Proteomic pability. J Plant Physiol 2009; available on line DQG7UDQVFULSWRPLFDQDO\VLVLGHQWL¿HVGLIIHUHQ- (DOI 10.1016/j.jplph.2009.09.018). tially expressed pathways associated to Pinus radiata needle maturation. Mol Cell Proteomics, [2] Valledor L, Castillejo MA, Lenz C, Rodríguez under review. 156 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 (VWXGLRGHODUHVSXHVWDDOHVWUpVKtGULFRHQGRVSREODFLRQHVGHHQFLQD Quercus ilex subsp. ballota 'HVI 6DPS PHGLDQWHXQDDSUR[LPDFLyQGHSURWHyPLFD comparativa basada en electroforesis bidimensional José Valero Galván1, Rafael Mª Navarro Cerrillo2, Ma Cristina Romero Rodríguez1, David Ariza2, Jesús Jorrín Novo1 1 Grupo de Bioquímica, Proteómica Vegetal y Agrícola. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Córdoba, España. 2 Departamento de Ingeniería Forestal. ETSIAM, Universidad de Córdoba. Córdoba, España Resumen entre poblaciones, sin que, por otro lado, hayamos podido asociar las diferencias observadas al carác- La encina (Quercus ilex subsp. ballota) es una ter más o menos tolerante de la población utilizada. de las especies forestales más importantes del Bos- Ello puede ser debido a la intensidad y duración del que Mediterráneo, siendo ampliamente utilizada en HVWUpVDODVGL¿FXOWDGHVGHOVLVWHPDH[SHULPHQWDOR programas de conservación forestal, reforestación limitaciones de la técnica. y otras practicas silvícolas. El éxito de dichas prác- ticas depende, en gran medida, de la supervivencia Nuestro grupo de investigación esta trabajando de las plántulas, siendo el estrés por sequía la prin- en un proyecto de investigación (Variabilidad, cata- cipal causa de mortalidad tras el transplante. Es logación, respuesta a estreses y propagación clonal por ello que la selección de “individuos plus” con de encina (Q. ilex), DECOVA, AGL2009-12243- tolerancia a estrés hídrico es de gran importancia. C02-02), dirigido, entre otros objetivos, a estudiar la Los mecanismos de respuesta a estrés en encina respuesta de la encina a estrés producido por sequía y su variabilidad poblacional han sido muy poco utilizando una aproximación multidisciplinar, pro- estudiados. En el presente trabajo se ha evaluado, teómica incluida [1, 2]. La proteómica en especies mediante una aproximación de proteómica compa- IRUHVWDOHVQRHVIiFLOGHELGRDVXGL¿FXOWDGFRPR rativa basada en geles bidimensionales, la respuesta sistema experimental (variabilidad genética alta, diferencial de dos poblaciones de encina a la sequía. ciclo de vida largo, ausencia de entradas en bases Aunque dicha aproximación revela diferencias en la de datos de DNA genómico, ESTs o proteínas). No intensidad de manchas entre tratamientos, no lo hace REVWDQWHVXHVWXGLRHVWDMXVWL¿FDGRGDGDODLPSRU- Figura 1. A) Imagen de hojas y raíz de plantas de las dos poblaciones utilizadas a los 28 días del tratamiento de sequía. SSA (población almeriense), GSE (población sevillana). B) Gel 2-DE representativo de extractos de hoja de encina. La imagen corresponde a una muestra de la población SSA a los 28 días del tratamiento de sequía. En la tabla se indican las proteínas LGHQWL¿FDGDVFRUUHVSRQGLHQWHVDPDQFKDVGLIHUHQFLDOHVHQWUHWUDWDPLHQWRV 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 157 tancia económica y medioambiental de la especie, Estos resultados son similares a los obtenidos en componente principal de la “dehesa” y el Bosque plántulas de encina sometidas a diferentes niveles Mediterráneo. Mediante una aproximación de pro- de estés hídrico [1, 2] y a otras especies forestales teómica de expresión diferencial basada en electro- como el caso del genero Populus [5], sin que hasta la foresis bidimensional se han analizados cambios fecha, y en especies forestales, se haya concluido de HQHOSHU¿OSURWHLFRGHGRVSREODFLRQHVGHHQFLQD forma contundente la base molecular de la respuesta [Almería (SSA) y Sevilla (GSE)] [3] sometidas a a estrés, y si las consecuencias del estrés. HVWUpVKtGULFRPHGLDQWHULHJRGH¿FLWDULR GtDV Previamente se caracterizó la respuesta de las dos poblaciones mediante parámetros de crecimiento, Referencias potencial hídrico, humedad relativa en raíz y hojas, [1] Jorge I, Navarro-Cerrillo RM, Lenz C, Ariza D, \H¿FLHQFLDIRWRVLQWpWLFD UHVXOWDGRVQRSXEOLFDGRV Jorrín J, Variation in the holm oak leaf proteome A tenor de los resultados obtenidos se concluyó que at different plant developmental stages, between la población SSA fue más tolerante, mientras que la provenances and in response to drought stress. población GSE fue la más susceptible (Figura 1A). Proteomics, 2006; 6: S207–14. Las proteínas de hoja (300 mg) de plantas de un [2] Echevarría-Zomeño S, Ariza D, Jorge I, Lenzc año de crecimiento (control, plantas regadas cada C, Campo A, Jorrín J, Navarro-Cerrillo, RM. tres días; tratamiento de sequía, plantas no regadas &KDQJHVLQWKHSURWHLQSUR¿OHRIQuercus ilex a los 28 días) fueron extraídas usando el protocolo leaves in response to drought tress and in re- de precipitación TCA-FENOL [4]. Las condiciones sponse to drought stress and recovery. J. Plant de electroforesis, tinción, análisis de los geles y es- Physiol.2009; 166:233–245. WDGtVWLFRHLGHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDVVHUHDOL]DURQ [3] Valero GJ, Navarro-Cerrillo RM, Gómez CA, como lo indica Maldonado et al. [4]. Ariza D, Jorrín J. Population variability and mother tree selection in holm oak (Quercus Después de la tinción de los geles y análisis de ilex L. subsp. ballota [Desf.] Samp.) based on las imágenes se detectaron alrededor de 350-370 acorn morphometry and analysis by near in- manchas. Tras el análisis estadístico se concluyo IUDUHGUHÀHFWDQFHVSHFWURVFRS\ 1,56 que existían 40 manchas diferenciales entre trata- (Submited). mientos y tan solo 4 entre poblaciones (muestras [4] Maldonado AM, Echevarria-Zomeno S, Jean- control). Dado el carácter de especie huérfana de en- Baptiste S, Hernandez M, Jorrin-Novo JV. FLQDHOSRUFHQWDMHGHLGHQWL¿FDFLyQIXHEDMRPHQRV Evaluation of three different protocols of pro- del 50 % de las manchas diferenciales. En general, tein extraction for Arabidopsis thaliana leaf se observó como consecuencia del tratamiento de proteome analysis by two-dimensional electro- sequía un descenso en la intensidad de manchas phoresis. J. Proteomics, 2008; 71:461–72. correspondientes a proteínas fotosintéticas, fosfogli- cerato-quinasa (glicólisis), peroxiredoxinas (estrés [5] Bonhomme L, Monclus R, Vincent D, Carpin S, oxidativo) y una glucanasa (proteína de defensa Claverol S, Lomenech MA, Labas V, Plomion C, frente a patógenos) (Figura 1B). Por el contrario se Brignolas F, Morabito D. Genetic variation and drought response in two Populus euramericana observó un aumento de intensidad de la glutamina genotypes through 2-DE proteomic analysis sintetasa y la s-adenosil-metionina sintetasa. No se RIOHDYHVIURP¿HOGDQGJODVVKRXVHFXOWLYDWHG - HQFRQWUDURQGLIHUHQFLDVHVWDGtVWLFDPHQWHVLJQL¿FD plants. Phytochemistry, 2009; 70: 988–1002. tivas entre las dos poblaciones analizadas, tanto en controles como en tratamiento de sequía. 158 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Desarrollo y optimización del proceso de extracción de proteínas y electroforesis bidimensional en fruta de hueso Esther Giraldo Ramos1, Amelia Díaz Méndez1, Alfredo Garcia Sánchez2 1 Departamento de Vegetales II. Instituto Tecnológico Agroalimentario (INTAEX) 2 Centro de Investigación “Finca La Orden-Valdesequera” La fruta de hueso es muy inestable y se deteriora minutos; 4ºC), y el precipitado lavado 2 veces con muy rápido a temperatura ambiente. El almacena- acetona fría, y se dejó secar al aire para eliminar los miento a bajas temperaturas para prolongar su vida restos de acetona. Finalmente el precipitado de pro- puede afectar negativamente a la calidad de la fruta, teínas se resuspendió en tampón de rehidratación (7 GHELGRDOGHVDUUROORGHGHVRUGHQHV¿VLROyJLFRVFR- M Urea, 2 M thiurea, 4% CHAPS, 2% Pharmalyte, nocidos como daños por frió (DF) [1]. La incidencia 40 mM DTT). Debido a la baja calidad de los geles, de estos daños es mayor en unas variedades que causados por la presencia de sales y contaminantes en otras [2], por lo tanto su severidad parece tener no proteínicos, se decidió el empleo del PlusOne un componente genético [3]. Conocer los procesos 2-D Clean-Up kit. El precipitado limpio fue disuelto moleculares puede permitir diseñar procedimientos en tampón (7M Urea, 4% (p/v) CHAPS, 1% (v/v) para inducir resistencia o disminuir la sensibilidad al tampón de inmobilización gradiente de pH 3-11 DF. El estudio de la proteomica comparativa es cada (GE Healthcare), 0,037 DTT y 0,002% (p/v) azul vez más atractivo en la biología de plantas dada de bromofenol, conteniendo una tableta de Mini las amplias bases de datos de secuencia genómi- Protease Inhibitor Cocktail (Roche) por cada 10 ml cas y EST que proporcionan grandes oportunidades de tampón). La concentración de proteínas extraídas SDUDLGHQWL¿FDUSURWHtQDV/DHOHFWURIRUHVLVELGL- fue determinado utilizando el PlusOne Quant Kit mensional (2D) constituye actualmente el método (GE Healthcare). En el Isoelectroenfoque, se utili- PiVH¿FLHQWHSDUDODVHSDUDFLyQGHSURWHtQDV\DTXH zarón 150 mg de proteínas/ geles teñidos con plata permite separar cientos, incluso miles de proteínas y 300 mg/ geles teñidos con azul de Coomassie para en un solo experimento. En este trabajo se presenta la rehidratación pasiva de tiras de isoelectroenfoque la optimización de la extracción y separación de (IEF) de 13 cm con pH 3-11 “no lineal” (al menos proteínas mediante geles bidimensionales a partir 12 horas). Tras la rehidratación se procedió al IEF a del problemático tejido de la fruta. Las proteínas 100, 200, 500 y 1000 V durante 1 hora cada uno, un fueron extraídas de la pulpa del melocotón y la nec- paso de gradiente hasta 8000 V durante 2:30 horas tarina mediante un método ya descrito [4] con lige- y 8000 V durante 1 hora en un Ettan IPGphor Ma- UDVPRGL¿FDFLRQHV3DUWLPRVGHJUDPRVGHSROYR nifold (GE Healthcare) a 20ºC y con una corriente de pulpa de melocotón o nectarina, pulverizados en máxima de 50 uA/gel. A continuación las tiras fue- mortero con nitrógeno liquido, resuspendidos en 10 ron incubadas 30 minutos en Tampón de equilibrado ml de tampón de extracción (100 mM TRIS pH 8.8, (0,075 M Tris, 6 M urea, 29.3% (v/v) glicerol, 2% 5 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 Mm PMSF y 30% de (p/v) SDS y 0,002% (p/v) azul de bromofenol), los sacarosa), más fenol saturado en TRIS (pH 8.8) en primeros 15 minutos con 0,065 M DTT y la segunda proporción 1:1 (v/v), mezclamos vigorosamente y se incubación con iodoacetamida (0,135 M). La elec- dejó reposar las muestras durante 10 minutos a 4ºC troforesis SDS PAGE se realizó en geles (20x20 cm) antes de centrifugar (10.000g; 15 minutos; 4ºC), se de poliacrilamida 12,5% (p/v) utilizando tampones recuperó la fase fenólica se añadió 1:5 (v/v) volú- >@D:SRUJHO\&GXUDQWHWRGDODQRFKH menes de Acetato Amónico 100 mM en metanol y Los geles fueron teñidos mediante las tinciones de se dejó a -20ºC toda la noche. También se probó en plata, (silver-stain GE Healthcare) y azul Coomas- este paso el empleo de ácido tricloroacético (ATC) sie (GE Healthcare). Los geles obtenidos fueron en lugar de Acetato Amónico, sin embargo los re- escáneados y calibrados con el software labscan sultados fueron decepcionantes. Tras la precipita- 6 (GH Healthcare) (Figuras 1 y 2). La mayoría de ción, las muestras fueron centrifugadas (10.000g; 15 los protocolos de extracción incluyen un paso de 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 159 precipitación con ATC para incrementar la concen- peach and nectarine. Postharvest Biol. Tech- tración de proteínas y ayudar a la eliminación de nol. 2005;37:195-208. contaminantes [6], sin embargo en ciertas ocasiones, [3] Ogundiwin EA, Peace CP y Gradziel TM. Mole- como es nuestro caso, provoca una co-extracción de cular genetic dissection of chilling injury in peach contaminantes, este es el principal problema de los fruit. Acta Horticulturae 2007;738:633-638. tejidos de fruta carnoso, que presentan un alto nivel tanto de polisacaridos de pared celular como de pec- [4] Renaut J, Lutts S, Hoffmann L, et al. Responses of poplar to chilling temperatures: Proteomic and tinas [7]. Una alternativa ya descrita [8] y adoptada physiological aspects. Plant Biol. 2004;6:81-90. por nuestro grupo en el protocolo de extracción fue solubilizar las proteínas con fenol y precipitar con [5] Laemmli UK. Cleavage Of Structural Proteins acetato amónico. En este caso se consiguió una alta During Assembly Of Head Of Bacteriophage- calidad y cantidad de extracción de proteínas libres T4. Nature 1970;227:680. de contaminantes. Ya que el fenol ofrece una mayor [6] Santoni V, Bellini C y Caboche M. Use Of estabilidad proteica al minimizar la proteolisis du- 2-Dimensional Protein-Pattern Analysis For The rante la extracción [9]. Por otro lado el melocotón y Characterization Of Arabidopsis-Thaliana Mu- la nectarina presentaron un comportamiento similar tants. Planta 1994;192:557-566. [7] Saravanan en la extracción de proteínas. La electroforesis 2D RS y Rose JKC. A critical evaluation of sample es actualmente el método de elección para los estu- extraction techniques for enhanced proteomic GLRVGHFRPSDUDFLyQGHSHU¿OHVSURWHLFRV\DTXH analysis of recalcitrant plant tissues. Proteomics se trata de una técnica muy resolutiva empleada 2004;4:2522-2532. frecuentemente en los análisis proteómicos, que per- >@ +XUNPDQ:-\7DQDND&.6ROXELOL]DWLRQ2I mite la generación de datos fácilmente evaluables, Plant Membrane-Proteins For Analysis By Two- así como su comparación cuantitativa [10]. Dimensional Gel-Electrophoresis. Plant Physiol. 1986;81:802-806. Bibliografía [9] Schuster AM y Davies E. Ribonucleic-Acid And Protein-Metabolism In Pea Epicotyls .1. The [1] Lill RE, O´Donoghue EM y King GA. Pos- Aging Process. Plant Physiol. 1983;73:809-816. tharvest physiology of peach and nectarines. [10] Rabilloud T. Two-dimensional gel electrophoresis Horticultural Reviews 1989;11:413-452. in proteomics: Old, old fashioned, but it still clim- [2] Lurie S y Crisosto CH. Chilling injury in bs up the mountains. Proteomics 2002;2:3-10. Figura 1. Gel teñido con Coomassie Figura 2. Gel teñido con Plata 160 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Comparative proteomic analysis of Arabidopsis wild-type, mutants, and Fa WRKY1WUDQVJHQLFSODQWVWRFKDUDFWHUL]HWKHIXQFWLRQRIWKHVWUDZEHUU\ Fragaria x ananassa )D:5.<SURWHLQDQGLWV$UDELGRSVLVKRPRORJ$W:5.<WZR positive regulators of resistance Alba Ruíz-Ramos1, Francisco Amil-Ruíz1, Juan Muñoz-Blanco1,3, José Luis Caballero1,3, Ana M. Maldonado Alconada2 1Plant Biotechnology Research Group and 2Agricultural and Plant Biochemistry and Proteomics Research Group, Dept. of Biochemistry and Molecular Biology, University of Cordoba,, and 3Andalusian Institute of Biotechnology, Spain :5.<IDFWRUVDUHFHQWUDOSOD\HUVRUFKHVWUDWLQJ ring fruit ripening and strongly up-regulated fo- WKHHI¿FLHQWDFWLYDWLRQRISODQWGHIHQVHUHVSRQVHV llowing Colletotrichum infection, and treatments :HKDYHJHQHUDWHG$UDELGRSVLVSODQWVRYHUH[SUHV- with defense-related hormones. :HGHPRQVWUDWHG VLQJWKHVWUDZEHUU\)D:5.<JHQHWKDWH[KLELW WKDW)D:5.<DQGLWV$UDELGRSVLVKRPRORJ$W enhanced resistance to pathogen infection, and :5.<DFWDVSRVLWLYHUHJXODWRUVGXULQJWKHDF- used a proteomic approach to identify differen- WLYDWLRQRIEDVDO WKH¿UVWOLQHRIDFWLYHGHIHQVHLQ tially accumulated proteins when compared to the plants) and R-mediated resistance (a strong form of FRUUHVSRQGLQJ:7DQGPXWDQW$Wwrky75 parental UDFHVSHFL¿FUHVLVWDQFH LQ$UDELGRSVLV$Wwrky75 OLQHV7KHLGHQWL¿FDWLRQRIWKHSURWHLQVVKRZLQJ T-DNA insertion mutants were more susceptible VLJQL¿FDQWGLIIHUHQFHVZLOOJLYHXVVRPHFOXHVRQ to virulent and avirulent isolates of the pathogenic the signaling networks in which these two factors bacteria Pseudomonas syringae, while overexpres- might be involved. sion of Fa WRKY1 in At wrky75 mutant and wild- type reverts the enhanced susceptible phenotype Plant resistance involves the reprogramming of of the mutant, and even increases resistance. The host cells which relies on major changes in gene resistance phenotype of these transgenic plants was H[SUHVVLRQ7KHLGHQWL¿FDWLRQRIWKHPROHFXODUPH- uncoupled to the expression of the tipical PATHO- chanisms that translate recognition of pathogens into GENESIS RELATED (PR) signalling pathway as- appropriate transcriptional outputs resulting in resis- sociated with resistance, suggesting differences in tance is a valuable tool in directing programs aimed the way of action between both factors in order to at generating resistant varieties [1]. Nevertheless, re- activate the defense response. levant crops of agronomical interest usually contain FRPSOH[JHQRPHVPDNLQJGLI¿FXOWPROHFXODUVWXGLHV In order to investigate the mode of action of This is the case of the interaction between strawberry $W:5.<DQG)D:5.<DQGWRLGHQWLI\WKH (Fragaria x ananassa), an important agronomical targets of these factors we are using a differential fruit crop, and Colletotrichum acutatum, a pathogen expression proteomics strategy, consisting in 2- DE which infection causes severe yield losses. combined with MS [4]. In a previous work we used the molecular re- Here we present the proteomic analysis carried sources of the model plant Arabidopsis for studying RXWWRFRPSDUHWKHOHDISURWHLQSUR¿OHRIWUDQVJHQLF this plant-pathogen interaction, and characterize Fa Arabidopsis plants overexpressing Fa WRKY1 and WRKY1WKH¿UVWPHPEHURIWKH:5.<IDPLO\RI WKHFRUUHVSRQGLQJ:7DQGPXWDQW$Wwrky75 pa- WUDQVFULSWLRQDOUHJXODWRUVLGHQWL¿HGLQVWUDZEHUU\ rental lines to identify proteome alterations due to >@:5.<IDFWRUVDUHFHQWUDOSOD\HUVRISODQWSK\- the expression of this strawberry gene under normal siology and orchestrate the defense transcriptome physiological conditions. This constitutes a pre- IRUHI¿FLHQWDFWLYDWLRQRIWKHSODQWGHIHQVHUHVSRQVH vious and neccesary step for further comparisons against a range of biotic and abiotic stresses [3]. of these lines, that exhibit enhanced resistance and In strawberry, Fa WRKY1 gene is modulated du- 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 161 susceptibility, in response to pathogen infection or References hormone treatment. [1] Jones JDG and Dangl JL. The plant immune 7KHLGHQWL¿FDWLRQRIWKHSURWHLQVVKRZLQJVLJ- system. Nature 2006; 444: 323–329. QL¿FDQWGLIIHUHQFHVEHWZHHQWKHFAWRKY1 overex- [2] Encinas-Villarejo S, Maldonado AM, Amil- pressing lines and their controls (mutant and wild Ruiz F, Berta De Los Santos F, Romero F, type plants) will give us some clues on the signa- Pliego-Alfaro F, et al. Evidence for a positive lling networks in which these two factors might be regulatory role of strawberry (Fragaria x involved, in addition to defense-related signaling. ananassa )D:5.<DQG$UDELGRSVLV$W :5.<SURWHLQVLQUHVLVWDQFH-([S%RWDQ\ 2009; 60: 3043-65. $FNQRZOHGJHPHQWV >@ (XOJHP76RPVVLFK,(1HWZRUNVRI:5.< This work was supported by grants PROFIT transcription factors in defence signaling. 010000-2001-100, 2002-81, 2003-32 and 2004-2 Current Opinion in Plant Biology 2007;10: from MCYT, Proyecto de Excelencia P07-AGR- 366-371. 02482 and grants to Grupo CVI278 from Junta de [4] Jorrín J, Maldonado AM and Castillejo MA. Andalucía, Spain. Alba Ruíz-Ramos y Francisco Plant proteome analysis: a 2006 update. Proteo- Amil-Ruíz thank the Junta de Andalucía, Spain for mics 2007; 7: 2947–2962. their predoctoral grants. 162 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 El estudio comparativo, proteómico y transcriptómico, de la respuesta a azúcares en Arabidosis thaliana PXHVWUDXQDUHODFLyQHQWUHHOPHWDEROLVPR\HOGHVDUUROORÀRUDO Marina Ribeiro-Pedro, Fatima Ezzahra Said, María Teresa Ruiz, José María Romero, Federico Valverde Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis. CSIC-Universidad de Sevilla. Av. Américo Vespucio, 49. 41092 Sevilla, Spain El desarrollo vegetal está bajo el control de reguladora y moduladora de los azúcares es co- complejos programas genéticos que permiten gene- nocida desde hace tiempo. Sin embargo, se sabe rar múltiples respuestas a cambios ambientales. La poco sobre su mecanismo molecular, es decir, qué transcriptómica y la proteómica han surgido como factores de transcripción y proteínas reguladoras potentes herramientas para profundizar en el cono- intervienen en esta respuesta. Para responder a esta cimiento de los mecanismos regulatorios que los incógnita hemos diseñado y optimizado un protoco- controlan. En particular, la proteómica vegetal, es ORGHSURWHyPLFDQXFOHDUTXHQRVSHUPLWDLGHQWL¿FDU un campo de investigación emergente ya que, al proteínas implicadas en la respuesta a azúcares. Más LGHQWL¿FDU\FXDQWL¿FDUODVSURWHtQDVSUHVHQWHVHQ recientemente, y con objeto de profundizar en el determinadas condiciones, proporciona información conocimiento de dicho mecanismo, hemos iniciado funcional sobre los mecanismos moleculares bási- un acercamiento transcriptómico mediante la uti- cos. En nuestro laboratorio estudiamos los cambios lización de microarrays y estudios más detallados que ocurren en el proteoma nuclear de A. thaliana en GHORVWUDQVFULWRVTXHFRGL¿FDQSURWHtQDVSRWHQFLDO- UHVSXHVWDDOVXPLQLVWURGHD]~FDUHV+HPRVLGHQWL¿- mente implicadas en la regulación por azúcares. De cados varias proteínas posiblemente implicadas en la comparación de ambas aproximaciones podremos esta señalización incluidos factores de transcripción, sacar datos que ayuden a comprender la respuesta a como FRIGIDA, y otras proteínas señalizadoras. azúcares. Las complejas interacciones moleculares que Proteómica. (QQXHVWURSURWRFRORSXUL¿FDPRV subyacen los procesos de desarrollo vegetal pueden núcleos de A. thaliana var. Col-0 cultivadas en me- abordarse en la actualidad mediante un conjunto dio MS (control) y medio MS suplementado con 3% YDULDGRGHWpFQLFDVPDVLYDVTXHSHUPLWHQLGHQWL¿FDU (p/v) de sacarosa, extrayendo las proteínas nucleares las moléculas biológicamente más relevantes [1]. con sulfato de amónio/deoxicolato en condiciones Entre ellas, la transcriptómica permite el análisis nativas. Luego se eliminan los contaminantes por global de la expresión del genoma en determinadas ¿OWUDFLyQHQJHOHQXQDFROXPQDGH6HSKDGH[\VH FRQGLFLRQHV¿VLROyJLFDVPLHQWUDVTXHODSURWHy- enriquecen las muestras en potenciales factores de PLFDSHUPLWHLGHQWL¿FDU\FXDQWL¿FDUODVSURWHtQDV WUDQVFULSFLyQPHGLDQWHFURPDWRJUDItDGHD¿QLGDG involucradas [1, 2]. Dado que, por una parte, son las en una matriz de heparín-sulfato. En condiciones proteínas los componentes directos de las cascadas desnaturalizantes se extraen las proteínas con fenol de señalización y rutas bioquímicas, y que no existe y luego se precipitan con una mezcla de acetato de correspondencia directa entre gen-proteína, la pro- DPRQLR\PHWDQRO(QORVSDVRVFURPDWRJUi¿FRVVH teómica vegetal emerge como la mejor herramienta HPSOHyHOVLVWHPDb.7$)3/&/DVIUDFFLRQHV SDUDUHÀHMDUODFRPSOHMLGDG\GLQDPLVPRGHORV proteicas se sometieron a una electroforesis bidi- sistemas vegetales. mensional: isoelectroenfoque en strip5HDG\6WULS IPG y separación en SDS-PAGE en geles Criterion Las plantas son organismos sésiles y responden XT Bis-Tris (Bio-Rad). Los geles fueron teñidos DFDPELRVGHODPELHQWHPRGL¿FDQGRVXVFDUDFWH- con SYPRO Ruby, nitrato de plata o Coomassie UtVWLFDV¿VLFRTXtPLFDV>@(QQXHVWURODERUDWRULR coloidal. Las proteínas de interés fueron analizadas estamos interesados en estudiar los cambios a nivel mediante espectrometría de masas MALDI-TOF e molecular que ocurren en el núcleo de A. thaliana LGHQWL¿FDGDVFRQHOSURJUDPD0$6&273DUDORV en respuesta al suministro de azúcares. La función 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 163 análisis de Western blot se utilizaron anticuerpos es- SHFt¿FRVJHQHUDGRVHQHOODERUDWRULRRDQWLFXHUSRV control de casas comerciales. Transcriptómica. 3DUDHODQiOLVLVGHORVSHU¿OHV de expresión en presencia de azúcares se extrajo RNA total de plántulas de A.thaliana var. Col-0 cul- tivadas en medio MS o MS con sacarosa mediante Figura 1. Comparación funcional, entre transcriptómica y pro- HOPpWRGRGHO7UL]RO\VHSXUL¿FDURQHQFROXPQDV teómica, de la respuesta a sacarosa. $ &ODVL¿FDFLyQIXQFLRQDO “RNeasy” (Qiagen). Se hibridaron 3 muestras bio- de los genes cuya expresión se altera (represión FDR<-2 ó lógicas de cada condición experimental en “Gene- LQGXFFLyQ)'5! HQSUHVHQFLDGHVDFDURVD% &ODVL¿FDFLyQ Chips” de Affymetrix (Unidad de Genómica, CNB) funcional de las proteínas cuya producción (incremento ó disminuición) se altera en presencia de sacarosa. y los datos se analizaron mediante LiMMA con el software FIESTA (http://bioinfogp.cnb.csic.es). Los Una vez desarrollado y utilizado el protocolo de resultados fueron posteriormente analizados con forma rutinaria, hemos iniciado la optimización de los programas disponibles en red en el “Bio-array los pasos más críticos. Asimismo, hemos comparado Resource” (http://bar.utoronto.ca). En función de varios métodos de extracción de proteínas nucleares, los resultados obtenidos se procedió al análisis, me- entre ellos la extracción en presencia de 6M gua- diante QPCR, de los genes de interés. nidina, en condiciones de alta sal y con fenol. Los Tabla 1. ,GHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDVLGHQWL¿FDGDVHQHVWHHVWXGLR ATG Category Protein Description number Regulation of timing of transition from vegetative to FRI at4g00650 reproductive phase CPC Transcription factor activity at2g46410 ATMYB3R4 Transcription factor at5g11510 GLP3 Response to cold at5g20630 TF2 MyB-like transcription factor at1g05055 Signalling, gene ARAC7 GTP-binding protein implicated in signal transduction at4g28950 regulation T3F24.4 F-Box related protein at1g47350 F5F19.6 Signalling at1g52000 JR1 Signalling at3g16470 T204.11 Signalling at3g16450 3XWDWLYH5,1*]LQF¿QJHUSURWHLQ Signalling at3g53410 ESM1 Sugar related protein at3g14210 TGG1 Sugar related protein at5g26000 Carbon metabolism TGG2 Sugar-related protein at5g25980 PYK10 Hydrolase activity, hydrolyzing O-glycosyl compounds at3g09260 RNA and DNA me- SAD1 mRNA splicing, export, and degradation. at5g48870 tabolism MSH2 Damaged DNA reparation at3g18524 Cell cycle TPLATE Cytokinesis protein targeted to the cell plate at3g01780 Folding PBP1 Protein folding at3g16420 RNA-binding Unknown at3g24255 Unknown JAL22 Unknown at2g39310 resultados obtenidos demuestran que se obtiene una tinción con coomassie coloidal nos ha proporcionado PD\RUH¿FLHQFLDPHGLDQWHODH[WUDFFLyQFRQJXDQL- la mejor resolución y compatibilidad con los análisis dina que con los otros métodos por separado, mien- de espectrometría de masas. Del total de proteínas tras que la utilización secuencial de ambos (alta sal LGHQWL¿FDGDVKDVWDHOPRPHQWRKHPRVDQDOL]DGRODV y fenolización) es comparable a la extracción con el que presentaban expresión diferencial en presencia caotropo. A titulo de comparación hemos aplicado o ausencia de sacarosa y se muestran en la Tabla 1 varios métodos de tinción de geles, entre los que la en base a su función. Se observa que el grupo más 164 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 representado corresponde a proteínas implicadas en mecanismos de señalización y regulación de la expresión génica, como es el caso de FRIGIDA cuya expresión parece aumentar en presencia de sacarosa. Una situación similar puede comprobarse a nivel GHOSHU¿OGHH[SUHVLyQ )LJXUDE 6LQHPEDUJR\ en el caso particular de FRIGIDA, no parece existir una relación directa entre gen-proteína ya que, en presencia de sacarosa, una mayor producción de Figura 2. Estudio de los niveles de expresión de FRIGIDA SURWHtQD )LJXUDE QRSDUHFHUHÀHMDUVHDQLYHOGHO y detección de la proteína en plántulas de A. thaliana, en correspondiente transcrito (Figura 2a). Mediante el respuesta a sacarosa. A) Análisis, por QPCR, de los nive- uso combinado de estas herramientas (Proteómica les de transcripto de FRIGIDA en plántulas (Wt col y Sf2 y Transcriptómica) hemos mostrado que podemos col) crecidas en medio MS y medio MS suplementado con aumentar la comprensión de los mecanismos bioló- 3% de sacarosa. B) Análisis, mediante Western blot, de la gicos, ya que permite la integración y la intersección presencia de FRIGIDA en extractos nucleares y citosóli- de la información transcripcional, traduccional y cos de plántulas Wt col y Sf2 col crecidas en las mismas condiciones de ensayo. Cabe mencionar que FRIGIDA se post-traduccional. detecta exclusivamente en las fracciones nucleares (banda de 57 Kda aprox.) y que en presencia de sacarosa parece aumentar su producción. La banda de 20 Kda corresponde a la Histona H3, utilizada como control de la integridad y pureza de las fracciones. Referencias [2] Chen S y Harmon AC. Advances in plant pro- teomics. Proteomics 2006; 6:5504-5516. [1] Hochholdinger F, Sauer M, Dembinsky D, Hoec- ker N, Muthreich N, Saleem M, Liu Y.Proteomic [3] Casal, JJ. Fankhauser C, Coupland G, Blázquez dissection of plant development. Proteomics MA. Signalling for developmental plasticity. 2006; 6:4076-4083. Trends in Plant Science 2004; 9 (6):309-314. $',*(SURWHRPLFDQDO\VLVRIZKHDWÀDJOHDIWUHDWHGZLWK7(55$625% foliar, a free amino acid-based biostimulator María José Martinez-Esteso1, Mayte Vilella-Antón1, Susana Sellés-Marchart2, Anna Botta-Català3, Rafael Piñol-Dastis3, Roque Bru-Martinez1 1Grupo de Proteómica y Genómica Funcional de Plantas. Dpto. Agroquímica y Bioquímica, IMEM Ramon Margalef, Universidad de Alicante; 2Unidad de Genómica y Proteómica, SSTTI, Universidad de Alicante; 3Departamento I+D Fisiología Vegetal, BIOIBERICA, S.A. Abstract In this work, we have undertaken a proteomic ÀDJOHDIVWDJH3URWHLQVLGHQWL¿HGXSDQGGRZQUHJXOD- approach using DIGE in order to explore molecular ted suggest an improvement of wheat productivity by a mechanisms potentially involved in the biostimula- combination of an enhanced CO2¿[DWLRQDPRUHDFWLYH ting effect of Terra-Sorb® foliar on wheat applied at protein synthesis and a decrease of oxidative stress. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 165 Table 1. 3URWHLQVGHUHJXODWHGLQZKHDWÀDJOHDIWUHDWHGZLWK7HUUD6RUE)ROLDU1RUPDOLVHGVSRWVYROXPHVIRU&21752/ and TREATED samples. Protein Information Norm. Vol. Ref. Protein Description Accession No. CONTROL Terra-Sorb Spot 73 EF-Tu Chl-1 translational elongation factor Tu 125540125 1 1,412 10 EF-Tu Chl-2 translational elongation factor Tu 125540125 1 1,371 14 EF-Tu Chl-3 translational elongation factor Tu 125540125 1 1,301 RuBisCO large subunit-binding protein 18 RUBISCO LBP-B-1 2493650 1 1,256 subunit beta, chloroplast RuBisCO large subunit-binding protein 122 RUBISCO LBP-B-2 2493650 1 1,231 subunit beta, chloroplast RuBisCO large subunit-binding protein 30 RUBISCO LBP-B-3 2493650 1 1,176 subunit beta, chloroplast RuBisCO large subunit-binding protein subunit 8 RUBISCO LBP-A-1 134102 1 1,4 alpha, chloroplast precursor RuBisCO large subunit-binding protein subunit 12 RUBISCO LBP-A-2 134102 1 1,328 alpha, chloroplast precursor RuBisCO large subunit-binding protein subunit 11 RUBISCO LBP-A-3 134102 1 1,284 alpha, chloroplast precursor RUBISCO-L RuBisCO large subunit. Ribulose bisphosphate 56 548677 1 1,825 (fragmento?)-1 carboxylase large chain, N-terminal domain. RUBISCO-L RuBisCO large subunit. Ribulose bisphosphate 62 548677 1 1,611 (fragmento?)-2 carboxylase large chain, N-terminal domain. 5 RUBISCO A-1 RuBisCO activase A chloroplast precursor 12643756 1 1,43 9 RUBISCO A-2 RuBisCO activase A chloroplast precursor 12643756 1 1,413 89 RUBISCO A-3 RuBisCO activase A chloroplast precursor 12643756 1 1,274 RUBISCO A-A 170 RuBisCO activase A chloroplast precursor 12643756 1 1,184 (Precursor?) 40 PRK-1 Phosphoribulokinase, chloroplast precursor 125580 1 1,087 46 PRK-2 Phosphoribulokinase, chloroplast precursor 125580 1 1,037 71 HSP90 Heat schock protein 90kDa 556673 1 1,47 Elongation factor G, chloroplast precursor 33 EF-G Chl 125549171 1 1,113 (EF-G) Elongation factor G, chloroplast precursor 36 EF-G Chl 125549171 1 1,108 (EF-G) 32 PGM phosphoglycerate mutase 32400802 1 -1,264 34 GA3PDH glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 15222111 1 -1,27 29 ATP-CF1-A ATP synthase CF1 alpha subunit 14017569 1 -1,273 putative Elongation factor G, chloroplast 22 pEF-G Chl 125549171 1 -1,289 precursor (EF-G). Fragmento? 131 Cu/Zn SOD Cu/Zn superoxide dismutase 1568639 1 -1,34 13 Cu/Zn SOD Cu/Zn superoxide dismutase 1568639 1 -1,476 166 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Communication DVOLJKWGHFUHDVHRIWKHWKUHH¿UVWSURWHLQVFRQVLVWHQW with a decrease in consumption of the product of Proteomics has been shown as successful appro- photosynthesis 3-phosphoglycerate for catabolism, ach to analyze the response of plants to external thus this product might be accumulated in a reservoir VWLPXOXV>@:HSHUIRUPHGDSURWHRPLFDSSURDFK as a sugar. The decrease of a superoxide dismutase in order to study the effects of Terra-Sorb ® foliar VSHFL¿FIRUVFDYHQJLQJRIWKHVXSHUR[LGHJHQHUDWHG RQZKHDWOHDYHVDWWKHÀDJOHDIVWDJH %%&+ by photooxidation of O2 in PS-I (Cu/Zn SOD) is 7HUUD6RUEIROLDUD/ĮDPLQRDFLGEDVHGSUR- consistent with a lower oxidative stress state. duct from enzymatic hydrolysis with a high ratio of free-to-total amino acids, was applied two and three According to results, the three major molecular days following foliar by spraying treatment. Flag effects found of spraying wheat with Terra-Sorb ® leaf samples were taken from independent control IROLDURQWKHÀDJOHDISURWHRPHVXSSRUWWKHSK\VLR- (C) and treated plots (T). logical effects described upon treatment of other crops with Terra-Sorb ® foliar foliar such as increa- A quantitative DIGE approach was used to com- se of plant photosynthetic activity and chlorophyll pare the proteomes of T vs C plants in four biological content, promotion of rapid recovery from stress and replicates. After SameSpots v3.0 gel analysis, 37 de- improvement of nutrient absorption [2]. regulated spots were selected out of 918 detected, with an ANOVA p<0.05. As shown in table 1, 26 protein spots encoded by 12 different genes were successfu- OO\LGHQWL¿HGE\Q/&0606LQD;&7SOXV,7PDVV spectrometer (Agilent) (SpectrumMill Proteomics :RUNEHQFKDVVHDUFKHQJLQH 1&%,QUDVGDWDEDVH )RXUVSRWVLGHQWL¿HGDV58%,6&2DFWLYDVH$ chloroplast precursor (RBA) were up-regulated by treatment with Terra-Sorb ® foliar. This enzyme produces ATP-dependent conformational changes in RUBISCO, making the inactivated enzyme to re-en- ter the catalytic cycle. Phosphoribulokinase has been detected with a slight increase in abundance, which Figure 1. 2D reference gel image showing the location of LVFRQVLVWHQWZLWKDQHQKDQFHPHQWRIFDUERQ¿[DWLRQ selected spots down- regulated (upwards arrowhead) and In addition, RUBISCO large subunit-binding protein up-regulated. subunits alpha and beta (RUBISCO LBP A and B), that assists RUBISCO folding, have been found up- regulated in treated leaves. These results together $FNQRZOHGJHPHQWV suggest that Terra-Sorb ® foliar promotes RUBISCO The technical support and helpful discussions of DFWLYLW\DQGWKXVHQKDQFHGFDUERQ¿[DWLRQ Ramón Sánchez Pérez and Cándido Marín Garrido 7KUHHXSUHJXODWHGVSRWVLGHQWL¿HGDVFKORURSODVW are very acknowledged. The DIGE and protein iden- elongation factors Tu (EF-Tu Chl), G (EF-G Chl) and WL¿FDWLRQDQDO\VLVZHUHFDUULHGRXWDW6HUYLFLRGH heat shock protein 90 (HSP-90) indicate a potentially Proteómica de la Universidad de Alicante, a PRO- enhanced protein synthesis and folding to produce TEORED member (www.proteored.org). This work functional proteins upon Terra-Sorb ® foliar treatment. was supported by Bioibérica, S.A. Plants invest an important amount of the photosyn- thetic energy in biosynthesis of amino acids, thus the References application of exogenous amino acids via foliar may give rise to an enhancement of protein synthesis. [1] Martínez-Esteso MJ, Sellés-Marchart S, Vera- Urbina JC, Pedreño MA, Bru-Martinez R. J. Among those down-regulated spots four pro- Proteomics 2009 ;73 (2): 331-341. WHLQVKDYHEHHQLGHQWL¿HG FKORURSODVW$73DVHDOSKD subunit, phosphoglyceromutase (PGM), glyceralde- >@ *RUGRQ/.'DQLHO3.7KRPDV/:3ODQW hyde-3-phosphate dehydrogenase (GA3PDH) and Growth Regulation Society of America 2005; Cu/Zn superoxide dismutase (Cu/Zn SOD). There is 33 (4): 134-141. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 167 High-throughput biological and functional analisys of interactions among tetras- panin associated proteins in T Limphocytes using second generation proteomics techniques Daniel Pérez-Hernández1&2, Elena Bonzón-Kulichenko1, Pablo Martínez-Acedo1, Pedro J. Navarro1, Estefanía Núñez1, Marco Trevisan-Herraz1, María Yáñez-Mo2, Mónica Sala-Valdés2, Mª Ángeles Ursa2, Francisco Sánchez-Madrid2, JesúsVázquez1 1Laboratorio de Química de Proteínas y Proteómica, CBMSO. 2Hospital Universitario La Princesa y Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares CNIC The tetraspanin superfamily of transmembrane pate in antigen presentation. Furthermore, they par- proteins is clustered in compact structural groups ticipate as viral correceptors in certain situations and forming specialized membrane microdomains (Tet- are involved viral growth in infected cells [1]. raspanin Enriched Microdomains, TEM or TERM). Through heterolog and homolog interactions, tet- In spite of the growing interest for these proteins, raspanins regulate signalling processes mediated by the cytosolic interactions by which tetraspanins are cellular adhesion molecules, growth factor receptors involved in various receptor activation pathways, their and costimulatory proteins. The presence in TERMs cytoskeleton anchorage and in general the protein of Major Histocompatibility Complex (MHC) I and ligands that interact with these proteins are poorly II molecules also suggest that tetraspanins partici- known. In this work we have made a systematic analy- Figure 1. Systems Biology analysis of the proteins that interact with the peptide baits belonging to CD81, ICAM-1 and EWI-2. Proteins with the same molecular or biological function are clustered. The same colour belongs to the same bait or the same combination of the three peptide baits. Links between proteins are previously validated by IPA. 168 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 sis of interacting partners of different proteins that are or IPA) (Figure 1). Interacting proteins from diffe- presented in TERMs [2]. This was accomplished by rent baits were found to share biological functiona- “pull-down” techniques and high-throughput protein lity, and the groups of interactions showed a strong LGHQWL¿FDWLRQRIWKHFDSWXUHGOLJDQGVE\PDVVVSHF- functional and biological relationship among them. trometry. For this end, synthetic biotinylated peptides This information suggests that proteins which link spanning the C-terminal cytoplasmic end of these pro- the citosolic domains of tetraspanins form a cohe- teins were incubated with extracts from lymphoblast rent network of interactions with their functional cell models, and then captured using Streptavidin-sep- role between T lymphocytes and vascular endothe- harose microbeads. Proteins interacting with the pep- lium in the processes of diapedesis. tide baits were subjected to digestion and the resulting peptides systematically analyzed by HPLC-linear ion trap MS/MS mass spectrometry. Proteins from more References WKDQSXOOGRZQDQDO\VLVFODVVL¿HGLQ GLIIHUHQW [1] Hemler ME. Tetraspanin functions and asso- H[SHULPHQWVZHUHDXWRPDWLFDOO\LGHQWL¿HGIURPWKH ciated microdomains. Nat Rev Mol Cell Biol. 0606VSHFWUDLQDKXPDQGDWDEDVH:HLGHQWL¿HG 2005;6:801-11. PRUHWKDQKXPDQSURWHLQV¿OWHULQJZLWKS5DWLR software developed by our group with an error rate of [2] Barreiro O, Yáñez-Mó M, Sala-Valdés M, Sán- chez-Madrid F. Endothelial tetraspanin microdo- SURWHLQLGHQWL¿FDWLRQQHYHUVXSHULRUWR>@ PDLQVUHJXODWHOHXNRF\WH¿UPDGKHVLRQGXULQJ :HGHYHORSHGDUREXVWVWDWLVWLFDOFULWHULRQEDVHG extravasation. Blood. 2005; 105:2852-61. RQWKHQXPEHURISHSWLGHVRIHDFKSURWHLQLGHQWL¿HG [3] Martínez de Bartolomé S., Navarro P., Martín- in all the partners in the same pull down experi- Maroto F., Vazquez J., López-Ferrer D., Ramos- PHQW S :HDOVRFRQ¿UPHGWKHLQWHUDFWLRQV Fernández A.,et al. Properties of Average Score EHWZHHQWKHLGHQWL¿HGSURWHLQVDQGWKHEDLWVFRQ- Distributions of SEQUEST The Probability sidering the reproducibility in all the experiments. 5DWLR0HWKRG0ROHFXODU &HOOXODU3URWHRPLFV 0RUHWKDQVSHFL¿FLQWHUDFWLRQVZHUHGLIIHUHQ- 2008; 7:1135-1145. tially clustered revealing strong relationships among [4] Navarro P, Vázquez J. $UH¿QHGPHWKRGWRFDO- groups of peptide baits. FXODWHIDOVHGLVFRYHU\UDWHVIRUSHSWLGHLGHQWL¿- The validated proteins have been analyzed using cation using decoy databases. J Proteome Res. System Biology tools (Ingenuity Pathways Analysis 2009;8:1792-6. Use of ProteoMiner in Veterinary Research Anna Marco, Gemma Rovira, Anna Bassols Departament de Bioquímica i Biologia Molecular. Facultat de Veterinària. Universitat Autònoma de Barce- lona. 08193 Cerdanyola del Vallès One of the main applications of serum proteo- :KHQORRNLQJIRUELRPDUNHUVVHUXPLVSRWHQ- PLFVLVWKHLGHQWL¿FDWLRQRIQHZELRPDUNHUVIRU tially the most valuable biological sample, because animal disease or animal production. However, po- it contains thousands of different proteins and pepti- tential obstacles to these studies are the poor perfor- des and it is the most easily accessible, noninvasive, PDQFHRIDI¿QLW\VHUXPGHSOHWLRQPHWKRGVEDVHG and widely collected sample [1]. Unfortunately, its on human antigens when using animal samples. In content is dominated by a handful of high-abundant WKHSUHVHQWVWXG\ZHKDYHDQDO\]HGWKHHI¿FLHQF\ proteins, with their estimated concentration excee- and reproducibility of the ProteoMiner® beads with ding the low-abundant proteins highly by 10 orders bovine and porcine serum samples. of magnitude [2]. This large dynamic range exceeds 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 169 the analytical capabilities of traditional proteomic Stendstedt protocol [5]. Gels were scanned with the methods, making the detection of lower abundance Image Scanner III (GE Healthcare). serum proteins extremely challenging. In particular, most potential biomarkers are among those low- After treatment with the ProteoMiner system, a abundance proteins, secreted into the bloodstream substantial enrichment of the low-abundance pro- by tissues or cells because of the disease process. teins was achieved and new spots were detected, whereas albumin and the light and heavy chains of To detect these low-abundance proteins using immunoglobulins were less represented (Figure 1). currently available technologies, it is advisable to 7KHVHUHDJHQWVDUHEDVHGRQWKHDI¿QLW\ELQGLQJRI UHPRYHWKHPRVWDEXQGDQWSURWHLQV¿UVW0DQ\VWUD- all kind of proteins and thus they intend to capture tegies have been developed for the removal of al- and amplify the low-abundance proteome. bumin and other high-abundance proteins; however WKH\KDYHDKLJKVSHFL¿FLW\IRUKXPDQRUODERUDWRU\ animal proteins [3]. Recently, a new method for capturing low-abundance proteins has been com- mercially available, which is known under the trade name of ProteoMiner® and it is based on the use of a combinatorial peptide binding library, which DI¿QLW\FDSWXUHVDQGDPSOL¿HVWKHORZDEXQGDQFH proteome [4]. Proteomics constitutes an interesting approach to veterinary medicine and animal production. In Figure 1. Two-dimensional electrophoresis of bovine and this sense, porcine and bovine livestock are the porcine serum after treatment with the ProteoMiner beads: a) control, non-depleted serum; b) bound fraction (“enri- most interesting species due to their economical ched” serum). interest. Surprisingly, there are very few applica- tions of serum proteomics to veterinary science. Reproducibility is necessary for accurate downs- The ProteoMiner technology, since it is not based tream analysis. To assess this characteristic in the on an immunological approach, should be species 3URWHR0LQHUV\VWHP¿YHWHFKQLFDOVHUXPUHSOLFD- independent, and thus of potential application to tes from cow and pig were prepared from aliquots samples of veterinary interest. of the same sample and run on a one dimensional SRO\DFU\ODPLGHJHOXVLQJȝJSURWHLQSHU The objective of the present work was to analyze lane. Gels were stained with silver and scanned WKHHI¿FLHQF\DQGUHSURGXFLELOLW\RIWKH3URWHR0LQHU as described above. Densitometry was performed system with bovine and porcine serum samples. ZLWKWKH0XOWL*DXJHVRIWZDUH )XML¿OP $VVHHQ Blood was collected from the coccygeal vein in in Figure 2, the ProteoMiner system presents good Holstein cows and from the cava vein in Duroc x reproducibility. /DQGUDFH[/DUJH:KLWH SLJVLQDYDFXWDLQHUWXEH with no added chemicals. Serum samples were trea- ted with the ProteoMiner beads (Bio-Rad, Hercules, CA, USA); a relationship 1:10 (mg protein:µl resin) was used to optimize the yield of the procedure. First dimension was performed on pH 3-10, 24 cm Immo- biline DryStrips (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) under reducing and denaturing conditions. Then, Figure 2. Reproducibility analysis of the enriched low- strips were reduced and alkilated with equilibration abundance proteome achieved with the ProteoMiner beads buffer (50mM Tris-HCl pH 8.8, 6M urea, 30% (v/v) on bovine and porcine samples. Densitometry of the bound glycerol, 2% (w/v) SDS and bromophenol blue) and fraction (“enriched” serum) obtained from one-dimensional 1% (w/v) DTT or 2.5% (w/v) IAA, respectively. The SDS-PAGE gels is shown. second dimension was performed with home-made These results clearly demonstrate that the Pro- 12% polyacrylamide gels. Protein staining was per- teoMiner system is useful for bovine and porcine formed with silver, following the Berkelman and VHUXPVDPSOHV:KLOHWKLVLVQRWDGHSOHWLRQPHWKRG 170 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 to remove high abundance proteins, like others used sional separation coupled with mass spectrome- IRUKXPDQELRPDUNHULGHQWL¿FDWLRQWKH3URWHR0LQHU try. Mol. Cell. Proteomics 2002; 1, 947-955. treatment will decrease the amount of these high- [2] Anderson NL and Anderson NG. The human abundance proteins. This kind of strategies should plasma proteome: history, character, and diag- widen the number of applications in serum animal nostic prospects. Mol. Cell. Proteomics 2002; proteomics. 1, 845-867. This work was funded by grant AGL2006- [3] Echan LA, Tang HY, Ali-Khan N, Lee K and 02364/GAN from the Spanish “Ministerio de Edu- 6SHLFKHU':'HSOHWLRQRIPXOWLSOHKLJK FDFLyQ\&LHQFLD´3DUWRIWKHIXQGLQJZDV¿QDQFHG DEXQGDQFHSURWHLQVLPSURYHVSURWHLQSUR¿OLQJ by the FEDER program from the European Union. capacities of human serum and plasma. Proteo- :HWKDQN0V$QQD9LODOWDIRUKHUH[FHOOHQWWHFKQL- mics 2005; 5, 3292-3303. cal assistance. [4] Boschetti E and Righetti PG. The ProteoMiner in the proteomic arena: A non-depleting tool for discovering low-abundance species. J. Proteo- References mics 2008; 71, 255-264. [1] Adkins JN, Varnum SM, Auberry KJ, Moore RJ, [5] Berkelman T and Stenstedt T. 2-D Electro- Angell NH, Smith RD et al. Toward a human phoresis. Principles and methods. Amersham blood serum proteome: analysis by multidimen- Biosciences, Uppsala, Sweden. 1998. La Proteómica como vía para determinar el origen animal de los productos cárnicos Miguel Ángel Sentandreu1, Paul D. Fraser2, Enrique Sentandreu1, Leticia Mora1, Peter M. Bramley2 1 Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC), P.O. Box 73, 46100 Burjassot, Valencia. España. 2 Center for Systems and Synthetic Biology, School of Biological Sciences, Royal Holloway, 8QLYHUVLW\RI/RQGRQ(JKDP7:(;5HLQR8QLGR Resumen interesante a los métodos que se están empleando actualmente para el control del origen animal de En el presente trabajo se describe el desarrollo los productos cárnicos. de un método para detectar la presencia de carne de pollo en mezclas de carne haciendo uso de la tecnología proteómica. Es un método simple y Texto principal robusto que incluye una etapa de extracción de proteínas musculares, enriquecimiento de la pro- Los principales casos de adulteración en produc- teína diana mediante isoelectroenfoque, digestión tos cárnicos se relacionan con la sustitución de carne con tripsina de la misma y análisis de un péptido de elevada calidad por carne de un menor coste con ELRPDUFDGRUHVSHFt¿FRVGHODHVSHFLHDYLDUPH- REMHWRGHSRGHUREWHQHUXQEHQH¿FLRHFRQyPLFR diante LC-ESI-MS/MS. Esta metodología ha per- adicional. Para poder controlar el fraude que supo- mitido detectar la presencia de un 0,5 % de carne ne esta forma de proceder es necesario disponer de de pollo contaminando carne de cerdo. Además métodos de análisis robustos, sensibles y precisos. de su sencillez, el método presenta la ventaja de De entre las tecnologías más empleadas hasta el poder aplicarse indistintamente al análisis de carne momento para este propósito hay que destacar los fresca y cocinada, representando una alternativa inmunoensayos y los análisis de ADN. A pesar del 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 171 gran avance que ha supuesto la introducción y el en este extracto mediante LC-ESI-MS/MS (Thermo desarrollo de estas técnicas, existen importantes (OHFWUyQ&RUS /DLGHQWL¿FDFLyQGHSpSWLGRVVH limitaciones cuando éstas se aplican al análisis de realizó a partir de los espectros MS/MS empleando productos cárnicos procesados ya que las agresivas MASCOT como algoritmo y la base de datos de condiciones empleadas durante el procesado de la SURWHtQDV1&%,QU/DFXDQWL¿FDFLyQGHOSpSWLGR FDUQHSXHGHQLQÀXLUQHJDWLYDPHQWHHQHOUHFRQRFL- seleccionado como biomarcador de la especie aviar miento de las proteínas diana o del ADN [1]. Los en distintas mezclas de carne conteniendo diferentes recientes avances en las técnicas de espectrome- porcentajes de carne de pollo se realizó mediante tría de masas aplicadas al campo de la proteómica la adición de 5 picomoles del péptido seleccionado constituyen una alternativa interesante a través de la marcado con isótopos estables 13C6/15N (Técnica LGHQWL¿FDFLyQGHSpSWLGRVELRPDUFDGRUHVHVSHFt¿FRV $48$ /DLQWHJUDFLyQGHORVSLFRVFURPDWRJUi¿- de cada especie animal. En el presente trabajo se ha cos correspondientes tanto al péptido nativo como al VHOHFFLRQDGRXQSpSWLGRELRPDUFDGRUHVSHFt¿FRGH péptido pesado se realizó manualmente. La cantidad la especie aviar para poder detectar esta carne en de péptido nativo en cada muestra se determinó por cualquier tipo de mezcla de carne tanto fresca como comparación de las áreas de cada pico. cocinada. Para ello, un gramo de distintas mezclas de carne de pollo se homogeneizaron con 10 mL de El método que se ha desarrollado en el presente tampón Tris, pH 8,0, centrifugándose a continuación trabajo se esquematiza en la Figura 1. Las proteínas durante 20 min a 10000 rpm. Se recogió el precipita- de los distintos extractos de carne se fraccionaron do obtenido y se solubilizó en el tampón Tris pH 8.0 mediante isoelectroenfoque en medio líquido. En conteniendo 6M de urea y 1 M de thiourea. Se tomo OD)LJXUDVHSXHGHREVHUYDUHOSHU¿OGHSURWHt- el volumen necesario de este extracto para fraccionar nas obtenido en SDS-PAGE para las fracciones 2,5 mg de proteínas totales por isoelectroenfoque en OFFGEL correspondientes a los valores de pH más el intervalo de pH 4-7 empleando un fraccionador ácidos. Como se puede apreciar, las fracciones 3 OFFGEL 3100 (Agilent). De la fracción donde se y 4 contienen una sola banda de proteína, corres- localizó la cadena ligera de mosina 3 se tomaron 20 pondiente a la cadena ligera de miosina 3 (MLC3). µL para realizar una digestión con tripsina. Después (VWRFRQ¿UPDHOXVRGHOLVRHOHFWURHQIRTXHHQPHGLR GHODGLJHVWLyQVHDMXVWyHOYROXPHQ¿QDOGHFDGD líquido como vía adecuada para el enriquecimiento muestra a 30 µL, analizando los péptidos contenidos de MLC3 como proteína diana para la posterior hidrólisis con tripsina y generación de péptidos po- Figura 2. SDS-PAGE al 12 % correspondiente a las nueve primeras fracciones obtenidas después de separar las pro- teínas de una mezcla de carne (1 % de pollo en carne de cerdo) con el fraccionador de proteínas en solución OFF- Figura 1. Resumen esquemático del método desarrollado GEL 3100 de Agilent. El isoelectroenfoque se realizó en el para detectar cuantitativamente la presencia de la carne de intervalo de pH 4-7. Se indica la posición en el gel de la pollo en las distintas mezclas de carne. cadena ligera de miosina 3 (MLC3). 172 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 tenciales biomarcadores de cada especie animal. El estables (+7 Da) al extracto enriquecido en MLC3 presente trabajo se ha centrado en la selección de después del fraccionamiento en OFFGEL (Figura un péptido biomarcador para detectar la presencia 1). De este modo se obtuvo una buena correlación de pollo en mezclas de carne. Como criterios de lineal (R2 = 0,9921) entre el porcentaje de carne de selección se tuvo en cuenta que el péptido elegido pollo añadido a la mezcla y la cantidad del péptido IXHUDHVSHFt¿FRGHODHVSHFLHDYLDUDVtFRPRTXH biomarcador seleccionado, determinada por LC- su detección fuera posible aun en aquellos casos ESI-MS/MS. El método desarrollado en el presente en los que la carne de pollo esté presente en bajas WUDEDMRHVSUHFLVR\VHQVLEOHDGHPiVGHVHU¿DEOHHQ cantidades en el producto. De este modo, se llevó el análisis de alimentos sometidos a un tratamiento a cabo el protocolo de trabajo de la Figura 1 em- térmico elevado. Los resultados obtenidos permiten pleando una mezcla de carne conteniendo un 1% D¿UPDUTXHODDSUR[LPDFLyQSURWHyPLFDSXHGHVHU de pollo en carne de cerdo. Después de realizar la una alternativa de interés a los métodos empleados hidrólisis con tripsina de las fracciones OFFGEL 3 actualmente para resolver el problema de la deter- y 4 (Figura 2), el análisis mediante LC-ESI-MS/MS minación de las especies cárnicas. GHORVSpSWLGRVJHQHUDGRVSHUPLWLyODLGHQWL¿FDFLyQ GHOSpSWLGRELRPDUFDGRUHVSHFt¿FRGHODHVSHFLH aviar 37ALGQNPTNAEINK49 procedente de MLC3. Referencias /DFXDQWL¿FDFLyQGHHVWHSpSWLGRHQPH]FODVGH >@ :RROIH03ULPURVH6)RRGIRUHQVLFV XVLQJ carne conteniendo distintos porcentajes de carne DNA technology to combat misdescription and de pollo (0, 0,5, 1, 2, 5 y 10 %) se realizó mediante fraud. Trends in Biotechnology 2004; 22 (5): la adición de su homólogo marcado con isótopos 222-6. Péptidos inhibidores de la Enzima Convertidora de Angiotensina I generados en la digestión in vitro de la carne de cerdo Elizabeth Escudero1, Miguel Angel Sentandreu1, Keizo Arihara2, Fidel Toldrá1 1Instituto de agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC). 2Faculty of Animal Science, School of Veterinary Medicine and Animal Sciences, Kitasato University Resumen Estudios recientes han demostrado el potencial de la carne de cerdo al generar péptidos biologica- El objetivo principal de este trabajo se ha cen- mente activos con capacidad para regular numero- trado en la generación de péptidos inhibidores de sos procesos en el organismo [1], lo que otorga a la la Enzima Convertidora de Angiotensina I (ECA) carne un valor añadido. En trabajos anteriores se han después de la digestión de carne de cerdo mediante descrito péptidos con acción antioxidante, antimi- la acción secuencial de pepsina y pancreatina, si- crobiana o antihipertensiva por ejemplo [2]. La ac- mulando las condiciones del sistema digestivo. El ción antihipertensiva ejercida por algunos péptidos hidrolizado fue analizado directamente mediante es debida a su capacidad para inhibir la actividad nanoLC-ESI-MS/MS, estudiando seguidamente las ECA. En el presente estudio, se ha investigado la secuencias obtenidas a partir de los espectros MS/ posibleactividad inhibidora de la ECA de los pépti- 06/RVUHVXOWDGRVREWHQLGRVSRQHQGHPDQL¿HVWR dos generados en la digestión de las proteinas del el potencial de las proteínas de la carne de cerdo músculo esquelético del cerdo por acción de las como fuente de péptidos antihipertensivos después enzimas gastrointestinales. El proceso de digestión de la digestión gastrointestinal. fue simulado in vitro usando pepsina y pancreatina 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 173 de manera secuencial. El hidrolizado obtenido fue Este pentapéptido mostró la mayor inhibición posteriormente analizado mediante nanoLC-ESI- de la actividad ECA con un valor de IC50 de 46.56 MS/MS utilizando un sistema Ultimate nano-LC µM. KAPVA contiene una alanina en posición C- acoplado a una fuente de iones nanoelectrospray y terminal. Éste amino ácido parece desempeñar un un espectrómetro de masas cuadrupolo-tiempo de papel importante en su unión con la ECA [4]. La vuelo (Q-TOF) QSTAR XL. Todos los espectros presencia de prolina en la antepenúltima posición MS/MS fueron interpretados utilizando los algorit- del extremo C-terminal también parece promover mos MASCOT y Paragon. De este modo se lograron la unión del péptido con la enzima [5]. Por su parte, LGHQWL¿FDUXQDEXHQDSDUWHGHORVSpSWLGRVSUHVHQWHV el péptido PTPVP también mostró una notable in- en el hidrolizado; sin embargo, sólo aquellos con los hibición de la ECA, con un valor de IC50 de 256.41 requerimientos de tamaño y estructura adecuados µM. Éste péptido contiene un residuo de prolina para ser potenciales inhibidores de la ECA fueron en último y antepenúltimo lugar (Tabla 1). El res- sintetizados. La actividad inhibidora de la ECA de to de secuencias ensayadas mostraron moderada los péptidos sintetizados se realizó según el método inhibición de la ECA. Se sabe que los péptidos de desarrollado por Sentandreu y Toldrá [3]. pequeño tamaño presentan una mayor facilidad para ser absorbidos en el tracto intestinal que los pépti- /RVSpSWLGRVTXHVHLGHQWL¿FDURQHQHOKLGUR- dos grandes [6]. Además, los péptidos que contie- lizado y fueron posteriormente sintetizados para nen prolina son generalmente más resistentes a la conocer su capacidad de inhibir la actividad ECA digestión enzimática [7]. En consecuencia, cabe se muestran en la Tabla 1. A modo de ejemplo, en la esperar que los pentapéptidos KAPVA y PTPVP que Figura 1 se muestra el espectro de MS/MS corres- mostraron una notable inhibición de la ECA y que pondiente al péptido KAPVA. además contienen residuos de prolina en sus secuen- cias, puedan mostrar una actividad antihipertensiva in vivo [8]. Los resultados obtenidos sugieren que ODGLJHVWLyQ¿VLROyJLFDGHODVSURWHtQDVGHODFDUQH de cerdo puede promover la generación de péptidos bioactivos, apoyando la idea de que la carne de cerdo puede ser una buena fuente de constituyentes saludables. No obstante, son necesarios estudios in YLYRSDUDGHPRVWUDUVLORVSpSWLGRVLGHQWL¿FDGRV pueden ejercer una acción antihipertensiva real. Agradecimientos Damos las gracias al Centro de Investigación Príncipe Felipe (CIPF) Proteomics core facility (miembro de Proteored), y en especial a Luz Va- lero, por su valiosa contribución en el análisis de 1+ Figura 1. Espectro MS/MS del ion 527.32 obtenido del espectrometría de masas. análisis del hidrolizado de cerdo mediante nanoLC-ESI-MS/ MS. Se muestran los iones y y b encontrados por MASCOT (resaltados en negrita). 174 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Tabla 1. ,GHQWL¿FDFLyQGHSpSWLGRVSUHVHQWHVHQHOKLGUROL]DGRGHSURWHtQDVPHGLDQWHQDQR/&(6,0606REWHQLGRSRU digestión enzimática de la carne de la carne de cerdo. La actividad inhibidora in vitro de la ECA está expresada como IC50 (concentración de péptido necesaria para inhibir el 50% de la actividad ECA original). tiempo proteína origen de cerdo IC50 de masa calc masa obs secuencia posición (NCBI accesion no. ) (µM) retención 25,2 589,29 589,96 MMVPI cytocromo P450 3A46 (NP001128296) 394-398 >1000 28,54 445,26 446,26 IGGSI beta-actina (ABI29185) 343-347 n.aa 31,6 526,31 527,32 KAPVA titina (XP001925902) 4784-4788 46,56 35,43 509,28 511,33 PTPVP titina (XP001925902) 4216-4220 256,41 36,01 519,27 520,28 YPGIA beta-actina (ABI29185) 308-312 n.a 36,89 526,32 527,32 NIIPA GAPDHb (ABI29187) 203-207 >1000 47,18 650,32 651,33 MYPGIA beta-actina (ABI29185) 307-312 641,02 59,06 569,34 570,35 VIPEL GAPDH (ABI29187) 218-222 799,24 60,35 603,35 604,36 INDPF GAPDH (ABI29187) 31-35 n.a 64,87 569,34 570,36 VLPEI titina (XP001925902) 4316-4320 >1000 aActividad inhibidora de la ECA no encontrada. bGliceraldehido 3-fosfato dehidrogenasa Referencias >@ 5RKUEDFK06 :LOOLDPV(% 5ROVWDG5 $3XUL¿FDWLRQDQG6XEVWUDWH6SHFL¿FLW\RI%R- [1] Arihara, K. Functional properties of bioactive vine Angiotensin-Converting Enzyme. Journal peptides derived from meat proteins. Advanced of Biological. Chemistry 1981; 256 (1): 225- Technologies for Meat Processin. CRC Press 230. (Boca Raton) 2006; 245-246. [6] Hara, H.; Funabiki, R.; Iwata, M.; Yamazaki, [2] Yamamoto, N.; Ejiri, M.; Mizuno, S. Biogenic K. I. Portal Absorption of Small Peptides in peptides and their potential use. Curr. Pharm. Rats Under Unrestrained Conditions. Journal Design 2003; 9 (16): 1345-1355. of Nutrition 1984; 114 (6): 1122-1129. >@ 6HQWDQGUHX0$7ROGUD)$ÀXRUHVFHQFH >@ .LP6%HUWZKLVWOH: .LP<:3HSWLGH based protocol for quantifying angiotensin-I hydrolyses on the brush border and soluble converting enzyme activity. Nature Protocols fractions of small intestinal mucosa of rat and 2006; 1 (5): 2423-2327. man. Journal of Clinical Investigation 1972; 51: >@ 0DMXPGHU. :X-$QJLRWHQVLQ,&RQYHUWLQJ 1419-1430. Enzyme Inhibitory Peptides from Simulated [8] Nakashima, Y.; Arihara, K.; Sasaki, A.; Mio, H.; in Vitro Gastrointestinal Digestion of Cooked Ishikawa, S.; Itoh, M. Antihypertensive activities Eggs. Journal of Agricultural and. Food Che- of peptides derived from porcine skeletal muscle mistry 2009; 57 (2): 471-477. myosin in spontaneously hypertensive rats. Jo- urnal of Food Science 2002; 67 (1): 434-437. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 175 Péptidos derivados de la troponina T generados en jamón curado Leticia Mora, Miguel Angel Sentandreu, Fidel Toldrá Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC), Apartado de correos 73, 46100, Burjassot, Valencia, España Resumen pretación de los espectros se realizó utilizando el algoritmo MASCOT y la base de datos NCBInr. /DWURSRQLQD7HVXQDSURWHtQDPLR¿EULODUSUH- sente en el músculo estriado con importantes fun- De los resultados obtenidos se evidencia la in- ciones estructurales y reguladoras. Esta proteína tensa degradación proteica que tiene lugar durante se degrada fácilmente durante el condicionamiento la elaboración de jamón curado. La Figura 1 muestra post-mortem de la carne aunque todavía se desco- el espectro de masas MALDI-TOF de la fracción nocen los detalles de su degradación y la secuencia eluida a una concentración del 20% de acetonitrilo de los péptidos generados en procesos más largos en la cromatografía de fase reversa. El espectro de como el curado del jamón. masas muestra las masas moleculares de los io- nes monocargados ([M + H]+) 2811.42, 2690.42, \ORVFXDOHVVHLGHQWL¿FDURQFRPR La degradación de la troponina T (TnT) se ha los péptidos 1, 2, 3, y 4. En la Tabla 1 se muestran correlacionado positivamente con el ablandamiento las secuencias de los cuatro fragmentos de TnT iden- post-mortem de la carne [1], relacionándola también WL¿FDGRVDSDUWLUGHORVHVSHFWURV0606REWHQLGRV FRQODFDOLGDG¿QDOGHODPLVPD>@/RVFDPELRV por espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF a que sufren las proteínas musculares durante el pro- partir de las fracciones de jamón curado. cesado del jamón curado han sido ampliamente es- tudiados, observándose cambios en proteínas estruc- turales como la TnT [4]. La hidrólisis observada en las proteínas estructurales ayudan a entender como VHJHQHUDODWH[WXUD\HOÀDYRUWtSLFRHQHOMDPyQ FXUDGR(QHVWHWUDEDMRKDVLGRSRVLEOHLGHQWL¿FDU cuatro péptidos generados a partir de la proteolisis de la TnT durante el curado del jamón haciendo uso de la tecnología proteómica. Se tomaron 50 g de músculo Biceps femoris de una pieza de jamón curado para realizar una extrac- Figura 1. Espectro de masas MALDI-TOF obtenido a partir ción y posterior desproteinización, obteniendo un de la fracción eluída al 20% de acetonitrilo en cromatogra- extracto de péptidos. Parte del extracto obtenido (5 fía de fase-reversa. mL) se fraccionó por medio de cromatografía de ex- Las calpaínas (EC 3.4.22.17) participan en la clusión molecular en una columna Sephadex G-25. proteolisis del músculo post-mortem principalmente Las fracciones correspondientes a un mayor tama- durante la primera etapa del proceso de curado de- ño molecular se concentraron e inyectaron en un bido a su baja estabilidad en presencia de elevadas sistema de cromatografía líquida de alta resolución concentraciones de sal y pH ácidos, tal como ocurre equipado con una columna Symmetry C18 (250 x en las etapas posteriores del curado. De acuerdo con 4.6 mm) y un colector de fracciones automático. Las los resultados obtenidos por algunos autores tras fracciones obtenidas después de esta cromatografía incubar TnT de músculo esquelético de conejo bajo se analizaron posteriormente en un espectrómetro condiciones de baja temperatura y alta fuerza iónica de masas MALDI-TOF/TOF empleando el ácido [5], la enzima µ-calpaina podría ser la responsable α-ciano-4-hidroxicinámico como matriz. La inter- del sitio de corte Leu81-Met82, correspondiente al 176 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Table 1. 6HFXHQFLDVGHORVIUDJPHQWRVGH7Q7LGHQWL¿FDGRVQMDPyQFXUDGRXWLOL]DQGRHVSHFWURPHWUtDGHPDVDV0$/', TOF/TOF. Péptido Masa observada (Da) Residuo en P1 Secuencia Identificada Residuo en P'1 1 2912.48 56L 57TAPKIPEGEKVDFDDIQKKRQNKDL81 M82 2 2811.42 57T 58APKIPEGEKVDFDDIQKKRQNKDL81 M82 3 2643.37 59P 60KIPEGEKVDFDDIQKKRQNKDL81 M82 4 2515.27 60K 61IPEGEKVDFDDIQKKRQNKDL81 M82 H[WUHPR&WHUPLQDOGHORVSpSWLGRVLGHQWL¿FDGRV vine Skeletal-Muscle. Journal of Food Science en el presente estudio (Tabla 1). Sin embargo, aun- 1977;42: 117-124. TXHHVWRVDXWRUHVWDPELpQLGHQWL¿FDURQHOVLWLRGH [2] Laville, E.; Sayd, T.; Sante-Lhoutellier, V.; corte Thr57-Ala58, no podemos asegurar que esta Morzel, M.; Labas, R.; Franck, M.; Chambon, enzima sea la responsable del extremo N-terminal C.; Monin, G. Characterisation of PSE zones in del péptido 2, ya que este mismo péptido también semimembranosus pig muscle. Meat Science KDVLGRLGHQWL¿FDGRFRQXQDWKUHRQLQDDGLFLRQDOHQ 2005; 70: 167-172. el extremo N-terminal (péptido 1, Tabla 1), lo que [3] Hwang, I. H.; Park, B. Y.; Kim, J. H.; Cho, S. H.; sugiere una posible acción de las aminopeptidasas Lee, J. M. Assessment of postmortem proteolysis en la generación de este sitio de corte. El efecto de by gel-based proteome analysis and its relation- la m-calpaína en músculo de cerdo ha sido también ship to meat quality traits in pig longissimus. HVWXGLDGRLQYLWUR>@FRQ¿UPDQGRHOVLWLRGH Meat Science 2005;69: 79-91. corte Thr -Ala . 57 58 [4] Toldrá, F.; Rico, E.; Flores, J. Cathepsin B, (VWHHVWXGLRSRQHGHPDQL¿HVWRODUHOHYDQFLD D, H and L Activities in the Processing of Dry- que pueden tener las calpaínas en la hidrólisis de la Cured Ham. Journal of the Science of Food and TnT durante el curado del jamón. De hecho, parte Agriculture 1993; 62: 157-161. GHORVUHVXOWDGRVREWHQLGRVFRQ¿UPDQDOJXQRVGH >@ +XJKHV0& *HDU\6 'UDQV¿HOG( 0F- ORVVLWLRVGHFRUWHSUHYLDPHQWHLGHQWL¿FDGRVSRU Sweeney, P. L. H.; O’Neill, E. E. Characteriza- otros autores. tion of peptides released from rabbit skeletal muscle troponin-T by mu-calpain under condi- tions of low temperature and high ionic strength. Agradecimientos Meat Science 2001; 59: 61-69. Beca FPU del Ministerio de Educación y Ciencia [6] Kitamura, S. I.; Muroya, S.; Tanabe, S.; Okumu- (España), beca AGL2007-65379-C02-01/ALI del Mi- ra, T.; Chikuni, K.; Nishimura, T. Mechanism nisterio de Educación y Ciencia (España) y FEDER. of production of troponin T fragments during Especialmente al Servicio de Proteómica del Centro postmortem aging of porcine muscle. Journal de Investigación Príncipe Felipe (CIPF) por su con- of Agricultural and Food Chemistry 2005; 53: tribución al análisis por MALDI-TOF/TOF. 4178-4181. [7]. Muroya, S.; Kitamura, S.; Tanabe, S.; Nishi- mura, T.; Nakajima, I.; Chikuni, K. N-terminal Referencias amino acid sequences of troponin T fragments, >@ 2OVRQ'* 3DUULVK)& 'D\WRQ:5 *ROO including 30 kDa one, produced during postmor- D. E. Effect of Postmortem Storage and Calcium tem aging of bovine longissimus muscle. Meat $FWLYDWHG)DFWRURQ0\R¿EULOODU3URWHLQVRI%R- Science 2004; 67: 19-24. 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 177 Instrucciones a los autores http://www.cbm.uam.es/seprot/ Envío de los manuscritos: Mediante correo electrónico [email protected] ProteómicaHVODUHYLVWDR¿FLDOGHOD6RFLHGDG(VSDxRODGH3URWHyPLFD6XSHULRGLFLGDGVHUiVHPHVWUDO HQH- ro-febrero y julio-septiembre) y será publicada por el Servicio de Publicaciones de la Universidad de Córdoba. Esta revista publicará artículos originales y comu- periodo doctoral, a la vez que os ayudará a daros a QLFDFLRQHVEUHYHVGHFRQWHQLGRFLHQWt¿FRRWpFQLFR conocer, por lo que el resumen debe de ir acompaña- así como artículos de revisión, tutoriales y opiniones, GRGHXQDSHTXHxDUHVHxDELEOLRJUi¿FDGHOJUXSRGH notas, resúmenes de tesis doctorales o comentarios investigación. La extensión no debe de ser superior sobre cualquier aspecto relacionado con la proteó- a 4 páginas. El resto de las contribuciones tendrá mica. Incluirá información sobre nuestra Sociedad y una extensión máxima de 4 páginas. Para el cálculo sobre los socios, grupos e instituciones que la compo- de la extensión se tendrán en cuenta, además del nen. El idioma será el castellano, aunque se admitirán WH[WRODV¿JXUDVODVWDEODVODVLOXVWUDFLRQHV\ODV contribuciones en otras lenguas, preferentemente el referencias. No se considera la publicación en color inglés. Aunque Proteómica se distribuirá preferente- en la versión impresa, por lo que las ilustraciones, mente en España y Latinoamérica, pretende tener un IRWRJUDItDV\JUi¿FRVDSDUHFHUiQHQEODQFR\QHJUR carácter internacional, extendiendo su distribución a Deberán enviarse, en archivos separados, por una otros países. Esta revista se envía, sin coste alguno, a SDUWHHOWH[WR\ODVWDEODV SUHIHUHQWHPHQWHHQ:RUG los socios de la SEProt, a Unidades y Servicios que \SRURWUDODV¿JXUDV HQIRUPDWRSGID trabajen en este campo, y a instituciones y organiza- GSLGHUHVROXFLyQ\DOWDPDxRGHLPSUHVLyQ¿QDO ciones públicas o privadas vinculadas a la sociedad o /RVDXWRUHVGHEHUiQYHUL¿FDUTXHORVGHWDOOHVGH con actividad relevante en el campo de la proteómica. ODV¿JXUDVVHLPSULPHQDSDUWLUGHORV¿FKHURVFRQ Existirá una versión impresa, editada por el Servicio la calidad requerida y que el texto que incluyan las de Publicaciones de la UCO, y una versión “on-line” ¿JXUDVVHDOHJLEOHDOWDPDxRGHUHSURGXFFLyQ¿QDO que aparecerá en la página web de la SEProt y de la /DVWDEODV\OH\HQGDVGH¿JXUDVGHEHQLUDO¿QDOGHO Universidad de Córdoba. texto. El texto debe ajustarse al siguiente formato: letra Times New Roman, tamaño 12, doble espacio, Todas las contribuciones serán revisadas por el SiJLQDV\OtQHDVQXPHUDGDVMXVWL¿FDFLyQWRWDO comité editorial, y su formato deberá ajustarse a las instrucciones que se adjuntan. Los artículos origina- Los artículos originales deben tener las siguien- les, las comunicaciones breves, las revisiones y los tes secciones: WXWRULDOHVVHUiQHYDOXDGRVFLHQWt¿FDPHQWHSRUXQRR dos revisores elegidos por el comité editorial. Todas Portada. Incluirá el título, la lista de autores ODVFRQWULEXFLRQHVUHÀHMDQODRSLQLyQGHVXVDXWRUHV QRPEUH\DSHOOLGR V \VX¿OLDFLyQ\ORVGDWRV y no necesariamente la opinión del Comité Editorial completos del autor con el que se mantendrá la ni de la Junta Directiva de la SEProt. FRUUHVSRQGHQFLD/D¿OLDFLyQGHORVDXWRUHVHQ el caso de que exista más de una, se indicará Los manuscritos se enviarán por correo electró- mediante un símbolo en formato superíndice nico, a la dirección [email protected] Los artículos detrás del nombre de cada autor. originales, las revisiones y los tutoriales deberán ir acompañados de una carta de presentación del Resumen (máximo de 250 palabras) y palabras trabajo (cover letter) y tendrán una extensión máxi- clave (máximo de 6, separadas por comas). ma de 15 páginas A4; las comunicaciones breves Introducción. Deberá evitarse una revisión de- también deberán incluir una carta de presentación y PDVLDGRH[WHQVDGHOWHPD\GHEHUiMXVWL¿FDU tendrán una extensión máxima de 8 páginas A4. Los adecuadamente el contenido del trabajo. resúmenes de las Tesis Doctorales pretenden ser una forma de comunicar el trabajo realizado durante el 178 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 Materiales y métodos. Esta sección deberá ser [4] Kyte J. Mechanism in Protein Chemistry, Gar- breve, limitándose a describir los procedimientos land Publishing, Inc., 1995. que sean novedosos y referenciando aquellos ya [5] Castillejo MA. Análisis de los cambios de expre- GHVFULWRV/DVGHVFULSFLRQHVWHQGUiQHOVX¿FLHQWH sión producidos por un inhibidor de quinasas en detalle para permitir la repetición de los experi- células endoteliales. Tesis Doctoral, Universidad mentos. de Córdoba, 2005. Resultados. Con objeto de facilitar la edición de los manuscritos VHKDSUHSDUDGRXQ¿FKHURGHHVWLORSDUDHOSURJUDPD Discusión. Los Resultados y la Discusión po- EndNote denominado Proteomica.ens, accesible desde drán agruparse en una única sección. QXHVWUDSiJLQDZHE3DUDSRGHUXVDUHVWH¿FKHURKD\ Referencias. que colocarlo en el subdirectorio Styles del EndNote. Agradecimientos. /DVWDEODV\¿JXUDVOOHYDUiQQXPHUDFLyQDUiELFD y se citarán en el texto en el siguiente formato: ta- Las abreviaturas se incluirán como nota al pié EOD¿JXUD/DVWDEODVGHEHUiQOOHYDUXQWtWXOR\ de página la primera vez que aparezcan en el texto. podrán incluir notas a pie de tabla, que se referirán Como norma general, no deben incluírse abreviatu- al contenido de la tabla usando símbolos en formato ras ni en el título ni en el resumen. VXSHUtQGLFH7RGDVODV¿JXUDVGHEHUiQOOHYDUXQD leyenda conteniendo un titulo lo más representativo (OVLVWHPDGHFLWDVELEOLRJUi¿FDV\UHIHUHQFLDV SRVLEOHGHOFRQWHQLGRGHOD¿JXUDHQQHJULWD\XQ a partir del número 3 de la revista, será un formato texto explicativo lo más conciso posible; la descrip- basado en la revista Journal of Proteomics. Las refe- FLyQGHWDOODGDRODLQWHUSUHWDFLyQGHOD¿JXUDHQVX rencias se citarán en el texto mediante números entre caso, deberá hacerse en el texto del manuscrito. corchetes cuadrados de acuerdo a su orden de cita- ción: cita simple[1], cita de varias referencias[2-4], Las comunicaciones breves deben ajustarse al cita de referencias alternadas[1, 3-5]. Todas las refe- mismo formato que los artículos originales, y conten- rencias deben ser numeradas de forma consecutiva. drán un resumen (máximo 250 palabras), una lista de Las referencias a trabajos que no hayan sido publi- palabras clave (máximo de 6, separadas por comas), cados no se incluirán en la sección de Referencias; una única sección conteniendo el texto principal, dichos trabajos deberán citarse, en el texto y entre y las referencias y agradecimientos, además de las paréntesis de acuerdo al siguiente formato: (Corra- WDEODV\¿JXUDV(OWH[WRSULQFLSDOGHEHUiLQWURGXFLU les F, Jorrín J, resultados no publicados), (Corrales adecuadamente el tema, explicar la metodología uti- F, Jorrín J, manuscrito enviado), (Jorrín J, Corrales lizada, y comentar y discutir los resultados. F, comunicación personal). Los artículos de revisión y los tutoriales tendrán Las publicaciones serán citadas en la sección un formato libre pero deberán incluír un Resumen de Referencias según su orden de aparición y de (máximo 250 palabras) y una lista de palabras clave acuerdo a los siguientes ejemplos: (máximo de 6, separadas por comas). El resto de las contribuciones tendrá un formato libre. Todas >@ 6WRUH\-'\7LEVKLUDQL56WDWLVWLFDOVLJQL¿FDQFH las contribuciones deberán respetar el formato de for genomewide studies. Proc Natl Acad Sci U ORVDUWtFXORVRULJLQDOHVHQFXDQWRDWDEODV¿JXUDV S A 2003;100:9440-5. abreviaturas y referencias. [2] Ong SE, Blagoev B, Kratchmarova I, Kristensen DB, Steen H, Pandey A, et al. Stable isotope la- Los resúmenes de las Tesis Doctorales incluirán beling by amino acids in cell culture, SILAC, as a los siguientes apartados: título de la tesis, autor, simple and accurate approach to expression pro- GLUHFWRU HV \D¿OLDFLyQIHFKD\OXJDUGHOHFWXUD teomics. Mol Cell Proteomics 2002;1:376-86. dirección web donde se puede consultar la tesis completa, si existe, resumen del trabajo (este apar- >@ 6WXOWV-7+HQ]HO:-:RQJ6&\:DWDQDEH& tado puede organizarse según el criterio del autor), ,GHQWL¿FDWLRQRI(OHFWUREORWWHG3URWHLQVE\3HS- tide Mass Searching of a Sequence Database en XQD¿JXUDRHVTXHPDTXHLOXVWUHORVGDWRVDSRUWDGRV Mass Spectrometry in the Biological Sciences en la tesis, bibliografía, reseña del grupo de investi- (editores: Burlingame A.L. y Carr S.A.), Humana gación en el que se ha realizado el trabajo (máximo Press, Totowa, New Jersey 1996, pp. 151-70. 200 palabras). Se puede incluir una foto del grupo.