SCENEDESMUS DIMORPHUS BİYOFİLM KÜLTÜRLERİNDE AZOT AÇLIĞININ LİPİD ÜRETİMİ ÜZERİNE ETKİSİ Fatma KAR Yüksek Lisans Tezi Biyoloji Anabilim Dalı Haziran 2019

SCENEDESMUS DIMORPHUS BİYOFİLM KÜLTÜRLERİNDE AZOT AÇLIĞININ LİPİD ÜRETİMİ ÜZERİNE ETKİSİ

Fatma KAR

Kütahya Dumlupınar Üniversitesi Lisansüstü Eğitim Öğretim ve Sınav Yönetmeliği Uyarınca Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalında YÜKSEK LİSANS TEZİ Olarak Hazırlanmıştır.

Danışman: Prof. Dr. Tuba İÇA

Haziran-2019 KABUL VE ONAY SAYFASI

Fatma KAR’ın YÜKSEK LİSANS tezi olarak hazırladığı “SCENEDESMUS DIMORPHUS BİYOFİLM KÜLTÜRLERİNDE AZOT AÇLIĞININ LİPİD ÜRETİMİ ÜZERİNE ETKİSİ” başlıklı bu çalışma, jürimizce Kütahya Dumlupınar Üniversitesi Lisansüstü Eğitim Öğretim ve Sınav Yönetmeliğinin ilgili maddeleri uyarınca değerlendirilerek kabul edilmiştir.

25/06/2019

Prof. Dr. Önder UYSAL ------Enstitü Müdürü, Fen Bilimleri Enstitüsü

Prof. Dr. Hayri DAYIOĞLU ------Anabilim Dalı Başkanı, Biyoloji Anabilim Dalı

Prof. Dr. Tuba İÇA ------Danışman, Biyoloji Anabilim Dalı

Sınav Komitesi Üyeleri

Prof. Dr. Tuba İÇA ------Biyoloji Bölümü, Kütahya Dumlupınar Üniversitesi

Doç. Dr. Ceylan AYADA ------Temel Tıp Bilimi Bölümü, Kütahya Sağlık Bilimleri Üniversitesi

Doç. Dr. Cüneyt Nadir SOLAK ------Biyoloji Bölümü, Kütahya Dumlupınar Üniversitesi

ETİK İLKE VE KURALLARA UYGUNLUK BEYANI

Bu tezin hazırlanmasında Akademik kurallara riayet ettiğimizi, özgün bir çalışma olduğunu ve yapılan tez çalışmasının bilimsel etik ilke ve kurallara uygun olduğunu, çalışma kapsamında teze ait olmayan veriler için kaynak gösterildiğini ve kaynaklar dizininde belirtildiğini, Yüksek Öğretim Kurulu tarafından kullanılmak üzere önerilen ve Kütahya Dumlupınar Üniversitesi tarafından kullanılan İntihal Programı ile tarandığını ve benzerlik oranının % 5 çıktığını beyan ederiz. Aykırı bir durum ortaya çıktığı takdirde tüm hukuki sonuçlara razı olduğumuzu taahhüt ederiz.

Prof. Dr. Tuba İÇA Fatma KAR

SCENEDESMUS DIMORPHUS BİYOFİLM KÜLTÜRLERİNDE AZOT AÇLIĞININ LİPİD ÜRETİMİ ÜZERİNE ETKİSİ

Fatma KAR Biyoloji, Yüksek Lisans Tezi, 2019 Tez Danışmanı: Prof. Dr. Tuba İÇA

ÖZET

Bu çalışmada Scenedesmus dimorphus biyofilm kültürlerinde azot (N) stresinin lipid üretimi üzerine etkisi incelenmiştir. Yeşil alglerden (Chlorophyceae) S. dimorphus’ un planktonik ve biyofilm formu, %100 N ve %25 N içeren ortamlarda inoküle edilmiştir. Yapılan denemelerde N stresinin ve biyofilm oluşumunun, kuru madde (DCW), klorofil-a ve total lipit miktarlarına olan etkisi incelenmiştir. S. dimorphus mikroalginin biyofilm oluşturma becerisinin incelenebilmesi için laboratuar koşullarına modifiye edilerek Dönen algal biyofilm reaktörü (RABR) kurulmuştur. RABR’ ın tasarımında S. dimorphus mikroalginin biyofilm oluşturabilmesi için çeşitli tutunma materyalleri denenmiş ve en yüksek tutunma oranına ve hasat işleminin kolay olması gibi özelliklere sahip olmasından dolayı polietilen halat kullanılmasına karar verilmiştir. Deneme sonucunda elde edilen en yüksek kuru biyokütlenin 0,275 g/m2 olduğu ve bu sonucun %100 N içeren biyofilm formundan elde edildiği belirlenmiştir. Uygulanan azot stresinin total lipit miktarına olan etkisi incelendiğinde, en yüksek DCW içinde % total lipit miktarının 13,81 olduğu ve bu sonucun %25 N içeren biyofilm formundan elde edildiği belirlenmiştir.

Anahtar Kelimeler: Azot (N) stresi, Biyofilm, Biyoreaktör, Chloropyceae, Dönen algal biyofilm reaktörü (RABR), Klorofil-a, Kuru madde (DCW), Mikroalg, Planktonik form, Polietilen halat, Scenedesmus dimorphus, Total lipit

THE EFFECT OF NITROGEN STARVATION ON LIPID PRODUCTION OF SCENEDESMUS DIMORPHUS BIOFILM CULTURES

Fatma KAR Biology, M.S. Thesis, 2019 Thesis Supervisor: Prof. Dr. Tuba İÇA

SUMMARY

This study investigated the effect of the for lipid production in the Scenedesmus dimorphus biofilm form cultivation under nitrogen (N) starvation. The formation of planktonic and biofilm in the species of gren algaes (Chlorophyceae) S. dimorphus was inoculated at environments with both %100 N and %25 N. The aim of this study was to experiment the effects of nitrogen starvation and biofilm formation on dry cell weight (DCW), chlorophyll-a and total lipid production. Under laboratory conditions were modified a Rotating algal biofilm reactor (RABR) in order to investigate the formation of biofilm at S. dimorphus microalgae. Design process of the RABR was important for the purposes of microalgae production by S. dimorphus. During the design process, multiple materials were tested for their adhesion quality. Polyethylene robe was chosen for this experiment for its highest adhesion percentage along with the simple harvesting process. The highest dry biomass data recorded after the experimentwas 0,275 g/m2 and this result came from a biofilm formation that contained %100 N. When the effects of the nitrogen stress on total lipid concentration was examined, it was found that the highest amount % total lipid in DCW was 13,81 and this result was obtained from biofilm form containing %25 N.

Keywords: Biofilm, Bioreactor, Chlorophyceae, Chlorophyll-a, Dry cell Weight (DCW), Microalgae, Nitrogen (N) stress, Planktonic form, Polyethylene robe, Rotating Algal Biyofilm Reactor (RABR), Scenedesmus dimorphus, Total lipid

vii

TEŞEKKÜR

Öncelikle yüksek lisans öğrenimim süresince benden ilgisini ve desteğini hiç esirgemeyen, büyük bir sabır ve titizlikle bilgi ve tecrübelerini aktararak gelişmemi sağlayan, insani değerlerini ve eğitimci kişiliğini örnek edindiğim değerli danışman hocam Prof. Dr. Tuba İÇA’ ya saygılarımı sunuyor ve sonsuz teşekkür ediyorum.

Üniversitemizin ileri teknoloji özelliklerine sahip Zoonozlar Uygulama ve Araştırma Merkezi’nde çalışmama olanak sağlayan ve engin bilgileriyle yol gösteren hocam Prof. Dr. Anıl İÇA’ ya sonsuz teşekkürlerimi sunuyorum.

Tezimin laboratuar aşamalarında elinden gelen her türlü yardımı karşılıksız sunan, çok değerli arkadaşım Ersel ÇEÇEN’ e, Hasan İlkay YILMAZ’ a ve tez çalışmam boyunca destek ve yardımlarını esirgemeyen Zoonozlar Uygulama ve Araştırma Merkezi sekreteri Barış KÜÇÜKAKSOY’ a çok teşekkür ediyorum.

Son olarak bugün olduğum yere gelmemi sağlayan, beni hayatımın her döneminde koşulsuz şartsız destekleyen ve arkamda olan babam Ali KAR’ a, annem Pembe KAR’ a sevgili ablam Merve KAR’ a, sevgili ablam Bilge AYDEMİR’ e, sevgili ağabeyim Serkan AYDEMİR’ e ve hayatımı paylaştığım, müstakbel eşim Semih GÜMÜŞ’ e sonsuz minnet ve teşekkürlerimi sunarım.

viii

İÇİNDEKİLER

Sayfa

ÖZET ...... v

SUMMARY ...... vi

ŞEKİLLER DİZİNİ ...... x

ÇİZELGELER DİZİNİ ...... xii

SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ ...... xiii

1. GİRİŞ ...... 1

2. LİTERATÜR ÖZETİ ...... 5

2.1. Alglerin Tanımı ...... 5 2.2. Alglerin Taksonomideki Yeri ...... 5 2.3. Alglerin Evrimi ...... 6 2.4. Alglerin Anatomik Yapıları ...... 7 2.4.1. Hücre duvarı ...... 7 2.4.2. Hücre organelleri...... 7 2.5. Mikroalglerin Büyümesi Üzerine Etkili Olan Faktörler ...... 8 2.5.1. Besin elementleri...... 9 2.5.2. Işık...... 10 2.5.3. Sıcaklık ...... 11 2.5.4. pH değeri ...... 11 2.5.5. Kültürlenme sistemleri ...... 12 2.6. Mikroalglerin Fotosentez Tepkimeleri ...... 16 2.7. Alglerin Lipit Üretim Mekanizmaları ve Lipit Kompozisyonu ...... 20 2.8. Alglerin Lipit Üretim Mekanizmalarını İndükleyen Stres Koşulları ve Verdikleri Cevaplar ...... 23 2.8.1. Azot stresi ...... 23 2.8.2. Fosfor stresi ...... 24 2.8.3. Işık stresi ...... 25 2.8.4. Sıcaklık stresi ...... 25 2.8.5. Tuz stresi ...... 25 2.8.6. Mikroalglerin biyofilm formasyonu ...... 26 2.9. Endüstriyel Biyoyakıt Üretiminde Mikroalg Kullanımı ...... 29

İÇİNDEKİLER (devam)

Sayfa

2.9.1. Alglerden elde edilen biyoyakıtlar ...... 29 2.10. Mikroalglerden Biyodizel Eldesi İçin Uygulanan Prosedürler ...... 32 2.10.1. Mikro-emülsifikasyon ...... 33 2.10.2. Piroliz ...... 33 2.10.3. Transesterifikasyon ...... 33

3. MATERYAL METOD ...... 35

3.1. Materyal ...... 35 3.1.1. 1.Kullanılan alg türü ve kültür ortamı ...... 35 3.2. Metod ...... 35 3.2.1. Kültür koşulları ...... 35 3.2.2. Reaktörün tasarlanması ...... 37 3.2.3. Optik dansitenin ölçülmesi ...... 39 3.2.4. Klorofil-a tayini...... 39 3.2.5. Kuru madde analizi (DCW - Dry Cell Weight) ...... 40 3.2.6. Total lipit ekstraksiyonu...... 40

4. BULGULAR ...... 42

4.1. Kullanılan Alg Türünün Mikroskopisi ...... 42 4.2. Dönen Algal Biyofilm Reaktöründe (RABR) Kullanılacak Materyalin Seçimi ...... 42 4.3. Optik Dansite ...... 45 4.4. Klorofil-a Tayini ...... 48 4.5. Kuru madde analizi (DCW) ...... 49 4.6. Total yağ miktarları ...... 51

5. TARTIŞMA ...... 60

6. SONUÇ VE ÖNERİLER ...... 67

KAYNAKLAR DİZİNİ ...... 68

ÖZGEÇMİŞ

ŞEKİLLER DİZİNİ

Şekil Sayfa 2.1. Açık havuz sistemi ...... 14 2.2. Tübüler fotobiyoreaktör ...... 15 2.3. Kapalı fotobiyoreaktör ...... 15 2.4. Dönen Algal biyofilm reaktörü ...... 16 2.5. Görünür ışık ...... 18 2.6. Mikroalglerde lipit biyosentezinin basit bir şeması ...... 23 2.7. Mikroalglerin biyofilm oluşturma şekilleri ...... 27 2.8. Alglerden biyoyakıt elde etmenin farklı yolları ...... 34 3.1. Planktonik form %100 N ve %25 N içeren besiyeri (orijinal)...... 36 3.2. Dönen algal biyofilm reaktöründe (RABR) kullanılan diskin ve motorun görünümü...... 38 3.3. Dönen algal biyofilm (RABR) reaktörünün yan açıdan görüntüsü...... 38 3.4. Dönen algal biyofilm reaktörünün (RABR) perspektif görüntüsü...... 39 4.1. Scenedesmus dimorphus mikroalginin mikroskobik görüntüleri (Orijinal)...... 42 4.2. Disk üzerindeki biyofilm formasyonunun şekillenmesinde kullanılan materyaller (a. Pamuk ip, b. Naylon ip, c. Polietilen halat, d. Yumuşak seramik, e. Sert seramik f. Hava taşı) (Orijinal)...... 44 4.3. Jüt halatın üzerinde biyofilm oluşturan S. dimorphus mikroalginin SEM görüntüleri (Orijinal)...... 45 4.4. Planktonik formun OD değerlerinin karşılaştırılması...... 46 4.5. Biyofilm formun OD değerlerinin karşılaştırılması...... 47 4.6. %100 N içeren planktonik ve biyofilm formunun OD değerlerinin karşılaştırılması...... 47 4.7. %25 N içeren planktonik ve biyofilm formun OD değerlerinin karşılaştırılması...... 48 4.8. Normal koşullar (%100 N) ve azot eksikliği stresi (%25 N) sonrası planktonik formdaki klorofil-a miktarının karşılaştırılması...... 49 4.9. Planktonik formasyonlarında azot eksikliğine bağlı kuru madde miktarları (g/L)...... 50 4.10. Biyofilm formasyonlarında azot eksikliğine bağlı kuru madde miktarları (g/m2)...... 51 4.11. Planktonik ve biyofilm formunda kuru hücre ağırlığın (DCW) normal koşullarda % yağ miktarı üzerine etkisi ...... 52 4.12. Planktonik ve biyofilm formunda kuru hücre ağırlığın (DCW) azot eksikliği koşullarında % yağ miktarı üzerine etkisi ...... 53

ŞEKİLLER DİZİNİ

Şekil Sayfa 4.13. %100 N içeren planktonik formun kuru madde (g/L) ve % total yağ miktarlarının karşılaştırması ...... 54 4.14. %25 içeren planktonik formun kuru madde (g/L) ve % total yağ miktarlarının karşılaştırması ...... 55 4.15. %100 N içeren biyofilm formun kuru madde (g/m2) ve % total yağ miktarlarının karşılaştırması...... 56 4.16. %25 N içeren biyofilm formun kuru madde (g/m2) ve % total yağ miktarlarının karşılaştırması...... 57 4.17. %100 N içeren planktonik formun klorofil-a ve % total yağ miktarlarının karşılaştırılması...... 58 4.18. %25 N içeren planktonik formun klorofil-a ve % total yağ miktarlarının karşılaştırılması ...... 59

xii

ÇİZELGELER DİZİNİ

Çizelge Sayfa 1.1. Bazı mikroalg türlerinin % yağ asidi miktarları (Demirbaş ve Demirbaş, 2010)...... 2 3.1. M3N-BBM besiyerinin içeriği...... 36 3.2. Azot miktarı %25 olan M3N-BBM içeriği...... 37 4.1. %100-%25 N içeren planktonik ve biyofilm formundaki total yağ miktarları (mg/g)...... 52

xiii

SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ

Kısaltma Açıklama

ACP Açil taşıyıcı protein ADP Adenozindifosfat AT Açil transferaz ATP Adenozintrifosfat CoA Koenzim A DCW Dry Cell Wight (Kuru Hücre Ağırlığı) DH Dehidrataz DNA Deoksiribonükleik Asit EPS Hücre dışı polimerik madde ER Enoilredüktaz FAS Yağ asidi sentaz KAS 3-ketoaçil ACP senteaz KR Ketoredüktaz M3N - BBM Modified 3 - N Basal Bold Medium NADP Nikotinamid adenin dinükleotit fosfat NADPH Nikotinamid adenin dinükleotit fosfat hidrojen OD Optik Dansite PGA Fosfogliserik asit PSI Fotosistem I PSII Fotosistem II RABR Dönen Algal Biyofilm Reaktörü RNA Ribonükleik asit SFA Doymuş Yağ Asidi TE Tioesteraz

1. GİRİŞ

Son 50 yılda dünya nüfusu iki katından fazla artış göstermiştir. Daha yüksek bir yaşam standardı ve sürekli artan bir ekonomi beklentisi, birincil enerji tüketiminde, özellikle fosil yakıt kaynaklı enerji kullanımında büyük bir artışa neden olmuştur. Dünya nüfusunun 2030 yılına kadar 1,4 milyar kişi daha artacağı ve dünyadaki kişi başı gelirin de artış göstereceği öngörüldüğünden, fosil yakıtların kullanımının artacağı tahmin edilmektedir (Jones ve Mayfield, 2012). Yerli sektörde ve endüstrileşen dünyadaki büyük enerji ihtiyacı nedeniyle fosil yakıtların kullanımının artmasıyla oluşan iklim değişiklikleri, yağış anormalileri, asit yağmurları, sağlık problemleri gibi sorunlar nedeniyle, yenilenebilir, daha düşük çevresel etkileri olan ve daha fazla enerji güvenirliği bulunan enerji kaynaklarının geliştirilmesi gerekmektedir (Soydemir, 2016).

Enerji kaynakları yenilenebilir ve yenilenemeyen olmak üzere iki kısma ayrılmaktadır. Yenilenemeyen kaynakların kullanımından gelen enerji sınırlıdır. Bunların keşfedilmesi, işlenmesi ve kullanılması çevre üzerinde ciddi derecede kötü etkiler yaratmaktadır. Günümüzde, dünyanın enerji ihtiyacını karşılayabilmek için kömür ve petrol gibi yenilenemeyen fosil yakıtlar kullanılmaktadır (Demirbaş ve Demirbaş, 2010). Ayrıca, 2069-2088 yılları arasında fosil yakıt rezervlerinin tamamen tükeneceği öngörülmektedir. Bu kaynaklara bağımlılığımız göz önüne alındığında, çevre için sürdürülebilir bir enerji kaynağına ihtiyaç vardır (Ishikaa, vd., 2017). Fosil yakıtların kullanımının azaltılması, üretilen karbondioksit ve diğer kirleticilerin miktarını önemli ölçüde azaltacaktır. Çevre kirliğiyle, daha az enerji kullanmak ya da fosil yakıtların yerine yenilenebilir enerji kaynaklarını kullanmakla mücadele edilebilir. Fosil yakıtların yerine geçebilecek alternatif yenilenebilir kaynaklar olarak algler, büyük ilgi görmektedir (Demirbaş ve Demirbaş, 2010).

Büyüyen nüfusun taleplerini karşılayabilmek için, ilk olarak yağ içeren bitkiler, birinci nesil yenilenebilir biyoyakıt kaynakları olarak kullanılmaya başlanmıştır. Ancak temiz su, ekilebilir arazi ve düşük enerji içeriği gibi problemlerden dolayı bu kaynaklar, biyoyakıt üretimini sınırlandırmıştır. İkincil nesil biyodizel olarak gıda dışı hammadde olarak isimlendirilen bitki ve orman kalıntıları, atıklar, özel hammaddeler ve kısa rotasyon ormanları kullanılmış, ancak düşük enerji yoğunlukları nedeniyle bu yöntem biyodizel üretimini sınırlandırmıştır. Üçüncü nesil yenilenebilir biyoyakıt olarak da fotootrofik mikroalgler kullanılmıştır ve diğer kaynaklara oranla daha yüksek oranda yağ bulundurduğu gözlenmiştir (Ishikaa, vd., 2017).

Mikroalgler fotosentez yapabildiğinden CO2‘ i kullanan mikroorganizmalardır. Bu yüzden alg bazlı teknolojiler, kömür yakıtlı elektrik santrallerinin karbon salınımını ve sera gazı emisyonlarını azaltılması için kullanılabilmektedir. Mikroalgler, biyodizel üretmek için kullanılan diğer ham maddelerden daha fazla yağ üretme potansiyeline sahiptirler ve bitkiler için uygun olmayan koşullarda da üreyebilmektedirler. Alglerden elde edilen yağ veriminin, en iyi performans gösteren bitki veya bitkisel yağlardan elde edilen yağ verimine göre 200 kat daha fazla olduğu bilinmektedir. Kültürlenen mikroalg türüne göre değişkenlik gösterse de mikroalgler, %2 ile %40 arasında yağ biriktirebilirler (Demirbaş ve Demirbaş, 2010). Bazı mikroalg türlerinin % yağ asidi miktarları Çizelge 1.1’ de verilmiştir.

Çizelge 1.1. Bazı mikroalg türlerinin % yağ asidi miktarları (Demirbaş ve Demirbaş, 2010).

Mikroalg Türü Protein Karbonhidrat Yağ Nükleik Asit % % % % Scenedesmus obliquus 50-56 10–17 12-14 3-6 Scenedesmus quadricauda 47 - 1,9 Scenedesmus dimorphus 8-18 21–52 16-40 Chlamydomonas rheinhardii 48 17 21 Chlorella vulgaris 51-48 12–17 14-22 4-5 Chlorella pyrenoidosa 57 26 2 Spirogyra sp. 6-20 33-64 11-21 Dunaliella bioculata 49 4 8 Dunaliella salina 57 32 6 Euglena gracilis 39-61 14-18 14-20 Prymnesium parvum 28-45 25-33 22-38 1-2 Tetraselmis maculata 52 15 3 Porphyridium cruentum 28-39 40-57 9-14 Spirulina platensis 46-63 8-14 4-9 2-5 Spirulina maxima 60-71 13-16 6-7 3-4,5 Synechoccus sp. 63 15 11 5 Anabaena cylindrica 43-56 25-30 4-7 -

Mikroalgler tatlı, acı ve tuzlu suda gelişim gösterebilen fotosentetik mikroorganizmalardır. Bu mikroorganizmalar, bir biyokütle oluşturabilmek ya da transesterifikasyon ile biyodizele dönüştürülebilen triaçilgliserolleri (TAG) biriktirebilmek için güneş ışığını kullanırlar (Gour, vd., 2016). Mikroalglerden üretilen lipitler, transesterifikasyon işleminin ardından, yağ içeren tohumlar kullanılarak üretilen diğer lipitlere benzerler ve biyodizelin kaynağını oluştururlar. Transesterifikasyon işleminin optimize edilmesi, alglerden

biyodizel üretiminin maliyetini düşürmek için büyük fayda sağlayacağı düşünülmektedir (Jones ve Mayfield, 2012).

Her ne kadar mikroalgler biyodizel üretimi için büyük umutlar vaat ediyor olsa da, ticari olarak üretilebilmesi için bazı iyileştirme çalışmaları yapılması gerekmektedir (Cheng ve He, 2014). İyileştirme çalışmaları aşağıdaki gibi özetlenebilir:

 Biyodizel üretirken en iyi sonucu alabilmek için çalışmada kullanılacak mikroalg suşunun iyi seçilmesi,  Biyomühendislik çalışmaları ile biyoyakıt üretimi için tüm koşulların optimize edilmesi,  Büyük ölçekli mikroalg üretimi için gerekli olan biyoreaktörün tasarlanması,  Üretim sonrası kullanılacak işleme teknolojilerinin belirlenmesi,  Üretim maliyetlerini ve tüketeceği enerji miktarını planlanması gerekmektedir (Chen vd., 2018).

Mikroalg bazlı biyodizelin ekonomik fizibilitesini arttırabilmek için, biyokütle, lipit ve karbonhidrat verimliliği optimize edilmelidir. Mikroalglerin biyokütle verimliliğinin arttırılması ya da istenilen biyokimyasal bileşenlerin üretilebilmesi için ortam koşullarını ya da ortam içeriklerini değiştirmek yeterli olabilmektedir. Mikroalglerin lipit ve karbonhidrat içeriği, azot ve fosfat eksikliği veya tuzluluk stresi gibi kimyasal uyarıcılar, kültür pH' ındaki değişiklikler, sıcaklık ve ışık yoğunluğu veya fotoperiyotlar gibi fiziksel uyarıcılar ile arttırılabilmektedir (Pancha vd., 2014).

Bu besin maddelerinin eksikliğinde birçok farklı türün alg biyokütlesi içindeki lipit konsantrasyonlarının önemli ölçüde artırabileceği ortaya konulmuştur.

 Rodolfi vd. (2009), deniz yosunu Nannochloropsis sp. 3 günlük azot açlığından sonra lipit konsantrasyonunu 4 kat (~% 15 ila ~ 60) arttırdığını belirtmiştir (Schnurr, vd., 2013).  Griffiths vd. (2011), C.vulgaris’ in belirli suşlarında azot sınırlandırılması yaparak 7. günde %39, 14. günde %57 ye ulaşan lipit birikiminin olduğunu gözlemlediğini rapor etmiştir (Griffiths, vd., 2011).  Wang vd. (2012), Scenedesmus dimorphus türünde yaptığı çalışmalarda azot konsantrasyonlarını değiştirerek, azotun hiç olmadığı koşullarda lipit birikiminin en fazla olduğunu rapor etmiştir (Wang, vd., 2012).

 Çakmak (2013), yedi ve on günlük inkübasyon sonrasında N, S, K, P, Mg, Ca, Zn ve Fe element açlıklarına cevap olarak Chlamydomonas reinhardtii hücrelerinin nötral lipit içerikleri sırasıyla; %22-95, %87-128, %37-42, %137-407, %99-253, %44-30, %15-79 ve %60-151 oranlarında artış gösterdiğini rapor etmiştir (Çakmak, 2013).

Bu nedenle, besin açlığı biyokütle hasadından önce nötr lipitlerin verimini kontrol etmek ve arttırmak için önemli bir endüstriyel strateji olabilir.

Mikroalgler, çeşitli biyokimyasallar ve biyoyakıt üretimi açısından gelecek vaad etmektedir. Ancak bu ürünlerin üretimi sonrası sucul ortamlardan izole edilmesi ve yoğunlaştırılması kısaca biyokütlenin hasatlanması ciddi ekonomik sıkıntılar yaratmaktadır (Christenson ve Sims, 2011; Uduman, vd., 2010). Mikroalglerin sıvı ortamda planktonik olarak kültürlendiği sıradan yetiştirme teknikleri, düşük biyokütle üretkenliği, hasat işleminin zorluğu, yüksek kurulum ve işletme maliyeti, yüksek su gereksinimleri vb. gibi birçok sıkıntı yüzünden yapılan çalışmaları sınırlandırmaktadır. Günümüzde biyofilm bazlı yetiştirme sistemleri oldukça ilgi görmektedir. Bunun sebebi ise sistemde harcanan su ve enerji miktarlarının oldukça düşük olmasıdır. Her ne kadar mikroalglerin biyofilmlerini oluşturduğu yüzeylerin tıkanması bir sıkıntı olarak görülse de, mikroalglerin katı bir yüzeye bağlı olarak kültürlendirildiği, yenilikçi bir teknoloji olarak ortaya çıkmıştır. Bu teknik, geleneksel kültürlenme sistemlerine kıyasla avantajlı görünmektedir (Mantzorou ve Ververidis, 2019). Bu yüzden alglerin ve lipitlerin ticari üretimini sağlamak ve ekonomik maliyeti azaltmak için, biyofilm sistemlerinin kullanılması alternatif bir yöntem olarak düşünülmektedir. Ancak bu konu üzerine yapılan çalışmaların sayısı oldukça sınırlıdır (Christenson ve Sims, 2012; Irving ve Allen, 2011; Johnson ve Wen, 2010; Ozkan, vd., 2012).

Bu çalışmada biyokütle işleme maliyetlerini azaltmak için geleneksel süspansiyon kültüründen farklı olarak alglerin biyofilm formunda üretilmesi ve bu üretimde besin stresi yaratmanın biyofilm ve lipit oluşumu üzerine etkileri araştırılmıştır.

2. LİTERATÜR ÖZETİ

2.1. Alglerin Tanımı

Thallophytes olarak da tanımlanan algler, tek hücreli veya çok hücreli formlarda olabilen basit, fotosentetik sucul organizmalardır. Başlangıçta algler sucul bitkiler olarak tanımlanıyorken, yüksek bitkiler gibi kökleri, embriyoları ve vasküler sistemi olmadığından bitkilerden ayrı bir yerde kategorize edilmektedir (Sankaran, vd., 2018). Alglerin çoğu tatlı su ve deniz ortamlarında yaşayan ototrof canlılardır. Siyanobakteriler ve diyatomlar gibi küçük tek hücreli mikroalglerden, kelp yosunu gibi büyük çok hücreli makroalglere kadar çeşitlilik göstermektedirler (Bule, vd., 2018). Boyutları 3-10 µ’ dan 70 cm uzunluğuna çıkabilir ve günde 50 cm’ e kadar uzayabilirler (Aktar ve Cebe, 2010).

Algler her yerde gözlemlenebilen birer canlı olsalar da, bazı özgün türler belirli habitatlarda yaşarlar. Bazı algler, bitkiler gibi katı bir zemine bağlanır, bazıları hayvanlar gibi hareket eder, bazıları su içinde asılı, bazıları toprakta, ağaçlarda ve hayvanlara bağlı olarak büyürken, bazıları diğer organizmalar ile simbiyotik ilişki içerisindedir (Richmond, 2013).

2.2. Alglerin Taksonomideki Yeri

Alglerin tek bir monofiletik grupları yoktur ve bundan ötürü kolayca tanımlanamazlar (Richmond, 2013). Algler ve bitkiler aynı depolama bileşiklerini üretmekte, ayrıca avcılara ve parazitlere karşı benzer savunma stratejileri kullanmaktadır. Bazı algler ve bitkiler arasında güçlü bir morfolojik benzerlik vardır; bununla birlikte algleri bitkilerden ayırmak oldukça kolaydır çünkü algler ve bitkiler arasındaki benzerlikler, farklılıklarından çok daha azdır. Bitkilerin kökleri, yaprakları, ksilem ve floem olarak adlandırılan iletim demetlerini içeren çok gelişmiş bir vasküler sistemleri vardır. Dahası, üreme tüm bitkilerde bir haploid gametofit ve bir diploid sporofit arasında bir geçiş ile bir digenetik yaşam döngüsüne sahiptir ve embriyo oluştururlar. Alglerin ise kökleri, gövdeleri, yaprakları, iyi tanımlanmış bir vasküler sistemi yoktur ve embriyo oluşturamazlar. Ayrıca algler, mikroskobik tek hücreli, makroskobik çok hücreli serbest veya biyofilm oluşturan grupları, keçeleşmiş veya dallanmış koloniler gibi farklı biçimlerde ortaya çıkmaktadırlar. Sonuç olarak, algler ile bitkiler aynı grup içerisinde değerlendirilemezler (Barsanti ve Gualtieri, 2005).

Bitkilerinin dışında kalan fotosentetik ökaryotlar ya da protistler olarak basitçe tanımlanabilen algler, şaşırtıcı bir hücre morfolojisi ve yaşam döngüsü dizisine sahiptir ve çok sayıda habitatta yaşamaktadır (Bhattacharya ve Medlin, 1998). Algler, makroalg ve oldukça

fazla çeşidi olan mikroorganizmal mikroalg olarak sınıflandırılabilen, fotosentetik sucul organizmalardır (Demirbaş, 2010; Barsanti ve Gualtieri, 2005). Algler, Chlorophyta (yeşil algler), Rhodophyta (kırmızı algler), Glaucocystophyta, Euglenophyta, Chlorarachniophyta, Heterokonta, Haptophyta, Cryptophyta ve dinoflagellatlar olarak sınıflandırılabilmektedir. Son dört gurubu basit bir şekilde kromofit algleri olarak isimlendirilir. Bunun sebebi klorofil-a, klorofil-b, sarı veya kahverengi görünmelerini sağlayan ksantofil pigmentlerini bulundurmalarıdır (Bhattacharya ve Medlin, 1998). Mikroalgler, tuzlu ve tatlı su ortamlarında yaşayabilen, fotosentez yapan mikroskobik canlılardır. Mikroalgler, özellikle içerdikleri pigmentlere, yaşam döngülerine ve hücresel yapılarına göre çeşitli sınıflara ayrılmaktadır (Demirbaş, 2010). Günümüzde bilinen alg sayısının 30,000 ile 1 milyondan fazla tür arasında değişim gösterdiği tahmin edilmektedir (Barsanti ve Gualtieri, 2005).

2.3. Alglerin Evrimi

Algler ve karasal bitkiler arasındaki ilişki, filogenetik sınıflandırmanın henüz ortaya çıkmadığı zamanlardan beri bilinmektedir. Bulunan fosillerin morfolojik tanısı ve moleküler çalışmalardan elde edilen verilerin yardımıyla alglerle, karasal bitkilerin arasındaki evrimsel bağlantılar ortaya konulmuştur (Aktar ve Cebe, 2010).

Yapılan çalışmalara göre alglerin bir buçuk milyon yıl önce ortaya çıktığı düşünülmektedir ve karasal bitkilerin bu soydan ayrılması 425-490 milyon yıl önce gerçekleşmiştir. Suların çekildiği Siluriyen devrinin şartlarından dolayı, kıyılardaki alglerin kuru ortama ve diğer ekstrem şartlara dayanabilecek şekilde evrimleştiği düşünülmektedir. Gerçekleşen doğal seçilim, bitki evriminin yeni bir yol girmesine neden olmuştur (Aktar ve Cebe, 2010)

Prokaryotik siyanobakterilerin fosilleri, bazı bölgelerin çökeltilerinde bulunmuştur ve bu fosillerin yaklaşık 3,8 milyar yıl öncesine ait olduğu düşünülmektedir. Canlılığın başladığı tarihten bu yana, dünyanın oksijen ihtiyacını karşılayan fotosentezin gerçekleştiği bilinmektedir. Ökaryotik alglerin kökeni kesin olarak bilinmemekle birlikte, yaklaşık 2 milyar yıl önce ortaya çıkmış olabileceği düşünülmektedir (Richmond, 2013).

Ökaryotik alglerin tek bir soyu olmadığı ve bu nedenle alglerin tek bir monofiletik bir grubunun olmadığı bilinmektedir. Bununla birlikte, plastid yapısı ökaryotik algleri fotosentetik protistalardan ayırmaktadır ve alglerde bulunan plastid genomunun kökeni primer endosimbiyosis olarak adlandırılan olaya kadar uzanmaktadır. Primer endosimbiyosis, yaklaşık

2 milyar yıl önce fotosentetik olmayan bir ökaryotun siyanobakteriyi içine almasıyla başlamaktadır. Ökaryot canlı yuttuğu bu siyanobakteriyi sindirmek yerine bir nevi köle olarak kullanmaya başlamıştır. Zamanla bu köleleştirilmiş hücrenin konakçı içine yerleşmiş olabileceği ve bir kloroplasta dönüştüğü düşülmektedir (Richmond, 2013).

2.4. Alglerin Anatomik Yapıları

Alglerin yapısının, hayvan ve bitki hücrelerinden çok daha çeşitli olduğu bilinmektedir. Bu geniş filogenetik çeşitliliğini, çevreye olan adaptasyonları ve 3,5 milyar yıllık evrimsel değişimleri sağlamaktadır. Siyanobakteriler nispeten daha basit hücrelere sahiptir ve daha çok bakterilere benzemektedirler. Ökaryotik hücrelerin yapıları çok daha karmaşıktır, evrimsel tarihi yaklaşık 1,5-2 milyar yıl arasındadır ve bu yapılar alg sınıfları ve kendi içerisinde önemli ölçüde farklılık gösterir. Ökaryotlar çok sayıda organel içerir ve bunlar özelleşmeyi sağlayan önemli metabolik bölümlerdir. Ökaryotik alglerin bir çekirdeği ve genellikle bir veya daha fazla kloroplastları vardır; Ayrıca mitokondri, golgi cisimciği, endoplazmik retikulum gibi tipik ökaryotik organallere sahiptirler (Richmond, 2013).

2.4.1. Hücre duvarı

Alglerin hücre duvarı, sitoplazmayı tamamen saran ve turgor basıncının artmasına bağlı olarak hücrenin patlamasına engel olmayı sağlayan oldukça sağlam bir yapıdır. Hücre duvarının biyokimyasal yapısı alg grupları arasında farklılık göstermektedir. Siyanobakteriler, genellikle fibril tabakaları ile birlikte peptidoglikandan oluşan bir hücre duvarına sahiptirler. Yeşil Alglerde ise hücre duvarı selüloz, hemiselüloz, pektin içeren bileşikler ve glikoproteinden oluşur. Bu maddeler, hücrenin çoğu kısmını kapsayan fakat her tarafını sarmayan ince organik bir katmandır. Selülozik malzemeler, silikat cam veya kalsiyum karbonat kristalleri olabilmektedir. Öglenaların kabukları, kriptofitlerin periplastları ve birçok çeşitte müsilajlı salgılar gibi değişik şekilde hücre kaplamaları vardır (Richmond, 2013).

2.4.2. Hücre organelleri

Kloroplast, ökaryotik alglerin baskın organelidir ve tabaka benzeri tilakoidlerinde, zara bağlı fotosentez için ışık yakalayan pigmentler bulunmaktadır. Tilakoid düzenek alg grupları arasında tutarlıdır fakat şekilleri gruplar arasında farklılık gösterir ve sadece yeşil algler fotosentatlarını kloroplastları içinde depolar. Bu nedenle, yeşil alglerin plastidlerinin içinde nişasta taneciklerine rastlanır. Ancak diğer tüm alglerde karbonhidrat veya lipit depolaması plastidin dışındadır. Alglerde lipit birikimi çok yaygındır ve bu lipitlerin görünümleri genellikle

alglerin fizyolojik veya çevresel koşulları ile ilgilidir. Örneğin; hücreler yüksek ışık stresi veya besin eksikliği altındayken lipit cisimlerinin sayısı ve büyüklüğü artar (Ball, vd., 2011). Kloroplastın kendi deoksiribonükleik asidi (DNA) tipik olarak dairesel formdadır ve bununla birlikte bu DNA sadece az sayıda geni kodlar, çünkü çoğu gen çekirdekte kodlanmıştır (Richmond, 2013).

Alglerdeki mitokondrinin çeşitliliği hayvanlar ve bitkilerden daha fazladır. Yeşil ve kırmızı algler, bitki veya hayvanlarınki gibi yassılaşmış mitokondriyal kristaya sahiptir. Golgi cisimciği ve endoplazmik retikulum gibi organeller genellikle yapı olarak ökaryotlarınkiyle benzerdir. Algler bu organelleri organik silikat ve kalsiyum karbonat bileşiklerin yanı sıra flagella ve diğer yapıları üretmek için kullanırlar. Ökaryotik hücreler bir veya daha fazla tipte vakuol içerebilirler. Sert ve eksiksiz hücre duvarı bulunduran hücrelerin vakuolleri, tipik bitki vakuolüne az derecede benzer ve vakuol organizmal bütünlüğü koruyan pozitif bir ozmotik basıncın muhafaza edilmesi için işlev görür. Bazı algler, hücre elemanlarının parçalanmasından veya yeniden şekillendirilmesinden elde edilen yan ürünlerin depolanması için vakuolleri kullanır (Richmond, 2013).

Ökaryotik flagella, su içerisinde alglerin hareketini sağlayan bir hücre elemanıdır. Alglerde bulunan temel flagella yapısı değişkenlik gösterebilmektedir. Su içerisindeki bir algin flagellası hücre iskeletine büyük bir kuvvet uygular bu yüzden flagella hücreye çok sağlam bir şekilde bağlıdır. Flagella oluşturulurken birçok aşamadan geçer. Flagella ilk oluşturulduğunda olgunlaşmamış flagella olarak adlandırılır. Hücre bölündüğünde bu olgulaşmamış flagella geri çekilir ve yerini olgunlaşmış flagella alır. Bu süreç “flagellar dönüşüm” olarak adlandırılmaktadır. Alglerde flagella ile ilişki içerisinde olan göz lekeleri bulunur ve bu göz lekeleri ışığın yönünü tespit eder buna bağlı olarak flagella ile birlikte çalışarak fototaksis olayının gerçekleştirilmesini sağlar (Richmond, 2013).

2.5. Mikroalglerin Büyümesi Üzerine Etkili Olan Faktörler

Alglerin büyüme hızı fiziksel, kimyasal ve biyolojik faktörlerden etkilenir. Fiziksel faktörlerin en önemlileri ışık ve sıcaklık iken, kimyasal faktörlerin başında besinlerin bulunabilirliği ve karbondioksit konsantrasyonu gelmektedir. Biyolojik faktörlere ise, türler arasındaki rekabet ve virüs enfeksiyonları örnek olarak verilebilir (Larsdotter, 2006). Mikroalglerin büyümesi üzerine etkili olan faktörlerin başında besin elementlerinin varlığı ve bunların miktarları, sıcaklık, ışık ve pH değerleri gelmektedir (Çakmak, 2013). Çalışma faktörleri ise yukarıda belirtilen tüm faktörleri etkileyen bir faktördür ve biyoreaktör tasarımı,

karıştırma ve seyreltme oranı bu çalışma faktörlerine örnek olarak verilebilmektedir (Larsdotter, 2006).

2.5.1. Besin elementleri

Mikroalglerin fotootrofik üretimlerinde gerekli olan besinler makro elementler, mikro elementler ve vitaminlerdir. Alglerde en az 56 elementin var olduğu yapılan çalışmalar ile ortaya konulmuştur. Bu elementlerden Azot (N), Fosfor (P), Potasyum (K), Kükürt (S), Sodyum (Na), Magnezyum (Mg) ve Kalsiyum (Ca) gibi elementler çokça bulunmaktadır (Chisti, 2007).

Makro elementlerden biri olan azot, en fazla gereksinim duyulan element olup aminoasitler ve nükleik asitler dâhil birçok hücre bileşenin temelini oluşturur. Bu nedenle azot eksikliği, mikroalglerin gelişimlerini önemli ölçüde etkileyen bir faktördür. Çeşitli çalışmalardan elde edilen sonuçlar ışığında ise, yağların biyosentezi ve depolanması, azotun sınırlı olduğu ve hiç azot olmayan durumlarda başarılmıştır (Chisti, 2007). Mikroalgler azot kaynağı olarak nitrit, nitrat, amonyum ya da üreyi kullanırlar. Bu azot tuzlarının kullanımındaki öncelik sırası amonyum > üre > nitrat > nitrit şeklindedir (Elcik ve Çakmakçı, 2017).

Fosfor elementi, hücrede gerçekleşen metabolik reaksiyonlarda, mikroalglerin büyümesi ve gelişmesi için gerekli olan bazı yapısal ve fonksiyonel maddeleri oluşturmak üzere

önemli bir rol oynar. Fosfor, ortamda fosfor tuzları K2HPO4, KH2PO4, Na2HPO4.12H2O,

Na2HPO4.7H2O, NaH2PO4.7H2O şeklinde bulunmaktadır. Fosfor eksikliğinin, mikroalglerde lipit birikimini indüklediği bilinmektedir (Çakmak, 2013). Ayrıca fosfor, hücre gelişimi ve mikroalglerin metabolizmal reaksiyonları için gerekli bir makro elementtir. Enerji üretimi, hücre içi sinyal iletimi, fotosentez ve solunum reaksiyonları gibi metabolik reaksiyonlarda önemli rol oynamaktadır (Elcik ve Çakmakçı, 2017).

Kükürt, azot ile birlikte proteinlerin yapıtaşlarını oluşturur. Kükürt ayrıca tiamin ve biotin gibi vitaminlerin yapısında da bulunmaktadır. Canlı bir hücrede moleküler kükürt, organik kükürde çevrilir ve sülfat iyonu halinde hücrede yeniden kükürt bileşikleri üretebilmek üzere biriktirilir (Çakmak, 2013).

Potasyum, organizmalarda eriyebilir tuzlar şeklinde bulunur. Hücrelerin ozmotik basıncının düzenlenmesinde önemli görevi vardır ve özellikle erimiş halde K+ katyonu şeklinde bulunup turgor basıncının oluşturulmasını sağlar. Ayrıca solunum ve fotosentez enzimlerinin aktifleştirilmesinde de kofaktör olarak görev yapar (Çakmak, 2013).

Kalsiyum, Ca+2 iyonları şeklinde bulunup, hücre çeperinin üretim aşamalarında görev alır. Hücre zarının görevlerini yerine getirebilmesi için kalsiyum çok gereklidir ve canlının çevresel etkilere gösterdiği çeşitli tepkilerin oluşturulmasında sekonder haberci rolü oynadığı bilinmektedir (Çakmak, 2013).

Magnezyum, hücrelerde Mg+2 iyonları şeklinde solunum reaksiyonlarında, fotosentezde, DNA ve Ribonükleik asit (RNA) sentezlenmesinde görevli olan enzimlerin aktifleştirilmesinde kofaktör olarak görev almaktadır. Ayrıca magnezyumun, klorofil molekülünün yapısını oluşturan önemli bir element olduğu bilinmektedir (Çakmak, 2013).

2.5.2. Işık

Işık, fotosentetik organizmaların canlılığını sürdürmeleri için zorunlu olan bir faktördür. Fotosentetik büyüme, her bir hücrenin kullandığı ışık enerjisi ile doğru orantılı olduğundan, biyokütle üretim ve işlemlerinde ışığın en uygun düzeyde uygulanması gerekmektedir. Işık yoğunluğunun artması ile birlikte fotosentetik organizmaların büyüme hızları da artmaktadır. Ancak ışık yoğunluğu belirli bir düzeyin üzerine çıktığında ise büyüme sınırlanabilmektedir. Yüksek ışık etkisi uzun süre devam eder ise organizmanın fizyolojik dengesi bozulabilmekte hatta organizmada geri döndürülemez zararlar meydana gelebilmektedir (Richmond, 2013).

Fotosentetik mikroalgler, karbondioksit ve ışığı kullanarak fotosentez reaksiyonlarını gerçekleştirmektedir. Işık kaynağına bağlı olarak absorbe edilen enerjiyi, adenozintrifosfat (ATP) ve nikotinamid adenin dinükleotit fosfat (NADP) gibi kimyasal bileşenlere dönüştürürler. Fotosentez etkinliği, ışık spektrumuna göre farklılık göstermektedir. Mikroalgler genellikle, 400-700 nm dalga boyundaki ışığı kullanarak fotosentez reaksiyonlarını gerçekleştirirler. Absorbe edilen ışığın dalga boyu mikroalg türüne bağlı olarak değişkenlik göstermektedir. Örneğin; yeşil mikroalgler fotosentez sırasında klorofil pigmentleri ile en iyi 450-475 nm ve 630-675 nm aralığındaki ışığı absorbe etmektedir. Mikroalg kültürlerinde, ışığın hangi şiddet aralığında yeterli doygunluğa ulaştığı, ışık kullanım verimliliğinin belirlenmesinde dikkat edilmesi gereken bir faktördür. Genel olarak, birçok fotosentetik mikroorganizmanın doygunluğa ulaştığı aydınlatma düzeyi 200 µmol·m-2·s-1 olduğu rapor edilmiştir (Elcik ve Çakmakçı, 2017)

Mikroalgler, ışığı fotosistemlerindeki anten kompleksi olarak adlandırılan sistemler ile yakalamaktadırlar. Antenler, fotosentez reaksiyonlarının gerçekleşmesinde rol alan yapılardır. Bu antenler, fotonları tutarak reaksiyon merkezlerine göndermekle görevlidirler. Mikroalgler

farklı ışık konsantrasyonlarına adapte olabilmek için fotosistem sayılarında ve antenlerinin boyutlarında değişkenlik meydana getirebilirler. Kültür ortamları için kullanılan ışık kaynağı doğal ya da yapay olabilir. Laboratuar ortamında yapay aydınlatma olarak floresan lambalar kullanılmaktadır. Farklı türdeki floresan lambaların yaydıkları ışık miktarları da farklı olduğu için, kullanılan lambanın özelliklerine dikkat edilmelidir. Kullanılan ışığın kültür ortamına ısı yaymasından kaçınılmalıdır (Çakmak, 2013).

2.5.3. Sıcaklık

Sıcaklığın biyokimyasal reaksiyonlar üzerindeki etkisi onu, alglerin biyokimyasal bileşimini etkileyen en önemli çevresel faktörlerden biri haline getirmektedir. Büyüme sıcaklığını optimal seviyenin altına düşürmek, membran sistemlerindeki lipitlerin doymamışlık derecesini arttırmaktadır. Hücresel membranların, özellikle tilakoid membranların, artan stabilitesi ve akışkanlığı, fotosentetik canlıyı düşük sıcaklıklarda ortaya çıkan foton inhibisyondan korumaktadır (Richmond, 2013).

Büyüme sıcaklığının optimal değerin altına düşürülmesinin, fotosentez ve solunum oranlarını korumak için uyarlanabilir bir mekanizma olarak enzim üretiminin arttırılmasına neden olabileceği de tespit edilmiştir. Bunun yanında, düşük sıcaklıklar, aminoasitlerin ve aminoasit türevlerinin, uygun çözünen maddeler halinde hücre içerisinde birikimini indükler. Bu olay, mikroalglerin soğuğa duyarlılığına veya toleransına katkıda bulunabilir. Büyüme için optimal bir sıcaklık, minimum hücre büyüklüğüne, hücresel karbon ve azot içeriğine sahip alg hücrelerin oluşmasına yol açarken, optimal seviyenin altında veya üstünde bir sıcaklık, hücre hacminde ve biyokimyasal içerikte artışlara yol açabilmektedir (Richmond, 2013).

Doğada bulunan alglerden bazıları yüksek sıcaklıkta yaşayabilirken bazıları yüksek sıcaklıklarda canlılığını devam ettirememektedir. Bu nedenle üretimi yapılacak alg türünün gelişim gösterdiği optimum sıcaklık aralığına dikkat edilmelidir. Genel olarak mikroalg türlerinin kültür koşullarında 16-27°C arasındaki sıcaklık değerleri tercih edilmektedir. Zira 16°C’ den düşük sıcaklıklar üremeyi minimuma indirirken, 35°C’ den yüksek sıcaklıklar ise genellikle öldürücü etki göstermektedir (Çakmak, 2013).

2.5.4. pH değeri

pH değeri, mikroalglerin metabolik olaylarını gerçekleştirmesinde önemli olan bir faktördür. pH değeri, besin alınımı ile doğrudan ilişkilidir. Mikroalglerde biyokütle gelişimi, pH 10-11’ in üzerine çıktığında inhibe olmaktadır. Birçok alg türünün gelişimi için gereken

optimum pH değeri 7-9 arasındadır. Ancak, bazı türler asidik veya alkali şartlarda da optimum gelişim gösterebilirler. Mikroalgler fotosentez yaparak CO2’ i kullanırlar ve bu olay sonucunda ortamın pH’ ı yükselir. Yükselen pH’ ı kontrol etmek için hidroklorik asit veya asetik asit kullanılır. Asetik asit, aynı zamanda karbon kaynağı olarak mikroalglerin gelişimine katkı sağladığı için hidroklorik aside göre daha avantajlıdır (Elcik ve Çakmakçı, 2017).

2.5.5. Kültürlenme sistemleri

Mikroalglerin kültivasyonu için kullanılan iki ana sistem vardır. Bunlar kapalı ve açık sistemler olarak adlandırılmaktadır. Kapalı sistemler, büyüme koşullarının daha iyi kontrol edilmesine izin verirken, açık sistemler hava ile temas ettiğinden dış faktörlerden büyük ölçüde etkilenmektedir. Bununla birlikte, açık sistemlerin kurulumu ve işletilmesi kapalı sistemlere oranla daha basittir ve bu ekonomik nedenlerden dolayı açık sistemler daha çok tercih edilmektedir (Larsdotter, 2006).

Açık sistemler

Ticari olarak alg yetiştiriciliğinde, kültürleri karıştırmak için dönen kolu ve yuvarlak olukları olan bir havuz veya dairesel göletler kullanılır (Şekil 2.1). Oluklu havuzlar, kıvrımları olacak biçimde hazırlanır ve düşük kesme kuvvetine sahip kürek şeklindeki çarklar ile karıştırılır. Fakültatif havuzlar ise genellikle bir metreden daha derindir ve algler genellikle yüzeye yakın yerlerde bulunur, bunun sebebi havuzun dibinin anoksik olmasıdır. Öte yandan, yüksek oranlı alg havuzları bir metreden daha derindir ve hafifte olsa sürekli olarak karıştırıldığı için havuzun her yeri oksijen bakımından zengindir (Larsdotter, 2006).

Açık sistemlerde maliyeti en aza indirmek için mikroalglerin atmosferdeki karbondioksiti ve güneş ışığı kullanması sağlanmaktadır. Fakat güneş ışığının kalitesi veya mevsimsel farklılıklardan dolayı mikroalgler bu çevresel şartlardan olumsuz etkilenebilmektedirler. Çoğu açık havuz sistemlerinde ve oluklu kanallarda, mikroalglere yeterli güneş ışığı sağlamak için genellikle 0,2-0,3 m derinliği olan sistemler kurulur. Açık sistemlerde olukların sterilizasyonunu sağlamak imkânsız olduğu için mikrobiyal kontaminasyon engellenememektedir. Açık havuzlar ve oluklar, fotobiyoreaktörlere kıyasla bazı avantajlara sahip olsa da, genel olarak düşük verimlilikleri yüzünden de büyük bir dezavantaja sahiptir (Gong ve Jiang, 2011).

Kapalı sistemler

Fotobiyoraktörler, içerisinde fotootrofların yetiştirildiği veya bir fotobiyolojik reaksiyonun gerçekleştirilmesi için kullanılan reaktörlerdir. Günümüzde fotootrofik mikrobiyal biyokütlelerin ticari üretimi, açık havuzlarda yetiştirilebilen birkaç mikroalg türü ile sınırlıdır. Mikroalglerin çoğu, mantar, bakteri ve protozoa ile kontaminasyon riski ve inoküle edilen orijinal türden bağımsız olarak baskın olma eğiliminde olan diğer mikroalglerin rekabeti nedeniyle dış mekânda kurulan açık sistemlerde yeterince uzun süre korunamaz. Fotobiyoreaktörler, çevresel etkenlerden, rakip mikroorganizmaların istilasından korunabileceği, nispeten daha güvenli olan ve koşulların istenen türlerin baskınlığını sağlamak için daha iyi kontrol edilebileceği kapalı bir kültür ortamı sunmaktadır. Bu nedenle fotobiyoreaktörler, bilinen 50,000 den fazla mikroalg türünün kültürlenmesine izin veren sistemlerdir (Richmond, 2013).

Fotobiyoreaktörler, ışığın büyük bir kısmının doğrudan kültür yüzeyine çarpmadığı, ancak kültürde olan hücrelere ulaşmak için şeffaf bir biçimde tasarlanan reaktör duvarlarından geçmesi gereken fotootroflar için kullanılan kültür sistemleri olarak tanımlanabilir. Fotobiyoreaktörler, kültür ve atmosfer arasında doğrudan gazların ve diğer kirleticilerin geçişine izin vermez ve bunu gerçekleştirirken kültür ortamındaki biyokütle gelişimini sınırlandıran bir etki göstermez (Richmond, 2013). Kapalı fotobiyoreaktörler, yüksek biyokütle üretkenliği ve kültür koşullarının daha kolay kontrol edilmesi nedeniyle büyük ilgi görmüştür (Gong ve Jiang, 2011).

Farklı amaçlar için tasarlanmış çeşitli fotobiyoreaktörler bulunmaktadır. Kapalı fotobiyoreaktörler, kapalı kanallar ve tübüler reaktörler olmak üzere iki ana sınıfa ayrılabilir (Şekil 2.2 ve Şekil 2.3). Geniş aydınlatma yüzeyine sahip olan tübüler fotobiyoreaktörlerde düz plakalar, mikroalglerin dış mekânlarda kültürlenmeleri için daha uygundur. Tübüler fotobiyoreaktörler, mikroalg biyokütlelerinin büyük ölçekli endüstriyel üretimleri için uygun olan reaktörlerdir. İç mekânlarda kurulan kapalı fotobiyoreaktörlerde, doğal güneş ışığı ya da metal halojenür lambalar kullanılabilirken, dış mekânlarda kurulan fotobiyoreaktörlerde ise, doğal güneş ışığı ya da güneş enerjisini toplayan cihazlar kullanılır. Dış mekan fotobiyo reaktörlerindeki mikroalglerden optimum fotosentetik verim alabilmek ve kültür ortamının karıştırılmasını sağlayabilmek için hava pompaları veya mekanik pompalar kullanılmaktadır.

Fotobiyoreaktörlerin üretkenlikleri, ışık ve CO2 kaynaklarından, sıcaklık değişimlerinden, pH' dan, çözünmüş O2 kültür seviyelerinden ve seçilen mikroalg türlerinin performansından

etkilenir. Biyokütle ölçümleri veya büyüme hızı değerlendirmeleri, fotobiyoreaktörlerin potansiyelini ve alg suşlarının performansını değerlendirmede kritik öneme sahiptir. Mikroalglerin büyüme hızı, ortalama aydınlatma süresi, ışık doygunluğu sabiti ve biyokütle konsantrasyonundan etkilenebilmektedir. Optimal kültür koşullarında mikroalglerden yüksek verimlilik sağlanabilir. Taşıtların yakıt ihtiyacını karşılayabilmek için büyük ölçekli biyodizel üretimi, uygun kültür sistemleri tarafından yeterli biyokütle üretimi ile sağlanabilecektir (Gong ve Jiang, 2011).

Açık havuzların aksine, fotobiyoreaktörler düşük kirlenme, yüksek verimlilik, minimum buharlaşma, ulaşılabilir yüksek mikroalg yoğunlukları veya biyokütle konsantrasyonları, düşük

CO2 kayıpları ve kültür koşulları üzerinde daha iyi kontrol avantajlarına sahiptir. Fotobiyoreaktörlerin en büyük dezavantajı kurulumu, işletme ve bakım maliyetlerinin yüksek olmasıdır. Bunlar daha yüksek üretkenlik ile kısmen telafi edilebilse de, maliyetli olması biyodizel üretimi için gerekli olan ölçekte mikroalg biyokütlesinin etkin üretimini sınırlandırmaktadır (Gong ve Jiang, 2011).

Şekil 2.1. Açık havuz sistemi (http://www.isfikirleri-girisimcilik.com/alg-ciftligini-az- sermayeyle-kurabilirsiniz).

Şekil 2.2. Tübüler fotobiyoreaktör (http://algler.biyokimyalab.org/kultur-sistemleri/).

Şekil 2.3. Kapalı fotobiyoreaktör (http://docplayer.biz.tr/47567865-Sifir-karbon-bgnalara- ulagmada-anahtar-bgr-cephe-onergsg.html).

Dönen algal biyofilm reaktörü (RABR)

Dönen algal biyofilm reaktörü (RABR), kısmen suyun içine batan bir silindir ve bu silindirin dışına tutturulmuş kaplama materyalinden oluşan biyofilm bazlı bir reaktör sistemidir (Şekil 2.4). Dönen algal biyofilm reaktörü, mikroalgal biyokütleyi hem suyun içine hem de dışına doğru döndürerek ışığa ve besin kaynağına eşit oranda maruz kalmasını sağlar ve hem alglerden hem de bakterilerden oluşan alg bazlı fotosentetik bir biyofilm üretir. Diğer biyofilm sistemlerine kıyasla bu reaktör, polimer, sedimantasyon ve santrifüjleme ihtiyacını ortadan kaldırarak ek faydalar sağlar ve bu nedenle, geleneksel büyüme sistemlerindeki gibi maliyetli hasat işlemlerini minimuma indirir. Hasat edilen biyofilmlerden biyoplastik, biyoyakıt, değerli farmasötik bileşikler ve zengin besi değeri olan hayvan yemleri gibi maddeler üretilebilir (Fica

ve Sims, 2016). Dönen algal biyofilm reaktörü, yüksek biyokütle üretimi, kolay hasat ve gelişmiş ışık kullanımı da dâhil olmak üzere geleneksel açık havuzlara ve fotobiyoreaktörlere oranla daha fazla avantajlara sahip olduğu bilinmektedir (Gross ve Wen, 2014).

Dönen algal biyofilm reaktörünün eşsiz geometrisi, kanal havuzlarına kıyasla mekân kullanımlarını sınırlandırmaz. Kanallı havuzlarda, alan sadece iki boyutlu olarak kullanılabilir, çünkü göletin derinliği nüfuz oranın hafifletilmesi için sığ olmalıdır. Dönen algal biyofilm reaktörleri ise dikey olarak mikroalg üretebilir ve bu üç boyutlu olabilme özelliği, alan kullanımı büyük ölçüde arttırır. Bu üç boyutlu olma özelliği, alanın sınırlı olduğu bölgelerde ekim yapılırken büyük avantaj sağlar (Gross, vd., 2015). Bu çalışmada, yapılan tüm araştırmaların ışığında, dönen algal biyofilm reaktörünü (RABR) laboratuar ortamına göre modifiye ederek, lipit birikim oranlarının üzerine etkisi araştırılmıştır.

Şekil 2.4. Dönen Algal biyofilm reaktörü (http://hardnewscafe.usu.edu/?attachment_id=8006).

2.6. Mikroalglerin Fotosentez Tepkimeleri

Fotosentez, güneş ışığının enerji dönüşümünü temsil eden bir olaydır. Bu işlemde, fotoototroflar tarafından güneş ışığı ve inorganik bileşikler kullanılarak, organik maddeler üretilmektedir. Dünyadaki tüm yaşam formları, metabolizmaları ve büyüme reaksiyonlarının gerçekleşebilmesi için doğrudan ya da dolaylı olarak fotosenteze ihtiyaç duyarlar (Richmond, 2013).

Ökaryotik ototrof mikroalgler, içerdikleri ışık yakalayan fotosentetik pigmentlerine göre ayrılmaktadır; Rhodophyta (kırmızı alg), Chrysophyceae (altın alg), Phaeophyceae (kahverengi alg) ve Chlorophyta (yeşil alg). Bu fotosentetik pigmentleri, kloroplast adı verilen özelleşmiş organellerinin içindeki tilakoid zarlarda ve kloroplastların sıvı fazı olan stromasında bulunabilir (Richmond, 2013).

Oksijenik fotosentez, karbondioksitin ve suyun karbonhidrata dönüştürülmesi için klorofil tarafından absorbe edilen ışığında yardımcı olduğu bir redoks tepkimesi olarak isimlendirilebilmektedir. Fotosentez temel olarak, ışığa bağımlı reaksiyonlar ve ışıktan bağımsız reaksiyonlar olmak üzere iki aşamada gerçekleşir. Işığa bağımlı reaksiyonlarda fotosentetik membranlar ışık enerjisini, Nikotinamid adenin dinükleotit fosfat hidrojen (NADPH) ve yüksek enerjili bir bileşik olan Adenozin trifosfata (ATP) dönüştürür. Stromada gerçekleşen ışıktan bağımsız reaksiyonlarda ise, karbondioksitin karbonhidratlara indirgenmesinde ışığa bağımlı reaksiyonlarda üretilen ATP ve NADPH kullanılır (Richmond, 2013).

Fotosentezdeki enerji ışıktan karşılanır. Günümüzde yapılan çalışmalarla ışığın foton adı verilen paketler halinde yayıldığı bilinmektedir. Fotosentetik pigmentler, fotonlarda bulunan bu enerjiyi absorbe eder ve fotokimyasal reaksiyonların gerçekleştiği merkezlerine aktarır. Fotondaki elektronları klorofil pigmentinden ayırmak ve yük ayrılmasını başlatabilmek için bir miktar enerjiye ihtiyaç vardır (Richmond, 2013).

Görünen ışığın dalga boyu, 380 nm mavi-mor renkten, 750 nm’ deki kırmızı renge kadar değişmektedir (Şekil 2.5). Enerji, dalga boyuyla ters orantılı olduğundan mavi ışığın bir fotonu, kırmızı ışıktaki bir fotondan daha fazla enerjiye sahiptir (Richmond, 2013). Bu yüzden fotosentetik etkinliğin, ışığın dalga boyuyla ilişkisinin olduğu söylenebilmektedir. Mikroalgler fotosentez için genellikle 400-700 nm dalga boyundaki ışığı kullanırlar ve bu absorbe edilen ışığın dalga boyu mikroalglerin türüne göre farklılık gösterebilmektedir (Elcik ve Çakmakçı, 2017).

Şekil 2.5. Görünür ışık (http://www.biyolojiportali.com/konu-anlatimi/8/18/Fotosentezin- Canlilar-Icin-Onemi-Gerceklestirdigi-Yapilar-ve-Isik).

Tüm fotosentetik organizmalar, ışık enerjisini absorbe edebilmek için organik pigmentlere ihtiyaç duyar. Organik pigmentler klorofil, karotenoid ve fikobilinler olmak üzere üç ana sınıfta incelemektedir. Klorofiller (yeşil renkli pigment) ve Karotenoidler (sarı ve turuncu renkli pigmentler) lipofilik iken, fikobilinler hidrofilik özelliktedir (Richmond, 2013).

Klorofil molekülü, merkezinde bir Mg atomu bulunduran tetrapirol bir halkadan ve uzun zincirli alkolden oluşur. Yapısal olarak birbirinden farklı a, b, c, d olarak adlandırılan klorofil çeşitleri vardır. Tüm klorofil çeşitleri, mavi veya mavi-yeşil (450–475 nm) ve kırmızı (630–675 nm) dalga boyundaki ışığı absorbe ederler. Klorofil-a, tüm fotootroflarda ortada ve reaksiyon merkezindeki kompleks moleküllerin bir parçası olarak bulunmaktadır. Işığın yakalandığı reaksiyonlarda ise klorofil-b veya c görev almaktadır. Anten pigmentleri olan klorofil-b, c veya d ışığın absorbsiyon aralığının genişletilmesinde görevlidir (Richmond, 2013). Klorofillerin ve karotenoidlerin miktar tayini metanol, etanol gibi organik çözücüler içerisinde ekstrakte edilerek yapılabilmektedir. Ekstraktın absorbansı spektrofotomerik olarak belirlenebilmekte ve belirli matematiksel formüller kullanarak hesaplanabilmektedir (Lichtenthaler ve Wellburn, 1983).

Fotosentezin ışığa bağımlı reaksiyonları kloroplastların tilakoid zarlarında gerçekleşir. Yüksek bitkilerin kloroplastlarında, grana adı verilen üst üste istiflenmiş tilakoid zarlar bulunur ve bu granalar stromal lamella adı verilen köprülerle birbirine bağlıdır. Buna karşılık çoğu alg suşunda tilakoidler üçlü paketler halinde dizilenmiştir. Bu tilakoid zarlar beş ana kompleks yapı

içermektedir. Bu yapılar, ışığı toplayan anten kompleksi, fotosistem II (PS II) ve fotosistem I

(PS I), sitokrom b6/f, fotosentetik elektron taşınmasını ve fotofosforilasyonu sağlayan ATPsentaz pompasıdır (Richmond, 2013).

Işığa bağımlı reaksiyonlarının fotosentezdeki asıl görevi, karbon asimilasyonu için gerekli biyokimyasal indikatör olan NADPH ve ATP’ nin üretilmesini sağlamaktır. Işığa bağımlı reaksiyonlarda ışık, PSI ve PSII olarak isimlendirilen pigment-protein kompleksi olan sistem tarafından tutulur. Bu fotosistemler, Z şeklinde tasarlanmış bir elektron taşıma sistemi zinciriyle birlikte çalışır. Işığın tutulmasının ardından tilakoid boşlukta H2O parçalanır, sudan gelen 2 elektron ve hidrojenler sayesinde NAPDH üretilir. Aynı zamanda bir taraftan tilakoid boşlukta bir pH gradiyenti oluşturabilmek için protonlar pompalanır. Kemiozmotik hipoteze göre ATPsentaz pompası olarak adlandırılan yapı kullanılarak, pompalanan protonlar sayesinde ATP üretir (Richmond, 2013).

Işıktan bağımsız evre reaksiyonlarında CO2’ nin asimilasyonu için, iki molekül NADPH ve üç molekül ATP gerekmektedir. Karbon fiksasyonun reaksiyon mekanizması Calvin ve

Benson tarafından 1940’ larda keşfedilmiştir ve CO2’ in şekere dönüşümün dört ayrı aşamada gerçekleştiğini açıklamışlardır. Karbondioksit ilk olarak Rubisko adı verilen bir enzimle katalize edilir ve bunun sonucunda oluşan 6 C kararsız ara bileşikten karbon eksiltmek için iki aşamada da NAPDH ve ATP kullanılarak gliseraldehit (PGAL) oluşturulur. Oluşturulan bu molekülün bir kısmı sirkülasyonun devam edebilmesi için ribulozbifosfat’ a dönüştürülür ve bu dönüşüm olaylarının her bir basamağı birer enzimatik reaksiyon dizisidir. Bu aşamanın sonucunda üretilen birincil ürün karbonhidratlar olarak kabul edilir ancak yağ asitleri, aminoasitler ve organik asitler de fotosentezin CO2 fiksasyonunda sentezlenir (Richmond, 2013).

Yağ asitlerinin ve triaçilgliserollerin sentezinin gerçekleşmesi, fotosentezdeki karbon yakalama reaksiyonlarıyla gerçekleşmektedir. Bu reaksiyonun gerçekleşme süreçleri, bir organizma için yağ asitleri öncüllerinin bulunmasını, dolayısıyla triaçilgliserollerin üretilme ve depolama özelliklerini değiştirebilmektedir. Yağ asitlerinin üretilmesi Asetil CoA’ nın karboksilasyonu ile başlar ve Asetil CoA karboksilaz olarak adlandırılan bir enzim tarafından katalize edilir. Malonil CoA oluşabilmesi içinde bir molekül ATP harcanır. Daha sonra üretilen Malonil CoA, bir taşıyıcı açil proteine transfer edilir, bu döngünün sürekli olarak gerçekleşmesiyle açil protein zinciri uzar ve kloroplasttan çıkar. Bu olay sonucunda üretilen yağ asitleri kloroplastı terk ettikten sonra tekrar Asetil CoA olarak endoplazmik retikuluma girer. Burada farklı lipitlere dönüşmeden önce bazı işlemlere tabi tutulurlar. İşlemler sona erdiğinde

üretilen yağ asitleri istenilen lipitlere dönüştürülür ya da lipitlere dönüştürülünceye kadar burada depolanır. Hücreler triaçilgliserolleri çoğunlukla enerji rezervuarları olarak ya da yapı taşları olarak kullanmak için depolar ve enerjiye ihtiyaç duyduğunda ya da membran yapısını yenilemek istediğinde bu molekülleri kullanır (Schuhman, vd., 2014).

Mikroalglerdeki triaçilgliseroller, transesterifikasyon yoluyla kolayca biyodizele dönüşebilme özelliğine sahiptir. Mevcut tarımsal ürünlerden elde edilen hasat dışında yüksek miktarda organik karbon üretebilecek yeni teknolojiler geliştirilmeye çalışılmaktadır. Büyük ölçekli mikroalglerin kültivasyonu, diğer biyoyakıt üretilen ürünlerden, 10-20 kat daha verimli olabilme potansiyeline sahiptir. Fotosentez ise CO2’ i yüksek enerji içeriğine sahip organik bileşiklere dönüştürülebilen ve böylece sürdürülebilir bir biyodizel üretimi için kaynak sağlayabilecek tek işlem olarak kabul edilmektedir (Sharma, vd., 2012).

2.7. Alglerin Lipit Üretim Mekanizmaları ve Lipit Kompozisyonu

Mikroalglerde fotosentez, bitkilere çok benzerdir ancak mikroalglerin daha yüksek fotosentez hızı ve daha hızlı büyüme oranları vardır. Buna bağlı olarak bitkilere göre daha yüksek miktarlarda lipit biriktirilebilirler (Gour, vd., 2016). Mikroalglerde üretilen lipitler, temel olarak doymuş yağ asitlerinden oluşan polar olmayan lipitler ve yapısal polar lipitler olmak üzere iki kategoride incelenebilmektedir (Luna, 2016). Besin yoksunluğu gibi stres koşulları altında birçok mikroalg türü, önceden oluşturulmuş membran lipitlerini ve yağ asitlerini, membran lipitlerinden, triaçilgliserollere dönüştürerek büyük miktarda lipit birikimini sağlayabilmektedir. Çoğu ökaryotik hücrede, depolanmış lipitler, basit yağ damlacıkları olarak depolanır (Xu, vd., 2016). Depolanan lipitler, ağırlıklı olarak doymuş yağ asitlerinden ve biyodizel yapımında transesterifikasyon işlemine tabi tutulabilen bazı doymamış yağ asitlerinden (TAG) oluşur. Yapısal lipitler ise suda yaşayan hayvanlar ve insanlar için gerekli olan doymamış yağ asitleri içeren lipitlerdir. Polar lipitler ve steroller, hücre ve organeller için seçici geçirgen özellik gösteren zarın yapısına katılırlar (Sharma, vd., 2012).

Mikroalglerin birçoğu, ortam koşullarının değişikliliğine cevap olarak lipit metabolizmasını etkili bir şekilde değiştirebilmektedir. Olumsuz çevre koşulları ya da stres altındayken mikroalgler kuru ağırlıklarının yaklaşık %20-50 kadarında triaçilgliserol formunda nötral lipit biriktirerek, bu koşullara dayanıklılığını arttırmaktadır. Stres koşullarında üretilen bu lipitler, biyodizel üretimi için uygundur. TAG’ ların oluşumu ve içeriği, mikroalglerin türüne özgüdür (Sharma, vd., 2012).

Çoğu mikroalgde lipit, çoğunlukla doymuş ve tekli doymamış C14-C20 yağ asitlerinden oluşur, bu nedenle lipit bazlı biyodizel üretimi için umut verici bir alternatif kaynak olarak kabul edilmektedir. Mikroalglerde biyodizel üretiminde kullanılan lipitlerin sentez yolları, yağ asidi sentaz (FAS) ve triasilgliserol (TAG) biyosentez yoluna dayanır. Genel olarak, yağ asidi sentaz enzim kompleksi, lipit bazlı biyodizel üretimi için doymuş yağ asitlerini (SFA) sentezler. Son yıllarda, yağ asidi ve TAG biyosentezi yolunda yer alan çeşitli anahtar enzimler ve fonksiyonel alanlar tanımlanmış ve spesifik lipit içeriğini arttırmak için genetik mühendisliğin yaklaşımlarıyla lipit üretimin indüklenebilmesi için bir potansiyel olarak görülmeye başlanmıştır. Bu nedenle, herhangi bir metabolik mühendislik stratejisi tasarlanmadan önce, belirli mikroalg türlerinde aktif olan biyosentetik yolun tipini belirlemek gereklidir (Sun, vd., 2018).

Doymuş ve tekli doymamış yağ asitleri (C12: 0, C14: 0, C16: 0, C16: 1, C18: 0 ve C18: 1) biyodizel üretimi için en uygun yağ asitleridir. Mikroalgler C14: 0, C16: 0 ve C18: 0 da dâhil olmak üzere doymuş yağ asitlerini sentezlemek için asetil-CoA karboksilaz (ACCase) ve tip II yağ asidi sentazı kullanabilmektedir (Sun, vd., 2018). Alglerin kloroplastlarındaki yağ asitleri, tip II yağ asidi sentaz tarafından sentezlenir. Malonil CoA, yağ asidi biyosentezi sırasında metabolik bir iskele görevi gören açil taşıyıcı protein (ACP) üzerine yüklenir ve ve ilk önce apo-ACP’ yi holo formuna dönüştüren bir fosfopantetiniltransferaz (PPTase) tarafından translasyon sonrası modifikasyona tabi tutulur. Bu modifikasyonun sonucunda oluşan “kol” yağ asidi biyosentezi boyunca büyüyen yağ asidini tioester bağı ile bağlar. ß-ketoaçil –ACP sentaz III, açil-ACP üzerinde, ß-keton uzatılmış 2-karbon birimi oluşturabilmek için asetil-CoA’ yı malonil-ACP ile yoğunlaştırır. Bu daha sonra ketoredüktaz (KR), dehidrataz (DH) ve enoilredüktaz (ER) enzimleriyle doymuş metilen birimlerine tamamen indirgenir. Bu döngü C4- C16’ yı uzatan KASI ve C16’ dan C18’ i oluşturan KASII ile yedi kez tekrar eder. Olgun bir yağ asidi istenilen uzunluğuna ulaştığında, ya membran lipitlerine aktarılmak üzere açil- transferaz (AT) üzerindeki gliserol-3-fosfat’ a prokaryotik yol vasıtasıyla iletilir ya da ökaryotik yol vasıtasıyla yağ asidini FAS’ tan plastide göndermek için tioesteraz bölgesinin etkisiyle sitozole aktarılırlar. Bitkilerde, yağ asitleri tioesterazlar tarafından ACP’ den hidrolize edildikten sonra, plastid zarfın içine yayılırlar ve bir CoA ligaz enzimi tarafından koenzim A ile esterlenirler, buradaki yağ açil-CoA, membran fosfolipidleri ve depolama trigliseritleri içeren hücresel lipitlere dâhil olmak için kloroplasttan ayrılır (Blatti, vd., 2013).

Yağ asitleri kloroplastın dışına taşındıktan sonra bir açil-CoA sentetaz tarafından tekrar CoA’ ya transfer edilir ve endoplazmik retikuluma girer. Burada TAG, fosfatidilkolin ve

fosfatidiletanolamin de dâhil olmak üzere gliserollü lipitlerinin biyosentezi için merkezi metabolit olan fosfatidik asidi vermek üzere gliserol-3-fosfata aktarılmadan önce, daha fazla uzama ve desatürasyon gibi çeşitli modifikasyonlara maruz kalabilirler. Bu ürünler, açil transferazların etkisiyle açil kısımlarını değiştirebilir, böylece gliserollü lipitlerin çeşitliliğini arttırabilir ve hücrenin yağ asitlerini depo lipitlerinin üretimi için membranlardan geri dönüştürmesini sağlayabilir. Triaçilgliseroller hücre tarafından ihtiyaç duyulana kadar bir enerji ve yağ asidi kaynağı olarak depolandıkları lipit cisimlerine veya damlacıklarına taşınırlar (Şekil 2.6) (Schuhmann, vd., 2014).

Bitkilerdeki tioesterazlar (TE), prokaryotik ve ökaryotik lipit sonlandırma yolları arasındaki karbon akışını belirler ve lipit biyosentezinde metabolik bir bekçi görevi görür. Bitkilerdeki bu enzimlerin benzerleri mikroalglerde de tanımlanmıştır ve bu nedenle mikroalglerin de iki yol arasında yaptıkları ayrımın, bitkiler ile benzer bir mekanizma olması muhtemeldir. TE, fonksiyonel olarak yağ asidi kimliğini belirlediğinden ve bitkilerde yağ asidi bileşimini modifiye etmek için kullanıldığından, alg suşlarında gelişmiş biyodizel kalitesi için algal yağ asidi zincir uzunluğunu tasarlama çabalarında ön plandadır (Blatti, vd., 2013).

Laboratuar koşullarında veya dış ortamda mikroalg yetiştirebilmek ve yüksek lipit içeriği elde edebilmek için, dış stres koşullarına ve lipit indüksiyon tekniklerinin uygulanmasına ihtiyaç vardır. Lipit ve yağ asitleri bileşimindeki önemli değişikliklerin eşlik ettiği büyük miktarlarda TAG’ ların sentezi ve birikmesi, tek tek veya kombinasyon halinde tasarlanan kimyasal veya fiziksel çevresel uyaranların dayattığı stres koşulları altında gerçekleşebilmektedir. Mikroalglerde lipit indüksiyon teknikleri üzerinde azot veya fosfor açlığı, ışık, pH, sıcaklık, ağır metaller ve diğer kimyasallar dâhil olmak üzere besin stresinin kullanılması gibi çok çeşitli çalışmalar yapılmıştır (Sharma, vd., 2012).

Şekil 2.6. Mikroalglerde lipit biyosentezinin basit bir şeması (https://www.research gate.net/figure/A-simplified-scheme-proposed-for-the-lipid-biosynthesis-pathway-in-themicro algae_fig4_235396878).

2.8. Alglerin Lipit Üretim Mekanizmalarını İndükleyen Stres Koşulları ve Verdikleri Cevaplar

Mikroalglerin biyokütle olarak arttırılması için, sıcaklık, ışık yoğunluğu, pH gibi çeşitli çevresel koşulların optimum hale getirilmesi gerekmekteyken, mikroalglerde lipit üretiminin arttırılması için azot, fosfat, sıcaklık, tuzluluk, pH ve ağır metaller gibi stres koşullarının yaratılması gerekmektedir (Wong, vd., 2016).

2.8.1. Azot stresi

Azot, klorofil ve protein sentezi için gerekli olan ana bileşendir (Wong, vd., 2016). Azot sınırlaması, lipit içeriğinin arttırılması için en sık kullanılan yöntemdir, çünkü ucuz, kullanımı kolaydır ve birçok türdeki lipit içeriği üzerinde güvenilir ve güçlü bir etkiye sahiptir (Griffiths, vd., 2011). Azot mikroalglerde, lipit metabolizmasını etkileyen en kritik besin maddesidir (Wong, vd., 2016). Azot eksikliği, düşük biyokütle verimliliği ve fotosentez oranı

ile ilişkilidir. Çeşitli mikroalglerin sayısız türünde veya suşunda, azot eksikliğine cevap olarak lipitlerin, özellikle TAG’ ın birikmesine yönelik bir eğilim söz konudur (Sharma, vd., 2012).

Besinlerin sınırlı olduğu çevresel stres koşullarında, sürekli olarak azalan bir hücre bölünme oranı gözlenmektedir (Sharma, vd., 2012). Biyokütle verimliliğinin azalması konusunda endişeler hala devam etse de kültürlerdeki azot eksikliği, ekonomik olarak lipit üretiminin arttırılması için uygulanabilecek tek ve etkili yöntem olarak kabul edilebilmektedir (Concas vd., 2016). Alglerin büyümesi yavaşladığında yani membran bileşiklerinin sentezi için lipit gereksinimi olmadığında, hücreler yağ asitlerini TAG’ a yönlendirir ve TAG olarak biriktirir. Stres koşulları altında üretilen TAG molekülünün hücreyi koruyucu işlevi olabilmektedir. Normal büyüme koşulları altında, fotosentez tarafından üretilen ATP ve NADPH, biyokütle üretmek için tüketilir ve tepkimeler sonucunda üretilen ADP ve NADP sonunda fotosentezde alıcı moleküller olarak tekrar tekrar kullanılabilir hale gelmektedir. Besin eksikliği nedeniyle hücre büyümesi ve çoğalması bozulunca, fotosentez havuzunda bulunan ve ana elektron alıcısı olan NADP molekülü tükenebilir. Fotosentez ışık tarafından kontrol edildiğinden ve istenildiği zaman kapatılamadığından bu olay, hücre bileşenleri için zarar verici bir olaya sebebiyet verebilmektedir. NADPH, yağ asidi biyosentezinde tüketilir ve bu nedenle artan yağ asidi miktarı, büyüme sınırlayıcı koşullar altında NADP havuzunu tekrar doldurmaktadır (Sharma, vd., 2012). TAG, enerji ve karbon için bir depolama bileşeni olarak işlev görür, ancak ek olarak yapısına, fotosentetik olarak türetilen elektronları dâhil ederek hücreyi fotooksidatif hasara karşı korumaktadır (Breuer, vd., 2013).

Mikroalgler, optimum koşullarda çok düşük miktarda TAG üretirler ancak azot açlığına maruz bırakıldıklarında TAG üretimi büyük ölçüde indüklenebilir ve kuru ağırlığın %40’ ına kadar ulaşabilmektedir (Breuer, vd., 2013). Griffiths ve arkadaşlarının yapmış olduğu çalışmalarda Chlorophyta içerisinde bulunan Scenedesmus ve Chlorella vulgaris’ in azot sınırlamasına yanıt olarak lipit içeriğinde en büyük artışı gösterdiğini rapor etmiştir (Griffiths, vd., 2011). Ayrıca diğer çalışmalarda, azot sınırlayıcı koşullar altında yüksek üretkenliği olan bir türün dikkatlice seçilmesi, orta düzeyde azot stres seviyesinin, azot sınırlandırması işlemlerinde başarıyla kullanılabileceği rapor edilmiştir (Rodolfi vd., 2009; Stephenson, vd., 2010; Hsieh ve Wu, 2009; Takagi, vd., 2000).

2.8.2. Fosfor stresi

Alglerin için esansiyel bir besin maddesi olan fosfor, mikroalglerin büyümesinde önemli bir rol oynar ve ayrıca hücrelerde enerji transferi, nükleik asit biyosentezi, fosfolipit

biyosentezi ve membran gelişimi gibi birçok metabolik süreçlerde görev alan bir maddedir (Paliwal, vd., 2017). Fosfor sınırlamasının, mikroalglerde lipit birikimini indükleyen bir stres koşulu olduğu bilinmektedir (Cheng ve He, 2014). Örneğin; Scenedesmus sp. üzerinde yapılan bir çalışmada, fosfor sınırlandırmasının lipit içeriğini %53’ e kadar çıkardığı rapor edilmiştir (Xin, vd., 2010).

2.8.3. Işık stresi

Mikroalgler farklı ışık konsantrasyonlarında kimyasal bileşenlerinde kayda değer farklılıklar göstermektedir. Düşük ışık miktarında çoklu yapısal lipitlerden olan doymamış yağ asitlerinin miktarı artarken, yüksek ışık miktarlarında deposal lipitlerden doymuş yağ asitleri ve tekli doymamış yağ asitlerinin miktarları artmaktadır. Doymuş ve tekli yağ asitleri, biyodizel eldesi için uygun yağ asitleri olduğundan yüksek ışık stresi mikroalglerde lipit birikimini arttırmak için uygulanabilen çevresel stres koşullarındandır (Cheng ve He, 2014).

2.8.4. Sıcaklık stresi

Mikroalglerin yaşaması için gerekli olan sıcaklık aralığı türe göre değişkenlik gösterse de, genel olarak gelişim gösterdikleri optimum sıcaklık aralığı 20-30oC’ dir. Sıcaklık mikroalglerin yaşayabileceği optimum aralıkta olduğunda, kültür ortamında yüksek biyokütle verimliliğine sebep olur. Sıcaklık optimum değerlerin üzerine çıktığında ise zarar verici düzeyde biyokütlelerin ölümüne sebebiyet verebilmektedir (Cheng ve Hu, 2014).

Sıcaklık mikroalglerde üretilen lipit içeriğini etkileyen bir faktördür (Cheng ve He, 2014). Mikroalglerin birçoğunda sıcaklık azaldıkça polar lipit üretiminin arttığı, sıcaklık azaldığında ise polar olmayan lipitlerin yani TAG’ ın üretiminin arttığı gözlenmektedir (Paliwal, vd., 2017). Bu nedenle, uygun derecedeki yüksek bir sıcaklık, yüksek miktarda ve yüksek kalitede lipit üretimine teşvik ettiğinden biyodizel üretimi için kullanılabilir çevresel stres koşullarından biri olabilmektedir (Cheng ve He, 2014).

2.8.5. Tuz stresi

Pek çok mikroalg türü, tuzluluk veya ozmotik basıncın artışına yanıt olarak osmoregülatör maddeler ya da ozmotik maddeler oluşturmak üzere birçok küçük maddeler biriktirme kabiliyetine sahiptir (Richmond, 2013). Tuzluluk aynı zamanda, istenilen miktarda olmasa da lipit biyosentezini arttıran bir faktör olarak kabul edilebilmektedir. Yüksek tuz konsantrasyonlarını tolere edebilen mikroalgler, tuzluluğun lipit biyosentezi üzerine etkisinin

incelenmesi için kullanılabilecek mikroalglerdendir (Paliwal vd., 2017). Örneğin; Scenedesmus sp. tuz stresi altındayken çoğu nötral lipit olmak üzere %24,77 oranında lipit biriktirdiği rapor edilmiştir (Pancha vd., 2015). Ayrıca tuz stresi mikroalg hücrelerindeki lipit içeriğini ve bileşimini etkileyebilen bir faktördür. Yüksek tuzluluk yağ asitlerinin doygunluğunu indüklediği için biyodizel verimliliğini arttırmada kullanılabilmektedir (Cheng ve He, 2014).

2.8.6. Mikroalglerin biyofilm formasyonu

Biyofilm, mikroorganizmaların birlikte oluşturdukları bir yaşam formu olarak tanımlanabilmektedir. Bu mikroorganizmalar hücre dışı polimerik maddelerle (EPS) substrata gömülürler ve katı yüzeylerde geliştirilebilen karmaşık bir yapıyı oluştururlar (Mantzorou, vd., 2018). Yapılan çalışmaların sınırlı olmasına rağmen, bulunan en eski biyofilm fosili 3,5 milyar yıl öncesine ait olduğu bilinmektedir (Roeselers, vd., 2008). Bununla birlikte bir çalışmada, hücre dışı matrisle çevrilmiş ve bir sıvı ortam ile temas halinde olan bir substrata tutturulmuş bu koalisyon için biyofilm terimini kullanmışlardır (Polizzi, vd., 2017). Biyofilmler, doğada bulunan hemen hemen her sıvı-katı yüzeylerde oluşabilir ve ekosistemlerin işleyişinde çok önemli bir rol oynamaktadır. Doğadaki besin döngüsüne ve enerji akışına önemli ölçüde katkıda bulunmaktadır (Şekil 2.7) (Mantzorou ve Ververidis, 2019).

Şekil 2.7. Mikroalglerin biyofilm oluşturma şekilleri (Mantzorou ve Ververidis, 2019).

Mikroalg biyofilmleri, mikroalg ve bakterilerden oluşan özel bir yapıyı kapsamaktadır. Ayrıca mikroalglerin biyofilmleri, mikroalgleri (Siyanobakteriler dâhil) ve heterotrofik mikroorganizmaları (mantarlar, bakteriler ve protozoalar) içeren ototrofik biyofilmler olarak da tanımlanırlar (Mantzorou, vd., 2018). Mikroalglerin biyofilm formasyonları oldukça karmaşık bir yapı gösterir ve bu yüzden tam anlamıyla çözülememiş bir prosedür olarak tanımlanmaktadır (Katarzyna, vd., 2015). Ayrıca biyofilm oluşum süreci ve büyüme, biyofilmi oluşturan mikroalgin türüne bağlı olduğu düşünülmektedir (Mantzorou ve Ververidis, 2019).

Mikroalgal biyofilm oluşumu iki aşamada incelenebilir. İlk aşamada, biyofilm oluşturabilmek için kullanılan tür adsorbsiyon yöntemiyle katı yüzeylere yapıştırılır. Bu adım genellikle geri dönüştürülebilen bir işlemdir. İkinci aşamada ise, hücre dışı polimerik maddelerle gerçekleştiği için geri dönüşümsüz bir adezyon işlemi söz konusudur (Shen, vd., 2014).

Katyonlar, organik maddeler ve özellikle protein, yüzeylerde geliştirilen mikroorganizmaların büyümesini ve bu tür biyofilmlerin oluşumunu destekleyen yapılardır. Biyofilm, yakındaki ortamdan serbest partikülleri yakalamak yerine, biyofilm oluşumunda yer alan mikroorganizmaların hücre bölünmesi ile daha da büyür. Bu büyüme sonucunda, biyofilm

birden fazla katmanlara sahip üç boyutlu olarak gözlemlenebilen bir yapıyı oluşturur. Büyüme tamamlandığında, hücreler hareketsiz forma geçer ve hücresel kümelenme oluşturulur. Biyofilm oluşturan mikroalgler difüzyon yoluyla beslenme olayını gerçekleştirirler. Biyofilm belirli bir kalınlığa ulaştığında hücrelerin yitirilmesi ya da parazitlerin bulaşması nedeniyle, ölüm ve büyüme hızı neredeyse birbirine eşitlenir (Mantzorou ve Ververidis, 2019).

Biyofilm üzerindeki mikroalgler, farklı iklim koşullarına kendilerini adapte edebilirler. Ayrıca, biyofilm formasyonunun, parazit mikroorganizmalara karşı avantajlar sağlayan korunaklı bir büyüme şekli olduğu da düşünülmektedir (Mantzorou ve Ververidis, 2019). Mikroalgler ve bakteriler çeşitli yüzeylere yapışmalarını ve dengelenmelerine yardımcı olan özelleşmiş hücre dışı polimerik maddeler salgılarlar (Zippel, vd., 2007; Choudhary, vd., 2017). Hücre dışı polimerik maddelerin içeriği, protein, fosfolipit, polisakkarit ve nükleik asitler gibi organik bileşiklerden ve fosforik, karboksilik, hidroksil ve amino grupları gibi fonksiyonel gruplardan oluşabilmektedir. Hücre dışı polimerik maddeler biyofilm oluşumları için çok önemli bir maddedir çünkü biyofilmi oluşturan hücrelerin bir arada kalmasını, mikroorganizmaların katı yüzeylere tutunmasını ve burada bağlı kalmasını sağlar. Ayrıca oluşturulan polimerik maddelerin matrisi, su ve besin maddeleri için bir saklama alanı olarak kullanılabilir ve hücreler için stres oluşturan çevresel koşullara (örneğin pH ve sıcaklık değişimi, dehidrasyon) ve zararlı kimyasallara karşı koruma rolüne sahiptir (Mantzorou ve Ververidis, 2019).

Hücre dışı polimerik maddeler, biyofilmin yaşı, biyofilmdeki türlerin kompozisyonu, stres koşulları ve besin gibi çeşitli faktörler tarafından etkilenebilmektedir. Son yıllarda mikroalglerin biyofilm tabanlı kültürlenme çalışmaları büyük ilgi görmüştür. Bu ilgi, mikroalglerin daha ekonomik bir şekilde hasat edilmesine duyulan ihtiyaçtan ortaya çıkmaktadır. Biyofilm tabanlı kültürlenme, planktonik ortamlarda ortaya çıkan yetiştirme sorunlarının eksik yanlarını çözebilir, biyoyakıt üretimini ve atık su arıtma ihtiyaçlarını karşılayabilmektedir. Şimdiye kadar, tasarımları ve şekilleri amaçlarına göre belirlenmiş olan birkaç tane biyofilm sistemi geliştirilmiştir ve çoğunlukla bu sistemler laboratuar ortamlarında kullanılmak üzere tasarlanmıştır (Mantzorou ve Ververidis, 2019). Biyofilm sistemlerinin uygulanmasına bağlı olarak, kullanılan tasarımın mantığı, geometrik yapılandırmaları ve kullanılan malzemeler çok çeşitlidir (Gross, 2015).

Biyofilm sistemlerinin avantajları ve dezavantajları

Mikroalglerin biyofilmde, planktonik formdan daha az suya ihtiyaç vardır. Sıradan kültür sistemlerinin kurulumu yüksek maliyet gerektirirken, biyofilm sistemlerinin kurulumu yüksek maliyetlerin önüne geçmektedir ve bunun yanında biyofilm sistemlerinde kullanılan tutunma yüzeyleri tekrar tekrar kullanılabilir özelliktedir. Aynı miktarda planktonik form ile biyofilm sistemlerinin sonucunda üretilen biyokütlenin, planktonik forma göre daha fazla olduğu tespit edilmiştir. Biyofilmlerde mikroalgler, planktonik formlara göre çok daha küçük bir alanda kültürlenebilmektedir. Planktonik formlardaki biyokütlelerin hasadı birçok soruna sebep olurken, biyofilm sistemlerinde hasat olabildiğince basittir ve katı sistemlerden sıyrılarak bu işlem kolayca tamamlanabilmektedir. Buna ek olarak biyofilmdeki mikroalglerin nem içerikleri çok düşüktür, bu yüzden ayrı bir kurutma işlemi gerektirmeyebilir. Planktonik formlara göre biyofilmlerde bulunan mikroalglerin ışığı kullanma oranları daha yüksektir. Birçok faydalı yönleri olmasına rağmen, biyofilm kültivasyonunun dezavantajları da vardır. Örneğin; biyokütlenin katı yüzeylerden ayrılmaması ile yaşabilecek biyokütle kaybı ve biyofilmde kullanılan yüzeylerin zarar görmesi gibi (Mantzorou ve Ververidis, 2019).

2.9. Endüstriyel Biyoyakıt Üretiminde Mikroalg Kullanımı

Alglerin biyorafinerisi, endüstriyel olarak yetiştirilen alglerden büyük ölçekte biyoyakıt üretebilmek için analiz edilmesi gereken olan önemli bir olaydır. Tipik bir algin besin bileşenleri proteinler, karbonhidratlar, lipitler, pigment, antioksidanlar, yağ asitleri ve vitaminlerdir. Çeşitli alg türlerinin protein ve karbonhidrat bileşenleri kuru ağırlığının %50’ sini yağ içeriği %40’ ını oluşturmaktadır. Tüm bu faktörler mikroalgleri biyolipit için potansiyel bir kaynak haline getirmektedir (Singh ve Gu, 2010).

Algler birçok çeşitte ürün oluşturulabilmektedir. Bu ürünler; hayvan yemi, eczacılık için kullanılan organik kimyasallar, insanlar için gıda takviyeleri, biyoetanol, biyometan ve biyodizel olarak tanımlanabilmektedir (Singh ve Gu, 2010).

2.9.1. Alglerden elde edilen biyoyakıtlar

Biyoetanol

Son zamanlarda fermantasyon işlemi uygulanarak mikroalglerden biyoetanol üretimi yapılabilmesi için birçok çalışma yapılmıştır. Bunun sebebi, mikroalglerin fermantasyon için karbon kaynağı olarak kullanılabilecek bolca karbonhidrat ve protein içermesidir. Aynı

zamanda yapılan çalışmalarda mikroalglerlerin, biyoetanol üretilebilmesi için iyi bir substrat olabileceği rapor edilmiştir (Singh ve Gu, 2010).

Algal biyokütleden biyoetanol elde etmek için iki yol kullanılmaktadır. Birinci işlem kimyasal yöntem olan fermantasyon, ikincisi ise termo-kimyasal bir yöntem olan gasifikasyondur (Singh ve Gu, 2010).

Alglerin fermantasyonu için, ilk aşama olarak mikroalgler anerobik ve karanlık bir ortamda tutularak etanol üretmesi beklenmelidir. Bu aşamada üretilen etanol saflaştırma işleminden geçirilerek biyoetanole dönüştürülebilmektedir. Fermantasyonda etanol üretmek için açığa çıkan CO2 geri dönüştürülerek alglerin beslenmesi için kullanılabilir özelliktedir. İkinci aşamada ise fermantasyondan arta kalan alg biyokütlesini anaerobik sindirim işlemine tabi tutularak elektrik üretmek için metana dönüştürülebilir (Singh ve Gu, 2010).

Her ne kadar mikroalglerin fermantasyonu sonucunda oluşturulan biyoetanol hakkında az sayıda çalışma bulunsa da bu prosedür ile ilgili birçok avantajda bildirilmiştir. Fermantasyon sonucu üretilen biyoetanol, mikroalglerden elde edilen biyodizel prosedüründen daha kolaydır ve buna ek olarak fermantasyon işlemi sonucunda açığa çıkan CO2, mikroalglerin besi ortamı için dönüştürülebilir formdadır ve bu işlem sonucunda sera gazı emisyonları azaltılabilmektedir (Singh ve Gu, 2010). Bununla birlikte, mikroalglerden biyoetanol üretim üzerine yapılan çalışmalar başlangıç aşamasındadır bu yüzden henüz ticarileştirilememiştir ve gelişmiş biyoetanol verimi için koşulları optimize etmek için çalışmalar devam etmektedir (Rawat, vd., 2010).

Biyometan

Biyometan üretimine ilgi, biyometan fermantasyon teknolojisinin biyogaz gibi değerli ürünler üretmesinden kaynaklanmaktadır (Rawat, vd., 2010). Anaerobik mikroorganizmalardan anaerobik sindirim sonucunda üretilen biyogaz, temel olarak metan (%55-75) ve CO2 (%25-45) karışımından oluşmaktadır. Anaerobik sindirim sonucunda oluşan metan yakıt olarak kullanmak ve elektrik üretmek için dönüştürülebilen bir kimyasaldır. Bunun yanında metan üretmek için yapılan anaerobik sindirim sonucunda arta kalan biyokütle gübre üretmek için tekrar dönüştürebilir özelliktedir. Anaerobik sindirim işleminden uygulanmasıyla elde edilen biyogaz, öncelikle organik yüklemelerden, pH’ tan, sıcaklıktan ve reaktörlerde tutulma süresinden etkilenmektedir (Singh ve Gu, 2010).

Metan üretimi için alg yetiştiriciliği ve atık su arıtma sistemini birleştirmek, üretim maliyetini düşürmek ve daha karlı hale getirmek için en uygun yaklaşım olabilir. Bu yaklaşım ötrofikasyonu önleyebileceği gibi aynı zamanda atıkların iyileştirilmesini de sağlayabilmektedir. Her ne kadar mikroalgler biyogaz üretimi için iyi bir potansiyel olsa da, ticari olarak geliştirme uygulamaları henüz gerçekleştirilmemektedir (Singh ve Gu, 2010).

Biyodizel

Biyodizel, bitkisel yağlar, hayvansal yağlar ya da mikroalgler gibi yenilenebilir hammaddelerinden elde edilen, uzun zincirli yağ asitlerinin mono alkil esterleri olarak tanımlanabilen alternatif bir yakıttır. Biyodizel, biyolojik olarak parçalanabilen, zehirsiz, CO2 gazı emisyonlarının azaltılmasına etkili olan yenilenebilir ve sürdürülebilir bir dizel yakıttır ve petrol dizeli ile rekabet edebilecek özelliklere sahiptir. Biyodizelin özellikleri, yağ hammaddesine ve kullanılan alkole göre değişkenlik gösterse de, direkt veya karışım oluşturarak dizel yakıt yerine kullanılabilir özelliktedir (Soydemir, 2016). Biyodizel, petrol dizelinkine yakın bir viskoziteye ulaşmak için yağın transesterize edilmesiyle üretilen bir yakıttır. Yağların, yağlı esterlere dönüştürme işlemi transesterifikasyon olarak adlandırılır (Demirbaş ve Demirbaş, 2010).

Bitkisel yağlar biyodizele dönüştürülebilir hatta biyodizel bir güneş enerjisi olarak da adlandırılabilir. Bitkisel yağlar, dizel yakıtına yakın enerji içeriği olan, yenilenebilir ve potansiyel olarak tükenmeyen bir enerji kaynağıdır. Aynı zamanda da, bitkisel yağların yoğun kullanımı, gelişmekte olan ülkelerde açlık gibi diğer önemli sorunlara neden olabilmektedir ve bitkisel yağlardan elde edilen dizel, petrol dizeline göre daha maliyetli olmaktadır (Demirbaş ve Demirbaş, 2010).

Biyodizel açısından bakıldığında, algler dünyadaki fotosentetik açıdan en verimli bitkiler arasındadır. Biyodizel üretiminde kullanılan algler genellikle sucul ve tek hücreli canlılardır ve yüksek büyüme oranları ile karakterize edilebilir özelliktedir. Alglerin organik madde kompozisyonu, değişen oranlarda proteinler, karbonhidratlar, lipitler ve nükleik asitler içerir. Algin türüne göre değişkenlik gösterse de toplam biyokütlelerin %40’ ına kadar yağ asidinden oluşabilmektedir ve bu alg bazlı yağların en belirgin özelliği biyodizel açısından verimli olmasıdır (Demirbaş ve Demirbaş, 2010).

Biyodizel üretiminde mikroalgleri kullanmanın avantajları

Yakıt üretmek için mikroalgleri kullanma fikri yeni değildir, ancak sürdürülebilir enerji arayışında son zamanlarda dikkatleri üzerine çekmeyi başarmıştır (Demirbaş, 2010). Pek çok araştırmalarda ve makalelerde, diğer mevcut hammaddelere kıyasla biyodizel üretimi için mikroalg kullanmanın birçok avantajı tanımlanmıştır (Mata, vd., 2009).

 Mikroalglerin yetiştirilmesi kolaydır ve insan tüketimi için uygun olmayan, elde edilmesi kolay besinleri kullanır.  Fotosentetik mikroorganizmalar olduklarından ışık enerjisini kimyasal enerjiye dönüştürürler ve birkaç gün içerisinde büyüme döngülerini tamamlarlar. Fotosentez tepkimelerini gerçekleştirmek için güneş ışığını ve hemen hemen her yerde bulunabilen basit besin maddelerini kullanmaktadırlar.  Farklı alg türleri, çeşitli çevresel koşullara uyum sağlayabilirler ve bu yüzden diğer biyodizel ham maddesi olarak kullanılan soya fasulyesi, kolza tohumu ve ayçiçeğinin gelişim gösteremeyeceği ortamda çoğaltılabilirler.  Güncel olarak kullanılan ham maddelere oranla çok daha yüksek bir büyüme oranları bulunmaktadır ve üretimleri için tarımsal arazilerden çok daha az yere ihtiyaç duymaktadırlar.  Mikroalgler biyodizelin yanı sıra metan, hidrojen, etanol gibi birkaç farklı yenilenebilir yakıtları da üretebilmektedir.  Mikroalglerin üretmiş olduğu biyodizelde kükürt yoktur. Petrolden üretilen dizelin

yanı sıra mikroalgler biyodizeli, partikül madde içeriği, CO ve NOx emisyonlarını azaltan bir etki göstermektedir (Mata, vd., 2009).

Dünya yüzeyinin üçte ikisi sularla kaplıdır. Bu nedenle küresel enerji ihtiyacını karşılamak için potansiyeli olan algleri kullanmak güzel bir seçenek olacaktır (Demirbaş, 2010).

2.10. Mikroalglerden Biyodizel Eldesi İçin Uygulanan Prosedürler

Mikroalglerden biyodizel üretilmesi için öncelikle lipit ekstraksiyonu, ardından fazla solventin uçurulması ve mikroalgal lipidin biyodizele dönüştürülmesi prosedürlerinin uygulanması gerekmektedir (Pragya, vd., 2013).

Bitkisel yağlar, petrol dizeliyle belirli bir oranda karıştırılarak doğrudan biyodizel olarak kullanılabilmektedir. Bu biyodizel yüksek viskoziteleri nedeniyle, dizel motorlarda direkt olarak kullanılamaz bu yüzden birkaç işleme prosedüründen geçmek zorundadır (Şekil 2.8). Bu

işleme prosedürleri mikroemülsifikasyon, piroliz ve transesterifikasyon olarak sınıflandırılabilir (Pragya, vd., 2013).

2.10.1. Mikro-emülsifikasyon

Mikro emülsiyon için etanol ve metanol gibi kısa zincirli alkoller kullanılmaktadır. Günümüzde metanol ve etanol gibi kısa zincirli karışmayan alkoller ve iyonik veya iyonik olmayan amfipiller ile mikro emülsiyonlar oluşturarak bitkisel yağların yüksek viskozitelerinin azaltılması üzerine çalışmalar yapılmaktadır. Fakat bu yöntem bitkisel yağların viskozitesini azaltmasına rağmen, yağın eksik yanmasından kaynaklı olarak enerji kaybı ve ağır karbon birikintileriyle sonuçlanmıştır (Pragya, vd., 2013).

2.10.2. Piroliz

Biyokütle pirolizi, sıvı, aktif karbon ve gaz yakıtların ve önemli kimyasalların eş zamanlı üretimi için umut verici bir tekniktir. Mikroalgal biyokütlenin ya oksijen yokluğunda ısıtıldığı ya da kısmen düşük oksijen kaynağı varlığında yandığı bir termo-kimyasal bir işlem olarak özetlenebilmektedir. Piroliz sonucunda elde edilen dizel, genel olarak petrol dizeline benzer bir kimyasal içeriğe sahiptir. Ancak bu işlem sonucunda oluşan ağır karbon birikintileri kabul edilebilir bir aralıkta değildir (Pragya, vd., 2013).

2.10.3. Transesterifikasyon

Mikro emülsiyon ve piroliz işlemleri hem maliyet açısından pahalıdır ve düşük kaliteli bir biyodizel üretimi gerçekleştirir. Transesterifikasyon yöntemi günümüzde en yaygın kullanılan işlemdir. Bunun sebebi, bu işlem sonucunda üretilen yağ asidi metil esterleri (FAME), petrol dizelinin içeriğine çok benzemesidir. Üstelik çokta basit bir işlemdir (Pragya, vd., 2013).

Transesterifikasyon işlemi viskoz mikroalg lipidini (triaçilgliseroller ve serbest yağ asitleri) düşük molekül ağırlıklı yağ asidi alkil esterlerine dönüştürür. Bu işlem, bir katalizör varlığında ana yağ (trigliserit) ile kısa zincirli bir alkol arasındaki bir reaksiyondur. Bu işlem sonucunda yağ asidi metil esterleri (FAME) ve gliserol oluşmaktadır (Pragya, vd., 2013).

Etanol fermantasyon sonucunda üretilebilir, dolayısıyla yenilenebilir ve toksitlik derecesi düşüktür. Buna rağmen daha ucuz ve reaktif olan metanol, yağ asitleri metil esterlerinin üretilmesinde kullanılır (Pragya, vd., 2013).

Reaksiyon hızı ve verimi uygun bir katalizör kullanılarak iyileştirilebilir. Katalizör doğada enzimatik olarak bulunabileceği gibi asidik veya bazik bir çözeltide olabilir. Bazik katalizörler; potasyum hidroksit, sodyum hidroksit ve sodyum metoksit, asidik katalizörler; hidroklorik asit, sülfürik asit ve sülfonik asit, fosforik asit, enzimatik katalizör olarak ise lipazlar kullanılabilir (Pragya, vd., 2013).

Mikroalglerle yapılan transesterifikasyon çalışmalarında, genel olarak kuru biyokütle kullanılmaktadır. Hasat edilen mikroalgal biyokütlenin kurutulması işlemi, biyodizel üretim maliyeti açısından bir dezavantaj olarak görülmektedir. Biyodizel üretiminde kullanılacak olan biyokütlenin ıslak ya da kuru olmasının biyodizel verimi ve FAME karakterizasyonunu etkilediği belirtilmektedir (Soydemir, 2016).

Şekil 2.8. Alglerden biyoyakıt elde etmenin farklı yolları (Pragya, vd., 2013).

3. MATERYAL METOD

3.1. Materyal

3.1.1. 1.Kullanılan alg türü ve kültür ortamı

Bu çalışmada yeşil algler (Chlorophyceae) grubuna üye olan Scenedesmus dimorphus (UTEX #1237) kullanılmıştır. Scenedesmus dimorphus’ un sistematik şeması aşağıdaki gibidir.

Alem: Plantae

Altalem: Viridiplantae

Grup: Chlorophyta

Sınıf: Chloropyhceae

Takım: Sphaeropleales

Aile: Scenedesmaceae

Cins: Scenedesmus

Tür: Scenedesmus dimorphus

3.2. Metod

3.2.1. Kültür koşulları

Planktonik form

S. dimorphus katı kültüründen her aşamada M3N-BBM besiyerinde 5 kat çoğaltarak 12 L’ lik stok kültür elde edildi. Bu kültürler 22±2oC’ de ve bir hava kompresörü yardımıyla yeterli biyokütleye ulaşıncaya kadar inkübe edildi. Işık yoğunluğu yaklaşık 130 µmol·m-2·s-1 olarak ölçüldü. Yeterli biyokütleye ulaşınca bu 12 L’ lik stok kültürden optik dansite (OD) 0,4 olacak şekilde 1,1 L alg örneği alınıp üzerine 0,9 L Modified 3-N Basal Bold Medium (M3N-BBM) besiyeri ilave edildi ve bu kontrol grubu 25 günlük inkübasyona bırakıldı (Çizelge 3.1) (Şekil 3.1).

Bu çalışmada çevresel stres koşullarından olan N eksikliğinin lipit üretimi üzerine etkisi araştırıldı. Bu amaçla S. dimorphus türü kontrol grubu olarak standart miktarda azot içeren (%100) M3N-BBM besiyerine ve 1/4 (%25) azot içeren M3N-BBM besiyerine kültüre edildi. Başlangıç OD değeri 0,4 olacak şekilde aşılama yapılarak 22±2oC’ de ve bir hava kompresörü yardımıyla 25 gün inkübasyona bırakıldı (Çizelge 3.2).

Şekil 3.1. Planktonik form %100 N ve %25 N içeren besiyeri (orijinal).

Biyofilm formu

S. dimorphus’ un M3N-BBM ortamında hazırlanmış olan stok kültüründen alınarak başlangıç OD değeri 0,4 olan 5 L alg-besiyeri karışımı dönen algal biyofilm reaktörüne konuldu. 22±2oC ısıda ve yaklaşık 130 µmol·m-2·s-1 ışık yoğunluğunda cihaz çalıştırıldı. Planktonik formda uygulanan azot eksiltme işlemi ve besiyeri biyofilm formasyonunda da uygulandı (Çizelge 3.1, 3.2).

Çizelge 3.1. M3N-BBM besiyerinin içeriği.

STOK SOLÜSYONLAR 1 LİTRE İÇİN

NaNO3 30 ml/L

CaCl2.2H2O 10 ml/L

MgSO4.7H2O 10 ml/L

K2HPO4 10 ml/L

KH2PO4 10 ml/L NaCl 10 ml/L PIV Metal Solüsyon 6 ml/L Soilwater (Green House soil) 40 ml/L

Vitamin B12 Solüsyonu 1 ml/L Biotin 1 ml/L Tiamin 1 ml/L

Çizelge 3.2. Azot miktarı %25 olan M3N-BBM içeriği.

STOK SOLÜSYONLAR 1 LİTRE İÇİN

NaNO3 7,5 ml/L

CaCl2.2H2O 10 ml/L

MgSO4.7H2O 10 ml/L

K2HPO4 10 ml/L

KH2PO4 10 ml/L NaCl 10 ml/L PIV Metal Solüsyon 6 ml/L Soilwater (Green House soil) 40 ml/L

Vitamin B12 Solüsyonu 1 ml/L Biotin 1 ml/L Tiamin 1 ml/L

3.2.2. Reaktörün tasarlanması

Bu çalışma içerisinde S. dimorphus mikroalginin biyofilm oluşturma potansiyelinin incelenebilmesi için laboratuar koşullarına modifiye edilmiş dönen algal biyofilm reaktörü (RABR) tasarlanmıştır. Bu reaktör tasarımında ilk olarak 52x34x13 cm ölçülerinde suntalam malzeme çerçeve oluşturacak şekilde birleştirildi. Bu çerçevenin içerisine girebilecek büyüklükte plastik malzemeden oluşan 9 L’ lik şeffaf bir kap yerleştirildi.

Dönen algal biyofilm reaktörünün tasarlanmasında 20 cm çapında krom malzemeden üretilmiş bir disk eklenmiş ve rulman ile çerçeveye sabitlenmiştir (Şekil 3.2). Bu diskin etrafı çeşitli kaplamalarla (pamuk ip, plastik halat, polietilen halat, yumuşak seramik, sert seramik, hava taşı) kaplanmıştır ve kullanılan malzemenin özelliğine bağlı olarak S. dimorphus mikroalginin biyofilm oluşturma yeteneği karşılaştırılmıştır.

Biyofilm reaktörünün istenilen hızda dönebilmesi için 12 V 30 rpm redüktörlü dc motor kullanılmış olup, bu motor diskin dönmesini sağlandı. Plastik kabın içerisine, diskin en az yarısının girebileceği miktar hesaplandıktan sonra OD 0,4 olarak ayarlanan 5 L’lik alg örneği- besiyeri karışımı reaktör tankına konuldu. Aynı zamanda reaktörün içerisinde alg tortularının oluşmasını engelleyebilmek için cam parçaları kestirilerek, rulmana krom malzeme ile sabitlendi. Reaktör ışık kaynağı olarak disk üzerine yerleştirilen ikili floresan lamba kullanıldı. Ortam ısısı 22±2oC ve ışık yoğunluğu 130 µmol·m-2·s-1 olarak ölçüldü (Lux METER)(LX-101). Reaktörün çizimleri Şekil 3.3. ve şekil 3.4.’ de gösterilmiştir.

Şekil 3.2. Dönen algal biyofilm reaktöründe (RABR) kullanılan diskin ve motorun görünümü.

Şekil 3.3. Dönen algal biyofilm (RABR) reaktörünün yan açıdan görüntüsü.

Şekil 3.4. Dönen algal biyofilm reaktörünün (RABR) perspektif görüntüsü.

3.2.3. Optik dansitenin ölçülmesi

S. dimorphus stok kültüründen mikropipet kullanılarak 200 µL alg solüsyonu alınıp mikropleytte üçlü tekrarlar halinde 680 nm’de ölçümler gerçekleştirildi. Bu işlem biyofilm ve planktonik form için ayrı ayrı uygulandı. Başlangıç yoğunluğu her iki ortamda da OD 0,4 olacak şekilde ayarlandı. Örneklemeler 10-15-20-25. günlerde gerçekleştirildi. Biyofilm formasyonunda OD değeri dönen algal biyofilm reaktörü içerisindeki tanktan alınan örneklerden ölçüldü. Böylece polietilen halata tutunma kapasitesi değerlendirildi.

3.2.4. Klorofil-a tayini

Klorofil ölçümü 10-15-20-25. günlerde gerçekleştirildi. Bu amaçla önerilen standart miktarda azot içeren besi yeri (%100) ve 1/4 (%25) azot içeren besi yeri ortamında kültüre edilen planktonik form S. dimorphus örneklerinin klorofil tayinleri gerçekleştirildi. Dönen algal biyofilm reaktörü tankından alınan örneklerde S. dimorphus türlerinin büyük bir kısmının polietilen halata tutunması sebebi ile klorofil ölçümü gerçekleştirilemedi.

Planktonik form

Bu amaçla planktonik form kültür ortamından belirlenen günlerde 5 mL örnek alındı. Alınan bu örnek GF/C filtreden vakum makinesi yardımıyla süzüldü ve filtre bir falcon tüpüne

alındı. Filtrenin bulunduğu falcon tüpüne 5 mL saf metanol eklendi ve 70oC’ lik su banyosunda 3 dakika beklemenin ardından örnekler 3500 rpm’ de 5 dakika boyunca santrifüj edildi. Santrifüj işlemi tamamlandıktan sonra süpernatant kısmından mikropipet yardımıyla 200 µl örnek alınarak 665-750 nm dalga boylarında ölçülüm gerçekleştirildi, klorofil-a miktarı aşağıdaki denkleme göre belirlendi.

Klorofil-a(mg/L)= 13,9 x (AB665 - AB750)

3.2.5. Kuru madde analizi (DCW - Dry Cell Weight)

Kuru madde analizi 10-15-20-25. günlerde gerçekleştirildi. Bu amaçla S. dimorphus örneklerinin önerilen standart miktarda azot içeren besi yeri (%100) ve 1/4 (%25) azot içeren besi yeri ortamında kültüre edilen planktonik form ve biyofilm formlarında kuru madde ağırlıkları değerlendirildi.

Planktonik form

Kuru madde analizi amacıyla planktonik formda bulunan S. dimorphus stok kültüründen steril koşullar sağlanarak belirlenen günlerde 25 mL örnek alındı ve steril falcon tüpü içerisine konuldu. Alg örnekleri darası alınmış GF/C filtreden vakum makinesi aracılığı ile süzüldü. Filtrenin üzerinde kalan örnekler etüvde (50oC) kurutularak desikatörde soğuması beklendikten sonra kuru ağırlık hesaplandı.

Biyofilm formu

Kuru madde analizi amacı ile dönen algal biyofilm reaktöründe bulunan S. dimorphus kültürünün tutunduğu polietilen halatlardan belirlenen günlerde 75 cm’ lik örnekler alındı. Boş ve biyofilm formasyonu şekillendikten sonra tartım işlemleri gerçekleştirildi. Kuru madde miktarları g/m2 cinsinden hesaplandı.

3.2.6. Total lipit ekstraksiyonu

Total lipit tayini 10-15-20-25. günlerde üçlü tekrarlar şeklinde gerçekleştirildi. Bu amaçla S. dimorphus örneklerinin önerilen standart miktarda azot içeren besi yeri (%100) ve 1/4 (%25) azot içeren besi yeri ortamlarında kültüre edilen planktonik form ve biyofilm formlarının total lipit miktarları gravimetrik olarak değerlendirildi.

Planktonik form

Lipit ekstraksiyonu prosedürü için öncelikle belirlenen günlerde S. dimorphus örnekleri 50 mL falcon tüplerine alındı 6500 rpm’ de 15 dakika santrifüj edildi. Santrifüj işleminden sonra falcon tüpündeki süpernatant kısmı enjektör yardımı ile uzaklaştırıldı. Tüplerde kalan biyokütle çökeltisi 60oC inkübatörde kurutma işlemine tabii tutuldu. Kurutulan örnekler, toz haline getirildi. 50 mg kuru alg örneği üzerine 10 mL metanol:kloroform (2:1) ilave edildi ve 2200 rpm 2 dakika süre ile vortekslendi. Üzerine 5 mL kloroform eklenerek 2200 rpm’ de 2 dakika vortekslendi. Üzerine 5 mL saf su konulup 2200 rpm’ de 2 dakika vortekslendi ve 5 dakika kaynar su konulmuş beherde bekletildi. Gereken işlemler tamamlandıktan sonra 6000 rpm’ de santrifüj edildi. Alt faz, enjektör yardımıyla alınarak ayrı bir falcon tüpüne aktarıldı. Üzerine 5 mL saf su konularak 1 dakika vortekslendikten sonra 6000 rpm’ de 10 dakika santrifüj edildi. Bu yıkama işlem 2-3 kez tekrarlandı ve son olarak su ortamdan uzaklaştırıldı. Kloroform uçurularak total lipit miktarı gravimetrik olarak hesaplandı.

Biyofilm formu

Lipit ekstraksiyonu prosedürü için öncelikle reaktörde sarılı olan polietilen halatlardan belirlenen günlerde 75 cm’ lik örnekler alındı. Halat örnekleri 100 mL %0,9’ luk NaCl çözeltisi içerisine konularak iplerin üzerindeki biyokütlenin ayrılabilmesi için 1500 rpm’ de vortekslendi. Bu çözelti 6000 rpm’ de 10 dakika boyunca santifüj edildi. Süpernatant uzaklaştırıldı ve kalan alg örneği kuru madde ve total lipit analizleri yapılmak üzere saklandı. Kuru alg örneğinden 50 mg alındı ve planktonik form için uygulanan total lipit ekstraksiyonu prosedürünün aynısı uygulandı.

4. BULGULAR

4.1. Kullanılan Alg Türünün Mikroskopisi

Yapılan bu çalışmada Scenedesmus dimorphus mikroalgi kullanılmış olup yapılan mikroskop incelemelerinde elde edilen görüntüleri Şekil 4.1’ de verilmiştir.

Şekil 4.1. Scenedesmus dimorphus mikroalginin mikroskobik görüntüleri (Orijinal).

Scenedesmus dimorphus Şekil 4.1’ de de görüldüğü gibi yaklaşık 10 µ boyutunda, yeşil ve mekik şeklinde görüntüsü olan bir mikroalgdir. Scenedesmaceae hücreleri iki katmanlı bir hücre duvarına sahiptir ve 100-300 nm kalınlığındaki mikrofibriller plazma membranını çevrelemektedir. Scenedesmus’ un hücreleri “coenobium” adı verilen dört hücreden oluşan koloniler halinde bulunabilmektedir. Bu kolonide hücreler uzunlamasına birbiriyle birleşir ve bu birleşmeyi “coenobial yapışkan” olarak adlandırılan bir yapı sağlar (Baudelet, vd., 2017). Bu yapılara şekil 4.1’ de rastlanmaktadır.

4.2. Dönen Algal Biyofilm Reaktöründe (RABR) Kullanılacak Materyalin Seçimi

Dönen algal biyofilm reaktöründe kullanılan diskin üzerinin kaplanacağı materyal seçimi için diskin etrafını pamuk ip, jüt halat, plastik halat, polietilen halat, sert seramik, yumuşak seramik ve hava taşı ile kaplayıp alglerin biyofilm oluşturma kabiliyetleri incelenmiştir. İnceleme sonucunda yumuşak seramik kaplamada alglerin seramiğe tutunma oranları üst düzeyde iken hasat işleminde biyokütle kaybına ve biyokütlenin seramik tozları ile kirlenmesine sebep olduğu görülmüştür (Şekil 4.2-d). Sert seramik denemesinde alglerin yumuşak seramiğe göre daha az tutunma sağladığı ve hasat işlemi gerçekleştirirken çok fazla

biyokütle kaybına sebep olduğu gözlenmiştir (Şekil 4.2-e). Diskin etrafı hava taşı ile kaplandığında, alglerin tutunma oranının yüksek olduğu fakat delikli yüzey olmasından kaynaklı olarak hasat işleminin oldukça zor olduğu kanısına varılmıştır (Şekil 4.2-f). Diskin etrafına pamuk ip sarıldığında, alglerin tutunma oranlarının yüksek olduğu, hasat işleminde sıvı ile çalkalama yöntemi kullanıldığında biyokütlenin rahatça alınabildiği fakat yüzey alanları diğer iplere oranla daha ince olduğundan taşıma kapasitesine erken ulaştığı için belirlenen deney süresi (25 gün) için uygun olmadığı gözlemlenmiştir (Şekil 4.2-a). Diskin etrafına plastik halat sarıldığında alglerin tutunma oranlarının gayet iyi olduğu, hasat işleminde sıvı ile çalkalama yöntemi kullanıldığında biyokütlenin büyük bir kısmının rahatça alınabildiğini fakat ipin morfolojik yapısından ötürü liflerin arasında biyokütle kalıntısının çok olduğu gözlemlenmiştir (Şekil 4.2-b). Diskin etrafı polietilen halat ile sarıldığında ise alglerin tutunma kabiliyetlerinin yüksek olduğu, hasat işleminde sıvı ile çalkalama yöntemi kullanıldığında biyokütlenin çok büyük bir kısmının rahatça alınabildiği fakat hasat işleminde biyokütlenin içerisine az miktarda ip liflerinin karıştığı gözlemlenmiştir (Şekil 4.2-c). Diskin etrafı jüt ip ile sarıldığında alglerin tutunma oranının iyi olduğu, fakat hasat işleminde biyokütlenin içerisine çok fazla ip liflerinin karıştığı ve hasat işleminin sonucunda elde edilen biyokütle miktarında yanıltıcı sonuçlar verdiği gözlemlenmiştir. Jüt halatın üzerinde oluşan biyofilm tabakasının mikroskobik görüntüleri Şekil 4.3’ de verilmiştir. Bu deneme sonucunda yukarıdaki bilgiler ışığında, çapının daha geniş olması ve hasat işleminin sonucunda daha fazla biyokütlenin alınımını sağladığından diskin etrafına polietilen halat sarılmasının daha uygun olacağına karar verilmiştir.

Şekil 4.2. Disk üzerindeki biyofilm formasyonunun şekillenmesinde kullanılan materyaller (a. Pamuk ip, b. Naylon ip, c. Polietilen halat, d. Yumuşak seramik, e. Sert seramik f. Hava taşı) (Orijinal).

Şekil 4.3. Jüt halatın üzerinde biyofilm oluşturan S. dimorphus mikroalginin SEM görüntüleri (Orijinal).

4.3. Optik Dansite

Bu çalışmada çevresel stres koşullarından olan N eksikliğinin lipit üretimi üzerine etkisi araştırılmıştır. Bu amaçla S. dimorphus türü kontrol grubu olarak standart miktarda azot içeren (%100) M3N-BBM besiyerine ve 1/4 (%25) azot içeren M3N-BBM besiyerine kültüre edilmiştir.

Planktonik form

Başlangıç OD’ si 0,4 olacak şekilde ayarlanarak başlatılan deney esnasında kontrol grubu niteliğinde standart besi yeri (%100 N) kullanılarak yapılan deneyde S. dimorphus planktonik formundan belirlenen günlerde örnekler alınmıştır. 680 nm’ de ölçülen en düşük ve en yüksek OD değerleri sırasıyla 1,117±0,03 ile 3,174±0,16 olarak belirlenmiştir.

Optik dansitesi başlangıçta 0,4 olacak şekilde hesaplanıp kültürlenmesi sağlanan %25 N içeren S. dimorphus planktonik formundan belirlenen günlerde örnek alınıp 680 nm’ de incelenmiş olup ölçülen en düşük ve en yüksek OD değerleri sırasıyla 1,009±0,04 ile 2,378±0,1 olarak belirlenmiştir. S. dimorphus’ un planktonik formunun %100 N içeren ortam ile %25 N içeren ortamın OD ölçümlerinin karşılaştırıldığı değerler Şekil 4.4’ de verilmiştir.

4,0 3,5 3,0

2,5 680

2,0 OD 1,5 1,0 0,5 0,0 10 15 20 25 Planktonik form %100 N içeren 1,117 1,376 2,266 3,174 ortam Plantonik Form %25 N içeren 1,009 1,403 1,975 2,378 ortam Gün

Şekil 4.4. Planktonik formun OD değerlerinin karşılaştırılması.

Biyofilm formu

Başlangıçta OD 0,4 olacak şekilde hesaplanmış olan S. dimorphus’ un biyofilm formundan, materyal bölümünde izah edildiği gibi kurulan reaktör içerisindeki tekneden 10.- 15.-20.-25. günlerde örnekler alınmış olup spektrofotometre cihazında 680 nm’ de ölçümler gerçekleştirilmiştir. %100 N içeren biyofilm formundan alınan örneklerde ölçülen en düşük ve en yüksek OD değerleri sırasıyla 0,251±0,02 ile 0,828±0,12 olarak belirlenmiştir.

Başlangıçta OD 0,4 olacak şekilde hesaplanmış olan S. dimorphus’un biyofilm formundan, materyal bölümünde izah edildiği gibi kurulan reaktör içerisindeki tekneden 10.- 15.-20.-25. günlerde örnekler alınmış olup spektrofotometre cihazında 680 nm’ de incelenmiştir. %25 N içeren biyofilm formundan alınan örneklerde ölçülen en düşük ve en yüksek OD değerleri sırasıyla 0,165±0,1 ile 0,419±0,1 olarak belirlenmiştir. S. dimorphus’ un biyofilm formunun %100 N içeren ortam ile %25 N içeren ortamın OD değerlerinin karşılaştırıldığı değerler Şekil 4.5’ de verilmiştir.

1,2

1,0

0,8 680

OD 0,6

0,4

0,2

0,0 10 15 20 25 %100 N içeren biyofilm 0,358 0,828 0,251 0,271 formunun OD değerleri %25 N içeren biyofilm 0,247 0,419 0,165 0,337 formunun OD değerleri Gün

Şekil 4.5. Biyofilm formun OD değerlerinin karşılaştırılması.

S. dimorphus’ un biyofilm formu ile planktonik formunun %100 N içeren ortamdaki ölçülen OD değerlerinin karşılaştırılması Şekil 4.6’ da verilmiştir.

4,0 3,5 3,0 2,5 680 2,0 OD 1,5 1,0 0,5 0,0 10 15 20 25 %100 N içeren planktonik 1,117 1,376 2,266 3,174 formunun OD değerleri %100 N içeren biyofilm 0,358 0,828 0,251 0,271 formunun OD değerleri Gün

Şekil 4.6. %100 N içeren planktonik ve biyofilm formunun OD değerlerinin karşılaştırılması.

S. dimorphus’ un biyofilm formu ile planktonik formunun %25 N içeren ortamdaki ölçülen OD değerlerinin karşılaştırılması Şekil 4.7’ de verilmiştir. Şekil 4.6 ve 4.7’ de biyofilm

formasyonunda örnekleme RABR içerisindeki tanktan yapılmıştır. OD değerlerinin planktonik forma göre düşük olmasının nedeninin S. dimorphus türlerinin materyal üzerine yapışma eğilimlerinin fazla olmasından kaynaklandığı düşünülmektedir.

3,0 2,5

2,0 680

1,5 OD 1,0 0,5 0,0 10 15 20 25 %25 N içeren planktonik 1,009 1,403 1,975 2,378 formun OD değerleri %25 N içeren biyofilm 0,247 0,419 0,165 0,337 formunun OD değerleri Gün

Şekil 4.7. %25 N içeren planktonik ve biyofilm formun OD değerlerinin karşılaştırılması.

4.4. Klorofil-a Tayini

Planktonik form

Bu çalışmada %100 N içeren S. dimorphus planktonik formundan belirlenen günlerde örnek alınıp 665 nm ve 750 nm’ de spektrofotometre cihazında ölçümleri yapılmıştır. Gerekli hesaplamalar yapıldığında %100 N içeren S. dimorphus kültüründeki en düşük ve en yüksek klorofil-a miktarı sırasıyla 17,25 mg/L ile 27,81 mg/L olarak belirlenmiştir.

Bu çalışmada %25 N içeren S.dimorphus planktonik formundan belirlenen günlerde örnek alınıp 665 nm ve 750 nm’ de spektrofotometre cihazında ölçüm yapılmıştır. Gerekli hesaplamalar yapıldığında %25 N içeren S.dimorphus kültüründeki en düşük ve en yüksek klorofil-a miktarı sırasıyla 15,1 mg/L ile 24,76 mg/L olarak belirlenmiştir. S. dimorphus kültürü üzerine yapılan bu denemede %100 N içerikli ve %25 N içerikli ortamların klorofil-a miktarlarının karşılaştırılması Şekil 4.8’ de verilmiştir.

30 25

20 mg/L 15 10 5 0 10 15 20 25 Planktonik form %100 N 17,25 23,12 27,81 24,83 ortam Planktonik form %25 N ortam 15,10 22,56 24,76 24,71 Gün

Şekil 4.8. Normal koşullar (%100 N) ve azot eksikliği stresi (%25 N) sonrası planktonik formdaki klorofil-a miktarının karşılaştırılması.

4.5. Kuru madde analizi (DCW)

Planktonik form

S. dimorphus’ un planktonik formundaki %100 N içeren ortam ile %25 N içeren ortamdan belirlenen günlerde 25 mL örnek alınıp gerekli prosedürler uygulanmıştır. Uygulama sonucunda %100 N içeren ortamda ölçülen en düşük ve en yüksek kuru madde miktarı sırasıyla 0,88 g/L ile 2,404 g/L olarak belirlenmiştir.

S. dimorphus’ un planktonik formunda uygulanan %25 N içerikli ortamdan belirlenen günlerde 25 mL örnek alınarak gerekli prosedürler uygulanmıştır. Uygulama sonucunda bulunan en düşük ve en yüksek değer sırasıyla 0,792 g/L ile 1,828 g/L olarak belirlenmiştir.

S. dimorphus kültürü üzerine yapılan bu denemede %100 N içerikli ve %25 N içeren ortamların, kuru madde değerlerinin g/L cinsinden karşılaştırmalı grafiği Şekil 4.9’ da verilmiştir.

3 2,5 2

1,5 g/L 1 0,5 0 10 15 20 25 %100 N içeren planktonik ortamın kuru ağırlık miktarları 0,88 1,052 1,508 2,404 (g/L) %25 N içeren planktonik ortamın kuru ağırlık miktarları 0,792 1,024 1,372 1,828 (g/L) Gün

Şekil 4.9. Planktonik formasyonlarında azot eksikliğine bağlı kuru madde miktarları (g/L).

Biyofilm formu

Dönen algal biyofilm reaktöründe bulunan S. dimorphus biyofilm formundaki %100 N içeren ortam ile %25 N içeren ortamdan belirlenen günlerde halatlardan üçlü tekrarlar halinde 75 cm kesilmiştir ve belirtilen prosedürler uygulanmıştır. Deneme sonucunda elde edilen kuru madde miktarlarındaki en düşük ve en yüksek sonuçlar sırasıyla 0,093 g/m2 ile 0,275 g/m2 olarak ölçülmüştür.

Deneyin 10. gününde yapılan ölçümlerde %100 N içeren ortamdaki metrekareye düşen kuru madde miktarı 0,108 (±0,006) g/m2 olarak bulunmuştur. %25 N içeren ortamın ölçüm değeri ise 0,093 (±0,008) g/m2 olarak belirlenmiştir. Deneyin 15. gününde yapılan ölçümlerde %100 N içeren ortamdaki metrekareye düşen kuru madde miktarı 0,155 (±0,009) g/m2 olarak bulunmuştur. %25 N içeren ortamın ölçüm değeri ise 0,123 (±0,018) g/m2 olarak bulunmuştur. Deneyin 20. gününde yapılmış olan ölçümlerde %100 N içeren ortamdaki metrekareye düşen kuru madde miktarı 0,176 (±0,004) g/m2 olarak bulunmuştur. %25 N içeren ortamın ölçüm değeri ise 0,155 (±0,019) g/m2 olarak belirlenmiştir. Deneyin 25. günde yapılan ölçümlerde %100 N içeren ortamdaki metrekareye düşen kuru madde miktarı 0,275 (±0,006) g/m2 olarak belirlenmiştir. %25 N içeren ortamın ölçüm değeri ise 0,268 (±0,003) g/m2 olarak belirlenmiştir.

Biyofilm formunda %100 N içeren ortamın metrekareye düşen kuru madde miktarları ile %25 N içeren ortamın metrekareye düşen kuru madde miktarlarının g/m2 cinsinden değerleri Şekil 4.10’ da belirtilmiştir.

0,30

0,25

0,20

2 0,15 g/m 0,10

0,05

0,00 10 15 20 25 %100 N ortam 0,108 0,155 0,176 0,275 %25 N ortam 0,093 0,123 0,155 0,268 Gün

Şekil 4.10. Biyofilm formasyonlarında azot eksikliğine bağlı kuru madde miktarları (g/m2).

4.6. Total yağ miktarları

S. dimorphus mikroalginin kültürlendiği %100 N ve %25 N içeren planktonik ve biyofilm formundan 10.-15.-20.-25. günlerde alınan örnekler üzerinde metot kısmında bahsedildiği şekilde total yağ ekstraksiyonu prosedürü uygulanmıştır.

Planktonik form

S. dimorphus mikroalginin kültürlendiği %100 N içeren planktonik formunda ölçülen en düşük ve en yüksek total yağ miktarları sırasıyla 26,6 mg/g ile 188 mg/g olarak belirlenmiştir. %25 N içeren planktonik ortamda ise en düşük ve en yüksek total yağ miktarları sırasıyla 44,6 mg/g ile129,6 mg/g olarak ölçülmüştür. Ölçümler sonucunda elde edilen verilerin mg/g cinsinden değerleri Çizelge 4.1’ de verilmiştir.

Biyofilm formu

S. dimorphus mikroalginin kültürlendiği %100 N içeren biyofilm formunda ölçülen en düşük ve en yüksek total yağ miktarları sırasıyla 45,6 mg/g ile 120 mg/g olarak ölçülmüştür. %25 N içeren biyofilm formunun ise en düşük ve en yüksek total yağ miktarları sırasıyla 49

mg/g ile 138,2 mg/g olarak belirlenmiştir. Ölçümler sonucunda elde edilen verilerin mg/g cinsinden değerleri Çizelge 4.1’ de verilmiştir.

Çizelge 4.1. %100-%25 N içeren planktonik ve biyofilm formundaki total yağ miktarları (mg/g).

Total lipit (mg lipit/g kuru mikroalg biyokütle) 10. gün 15. gün 20. gün 25. gün

%100 N içeren Planktonik Ortam 26,6 48 53 118 %25 N içeren Planktonik Ortam 49,6 44,6 67,2 129,6 %100 N içeren Biyofilm Ortamı 45,6 87,6 56,8 120 %25 N içeren Biyofilm Ortamı 49 81 72,8 138,2

S. dimorphus mikroalginin planktonik ve biyofilm formları üzerinde yapılan değerlendirmede kuru hücre ağırlığının normal koşullarda (%100 N içeren) yağ miktarı üzerine % etkisi en düşük ve en yüksek değerler sırasıyla 3 ile 12 olarak belirlenmiştir. (Şekil 4.11)

14 12 10 8 6 4 2

DCW içinde % yağ % total DCW içinde 0 10 15 20 25 %100 N içeren planktonik 3 4,81 5,3 11,84 formun total yağ miktarları(%) %100 N içeren biyofilm 4,57 4,38 5,69 12 formun total yağ miktarları(%) Gün . Şekil 4.11. Planktonik ve biyofilm formunda kuru hücre ağırlığın (DCW) normal koşullarda % yağ miktarı üzerine etkisi.

S. dimorphus mikroalginin planktonik ve biyofilm formları üzerinde yapılan değerlendirmede kuru hücre ağırlığının 1/4 azot eksikliği koşullarında (%25 N içeren) yağ miktarı üzerine % etkisi en düşük ve en yüksek değerler sırasıyla 4 ile 13,81 olarak belirlenmiştir (Şekil 4.12).

16 14 12 10 8 6 4 2

DCW DCW içinde % totalyağ 0 10 15 20 25 %25 N içeren planktonik 4,97 4 6,71 12,95 formun total yağ miktarları(%) %25 N içeren biyofilm formunun total yağ 5 8 7 13,81 miktarları(%) Gün

Şekil 4.12. Planktonik ve biyofilm formunda kuru hücre ağırlığın (DCW) azot eksikliği koşullarında % yağ miktarı üzerine etkisi.

S. dimorphus mikroalginin %100 N içeren planktonik formunun kuru madde ve % total yağ miktarlarının karşılaştırılması sonucunda en düşük kuru madde miktarının 0,88 g/L olduğu günde % total yağ miktarı %3 olarak bulunmuştur. Karşılaştırma sonucunda elde edilen en yüksek kuru madde miktarının 2,404 g/L olduğu günde ise % total yağ miktarı %11,84 olarak bulunmuştur. %100 N içeren planktonik formun kuru madde ve % total yağ miktarlarının karşılaştırmalı grafiği Şekil 4.13’ de verilmiştir.

3,00 14

2,50 12 10 2,00 8 g/L 1,50 6 1,00 4 0,50

2 içinde DCW total % yağ

0,00 0 10 15 20 25 %100 N içeren planktonik formun kuru madde 0,88 1,052 1,508 2,404 miktarı(g/L) %100 N içeren planktonik formun total yağ miktarı 3 4,81 5,3 11,84 (%) . Şekil 4.13. %100 N içeren planktonik formun kuru madde (g/L) ve % total yağ miktarlarının karşılaştırması.

S. dimorphus mikroalginin %25 N içeren planktonik formunun kuru madde ve % total yağ miktarlarının karşılaştırılması sonucunda en düşük kuru madde miktarının 0,792 g/L olarak 10. günde tespit edilmiş ve % total yağ miktarı %4,97 olarak saptanmıştır. Karşılaştırma sonucunda elde edilen en yüksek kuru madde miktarının 1,828 g/L olduğu ve % total yağ miktarının %12,95 olduğu saptanmıştır. %25 N içeren planktonik formun kuru madde ve % total yağ miktarlarının karşılaştırmalı grafiği Şekil 4.14’ de verilmiştir.

2,0 14 1,8 12 1,6 1,4 10 1,2 8

g/L 1,0 0,8 6 0,6 4 0,4 2 0,2 içinde DCW total % yağ 0,0 0 10 15 20 25 %25 N içeren planktonik formunun kuru madde 0,792 1,024 1,372 1,828 miktarları(g) %25 N içeren planktonik formunun total yağ 4,97 4 6,71 12,95 miktarları(%) . Şekil 4.14. %25 içeren planktonik formun kuru madde (g/L) ve % total yağ miktarlarının karşılaştırması.

S. dimorphus mikroalginde %100 N içeren biyofilm formunun kuru madde ve % total yağ miktarlarının karşılaştırılması sonucunda en düşük kuru madde miktarının 0,108 g/m2 olduğu 10. günde % total yağ miktarı %4,57 olarak saptanmıştır. Karşılaştırma sonucunda elde edilen en yüksek kuru madde miktarının 0,275 g/m2 olduğu ve % total yağ miktarının %12 olduğu saptanmıştır. %100 N içeren biyofilm formun kuru madde ve % total yağ miktarlarının karşılaştırmalı grafiği Şekil 4.15’ de verilmiştir.

0,30 14 0,25 12 10 0,20

2 8 0,15 6 g/m 0,10 4

0,05 2 DCW DCW içinde % totalyağ 0,00 0 10 15 20 25 %100 N içeren biyofilm formun kuru madde 0,108 0,155 0,176 0,275 miktarları(g/m2) %100 N içeren biyofilm formunun % total yağ 4,57 4,38 5,69 12 miktarları(%) Gün

Şekil 4.15. %100 N içeren biyofilm formun kuru madde (g/m2) ve % total yağ miktarlarının karşılaştırması.

S. dimorphus mikroalginin %25 N içeren biyofilm formunun kuru madde ve % total yağ miktarlarının karşılaştırılması sonucunda en düşük kuru madde miktarının 0,093 g/m2 olduğu ve % total yağ miktarı %5 olduğu görülmüştür. Karşılaştırma sonucunda elde edilen en yüksek kuru madde miktarının 0,268 g/m2 olduğu günde ise % total yağ miktarı %13,81 olarak bulunmuştur. %25 N içeren biyofilm formun kuru madde ve % total yağ miktarlarının karşılaştırmalı grafiği Şekil 4.16’ da verilmiştir.

0,30 16 0,25 14 12

2 0,20 10 0,15 8 g/m 0,10 6 4 0,05 2 0,00 0 10 15 20 25

%25 N içeren biyofilm DCW içinde % totalyağ formunun kuru madde 0,093 0,123 0,155 0,268 miktarı(g/m2) %25 N içeren biyofilm formunun % total yağ 5 8 7 13,81 miktarları(%) Gün . Şekil 4.16. %25 N içeren biyofilm formun kuru madde (g/m2) ve % total yağ miktarlarının karşılaştırması.

S.dimorphus mikroalginin %100 N içeren planktonik formunun klorofil-a ve % total yağ miktarlarının karşılaştırılması sonucunda en düşük % total yağ miktarının %3 olduğu günde klorofil-a miktarı 17,25 mg/L olarak bulunmuştur. Karşılaştırma sonucunda elde edilen en yüksek % total yağ miktarının %11,84 olduğu ve klorofil-a miktarının 24,83 mg/L olduğu saptanmıştır. %100 N içeren planktonik formun klorofil-a ve % total yağ miktarlarının karşılaştırmalı grafiği Şekil 4.17’ de verilmiştir.

. 30 14

25 12 10 20 8 mg/L 15 6 10 4

5 2 DCW içinde içinde DCW total % yağ 0 0 10 15 20 25 %100 N içeren planktonik formun klorofil-a miktarı 17,25 23,12 27,81 24,83 (mg/L) %100 N içeren planktonik formundaki % total yağ 3 4,81 5,3 11,84 miktarı Gün

Şekil 4.17. %100 N içeren planktonik formun klorofil-a ve % total yağ miktarlarının karşılaştırılması.

S.dimorphus mikroalginin %25 N içeren planktonik formunun klorofil-a ve % total yağ miktarlarının karşılaştırılması sonucunda en düşük % total yağ miktarının %4 olduğu günde klorofil-a miktarı 22,56 mg/L olarak bulunmuştur. Karşılaştırma sonucunda elde edilen en yüksek % total yağ miktarının %12,95 olduğu günde ise klorofil-a miktarı 24,71 mg/L olarak bulunmuştur. %25 N içeren planktonik formun klorofil-a ve % total yağ miktarlarının karşılaştırmalı grafiği Şekil 4.18’ de verilmiştir.

30 14

25 12 10 20 8 15 mg/L 6 10 4

5 2 DCW içinde % totalyağ 0 0 10 15 20 25 %25 N içeren planktonik formun klorofil-a 15,10 22,56 24,76 24,71 miktarları(mg/L) %25 N içeren planktonik formun %total yağ 4,97 4 6,71 12,95 miktarları Gün . Şekil 4.18. %25 N içeren planktonik formun klorofil-a ve % total yağ miktarlarının karşılaştırılması.

5. TARTIŞMA

Scenedesmus dimorphus endüstriyel açıdan önemli olan bir alg türüdür. Bu çalışmada S. dimorphus biyofilm kültürlerinde azot stresinin lipit üzerine etkisi incelenmiştir.

Çalışma içerisinde S. dimorphus türü üzerinde planktonik olarak gelişim gösterebileceği kültür ortamı oluşturulmuş, %100 N ve %25 N içeren besiyerinde inkübasyona bırakılmıştır. S. dimorphus mikroalginin biyofilm oluşturma ve buna bağlı olarak yağ depolama kabiliyetinin incelenebilmesi için, içerisinde %100 N içeren besiyeri ile % 25 N içeren besiyeri bulunan dönen algal biyofilm reaktörü kurulmuştur.

Optik dansite sonuçlarının değerlendirilmesi

Yapılan araştırmalar besinlerin kullanılabilirliğinin, mikroalglerin büyümesinde, geniş alanlara yayılım göstermesinde ve lipit üretim metabolizmasında çok önemli bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte besin stresine bağlı olarak lipit üretiminin arttığı, hücre bölünme sayısının giderek azaldığını rapor etmiştir (Thompson, 1996). Bu çalışmada S. dimorphus mikroalginin kültürlendiği 25 günlük çalışma sonucunda %100 N içeren planktonik formunun OD değerleri, %25 N içeren planktonik formun OD değerlerine göre daha yüksek olduğu gözlemlenmiştir. %100 N içeren planktonik formun en yüksek OD değeri 25. günde ölçülmüş ve 3,174±0,16 olarak belirlenmiştir. %25 N içeren planktonik formun en yüksek OD değerine 25. günde ulaşılmış ve 2,378±0,1 olarak belirlenmiştir. Planktonik form üzerinde yapılan bu çalışmada azot eksikliğinin OD değerlerini arttırıcı etkisinin olmadığı sonucuna varılmıştır. S. dimorphus mikroalginin kültürlendiği dönen algal biyofilm reaktöründe %100 N içeren formun OD değerleri, %25 N içeren biyofilm formunun OD değerlerine göre daha yüksek olduğu gözlemlenmiştir. %100 N içeren biyofilm formunun en yüksek OD değeri 15. günde ölçülmüş ve 0,828±0,12 olarak belirlenmiştir. %25 N içeren biyofilm formunun en yüksek OD değerine 15. günde ulaşılmış 0,419±0,015 olarak belirlenmiştir. 15. günden sonra, dönen algal biyofilm reaktörünün açık bir sistem olmasına bağlı olarak buharlaşma meydana gelmiştir. Bu nedenle 1/15 gün besi takviyesi yapılmıştır. %100-%25 N içeren planktonik formun OD değerlerinin, %100-%25 N içeren biyofilm formunun OD değerlerinden yüksek çıkmasının nedeni, Dönen Algal biyofilm reaktöründeki ölçümlerin teknenin içerisindeki solüsyondan yapılması ve S. dimorphus mikroalginin halatlara tutunarak biyofilm oluşturmasıdır. S. dimorphus mikroalginin kültürlenmesinin sağlandığı %100-%25 N içeren planktonik formunda yapılan kuru madde analizi sonucunda, %100 N içeren planktonik ortamın kuru madde miktarının daha yüksek olduğu yapılan hesaplamalar sonucunda belirlenmiştir. S.

dimorphus mikroalginin kültürlenmesi için oluşturulan dönen algal biyofilm reaktöründe uygulanan %100-%25 N içeren biyofilm formunda da %100 N içeren ortamdaki kuru madde miktarının %25 N içeren biyofilm formuna göre daha yüksek olduğu belirlenmiştir. Yapılan bir çalışmada, mikroalgler üzerinde azot stresinin uygulanması, bazı biyokimyasal bileşenlerin miktarını arttırırken, biyokütle verimliliğinde azalma meydana getirdiğini rapor etmişlerdir (Procházková, vd., 2013). %25 N içeren ortamların kuru madde miktarı belirlenen günlerde artış göstermiş olsa da, kuru madde miktarlarının %100 N içeren formlara göre daha az olmasının nedeni azot stresinin mikroalgler üzerinde hücre sayısını azaltıcı yönde etki göstermesidir ve elde ettiğimiz bu sonuçlar rapor edilen diğer sonuçlarla uyumludur.

Total yağ miktarlarının değerlendirilmesi

Mikroalgler ortam koşullarının değiştirilmesine cevap olarak lipit metabolizmasını etkili bir şekilde değiştirmektedirler. Olumsuz çevre koşulları varlığında ya da stres koşulları oluşturulduğunda kuru ağırlıklarının yaklaşık %20-50 kadarında triaçilgliserol formunda nötral yağ biriktirerek, bu koşullara dayanıklılıklarını arttırmaktadırlar (Sharma, vd., 2012). Bu çalışmadan elde ettiğimiz sonuçlarda %100-%25 N içeren planktonik formlarda günlük olarak total yağ miktarında artış olduğu gravimetrik hesaplamalarla belirlenmiştir. %100 N içeren planktonik formun en yüksek total yağ miktarı 25. günde ölçülmüş ve 188 mg/g olarak belirlenmiştir. %25 N içeren planktonik formun en yüksek total yağ miktarı 25. günde ölçülmüş ve 129,6 mg/g olarak belirlenmiştir. Planktonik formlarda yapılan total yağ miktarlarının % cinsinden değerleri ise %100 N içeren ortamda en yüksek %11,84, %25 N içeren ortamda ise %12,95 olarak saptanmıştır. Griffiths ve arkadaşlarının yapmış olduğu çalışma içerisinde, uyguladıkları azot stresi sonucunda C. vulgaris, Neochloris oleoabundans ve Scenedesmus sp.’de lipit içeriğinin arttığını ve özellikle C. vulgaris ve Scenedesmus sp.’de 14. günün sonucunda bile lipit içeriğinin artmaya devam ettiğini rapor etmişlerdir (Griffiths, vd., 2011). Bu değerlere bakılarak planktonik form üzerinde azot stresinin uygulanması, total yağ miktarını arttırıcı yönde etki ettiğini göstermektedir ve elde ettiğimiz verilerin yapılan diğer çalışmalarla uyumlu olduğu sonucuna varılmaktadır.

S. dimorphus mikroalginin kültürlenmesi için tasarlanan dönen algal biyofilm reaktörü üzerinde çalışılan %100-%25 N içeren ortamda total yağ miktarının günlük olarak artış gösterdiği saptanmıştır. %100 N içeren biyofilm formundaki en yüksek total yağ miktarı 25. günde ölçülmüş ve 120 mg/g olarak belirlenmiştir. %25 N içeren biyofilm formunda en yüksek total yağ miktarı 25. günde ölçülmüş ve 138,2 mg/g olarak belirlenmiştir. Biyofilm formunda

yapılan incelemede total yağ miktarının % cinsinden değerleri %100 N içeren ortamda en yüksek %12, %25 N içeren ortamda ise en yüksek %13,81 olarak hesaplanmıştır. Bu değerlerin sonucunda biyofilm formunun üzerinde azot stresinin uygulanması, total yağ miktarını arttırıcı yönde etki ettiğini göstermektedir. Aynı zamanda yapılan ölçümler sonucunda %100 N içeren planktonik formun kuru madde miktarının, %25 N içeren planktonik formun kuru madde miktarına göre daha fazla olduğu fakat %100 N içeren planktonik formun kuru madde miktarı arttıkça %25 N içeren planktonik forma oranla % total yağ miktarının daha az miktarda arttığı belirlenmiştir. %100N içeren planktonik formun 25. günde kuru madde miktarı 2,404 g/L olduğunda, total yağ miktarının %11,84, %25 N içeren planktonik formun kuru madde miktarı 1,828 g/L olduğunda total yağ miktarı %12,95 olarak bulunmuştur. %100 N içeren biyofilm formunda 25. günde yapılan ölçümlerde kuru madde miktarının 0,275 g/m2 olduğunda total yağ miktarının %12, %25 N içeren biyofilm formunun kuru madde miktarı 0,268 g/m2 olduğunda total yağ miktarı %13.81 olarak bulunmuştur. Gross ve arkadaşlarının C. vulgaris ile yapmış oldukları çalışmaya göre dönen algal biyofilm reaktöründe yapılan biyokimyasal ölçümler sonucunda, karbonhidrat miktarı planktonik forma göre daha fazlayken, lipit miktarının planktonik forma göre az olduğunu, bu sonuçların sebebinin biyofilm oluştururken üretilen karbonhidrat içerikli hücre dışı polimerik madde miktarının artışına bağlı olduğunu rapor etmişlerdir (Gross ve Wen, 2014). Bu çalışmada tasarlanan dönen algal biyofilm reaktöründen elde edilen total yağ miktarlarının hem %100 hem de %25 N içeren ortamda, planktonik forma göre daha yüksek çıktığı belirlenmiştir. Diğer çalışmalara göre, laboratuar ortamında tasarladığımız dönen algal biyofilm reaktöründeki total yağ miktarının fazla çıkmasının nedeninin kullandığımız mikroalg türünün farklı olması, kültürdeki mikroalgleri azot stresine maruz bırakmamız, dönen algal biyofilm reaktörünü tasarlarken kullandığımız kaplama materyalini farklı kullanmamız ve mikroalglerin kültürlendirilmesini sağlayan besiyeri çeşidinin farklı olmasından kaynaklandığı düşünülmektedir.

Klorofil oluşumunun değerlendirilmesi

25 gün süren bu deneyde, %100-%25 N içeren planktonik form üzerinde yapılan klorofil-a ölçümlerinin sonucunda, %100 N içeren planktonik formun klorofil-a miktarının, %25 N içeren planktonik formun klorofil-a miktarından daha yüksek olduğu belirlenmiştir. Mikroalglerin kültür ortamlarındaki azot sınırlamasının hücre sayısı ve klorofil-a miktarlarında azalmaya neden olduğu gözlemlenirken, mikroalglerin biyokimyasal içeriğinde yağlar gibi organik bileşiklerin oranlarında artış elde edildiği bilinmektedir. Aynı zamanda mikroalgler üzerinde uygulanan azot eksikliği klorofil-a miktarını azaltırken karoten pigmentinin sayısını

arttırdığı için kültür ortamında sararmalar meydana getirdiği bilinmektedir (Shifrin ve Chisholm, 1981; Sukenik, vd., 1989). %25 N içeren planktonik formun klorofil-a miktarı %100 N içeren planktonik forma göre daha düşük çıkmış ve %100 N içeren planktonik formun en yüksek total yağ miktarı %11,84 olarak belirlenirken, %25 N içeren planktonik formun en yüksek total yağ miktarı %12,95 olarak belirlenmiştir. Daha önceki çalışmalarda alglerin besi ortamındaki azot miktarının azaltılmasıyla klorofil-a miktarının azaldığı fakat lipit miktarının arttığı rapor edilmiştir (Chu, vd., 1996;Geider, vd., 1998; Zhila, vd., 2005). Yapılan morfolojik gözlemlerde ise %25 N içeren planktonik formun renginde sararmalar meydana geldiği gözlemlenmiştir. Bu durum %25 N içerikli planktonik formun yağ miktarının %100 N içeren planktonik forma göre daha fazla olabileceğini düşündürmektedir. Bu sonuçlar doğrultusunda, besin ortamına eklenen azot miktarının azaltılmasının, lipit üretimini arttırdığı ve bu konuda daha önce yapılan çalışmalarla da uyumlu olduğu belirlenmiştir.

Dönen algal biyofilm reaktörünün ve S. dimorphus türünün biyofilm oluşturma becerisinin değerlendirilmesi

Gross ve arkadaşlarının yapmış olduğu çalışmada, düşük maliyetli hasat işlemi ve yüksek biyokütle üretkenliği nedeniyle, dönen algal biyofilm sisteminin, süspansiyon bazlı kültür sistemlerine kıyasla alternatif bir alg yetiştirme sistemi olarak kullanılabilir özellikte olduğunu rapor etmişlerdir (Gross ve Wen, 2014). Büyük çaplı endüstriyel alg üretiminde hasat işleminin sonucunda elde edilen biyokütle miktarının önemli olmasından, kapalı bir ortam olan planktonik formun yerine biyofilm reaktörlerinin kullanılmasının daha kazançlı bir tercih olacağı düşünülmektedir. Aynı zamanda endüstriyel üretim açısından hasat işlemi de çok önemlidir. Bu çalışmada yapılan planktonik formun hasat işlemi çok yoğun santrifüj işlemi gerektirmiştir ve maliyeti fazladır. Biyofilm reaktörlerinde hasat işlemi planktonik kültürlenmeye göre daha kolaydır ve daha az miktarda santrifüj işlemi ile gerekli hasat elde edilebilmektedir. Bu yüzden büyük ölçekli endüstriyel alg üretiminde biyofilm reaktörlerinin kullanılması, biyokütle hasadının maliyetini düşürebileceği öngörülmektedir ve deneme sonucunda elde edilen veriler, daha önce rapor edilmiş bilgiler ile aynı doğrultudadır.

Dönen algal biyofilm reaktörünün tespit edilmiş iki tane dezavantajı vardır. Bunlardan birincisi açık bir sistem olduğundan başka alg türlerinin ve bakterilerin kontaminasyonuna açık olması, ikincisi ise besiyerinin buharlaşarak miktarının azalmasıdır. Bu yüzden sistem kurulduğunda istenilen biyokütleyi elde etmek için besiyeri miktarına dikkat edilmeli ve kritik sınırı aştığında mutlaka besiyeri takviyesi yapılması gerekmektedir. Gross ve arkadaşları, dönen

algal biyofilm reaktörünün, yüksek oranda biyokütle üretimi ve hasat işleminin kolay olması yönünden, açık havuzlara ve fotobiyoreaktörlere oranla daha fazla avantajlara sahip olan bir reaktör olduğunu belirtmişlerdir (Gross ve Wen, 2014). Bunlardan en önemlisi sisteme aşılanan mikroalglerin ışığa ve besiyerine eşit oranda maruz kalmalarıdır. Reaktör çalıştırıldığında ve disk dönmeye başladığında teknenin içerisinde giren kısım besiyeri bakımından zenginleşirken üste kalan kısım ışık ihtiyacını karşılar ve disk sürekli olarak belirli hızda döndüğünden halat üzerinde biyofilm oluşturmuş biyokütle eşit oranda besi ortamından ve ışıktan faydalanabilmektedir. Laboratuar ortamına uyarlanacak olan dönen algal biyofilm reaktöründe dikkat edilmesi gereken en önemli olay disk üzerine kaplanacak materyalin iyi seçilmesidir. Gross ve arkadaşlarının yapmış olduğu çalışmada son beş yıl içerisinde biyofilm bazlı kültürlenme gerçekleştirmek için kurulan reaktörlerin daha çok laboratuar ortamında kurulduğunu ve kaplama için kullanılan materyallerin pamuk bazlı malzemelerden, bozunmaz polimer tabakalara kadar değişkenlik gösterdiğini rapor etmişlerdir (Gross ve Wen, 2014). Daha önce yapılan çalışmalarda cam, polistiren köpük, tülbent bez, poliüretan köpük, vermikülit, jüt, polyester, karton, polilaktik asit, cam elyafı, pamuk kanalı, pamuk ipi gibi mikroalglerin biyofilm oluşturmasının denendiği materyaller rapor edilmiştir (Gross, vd., 2013; Johnson ve Wen, 2010; Shen, vd., 2014). Yapılan başka bir çalışmada ise, kaplama malzemeleri seçilirken dikkat edilmesi gereken başlıca özelliğin dayanıklılık ve yeniden kullanabilirliğin yanı sıra hücrelerin tutunma kabiliyetlerinin olması gerektiğini vurgulamışlardır (Gross, vd., 2013). Eğer bu materyal denemeleri yapılmazsa istenilen biyokütleyi elde etmek mümkün olmayacaktır ve büyük ölçekli endüstriyel biyokütle üretim maliyetini arttıracaktır. Mantzorou ve arkadaşlarının daha önce yapmış oldukları bir çalışmada, biyofilm oluşumunu destekleyici olan malzemenin dokusunun ve pürüzlü yüzeyinin hücrelerin yapışmasında kilit bir rol oynadığının kanıtlandığını belirtmişlerdir (Mantzorou ve Ververidis, 2019). Bu çalışmada denenen en pürüzlü yüzey olan hava taşında mikroalglerin tutunma oranlarının yüksek olduğu fakat hasat işlemini gerçekleştirirken çok fazla biyokütle kaybının yaşandığı sonucuna varılmıştır ve bu yüzden tercih edilmemiştir. Dönen algal biyofilm reaktörüne sardığımız polietilen halat ise hava taşına göre kısmen daha az pürüzlüdür fakat tutunma oranı ve hasat işleminin kolaylığı nedeniyle biyofilm oluşumunun sağlanabilmesi için substrat yüzeyi olarak tercih edilmiştir. Cui’ nin yapmış olduğu çalışmada S. dimorphus mikroalginin, çelik, naylon ve cam yüzeylerde biyofilm oluşturma oranlarını karşılaştırmış ve en yüksek tutunma oranının naylonda olduğunu rapor etmiştir (Cui, 2013). Bu çalışma içerisinde S. dimorphus mikroalginin farklı substratlara tutunma oranlarını incelerken naylon ip de kullanılmış fakat hasat işlemi sırasında ipin kıvrımlarının arasındaki biyokütlelerin toplanmasında sıkıntı yaşandığı için tercih edilmemiştir.

Bununla birlikte daha önce yapılan çalışmalarda biyofilm oluşturmada kullanılabilecek standart bir substratın henüz rapor edilmediğini belirtmişlerdir (Mantzorou ve Ververidis, 2019). Bu yüzden dönen algal biyofilm reaktöründe biyofilm oluşumunu desteklemek için daha fazla substrat denemelerinin yapılmasına ihtiyaç vardır. Ayrıca Mantzorou ve arkadaşlarının yapmış olduğu çalışmada planktonik ortamda kültürlenen biyokütlelerin hasat işleminde birçok sorun meydana geldiğini, biyofilm sistemlerinde ise hasat işleminin tutunma materyallerinden sıyrılarak gerçekleştirilebilen basit bir işlem olduğunu rapor etmişlerdir (Mantzorou ve Ververidis, 2019). Dönen algal biyofilm reaktöründe diskin üzerinde biyofilm oluşturan algleri, kaplamanın türüne göre kazıma ya da sıvı içinde çalkalama yöntemi kullanarak izole etmek mümkündür. Deneme ve gözlem sonucunda elde ettiğimiz veriler yapılan diğer çalışmalar ile paralellik göstermektedir.

Katarzyna ve arkadaşlarının yapmış olduğu bir çalışmada, her mikroalg türünün farklı özellikleri ve davranış şekilleri olduğunu, bu yüzden bazıları biyofilm oluşturarak gelişim gösterebilirken, bazılarının ise planktonik formda gelişim gösterebileceğini ve buna bağlı olarak da biyofilm sistemlerinin kurulumunda dikkat edilmesi gereken en önemli faktörün uygun alg türünün seçilmesi olduğunu rapor etmişlerdir (Katarzyna, vd., 2015). Yapılan bir diğer çalışma içerisinde Chlorella vulgaris ve Scenedesmus obliquus mikroalglerinin steril ve steril olmayan koşullardaki biyofilm oluşturma yetenekleri karşılaştırmış ve bu karşılaştırma sonucunda S. obliquus mikroralginin her iki koşulda da C. vulgaris’ e göre daha kalın biyofilm oluşturduğunu rapor etmişlerdir (Irving ve Allen, 2011). Bu çalışma için laboratuar koşullarına modifiye edilerek tasarlanmış olan dönen alg biyofilm reaktörüyle yapılan deneylerde S. dimorphus mikroalginin biyofilm oluşturma yeteneği incelenmiştir ve polietilen halatının üzerinden hasat edilen kuru madde miktarı baz alınarak S. dimorphus türünün yüksek biyofilm oluşturabilme yeteneğinin olduğu belirlenmiştir.

Azot stresinin lipit üretim mekanizması üzerine etkisinin değerlendirilmesi

Griffiths ve arkadaşlarının yapmış olduğu çalışmada azot sınırlamasının, depolanan lipit miktarının arttırılması için en sık kullanılan yöntem olduğunu ve sebebinin ise ucuz ve kolay uygulanabilir olduğunu belirtmişlerdir (Griffiths, vd., 2011). Bu çalışmada, planktonik ve biyofilm formunun üzerinde uygulanan, stres koşullarından biri olan azot eksiltme işlemi sonucunda elde edilen lipit miktarının arttığı sonucuna varılmıştır. Griffiths ve arkadaşlarının yapmış oldukları bir diğer çalışmada lipit verimliliğinin arttırılması, biyodizel üretim oranını belirleyen en önemli parametre olduğunu rapor etmişlerdir (Griffiths ve Harrison, 2009). Elde

ettiğimiz bu verilere bakıldığında azot stresinin uygulanması lipit verimini artırdığı sonucu çıkmaktadır ve bu sonuçlar daha önce yapılan çalışmaların sonuçlarıyla uyumludur. Stres koşullarında üretilen lipitler, biyodizel üretimi için kullanılabilir özelliktedir (Sharma, vd., 2012).

6. SONUÇ VE ÖNERİLER

Mikroalglerden büyük ölçekte, yüksek biyokütle verimliği ve yüksek miktarda lipit elde edebilmek için azot stresinin uygulanması, mikroalglerin biyofilm oluşturmasına teşvik edilmesi ve diğer koşulların optimizasyonu çok önemlidir. Yapılan bu çalışmadan elde edilen bilgiler ışığında, kültürlenme sistemlerinde dönen algal biyofilm reaktörünün kullanılması ve seçilen alg türüne bağlı olarak azot stresinin uygulanması lipit üretimini arttıracağı sonucu çıkmaktadır. Mikroalglerden elde edilen bu lipitlerin miktarlarının arttırılmasına yönelik yapılan çalışmalar oldukça sınırlıdır. Sharma ve arkadaşlarının yapmış oldukları çalışmada biyodizel üretimi için büyük ölçekli bir ticari yetiştirme sisteminde optimum lipit üretkenliğinin sağlanması için, indüksiyon streslerinin kombine edilmesi, her bir Mikroalg suşu için farklılık göstereceğini ve besin tedarikine, çevresel ve iklim koşullarına bağlı olarak değişeceğini rapor etmiştir (Sharma, vd., 2012). Mikroalglerin biyofilm oluşturmasını etkileyen faktörlerde henüz araştırılmamış birçok nokta vardır. Bu parametrelerin belirlenebilmesi için birçok çalışma yapılmış olmasına rağmen, bu biyofilm sistemlerinin değerlendirilebilmesi için daha büyük sistemler kurulması gerekmektedir. Bu parametreler belirlenip gerekli koşullar oluşturulduğunda büyük ölçekli endüstriyel üretim sistemlerinin daha işlevsel olması sağlanabilir. Bu yüzden büyük ölçekli endüstriyel ya da küçük ölçekli biyokütle üretimini gerçekleştirebilmek ve mikroalglerden biyodizel eldesinin sağlanabileceği lipitler elde edebilmek için daha fazla çalışma gerçekleştirmek gerekmektedir.

KAYNAKLAR DİZİNİ

Aktar, S., ve Cebe, G. E. (2010), Alglerin genel özellikleri, kullanım alanları ve eczacılıktaki önemi, Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Dergisi, 39, 237- 264.

Ball, S., Colleoni. C., Cenci, U., Raj, J. N., Tirtiaux, C. (2011), The evolution of glycogen and starch metabolism in eukaryotes gives molecular clues to understand the establishment of plastid endosymbiosis, Journal of Experimental Botany, 62, 1775-1801. Doi: 10.1093/jxb/erq411

Barsanti, L., ve Gualtieri, P. (2005), Algae Anatomy, Biochemistry and Biotechnology Second Edition, Pisa, Italy: CRC Press, 1- 325.

Baudelet, P. H., Ricochon, G., Linder, M., ve Muniglia, L. (2017), A new insight into cell walls of Chlorophyta, Algal Research, 25, 333-371. Doi: 10.1016/j.algal.2017.04.008

Bhattacharya, D., ve Medlin, L. (1998), Algal Phylogeny and the Origin of Land Plants, Plant Physiology, 116, 9-15. Doi: Doi.org/10.1104/pp.116.1.9

Blatti, J. L., Michaud, J., ve Burkart, M. D. (2013), Engineering fatty acid biosynthesis in microalgae for sustainable biodiesel, Current Opinion in Chemical Biology, 17, 497-498. Doi: 10.1016/j.cbpa.2013.04.007

Breuer, G., Lamers, P. P., Martens, D. E., Draaisma, R. B., ve Wijffels, R. H. (2013), Effect of light intensity, pH, and temperature on triacylglycerol (TAG) accumulation induced by nitrogen starvation in Scenedesmus obliquus, Bioresource Technology, 143, 1-9. Doi: 10.1016/j.biortech.2013.05.105

Bule, M. H., Ahmed, I., Maqbool, F., Bilal, M., Iqbal, H. M. N. (2018), Microalgae as a source of high-value bioactive compounds, Frotiers in Bioscience (Scholar edition), 10, 197-216. Doi: 10.2741/S509

Chen, J., Li, J., Dong, W., Zhang, X., Tyagi, R. D., Drogui, P., ve Surampalli, R. Y. (2018), The potential of microalgae in biodiesel production, Renewable and Sustainable Energy Reviews, 90, 336-346. Doi: 10.1016/j.rser.2018.03.073

Cheng, D., ve He, Q. (2014), Assessment of environmental stresses for enhanced microalgal biofuel production-an overview, Frontiers in Energy Research, 2, 1-19. Doi: 10.3389/fenrg.2014.00026

Chisti, Y. (2007), Biodiesel from microalgae, Biotechnology Advances, 25, 294–306 Doi: 10.1016/j.biotechadv.2007.02.001

Choudhary, P., Malik, A., ve Pant, K. (2017), Algal biofilm systems: an answer to algal biofuel dilemma, In: Gupta, S.K., Malik, A., Bux, F. (Eds.), Algal Biofuels: Recent Advances and Future Prospects, 77-97. Doi: 10.1007/978-3-319-51010-1_4

KAYNAKLAR DİZİNİ (devam)

Christenson, L. B., ve Sims, R. C. (2012), Rotating Algal Biofilm Reactor and Spool Harvester for Wastewater Treatment with Biofuels By-Products, Biotechnology and Bioengineering, 1-11. Doi: 10.1002/bit.24451

Christenson, L., ve Sims, R. (2011), Production and harvesting of microalgae for wastewater treatment, biofuels and bioproducts, Biotechnology Advances, 29, 686–702. Doi: 10.1016/j.biotechadv.2011.05.015

Chu, W.L., Phang, S.-M., ve Goh, S.H. (1996), Environmental effects on growth and biochemical composition of Nitzschia inconspicua Grunow, Journal of Applied Phycology, 8, 389–396. Doi: 10.1007/BF02178582

Concas, A., Malavasi, V., Costelli, C., Fadda, P., Pisu, M., ve Cao, G. (2016), Autotrophic growth and lipid production of C. sorokiniana in lab batch and BIOCOIL photobioreactors: experiments and modeling, Bioresource Technology, 211, 327-338. Doi: 10.1016/j.biortech.2016.03.089

Cui, Y. (2013), Fundamentals in Microalgae Harvesting: From Flocculation to Self-attachment, M.S. Thesis, North Carolina State University, 157s. Doi:

Çakmak, Z. E. (2013), Mikroalglerde Nötral Lipid İçeriğinin Arttırılması Üzerine Bir Araştırma, Doktora Tezi, Kırıkkale Üniversitesi, Kırıkkale, Fen Bilimleri Enstitüsü, 171s. Doi:

Demirbaş, A. (2010), Use of algae as biofuel sources, Energy Conversion and Management, 51, 2738–2749. Doi: 10.1016/j.enconman.2010.06.010

Demirbaş, A., ve Demirbaş, F. (2010), Importance of algae oil as a source of biodiesel, Energy Conversion and Management, 52, 163-170. Doi: 10.1016/j.enconman.2010.06.055

Elcik, H., ve Çakmakçı, M. (2017), Mikroalg üretimi ve mikroalglerden biyoyakıt eldesi, Journal of the Faculty of Engineering and Architecture of Gazi University, 32(3), 795-820. Doi: 10.17341/gazimmfd.337627

Fica, Z. T., ve Sims, R. C. (2016), Algae-based biofilm productivity utilizing dairy wastewater: effects of temperature and organic carbon concentration, Journal of Biological Engineering, 10(18), 2-7. Doi: 10.1186/s13036-016-0039-y

Geider, R. J., Macintyre, H. L., Graziano, L. M., ve McKay, R. M. (1998), Responses of the photosynthetic apparatus of Dunaliella tertiolecta (Chlorophyceae) to nitrogen and phosphorus limitation, European Journal of Pycology, 33(4), 315-332. Doi: 10.1080/09670269810001736813

Gong, Y., ve Jiang, M. (2011), Biodiesel production with microalgae as feedstock: from strains to biodiesel, Biotechnol Lett, 33, 1269–1284. Doi: 10.1007/s10529-011-0574-z

KAYNAKLAR DİZİNİ (devam)

Gour, R. S., Chawla, A., Singh, H., Chauhan, R. S., ve Kant, A. (2016), Characterization and Screening of Native Scenedesmus sp. Isolates Suitable for Biofuel Feedstock, Plos One, 11(5), 1-16. Doi: 10.1371/journal.pone.0155321

Griffiths, M. J., ve Harrison, S. T. (2009), Lipid productivity as a key characteristic for choosing algal species for biodiesel production, Journal of Applied Phycology, 21(5), 493-507. Doi: 10.1007/s10811-008-9392-7

Griffiths, M. J., Hille, R. P., ve Harrison, S. T. (2011), Lipid productivity, settling potential and fatty acid profile of 11 microalgal species grown under nitrogen replete and limited conditions, Journal of Applied Phycology, 24, 989–1001. Doi: 10.1007/s10811-011-9723-y

Gross, M. A. (2015), Development and optimization of biofilm based algal cultivation, M.S. Thesis, Iowa State University, 127s.

Gross, M., ve Wen, Z. (2014), Yearlong evaluation of performance and durability of a pilot-scale Revolving Algal Biofilm (RAB) cultivation system, Bioresource Technology, 171, 50-58. Doi: 10.1016/j.biortech.2014.08.052

Gross, M., Henry, W., Michael, C., ve Wen, Z. (2013), Development of a rotating algal biofilm growth system for attached microalgae growth with in situ biomass harvest, Bioresource Technology, 150, 195-201. Doi: 10.1016/j.biortech.2013.10.016

Gross, M., Mascarenhas, V., ve Wen, Z. (2015), Evaluating Algal Growth Performance and Water Use Efficiency of Pilot-scale Revolving Algal Biofilm (RAB) Culture Systems, Biotechnology and Bioengineering, 112(10), 2040-2050. Doi: 10.1002/bit.25618

Hsieh, C.-H., ve Wu, W.-T. (2009), Cultivation of microalgae for oil production with a cultivation strategy of urea limitation, Bioresource Technology, 100(17), 3921-3926. Doi: 10.1016/j.biortech.2009.03.019

Irving, T. E., ve Allen, D. G. (2011), Species and material considerations in the formation and development of microalgal biofilms, Applied Microbiology and Biotechnology, 92(2), 283-294. Doi: 10.1007/s00253-011-3341-0

Ishikaa, T., Moheimania, N. R., ve Bahrib, P. A. (2017), Sustainable saline microalgae co- cultivation for biofuel production: A critical review, Renewable and Sustainable Energy Reviews, 78, 356-368. Doi: 10.1016/j.rser.2017.04.110

Johnson, M. B., ve Wen, Z. (2010), Development of an attached microalgal growth system for biofuel production, Applied Microbiology and Biotechnology, 85(3), 525-534. Doi: 10.1007/s00253-009-2133-2

Jones, C. S., ve Mayfield, S. P. (2012), Algae biofuels: versatility for the future of bioenergy, Current Opinion in Biotechnology, 23(3), 346-351. Doi: 10.1016/j.copbio.2011.10.013

KAYNAKLAR DİZİNİ (devam)

Katarzyna, L., Sai, G., ve Singh, O. A. (2015), Non-enclosure methods for non-suspended microalgae cultivation: literature review and research needs, Renewable and Sustainable Energy Reviews, 42, 1418-1427. Doi: 10.1016/j.rser.2014.11.029

Larsdotter, K. ( 2006), Wastewater treatment with microalgae – a literature review, Vatten, 62, 31-38. Doi:

Lichtenthaler, H. K., ve Wellburn, A. R. (1983), Determinations of total carotenoids and chlorophylls a and b of leaf extracts in different solvents, Biochemical Society Transactions, 11(5), 591-592. Doi: 10.1042/bst0110591

Luna, D. E. (2016), Effect of green and red light in lipid accumulation and transcriptional profile of genes implicated in lipid biosynthesis in Chlamydomonas reinhardtii, Biotechnology Progress, 32(6), 1404-1411. Doi: 10.1002/btpr.2368

Mantzorou, A., ve Ververidis, F. (2019), Microalgal biofilms: A further step over current microalgal cultivation techniques, Science of the Total Environment, 651(2), 3187-3201. Doi: 10.1016/j.scitotenv.2018.09.355

Mantzorou, A., Navakoudis, E., Paschalidis, K., ve Ververidis, F. (2018), Microalgae: a potential tool for remediating aquatic environments from toxic metals, International Journal of Environmental Science and Technology, 15(8), 1815-1830. Doi: 10.1007/s13762-018-1783-y

Mata, T. M., Martins, A. A., ve Caetano, N. S. (2009), Microalgae for biodiesel production and other applications: A review, Renewable and Sustainable Energy Reviews, 14(1), 217-232. Doi: 10.1016/j.rser.2009.07.020

Ozkan, A., Kinney, K., Katz, L., ve Berberoglu, H. (2012), Reduction of water and energy requirement of algae cultivation using an algae biofilm photobioreactor, Bioresource Technology, 114, 542-548. Doi: 10.1016/j.biortech.2012.03.055

Paliwal, C., Mitra, M., Bhayani, K., Bharadwaj, V. S., Ghosh, T., Dubey, S., ve Mishra, S. (2017), Abiotic stresses as tools for metabolites in microalgae, Bioresource Technology, 244, 1216-1226. Doi: 10.1016/j.biortech.2017.05.058

Pancha, I., Chokshi, K., George, B., Ghosh, T., Paliwal, C., Maurya, R., ve Mishra, S. (2014), Nitrogen stress triggered biochemical and morphological changes in the microalgae Scenedesmus sp. CCNM 1077, Bioresource Technology, 156, 146-154. Doi: 10.1016/j.biortech.2014.01.025

Pancha, I., Chokshi, K., Maurya, R., Trivedi, K., Patidar, S. K., Ghosh, A., ve Mishra, S. (2015), Salinity induced oxidative stress enhanced biofuel production potential of microalgae Scenedesmus sp. CCNM 1077, Bioresource Technology, 189, 341-348. Doi: 10.1016/j.biortech.2015.04.017

KAYNAKLAR DİZİNİ (devam)

Polizzi, B., Bernar, O., ve Ribot, M. (2017), A time-space model for the growth of microalgae biofilms for biofuel production, Journal of Theoretical Biology, 432, 55-79. Doi: 10.1016/j.jtbi.2017.08.017

Pragya, N., Pandey, K. K., ve Sahoo, P. (2013), A review on harvesting, oil extraction and biofuels production technologies from microalgae, Renewable and Sustainable Energy Reviews, 24, 159-171. Doi: 10.1016/j.rser.2013.03.034

Procházková, G., Brányiková, I., Zachleder, V., ve Brányik, T. (2013), Effect of nutrient supply status on biomass composition of eukaryotic green microalgae, Journal of Applied Phycology, 26(3), 1359–1377. Doi: 10.1007/s10811-013-0154-9

Rawat, I., Kumar, R. R., Mutanda, T., ve Bux, F. (2010), Dual role of microalgae: Phycoremediation of domestic wastewater and biomass production for sustainable biofuels production, Applied Energy, 88(10), 3411-3424. Doi: 10.1016/j.apenergy.2010.11.025

Richmond, A. (2013), Handbook of Microalgal Culture: Biotechnology and Applied Phycology, 2, 3- 566. Doi: 10.1002/9781118567166

Rodolfi, L., Zittelli, 1. G., Bassi, N., Padovani, G., Biondi, N., Bonini, G., ve Tredici, M. R. (2009), Microalgae for Oil: Strain Selection, Induction of Lipid Synthesis and Outdoor Mass Cultivation in a Low-Cost Photobioreactor, Biotechnology and Bioengineering, 102(1), 100- 112. Doi: 10.1002/bit.22033

Roeselers, G., Loosdrecht, M. C., ve Muyzer, G. (2008), Phototrophic biofilms and their potential applications, Journal of Applied Phycology, 20(3), 227-235. Doi: 10.1007/s10811-007- 9223-2

Sankaran, R., Show, P. L. (2018), Exploitation and Biorefinery of Microalgae, Biofuels Bioproducts and Biorefining, 10(6), 896-916. Doi: 10.1016/B978-0-444-63992-9.00019-7

Schnurr, P. J., Espie, G. S., ve Allen, D. G. (2013), Algae biofilm growth and the potential to stimulate lipid accumulation through nutrient starvation, Bioresource Technology, 136, 337- 344. Doi: 10.1016/j.biortech.2013.03.036

Schuhmann, H., Lim, D. K., ve Schenk, P. M. (2014), Perspectives on metabolic engineering for increased lipid contents in microalgae, Biofuels, 3(1), 71-86. Doi: 10.4155/bfs.11.147

Sharma, K. K., Schuhmann, H., ve Schenk, P. M. (2012), High Lipid Induction in Microalgae for Biodiesel Production, Energies, 5(5), 1532-1553. Doi: 10.3390/en5051532

Shen, Y., Chen, C., Chen, W., ve Xu, X. (2014), Attached culture of Nannochloropsis oculata for lipid production, Bioprocess Biosystems Engineering, 37(9), 1743-1748. Doi: 10.1007/s00449- 014-1147-z

KAYNAKLAR DİZİNİ (devam)

Shen, Y., Xu, X., Zhao, Y., ve Lin, X. (2014), Influence of algae species, substrata and culture conditions on attached microalgal culture, Bioprocess Biosystems Engineering, 37(3), 441-450. Doi: 10.1007/s00449-013-1011-6

Shifrin, N. S., ve Chisholm, S. W. (1981), Phytoplankton lipids: Interspecific differences and effects of nitrate, silicate and light‐dark cycles, Journal of Phycology, 17(4), 374-384. Doi: 10.1111/j.1529-8817.1981.tb00865.x

Singh, J., ve Gu, S. (2010), Commercialization potential of microalgae for biofuels production, Renewable and Sustainable Energy Reviews, 14(9), 2596-2610. Doi: 10.1016/j.rser.2010.06.014

Soydemir, G. (2016), Atıksu Ortamında Yetiştirilen Mikroalglerin Yağının Karakterizasyonu ve Değerlendirilmesi, Doktora Tezi, Gebze Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Kocaeli, 128s.

Stephenson, A. L., J. S., Howe, C. J., Scott, S. A., ve Smith, A. G. (2010), Influence of nitrogen- limitation regime on the production by Chlorella vulgaris of lipids for biodiesel feedstocks, Biofuels, 1(1), 47-58. Doi: 10.4155/bfs.09.1

Sukenik, A., Carmeli, Y., ve Berner, T. (1989), Regulatıon of fatty acid composition by irradiance level in the eustigmatophyte nannochloropsis sp., Journal of Phycology, 25(4), 686- 692. Doi: 10.1111/j.0022-3646.1989.00686.x

Sun, X.-M., Ren, L.-J., Zhao, Q.-Y., Ji, X.-J., ve Huang, H. (2018), Enhancement of lipid accumulation in microalgae by metabolic engineering, BBA - Molecular and Cell Biology of Lipids, 1864(4), 552-566. Doi: 10.1016/j.bbalip.2018.10.004

Takagi, M., Watanabe, K., Yamaberi, K., ve Yoshida, T. (2000), Limited feeding of potassium nitrate for intracellular lipid and triglyceride accumulation of Nannochloris sp. UTEX LB1999, Applied Microbiology Biotechnology, 54(1), 112-127. Doi: 10.1007/s002530000333

Thompson, G. A. (1996), Lipids and membrane function in green algae, BBA - Molecular and Cell Biology of Lipids, 1032(1), 17-45. Doi: 10.1016/0005-2760(96)00045-8

Uduman, N., Qi, Y., Danguah, M. K., Hoadley, A. (2010), Dewatering of microalgal cultures : a major bottleneck to algae-based fuels, Journal of Renewable and Sustainable Energy, 2(1), 012701. Doi: 10.1063/1.3294480

Wang, L., Li, Y., Sommerfeld, M., ve Hu, Q. (2012), A flexible culture process for production of the green microalga Scenedesmus dimorphus rich in protein, carbohydrate or lipid, Bioresource Technology, 129, 289-295. Doi: 10.1016/j.biortech.2012.10.062

KAYNAKLAR DİZİNİ (devam)

Wong, Y., Ho, Y., Ho, K., Leung, H., ve Yung, K. (2016), Maximization of cell growth and lipid production of freshwater microalga Chlorella vulgaris by enrichment technique for biodiesel production, Environmental Science and Pollution Research, 24(10), 9089-9101.

Xin, L., Hong-ying, H., Ke, G., ve Ying-xue, S. (2010), Effects of different nitrogen and phosphorus concentrations on the growth, nutrient uptake, and lipid accumulation of a freshwater microalga Scenedesmus sp., Bioresource Technology, 101(14), 5494-5500. Doi: 10.1016/j.biortech.2010.02.016

Xu, C., Andre, C., Fan, J., ve Shanklin, J. (2016,. Cellular Organization of Triacylglycerol Biosynthesis in Microalgae, Subcellular Biochemistry, 86, 207-221. Doi: 10.1007/978-3-319- 25979-6_9

Zhila, N. O., Kalacheva, G. S., ve Volova, T. G. (2005), Effect of Nitrogen Limitation on the Growth and Lipid Composition of the Green Alga Botryococcus braunii Kutz IPPAS H-252, Russian Journal of Plant Physiology, 53(3), 311-319. Doi: 10.1007/s11183-005-0047-0

Zippel, B., Rijstenbil, J., ve Neu, T. R. (2007), A flow-lane incubator for studying freshwater and marine phototrophic biofilms, Journal Microbiological Methods, 70(2), 336-345. Doi: 10.1016/j.mimet.2007.05.013

ÖZGEÇMİŞ

Kişisel Bilgiler

Soyadı, adı : KAR FATMA

Doğum tarihi ve yeri : 20/06/1992 BURSA e-mail : [email protected]

Eğitim

Derece Doktora Eğitim Birimi Mezuniyet Tarihi

Yüksek lisans Kütahya Dumlupınar Üniversitesi 2019

Lisans Kütahya Dumlupınar Üniversitesi 2015

Lise Bursa Süleyman Çelebi Lisesi 2010

İş Deneyimi

Yıl Yer Görev

2017- Özel Osmangazi Birey Özel Öğretim Kursu Biyoloji Öğrt.

Yabancı Dil

İngilizce