Universidad de Matanzas “CAMILO CIENFUEGOS” FACULTAD DE AGRONOMÍA
Evaluación in vitro de la actividad antimicrobiana de una cepa de Bacillus subtilis con potencial probiótico
Tesis presentada en opción al Título Académico de Ingeniero Agrónomo
Autor: Benoit Bayoda Hodabalo
Tutoras: Dr C. Ana Julia Rondón Castillo
MsC. Marta E. Laurencio Silva
Ing. Marvelys Socorro Ortega
Matanzas 2013 PENSAMIENTO
Amargas son las raíces del estudio, pero los frutos son dulces.
Albert Einstein NOTA DE ACEPTACIÓN ______
______Presidente del Tribunal Firma ______Miembro del Tribunal Firma ______Miembro del Tribunal Firma ______Miembro del Tribunal Firma
Dado en Matanzas, el día ____ del mes de ______del año 2013. “Año 55 de la Revolución” DECLARACIÓN DE AUTORIDAD
Yo, Benoit Bayoda Hodabalo, estudiante de 5to año de la facultad de Agronomía, declaro que soy el único autor de este trabajo de diploma y autorizo a la Universidad de Matanzas “Camilo Cienfuegos” a hacer uso del mismo para lo que sea necesario.
______Firma DEDICATORIA
A mis padres Bayoda Essobyou y Belei Essodezam quienes han confiado en mí en los estudios.
A mi tio Belei Estache por su apoyo y estimulo en todo mi trayectoria estudiantil.
A mis hermanos, especialmente Juliette y Romeo y a mi tutor de casa Mr Innocent, quien me enseñó a ser una persona responsable. OPINIÓN DE LOS TUTORES AGRADECIMIENTOS
Quiero expresar mis más sinceros agradecimientos en primer lugar al gobierno de mi país (TOGO) y al gobierno cubano, los cuales me dieron la oportunidad de estudiar y de ser hoy un profesional más para esta sociedad.
A mis tutores, la Dra C. Ana J. Rondón Castillo, la MsC. Marta E. Laurencio Silva, la Ing. Marvelis Socorro Ortega y el Dr C. Manuel Pérez Quintana, por brindarme su apoyo constante, su tiempo y paciencia para que este trabajo se realizara satisfactoriamente.
A mi tío, mis padres por darme la vida, la atención y apoyo que siempre he necesitado. A mis hermanos y todos mis amigos de mi país. A todos los profesores por su apoyo en mi carrera estudiantil. A todos mis compañeros de estudio que de una forma u otra hicieron posible la culminación de este trabajo.
Muchas Gracias. RESUMEN
Las bacterias del género Bacillus producen sustancias que inhiben el desarrollo de microorganismos patógenos. El presente trabajo tuvo como objetivo evaluar la actividad antimicrobiana de la cepa Bacillus subtilis 21BMC, con potencial probiótico. Para ello se realizaron tres experimentos in vitro donde se enfrentó la cepa Bacillus subtilis (21BMC), procedente del tracto digestivo de cerdos a microorganismos patógenos y se evaluó la capacidad de coagregación de esta bacteria a células patógenas. Como resultado, Bacillus subtilis 21BMC produjo sustancias antimicrobianas o antibioticos que inhiben el crecimiento de Shigella spp. Se demostró además el efecto antimicrobiano de esta cepa frente a E. coli, Salmonella spp. y Shigella spp. a través del establecimiento de cocultivos en condiciones de simulación del TGI de cerdos. Se comprobó también, que las células de Bacillus inducen un alto grado de coagregación con las paredes celulares de los microorganismos patógenos, tanto en estado vegetativo como esporulado, lo cual significa que pudieran presentar un porciento elevado de adherencia de las fimbrias y arrastrar a los patógenos a través del tracto digestivo de los animales. Los resultados de este trabajo avalan el posible uso de este microorganismo como probiótico. INDICE INTRODUCCIÓN 1 CAPÍTULO 1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 1.1. Los probióticos 5 1.1.1. Reseña histórica 5 1.1.2. Evolución del concepto 5 1.2. Mecanismos de acción de los probióticos 7 1.3. Criterios de selección de los microorganismos probióticos 9 1.4. Actividad antimicrobiana 13 1.4.1. Producción de bacteriocinas y antibióticos 14 1.5. Género Bacillus. Características morfológicas, fisiológicas, 15 bioquímicas e inmunológicas. 1.5.1. Características morfológicas y fisiológicas del género Bacillus 15 1.5.2. Características bioquímicas del género Bacillus 18 1.5.3. Acción de las endosporas en el sistema inmunológico 18 1.6. Efecto de los probióticos elaborados con Bacillus spp en cerdos 19 CAPÍTULO 2. MATERIALES Y MÉTODOS GENERALES 2.1. Materiales y métodos 22 2.1.1. Cepas utilizadas 22 2.1.2. Medios de cultivos 22
2.2. Conservación de cepas 23 2.3. Procedimiento experimental para la evaluación in vitro de la actividad antimicrobiana de Bacillus subtilis 21BMC frente a cepas 23 potencialmente patógenas. 2.3.1. Experimento 1. Evaluación de la actividad antimicrobiana de la cepa de Bacillus subtilis (21BMC) frente a cepas patógenas, con la aplicación de la técnica de difusión de sustancias en agar. 24 2.3.2. Experimento 2. Determinación del efecto antimicrobiano de Bacillus subtilis a través del establecimiento de cocultivos con bacterias potencialmente patógenas. 25 2.3.3. Experimento 3. Comprobación del nivel de coagregación de Bacillus spp a células de bacterias patógenas. 26 2.4. Procesamiento estadístico 26 CAPÍTULO 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 3.1. Evaluación de la actividad antimicrobiana de cepa de Bacillus subtilis frente a cepas patógenas, con la aplicación de la técnica de difusión de sustancias en agar. 27 3.2. Determinación del efecto antimicrobiano de Bacillus subtilis a través del establecimiento de cocultivos con bacterias potencialmente patógenas. 31 3.3. Comprobación del nivel de coagregación de Bacillus spp a células 35 de bacterias patógenas. CAPÍTULO 4. VALORACIÓN ECONÓMICA 4.1. Valoración Económica 39 CONCLUSIONES 40 RECOMENDACIONES 41 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ANEXOS INTRODUCCIÓN
La producción porcina moderna se caracteriza por una alta intensidad productiva que somete a los animales a situaciones estresantes, lo que trae como consecuencia, una mayor frecuencia en la aparición de enfermedades y una disminución de los niveles de producción.
Antiguamente, para atenuar esta problemática, se incorporaron los antibióticos en las dietas como Aditivos Promotores de Crecimiento (APC), los cuales mostraron ser efectivos en la disminución de los trastornos diarreicos y en el aumento del comportamiento productivo de los animales (Jones et al., 2003; Coppola y Gil− Tuners, 2004).
El uso indiscriminado de los antibióticos en el mundo, tanto en el hombre como en los animales, provocaron resistencia microbiana y crearon residuos en los animales, de ahí la necesidad de sustituir a los antibióticos como promotores del crecimiento en la producción animal por otros aditivos alternativos promotores de la respuesta productiva que sean compatibles con el medio ambiente y eviten efectos negativos en la salud humana, tales como los probióticos (Coppola y Gil−Tuners, 2004; Tim et al., 2006).
Al finales del siglo pasado, en la década del 90, se desarrollaron los probióticos, conjunto de productos que no crean los problemas de resistencia microbiana o efecto residual que producen los antibióticos, los cuales se elaboran a partir de microorganismos, principalmente bacterias productoras de endosporas (Bacillus), bacterias lácticas, hongos y levaduras, que contribuyen a mantener el equilibrio ecológico favorable en el intestino y el buen funcionamiento del sistema inmune (Bengmark, 1998; Ferreira, 2003).
Dentro de los productos que presentan actividad probiótica se encuentran los cultivos de Bacillus spp procedentes del tracto digestivo de los animales y el hombre, los cuales se destacan por su efectividad en mejoramiento de la microbiota intestinal (Rodríguez et al., 1996; Spring et al., 1996 y Bocourt et al., 2002).
1 En tal sentido, algunos cultivos del género Bacillus spp. y sus endosporas, reciben atención por el efecto probiótico que brindan en el balance de la microbiota intestinal, el mejoramiento de la digestión, la activación del sistema inmune, la absorción de nutrientes, la mejora de la fisiología digestiva, la mayor eficiencia en la conversión alimenticia y los mejores rendimientos productivos, en cerdos y en las aves (Lata et al., 2006; Mutus et al., 2006; Utiyama et al., 2006). Se conocen productos elaborados a partir de cepas de B. licheniformis, B. subtilis y sus endosporas como: el Biomin® P.E.P y el Protexin, BioPlus 2B®, BioGrow®, Biostart®, Toyocerin®, Liqualife®, Biosporin® y CenBiot®, con efectos probióticos en cerdos (Hong et al., 2004; Ugras et al., 2013).
Existen instituciones científicas cubanas, tales como la Universidad de Matanzas “Camilo Cienfuegos” y el Instituto de Ciencia Animal (ICA), que ejecutan diferentes proyectos de investigación para el desarrollo de productos probióticos económicamente viables y que dentro de sus características tengan la capacidad de inhibir a microorganismos patógenos de los animales (Pérez, 2000; Milián, 2009; Rondón, 2009; Laurencio, 2010; Pérez, 2011).
Se sabe que la actividad probiótica es multifactorial y puede estar compuesta por la acción directa del preparado biológico sobre el ecosistema intestinal o la acción indirecta apoyada por la estimulación de la respuesta inmune animal (Mañosa et al., 2009).
Problema
En la producción animal contemporánea se producen constantemente situaciones de estrés que alteran el equilibrio biológico y traen consigo múltiples enfermedades que afectan la salud animal y el rendimiento productivo. Ha sido práctica habitual el uso indiscriminado de antibióticos como promotores del crecimiento animal y mejoradores de la salud; sin embargo, estos han generado la aparición de resistencia microbiana en los gérmenes que causan enfermedades en el hombre y los animales. Si esta situación continúa, los antimicrobianos no serán efectivos contra un número importante de
2 enfermedades. Es por ello, que esta práctica está prohibida en diversos países y se evalúan nuevas alternativas para contrarrestar el empleo de los antibióticos como promotores del crecimiento animal. Los probióticos a base de bacterias productoras de endosporas, y en especial de Bacillus spp, se utilizan para neutralizar la incidencia o colonización de microorganismos patógenos y los efectos negativos que traen para la salud. Los microorganismos probióticos se caracterizan por producir diferentes sustancias antimicrobianas que inhiben el crecimiento de bacterias patógenas causantes de desórdenes en el tracto gastrointestinal (TGI) de los animales y el hombre. De ahí que una de las pruebas de selección de estos microorganismos sea la evaluación de la actividad antimicrobiana. En el laboratorio de Microbiología de la UMCC se cuenta con cepas de Bacillus subtilis spp aisladas del tracto digestivo de cerdos, a las cuales es necesario realizar su selección como candidatas a probióticos a partir de la evaluación in vitro de su actividad antimicrobiana frente a microorganismos patógenos.
Hipótesis:
La evaluación in vitro de la actividad antimicrobiana de cepas de Bacillus subtilis frente a bacterias patógenas, permitirá la selección de cepas con potencial probiótico.
Para desarrollar esta hipótesis se definieron los siguientes objetivos:
Objetivo general
Evaluar in vitro la actividad antimicrobiana de Bacillus subtilis 21BMC frente a microorganismos potencialmente patógenos, para su selección como candidatas a cepas probióticas.
Objetivos específicos
1. Evaluar la actividad antimicrobiana de la cepa Bacillus subtilis 21BMC, procedente del tracto digestivo de cerdos, frente a microorganismos patógenos.
3 2. Determinar el efecto antimicrobiano de Bacillus subtilis 21BMC a través del establecimiento de cocultivos con microorganismos patógenos.
3. Comprobar el nivel de coagregación de Bacillus subtilis 21BMC a células de bacterias patógenas.
NOVEDAD CIENTÍFICA
Por primera vez se realiza en Cuba, la evaluación de la actividad antimicrobiana de una cepa Bacillus spp a través de cocultivos con bacterias patógenas en presencia de un medio de cultivo que simula el contenido alimenticio del tracto gastrointestinal de los cerdos.
4 CAPÍTULO 1
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 1.1. Los Probióticos
1.1.1. Reseña histórica
El uso de los probióticos se remonta a principios del siglo XX con los estudios de Metchnikoff (1903 y 1908) quien fuera el primero en describir que la ingestión de bacterias ácido lácticas podía tener efectos beneficiosos en la microbiota intestinal. Él había observado que los agricultores búlgaros tomaban grandes cantidades de leche agria, una forma primitiva de yogurt y gozaban de vidas largas y saludables. Por sus estudios posteriores sobre el sistema inmunológico, Metchnikoff fue galardonado con el Premio Nobel en 1908 (Sigrid y Green, 2009). Numerosos trabajos se han desarrollado durante las últimas décadas para esclarecer los efectos de los probióticos, obtenidos a partir de bacterias formadoras de endosporas, bacterias ácido lácticas, y levaduras, dando lugar a muchas investigaciones (Chaveerach, 2004; Martínez-Cócera y Mesa del Castillo, 2005).
1.1.2. Evolución del concepto El concepto de probióticos ha evolucionado desde los trabajos de Metchnikoff, (1905), quien planteó, según sus estudios, que la aparente longevidad de ciertos campesinos balcánicos estaba asociada a la ingestión de productos fermentados, portadores de Lactobacillus.
En 1906 el médico pediatra francés Henry Tissier observó que los niños con diarrea tenían en sus heces una baja cantidad de bifidobacterias. Estas bacterias “bífidas” eran, por el contrario, abundantes en los niños sanos. Este especialista sugirió la posibilidad de administrar dichas bacterias a pacientes con diarrea para ayudar a restaurar su microbiota intestinal (FAO/OMS, 2001). Lilly y Stilwell (1965) utilizaron por primera vez el término “probiótico” para representar a “sustancias secretadas por un organismo y capaces de estimular
5 el crecimiento de otro”. Nueve años después, Parker (1974) describió a los probióticos como “organismos y sustancias que contribuyen al balance microbiano intestinal”. Quince años después, Fuller (1989) postuló que los probióticos eran “suplementos microbianos que influyen beneficiosamente en el animal huésped al mejorar su balance microbiano”. Tiempo después, Salminen (2004) definió a los probióticos como “alimentos que contienen bacterias vivas, las cuales son beneficiosas para la salud”.
González et al. (2006) afirmaron que los probióticos son microorganismos vivos (tabla 1), que al ser ingeridos en cantidades adecuadas, ejercen influencia positiva en la salud o en la fisiología del hospedero. Mañosa et al. (2009), incluyen a los probióticos dentro del concepto más amplio de alimentos funcionales, que contienen ingredientes (que pueden ser o no nutrientes) que afectan a una o varias funciones del organismo de forma selectiva y en beneficio de la salud, o que tienen efectos fisiológicos más allá de los efectos nutricionales. Tabla 1: Microorganismos que se usan como probióticos (Escalante, 2001; Oliveira, 2007; Pino y Dihigo, 2007). Lactobacillus Bifidobacterium Lactococcus Streptococcus Enterococcus Bacillus y otras especies
L. acidophilus B. bifidum L. cremoris S. thermophilus E. faecium B. subtilis
L. bulgaricus B. infantis L.diacetylactis S. lactis E. faecalis B. coagulans
L. rhamnosus B. lactis L. lactis S. cerevisiae GG
L. casei B. adolescentis S. boulardii
L. kefir B. breve
L. salivarius B. longum
L. plantarum
La particularidad de los microorganismos probióticos es que poseen la capacidad de sobrevivir al tránsito por el tracto gastrointestinal (TGI) y de colonizar tanto el intestino delgado como el intestino grueso, lo cual favorece el
6 equilibrio del ambiente ecológico bacteriano. Los probióticos pueden incorporarse a un amplio abanico de productos que incluyen alimentos, medicamentos y suplementos dietéticos (Mennickent y Green, 2009).
1.2. Mecanismos de acción de los probioticos Los probióticos, una vez que se suministran, desarrollan en el TGI numerosos mecanismos a través de los cuales contribuyen al balance de los microorganismos intestinales y proporcionan una mejora en los procesos fisiológicos y la salud del hospedero (Kalliomaki et al., 2003; Nocek et al., 2012). Los probióticos ejercen acciones diversas sobre la salud, mediante distintos mecanismos de acción (Saavedra, 1995). Actúan acidificando la luz intestinal, segregando sustancias que inhiben el crecimiento de microorganismos patógenos, consumen nutrientes específicos o se unen competitivamente a los receptores intestinales, de forma que mantienen la microbiota intestinal y evitan la acción de gérmenes patógenos (Close, 2000; Prieto et al., 2012).
Se conoce que los probióticos son estimuladores del sistema inmune: modifican la respuesta a antígenos (Nieto, 1999), aumentan la secreción de IgA específica frente a rotavirus (Kaila, 1992), facilitan la captación de antígenos en la placa de Peyer, producen enzimas hidrolíticas y disminuyen la inflamación intestinal (Majamaa, 1997).
Los probióticos aumentan la actividad de las hidrolasas de las sales biliares que se unen al colesterol y ayudan a su eliminación, por lo que tienen un efecto hipocolesterolémico. Mediante la producción de triglicéridos de cadena corta inhiben la síntesis de colesterol, el cual se redistribuye desde el plasma en sales biliares. De esta forma el colesterol no se reabsorbe y se utiliza para la síntesis de novo de ácidos biliares (St-Onge et al., 2000). Los mecanismos de acción citados anteriormente están en constante estudio, ya que en algunos casos no se disponen de datos científicamente probados in vivo (De Roos et al., 2000). Entre otras funciones que desarrollan los probióticos están la modificación de la población microbiana intestinal, intervienen en los procesos metabólicos, evitan la colonización por los microorganismos patógenos, incrementan la producción
7 de ácidos grasos volátiles (AGV), reducen la absorción de sustancias tóxicas tales como NH3, aminas, indol, mercaptanos y sulfitos, sintetizan vitaminas (especialmente vitaminas K y del complejo B), y mejoran la absorción de minerales (Taranto et al., 2005; Jacela et al., 2010; Sabaté y Audisio, 2013). Como se puede apreciar en la figura 1, la fibra dietética soluble es fácil de fermentar; la mayor parte se rompe en el ciego y cerca del colon, mientras que la fibra dietética insoluble se degrada en las partes más distales. La fibra dietética aumenta en general el flujo de carbohidratos en el intestino grueso y por lo tanto, estimula por completo la población microbiana. Hay unos cuantos carbohidratos no digeribles que tienen la capacidad de estimular grupos microbianos específicos, que tienen efectos beneficiosos en el TGI (Knud Erik, 2008).
Figura 1. Influencia de las fibras dietéticas solubles e insolubles en los procesos de digestión y absorción en diferentes segmentos del tracto gastrointestinal (Tomado de Knud Erik, 2008).
Los oligo y polisacáridos que contienen fructosa, tienen la capacidad de estimular a las bacterias ácido lácticas (Lactobacillus spp. junto con Bifidobacterium spp.). Está ampliamente aceptada la opinión de que las 8 bacterias ácido lácticas, al fijarse a la mucosa intestinal, incitan el funcionamiento del sistema inmune y protegen a los animales de las infecciones gástricas (Knud Erik, 2008).
1.3. Criterios de selección de los microorganismos probióticos Los probióticos son microorganismos vivos que al ser ingeridos en cantidades adecuadas ejercen influencia positiva en la salud o en la fisiología del hospedero (Kalliomaki et al., 2003; Fuente Salcido et al., 2012).
Para realizar la caracterización de una cepa candidata a probiótico se establecen diferentes criterios de selección, indispensables para que se logren efectos positivos en la salud y en el rendimiento de los animales. Según Jurado (2009) y Murieta (2011) las cepas probióticas deben:
1. Ser especies microbianas específicas del hospedero, consideradas cepas GRAS (ausencia de patogenicidad).
2. Mostrar resistencia a las enzimas líticas de la saliva y a las enzimas digestivas.
3. Mantener estabilidad ante los ácidos y sales biliares.
4. Presentar habilidad para adherirse y colonizar las células de la mucosa intestinal.
5. Producir sustancias bacteriostáticas y bactericidas.
6. Estimular el sistema inmune.
7. No degradar la mucina.
8. Mejorar el rendimiento productivo de los animales.
9. Presentar viabilidad, estabilidad y probabilidad de supervivencia durante el procesamiento tecnológico y el almacenado.
El aislamiento, caracterización y selección de microorganismos nativos del TGI, a partir de animales sanos, permite disponer de productos biológicos naturales que cuando se administren a ejemplares de la misma especie animal,
9 favorezcan el equilibrio del ecosistema gastrointestinal y la sanidad en general (Rosmini et al., 2004; Basurto Cadena et al., 2012; Saelim et al., 2012).
La metodología que se utilice para seleccionar las diferentes cepas de bacterias susceptibles de ser caracterizadas como probióticos, debe evaluar ciertos criterios para asegurar las características funcionales una vez en el interior del organismo. Estos criterios deben basarse, como es lógico, en su capacidad de llegar vivas al intestino, por eso no debe sorprender que los principales criterios a evaluar a los microorganismos candidatos a probióticos sean la resistencia al ácido del estómago y a las sales biliares del intestino (Dunne et al., 2001). a. Estabilidad en su paso por el estómago
La mayoría de los microorganismos caracterizados como probióticos deben someterse a pruebas de resistencia frente a ácidos. Se debe tener en cuenta que el pH del estómago puede tener valores hasta 1,5 (Giannella et al., 1972). Estas pruebas son imprescindibles, ya que las respuestas varían de una especie a otra (Chou et al., 1999). Berrada et al. (1991) informan, que el tiempo medio desde que un alimento entra hasta que sale del estómago es de 90 minutos. Según Chou y Weimer (1999), las pruebas in vitro de resistencia de microorganismos susceptibles de ser catalogados como probióticos deben verificar que son capaces de resistir ese tiempo y pH sin perder viabilidad. Varios estudios demuestran que la matriz de alimentos consumidos conjuntamente con los probióticos, pueden tener un efecto protector frente a los ácidos del estómago (Gardiner et al., 2005 y Messaoudi et al., 2012). b. Resistencia a las sales biliares
El pH ácido del estómago no es el único impedimento con el que se encuentran los microorganismos candidatos a llegar vivos al intestino, para ejercer allí su efecto beneficioso en el huésped. En el intestino delgado, el obstáculo más importante para los microorganismos son las sales biliares (Bezkorovainy et al., 2001), por lo que los probióticos para ejercer sus efectos beneficiosos no deben
10 sucumbir a la acción de este bactericida natural (Chou et al., 1999). Las transformaciones microbianas de los ácidos y sales biliares son numerosas, entre las cuales se destaca la hidrólisis, reacción muy habitual en el tracto intestinal de los animales (Christiaens et al., 1992). En este sentido, uno de los microorganismos más estudiados es Bacillus subtilis. Esta bacteria tiene la capacidad de desconjugar las sales biliares y así inactivar su potente acción bactericida (Boever, 2000 y Gharib-Naseri et al., 2012).
La resistencia a las barreras químicas que se presentan en el TGI (figura 2) es una de las pruebas para la selección de las cepas candidatas a probióticas. A través de ensayos in vitro, donde se simulen las condiciones de pH y la concentración de sales biliares en el estómago, se pueden distinguir las cepas que soportan el estrés gástrico (Salminen et al., 1996). c. Capacidad de adhesión a las células de la mucosa intestinal
La capacidad de adhesión a las células epiteliales del intestino es un importante criterio para la selección de los microorganismos probióticos, ya que sólo las cepas que se pueden adherir llevarán a cabo una colonización efectiva (Merk, 2005) y ejercerán los efectos beneficiosos que proveen los probióticos en su interacción con el huésped (Fuller, 1991). Según Reid et al. (1987) la capacidad de adhesión es el factor más importante antes que competir por nutrientes con el resto de la microbiota. Sin adhesión a la mucosa intestinal, la concentración de probióticos sería diluida hasta un nivel insignificante después de una comida o bebida (Salminen et al., 2004). Además, se sabe que muchos patógenos no pueden ejercer su efecto en el intestino hasta que no se han adherido, por lo que el hecho de tener una colonización protectora de la mucosa del intestino, va a prevenir la adhesión de microorganismos dañinos (Hoepelman, 1992).
El desarrollo de la microbiota favorable dependerá de la especificidad de las adhesinas de las bacterias por los receptores del intestino y de la competencia con otras bacterias presentes. En el intestino delgado la comunidad microbiana es más pequeña en número y diversidad que en el colon (Salminen, 2004).
11 Figura 2. Anatomia del cerdo (Wikimedia Commons, 2011)
Tuomola et al. (2001) y Zoetendal et al. (2002) refieren que las biopsias intestinales son el mejor método para obtener información sobre la adhesión de los microorganismos en el intestino, no sólo porque es una evaluación in vivo, sino porque es la mejor aproximación para conocer en qué parte del intestino se produce la adhesión, lo cual es importante para la estimulación del sistema inmune mediante el suministro vía oral de probióticos.
12 En la literatura, se describen diferentes métodos para evaluar la capacidad de adherencia in vitro de las células bacterianas a la mucosa. Entre éstos se encuentran algunos modelos ya probados, como la invasión de líneas de células Caco-2, Int-407 y Hep-2 (Coconnier et al., 2000), los ensayos de coagregación bacteriana mediante lectinas, a células de levaduras (Gusils et al., 1999), la determinación de la hidrofobicidad de la superficie celular (Vinderola y Reinheimer 2003; Souza et al., 2004), el conteo de células bacterianas teñidas que se adhieren a células de la mucosa intestinal (Fuller, 1977) y el empleo de marcadores radioactivos (Ouwehand et al., 2005). Algunos trabajos refieren la combinación de estos métodos para corroborar los resultados (Ehrmann et al., 2002). d. Viabilidad durante el procesado y el almacenamiento en refrigeración
Los probióticos tienen que ser microorganismos que además de cumplir con los requisitos anteriormente mencionados, deben ser capaces de soportar las condiciones de la producción industrial y mantener gran parte de su viabilidad durante el almacenamiento, en muchas ocasiones en refrigeración o congelación. De no ser así, de nada servirá que el alimento contenga microorganismos promotores de la salud del consumidor, si no podrá ejercer sus efectos beneficiosos por estar lesionados o muertos (Chou et al., 1999).
1.4. Actividad antimicrobiana Las bacterias con actividad probiótica se caracterizan por producir un amplio grupo de sustancias que inhiben el desarrollo de microorganismos patógenos. Dentro de estos compuestos se incluyen las bacteriocinas, los ácidos orgánicos (acético, propiónico, butírico, isopropiónico, isobutírico y el ácido láctico) y los antibióticos (Ma et al., 2004; Van-Staden y Dicks, 2012).
En la literatura se citan diferentes procedimientos para determinar la actividad antimicrobiana de las cepas candidatas a probióticas. Entre las más utilizadas está la técnica de difusión de sustancias en el agar, en la cual se comprueba la inhibición del crecimiento de las cepas indicadoras, cuando se enfrentan a los
13 compuestos que producen las cepas productoras, como ácidos y bacteriocinas (Schillinger y Lucke, 1989).
1.4.1. Producción de bacteriocinas y antibióticos
Por otra parte, un aspecto que cobra gran importancia en la actualidad en la actividad antimicrobiana, es la producción de bacteriocinas (Aymerich et al., 2000; Powell et al., 2007). Tradicionalmente, se consideró a las bacteriocinas como péptidos biológicamente activos que tenían propiedades bactericidas contra otras especies estrechamente relacionadas con la cepa productora; sin embargo, este concepto se modificó, ya que se encontraron también acciones bactericidas frente a cepas distanciadas filogenéticamente (Sablon et al., 2000).
Se demostró por Hong et al., (2004) y Yadava et al., (2006) que los cultivos de Bacillus producen un grupo de sustancias antimicrobianas como subtilisina, bacitracina y otras sustancias que inhiben a microorganismos patógenos.
Por lo general, las bacteriocinas destruyen la integridad de la membrana citoplasmática a través de la formación de poros, lo que provoca la salida de compuestos pequeños o altera la fuerza motriz de protones necesaria para la producción de energía, síntesis de proteínas o ácidos nucleicos (Chikindas et al., 1993).
Las bacteriocinas se describieron por primera vez en Escherichia coli y posteriormente se demostró su producción en bacterias Gram positivas. Las bacteriocinas producidas por estas últimas, constituyen un grupo estructural y funcionalmente más amplio y muy heterogéneo. Existe una gran diversidad en cuanto a su tamaño y al número de subunidades que componen la molécula activa, su espectro de inhibición puede ser en ocasiones bastante amplio, no siempre requieren de receptores específicos para su acción bactericida y sus determinantes genéticos pueden localizarse tanto en el cromosoma como en plásmidos (Sinéad et al., 2007). Todo eso llevó a redefinir el concepto de bacteriocina como agentes antimicrobianos de naturaleza peptídica, cuya síntesis no es letal para la célula productora (Konisky, 1982).
14 El blanco primario de acción de las bacteriocinas parece ser la membrana plasmática. Éstas alteran la permeabilidad selectiva de la membrana de las células vegetativas sensibles, provocando la inmediata e inespecífica liberación de iones, compuestos de bajo peso molecular y algo más tarde del ATP intracelular. Estas alteraciones estimulan la disipación completa o parcial de la fuerza motriz protónica (PMF), lo cual ocasiona desórdenes metabólicos secundarios que, en último término, inhiben la generación de energía y la síntesis de macromoléculas, lo que supone la muerte celular (Monteville et al., 1995; Sinéad et al., 2007).
1.5. Género Bacillus. Características morfológicas, fisiológicas, bioquímicas e inmunológicas.
1.5.1. Características morfológicas y fisiológicas del género Bacillus
Según Stanier (1996), Jawets (1996) y Bergey (1997), las bacterias del género Bacillus son Gram positivas en general, aunque algunas especies presentan reacción negativa variable a esta técnica de tinción. Estas bacterias tienen forma de bastoncillo, se agrupan en cadenas, son mótiles con flagelación perítrica. Forman endosporas (figura 3), son aerobias, anaerobias facultativas y aerotolerantes. No son adherentes a la mucosa intestinal, son productoras de sustancias antimicrobianas y producen enzimas hidrolasas. Tienen reacción positiva a la catalasa, hidroliza la gelatina, fermentan algunos azúcares y en ocasiones producen gas. Usualmente descomponen las proteínas para producir amonio. Generalmente crecen a 37 ºC, la mayor parte son saprofitas y están presentes comúnmente en el suelo e incluso en el conducto intestinal de los animales y en algunos alimentos.
Las bacterias de este género se agrupan en la familia Bacillaceae. Las especies tipo son: Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. cereus, B. megaterium, B. macerans, B. polymyxa, B. thuringiensis, B. pasterii, B. fastidiosus, B. sphaericus y B. anthracis (Mayea, 1997). Se conoce que existen 69 especies identificadas y
15 reconocidas por Internacional Journal of Systematic Bacteriology (Garrity et al., 2013).
Figura 3. Género Bacillus (Waterscan.co.yu, 2009)
La producción de endosporas es una característica típica de todas las bacterias de los géneros Bacillus y Clostridium. En la figura 4 se observan células de Bacillus donde se están formando las endosporas, estas son pequeñas estructuras ovoides o esféricas, en las que se pueden transformar estas bacterias y constituir formas celulares muy resistentes al calor y al medio adverso. Su síntesis se produce cuando se presentan condiciones de limitación de nutrientes, agua y oxígeno. Constituye un sistema de protección frente a condiciones ambientales adversas (Huang- Mo et al., 2000).
Normalmente no se forman endosporas durante el crecimiento activo y la división. Generalmente, se forma una endospora por cada célula vegetativa. La endospora madura es liberada por lisis de la célula vegetativa en la que se desarrolló, a partir de este momento pierde su característica de bacteria Gram + y la endospora se puede decir que es Gram −. Las endosporas libres no tienen metabolismo detectable, pero mantienen durante años (a menudo décadas) su
16 capacidad potencial de germinar y crecer en forma vegetativa. Este estado de latencia total se conoce como criptobiosis (Gálvez, 2004).
Formación de endosporas
Figura 4. Bacillus subtilis (Wikimedia Commons, 2013)
Esta estructura se puede reconocer fácilmente al microscopio por su lugar intracelular de formación, su extrema refringencia y su resistencia a la tinción por colorantes básicos de anilina, que tiñen fácilmente a las células vegetativas. La estructura de las endosporas es compleja y éstas poseen varias capas que, del exterior al interior, se nombran exosporio (cubierta fina y muy delicada), cutícula (con una o varias capas de material similar al de la pared celular) y córtex (compuesta por varios anillos concéntricos, constituidos por glucopéptidos y contienen las estructuras normales de la célula (Pelczar y Reid, 1977; Samaniego, 2005).
El proceso de formación de la endospora se ha estudiado extensamente como un modelo simple y en años recientes, se han usado las endosporas de Bacillus subtilis como probióticos (Barbosa et al., 2005 y Khaksefidi et al., 2006).
17 1.5.2. Características bioquímicas del género Bacillus
Otro de los elementos característicos del género Bacillus es la producción de enzimas hidrolíticas, más o menos específicas, para sus sustratos. Muchas reacciones biotecnológicas pueden llevarse a cabo gracias a la ayuda de las enzimas aisladas a partir de microorganismos o por las propias enzimas que éstos producen (Shumí et al., 2004).
Entre las enzimas microbianas que se utilizan resaltan las proteasas, amilasas, manosidasas y glucosidasas que descomponen las complejas moléculas presentes en los alimentos y las transforman en nutrientes más simples, los que son absorbidos rápidamente por el animal o pueden ser empleados por otras bacterias beneficiosas para el establecimiento de una microbiota intestinal balanceada (Pérez, 2000).
En estudios de la compañía ChemGen Corp (2004) acerca del empleo de enzimas naturales de Bacillus en animales monogástricos, se encontraron efectos como la inhibición de la colonización por patógenos, la elevación de los niveles de IGF (factores similares a la insulina para el crecimiento) y la mejora en la absorción de nutrientes y agua debido a la degradación de los β-mananos.
1.5.3. Acción de las endosporas en el sistema inmunológico
Hoy se plantea la necesidad de que el hombre y los animales tengan un adecuado funcionamiento del sistema inmunológico para responder a los desafíos estresantes de la vida moderna y las prácticas de crianza intensiva animal. El uso de probióticos, como las bacterias productoras de esporas que son inmunoestimulantes, puede contribuir a elevar el bienestar y las expectativas de vida de los animales y de los seres humanos, al contrarrestar la acción perjudicial de muchos microorganismos patógenos (Ericsson, 2000 y Duc et al., 2004).
Algunos microorganismos probióticos ajenos a la microbiota intestinal como los del género Bacillus, pueden actuar como antígenos y desencadenar cierta
18 reacción inmunitaria que se traduce en una mayor producción, principalmente, de Ig A a nivel intestinal (Granato et al., 2004). El uso de Bacillus subtilis como probiótico en la alimentación de aves se estudió mediante la evaluación de su efecto en la estimulación de células inmunes en el tracto gastrointestinal de pollos de engorde inoculados con Salmonella Minnesota. Las aves alimentadas con B. subtilis mostraron un aumento de recuentos de células CD4+ en el íleon y una reducción de las células CD8+ en el ciego antes de ser desafiados con Salmonella Minnesota. Basándose en los resultados se comprobó que el suministro de Bacillus como probiótico en estos animales redujo los recuentos de Salmonella spp. y afectó la movilización de las células CD4+ y CD8+ en la mucosa del íleon y el ciego (Lourenco et al., 2012).
1.6. Efecto de los probióticos elaborados con Bacillus spp. en cerdos El uso de probióticos en la nutrición de cerdos constituye una alternativa para mejorar el equilibrio ecológico de la población microbiana existente en el tracto gastrointestinal (Quintero-Moreno et al., 2011). Muchos investigadores emplean cepas de Bacillus en monocultivos o en mezclas de ellos, o bien en combinaciones con otros microorganismos de diferentes géneros, para comprobar el efecto de estos productos en diferentes indicadores productivos y de salud en la cría de cerdos (Wolke et al., 2006). Quintero y Huerta (2010) plantearon que el uso de probióticos en los animales de interés zootécnico se dirige a: mejorar los síntomas de estrés, promover de forma natural el crecimiento, aumentar la producción y mejorar el estado general del animal. Santos et al., (2004) informaron que cuando se suministraba crema de biomasa proteica a los cerdos, obtenida por vía simplificada a través de un cultivo mixto de levaduras y bacterias lácticas, se producía la disminución de la mortalidad e incidencia de diarreas, acompañada por el aumento de la ganancia de peso en los animales.
Anon. (2012) y Cho et al. (2011) plantean que el empleo de las bacterias del género Bacillus y sus esporas viene dado por su capacidad para la producción de enzimas. Estas, además de mejorar la digestión en el hospedero, son
19 capaces de inhibir el crecimiento microbiano de bacterias dañinas. Por su parte, las esporas estimulan el sistema inmune y contribuyen a potenciar la resistencia frente al desafío de patógenos ambientales. Cortés et al. (2000) informaron que las endosporas viables de Bacillus subtilis en el alimento son estables a la acidez gástrica y actúan contra patógenos específicos en el intestino, tales como E. coli. Su empleo incrementó los conteos de Lactobacillus en tracto con un efecto promotor del crecimiento. Alexopoulos et al., (2004) evaluaron la eficacia de BioPlus 2B, un probiótico a base de Bacillus licheniformis que contiene esporas de B. subtilis, en el estado de salud y la productividad de los cerdos durante las etapas de destete, crecimiento y acabado. Los resultados muestran que en comparación con los controles, los cerdos tratados con BioPlus 2B tuvieron menor morbilidad y mortalidad durante el período de prueba, además de producirse menor incidencia de diarrea post-destete, debido principalmente a Escherichia coli. El aumento de peso, la conversión alimenticia y la calidad de la canal de los animales que consumieron BioPlus 2B fue significativamente superior a los resultados observados en los animales controles.
Sato (2001) y Da Silva et al. (2006) evaluaron el efecto de diferentes antibióticos mezclados en la dieta de cerdos con una cepa de Bacillus subtilis a una concentración de 1x1012 UFC /Kg de concentrado, en todas las fases de crianza, para comprobar la ganancia de peso, el consumo de alimentos, la eficiencia y la conversión. Se comprobó en los animales muestreados que en los que se aplicó el tratamiento probiótico se produjo una mejora en los indicadores que se evaluaron. En un estudio realizado por Nitikanchana et al. (2011), con 1.099 cerdos (PIC 1050 × 337; peso inicial de 75 libras) se determinó la influencia de un producto de Bacillus en el crecimiento, rendimiento de la canal, consistencia fecal de cerdos criados en condiciones comerciales. En general, desde el día 0 al 104 d, no se encontraron diferencias en el rendimiento de la canal de los cerdos alimentados con el producto de Bacillus. Sin embargo, la textura del estiércol aumentó a medida que se incrementaba la dosis de Bacillus, lo cual indica que
20 los cerdos alimentados con el producto tenían más firmes las heces y menos incidencia de diarrea. Se conoce de los trabajos hechos por Perdigón y Alvares (1992) que algunas cepas Bacillus usadas como probióticos en los animales tienen la capacidad de traslocarse. El término “traslocación” se introdujo para describir el pasaje de las bacterias viables del TGI a los nódulos linfáticos mesentéricos y a otros órganos como el bazo e hígado. Pueden sobrevivir esos probioticos por varios días en el bazo u otros sitios y así estimular la fagocitosis y las células inmunocompetentes del tejido linfático asociado a esos niveles (Vandelle et al., 1990).
Además de los cerdos, los biopreparados probióticos con cepas de bacillus también se emplearon en aves. En un estudio realizado por Aristides et al. (2012) se utilizaron pollos de engorde, los cuales fueron tratados con cinco dietas que contenían probióticos (Bacillus subtilis), prebióticos (oligosacáridos mananos-MOS), simbióticos (Saccharomyces cerevisiae, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Bifidobacterium bifidum, MOS y FOS (fructoligosacáridos), avilamicina, y un tratamiento control (sin aditivos). Los parámetros de rendimiento que se evaluaron incluyeron el peso total, ganancia diaria de peso, consumo de alimento, índice de viabilidad, eficiencia de la producción y el rendimiento de la canal. Además, se midieron otros parámetros como la calidad de la carne y la oxidación de los lípidos. Los resultados indican que los tratamientos con probióticos no causaron diferencias significativas en ninguno de los parámetros evaluados; sin embargo, con respecto a la calidad de la carne, las aves alimentadas con alimentos bióticos mostraron una reducción en el desarrollo de carne pálida, suave y exudativa (PSE) y también una disminución en la oxidación de lípidos.
21 CAPÍTULO 2 MATERIALES Y MÉTODOS 2.1. Material biológico y medios de cultivo
2.1.1. Cepas utilizadas
Cepa con potencial probiótico
Se utilizó la cepa Bacillus subtilis 21BMC, aislada de mucosa de cerdos procedente del cepario del Centro de Estudios Biotecnológicos (CEBIO) de la Universidad de Matanzas y de la Escuela Superior Politécnica Agropecuaria de Manabí (ESPAM), Ecuador. Esta cepa fue aislada, caracterizada y seleccionada por Laurencio et al. (2010).
Cepas indicadoras
Como indicadoras se emplearon cepas salvajes de Escherichia coli, Salmonella spp y Shigella spp., las cuales fueron aisladas del tracto digestivo de cerdos enfermos e identificadas en el Laboratorio de Medicina Veterinaria de Matanzas.
2.1.2. Medios de cultivo
Agar y caldo nutriente enriquecido
Los medios de cultivo agar nutriente (BIOCEN) y caldo nutriente enriquecidos para el crecimiento de Bacillus, se formularon a base de peptona bacteriológica 6 %, triptona 4 %, extracto de levadura 3 %, extracto de carne 1,5 % y glucosa 1 %. pH: 7
Caldo Alimento para cerdos (CAC, Murry et al, 2004). Composición 100 g de alimento para cerdos en 1000 mL de H2O destilada. En la tabla 2 se presenta la composición del alimento para cerdos que se utilizó en la elaboración del medio de cultivo.
Agar MacConkey. Composición (g/L): Triptona, 17; Peptona, 3; D-sorbitol, 10; Sales biliares, 1,5; Cloruro de sodio, 5; Rojo neutro, 0,03; Cristal violeta, 0,001; Agar, 14,5; pH 7,1
22 Tabla 2: Composición del medio Caldo Alimento para Cerdo (CAC). Materia Prima % de inclusión Trigo 70,36 Soya 27,0 NaCl 0,50 Carbonato 0,50 Premezcla I 0,50 Colina 0,14 Fosfato 1,0 Composición bromatológica del medio caldo alimento para cerdo. M.S (%) P.B (%) E.D (MJ/kg) Ca (%) P (%) 90,81 19 18,97 0,61 0,49 M.S, materia seca; E.D, energía digestible; Ca, calcio; P, fósforo.
Caldo Infusión Cerebro Corazón: Composición (g/L): Sólidos de infusión de cerebro, 12,5; Sólidos de infusión de corazón bovino, 5; Peptona, 10; Glucosa,
2 ; Cloruro de sodio 5 ; Na2HPO4, 2,5. pH 7.
Caldo o Agar Nutriente: Composición (g/L): Extracto de carne, 3; Peptona,5 ; NaCl, 5; Agar,15, pH 7,1.
2.2. Conservación de las cepas
La cepa de Bacillus y las cepas indicadoras se conservaron en cuñas de agar nutriente en condiciones de refrigeración (4 ºC).
2.3. Procedimiento experimental para la evaluación in vitro de la actividad antimicrobiana de Bacillus subtilis 21BMC frente a cepas potencialmente patógenas.
En la figura 5 se muestra el esquema con los experimentos que se realizaron durante el presente trabajo.
23 Figura 5: Esquema que representa la secuencia experimental del trabajo.
2.3.1. Experimento 1. Evaluación de la actividad antimicrobiana de la cepa de Bacillus subtilis frente a cepas patógenas, con la aplicación de la técnica de difusión de sustancias en agar.
Para evaluar la actividad antimicrobiana de la cepa se empleó la técnica de difusión en Agar, propuesta por Schillinger y Lucke (1989) (Anexo 1).
Tratamiento de las cepas productoras: la cepa Bacillus subtilis (21BMC) se cultivó en caldo nutriente a 37 ºC en condiciones de zaranda por 18 h (10 Log UFC. mL-1). A partir de este cultivo se inocularon (1:10) tres erlenmeyers que contenían 100 mL de caldo nutriente, los cuales se mantuvieron en las mismas condiciones experimentales. Se tomaron muestras a las 16 y 24 horas, las cuales se centrifugaron a 15000 rpm a 5 ºC (MSM HIGH SPEED 18) por 10 min y se esterilizaron a través de filtros de acetato de celulosa con poros de 0,22 μm (Minisart, satorius 600 kPa max). La variante utilizada fue el sobrenadante sin modificar (V1), donde estaban presente todas las sustancias antimicrobianas (bacteriocinas o antibióticos).
24 Tratamiento de las cepas indicadoras: las cepas indicadoras Escherichia coli, Salmonella spp y Shigella spp se inocularon en caldo nutriente enriquecido y se incubaron en zaranda termostatada (UNITRONIC 320 OR) durante 18 h a 37 ºC.
Desarrollo de la técnica de difusión en agar
A partir de los cultivos previos con las cepas indicadoras, se tomaron 200 μL que se inocularon en 20 mL de agar nutriente (ión agar 10 %). Posteriormente, éstos 20 mL se vertieron en placas a una temperatura de 45o C hasta su solidificación. En cada placa, que contenía las cepas indicadoras, se abrieron pocillos de 5 mm de diámetro, en los que se depositaron 60 μL de las muestras de las cepas productoras. Las placas se mantuvieron a 4o C por un tiempo de 4 horas para lograr una mejor difusión de las sustancias producidas en el agar. Se incubaron entre 24 horas y 48 horas a 37o C para observar el crecimiento y la aparición de halos de inhibición. El diámetro de dichos halos se midió con una regla milimetrada. A los valores obtenidos se les restó el diámetro de los pocillos.
2.3.2. Experimento 2. Determinación del efecto antimicrobiano de Bacillus subtilis a través del establecimiento de cocultivos con bacterias potencialmente patógenas.
La actividad antagónica de Bacillus subtilis frente a bacterias potencialmente patógenas se estudió a través de cultivos asociados o mezclas de cultivos. Para ello se empleó la técnica descrita por Orlowski y Bielecka (2006) modificada (Anexo 2). Como cepas indicadoras se utilizaron: Escherichia coli, Salmonella spp y Shigella spp., aisladas del tracto gastrointestinal de cerdos enfermos e identificadas en el Laboratorio de Investigación y Diagnóstico Aviar de Matanzas.
Para el desarrollo del cocultivo se empleó el caldo alimento para cerdos (CAC, Murry et al, 2004), el cual se adicionó en frascos de 100 mL, con un volumen efectivo de 50 mL del medio CAC. En cada frasco se añadieron 5 mL del cultivo de Bacillus y 5 mL del cultivo patógeno o indicador (con una población de 9 Log UFC.mL-1) y se incubaron por 24 horas a 37 ºC en condiciones estáticas. Las
25 muestras se tomaron a las 0, 3, 6, 12, 18 y 24 horas. Se dispuso además, de controles, a través del crecimiento de cultivos puros de Bacillus subtilis, Escherichia coli, Salmonella spp y Shigella spp. en el mismo medio CAC.
Para realizar el conteo de viables en placas se utilizó el medio Agar Mac Conkey (Biocen) para los patógenos y Agar nutriente para Bacillus. 2.3.3. Experimento 3. Comprobación del nivel de coagregación de Bacillus subtilis a células de bacterias patógenas.
Para determinar la coagregación de las células de Bacillus a las paredes celulares de los microorganismos patógenos se realizó el procedimiento descrito por Orłowski y Bielecka (2006) (Anexo 3).
Se realizó el cultivo de la cepa de Bacillus subtilis en caldo nutriente por 72 h a 37 ºC y las cepas patógenas (Escherichia coli, Salmonella spp y Shigella spp) en caldo nutriente por 24 h a 37 ºC. Posteriormente, se mezclaron 5 mL de cada cultivo en caldo nutriente enriquecido. Una vez inoculados los cultivos puros, se procedió a determinar la absorbancia (A) a 600 nm antes y después de 5 horas de mezclados e incubados a temperatura ambiente.
El porciento de coagregación se determinó a través de la siguiente fórmula (Orłowski y Bielecka, 2006):
% de Coagregación= [((Axi +Ayi)/2 – At (x + y)) / ((Axi + Ayi)/2)] . 100
At (x + y): Absorbancia de la mezcla del Bacillus subtilis + patógenos. Axi: Absorbancia de la cepa Bacillus subtilis en el tiempo inicial. Ayi: Absorbancia de los patógenos en el tiempo inicial.
2.4. Procesamiento estadístico Para el análisis de los datos se utilizó el Microsoft office Excel 2007 y el sistema Statgraphics Plus version 5.1 (2002). Los conteos de microorganismos viables se transformaron a Log N, para garantizar las condiciones de normalidad en la curva de crecimiento. Para el análisis, se aplicó la fórmula (K+N).10x, donde K es la constante que representa el logaritmo de la dilución en la cual se inoculó el microorganismo; N es el logaritmo del número de UFC determinado; 10 es la base de los logaritmos y X es la dilución a la cual se efectuó la inoculación.
26 CAPÍTULO 3
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1 Evaluación de la actividad antimicrobiana de la cepa de Bacillus subtilis 21BMC procedente del tracto digestivo de cerdos frente a microorganismos patógenos. Los resultados de la acción antimicrobiana de la cepa de Bacillus subtilis 21BMC frente a microorganismos patógenos se muestran en la tabla 3. Tabla 3. Actividad antibacteriana de la cepa Bacillus subtilis 21BMC frente a microorganismos patógenos. Cepas Halos de inhibición producidos por el indicadoras Bacillus subtilis (mm) Media DE CV (%) 1- Escherichia NI - - coli 2- Salmonella NI - - spp 3- Shigella spp 11 1,1 1,9 1- Escherichia coli , 2 - Salmonella spp y 3- Shigella spp NI- no inhibición
Una de las funciones más importantes de los probióticos elaborados con cultivos de Bacillus subtilis, es la producción de sustancias antimicrobianas. Como se puede apreciar en la figura 6, a partir de las 24 horas se observó la formación de halos de inhibición, únicamente frente a Shigella spp. El género Shigella se caracteriza por tener forma de bacilo, Gram negativas, no móviles, no esporuladas, incapaces de fermentar la lactosa y pueden ocasionar diarreas en los animales y seres humanos. Las principales especies de Shigella que se encuentran en el TGI son S. sonnei, S. flexneri y S. dysenteriae (Hale TL et al., 1996). Según Hill Gaston et al., (2003) las bacterias del género Shigella no sobreviven a pH menores de 4,5 y utilizan un mecanismo que las provee de motilidad en la que se dispara la polimerización de actina en la célula intestinal.
27 Formación de halos de inhibición
Figura 6: Actividad antibacteriana de Bacillus subtilis frente Shigella spp. No se observó inhibición de Escherichia coli, ni Salmonella spp por parte de Bacillus subtilis (figuras 7 y 8). Es posible que la concentración de sustancias antimicrobianas en el medio no sea suficiente para inhibir el crecimiento de estos microorganismos patógenos o es debido a la no producción de bacteriocinas o antibióticos que afecten el crecimiento de Salmonella spp y Escherichia coli.
Figura 7: Actividad antibacteriana de Bacillus subtilis frente Salmonella spp.
Figura 8: Actividad antibacteriana de Bacillus subtilis frente Escherichia coli .
28 Resultados similares obtuvo Milián (2009) al enfrentar cepas de Bacillus subtilis a los patógenos E. coli -0157-H7, E. cloacae y S. thyphimurium. En este estudio se refiere que la respuesta a este resultado pudiera estar dada por la ausencia de la batería enzimática para producir estas sustancias antimicrobianas por Bacillus subtillis frente a estos patógenos específicos. Sin embargo, otros autores como Hoat et al. (2001) no coinciden con los reportes de la literatura consultada, ya que evaluaron la respuesta de B. subtilis frente a patógenos de origen aviar, incluida E. coli y obtuvieron resultados inhibitorios frente a este patógeno. Pinchuk et al. (2001) evaluaron el producto comercial Biosporin, que se elaboró con una cepa de B. subtilis. Estos autores obtuvieron resultados positivos en la inhibición de Staphylococcus aureus, Enterococcus faecium, Shigella flexneri, Campylobacter jejuni y Helicobacter pylori.
Una cepa de Bacillus subtilis se aisló a partir del tracto gastrointestinal de las aves de corral y se encontró que producían excelentes efectos inhibitorios en Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli y Streptococcus pneumoniae. Este trabajo también demostró que aún después del tratamiento térmico de los cultivos, el mismo mantenía su actividad antimicrobiana (Seah Huay Lin y Yeow-Lim Teo, 2005). Estudios realizados por Campos et al. (2002) determinaron que cuando se enfrentan cepas de Bacillus subtilis a S. thyphimurium no se observa la inhibición por parte de las endosporas de Bacillus. Resultados similares se obtuvieron en el presente trabajo, todo parece indicar que la cepa evaluada como productora no sintetiza antibióticos o bacteriocinas que inhiban a este microorganismo de forma directa. En la literatura se reporta que la producción de estas sustancias pudiera estar codificada por la presencia de plásmidos en el citoplasma celular (Bernhard et al., 2009), lo cual indica que producirán estas sustancias las cepas portadoras de estos fragmentos de ADN.
Los estudios realizados por Cladera-Olivera et al. (2004) refieren, que una sustancia antimicrobiana producida por Bacillus licheniformis P40 inhibió a una
29 amplia gama de cepas indicadoras, tales como, Listeria monocytogenes, Bacillus cereus y los aislados clínicos de Streptococcus spp. El compuesto era estable a 100 °C, pero perdía su actividad cuando se trataba a 121 °C durante 15 min. La sustancia era resistente a la acción proteolítica de la tripsina y papaína, pero sensible a la pronasa E. También se demostró que este compuesto era estable dentro de una amplia gama de pH (3-11) y que la misma tenía acción bactericida y bacteriolítica frente a Listeria. monocytogenes.
En relación con la formación de halos de inhibición debido a la producción de bacteriocinas por Bacillus, Desmazeaud (1997) y Powell et al. (2007) apuntaron que la biosíntesis de las bacteriocinas ocurre al final de la fase exponencial del crecimiento microbiano. En cambio, Avonts et al., (2004), demostraron que esta propiedad no se manifiesta para todas las cepas de igual forma, pues observaron que Lactobacillus acidophilus IBB801, L. gasseri K7 y L. johnsonii La1 presentaban el pico de actividad en la producción de bacteriocinas al final de la fase exponencial del crecimiento, en tanto L. casei Imunitas y L. casei YIT 9029 generaron las bacteriocinas en las primeras horas de la fase de crecimiento.
Purkayasta et al., (2008) demostraron que la cepa B7 de B. subtilis, la cual fue colectada de muestras de suelo, era capaz de elaborar cuatro sustancias antibióticas diferentes. Entre estas sustancias se encuentran antibióticos del grupo de las bacilomicinas. Ansari et al. (2012) observaron que una cepa de Bacillus subtilis KIBGE IB-17 producía bacteriocina Bac-IB17 en un amplio rango de pH y temperatura y la misma era capaz de inhibir a los microorganismos patógenos presentes en el intestino de los animales.
En la literatura se informa de cepas de Bacillus que son capaces de producir sustancias inhibitorias como las bacteriocinas. Kindoli et al. (2012), realizaron un trabajo con diez cepas de Bacillus, de las cuales cuatro (W42, H27, SKE 12, y K21) presentaron actividad antimicrobiana frente a Listeria monocytogenes ATCC 19111 y Bacillus cereus ATCC 14579, debido a la producción de
30 bacteriocinas Bac (W42, H27, SKE 12, y K21), sustancias que eran estables a pH 3, 6, 7, 8 y 9 a una temperatura de 80 °C. También en un experimento donde se utilizó la técnica de Espectrometría de masa y análisis de los datos genéticos, Liu et al., (2012) revelaron, que la bacteriocina subtilisina A fue producida y era responsable de la actividad antibacteriana de Bacillus amyloliquefaciens.
3.2 Determinación del efecto antimicrobiano de Bacillus subtilis a través del establecimiento de cocultivos con bacterias potencialmente patógenas.
En las figuras 9, 10 y 11 se aprecian los resultados del desarrollo de cocultivos con Bacillus subtilis y las cepas indicadoras E. coli., Salmonella spp y Shigella spp en un medio de cultivo que simula las condiciones ecológicas del tracto digestivo de cerdos.
La cepa de Bacillus, tanto en el cultivo control como en el cocultivo, continuó su crecimiento en el medio de alimento para cerdos, fundamentalmente a partir de las 3 horas. Significa que este cultivo tuvo que generar la batería enzimática para poder asimilar los nuevos componentes de este medio y adaptarse a las condiciones físicas y químicas del ambiente. Sin embargo, a medida que pasó el tiempo, las células de las cepas indicadoras (Shigella y E. coli) perdieron viabilidad y a las 6 o 12 horas no se observaron células vivas en los cocultivos. Estos resultados indican que en ese momento de muestreo la concentración de sustancias antimicrobianas o antibióticos presentaban niveles tan elevados que eliminaron a todos los microorganismos potencialmente patógenos. Específicamente, cuando se observa la figura 10, se puede apreciar que no hubo una inhibición completa de Salmonella a las 24 horas. Este resultado pudiera estar dado porque la concentración de sustancias inhibitorias no se encuentra en una dosis letal para este microorganismo.
31 Líneas de barras representan DE
Figura 9. Comportamiento del crecimiento de E. coli en presencia de. Bacillus subtilis en Medio Caldo Alimento para cerdos.
Líneas de barras representan DE Figura 10. Comportamiento del crecimiento de Salmonella spp. en presencia de Bacillus subtilis en Medio Caldo Alimento para cerdos.
32 Líneas de barras representan DE
Figura 11. Comportamiento del crecimiento de Shigella spp. en presencia de Bacillus subtilis en Medio Caldo Alimento para cerdos.
Brugier y Patte (1975) y Svetoch et al. (2011) informaron resultados similares a los obtenidos en este trabajo, ya que estos autores comprobaron in vitro la actividad antagonista de un hidrolizado de Saccharomyces cerevisiae y Lactobacillus frente a diferentes microorganismos, entre los que se incluían Candida albicans, Proteus, E. coli, Shigella y Salmonella. En los experimentos realizados por Socorro (2012) se demostró el efecto inhibitorio de Lactobacillus salivarius C7 a las cepas indicadoras Proteus spp., Shigella spp. y Salmonella spp.
A partir de los resultados de las figuras 9, 10 y 11 se pudo constatar que la cepa de Bacillus subtilis que se empleó tiene potencial para la inhibición de microorganismos patógenos y es probable que estos resultados estén provocados por la producción de algunas bacteriocinas o antibióticos, cuya síntesis es inducida por la presencia de las células indicadoras. Estos datos confirman el papel que tiene este género en la producción de sustancias bactericidas y bacteriostáticas. La bacitracina es uno de los antibióticos producidos por las bacterias del género Bacillus (Johnson et al., 1945). Este antibiótico inhibe la formación de la pared celular de los microorganismos patógenos. Entre otros antibióticos están los
33 producidos por Bacillus cereus como cerexina y zwittermicina, Bacillus circulans produce circulina, Bacillus licheniformis, bacitracina y Bacillus subtilis es capaz de generar polimixina, difficidina, subtilina y mycobacillina. Otras especies de Bacillus producen la gramicidina, tirotricina, laterosporina y polimixina (Mensa et al., 2008).
Lim-Teo et al. (2005) evaluaron la actividad inhibitoria de cepas de Bacillus subtilis por espectroscopía de masa y concluyeron que las mismas tienen la capacidad de inhibir a Clostridium difficile, Streptococcus pneumoniae, Campylobacter jejuni ATCC-35918, Campylobacter coli ATCC-51798 y Clostridium perfringens ATCC- 13124, debido a la producción de bacteriocinas.
Leser et al. (2008) utilizaron esporas de Bacillus ssp como tratamiento de desórdenes gastrointestinales; alegando que estas cepas (células vegetativas o esporas) excluyen a los microorganismos patógenos por adhesión competitiva o por la síntesis de sustancias antimicrobianas.
Resultados similares al presente trabajo obtuvieron Vallejo et al. (2008), cuando seleccionaron cepas de Lactobacillus para ser usadas como probióticos en queso. Para ello evaluaron el potencial probiótico de 20 cepas de Lactobacillus spp aisladas de quesos ovinos provenientes del Valle Inferior del Río Chubut, (Patagonia-Argentina). Se analizó la actividad antimicrobiana y los resultados los compararon con cepas comerciales. Como resultado se obtuvo que doce cepas desarrollaron actividad inhibitoria contra todos los microorganismos Gram- positivos y negativos estudiados (Salmonella, Escherichia coli, Shigella, Serratia Enterobacter, Listeria monocytogenes, Staphylococcus y Bacillus). Sobre la base de los resultados obtenidos concluyeron que las cepas LbTw3, LbTw5 y LbTw7 presentaban características para ser consideradas como cepas potencialmente probióticas.
De acuerdo con lo que plantea Floch et al. (2008) y Walker (2009) los cerdos nacen con un TGI completamente estéril, sin ningún microorganismo en el intestino, por lo que la microbiota comienza a colonizar rápidamente en los primeros días de vida de forma natural, vía la madre y el ambiente. El número
34 más alto de microorganismos se encuentra en la parte caudal del intestino, donde alrededor de 500 especies diferentes de microorganismos, tanto beneficiosos como perjudiciales, se han descrito e identificado (Vondruskova et al. 2010). De ahí que si Bacillus subtilis es capaz de inhibir el crecimiento de estos microorganismos perjudiciales in vitro, una vez empleada como probiótico, podrá proteger a los cerdos de todas las enfermedades entéricas que se presentaran.
Se conoce que Bacillus y otras bacterias beneficiosas contribuyen a mantener la integridad de la mucosa intestinal debido a la reducción de los niveles de ureasa, con una correspondiente disminución de los niveles de amoníaco en el TGI, lo que condiciona un buen estado físico de la mucosa intestinal (Bradley et al. 1994 y Urrutia 1997). Esta información adicional indica el posible uso de estas cepas como probióticos
3.3 Comprobación del nivel de coagregación de Bacillus subtilis a células de baterías patógenas.
En la tabla 4 se muestra el porciento de coagregación que alcanzó la cepa de Bacillus subtilis a las células de E. coli, Salmonella spp y Shigella spp. Tabla 4. Porciento de coagregación que alcanzó la cepa de Bacillus subtilis en estado vegetativo a las células de las bacterias patógenas.
Coagregación (%) Cepas Bacillus subtilis CV (%) DE indicadoras E. coli 30,30 1,01 0,30 Salmonella spp. 36,75 0,68 0,25 Shigella spp 42,50 0,85 0,30 CV: Coeficiente de Variación DE- Desviación Estándar
Según Bujnakova et al. (2004) la autoagregación en las bacterias se puede definir como el fenómeno de la agregación entre células de la misma cepa, mientras que la coagregación obedece a la agregación que ocurre entre
35 diferentes especies. La capacidad de agregación está relacionada con la adhesión, propiedad que posee E. coli, Salmonella spp y Shigella spp. Tabla 5. Porciento de coagregación que alcanzó la cepa de Bacillus subtilis en estado esporulado a las células de las bacterias patógenas.
Coagregación (%) Cepas Bacillus subtilis CV (%) DE indicadoras E. coli 70,40 1,10 1,70 Salmonella spp. 91,54 1,30 1,18 Shigella spp 97,68 1,08 1,04 CV: coeficiente de variación DE- Desviación estándar
Como se observa en las tablas 4 y 5, la congregación a las bacterias patógenas (E. coli, Salmonella spp. y Shigella spp.), se manifestó como característica de la cepa Bacillus subtilis, tanto en estado vegetativo como esporulado lo cual revela el potencial probiótico de este microorganismo en la actividad antimicrobiana.
La capacidad de adherencia de las bacterias al epitelio del tracto digestivo involucra diferentes mecanismos, entre los que se destaca la presencia de fimbrias o adhesinas en la superficie de las células bacterianas. Las fimbrias son apéndices filamentosos rectos y rígidos, más cortos y más finos (3-10 nm de diámetro) que los flagelos, y que aparecen en muchas bacterias (sobre todo Gram-negativas). La mayoría están compuestas por un solo tipo de proteína (la pilina), de unos 17-25 kDa, cuyas subunidades se disponen en una matriz helicoidal que deja un pequeño orificio central (Harshey, 1994).
Las adhesinas son mayoritariamente proteínas, que pueden unirse a los carbohidratos que se encuentran en el glicocalix de las células epiteliales. Estos carbohidratos funcionan como sitios receptores o sitios de anclaje para las bacterias (Savage, 1992).
Las bacterias Gram-negativas como E. coli y Salmonella utilizan fimbrias para adherirse a las células dianas (Gusils et al., 2003). Diferentes autores plantean que estas fimbrias también se adhieren a las paredes celulares de Bacillus,
36 como refirieron Bischoff et al. (1992), al afirmar que las células de Bacillus actúan como atrapadoras, transportadoras o controladoras de patógenos en el ecosistema intestinal. Se infiere que estas proteínas (adhesinas) presentes en las fimbrias de los microorganismos patógenos se fijan a receptores de las paredes celulares de Bacillus, cuyas células transitan por el TGI hasta salir en las heces fecales. Otros ensayos de coagregación se realizaron de acuerdo al procedimiento utilizado por Kmet et al. (1995). Para ello se prepararon suspensiones en PBS de las BAL y de las cepas indicadoras utilizadas: Escherichia coli ATCC 25922 y Salmonella dublin DSPV 595T. La prueba se consideró positiva cuando se hizo visible la sedimentación de las células sobre el fondo del tubo en un período máximo de 2 h a temperatura ambiente. Se pudo comprobar a través de estas observaciones que las cepas que se utilizaron mostraron actividad de coagregación positiva (Martín et al., 2006). Sánchez-Hernández et al. (2012 ) informaron que la microbiota vaginal es protegida contra agentes patógenos por el bacilo de Döderlein, Lactobacillus acidophilus y Lactobacillus vaginalis, gracias a tres mecanismos complementarios: a) la adherencia específica al epitelio, b) la producción de compuestos antimicrobianos y c) la coagregación con patógenos, los cuales potencian su efecto microbiocida, con la finalidad de mantener el pH vaginal y a la vez impedir el desarrollo intravaginal de gérmenes patógenos como Gardnerella vaginalis y Neisseria gonorrhoeae. Sin embargo, en la literatura se describen casos de mujeres con aumento excesivo de Lactobacillus, conocido como lactobacilosis, situación que provoca una acidificación extrema del medio vaginal, que da como resultado la lisis de las células epiteliales a lo que se le llama vaginosis citolítica. Rodriguez (2010) realizó un experimento para determinar la coagregación de Salmonella spp. y E. coli a los componentes de las paredes celulares de levaduras presentes en un hidrolizado enzimático. Como resultado, el mayor porciento de coagregación fue para Salmonella (32,7 %) seguido por E. coli con un 22,3%. La capacidad de coagregación que mostraron las bacterias
37 estudiadas con S. cerevisiae demuestra, la capacidad que tienen los componentes de paredes celulares de las levaduras para atraer y adherir a estas bacterias potencialmente patógenas
El hecho de que las bacterias evaluadas en el presente trabajo manifiesten una alta coagregación indica que estos microorganismos pudieran también tener efecto en la estimulación del sistema inmune. En este sentido, Cagigas y Blanco (2002) refieren que, el efecto protector de estos microorganismos se realiza mediante dos mecanismos: el antagonismo, que impide la multiplicación de los patógenos, y la producción de toxinas, que imposibilitan su acción patogénica. Este antagonismo es debido a la competencia por los nutrientes o los sitios de adhesión. Mediante la inmuno-modulación se protege al huésped de las infecciones, se induce el aumento de la producción de inmunoglobulinas y aumenta la activación de las células mononucleares y de los linfocitos.
38 CAPÍTULO 4
Valoración Económica
Mundialmente, el empleo de productos con actividad probiótica es una actividad común para disminuir la acción dañina que ejercen los microorganismos patógenos en el TGI. En tal sentido, existen en el mercado varios de estos productos que suministrados en pequeñas dosis mezclados con el alimento o el agua de bebida, contribuyen a estimular la respuesta inmunológica y la prevención de enfermedades infecciosas en los animales y el hombre.
Se conoce que el precio del medio de cultivo tradicional para el crecimiento de Bacillus spp. es de 23,75 USD (frasco de 500 g BIOCEN). El costo de 1 L de este medio es de 0,76 USD. En cambio el medio de cultivo que se propone McBs contiene recursos nacionales que abarata el costo antes mencionado. (Milián, 2009).
En Cuba se realizó el estudio de costo de obtención a escala industrial de un biopreparado probiótico de Saccharomyces cerevisiae (Pérez, 2000) donde se obtuvo un costo de producción de 0,08 moneda nacional a escala industrial (fermentador de 1000 L de capacidad total). Lo que permite inferir que a escala industrial el nuevo medio de cultivo McBs formulado con componentes nacionales se abarate mucho más, lo que demuestra la factibilidad del mismo bajo las condiciones técnico- materiales de Cuba. La elaboración de los biopreparados probióticos con las cepas seleccionadas tendrá gran importancia desde el punto de vista económico, ya que una vez que se apliquen estos probióticos a los animales, deberá disminuir la colonización por microorganismos patógenos, de forma tal, que se producirán menos pérdidas por concepto de enfermedades y una disminución en los costos por la utilización de medicamentos, fundamentalmente antibióticos.
39 CONCLUSIONES
1. La cepa Bacillus subtilis (21BMC) exhibió la producción de sustancias antimicrobianas o antibióticos frente a microorganismos patógenos, con mayor incidencia sobre Shigella spp. 2. Bacillus subtilis (21BMC), demostró efecto antimicrobiano frente a E. coli, Salmonella spp. y Shigella spp. a partir del establecimiento de cocultivos en condiciones de simulación del contenido alimenticio del TGI de cerdos. 3. La cepa Bacillus subtilis mostró alto grado de coagregación a células de microorganismos patógenos tanto en estado vegetativo como esporulado, lo cual significa que pudiera presentar un porciento elevado de adherencia de las fimbrias de los microorganismos patógenos a sus paredes celulares. 4. Los resultados de la actividad antimicrobiana y la coagregación de la cepa de Bacillus subtilis a los microorganismos patógenos, confirman su posible uso como microorganismo probiótico.
40 RECOMENDACIONES
• Evaluar la actividad antimicrobiana de las cepas Bacillus subtilis in vivo, a partir de experimentos de desafíos con microorganismos patógenos en los animales. • Determinar las sustancias antimicrobianas producidas por la cepa de Bacillus subtilis (21BMC) al inhibir a esos microorganismos patógenos. • Suministrar los productos a base de Bacillus subtilis a los animales cuando están en su estado esporulado.
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Figura 12. Desarrollo de la Metodología de la difusión de sustancias antimicrobianas en agar en el laboratorio. Anexo 2
Figura 13. Procedimientos de la Determinación del efecto antimicrobiano de Bacillus subtilis a través del establecimiento de cocultivos con bacterias potencialmente patógenas. Anexo 3
Figura 14. Procedimientos para la técnica de la coagregación.