Rheumatoide Arthritis Im Mausmodell - Immunologische Und Strukturelle Verän- Derungen Im Darm

Rheumatoide Arthritis im Mausmodell - immunologische und strukturelle Verän- derungen im Darm

in Medizin 3 Rheumatologie/ Immunologie des Universitätsklinikums Erlangen Klinikdirektor: Prof. Dr. med. univ. Georg Schett

Dissertation der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. med. vorgelegt von

Oscar Theodor Schulz aus Burgwedel

Als Dissertation genehmigt von der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Markus F Neurath

Gutachter: Prof. Dr. Mario Zaiss

Gutachter: Prof. Dr. Gerhard Krönke

Tag der mündlichen Prüfung: 16. März 2021

Inhaltsverzeichnis 1. Zusammenfassung / Abstract ...... - 1 -

1.1.1 Hintergrund und Ziele ...... - 1 -

1.1.2 Methoden (Patienten, Material und Untersuchungsmethoden) ...... - 1 -

1.1.3 Ergebnisse und Beobachtungen ...... - 2 -

1.1.4 Schlussfolgerung ...... - 3 -

1.2.1 Background and aims ...... - 4 -

1.2.2 Methods (patients, material and examination methods) ...... - 4 -

1.2.3 Results ...... - 5 -

1.3.4 Conclusion ...... - 6 -

2. Einleitung ...... - 6 -

2.1 Rheumatoide Arthritis ...... - 6 -

2.2 Rheumatoide Arthritis und der Gastrointestinaltrakt ...... - 8 -

2.3 Immunisierung im Darm ...... - 9 -

2.4 Das Immunsystem bei der rheumatoiden Arthritis ...... - 11 -

2.5 Behandlung der rheumatoiden Arthritis ...... - 15 -

2.6 Medikamentöse Therapieansätze ...... - 17 -

3. Fragestellung und Zielsetzung ...... - 19 -

4. Material und Methoden ...... - 20 -

4.1. Mausstudien ...... - 20 -

4.2 Materialgewinnung ...... - 21 -

4.3 Durchflusszytometrie (FACS) ...... - 23 -

4.4 Darmhistologie ...... - 28 -

4.5 Immunofluoreszenzhistologie für Neutrophile ...... - 29 -

4.6 In vivo Permeabilitätsmessung ...... - 31 -

4.7 Zellkultur ...... - 32 - 4.8 LEGENDplex™ ...... - 32 -

4.9 qRT-PCR ...... - 34 -

4.10 Knochendichtemessung mit µCT ...... - 39 -

4.11. Osteomeasure ...... - 40 -

4.12 Zonulin ELISA ...... - 41 -

4.13 Behandlungen ...... - 42 -

4.13.1 Butyrate ...... - 42 -

4.13.2 ACEA ...... - 42 -

4.13.3 Larazotide ...... - 43 -

4.13.4 α4ß7-Antikörper ...... - 43 -

4.14 Humanstudie: Zonulin-Serumlevel ...... - 43 -

4.15 Statistik ...... - 44 -

5. Ergebnisse ...... - 45 -

5.1 Verlaufsstudie der CIA ...... - 45 -

5.1.1 Längenmessung des Darms ...... - 45 -

5.1.2 FACS ...... - 47 -

5.1.3 Histologie ...... - 53 -

5.1.4 LEGENDplex™...... - 55 -

5.1.5 in vivo Permeabilitätsmessung ...... - 56 -

5.1.6 qRT-PCR ...... - 57 -

5.1.7 Zonulin ELISA ...... - 59 -

5.2 Butyrate ...... - 60 -

5.3 ACEA + α4ß7 ...... - 60 -

5.3.1 Behandlungserfolg anhand von Score und Gewicht ...... - 61 -

5.3.2 Längenmessung ...... - 62 -

5.3.3 FACS ...... - 62 - 5.3.4 Knochendichte im µCT ...... - 65 -

5.3.5 Zonulin ELISA ...... - 66 -

5.4 Larazotide ...... - 67 -

5.4.1 Behandlungserfolg anhand von Score und Gewicht ...... - 67 -

5.4.2 Längenmessung ...... - 68 -

5.4.3 FACS ...... - 68 -

5.4.4 Knochendichte im µCT ...... - 71 -

5.4.5 Osteomeasure ...... - 72 -

5.4.5 Zonulin ELISA ...... - 75 -

5.5 Zonulin Humanstudie ...... - 76 -

6. Diskussion ...... - 78 -

6.1 Verlaufsstudie der CIA ...... - 78 -

6.2 Butyrate, ACEA, α4ß7-Antikörper ...... - 82 -

6.2.1 Butyrate ...... - 82 -

6.2.2. ACEA ...... - 83 -

6.2.3 α4ß7-Antikörper ...... - 84 -

6.3 Zonulin und Darmpermeabilität ...... - 86 -

6.4 Larazotide ...... - 88 -

6.5 Generelle Kritik ...... - 90 -

6.5.1 FACS ...... - 90 -

6.5.2 Histologie ...... - 91 -

6.5.3 Zellkultur ...... - 92 -

6.5.4 Darmpermeabilität ...... - 92 -

6.5.5 Osteomeasure ...... - 92 -

6.6 Fazit ...... - 93 -

6.7 Ausblick ...... - 94 - 6.7.1 Durchlässigkeit ...... - 94 -

6.7.2 Immunisierungsort Darm ...... - 95 -

7. Literaturverzeichnis ...... - 96 -

8. Anhang ...... - 127 -

8.1 Abbildungen zu Kapitel 5.1.3 Histologie (Zeitverlauf CIA) ...... - 127 -

8.2 Abbildungen zu Kapitel 5.1.4 LegendplexTM (Zeitverlauf CIA) ...... - 129 -

8.3 Abbildungen zu Kapitel 5.3.3 FACS (ACEA und α4ß7) ...... - 131 -

9. Danksagung ...... - 132 -

10. Lebenslauf ...... - 133 - 1. Zusammenfassung / Abstract

1.1.1 Hintergrund und Ziele Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine der häufigsten autoimmunen und chronischen Erkrankungen. Die Pathogenese von Autoimmunerkrankungen ist nicht abschließend verstanden und ein weltweiter Forschungsschwerpunkt. Dabei gibt es zunehmend Hinweise, dass Veränderungen im Darm und in seinem Mik- robiom, zusammen mit einer genetischen Vulnerabilität, ein entscheidender Mechanismus sind.

Im Rahmen dieser Arbeit ist der Fokus auf strukturelle sowie immunologische Veränderungen im Darm, abseits vom Mikrobiom, gelegt worden. Inwiefern diese Veränderungen ein Therapieansatz bieten, wurde im Anschluss durch den Einsatz Darm gerichteter Therapien evaluiert.

1.1.2 Methoden (Patienten, Material und Untersuchungsmethoden) Die Collagen induzierte Arthritis (CIA) in DBA/1J Mäusen – ein allgemein aner- kanntes Modell der RA – ist die Grundlage des Forschungsprojektes. Der Krankheitsverlauf wurde eng durch das etablierte Scoringkonzept nach Brand et al., 2007, gemonitort.

Eine Analyse fand zu verschiedenen Zeitpunkten nach Symptombeginn statt. Dabei wurden zunächst das Darmimmunsystem sowie der strukturelle Aufbau mit gesunden Mäusen verglichen. Dazu wurden Dünn- und Dickdarm der Mäu- se entnommen sowie ihr Blut zur Analyse gewonnen.

Das Immunsystem wurde dabei durch FACS, Immunofluoreszenz und indirekt durch Zytokinmessungen von Zellkulturüberständen des gewonnenen Gewebes nach Hinweisen auf Entzündung sowie Zellverschiebungen, analog zu den bereits bekannten Zellverteilungen in entzündeten Gelenken, analysiert.

Es erfolgte eine histologische Untersuchung auf lichtmikroskopisch sichtbare Veränderungen. Eine indirekte Messung der Integrität der Darmwand wurde mittels FITC-Dextran durchgeführt sowie eine Analyse von Strukturproteinen mittels qRT-PCR.

- 1 - Darm gerichtete Therapien wurden mit einem α4ß7-Antikörper, Butyrate (einer kurzkettigen Fettsäure), ACEA (einem synthetischem Cannabionid) sowie Larazotide (einem Zonulinantagonisten) in Zeiträumen vor und während des regelhaften Einsetzens der Gelenkinflammation beim CIA-Modell durchgeführt.

Abseits des Scorings sind die systemischen Auswirkungen der Therapie durch Knochendichtemessung und histologischer Gelenks- und Knochenanalyse, mithilfe eines Osteomeasuregeräts, auf Unterschiede in Gelenkschaden und Kno- chenverlust mit nicht therapierten Tieren verglichen worden.

Lokale Veränderungen des Darms sind mittels systemischer Zonulinmessung, FACS-Analyse des Darmimmunsystems, Histologie sowie qRT-PCR analysiert worden.

Eine Übertragung vom Mausmodell auf den Menschen erfolgte mit Hilfe einer Studienpopulation der Forschungsambulanz des Universitätsklinikums Erlan- gen. Dabei handelt es sich um eine Population an Gesunden, Prä-RA- und RA- Patienten. Kontrollen waren dabei ACPA negativ und gesund, Prä-RA ACPA positiv und gesund sowie RA ACPA positiv und erkrankt. Die drei Gruppen wurden auf ihre systemischen Zonulinlevel untersucht.

1.1.3 Ergebnisse und Beobachtungen In der Gesamtschau der Methoden finden sich viele Veränderungen, die eine Mitbeteiligung des Darms bei der RA zeigen. Hervorzuheben sind dabei zum einen das Darmimmunsystem und zum anderen die Permeabilitätssteigerung des Darmepithels.

So zeigte sich bei der Analyse der Immunzellen im Darmgewebe eine Ver- schiebung hin zu einem autoimmunaktivem Verteilungsmuster, entsprechend bekannter Muster aus inflammatorischen Gelenken. Tendenziell schien die Ver- schiebung sogar vor den ersten Gelenksymptomen zu beginnen.

Die Permeabilität des Darmepithels steigerte sich dabei schon vor dem Auftre- ten der ersten Gelenkinflammation und hatte dann im Folgenden einen zeitlich vorverlagerten Verlauf im Vergleich zur Inflammationsschwere.

- 2 - Die, aufgrund der bisherigen Ergebnisse, durchgeführten Behandlungsansätze verliefen positiv. So konnte für alle genannten Substanzen eine leichte Verbes- serung des Krankheitsverlaufs festgestellt werden. Besonders Larazotide hat eine signifikante Verbesserung der Gelenkinflammation bewirkt.

Als Abschluss dieser Arbeit konnte eine signifikante Erhöhung des systemischen Zonulinwertes bei erkrankten Patienten festgestellt werden. Auch bei den Prä-RA-Patienten wurde bei einigen Patienten eine deutliche Erhöhung des Wertes gezeigt. Bei genauerer Betrachtung der Proben korrelierte der erhöhte Wert mit dem Auftreten von Gelenkentzündungen und der Diagnose RA bei den Verlaufsvorstellungen in der Studienambulanz.

1.1.4 Schlussfolgerung Eine Beteiligung des Darms bei der Systemerkrankung rheumatoide Arthritis erscheint als sehr wahrscheinlich, angesichts der vielen Hinweise auf Verände- rungen in diesem. In Anbetracht der unverstandenen Pathogenese der Auto- immunerkrankungen und der Annahme, Bestandteile und Veränderungen des Mikrobioms könnten mitursächlich sein für Autoimmunität, bekräftigt diese Ar- beit die Annahmen. So unterstützt die Veränderung der intestinalen Immunzell- komposition, schon vor Symptomen durch einen unbekannten Trigger, die The- se der Darm sei Ursprung des autoimmunen Prozesses.

Als wichtigster Mechanismus könnte dabei die frühzeitig gestörte Barrierefunk- tion des Darms, mit einer möglichen Translokation von bakteriellen Bestandtei- len und folgender Sensibilisierung von Immunzellen, sein. Möglicherweise füh- ren ähnliche Epitope auf den bakteriellen Translokaten und menschlichen Zel- len zu einer „Autoimmunisierung“ des aktivierten Immunsystems.

Mit FITC-Dextran wurde nur ein Molekül zur Permeabilitätsmessung verwendet, sodass die erhobenen Daten in weiteren Projekten dieser Arbeitsgruppe vali- diert und verifiziert worden sind.

Eine Migrationsanalyse der sensibilisierten Autoimmunzellen aus dem Darm in die Gelenke könnte ein weiterer zukünftiger Forschungsansatz sein.

- 3 - 1.2.1 Background and aims Rheumatoid arthritis (RA) is one of the most common autoimmune and chronic diseases. The pathogenesis of autoimmune diseases is not fully understood and is a global research focus. There is increasing evidence that changes in the gut and its microbiome, together with genetic vulnerability, are a key mechanism.

In the context of this work, the focus has been placed on structural as well as immunological changes in the gut, apart from the microbiome. The extent to which these changes provide a therapeutic approach was subsequently evalu- ated by using

1.2.2 Methods (patients, material and examination methods) Collagen induced arthritis (CIA) in DBA/1J mice - a generally accepted model of RA - is the basis of the research project. The course of the disease was closely monitored by the established scoring concept according to Brand et al., 2007.

An analysis was performed at different points in time after the onset of symptoms. First, the intestinal immune system and the structural setup were compared with healthy mice. For this purpose, the small and large intestines of the mice were removed and their blood was collected for analysis. A differentiation into individual sections of the intestine was performed to localize the changes more precisely.

The immune system was analyzed by FACS, immunofluorescence and indirect- ly by cytokine measurements of cell culture supernatants of the obtained tissue for indications of inflammation as well as cell shifts, analogous to the already known cell distributions in inflamed joints.

A histological examination for changes visible under the light microscope was performed. An indirect measurement of the integrity of the intestinal wall was carried out using FITC-dextran and an analysis of structural proteins using qRT- PCR.

Intestine-directed therapies were performed with an α4ß7 antibody, butyrates (a short-chain fatty acid), ACEA (a synthetic cannabionide) and larazotides (a

- 4 - zonulin antagonist) in periods before and during the regular onset of joint inflammation in the CIA model.

Away from scoring, the systemic effects of therapy by bone densitometry and histological joint and bone analysis, using an osteomeasurement device, on differences in joint damage and bone loss were compared with non-treated an- imals.

Local changes of the intestine were analyzed by systemic zonulin measurement, FACS analysis of the intestinal immune system, histology and qRT-PCR.

A transfer from the mouse model to humans was performed using a study population from the research outpatient clinic of the University Hospital Erlangen. This is a population of healthy, pre-RA and RA patients. Controls were ACPA negative and healthy, pre-RA ACPA positive and healthy and RA ACPA positive and diseased. The three groups were examined for their systemic zonulin levels.

1.2.3 Results In the overall review of the methods, there are many changes that show that the bowel is involved in RA. Particularly noteworthy are the intestinal immune system and the increase in permeability of the intestinal epithelium.

The analysis of immune cells in the intestinal tissue showed a shift towards an autoimmune distribution pattern, corresponding to known patterns of inflammatory joints. The shift seemed to start even before the first joint symptoms.

The permeability of the intestinal epithelium increased even before the first joint inflammation occurred and then subsequently had a temporally shifted course compared to the severity of the inflammation.

The treatment approaches carried out on the basis of the results so far have been positive. A slight improvement in the course of the disease could be observed for all substances mentioned. Larazotides in particular have brought about a significant improvement in joint inflammation.

At the end of this work, a significant increase of the systemic zonulin level in diseased patients could be observed. Also in pre-RA-patients a significant in-

- 5 - crease of the value was shown in some patients. On closer examination of the samples, the increased value correlated with the occurrence of joint inflammation and the diagnosis of RA in the outpatient study.

1.3.4 Conclusion An involvement of the intestine in the systemic disease rheumatoid arthritis seems very likely, given the many indications of changes in this. Considering the misunderstood pathogenesis of autoimmune diseases and the assumption that components and changes in the microbiome could be partly responsible for autoimmunity, this work confirms the assumptions. For example, the change of the intestinal immune cell composition, even before symptoms by an unknown trigger, supports the thesis that the intestine is the origin of the autoimmune process.

The most important mechanism could be the early disturbed barrier function of the intestine, with a possible translocation of bacterial components and subse- quent sensitization of immune cells. It is possible that similar epitopes on bacterial translocates and human cells lead to an "autoimmunisation" of the activated immune system.

With FITC-dextran only one molecule was used for permeability measurement, so that the collected data have been validated and verified in further projects of this research group.

A migration analysis of the sensitized autoimmune cells from the intestine into the joints could be another future research approach.

2. Einleitung

2.1 Rheumatoide Arthritis Die rheumatoide Arthritis (RA) ist eine systemische Autoimmunerkrankung und gehört mit einer Prävalenz von 500-1.000/100.000 Menschen und einer Inzi- denz von 5-50/100.000 Menschen pro Jahr zu einer der häufigsten chronischen Erkrankungen der Industrieländer (Helmick et al., 2008; Pedersen et al., 2009). Frauen sind dabei etwa dreimal so häufig wie Männer betroffen. Dabei steigt die

- 6 - Prävalenz ab dem 45. Lebensjahr stark an. (Symmons et al., 2002) Die klassischen Symptome der RA sind fortschreitende, destruktive Gelenkentzündungen mit begleitender Synovitis, die häufig symmetrisch und typischerweise die Handgelenke, Fingergrundgelenke (Metacarpophalangealgelenk; MCP) oder die proximalen Interphalangealgelenke (PIP) betreffen. Klinisch präsentiert sich die RA dabei durch Überwärmung, Steife und Schwellung der Gelenke. (Kourilovitch et al., 2014; Wasserman, 2011) Wie auch im Disease activity score 28 (DAS28) festgehalten wird, können potentiell alle Gelenke betroffen sein. Der DAS28 ist ein validiertes System zur Beurteilung der Schwere der RA. Durch die gute Nachvollziehbarkeit ist dieser Score sehr untersucherunabhän- gig. Es werden 28 Gelenke auf Druckschmerz und Schwellung hin untersucht, die Blutsenkungsgeschwindigkeit bestimmt und die subjektive Einschätzung der Krankheitsaktivität und -schwere durch den Patienten mittels einer visuellen Analogskala ermittelt. Diese Aspekte bilden zusammen den DAS28, der einen Score von 2,0 bis 10,0 hat. Dabei definiert der DAS28 die Krankheitsaktivität wie folgt: ein Wert <2,6 gilt als Remission, zwischen 2,6 bis 3,1 als geringe sowie zwischen 3,2 bis 5,1 als mittlere Krankheitsaktivität und Werte >5,1 als hochaktive RA. (Carpenter et al., 2018; Sengul et al., 2015)

Die RA wird anhand des Nachweises von Rheumafaktoren – verschiedene An- tikörper im Serum, die gegen die Fc-Region körpereigener Antikörper gerichtet sind – in seropositv und seronegativ eingeteilt (Arnett et al., 1988). Entschei- dend für die Diagnose RA bleibt allerdings nach wie vor die klinische Diagnostik durch Gelenkuntersuchungen. Diese haben – wie auch die Blutmarker – große Bedeutung in den international anerkannten Kriterien der ACR-EULAR 2010 (American College of Rheumatology – European League Against Rheumatism collaborative initiative). (Aletaha et al., 2010) Die RA wird dabei zunehmend nicht mehr als eine Erkrankung gesehen, sondern als Syndrom mit verschiedenen Ausprägungen (van der Helm-van Mil et al., 2008). So sind für seropositive und seronegative RA unterschiedliche inflammatorische Kaskaden entdeckt worden, die in beiden Fällen zu Arthritis und Gelenkdestruktion führen (van Oosterhout et al., 2008).

- 7 - Bei der Suche nach der Krankheitsgenese der RA sind bereits viele Fortschritte gemacht worden. So ist inzwischen nachgewiesen, dass 50 % des Risikos, an RA zu erkranken, genetischen Faktoren zugeschrieben werden kann (van der Woude et al., 2009). Viele Umweltfaktoren, wie Rauchen, niedriger sozioöko- nomischer Status oder Menopause, gelten als schwache Risikofaktoren, allerdings bisher mit schwacher Evidenz (Liao et al., 2009). Eine besonders große Rolle spielt dabei das HLA-DRB1 Allel, welches bei der Entstehung von Anti- körpern gegen zyklisch-zitrullinierte Peptide (ACPA) von Bedeutung ist (Huizinga et al., 2005). ACPA ist dabei aktuell der beste Serummarker der RA mit einer Spezifität von 96-98 % und einer Sensitivität von 65-70 % (van Venrooij et al., 2006).

Die RA betrifft allerdings nicht nur die Gelenke, wie auch schon die Definition als systemische Autoimmunerkrankung vermuten lässt, sondern kann im gan- zen Körper zu Symptomen führen (Bevans et al., 1954). Extraartikuläre Mani- festationen (EAM) sind dabei in allen Geweben und Organen zu finden. Die häufigsten EAMs sind dabei kutaner, kardiovaskulärer, okulärer oder pulmona- ler Natur (Das et al., 2017). Für dieses Projekt sind die seltenen gastrointestina- len Beteiligungen, die durch Vaskulitiden mit Inflammation und Fibrosierung von Gewebe entstehen (Ebert et al., 2011), von besonderem Interesse.

2.2 Rheumatoide Arthritis und der Gastrointestinaltrakt Generell scheint eine Assoziation zwischen RA und chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (CED) zu bestehen; Patienten mit CED haben ein 3-fach höheres Risiko an RA zu erkranken (Bae et al., 2017). Die Verbindung zwischen diesen Erkrankungen wird in der Fachliteratur Gelenk-Darm-Achse genannt (Brakenhoff et al., 2010; Zaiss et al., 2019). Tatsächlich wird sogar eine gemeinsame Pathogenese chronischer Autoimmunerkrankungen diskutiert. Die Schlüsselrolle nimmt dabei das Mikrobiom ein, welches dabei die Gesamtheit der kommensalen Mikroben definiert und eine wichtige Rolle im Metabolismus und in der Immunkompetenz des Wirts spielt (Kamada et al., 2013). Dabei ist der Darm das größte Reservoir des Mikrobioms (Sender et al., 2016).

- 8 - Auch bei Autoimmunerkrankungen scheint das Mikrobiom von entscheidender Bedeutung zu sein, sodass keimfrei und damit auch mikrobiomfrei aufgewach- sene HLA-B27-Ratten, ein häufig genutztes Modell für Autoimmunerkrankun- gen, keine Darm- und/oder Gelenkentzündung entwickeln (Taurog et al., 1994). Bei der RA ist eine Veränderung des Mikrobioms bereits nachgewiesen. So ist die Bakterienanzahl der Familie der Bifidobakterien und Bakteroides bei Patien- ten mit früher RA zurückgegangen (Vaahtovuo et al., 2008), während Bakterien der Prevotella-Familie deutlich vermehrt vorkommen (Alpizar-Rodriguez et al., 2019; Bernard, 2014; Scher et al., 2016). Nachdem die RA behandelt worden ist, lässt sich eine partielle Normalisierung der Bakterienkomposition im Mirko- biom feststellen (Zhang et al., 2015). Es hat bereits viele Studien zur Effektivität von Ernährungsveränderungen bei RA gegeben, mit dem Ergebnis eines unter- stützenden Effekts zur klassischen RA-Therapie (Tedeschi et al., 2016). Dabei ist vor allem für die kurzkettigen Fettsäuren (Short chain fatty acids, SCFA) ein anti-inflammatorischer und regulatorischer Effekt auf das Immunsystem nachgewiesen worden (Arpaia et al., 2013; Smith et al., 2013). SCFA werden von kommensalen Bakterien aus Ballaststoffen hergestellt (Tan et al., 2014). Eine Besserung von Arthritis ist für die Behandlung mit im Wasser gelösten SCFA bereits nachgewiesen (Lucas et al., 2018). Für eine ballaststoffreiche Ernäh- rung, und damit erhöhter Produktion der SCFA, konnte bereits eine protektive Zusammensetzung der Bakterienflora gegen Colonkarzinom festgestellt worden (Bishehsari et al., 2018). Entsprechende Daten wurden ebenfalls für die ballaststoffreiche Ernährung bei RA-Mausmodellen gewonnen (Lucas et al., 2018). Der genaue Wirkmechanismus der SCFA bleibt allerdings weiterhin ungeklärt.

2.3 Immunisierung im Darm Der Zusammenhang von Darm und Autoimmunerkrankungen ist in der For- schung aktuell ein Thema, bei dem in viele Richtungen experimentiert wird (Fasano, 2012). So wurde die Hypothese, dass das Darmimmunsystem für die Autoimmunität gegen die Betazellen im Pankreas bei Diabetes mellitus Typ 1 (DM 1) verantwortlich ist, schon im Jahr 2000 aufgestellt (Vaarala, 2000). Inzwi- schen gilt der Zusammenhang von verändertem Mikrobiom und erhöhter Inzi-

- 9 - denz von DM 1 in Industrieländern als sehr sicher und es wird empfohlen, dass zukünftige Interventionen zur Prävention auf das Darmimmunsystem abzielen sollten (Vaarala, 2012). Bei Patienten mit diagnostiziertem DM 1 oder in einer präklinischen Erkrankungsphase ist eine erhöhte Darmdurchlässigkeit festgestellt worden, womit der Zusammenhang Darm und Erkrankung weiter gefestigt wurde (Bosi et al., 2006).

Eine erhöhte Durchlässigkeit ist dabei bereits bei vielen weiteren Autoimmuner- krankungen festgestellt worden. Es ist wenig überraschend, dass bei den Dar- merkrankungen Zöliakie und CED die Permeabilität gesteigert ist (Fasano et al., 2000; Michielan et al., 2015). Die erhöhte Permeabilität bei Multipler Sklerose, Morbus Parkinson und Autoimmunhepatitis erscheint dagegen auf den ersten Blick aufgrund des fehlenden Darmbezuges nicht offensichtlich (Lin et al., 2015; Rodriguez et al., 2016; Salat-Foix et al., 2012). Auch bei der zum rheumati- schen Formenkreis gehörenden Spondyloarthritis gibt es schon lange Hinweise, dass die Permeabilität gesteigert ist (Mielants et al., 1991). Das Konzept der Krankheitsentstehung im Darm für autoimmune Reaktionen im Körper gilt aktuell als eine allgemein schlüssige Theorie, weshalb die Forschung versucht diese zu belegen (Mu et al., 2017).

Zonulin ist dabei das bisher einzige bekannte physiologische Molekül, das durch Steigerung der Darmpermeabilität zu vermehrten Eintritt von Makromole- külen durch das Epithel führt (Fasano, 2008) und könnte daher eines der Hauptmechanismen bei der Entstehung von Autoimmunerkrankungen sein (Fasano, 2011). Wieso Zonulin bei Autoimmunerkrankungen in erhöhter Kon- zentration vorkommt, ist bisher nicht geklärt. Im Blut zirkulierendes Zonulin wird dabei als leicht messbarer Marker für Veränderungen der intestinalen Permea- bilität gewertet (Smecuol et al., 2005; W. Wang et al., 2000).

Eine weitverbreitete Theorie ist, dass sich Autoimmunität durch Reaktionen auf Pathogene aus dem Mikrobiom entwickelt und dadurch eine Form der Kreuzre- aktivität entsteht. Die Kreuzreaktivität von Epitopen der Bakterien Mycoplasma pneumoniae sowie Campylobacter jejuni und Gangliosidepitopen der Nerven- zellen ist wahrscheinlich Krankheitsauslöser beim Guillain-Barré-Syndrom

- 10 - (Meyer Sauteur et al., 2016; van Doorn et al., 2008). Der autoimmune Prozess des Guillain-Barré-Syndroms ist dabei mit einer vorherigen Erkrankung wie der Mycoplasmen-Lungenentzündung und der Campyloabcter-Enteritis assoziiert (Caudie et al., 2011; Gruenewald et al., 1991). Für Autoimmunerkrankungen sind solche klaren Zusammenhänge zwischen erregerassoziierter Krankheit und Erkrankung bisher nicht gesichert worden. Wie bereits aufgeführt, konnte für die RA ein vermehrtes Auftreten von Prevotella copri im Darm festgestellt werden, sodass diesem Bakterium eine Rolle als möglicher Entstehungsfaktor zugeschrieben wird (Scher et al., 2013). Ein Teil der Pathogenese könnte demnach eine gesteigerte Permeabilität und dadurch ein erhöhter Kontakt mit der Darmflora sein.

Dieses Projekt soll die Theorie der Krankheitsentstehung im Darm und die intestinale Beteiligung bei der RA bekräftigen. Dabei wird das Augenmerk auf die Permeabilität im Darm gelegt.

2.4 Das Immunsystem bei der rheumatoiden Arthritis Durch den Charakter als chronisch-inflammatorische Erkrankung gibt es viele Immunsystemveränderungen bei der RA (Wicks et al., 1994). Die Immunreakti- onen erfolgen dabei humoral und zellulär, d. h. mit Zytokin und Antikörper ge- steuerten Mechanismen bzw. mit direkter Zell-Pathogen-Interaktion (Schultz et al., 1987). Beides ist bei der RA relevant, so spielen auf der einen Seite Anti- körper eine große Rolle (Scott et al., 2010) und auf der anderen sind T-Zellen, Neutrophile und antigenpräsentierende Zellen entscheidend bei der Zerstörung von Gelenken (Cavanagh et al., 2005; Komatsu et al., 2015; Talbot et al., 2015).

Die verschiedenen Antikörper der RA werden immer stärker in Verbindung mit dem Krankheitsverlauf gebracht. Die ACPA werden zunehmend als Prädiktions- faktor für die Entwicklung einer RA verwendet und steht für einen schwereren Krankheitsverlauf (van der Linden et al., 2009). Der ursprüngliche Serummarker Rheumafaktor (RF) hat eine deutlich schlechtere Spezifität und Sensitivität für

- 11 - RA (Nishimura et al., 2007). Ein positiver RF gilt allerdings weiterhin als ein Ri- sikofaktor für einen schlechteren Verlauf einer RA. (Katchamart et al., 2015).

Die ACPA, die wichtigsten bekannten Autoimmunantikörper, sind nicht eindeutig vergleichbar im verwendeten Mausmodell Collagen induzierte Arthritis (CIA) vorhanden (Cantaert et al., 2013), sodass in der Immunsystemanalyse dieses Projektes der Fokus auf die zelluläre Immunantwort im Darm gelegt wird.

Die Antikörperproduktion im Körper obliegt den Plasmazellen, die nach Anti- genkontakt aus den B-Zellen entstehen (Nutt et al., 2015). Über komplexe Kon- trollmechanismen werden die B-Zellen nach der Passgenauigkeit ihrer Antikör- per selektiert, dabei wird sowohl die auf die Spezifität gegenüber dem Fremdan- tigen, als auch auf das Nicht-Vorhandensein von Bindungsaffinität gegenüber körpereigenen Antigenen kontrolliert (LeBien et al., 2008). Bei der RA scheint dieser Selektionsmechanismus gestört, sodass autoreaktive Antikörper entstehen und diese dann eine Autoimmunantwort verursachen (Samuels et al., 2005). Dabei können viele verschiedene Autoantikörper produziert werden, wobei die ACPA die prominentesten sind (Sun et al., 2017). Zusätzlich interagieren B-Zellen über Zytokinausschüttung und Zellkontakt mit anderen Zellen des Im- munsystems (Bugatti et al., 2014).

In der zellulären Immunantwort spielen vor allem die T-Zellen bei der RA eine entscheidende Rolle (Fournier, 2005; Keystone et al., 1983). Die T-Zellen spal- ten sich dabei in zytotoxische T-Zellen und T-Helferzellen auf.

Die zytotoxischen T-Zellen sind dabei die Effektorzellen, die bei erkrankten bzw. beschädigten Zellen die Apoptose einleiten können und somit aktiv zur Beseiti- gung dieser Zellen beitragen (Andersen et al., 2006). Bisher sind sie wenig im Zusammenhang mit Autoimmunerkrankungen erforscht worden, aber es gibt Hinweise darauf, dass die zytotoxischen T-Zellen eine Rolle in der Pathologie von autoimmuner Arthritis spielen (Petrelli et al., 2016).

Die T-Helferzellen werden in weitere Subtypen unterteilt, u. a. die Typ 1 T- Helferzellen (Th1 Zellen), die Interleukin-17 produzierenden T-Helferzellen (Th17 Zellen), die Typ 2 T-Helferzellen (Th2 Zellen) und die regulatorischen T- Helferzellen (Treg Zellen) (Caza et al., 2015). Naive T-Zellen differenzieren sich

- 12 - in die verschiedenen Subtypen durch das Vorhandensein von bestimmten Zyto- kinen und Interleukinen (Luckheeram et al., 2012).

So wird den Th1 Zellen und Th17 Zellen über die Ausschüttung ihrer Zytokine Interferon-γ (IFN-γ) sowie Interleukin-17 (IL-17) und ihrem häufigeren Vorkom- men eine wichtige Rolle bei der Pathogenese der RA zugeschrieben (Schinnerling et al., 2017). Es gibt den Hinweis auf eine Vermehrung von zitrul- lin-spezifischen Th1 Zellen, die folglich zitrullinierte Strukturen angreifen können (James et al., 2014). So sollen die Th1 Zellen die erste inflammatorische Reak- tion im Gelenk verursachen, während die Th17 Zellen vor allem für die Chronifi- zierung der RA verantwortlich gemacht werden (Tuncel et al., 2017).

Ein Th1 Zellenabfall im Blut und das vermehrte Auftreten der Th1 Zellen im Ge- lenk ist in frühen Stadien der RA beschrieben (Mangge et al., 1999) und wird mit der Migration ins Gelenk begründet (Dolhain et al., 1996). Die IFN-γ- Produktion der Th1 Zellen sorgt dann für die Initiation und Aufrechterhaltung der inflammatorischen Antwort (de Groen et al., 2014).

Eine Imbalance zwischen Th1 und Th2 Zellen zugunsten einer Th1 Zellantwort korreliert mit Arthritis und führt zu einem proinflammatorischen Zytokinmilieu, durch welches die Entstehung von Th17 Zellen gefördert wird (Hirota et al., 2007). So führt eine erfolgreiche RA-Behandlung zur einer Verschiebung Rich- tung Th2 Zellantwort (Nissinen et al., 2003). Ein protektiver Charakter ist für die RA bei verschiedene Th2 zellassoziierten Krankheiten beschrieben worden: Eine Helmintheninfektion führt über die Aktivierung der Th2 Zellen und Eosino- philen zur Supression von inflammatorischer Arthritis (Z. Chen et al., 2016; Sarter et al., 2016). RA-Patienten mit atopischen Erkrankungen, welche ebenfalls die Th2 Zellen aktivieren, haben geringere Krankheitsaktivitäten aufgewie- sen (Hartung et al., 2003). Die Rolle der Th2 Zellen ist aber bisher nicht eindeutig geklärt, so gibt es Hinweise, dass bestimmte Th2 Zellpopulationen zur vermehrten Autoantikörperproduktion beitragen (J. Wang et al., 2016). Tendenziell wird ein vermehrter Th2 Zellanteil als positiv angesehen.

Insgesamt gelten die Th17 Zellen inzwischen als die T-Zellpopulation, die am stärksten mit chronischen Autoimmunerkrankungen vergesellschaftet sind

- 13 - (Singh et al., 2014). Der Th17 Zellanteil im Blut korreliert dabei mit der Krank- heitsaktivität der RA (J. Kim et al., 2013). Vor allem das gestörte Gleichgewicht von Th17 Zellen zu Treg Zellen wird als Schlüsselpunkt für die RA-Entstehung gesehen (Niu et al., 2012). Die vermehrte Anzahl der Th17 Zellen könnte u. a. durch die Konversion von Treg zu Th17 Zellen zustande kommen. Die ehemali- gen Treg Zellen stehen im Verdacht noch pathogener als die aus naiven T- Zellen entstandenen Th17 Zellen zu sein. (Komatsu et al., 2014) Die Wirkungen der Th17 Zellen sind dabei vielfältig, so verursachen sie u. a. vermehrte Angio- genese im bradytrophen, synovialen Gewebe (Pickens et al., 2010). Das von den Th17 Zellen produzierte IL-17 verursacht Gelenkschäden über Induktion von Matrix-Metalloproteasen, deren Überexpression wiederum zur Degenerati- on der extrazellulären Matrix im Gelenk beiträgt (Moran et al., 2009). Osteopo- rose ist bei vielen RA-Patienten lange als eine Nebenwirkung der Cortisonthe- rapie angesehen worden, aber schon um die Jahrtausendwende wurde der Be- zug zu Krankheitsschwere und Verlauf festgestellt (Cortet et al., 1997). Inzwi- schen ist bewiesen, dass die Th17 Zellen eine entscheidende Rolle beim Kno- chenverlust spielen und über ihre Zytokine zu vermehrter Expression des Re- zeptoraktivators von NF-κB-Ligand (RANKL) führen K. W. Kim et al. (2015). Vermehrte RANKL-Ausschüttung sorgt für vermehrte Osteoklastendifferenzie- rung und damit zu einem gestörtem Osteoblasten/Osteoklasten-Verhältnis, was wiederum zu einem Knochensubstanzverlust führt (Rachner et al., 2011; Teitelbaum, 2000).

Eine Verschiebung Richtung Treg Zellen im Th17/Treg Zellverhältnis steht im Zusammenhang mit verringerter Krankheitsaktivität und erfolgreicher Behand- lung (Samson et al., 2012). Die Treg Zellen inhibieren über Kontrolle der Th17 Zellen die Gewebeverletzung durch autoimmune Zellen und Prozesse (Bettelli et al., 2006). So reduzieren sie nicht nur die Th17 Zellaktivität direkt, sondern schränken auch die Antigenpräsentation von dendritischen Zellen ein, sodass diese die T-Zellen nicht mehr zu autoantigen-spezifischen Zellen sensibilisieren können (Alissafi et al., 2017). Ein Schutz vor Knochensubstanzverlust ist mit vermehrtem Auftreten der Treg Zellen verknüpft und damit wird ein weiterer

- 14 - Schädigungsmechanismus der Th17 Zellen durch die Treg Zellen ausgeglichen (Zaiss et al., 2010).

Alle Zellen des Körpers können als nicht-professionelle antigenpräsentierende Zellen über den Haupthistokompatibilitätskomplex I (MHC I) Antigene präsentie- ren, mit welchem sie nach Stand der aktuellen Wissenschaft fast ausschließlich mit cytotoxischen T-Zellen interagieren und auf Zellschäden kontrolliert werden (den Haan et al., 2014). Die professionellen antigenpräsentierenden Zellen (APC) lösen über die Präsentation der Antigene eine T-Zellantwort aus und können damit antigenspezifische Zellen kreieren (Mann et al., 2014). Makro- phagen, B-Zellen und dendritische Zellen bilden die Haupttypen der APC und steuern über Antigenpräsentation viele Mechanismen im Immunsystem. Die APC präsentieren über den MHC II Fremdantigene für andere Immunzellen und sind zusätzlich in der Lage co-stimulatorische Zytokine auszuschütten. (Kambayashi et al., 2014)

In der RA ist das Zusammenspiel von APC und T-Zellen in der Synovia ein entscheidender Mechanismus für die Gelenksinflammation (Aarvak et al., 2001). Eine weitere Theorie ist das dendritische Zellen über Präsentation von zitrullinierten Peptiden autoreaktive T-Zellen verursachen (Rodriguez-Fernandez, 2013). Die Gelenkdestruktion wird zu einem großen Teil von Makrophagen verursacht (Udalova et al., 2016). Makrophagen sind dabei die Hauptproduzenten des Tumornekrosefaktor alpha (TNFα) (Gahring et al., 1996). Über verschiedene Zellmechanismen führt TNFα zu inflammatorischen Reaktionen bei der RA (G. Chen et al., 2002; Wajant et al., 2003).

Die Zusammenhänge des Immunsystems in der RA komplett darzustellen, ist aufgrund der Komplexität und Vielfältigkeit im Rahmen einer Doktorarbeit nicht möglich. Daher dient die vorherige Darstellung des Immunsystems als Rahmen, die Forschungsergebnisse nachvollziehen zu können.

2.5 Behandlung der rheumatoiden Arthritis Da die Pathogenese der RA bisher nicht restlos verstanden ist, beschränkt sich die Therapie größtenteils auf Schmerzbehandlung und Entzündungshemmung

- 15 - mit nicht-steroidalen Antirheumatika (NSAR) (Y. F. Chen et al., 2008) und auf Krankheitskontrolle durch Immunsupression bzw. -modulation. Mit dieser Kom- bination kann das Fortschreiten der Krankheit nahezu verhindert werden, sodass neue, starke Gelenkdeformitäten die Seltenheit geworden sind (Smolen et al., 2006). Das älteste verwendete Immunsuppressivum ist dabei Cortison; die Wirksamkeit ist seit 1955 in Studien nachgewiesen (McEwen et al., 1955). Heutzutage spielt Cortison überwiegend im akuten Schub eine Rolle und wird nur noch in Sonderfällen langfristig eingesetzt (Palmowski et al., 2017). Die Langzeittherapie ist durch krankheitsmodifizierende Basistherapeutika (Disease modifying antirheumatic drugs, DMARDs) ersetzt worden. Da die RA und die damit auftretenden Veränderungen im Körper immer besser verstanden werden, hat sich das Therapieregime in den letzten Jahrzehnten regelmäßig ver- ändert. Daher werden folgend einige der aktuellen Empfehlungen der EULAR von 2016 aufgeführt: Eine möglichst frühe Therapie mit DMARDs führt dabei zu einem langfristig deutlich besseren Outcome der Patienten (Kyburz et al., 2011). Aufgrund dessen ist ein aktuelles Ziel der Forschung die Parameter zur Diagnose RA zu verbessern und damit den Behandlungsstart vorzuverlegen. Methotrexat (MTX) ist das DMARD der ersten Wahl (Visser et al., 2009), es wirkt als Folsäure-Antagonist und hemmt durch verlangsamte DNA-Synthese sich schnell teilendes Gewebe wie das Immunsystem (Berry et al., 1972). Die neueren DMARDs sind so genannte Biologika – von einem biologischen Orga- nismus hergestellte Produkte (Freissmuth, 2012). Vor allem Antikörper gegen inflammatorische Zytokine sind dabei die entscheidende Entwicklung der letzten Jahre (Brekke et al., 2003). Dabei sind die Zytokine TNFα, Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-1 (IL-1) und das Antigen Cluster of Differentiation 20 (CD20) nur die gängigste Auswahl an Antikörperzielen (Siebert et al., 2015). Dies sind inflammatorische Zytokine, die in der RA erhöht sind (Mateen et al., 2016). Ledig- lich die CD20-Antikörper, wie Rituximab, wirken über Reduktion der B-Zellen (CD20 positiv) und verhindern damit die Antikörperproduktion dieser (Cerny et al., 2002). Cortison, MTX und Rituximab haben eine direkte Wirkung auf die Zellanzahl und supprimieren somit das Immunsystem. Einen modulierenden Effekt kann den Medikamenten zugeschrieben werden, die gegen die Zytokine

- 16 - wirken und damit eine Veränderung im Immunsystem verursachen. Auch die neuste Entwicklung der Januskinasen-Inhibitoren (JAK) greift in das Immunsys- tem ein. Die JAK sind essentielle Enzyme im Signalweg von inflammatorischen Zytokinen. (Schwartz et al., 2017) Die RA-Therapie ist bisher also darauf be- schränkt, die entstandene Inflammation zu unterdrücken und dadurch die Re- mission einzuleiten. Eine kausale Therapie ist bisher nicht vorhanden.

In diesem Kapitel wurde nicht auf alle vorhandenen Therapieoptionen und - regime eingegangen. Die Behandlung der RA und ihrer extraartikulären Mani- festationen sind bisweilen so vielfältig, dass eine umfassende Darstellung den Rahmen dieser Ausarbeitung überschreiten würde.

2.6 Medikamentöse Therapieansätze Die Experimente dieser Arbeit sind u. a. auf Grundlage der Theorie „der Darm als Entstehungsort autoimmuner Erkrankungen“ entstanden (vergleiche Kapitel 2.4.). So sind Medikamente, die eine lokale Wirkung im Darm haben, für dieses Projekt von großem Interesse. Daher sollen im Folgenden die Entscheidungs- hintergründe zur Medikamentenauswahl erläutert werden.

Es wurde sich für die Behandlung mit einem α4ß7-Antikörper entschieden, um die Migration der Immunzellen in den Darm zu verhindern und somit die Krank- heitsentstehung zu beeinflussen. Für CED ist Vedolizumab – ein α4ß7- Antikörper für die humane Verwendung – bereits eine häufige und sichere Langzeittherapieoption (Eriksson et al., 2017). Dabei verhindert der Antikörper effektiv das Homing von vielen Immunzellen, v. a. den T-Zellen, in den Darm über eine Störung der Interaktion von dem α4ß7-Integrin und dem mukosaas- soziierten Zelladhäsionsmolekül 1 (MadCAM-1). Die hohe Spezifität auf diese Interaktion verhindert Störungen in der sonstigen Immunkompetenz der Patien- ten. (Soler et al., 2009) Aufgrund dieses Mechanismus besteht die Überlegung, dass eine Therapie vor Einsetzen der RA-Klinik eine Kreuzreaktion mit Darmpa- thogenen verhindern könnte und der Ausbruch der RA abgeschwächt bzw. ab- gewendet wird.

- 17 - Die Integrität der Darmepithelstruktur, und damit einhergehend die Erhaltung der selektiven Permeabilität des Darms, erscheint in der Verhinderung der Krankheitsentstehung als sinnvolles Therapieziel. Im Kapitel 2.2 ist auf dieses Thema bereits ausführlich eingegangen worden. Aufgrund der Annahme, dass die Permeabilität bei RA steigt, wurde sich für zwei potentielle Substanzen entschieden, die einen positiven Einfluss auf die Darmpermeabilität haben.

So ist inzwischen für Endocannabinoide nachgewiesen, dass sie eine große Rolle bei Motilität, Ionentransport, Inflammation, Zellproliferation und Barriere- funktion im Darm spielen (Izzo et al., 2010). Der Cannabionid-Rezeptor 1 (CB1) ist dabei vermehrt im Colonepithel und im enterischen Nervensystem gefunden worden und scheint ein wichtiger Faktor bei der Erhaltung der Darmbarriere und der Wundheilung im Darm zu sein (Wright et al., 2005). Die intestinale Expres- sion des CB1 beschränkt sich dabei allerdings nicht auf das Colon (Casu et al., 2003; Croci et al., 1998). Der Cannabionid-Rezeptor 2 (CB2) ist dagegen vermehrt auf Immunzellen und Neuronen des Plexus myentericus zu finden (Duncan et al., 2008). Das Fehlen des CB1 führt zu deutlich vermehrter Translokation von Bakterien in die Lamina propria des Darms (Zoppi et al., 2012). Die Verbesserung einer Darmentzündung und eine Permeabilitätssteige- rung ist für Agonisten der Cannabionid-Rezeptoren beschrieben worden (Massa et al., 2004). Ein Wirkmechanismus zur Wiederherstellung der Darmbarriere durch einen CB1-Agonismus scheint dabei die gesteigerte Expression von Zonula Occludens (ZO1) zu sein (Alhamoruni et al., 2010). ZO1 bildet die Ver- ankerung von Tight Junctions im Zytoplasma von Zellen (Stevenson et al., 1986). Da vor allem eine Verbesserung der Darmpermeabilität in der Behand- lung erreicht werden sollte, musste das verwendete, synthetische Cannabionid eine Selektivität für den CB1 aufweisen. Zudem ist CB1-Agonisten ein antiin- flammatorischer Effekt im Darm zugeschrieben, ohne dass der genaue Mecha- nismus eindeutig geklärt wäre (Karwad et al., 2017).

Das Cannabionid Arachidonyl-2'-chloroethylamide (ACEA) ist dabei ein hochse- lektiver Agonist für den CB1 mit einer 1.400fachen Bindeaffinität gegenüber dem CB2 (Hillard et al., 1999) und daher für die Behandlung ausgewählt worden.

- 18 - In Kapitel 2.4. wurde der Botenstoff Zonulin bereits vorgestellt. Mit Larazotide- Acetat (INN: AT-1001, CAS: 258818-34-7 oder als Acetatsalz 881851-50-9) ist ein direkter Antagonist von Zonulinrezeptoren vorhanden (Khaleghi et al., 2016). Larazotide ist ein aus acht Aminosäure bestehendes Molekül (PubChem, 2009), das von der Bindedomäne des Zonula occludens Toxin (ZOT) des Bak- teriums Vibro cholerae abgeleitet ist. Das Octapeptid hat dabei dieselbe Bin- dungsaffinität an den Zonulinrezeptor wie Zonulin und verhindert damit die per- meabilitätssteigernde Wirkung dieses. (Di Pierro et al., 2001) Die effektive Ver- besserung der Darmpermeabilität durch Larazotide ist bereits in vitro und in vivo bestätigt worden (Gopalakrishnan et al., 2012). Die humane Verwendung hat 2007 mit einer Phase I-Studie zur Behandlung von Zöliakie begonnen (Paterson et al., 2007) und eine Phase IIb-Studie ist bereits erfolgreich an Zöliakiepatien- ten durchgeführt worden (Leffler et al., 2015; Valitutti et al., 2019).

Da die Wirkung von Larazotide auf die Darmpermeabilität beschränkt und dies als möglicher Mechanismus zur Krankheitsentstehung der RA ausgemacht worden ist, könnte es sich hierbei um ein Medikament handeln, das eine spezifische Betrachtung von Permeabilitätsveränderungsauswirkungen ermöglicht. Für die Verwendung von Larazotide spricht ebenfalls die bereits erfolgte humane Anwendung, wodurch eine Übertragung vom Mausmodell in den Menschen vereinfacht umgesetzt werden könnte.

3. Fragestellung und Zielsetzung Ziel dieses Projektes ist die Erforschung des Zusammenhangs von Darm und Gelenk bei der Krankheit Rheumatide Arthritis (RA). Dabei sollen im ersten Schritt Veränderungen des Immunsystems und der Struktur des Darms mit Hilfe eines Mausmodells für RA analysiert werden und im Folgenden auftretende Veränderungen als Behandlungsziel für Therapien identifizieren. Im Weiteren sollen erste Behandlungsversuche im Tierversuch gestartet und auf ihre Wirk- samkeit untersucht werden. Im Verlauf ist die Übertragung der Ergebnisse auf den Patienten das Ziel. Kann der Darm als Therapieziel dienen und damit das Outcome der RA-Patienten verbessern?

- 19 - 4. Material und Methoden

4.1. Mausstudien Die verwendeten DBA/1J Mäuse sind von Janvier Laboratorien gekauft und im Präklinischen Experimentellen Tierzentrum (PETZ) Erlangen, Deutschland, unter speziell pathogen-freien (SPF) Bedingungen gehalten worden. In allen Ex- perimenten wurden acht Wochen alte, weibliche Mäuse verwendet, nachdem sie zuvor eine zweiwöchige Akklimatisierungsphase im Tierstall hatten. Mit ma- ximal fünf Mäusen pro Käfig, und der Möglichkeit zum Nestbau im lichtge- schützten Unterschlupf, wurden sie möglichst natürlich und stressfrei gehalten. Die Versuche wurden durch die ethische Kommission der Regierung Unterfran- ken mit den Tierversuchsgenehmigungsnummern #55.2-2532-2-424 und #55.2- 2532-2-630 genehmigt.

Die DBA/1J-Maus wurde ausgewählt, da sie eine fast 100%ige Inzidenz von Arthritis beim Modell der collageninduzierten Arthritis (CIA) hat und somit eine gute Vergleichbarkeit zwischen den Gruppen innerhalb einer Versuchspopulati- on gewährleistet (Janvier Labs, 2017).

Die CIA ist die meistverwendete Methodik eines RA-Mausmodells und wurde entsprechend des Nature Protokolls von Brand durchgeführt. An Tag 0 erfolgte die Immunisierung mit Collagenlösung aller Mäuse einer Studienpopulation und an Tag 21 der Boost. Anders als im Protokoll beschrieben, wurde die Emulsion subdermal oberhalb des Schwanzansatzes appliziert. Jede Maus erhielt an diesen Tagen eine Injektion von 100 µl mit 0,25 mg Chicken Collagen II in komplet- tem Freund´s adjuvant. (Brand et al., 2007)

Dabei wurde Chicken Collagen II von Sigma Aldrich, USA, (Bestellnummer: C- 9301), incomplete Freund´s adjuvant von Sigma Aldrich, USA, (B.-Nr.: F5506) und zur Herstellung des kompletten Freund´s adjuvant das gefriergetrocknete Mykobakterium tuberculosis (HR37a) von BD Biosciences, USA, (B.-Nr.: 231141) verwendet.

Die Mäuse wurden nach dem Boost dreimal pro Woche gewogen und nach dem Scoring-Prinzip des Nature Protokolls in einem Score von 0-4 (siehe Ta- belle 1) bewertet (Brand et al., 2007). Dabei wurde jede Pfote sowohl auf

- 20 - Schwellung und Rötung als auch auf Griffkraftverlust kontrolliert. (Brand et al., 2007) Aus dem Mittelwert der Untersuchung aller vier Pfoten wurde der Ge- samtscore einer Maus gebildet.

Score Schwellung/Rötung Griffkraft 0 Normale Pfote Normaler Griff 1 Minimale Schwellung/Rötung Leicht reduzierter Griff 2 Schwellung Vorfuß/Rötung Deutlich eingeschränkter Griff 3 Schwellung/Rötung komplette Pfote Kaum Griffkraft vorhanden 4 Gelenkdeformitäten/Ankylosis Kein Griff mehr möglich Tabelle 1: Scoring-Tabelle nach Brand Im Rahmen dieser Arbeit sind zwei Formen von Experimenten durchgeführt worden. Jedes Experiment ging dabei über einen Zeitraum von 50 Tagen. Zu- erst wurde eine CIA-Verlaufsstudie an 35 Mäusen durchgeführt, wobei fünf gesunde Mäuse die Kontrollgruppe bildeten. Die erkrankten Mausgruppen mit je 5 Mäusen wurden an den Tagen 25, 30, 35, 40, 45 und 50 präpariert; die Kon- trollgruppe an Tag 27. Dieses Experiment wurde unabhängig von der ersten Verlaufsstudie ein zweites Mal durchgeführt.

Als zweites erfolgten Endzeitpunktstudien mit Behandlungsversuchen der CIA. Jede Gruppe bestand aus 5 Mäusen. Das je einmal durchgeführte ACEA- und α4ß7-Experiment hatte eine gemeinsame Kontrollgruppe. Das zweifach durch- geführte Larazotide-Experiment besaß eine eigenständige Kontrollgruppe. Bei den Endzeitpunktstudien wurde an allen Mäusen inklusive der Kontrollen eine CIA induziert.

Intraperitoneale (i. p.) Verabreichungen wurden unter sterilen Bedingungen ab- wechselnd in den rechten oder linken Unterbauch mit kleinlumigen Nadeln (G30) entsprechend der Richtlinien des Federation for Laboratory Animal Sci- ence Associations (FELASA) vorgenommen.

4.2 Materialgewinnung Nach der Mauseuthanasie wird der Darm präpariert. Dabei wird gemäß FELA-

SA-Richtlinien die Maus zunächst in eine tiefe CO2-Narkose bis hin zum Able- ben versetzt und anschließend sofort mittels Herzpunktion mit einer 20G Nadel

- 21 - und 1 ml Spritze das Blut entnommen. Dieses wird in einen Serumcontainer umgefüllt und bei 4.000 Umdrehungen pro Minute (rpm) für 180 Sekunden zentrifugiert. Das Serum wird danach für spätere Analysen bei -20°C gelagert.

Nach der Blutgewinnung wird der Bauchraum der Maus eröffnet und der Darm oberhalb des Pylorus vom Magen abgesetzt. Von dort wird der Darm von crani- al nach caudal behutsam vom Mesenterium gelöst und möglichst tief am Anus abgetrennt. Das restliche mesenteriale Gewebe wird entfernt und Dick- sowie Dünndarm vom Caecum abgesetzt. Anschließend wird der Darm von Kot gereinigt, indem dieser mit Phosphate buffered saline (PBS) von Gibco, USA, durch- gespült wird. Für die Längenmessung des Dick- bzw. Dünndarms wird der Darm zunächst in 4°C warmes PBS gelegt. Daraufhin wird er, um zusammen- gezogene Abschnitte zu entspannen, vorsichtig der Länge nach mit leichtem Zug auf einer glatten Oberfläche ausgelegt und vermessen.

Nach der erfolgten Messung wird der Darm für weitere Untersuchungsmetho- den präpariert. Hierfür wird je 1 cm Darm für eine Polymerasekettenreaktion (PCR) und 2 cm für eine Zellkultur von den Darmabschnitten Duodenum, Je- junum, Ileum und Colon benötigt. Für die Histologie werden dreimal 1 cm im Duodenum, Jejunum und Ileum und zweimal 1 cm im Colon entnommen, um möglichst viele Darmbereiche untersuchen zu können. Das übrige Gewebe wird für die Durchflusszytometrie (FACS) verwendet. Gewebe für die PCR wird mit Hilfe von Flüssigstickstoff schockgefroren, das restliche Material wird am Ver- suchstag direkt weiterverarbeitet. Bei Zwischenschritten lagert das Gewebe in 4°C warmen PBS.

- 22 - Abbildung 1: Dargestellt ist der Darm, abgesetzt vom Magen, Caecum und Anus. Das abgebildete Lineal dienst zur Längenmessung. Die Aufteilung für die verschiedenen Methodiken sind wie folgt bezeichnet: Histo = Histologie, Tissue culture = Zellkultur, FACS = Durchflusszytometrie, PCR = Polymera- sekettenreaktion, rote Makierungen = Abtrennung der Abschnitte, schwarze Makierungen = Trennstellen.

Die Abbildung 1 stellt diese Aufteilung noch einmal am Beispiel eines entnom- menen Darms dar.

4.3 Durchflusszytometrie (FACS) Bei dem verwendetem Durchflusszytometer handelt es sich um ein Cytoflex S von Beckman Coulter, USA, mit vier Lasern mit den Wellenlängen 405 nm, 488 nm, 561 nm und 638 nm. Das Zytometer hat 13 Fluoreszenzdetektoren, sodass theoretisch bis zu 13 verschiedene Farbstoffe analysiert werden können. Durch die Möglichkeit eine 96-Kammerplatte einzulegen, ist das Zytometer geeignet viele Proben auf in einem Untersuchungsgang zu analysieren.

Damit die einzelnen Zellen des Darms analysiert werden können, müssen die Zellen zunächst separiert werden. Dazu wird der von Fettgewebe und Kot be- reinigte Darm aufgeschnitten und in 1 cm große Stücke aufgetrennt. Im nächs- ten Schritt wird mit einer 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure-Lösung (EDTA von Roth, Deutschland, in PBS gelöst) für 15 Minuten bei 37°C die Stabilität der extrazellulären Matrix sowie der Epithelschicht gelöst. Dabei löst sich ebenfalls der Mukus der Darmoberfläche und kann entfernt werden. Nach einer mechanischen Zerkleinerung werden die Zellen mit Hilfe eines Verdauungsmediums – 20 ml RMPI 1640 von Gibco, USA,, 2,0 ml fetalem Kälberserum (FCS) von Gibco, USA, und 20 mg Kollagenase von Sigma Aldrich, USA, (B.-Nr.: C5138)

- 23 - pro Probe – aus ihrem Zellverbund gelöst. Die Kollagenase schneidet bei 37°C über 35 min die Kollagenverbindungen zwischen den Zellen auf, sodass einzel- ne Zellen vorliegen. Um Darmzellen und zusammenhängende Zellen herauszu- filtern, wird die Zellsuspension durch einem 70 µm Filter gegeben. Mit Hilfe einer Zählkammer und Trypanblau wird die Anzahl der lebenden Zellen gezählt und ermittelt wie viel Zellsuspension benötigt wird, um 250.000 Zellen in einer Kammer zu erhalten. Trypanblau färbt dabei das Zytoplasma toter Zellen blau, lebende Zellen haben hingegen ein helles Zytoplasma und sind da durch gut sichtbar (Strober, 2015). Obwohl durch den 70 µm Filter gewährleistet werden soll, dass nur Immunzellen in der Suspension vorhanden sind, muss davon ausgegangen werden, dass nach wie vor eine gewisse Anzahl an Darmepithel- zellen sowie Fibroblasten der extrazellulären Matrix vorhanden sind.

Um die verschiedenen Immunzellen zu identifizieren und zu quantifizieren, werden jeweils 250.000 Zellen pro Dünndarm und Colon pro Färbung plus unge- färbte Kontrolle in eine 96-Kammerplatte transferiert und anschließend mit Anti- körpern identifiziert. Verwendet wurden monoklonale, mit Fluoreszenzfarbstof- fen konjugierte, primäre Antikörper. Dabei werden sowohl extrazelluläre Anti- körper, die an Oberflächenantigene binden, als auch intrazelluläre, welche an Antigene innerhalb der Zelle binden, verwendet. Die einzelnen Antikörper und die Zusammensetzungen der Färbungen werden im Verlauf erläutert. Reini- gungsschritte sowie die Verdünnung der Antikörper erfolgen mit einem FACS- Puffer. Dieser besteht aus PBS, in welchem EDTA von Roth, Deutschland, zu einer 0,5 mM Konzentration hinzugefügt wird, um eine Zellverklumpung zu verhindern, sowie Rinderserumalbumin (BSA) von Sigma Aldrich, USA, (B.-Nr.: A7030) zu einer 0,5% Konzentration. BSA verhindert dabei unspezifische Anti- körperbindungen. Um eine größtmögliche Farbstabilität und Zellqualität zu ge- währleisten, wird auf Eis gearbeitet und die Lichteinstrahlung minimiert. Zur Ent- fernung von Überständen werden die 96-Kammerplatten bis zum Beginn der Permeabilisierung in der Zentrifuge 5810R von Eppendorf, Deutschland, bei 2000 rpm für 2 min bei 4°C zentrifugiert und nach Hinzufügen des neuen Puf- fers wieder resuspendiert. Live/Dead-Staining (L/D) werden bei 4°C 10 min inkubiert, extrazelluläre Färbungen bei 4°C 30 min und die intrazellulären Farb-

- 24 - stoffe bei 4°C über Nacht. Die Antikörper werden in 50 µl FACS-Puffer bzw. Permeabilitätspuffer pro Probe verdünnt. Zwischen den Färbeschritten erfolgt eine Waschung mit 100µl FACS-Puffer. Damit die Antikörper, die intrazellulär binden sollen, in die Zelle gelangen, muss die Zellmembran nach einer 45 min Fixation bei Raumtemperatur mit einem 1x Permeabilitätspuffer (1:10 mit vollentionisiertem Wasser) durchlässig gemacht werden. Dazu werden Fixa- tions- und 10x Permeabilitätspuffer von eBioscience, USA, (B.-Nr.: 88-8824-00) verwendet. Nach der Permeabilisierung werden die Zellen 5 min bei 600 rpm zentrifugiert, um der erhöhten Anfälligkeit der Zellen gegenüber mechanischer Belastung Rechnung zu tragen. Vor und nach der Färbung werden die Zellen mit Permeabilitätspuffer zweimal gewaschen. Bis zur zeitnahen Analyse im Zy- tometer werden die Zellen im FACS-Puffer gelagert. Die Analyse erfolgt spätes- tens zwei Stunden nach Beendigung des Protokolls.

Die Auswertung der gemessenen Daten wird mit der FACS-Auswertesoftware Kaluza Analysis Version 2.1 von Beckman Coulter, USA, durchgeführt. Mit Hilfe dieser Software lassen sich absolute und relative Zahlen messen. Relative Zah- len lassen sich dabei auf unterschiedliche Parameter beziehen, z. B. als Anteil der lebenden Zellen.

Die Vermessung der Zellen wird über ein Vorwärtsstreulicht (FSC), welches das Zellvolumen misst, und ein Seitwärtsstreulicht (SSC), das die Granularität und Größe der Zelle misst, durchgeführt. Die mit einem spezifischen fluoreszieren- den Farbstoff markierten Antikörper werden mit den farbigen Lasern aktiviert und mit Hilfe einer Messdiode wird das emittierte Licht dieser Farbstoffe aufge- fangen und gemessen. Jeder der verwendeten Farbstoffe hat eine spezifische Wellenlänge, bei der er aktiviert wird und wiederum eine bekannte Wellenlänge an Licht emittiert. Angepasst an die bereits aufgezählten Laser und den 13 vorhandenen Messkanälen, sind Färbungen entwickelt worden. Dabei wird jeder mit einem Farbstoff konjugierte Antikörper von einem Kanal gemessen. Der Fluorescence spectrum viewer von BD Sciences, USA, ist ein Tool, das Fluo- reszenzüberschneidungen in Messkanälen visualisiert und damit hilft, messbare Färbungen zu erstellen.

- 25 - Die verwendeten Verdünnungen wurden im Vorfeld mittels Verdünnungsreihen an Darmzellen ermittelt. Dazu wird gemessen, ab welcher Konzentration eine eindeutige Entscheidung zwischen negativ und positiv für den jeweiligen Anti- körper, durch zwei unterschiedliche Fluoreszenzmaxima, gemacht werden kann. Das niedrigere Fluoreszenzmaximum entspricht dabei der natürlichen Fluoreszenzintensität der Darmzellen.

Eine eindeutige Identifizierung von Zellen ist nur dann möglich, wenn diese Zel- len einzeln von den Lasern detektiert werden. Dies wird zum einen dadurch gewährleistet, dass die Durchflussrate durch das Zytometer innerhalb der vom Hersteller angegeben Zellkonzentration liegt. Zum anderen werden zusammen- hängende Zellen oder Zelltrümmer aus der Analyse aussortiert. Dazu wird jede Zelle über die FSC und SSC vermessen. Zellen, die außerhalb der erwarteten Größe liegen, werden aussortiert. Hierbei handelt es sich in der Regel um Zell- trümmer, beschädigte bzw. tote oder zusammenhängende Zellen.

Um lebende von toten Zellen zu unterscheiden, wurde vor jeder Färbung ein Live/Dead-Staining mit dem KromeOrange-Farbstoff von Invitrogen, USA, (B.- Nr.: L34966) in der Verdünnung 1:400 gemacht. Dabei werden tote Zellen stark positiv für KromeOrange. Dadurch, dass die Zellmembran durch Absterben ihre Barrierefunktion verliert, wird sie durchlässig für das L/D. Dieses reagiert unspezifisch mit Proteinen. Da bei lebenden Zellen lediglich Oberflächenantigene markiert werden und entsprechend bei toten Zellen ebenfalls die intrazellulären Proteine, sind tote Zellen deutlich intensiver eingefärbt. Daher wird der stark positive Anteil der Zellen von der weiteren Analyse ausgeschlossen. (ThermoFisher Invitrogen, 2018)

Die Antikörperschema F1 und F2 dienen dazu T- und B- Zellen zu identifizieren. In Tabelle 2 (S. 27) und Tabelle 3 (S. 28) sind die verwendeten Antikörper mit Antigen, Farbstoff, Verdünnung sowie Vertreiber mit Katalognummer aufgelis- tet. Das Farbschema F2 ist erst ab dem zweiten Durchlauf der CIA- Verlaufsstudie verwendet worden. Intrazelluläre Antikörper binden an Proteine, v. a. Transkriptionsfaktoren, im Inneren der Zelle, während extrazelluläre an Oberflächenmoleküle binden.

- 26 - Farbschema F1 Ziel Farbe Verdünnung Vertrieb B.-Nr. BioLegend, CD3 Alexa Fluor 647 1:600 100209 USA BioLegend, CD4 PE-Cy7 1:400 100422 USA BioLegend, CD8a Alexa Fluor 700 1:600 100730 USA BioLegend, B220/CD45R FITC 1:800 103206 USA RoRγT intrazel- PE 1:100 BD, USA 562607 luär BioLegend, T-bet Intrazelluär Pacific Blue 1:100 644808 USA Tabelle 2: Verwendete Antikörper im Farbschema F1 Das Farbschema der Tabelle 2 dient der Unterscheidung von T- und B-Zellen. Nachdem die Zellen, wie vorher beschrieben, auf die einzelnen, lebenden Zel- len reduziert worden sind, werden zunächst die beiden Antigene B220/CD45R und CD3 betrachtet. Zellen, die B220/CD45R positiv sind, gelten als B-Zellen (B220+). Dabei sind alle Stadien der B-Zellen für diesen Marker positiv (Coffman et al., 1981). CD3 ist ein Positivmarker für T-Zellen (CD3+). Im nächs- ten Schritt werden die T-Zellen mit Hilfe der Positivmarker CD8a für zytotoxische T-Zellen (CD8+) und CD4 für T-Helferzellen (CD4+) in die genannten Subpopulationen eingeteilt (Gill et al., 2003; Takahama, 2006). Die beiden int- razellulären Antikörper gegen die Antigene T-bet und RoRγT dienen zur Unter- scheidung von Typ 1 T-Helferzellen (Th1) und Interleukin-17 produzierenden T- Helferzellen (Th17). T-bet ist ein Transkriptionsfaktor der Th1, während RoRγT bei den Th17 als Transkriptionsfaktor eine entscheidende Rolle spielt. (Afkarian et al., 2002; X. O. Yang et al., 2008)

Das Farbschema F2 (Tabelle 3, S. 28) dient ebenfalls zur Identifizierung von T- Helferzellsubpopulationen. Die CD4 positiven Zellen werden in Typ 2 Helferzel- len (Th2) mit dem intrazellulären Antikörper gegen den Transkriptionsfaktor GATA3 und regulatorische T-Helferzellen (Treg) mit dem intrazellulären Anti- körper gegen den Transkriptionsfaktor FoxP3 eingeteilt (Kaplan et al., 1996; Li et al., 2007).

- 27 - Farbschema F2 Ziel Farbe Verdünnung Vertrieb B.-Nr. BioLegend, CD4 PE-Cy7 1:400 100422 USA Alexa Fluor BioLegend, FoxP3 intrazellulär 1:100 126408 647 USA BioLegend, GATA3 intrazellu- PE 1:100 653804 lär USA Tabelle 3: Verwendete Antikörper im Farbschema F2

4.4 Darmhistologie Zur histologischen Untersuchung wird der Darm in die Segmente Duodenum, Jejunum, Ileum und Colon eingeteilt. Zur Präparation werden jeweils 1 cm lange Abschnitte von Anfang, Mitte und Ende jedes Segments sorgfältig mit PBS von Kot gereinigt und mit 4% Formaldehydlösung von Roth, Deutschland, über Nacht bei 4°C fixiert. Beim Colon werden lediglich Anfang und Ende verwendet. Anschließend erfolgt eine Reinigung unter fließendem Wasser und eine Lage- rung bis zur weiteren Verarbeitung durch das Personal des Histologielabors in 70% Alkohol von Roth, Deutschland.

Nach histologischer Aufbereitung werden dort die Darmstücke in aufrechter Po- sition in Paraffin gebettet, um Querschnitte aller drei bzw. zwei Darmsegmente in einem Schnitt zu erhalten. Die Schnittdicke beträgt 4 µm. Anschließend werden die Proben mit der Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HE) bzw. das Colon wird zusätzlich in einer Periodic acid-Schiff-Reaktion (PAS) behandelt. Das Histolo- gielabor stellt daraufhin die gefärbten Proben zur Analyse bereit.

Die HE färbt Zellkerne bläulich und Zytoplasmaproteine rötlich. Somit bietet die HE einen guten Überblick über die Struktur des Darms. Durchgeführt wurden Breiten- und Längenmessungen pro Schnitt von drei komplett erhaltenen Zotten bzw. Krypten, allerdings hat bei einigen Schnitten die Zottenqualität diese Mes- sungen nicht zugelassen. Da das Colon keine Zotten hat, entfällt hier diese Messung. Anschließend werden für jeden Schnitt die Mittelwerte errechnet.

Da die PAS die vermehrt in Becherzellen vorkommenden Kohlenhydrate an- färbt, dient sie zur Zählung der Becherzellen (Osho et al., 2017). Dabei werden

- 28 - pro Schnitt die Becherzellen von drei Krypten beider Querschnitte gezählt und anschließend aus diesen sechs Werten ein Mittelwert erstellt.

Für die Messungen bzw. Zählungen wurden mit einem Olympus CX21LED Lichtmikroskop in der Vergrößerung 10x und der zugehörigen Olympus U- CMAD3 Kamera Bilder gemacht und diese mit der Olympus LCmirco Software ausgewertet (Olympus, Japan). Die Proben sind dabei randomisiert worden, um eine objektive Auszählung und Messung zu gewährleisten.

4.5 Immunofluoreszenzhistologie für Neutrophile Um eine Immunofluoreszenz des Colons durchzuführen, müssen zunächst die ungefärbten Paraffinschnitte mit zwei Schnitten pro Objektträger entparaffiniert werden. Dazu werden die Objektträger, nach Aufweichung des Wachses durch 35 min Erwärmung bei 60°C, dreimal für 5 min in Xylollösung von Roth, Deutschland, getaucht. Anschließend werden die Proben in Isopropanollösun- gen von Roth, Deutschland, mit absteigender Konzentration (100%, 90% und 70%) jeweils 3 min eingetaucht. Zwischen den Schritten wird der Objektträger mit vollentionisiertem Wasser (ddH20) abgespült.

Um die Epitope darstellen zu können, muss bei diesen die Bindefähigkeit für Antikörper mit der Epitope Retrieval Solution (ERS) von Invitrogen, USA, (B.-

Nr.: 00-4956-58), 1:20 in ddH20, wiederhergestellt werden. Die auf einer 90°C warmen Platte liegenden Objektträger werden dann viermal mit je 100 µl ange- wärmter ERS benetzt, sodass die Proben immer befeuchtet sind. Nach diesen vier Durchgängen werden die Proben für weitere 20 min mit ddH20 feucht gehalten. Anschließend werden die Objektträger von der Platte genommen und kühlen bei Raumtemperatur ab. Daraufhin werden die Proben zweimal 2 min in ddH20 und anschließend einmal 5 min in PBS getaucht.

Zur Sättigung von freien, unspezifischen Proteinbindungsstellen wird die Probe mit einem Blockpuffer, bestehend aus 0,1% Saponin und 1% BSA in PBS, überzogen und für zwei Stunden bei Raumtemperatur in einer Feuchtigkeits- kammer inkubiert. Es wurde PBS von Gibco, USA, verwendet, sowie Saponin

- 29 - von Sigma Aldrich, USA, (B.-Nr.: 47036) und BSA von Sigma Aldrich, USA, (B.- Nr.: A7030). Im Anschluss wird die Probe mit PBS abgespült.

Für anschließende Verdünnungen der Antikörper wurde ein Färbepuffer mit 0,1% Saponin und 0,2% BSA in PBS verwendet.

Zur Darstellung von Neutrophilen in der Immunofluoreszenz wurde ein Kanin- chen-Antikörper gegen die Neutrophilenelastase von abcam, Großbritannien, (B.-Nr.: ab21595) verwendet. Die Neutrophilenelastase ist ein spezifischer Mar- ker der Neutrophilen (Gen: Elane, Ensembl-ID: ENSMUSG00000020125).

Der Antikörper gegen die Elastase wurde 1:200 im Färbepuffer verdünnt und anschließend 100 µl auf einen Schnitt der Probe aufgetragen. Als Negativkon- trolle ist der andere Schnitt mit dem Färbepuffer ohne Antikörper benetzt worden. Die Inkubation erfolgt in einer Feuchtigkeitskammer über Nacht bei 4°C.

Zur Detektion des primären Kaninchen-Antikörper wurde ein sekundärer Zie- gen-Antikörper gegen Kaninchen genutzt, der mit dem roten Farbstoff Cyanin5 (Cy5) konjugiert ist. Der Antikörper von abcam, Großbritannien, (B.-Nr.: ab97077) emittiert im rotem Farbspektrum (670 nm) (Ernst et al., 1989).

Als Hintergrundfärbung wurde ein Hoechstfarbstoff von EMP Biotech GmbH, Deutschland, (B.-Nr.: F-0411) verwendet. Hoechst ist ein fluoreszierender Farb- stoff, der an DNA bindet und bei Anregung Licht im blauen Farbspektrum (Ma- ximum bei 465 nm) emittiert (Latt et al., 1975). Daher färbt er alle Zellkerne an.

Der sekundäre Antikörper wird 1:400 gemeinsam mit dem Hoechstfarbstoff, 1:5000, im Färbepuffer verdünnt. Es werden 100 µl pro Schnitt aufgetragen und dann in einer Feuchtigkeitskammer für 90 min bei 4°C inkubiert. Anschließend werden die Proben nach der Reinigung mit ddH20 mit 3-4 Tropfen des Fluoros- hield Mounting Medium von abcam, Großbritannien, (B.-Nr.: ab104135) benetzt. Dieses Medium schützt die Farbstoffe vor dem Ausbleichen durch Licht.

Die Objektträger werden auf Eis in der Feuchtigkeitskammer lichtgeschützt bis zur Analyse am selben Tag aufbewahrt. Für die Analyse wurde ein Fluores- zenzmikroskop Leica DM2000, Deutschland, mit einer Leica DFC320 Kamera, Deutschland genutzt und anschließend auf den Fotos ausgewertet. Für jede

- 30 - Probe wurde mit der Negativfärbung die erfolgreiche Färbung überprüft. Nach- dem jeweils von der Hintergrundfärbung und der Antikörperfärbung Bilder gemacht wurden, sind diese im Programm übereinandergelegt worden. Anschlie- ßend wurde die relative Menge an Neutrophilen zwischen den Versuchstagen verglichen, um einen Eindruck von der Neutrophileninfiltration in den Darm wäh- rend der Verlaufsstudie zu gewinnen.

4.6 In vivo Permeabilitätsmessung Zur in vivo Permeabilitätsmessung des Darms ist FITC-Dextran 4kDa von Sig- ma Aldrich, USA, (B.-Nr.: FD4) verwendet worden. Dabei handelt es sich um einen mit FITC konjugierten, unverdaulichen Zucker mit einem 4.000 Dalton Molekulargewicht, der aufgrund seiner Größe parazellulär, abhängig von der Permeabilität der parazellulären Strukturen des Darms ins Blut gelangt. Das beschriebene Verfahren gilt als valides zur Messung von intestinaler Permeabi- lität (Volynets et al., 2016).

Vier Stunden vor Beginn der Präparation erhalten die Mäuse 44 mg/100 g Kör- pergewicht FITC-Dextran oral mit Hilfe einer Schlundsonde. Das FITC-Dextran wird zuvor in PBS zu einer Konzentration von 100 mg/ml gelöst. Flüssigkeit und Nahrung werden während dieses vier Stunden Zeitintervalls entfernt, um eine Verfälschung der Ergebnisse durch Flüssigkeits- bzw. Nahrungsaufnahme zu verhindern.

Nach der in Kapitel 4.2. beschriebenen Gewinnung des Serums werden 50 µl des Serums mit 50 µl PBS verdünnt und mit Hilfe des in Kapitel 4.3. vorgestell- ten Zytometers analysiert. Die mittlere Fluoreszenzintensität im FITC-Kanal der jeweiligen Proben wird miteinander verglichen, sodass man die relative Perme- abilität messen kann.

- 31 - 4.7 Zellkultur Um die Produktion von Zytokinen im Darm messbar zu machen, sind von den jeweiligen Darmabschnitten Duodenum, Jejunum, Ileum und Colon ein jeweils 2 cm langes Stück in eine Zellkultur überführt worden.

Dazu sind die 2 cm langen Stücke der Länge nach aufgeschnitten und in PBS gereinigt worden, um jegliche Kotrückstände zu entfernen. Anschließend wurden die Abschnitte in kleine Stücke zerschnitten, damit die Zellen gleichmäßig an das Zellmedium RPMI 1640 von Gibco, USA, mit 10% FCS von Gibco, USA, und 1% Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml (PS) von Gibco, USA, kommen. Jede Probe wird in einer eigenen Kammer einer 48-Kammerplatte mit 500 µl des Mediums versetzt und dann bei 37°C, 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit in einem keimfreiem Zellkulturschrank inkubiert.

24 Stunden später wird die Platte bei 1500 rpm und 4°C für 5 min zentrifugiert, der Überstand abgenommen und für spätere Analysen bei -20°C eingefroren.

4.8 LEGENDplex™ LEGENDplex™ der Firma BioLegend, USA, ist ein Analysetool, dass es ermög- licht mehrere lösliche Analysate simultan mit Hilfe eines Durchflusszytometers (vgl. Kapitel 4.3.) zu analysieren. In der Tabelle 4 sind die verwendeten Produk- te der LEGENDplex™ Produktpalette aufgeführt.

Produkt Bestellnummer Bei diesem Tool gibt es Beads, Standard 740371 die eine definierte Größe und Dectection Antibodies 740165 Buffer Set 740373 Farbintensität für APC (Allo- IFN-γ Bead 740153 phycocyanin) haben und mit einer TNFα Bead 740154 IL-17A Bead 740161 spezifischen Bindungskapazität IL-1β Bead 740157 für das gewählte, zu analysieren- IL-6 Bead 740159 Tabelle 4: Verwendete Produkte des de Molekül lieferbar sind. Jeder LEGENDplex™ spezifische Bead ist dadurch eindeutig in der Analyse auffindbar. Die Beads werden daher in einem Bead-Mix zusammen auf die Probe gegeben.

- 32 - 10000

y = 0,0289x0,9374 1000 R² = 0,9963

Abbildung 2: Standardkurve 100 am Beispiel IL-6. Y ist eine logarithmische Kurve, errechnet durch die gemessenen Punkte. R2 steht für 10 die Genauigkeit (R2 = 1, entspräche 100%). Die X- Achse ist die mittlere Far- 1 bintensität und Y-Achse die 1 100 10000 1000000 Konzentration in pg/ml.

Das gebundene Molekül wird entsprechend einem Sandwich-Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) zunächst mit einem primären, biotingelabelten Detektionsantikörper und einem sekundären, PE-gelabelten Strepavidinantikör- per (Phycoerythrin) mit einem Farbstoff markiert.

Der verwendete Bead-Mix und die Antikörpermischungen sind noch 1:15 mit dem mitgelieferten Versuchspuffer zu verdünnen. Im ersten Schritt werden 25 µl des Bead-Mix, 25 µl des Versuchspuffers, 25 µl des Detektionsantikörper und 25 µl des Überstands der Zellkultur, bzw. des Serums, in eine 96-Kammerplatte gegeben, mit Aluminiumfolie vor Licht geschützt und für zwei Stunden auf einem Taumelschüttler bei 100 rpm und Raumtemperatur inkubiert. Nach Hinzu- gabe von 25 µl des sekundären Antikörpers wird die Platte erneut für 30 min auf den Taumelschüttler gegeben. Anschließend wird die Platte bei 1.200 rpm für 5 min zentrifugiert und der Überstand durch Überkippen entfernt. Danach werden die Proben mit 100 µl des mit ddH20 1:20 verdünntem Waschpuffer des Kits resuspendiert und im Zytometer analysiert.

Je mehr Moleküle eines Stoffes an einem Bead gebunden sind, desto mehr PE- Farbstoffe binden sich sekundär an diesen und desto größer ist folglich die Far- bintensität für PE. Mit der Kaluza Analysis Software kann die mittlere Intensität für jede Probe und jeden Bead einfach ermittelt werden. Über, wie in Abbildung 2 dargestellt, errechnete Standardkurven kann die mittlere Intensität in eine Konzentration in pg/ml übersetzt werden. Dazu wird eine Verdünnungsreihe mit bekannten Konzentrationen benutzt. Der auf die Konzentrationen verdünnte

- 33 - Standard wird anstatt des Überstandes im Protokoll verwendet. Alle Standard- kurven weisen dabei eine Genauigkeit von r2>0,97 auf. Zusätzlich werden zwei Leerproben mit doppeltem Versuchspuffer gemessen, um Verunreinigungen und Fehlintensitäten auszuschließen.

Im LEGENDplex™ sind sowohl die Serumproben als auch die Zellkulturüber- stände auf die inflammatorischen Zytokine IFN-γ, TNFα, IL-17A, Interleukin-1β (IL-1β) und IL-6 untersucht worden. Konzentrationen, die außerhalb des Mess- bereiches, welcher durch die Standardmessung minus die Leerkontrolle definiert wird, liegen, werden als 0 pg/ml gewertet; Werte, die oberhalb der Mess- grenze liegen, werden herausgenommen. Der Messbereich für die einzelnen Zytokine wird in der Tabelle 5 gezeigt.

Untere Messgrenze Obere Messgrenze IFN-γ 9,8 pg/ml 2.500 pg/ml TNFα 2,4 pg/ml 2.500 pg/ml IL-17A 2,4 pg/ml 2.500 pg/ml IL-1β 9,8 pg/ml 2.500 pg/ml IL-6 2,4 pg/ml 2.500 pg/ml Tabelle 5: Messbereiche für die Zytokine im LEGENDplexTM

4.9 qRT-PCR Eine quantitative Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT- PCR) wird angewendet, um die Genexpression, von durch Primer definierten Genen, in Zellen quantitativ zu messen. Dabei wird die bei der Transkription entstehende Boten-Ribonukleinsäure (mRNA) genutzt, mit welcher Ribosomen Proteine herstellen können (Wilson et al., 2012). Vereinfacht ausgedrückt: Je mehr Proteine eines Types benötigt werden, desto mehr mRNA dieses Genes wird produziert, gesteuert von vielen Prozessen innerhalb der Zelle (Washburn et al., 2015). Damit dies möglich ist, muss die mRNA in komplementäre Des- oxyribonukleinsäure (cDNA) übersetzt und restliche DNA entfernt werden, da eine PCR DNA vervielfältigt. Für die Übersetzung wird die Reverse Transkripta- se von Retroviren genutzt (Spiegelman et al., 1971). Die cDNA wird dann mittels einer PCR vermehrt und die Vermehrung quantitativ über Fluoreszenzmar- kierung ermittelt. Anschließend wird die Vermehrung auf ein Referenzgen, von

- 34 - welchem bekannt ist, dass es in großer Menge produziert wird, bezogen und damit die relative Expression ermittelt (Bachman, 2013; Nolan et al., 2006). Im Folgenden werden die Schritte zur Durchführung einer qRT-PCR erläutert und im Anschluss werden die untersuchten Gene vorgestellt.

Im ersten Schritt muss aus den Darmproben die RNA isoliert werden. Um Ver- unreinigungen zu verhindern, werden gestopfte, DNA/RNA-freie Pipettenspitzen verwendet. Die auf -20°C gelagerten Darmproben tauen auf Eis auf, werden anschließend der Länge nach aufgeschnitten und in 4°C warmen PBS sorgfältig vom Stuhl und Mucos befreit. Die sorgfältige Reinigung ist essentiell, da sonst die Gefahr der Verunreinigung durch bakterielle DNA/RNA besteht. Anschlie- ßend ist der Darm in Precelly Tubes Ceramics von Bertin Technologies, Frank- reich (B.-Nr.: P000912-LYSK0), zusammen mit 1.000 µl Trizol von VWR Life Science, USA (B.-Nr.: 30-2010), überführt worden. Die Keramikkügelchen zer- kleinern dabei im Homogenizer precellys 24 von Bertin Technologies, Frank- reich, mit den Einstellungen einmal 15 Sekunden bei 6.600 rpm das Gewebe, sodass man das Gewebe nicht mehr makroskopisch erkennt. Die homogene Flüssigkeit wird in ein neues 2 ml Mikroreaktionsbehältnis (Eppi) gefüllt und an- schließend wird 200 µl Chloroform von Roth, Deutschland, hinzugegeben. Nach 30 Sekunden Durchmischen mit langsam schüttelnden Bewegungen und 3 min Inkubation bei Raumtemperatur, wird das Gemisch durch eine 15 min Zentrifu- gation bei 12.400 rpm und 4°C in zwei Schichten aufgetrennt. Die verwendete Zentrifuge ist eine Mikro 200R von Hettich Zentrifugen, Deutschland, und wird auch bei allen folgenden Zentrifugationsschritten verwendet. Die klare obere Schicht wurde in ein neues Eppi überführt und 500 µl Isopropanol von Roth, Deutschland, hinzugegeben. Durch 30 sek langsames Schütteln wird der Inhalt durchmischt und dann bei Raumtemperatur 3 min inkubiert. Nach der Zentrifu- gation (15 min, 12.400 rpm, 4°C) wird der Überstand komplett abgekippt und die verbleibende Flüssigkeit hat 5 min Zeit bei Raumtemperatur zu verdunsten. Nach der Resuspension zur Reinigung mit 1.000 µl 70% Ethanol von Roth, Deutschland, wird erneut 10 min bei 12.400 rpm und 4°C zentrifugiert und an- schließend nach Abschütten des Überstandes das Pellet für 45 min bei Raum- temperatur getrocknet.

- 35 - Bis zu diesem Schritt muss unter einer Abzugshaube gearbeitet werden, da es sich bei Trizol und Chloroform um flüchtige, potentiell kanzerogene Stoffe handelt. Alle verwendeten Schadstoffe sind sachgerecht im Sondermüll zu entsor- gen.

Das Pellet wird in 100 µl Nuclease-freiem Wasser von Qiagen, Niederlande (B.- Nr.: 129114), gelöst und für 10 min bei 55°C in einem Wärmeschüttler Mixing Block MB-102 für Eppis von BIOER, Japan, erhitzt. Anschließend wird die RNA- Konzentration in ng/µl mit einem Nanodrop 2000 von Thermo Scientific, USA, gemessen. Die RNA-Konzentration lag bei den Proben zwischen 750-2.500 ng/µl; Proben außerhalb dieses Bereichs wurden nicht verwendet. Zusätzlich wurden nur Proben weiterverarbeitet, die eine Absorptionsratio 250/280 nm zwischen 1,8-2,1 und 250/230nm von über 1,75 haben. Beides sind Ratios, die die Reinheit der Proben messen. (Desjardins et al., 2010)

Von den ausgewählten Proben werden 1.000 ng RNA entnommen und mit Nu- clease-freiem Wasser in 0,1 ml Eppis verdünnt, um auf eine Endkonzentration von 1000 ng/8 µl zu kommen. Im Folgenden wird ein Vortexer Vornado von Benchmark, USA, und eine Minizentrifuge Sprout von Biozym Scientific, Deutschland, verwendet. Es wird jeder Probe 2 µl eines 1:1 Gemisches aus DNAse I von Invitrogen, USA (B.-Nr.: 18068015), und Reaktionspuffer mit

MgCl2 von Applied Biosystems, USA (B.-Nr.: N8080130), hinzugefügt und nach kurzem Vortexen und Zentrifugieren die Eppis bei 37°C für 30 min inkubiert. Anschließend wird 1 µl 50 mM EDTA von Invitrogen, USA (B.-Nr.: AM9260G), hinzugegeben, gevortext, zentrifugiert und das Gemisch bei 65°C für 10 min inkubiert. Diese Schritte dienen dem Entfernen von DNA aus den Proben. Die DNAse schneidet dabei die DNA in sehr kurze Nukleotidabschnitte, sodass In- teraktionen in den folgenden Schritten vermieden werden (Sollner-Webb et al., 1978).

Nachdem die Probe von DNA gereinigt wurde, wird mit der Synthese der cDNA fortgesetzt. Dazu wird erneut ein Mastermix (Tabelle 6, S. 37) hergestellt und von diesem 8 µl pro Probe hinzugegeben. Der Mastermix enthält alle benötigten Stoffe, um eine störungsfreie cDNA-Synthese zu gewährleisten. Als letztes wird

- 36 - 1 µl der RevertAid Reverse Transkriptase von Thermo Scientific, USA (B.-Nr.: EPO441), hinzugegeben. Nach kurzem Vortexen und Zentrifugieren wird im Mixing Block MB-102 von BIOER, Japan, das Programm zur cDNA-Synthese gestartet. In diesem wird der Eppi 10 min bei 25°C, 60 min bei 42°C und 10 min bei 70°C erhitzt. Die Konzentration der cDNA sollte anschließend bei 50 ng/µl liegen.

Menge/Probe Name Vertrieb B.-Nr.

1,0 µl Random Primer Invitrogen, USA 48190011

4,3 µl DEPC-treated water Thermo Scientific, USA R0601

2,0 µl 10x Reactionbuffer Applied Biosystems, USA N8080130 RiboLock RNase 0,5 µl Thermo Scientific, USA EO0381 Inhibitor (40 U/µl) 0,2 µl dNTP MIX 100 mM Thermo Scientific, USA RO191 Gesamt: 8 µl/Probe Tabelle 6: Zusammensetzung des Mastermix zur cDNA-Synthese für eine Probe In den bisherigen Schritten ist die Probe in cDNA übersetzt worden, sodass in den folgenden Schritten die eigentliche Vervielfältigung der gesuchten Oligo- nukleotide und deren quantitative Analyse mit Hilfe der PCR-Maschine Quant- Studio 6 Flex von applied biosystems, USA, erfolgt. Die Proben wurden im Fol- genden immer in zwei Kammern pro Primer in eine 384-Kammerplatte pipettiert. Wie vorher beschrieben enthält 1 µl 50 ng cDNA.

Dass alle Proben dieselbe Menge an cDNA aufweisen ist entscheidend, damit die Ergebnisse vergleichbar sind. Ebenfalls darf keine zu große oder kleine Menge cDNA verwendet werden, da bei der Messung die Steigungen der Amp- lifikationen der Proben – indirekt durch die Fluoreszenz gemessen – verglichen wird. Bei zu viel cDNA würden die Nukleotide in zu wenig Zyklen verbraucht werden, sodass die Schmelzkurve nach wenigen Zyklen bereits ihr Maximum erreicht hätte und somit keine sinnvollen Aussagen über die Konzentrationen gemacht werden könnten. Bei zu wenig cDNA würden entsprechend zu viele

- 37 - Zyklen gebraucht werden, um in den exponentiellen Steigungsbereich zu gelangen und es wäre keine valide Schmelzkurve messbar. (Bustin et al., 2004)

Um diese Anforderung zu erfüllen, werden 1 µl der cDNA Lösung, also 50 ng, pro Kammer verwendet. Diese werden mit 4,5 µl DEPC-treated Wasser – ein RNA, DNA, RNAse, DNAse freies Wasser – verdünnt. Jeder Kammer wird an- schließend der 6,5 µl Primermastermix hinzuzugegeben. Dieser besteht aus 0,25 µl forward Primerlösung 10 µM mM, 0,25 µl reverse Primerlösung 10 µM und 6 µl SYBgreen Mix von Applied Biosystems, USA (B.-Nr.: 4472908). SYBgreen bindet dabei unspezifisch an Doppelstrang-DNA und markiert damit alle entstandenen Produkte. Da pro Kammer nur ein Primerpaar vorhanden ist, wird nur das gesuchte Produkt markiert. (Ishiguro et al., 1995) Jede Kammer enthält nun eine Probe, ein Primerpaar und alle benötigten Reagenzien um die Analyse durchzuführen. Zusätzlich werden zwei Wasserleerproben gemessen. Vor der Analyse wird die Platte mit Folie abgedeckt und 2 min bei 4°C mit 1.200 rpm zentrifugiert.

Mit der QuantStudio Real-Time PCR Software v1.3 von applied biosystems, USA, werden die Einstellungen für den Durchlauf konfiguriert und anschließend die gemessenen Daten übertragen. Es handelt sich dabei um das Setup com- parative cycle threshold (CT) mit SYBRgreen inklusive Schmelzkurven. Es werden 40 Zyklen aus Denaturierung, Primer Hybridisierung und Polymerisation der DNA durchgeführt und gemessen.

Für die Analyse von Darm eignet sich GAPDH als Referenzprotein (Sirakov et al., 2013). Claudin und Occludin bilden die extrazellulären Strukturmoleküle der Tight Junction (Furuse et al., 1993; Tsukita et al., 1999). Claudin 2 ist ein im Darm häufig vorkommendes Claudin (Lameris et al., 2013). Die Peptidylargini- nedeiminasen 2 und 4 (PAD 2 und PAD 4) sind im entzündeten Gelenk von RA- Patienten vermehrt exprimiert und sind u. a. für die Zitrullinierung von Proteinen zuständig (Foulquier et al., 2007). Die Primersequenzen sind mit Hilfe des NCBI Primer BLAST erstellt und von Invitrogen, USA, synthetisiert worden und in der Tabelle 7 auf Seite 39 aufgeführt.

- 38 -

Oligonukleotid Forward 5´-> 3´ Reverse 5´-> 3´ GAPDH GGG TGT GAA CCA CGA GAA AT CCT TCC ACA ATG CCA AAG TT PAD 2 CCT CGA GAT GGA AAC CTG AA GGG TCAC ATA GCC GAA ATC T PAD 4 TGA CCA ATG GAT GCAG GAC CTC TGT CCC TCG GGG AGT Occludin CCT CCA ATG GCA AAG TGA AT CTC CCC ACC TGT CGT GTA GT Claudin 2 TAT GTT GGT GCC AGC ATT GT TCA TGC CCA CCA CAG AGA TA Tabelle 7: Primersequenzen für die verwendeten Primerpaare In der Auswertung der Daten wird zunächst die Leerprobe angeschaut, um nachzuweisen, dass ohne cDNA keine Amplifikation stattfindet. Dazu muss der CT undefiniert sein. Der CT-Wert gibt an, ab welchem Zyklus die Fluoreszenz eine vom Gerät definierte Intensität überschreitet. Je mehr Produkte vorhanden sind, desto höher ist die Intensität. Mit der ΔCT-Methode wird die relative Gen- expression bezogen auf das Referenzgen GAPDH errechnet. Die Formel zur Errechnung lautet aufgrund der exponentiellen Natur einer PCR ΔCT= 2^(CT[GAPDH]-CT[Gen]). Wichtig ist, dass für alle Proben ein eigener GAPDH-CT- Wert ermittelt wird, sodass man für jede Probe einen Referenzwert hat. Nur so sind die relativen Genexpressionen der einzelnen Proben miteinander vergleichbar.

4.10 Knochendichtemessung mit µCT Zur Knochendichtemessung wurde der Desktop Micro Computer Tomograph µCT 40 von SCANCO Medial AG, Schweiz, verwendet. Die Einstellungen sind nach Laborprotokoll durch die Fachkraft optimiert, um kalzifiziertes Knochen- gewebe darzustellen. Die Einstellungen sind 55k Vp und 155 µA über 200 ms mit 500 Projektionen pro 180°. Zur Visualisierung ist das Programm Open VMS von SCANCO Medial AG, Schweiz, verwendet worden. Damit lässt sich das Gewebe dreidimensional darstellen mit einer Voxelgröße von 8,4 µm. Dieses Programm berechnet zusätzlich Daten zur Trabekelstruktur und Knochendichte.

Beim untersuchten Gewebe handelt es sich, um die von Weichgewebe berei- nigte, Tibia. Dargestellt wurde die proximale Metaphyse 0,43 mm von der Wachstumsplatte bis 1,72 mm distal der Platte.

- 39 - 4.11. Osteomeasure Ein Osteomeasure ist ein Verfahren zur Analyse von verschiedenen Knochen- parametern in histologischen Schnitten. Analysiert werden die Tibia sowie die Pfoten der Mäuse.

Damit die Knochen histologisch aufgearbeitet werden können, werden zunächst Pfote und Tibia sorgfältig von Weichteilgewebe bereinigt und über Nacht mit 4% Formaldehydlösung von Roth, Deutschland, fixiert. Um den Knochen schneid- bar zu machen, muss dieser zunächst dekalzifiziert werden. Dazu wird der Knochen 14 Tage EDTA Dekalzifikation (177 g/l EDTA in 0,1 M Cacodylate) bei Raumtemperatur gelagert und anschließend in das Histologielabor gegeben. Aus diesem kommt der Knochen histologisch aufbereitet, in Paraffin gebettet, geschnitten (6 µm) und gefärbt zurück. Die Tibia wird so geschnitten, dass die Trabekelschicht komplett dargestellt ist. Der Schnitt der Pfote liegt auf Trab- ekelebene der Mittelhandknochen, sodass diese komplett unter einem Mikro- skop komplett sichtbar ist.

Zur Analyse werden Schnitte in HE und TRAP-Färbung benötigt. Die HE- Färbung ist bereits unter 4.4. vorgestellt worden. Sie dient der Analyse der Fib- rosierung des Gewebes und der Erosionsfläche des Knochens im Verhältnis zur Gesamtknochenmenge bzw. -oberfläche.

Die Tartrate-Resistant Acid Phosphatase-Färbung (TRAP) färbt diese für Oste- oklasten typische Phosphatase violett an, sodass die mehrkernigen Osteoklas- ten eindeutig im Gewebe identifizierbar sind (J. Yang et al., 2018). Die Zellkerne der Osteoklasten bleiben ungefärbt; sonstiges Gewebe bleibt ebenfalls blass. Mit dieser Färbung lassen sich Osteoklasten zählen und deren Knochenresorp- tionsfläche im Verhältnis zur Knochenoberfläche ermitteln.

Die Software Osteomeasure V4.1 von Osteometrics, USA, hilft dabei die von der Kamera DP72 von Olympus, Japan, auf dem Mikroskop AX10 von Carl Zeiss, Deutschland, aufgenommenen Bilder zu analysieren. Die Software misst dabei immer in Quadraten, welche einen definierten Maßstab über die angege- bene Vergrößerung erhalten. In diesen Quadraten wird manuell mit Hilfe eines Touchpads, entsprechend für jeden Parameter, die entsprechenden Merkmale

- 40 - markiert. Die Knochenflächen werden umrandet, sodass Knochenvolumen sowie -oberfläche ermittelt werden können. Die zum Knochen gerichtete Oberflä- che der Osteoklasten wird markiert und ins Verhältnis zur Knochenoberfläche gesetzt. Die Anzahl der Osteoklasten innerhalb dieser Felder wird ebenfalls bestimmt.

In der HE-Färbung werden fibrosierte Flächen umrandet und ins Verhältnis zum Knochenvolumen gesetzt. Erosionsflächen werden auf die Knochenoberfläche bezogen.

In der Tibia werden 5x2 Quadrate analysiert. Dabei sind distale und mediale Tibiakanten die Grenzflächen. Es wird die innere Oberfläche der medialen Kor- tikalis und vor allem die Trabekelschicht analysiert, dadurch kann die Software die Anzahl der Trabekel sowie deren Abstand berechnen.

Bei der Pfote werden die Handwurzelknochen auf die zuvor aufgeführten Para- meter analysiert. Die Analysegrenzlinien sind die Karpometakarpalgelenke und das proximale Handgelenk.

Im Anschluss errechnet die Software die gewünschten Parameter mit den erhobenen Daten automatisiert.

4.12 Zonulin ELISA Um indirekt die Permeabilitätsveränderung im Darm zu messen, wird mit dem gesammelten Serum aus den verschiedenen Versuchen ein Maus-Zonulin- ELISA von Bluegene, China (B.-Nr.: E03Z0004), durchgeführt. Es handelt sich dabei um einen Sandwich-ELISA mit einer Messreichweite von 25-500 ng/ml.

Zur Messung werden 50 µl des Serums auf die mit Zonulinantikörpern be- schichtete ELISA-Platte gegeben. Zusätzlich wird über einen mitgelieferten Standard eine Standardkurve ermittelt. In den folgenden Schritten werden bio- tingelabelte Antikörper gegen Zonulin und anschließend HRP-avidin (horseradish peroxidase) Antikörper gegen Biotin hinzugegeben. Als letztes wird das TMB-Substrat (3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin), welches vom HRP gespalten wird und ein Lichtsignal in 450 nm Wellenlänge emittiert, hinzugegeben (Martin et

- 41 - al., 1984). Wasch- und Inkubationsschritte sind entsprechend der beigefügten Betriebsanweisung durchzuführen. Im Mikroplattenlesegerät spectraMax 190 microplate Reader von Molecular Devices, USA, wird über 5 min die Lichtemis- sion gemessen. Die Farbintensität ist proportional zur Zonulinkonzentration. Mit Hilfe der Standardkurve kann die Intensität in eine Konzentration ng/ml umge- rechnet werden.

4.13 Behandlungen Alle Medikamentenstudien wurden mit DBA/1J Mäusen durchgeführt, lediglich das Butyrate Experiment erfolgte mit C57B/6 Mäusen von Charles River. Die Haltungsbedingungen für die C57B/6-Mäuse entsprechen den in Kapitel 4.1. genannten Bedingungen. Bei der durchgeführten CIA wurden die Mäuse aus der gleichen Lieferung in Kontroll- und Behandlungsgruppen mit je fünf Mäusen eingeteilt, um eine Vergleichbarkeit zu gewährleisten. Der Versuchszeitraum beginnt bei Tag 0 mit der Immunisierung, wird an Tag 21 mit dem Boost fortgesetzt und endet an Tag 50 mit der Mauspräparation. Kontrollgruppen erhalten keine Behandlung, lediglich pH- und Salzgehalt-angepasstes Trinkwasser.

Bei den Experimenten zu ACEA, Larazotide und α4ß7 wurden alle Proben und Daten, wie in Kapitel 4.1. und 4.2. beschrieben, gesammelt. In der Auswertung werden allerdings die Histologie sowie die Zellkultur nicht durchgeführt.

4.13.1 Butyrate Das Butyrate wurde von SIGMA Aldrich, Deutschland, erworben und in der Konzentration 150 mM der Behandlungsgruppe als Trinkwasser zur Verfügung gestellt. Das Trinkwasser wurde alle drei Tage gewechselt. Da dieser Versuch einem anderen Projekt der AG zu geordnet war, sind nur in vivo Permeabili- tätsmessungen durchgeführt worden.

4.13.2 ACEA Das synthetische Cannabionid ACEA wurde von Tocris Bioscience, Großbritan- nien (B.-Nr.: 1319), erworben und den Mäusen im Zeitraum von Tag 21 bis Tag 38 täglich i. p. gespritzt. Die verabreichte Menge von 200 µl hatte eine Konzent- ration von 250 µg ACEA, in PBS emulgiert.

- 42 - 4.13.3 Larazotide Der Zonulin-Antagonist Larazotide wurde von der Firma BOC Sciences, USA (B.-Nr.: 258818-34-7), bezogen. Die Mäuse haben im Zeitraum von Tag 19 bis Tag 29 Trinkwasser mit der Konzentration 0,15 mg Larazotide/ml, welches täg- lich gewechselt wurde, erhalten.

4.13.4 α4ß7-Antikörper Der α4ß7-Antikörper wurde von der Arbeitsgruppe (AG) Zundler zur Verfügung gestellt. Dieser Antikörper wurde im Zeitraum von Tag 0 bis Tag 35 dreimal wö- chentlich i. p. appliziert. Er wurde in der Konzentration 100 µg/100 µl in PBS gelöst; davon wurden jeweils 200 µl gespritzt.

4.14 Humanstudie: Zonulin-Serumlevel Alle Proben sind von der Studienambulanz der Medizin 3 des Universitätsklini- kums Erlangen gesammelt worden. Die Proben wurden in drei Gruppen eingeteilt: Gruppe I ≙ 40 Personen als gesunde Kontrollen, Gruppe II ≙ 41 Personen mit aktiver RA (DAS28 >5,1) und Gruppe III ≙ 65 Personen als prä-RA definierte Personen. Jede Gruppe stimmte nach Möglichkeit mit Alter, Geschlecht und BMI überein. Alle Probanden haben oder hatten noch keine Zeichen einer chronisch-inflammatorischen Darmerkrankung zum Zeitpunkt der Blutentnahme. Die Gruppen II und III haben sich weiterhin regelmäßig in der Studienambulanz vorgestellt.

Die Personen aus Gruppe I sind gesunde Probanden, die keine chronisch- inflammatorische oder sonstige systemische Erkrankung haben, in der Vergan- genheit keine Gelenkschmerzen oder -schwellungen hatten und zusätzlich negative Serummarker für RA aufweisen (ACPA und Rheumafaktor).

Gruppe II sind Probanden, die die ACR-EULAR 2010 Kriterien für eine RA erfül- len und durch Nachweis von Rheumafaktoren und ACPA im Serum als Patien- ten mit seropositiver RA bezeichnet werden. Zusätzlich handelt es sich um Pro- banden mit hochaktiver RA. Dies wird durch den DAS28 >5,1 definiert.

- 43 - Gruppe III sind Probanden mit positivem Autoantikörpertest für zyklisch- zitrullinierte Peptide 2 (CCP2) oder mutiertes zitrulliniertes Vimentin. Diese Pro- banden haben zum Zeitpunkt der Probenentnahme weder Zeichen einer Arthri- tis in Form von Gelenkschwellungen oder -schmerzen noch von solchen in der Vergangenheit berichtet. Ebenfalls wurde keine andere Autoimmunerkrankung bis zu diesem Zeitpunkt diagnostiziert. Die festgestellten Autoantikörper gehö- ren zu den ACPA, welche als sehr sensitiv und spezifisch für RA gelten (van der Linden et al., 2009). Demnach haben diese Probanden ein hohes Risiko an RA zu erkranken und werden prä-RA-Probanden bezeichnet. Im Weiteren wurde verfolgt, welche dieser Probanden eine RA ausgebildet haben.

Die drei Gruppen sind mit Hilfe des Zonulin-ELISA von CUSABIO Technology LLC, USA (B.-Nr.: CSB-EQ027649HU), auf die Zonulinkonzentration im Serum gemessen worden. Es handelt sich dabei um einen Sandwich-ELISA mit einer Messreichweite von 0,625-40 ng/ml. Die Messung erfolgt analog zum Zonulin- ELISA für Mäuse wie im Kapitel 4.12 beschrieben.

Zum Vergleich der Gruppen ist Gruppe I als Basis-Zonulin-Serumkonzentration definiert und anschließend mit den Werten der Gruppen II und III verglichen worden. Zusätzlich wurde diese Baseline mit den Patienten aus Gruppe III verglichen, die inzwischen eine RA nach ACR-EULAR-Kriterien entwickelt haben.

Diese Studie wurde vom Untersuchungsausschuss des Universitätsklinikums Erlangen (#4564) genehmigt und die schriftlichen Einverständniserklärungen aller Probanden liegen vor.

4.15 Statistik Die verwendeten Daten sind als Mittelwert ± SD dargestellt, sofern nicht anders deklariert. Einfache Vergleiche sind mit dem Student´s t-test durchgeführt worden und Mehrgruppenvergleiche mit dem Analysis of variance-Test (ANOVA) gefolgt vom Tukey´s oder Bonferroni Mehrgruppenvergleichstest. Dabei werden P-Werte von 0,05 als signifikant bewertet und als p<0,05 (*), p<0,01 (**) oder p<0,001 (***) gezeigt. Ergebnisse und deren Darstellungen wurden mit dem Statistikprogramm Prism version 8 von GraphPad, USA, erstellt.

- 44 - 5. Ergebnisse

5.1 Verlaufsstudie der CIA Im Folgenden werden die Ergebnisse der CIA-Verlaufsstudie dargestellt. Es wurden jeweils 2 unabhängige Experimente durchgeführt mit einer Gruppen- größe von n=5, wenn nicht anders angegeben. In Abbildung 3 ist zu sehen, dass die CIA erfolgreich durchgeführt wurde und ein gleichmäßiger Verlauf der CIA gewährleistet wurde. Der Score beschreibt den Mittelwert aller Pfoten. Kei- ne Maus musste aus dem Versuch nach FELASA-Richtlinien ausgeschlossen werden. Der Gewichtsverlust an Tag 25 ist kurz nach dem Boost und tritt nor- malerweise nach diesem auf.

Die Arthritis beginnt 2-3 Tage nach dem Boost an Tag 21 und erreicht die maximale Ausprägung an Tag 45. An Tag 50 lässt sich eine beginnende Remissi- on feststellen. Tag 30 bis 45 wird als der chronische Anteil des Experiments bezeichnet.

Abbildung 3: Gezeigt werden links der Gewichtsverlauf in Gramm. An Tag 25 sieht man den Gewichtsverlust der Mäuse nach dem Boost. Rechts ist der Arthritis-Score als Mittelwert aller Pfoten der Mäuse abgebildet. Die Erkrankung beginnt kurz nach dem Boost und steigert sich im Laufe des Experiments. Die Mäuse sind dann an Tag 45 am schwersten erkrankt. Anschließend beginnen sich die Symptome zu verbessern.

5.1.1 Längenmessung des Darms Bei der durchgeführten Längenmessung fällt zunächst auf, dass die Darmlänge (Abbildung 4, S. 46) mit dem Gewicht der Mäuse (Abbildung 3) korreliert. Die Darmlänge der an Tag 27 getöteten, gesunden Kontrolle beträgt durchschnitt-

- 45 - lich 9 cm beim Colon und ø 34,5 cm im Dünndarm. In beiden Darmabschnitten ist eine Verkürzung an Tag 25 im Vergleich zur gesunden Kontrolle zu sehen. Im Colon ist eine weniger ausgeprägte Verkürzung um ca. 0,5 cm in den Tagen 30 bis 40 zu beobachten. Anschließend entspricht die Länge wieder der der Kontrolldärme. Der Dünndarm ist während des restlichen Expermentenverlau- fes in einem Bereich von 34 bis 36 cm ähnlich lang wie die Kontrolldärme.

Abbildung 4: Dargestellt sind links die Länge des Colons und rechts die des Dünndarms in cm. Eine Verkürzung in den ersten Tagen nach dem Boost ist in beiden Darmabschnitten festzustellen. An Tag 25 ist die Ver- kürzung besonders ausgeprägt. Im Colon ist eine Verkürzung bis Tag 40 festzustellen. Der Dünndarm ist nur an Tag 25 deutlich erkennbar verkürzt.

Da ein Längenwachstum des Darms durch Wachstum der Mäuse während des Experiments nicht auszuschließen ist, wird ein besonderes Augenmerk auf den Vergleich von der an Tag 27 euthanasierter Kontrolle und der Tag 25-Gruppe gelegt. In der folgenden Abbildung 5 (S. 47) sieht man, dass der Darm bei den erkrankten Mäusen verkürzt ist. Im Colon ist diese Verkürzung um ca. 12%, was einer Längenminderung von 1cm entspricht, deutlich signifikant. Die durchschnittliche Verkürzung des Dünndarms von ø 34,5 cm auf ø 32 cm führt zu keiner Signifikanz, ist aber in der Grafik deutlich erkennbar.

- 46 -

Abbildung 5: Links die Länge des Colons und rechts die des Dünndarms in cm. Be- trachtet werden Kontrolle, getötet an Tag 27, und Tag 25 im direkten Vergleich. Die Verkürzung im Colon ist dabei signifikant, während die Verkürzung im Dünndarm deutlich ist, aber keine Signifikanz verursacht.

5.1.2 FACS In diesem Abschnitt werden die Veränderungen einzelnen Zelltypen, die im FACS identifiziert worden sind, im Verlauf der CIA dargestellt. Die Anzahl be- trägt n=10 für die F1 und für F2 ist n=5, da diese Färbung erst im zweiten Durchlauf des Experiments ins Protokoll mit aufgenommen wurde. Vereinzelt sind Werte aufgrund einer zu geringen Zellzahl in der Isolation und in der Aus- wertung nicht berücksichtigt worden, da dadurch keine validen Werte ermittelt werden können. Die Daten werden allgemein als Prozent von vorsortierten Da- ten dargestellt, eine nähere Erläuterung dazu erfolgt im Text und bei den Abbil- dungen. Die Aussagekraft der prozentualen Werte ist größer, da aufgrund der Methodik und der Darmzellreste relativ viel Hintergrundsignal vorhanden ist und dieses Signal von Probe zu Probe variiert. Damit hätten absolute Zahlen in Be- zug zur Zellzahl wenig Aussagekraft. Zusätzlich muss davon ausgegangen werden, dass weiterhin Darmzellen in der Population der lebenden Zellen, trotz vorheriger Isolation der Immunzellen, vorhanden sind.

- 47 -

Abbildung 6: Dargestellt sind der prozentuale Anteil an CD8+ zytotoxischen T-Zellen von der Gesamtzahl der CD3+ T-Zellen, links des Colons und rechts des Dünndarms. Im Colon scheint es zur Hochphase der Krankheitsaktivität von Tag 35-45 einen Abfall zu geben. Im Dünndarm ist dieser Abfall für Tag 30-35 zu beschreiben. Eine leichter Anstieg für Tag 25 ist erkennbar, aber insgesamt sind keine eindeutigen Tendenzen festzustellen. Im Dünndarm ist der Anteil der CD8+-Zellen insgesamt deutlich größer.

In der obigen Abbildung 6 sieht man den Verlauf der zytotoxischen T-Zellen auch CD8+ T-Zellen genannt. Es handelt sich dabei um die Angabe in % CD3+ Zellen, also entspricht die Prozentzahl dem Anteil an T-Zellen (CD3+). Dabei sind keine großen, eindeutigen Verschiebungen innerhalb des Versuchszeit- raum zu beobachten. Jedoch ist ein Abfall der Zellen im Colon in Zeitraum Tag 35-45, also in der aktivsten Phase der RA, erkennbar; im Dünndarm ist ein Ab- fall an Tag 30 und 35 zu sehen. Zusätzlich scheint es im Dünndarm einen leichten Anstieg an Tag 25 zu geben, allerdings ist die Streuweite dieser Daten sehr groß. Im Colon sind zwischen 1-10% der T-Zellen zytotoxische T-Zellen, im Dünndarm ist diese Rate deutlich höher mit Werten bis ø 20% der T-Zellen.

In der Abbildung 7 (S. 49) ist der Anteil an CD4+ Zellen aller lebenden Zellen, also der T-Helferzellanteil aufgeführt. Dieser beträgt im Colon zwischen 1 – 4% der lebenden Zellen und im Dünndarm bis zu 7%. In beiden Darmabschnitten scheint es eine leichte Anteilserhöhung an den Tag 40 und 45 zu geben. Ein signifikanter Unterschied ergibt sich allerdings lediglich für den Dünndarm im Vergleich zwischen Kontrolltag und Tag 40. Im Weiteren sind keine klaren Ten- denzen festzustellen.

- 48 -

Abbildung 7: In dieser Abbildung ist der prozentuale Anteil an CD4+-T-Zellen der gesamten lebenden Zellpopulation, links das Colon und rechts der Dünndarm. In beiden Darmabschnitten sind keine deutlichen Verschiebungen festzustellen. Lediglich an den Tagen 40 und 45 scheint der Anteil in beiden Darmabschnitten erhöht zu sein. Im Dünndarm ist der Unterschied zwischen Kontrolle und Tag 40 signifikant.

Allerdings teilen sich die T-Helferzellen in verschiedene Subtypen auf. Die untersuchten Subtypen sind: Th1, Th17, Th2 und Treg. Bei diesen Subtypen ist im Verlauf ersichtlich, dass sich der prozentuelle Anteil der T-Helferzellen im Laufe verschiebt. Die Gesamtanzahl der T-Zellen hat dabei nie 100% überschritten. Th1 und Th17 Zellen sind durch CD3- und CD4-Positivität vorsortiert. Th2 und Treg sind aufgrund der anderen Färbung lediglich durch CD4-Positivität vorsortiert.

Wie man in Abbildung 8 (S. 50) sieht haben die Th1 ihr Maximum an Tag 25. Mit einem durchschnittlichen Anteil von 8% der T-Helferzellen an Tag 25 und einem Kontrollwert von unter 2,5% am Kontrolltag ist im Dünndarm ein signifikanter Anstieg der Th1 mit Beginn der Arthritis zu beobachten. In der restlichen Studie bleibt der Th1-Anteil unter 2,5% und damit auf dem Niveau der Kontrolle. Im Colon gibt es gleichfalls einen Th1-Anstieg an Tag 25 auf ø 8%, allerdings weist der Kontrolltag dort mit ø 5% ebenfalls relativ hohe Th1-Werte auf, sodass keine Signifikanz ermittelt werden kann. An den restlichen Versuchstagen bewegen sich der Th1-Anteil deutlich unter 4%. Infolgedessen ist die Th1- Erhöhung an Tag 25 deutlich signifikant zu den Tag 30 bis 50. Die Verlaufskur- ve des durchschnittlichen Th1-Anteils verhält sich im Colon insgesamt umgekehrt-proportional zum Score. Ein Maximum an Tag 25, sinkende Anteile bis Tag 45, dem Tag mit dem höchsten Arthritis-Score, und schließlich wieder ein

- 49 - leichter Anstieg an Tag 50, an welchem sich die Arthritis wieder leicht bessert. Die Definition der Th1 erfolgt über die Positivität von T-bet.

Abbildung 8: Dargestellt ist der prozentuale Anteil an CD3+/CD4+ vorsortierten Th1- Zellen (T-bet+), links des Colons und rechts des Dünndarms. Im Dickdarm ist ein Abfall des Th1-Anteils über die Zeit zu sehen, um an Tag 50 mit Beginn der Besserung wieder leicht anzusteigen. Wie auch im Dünndarm ist an Tag 25, somit kurz nach dem Boost und mit Beginn der Arthritis, das Maximum des Th1-Anteils erreicht. Die Th1 bilden im Dünndarm bis auf den Tag 25 einen Anteil von unter 2,5%.

Der Verlauf des Th17-Anteils verhält sich ähnlich wie der Score der Arthritis (siehe Abbildung 9, S. 51). Besonders im Colon stellt sich der proportionale An- teilsverlauf zum Arthritis-Score sehr eindrücklich dar. So ist der Anteil der der Th17 am Kontrolltag und Tag 25 bei ø 20%. Eine kontinuierliche Steigerung im Zeitraum Tag 30 bis 45 von ø 50% bis zu 65% der T-Helferzellen ist festzustellen. Mit Verbesserung der Symptome an Tag 50 beginnen die Th17 wieder zu fallen, auf einen 45%-igen Anteil. Im Dünndarm ist für die aktive Krankheitspha- se von Tag 30 bis 45 ebenfalls ein deutlicher Th17-Anstieg zu beobachten. Der Anstieg verhält sich dort allerdings mehr wie ein Plateau bei einem Sprung von 20%-Anteil auf ø 40-45%. Ebenfalls ist ein Abfallen an Tag 50 zu beobachten. Die Th17 sind dabei mit einem Antikörper gegen den Transkriptionsfaktor RoRγT als positiv markiert worden.

- 50 -

Abbildung 9: Dargestellt ist links der Arthritis-Score, in der Mitte und rechts der Th17- Anteil an CD3+/CD4+ vorsortierten T-Helferzellen des Colons und des Dünndarms. Der Arthritis-Score ist dargestellt damit man den ähnlichen Verlauf der Th17 im Darm besser nachvollziehen kann. Besonders im Colon wird der zum Score proportional ver- laufende Anteil der Th17 deutlich. Im Gesunden und an Tag 25 sind circa 20% der T- Helferzellen Th17, an Tag 45 ist ein Maximum von 65% und endet mit einem Abfall an Tag 50. Im Dünndarm sind die Verschiebungen nicht ganz so deutlich und signifikant. Aber auch dort ist eine Th17-Anteilserhöhung für die Krankheitsphase von Tag 35-45 festzustellen.

Die Färbung F2 ist am Tag 30 fehlerhaft durchgeführt worden, daher fehlt dieser Tag in den folgenden Ergebnissen. Für die Th2 (GATA3+) und die Treg (FoXp3+) sind Maxima am Tag der aktivsten Arthritis und kurz vor Verbesse- rung der Arthritis im Colon ersichtlich (Abbildung 9).

Abbildung 10: Dargestellt sind der Anteil der Th2 und Treg von den CD4+-T- Helferzellen im Colon. Signifikante Unterschiede sind jeweils von Tag 45 im Vergleich mit den restlichen Tagen feststellbar. Die Maxima liegen damit am Tag mit dem höchs- ten Arthritisscore und kurz vor Eintreten der Symptomverbesserung. Der Th2-Anteil verhält sich an den anderen Tagen etwas variabler als der der Treg. An Tag 25 und 35 ist ein leichter Rückgang des Th2-Anteils ersichtlich.

Die Th2 haben dabei an Tag 45 mit einem Anteil von ø 10% der T-Helferzellen einen doppelt so großen Anteil wie am Kontrolltag. Für die Treg ist eine Vervier-

- 51 - fachung des Anteils von ca. 1% an den restlichen Tagen zu ø 4,5% an Tag 45 zu beobachten. Zwischen den restlichen Tagen ist nur ein marginaler Unter- schied zwischen den Treg-Anteilen festzustellen. Die Kontrollgruppe hat einen Referenz-Th2-Anteil von ø 5%. Dieser Anteil sinkt im Verlauf an den Tagen 25 und 35 auf unter 3%. An Tag 40 und 50 sind die Th2 auf dem Niveau des Kon- trolltages.

In der Abbildung 11 ist der Anteil von Th2 und Treg an CD4+-T-Helferzellen im Dünndarm dargestellt. Bei den Th2 erhöht sich der Anteil von ø 3% an den Ta- gen Kontrolle, 25 und 35 auf einen durchschnittlichen Anteil von über 7% an den Tagen 40, 45 und 50. Die Treg haben am Kontrolltag und Tag 25 einen Anteil um ca. 1% und haben einen Anteilsanstieg auf ø 2,5% für die Tage 40 bis 50. Tag 35 hat einen Treg-Anteil von ø 3,5% und weist damit eine signifikante Erhöhung zu den Tagen Kontrolle, 25 und 40 auf. Damit ist generell ein leichter Anstieg der Th2 und Treg im späteren Verlauf der Arthritis für das Dünndarm- immunsystem zu beobachten.

Abbildung 11: Rechts ist der Th2-Anteil und links der Treg-Anteil der CD4+-T- Helferzellen im Dünndarm abgebildet. Für die Th2 lässt sich ein Anstieg von ø 3% auf ø 7% ab Tag 40 feststellen. Bei den Treg gibt es für den Tag 35 einen signifikanten Anstieg im Vergleich zu Kontrolltag, Tag 25 und 40. Tendenziell lässt sich für die Treg eine Erhöhung des Anteils um 1-2% ab Tag 35 beobachten.

Bei den B-Zellen sieht man einige Veränderungen im Verlauf der Arthritis. Aller- dings ist dort kein wirkliches Muster zu erkennen, wie auf Abbildung 12 (S. 53) ersichtlich. Mit durchschnittlich 8 – 18% aller lebender Zellen bilden sie einen größeren Zellanteil der lebenden Zellen. Im Colon ist am Kontrolltag der Anteil mit ø 15% am größten und bildet damit einen signifikant höheren Anteil als an den Tagen 30 bis 45. Der Tag 25 hat ebenfalls mit 13% einen signifikant höhe-

- 52 - ren Anteil vergleich mit den Tagen 30, 40 und 45. Am ehesten lässt sich die eine Tendenz der B-Zellreduktion im Colon für den Verlauf der Arthritis feststellen. Im Dünndarm sind signifikante Maxima am Kontrolltag und an Tag 35 festzustellen. Ein Anstieg im Vergleich zu den restlichen Tagen ist ebenfalls für Tag 50 ersichtlich. Im Dünndarm ist auch die Tendenz eines B-Zellrückgangs im Verlauf der Arthritis zu beobachten. Die B-Zellen sind als B220/CD45R positiv definiert.

Abbildung 12: Abgebildet ist der B-Zellanteil von den lebenden Zellen, links im Colon und rechts im Dünndarm. Im Colon sind an Kontrolltag und Tag 25 im Vergleich zu den restlichen Tagen die B-Zellen signifikant erhöht. Im Dünndarm sind Maxima für Kontrol- le und Tag 35 ersichtlich. Eine Tendenz des B-Zellanteils im Verlauf der Arthritis ist festzustellen. Der Tag 35 fällt im Dünndarm aus dieser Tendenz heraus.

5.1.3 Histologie In der folgenden Abbildung 13 (S. 54) sieht man PAS-gefärbte Schnittbilder des Colons einer Kontrollmaus sowie einer Maus des Tag 50 und die statistische Auswertung der Zählung. Wie auf den Bildern bereits durch die geringere Ein- färbung an Tag 50 sichtbar ist, gibt es einen Rückgang der Becherzellen im Co- lonepithel. Ein signifikanter Rückgang der Becherzellen im Verlauf der Arthritis ist dabei zu beobachten. Die durchschnittliche Verringerung beträgt 3-4 Be- cherzellen pro Krypte. So hat eine Colonkrypte in den Kontrollmäusen ø 24 Be- cherzellen und an allen anderen Tagen zwischen 20 und 21 Becherzellen pro- Krypte.

- 53 - Abbildung 13: Oben sind Krypten des Colons in einer PAS-Färbung dargestellt, links ein Colon der Kon- trollgruppe und links ein Colon der Tag-50-Gruppe. Man sieht bereits eine deutlich schwächere Anfär- bung auf der rechten Seite. In der Grafik unten links ist die durchschnittliche Becherzellanzahl von 6 Krypten dargestellt. Man sieht dabei, dass im Zuge der CIA die Anzahl der Becherzellen pro Krypte signifikant zurück geht.

In der HE-Färbung sind die Abschnitte Duodenum, Jejunum, Ileum und Colon betrachtet worden. Signifikante Längen- oder Breiteverschiebungen der Darm- strukturen Zotten und Krypten konnten über den gesamten Verlauf der CIA nicht festgestellt werden. Folgende Daten der Abbildung 14 zeigen repräsenta- tiv Daten aus den Messungen. Ähnlich homogene Messungen sind bei allen Darmstrukturen und in allen Darmabschnitten zu finden. Die Grafiken zu den erhobenen Daten sind im Anhang ab S.127 zu finden.

Abbildung 14: Man sieht auf der linken Seite die Messung der Kryptentiefe des Colons in µm und auf der rechten die Messung der Zottenlänge im Ileum in µm. In beiden Gra- fiken sieht man, dass es keine Verschiebungen während der CIA gibt.

- 54 - 5.1.4 LEGENDplex™. Die Zellkulturüberstände bieten lediglich bei dem Zytokin IL-6 im Colon verwert- bare Ergebnisse. Bei den übrigen Zytokinen IFN-γ, TNFα, IL-17A und IL-1β sowie den Zellkulturüberständen der Dünndarmabschnitte hat sich die Zytokin- konzentration überwiegend im nicht nachweisbaren Bereich bewegt. Die Abbil- dungen zu den einzelnen Messdaten finden sich im Anhang ab S. 127.

Abbildung 15: In der Abbil- dung ist die Konzentration in pg/ml von IL-6 im Zellüber- stand nach 24h Zellkultur des Darms zu sehen. An Tag 25 ist eine deutliche Konzentrati- onssteigerung zu sehen. An- sonsten bleibt die IL-6 Kon- zentration auf einem ähnlichen Level wie die Kontrolle

Die Zellkultur des Colons hat in der ersten Zeit nach dem Boost circa 200pg/ml mehr IL-6 produziert und in den Überstand abgegeben (Tag 25); auch im Ver- lauf bleibt die IL-6 Produktion um circa 75pg/ml bis Tag 40 leicht erhöht. Diese Erhöhung ist aber eindeutig außerhalb des Signifikanzniveaus anzusiedeln. (Abbildung 15)

Bei den Serumproben sind für die Zytokine IL-6, IFN-γ und TNFα genügend Proben mit Konzentrationen oberhalb der Nachweisgrenze, so dass eine Aus- wertung sinnvoll ist. Die Ergebnisse sind in der Abbildung 16 (S. 56) zu finden. IL-17A und IL-1β weisen auch hier nur vereinzelt Werte innerhalb des Nach- weisbereichs auf und sind im Anhang ab Seite 127 visualisiert.

Bei dem Zytokin IL-6 gibt es eine Erhöhung der Serumkonzentration von 0pg/ml der Kontrolle auf an Tag 25 200pg/ml und im Verlauf auf circa. 100pg/ml. Ent- sprechend der Ergebnisse aus der Zellkultur ist der Peak an Tag 25, an welchem signifikant mehr IL-6 im Serum nachweisbar ist.

Die Serumkonzentration des IFN-γ ist ebenfalls über den kompletten Versuchs- verlauf erhöht. Jedoch ist eine signifikante Erhöhung nur an Tag 25 und 30 auf

- 55 - circa 500pg/ml festzustellen. Am Kontrolltag liegt der durchschnittliche Wert leicht über der Nachweisgrenze und ab Tag 35 zwischen 200 und 300pg/ml.

Mit dem TNFα verhält es sich anders. Dieses Zyktokin ist lediglich zu Beginn (Tag 25-35) vermehrt im Serum nachweisbar. Ein signifikanter Unterschied ist lediglich für Kontrolle (0pg/ml) versus Tag 30 (50pg/ml) vorhanden.

Abbildung 16: Dargestellt sind die Serumkonzentrationen in pg/ml von IL-6 links, IFN-γ in der Mitte und TNFα rechts. Für IL-6 ist eine Steigerung über den kompletten Verlauf beobachten. Ein signifikanter Unterschied ist jedoch nur zwischen Kontrolle und Tag 25 festzustellen. IFN-γ ist ebenfalls im kompletten Verlauf in erhöhter Konzentration im Serum zu finden. Signifikanzen treten nur zwischen Kontrolle und Tag 25 sowie 30 auf. Bei TNFα ist eine Erhöhung mit einem signifikanten Maximum an Tag 30 für die Tage 25 bis 35 zu beobachten.

5.1.5 in vivo Permeabilitätsmessung Die Permeabilitätsmessung wurde nur im zweiten Durchlauf der CIA-Verlaufsstudie durchge- führt; daher beträgt n=5. Der Verlauf der mittleren Fluoreszenzintensität aus Abbildung 17 zeigt ein vermehrtes Durchtreten von FITC- Dextran durch den Darm ins Serum im Verlauf der CIA. An Tag 35 mussten drei Messungen mit unrealistisch hohen Werten aufgrund von Abbildung 17: Zu sehen ist die Fluoreszenzintensitätssteigerung Hämolyse ausgenommen werden. Selbiges gilt im Serum durch FITC-Dextran im für einen Datensatz an Tag 40. Verlauf der CIA.

- 56 - 5.1.6 qRT-PCR Es wurden das Colon und das Ileum – als Dünndarmabschnitt – in der qRT- PCR auf ihre mRNA-Expression untersucht. Die mRNA-Expression drückt dabei aus wie viel von dem Proteingenom translatiert wird und zeigt damit indirekt wie viel des untersuchten Proteins produziert wird. Als Referenzgen wird das GAPDH verwendet.

In der Abbildung 18 ist die relative Expression von Occludin zu sehen. In beiden Darmabschnitten sieht man, dass deutlich weniger Occludin-mRNA während der ersten Erkrankungsphase im Vergleich zur gesunden Kontrolle produziert wird. Für das Colon werden dabei signifikante Unterschiede für den Vergleich von Kontrolle und Tag 25 sowie 30 erreicht. Für das Ileum können keine Signifi- kanzen ermittelt werden. Im Ileum kommt es erst am Tag 45 zu einer Erhöhung der Produktion und damit kurz vor Einsetzen der Symptomverbesserung der Arthritis. Das Colon produziert bereits an Tag 40 wieder deutlich mehr Occludin, damit ist noch vor maximaler Krankheitsausprägung wieder eine Veränderung erkennbar.

Abbildung 18: Abgebildet ist die relative Genexpression von Occludin bezogen auf das Referenzgen GAPDH, links des Ileums und rechts des Colons. Im Ileum ist eine verminderte Expression an den Tagen 25, 30 und 40 im Vergleich zu den Kontrolldärmen ersichtlich. Für das Colon ist ein signifikanter Abfall an den Tagen 25 und 30 zu beobachten. Die restlichen Tage bewegen sich auf einem deutlich höheren Expressions- niveau im Bereich der Kontrolle.

Für die Claudin2-Auswertung ergibt sich ein anderes Bild. Wie in Abbildung 19 (S. 58) zu sehen steigt die Claudin2-mRNA-Produktion deutlich an im Verlauf der Erkrankung. So wird Claudin2 im Ileum für die Tage 25 und 30 doppelt bis dreifach so viel wie am Kontrolltag exprimiert. An Tag 40 wird die vermehrte

- 57 - Expression durch den sechs- bis achtfachen Anstieg signifikant. Die Expression an Tag 45 liegt leicht unter dem Niveau der Kontrolle. Im Colon lässt sich eine drei- bis vierfache Expression im Vergleich zur Kontrolle an den Tagen 25, 30 und 40 feststellen. Wie im Ileum liegt an Tag 45 die Expression unterhalb der Kontrollexpression. Claudin2 verhält sich damit umgekehrt zum Occludin.

Abbildung 19: Links ist die relative Expression von Claudin2 in Bezug auf GAPDH im Ileum und rechts die des Colons abgebildet. In beiden Abschnitten ist die Expression in den Tagen 25 bis 40 erhöht im Vergleich zur Kontrolle und dem Tag 45. Eine Signifi- kanz ist lediglich für den Vergleich von Kontrolle und Tag 40 ermittelt worden.

Für PAD 2 und PAD 4 lässt sich eine erhöhte Expression während der Erkran- kungsphase zeigen (Abbildung 20, S. 59). Die relative Expression im Colon hat dabei für beide Enzyme einen ähnlichen Verlauf: eine vielfache Expression im Vergleich zu den Kontrollen und Tag 45 ist für die Tage 25, 30 und 40 festzustellen. PAD 2 hat im Ileum an Tag 25 eine achtfach erhöhte Expression im Vergleich zur Kontrolle. An den folgenden Versuchstagen fällt die Expression zunächst wieder deutlich ab, um dann wieder bis zur fünffachen Expression an Tag 45 anzusteigen. Im Ileum bleibt die erhöhte Expression von PAD 4 auf einem ähnlichen Niveau an allen Tagen im Vergleich zur Kontrolle. Für keine Än- derung der Datensätze sind Signifikanzen festgestellt worden.

- 58 -

Abbildung 20: Dargestellt sind oben die relative Expression bezogen auf GAPDH von PAD 2 und unten die von PAD 4, auf der linken Seite sind Daten des Ileums und rechts die des Colons. Die PAD 2-Expression im Ileum hat einen Höhepunkt an Tag 25. Im weiteren Verlauf fällt die Expression ab, um dann wieder anzusteigen bis Ende des Versuchs. Für PAD 4 ist eine erhöhte Expression der erkrankten Mäuse über den kompletten Versuch zu beobachten. Im Colon ist die Expression an den Tagen 25, 30 und 40 im Vergleich zum Kontrolltag und Tag 45 sowohl für PAD 2 als auch für PAD 4 mehrfach erhöht. Signifikanzen treten in keiner Grafik auf.

5.1.7 Zonulin ELISA In der Abbildung 21 (S. 60) ist die Serumkonzentration vom Zonulin in der CIA- Verlaufsstudie dargestellt. Einen zusätzlichen Datensatz gibt es von einer Gruppe aus einem anderen Projekt, welche an Tag 20 und damit einem Tag vor dem Boost euthanasiert worden sind. Die gesunde Kontrollgruppe liegt bei einem Serumwert von 50 ng/ml. Das Zonulin ist schon an Tag 20 und damit vor Beginn der Arthritis um 25 ng/ml auf 75 ng/ml erhöht. Mit Beginn der Arthritis ist die Konzentration am höchsten und liegt 40 ng/ml über dem Level der gesunden Kontrolle. Dieses erhöhte Level hält bis zum Tag 35 an und beginnt an Tag 45 kurz vor der einsetzenden Verbesserung der Arthritis wieder abzufallen, bis um an Tag 50 wieder mit 50 ng/ml dieselbe Konzentration wie die Kontrolle auf-

- 59 - zuweisen. An Tag 50 ist bereits ein abfallender Score, d.h. eine Verbesserung der Arthritis festzustellen.

Abbildung 21: Dargestellt ist die Zonulin-Serumskonzentration in ng/ml im Verlauf der CIA. Man sieht dabei, dass schon vor Be- ginn dem Boost an Tag 20 die Konzentration erhöht ist. Kurz nach dem Boost erreicht sie ein Maximum, um dann langsam bis Tag 50 wieder auf Kontrollni- veau abzufallen

5.2 Butyrate Die Abbildung 22 zeigt, dass die Behandlung der RA mit Butyrate zu einer gerin- geren Durchlässigkeit im Vergleich zur mit Wasser behandelten Gruppe führt. Dies wird deutlich durch eine halbierte, mittlere Fluoreszenzintensität von FITC-Dextran im Serum der Butyrate-Gruppe im Vergleich zur erkrankten Kontrolle.

Abbildung 22: Es ist eine geringere Fluores- zenzintensität im Serum durch FITC-Dextran bei Behandlung mit Butyrate im Vergleich zur Kontrollbehandlung mit Wasser dargestellt.

5.3 ACEA + α4ß7 Für dieses Experiment wurde eine gemeinsame Kontrollgruppe für die Behand- lung mit ACEA und α4ß7 verwendet. Die CIA wurde bei allen Gruppen gemein-

- 60 - sam gestartet, d.h. das in diesem Experiment die Kontrollgruppe nicht gesund ist, sondern ebenfalls an Arthritis erkrankt ist.

5.3.1 Behandlungserfolg anhand von Score und Gewicht In den Abbildungen 23 und 24 (S.62) sind der summierte Score aller Pfoten sowie das Gewicht der Mäuse im Verlauf dargestellt. Nach dem Boost verlaufen die Gewichtskurven zunächst parallel bis Tag 26. Ab Tag 28 gewinnen die behandelten Gruppen mehr Gewicht als die Kontrollgruppe hinzu. Von Tag 30 an laufen die Gewichtskurven parallel und gleichen sich gegen Ende des Versuchs (Tag 47) bei α4ß7 und Kontrolle wieder an. Zwischen Tag 26 und 30 haben die behandelten Mäuse mehr Gewicht zugelegt als die unbehandelten. Der dabei entstandene Gewichtsunterschied bleibt bis zum Ende des Versuches bestehen.

Abbildung 23: Dargestellt sind die Ge- wichtsverläufe der drei Gruppen Kontrol- le, ACEA und a4b7. Die Gewichtskurven laufen bis Tag 26 parallel. Zwischen Tag 26 und 30 gewinnen die Behandlungs- gruppen mehr Gewicht hinzu, um danach auf einem erhöhten Niveau oberhalb der Kontrollgruppe zu verlaufen.

Bei allen 3 Gruppen ist das Modell der CIA erfolgreich gewesen, wie man in der Abbildung 24 (S. 62) sieht. Die Kurven des Arthritisscores verlaufen zunächst parallel. Ab Tag 28 beginnt sich die Arthritis deutlich zu verschlechtern. Zu diesem Zeitpunkt setzen sich die beiden Behandlungsgruppen mit einem niedrige- ren Score von der Kontrollgruppe ab. In der aktivsten Phase dieser CIA von Tag 33 bis 42 beträgt der durchschnittliche Unterschied zwischen den Behandlun- gen und Kontrolle drei Scorepunkte. Der maximale Durchschnittsscore beträgt 6,5 bei der Kontrolle und 3,5 bei ACEA und α4ß7. Der Unterschied in den Kur- ven bleibt auch bei Verbesserung der Arthritis gegen Ende des Versuchs bestehen. Damit verzögert sich die Arthritis nicht nur durch die Behandlung, sondern bleibt bis zum Ende des Versuches verbessert.

- 61 -

Abbildung 24: Dargestellt sind die Arthri- tisscore-Verlaufskurven von Kontrolle, ACEA und a4b. Mit dem Sprung der Arthri- tisaktivität an Tag 26 beginnt sich der Score der Kontrolle von denen der Be- handlungsgruppen höher zu werden. Ab Tag 33 in der aktivsten Phase der CIA ist der Kontrolldurchschnittsscore ca. 3 Punk- te höher als der der behandelten Gruppen. Dies hält bis zum Ende des Versuchs an. 5.3.2 Längenmessung Bei der Längenmessung des Darms ist kein relevanter Unterschied zwischen den Gruppen messbar, wie Abbildung 25 zeigt. Sowohl im Colon als auch im Dünndarm scheint die Behandlung keinen Einfluss auf die Darmlänge zu haben.

Abbildung 25: Gezeigt werden links die Durchschnittslänge der Co- lons und rechts die der Dünndärme. Unterschiede zwischen den drei Gruppen Kontrolle, ACEA und a4b7 sind nicht festzustellen.

5.3.3 FACS Wie schon bei der CIA-Verlaufsstudie unter Kapitel 5.1.2 werden im Folgenden die Ergebnisse der B- und T-Zellanalyse beschrieben.

Der B-Zellanteil liegt in beiden Darmabschnitten bei allen drei Gruppen auf einem Niveau (Abbildung 26, S. 63) Für die Kontrolle und ACEA liegt der Anteil

- 62 - bei ø 10%, während bei α4ß7 der Anteil etwas höher ist. Ein signifikanter Unter- schied besteht allerdings nicht.

Abbildung 26: Dargestellt ist links der B-Zellanteil der lebenden Zellen, rechts der des Dünndarms. Signifikan- te Unterschiede zwischen den Gruppen Kontrolle, ACEA und a4b7 sind nicht festzustellen, lediglich eine leichte Tendenz einer B- Zellvermehrung bei a4b7. Die in den folgenden Grafiken dargestellten Daten für T-Helferzellen und zytotoxische T-Zellen zeigen, dass die CD3+ T-Zellpopulation überwiegend aus den CD4+ T-Helferzellen besteht. Die zytotoxischen Zellen bilden einen Anteil von unter 10%, während die T-Helferzellen Anteile von über 50% bilden.

Abbildung 27: Links sind CD4+ T-Helferzellen als Anteil der CD3+ Zellen im Colon und rechts im Dünndarm dargestellt. Ein signifikanter Unterschied besteht zwischen der Kontrolle und a4b7 im Colon. Der Anteil bei ACEA ist nur minimal größer als bei der Kontrolle. Im Dünn- darm ist der Anteil der Kontrolle leicht vermindert.

Für die T-Helferzellen ist im Dünndarm der Anteil für α4ß7 signifikant gegen- über der Kontrolle erhöht (Abbildung 27). Der Anteil bei ACEA ist mit ø 45% nur minimal größer als der 42%-ige Anteil der Kontrolle. Im Colon die Tendenz einer leichten Erhöhung des Anteils für ACEA und α4ß7 gegenüber der Kontrolle festzustellen. Im Dünndarm liegt der Kontrollanteil durchschnittlich 8-10% unter dem der beiden Behandlungsgruppen. Ein signifikanter Unterschied besteht dabei nicht.

Wie in Abbildung 28 (S. 64) zu sehen, bilden die zytotoxischen T-Zellen im Co- lon bei der Kontrolle einen 0,75%-igen Anteil der CD3+ Zellen, bei ACEA einen 5%-igen und bei α4ß7 einen 3,8%-igen. Ein signifikanter Unterschied besteht dabei lediglich zwischen Kontrolle und ACEA. Im Dünndarm liegen Kontrolle

- 63 - und ACEA auf einem Level mit einem 4%-Anteil. Eine Signifikanz bildet der Un- terschied zwischen Kontrolle und α4ß7 (8%-Anteil).

Abbildung 28: Dargestellt sind die Anteile der CD8+ zytotoxischen T-Zellen von den CD3+ Zellen, links im Colon und rechts im Dünndarm. Im Colon ist der Anteil für die Kontrolle im Vergleich zu den beiden anderen Gruppe vermindert. Im Dünndarm ist der Anteil bei a4b7 deutlich erhöht gegen über ACEA und Kontrolle.

Bei der Betrachtung des Th17-Anteils bei den CD4+ T-Helferzellen in Abbildung 29 sieht man die Tendenz, dass diese vermehrt in den behandelten Gruppen auftreten. Im Colon ist der Anstieg von 9,5%-Anteil der Kontrolle auf ca. 15%- Anteil bei ACEA und α4ß7 nicht signifikant. Im Dünndarm sind Anstiege von 8% bei der Kontrolle auf 17% bei α4ß7 und 22% bei ACEA zu beobachten. Letzte- rer ist signifikant. Für Th1, Th2 und Treg sind keine nennenswerten Unterschie- de festgestellt worden, die Grafiken zu diesen Zellen sind im Anhang ab S. 127 zu finden.

Abbildung 29: Es sind die prozentualen Anteile der Th17 an CD4+ T-Helferzellen abgebildet, links die des Colons und rechts des Dünndarms. Im Colon steigt der Anteil von 8% auf ca. 15% bei den beiden Behandlungsgruppen. Im Dünndarm ist ebenfalls ein Anstieg bei den Behandlungsgruppen festzustellen. Von 8% bei der Kontrolle zu 17% bei a4b7 und signifikant zu 22% bei ACEA.

- 64 - 5.3.4 Knochendichte im µCT Dargestellt in der Abbildung 30 ist das Knochenvolumen, bezogen auf das gan- ze Volumen der Messung (BV/TV). Je größer das Knochenvolumen desto dichter ist der Knochen. Grundsätzlich sind die Kortikalis als äußere Schicht das dichtere Gewebe und die Trabekel, die auch das Knochenmark bzw. -fett be- herbergen, das lockere Kompartiment des Knochens. Dies wird deutlich, wenn man die Werte innerhalb einer Gruppe vergleicht, z.B. die Kontrolle in der Korti- kalis 0,83 BV/TV und in den Trabekeln 0,12 BV/TV. Vergleicht man nun die Gruppen sieht man, dass die behandelten Gruppen in der Kortikalis eine signifikant erhöhte Knochendichte haben, während im inneren Knochen nur geringe Unterschiede festzustellen sind. Die ebenfalls gemessene Anzahl, Dicke und Abstand der Trabekel ist in allen 3 Gruppen innerhalb eines engen Rahmens, sodass keine signifikanten Unterschiede festzustellen sind.

Abbildung 30: Dargestellt sind links das kortikale und rechts das trabekuläre Knochen- volumen (BV) bezogen das totale Volumen (TV). In der Kortikalis ist das Knochenvo- lumen in der erkrankten Kontrolle im Vergleich zu den Behandlungsgruppen signifikant erniedrigt. Die Kontrolle hat ø 82,5%, die ACEA-Gruppe ø 91% und die a4b7-Gruppe 89% Knochenvolumen. Auf der Trabekelebene ist das gegen das Knochenvolumen der Kontrolle leicht vermehrt. Kontrolle ø 11,5%, ACEA ø 10% und a4v7 ø 9%.

Wenn man die weiteren Daten zur trabekulären Ebene betrachtet (Abbildung 31, S. 66) sieht man ebenfalls leichte Unterschiede, die allerdings zusammen- führend betrachtet keine signifikanten Unterschiede aufweisen. So wird ein ver- größerter Abstand zwischen den Trabekeln mit einer verringerten Anzahl pro µm begleitet; dafür steigt die Dicke der Trabekel. Es handelt sich nicht um eine eindeutige Strukturveränderung des Knochens.

- 65 -

Abbildung 31: Links ist die Trabekelanzahl, in der Mitte der Trabekelabstand und rechts die Trabekeldicke abgebildet. Die µCT-Daten sind aus Tibien gewonnen worden. Signi- fikante Unterschiede zwischen Kontroll-, ACEA- und a4b7-Gruppe sind nicht festzustellen. Die Kontrolle weist im Vergleich eine leicht erhöhte Anzahl an Trabekeln/mm auf, während der Abstand und die Dicke der Trabekel in µm etwas verringert sind.

5.3.5 Zonulin ELISA

Abbildung 32: Dargestellt ist die Zonulin-Serumkonzentration von erkrankter Kontrolle und den beiden Behandlungsgruppen ACEA und a4b7 an Tag 50. Beide Be- handlungen führen zu einer signifikanten Senkung im Vergleich zur Kontrolle um ca. 1/3.

Beim durchgeführten Zonulin-ELISA sieht man die Auswirkungen der Behand- lungen deutlich. Die durchschnittliche Zonulin-Serumkonzentration sinkt von 95 ng/ml der Kontrollgruppe auf 65 ng/ml bei ACEA- bzw. 60 ng/ml bei α4ß7- Behandlung (Abbildung 32). Wenn man die behandelten Gruppen vergleicht mit der gesunden Population (50 ng/ml) aus den CIA-Verlaufsstudien (vgl. Abbil- dung 21, S. 60) liegt der Zonulinwert der behandelten Gruppen nur leicht oberhalb der gesunden Mauspopulation.

- 66 - 5.4 Larazotide Dieser Experimentenaufbau besteht aus 2 Gruppen. Beide Gruppen wurden am gleichen Tag nach dem CIA-Modell immunisiert. Die Larazotidebehandlung einer Gruppe wurde von Tag 19-29 durchgeführt. Im Folgenden werden reprä- sentative Daten aus einem Durchlauf gezeigt. Der Versuch ist zweimal mit n=5 durchgeführt worden.

5.4.1 Behandlungserfolg anhand von Score und Gewicht Die Behandlung mit Larazotide führt besonders zu Beginn der Entwicklung der Arthritis zu einer Verbesserung des Scores. Von Tag 28 bis Tag 37 ist ein Un- terschied des Arthritisscores um bis zu 4 Punkten festzustellen, wie in der Ab- bildung 33 zu sehen ist. In diesem Zeitraum sind die Unterschiede stark signifikant. Danach nähern sich die Scorekurven wieder an, um ab Tag 44 nahezu parallel zu verlaufen. Dabei erreicht die behandelte Gruppe deutlich später und abgeschwächt den Höhepunkt der Symptomatik.

Abbildung 33: Links ist der Arthritisscore der beiden Gruppen im Zeitverlauf dargestellt und rechts der Gewichtsverlauf. Mit Beginn der aktiven Erkrankungsphase an Tag 28 ist der Score der Kontrollgruppe signifikant höher als bei der Larazotidegruppe. Der Unterschied von 3 bis 4 Punkten hält bis zu Tag 37 an. Ab dort gleichen sich die Scorekurven wieder an. Beim Gewicht ist die Larazotidegruppe bis Tag 40 ø 2 g schwerer, ab diesem Tag verlaufen die Kurven parallel.

Ebenfalls in der Abbildung 33 ist das Gewicht der Gruppen abgebildet. Dort sieht man, dass die Larazotidegruppe bis Tag 40, an welchem sich auch die Scorekurven sich wieder annähern, ein durchschnittlich um 2 g höheres Ge- wicht als die Kontrollgruppe aufweisen. Ab dort verlaufen die Gewichtskurven auf einem Niveau.

- 67 - 5.4.2 Längenmessung Wie in Abbildung 34 dargestellt, ist der Colon bei der Kontrollgruppe im Ver- gleich zur behandelten Gruppe um durchschnittlich 1,5cm kürzer. Dies ist ein signifikanter Unterschied. Beim Dünndarm ist kein Unterschied festzustellen.

Abbildung 34: Links ist die Länge des Colons und rechts die Länge des Dünn- darms in cm abgebildet. Bei Colon ist eine signifikante Verkürzung um durchschnittlich 1,5cm vorhanden. Längenunterschiede im Dünndarm sind nicht festzustellen.

5.4.3 FACS Entsprechend der Färbungen aus den vorherigen Versuchen, wurde das Au- genmerk wieder auf die B- und T-Zellen gelegt. Die Ergebnisse im Folgenden präsentiert

Abbildung 35: Links sind die Daten zum Colon und rechts zum Dünndarm. In beiden Ab-schnitten und in beiden Gruppen liegt der B-Zellanteil bei ca. ø 5% aller lebenden Zellen.

- 68 - Wie man in der Abbildung 35 (S. 68) sieht, bleibt der Anteil der B-Zellen in beiden Gruppen um ø 5% aller lebenden Zellen. Die Behandlung hat nicht zu Un- terschieden bei den B-Zellen geführt.

In der folgenden Abbildung 36, die die weitere Unterscheidung der T-Zellen in zytotoxische T-Zellen und T-Helferzellen darstellt, sieht man, dass der T- Helferzellanteil (CD4+) wie bei den vorherigen Versuchen um ein vielfaches größer ist als der Anteil der zytotoxischen T-Zellen (CD8+). Zwischen den Ver- suchsgruppen gibt es keine signifikanten Unterschiede. Man kann lediglich eine Tendenz feststellen, dass die Larazotidegruppe etwas mehr CD8+ Zellen im Darm hat. Die T-Helferzellen treten bei der Kontrolle im Colon etwas vermehrt und im Dünndarm etwas verringert im Vergleich zur Larazotidegruppe auf. Sig- nifikanzen entstehen dabei keine.

Abbildung 36: Dargestellt sind die Daten oben zu den T- Helferzellen (CD4+) und unten zu den zytotoxischen T-Zellen (CD8+) als Anteil der CD3+ Zel- len. Links die Daten zum Colon und rechts zum Dünndarm. Die Dünndarm T-Helferzellen treten im Vergleich bei der Kontrolle im Colon etwas vermehrt und im Dünndarm etwas vermindert auf. Bei den zytotoxischen T-Zellen ist eine leichte Tendenz zu einer Vermehrung bei der Larazotidegruppe.

Schlüsselt man die T-Helferzellen weiter in die Subpopulationen Th1, Th2, Th17 und Treg auf, sind in der Abbildung 37 und der Abbildung 38 (S. 70) nur margi- nale Unterschiede für den Anteil von Th1, Th17 und Treg an den T-Helferzellen zwischen Behandlung und Kontrolle zu beobachten. Für die Th1 ist im Dünn- darm eine leichte Verminderung festzustellen, während im Colon eine durchschnittliche Steigerung um 2% auffällt. Allerdings ist aufgrund der großen Streuung der Daten nicht von einer klaren Tendenz auszugehen.

- 69 - Abbildung 37: Dargestellt sind die Th1-Anteile an T-Helferzellen für links Colon und rechts Dünn- darm. Im Colon ist eine leichte Steigerung und im Dünndarm eine leichte Verminderung in der Larazotidegruppe im Vergleich zur Kontrolle festzustellen.

Die Th17 bilden mit Anteilen um 30% den größten Anteil der T-Helferzellen mit einer leichten Tendenz zur Verringerung bei Behandlung mit Larazotide. Bei den Treg sind keine Tendenzen zu erkennen.

Abbildung 38: Dargestellt sind oben die Anteile von den Th17 und unten von den Treg an den CD4+ T-Helferzellen. Links sind die Daten zum Colon und rechts zum Dünndarm abgebildet. Für die Th17 gibt es die leichte Ten- denz der Verringerung unter The- rapie. Bei den Treg ist kein Unter- schied festzustellen.

Signifikante Unterschiede sind nur bei den Th2 festzustellen (Abbildung 39, S.71). Die Behandlung scheint hier zu einem deutlichen Anstieg des Th2- Anteils im Darm zu führen. Bei der erkrankten Kontrolle ist der Anteil bei ø 2,5% in beiden Darmabschnitten. Nach Larazotidetherapie steigert sich der Anteil ø 9% im Colon und ø 7,5% im Dünndarm.

- 70 - Abbildung 39: Zu sehen ist der Anteil der Th2 an CD4+ T- Helferzellen links im Colon und rechts im Dünndarm. Es gibt eine signifikante Vermehrung der Th2 unter Behandlung mit Larazotide.

5.4.4 Knochendichte im µCT In den gewonnenen Daten wird der prozentuale Anteil von Knochen bezogen auf das Gesamtvolumen (BV/TV) der Probe errechnet. Es handelt sich dabei um einen im Kapitel 4.10 (S. 39) beschriebenen, fest definierten Bereich der Tibien, sodass ein Vergleich zwischen erkrankter Kontrolle und Larazotidegrup- pe objektiv möglich ist.

Abbildung 40: Links ist der prozentuale Anteil an Knochen bezogen auf das Gesamtvo- lumen der analysierten Tibien aufgetragen. Das Knochenvolumen ist bei der behandelten Gruppe signifikant erhöht. Auf der rechten Seite sind exemplarisch zwei errechnete 3D-Knochenrekonstruktionen des µCT zu sehen. Dabei wirkt die Rekonstruktion der behandelten Maus deutlich dichter als das der Erkrankten.

In der Abbildung 40 wird das BV/TV von den beiden Gruppen verglichen und es fällt eine deutliche Steigerung der prozentualen Knochenmenge in der Behand- lungsgruppe auf. Es gibt eine durchschnittliche Steigerung um ca. 3% Kno- chenvolumen. Zusätzlich sind repräsentative 3D-Rekonstruktionen des µCTs von je einer Maus aus jeder Gruppe dargestellt. Ein deutlicher Unterschied der

- 71 - Dichte ist auf diesen Bildern bereits ohne grafische Darstellung erkennbar und damit passend zu den errechneten Ergebnissen.

5.4.5 Osteomeasure Zunächst werden die Daten der Tibia gezeigt. Die Abbildung 41 zeigt das Kno- chenvolumen (BV) im Vergleich zu Gesamtvolumen (TV) des vermessenen Gebiets. Wenn man die Werte mit denen aus dem µCT vergleicht, sieht man, dass die Werte sich in einem ähnlichen Bereich bewegen und somit jeweils das andere Verfahren validieren. Ebenfalls sieht man, dass das Knochenvolumen in der Larazotidegruppe in der Tibia einen um 2,5% und damit signifikant größeren Anteil bildet als in der Kontrollgruppe.

Abbildung 41: Zu sehen ist das Knochenvolumen in Bezug auf das Gesamtvolumen im Analysebereich der Tibia. Dabei ist ein signifikanter Unterschied in der Trabekelebene von ø 11% Knochenanteil bei Kontrolle auf ø 13,5% bei Larazotide festgestellt worden. Durch die Therapie scheint der Knochen- anteil gestiegen.

Wenn man die Osteoklastenmessungen in der Abbildung 42 betrachtet, fällt auf, dass die Anzahl der Osteoklasten bei der Larazotidebehandlung verringert ist trotz eines leicht größeren Verhältnis von Osteoklastenkontaktfläche (Oc.S) zur Knochenoberfläche (BS). Folglich sind die Osteoklasten der Larazotidegruppe größer als die der Kontrollgruppe.

- 72 - Abbildung 42: Links ist die Anzahl der Osteoklasten und rechts die Osteoklastenkno- chenkontaktfläche (Oc.S) im Bezug zur Knochenoberfläche (BS) dargestellt. Trotz der leicht verringerten Anzahl der Osteoklasten bei der Larazotidegruppe in der Analyse- fläche, ist dort ein etwas vergrößertes Osteoklastenkontaktfläche/Knochenoberfläche- Verhältnis festzustellen.

Schaut man sich die Trabekelstruktur genauer an, ist die Tendenz einer dichte- ren Trabekelstruktur, passend zu den Knochendichtedaten, bei der Larazotide- gruppe zu sehen. In Abbildung 43 wird besonders bei der Trabekeldicke der Anstieg des Knochenvolumens deutlich; die Dicke steigt um durchschnittlich 3µm. Die leicht steigende Trabekelnummer und der leicht sinkende Abstand sind ebenfalls Parameter, die in diese Richtung weisen.

Abbildung 43: Links ist die signifikante Steigerung der Trabekeldicke von der Larazoti- de- zur Kontrollgruppe dargestellt. In der Mitte die leicht vermehrte Trabekelanzahl/mm der Therapiegruppe. Rechts der verringerte Trabekelabstand bei Larazotide.

Betrachtet man im Folgenden die Pfote, finden sich diese Daten nicht bestätigt. Beim Knochenvolumen ist sogar ein gegensätzliches Ergebnis feststellbar. Die Knochendichte (BV/TV) der Pfoten ist bei der behandelten Gruppe mit durchschnittlich 10% signifikant geringer als die der Kontrolle (Abbildung 44, S. 74).

- 73 - Hierbei lassen sich die Daten nicht mit dem µCT vergleichen, da dort lediglich die Tibia betrachtet wurde.

Abbildung 44: Die Grafik zeigt das Knochenvo- lumen im Verhältnis zum Gesamtvolumen in der Pfote. Dabei ist eine signifikante Knochenreduk- tion in der Larazotidegruppe um einen ca. 10%- igen Anteil festzustellen.

Die knochenresorbierenden Osteoklasten, dargestellt in der Abbildung 45 sind vermehrt bei der Larazotidegruppe im Vergleich zur Kontrolle anzutreffen. Die Osteoklastenknochenkontaktfläche bezogen auf die Knochenoberfläche (Oc.S/BS) ist bei der Larazotidegruppe ebenfalls größer. Beides sind Parame- ter, die einen Hinweis auf den Knochensubstanzverlust geben können.

Abbildung 45: Dargestellt sind Daten der Pfoten: links die Anzahl der Osteoklasten in der analysierten Fläche und rechts das Verhältnis Osteoklastenknochenkontaktfläche zu Knochenoberfläche. Die Larazotide- hat durchschnittlich 50 Osteoklasten mehr pro Analysefläche als die Kontrollgruppe. Passend dazu decken die Osteoklasten bei Larazotide mehr Knochenöberfläche ab. Signifikante Unterschiede sind allerdings nicht festzustellen.

Bei der Betrachtung der Trabekelstruktur sind durch den erhöhten Trabekelab- stand bei verringerter Dichte im Vergleich von Larazotide mit der Kontrolle Zei- chen des Knochenschwundes zu beobachten. Die Trabekelanzahl/mm ist dagegen nicht reduziert. Die beschriebenen Daten sind in der Abbildung 46 (S. 75) zu sehen.

- 74 -

Abbildung 46: Alle drei Grafiken zeigen Daten der analysierten Pfoten. Links ist die Anzahl der Trabekel/mm, in der Mitte der Abstand der Trabkel in µm und rechts die Dicke der Trabekel dargestellt. Die Anzahl der Trabekel pro mm unterscheidet sich nicht in Kontroll- und Larazotidegruppe. Der Trabekelbstand ist bei der Behandlung mit Larazotide erhöht und zusätzlich die Trabekeldicke vermindert.

Zusätzlich wurden bei den Pfoten die Erosionsflächen an den Knochen (ES/BS) durch die Arthritis sowie die Fibrosierung von vorher zerstörtem Gewebe (Fb.V/TV) gemessen. Wie die Abbildung 47 deutlich macht, sind dort keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen festzustellen.

Abbildung 47: Links ist die Erosionsfläche (ES) im Verhältnis zu Knochenoberfläche (BS) dargestellt, rechts ist fibrosierte Fläche (Fb.V) im Verhältnis zur Gesamtfläche (TV) der analysierten Pfote gesetzt worden. In beiden Grafiken sind keine deutlichen Unterschiede zwischen der Kontroll- und Larazotidegruppe festzustellen.

5.4.5 Zonulin ELISA Der Zonulin-ELISA liefert bei der Behandlung mit Larazotide ähnliche Ergebnis- se wie schon bei der Behandlung mit ACEA und α4ß7. Die Abbildung 48 (S. 76) zeigt, dass die unbehandelte, erkrankte Kontrollgruppe eine im Vergleich zur gesunden Population aus 4.1.6 auf eine ø 90 ng/ml erhöhte Konzentration auf- weist. Die Kontrollgruppe ist dabei um die Werte aus der Kontrollgruppe aus dem ACEA/α4ß7-Versuchsaufbau erweitert worden. Die behandelte Gruppe

- 75 - liegt mit einem mittleren Wert von 55 ng/ml im Bereich der 50 ng/ml der gesunden Population.

Abbildung 48: Zu sehen ist der signifikante Un- terschied von ø 90 ng/ml der Kontrollgruppe zu den ø 55 ng/ml der Larazotide- Behandlungsgruppe bei der Zonulin- Serumkonzentration an Tag 50.

5.5 Zonulin Humanstudie In den humanen Daten gibt es ebenfalls Unterschiede in der Zonulin- Serumkonzentration. So zeigt Abbildung 49 den Vergleich der drei Gruppen Kontrolle, RA und Prä-RA. Bei der Kontrollgruppe sind nahezu keine Werte über 10 ng/ml Serum festzustellen, während bei der RA-Gruppe die Vielzahl über diesem Wert liegt. So gibt es insgesamt einen deutlich signifikanten Unter- schied zwischen diesen beiden Gruppen; mit Spitzenwerten über 150 ng/ml Serum.

Abbildung 49: Abgebildet sind auf der linken Seite der signifikante Unterschied der systemischen Zonulinlevel von Gesunden zu RA-Erkrankten sowie auf der rechten Seite der Unterschied zwischen Kontrollgruppe und der Prä-RA-Gruppe. Vgl. (Tajik et. al., 2020)

- 76 - Ein etwas weniger deutlicher Unterschied besteht ebenfalls zwischen Kontrolle und Prä-RA. Wie in Abbildung 50 zu sehen sind hier ebenfalls viele der Pro- banden unterhalb eines Zonulin-Serumkonzentration von unter 10 ng/ml wie bei den Kontrollen. Allerdings sind mehrere Werte deutlich erhöht mit Werten über 50 ng/ml Serum, sodass insgesamt weiterhin eine signifikante Erhöhung besteht.

Abbildung 50: Dargestellt sind Daten der Prä-RA-Gruppe. Auf der linken Seite werden die Zonulinserumlevel von inzwischen Erkrankten und weiterhin gesunden Patienten verglichen. Dabei ist eine signifikante Erhöhung der Werte bei Erkrankten zu sehen. Rechts wird eine Kaplan-Meier-Kurve für alle Prä-RA gezeigt, aufgeteilt in Zonulinwer- te über und unter 10ng/ml Serum über einen Zeitraum von 12 Monaten nach der Pro- beentnahme. Hierbei erkranken mehr Patienten mit höheren Zonulinwerten. Vgl. (Tajik et. al., 2020)

Da einige der Prä-RA-Probanden in einem Zeitraum von 12 Monaten bereits die EULAR-Kriterien der RA erfüllt haben, konnte diese Gruppe in einem Zeitverlauf untersucht werden. Dabei fiel eine signifikante Erhöhung der Zonulinwerte der Neuerkrankten, wie in Abbildung 50 dargestellt, im Vergleich zu den weiterhin gesunden Probanden auf. Bei Unterteilung der Prä-RA-Gruppe in Zonulin- Serumkonzentration über und unter 10 ng/ml zeigt sich, dass vermehrt Perso- nen mit Werten über 10 ng/ml erkranken. So sind nach 12 Monaten etwa 40% der Personen mit erhöhten Werten erkrankten im Gegensatz zu 10% mit Wer- ten unterhalb von 10 ng/ml. Zusätzlich erkrankten die Personen mit erhöhten Werten innerhalb von 6 Monaten, während die anderen erst nach 9 Monaten erkrankten.

- 77 - 6. Diskussion

6.1 Verlaufsstudie der CIA Für diesen Teil des Projekts ist zunächst festzustellen, dass die CIA, wie erwar- tet, wiederholt zu einem gleichmäßigen chronischen Verlauf geführt hat. Da die CIA als sehr gutes Modell zur Erforschung der RA bekannt ist, ist es möglich die Ergebnisse aufgrund der erfolgreichen CIA auf die RA zu beziehen (Holmdahl et al., 1989).

Dass sich etwas im Darm verändert, wird schon bei der Messung des Darms deutlich. Durch das frühe Untersuchen der Kontrollgruppe an Tag 27 ist die Messung besonders im Vergleich mit den Tagen 25 und 30 zu betrachten, da an diesen das Alter der Mäuse nahezu identisch ist und damit auch das Grö- ßenwachstum und die Darmlänge vergleichbar sind. Die Verkürzung des Darms – bei Dünndarm und Colon je 2 cm – ist ein Zeichen von Darmentzündung bzw. immunologischer Prozesse im Darm (Emge et al., 2016; Verma et al., 2014).

Eindeutige histologische Strukturveränderungen wie Epitheldegeneration, mas- sive Neutrophileninfiltration und Nekrosen bei chronisch-entzündlichen Darmer- krankungen (Perse et al., 2012) sind nicht auffindbar. Daher lässt sich festhalten, dass es bei der CIA keine regelhafte, schwere Inflammation im Darm gibt. Allerdings lässt sich eine leichtvermehrte Neutrophileninfiltration in der Immuno- fluoreszenz nachweisen. Dies ist ein Hinweis auf erhöhte Immunaktivität im in- terstitiellen Darmgewebe, da Neutrophile eine entscheidende Rolle bei der Ab- wehr von Mikroben im Interstitium inne haben (Amulic et al., 2012). Bei RA- Patienten konnte eine Inflammation gezeigt werden (Tajik et al., 2020). Jedoch ist eine regelhafte, schwere Darmentzündung bisher nur für RA-Patienten mit der Komorbidität einer CED beschrieben worden (Bae et al., 2017; Young et al., 2007).

Ebenfalls kann eine deutlich verringerte Becherzellanzahl im Colon histologisch festgestellt werden. Becherzellen sind die Zellen, die die Mukusschicht im Darm bilden, welche einen mechanischen Schutzwall gegenüber den Darmbakterien mit integrierten Abwehrmolekülen, den Defensinen, darstellt (Johansson et al., 2013). Zusätzlich transportieren Becherzellen mit sogenannten becherzellasso-

- 78 - ziierten Antigenpassagen kontrolliert luminale Antigene in die Lamina propria (McDole et al., 2012). Ein Verlust dieser Passagen führt – passend zur Immu- nofluoreszenzdarstellung – zur Infiltration der Lamina propria mit Neutrophilen (Knoop et al., 2015).

Damit die Antigene unkontrolliert in die Lamina propria und dem Immunsystem in Kontakt gelangen, muss sich die Darmdurchlässigkeit erhöhen. Ein intaktes Epithel bildet eine physikalische Barriere gegenüber dem Darmlumen und dessen Mikroben (Koch et al., 2012). Erhöhte Durchlässigkeit führt bewiesenerma- ßen zu einem vermehrten Kontakt mit bakteriellen Antigenen (Sheppard et al., 2005). Die Messungen vom FITC-Dextran, deren Daten auf eine erhöhte Per- meabilität im Verlauf der RA hinweisen, zusammen mit dem histologischen Be- fund der Becherzellen und dem vermehrten Einwandern von Neutrophilen, füh- ren zu der Annahme, dass sich die Darmstruktur in Hinsicht auf die Permeabili- tät bei der CIA verändert hat. Um diese Annahme zu bestärken, sind eine qRT- PCR auf die Gene der Strukturproteine der Barriere des Darmepithels sowie eine Zonulinanalyse im Serum durchgeführt worden. Die Kurve der Zonulin- Serumkonzentration verläuft dabei ähnlich wie die Kurve der Krankheitsaktivität der CIA; nur zeitlich etwas vorgezogen. So ist die Konzentration schon vor sichtbarer Krankheitsaktivität erhöht. Da Zonulin die Permeabilität der TJ zwischen den Darmzellen erhöht (Vanuytsel et al., 2013), kann man die erhöhte Konzentration ebenfalls als indirekten Parameter der erhöhten Darmpermeabili- tät werten.

Die in der qRT-PCR gewonnenen Daten deuten ebenfalls auf eine erhöhte Darmpermeabilität hin. So scheint die Expression von Occludin in der ersten Krankheitsphase bis zum Gipfel der Erkrankung reduziert zu sein. Eine verminderte Expression verschlechtert die Barrierefunktion des Darms (T. Yu et al., 2016). Die vermehrte Expression von Claudin 2 wird als Mediator einer erhöh- ten Darmpermeabilität bei CED und anderen intestinalen Inflammationen gesehen (Luettig et al., 2015). Eine Entzündung wiederum führt zu vermehrter Clau- din 2-Expression (Garcia-Hernandez et al., 2017). Da Claudin 2 bei der Poren- bildung zum parazellulären Transport von Kationen eine entscheidende Rolle spielt (Amasheh et al., 2002), ist es im Dünndarm von vornherein vermehrt ex-

- 79 - primiert als im Vergleich zum Colon (Lameris et al., 2013). Makromoleküle gelangen zwar nicht durch diesen Transporter (A. S. Yu et al., 2009), trotzdem scheint eine übermäßige Expression von Claudin 2 indirekt Lücken in der Darmbarriere zu verursachen, sodass Makromoleküle in die Lamina propria gelangen können (Luettig et al., 2015).

Die Zellkultur des Darms zeigt beim IL-6 eine vermehrte Produktion im Colon – für den Dünndarm lässt sich dies aufgrund der geringen Konzentrationen nicht sicher sagen. Da IL-6 die Expression des Claudin 2-Gens erhöht (Al-Sadi et al., 2014), ist dies ein Hinweis auf einen Mechanismus, der zu erhöhter Darmper- meabilität führt.

Als Zwischenfazit lässt sich somit festhalten, dass der Darm im Zuge einer CIA eine erhöhte Permeabilität hat. Allerdings stellt sich weiterhin die Frage, ob sich das Immunsystem des Darms während einer CIA verändert. Immerhin stellt der Darm das größte Kompartiment des Immunsystems dar (Mowat et al., 2014).

Bei der RA spielen bekanntermaßen T-Zellen eine große Rolle (Firestein, 2003; McInnes et al., 2011). Besonders die Th17, die – wie schon vorher beschrieben – Schlüsselzellen in der Entwicklung von Autoimmunerkrankungen sind (Bedoya et al., 2013), treten deutlich vermehrt auf. Dabei korrelieren die Th17- Vermehrung im Darm und der Krankheitsscore miteinander, wie auch schon für Blut und Synovialflüssigkeit in der Literatur beschrieben (Penatti et al., 2017). Dabei scheint es nach einer anfänglichen Th1-Aktivierung schnell zu einer Ver- schiebung Richtung Th17 zu kommen. In Studien wird gezeigt, dass die Th1 zu Beginn der RA im Blut einen deutlich verringerten Anteil bilden, und in Folge dessen wird davon ausgegangen, dass die Zellen zu Beginn in die betroffenen Gelenke migrieren (Dolhain et al., 1996; Mangge et al., 1999). Da es sich beim hier untersuchten Material ebenfalls um Gewebe handelt, scheinen die Th1 zu Beginn auch im intestinalen, extravasalen Immunsystem vermehrt aufzutau- chen. Zusätzlich gibt es Hinweise darauf, dass die Th1 die erste inflammatorische Reaktion im Gelenk entscheidend mittragen, während die Th17 für die Chronifizierung eine entscheidende Rolle spielen (Tuncel et al., 2017). Es ist demnach festzuhalten, dass sich die Th1 und Th17 im Darmimmunsystem wie

- 80 - bei der RA verhalten oder ggf. sogar noch vor den Veränderungen im Gelenk sich verändern.

Eine weitere beobachtete Veränderung im Darmimmunsystem ist der Th2-Anteil der T-Helferzellen. Die Verhältnisverschiebung von Th2 zugunsten von Th1 spielt vor allem zu Beginn der Arthritis eine Rolle (Dolhain et al., 1996); folglich schützt ein vermehrtes Auftreten von Th2 vor Arthritis (Z. Chen et al., 2016). Kurz vor der Symptomverbesserung in der CIA sind vermehrt Th2 im Darm zu finden, sodass ein Zusammenhang zwischen Th2-Vermehrung und Symptom- verbesserung zu vermuten ist.

Die Treg spielen als Regulatoren von CD4+- und CD8+-Zellen zu Gunsten eines anti-autoinflammatorischen T-Zellprofils, eine wichtige Rolle bei der Heilung bzw. Remission von RA (Cooles et al., 2013). So steigt unter Behandlung, u. a. mit Anti-TNFα, die Anzahl der Tregs (Komatsu & Takayanagi, 2015). Interes- santerweise steigert sich in der Verlaufsstudie ebenfalls die Anzahl der Tregs im Darmimmunsystem kurz vor Symptomverbesserung.

Es lässt sich zusammenfassen, dass das Darmimmunsystem ein eventuell vor- geschaltetes Abbild der peripheren und synovialen T-Zellverteilung bei der RA zu sein scheint.

Für B-Zellen, obwohl sie u. a. als antikörperproduzierende Zellen, einen wichti- gen Mechanismus der RA bilden (Bugatti et al., 2014), lässt sich kein klares Verhaltensprofil im Darm während einer Arthritis feststellen. Tendenziell scheinen sie sich während der Erkrankung vermindert im Darmgewebe aufzuhalten. Daher ist es unwahrscheinlich, dass der Darm Hauptproduktionsort der autoimmunen Antikörper ist.

Über die Rolle der zytotoxischen T-Zellen in der RA ist bisher wenig bekannt, obwohl es den Hinweis auf eine gestörte CD8-Homöostase gibt (Petrelli & van Wijk, 2016). Im Darm lässt sich kein Hinweis auf ein gestörtes Gleichgewicht während der Experimente feststellen.

Wie zuvor beschrieben, spielen die ebenfalls in der qRT-PCR analysierten Ge- ne PAD 2 und PAD 4 eine Rolle bei der Zitrullinierung von Proteinen und sind im Gelenk bei RA vermehrt exprimiert (Foulquier et al., 2007). In den häufigen

- 81 - extraartikulären Manifestationen dermaler Rheumaknoten und Paradontaler- krankung sind PAD 2 und PAD 4 ebenfalls vermehrt exprimiert (de Pablo et al., 2008; Turunen et al., 2016). Bei der Gingivitis, einer Erscheinung der Paradon- talerkrankung, hängt die vermehrte Expression mit der Schwere der Inflammati- on zusammen (Harvey et al., 2013). ACPA sind Auto-Antikörper, die sich gegen die von PAD 2 und PAD 4 zitrullinierten Proteine richten und eine wichtige Rolle in der Pathogenese von RA spielen (England et al., 2017). Nachdem PAD 2 und PAD 4 im Darm ebenfalls vermehrt exprimiert zu sein scheinen, ist die Möglichkeit gegeben, dass die Zitrullinierung von Proteinen ein Mechanismus im Darm ist, der zu Veränderungen in der Epithelstruktur und im Immunsystem führt. Die Enyzme PAD 2 und PAD 4 sind im Darm vor allem zu Beginn der Arthritis deutlich erhöht. Für PAD 4 konnte bereits eine anfängliche Erhöhung der Expression im Gelenk beschrieben werden (Xu et al., 2014). Die vermehrte Expression spielt daher bei der Krankheitsentstehung eine Rolle, was ein weiterer Hinweis darauf sein könnte, dass die RA im Darm ihren Ursprung hat.

Bisher fehlt das endgültige Verständnis für den Entstehungsort der RA im Kör- per und die zeitlichen Zusammenhänge bis zur Manifestation der Arthritis. Wie in der Einleitung beschrieben, weist vieles darauf hin, dass der Darm der Ent- stehungsort der Autoimmunität ist (Fasano, 2012; Michielan & D'Inca, 2015).Die Verlaufsstudien der CIA unterstützen diese Theorie. Wenn man alle Ergebnisse zusammenführt, lässt sich festhalten, dass der Darm durchlässiger wird. Damit findet eine vermehrte Antigenexposition in der Lamina propria statt (McGough, 2011). Dies wiederum könnte der Trigger von Kreuzreaktionen des Immunsys- tems sein.

6.2 Butyrate, ACEA, α4ß7-Antikörper 6.2.1 Butyrate Butyrate ist eine kurzkettige Fettsäure (SCFA) die vom Mikrobiom im Darm produziert wird (Tan et al., 2014) und einen positiven Einfluss auf eine durch Lipo- polysaccharide ausgelöste Inflammation hat (F. Wang et al., 2017). Die Arbeits- gruppe befasste sich mit einem großen Projekt zur Wirkung von SCFA bei RA und hat dabei besonders für Butyrate eine positive Wirkung bei Supplementati- on von SCFA festgestellt (Lucas et al., 2018). Da Butyrate die Translokation

- 82 - von Bakterien durch metabolisch-gestresstes Darmepithel verringert (Lewis et al., 2010), wurde innerhalb dieser Arbeit bestätigt, dass die Permeabilität im Darm bei der Behandlung von RA sinkt. Dies ist damit ein weiterer Wirkmecha- nismus des Butyrates.

6.2.2. ACEA ACEA scheint ebenfalls positiven Einfluss auf die Arthritis bei der CIA zu haben. Score, Gewicht und auch kortikales Knochenvolumen verbessern sich unter der Therapie. Während das Scoring trotz des anerkannten Prinzips eine subjektive Betrachtung ist, bietet die Knochendichtemessung durch das µCT einen guten, objektiven Langzeitparameter für einen Behandlungserfolg innerhalb der CIA (Barck et al., 2004). Eine chronische Entzündung führt zu vermehrtem Kno- chenverlust und erhöhter Frakturrate (Redlich et al., 2012; Straub et al., 2015). Dabei ist der veränderte kortikale Knochenaufbau für die erhöhte Frakturrate von entscheidender Bedeutung (Ohlsson et al., 2017). Genau der kortikale Knochenaufbau, gemessen durch die Knochendichte, ist in dieser Studie mit ACEA deutlich verbessert und zeigt damit auf objektive Weise die Verbesse- rung durch die Behandlung. Ebenfalls ein Zeichen der erfolgreichen Therapie ist die Gewichtszunahme der Behandlungsgruppe im Vergleich zur erkrankten Kontrolle. Gewichtsunterschiede können als Therapieerfolge gewertet werden aufgrund des Zusammenhangs von Gewichtsverlust und schwerer Erkrankung sowie der FELASA-Richtlinie, bei der ein Gewichtsverlust von mehr als 20% des Körpergewichts ein Abbruchkriterium in Tierversuchen sein muss (Jerchow, 2017).

In diesem Fall lässt sich die Wirkung von ACEA am ehesten durch den Ago- nismus am CB1 erklären (Pertwee, 1999). Wie in Kapitel 2.6 (S. 17) bereits beschrieben, führt dieser Agonismus zu Verbesserung der Darmpermeabilität und verhindert Entzündung im Darm. Jedoch können Endocannabionide über den CB1 auch die Permeabilität bei apikaler Applikation auf die Membran steigern, während sie bei basolateraler Applikation die Permeabilität senken (Alhamoruni et al., 2010). Da über das Zonulin-Serumlevel ein indirekter Permeabilitätsmar- ker zurück gegangen ist, scheint es wahrscheinlich, dass ACEA aufgenommen wurde und über die Blutbahn gewirkt hat.

- 83 - ACEA wurde bisher fast ausschließlich für neurologische Erkrankungen wie Tinnitus und Epilepsie im Tiermodell verwendet (Andres-Mach et al., 2017; Berger et al., 2017; Luszczki et al., 2017). Es lässt sich vermuten, dass aufgrund der zuvor ausgeführten Wirkung am CB1, durch eine Verringerung der Darmpermeabilität zusammen mit einer allgemein anti-inflammatorischen Kom- ponente, weniger autoreaktive Immunzellen entstanden und dadurch die Ge- lenkentzündung verbessert wurde. Eine Behandlung von CED mit Cannabinoi- den ist bereits in Studien als wirksame Unterstützungstherapie anerkannt worden (Naftali et al., 2013; Naftali et al., 2014). Aus diesem Grund könnte ACEA als Cannabionid auch ein unterstützender Therapieansatz bei der RA sein. Al- lerdings ist aufgrund der einmaligen Durchführung dieses Experiments die Si- cherheit der Ergebnisse eingeschränkt und bedarf weiterer Untersuchungen. Noch aussagekräftigere Ergebnisse könnten durch die zusätzliche Untersu- chung des Effekts auf das Immunsystem während der Behandlungsphase erzielt werden. Wenn in dieser Konstellation erneut positive Behandlungsergeb- nisse erzielt werden können, ist die ACEA-Behandlung eine vielversprechende Therapie. Der entscheidende Wirkmechanismus müsste unter diesen Umstän- den detaillierter evaluiert werden.

6.2.3 α4ß7-Antikörper Beim Behandlungsversuch mit einem α4ß7-Antikörper ist überraschenderweise eine deutliche Verbesserung des Arthritisverlaufs aufgetreten, denn bei der Be- handlung von CED mit Vedolizumab gibt es widersprüchliche Daten zum Ein- fluss auf extraintestinale Manifestation in Gelenken. So wird einerseits in gro- ßen Studien gezeigt, dass es unter der Behandlung bei Morbus Crohn weniger Arthritis und Arthralgien gibt, während bei der Behandlung von Colitis Ulcerosa keine Veränderungen auftreten (Feagan et al., 2018). Andererseits beschreiben Fallberichte, dass Vedolizumab bei CED zur Verschlimmerung bzw. direkt nach Therapiebeginn zur Entwicklung von Gelenkentzündungen beigetragen hätte (Varkas et al., 2017).

- 84 - Vom Score abgesehen, verändert sich wie beim ACEA die kortikale Knochen- struktur zum Positiven. Ebenfalls gewinnen die behandelten Mäuse während der Erkrankungsphase mehr Gewicht hinzu, als die erkrankten Mäuse. Das ge- stiegene Knochenvolumen zeigt wieder, dass langfristig eine chronische Ent- zündung reduziert worden ist. Das gesteigerte Gewicht ist ebenfalls ein Hinweis darauf, dass es diesen Mäusen im Verhältnis besser als den erkrankten geht. Dass sonst keine Veränderungen aufgetreten sind, bzw. teilweise das T- Zellprofil sogar Richtung Inflammation und damit RA weist, liegt wahrscheinlich an der nur bis zu Tag 35 erfolgten Therapie. Die Behandlung mit Vedolizumab ist bei CED eine Langzeitmedikation bis zum Wirkverlust (Loftus et al., 2017; Vermeire et al., 2017). Daher sollte in Folgeexperimenten eine Therapie bis zum Endpunkt erfolgen, um eindeutigere Ergebnisse zu erhalten.

Zusätzlich ist das Experiment bisher nur einmalig durchgeführt worden, sodass die Gültigkeit der Ergebnisse mit Vorsicht zu betrachten ist. Trotz dessen lassen sich Theorien zur Wirksamkeit des α4ß7-Antikörpers aufstellen, die zur Theorie der Krankheitsgenese der RA und anderer Autoimmunerkrankungen passen. So ist bekannt, dass das α4ß7-Integrin der Homing-Rezeptor für naive und Ge- dächtnis-T-Zellen im Darm ist (M. B. Williams et al., 1997). Die Wirksamkeit des Vedolizumab begründet sich auf Verhinderung von Homing der Immunzellen in den Darm und verhindert damit die Entstehung der lokalen autoimmunen Aktivi- tät (Rosario et al., 2017). So ist in den durchgeführten Verlaufsstudien nachgewiesen worden, dass es bei der RA viele Veränderungen im Darm gibt. Einige davon sind in CED deutlich ausgeprägter zu finden (Galvez, 2014; Michielan & D'Inca, 2015). Nichtsdestotrotz sind viele Veränderungen bei der RA, wie der Th17-Anstieg, in vergleichbarer Richtung zu den Veränderungen bei den CED zu sehen. Die α4ß7-Antikörpertherapie könnte folglich genauso wirken wie bei der CED. Da der Darm als Immunisierungsort, wie in Kapitel 2.3 (S. 9) erläutert, für die autoreaktiven Immunzellen diskutiert wird, könnte das verhinderte Darm- Homing dafür sorgen, dass die Immunzellen nicht mit Darmpathogenen in Kon- takt kommen und erreichen, dass keine Kreuzautoimmunität entsteht. Ein direkter Einfluss auf das Homing ins Gelenk ist nicht möglich, da α4ß7 mit dem MadCAM-1, einem mucosaassoziierten Oberflächenmolekül, interagiert (Wyant

- 85 - et al., 2016) und MadCAM-1 nicht im Gelenk vorkommt (Gen: Madcam1, En- sembl-ID: ENSMUSG00000020310).

Weitere Versuche mit dem α4ß7-Antikörper sollten zukünftig erfolgen, um die Verbesserung der Arthritis evaluieren zu können. Wenn dies der Fall sein sollte, ist die Theorie desselben Wirkmechanismus wie bei den CED zu bestätigen.

6.3 Zonulin und Darmpermeabilität Dass eine aktive RA im Zusammenhang mit einer Steigerung der Zonulin- Serumkonzentration steht, ist sowohl in der CIA-Verlaufsstudie als auch in hu- manem Serum gezeigt worden. Im Mausmodell wird dabei gezeigt, dass Zonu- lin mit der Krankheitsaktivität zusammenhängt und schon vor Veränderungen in der Krankheitsschwere die Tendenz anzeigt. Beim Menschen korreliert eine schwere Erkrankung ebenfalls mit deutlich erhöhten Zonulinwerten.

Zonulin ist dabei ein Molekül, das Darmpermeabilität durch Modulation der Tight Junctions indirekt beeinflusst (Fasano et al., 2000; W. Wang et al., 2000). Es gilt daher als guter Biomarker für intestinale Permeabilität (Sturgeon et al., 2016). Wie vorher schon angeklungen ist, kann aufgrund der Serumwerte des Zonulin, den qRT-PCR-Daten und der FITC-Dextranmessung von erhöhter Darmpermeabilität bei RA gesprochen werden. Die erhöhte Darmdurchlässig- keit bei verschiedenen Autoimmunerkrankungen und der Zusammenhang mit Zonulin-Serumkonzentrationssteigerungen ist bereits beschrieben worden (Fasano, 2011). Wieso Zonulin bei Autoimmunerkrankungen in erhöhter Kon- zentration vorkommt, ist bisher nicht geklärt. Hier könnte allerdings die Schnitt- stelle vom Immunsystem und mit den autoimmunologischen Erkrankungen ver- gesellschafteten Bakterien, wie Prevotella copri für RA (Pianta et al., 2017), liegen.

Die Untersuchungen zeigten, dass darmspezifische Behandlungen bei Mäusen eine Arthritis verbessern können und dass das Zonulin-Serumlevel dadurch langfristig gesenkt wird. Dies gibt einen weiteren Hinweis auf eine erfolgreiche Therapie mit den verwendeten Medikamenten. Die Zonulin-Serumkonzentration steht dabei im direkten Zusammenhang mit der Krankheitsaktivität der Maus.

- 86 - Da das Zonulin bereits vor Einsetzen der Arthritis erhöht ist, könnte Zonulin ein Frühmarker für Rezidive aus der Remission sein und den Verlauf monitoren. Dazu muss jedoch zunächst der Abfall des Zonulin-Serumlevels bei Behand- lung mit den gängigen RA-Therapeutika bestätigt und das Zonulin-Serumlevel von Patienten in Remission ermittelt werden. Im Idealfall könnte sich dabei zeigen, dass Zonulin als Verlaufsmarker genutzt werden kann und dadurch früh- zeitig Rezidive und Therapieversagen erkennbar sind. Ein wichtiger Parameter wäre dabei den Zeitzusammenhang von Zonulinanstieg und Rezidiv zu ermitteln. Nur bei einem sinnvollen und realistischen Zeitintervall, wäre Zonulin als Parameter in der Klinik nutzbar. Dies wiederum könnte dazu führen, dass eine frühzeitige Therapieanpassung zu einer verminderten Rezidivrate führt.

In der Humanstudie hat sich gezeigt, dass Zonulin als Frühmarker für RA dienen könnte. Besonders hohe Zonulinwerte der prä-RA-Probanden korrelierten mit späterer Erkrankung. Zum einen ist dies als ein Hinweis darauf zu werten, dass der Darm schon lange vor Einsetzen der Symptome durchlässiger geworden und damit Ort der Krankheitsentstehung ist. Zum anderen zeigt sich das Potential von Zonulin als Therapieziel bereits vor Ausbruch der Erkrankung.

Allerdings ist es ebenfalls unerlässlich zu ermitteln, wie die Zonulin- Serumkonzentrationssteigerung entsteht. So ist im Zellmodell beschrieben worden, dass Gliadin Zonulinausschüttung von intestinalen Epithelzellen verursacht und dadurch sekundär die Permeabilität steigt. Dabei ist die Steigerung der Durchlässigkeit deutlich stärker bei Zellkulturen aus Darmproben von Zöliakie- patienten als bei denen von gesunden aufgetreten. (Drago et al., 2006) Zonulin ist ebenfalls schon bei Neugeborenen als Marker für intestinale Verletzungen im Gespräch (Tarko et al., 2017). Da Neugeborene noch keinen Kontakt zu Ge- treide und damit Gliadin gehabt haben, muss es weitere Mechanismen zur Frei- setzung von Zonulin geben. Werden weitere Antigene identifiziert, die eine Zonulinaussschüttung verursachen, könnte damit ein großer Beitrag zur Aufklä- rung und dem Verständnis von Autoimmunerkrankungen geleistet werden. Wei- terführend wäre für das Verständnis entscheidend zu verstehen wie die erste Permeablitätssteigerung entsteht: ob interne Mechanismen die Steigerung ver-

- 87 - ursachen oder ob bestimmte Bakterien des Mikrobioms die Barriere entscheidend schwächen.

6.4 Larazotide Die Behandlung mit dem Zonulin-Antagonist Larazotide hat in den Mausstudien wiederholt zu einem deutlichen Erfolg in der Behandlung der CIA geführt. Ein- deutige Besserungen in den Knochenparametern zeigen, dass die Behandlung ein langfristiger Erfolg ist.

Dass die Knochendaten des Osteomeasures dabei in der Pfote von µCT und Tibiaanalyse des Osteomeasures abweichen, liegt vermutlich daran, dass die untersuchten Pfoten in der behandelten Gruppe verhältnismäßig von stärkerer Arthritis betroffenen waren. In der Natur der CIA liegt, dass jede Pfote zufällig Arthritis entwickeln kann (Brand et al., 2007). Für die Histologie wurde immer die rechte Hinterpfote genutzt, wodurch der Anteil an erkrankten Pfoten zufällig in einer Gruppe erhöht sein kann. Während die Arthritis in der Pfote lokale Kno- chen- und Gelenkdestruktion verursacht, ist der Knochensubstanzverlust an der Tibia auf die systemische Entzündung bei RA zurückzuführen (Kong et al., 1999; Rauner et al., 2012). Daher sind die Daten der Tibia aussagekräftiger für die systemische Krankheit, während die Daten der Pfote das lokale Ausmaß der Arthritis für das Gelenk beschreiben.

Dass das Colon in der behandelten Gruppe deutlich länger ist, ist ein Zeichen des anti-inflammatorischen Therapieerfolgs (Cha et al., 2017) und zeigt ebenfalls, dass selbst eine kurze Behandlungsphase von zehn Tagen langfristige Veränderungen nach sich ziehen kann.

Es lässt sich durch das gleich hohe Zonulin-Serumlevel in der behandelten Mausgruppe wie auch in der gesunden Gruppe der Verlaufsstudie schließen, dass Larazotide die Darmbarriere erfolgreich durch Konkurrenz zu Zonulin un- terstützt. Allerdings ist es wahrscheinlich, dass Larazotide nicht die Ausschüt- tung von Zonulin selbst verhindert. Für FZI/0 – ein Zonulin-Antagonist für Zell- kulturen (Di Pierro et al., 2001) – ist gezeigt worden, dass die parallele Gabe von FZI/0 und Gliadin die Ausschüttung von Zonulin nicht beeinflusst (Drago et al., 2006). Man kann demnach sagen, dass der Zonulin-

- 88 - Serumskonzentrationsabfall durch Larazotide vermutlich durch eine Senkung der Permeabilität verursacht worden ist. Die verminderte Exposition zu dem Antigen, welches die Zonulinausschüttung verursacht, führt sekundär zum Ab- fall der Serumkonzentration. Dies ist als Hinweis darauf zu werten, dass Me- chanismen im Darm, die die Zonulinproduktion anregen, durch erhöhte Perme- abilität verstärkt werden. Ein erhöhtes Zonulin-Serumlevel sorgt dann dafür, dass wiederum durch erhöhte Permeabilität sekundär die Zonulinexpression steigt. Entsprechend dieser Theorie – zusammengenommen mit der Theorie im Darm liege der Ursprung der RA – kann postuliert werden, dass Larazotide in diesen Regelkreis eingreift und damit den Krankheitsprogress verhindert bzw. verlangsamt.

Bei ACEA und dem α4ß7-Antikörper ist für die FACS-Analyse in Kapitel 5.3.3 (S. 62) beschrieben worden, dass es für die T-Zell-Verteilung im Darm eine leichte Tendenz in Richtung der Verteilung bei der RA zum Endzeitpunkt des Versuches gibt. Für Larazotide gilt dies nicht, sondern durch vermehrtes Vor- kommen der Th2-Zellen scheint sogar ein protektives Verhältnis vorzuliegen.

Durch die Untersuchungen ließ sich feststellen, dass selbst eine kurzfristige Behandlung mit Larazotide in der Phase der Krankheitsentwicklung der CIA eine langfristige Verbesserung verursacht hat. Larazotide könnte damit eine Therapieform sein, die spezifischer als die bisherigen Therapien wirkt, und dabei nicht das Immunsystem supprimiert.

In Humanstudien zur Behandlung der Zöliakie wird Larazotide als langfristige Behandlung bereits erfolgreich untersucht (Leffler et al., 2015). Auch bisherige RA-Therapien erfolgen dauerhaft (Scott et al., 2010). Daher sollten die Ergeb- nisse einer Dauertherapie im CIA-Modell untersucht werden, um den Effekt dieser zu evaluieren. Mit einer Therapie bei bereits erkrankten Mäusen könnte der Nachweis der Wirksamkeit in hochaktiven Arthritisphasen erbracht werden. Ein Problem in der Behandlung von RA ist das Therapieversagen von langwirksa- men Antirheumatika (dieseae-modifying antirheumatic drugs; DMARDs) sowie der Therapieabbruch aufgrund von Nebenwirkungen (Dale, 2015). Gerade beim Erstlinienpräparat Methotrexat (MTX) treten häufig gastrointestinale Nebenwir-

- 89 - kungen auf (Kremer et al., 1992). Das Larazotide könnte aufgrund der darm- spezifischen Wirkung eine unterstützende Therapie ohne weiteren Einfluss auf das Immunsystem bei DMARDs sein und Therapieabbrüche verhindern. Aus diesem Grund sollte der synergistische Effekt von Larazotide mit anderen An- tirheumatika ebenfalls evaluiert werden.

Für Larazotide läuft seit Oktober 2018 bis Dezember 2020 eine langfristige, dreiarmige, randomisierte, Placebo kontrollierte und doppelblinde Phase-III- Studie für die Behandlung von Zöliakie mit der NCT-Nummer NCT03569007 (Almenoff, 2018). Daher ist davon auszugehen, dass Larazotide in den nächs- ten Jahren zur Behandlung im Menschen zugelassen wird und infolgedessen auch klinische Projekte, die die hier gewonnenen Daten bestätigen könnten, begonnen werden können.

6.5 Generelle Kritik Essentieller Bestandteil der Forschung ist, die eigenen Methoden und Ergeb- nisse kritisch zu hinterfragen und im nächsten Schritt mit Hilfe dieser Überle- gungen die Ergebnisse zu verbessern und zu validieren. Im Folgenden sollen Kritikpunkte an der eigenen Arbeit herausgearbeitet werden.

Zunächst ist generell zu sagen, dass eine höhere Anzahl an Versuchen und damit auch die Anzahl der Versuchstiere, die Evidenz erhöht. Dies kann dazu führen, dass Tendenzen zu signifikanten Veränderungen werden, oder deutlich wird, dass die Tendenz nur aufgrund der zu kleinen Population vorhanden war. Um dies ressourcensparend zu erreichen, sind die meisten Versuche doppelt und unabhängig voneinander durchgeführt worden. Eine Erhöhung der Ver- suchsanzahl wäre dennoch wünschenswert.

6.5.1 FACS Als Problem im Isolationsverfahren der Immunzellen aus dem Darmgewebe stellte sich heraus, dass nicht alle lebenden Darmzellen aussortiert werden konnten und im FACS als Einzelzellen eine große Hintergrundpopulation gebildet haben. Zusätzlich sind Zelltrümmer von im langen Prozess zerstörter Zellen entstanden, die bei der Auswertung eine hohe Anzahl an Einzelsignalen verursacht haben. Die Auswertung ist dadurch erschwert worden, denn die Immun-

- 90 - zellen mussten zunächst aus den anderen Zellsignalen herausgefiltert und identifiziert werden. Zusätzlich gab es teilweise Probleme im Colon, bedingt durch die eingeschränkte Länge und die Menge des für andere Verfahren benötigten Gewebes, die benötigte Zellanzahl an lebenden Zellen zu generieren. Die An- zahl von 250.000 Zellen pro Messkammer wurde deswegen nicht erhöht. Ins- gesamt hat das Isolationsverfahren aber dazu geführt, dass man von einer re- präsentativen Population für die relativ häufig vorkommenden T-Zellen ausge- hen kann.

Für die antigenpräsentierenden Zellen gab es ebenfalls eine FACS-Färbung. Allerdings sind dort aufgrund der geringen Anzahl dieser im Gewebe keine re- präsentativen Ergebnisse erzielt worden. Um diese genauer untersuchen zu können, muss das Isolationsverfahren noch weiter verbessert werden.

Aufgrund der langen Versuchstage und der Notwendigkeit, zu Beginn viele Ver- fahren gleichzeitig zu beginnen ohne Gewebe zu schädigen, ist es nicht mög- lich gewesen, Peyer-Plaques und interstitielles Immunsystem zu unterscheiden. Bei den Peyer-Plaques handelt es sich um Lymphknoten, die Kontakt zum Darmlumen haben (Ohno, 2016).

6.5.2 Histologie Die Dünndarmhistologie hat bei der Darstellung der Zotten Probleme bereitet. Aufgrund der dünnen Darmstruktur und der nötigen Reinigung von Kotrück- ständen sind die Zotten häufig beschädigt worden und/oder nicht in der kompletten Länge dargestellt gewesen. Dies ist ein bekanntes Problem in der For- schung (J. M. Williams et al., 2016). In den meisten Fällen sind trotzdem genü- gend intakte Zotten im Lichtmikroskop sichtbar gewesen, sodass die vorher ge- planten Messungen durchführbar waren. Nichtsdestotrotz konnten einige Schnitte nicht verwertet werden. Mit längeren Darmabschnitten für die Histolo- gie könnte dieses Problem behoben werden, dies war aber aufgrund der Ver- suchsstruktur mit Verbrauch des Darmes für verschiedene Untersuchungsme- thoden nicht machbar.

Überraschenderweise gab es im Colon, außer dem Becherzellverlust, keine weiteren lichtmikroskopischen Veränderungen in der HE. Hier könnte mit weite-

- 91 - ren Färbungen, Immunohistochemie und/oder weiteren Immunofluoreszenzfär- bungen die Darmstruktur noch genauer untersucht werden.

6.5.3 Zellkultur Durch die verwendete Technik den kompletten Darmabschnitt in Zellkultur zu bringen, sollte die Umgebung, die zu Zytokinausschüttungen führt, erhalten bleiben. Allerdings fehlt die Möglichkeit zu überprüfen, ob diese Umgebung weiterhin besteht. Zusätzlich fallen vaskuläre sowie luminale Stimulationsmecha- nismen weg. Daher sind die gewonnenen Daten mit Vorsicht zu betrachten. Dieser Versuchsaufbau war jedoch lediglich als leicht durchführbare Scree- ningmethode gedacht, um starke Zytokinproduktionen im Darm aufzudecken und diesen Zweck erfüllte er.

6.5.4 Darmpermeabilität Das benutzte 4kDa-FITC-Dextran ist eine Methode, die aufgrund der Blutent- nahme durch Hämolyse verunreinigt werden und dadurch zu nicht verwertbaren Proben führen kann. Bei einigen Proben ist die Hämolyse so ausgeprägt gewesen, dass die Anzahl der verwertbaren Proben relativ gering war. Die FITC- Dextranmessungen sollten daher wiederholt werden, um die Permeabilitätsstei- gerung zu validieren. Bei wiederholter Permeabilitätstestung mit FITC-Dextran ohne Euthanasie wären die Tiere durch die regelmäßige Blutentnahme großem Stress ausgesetzt. Deswegen sollte auf Verfahren, die keine Blutentnahme be- nötigen, ausgewichen werden.

Auch wenn Zonulin, wie vorher beschrieben, ein Molekül ist, das die Permeabili- tät beeinflusst, kann über die Veränderungen der Zonulinkonzentration nur indirekt auf eine veränderte Permeabilität geschlossen werden. Entsprechend rei- chen FITC-Dextran- und Zonulinmessung nicht aus, um von einer gesicherten Permeabilitätssteigerung zu sprechen, sondern sind nur als Hinweis auf diese zu sehen.

6.5.5 Osteomeasure Das beim Larazotide durchgeführte Osteomeasure für die Tibia liefert Ergebnis- se, die zum µCT passen. Allerdings sind die gemessenen Werte der Pfoten ge- gensätzlich zu diesen Ergebnissen. Dies kann daran liegen, dass nicht alle Pfo-

- 92 - ten von Arthritis betroffen gewesen sind. Dadurch, dass immer die linke hintere Pfote verwendet wurde, kann es sein, dass in den Gruppen der Pfotenscore nicht dem Gesamtscore entspricht und daher die Ergebnisse nicht repräsentativ sind. Daher müsste die Anzahl an untersuchten Pfoten für repräsentative Daten erhöht werden.

Da die Tibien wiederum nicht von Destruktionen betroffen gewesen sind, be- zieht sich diese Kritik vor allem auf die Osteomeasure-Daten der Pfoten.

6.6 Fazit Grundlagenforschung hat den Charakter, dass sie Ergebnisse, die das Ver- ständnis von Krankheiten und Prozessen im Körper verbessern, liefern kann. Aufgrund der Ergebnisse lassen sich im Idealfall weitere Schritte zum Erkennt- nisgewinn planen. In dieser Hinsicht haben die durchführten Versuche ihren Zweck erfüllt.

Der Darm scheint ein essentieller Ort in der Pathogenese von Arthritis zu sein. In vielen Forschungsarbeiten ist bereits identifiziert worden, dass Änderungen im Mirkobiom im Zusammenhang mit chronischer Arthritis stehen (Pianta et al., 2017; Teng et al., 2017). Diese Arbeit unterstützt die Theorie, dass im Darm die Autoreaktivität des Immunsystems entsteht. Die gesteigerte Permeabilität könn- te den vermehrten Kontakt der Immunzellen mit pathologischer Darmflora verursachen. Die große genetische Komponente könnte in der Hinsicht eine Rolle spielen, dass verschiedene Pathogene nur bei bestimmten, das Immunsystem determinierenden, genetischen Konstellationen, zu Autoimmunität führen. So ließe sich erklären, dass viele Patienten das gleiche, aber doch variable Krank- heitsbild aufweisen (Feldmann et al., 1996), dass es eine seropositive und eine seronegative RA gibt (Edelman et al., 1983), sowie dass keine eindeutige genetische Ursache bekannt ist (Kurko et al., 2013), und dass keine sicheren Bio- marker für RA in klinischen Labortests vorliegen (Verheul et al., 2015). So könn- te die Permeabilität ein Ansatzpunkt für Therapie von RA und anderen chronisch-inflammatorischen Erkrankungen sein.

Larazotide ist ein Medikament, das genau in diesen Prozess eingreifen soll und damit das erste, an der Ursache ansetzende, Medikament zur Therapie der RA

- 93 - wäre. Mit ACEA ist ein weiteres potentielles Medikament vorhanden, dass an der Stellschraube Permeabilität dreht.

6.7 Ausblick Im Folgenden sollen weitere Gedanken und Überlegungen dargestellt werden, wie die gewonnenen Erkenntnisse in weiteren Experimenten und Projekten be- stätigt und vertieft werden können. Einige der Überlegungen wurden bereits in der Arbeitsgruppe fortgesetzt und veröffentlicht, während andere Anregungen für potentielle Projekte sind.

6.7.1 Durchlässigkeit Wie vorher schon ausgeführt, scheint der Darm bei CIA-Mäusen permeabler zu werden. Um dies endgültig zu bestätigen, werden noch weitere Daten benötigt. Dafür bieten sich neben weiteren FITC-Dextranversuchen auch Permeabilitäts- versuche mit anderen unverdaulichen Zuckern an. So ist die Permeabilitäts- messung über Lactulose und Mannitol im Urin nach oraler Einnahme ein gängi- ges Verfahren (Pernet et al., 1998). Um die Übertragung von der Maus auf den Menschen vollziehen zu können, müssen noch weitere Daten außer dem indirekten Parameter Zonulin gewonnen werden. Da das Lactulose/Mannitol- Verfahren ebenfalls im Menschen verwendbar ist (van Elburg et al., 1995), sollte eine gesteigerte Darmpermeabilität durch dieses Verfahren bei RA-Patienten nachweisbar sein. Dabei sollten idealerweise Patienten ohne bisherige medi- kamentöse Vortherapie teilnehmen, um einen Einfluss der Medikation auf die Darmbarriere auszuschließen. Für Patienten mit Sponyloarthritis konnte diese Permeabilitätssteigerung bereits gezeigt werden (Ciccia et al., 2017). Weitere Daten der Arbeitsgruppe zu CIA, prä-RA und RA bestätigen die Vermutungen aus den Zonulin- und FITC-Dextranuntersuchungen dieser Arbeit. (Tajik et al., 2020)

Um ein näheres Verständnis der Permeabilitätssteigerung zu gewinnen, sollten die Tight Junctions im Darm sowohl bei der Maus als auch beim Menschen durch Immunofluoreszenz dargestellt und auf Veränderungen in der Morpholo- gie untersucht werden. Zur histologischen Evaluation von Tight Junctions über

- 94 - ZO-1 und Occludin gibt es bereits etablierte Verfahren (Krzyzaniak et al., 2011; Tang, 2006).

Wie bereits angeführt, sollte der Mechanismus der Permeabilitätsentstehung genauer untersucht werden. Um ein Modell eines Darmepithels darzustellen, eignet sich die CaCo2-Zelllinie, das gängigste in vitro Darmmodell (Lea, 2015). Mit Hilfe dieses Modells lassen sich Antigene oder auch Faeces von an Arthritis erkrankten Menschen und Mäusen luminal auf ein Epithel auftragen und daraufhin die Auswirkung auf die Permeabilität des Epithels messen. Durch dieses Verfahren könnten für die Entstehung von RA und Permeabilität besonders kri- tische Bakterienstämme oder Antigene aus der Nahrung identifiziert werden. Dieses Modell wird bereits in der Arbeitsgruppe angewandt und es konnten erste positive Ergebnisse erzielt werden. (Tajik et al., 2020) Mittels Mikrobiomse- quenzanalyse wird der verwendete Stuhl auf pathogene Keime untersucht.

Ein weiterer wichtiger Teil der Forschung an Darmpermeabilität bei der RA liegt darin, den Beginn der Permeabilitätssteigerung zu definieren. Dazu könnte im Mausmodell der Darm vor Einsetzen der Arthritis genauer analysiert werden.

Viele genetische Merkmale, die einen Risikofaktor zur Ausbildung einer RA sind, wurden bereits identifiziert (Suzuki et al., 2015). Dabei scheint z. B. die Interaktion von HLA-DRB1, dem größten genetischen Risikofaktor, mit zitrullinierten Proteinen von entscheidender Bedeutung zu sein (Hill et al., 2003). Nachdem die zitrullinierenden Enzym PAD 2 und PAD 4 im Darm vermehrt exprimiert scheinen, sollte der Darm auf Zitrullinierung der Proteine untersucht werden. ACPAs binden dabei gegen zitrullinierte Proteine (Schellekens et al., 1998) und könnten somit auch im Darm gegen Strukturproteine der Tight Junc- tions wirken, sollten diese zitrulliniert worden sein. In diesem Zusammenhang ließen sich auch ACPAs im Gewebe identifizieren.

6.7.2 Immunisierungsort Darm Der Darm als Immunisierungsort für autoreaktive Zellen ist, wie vorher beschrieben, ein gängiges Modell. Ein Weg, um diese Theorie zu unterstützen, ist die gezielte Wanderung von Immunzellen aus dem Darm in das entzündete Ge- lenk nachzuweisen. Dabei ist die Kaede-Maus ein ideales Tool, zelluläre Migra-

- 95 - tion in vivo zu messen. Kaede ist ein fluoreszierendes Protein, welches unter einer Belichtung mit UV oder violettem Licht (350-400 nm) dauerhaft die Kon- formation von grüner auf rote Lichtemission ändert und eine mehrtägige Halb- wertszeit hat (Ando et al., 2002). Das Kaede-Gen wurde in das Mäusegenom impliziert und die transgene Kaede-Maus erschaffen, welche auf allen Zellen Kaede exprimiert (Tomura et al., 2008). Dadurch ist es erstmalig möglich Zellen zu verfolgen ohne diese ex vivo zu markieren.

Beim Durchführen der CIA könnten durch UV-Bestrahlung des Darms, unter Narkose und nach steriler Baucheröffnung, die Darmzellen und das Darmim- munsystem markiert werden. Anschließende Migration in andere Gewebe ist dadurch verfolgbar. Eine Zellidentifizierung von transformierten und nicht- transformierten Zellen ist ebenfalls durch übliche Zytometer und entsprechend an die beiden schon vorhandenen angepassten Farbschemata möglich (Tomura et al., 2008). Damit könnten, vorbehaltlich vorhandener Migration, die entscheidenden Zellen identifiziert und ein Forschungsschwerpunkt auf diese gelegt werden. Erste vielversprechende Ergebnisse sind dabei bereits gelun- gen. (Tajik et al., 2020)

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- 126 - 8. Anhang

8.1 Abbildungen zu Kapitel 5.1.3 Histologie (Zeitverlauf CIA)

Zottenlänge Duodenum Zottenbreite Duodenum 150 40

Zottenlänge Duodenum 30 Zottenbreite Duodenum 100 150 40 20 µm µm 50 30 100 10 20 µm µm 0 0 e 5 0 5 0 5 0 50 e 5 0 5 0 5 0 ll 2 3 3 4 4 5 ll 2 3 3 4 4 5 10 o o tr ag ag ag ag ag ag tr ag ag ag ag ag ag T T T T T T T T T T T T on on K K 0 0 e 5 0 5 0 5 0 e 5 0 5 0 5 0 ll 2 3 3 4 4 5 ll 2 3 3 4 4 5 o o tr ag ag ag ag ag ag tr ag ag ag ag ag ag T T T T T T T T T T T T on on K K Kryptentiefe Duodenum Krytenbreite Duodenum 50 20

40 15 Kryptentiefe Duodenum Krytenbreite Duodenum 30 20 50 10 µm µm 4020 515 10 30 10

µm 0

µm 0 e 5 0 5 0 5 0 ll 2 3 3 4 4 5 20 o e 5 0 5 0 5 0 tr ag ag ag ag ag ag ll 2 3 3 4 4 5 5 T T T T T T o on tr ag ag ag ag ag ag K T T T T T T 10on K 0 0 e 5 0 5 0 5 0 ll 2 3 3 4 4 5 o e 5 0 5 0 5 0 tr ag ag ag ag ag ag ll 2 3 3 4 4 5 T T T T T T o on Abbildungtr ag Zottenlänge 51ag : agGezeigtag Jejunumag werdenag histologischeK AbmessungenZottenbreite Jejunum des Duodenums in µm von T T T T T T on Zottenlänge,K150 Zottenbreite, Kryptentiefe und30 Kryptenbreite. Unterschiede können im Zeitverlauf nicht gemessen werden. 100 Zottenlänge Jejunum 20 Zottenbreite Jejunum 150 30 µm µm 50 10

100 20

0 0 µm µm e 5 0 5 0 5 0 e 5 0 5 0 5 0 ll 2 3 3 4 4 5 ll 2 3 3 4 4 5 50 o 10 o tr ag ag ag ag ag ag tr ag ag ag ag ag ag T T T T T T T T T T T T on on K K

0 0 e 5 0 5 0 5 0 e 5 0 5 0 5 0 ll 2 3 3 4 4 5 ll 2 3 3 4 4 5 o Kryptentiefe Jejunum o Kryptenbreite Jejunum tr ag ag ag ag ag ag tr ag ag ag ag ag ag T T T T T T T T T T T T 30on 20 on K K

15 20 Kryptentiefe Jejunum Kryptenbreite Jejunum 10 µm 30 µm 20 10 5 15 20 0 0 10 µm e 5 0 5 0 5 0 µm e 5 0 5 0 5 0 ll 2 3 3 4 4 5 ll 2 3 3 4 4 5 o o tr ag ag ag ag ag ag tr ag ag ag ag ag ag 10 T T T T T T T T T T T T on on K K 5

0 0 e 5 0 5 0 5 0 e 5 0 5 0 5 0 ll 2 3 3 4 4 5 ll 2 3 3 4 4 5 o o tr ag ag ag ag ag ag tr ag ag ag ag ag ag T T T T T T T T T T T T on on K K Abbildung 52: Gezeigt werden histologische Abmessungen des Jejunums in µm von Zottenlänge, Zottenbreite, Kryptentiefe und Kryptenbreite. Unterschiede können im Zeitverlauf nicht gemessen werden.

- 127 - Zottenlänge Ileum Zottenbreite Ileum 100 30

80 20 60 µm 40 µm Zottenlänge Ileum 10 Zottenbreite Ileum 10020 30

800 0 e 5 0 5 0 5 0 e 5 0 5 0 5 0 ll 2 3 3 4 4 5 ll 2 3 3 4 4 5 o 20 o 60 tr ag ag ag ag ag ag tr ag ag ag ag ag ag T T T T T T T T T T T T on on K K µm 40 µm 10 20 Kryptentiefe Ileum Kryptenbreite Ileum

30 0 200 e 5 0 5 0 5 0 e 5 0 5 0 5 0 ll 2 3 3 4 4 5 ll 2 3 3 4 4 5 o o tr ag ag ag ag ag ag tr ag ag ag ag ag ag T T T T T T T T T T T T on 15on 20K K

10 µm µm 10 Kryptentiefe Ileum Kryptenbreite Ileum 5 30 20

0 0 15 e 5 0 5 0 5 0 e 5 0 5 0 5 0 20 ll 2 3 3 4 4 5 ll 2 3 3 4 4 5 o o g g g g g g tr ag ag ag ag ag ag tr a a a a a a T T T T T T T T T T T T on on K 10K µm µm 10 5 AbbildungKryptentiefe 53: Gezeigt Colon werden histologische AbmessungenKryptenbreite Colon des Ileums in µm von Zot- 800 200 e 5 0 5 0 5 0 e 5 0 5 0 5 0 tenlänge,ll 2 Zottenbreite,3 3 4 4 Kryptentiefe5 und Kryptenbreite.ll 2 3 3 Un4 terschiede4 5 können im Zeit- o o g g g g g g tr ag ag ag ag ag ag tr a a a a a a T T T T T T T T T T T T 60on 15on verlaufK nicht gemessen werden. K

40 10 µm µm Kryptentiefe Colon Kryptenbreite Colon 2080 205

600 150 e 5 0 5 0 5 0 e 5 0 5 0 5 0 ll 2 3 3 4 4 5 ll 2 3 3 4 4 5 o o tr ag ag ag ag ag ag tr ag ag ag ag ag ag T T T T T T T T T T T T 40on 10on µm K µm K

20 5

0 0 e 5 0 5 0 5 0 e 5 0 5 0 5 0 ll 2 3 3 4 4 5 ll 2 3 3 4 4 5 o o tr ag ag ag ag ag ag tr ag ag ag ag ag ag T T T T T T T T T T T T on on K K

Abbildung 54: Gezeigt werden histologische Abmessungen des Colons in µm von Kryptentiefe und Kryptenbreite. Unterschiede können im Zeitverlauf nicht gemessen werden.

- 128 - 8.2 Abbildungen zu Kapitel 5.1.4 LegendplexTM (Zeitverlauf CIA)

Abbildung 55: Gezeigt werden die Daten von INFγ-LegenplexTM Analyse der Darmab- schnitte Duodenum, Jejunum, Ileum und Colon. Eine Auswertung ist aufgrund zu weniger verwertbarer Ergebnisse nicht möglich.

Abbildung 56: Gezeigt werden die Daten von TNFa-LegenplexTM Analyse der Darmab- schnitte Duodenum, Jejunum, Ileum und Colon. Eine Auswertung ist aufgrund zu weniger verwertbarer Ergebnisse nicht möglich.

- 129 - IL17A Duodenum IL17A Jejunum 4 2.5

2.0 3

1.5 2 pg/ml pg/ml 1.0 IL17A Duodenum IL17A Jejunum 1 4 0.52.5

0 0.02.0 3 e 5 0 5 0 5 0 e 5 0 5 0 5 0 ll 2 3 3 4 4 5 ll 2 3 3 4 4 5 o o tr ag ag ag ag ag ag tr ag ag ag ag ag ag T T T T T T 1.5 T T T T T T on on K2 K pg/ml pg/ml 1.0 1 IL17A Ileum 0.5 IL17A CO 3.4 0.42 0 0.0 e 5 0 5 0 5 0 e 5 0 5 0 5 0 ll 2 3 3 4 4 5 ll 2 3 3 4 4 5 o 0.41 o 3.3tr ag ag ag ag ag ag tr ag ag ag ag ag ag T T T T T T T T T T T T on on K K 0.40 3.2 pg/ml pg/ml 0.39 IL17A Ileum IL17A CO 3.1 0.38 3.4 0.42

3.0 0.37 0.41 3.3 e 5 0 5 e 5 ll 2 3 3 ll 2 o o tr ag ag ag tr ag T T T T on 0.40 on 3.2 K K pg/ml pg/ml 0.39 3.1 AbbildungIL1 57β Duodenum: Gezeigt werden die Daten0.38 vonIL1 βIL17A Jejunum-LegenplexTM Analyse der Darmab- 40 80 3.0 0.37 schnittee Duodenum,5 0 Jejunum,5 Ileum und Colon.e Eine Auswertung5 ist aufgrund zu weni- ll 2 3 3 ll 2 o o 30 tr ag ag ag 60 tr ag T T T T ger verwertbareron Ergebnisse nicht möglich.on K K 20 40 pg/ml pg/ml β β 10 IL1 Duodenum 20 IL1 Jejunum 40 80 0 0 e 5 0 5 0 5 0 e 5 0 5 0 5 0 30 ll 2 3 3 4 4 5 60 ll 2 3 3 4 4 5 o o tr ag ag ag ag ag ag tr ag ag ag ag ag ag T T T T T T T T T T T T on on K K 20 40 pg/ml pg/ml

10 IL1β Ileum 20 IL1β Colon 250 8 0 0 e 5 0 5 0 5 0 e 5 0 5 0 5 0 200 ll 2 3 3 4 4 5 ll 2 3 3 4 4 5 o o tr ag ag ag ag ag ag 6 tr ag ag ag ag ag ag T T T T T T T T T T T T on on 150K K 4 pg/ml 100 pg/ml IL1β Ileum 2 IL1β Colon 50 250 8 0 0 200 e 5 0 5 0 5 0 e 5 0 5 0 ll 2 3 3 4 4 5 6 ll 2 3 3 4 o o tr ag ag ag ag ag ag tr ag ag ag ag T T T T T T T T T T 150on on K K 4 pg/ml 100 pg/ml 2 50

0 0 e 5 0 5 0 5 0 e 5 0 5 0 ll 2 3 3 4 4 5 ll 2 3 3 4 o o tr ag ag ag ag ag ag tr ag ag ag ag T T T T T T T T T T on on K K

Abbildung 58: Gezeigt werden die Daten von IL1b-LegenplexTM Analyse der Darmab- schnitte Duodenum, Jejunum, Ileum und Colon. Eine Auswertung ist aufgrund zu weniger verwertbarer Ergebnisse nicht möglich.

- 130 -

Abbildung 59: Gezeigt werden die Daten von INFγ-LegenplexTM Analyse der Darmab- schnitte Duodenum, Jejunum und Ileum. Die Daten des Colons werden im Kapitel 5.1.4 gezeigt. Eine Auswertung ist aufgrund zu weniger verwertbarer Ergebnisse nicht mög- lich.

8.3 Abbildungen zu Kapitel 5.3.3 FACS (ACEA und α4ß7)

% Treg Dünndarm % Treg Colon 0.5 0.20

0.4 0.15 0.3

0.2 0.10 %CD4+ 0.1 %CD4+ 0.05 0.0

-0.1 0.00 l l o o tr CEA a4b7 tr CEA a4b7 on A on A C C

Abbildung 60: Dargestellt ist der prozentuale Anteil der Treg von den CD4 positiven T- Zellen links im% DünndarmTh1 Dünndarm und rechts im Colon. Signifikante Unterschiede% Th1 Colon zwischen den 4Gruppen ergeben sich nicht. 10 8 3 6 2 4 %CD4+ %CD4+ 1 2

0 0 l l o o EA b7 tr tr C a4 CEA a4b7 A on A on C C

% Th17 Dünndarm - 131 - % Th17 Colon

40 * 40

30 30

20 20 %CD4+ %CD4+ 10 10

0 0 l 7 l 7 o ro EA tr CEA a4b t C a4b on A on A C C % Treg Dünndarm % Treg Colon 0.5 0.20

0.4 0.15 0.3

0.2 % Treg Dünndarm 0.10 % Treg Colon %CD4+ 0.5 %CD4+0.20 0.1 0.4 0.05 0.0 0.15 0.3 -0.1 0.00 l l 0.2 o 0.10 o tr CEA a4b7 tr CEA a4b7 A A

%CD4+ on %CD4+ on 0.1 C C 0.05 0.0

-0.1 % Th1 Dünndarm 0.00 % Th1 Colon l l o o 4 tr 10 CEA a4b7 tr CEA a4b7 on A on A C C 8 3 6 2 % Th1 Dünndarm % Th1 Colon 4 %CD4+ %CD4+4 10 1 82 3 0 60 l l 2 o EA b7 o tr tr CEA a4b7 C a4 A 4 on A %CD4+

%CD4+ on C C 1 2

Abbildung0 61:% Dargestellt Th17 Dünndarm ist der prozentuale Anteil der0 Th1 von den% Th17 CD4 Colon positiven T- l l Zellen40 linkso im Dünndarm und rechts im Colon. Signifikante40 Unterschiedeo EA zwischenb7 tr * tr C a4 CEA a4b7 A on A on den GruppenC ergeben sich nicht. C 30 30

20 % Th17 Dünndarm 20 % Th17 Colon

%CD4+40 * %CD4+40 10 10 30 30 0 0 l 7 l 7 20 o 20 ro EA tr CEA a4b t C a4b on A on A %CD4+ C %CD4+ C 10 10

0 0 l 7 l 7 o ro EA tr CEA a4b t C a4b on A on A C C

Abbildung 62: Dargestellt ist der prozentuale Anteil der Th17 von den CD4 positiven T- Zellen links im Dünndarm und rechts im Colon. Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen ergeben sich außer im Dünndarm zwischen der ACEA im Vergleich zur Kontrollgruppe nicht.

9. Danksagung Zunächst möchte ich mich bei meinem Doktorvater Prof. Dr. Mario Zaiss für die wissenschaftliche und methodische Unterstützung, die Freiheit das Projekt von vielen Richtungen aus anzugehen und natürlich für die tatkräftige Unterstützung beim Verfassen dieser Dissertation bedanken.

Im Weiteren gilt mein Dank der AG Zaiss, dessen Mitglieder mich bei der Pla- nung und Durchführung unterstützt und immer gute Anregungen eingebracht haben. Sobald Probleme auftauchten, konnte ich mich auf die Mithilfe zur Lö-

- 132 - sungsfindung verlassen. Besonders hervorheben möchte ich Magarete Schimpf, die mir die ersten Schritte im Labor leicht gemacht und mich auf ihre herzliche Art und Weise gut im Team aufgenommen hat.

Ich danke auch den Mitgliedern der AG Bozec, unserem Histologielabor, der Studienambulanz der Medizin 3 sowie dem Team unseres µ-CTs, welche mich bei der Durchführung meiner Experimente unterstützt haben.

Ebenfalls möchte ich mich beim IZKF der FAU Erlangen für die finanzielle Un- terstützung im Rahmen meines Stipendiums bedanken.

Abschließend danke ich meiner Freundin Isabella Kussmann, meiner Familie – Carlotta Schulz, Emilie Schulz, Beate Herwig-Schulz und Matthias Schulz – und meinen Freunden für den emotionalen Rückhalt, die stetige Motivation sowie die sprachliche Mithilfe beim Verfassen der Dissertation.

10. Lebenslauf Berufserfahrung

08/2020 – heute DIAKOVERE Krankenhaus gGmbH, Henriettenstift, Hannover Assistenzarzt Geburtshilfe und Gynäkologie

12/2020 – 04/2020 Krankenhaus Region Hannover GmbH, Klinikum Siloah PJ-Student in der Allgemein-, Viszeral-, Gefäß- und Thorax- chirurgie

09/2019 – 12/2019 Medizinische Hochschule Hannover PJ-Student in der Nephrologie und Gastroenterologie

05/2019 – 09/2019 Vinzenzkrankenhaus Hannover GmbH PJ-Student im Fachbereich Geburtshilfe und Gynäkologie

02/2014 – 04/2018 Universitätsklinikum Erlangen Studentische Hilfskraft der Pflege in der Rheumatologie/ Immunologie

02/2018 – 03/2018 Kliniken der Stadt Köln gGmbH, Krankenhaus Köln- Merheim Famulant in der interdisziplinären zentralen Notaufnahme

09/2017 – 10/2017 King´s College London, England Famulant in der Herzchirurgie

07/2016 – 08/2016 Hausarzt Zentrum List, Dr. med. Ulrich Krieger-Bodek, Hannover Famulant in der hausärztlichen Versorgung

- 133 - 02/2016 – 03/2016 Medizinische Hochschule Hannover Famulant in der Anästhesie

09/2012 – 10/2013 Orientierungsjahr, Hannover Ausbildung zum Rettungssanitäter beim Deutschen Roten Kreuz e.V. (1,8) 3 Monate Pflegedienstpraktikum im DRK-Clementinenhaus Vorbereitung auf den TMS

08/2011 – 08/2012 »Die kleinen frechen Muckmäuse e.V.«, Hannover Freiwilliges Soziales Jahr

Bildungsweg

05/2020 Regierung Unterfranken Würzburg Approbation als Arzt

05/2020 Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Klinischer Abschnitt Humanmedizin, 3. Staatsexamen (1,0)

05/2019 – 04/2020 Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Praktisches Jahr (Wahlfach Gynäkologie)

10/2015 – 05/2019 Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Klinischer Abschnitt Humanmedizin, 2. Staatsexamen (2,0)

10/2013 – 09/2015 Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Vorklinischer Abschnitt Humanmedizin, 1. Staatsexamen (1,5)

08/2004 – 05/2011 Sophienschule Hannover Allgemeine Hochschulreife (1,7)

Forschung

10/2016 – heute Universitätsklinikum Erlangen Medizin 3 Rheumatologie/Immunologie, AG Zaiss Doktorarbeit zum Thema: Zusammenhang von Darm und rheumatoider Arthritis im Mausmodell

04/2020 Publikation im Nature Communications 11, Artikel-Nr. 1995 (2020) »Targeting zonulin and intestinal epithelial barrier function to prevent onset of arthritis«, N. Tajik, M. Frech, O. Schulz, […] & M. Zaiss DOI: 10.1038/s41467-020-15831-7

04/2020 Publikation im ERJ Open Research 6, (2020) »Enoximone in status asthmaticus«, O. Schulz, O. W., T. W., BA. B., H. S., M. Hoeper & M. Busch DOI: 10.1183/23120541.00367-2019

- 134 - 01/2018 Publikation im Nature Communications 9, Artikel-Nr. 55 (2018) »Short-chain fatty acids regulate systemic bone mass and protect from pathological bone loss«, S. Lucas, Y. O., J. H., M. B., A. I., K. S., O. A., O. Schulz, […] & M. Zaiss DOI: 10.1038/s41467-017-02490-4

05/2017 Elsbeth Bonhoff Stiftung, Förderprojekt Nr. 173 Fördermittel für die Rolle von BIP im Knochenmetabolismus (46.000€) Mitwirkung als zweiter Antragssteller mit Prof. Dr. rer. nat. M. Zaiss

Stipendium

10/2016 – 05/2017 Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Interdisziplinäres Zentrum für klinische Forschung (IZKF), Erlangen Medizin 3 Rheumatologie/Immunologie, AG Zaiss »Pathologic intestinal inflammation in arthritic diseases«

Kenntnisse

Sprachen Deutsch Muttersprache Englisch C1 (IELTS 12/2018)

EDV Word, Excel, PowerPoint gut EndNote gut

Versuchstierkunde FELASA Kategorie B zertifiziert

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