Charakterisierung Und Expression Der MHC-Kodierten BAT2- Und BAT3-Gene

Charakterisierung und Expression der MHC-kodierten BAT2- und BAT3-Gene

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades (Dr. rer. nat.) der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn

vorgelegt von Johannes Winkler aus Bonn

Bonn (Juni) 2003 i

1 Einleitung...... 1 1.1 Der Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) ...... 1 1.1.1 Der MHC Klasse I-Bereich...... 4 1.1.2 Der MHC Klasse II-Bereich ...... 6 1.1.3 Der MHC Klasse III-Bereich...... 6 1.2 BAT2...... 13 1.3 BAT3...... 14 1.4 Zielsetzung der Arbeit...... 18 2 Material und Methoden...... 19 2.1 Geräte...... 19 2.2 Verbrauchsmaterialien ...... 20 2.2.1 E.coli-Bakterienstämme...... 22 2.2.2 Zelllinien...... 23 2.2.3 Antikörper...... 23 2.2.4 Peptide...... 24 2.2.5 Oligonukleotide ...... 24 2.2.6 Crosslinker...... 26 2.2.7 Tierstämme ...... 26 2.3 Methoden ...... 27 2.3.1 Zellkultur ...... 27 2.3.2 Bakterienkultur ...... 27 2.3.3 Isolierung von RNA aus eukaryontischen Zellen...... 27 2.3.4 Northern Blot ...... 27 2.3.5 Multiple Tissue Expression-Array (MTE)...... 28 2.3.6 In-situ-Hybridisierung ...... 29 2.3.7 Reverse Transkription...... 30 2.3.8 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ...... 30 2.3.9 Rapid amplification of cDNA ends (RACE) ...... 30 2.3.10 Bestimmung einer DNA-Sequenz durch Sequenzierung...... 31 2.3.11 Isolierung von Plasmid-DNA aus E.coli...... 31 2.3.12 Restriktionsverdau ...... 32 2.3.13 Agarosegelektrophorese und Elution von DNA aus Agarosegelen...... 32 2.3.14 Klonierung von DNA-Fragmenten ...... 33 ii

2.3.15 Klonierung von Oligonukleotiden ...... 33 2.3.16 Klonierung von PCR-Produkten durch TOPO-Klonierung...... 34 2.3.17 Identifikation rekombinanter Klone durch Kolonie-PCR...... 34 2.3.18 Ortsspezifische Mutagenese (Site-directed mutagenesis)...... 35 2.3.19 Expression rekombinanter Proteine in E. coli ...... 35 2.3.20 Affinitätsreinigung rekombinanter GST-Fusionsproteine...... 36 2.3.21 Kopplung von Peptiden an Trägerproteine...... 37 2.3.22 Herstellung von Antiseren in Kaninchen...... 37 2.3.23 ELISA zur Bestimmung des Antikörpertiters...... 38 2.3.24 Affinitätsreinigung von Antikörpern ...... 38 2.3.25 Transiente Proteinexpression in eukaryontischen Zellen ...... 39 2.3.26 Stabile Proteinexpression in eukaryontischen Zellen ...... 39 2.3.27 Metabolische Markierung von eukaryontischen Zellen...... 40 2.3.28 Herstellung von Zelllysaten...... 40 2.3.29 Immunpräzipitation...... 40 2.3.30 Reduzierende SDS-PAGE ...... 41 2.3.31 Nachweis von Proteinen im SDS-PAGE-Gel...... 41 2.3.32 Fluorographie...... 41 2.3.33 Western Blot ...... 42 2.3.34 Immunfluoreszenz ...... 42 2.3.35 In-vitro-Transkription/Translation...... 43 3 Ergebnisse...... 44 3.1 Molekularbiologie von BAT2...... 44 3.1.1 Bestimmung der humanen BAT2-cDNA-Sequenz...... 44 3.1.2 Bestimmung des Transkriptionsstarts von BAT2 durch 5’-RACE ...... 46 3.1.3 Bestimmung der Genorganisation von BAT2 ...... 47 3.1.4 Sequenzanalyse der humanen BAT2-cDNA ...... 47 3.1.5 Sequenzvergleiche mit anderen Spezies...... 54 3.1.6 BAT2-verwandte Sequenzen ...... 54 3.1.7 Zusammensetzen eines vollständigen BAT2 cDNA-Klons...... 60 3.1.8 Herstellung rekombinanter GST-BAT2-Fusionsproteine...... 61 3.1.9 Immunisierung von Kaninchen mit GST-Fusionsproteinen und BAT2- abgeleiteten Peptiden ...... 64 3.1.10 Aufreinigung der BAT2-Antiseren...... 66 iii

3.2 Molekularbiologie von BAT3...... 74 3.2.1 Klonierung und Sequenzierung einer BAT3-cDNA...... 74 3.2.2 Sequenzanalyse der BAT3-cDNA...... 79 3.2.3 Sequenzvergleich der BAT3-cDNA mit anderen Spezies...... 83 3.2.4 BAT3-verwandte Sequenzen ...... 83 3.3 Gewebeverteilung der BAT2- und BAT3-mRNA...... 83 3.4 Proteinbiochemische Ergebnisse ...... 92 3.4.1 Expression von BAT2 in eukaryontischen Zellen ...... 92 3.4.2 Expression und Detektion von BAT3 in COS7-Zellen ...... 95 3.4.3 Subzelluläre Fraktionierung zur Lokalisierung der BAT-Proteine in transfizierten Zellen ...... 96 3.4.4 Immunfluoreszenz mit transient transfizierten Zellen...... 96 3.4.5 Einfluss von BAT2 und BAT3 auf die proteasomale Degradation des Glukokortikoidrezeptors ...... 99 3.5 Second Mitochondrial Activator of Caspases (Smac) ...... 99 3.5.1 Klonierung einer Smac-cDNA...... 101 3.5.2 Expression in eukaryontischen Zellen ...... 102 3.5.3 Koexpression von Smac mit BAT3 ...... 102 4 Diskussion...... 104 4.1 Molekularbiologie von BAT2...... 104 4.2 Molekularbiologie von BAT3...... 107 4.3 Transkriptionsmuster von BAT2 und BAT3 ...... 109 4.4 Das BAT2-Polypeptid...... 110 4.5 Das BAT3-Polypeptid...... 111 4.6 Assoziation von BAT3 mit Smac ...... 112 4.7 Einfluss von BAT3 und BAT2 auf die CHIP-vermittelte Degradation des Glukokortikoidrezeptors ...... 113 5 Zusammenfassung...... 114 6 Literaturverzeichnis ...... 115 7 Anhang...... 138 Einleitung 1

1 Einleitung

1.1 Der Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)

Der Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) des Menschen ist ein Genkomplex von 4 Mb Länge, der über 220 Gene enthält. Beim Menschen wird der MHC-Lokus auch als HLA (Human Leukocyte Antigen)-Lokus bezeichnet; er liegt auf Chromosom 6 und umfasst ca. 0,1 % des menschlichen Genoms. Der HLA-Lokus wird in drei Bereiche unterteilt: die Klasse I-Region umfasst über 100 Loci am telomeren Ende, der Klasse II-Bereich umfasst etwa 60 Loci am zentromeren Ende. Zwischen den Klasse I- und II-Regionen liegt der Klasse III- Bereich mit etwa 60 Genloci (Abb. 1, MHC Sequencing Consortium 1999). Der MHC-Lokus wurde ursprünglich aufgrund der Rolle der hier kodierten klassischen Klasse I- und Klasse-II Moleküle bei Abstoßungsreaktionen nach Transplantationen und bei ihrer Rolle in der Antigenpräsentation an T-Zellen entdeckt. Gene des MHC-Lokus spielen bei zahlreichen Autoimmunerkrankungen eine Rolle, darunter insulinabhängige Diabetes mellitus (IDDM), rheumatoide Arthritis (RA), variables Immundefektsyndrom (CVID) und IgA-Defizienz. Andere Krankheitsbilder, unter anderem Narkolepsie oder Dyslexie, werden ebenfalls mit dem MHC in Verbindung gebracht (Mignot & Thorsby 2001, Ahn et al. 2001). Der MHC-Lokus war daher einer der ersten Genkomplexe, der vollständig sequenziert und näher untersucht wurde (The MHC Sequencing Consortium 1999). Im Vergleich zu anderen Bereichen des menschlichen Genoms hat der MHC-Komplex mehrere auffällige Merkmale. Die klassischen Klasse-I und Klasse-II-Gene sind hochgradig polymorph und der MHC-Kom- plex enthält mit den Klasse I- und -Klasse II-Genen die Sequenzen mit dem höchsten bisher bekannten Grad von Polymorphismus (zwischen 5 und 17 % im Fall von HLA-DP, -DQ, bzw. HLA-B und -C). Für HLA-A, HLA-B und HLA-DRB1 sind 250, 490 bzw. 315 Allele bekannt (Marsh et al. 2002). Die verschiedenen möglichen Allelkombinationen treten allerdings nicht zufällig entsprechend der Allelfrequenz auf; stattdessen kommen bestimmte Allelkombi- nationen häufiger vor, so dass es zur Bildung von „erweiterten Haplotypen“ kommt (Dawkins et al. 1999). In einigen Haplotypen ist es zu umfangreichen Genduplikationen gekommen, die mehrere benachbarte Gene bzw. Genfragmente umfassen. Beispielsweise ist der Bereich um das Komplementgen C4 in den verschiedenen Haplotypen in unterschiedlichem Umfang dupli- ziert, so dass zwischen zwei und vier Kopien des C4-Gens direkt benachbart vorkommen. Einleitung 2

Telomer

Klasse III-Region

Klassische Klasse I-Region

Klassische Klasse II-Region

Erweiterte Klasse II-Region

Zentromer

Abb.1: Genkarte des menschlichen MHC, nicht maßstabsgetreu. Schwarze Kästen stellen Gene dar, die erst durch Sequenzierung des MHC identifiziert wurden. Pseudogene sind mit Y gekennzeichnet. In Bereichen mit variabler Genanzahl (C4 im Klasse III-bereich, DR im Klasse II-Bereich) sind mehrere bekannte Varianten dargestellt (modifiziert nach The MHC Sequencing Consortium 1999). Einleitung 3

Polymorphismen sind im MHC nicht auf kodierende Regionen beschränkt, sondern treten auch in untranslatierten Bereichen auf. Beispielsweise ist für die CL2-Region zwischen den MICA- und MICB-Genen mit ca. 1,6 % ein Polymorphismusgrad ermittelt worden, der um den Faktor 20 über dem Durchschnitt für das gesamte menschliche Genom liegt (O’hUigin et al. 2000). Selbst repetitive Alu-Elemente im MHC sind zwischen den verschiedenen Haploty- pen polymorph (Gaudieri et al. 1997). Der hohe Grad an Polymorphismus im MHC-Lokus wird gemeinhin als vorteilhaft für die Widerstandsfähigkeit einer Population gegenüber Infektionen betrachtet. Beispielhaft sei der Zusammenhang zwischen dem Allel HLA-B*5301 und der Resistenz gegenüber Malaria genannt. Dieses Allel ist aus dem weit verbreiteten Allel HLA-B*3501 hervorgegangen und besitzt gegenüber diesem einen gewissen Selektionsvorteil, da es einen Schutz gegenüber den westafrikanischen Stämmen von Malaria bietet. Ein solcher Selektionsvorteil kann durch Anpassung des Malariaerregers wieder verloren gehen (wie es beispielsweise in Ostafrika der Fall ist). Dennoch können auch temporäre Selektionsvorteile die Allelfrequenz längerfristig beeinflussen. Zwei Mechanismen sind vorgeschlagen worden, um die Variabilität im MHC- Lokus zu erklären. Auf individueller Ebene kann eine durch Heterozygotie vielfältigere Immunantwort vorteilhaft sein. In einer Population, in der sich ein Pathogen an häufig vorkommende Allele angepasst hat, können seltene Allele einen Vorteil bieten, wenn sie eine er- höhte Resistenz bewirken. In der Praxis könnten beide Aspekte eine Rolle spielen (Beck & Trowsdale 2000). Auffällig ist auch die hohe lokale Dichte von Genloci mit einer Beziehung zum Immunsystem: fast 40 % der exprimierten Gene haben eine Funktion im Immunsystem (The MHC sequencing consortium 1999). Wie lässt sich erklären, dass ein solcher Genkomplex langfristig stabil bleibt? Die enge Nachbarschaft von Genen des Immunsystems kann funktionale Vorteile haben. Beispielsweise kombinieren nicht alle D und E-Ketten von HLA-DQ gut miteinander; so bilden D-Ketten von DQw1 keine stabilen Dimere mit DQw2-4 E-Ketten. Tatsächlich finden sich in den meisten Populationen keine Allelkombination für solche instabilen Kombinationen auf einem Chromosom (Trowsdale 2002). Ein zweites Beispiel ist der TAP-LMP-Cluster in der MHC Klasse II-Region (siehe 1.1.1). Die LMP2- und TAP1-Gene sind direkt benachbart und durch weniger als 500 bp voneinander getrennt. Ihre Expression wird durch einen gemeinsamen bidirektionalen Promotor kontrolliert und die Genprodukte sind beide für die Beladung von MHC Klasse I-Molekülen wichtig (Trowsdale 2002). Einleitung 4

In den letzten Jahren ist bekannt geworden, dass es im menschlichen Genom mindestens drei Regionen gibt, die zur MHC-Region 6p21.3 paralog sind, das heißt, durch Duplikation entstanden sind (Kasahara 1996, Kasahara 1999b, Flajnik & Kasahara 2001). Diese Regionen befinden sich auf 1q21-q25/1p11-p32, 9q33-q34 und 19p13.1-p13.3. Mit Ausnahme von Chromosom 1 befinden sich die paralogen Regionen entweder auf dem kurzen oder dem langen Arm eines Chromosoms. Die Anordnung der Gene in diesen paralogen Loci ist nur schwach konserviert, obwohl einzelne Segmente in mehreren paralogen Regionen identisch angeordnet sind und möglicherweise die Organisation eines ursprünglichen MHC-Lokus widerspiegeln (Flajnik & Kasahara 2001). Das Phänomen der paralogen Kopien ist nicht auf den MHC-Locus beschränkt: eine Vielzahl von Genen, die in Invertebraten in einer einzelnen Kopie vorkommen, existieren in Vertebra- ten in bis zu vier paralogen Loci (z.B. Src, EGF-Rezeptor, Jak-Gene). Diese Beobachtung wird auf zwei postulierte Polyploidisierungsereignisse zurückgeführt, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Entwicklungsgeschichte der Chordaten stattgefunden haben (Spring 1997, Abi-Rached et al. 2002, McLysaght et al. 2002, Spring 2002). Einige Genfamilien des MHC, wie z.B. NOTCH und RING3 kommen in allen vier paralogen Regionen vor, die meisten MHC-Gene haben allerdings nur auf ein oder zwei Chromosomen paraloge Kopien. Für manche Genfamilien sind keinerlei paraloge Kopien bekannt, beispielsweise für die MHC Klasse II-Gene DP, DQ, DR, DM und DO. Im Mausgenom sind entsprechende paraloge Regionen bekannt, allerdings sind diese Regionen teilweise stark fragmen- tiert (Flajnik & Kasahara 2001). Für BAT2 sind paraloge Kopien auf dem menschlichen Chromosom 1 (1q21.1-q24.3) und Chromosom 9 (9q34) beschrieben worden, von BAT3 sind bisher keine paralogen Kopien bekannt (Kasahara 1999).

1.1.1 Der MHC Klasse I-Bereich

Die Gene im Klasse I-Bereich kodieren unter anderem für die drei hochpolymorphen Mole- küle HLA-A, -B und -C, die an der Antigenpräsentation beteiligt sind. Zusammen mit Gen- produkten des Klasse II-Bereichs (HLA-DP, -DQ, -DR) sind sie als Peptidrezeptoren an der Präsentation von prozessierten Antigenen auf der Zelloberfläche beteiligt. Komplexe aus Peptiden und MHC-Molekülen können von spezifischen T-Zell-Rezeptoren erkannt werden. MHC Klasse I-Moleküle sind heterodimere Glykoproteine. Die schwere, transmembrane D- Einleitung 5

Kette ist im MHC kodiert und assoziiert mit dem löslichen E -Mikroglobulin (E M). E - 2 2 2 Mikroglobulin ist nicht im MHC kodiert und wenig polymorph (Ploegh et al., 1981). Die „klassischen“ MHC-Klasse I-Moleküle HLA-A, -B und -C sind in unterschiedlichem Ausmaß unter Immunaktivierungsbedingungen auf praktisch allen Zellen exprimiert (aus- genommen Nervenzellen und einige Zellen des Fortpflanzungsapparats und des Darmepithels) und präsentieren Peptide, die durch Prozessierung zytosolischer (d.h. zelleigener, aber auch viraler) Proteine entstehen. Auf der Zelloberfläche treten Klasse I-Peptid-Komplexe in Wechselwirkung mit T-Zell-Rezeptoren von CD8-positiven zytotoxischen Lymphozyten, die die präsentierende Zelle abtöten. Klasse I-Moleküle können außerdem in Wechselwirkung treten mit dem Killer Immunoglobulin-like Receptor (KIR), der auf natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) und manchen T-Zellen exprimiert wird (Trowsdale 2001). Die „nichtklassischen“ Klasse I-Gene HLA-E, -F, und -G kodieren für relativ wenig polymorphe Proteine vom Klasse I-Typ. HLA-E wird unter anderem auf ruhenden T-Lymphozyten exprimiert (Koller et al. 1988) und interagiert mit lektinähnlichen NK-Rezeptoren aus dem NKC (Natural Killer Complex) (Braud et al. 1998). Die Funktion von HLA-F ist noch unbekannt, das Protein kann aber mit den Rezeptoren ILT2 und ILT4 interagieren. Die ILT-Gene sind verwandt mit den Genen für KIR4 und sind auf dem Chromosom 19 benachbart (Lepin et al. 2000). HLA-G wird nur in der Plazenta exprimiert und ist wahrscheinlich daran beteiligt, den Fötus vor Abstoßungsreaktionen des mütterlichen Immunsystems zu schützen (King et al. 2000). Die Moleküle MICA und MICB sind entfernt mit Klasse-I-Proteinen verwandt und werden auf den Schleimhäuten des Verdauungstrakts und auf anderen Zellen als Stressantwort exprimiert. MIC-Moleküle sind polymorph, binden aber offensichtlich keine Peptide und sind auch nicht an der Antigenpräsentation an T-Zellen beteiligt. MICA und MICB werden allgemein von intraepithelialen T-Zellen mit JG-T-Zell-Rezeptor erkannt und können nach Induktion durch virale Infektionen als kostimulatorische Moleküle für CD8 DE-T-Zellen dienen (Groh et al. 2001). Sowohl für die Gene der klassischen wie auch nichtklassischen Klasse-I-Moleküle sind nichtexprimierte Pseudogene und Genfragmente im MHC-Lokus vorhanden (z.B. HLA-H, HLA-J, -K, -L, MICC und MICD). Einleitung 6

1.1.2 Der MHC Klasse II-Bereich

Ähnlich wie bei den Klasse-I-Molekülen kann im Klasse II-Bereich zwischen klassischen (HLA-DP, -DQ, -DR) und nichtklassischen Molekülen (HLA-DM und -DO) unterschieden werden. Alle MHC-Klasse-II-Moleküle sind heterodimere Glykoproteine mit Transmembran- domänen; beide Untereinheiten (DE) sind im MHC kodiert und mit Ausnahme von HLA-DO auf dem Chromosom direkt benachbart; die D- und E-Gene von HLA-DQ und HLA-DR liegen in entgegengesetzter Orientierung vor. HLA-DP, -DQ, und -DR-Moleküle werden vorwiegend auf der Oberfläche antigenpräsentierender Zellen exprimiert (vor allem auf Makro- phagen, dendritischen Zellen, B-Zellen) und präsentieren exogene Peptidantigene. Außerdem sind zahlreiche Gene im Klasse II-Bereich vorhanden, die nicht für Peptidrezepto- ren kodieren. Nur gering mit anderen Klasse-II-Sequenzen verwandt ist das mit der Antigen- präsentation assoziierte heterodimere HLA-DM, das über Wechselwirkungen mit dem Klasse II-Komplex ein Degradationsprodukt der Klasse II-assoziierten invarianten Kette, das CLIP- Peptid, aus der peptidbindenden Grube des Klasse II-Moleküls entfernt (Denzin & Cresswell 1995). HLA-DO ist dagegen zu etwa 60 % identisch mit HLA-DR, und spielt ebenfalls eine Rolle bei der Beladung klassischer Klasse-II-Moleküle mit Peptiden, indem es in B-Zellen die Aktivität von HLA-DM moduliert (Brocke et al. 2002). Beide Moleküle sind vorwiegend an den Orten der Peptidbeladung, den MIIC-Vesikeln (MHC II Loading compartments) exprimiert. Weitere Klasse-I-Gene sind TAP1/TAP2 (Transporters associated with antigen presentation) und die interferoninduzierbaren Gene PSMB9 und PSMB8, die Bestandteile des Immun- proteasoms kodieren (früher als LMP2 und LMP7 bekannt, siehe Marsh et al. 2002). Direkt benachbart ist das Gen für Tapasin (TAPB), das an der Antigenprozessierung für Klasse I- Moleküle beteiligt ist (Sadasivan et al. 1996). Andere Gene haben dagegen keinen offen- sichtlichen Bezug zum Immunsystem, so zum Beispiel das Kollagengen COL11A2 aus dem erweiterten Klasse II-Bereich.

1.1.3 Der MHC Klasse III-Bereich

Der Klasse III-Bereich ist ein 730 kb langer Bereich zwischen den Klasse I- und II-Regionen, der sich von BAT1 bis zu NOTCH4 erstreckt und mindestens 62 Gene umfasst (The MHC sequencing consortium 1999). Zahlreiche Gene aus dieser Region sind an Funktionen des Immunsystems beteiligt (Abb. 2). Einleitung

Transkriptionsrichtung exprimierte bekannte Immunloci Paraloge

Abb. 2: Genkarte des MHC-Klasse III-Bereichs. Dargestellt sind Gene (links), Gene mit einem Bezug zum Immunsystem (exprimierte Immunloci, Mitte) und Gene, für die Paraloge bekannt sind (rechts). Aus The MHC Sequencing Consortium 1999. 7 Einleitung 8

Die Klasse III-Region hat eine extrem hohe Gendichte von fast einem Gen pro 11 kb, und zahlreiche Gene sind sehr eng benachbart. G11 und C4 sind durch nur 611 bp voneinander getrennt, und im G11/C4/Z/CYP21/X/Y-Cluster überlappen Gene mit Promotoren der benachbarten Gene. Die Region enthält außerdem eine hohe Anzahl an Retroelementen wie humane endogene Retroviren (HERV) und Alu-Elemente (Kulski et al. 1999). Zahlreiche Gene aus dem Klasse I- und II-Bereich sind hochpolymorph und Polymorphismen finden sich dort auch in nichtkodierenden Bereichen. Im Klasse III-Bereich finden sich dagegen sowohl schwach polymorphe Sequenzen (z.B. C2 und HSP70-HOM) als auch hochpoly- morphe Gene (z.B. C4A, C4B). Die Gene der MHC Klasse III-Region sind von wachsendem Interesse, da eine zunehmende Anzahl von Autoimmunerkrankungen nicht durch bestimmte Klasse I- bzw. II-Allele ursäch- lich erklärt werden kann. Es ist wahrscheinlich, dass einzelne Allele benachbarter Gene aus der Klasse III-Region eine entscheidende Rolle bei der Anfälligkeit gegenüber bestimmten Autoimmunerkrankungen spielen. Beispielsweise wurde der Bereich zwischen G1/AIF und HLA-B als Locus für das variable Immundefektsyndrom bestimmt (Schroeder et al. 1998), und es gibt Hinweise, dass Gene aus der Klasse III-Region an der Anfälligkeit für Morbus Bechterew und IDDM beteiligt sind (Brown et al. 1998, Lie et al. 1999). Andere Krank- heitsbilder, wie kongenitale Hyperplasie oder Sialosidase sind direkt auf Mutationen von Genen der Klasse III-Region zurückzuführen (CYP21B, Morel & Miller 1991 bzw. G9, Bonten et al. 1996). In den letzten zehn Jahren wurde der MHC Klasse III-Bereich genauer untersucht und auf potentielle Gene überprüft (Spies et al. 1989, Sargent et al. 1989, Spies et al. 1989a, Kendall et al. 1990). Spies et al. (1989) isolierten ausgehend von bekannten Genen (LT-A, -B, HLA-B) eine Serie von überlappenden Cosmiden, die einen 435kb großen Bereich zentromerisch von HLA-B umfassten. Aus verschiedenen Zelllinien wurde mRNA isoliert, geblottet und mit Sonden aus diesen Cosmiden hybridisiert. So wurden zunächst fünf transkribierte Bereiche definiert und "HLA-B-assoziiertes Transkript" (BAT) 1-5 genannt. Eine andere Arbeitsgruppe führte ebenfalls 1989 eine ähnliche Studie durch (Sargent et al. 1989). Eine Serie von überlappenden Cosmiden aus dem Klasse III-Bereich wurde zunächst auf die Anwesenheit von HTF-(HpaII tiny fragment) Inseln untersucht. HTF-Inseln sind häu- fig mit 5'-Enden von Genen assoziiert, die meist nicht gewebespezifisch exprimiert werden (Bird 1986, Gardiner-Garden & Frommer 1987). Aus der Nähe von HTF-Inseln wurden Cosmidsonden gewonnen und für Hybridisierungen mit Northern-Blots von Gesamt-RNA aus verschiedenen Zelllinien verwendet. Insgesamt 11 transkribierte Bereiche konnten definiert Einleitung 9 werden und wurden G1-G11 benannt. Mit Ausnahme von G1 und G7 waren die Transkripte in allen untersuchten Zelllinien präsent. Beide Arbeitsgruppen definierten später weitere transkribierte Bereiche, die BAT6 bis BAT9 bzw. G12 bis G18 benannt wurden (Spies et al. 1989, Kendall et al. 1990). Die BAT- und die G-Nomenklaturen überschnitten sich teilweise; so sind G2 und G3 mit BAT2 und BAT3 identisch. Mit der 1999 abgeschlossenen Sequenzierung des menschlichen MHC konnte die genaue Lage der bekannten Gene bestimmt und weitere Loci durch computergestützte Exonvorher- sagen definiert werden (The MHC sequencing consortium 1999). Viele Loci sind zumindest teilweise charakterisiert, und zahlreiche Gene haben einen Bezug zum Immunsystem (Milner & Campbell 2001, Kumanovics et al. 2003). Auffällig ist die fast völlige Abwesenheit von Pseudogenen in diesem Teil des MHC. BAT1 kodiert ein kernlokalisiertes Protein mit Ähnlichkeit zu ATP-abhängigen RNA-Heli- kasen der DEAD-Box-Proteinfamilie (Peelman et al. 1995). Diese Helikasen sind an verschiedenen Prozessen beteiligt, unter anderem Initiation der Translation, RNA-Spleißen, Zusam- menbau von Ribosomen sowie bei der Spermatogenese und Oogenese und zellulären Wachs- tumsprozessen (Schmid & Linder 1992). Es ist möglich, dass BAT1 an den komplexen Spleißvorgängen der Klasse III-Gene LST-1, 1C7 und AIF1 (s.u.) beteiligt ist (Milner & Campbell 2001). INBL oder NFNBIL1 gehört zur Familie der INB Transkriptionsfaktorinhibitoren (Albertella & Campbell 1994). INB-Proteine inhibieren Transkriptionsfaktoren der Rel-Familie. NFNB und andere Mitglieder der Rel-Familie spielen unter anderem bei der Transkription von Zyto- kinen, Zytokinrezeptoren und Stressproteinen sowie zahlreicher anderer Proteine eine Rolle (Beg & Baldwin 1993). Die Zytokine TNF, LTDund LTE gehören zur Großfamilie der TNF-Liganden (Gruss & Dower 1995). TNF wird von vielen Zellen gebildet und hat entzündungsfördernde und immunmodulatorische Aktivitäten. LTDzeigt ähnliche Aktivität, wirkt aber oft schwächer als TNF und wird ausschließlich von Lymphozyten produziert. TNF kommt in einer membrange- bundenen und in einer löslichen Form als Homotrimer vor; LTDkommt ebenfalls als lösliches Homotrimer vor, kann aber mit LTE an der Zelloberfläche Heterotrimere bilden. Polymor- phismen im TNF-Promotor werden mit einer erhöhten Anfälligkeit für zerebrale Malaria in Verbindung gebracht (McGuire et al. 1994). Das Leukozyten-spezifische Transkript (LST-1) ist das menschliche Homolog zum murinen B144-Gen (Holzinger et al. 1995). Es wird auf Monozyten exprimiert und ist dort durch IFN- Einleitung 10

J induzierbar. Vom LST-1-Gen existieren zahlreiche alternative gespleißte Transkripte, mindestens neun Exons werden alternativ gespleißt. In monozytären U937-Zellen sind mindestens 24 verschiedene LST-1-Transkripte nachgewiesen worden (Neville & Campbell 1997). Durch zwei alternativ genutzte Leseraster werden außerdem lösliche und membrangebundene Isoformen des Proteins synthetisiert. Das Mengenverhältnis von löslichem zu membrangebundenem Produkt wird durch IFN-J-Stimulierung beeinflusst (deBaey et al. 1997). 1C7 kodiert für ein Protein aus der Immunglobulin-Großfamilie. Durch alternatives Spleißen entstehen neun verschiedene Transkripte, sechs davon kodieren putative Isoformen des Pro- teins (Neville & Campbell 1999). Die Isoform 1C7c entspricht dem Rezeptor NKp30, der auf natürlichen Killerzellen exprimiert wird und an der Erkennung von Zielzellen beteiligt ist (Pende et al. 1999). AIF1 (Allograft Inflammatory Factor) liegt in drei verschiedenen Transkripten vor, die durch alternatives Spleißen entstehen (Neville & Campbell 1999): AIF1, G1 und IRT-1 (IFN-J- responsive transcript) unterscheiden sich durch die Anzahl der Exons, alternative Startpunkte von Exon 4 und die Retention von Introns. AIF-1 wird in Monozyten exprimiert und ist durch IFN-J induzierbar. AIF-1 wird mit chronischen Abstoßungsreaktionen bei Allotransplantaten in Zusammenhang gebracht (Utans et al. 1996). Die Gene G5B, G5C, G6C, G6D und G6E kodieren für kleine, cysteinreiche Transmembran- proteine, die zur Familie der Ly-6-Rezeptoren gehören (Ribas et al. 1999). Ly-6-Moleküle sind in verschiedenen hämatopoetischen Zellen exprimiert und spielen eventuell eine Rolle während der Lymphozytenentwicklung (Rock et al. 1989). G6E ist wahrscheinlich ein Pseudogen (Ribas et al. 1999). Von allen hier kodierten Ly-6-Transkripten existieren mehrere, je nach Gewebe unterschiedlich häufige Spleißvarianten. Obwohl viele dieser Transkripte durch Retention von Introns oder Intronfragmenten vorzeitige Stopcodons besitzen, sind fehl- gespleißte Formen in einigen Fällen die vorherrschende Transkriptvariante (Mallya et al. 2002). MSH5 (identisch mit G7) kodiert ein Homolog des bakteriellen Mismatch-Reparaturproteins MutS (Her & Doggett 1998, Winand et al. 1998). Eukaryontische MutS-Homologe sind entweder an Mismatch-Reparaturprozessen beteiligt oder spielen eine Rolle bei der Rekombi- nation während der Meiose (Culligan et al. 2000). Im Menschen ist MSH5 besonders stark in Hoden transkribiert und das Protein wird vorwiegend während einer Phase der Spermato- genese exprimiert, so dass eine Rolle bei der Keimzellentwicklung naheliegt (Bocker et al. 1999). Einleitung 11

Das Val-TRS (G7a)-Gen kodiert die menschliche Valyl-tRNA-Synthetase (Hsieh & Campbell 1991). Die HSPA1A und -B-Gene kodieren beide das Hsp70-Protein, während das benachbarte HSPA1L ein nicht hitzeinduzierbares Hsp70-Homolog kodiert (Milner & Campbell 1990). Hsp-70-Proteine können fehlgefaltete oder partiell gefaltete Proteine binden und als Chaperone während der Biosynthese, Faltung und dem Abbau von Proteinen dienen. Für Hsp70 wird in Zusammenwirken mit dem zytosolischen Chaperon gp96 eine Rolle bei der Peptidbeladung von Klasse-I-Molekülen angenommen (Srivastava et al. 1994). G9 (oder Neu1) kodiert eine Sialidase (Milner et al. 1997). Nach Aktivierung von T-Zellen wird eine erhöhte Sialidaseaktivität gemessen; in Mäusen mit dem Allel Neu1a ist diese erhöhte Enzymaktivität nicht messbar. Eine Rolle für Neu1 bei der T-Zell-Aktivierung ist daher denkbar (Milner et al. 1997, Carrillo et al. 1997). Drei Gene für Bestandteile des Komplementsystems, des Effektorsystems der humoralen Immunität, sind im MHC eng benachbart (diskutiert in Mizuki et al. 1997). C2 und C4 sind am klassischen Weg der Komplementaktivierung beteiligt, während Faktor B (Bf) ein Teil des alternativen Wegs ist. C2 und Bf sind eng verwandt, auf dem Chromosom lediglich durch 421 bp getrennt und vermutlich durch Genduplikation entstanden (Wu et al. 1987). C4A und C4B sind sich untereinander sehr ähnlich; C4B wird je nach Vorhandensein eines HERV- Elements in Intron 9 in einer kürzeren oder längeren Form exprimiert (Tassabehji et al. 1994). Beide C4-Gene sind hochpolymorph, C2 und Bf sind deutlich weniger variabel (Campbell et al. 1990, Cross & Thomson 1990). Die Anzahl der C4-Gene schwankt zwischen zwischen keinem und vier Genen, meistens sind zwei Gene (C4A und B) vorhanden (Martinez et al. 2001). Partielle C4-Defizienz wird unter anderem mit systemischem Lupus (SLE) und Sklero- dermie in Verbindung gebracht (Hauptmann et al. 1988). SKI2W (oder G11a) ist eine RNA-Helikase mit einer großen Ähnlichkeit zu dem antiviralen Hefeprotein Ski2 (Superkiller 2). SKI2W interagiert auf genetischer Ebene mit dem direkt benachbarten Gen DOM3L; beide Proteine sind ubiquitär exprimiert und vermutlich am RNA-Metabolismus beteiligt (Dangel et al. 1995, Yang et al. 1998). Lysophosphatidylsäure (LPA)-Acetyltransferase (LPAAT oder G15) spielt eventuell eine Rolle bei entzündlichen Prozessen (Aguado & Campbell 1998). LPA ist ein intrazellulärer Botenstoff, der von vielen Zellen nach IL-1E-, TNFD- oder LPS-Stimulation gebildet wird (diskutiert in Leung 2001). RAGE ist ein Multiligandenrezeptor mit IgV und IgC-Domänen, der AGE-Liganden (Advanced glycosylation end products), das Kernprotein Amphoterin und S100/Calgranuline bindet (Neeper et al. 1992, Sugaya et al. 1994). Letztere sind proinflammatorische Zytokine, Einleitung 12 die bei chronischen Entzündungen Lymphozyten und Makrophagen aktivieren können (Schmidt et al. 2001). NOTCH-4 kodiert ein Mitglied der Notch-Transmembranproteine, die an Zell-Zell-Inter- aktionen beteiligt sind und eine wichtige Rolle bei der Steuerung der Zelldifferenzierung und Entwicklung spielen (Fortini & Artavanis-Tsakonas 1993). Gene ohne bekannten Bezug zum Immunsystem sind in der vorstehenden Liste bis auf wenige Ausnahmen nicht aufgeführt. Vom telomeren Ende des Klasse III-Bereichs angefangen, befinden sich darunter ein Gen für ein Homolog einer ATPaseG Untereinheit (ATP6G)(Neville & Campbell 1999), ein neues Apolipoprotein (ApoM bzw. G3a)(Xu & Dahlback 1999), eine Caseinkinase II E-Untereinheit (CSK2B)(Albertella et al. 1996), ein Dimethylarginin-Di- methylaminohydrolase-Homolog (DDAH oder G6a)(Ribas et al. 1999), ein nukleärer Chloridionenkanal (CLIC1/G6) (Ribas et al. 1999), ein putatives von-Willebrand-Faktor- Protein (G7c) (Kumánovics et al. 2001), ein snRNP-D-Homolog (G7b bzw. snRNP)(The MHC sequencing consortium 1999), der Cholintransporter CTL4 oder NG22 (O’Regan et al. 2000), eine Histonmethyltransferase (G9a, Tachibana et al. 2001, Tachibana et al. 2002), ein Zinkfingergen (G10) (The MHC sequencing consortium 1999), ein RNA-bindendes Protein mit RD-Repeat (RD) (Yang et al. 1998), Serin-Threonin-Kinase 19 (G11/STK19)(Gomez- Escobar et al. 1998), die Steroid-21-Hydroxylase CYP21 bzw. P450-C21B (Higashi et al. 1986), das extrazelluläre Matrixprotein Tenascin X (TNXB)(Mao et al. 2002), das cAMP- Response-Element CREBL1 (G13)(Khanna & Campbell 1996), ein Protein mit FK506- Bindungsmotiv (NG7) (The MHC sequencing consortium 1999), Palmitoyl-Proteinthio- esterase (PPT2/G14)(Sugaya et al. 1994, Sugaya et al. 1997), das Ring-Finger-Protein G16 (The MHC sequencing consortium 1999) und das Homöodomänenprotein PBX2 (G17) (Sugaya et al. 1994, Aguado & Campbell 1995). Andere Gene aus dieser Region sind noch völlig uncharakterisiert, so z.B. BAT4 (G5), G4 (NG34), BAT5 (NG26), NG23 (G7D), NG22, NG5 und NG18. G8 ist wahrscheinlich ein Pseudogen (The MHC sequencing consortium 1999). Auffällig ist die Häufung von Genen in der Klasse III-Region, die bei Entzündungen oder Infektionen eine Rolle spielen, u.a. der TNF-Cluster, LST-1, 1C7, AIF, NFN%IL. Der Bereich der Klasse III-Region von BAT1 bis zum SKI2W-Locus ist daher auch als MHC Klasse IV- Bereich bezeichnet worden (Gruen & Weissmann 1997). Mittlerweile ist bekannt, dass der Klasse III-Bereich in Maus und Mensch etwa gleich groß ist, die Anordnung der Gene weitgehend gleich ist und alle menschlichen Gene aus dieser Region ein Ortholog im murinen Klasse-III-Bereich haben. Lediglich der Bereich zwischen CREBL1 Einleitung 13 und RD, der auch das C4-Gen enthält, unterscheidet sich in der Art und Anzahl der Duplika- tionen, die stattgefunden haben (Xie et al. 2002, Kumánovics et al. 2003).

1.2 BAT2

Die cDNA-Sequenz von BAT2 wurde 1990 veröffentlicht (Banerji et al.1990). Aus einer HPB-ALL-cDNA-Bank wurde dabei eine Serie von überlappenden Klonen isoliert und anschließend die cDNA-Sequenz bestimmt. Die cDNA war 6,7 kb lang, und aus genomischen Klonen wurde die Lage der ersten vier Exons bestimmt. Die abgeleitete Aminosäuresequenz war 2142 Reste lang, und das postulierte Protein hatte ein Molekulargewicht von 228 kD (ohne etwaige Modifikationen). Die Arbeitsgruppe um Iris (1993) sequenzierte 1993 einen 90 kb großen Abschnitt des MHC Klasse III-Bereichs, der unter anderem ein 5’-Fragment des BAT2-Gens enthielt. So konnte die Lage der ersten 24 Exons (entsprechend ca. 85 % des translatierten Bereichs der cDNA) bestimmt werden. Die abgeleitete Aminosäuresequenz entsprach bis auf eine Insertion von 36 bp in Exon 11 weitgehend der von Banerji et al. publizierten Sequenz. Herausragendstes Merkmal von BAT2 ist der hohe Prolingehalt. Über 19 % der Aminosäure- reste sind Proline, so dass BAT2 zum Zeitpunkt der Publikation von Banerji et al. das Protein mit dem höchsten Gehalt an Prolin war. Das vorhergesagte BAT2-Protein besaß mit den Aminosäuren PKPPKP ein prolinreiches Motiv, das in der humanen invarianten Kette und dem Glykoprotein B aus HSV-1 Stamm 17 vorkommt. In der invarianten Kette liegt es in einem Bereich, der für die Interaktion mit MHC Klasse II-Molekülen verantwortlich ist (Freisewinkel 1995). Im Glykoprotein B aus HSV-1 Stamm 17 befindet sich dieses Motiv ebenfalls an einer Stelle, die für die Bindung an MHC Klasse II-Moleküle erforderlich ist (Sievers 2002). Das BAT2-Protein besitzt drei Typen von repetitiven Sequenzen: vier Repeats vom Typ A, zwei vom Typ B und drei vom Typ C (Banerji et al. 1990). Diese Repeats zeigen keine signifikanten Ähnlichkeiten untereinander, zu anderen bekannten Proteinen oder zum benachbarten BAT3-Protein. Das BAT2-Protein besitzt mehrere RGD-Motive, von denen drei in einem zentralen 95 Aminosäure langen Abschnitt liegen (Banerji et al. 1990). RGD-Motive spielen eine Rolle in der Zelladhäsion, wo sie die Bindung von Proteinen des Integrinrezep- tortyps mit ihren Liganden vermitteln. Proteine mit funktionalen RGD-Motiven sind zum Beispiel Fibronectin, Vitronectin und einige Kollagene (Ruoshlati 1996). Einleitung 14

Abgesehen von Transkriptionsmustern in verschiedenen Tumorzelllinien sind keine weiteren Daten über BAT2 publiziert; biochemische Eigenschaften, Lokalisation und Funktion des BAT2-Genprodukts sind unbekannt. Mittels humaner cDNA-Sonden wurde die Existenz eines murinen Orthologs nachgewiesen (Lafuse et al.1992) und im Zuge der Charakterisierung des murinen H2-Komplexes die Lage des Orthologs genauer bestimmt (Gasser et al. 1994). Ebenfalls durch Kreuzhybridisierung konnte ein BAT2-Homolog im MHC des Hausschweins Sus scrofa nachgewiesen werden (Nunes et al. 1994). Aufgrund der vermuteten Beteiligung von Genen aus dem Klasse III-Bereich an verschiedenen Erkrankungen wurden polymorphe Sequenzen charakterisiert, um als Marker zur Be- stimmung des Genorts von Kandidatengenen zu dienen. Verschiedene Restriktionsfragment- Längenpolymorphismen (RFLPs) und deren Kopplung an bestimmte HLA-B-Allele wurden auch in der Nachbarschaft des BAT2-Gens untersucht (Fugger et al.1990, Cross et al. 1991). Ein statistischer Zusammenhang eines BAT2-RFLPs mit erhöhter Anfälligkeit für rheuma- tischer Arthritis (RA), Sjögrens Syndrom (SS) und SLE konnte gezeigt werden, allerdings blieb unklar, ob es sich nicht um Sekundäreffekte handelte und eventuell andere Marker (u.a. HLA-B-Allele) einen direkteren Einfluss hatten (Fugger et al. 1991). Neuere Arbeiten haben das 78 kb telomer gelegene INBL-Gen als den Genlocus im MHC identifiziert, dessen Allele (neben HLA-DRB1) für ein erhöhtes RA-Risiko verantwortlich sind (Okamoto et al. 2003). Eine Studie hat das Expressionsmuster verschiedener Gene in der promyelotischen HL-60-

Zelllinie nach 1,25(OH)2D3-induzierter Differenzierung untersucht (Savli et al 2002).

24 Stunden nach 1,25(OH)2D3-Gabe war das BAT2-Transkript auf 36 % seines Normalwertes herunterreguliert. Nach 72 Stunden war die Expression wieder auf normalem Niveau. BAT3 befand sich nicht unter den untersuchten Genen.

1.3 BAT3

Die cDNA-Sequenz von BAT3 wurde 1990 zusammen mit der Sequenz von BAT2 veröffent- licht (Banerji et al.1990). Die BAT2- und BAT3-Gene sind direkt benachbart und ihre Trans- kriptionsrichtung ist entgegengesetzt. Die BAT3-cDNA war 3,7 kb groß und kodierte für ein vorhergesagtes Protein von 1132 Aminosäuren Länge. Die Lage der ersten zwei Exons wurde durch Sequenzierung genomischer Klone bestimmt. In der vermuteten Promotorregion wurde ein Hitzeschockelement identifiziert; ein Hitze- schock hatte allerdings in HeLa-Zellen keinen Einfluss auf die Transkriptionsrate von BAT3 Einleitung 15

(Banerji et al. 1990). Ähnlich wie für BAT2 wurden auch in der Umgebung des BAT3-Gens polymorphe Sequenzen als RFLPs charakterisiert (Pei et al. 1991) und mit bestimmten HLA- B und HLA-DR-Haplotypen in Verbindung gebracht. Zwischen bestimmten Allelen der BAT3-Polymorphismen und IDDM konnte ein statistischer Zusammenhang gezeigt werden (Degli-Eposti et al. 1992). Die BAT3-cDNA wurde ursprünglich aus Zelllinien leukämischen Ursprungs beschrieben (Banerji et al. 1990). Das Rattenortholog von BAT3 wird vorwiegend in Testis exprimiert und dort vor allem in Keimzellen (Wang & Liew 1994, Ozaki et al. 1999). Wie BAT2 ist auch das BAT3-Protein mit 13,6 % Prolinen sehr prolinreich. Im aminoterminalen Bereich von BAT3 findet sich ein 75 Aminosäuren langer Bereich, der zu 35 % zu Ubiquitin homolog ist. Ähnlich wie im Fall von BAT2 findet sich eine repetitive Sequenz von 29 Aminosäuren Länge, die insgesamt viermal im BAT3-Protein vorhanden ist. Diese repetitive Sequenz zeigt keine Ähnlichkeit zu den repetitiven Sequenzen aus BAT2 oder zu anderen bekannten Proteinen (Banerji et al. 1990). BAT3 enthält ein funktionales Kernlokalisierungssignal (Manchen et al. 2001); Berichte, nach denen es sich um ein zytoplasmatisches Protein handelt, sind vermutlich auf die verwendeten Fusionskonstrukte zurückzuführen (Ozaki et al. 1999). In einem Two-Hybrid-Experiment wurde BAT3 als Interaktionspartner von CAP, einem Homolog des Adenylylzyklase-assoziierten Proteins aus S. cerevisiae identifiziert (Hubberstey et al. 1996). In einer anderen Two-Hybrid-Studie wurde BAT3 als Interaktionskandidat für den potentiellen Tumorsuppressor DAN identifiziert (Ozaki et al. 1999). In beiden Studien wurden die Ergebnisse aus den Two-Hybrid-Experimenten nicht mittels anderer Nachweismethoden verifiziert. BAT3 besitzt am Carboxyterminus eine BAG-Domäne (Thress et al. 2001). BAG-1, der Prototyp dieser Proteinfamilie, wurde als Interaktionspartner des antiapoptotischen Proteins Bcl-2 identifiziert (Bcl-2-associated athanogene, Takayama et al. 1995) und besitzt wie BAT3 eine N-terminale ubiquitinähnliche Domäne. BAG-Proteine können verschiedene zelluläre Prozesse regulieren, darunter die Aktivität von Proteinkinasen, Signaltransduktionsvorgänge und die Aktivität von Transkriptionsfaktoren (diskutiert in Takayama & Reed 2001). BAG-1 interagiert über die BAG-Domäne mit der ATPase-Domäne von Hsp70/Hsc70 und kann die Aktivität dieser Chaperone bei der Neufaltung von Proteinen oder Stabilisierung von fehlgefalteten Proteinsubstraten positiv oder negativ regulieren (Takayama et al. 1999). BAG-1 kann unabhängig von Hsp70 an das 26S-Proteasom binden und stellt so eine Verbin- dung des Chaperonsystems mit dem System der proteasomalen Proteindegradation her (Lü- Einleitung 16 ders et al. 2000). In Kooperation mit der Ubiquitinligase CHIP kann BAG-1 so die proteasomale Degradation von Chaperonsubstraten fördern (Demand et al. 2001). BAG-1 bindet ATP-abhängig an Bcl-2; Überexpression von BAG-1 verringert besonders bei Koexpression von Bcl-2 die Empfindlichkeit für apoptotische Stimuli (Takayama et al. 1995), und in manchen Zelltypen ist eine Assoziation von BAG-1 mit Mitochondrien beobachtet worden (Takayama et al. 1998). Ein weiterer Interaktionspartner ist die Serin/Threonin- Proteinkinase Raf-1 (Wang et al. 1996). BAG1 bindet an die katalytische Domäne von Raf-1 und aktiviert so Raf-1. Neuere Studien zeigen, dass Raf-1 und Hsp70 Kompetitionspartner für die Bindung an BAG-1 sind (Song et al. 2001). Eine BAG-Domäne besteht aus drei antiparallelen Helizes von jeweils 30-40 Aminosäuren Länge. Die ersten beiden Helizes interagieren mit der Serin/Threoninkinase Raf-1, und die zweite und dritte Helix können an die ATPase-Domäne von Hsp70/Hsc70 binden. BAG-1 könnte dadurch als zentraler Regulator der Zellproliferation fungieren: in normalen Zellen fördert BAG-1 das Zellwachstum durch Aktivierung von Raf-1; in Zellen unter Stress könn- ten erhöhte Konzentrationen von Hsp70 Raf-1 aus der Bindung an BAG-1 verdrängen und so das Zellwachstum inhibieren (Doong et al. 2002). BAG1 kann mit verschiedenen Steroidhormonrezeptoren interagieren und die Aktivität dieser Rezeptoren beeinflussen (Zeiner & Gehring 1995, Kullmann et al. 1998). BAG-1 existiert in vier Isoformen, die von einer mRNA durch alternative Initiationsstartpunkte translatiert werden und sich in der Länge ihrer aminoterminalen Bereiche unterscheiden (Packham et al. 1997). BAG-1L interagiert mit dem Androgenrezeptor und verstärkt dessen Trans- kriptionsaktivität (Froesch et al. 1998). BAG-1M dagegen bindet und inhibiert den Glukokor- tikoidrezeptor (Kullmann et al. 1998). Neben den unterschiedlichen Eigenschaften bei der Interaktion mit Steroidhormonrezeptoren besitzen die verschiedenen Isoformen ebenfalls unterschiedliche Eigenschaften bei der Modulation der Hsp70-Aktivität (Lüders et al. 2000) und Inhibition der Apoptose (Chen et al. 2002). Die Expression bestimmter Isoformen in humanen Tumoren ist mit günstigem bzw. negativem Krankheitsprognosen korreliert worden (Turner et al. 2001, Tang et al. 1999, Yamauchi et al. 2001). Kürzlich wurde mit Scythe das Xenopus-Ortholog von BAT3 isoliert, das auf Aminosäure- ebene zu 57 % mit BAT3 identisch ist und in vitro mit dem proapoptotischen Drosophila-Pro- tein Reaper interagiert (Thress et al. 1998). Reaper und die verwandten Drosophila-Proteine Grim und Hid binden an IAPs (inhibitor of apoptosis proteins) und bewirken so die Aktivie- rung von Caspasen, deren Aktivität essentiell für den programmierten Zelltod ist (Wang et al. 1999, Goyal et al. 2000). Reaper, Grim und Hid können auch in Säugetierzellen Apoptose Einleitung 17 auslösen (McCarthy & Dixit 1998). Ein Sequenzhomolog zu Reaper ist bisher aus Säugetieren nicht bekannt. In Extrakten von Xenopus-Oozyten induziert rekombinantes Reaper Apoptose (unter anderem die charakteristische Cytochrom-C-Freisetzung aus Mitochondrien, Aktivierung von Caspa- sen und apoptotische Kernfragmentierung); wird endogenes Scythe aus Oozytenextrakten depletiert, hat Reaper keine apoptotische Wirkung mehr. Ein C-terminales Fragment von Scythe konnte in Xenopus-Oozytenextrakten auch ohne Zugabe von Reaper Apoptose induzieren, nicht aber an isolierten Mitochondrien Cytochrom-C-Freisetzung bewirken (Thress et al. 1998). Reaper setzt aus Scythe-Immunpräzipitaten einen noch uncharakterisierten Faktor frei, der in Xenopus-Oocytenextrakten Apoptose induzieren kann und in Mitochondrienpräparationen Cytochrom C freisetzt (Thress et al. 1999). Eine direkte Interaktion von Scythe und Reaper in vivo wurde bisher nicht gezeigt. Ein Säugerprotein mit einer analogen Funktion zu Reaper ist Smac bzw. das Mausortholog Diablo (Du et al. 2000, Verhagen et al. 2000). Smac ist ein proapoptotisches Molekül, das im Intermembranbereich von Mitochondrien lokalisiert ist. Durch apoptotische Stimuli wird die mitochondriale Membran permeabilisiert und unter anderem werden Smac sowie Cytochrom C freigesetzt. Smac kann daraufhin an IAPs durch Bindung inaktivieren und so Caspasen aktivieren (Du et al. 2000, Verhagen et al. 2000). Smac wird als inaktives Vorläuferpeptid mit einer mitochondrialen Lokalisierungssequenz (MLS) synthetisiert; nach dem Transport in die Mitochondrien wird das N-terminale MLS-Signal abgespalten und die aktive, apoptoseför- dernde Form liegt vor. Grim, Hid und Reaper besitzen dagegen kein MLS, obwohl Grim und Hid mit Mitochondrien kolokalisieren, wenn sie in Säugerzellen exprimiert werden (Claveria et al. 1998, Haining et al. 1999). Kürzlich wurde aus dem C-terminalen Bereich von Grim die proapoptotische GH3-Domäne beschrieben, die für die mitochondriale Lokalisierung von Grim und für einen Teil der proapoptotischen Wirkung verantwortlich ist. In Reaper und Sickle (einem weiteren proapoptotischen Drosophila-Protein) ist diese Domäne konserviert (Claveria et al. 2002). BAT3 aus Xenopus bindet ebenfalls an Hsp70-Proteine und inhibiert die Neufaltung von Substraten (Thress et al. 2001). Die inhibitorische Wirkung von Xenopus-BAT3 wird durch Reaper moduliert: in Gegenwart von Reaper ist die inhibitorische Wirkung von BAT3 je nach der Menge von zugegebenem Reaper reduziert bzw. völlig aufgehoben. Auf der Basis dieser Beobachtungen wurde ein Modell vorgeschlagen, das einen Komplex aus Hsp70, Scythe und dem undefinierten proapoptotischen Faktor postuliert. Die substratbindende Domäne von Einleitung 18

Hsp70 bindet den proapoptotischen Faktor, während BAT3 über die BAG-Domäne an Hsp70 bindet. Die Bindung von Reaper könnte dann die Bindung von BAT3 an Hsp70 aufheben und so den proapoptotischen Faktor freisetzen (Thress et al. 2001).

1.4 Zielsetzung der Arbeit

Die BAT2- und BAT3-Gene wurden als MHC-lokalisiertes Genpaar beschrieben, das für zwei putative prolinreiche Proteine ohne Ähnlichkeit zu anderen Proteinen kodiert. BAT2 und BAT3 sind auf dem Chromosom 6 in der MHC Klasse III-Region direkt benachbart und gegenläufig orientiert. Im Rahmen dieser Arbeit sollten BAT2 und BAT3 kloniert und charakterisiert werden. Ähnelt sich die Intron-Exon-Struktur? In welchen Geweben werden beide Gene exprimiert? Sind die Expressionsmuster der beiden Transkripte vergleichbar? Auf biochemischer Ebene sollte untersucht werden, wie die Polypeptide beschaffen sind, die von beiden Genen kodiert werden. Wo sind die Proteine in der Zelle lokalisiert? Ähnelt sich die subzelluläre Lokalisierung? BAT3 ist mit Proteinen der BAG-Familie verwandt. Daher sollte untersucht werden, ob das Protein ähnliche Funktionen wie BAG-1, der Prototyp der BAG-Proteinfamilie wahrnehmen kann: Hat BAT3 einen Einfluß auf die Proteindegradation, und spielt BAT2 dabei eine Rolle? Die Interaktion von BAT3 mit proapoptotischen Faktoren wurde bisher nur für das Xenopus- Ortholog in vitro in heterologen Systemen gezeigt. Interagiert humanes BAT3 in vivo mit dem proapoptotischen Protein Smac aus Säugerzellen? Unter Berücksichtigung dieser Fragen sollten beide Gene, ihre Transkripte und Polypeptide charakterisiert werden. Material und Methoden 19

2 Material und Methoden

2.1 Geräte

Agarosegelelektrophorese Owl Scientific, Oregon, USA Begasungsbrutschrank Heraeus, Zürich, Schweiz Entwicklermaschine Curix-60 Agfa-Gevaert-AG, Leverkusen Feinwaagen Sartorius Fluoreszenzmikroskop Zeiss, Oberkochen Geltrockner-Thermostat cti, Idstein/Taunus Konzentrationseinheit Amicon, Witten Mikroliterpipetten Labystems, Finnland Neubauerzählkammer Faust, Köln Netzgeräte Renner, Darmstadt Pipettierhilfen Hirschmann pH-Meter Orion 42 A Hitachi, Ratingen Proteinelektrophoresekammern cti, Idstein / Taunus Röntgenkassetten Faust, Köln Rollereinheit Technomara, Wallisellen, Schweiz Sequenzgelapparatur Owl Scientific, USA Tiefkühltruhe (-80°C) Colora, Ratingen Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg UV-Crosslinker Stratalinker, Stratagene Vakuumpumpe ME 4-C Heidolph, Kehlheim Vortex Genie 2 Bender & Holbein, Zürich, Schweiz Zentrifugen: Z 200 M/H Hermle, Wehingen Biofuge 22R, 28RS Heraeus, Zürich HL60 Zentrifuge Beckman, Hamburg Megafuge 1.0 Heraeus, Zürich TL Ultrazentrifuge Beckman, Hamburg Material und Methoden 20

2.2 Verbrauchsmaterialien

Einfrierröhrchen Nunc, Wiesbaden Einmalspritzen und -kanülen Henke-Sass Wolf, Tuttlingen Entwickler und Fixierer für Röntgenfilme Agfa-Gevaert AG, Leverkusen Gel-blotting Papier Schleicher & Schuell, Dassel Kammerobjektträger Nunc, Wiesbaden Nitrozellulosemembran BA85 Schleicher & Schuell, Dassel Nylonmembran Hybond-N Amersham Nylonmembran xyz Ambion, USA Polystyrolröhrchen für die Transfektion Bibby Sterilin Ltd., Staffordshire, England Reaktionsgefäße, 1,5 ml Sarstedt, Nümbrecht Röntgenfilme Biomax MR, MS, XOMat-Blue Kodak Company, New York, USA Röntgenfilm Hyperfilm ECL Amersham Rollerflaschen Sarstedt, Nümbrecht Zellkulturschalen TPP (Renner, Darmstadt) Zentrifugierröhrchen TPP (Renner, Darmstadt)

Reagenzien: Alle nicht aufgeführten Laborchemikalien wurden von Merck (Darmstadt), Applichem (Darmstadt) oder Sigma (Deisenhofen) bezogen

30 % Acrylamid/Bisacrylamid (37,5:1) Roth Ampicillin Sigma, Deisenhofen Aprotinin Sigma, Deisenhofen Ammoniumpersulfat Sigma, Deisenhofen Benzamidin Sigma, Deisenhofen E-Mercaptoethanol Roth Bromphenolblau Sigma, Deisenhofen BSA (Fraktion V) Serva, Heidelberg CL-4B-Sepharose Pharmacia, Freiburg Digitonin, wasserlöslich Fluka, Deisenhofen Material und Methoden 21

DMEM, 1,5 g/l Glucose Cambrex DMEM, 4,5 g/l Glucose Cambrex Dimethylsulfoxid (DMSO) für die Zellkultur Sigma, Deisenhofen Diphenyloxazol (PPO) in DMSO Roth, Karlsruhe DMSO für die Gelentwässerung Roth, Karlsruhe Dosper Transfektionsreagenz Roche, Mannheim DTT (Dithioerithrol) Biorad, Richmond, USA FCS Biochrom, Heidelberg Fluoreszenz-Einbettmedium Mowiol, Calbiochem Ham’s F12 Medium Cambrex Hybridisierungslösung UltraHyb Ambion, Texas Hybridisierungslösung ExpressHyb Clontech, Heidelberg Hygromycin Applichem, Darmstadt L-Glutamin Sigma, Deisenhofen Leupeptin Sigma, Deisenhofen m-Maleimidobenzoyl-N- Hydroxysuccinimide-Ester (MBS) Pierce Nonidet-P40 (NP40) Fluka, Buchs, Schweiz PMSF Serva, Heidelberg RNAse-away Applichem Protein-A-Sepharose Pharmacia, Freiburg Pyruvat Merck, Darmstadt

Radioisotope: >32P@-ATP Amersham, Braunschweig >35S@-Methionin Amersham, Braunschweig >35S@-ATP Amersham, Braunschweig

RPMI 1640 Cambrex Penicillin/Streptomycin, 100 U/ml, 100 µg/ml Cambrex TEMED Biorad, Richmond, USA Tris ICN Biomedicals GmbH, Eschwege Triton-X 100 Merck Material und Methoden 22

Trypsin/EDTA (0,5 g/l Trypsin 1:250, Cambrex 0,2 g/l EDTA)

Kits und sonstige Reagenziensätze:

DNA-Sequenzierung Sequenase T7 Kit, Amersham In-vitro-Transkription/Translation Promega TnT-Quick T7 Plasmidpräparationskits Biorad, Sigma (Mini) Qiagen, Macherey-Nagel (Midi, Maxi) RNA-Präparationskits Qiagen Total RNA-Kit TOPO-Klonierung Invitrogen pCRII, pCR2.1 (Klonierung) pcDNA3.1-V5-His, pcDNA3.1D-V5-His (eukaryontische Expression) Random-Priming-DNA-Labelling Amersham Megaprime

Größenstandards: DNA-Leitern 1 kb-Leiter, MBI Fermentas 50 bp-Leiter, Invitrogen Lambda/HindIII-DNA-Marker, Gibco Proteinstandards: Prestained Proteinmarker wide-range, NEB Vorgefärbter Proteinmarker, Biorad 14C-markierter Proteinstandard, Amers- ham (CFA626) RNA-Leiter Sigma

2.2.1 E.coli-Bakterienstämme

BL21 (F–, ompT, hsdS (rB-, mB-), gal) ist ein proteasedefizienter Stamm, der zur Expression rekombinanter Proteine benutzt wird.

DH5D(supE44, 'lacU169 (I80 lacZ 'M15), hsdR17, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, relA1) ist ein gebräuchlicher Stamm zur Klonierung und Propagation von rekombinanten Plasmiden Material und Methoden 23

M15 (nals, strs, rifs, thi-, lac-, ara, gal, mtl-, F-, recA, uvr, lon) wurde ebenfalls zur Expression rekombinanter Proteine benutzt.

TOP10 (mcrA, delta (mrr-hsdRMS-mcrBC), I 80'lac 'M15, ' lacX74, deoR, recA1, araD139 ' (ara, leu), 7697, galU, galK, lambda-, rpsL, endA1, mupG) wurde für die Transformation von TOPO-Klonierungsprodukten eingesetzt.

2.2.2 Zelllinien

CEM-C7 (ATCC CCL-119), humane leukämische T-Zelllinie, Kultur in RPMI, 10 % FCS CHO (ATCC CCL-61), Chinese Hamster Ovary, Kultur in Ham’s F12, 2mM Glutamin, 10 % FCS. COS-1, (ATCC CRL-1650), SV-40-transformierte Affennierenzellen. Diese Zellen enthalten genau eine integrierte Kopie der kompletten frühen Region von SV40. Kultur in DMEM (High Glucose), Glutamin, Pyruvat, Pen/Strep COS-7 (ATCC CRL-1651), ähnlich COS-1, Kultur wie COS-1 HeLa (ATCC CCL-2), humanes Adenokarzinom. Kultur in DMEM (low glucose), 1 mM Pyruvat, Glutamin, Pen/Strep, 10 % FCS HT29 (ATCC HTB-38), humanes colorektales Adenokarzinom (Dickdarm); McCoy's 5a Me- dium mit 1.5 mM L-Glutamin, HuT 78 (ATCC TIB-161), humanes T-Lymphom, Kultur in DMEM (high Glucose), 10 % FCS. P388D1 (ATCC CCL-46), murine lymphoblastoide Zelllinie vom Makrophagentyp, Kultur in DMEM (high Glucose), 10 % FCS Raji (CCL-86), humanes Burkitt-Lymphom, Kultur in RPMI, 10 % FCS. T2 (ATCC CRL-1992 ), humanes T-B-Zell-Hybrid aus den Zellinien 721.174 (B-Zelllinie) und CEMR.3 (T-Zelllinie). Kultur in RPMI, 10 % FCS.

2.2.3 Antikörper anti-GST-Antiserum aus Ziege Pharmacia anti-His (C-term) Invitrogen anti-His Roche anti-Kaninchen Ig-Antikörper, HRP-gekoppelt Amersham Material und Methoden 24 anti-Kaninchen Ig-Antikörper, HRP-gekoppelt Sigma anti-Kaninchen-Ig-ALEXA Molecular Probes, Oregon anti-Maus-Ig Antikörper, HRP-gekoppelt Sigma anti-Maus-Ig-ALEXA, gelb Molecular Probes, Oregon anti-Maus-Ig-ALEXA, rot Molecular Probes, Oregon anti-Maus-Ig-ALEXA, rot Molecular Probes, Oregon anti-myc Invitrogen anti-Ratte-Ig Antikörper, HRP-gekoppelt DAKO, Hamburg anti-Ratte-Ig-ALEXA, gelb Molecular Probes, Oregon anti-SMAC Antiserum Biocarta anti-SMAC monoklonaler Antikörper Calbiochem-Novachem anti-V5 Invitrogen anti-Ziegen-Ig Antiserum, HRP-gekoppelt Pharmacia In-1 (anti-invariante Kette) Koch et al. 1982 M2 (anti-FLAG) Sigma, St. Louis MAR 18.5 (monoklonaler Maus-anti-Ratte-Ig-AK) Lanier et al., 1982

2.2.4 Peptide

Peptide wurden von Interactiva Biosciences, Tübingen synthetisiert.

BAT2-N-term: NH2-MSDRSGPTAKGKDGKKY-Cys BAT2-C-term: Cys-EEPGSRGDKEPGLPPPR-COOH

2.2.5 Oligonukleotide

Oligonukleotide wurden von den Firmen Ark (Göttingen) bzw. Metabion (Martinsried) synthetisiert.

100F: GACCCAACATACTCAATGAGCTTCCAGCG 1900R: GGTTCCACCTTTGGAACT 1210.F: CTTCTGGTGAGGAACGGC 2921.R TCTACTTTTGTAGGTGGTGGAGG 5448.F GCCATTCCTGTATCACGA Material und Methoden 25

6512.R TCAGCGGGGTGGGGGCAA cDNA-Start-SacI-AscI TGAGCTCGGCGCGCCATGTCCGATCGCTCGGGG BAT2.301.R TGGGGTCATTGCCTTTGTTCTCGG BAT2-1.F: ATGTCCGATCGCTCGGGG BAT2-1.R: GCGGTAGGGAGGGAACT BAT2-4.F: GAGCGAGACTCCTCCAGT BAT2-4.R CTTCGGTTCTTGGGAGAG BAT2-5.F TCGTCCTCCAGAGGAGCG BAT2-5.F CTCAGTGACTGATGCTGT BAT2-6.F GCCATTCCTGTATCACGA BAT2-6.R TCAGCGGGGTGGGGGCAA BAT2-His-Tag CCTGGGTTGCCCCCACCCCGCCACCATCACCATCATCATTGAATTCGGGAGTTCCTCTTGCC CCCTA BAT2-Selection GGCCTTCCAGTTCTCAAATCTCTGGGGGGAGCCAT AscI-NotI-sense GGCGCGCCGTTAACGCGGCCGCA AscI-NotI-antisense GGCCTGCGGCCGCGTTAACGGCGCGCCGTAC NotI-AscI-sense GCGGCCGCGTTAACGGCGCGCC NotI-AscI-antisense GGCCGGCGCGCCGTTAACGCGGCCGCGTAC BAT2Fusion.102.F: TCATAAGCTTATGTCCGATCGCTCGGGGC BAT2Fusion.2565.R: TACTAAGCTTCATCCCCTTGTCATCCTCA BAT2Fusion.2566.F: TCATAAGCTTAGGAGCGAGACTCCTCCAG BAT2Fusion.4420.R: TACTAAGCTTACTTCGGTTCTTGGGAGAG BAT2Fusion.4421.F: TCATAAGCTTCGTCCTCCAGAGGAGCGTC BAT2Fusion.6572.R: TACTAAGCTTGCGGGGTGGGGGCAACCCA Ii1-20-BAT2-F CACCATGGATGACCAACGCGACCTCATCTCTAACCATGAGCAATTGCCCATACTGGGCAACC GCATGTCCGATCGCTCGGGG Ii1-29-BAT2-F CACCATGGATGACCAACGCGACCTCATCTCTAACCATGAGCAATTGCCCATACTGGGCAACC GCCCTAGAGAGCCAGAAAGGTGCAGCCGTATGTCCGATCGCTCGGGG BAT2.3254.R TGGAGGTGGGACAGGGGG Material und Methoden 26

BAT3.0269F.NheI GCTAGCATGGAGCCTAATGATAGTA BAT3.1859R CCGCTCACCATCTGGGCC BAT3.1791F TCCTCCACAGGCTCGGCC BAT3.3626R.HpaI-noUTR AGTGTTAACAGGATCATCAGCAAAGGCC

Smac.46F.XbaI ATTCTAGAATGGCGGCTCTGAAGAGT Smac.726R.NotI ATGCGGCCGCATCCTCACGCAGGTAGGC

2.2.6 Crosslinker m-Maleimidobenzoyl-N-Hydroxysuccinimid- Ester (MBS) Pierce CnBr-Sepharose Pharmacia Glutaraldehyd zum Quervernetzen, Immunograde Sigma

2.2.7 Tierstämme

New Zealand White Kaninchen Harlan Winkelmann C57/Black 6 Mäuse Harlan Winkelmann Material und Methoden 27

2.3 Methoden

2.3.1 Zellkultur

Alle eukaryontischen Zellen wurden in einem Begasungsbrutschrank bei 5 % CO2 und feuch- tigkeitsgesättigter Atmosphäre kultiviert. Die Zellen wurden in dem für sie empfohlenen Me- dium mit 10 % FCS gehalten.

2.3.2 Bakterienkultur

Bakterien wurden in 2x YT-Medium bei 37 °C und kontinuierlichem Schütteln kultiviert. Bakterien auf Agarböden wurden bei 37°C in einem Brutschrank kultiviert. Antibiotika-resis- tente Kulturen wurden in Gegenwart von 100 µg/ml Ampicillin gehalten bzw. 10 µg/ml Kanamycin, 25 µg/ml Zeocin.

2.3.3 Isolierung von RNA aus eukaryontischen Zellen

Als Quelle für die Isolierung größerer RNA-Mengen wurden verschiedene Zelllinien genutzt, um genügend Ausgangsmaterial zu besitzen. Zur Präparation wurde das Gesamt-RNA-Kit der Firma Qiagen eingesetzt: Zellen werden in Guanidiniumisothiocyanat lysiert, wobei alle Proteine einschließlich RNAsen denaturiert und inaktiviert werden. Genomische DNA wird mittels einer Kanüle (Größe 20) geschert, und die DNA selektiv an eine Affinitätsmatrix gebunden. Nach mehreren Waschschritten wird die RNA in nukleasefreiem Wasser eluiert und bei -20 °C gelagert.

2.3.4 Northern Blot

Das Protokoll folgt im wesentlichen Sambrook et al. (1989): denaturierte RNA wird unter denaturierenden Bedingungen in einem Agarosegel aufgetrennt und mittels Kapillartransfer auf eine Nylonmembran übertragen. Die Membran wird mit einer markierten Sonde inkubiert und so die Zielsequenz in der Autoradiografie sichtbar gemacht. Das Agarosegel wurde nach Maniatis wie folgt angefertigt: für ein Gelvolumen von 100 ml wurde 0,7 g Agarose in 84 ml ddH2O aufgelöst. Die Gellösung wurde auf ca. 60 °C abgekühlt, bevor 10 ml zehnfach konzentrierter MOPS-Puffer (10 x MOPS: 200 mM Morpholino- propansulfonsäure, pH 7,0, 50 mM Natriumazetat, 10 mM Na2EDTA) und 6 ml 37 % Form- aldehydlösung zugegeben wurden. Alle Bestandteile der Gelapparatur (Gelträger, Geltank und Material und Methoden 28

Taschenformer) wurden ausschließlich für RNA-Elektrophoresen verwendet und vor Gebrauch mit RNAse-away-Lösung RNAse-frei gemacht. Die zu ladende RNA wird in frisch angesetztem denaturierenden Ladepuffer aufgenommen (250 µl Formamid, 83 µl 37 % Form- aldehyd, 50 µl 10 x MOPS-Puffer, 0,01 µl Bromphenolblau, 1 µg/ml Ethidiumbromid) und direkt vor dem Auftragen bei 65 °C 10 min. denaturiert. Als Größenstandard dient bakterielle rRNA und ein synthetischer Marker aus in-vitro-Transkripten (Sigma). Das Gel wird in einfach konzentriertem MOPS-Puffer bei einer konstanten Feldstärke (10 V/cm) gefahren, bis die Bromphenolfront bei ca. zwei Drittel der Laufstrecke angelangt ist. Das Gel wird unter UV-Licht fotografiert, um die Position der Größenstandards zu bestimmen, die Bahnen mit den Größenstandards werden zwecks Reduzierung des Hintergrunds abgeschnitten. Der Transfer auf eine Nylonmembran (Hybond) erfolgt unter alkalischen Bedingungen (3 M NaCl, 8mM NaOH) innerhalb von 60 min abwärtsgerichtet (Chomczynski 1992). Gegenüber klassischen aufwärtsgerichteten Kapillartransfers erfolgt die Übertragung mit gleicher Effi- zienz in deutlich kürzerer Zeit. Die Membran wird nach dem Transfer neutralisiert (0,2 M Phosphatpuffer, pH 6,8 für 10 min.), getrocknet und die RNA unter UV-Licht mit der Membran vernetzt (150 nJ/cm2). Die Membran wird in einer Hybridisierungsröhre bei 55 °C mit 20ml EZ-Hyb für mindestens 60 min. prähybridisiert. Die Sonde wird mit zufälligen Nonamer-Primern und Klenow-Frag- ment in der Gegenwart von 32P-J-ATP nach der Anweisung des Herstellers erzeugt (Amersham Megaprime). Die Sonde wird über Qiagen QIAQuick-Säulen aufgereinigt, wodurch nicht inkorporierte Nukleotide, Primer und Enzyme abgetrennt werden. Die Aktivität der Sonde wird bestimmt und die Sonde auf eine Konzentration von 5-10 ng/ml (Aktivität 1-5 x 109 dpm/µg) in EZ-Hyb verdünnt. Die Hybridisierung erfolgt bei 55 °C bei ständiger Rotation über Nacht. Anschließend wird die Hybridisierungslösung entfernt und die Membran mit vorgewärmtem SSC (1x) bei 60 °C dreimal 10 min., danach dreimal 10 min. mit 0,1 fach SSC bei 60 °C gewaschen. Die Membran wird sofort feucht in Kunststofffolie eingeschweißt und bei -70 °C autoradiografiert (BioMax MS Film und Verstärkerfolie).

2.3.5 Multiple Tissue Expression-Array (MTE)

Zur Untersuchung des Expressionsstatus eines Transkripts in primären Geweben bietet die Firma Clontech sogenannte „Multiple Tissue Expression-Arrays“ an. Auf einer Membran im Mikrotiterformat sind punktförmig normalisierte mRNA-Proben aufgetragen; diese Membra- Material und Methoden 29 nen können wie im Northern Blot mit Sonden detektiert werden und liefern über die Signal- stärke Informationen über die Häufigkeit des betreffenden Transkripts in dem jeweiligen Ge- webe. Die Sonden für die MTE-Hybridisierung wurden wie für den Northern Blot hergestellt und auch zunächst im Northern Blot auf ihre Qualität überprüft. Die Hybridisierung wird nach Anleitung des Herstellers in einer mitgelieferten Hybridisierungslösung durchgeführt (ExpressHyb), die Waschschritte erfolgen wie im Northern Blot. Um die Signale quantitativ auswerten zu können, wurde die Auswertung mittels eines Fuji BAS 1000 Phosphorimagers (Institut für organische und Biochemie der Universität Bonn, Abt. Prof. Sandhoff) vorgenommen.

2.3.6 In-situ-Hybridisierung

Die In-situ-Hybridisierung von Mausembryonen wurde nach Wilkinson (1992) durchgeführt. 12 Tage alte Mausembryonen wurden über Nacht bei 4°C in Paraformaldehyd (4 % in PBS) fixiert. Die Präparate wurden in PBTX (0,1 % Triton X-100 in PBS) gewaschen (zweimal 10 min. bei 4 °C), anschließend wurden die Präparate in einer Methanolreihe entwässert (jeweils 10 min. in 25 %, 50 %, 75 % und 100 % Methanol/PBS). Die Embryonen wurden in einer umgekehrten Methanolreihe rehydriert, in PBTX gewaschen und mit 10 µg/ml Proteinase K in PBTX permeabilisiert. Die permeabilisierten Präparate wurden gewaschen und fixiert (20 min. in 0,2 % Glutaraldehyd, 4 % Paraformaldehyd in PBTX). Anschließend wurden die Präparate in Prähybridisierungslösung gegeben (50 % Formamid, 5x SSC, 2 % Roche Blockierungsreagenz, 0,1 % Triton X-100, 0,5 % CHAPS, 1 mg/ml Hefe-tRNA, 5 mM EDTA, 50 µg/ml Heparin) und für mindestens zwei Stunden bei 65 °C inkubiert. Die RNA- Sonde wurde durch in-vitro-Transkription in der Gegenwart von Digoxigenin-UTP synthetisiert und in einer Konzentration von 1 µg/ml in Prähybridisierungslösung verdünnt zu den Proben gegeben. Die Hybridisierung fand bei 65 °C über Nacht statt. Die Embryonen wurden in Lösung 1 gewaschen (50 % Formamid, 5x SSC, 0,1 % Triton X-100, 0,5 % CHAPS) und die Lösung 1 wurde in einer SSC-Reihe durch 2x SSC ersetzt (25 %, 50 %, 75 %, 100 %). Die Embryonen wurden mit 10 % Schafsserum, 2 % BSA in TBTX (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100) für zwei bis drei Stunden bei Raumtemperatur blockiert. Der Antikörper (Anti-DIG Fragmente, mit alkalischer Phosphatase gekoppelt) wurde mit Embryopuder präadsorbiert und der präadsorbierte Antikörper in einer Konzentration von 0,5 µg/ml zu den Embryonen gegeben und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Präparate mindestens fünfmal 1 h mit TBTX, 0,1 % BSA Material und Methoden 30 gewaschen und über Nacht in Waschlösung inkubiert. Die Embryonen wurden mit NTMT

(100 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl2, 0,1 % Tween-20) plus 2 mM Levamisol gewaschen und mit 4,5 µl NBT (75 mg/ml in Dimethylformamid) und 3,5 µl BCIP (50 mg/ml in Dimethylformamid) in NTMT plus 2 mM Levamisol gefärbt. Die Färbung wurde durch Waschen mit NTMT und PBTX abgestoppt, sobald der gewünschte Färbegrad erreicht war.

2.3.7 Reverse Transkription

Als Ausgangsmaterial diente zelluläre Gesamt-RNA. Die RNA wird hitzedenaturiert und während des Abkühlungsprozesses werden die Primer für die Erststrangsynthese angelagert. Die reverse Transkriptase verlängert den Primer, so dass ein DNA-RNA-Hybrid entsteht. Die- ser Doppelstrang ist eine geeignete Matrize für folgende PCR-Reaktionen. Für die Erststrangsynthese kam Expand Reverse Transkriptase (Boehringer) zum Einsatz; die Reaktion wurde nach Vorschrift des Herstellers durchgeführt. Als Erststrangprimer kamen je nach Einsatzzweck entweder zufällige Hexamere, Oligo-dT- Primer oder genspezifische Primer zum Einsatz. In den meisten Fällen erwiesen sich die Zufallsprimer als am besten geeignet.

2.3.8 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Die PCR beruht auf der Amplifikation einer Zielsequenz mittels einer hitzestabilen DNA- Polymerase (Taq, Pwo/Pfu o.ä.) und einem Paar kurzer, komplementärer Oligonukleotide (Primer). Zu Klonierungszwecken kam das Polymerasegemisch Expand Long Template DNA Polymerase (Boehringer Mannheim) zum Einsatz. Dieses System beruht auf einem Gemisch von Taq-Polymerase und geringen Mengen einer fehlerkorrigierenden Polymerase (vermutlich Pfu- oder Pwo-Polymerase) sowie verschiedenen Reaktionspuffern; im vorliegenden Fall wurde ausschließlich der detergenzhaltige Puffer 3 verwendet. So erhaltene Produkte zeichnen sich durch eine sehr geringe Fehlerrate sowie Ein-Basen-Überhänge aus, so dass sie zur TOPO-Klonierung geeignet sind. Für Produkte mit einer erwarteten Länge über 1,5 kb wurde die Reaktion in Gegenwart von 2 % DMSO durchgeführt, um GC-reiche Sequenzen effizient amplifizieren zu können.

2.3.9 Rapid amplification of cDNA ends (RACE)

5’-RACE ist eine Methode, um den Transkriptionsstart einer mRNA zu definieren. Die Me- thode beruht auf einer Erststrangsynthese mit einem genspezifischen Antisenseprimer in der Material und Methoden 31

Nähe des vermuteten Transkriptionsstarts. Nach der Erststrangsynthese wird die RNA-Mat- rize durch die intrinsische RNAse-H-Aktivität der verwendeten AMV-Reversen Transkriptase abgedaut, und an das 3’-Ende des Erststrangs wird mittels terminaler Transferase (TdT) und dATP ein Poly-A-Schwanz angehängt. Dieser Poly-A-Schwanz dient dann als Matrize für einen Anker/Poly-T-Primer, der zusammen mit einem zweiten genspezifischen Primer für einen zweiten PCR-Zyklus verwendet wird. In einer dritten PCR werden die Produkte mit einem dritten genspezifischen Primer und einem ankerspezifischen Primer amplifiziert. Durch den Gebrauch von drei verschiedenen genspezifischen Primern wird die Spezifität der RACE deutlich erhöht. Die PCR-Produkte werden dann kloniert und sequenziert, um so den als 5’- Ende der PCR-Produkte definierten Transkriptionsstart zu ermitteln. Für das Verfahren wurde der 5’/3’-RACE-Kit der Firma Boehringer Mannheim verwendet und nach Vorschrift des Herstellers vorgegangen; die PCR-Produkte wurden in den pCRII- TOPO-Vektor kloniert.

2.3.10 Bestimmung einer DNA-Sequenz durch Sequenzierung

Die Sequenz von klonierten cDNA-Fragmenten wurde im Sanger-Dideoxyribonukleotid- Verfahren bestimmt. Die Sequenzierungsreaktion wurde direkt mit doppelsträngiger Plasmid- DNA mit dem T7-Sequenase-2.0-Kit (Amersham) und 35S-J-ATP (Amersham) nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt . Die Sequenzierungsprodukte wurden durch Erhitzen denaturiert (95 °C, 5 min.) und an- schließend in einem denaturierenden Gel bei 35 V/cm aufgetrennt (8 % Polyacrylamid, 8 M Harnstoff in TBE). Um problematische Sequenzen mit starker Sekundärstruktur zu analysieren, wurden Gele mit zusätzlich 50 % Formamid eingesetzt. Nach Beendigung des Gellaufs wurden die Gele in 50 % Methanol/Essigsäure fixiert, in ddH2O gewässert und für die Autoradiographie auf BioMax MR-Film getrocknet. Alternativ wurden die Sequenzierungsreaktionen bei einem kommerziellen Anbieter (GATC) auf einem ABI-Sequenzierungsautomaten durchgeführt.

2.3.11 Isolierung von Plasmid-DNA aus E.coli

Übernachtkulturen von E.coli wurden abzentrifugiert und nach verschiedenen Methoden aufgeschlossen. Für kleinmaßstabige Präparationen wurde ein modifiziertes alkalisches Lyseprotokoll verwendet (Morelle 1982). Die Bakterien wurden in 200µl 50 mM Tris-HCl pH 7.4 resuspendiert, mit 300 µl 0.2 M NaOH / 1 % SDS aufgeschlossen und 5 min. auf Eis Material und Methoden 32

inkubiert. Durch Zugabe von 400 µl 7,5 M NH4Ac und fünfzehnminütige Inkubation auf Eis wurden denaturierte zelluläre Proteine sowie genomische DNA ausgefällt und dann abzentrifugiert (15000 g, 15 min.). Plasmid-DNA kann renaturieren und verbleibt im Überstand. Der geklärte Überstand wurde mit 500 µl Isopropanol versetzt und 15 min bei 18000 g zentrifugiert, um die Plasmid-DNA auszufällen. Das DNA-Pellet wurde mit 70 % Ethanol gewaschen, getrocknet und in 50 µl sterilem Wasser oder 10 mM Tris-HCl pH 7,4 resuspendiert. Die Reinheit der so gewonnenen DNA war für einen Restriktionsverdau und Ansequenzie- rungen ausreichend. Wurde DNA höherer Reinheit benötigt, wurden Plasmid-Minipräparationskits der Firmen BioRad oder Sigma verwendet, die die DNA über eine Affinitätsmatrix auf Kieselgelbasis aufreinigen; die Aufreinigung erfolgte nach Angabe des Herstellers. So erhaltene DNA bot vor allem bei maschinellen Sequenzierungsreaktionen Vorteile, weil eine höhere Leseweite erzielt werden konnte. Wurden größere Mengen reiner DNA benötigt, kamen Plasmidpräparationskits der Firmen Qiagen oder Macherey-Nagel zum Einsatz, die die DNA mittels eines Anionentauschers auf DEAE-Zellulose-Basis aufreinigen und RNA- sowie Proteinverunreinigungen wirksamer entfernen. Die Aufreinigung erfolgte jeweils nach der Vorschrift des Herstellers. Präparierte DNA wurde für kürzere Zeiträume bei 4 °C gelagert, für längerfristige Aufbewah- rung bei -20 °C eingefroren.

2.3.12 Restriktionsverdau

Restriktionsverdaus wurden nach Herstellerangaben durchgeführt bei ca. 1-5 U Enzym pro Mikrogramm eingesetzter DNA.

2.3.13 Agarosegelektrophorese und Elution von DNA aus Agarosegelen

Je nach gewünschtem Auftrennungsbereich wurde DNA in 0,5-2,0 % Agarose-TAE-Gelen bei ca. 5 V/cm in Gegenwart von 20 µg/ml Ethidiumbromid aufgetrennt und bei UV-Licht der Wellenlänge 290 nm sichtbar gemacht. Wenn DNA-Fragmente für die Klonierung verwendet werden sollten, wurde die Dauer der UV-Exposition minimiert und langwelliges UV-Licht (310 nm) eingesetzt. DNA-Banden wurden im UV-Licht ausgeschnitten und mittels des Geneclean-Protokolls aus dem Gel eluiert. Der Agarosegelblock wurde in 3 Volumen 5 M Natriumjodid bei 55 °C ge- Material und Methoden 33 schmolzen, pro Mikrogramm zu eluierender DNA wurde ein Mikroliter Glasmilch zugegeben und bei RT oder 55 °C (für die Elution kleiner DNA-Fragmente) für 5 min. inkubiert. Die Glasmilch wurde durch kurzes Zentrifugieren pelletiert (13000 rpm, 30 sec.) und dreimal mit der mitgelieferten Waschlösung gewaschen. Die DNA wurde durch Zugabe von 5-10 µl ddH2O eluiert und die Glassmilch durch Zentrifugation (13000 rpm, 1 min.) entfernt.

2.3.14 Klonierung von DNA-Fragmenten

Die Ligation von DNA-Fragmenten mit kompatiblen Enden wurde mit Hilfe von T4-DNA- Ligase erreicht. 10-50 ng Vektor-DNA wurden mit einem drei- bis zehnfachen molaren Über- schuss des zu klonierenden Fragments in Gegenwart von 1000 Weiss-Einheiten T4-DNA- Ligase in einfach konzentriertem Ligasepuffer bei Raumtemperatur für 30-60 min. oder bei 18 °C über Nacht inkubiert. Waren alle Schnittstellen miteinander kompatibel, wurde das Vektorfragment zuvor mit alkalischer Phosphatase (SAP, Shrimp Alkaline Phosphatase) nach Herstellerangabe dephospho- ryliert, um eine Ligation mit sich selbst („Religation“) zu unterdrücken. Das Enzym wurde vor der Ligation bei 65 °C 20 min. hitzeinaktiviert. Der Ligationsansatz wurde vor der Transformation in kompetente Bakterien auf 65 °C erhitzt, um die Ligase zu inaktivieren und so die Kolonienzahl zu erhöhen. Bakterien wurden durch Elektroporation transformiert. Bakterien wurden nach dem Protokoll von Dower et al. (1988) elektrokompetent gemacht. Drei bis fünf Mikroliter eines Ligationsansatzes wurden zu 50 µl

Bakterien gegeben, mit 100 µl sterilem ddH2O vermischt und bei 12,5 kV/cm, 40 µF, 192 : in Elektroporationsküvetten transformiert. Nach dem Elektroschock wurden die Zellen schnellstmöglich in vorgewärmtem 2x YT-Medium aufgenommen und bei 37 °C 30-60 min. geschüttelt, bevor sie auf vorgewärmte Agarnährböden mit dem entsprechenden Selektions- mittel ausplattiert wurden (jeweils ein und neun Zehntel des Transformationsansatzes). Die ausgestrichenen Bakterienkulturen wurden bei 37 °C über Nacht in einem Brutschrank inkubiert. Von einzelnen Kolonien wurden am nächsten Tag Übernachtkulturen angeimpft („Mini- preps“), aus denen am nächsten Tag DNA isoliert wird.

2.3.15 Klonierung von Oligonukleotiden

Um kürzere neue Sequenzen in ein Protein einzufügen oder einen Polylinker eines Vektors um neue Restriktionssequenzen zu ergänzen, wurden komplementäre Oligonukleotide mit der Material und Methoden 34 gewünschten Sequenz und den erforderlichen einzelsträngigen Überhängen synthetisiert. Im Gegensatz zu klassischen Methoden wurden die komplementären Oligonukleotide nicht phos- phoryliert und auch keiner Annealing-Prozedur unterworfen, sondern nach der von Kang und Inouye 1993 beschriebenen Methode lediglich in 500fachem molarem Überschuss zu dem geschnittenen und aufgereinigten Plasmid gegeben. Die Ligation fand mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur oder bei 16 °C über Nacht statt, und die Ligationsprodukte wurden wie üblich transformiert und analysiert (s.o.). Gegenüber anderen Methoden wurde so die Inser- tion von multiplen Kopien des Oligonukleotids vermieden, der hohe molare Überschuss war ausreichend, um den Hintergrund durch Religation niedrig zu halten.

2.3.16 Klonierung von PCR-Produkten durch TOPO-Klonierung

PCR-Produkte, die mittels Taq-Polymerase produziert wurden, weisen teilweise keine stumpfen Enden auf, sondern enthalten in vielen Fällen matrizenunabhängige 5’-Überhänge; das angehängte Nukleotid ist dabei zufällig. Solche Produkte können vereinfacht durch Vektoren mit einem komplementären ein-Basen-Überhang kloniert werden, entweder durch Zugabe größerer Menge Ligase (klassische „T-Vektoren“, die PCR-Produkte mit einem Adenosin-Überhang klonieren) oder durch T-Vektoren, die kovalent mit einer Topoisomerase aus Vaccinia-Virus verknüpft sind („TOPO-Vektoren“ der Firma Invitrogen). Die Topoisomerase katalysiert effizient die Verknüpfung von DNA-Enden, so dass eine Inkubation von 5-10 min. ausreicht, um die meisten PCR-Produkte zu klonieren. Die Ligationsprodukte können wie gewohnt in elektro- oder hitzekompetente Bakterien transformiert werden. Die Reaktion wurde nach Vorschrift des Herstellers durchgeführt.

2.3.17 Identifikation rekombinanter Klone durch Kolonie-PCR

Rekombinante Bakterienkolonien können zeitsparend durch Kolonie-PCR identifiziert werden. Eine kleine Menge Bakterienmasse wurde in ein Reaktionsgefäß überführt und ein normaler PCR-Ansatz (inkl. spezifischer Primer für das gewünschte rekombinante Plasmid) dazupipettiert. Es wurde ein gewöhnliches PCR-Programm verwendet, lediglich der anfäng- liche Denaturierungsschritt wurde auf 5 min. verlängert. Eine Negativkontrolle (Agarabstrich) war notwendig, um falsch positive Ergebnisse auszuschließen. Von positiv identifizierten Kolonien wurden Flüssigkulturen angelegt, um das Ergebnis durch Plasmidpräparation und Restriktionsverdau zu bestätigen. Material und Methoden 35

2.3.18 Ortsspezifische Mutagenese (Site-directed mutagenesis)

Ortsspezifische Mutagenese beruht auf der Änderung von DNA-Sequenzen oder Einführung neuer DNA-Sequenzen durch kurze Oligonukleotide, die in der Mitte den einzuführenden Bereich aufweisen und an beiden Enden zu der Zielsequenz komplementär sind. Plasmid-DNA wurde denaturiert und die einzelsträngige DNA mit dem mutagenen Primer hybridisiert. Mittels T4-DNA-Polymerase wurde dann ein Doppelstrang synthetisiert, die Lücken im Doppelstrang mit T4-DNA-Ligase geschlossen und der Doppelstrang in Mis- match-reparaturdefiziente Bakterien (mutS) transformiert. Der willentlich eingefügte Fehler wird nicht repariert; die Hälfte der Tochterplasmide entsprechen dem Matrizenplasmid, die andere Hälfte trägt die eingeführte Mutation. Die Plasmid-DNA wurde präpariert und retrans- formiert, und Einzelklone wurden auf die Gegenwart der Mutation geprüft. Um die Ausbeute an mutiertem Plasmidklonen zu erhöhen, gibt es verschiedene Selektionsmethoden, in der vorliegenden Arbeit wurde ein zweites Selektionsoligonukleotid verwendet, das zusammen mit dem mutagenen Oligonukleotid eine einmalig vorkommende Schnittstelle eliminiert (Unique Site Elimination). Vor der Retransformation wurde das Plasmidgemisch mit dem betreffenden Restriktionsenzym verdaut; linearisierte Plasmid-DNA wird in der folgenden Transformation deutlich weniger effizient transformiert, so dass die Ausbeute an verändertem Plasmid anstieg. Die Plasmide wurden anschließend sequenziert, um sicherzustellen, dass keine unbeabsichtigten Fehler eingeführt wurden.

2.3.19 Expression rekombinanter Proteine in E. coli

Die zu exprimierende Sequenz wurde mittels PCR amplifiziert und in die EcoRI- und HindIII- Schnittstellen des Plasmids pGEX-KN eingeführt, das die eingefügte Sequenz als carboxyterminales Fusionsprotein mit Glutathion-S-Transferase (GST) exprimiert. Für die Expression wurden zunächst aus einer frischen Einzelkolonie Übernachtkulturen in LB+ (LB,

2 % Glucose, 1mM MgCl2, 1mM ZnSO4) angelegt und am nächsten Tag im Verhältnis 1:100 mit frischem Medium verdünnt. Sobald sich die Kulturen in der logarithmischen Wachstums- phase befanden, wurde die Proteinexpression durch Zugabe von 1 mM IPTG (Isopropyl-beta- D-thiogalactopyranosid) induziert. Nach 120 min. wurden die Kulturen durch Zentrifugation geerntet. Die Identifikation von positiven Klonen erfolgte über Western Blot-Analyse von bakteriellen Lysaten mittels eines anti-GST-Serums. Der Zellaufschluss erfolgte durch Aufkochen in Material und Methoden 36 reduzierendem Probenpuffer (RSB). Die Identität so erhaltener Klone wurde durch Ansequen- zierung vom N- und C-Terminus aus bestätigt. Für die Produktion von größeren Mengen Protein wurden die Expressionsbedingungen opti- miert. Im einzelnen wurden die Temperatur und die Dauer der Induktion variiert. Während der Induktion wurden Proteaseinhibitoren (1 mM PMSF, 0,1 % Aprotinin, 1 mM Benzamidin) in das Kulturmedium gegeben. Für die Expression wurden drei verschiedene Bakterienstäm- me verwendet (BL21, DH5Į, M15) und für jedes Fusionsprotein wurden die jeweils optimale- n Produktionsbedingungen verwendet.

2.3.20 Affinitätsreinigung rekombinanter GST-Fusionsproteine

Die Affinitätsreinigung von GST-Fusionsproteinen beruht auf der Bindung der Glutathion-S- Transferase an das Substrat Glutathion, das hier kovalent an eine Sepharosematrix gekoppelt ist. Induzierte Expressionskulturen wurden durch Sonikation in PBS (mit 1 mM PMSF, 0,1 % Aprotinin, 1 mM Benzamidin und 10 µM Leupeptin) auf Eis lysiert. Die Lysate wurden zentrifugiert (20000 g, 30 min.) und ultrazentrifugiert (100000 g, 60 min.), um unlösliche Bestandteile zu entfernen und dann mit der Glutathion-Sepharosematrix (1 ml Matrix pro 1000 ml Bakterienkultur) auf einem Rotor bei 4 °C, 60 min. inkubiert. Die beladene Matrix wurde abzentrifugiert (300 g, 10 min.) und dann dreimal mit PBS und Proteaseinhibtoren (s.o.) gewaschen. Für eine längere Lagerung wurden die Lysate mit 50 % Glycerin bei -20 °C als Flüssigpräparate aufbewahrt, um ein Denaturieren von Proteinen durch wiederholtes Einfrie- ren und Auftauen zu vermeiden. Für Aufreinigungen im kleinen Maßstab wurde das gebundene Protein direkt mit reduzierendem Probenpuffer (RSB, einfach konzentriert) durch Aufkochen von der Matrix eluiert. Für präparative Aufreinigungen wurde das Protein durch Zugabe von reduziertem Glutathion im Überschuss (10 mM) eluiert. Das freie Glutathion verdrängt durch Kompetition das immobilisierte Glutathion aus der GST-Liganden-Bindung. Die Elution erfolgte fraktioniert, es wurden mindestens 10 Fraktionen von je 0,1 Säulenvolumen gesammelt und ihr Proteingehalt bestimmt. Fraktionen mit dem gewünschten Gehalt von Protein wurden gesammelt und für weitere Zwecke eingesetzt. Der verwendete Vektor (pGEX-KN) enthält eine Thrombin-Erkennungssequenz in der Klonierungsschnittstelle zwischen der GST-kodierenden Sequenz und dem einklonierten Pro- tein. Im Idealfall kann durch Thrombinverdau der GST-Anteil abgespalten werden und so im Falle der Immunisierung die Immunantwort gegen GST reduziert werden. Für den Thrombin- verdau wurde die beladene Matrix nach dem Waschen mit einem Bettvolumen Thrombinlö- Material und Methoden 37 sung (50 U/ml in PBS) für 2 Stunden inkubiert. Durch Zugabe von weiterem Waschpuffer wurde der abgespaltene Anteil des Fusionsproteins eluiert, GST bleibt an der Säule zurück.

2.3.21 Kopplung von Peptiden an Trägerproteine

Die Kopplung der Peptide an BSA und KLH erfolgte direktional mittels des bifunktionalen Crosslinkers m-Maleimidobenzoyl-N-Hydroxysuccinimid-Ester (MBS). Zu diesem Zweck enthielten die verwendeten Peptide entweder N-oder C-terminal ein Cystein, über dessen Sulfhydrylgruppe dann zunächst die Kopplung der Peptide an MBS erfolgte. In einem zweiten Schritt wurde dann das so aktivierte Peptid an das Trägerprotein gebunden. Die Kopplung erfolgte nach Vorschrift des Herstellers. Die erfolgreiche Kopplung der Peptide wurde durch SDS-PAGE kontrolliert (Trägerproteine vor bzw. nach der Kopplung).

2.3.22 Herstellung von Antiseren in Kaninchen

Kaninchen wurden nach folgendem Schema subkutan immunisiert:

x Woche 0, Tag 1: Blutentnahme für Präimmunserum x Woche 1, Tag 1 und 5: erste Immunisierung (100 µg Protein in CFA) x Woche 3, Tag 1 und 5: erste Boosterimmunisierung (50 µg Protein in 10 % CFA, 90 % IFA) x Woche 4, Tag 2: Blutentnahme für Serumtest x Woche 7, Tag 1 und 5: 2. Boosterimmunisierung (50 µg Protein in IFA) x Danach alle 4 Wochen, Tag 1 und 5: weitere Boosterimmunisierung x Eine Woche später: Serumgewinnung, sobald der Titer hoch genug ist.

Zur Serumgewinnung wurden die Blutproben bei Raumtemperatur in Glasgefäßen bis zur Bildung eines Blutkuchens stehengelassen. Das Serum wurde vorsichtig abgenommen und bei 500 g zentrifugiert, um etwaige Erythrocytentrümmer zu entfernen. Das so gewonnene Serum wurde bei –20 °C gelagert. Material und Methoden 38

2.3.23 ELISA zur Bestimmung des Antikörpertiters

Der Antikörpertiter der Kaninchenseren wurde im ELISA bestimmt. Dazu wurden bakterielle GST-Fusionsproteine affinitätsgereinigt und mit einer Konzentration von 1 mg/ml an die Oberfläche von Falcon ELISA-Platten adsorbiert (37 °C, 1 h). Die Platten wurden an- schließend mit 10 % BSA in PBS blockiert (37 °C, 1 h), bevor die Antiseren in den Verdün- nungen 1:316, 1:3160, 1:31600 und 1: 316000 (in 10 % BSA in PBS) zugegeben wurden (37 °C, 1 h). Die Antiseren wurden abgenommen und die Platte dreimal in PBS, 0,1 % Tween gewaschen. Der Sekundärantikörper (Amersham Ziege-anti-Kaninchen, HRP-gekoppelt) wurde 1:1000 in 10 % BSA in PBS verdünnt und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden anschließend wiederum dreimal gewaschen, bevor der ELISA mit NBTS kolorimetrisch entwickelt wurde.

2.3.24 Affinitätsreinigung von Antikörpern

Die Antiseren enthielten neben den gewünschten Antikörpern weitere Antikörper, unter anderem gegen das Fusionsprotein, bakterielle Verunreinigungen oder auch gegen die Linkerre- gion zwischen GST und dem Fusionsanteil. Im Fall von Peptidimmunisierungen waren Anti- körper gegen das Trägerprotein zu erwarten. Die Antiseren wurden in einem mehrschrittigen Verfahren aufgereinigt. In den ersten Schrit- ten wurden dem Antiserum durch Abreicherung unerwünschte Antikörper entzogen und in dem letzten Schritt durch positive Selektion die erwünschten Antikörper angereichert. Für die Antiseren, die gegen GST-Fusionsproteine erzeugt wurden, kam folgende Aufreini- gung zum Einsatz: für die erste Säule wurde ein E. coli BL21-Lysat an Cyanbromid (CNBr)- aktivierte Sepharose gekoppelt, um Antikörper gegen E. coli zu entfernen. Der Durchlauf der ersten Säule wurde auf einer Säule abgereichert, für die GST-exprimierenden E.coli BL21- Lysate an CNBr-Sepharose gekoppelt worden waren. Antikörper, die gegen die Linkerregion gerichtet waren, wurden mit einer dritten Säule entfernt, für die E. coli BL21-Lysate eines anderen GST-BAT2-Fusionsproteins an CNBr-Sepharose gekoppelt wurden. Im letzten Schritt erfolgte die Anreicherung der Antikörper mittels einer Säule, die das zur Immunisie- rung verwandte Antigen an CNBr-Sepharose gekoppelt enthielt. Alle Schritte der Aufreini- gung wurden durch ELISA kontrolliert, und abschließend wurde die Spezifität der Antikörper und der Anteil kreuzreaktiver Antikörper (gegen E. coli-Proteine, GST etc.) bestimmt. Für die Aufreinigung der Antiseren, die gegen ein gemischtes Peptidimmunogen hergestellt wurden, wurde ein vereinfachtes zweischrittiges Verfahren benutzt, in dem jeweils eins der Material und Methoden 39

Peptide an CNBr-Sepharose gekoppelt wurde. Zunächst wurden durch positive Selektion Antikörper gegen das eine Peptid angereichert, im zweiten Schritt wurden Antikörper gegen das zweite Peptid angereichert. Die gebundenen Antikörper wurden durch Zugabe von 0,1 M Glycin pH 2,8 eluiert, das Eluat wurde in Gefäßen mit 0,1 Volumen Tris-HCl, pH 8,0 fraktioniert aufgefangen. Die Protein- konzentration der so gereinigten Antikörper wurde bestimmt und die Antikörper in 5 % BSA,

0,01 % NaN3 bei 4 °C gelagert.

2.3.25 Transiente Proteinexpression in eukaryontischen Zellen

Eukaryontische Zellen wurden mit Hilfe liposomaler Reagenzien transfiziert. Das benutzte DOSPER (Boehringer Mannheim) ist ein polykationisches liposomales Reagenz, das die negativ geladene DNA bindet und mit ihr polykationische Komplexe bildet. Diese binden unspezifisch an die insgesamt negativ geladene Zelloberfläche und werden dann von den Zel- len aufgenommen. Gegenüber den Anleitungen des Herstellers kam ein modifiziertes Protokoll zum Einsatz: pro Transfektionsansatz 5 x 105 Zellen wurden durch Zugabe von Trypsin-EDTA abgelöst und zweimal in serumfreien Medium gewaschen. Die Zellen wurden in 50 µl serumfreiem Me- dium aufgenommen und auf Eis gestellt. Pro Ansatz wurde 8 µl DOSPER-Lösung in 42 µl serumfreiem Medium verdünnt, die DNA wurde ebenfalls in einem Endvolumen von 50 µl serumfreiem Medium verdünnt. Die DOSPER- und DNA-Lösungen wurden gemischt und kurz darauf die Zellsuspension zugegeben. Das Gemisch wurde bei ca. 50 rpm auf einem Taumelschüttler 20 min. leicht geschüttelt, danach wurden die Zellen in 3 ml vorgewärmten serumhaltigen Medium resuspendiert und in Zellkulturgefäße mit ca. 9 cm2 Oberfläche ausge- sät (6-Loch-Platten). Für den Glukokortikoidrezeptor (GR)-Degradationsversuch wurden äquivalente Mengen cDNA (pro Konstrukt 1,3 µg) verwendet und die Gesamtmenge an Plasmid durch Zugabe eines LacZ-Plasmids bei konstant 5 µg gehalten. Die Zellen wurden nach der Kalziumphos- phat-Methode transfiziert und nach zwei Tagen in RIPA-Puffer lysiert.

2.3.26 Stabile Proteinexpression in eukaryontischen Zellen

Zellen wurden am Tag vor der Transfektion so ausgesät, dass sie zum Transfektionszeitpunkt zu ca. 50-75 % konfluent gewachsen waren. Direkt vor der Transfektion wurde das Medium Material und Methoden 40

entfernt und durch frisches Medium ersetzt. 15 µg DNA wurde mit 32 µl 2,5 M CaCl2 vermischt und mit sterilem Wasser auf ein Endvolumen von 250 µl aufgefüllt. Tropfenweise wurde 2 x HBS-Lösung zugegeben und die Lösung dabei vorsichtig geschüttelt. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur für 15 min. inkubiert und dann tropfenweise zu den Zellen gegeben. Nach 48 Stunden erfolgte die Selektion mit einem geeigneten Antibiotikum, um stabil transfizierte Zellen zu selektionieren.

2.3.27 Metabolische Markierung von eukaryontischen Zellen

Die Zellen wurden zweimal in PBS gewaschen und für 30 bis 60 min. in methionindepletier- tem Medium unter normalen Zellkulturbedingungen bei 37 °C inkubiert (RPMI ohne Methio- nin, 5 % dialysiertes FCS). Anschließend wurde zu diesem Medium 30-50 µCi 35S-markiertes Methionin gegeben und für die gewünschte Zeit inkubiert. Das Markierungsmedium wurde entfernt und die Zellen wurden bis zur Weiterverwendung bei -20 °C eingefroren.

2.3.28 Herstellung von Zelllysaten

Adhärente Zellen wurden direkt im Zellkulturgefäß durch Zugabe von ca. 70 µl/cm2 eiskaltem Lysepuffer (1 % NP-40 in PBS, 1 mM PMSF, 0,1 % Aprotinin) bei 4 °C für 30 min. aufgeschlossen. Suspensionszellen wurden zunächst durch Zentrifugation gesammelt und durch Zugabe von ca. 50 µl Lysepuffer pro 1 x 105 Zellen lysiert. Die Lysate wurden zentrifugiert (14000 g, 5 min), um unlösliche Bestandteile zu entfernen. Für Western Blots wurde das Lysevolumen auf ein Zehntel verkleinert, adhärent wachsende Zellen wurden zuvor abgelöst. Für den GR-Degradationsversuch wurden die Zellen mechanisch vom Zellkulturgefäß abge- löst und in 50 µl RIPA-Puffer lysiert (150 mM NaCl, 1 % Triton X-100, 0,1 % SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8).

2.3.29 Immunpräzipitation

Die Zelllysate wurden in einem Gesamtvolumen von mindestens 250 µl mit 0,5-1 µg Antikör- per und 10 µl Protein-A-Sepharose 3 h oder über Nacht bei 4 °C und ständiger Bewegung inkubiert. Die Sepharose-Antikörper-Antigenkomplexe wurden durch Zentrifugation (300 g, 3 min.) gesammelt und dreimal in 1 ml Waschpuffer (0,1 % NP-40 in PBS) resuspendiert. Material und Methoden 41

Die Sepharosekomplexe wurden anschließend im gewünschten Volumen von reduzierendem Probenpuffer (RSB, 62,5 mM Tris/HCl, 50 mM DTT, 10 % Glycerin, 2,3 % SDS, 0,01 % Bromphenolblau) aufgekocht, um die gebundenen Antikörper und Proteine zu eluieren. Die Immunpräzipitate wurden in der SDS-PAGE nach dem Laemmli-Verfahren bei 1,2 V/cm aufgetrennt.

2.3.30 Reduzierende SDS-PAGE

Die SDS-PAGE nach Laemmli (1970) beruht auf der Auftrennung von Proteinen im elektri- schen Feld entsprechend ihrer Größe. Proteine werden durch Aufkochen unter reduzierenden Bedingungen denaturiert und SDS wird proportional zur Länge des Proteins angelagert; Ei- genladung und Faltung der Proteine haben somit keinen Einfluss auf ihr Migrationsverhalten mehr. Die Auftrennung der Proteinproben erfolgt in einem Polyacrylamidgel mit einem dis- kontinuierlichen Puffersystem, das für die Fokussierung der Proteinbanden verantwortlich ist. Proteine wurden in reduzierendem Probenpuffer aufgekocht und auf einem Polyacrylamidgel mit einer Konzentration von 7,5-12 % bei einer konstanten Spannung von 12 V/cm aufgetrennt.

2.3.31 Nachweis von Proteinen im SDS-PAGE-Gel

Nach Beendigung des Gellaufs wurde das Gel für 30 min. bei konstanter Bewegung in Coomassie-Blau-Färbelösung (0,1 % (w/v) Coomassie Blau R-250, 16 % Essigsäure in ddH2O) inkubiert. Die Färbelösung wurde anschließend entfernt und das Gel in Entfärbelö- sung (25 % Methanol, 5 % Eisessig in ddH2O) inkubiert, bis der gewünschte Färbegrad erzielt war. Die Gele wurden anschließend bei 70 °C vakuumgetrocknet.

2.3.32 Fluorographie

Mit 35S-Methionin metabolisch markierte Proteine wurden mittels Fluorographie (Bonner & Laskey 1974) nachgewiesen. PAGE-Gele wurden dazu mindestens 30 min. in DMSO entwäs- sert und anschließend mindestens 30 min. in einer DMSO-PPO-Lösung inkubiert. Die Gele wurden gewässert und dann bei 70 °C auf einem Vakuumtrockner getrocknet. Für die Fluoro- graphie wurde BioMax MR-Film verwendet. Material und Methoden 42

2.3.33 Western Blot

Die Proben wurden in der SDS-PAGE nach Laemmli bei 1,2 V/cm aufgetrennt. Nach Beendi- gung des Gellaufs wurde das Gel in Transferpuffer (20 mM Tris-Base, 387 mM Glycin, 0,1 % SDS, 20 % Methanol) 20 min. äquilibriert und die Proteine durch einen Semidry-Elektroblot auf eine Schleicher & Schüll BA85-Nitrozellulosemembran transferiert. Der Blotaufbau be- stand aus drei Lagen S&S Blotpapier, der Membran, dem Gel und drei weiteren Lagen Papier; alle Lagen wurden in Transferpuffer äquilibriert. Der Transfer findet bei einer konstanten Stromstärke von 1 mA/cm2 für 45-60 min. statt. Die Membran wurde entweder mit 5 % Milchpulver, 0,2 % Tween oder mit dem syntheti- schen Rotiblock (einfach konzentriert) für mindestens 60 min. abgesättigt. Der Primärantikör- per wurde in Blockierungslösung verdünnt und für mindestens 60 min. mit der Membran inkubiert. Anschließend wurde die Antikörperlösung abgenommen und die Membran mit Waschlösung (0,25 % Tween in PBS) gewaschen (dreimal 5 min., dreimal 15 min.). Der peroxidasegekoppelte Sekundärantikörper wurde ebenfalls in Blockierungslösung verdünnt und für 60 min. mit der Membran inkubiert. Die Membran wurde wie zuvor gewaschen; die Nachweisreaktion wurde mit dem Chemilumineszenzsubstrat ECL (Amersham) nach Vor- schrift des Herstellers durchgeführt. Das Signal wurde auf Kodak X-Omat Blue-, BioMax MR- oder Amersham Hyperfilm ECL-Film festgehalten.

2.3.34 Immunfluoreszenz

Adhärente Zellen wurden so auf Kammerobjektträger oder sterile Deckgläser ausgesät, dass sie am Tag des Experiments ungefähr zu 50 % konfluent sind. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und dann entweder in 5 % Paraformaldehyd in PBS für 20 min. bei Raumtemperatur fixiert oder alternativ bei -20 °C zunächst 10 min. mit vorgekühltem Metha- nol und anschließend 10 min. mit vorgekühltem Aceton fixiert. Die Zellen wurden daraufhin mit PBS gewaschen und mit 1 % Triton-X-100 10 min. permeabilisiert, bevor sie mit 10 % BSA in PBS für 60 min. blockiert wurden. Der Primärantikörper wurden in 5 % BSA, 0,1 % Triton-X-100 verdünnt und für 60 min. mit den Zellen inkubiert. Die Objektträger wurden mit 0,1 % Triton-X-100 in PBS dreimal gewaschen und dann der Sekundärantikörper zugegeben. Die Inkubation dauerte 60 min. und fand bei Dunkelheit statt. Die Präparate wurden wie zuvor gewaschen und dann mit Mowiol (2,4 g Mowiol 4-88 in 6 g Glycerin, 6 ml ddH2O, 12 ml 0,2 M Tris pH 8,5) eingebettet (nach Beug et al. 1979). Material und Methoden 43

2.3.35 In-vitro-Transkription/Translation

Für in-vitro-Transkriptionen wurde ein gekoppeltes System der Firma Promega verwendet. Die zu exprimierende cDNA muss sich zu diesem Zweck in geeigneter Orientierung in einem Vektor mit dem T7-RNA-Polymerase-Promotor befinden. In einem einzigen Reaktionsansatz findet die in-vitro-Transkription mit einer hochkonzentrierten RNA-Polymerase statt und das so erzeugte Transkript wird sofort in einem Retikulozytenlysat zellfrei translatiert. Durch Zugabe von markierten Aminosäuren (35S-Methionin) wurde das Translationsprodukt markiert und anschließend in der Autoradiographie nachgewiesen. Ergebnisse 44

3 Ergebnisse

3.1 Molekularbiologie von BAT2

3.1.1 Bestimmung der humanen BAT2-cDNA-Sequenz

Die cDNA-Sequenz sowie ein kleiner Teil der genomischen Sequenz des BAT2-Gens wurde 1990 zum ersten Mal publiziert (Banerji et al.). Iris et al. (1993) haben einen größeren Teil der MHC Klasse III-Region in der Nähe des TNF-D-Lokus sequenziert und so die ersten 25 Exons des BAT2-Gens identifiziert. Da kein vollständiger Klon der BAT2-cDNA verfügbar war, wurden zunächst vier frei ver- fügbare cDNA-Klone des IMAGE-Konsortiums (IMAGE Clone ID 21975, 32244, 38970, 159033, Lennon et al. 1996) sowie ein weiteres cDNA-Fragment (Klon G2-6, ein Geschenk von Dr. D. Campbell, MRC, UK) durch Ansequenzieren charakterisiert. Diese fünf cDNA- Fragmente enthielten allesamt Sequenzen aus dem 3’-Bereich des BAT2-Gens. Der fehlende 5’-Bereich wurde aus zwei RT-PCR-Klonen und dem Bereich von Exon 16 aus einem genomischen Klon (Cosmid 7A) gewonnen. RT-PCR Klon F wurde mit den Primern BAT2.100.F und BAT2.1900.R gewonnen und in den pCRII-TOPO-Vektor kloniert. RT- PCR-Klon D wurde mit den Primern BAT2.1210.F und BAT2.2921.R gewonnen und ebenfalls im pCRII-TOPO-Vektor kloniert. In beiden Fällen diente mit zufälligen Erststrang- primern (N6) synthetisierte Gesamt-cDNA von Raji-Zellen als Matrize. Exon 16 wurde als BamHI-PstI-Fragment aus dem Cosmid 7A subkloniert. Diese Klone sowie Klon G2-6 und die IMAGE-Klone 22479 und 38970 wurden manuell und beidsträngig mehrfach sequenziert und die Sequenzen manuell zusammengesetzt. Die ermittelte Sequenz besitzt ein offenes Leseraster von 6471 bp Länge und ergibt somit ein putatives Protein von 2157 Aminosäure- resten Länge. Gegenüber den von Banerji et al. und Iris et al. veröffentlichten Sequenzen ergeben sich in der vorliegenden Sequenz mehrere signifikante Unterschiede, die in zahlreichen Änderungen der Aminosäuresequenz, Insertionen und Verschiebungen des Leserasters resultieren (siehe Anhang 1). Ein Alignment der vorliegenden Sequenz mit aktuellen Sequenzdaten der NCBI- Datenbank ergibt eine fast vollständige Übereinstimmung der abgeleiteten Aminosäuresequenzen. Die Differenzen zwischen NCBI-Daten und den hier beschriebenen Daten sind bis auf zwei Aminosäuren auf Ein-Basen-Polymorphismen (Single Nucleotide Polymorphism, SNP) zurückzuführen. Die dbSNP-Datenbank des NCBI (Sherry et al. 1999) enthält bisher 17 SNPs für das BAT2-Transkript, die einen Einfluss auf die Aminosäurese- Ergebnisse 45 Der . Der rgehoben. orgehoben. publizierter mRNA- Startpunkt nach Banerji ATGAGCTTCCAGCGCAATGTCCGATCGCTCG leine Buchstaben repräsentieren die genomische Sequenz. leine Buchstaben k Rote Pfeile markieren die publizierten Start- Start von Exon 2 et al., et al., Ende von Exon 1 alternativer Start von Exon 2 gggacagagactgagacacttgctgtctggcccacag gtgtctaggcgcggagggaggtggraggtgggagggggtgctcccgggggyggyggttgcccggatgggccgttagtcggggytcagccgcggagtgag cgagggagacgggaggagccgaacccggcgccatccgccgccatcctcccccgccccaccgccatcccgtcccggggagccCCTAGGCCCGGGTCCCGG ATCCCCGCGCACCCGGCCAGGCTCTGGCACGTTTTGGGGGAGGTGCCTGCAGGACCCAACATACTCA Abb. 3: Definition des Transkriptionsstartpunkts. Aus Gesamt-RNA wurden mittels 5'-RACE cDNA-Klone gewonnen und ihr 5'-Ende Aus Gesamt-RNA Transkriptionsstartpunkts. Abb. 3: Definition des ansequenziert, um den Transkriptionsstart des BAT2-Transkripts zu bestimmen. Großbuchstaben stehen für den transkribierten zu bestimmen. Großbuchstaben des BAT2-Transkripts Transkriptionsstart ansequenziert, um den Bereich nach Banerji und Endpunkte der Exons bzw. alternativen Start von Exon 2. Schwarze Pfeile markieren die Startpunkte individueller RACE-Klone. von Exon 2. Schwarze Pfeile markieren die Startpunkte alternativen Start der Exons bzw. und Endpunkte translatierte Bereich ist fett hervorgehoben. Der alternative Startpunkt von Exon 2 ist ebenfalls durch einen roten Pfeil hervo translatierte Bereich ist fett hervorgehoben. Der alternative Startpunkt Abb. 3: Definition des Transkriptionsstartpunkts. Aus Gesamt-RNA wurden mittels 5'-RACE cDNA-Klone gewonnen und ihr 5'-Ende Aus Gesamt-RNA Transkriptionsstartpunkts. Abb. 3: Definition des ansequenziert, um den Transkriptionsstart des BAT2-Transkripts zu bestimmen. Großbuchstaben stehen für den transkribierten zu bestimmen. Großbuchstaben des BAT2-Transkripts Transkriptionsstart ansequenziert, um den Bereich nach Banerji repräsentieren die genomische Sequenz. Rote Pfeile markieren publizierten Start- kleine Buchstaben und Endpunkte der Exons bzw. alternativen Start von Exon 2. Schwarze Pfeile markieren die Startpunkte individueller RACE-Klone von Exon 2. Schwarze Pfeile markieren die Startpunkte alternativen Start der Exons bzw. und Endpunkte translatierte Bereich ist fett hervorgehoben. Der alternative Startpunkt von Exon 2 ist ebenfalls durch einen roten Pfeil herv translatierte Bereich ist fett hervorgehoben. Der alternative Startpunkt vorhergesagter mRNA-Startpunkt nach Iris Ergebnisse 46 quenz haben (dbSNP Build ID 114, 28.4.2003). Sieben weitere SNPs liegen zwar in den Exons, haben aber keinen Aminosäureaustausch zur Folge.

3.1.2 Bestimmung des Transkriptionsstarts von BAT2 durch 5’-RACE

Mit Unterstützung durch Dr. Keresztes wurde von mir der Transkriptionsstart für BAT2 bestimmt. Banerji et al. (1990) hatten einen Transkriptionsstart publiziert, Iris et al. (1993) hatten auf der Basis genomischer Sequenzdaten einen weiter 5’-gelegenen potentiellen alternativen Transkriptionsstart postuliert. Gesamt-RNA wurde aus Raji-Zellen präpariert, von Dr. Keresztes wurden in einem RACE-Experiment sechsundzwanzig 5’-RACE-Klone gewonnen und in den pCRII-TOPO-Vektor kloniert. Die so erhaltenen Klone wurden von mir ansequenziert, um den Startpunkt des Transkripts zu ermitteln. In der Abbildung 3 sind repräsentativ die Startpunkte der RACE-Klone dargestellt: einige Klone beginnen erst in Exon 2, einige Klone stimmen mit dem von Banerji et al. publizierten mRNA-Anfang überein und andere Klone hatten einen früheren Startpunkt, fast beim von Iris et al. vorhergesagten Transkripti- onsstart. Das offene Leseraster konnte jedoch in keinem Fall weiter verlängert werden.

Variante 1 ggccaggggacagagactgagacacttgctgtctggcccacaggctctggcacgttttgg |||||| ||||||||||||||||| Variante 2 ggccag------gctctggcacgttttgg

Exon 1 Exon 2 Variante 1 Exon 2 Variante 2

Variante Anzahl der Klone in der dbEST Exon 2 Variante 1 (212 bp) 4 Exon 2 Variante 1 (175 bp) 5

Abb. 4:Alternativer Startpunkt von Exon 2 im BAT2-Gen. Die Hälfte der untersuchten RACE-Klone benutzt einen alternativen, früheren Startpunkt für Exon 2 (oben), der in einem 37 bp größeren Exon 2 resultiert (oben). Eine Suche für entsprechende Klone in der dbEST ergibt eine ähnliche Häufigkeitsverteilung für beide Spleißvarianten (unten).

Zwischen Exon 1 und 2 befindet sich in der Hälfte der untersuchten Klone eine bisher nicht beschriebene Sequenz von 37 bp Länge, die auf einen alternativen Startpunkt von Exon 2 zurückzuführen ist (Abb. 4). Die Konsensussequenzen für Spleißakzeptor- und Donorstellen werden bei beiden Varianten eingehalten. Eine Suche in der EST-Datenbank nach der hier Ergebnisse 47 neu beschriebenen Spleißvariante ergibt vier cDNA-Klone, die den alternativen Startpunkt von Exon 2 besitzen. Dem stehen fünf Klone gegenüber, die die kürzere Variante von Exon 2 beinhalten. In der EST-Datenbank (Expressed Sequence Tags) des NCBI (dbEST) werden Sequenzdaten von cDNA-Klonen gesammelt, die aus der Ansequenzierung von cDNA-Bibliotheken verschiedener Herkunft stammen (Boguski et al. 1993). Zur Zeit enthält die humane EST- Datenbank (Version 041803, April 2003) ca. 5 Millionen Einträge mit insgesamt ca. 2,6 Gbp Umfang.

3.1.3 Bestimmung der Genorganisation von BAT2

Die von Iris et al. publizierte genomische Sequenz von BAT2 war unvollständig und reichte nur bis in Exon 25. Mit Unterstützung von Dr. Keresztes wurde von mir die noch unbekannte C-terminale Intron-Exon-Struktur von BAT2 aufgeklärt. Ein von Dr. Keresztes zur Verfü- gung gestelltes Plasmid, das ein aus dem Cosmid 7A amplifiziertes 2,1 kb großes PCR-Pro- dukt (Primer BAT2.5448.F und BAT2.6512.R ) des BAT2-Gens ab Exon 24 bis zum Ende der kodierenden Sequenz beinhaltet, wurde mit aus der cDNA abgeleiteten Primern sequenziert. Insgesamt wurden so sieben weitere Exons identifiziert (Abb. 5); damit hat das BAT2- Gen insgesamt 31 Exons. Die Intron-Exon-Grenzen stimmen mit den Konsensussequenzen für Spleißakzeptor- und -donorstellen überein.

3.1.4 Sequenzanalyse der humanen BAT2-cDNA

Herausragendes Merkmal der abgeleiteten Aminosäuresequenz von BAT2 (Abb. 6) ist der hohe Anteil an Prolinen (Tab. 1): von 2157 Aminosäuren sind 417 Proline (entsprechend 19,3 %). Zum Zeitpunkt der Veröffentlichung durch Banerji et al. (1990) waren keine Proteine mit einem höheren Prolingehalt bekannt. Heute sind in der Swissprot-Protein- datenbank (Release 41, Februar 2003, Boeckmann et al. 2003) humane Proteine mit einem Prolingehalt von bis zu 37 % bekannt (Prolin-Rich Protein 5 Precursor). Die Prolinreste sind über die ganze Sequenz verteilt, teilweise sind die Proline einzeln, teilweise treten sie doppelt oder in längeren Wiederholungen auf (bis zu fünf Proline in einer Reihe). Die Prolinreste sind nicht gleichmäßig über das gesamte Protein verteilt: zwischen prolinreichen Bereichen liegen prolinarme Bereiche, so dass man von getrennten Blöcken sprechen kann (Abb. 7). Ergebnisse 48

25 24 20 kB Abb. 5: Das BAT2-Gen mit kompletter Intron-Exon-Struktur. mit kompletter Intron-Exon-Struktur. Die Exons des Gens erstrecken Abb. 5: Das BAT2-Gen sich über eine Länge von ca. 17kB. Di neu definierten Exons 24-31 sind vergrößert herausgezeichnet. Ergebnisse 49

Aminosäure(n) Anzahl % nach Gewicht % nach Häufigkeit sauer (DE) 237 12.57 10.99 basisch (KRH) 306 18.69 14.18 polar (NQSTY) 469 21.73 21.74 nonpolar (AILFWV) 458 20.69 21.23 A Ala 159 5.29 7.37 C Cys 8 0.36 0.37 D Asp 88 4.38 4.08 E Glu 149 8.19 6.91 F Phe 46 2.84 2.13 G Gly 238 6.68 11.03 H His 29 1.68 1.34 I Ile 22 1.08 1.02 K Lys 98 5.35 4.54 L Leu 137 6.72 6.35 M Met 24 1.34 1.11 N Asn 35 1.73 1.62 P Pro 417 17.94 19.33 Q Gln 97 5.30 4.50 R Arg 179 11.65 8.30 S Ser 211 8.29 9.78 T Thr 91 4.05 4.22 V Val 74 3.24 3.43 W Trp 20 1.53 0.93 Y Tyr 35 2.37 1.62 B Asx 123 6.11 5.70 Z Glx 246 13.49 11.40 Tab. 1: Aminosäurezusammensetzung von BAT2

Die Verteilung geladener Aminosäurereste ist auffällig: von 50 Aminosäuren an Position 437 bis 486 sind 29 geladen. Dieser Bereich wird von Cysteinen flankiert. Die Region von Posi- tion 1024 bis 1048 enthält acht Arginin-Glycin-Paare und im Bereich von 648 bis 669 sind von 22 Aminosäureresten 14 Glutaminreste. Eine hydrophobe Leadersequenz (SignalP, Nielsen et al. 1997) oder ein Transmembranbereich (TMPred, Hofman et al. 1993, SMART, Schultz et al. 1998) konnten nicht identifiziert werden. Aufgrund der zahlreichen Proline sind computergestützte Strukturvorhersagen für das BAT2- Protein wenig aussagekräftig. Prolinhaltige Bereiche eines Proteins finden sich meistens in Übergängen zwischen benachbarten Domänen; Proline unterbrechen im allgemeinen geord- nete Bereiche eines Proteins. Da in BAT2 Proline im gesamten Protein verteilt vorkommen, versagen die bekannten Strukturvorhersagemethoden und sagen für weite Bereiche des Pro- teins eine Schleifenstruktur („Loop“) voraus (z.B. PHD/PredictProtein, Rost 1996). Poly- prolinhelizes wurden ebenfalls nicht detektiert. Homologievergleiche mit bekannten Proteinen ergeben aufgrund des hohen Prolingehalts Parallelen mit anderen prolinreichen Proteinen, z.B. Kollagenen. Ergebnisse 50

1 MSDRSGPTAK GKDGKKYSSL NLFDTYKGKS LEIQKPAVAP RHGLQSLGKV Typ A repeat 51 AIARRMPPPA NLPSLKAENK GNDPNVSLVP KDGTGWASKQ EQSDPKSSDA 101 STAQPPESQP LPASQTPASN QPKRPPAAPE NTPLVPSGVK SWAQASVTHG Typ A repeat 151 AHGDGGRASS LLSRFSREEF PTLQAAGDQD KAAKERESAE QSSGPGPSLR 201 PQNSTTWRDG GGRGPDELEG PDSKLHHGHD PRGGLQPSGP PQFPPYRGMM 251 PPFMYPPYLP FPPPYGPQGP YRYPTPDGPS RFPRVAGPRG SGPPMRLVEP Typ A repeat 301 VGRPSILKED NLKEFDQLDQ ENDDGWAGAH EEVDYTEKLK FSDEEDGRDS 351 DEEGAEGHRD SQSASGEERP PEADGKKGNS PNSEPPTPKT AWAETSRPPE Typ B repeat 401 TEPGPPAPKP PLPPPHRGPA GNWGPPGDYP DRGGPPCKPP APEDEDEAWR put.NLS 451 QRRKQSSSEI SLAVERARRR REEEERRMQE ERRAACAEKL KRLDEKFGAP Typ B repeat 501 DKRLKAEPAA PPAAPSTPAP PPAVPKELPA PPAPPPASAP TPEKEPEEPA 551 QAPPAQSTPT PGVAAAPTLV SGGGSTSSTS SGSFEASPVE PQLPSKEGPE 601 PPEEVPPPTT PPVPKVEPKG DGIGPTRQPP SQGLGYPKYQ KSLPPRFQRR 651 QQEQLLKQQQ QHQWQQHQQG SAPPTPVPPS PPQPVTLGAV PAPQAPPPPP 701 KALYPGALGR PPPMPPMNFD PRWMMIPPYV DPRLLQGRPP LDFYPPGVHP 751 SGLVPRERSD SGGSSSEPFD RHAPAMLRER GTPPVDPKLA WVGDVFTATP 801 AEPRPLTSPL RQAADEDDKG MRSETPPVPP PPPYLASYPG FPENGAPGPP 851 ISRFPLEEPG PRPLPWPPGS DEVAKIQTPP PKKEPPKEET AQLTGPEAGR 901 KPARGVGSGG QGPPPPRRES RTETRWGPRP GSSRRGIPPE EPGAPPRRAG 951 PIKKPPPPTK VEELPPKPLE QGDETPKPPK PDPLKITKGK LGGPKETPPN PKPPKP-Motiv 1001 GNLSPAPRLR RDYSYERVGP TSCRGRGRGE YFARGRGFRG TYGGRGRGAR 1051 SREFRSYREF RGDDGRGGGT GGPNHPPAPR GRTASETRSE GSEYEEIPKR RGD 1101 RRQRGSETGS ETHESDLAPS DKEAPTPKEG TLTQVPLAPP PPGAPPSPAP 1151 ARFTARGGRV FTPRGVPSRR GRGGGRPPPQ VCPGWSPPAK SLAPKKPPTG 1201 PLPPSKEPLK EKLIPGPLSP VARGGSNGGS NVGMEDGERP RRRRHGRAQQ 1251 QGKPPRFRRL KQERENAARG SEGKPSLTLP ASAPGPEEAL TTVTVAPAPP 1301 RAAAKSPDLS NQNSDQANEE WETASESSDF TSERRGDKEA PPPVLLTPKA RGD 1351 VGTPGGGGGG AVPGISAMSR GDLSQRAKDL SKRSFSSQRP GMERQNRRPG Poly-Gly RGD 1401 PGGKAGSSGS SSGGGGGGPG GRTGPGRGDK RSWPSPKNRS RPPEERPPGL Poly-Gly RGD 1451 PLPPPPPSSS AVFRLDQVIH SNPAGIQQAL AQLSSRQGSV TAPGGHPRHK 1501 PGPPQAPQGP SPRPPTRYEP QRVNSGLSSD PHFEEPGPMV RGVGGTPRDS 1551 AGVSPFPPKR RERPPRKPEL LQEESLPPPH SSGFLGSKPE GPGPQAESRD 1601 TGTEALTPHI WNRLHTATSR KSYRPSSMEP WMEPLSPFED VAGTEMSQSD 1651 SGVDLSGDSQ VSSGPCSQRS SPDGGLKGAA EGPPKRPGGS SPLNAVPCEG 1701 PPGSEPPRRP PPAPHDGDRK ELPREQPLPP GPIGTERSQR TDRGTEPGPI 1751 RPSHRPGPPV QFGTSDKDSD LRLVVGDSLK AEKELTASVT EAIPVSRDWE Typ A repeat 1801 LLPSAAASAE PQSKNLDSGH CVPEPSSSGQ RLYPEVFYGS AGPSSSQISG 1851 GAMDSQLHPN SGGFRPGTPS LHPYRSQPLY LPPGPAPPSA LLSGVALKGQ 1901 FLDFSTMQAT ELGKLPAGGV LYPPPSFLYS PAFCPSPLPD TSLLQVRQDL Typ C repeat 1951 PSPSDFYSTP LQPGGQSGFL PSGAPAQQML LPMVDSQLPV VNFGSLPPAP Typ C repeat 2001 PPAPPSLSLL PVGPALQPPS LAVRPPPAPA TRVLPSPARP FPASLGRAEL 2051 HPVELKPFQD YQKLSSNLGG PGSSRTPPTG RSFSGLNSRL KATPSTYSGV Typ C repeat 2101 FRTQRVDLYQ QASPPDALRW IPKPWERTGP PPREGPSRRA EEPGSRGDKE RGD 2151 PGLPPPR

Abb. 6: Abgeleitete Aminosäuresequenz des BAT2-Proteins. Repetitive Sequenzen sind fett hervorgehoben (Typ A) bzw. unterstrichen (Typ B und C). Andere Motive sind fett hervorgehoben (putatives Kernlokalisierungssignal (NLS), RGD-Motive, PKPPKP- Motiv) bzw. unterstrichen (Polyglycin-Bereiche). Ergebnisse 51

100

30 Prozent Prolin 20

0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 Aminosäure Nr.

Abb 7: Relative Häufigkeit von Prolinresten in der Aminosäuresequenz von BAT2. Dargestellt ist die prozentuale Häufigkeit innerhalb jeweils eines Abschnitts von 1 0 Aminosäuren Länge.

An Position 976-981 befindet sich mit den Aminosäuren PKPPKP ein prolinreiches Motiv, das in der humanen invarianten Kette und dem Glykoprotein B aus HSV-1 Stamm 17 vorkommt. In der invarianten Kette liegt es in einem Bereich, der für die Interaktion mit MHC Klasse II-Molekülen verantwortlich ist. Die BAT2-Sequenz enthält fünf RGD-Motive, von denen drei in einem zentralen 95 Amino- säuren langen Bereich liegen. Zwischen diesen drei RGD-Motiven liegen glycinreiche Se- quenzen mit jeweils einem sechsfachen Glycinrepeat. Das RGD-Motiv spielt eine Rolle in der Zelladhäsion, wo es die Bindung von Proteinen des Integrinrezeptortyps mit ihren Liganden vermittelt. Die Rolle des RGD-Motivs wurde zuerst anhand von Fibronectin und dessen Rezeptor untersucht; andere Proteine, in denen das RGD-Motiv eine Rolle bei Adhäsions- prozessen spielt, sind einige Kollagene, Fibrinogen, Vitronectin, von Willebrand-Faktor sowie einige virale Proteine (Ruoshlati 1996). Banerji et al. haben ursprünglich drei Typen von repetitiven Sequenzen im BAT2-Protein beschrieben: der Typ-A-Repeat vom 55 Aminosäuren Länge entsprach Exon 2 und 3 und kommt insgesamt viermal im Protein vor. Die Typ B- und C-Repeats kommen zwei- bzw. dreimal im Protein vor (s. Abb. 8). Die A-, B- und C-Repeats sind untereinander selbst nicht homolog und zeigen auch keine Homologien zu Sequenzen aus dem benachbarten BAT3-Gen. Ergebnisse

Typ B #1 RGD Typ A #4 Typ C #1 Typ A #3 NLS Poly-Glycin TypC#2 Poly-Glycin Typ A #2 Typ B #2 RGD TypC#3 Typ A #1 RGD RGD RGD PKPPKP

cDNA mit Exons 12 3 4 5 6 7 891011 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 2930 31

Abb. 8: Motive und repetitive Sequenzen im BAT2-Protein im Vergleich zur Lage der Exons. Repeats vom Typ A, B und C sind schraffiert hervorgehoben, NLS bezeichnet das putative Kernlokalisierungssignal. RGD-Motive und das PKPPKP-Motiv sowie der Polyglycinbereich sind blau markiert. Die Sequenzen der hervorgehobenen Motive könnenAbb. 6 entnommen werden. 52 Ergebnisse

Abb. 9: ClustalX-Alignments der BAT2-Repeats vom Typ A (oben), B (Mitte) und C (unten). Durchgängig konservierte Aminosäuren sind schwarz hinterlegt, nicht vollständig konservierte Aminosäuren sind grau unterlegt (identisch in drei von vier bzw. zwei von drei Sequenzen). 53 Ergebnisse 54

Aufgrund von Fehlern in der ursprünglich von Banerji veröffentlichten Sequenz sind einige der internen Homologien des Typ-A-Repeats weniger stark ausgeprägt als anfangs angenommen (s. Abb. 9).

3.1.5 Sequenzvergleiche mit anderen Spezies

Dank verschiedener Sequenzierungsprojekte sind mittlerweile auch Daten für andere, nicht- humane Genome zumindest teilweise verfügbar. Ein Sequenzvergleich auf Aminosäureebene zeigt einen sehr hohen Konservierungsgrad zwischen dem humanen BAT2 und den Ortholo- gen aus Maus (Chromosom 17), Ratte (Chromosom 20) und dem Kugelfisch Fugu rubripes. Das murine BAT2 ist zu 89 % mit der humanen Sequenz identisch. Die Sequenz aus der Ratte ist mit 88 % ebenfalls hoch konserviert. Für BAT2 aus Fugu ist nur eine N-terminale Teilse- quenz verfügbar; in diesem Bereich sind die Sequenzen zu 50 % identisch (Anhang 2).

3.1.6 BAT2-verwandte Sequenzen

Ein zentrales, 55 Aminosäuren langes Motiv des Exons 3 findet sich in anderen cDNA- Sequenzen (Abb. 10). Eine Homologie findet sich zu dem hypothetischen Protein CAB51071.1 (cDNA AL096857), dessen Gen auf dem menschlichen Chromosom 1 liegt und auch als BAT2-Iso bezeichnet wird; die Homologie auf Aminosäureebene liegt für das Exon 3-Motiv bei ca. 92 %. Der kodierende Bereich dieses hypothetischen Proteins ist 8.1 kb groß, und die abgeleitete Aminosäuresequenz entspricht 2701 Aminosäuren. In der Maus und der Ratte sind entsprechende, hoch konservierte Sequenzen auf Chromosom 1 (Maus) bzw. Chromosom 13 (Ratte) bekannt. Das zweite Gen mit einer ausgeprägten Homologie zu Exon 3 liegt auf Chromosom 9 (cDNA BC002872, Protein ID AAH02872.1); die Homologie zu Exon 3 liegt bei 84 %. Der kodierende Bereich dieses hypothetischen Proteins ist 1.1 kb groß, und die abgeleitete Aminosäure- sequenz ist 340 Aminosäuren groß. Auch hier sind ein Maus- und ein Rattenhomolog auf Chromosom 2 (Maus) bzw. 3 (Ratte) bekannt. Sequenzen mit einem geringfügig kleineren Homologiegrad zu Exon 3 finden sich in Xenopus laevis (cDNA BC043752, Protein ID AAH43752.1) und in Chaenorabditis elegans (cDNA AF026212, Protein ID AAF99974.2). In der ENSEMBL-Datenbank wird ein Eintrag mit den humanen und murinen Sequenzen von BAT2, BAT2-Iso und dem Chromosom-9-Protein BC0002872 als Proteinfamilie geführt. Die Proteine der Mitglieder dieser Genfamilie sind bis auf BAT2 hypothetischer Natur; die Ergebnisse

Abb. 10: Homologie des Exons 3 von humanem BAT2 mit anderen (hypothetischen) Proteinen aus der EMBL-Datenbank. Vollständig konservierteAminosäuren sind schwarz hinterlegt, konservierteAustausche sind in zwei Grauschattierungen hinterlegt (identische Reste in vier bzw. drei Sequenzen). Von oben nach unten: BAT2 cDNA, hypothetisches Protein BAT2-Iso (Chromosom 1), hypothetisches humanes Protein BC002872 (Chromosom 9), Xenopus laevis hypothetisches Protein BC043752, hypothetisches Protein AF026212 aus Chaenorabditis elegans. 55 Ergebnisse 56

BAT2-Iso : MSEKSGQSTKAKDGKKYATLSLFNTYKGKSLETQK--TTARHGLQSLGKVGISRRMPPPANLPSLKAENKGNDPNVNIVPKDGTGWASKQEQHE----EE : 94 BAT2 human : MSDRSGPTAKGKDGKKYSSLNLFDTYKGKSLEIQKPAVAPRHGLQSLGKVAIARRMPPPANLPSLKAENKGNDPNVSLVPKDGTGWASKQEQSDPKSSDA : 100

BAT2-Iso : KTPEVPPAQPKPGVAAPPEVAP------APKSWASN--KQGGQGDGIQVNSQFQ----QEFPSLQAAGDQE--KKEKETNDDNYGPGPSLR : 171 BAT2 human : STAQPPESQPLPASQTPASNQPKRPPAAPENTPLVPSGVKSWAQASVTHGAHGDGGRASSLLSRFSREEFPTLQAAGDQDKAAKERESAEQSSGPGPSLR : 200

BAT2-Iso : PPNVACWRDGGKAAGSPSSSDQDEKLPGQDESTAGTSEQNDILKVVEKRIACGPPQAKLNGQQAALASQYRAMMPPYMFQQYPRMTYPP-LHGPMRFP-- : 268 BAT2 human : PQNSTTWRDGGGRGPDELEGPDSKLHHGHD------PRGGLQPSGPPQFPPYRGMMPPFMYPPYLPFPPPYGPQGPYRYPTP : 276

BAT2-Iso : --PSLSETNKGLRGRGPPPSWASEPERPSILSASELKELDKFDNLDAEADEGWAGAQMEVDYTEQLNFSDDDEQGSNSPKENNSEDQGSKASENNENKKE : 366 BAT2 human : DGPSRFPRVAGPRGSGPPMRLVEPVGRPSILKEDNLKEFDQLD---QENDDGWAGAHEEVDYTEKLKFSDE-EDGRDSDEEGAEGHRDSQSASGEERPPE : 372

BAT2-Iso : TDEVSNTKSSSQIPAQPSVAKVPYGKGPSFNQERGTSSHLPPPPKLLAQQHPPPDRQAVPGRPGPFPSKQQVADEDEIWKQRRRQQS-EISAAVERARKR : 465 BAT2 human : ADGKKGNSPNSEPPTPKTAWAETSRPPETEPGPPAPKPPLPPPHRGPAGNWGPPG--DYPDRGGPPCKPPAPEDEDEAWRQRRKQSSSEISLAVERARRR : 470

BAT2-Iso : REEEERRMEEQRKAACAEKLKRLDEKLGILEKQPSPEEIREREREKEREREKELEKEQEQEREKEREKDRERQQEKEKELEKEQEKQREMEKERKQEKEK : 565 BAT2 human : REEEERRMQEERRAACAEKLKRLDEKFGAPDKRLKAEPAAPPAAPSTPAPPPAVPKELPAPPAP------PPASAPTPEKEPEEPAQAPPAQSTPTPG : 562

BAT2-Iso : ELERQKEKEKELQKMKEQEKECELEKEREKLEEKIEPREPNLEPMVEKQESENSCNKEEEPVFTRQDSNRSEKEATPVVHETEPESGSQPRPAVLSGYFK : 665 BAT2 human : VAAAPTLVSGGGSTSSTSSGSFEASPVEPQLPSKEGPEPP------EEVPPPTTPPVPKVEPKGDGIGPTRQPPSQGLGYP : 637

BAT2-Iso : QFQKSLPPRFQRQQE-----QMKQQQWQQQQQQGVLPQTVPSQPS------SSTVPPPPHRPLYQPMQPHPQHLASMGFDPRWLMMQSYMDPRMMSG : 751 BAT2 human : KYQKSLPPRFQRRQQEQLLKQQQQHQWQQHQQGSAPPTPVPPSPPQPVTLGAVPAPQAPPPPPKALYPGALGRPPPMPPMNFDPRWMMIPPYVDPRLLQG : 737

BAT2-Iso : RPAMDIPPIHPGMIPPKPLMRRDQMEGSPNSSESFEHIARSAR-DHAISLSEPRMLWGSDPYPHAEPQQATTPKATEEPEDVRSEAALDQEQITAAYSVE : 850 BAT2 human : RPPLDFYPPG---VHPSGLVPRERSDSGGSSSEPFDRHAPAMLRERGTPPVDPKLAWVGDVFTATPAEPRPLTSPLRQAADED------: 817

BAT2-Iso : HNQLEAHPKADFIRESSEAQVQKFLSRSVEDVRPHHTDANNQSACFEAPDQKTLSAPQEERISAVESQPSRKRSVSHGSNHTQKPDEQRSEPSAGIPKVT : 950 BAT2 human : ------DKGMRSETPPVPPPPPYLASYPGFPENGAPGPPISRFPLEEPGP---RPLPWPPGSDEVAKIQTPPPKKEPPKEE : 889

BAT2-Iso : SRCIDSKEPIERPEEKPKKEGFIRSSEGPKPEKVYKSKSETRWGPRPSSNRR---EEVNDRPVRRSGPIKKPVLRDMKEEREQRKEKEGEKAEKVTEKVV : 1047 BAT2 human : TAQLTGPEAGRKPARG------VGSGGQGPPPPRRESRTETRWGPRPGSSRRGIPPEEPGAPPRRAGPIKKPPPPTKVEELP------: 965

BAT2-Iso : VKPEKTEKKDLPPPPPPPQPPAPIQPQSVPPPIQPEAEKFPSTETATLAQKPSQDTEKPLEPVSTVQVEPAVKTVNQQTMAAPVVKEEKQPEKVISKD LV : 1147 BAT2 human : --PKPLEQGDETPKPPKPDP------LK : 985

BAT2-Iso : IERPRPDSRPAVKKESTLPPRTYWKEARERDWFPDQGYRGRGRGEYYSRGRSYRGSYGGRGRGGRG-HTRDYPQYRDNKPRAEHIP----SGPLRQREES : 1242 BAT2 human : ITKGKLGGPKETPPNGNLSPAPRLRRDYSYERVGPTSCRGRGRGEYFARGRGFRGTYGGRGRGARSREFRSYREFRGDDGRGGGTGGPNHPPAPRGRTAS : 1085

BAT2-Iso : ETRSESSDFEVVPKRRRQRGSETDTDSEIHESASDKDSLSKGKLPKREERPENKKPVKPHSSFKPDNHVRIDNRLLEKPYVRDDDKAKPGFLPKGEPTRR : 1342 BAT2 human : ETRSEGSEYEEIPKRRRQRGSETGSETHESDLAPSDKEAPTPKEGTLTQVPLAPPPPGAPPSPAP------ARFTARGGRVFTPRGVPSRR : 1170

BAT2-Iso : GRGGTFRRGGRDPGGRPSRPSTLRRPAYRDNQWNPRQSEVPKPEDGEPPRRHEQFIPIAADKRPPKFERKFDPARERPRRQRPTRPPRQDKPPRFRRLRE : 1442 BAT2 human : GRGGGRPPPQVCPGWSPPAKSLAPK------KPPTGPLPPSKEPLKEKLIPGPLSPVARGGSNGGSNVGMEDGERPRRRRHGRAQQQGKPPRFRRLKQ : 1262

BAT2-Iso : ------REAASKSNEVVAVPTNGTVNNVAQEPVNTLGDISGNKTPDLSNQNSSDQANEEWETASESSDFNERRERDEKKNADLNAQTVVKVGENVLPPKR : 1536 BAT2 human : ERENAARGSEGKPSLTLPASAPGPEEALTTVTVAPAPPRAAAKSPDLSNQNS-DQANEEWETASESSDFTSER-RGDKEAPPPVLLTPKAVGTPGGGGGG : 1360

BAT2-Iso : EIAKRSFSSQRPVDRQNRRGNNGPPKSGRNFSGPRNERRSGPPSKSGKRGPFDDQPAGTTGVDLINGSSAHHQEGVPNGTGQKNSKDSTGKKREDPKPGP : 1636 BAT2 human : AVPGISAMSRGDLSQRAKDLSKRSFSSQR----PGMERQNRRPGPGGKAG------SSGSSSGGGGGGPGGRTGPGRGDKRSWP : 1434

BAT2-Iso : KKPKEKVDALSQFDLNNYASVVIIDDHPEVTVIEDPQSNLNDDGFTEVV SKKQQKRLQDEERRKKEEQVIQVWNKKNANEKGRSQTSKLPPRFAKKQATG : 1736 BAT2 human : ------SPKNRSRPPEERP------: 1447

BAT2-Iso : IQQAQSSASVPPLASAPLPPSTSASVPASTSAPLPATLTPVPASTSAPVPASTLAPVLASTSAPVPASPLAPVSASAS VSASVPASTSAAAITSSSAPAS : 1836 BAT2 human : ------PGLPLPPPPPSSSAVFR------LDQVIHSNPAGIQQALAQLSSRQGS : 1489

BAT2-Iso : APAPTPILASVSTPASVTILASASIPILASALASTSAPTPAPAASSPAAPVITAPTIPASAPTASVPLAPASASAPAPAPTPVSAPNPAPPAPAQTQAQT : 1936 BAT2 human : VTAPG------GHPRHKPGPPQAPQGPSPRPPTRYEPQRVNSGLSSDPHFEEPGPMVRGVGGTPRDSAGVSPFPPKRRERPP : 1565

BAT2-Iso : HKPVQNPLQTTSQSSKQPPPSIRLPSAQTPNGTDYVASGKSIQTPQSHGTLTAELWDNKVAPPAVLNDISKKLGPISPPQPPSVSAWNKPLTSFGSAPSS : 2036 BAT2 human : RK------PELLQEESLPPPHSSGFLGSKPEGPGPQAESRDTGTEALTPHIWNRLHTATSRKSYRPSSMEPWMEPLSPFEDVAGTEMSQ--SDSGVDLSG : 1657

BAT2-Iso : EGAKNGQESGLEIGTDTIQFGAPASNGNENEVVPVLSEKSADKIPEPKEQRQKQPRAGPIKAQKLPDLSPVENKEHKPGPIGKERSLKNRKVKDAQQVEP : 2136 BAT2 human : DSQVSSGPCSQRSSPDGGLKGAAEGPPKRPGGSSPLNAVPCEGPPGSEPPRRPPPAPHDGDRKELPREQPLP-----PGPIGTERSQRTDRGTEPGPIRP : 1752

BAT2-Iso : EGQEKPSPATVRSTDPVTTKETKAVSEMSTEIGTMISVSSAEYGTNAKESVTDYTTPSSSLPNTVATNNTKMEDTLVNNVPLPNTLPLPKRETIQQSSSL : 2236 BAT2 human : SHRPGP-PVQFGTSDKDSDLRLVVGDSLKAEKELTASVTEAIPVSRDWELLPSAAASAEPQSKNLDSGHCVPEPSSSGQRLYPEVFYG----SAGPSSSQ : 1847

BAT2-Iso : TSVPPTTFSLTFKMESARKAWENSPNVREKGSPVTSTAPPIATGVSSSASGPSTANYNSFSSASMPQIPVASVTPTASLSGAGTYTTSSLSTKSTTTSDP : 2336 BAT2 human : ISGGAMDSQLHPNSGGFRPGTPSLHPYRSQPLYLPPGPAPPSALLSGVALKGQFLDFSTMQATELGKLPAGGVLYPP------PSFLYSPAFCPSPL : 1938

BAT2-Iso : PNICKVKPQQLQTSSLPSASHFSQLSCMPSLIAQQQQNPQVYVSQSAAAQIPAFYMDTSHLFNTQHARLAPPSLAQQQGFQPGLSQPTSVQQIPIPIYAP : 2436 BAT2 human : PDTSLLQVR----QDLPSPSDFYSTPLQP------GGQSGFLPSGAPAQQMLLPMVDSQLPVVNFGSLPP------APPPAPPSLSLLPVGPA : 2015

BAT2-Iso : LQGQHQAQLSLGAGPAVSQAQELFSSSLQPYRSQPAFMQSSLSQPSVVLSGTAIHNFPTVQHQELAKAQSGLAFQQTSNTQPIPILYEHQLGQASGLGGS : 2536 BAT2 human : LQ-----PPSLAVRPPPAPATRVLPSPARPFPAS------LGRAELHPVELKPFQDYQKLSSNLGGPGSSRTPPTGRSFSGLN------: 2087

BAT2-Iso : QLIDTHLLQARANLTQASNLYSGQVQQPGQTNFYNTAQSPSALQQVTVPLPASQLSLPNFGSTGQPLIALPQTLQPPLQHTTPQAQAQSLSRPAQVSQPF : 2636 BAT2 human : ------SRLKATPSTYSGVFR-TQRVDLYQQASPPDALRWIPKPWER------TGPPPREGPSRRAEEP------: 2143

BAT2-Iso : RGLIPAGTQHSMIATTGKMSEMELKAFGSGIDIKPGTPPIAGRSTTPTSSPSGLLLQVRTASPAK : 2701 BAT2 human : ------GSRGDKEPGLPPPR------: 2157

Abb. 11: Alignment des humanen BAT2-Iso-Proteins (BAT2-Iso) mit dem humanen BAT2-Protein (BAT2 human). Ergebnisse 57

Sequenzen sind im Rahmen des Genomprojekts ermittelt worden und es gibt einige EST- Klone, so dass es sich wohl um tatsächlich transkribierte Bereiche handelt. Es ist unbekannt, ob von diesen Transkripten funktionale Polypeptide translatiert werden. Während einige Bereiche eine hohe Homologie aufweisen, ist die Gesamthomologie von BAT2-Iso zu BAT2 auf Aminosäureebene vergleichsweise gering (Abb. 11). Das auf Chro- mosom 9 gelegene BAT2-Homolog besitzt ebenfalls mehrere Bereiche, die zu BAT2 hoch konserviert sind, der Grossteil der Aminosäuresequenz ist jedoch heterolog (Abb. 12). Die Xenopus- und Chaenorabditis-Proteine sind gleichfalls hypothetischer Natur; mit BAT2-Iso oder dem BAT2-Homolog von Chromosom 9 sind sie abgesehen von dem Exon-3-Motiv nicht verwandt.

BAT2-Hom. : MSDRLGQITKGKDGKSKYSTLSLFDKYKGKSVDAIRSSVIPRHGLQSLGKVAAARRMPPPANLPSLKSENKGNDPNIVIVPKDGTGWANKQDQQDPKSSS : 100 BAT2 human : MSDRSGPTAKGKDGK-KYSSLNLFDTYKGKSLEIQKPAVAPRHGLQSLGKVAIARRMPPPANLPSLKAENKGNDPNVSLVPKDGTGWASKQEQSDPKSSD : 99

BAT2-Hom. : ATASQPPESLPQPGLQKSVSNLQKPTQSISQENTNSVPGGPKSWAQLNGKPVGHEGGLRGSSRLLSFSPEEFPTLKAAGGQDKAGKEKGVLDLSYGPGPS : 200 BAT2 human : ASTAQPPESQPLPASQTPASNQPK-RPPAAPENTPLVPSGVKSWAQASVTHGAHGDGGRASSLLSRFSREEFPTLQAAGDQDKAAKERESAEQSSGPGPS : 198

BAT2-Hom. : LRPQNVTSWREGGGR------: 215 BAT2 human : LRPQNSTTWRDGGGRGPDELEGPDSKLHHGHDPRGGLQPSGPPQFPPYRGMMPPFMYPPYLPFPPPYGPQGPYRYPTPDGPSRFPRVAGPRGSGPPMRLV : 298

BAT2-Hom. : ------HIISATSL------STSPTELGSRNSSTGDG------APSSACTSDSKD : 252 BAT2 human : EPVGRPSILKEDNLKEFDQLDQENDDGWAGAHEEVDYTEKLKFSDEEDGRDSDEEGAEGHRDSQSASGEERPPEADGKKGNSPNSEPPTPKTAWAETSRP : 398

BAT2-Hom. : PSLRPAQPVRK------GASQFMG------: 270 BAT2 human : PETEPGPPAPKPPLPPPHRGPAGNWGPPGDYPDRGGPPCKPPAPEDEDEAWRQRRKQSSSEISLAVERARRRREEEERRMQEERRAACAEKLKRLDEKFG : 498

BAT2-Hom. : ------NVYHPPTYHDMLPAFMCSP------KSSENQGTVERG------: 301 BAT2 human : APDKRLKAEPAAPPAAPSTPAPPPAVPKELPAPPAPPPASAPTPEKEPEEPAQAPPAQSTPTPGVAAAPTLVSGGGSTSSTSSGSFEASPVEPQLPSKEG : 598

BAT2-Hom. : ------SFPLPQLRLEPRVPFRQ-----FQMNDQDWNYGAR------: 331 BAT2 human : PEPPEEVPPPTTPPVPKVEPKGDGIGPTRQPPSQGLGYPKYQKSLPPRFQRRQQEQLLKQQQQHQWQQHQQGSAPPTPVPPSPPQPVTLGAVPAPQAPPP : 698

BAT2-Hom. : ------LVNMTFNE------: 339 BAT2 human : PPKALYPGALGRPPPMPPMNFDPRWMMIPPYVDPRLLQGRPPLDFYPPGVHPSGLVPRERSDSGGSSSEPFDRHAPAMLRERGTPPVDPKLAWVGDVFTA : 798

Abb. 12: Alignment des putativen BAT2-Homologs von Chromosom 9 (BAT2-Hom.) mit dem humanen BAT2-Protein (BAT2 human).

Ein Vergleich auf Nukleinsäureebene zeigt, dass die Homologie zwischen dem BAT2-Iso- Gen und dem humanen BAT2 gering sind. Im BLAST-Vergleich wird deutlich, dass vor allem Exon 3 von BAT2 und von BAT2-Iso hoch konserviert sind (Abb. 13): Ergebnisse 58

BAT2-Iso ------ctcgacatggattacagagtcttggaaaagtcggtatttcacggcgtatgcctccacctg 60 |||| ||||| | |||||||| || ||||| | ||| | |||||||||| || || | BAT2 ttgcccctcgccatggcctgcagagtctcgggaaagttgccattgcccggcgtatgca-cctccag 5767

BAT2-Iso ctaacctcccaagtcttaaagcagaaaacaaaggcaatgatcctaatgtaaacattgtac 120 | ||||| ||||| || ||||| || |||||||||||||| || ||||| | || | BAT2 ccaaccttccaagcctgaaagccgagaacaaaggcaatgaccccaatgtctcactagtgc 5827

BAT2-Iso ctaaagatggcacagggtgggcatcaaaacaagagcaacatgaagaagaaaa- 172 | ||||| || ||||| |||||| ||||| |||||| | || | BAT2 caaaagacggaacaggatgggcaagcaaacaggagcaagtccgaccccaagag 5879

Abb. 13: Alignment von Exon 3 (BAT2-Iso) mit dem Exon 3 von BAT2. 69,7 % der Basen sind identisch.

Das BC0002872-Gen (Chromosom 9) und BAT2 zeigen auf Nukleinsäureebene gewisse Ähnlichkeiten: Die Größe und Lage der sieben Exons ähnelt der von BAT2, die Introns sind allerdings deutlich größer. Die Exons 2, 3 und 6 zeigen eine deutliche Sequenzhomologie (Abb. 14, 15):

Exon 1 (BC0002872)/ Exon 2 (BAT2) BC0002872 cgcaatgtccgatcgtttggggcaaattaccaagggcaaggatgggaaaagcaagtactc 171 ||||||||||||||| | ||||| | | ||||||| |||||||| |||| ||||| || BAT2 cgcaatgtccgatcgctcggggccgactgccaagggaaaggatgg--aaag-aagtattc 4819

BC0002872 gactctcagcctgtttgataagtataa 198 | |||| ||||||||||| |||||| BAT2 ctcgctcaacctgtttgatacgtataa 4846

Exon 2 (BC0002872)/ Exon 3 (BAT2)

BC0002872 catggcttacagagtcttgggaaagttgctgcagcccggcgcatgccaccgcctgcaaac 301 |||||| | |||||||| ||||||||||| |||||||| ||| |||| || || ||| BAT2 catggcctgcagagtctcgggaaagttgccattgcccggcgtatg-cacctccagccaac 5772

BC0002872 ctgccaagcttgaagtctgaaaacaaaggaaacgaccccaacatcgtgatagtacccaag 361 || |||||| |||| | || |||||||| || |||||||| || |||| || || BAT2 cttccaagcctgaaagccgagaacaaaggcaatgaccccaatgtctcactagtgccaaaa 5832

BC0002872 gacgggacgggatgggcaaacaagcaggatcagcaagacccaaagag 408 ||||| || |||||||||| ||| ||||| ||| ||||| ||||| BAT2 gacggaacaggatgggcaagcaaacaggagcagtccgaccccaagag 5879

Exon 5 (BC0002872)/ Exon 6 (BAT2)

BC0002872 aaggggctcaagccgactgttatccttctctcccgaggaatttccgacgctgaaagcagc 648 ||||| ||||||| ||||| | ||||||| |||||||||||||| ||| | || || BAT2 aagggcatcaagcctactgtcacgattctctcgagaggaatttccgaccctgcaggcggc 7199

BC0002872 tggagggcaggacaaggctggcaaagaaaagggcgtct-tagatctgtcgtatgggccag 707 ||| | |||||||||||| || ||| |||||| |||| || | ||||| |||||| | BAT2 tggcgaccaggacaaggct-gccaaggaaagggagtctgccgaacagtcgtctgggcccg 7258

BC0002872 gaccaagcctccgccc 723 |||||||||||||||| BAT2 gaccaagcctccgccc 7274

Abb. 14 : Alignment einzelner Exons des BC0002872-Gens mit dem BAT2-Gen. Die Homologie beträgt 80,6 %, 78,4 % bzw. 80,1 %. Ergebnisse

1 2 3 4 5 6 BAT2

BAT2-Paralog (Chr. 9) 1 2 3 4 5 6

20 kb

Abb. 15: Vergleich der genomischen Struktur von BAT2 und dem humanen Gen ENSG00000160544 (Chromosom 9). Die Exons 1 bis 6 entsprechen in ihrer Größe den Exons 2 bis 7 des humanen BAT2-Gens. Die Exons 1,2 und 5 des BAT2-Paralogs haben eine hohe Sequenzhomologie zu den Exons 2,3 und 6 des humanen BAT2-Gens (homologe Exons sind gelb). 59 Ergebnisse 60

3.1.7 Zusammensetzen eines vollständigen BAT2 cDNA-Klons Die fünf vorhandenen cDNA-Klone enthielten allesamt Sequenzen aus der 3’-Hälfte der BAT2-cDNA. Die IMAGE-Klone 38970 und 22479 wurden über Cfr10I-Schnittstellen zusammenkloniert und in einem weiteren Schritt das Cfr10I-Fragment des cDNA-Klons G2-6 eingefügt. Die fehlenden Bereiche aus der 5’-Hälfte wurden durch zwei RT-PCR-Produkte (Klon D, Klon F, siehe 3.1.1) sowie einen genomischen Klon (Cosmid 7A, ebenfalls ein Ge- schenk von Dr. D. Campbell, Oxford University) abgedeckt. Die beiden RT-PCR-Klone wurden an der gemeinsamen AsuII-Schnittstelle zusammengefügt und um das 1,1 kb MroI- Eco81I-Fragment von Exon 16 erweitert. Um das so gewonnene N-terminale cDNA-Frag- ment besser umklonieren zu können, wurde am 5’-Ende ein PCR-Produkt mit den Primern cDNA-Start-SacI-AscI (Vorwärtsprimer mit SacI- und AscI-Schnittstellen, der mit den kodierenden Bereich von BAT2 abschließt) und BAT2.301.R (revers) erzeugt und dessen SacI-SnaBI-Fragment in die SacI-SnaBI-Schnittstellen des cDNA-Konstrukts eingesetzt. An- schließend wurde der C-terminale Bereich über die Schnittstellen MroI und NotI angefügt (Abb. 16).

5’ 3’

NotI-Linker

Cfr10 I Cfr10 I

AscI-Linker Asu II

Eco81 I Mro I Ergebnisse 61

3.1.8 Herstellung rekombinanter GST-BAT2-Fusionsproteine

Die direkte Expression eukaryontischer Proteine in Prokaryonten ist oft mit Problemen ver- bunden, zu denen die Nichtlöslichkeit des eukaryontischen Proteins, sein Abbau oder (z.T. aufgrund der Größe) seine ineffiziente Expression zählen. Aus diesem Grund werden vielfach Fusionsproteine hergestellt, wobei der Fusionspartner sich gut in Prokaryonten exprimieren lässt und sich auch affinitätschromatographisch aufreinigen lässt. In unserem Fall wurde Glu- tathion-S-Transferase aus Schistosoma japonicum verwendet. Fusionsproteine mit diesem Proteinpartner sind im allgemeinen gut löslich und lassen sich über eine Glutathion-Sepha- rose-Matrix aufreinigen.

3.1.8.1 Klonierung der GST-BAT2-Fusionskonstrukte Zum späteren Zweck der Immunisierung von Kaninchen wurden zu einem frühen Zeitpunkt der Experimente in Zusammenarbeit mit Dr. Keresztes mehrere Konstrukte für GST-BAT2- Fusionsproteine hergestellt. Da zu diesem Zeitpunkt noch nicht für die gesamte Sequenz von BAT2 cDNA-Klone verfügbar waren, wurden die Konstrukte wie folgt entworfen und hergestellt. Aufgrund der Größe des BAT2-Transkripts wurde die cDNA-Sequenz entlang der bekannten Intron-Exon-Grenzen (Iris et al. 1993) in insgesamt 6 Fragmente aufgeteilt und mittels PCR hergestellt: BAT2-1: Exons 1-7, Vorwärtsprimer BAT2-1.F, Rückwärtsprimer BAT2-1.R, Matrize: humane Lymphozyten-cDNA-Bibliothek (Clontech) BAT2-4: Exon 16, Vorwärtsprimer BAT2-4.F, Rückwärtsprimer BAT2-4.R, Matrize: genomischer BAT2-Klon (Cosmid 7A) BAT2-5: Exons 17-23, Vorwärtsprimer BAT2-5.F, Rückwärtsprimer BAT2-5.R, Matrize: Ligationsprodukt IMAGE Klone 38970, 22479, Klon G2-6 BAT2-6: Exon 24-Ende: Vorwärtsprimer BAT2-6.F, Rückwärtsprimer BAT2-6.R, Matrize: IMAGE-Klon 22479. Der Bereich von Exon 8 bis 15 konnte trotz wiederholter Versuche nicht aus dem zur Verfü- gung stehenden Material amplifiziert werden. Die verwendeten Primer enthalten BamHI und EcoRI-Schnittstellen; die PCR-Produkte werden aufgereinigt und mittels Restriktionsverdau und Ligation in den entsprechend verdauten Vektor pGEX-KT eingesetzt. Dieser Vektor besitzt zwischen dem GST-Fusionsanteil und der multiplen Klonierungsschnittstelle (MCS) eine Linkerregion, die die Zugänglichkeit der vor der MCS gelegenen Thrombin-Erkennungssequenz verbessern soll. Ergebnisse 62

Rekombinante Klone wurden durch Restriktionsverdau mit BamHI und EcoRI identifiziert und die Linkerregion zwischen GST und BAT2 sequenziert, um Rasterverschiebungen auszu- schließen.

3.1.8.2 Expression der GST-BAT2-Fusionskonstrukte Die positiven Klone wurden auf die Expression von Fusionsprotein mittels Western Blot und einem Anti-GST-Serum getestet. Das GST-Protein ohne Fusionsanteil hat dabei ein Moleku- largewicht von ca. 25 kDa, die BAT2-Fusionsanteile vergrößern das Molekulargewicht entsprechend (Abb. 17).

GST BAT2-1 51 kDa (BAT2 Pos. 1-253)

GST BAT2-4 90 kDa (BAT2 Pos. 826-1439)

GST BAT2-5 65 kDa (BAT2 Pos. 1440-1791)

GST BAT2-6 63 kDa (BAT2 Pos. 1792-2157)

Abb. 17: schematische Darstellung der GST-BAT2-Fusionsproteine und ihrer Größe (in kDa). Der GST- Anteil ist 25 kDa groß.

Die Klone wurden zunächst im Klonierungsstamm E. coli DH5D exprimiert. Für die Expres- sion von rekombinanten Proteinen werden oft proteasedefiziente Stämme eingesetzt, so z.B. BL21 oder M15. Die vier Konstrukte wurden daher außer in DH5D auch in M15 und BL21 exprimiert und wiederum im Western Blot im Hinblick auf die Qualität des Fusionsproteins verglichen (Abb. 18). Außerdem wurden die Wachstumsbedingungen variiert. Im einzelnen wurden dabei die Induktionsdauer (normalerweise zwei Stunden) von einer bis vier Stunden variiert. Die Wachstums- und Induktionstemperatur wurde versuchsweise reduziert, weil in einigen Fällen von einer verbesserten Stabilität der Fusionsproteine berichtet wurde (Amersham 2002). Alternativ wurde während der Induktion der Kulturen ein Proteaseinhibitor in das Kulturmedium gegeben (1 mM PMSF). Die Variation der Kultur- und Ergebnisse BAT2-4 BAT2-5 BAT2-6

220 97 66 46

30 21.3 DH5 21.3 BL21 21.3 M15 24.2 DH5 24.2 M15 24.2 BL21 17.2 DH5 17.2 BL21 17.2 M15 17.3 M15 17.3 DH5 17.3 BL21 6.2 DH5 6.2 BL21 6.2 M15 9.1 DH5 9.1 M15 9.1 BL21 21 Plasmidklon

Bakterien- stamm a a a a a a

Abb. 18: Expression von GST-BAT2-Fusionsproteinen in E.coli. und Selektion optimal exprimierender Klone im Western Blot. Für jedes Konstrukt wurden zwei Plasmidklone verwendet, deren Sequenz zuvor überprüft wurde und die in jeweils drei verschiedene Bakterienstämme transformiert wurden (DH5a, BL21 und M15). Der Blot wurde mit einem Ziege-anti-GST-Serum entwickelt. 63 Ergebnisse 64

Induktionsbedingungen erbrachte jedoch keine signifikanten Änderungen in der Expression oder Qualität der exprimierten Proteine, so dass für jeden Klon der optimal exprimierende Bakterienstamm gewählt wurde (DH5Dfür BAT2-1, BL21 für BAT2-4 und BAT2-5 und DH5Dfür BAT2-6). Die Fusionsproteine besitzen zwischen dem GST-Fusionspartner und dem Polylinker eine Schnittstelle für die Protease Thrombin. Immobilisierte GST-Fusionsproteine können so durch einen Thrombinverdau von dem GST-Fusionsanteil befreit werden, was für spätere Immunisierungsvorhaben von Vorteil ist. Bakterielle Expressionskulturen von allen vier Konstrukten wurden durch Sonikation lysiert und an Glutathion-Sepharose gebunden. Der Verdau mit Thrombin-Protease (50 U/ml in PBS) wurde bei Raumtemperatur und Zugabe von einem Säulenvolumen Proteaselösung zu der Säule mit anschließender zweistündiger Inkuba- tion durchgeführt. Die Säule wurde mit drei Bettvolumen PBS eluiert und das Eluat im Coomassie-Blau-gefärbten Gel auf die Gegenwart von BAT2-Fusionsanteilen untersucht. Für das N-terminale Konstrukt BAT2-1 konnte der GST-Fusionsanteil durch Thrombinverdau abgespalten werden, bei den anderen Konstrukten war eine Abspaltung nicht möglich. Für die Aufreinigung größerer Mengen von Fusionsproteinen wurden Expressionskulturen im 2-Liter-Maßstab angelegt. Die Kulturen wurden wie üblich induziert, lysiert und im Batch- verfahren an Glutathion-Sepharose gebunden. Die Elution erfolgte mit freiem Glutathion (50 mM Tris-HCl, 10 mM reduziertes Glutathion, pH 8,0); es wurden 20 Fraktionen mit jeweils 100 µl Volumen aufgefangen. Der Proteingehalt der Proben wurde mittels des BCA- Systems kolorimetrisch durch die Messung der Extinktion bei 570 nm und Vergleich mit einer BSA-Eichgerade bestimmt. Die Qualität der Eluate wurde in der SDS-PAGE mit anschließender Coomassie-Blau-Färbung überprüft (Abb. 19).

3.1.9 Immunisierung von Kaninchen mit GST-Fusionsproteinen und BAT2-abgeleiteten Peptiden

Neben den oben beschriebenen Fusionsproteinen wurde zu Immunisierungszwecken aus dem N- und dem C-terminalen Bereich von BAT2 je eine Peptidsequenz abgeleitet. Das N- terminale Peptid MSDRSGPTAKGKDGKKY erhielt am C-terminalen Ende ein zusätzliches Cystein, das C-terminale Peptid EEPGSRGDKEPGLPPPR erhielt am N-Terminus ein Cystein. Über die Cysteine konnte das Peptid mittels des heterobifunktionalen Crosslinkers m-Maleimidobenzoyl-N-Hydroxysuccinimid-Ester (MBS) direktional an die Trägerproteine (BSA und KLH) gekoppelt werden. Die Kopplung der Peptide an die Trägerproteine wurde in Ergebnisse 65

BAT2-Protein (2157 Aminosäuren, 228 kD)

1. BAT2(1-253) 2. BAT2(826-1439) 3. BAT2(1440-1791) 4. BAT2(1792-2157) (51kDa) (90 kDa) (65 kDa) (63 kDa)

75 - 50 - 35 -

25 - 15 -

10 - 1 2 3 4

Abb. 19: Expression von BAT2-Proteinfragmenten als GST-Fusionsproteine. Vier Fragmente des BAT2-Proteins wurden als C-terminale Fusionsproteine mit GST exprimiert (oben). Die Fusionsproteine wurden über Glutathion-Sepharose-Säulen affinitätsgereinigt und mittels Coomassie-Färbung visualisiert (unten). Die Bandenpositionen, die den erwarteten Fusionsproteinen entsprechen, sind durch Pfeile gekennzeichnet. Alle Fusionsproteine sind unterschiedlich stark degradiert, im Fall von BAT2-4 ist kein intaktes Volllängenprodukt detektierbar. Ergebnisse 66 der SDS-PAGE mit Coomassie-Blau-Färbung vor und nach der Kopplung kontrolliert; eine Größenverschiebung des Trägerproteins zeigte im Fall von BSA die erfolgreiche Kopplung an. Die Immunisierung erfolgte in Titermax-Adjuvans nach Harlow & Lane (1991). Für die Peptidimmunisierung wurde nach jeder Immunisierung das Trägerprotein gewechselt, um die Immunantwort auf das gekoppelte Peptid zu fokussieren. Insgesamt wurden nach der anfäng- lichen Immunisierung noch drei Runden von Boosterimmunisierungen durchgeführt. Nach jeder Immunisierung wurde nach einer Woche ein Testserum abgenommen, um den Anti- körpertiter im ELISA zu verfolgen. Als Antigen diente dabei Lysat von entsprechenden Ex- pressionskulturen, für die anti-Peptid-Antiseren wurde das jeweilige Peptid an ein Träger- proteingemisch an die Platte adsorbiert (Abb. 20 zeigt dies exemplarisch für die Immunant- wort gegen das Peptid-Träger-Konjugat).

3.1.10 Aufreinigung der BAT2-Antiseren

Die so gegen GST-Fusionsproteine gewonnenen Antiseren wurden einer Affinitätsreinigung unterzogen, um unerwünschte Antikörper gegen den GST-Fusionsanteil bzw. gegen bakterielle Verunreinigungen zu entfernen. Zu diesem Zweck wurden die Antiseren einem mehrschrittigen Ab- und Anreicherungsverfahren unterzogen. Für den ersten Abreicherungsschritt wurden Lysate von E. coli an Cyanbromid-aktivierte Sepharose gekoppelt und die Antiseren über diese Säule gegeben, um entsprechende Antikörper zu entfernen. Im zweiten Schritt wurden Lysate von GST-exprimierenden E.coli-Kulturen an Sepharose gekoppelt, um Anti- körper gegen den GST-Fusionsanteil zu entfernen. Im dritten Schritt wurde eine Säule mit einem nichtverwandten BAT2-Fusionsprotein verwendet, um etwaige gegen die Linkerregion zwischen GST und BAT2 gerichtete Antikörper zu entfernen. Erst im letzten Schritt wurde dann eine positive Anreicherung mit dem zur Immunisierung benutzten Fusionsprotein vorgenommen, um so möglichst nur die spezifisch gegen den BAT2-Fusionsanteil gerichteten Antikörper anzureichern (Abb. 21). Die Antikörper wurden mit einem sauren Glycinpuffer (0,1 M Glycin, pH 2,8) eluiert und sofort in 1 M Tris pH 8 aufgefangen, um ein Denaturieren zu vermeiden. Die Konzentration der Antikörper wurde durch Messung der Extinktion bei 280 nm bestimmt (Abb. 22). Mittels ELISA wurde die Aufreinigung überprüft. Nach den einzelnen Aufreinigungsschrit- ten wurde die jeweilige Restaktivität gegen bakterielle Proteine, GST, unverwandte Fusions- proteine bzw. die erwünschte Aktivität gegen den BAT2-Anteil des Immunogens überprüft. Der Verlauf der Aufreinigung wird exemplarisch für das gegen BAT2-5 erzeugte Antiserum in Abb. 23 gezeigt. Nach der Aufreinigung wurde die Reaktivität aller Seren mit dem Beschichtung: BSA BSA-C-term BSA-N-term Ergebnisse

0,35 316X 0,3 3160X 0,25 31600X 316000X 0,2 Verdünnungsfaktor 0,15 #0 Präimmunserum #1 Serum nach der 0,1 ersten Immuni- sierung

490 0,05 #2 Serum nach der ersten Booster-

OD (hintergrundkorrigiert) Immunisierung 0 #3 Serum nach der 0 1 zweiten Booster- 2 3 4 Immunisierung 0 1 #4 Serum nach der 2 3 4 0 1 dritten Booster- 2 3 4 Immunisierung

Abb. 20: Immunantwort des mit KLH-N-Term und KLH-C-term immunisierten Kaninchens. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurde Serum gewonnen (Serum 0 (Normalserum) bis 4 (Serum nach der dritten Boosterimmunisierung)) und der Antikörpertiter im ELISA bestimmt. Die ELISA-Platten wurden mit dem Trägerprotein (BSA) und dem Antigen (Träger-Peptid-Konjugat BSA-C- term bzw. -N-term) beschichtet und das Serum in vier verschiedenen Verdünnungen (1:316 bis 1:316000, dargestellt als verschiedenfarbige Balken) eingesetzt. 67 Serum

Zweck Säule Kontrolle Ergebnisse

Depletion der gegen E.coli BL21-Lysat, an ELISA mit E.coli I bakterielle Proteine Durchlauf = CNBr-aktivierte CL-4B BL21-Lysat gerichteten Serum- abgereichertes Eluat Sepharose gebunden fraktion Serum (verworfen) E.coli Depletion der gegen GST-exprimierendes ELISA mit GST- II GST gerichteten BL21-Lysat, an CNBr-aktivierte exprimierenden Serumfraktion CL-4B Sepharose gebunden E.coli BL21-Lysaten Durchlauf = Eluat abgereichertes (anti-GST- Serum Serum) Depletion der GST-BAT2 (aspezifisch) ELISA mit GST-BAT2 Serumanteile, die exprimierende E.coli-BL21- (unspezifisch) exprimie- durch Überex- Lysate, an CNBr-aktivierte renden E.coli Bl21- E.coli III pression in CL-4BSepharose gebunden Lysaten induzierte Proteine Eluat erkennen Durchlauf = (verworfen) abgereichertes Serum spezifisches GST-BAT2 ELISA mit GST-BAT2 Anreicherung BAT2- exprimierende E.coli-BL21- (spezifisch) exprimie- IV spezifischer Anti- Lysate, an CNBr-aktivierte renden E.coli Bl21- körper CL-4B Sepharose gebunden Lysaten Durchlauf (verworfen) Eluat (anti-BAT2- Fragment Antikörper)

Abb. 21: Affinitätsreinigung der Anti-BAT2-Seren. Oben ist das Schema der Aufreinigung dargestellt. Über drei Affinitätssäulen wurden zunächst unerwünschte Antikörper gegen Verunreiniungen und den Fusionspartner GST entfernt (Schritt I bis III), bevor im letzten Schritt (IV) eineAnreinigung der erwünschten Antikörper erfolgte. Die Reinigung wird durch ELISAkontrolliert (sieheAbb. 23) 68 mithilfe einesBSA-Standards bestimmt (oben links). neutralisierendem Tris-Puffer fraktioniert aufgefangen.DieProteinkonzentration wurde bei280nmgemessen unddieKonzentratio Abb. 22:Fraktionierte Elutionderaufgereinigten BAT2-Antikörper. Die Antikörper wurdeninsauremGlycinpuffer (pH2,8)eluier

OD280 Konzentration [mg/ml]

Konzentration [mg/ml] Konzentration [mg/ml] t undin

69 Ergebnisse Beschichtung: E.coli Ergebnisse +GST +GST- BL21-Lys. +GST- BAT2(1-253) BAT2(1440-1791) 0,9 0,8 0,7 0,6 Verdünnungsfaktor 0,5 316x 0,4 3160X 0,3 31600X 0,2

490 0,1

OD (hintergrundkorrigiert) 0 S F E S DS F E S S - Serum DS F E S DS DS -Depletiertes Serum I F E F - Durchlauf II III E - Eluat Aufreinigungsschritt IV

Abb. 23: Affinitätsreinigung am Beispiel des anti-BAT2(1440-1791) Serums. Die Reinigung wird durch ELISA kontrolliert (unten, exemplarisch wird hier die Aufreinigung von BAT2-5 gezeigt). Im ersten Schritt (I) werden Antikörper gegen E. coli entfernt (Säule und ELISA-Beschichtung E.coli-Lysat), im zweiten und dritten Schritt (II und III) werden Antikörper gegen GST bzw. die Linkerregion des Fusionsproteins entfernt (Säule und ELISA-Beschichtung mit GST bzw. mit unverwandten GST-Protein exprimierenden Lysaten). Im vierten Schritt (IV) werden die gewünschten Antikörper positiv angereichert (Säule und ELISA mit dem als Antigen verwendeten

Fusionsprotein). 70 Ergebnisse

0,9 Immunogen 0,8 Thr.verd. BAT2(1-253) 0,7 BAT2(821-1439) 0,6 BAT2(1440-1791) 0,5 BAT2(1792-2157) 0,4 Beschichtung 0,3 E.coli 0,2 1. Bl21-Lysat 2. +GST 0,1 3. +GST-BAT2(1-253) 490 4. +GST-BAT2(821-1439)

OD (hintergrundkorrigiert) 0 5. +GST-BAT2(1440-1791) 1 2 6. +GST-BAT2(1792-2157) 3 4 5 6

Abb. 24: Reaktivität der aufgereinigten Antikörper. ELISA-Platten wurden mit Lysaten von E. coli BL21 bzw. mit Lysaten von E. coli BL21, die GST bzw. GST-BAT2-Fusionsprotein exprimieren, beschichtet (Reihe 1 bis 6). Die gereinigten Antikörper wurden in einer Konzentration von 3,16 µg/ml eingesetzt (farbige Balken). Die Antikörper zeigten vorwiegend Reaktivität mit dem Immunogen, die Reaktivität gegen E. coli-Proteine und gegen GST ist gering. Die Kreuzreaktivität mit anderen GST-Fusionsproteinen ist ebenfalls gering. 71 Ergebnisse 72

Immunogen sowie die unerwünschte Kreuzreaktivität mit anderen Fusionsproteinen bzw. GST und E.coli-Proteinen geprüft (Abb. 24). Die Funktion der Antiseren wurde im Western Blot mit in-vitro-Translationsprodukten untersucht. BAT2 cDNA wurde unter Kontrolle des T7-Promotors kloniert (pTracer-SV40-BAT2, s.u.) und mittels eines gekoppelten in-vitro-Transkriptions-Translationsverfahrens (Promega TnT Quick Coupled Reticulocyte Lysate System) translatiert. Um das Translationsprodukt direkt nachweisen zu können, wurde eine Reaktion in Gegenwart von 35S-Methionin durchge- führt und das Translationsprodukt mittels Autoradiografie direkt visualisiert. Ein Parallel- ansatz ohne radiomarkierte Aminosäuren wurde für einen Western Blot verwendet, um alle vier aufgereinigten Antikörper zu testen. Für die gegen BAT2-1 und BAT2-4 erzeugten Antikörper konnte so eine Reaktivität im Western Blot nachgewiesen werden (Abb. 25).

Abb. 25:In vitro -Translation der BAT2-cDNAund Reaktivität von zwei Antiseren mit dem Polypeptid aus der in-vitro-Translation. Die komplette BAT2-cDNA wurdein vitro in Gegenwart von35S-Methionin translatiert (Fluorographie, links). Nicht markiertes Translationsprodukt wurde im Western Blot mit zwei anti-BAT2- Antikörpern detektiert (anti-BAT2-1 und anti-BAT2-4, jeweils 1 µg/ml, Abbildung links). Ergebnisse 73

3.2 Molekularbiologie von BAT3

3.2.1 Klonierung und Sequenzierung einer BAT3-cDNA

Zentromerisch zum BAT2-Gen liegt in entgegengesetzter Orientierung das BAT3-Gen, das ein ebenfalls sehr prolinreiches Polypeptid kodiert. Die unmittelbar benachbarte Lage auf dem komplementären DNA-Strang und die Ähnlichkeit in der Aminosäurezusammensetzung ließen eine gemeinsam regulierte Expression und einen funktionalen Bezug möglich erschei- nen, so dass in einem weiteren Schritt eine BAT3-cDNA kloniert wurde. Die cDNA-Sequenz von BAT3 wurde zeitgleich mit der von BAT2 veröffentlicht (Banerji et al. 1990). Zwischenzeitlich wurden im Rahmen des humanen Genomprojekts (fortan als ENSEMBL-Daten bezeichnet) und des privat finanzierten Sequenzierungsprojekt der Firma Celera weitere Sequenzinformationen für BAT3 verfügbar, neben cDNA-Daten wurden auch genomische Sequenzen für das BAT3-Gen veröffentlicht. Eine Datenbankrecherche der NCBI-Genbank ergab, dass ähnlich wie bei BAT2 im 5’-untranslatierten Bereicht der BAT3-cDNA eine differenziell gespleißte Sequenz vorhanden ist. Während im Fall der BAT2-cDNA eine 5’-Verlängerung von Exon 2 vorliegt, wird in der BAT3-cDNA ein alternativer Endpunkt für Exon 1 benutzt. Die Variation im 3’-Bereich von Exon 1 ergibt eine Differenz von 34 bp (Abb. 26). Anhand der von Banerji et al. (1990) publizierten Sequenz wurden zwei Primerpaare synthetisiert, um BAT3 mittels RT-PCR in zwei Schritten klonieren zu können. Die Primer BAT3.0269F.NheI und BAT3.1859R dienten dazu, aus Raji-Zellen die N-terminale Hälfte von BAT3 zu amplifizieren, während mit den Primern BAT3.1791F und BAT3.3626R.-HpaI- noUTR die C-terminale Hälfte amplifiziert wurde. Die PCR-Produkte besitzen eine überlappende Sequenz von 105 bp Länge, in deren Mitte sich eine einmalige KpnI-Schnitt- stelle befindet. Über diese überlappende Sequenz wurden die beiden BAT3-Teilprodukte zusammengesetzt und in den Vektor pcDNA3.1-V5-His-TOPO kloniert. Die Sequenz wurde durch mehrfaches Sequenzieren eines kommerziellen Anbieter bestimmt. Gegenüber der ursprünglich von Banerji veröffentlichten Sequenz ergeben sich mehrere Unterschiede (Abb. 27). Insbesondere fehlt in dem klonierten Konstrukt das Exon 24; zwischen Exon 11 und Exon 12 findet sich in unserem cDNA-Klon ein weiteres Exon mit 108 bp Länge, das hiermit als Exon 11B bezeichnet wird. Die Spleißakzeptor- und -donorsequenzen für Exon 11B entsprechen den Konsensussequenzen: GAAGTGGCCGTCGGTGGCAGGTTTGGGGGAGACCGGAAGTGACGgtccgt... Banerji, NCBI Varianten 1 und 3, ENSEMBL Ergebnisse GAAGTGGCCGTCGGTGGCAGgtttgggggagaccggaagtgacggtccgt... NCBI Variante 2

Exon 5 Exon 7 Exon 11B Exon 24

Exon 1 Exon 11 Exon 22

cagcagTCTTACCCTGCCTTTGGTATCCTGACTCTCCCCTACCTTCAGTGTCGA ... ENSEMBL cagcagtcttaccctgcctttggtatcctgACTCTCCCCTACCTTCAGTGTCGA... Banerji (=NCBI Variante 1) cagcagtcttaccctgcctttggtatcctgactctcccctaccttcagTGTCGA. .. vorliegende Sequenz, NCBI Variante 2 u.3

Abb. 27: Alternativ gespleißte Exons im BAT3-Gen. Exonsequenzen sind im Text farbig hervorgehoben, Intronsequenzen sind in Kleinbuchstaben dargestellt. Für Exon 1 ist ein alternativer Endpunkt dokumentiert (NCBI Transkriptvariante 2), der das untranslatierte Exon 1 um 24 Basenpaare verkürzt (oben). Für Exon 7 (unten) ist neben der von Banerji et al. publizierten Spleißvariante eine 24 Basen längere Spleißvariante dokumentiert (ENSEMBL-Datenbank). Die hier beschriebene cDNA (und die NCBI Transkriptvarianten 2 und 3) besitzt dagegen ein um 18 Basen verkürztes Exon 7. Die Exons 11B und 24 sind alternativ gespleißt und gelb hervorgehoben. Die 74 putativen Spleißvarianten (Exons 5, 11 und 22, siehe Tabelle 2) sind ebenfalls gelb hervorgehoben und kursiv beschriftet. Ergebnisse 75

Exon 11A: ccccag|G...... CAG|gtaatg Konsensus: yyncag|G...... CAG|gtragt Intron Exon 11B Intron

Das Exon 7 besitzt in unserem cDNA-Klon einen alternativen Startpunkt und ist um 18 bp kürzer als in der von Banerji publizierten Sequenz. In der ENSEMBL-Datenbank wird dagegen von einem noch größeren Exon 7 ausgegangen, dessen Startpunkt noch 24 bp vor dem von Banerji publizierten Exon 7 liegt. Der hier gefundene Startpunkt von Exon 7 stimmt an der Intron-Exon-Grenze im wesentlichen mit den Konsensussequenzen überein:

Banerji TCCTG|AC vorliegende cDNA TTCAG|TG ENSEMBL-Daten AGCAG|TC Konsensussequenz YNCAG|GN

Die Banerji-Daten für den Startpunkt von Exon 7 zeigen keinerlei Ähnlichkeiten mit den Konsensussequenzen. Durch die beschriebenen Unterschiede in der Basensequenz der klonierten cDNA und der bisher publizierten NCBI-Daten ergeben sich keine Rasterverschiebungen in der BAT3 cDNA. Das BAT3-Gen besteht aus 26 Exons, die sich über einen Bereich von 13,5 kb erstrecken und in mindestens vier verschiedene Spleißvarianten der cDNA übersetzt werden. Zu dem erwähnten alternativen Endpunkt für das Exon 1, der in einer Verkürzung um 34 Basenpaare gegenüber der Banerji-Sequenz resultiert, ist keine Aussage möglich, da der vorliegende cDNA-Klon lediglich den kodierenden Bereich (d.h. ab Exon 2) umfasst. Tabelle 2 fasst die dokumentierten Spleißvarianten für BAT3 in Bezug auf Exon 1, 7, 11A und 24 zusammen. Eine Suche nach den hier beschriebenen Spleißvarianten für BAT3 in der humanen EST-Datenbank ergibt folgendes Bild: von 116 EST-Klonen, die den Bereich von Exon 1 abdecken, enthalten 17 Klone die Banerji-Variante, die übrigen besitzen das verkürzte Exon 1. Für Exon 7 finden sich fast ausschließlich Klone, die den hier beschriebenen Start- punkt von Exon 7 besitzen (gegenüber der Banerji-Sequenz um 18 bp verkürzt). Der von Banerji beschriebene Startpunkt von Exon 7 findet sich lediglich bei einem einzigen EST- Klon (IMAGE ID 5174926). Für den in der ENSEMBL-Datenbank beschriebenen Startpunkt ist kein cDNA-Klon in der EST-Datenbank dokumentiert, es handelt sich vermutlich um eine fehlerhafte computerbasierte Exonvorhersage. Das hier neu beschriebene Exon 11B findet Ergebnisse 76 EST-Klone (147 bp) Exon 24 vorhanden EST-Klone (108 bp) Exon 11B vorhanden EST-Klone Exon 7 Größe EST-Klone Exon 1 n.b. n.b. 236 bp >40 + 38 - 47 Größe 271 bp 17 254 bp 1 - 98 + >100 271 bp247 bp271 bp 17271 bp 99 17 254 bp 17 236 bp 236 bp 1 278 bp >40 >40 0 - - - - 98 98 98 + 98 + + >100 + >100 >100 >100 et al. Sequenz Banerji vorliegende cDNA NCBI Variation 1 NCBI Variation 2 NCBI Variation 3 ENSEMBL Tab. 2: Dokumentierte Spleißvarianten der BAT3-cDNA. Für den Endpunkt von Exon 1 (im untranslatierten Bereich) sind zwei Varianten dokumentiert, für den Startpunkt von Exon 7 sind drei Varianten in den Datenbanken festgehalten. Angeben sind jeweils die Größe des betreffenden Exons in der jeweiligen Spleißvariante und die Anzahl der Klone in der dbEST. Die Exons 11B und 24 sind alternativ gespleißt, die An- oder Abwesenheit des jeweiligen Exons wird durch “+” bzw. “-” angezeigt. Die Sequenzen repräsentieren keine individuellen Volllängen-cDNA-Klone, so dass kein Rückschluss auf die wirklich vorkommenden Kombinationen möglich ist. Ergebnisse 77 sich in fast 40 EST-Klonen wieder (demgegenüber gibt es ca. 100 EST-Klone, die dieses Exon nicht besitzen), und die vorliegende BAT3-Spleißvariante ohne Exon 24 wird durch über 40 cDNA-Klone repräsentiert (es gibt über 100 EST-Klone, die Exon 24 beinhalten). Aus diesen vier differenziell gespleißten Exons ergeben sich rein rechnerisch 16 mögliche Spleißvarianten der cDNA. Welche der möglichen Kombinationen tatsächlich vorkommen, kann aus den vorliegenden Daten nicht bestimmt werden, da alle Daten auf z.T. zusammen- gesetzten cDNA-Fragmenten beruhen und keinen individuellen Volllängenklon repräsentieren. Durch eine Datenbankanalyse wurden weitere mögliche Spleißvarianten der BAT3-cDNA untersucht. Die PALS-Datenbank (PALSdb, Putative alternative splicing database, Huang et al. 2002) sammelt für Volllängen-cDNA-Sequenzen aus der NCBI-Datenbank EST-Klone, die gegenüber der cDNA-Sequenz Deletionen oder kürzere Insertionen aufweisen und ver- sucht so, putative Spleißvarianten zu erfassen. Durch Alignment mit den Intron-Exon-Gren- zen konnten so vier weitere putative Spleißvarianten ermittelt werden, die auf alternative Spleißereignisse entlang der bekannten Intron-Exon-Grenzen zurückgeführt werden konnten und das Leseraster nicht verletzen (Tab. 3). 10 EST-Klone repräsentieren eine Spleißvariante, in der Exon 5 fehlt; je zwei Klonen fehlte Exon 11 bzw. Exon 11 und 11B, und in einem EST- Klon fehlte Exon 22. Der praktische Nachweis dieser putativen Spleißvarianten mittels RT- PCR war nicht Teil der vorliegenden Arbeit.

Anzahl dokumentierter putative Spleißvariante EST-Klone ' Exon 5 >10

' Exon 11-11B 2

' Exon 11 2

' Exon 22 1

Tab. 3: Putative neue Spleißvarianten der BAT3-cDNA. Das bzw. die herausgespleißten Exons sind mit ' bezeichnet. PALSdb-Einträge wurden daraufhin überprüft, ob die katalogisierten EST-Klone auf Spleißereignissen entlang der bekannten Intron-Exon-Grenzen beruhen und die resultierenden Transkripte keine Verschiebung des Leserasters aufweisen. In der dbEST wurde die Anzahl der so gefundenen putativen Spleißvarianten bestimmt.

Ein Alignment der vorliegenden Sequenz mit aktuellen Sequenzdaten der NCBI-Datenbank ergibt abgesehen von den Unterschieden, die auf alternativem Spleißen beruhen, eine fast Ergebnisse 78 vollständige Übereinstimmung der abgeleiteten Aminosäuresequenzen. In der dbSNP-Daten- bank des NCBI sind für BAT3 bisher drei SNPs dokumentiert, die einen Einfluss auf die Aminosäuresequenz haben. Die Unterschiede der hier klonierten cDNA auf Aminosäureebene zu den Daten aus der NCBI Genbank sind allerdings nicht in der SNP-Datenbank vorhanden (Anhang 3).

3.2.2 Sequenzanalyse der BAT3-cDNA

Die hier klonierte BAT3-cDNA kodiert ein Protein von 1113 Aminosäuren Länge (Abb. 29). So wie BAT2 ist auch dieses Protein prolinreich (Tab. 4), mit ca. 13,5 % allerdings nicht so prolinreich wie BAT2. Die Prolinreste sind nicht gleichmäßig verteilt. Die N-terminale Hälfte des Proteins besitzt überdurchschnittlich viele Proline, gefolgt von einem Bereich mit unter 5 % Prolinanteil; die restlichen 200 Aminosäuren bestehen dann wieder zu 15 % aus Prolin. Im zentralen Bereich befindet sich ein Polyprolinbereich von 12 aufeinanderfolgen- den Prolinresten (Abb. 30).

Aminosäure(n) Anzahl % nach Gewicht % nach Häufigkeit sauer (DE) 100 9.97 8.61 basisch (KRH) 110 12.61 9.48 polar (NQSTY) 295 26.06 25.41 hydrophob (ACGILFMPWV) 656 51.37 56.51 A Ala 108 6.72 9.30 C Cys 8 0.68 0.69 D Asp 31 2.88 2.67 E Glu 69 7.09 5.94 F Phe 28 3.23 2.41 G Gly 108 5.66 9.30 H His 37 4.01 3.19 I Ile 37 3.39 3.19 K Lys 14 1.43 1.21 L Leu 98 8.97 8.44 M Met 34 3.54 2.93 N Asn 39 3.60 3.36 P Pro 156 12.54 13.44 Q Gln 81 8.26 6.98 R Arg 59 7.17 5.08 S Ser 93 6.82 8.01 T Thr 69 5.74 5.94 V Val 76 6.21 6.55 W Trp 3 0.43 0.26 Y Tyr 13 1.64 1.12 B Asx 70 6.48 6.03 Z Glx 150 15.35 12.92 Tab. 4: Aminosäurezusammensetzung von BAT3 Ergebnisse 79

1MEPNDSTSTA VEEPDSLEVL VKTLDSQTRT FIVGAQMNVK EFKEHIRASV Ubiquitin-

51SIPSEKQRLI YQGRVLQDDK KLQEYNVGGK VIHLVERAPP QTHLPSGASS ähnlich

101GTGSASATHG GGSPPGTRGP GASVHDRNAN SYVMVGTFNL PSDGSAVDVH

151INMEQAPIQS EPRVRLVMAQ HMIRDIQTLL SRMECRGGPQ PQHSQPPPQP

201PAVTPEPVAL SSQTSEPVES EAPPREPMEA EEVEERAPAQ NPELTPGPAP Repeat Nr. 1

251AGPTPAPETN APNHPSPAEY VEVLQELQRL ESRLQPFLQR YYEVLGAAAT

301TDYNNNHEGR EEDQRLINLV GESLRLLGNT FVALSDLRCN LACTPPRHLH

351VVRPMSHYTT PMVLQQAAIP IQINVGTTVT MTGNGTRPPP TPNAEAPPPG

401PGQASSVAPS STNVESSAEG APPPGPAPPP ATSHPRVIRI SHQSVEPVVM Repeat Nr. 2

451MHMNIQDSGT QPGGVPSAPT GPLGPPGHGQ TLGSTLIQLP SLPPEFMHAV

501AHQITHQAMV AAVASAAAGQ QVPGFPTAPT RVVIARPTPP QARPSHPGGP

551PVSGTLQGAG LGTNASLAQM VSGLVGQLLM QPVLVAQGTP GMAPPPAPAT

601ASASAGTTNT ATTAGPAPGG PAQPPPTPQP SMADLQFSQL LGNLLGPAGP Repeats 3 und 4

651GAGGPGVASP TITVAMPGVP AFLQGMTDFL QATQTAPPPP PPPPPPPPAP Polyprolin

701EQQTMPPPGS PSGGAGSPGG LGLESLSPEF FTSVVQGVLS SLLGSLGARA

751GSSESIAAFI QRLSGSSNIF EPGADGALGF FGALLSLLCQ NFSMVDVVML

801LHGHFQPLQR LQPQLRSFFH QHYLGGQEPT PSNIRMATHT LITGLEEYVR

851ESFSLVQVQP GVDIIRTNLE FLQEQFNSIA AHVLHCTDSG FGARLLELCN

901QGLFECLALN LHCLGGQQME LAAVINGRIR RMSRGVNPSL VSWLTTMMGL

951RLQVVLEHMP VGPDAILRYV RRVGDPPQPL PEEPMEVQGA ERASPEPQRE

1001NASPAPGTTA EEAMSRGPPP APEGGSRDEQ DGASAETEPW AAAVPPEWVP

1051IIQQDIQSQR KVKPQPPLSD AYLSGMPAKR RKLRSDIQKR LQEDPNYSPQ NLS (zweigeteilt)

1101RFPNAQRAFA DDP BAG-Domäne

(partiell)

Abb. 29: Abgeleitete Aminosäuresequenz der klonierten BAT3-cDNA. Der Ubiquitin-Homologiebereich sowie die partielle BAG-Domäne sind unterstrichen, der Polyprolinbereich ist ebenfalls unterstrichen. Die repetitiven Bereiche und das zweigeteilte Kernlokalisierungssignal (NLS) sind fett hervorgehoben. Ergebnisse 80

100

30 Prozent Prolin 20

0 200 400 600 800 1000 Aminosäure Nr.

Abb. 30: relative Häufigkeit von Prolinresten in der Aminosäuresequenz von BAT3 Dargestellt ist die prozentuale Häufigkeit innerhalb jeweils eines Abschnitts von 10 Aminosäuren Länge.

BAT3 : LEVLVKTLDSQTRTFIVGAQMNVKEFKEHIRASVSIPSEKQRLIYQGRVLQDDKKLQEYNVG-GKVIHLVER---- Ubiquitin : MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGG VKTL T T V K I IP QRLI G L D L YN HLV R

Repeat 1 : RAPAQNPELTPGPAPAGPTPAPETNAPNH Repeat 3 : SAGTTNTATTAGPAPGGPAQPPPTPQPSM Repeat 2 : PSSTNVESSAEGAPPPGPAPPPATSHPRV Repeat 4 : SQLLGNLLGPAGPGAGGPGVASPTITVAM n Gp p GP p T p

Abb. 31: Ubiquitinhomologie (oben) und repetitive Sequenzen im BAT3-Protein (unten).

Am N-terminalen Ende von BAT3 befindet sich eine Sequenz mit 75 Aminosäuren, die eine Homologie zu Ubiquitin aufweist (Abb. 31 oben). Am Carboxyterminus befindet sich ein zweigeteiltes Kernlokalisierungssignal (Manchen & Hubberstey 2001) und kurz dahinter eine BAG-Domäne (Thress et al. 2001). BAG-Proteine gehören zur Familie der Ubiquitin-Domä- nenproteine (UDP) und zeichnen sich durch eine N-terminale Ubiquitindomäne sowie die C- terminale BAG-Domäne aus. Sie spielen möglicherweise eine Vermittlerrolle zwischen Cha- peronen und dem proteasomalen Abbausystem (Lüders et al. 2000). Die BAG-Domäne liegt teilweise in Exon 24; die vorliegende Spleißvariante von BAT3 enthält daher nur den C-ter- Ergebnisse Ubiquitin-ähnlich BAG-1

BAG-Domäne BAG-3

C.elegans BAG-1

S.pombe BAG-1A

Xenopus Scythe

humanes BAT3

humanes BAT3 kloniert ohne Exon 24

BAG-Domänen a2 a3

BAG-1 BAG-3 C. elegans BAG-1 S. pombe BAG-1A Xenopus Scythe BAT3 (human) BAT3 (kloniert, ohne Exon 24)

Abb. 32: Ubiquitin-ähnliche Domänen und BAG-Domänen in BAG und BAT3/Scythe. Lage der Domänen innerhalb verschiedener Proteine mit BAG-Domänen (nicht maßstabsgerecht, oben). Alignment der konservierten a2- und a3-Helizes der BAG-Domänen (unten). Konservierte Aminosäuren, die für die Interaktion mit Hsp70 wichtig sind bzw. für die Erhaltung der Sekundärstruktur erforderlich sind, sind durch Pfeile hervorgehoben. Verändert nach Sondermann et al. (2001) und Thress et al. (2001). 81 Ergebnisse 82 minalen Bereich der BAG-Domäne. Die gleiche Spleißvariante ist für BAT3 aus der Ratte beschrieben worden (Wang & Liew 1994). Abbildung 32 zeigt die Lage der Ubiquitin- und BAG-Domänen im BAT3-Protein im Vergleich zu anderen BAG-Proteinen und dem Xeno- pus-Protein Scythe. Das BAT3-Protein besitzt eine repetitive Sequenz, die im Protein insgesamt viermal vorkommt (Abb. 31 unten). Über die beschriebenen Domänen hinaus besitzt BAT3 keine Ähnlichkeit mit bekannten Proteinen.

3.2.3 Sequenzvergleich der BAT3-cDNA mit anderen Spezies

Auch das BAT3-Protein ist zwischen verschiedenen Spezies hoch konserviert. Vergleiche der Aminosäuresequenzen mit anderen Arten ergeben, dass das murine BAT3 zu 91 % mit dem humanen Protein identisch ist; für Rattus norvegicus liegt die Homologie bei 89 % und für den Kugelfisch Fugu rubripes bei 44 % (Anhang 4).

3.2.4 BAT3-verwandte Sequenzen

Im Gegensatz zu BAT2 finden sich für BAT3 keine paralogen Sequenzen im humanen Ge- nom.

3.3 Gewebeverteilung der BAT2- und BAT3-mRNA

3.3.1.1 Northern Blot mit Gesamt-RNA aus humanen Zelllinien für BAT2 Im Northern Blot wurde RNA aus verschiedenen eukaryontischen Zelllinien untersucht. Aus den Zelllinien Raji (humanes Burkitt-Lymphom), P388D1 (murine Makrophagen-Zelllinie), CEM-C7 (humanes T-Lymphom), HuT 78 (humanes T-Lymphom), HeLa (humanes Adeno- karzinom) und HT29 (colorektales Adenokarzinom) wurde Gesamt-RNA isoliert und pro Spur wurden 10 µg dieser RNA aufgetragen. Als Sonde diente ein N-terminales Fragment der BAT2-cDNA (SacI-EcoRI). Bei allen untersuchten Zelllinien wurde ein einzelnes Transkript mit einer Länge von ca. 7 kb detektiert, es gab keinerlei Hinweise auf Spleiß- varianten. Aufgrund der Auflösung des Northern Blots wären nur solche alternativ gespleiß- ten cDNA-Spezies detektierbar, in denen ein größeres Exon fehlt. Im Autoradiogramm konnten im Vergleich der verschiedenen Zelllinien keine signifikanten Unterschiede in der Bandenintensität festgestellt werden (Abb. 33). Ergebnisse 83

3.3.1.2 Multiple Tissue Expression Blot mit mRNA aus humanen Primärgewe- ben für BAT2 Um die Gewebeexpression in verschiedenen Geweben analysieren zu können, wurde ein MTE-Dot-Blot der Firma Clontech mit normalisierten mRNA-Proben aus verschiedenen humanen Primärgeweben verwendet. Neben verschiedenen adulten Geweben sind auf diesem Blot mRNA-Proben aus fötalen Geweben sowie einige Zelllinien aufgetragen (Abb. 34 oben). Als Sonde kam wiederum ein N-terminales BAT2-cDNA-Fragment (AscI-EcoRI) zum Ein- satz. Die Sonde wurde zunächst im klassischen Northern Blot auf ihre Qualität überprüft (nicht gezeigt), bevor sie im MTE eingesetzt wurde. Die direkte Auswertung im Phosphorimager ergibt folgendes Bild: BAT2 ist in den zur Verfügung stehenden adulten und fötalen Geweben und Zelllinien ubiquitär exprimiert, wenn auch in stark variierendem Umfang. Bei den adulten Geweben wird BAT2 vor allem in den Geweben des zentralen und peripheren Nervensystems sowie in Niere, Lunge, Plazenta und Ergebnisse 84

Herz-Kreislaufsystem Verdauungstrakt 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Negativkontrollen Nervensystem A B C Fötale Gewebe D A. Hirn E B. Herz C. Niere F D. Leber E. Milz G F. Thymus H G. Lunge

Verschiedene Gewebe A. Niere A. Lunge A. Leber Zelllinien B. Muskel B. Plazenta B. Pankreas A. HL-60 (Promyeloblast) C. Milz C. Blase C. Nebenniere B. HeLa (Adenokarzinom) D. Thymus D. Uterus D. Schilddrüse C. K562 (Knochenmark) E. PBL E. Prostata E. Speicheldrüse D. Molt4 (T-Lymphom) F. Lymphknoten F. Hoden F. Milchdrüse E. Raji (Burkitt-Lymphom) G. Knochenmark G. Eierstöcke H. Luftröhre F. Daudi (Burkitt-Lymphom) G. SW480 (kolorekt. Adenokarz.) H. A549 (Lungenkarzinom)

Abb. 34: Untersuchung des Expressionsmusters von BAT2-Transkripts in humanen Geweben. Ein normalisierter mRNA-Dotblot (MTE-Blot) wurde mit einer N-terminalen BAT2-cDNA-Sonde hybridisiert und auf einem Phosphorimager ausgewertet. Oben: Auftraggsschema, unten: Exposition auf Röntgenfilm. Ergebnisse 85

100

Nervensystem Herz-Kreislauf Verdauungstrakt 80

0 ------pons heart aorta ileum rectum jejunum stomach putamen ilocecum thalamus appendix amygdale atrium, left duodenum esophagus spinal cord frontal lobe whole brain atrium, right parietal lobe ventricle, left occipital lobe hippocampus temporal lobe pituitary gland cerebral cortex ventricle,, right cerebellum, left substantia nigra caudate nucleus corpus callosum apex of the heart cerebellum, right colon, ascending colon, transverse colon, descending medulla oblongata accumbens nucleus p.g. of cerebral cortex interventricular septum

100

80 verschiedene Gewebe Zellinien föt. Gewebe Negativkontr.

0 - - - - Raji PBL liver lung A549 HeLa testis ovary K-562 HL-60 Daudi uterus kidney spleen SW480 thymus trachea bladder MOLT-4 prostate placenta poly r(A) pancreas fetal liver fetal lung fetal brain fetal heart E.coli DNA yeast tRNA E.coli rRNA fetal kidney fetal spleen lymph node fetal thymus bone marrow thyroid gland adrenal gland salivary gland yeast total RNA skeletal muscle mammary gland human Cot-1 DNA human DNA 100ng human DNA 500ng

Abb. 35: Auswertung des MTE-Blots. Die Signalintensität für die RNA-Proben auf dem MTE-Blot wurde mit einem Phosphorimager ausgezählt und abzüglich des unspezifischen Membranhintergrunds aufgetragen.Die Proben sind nach dem Typ des Gewebes gruppiert, Leerwerte (d.h. keine RNA aufgetragen) sind mit Strichen bezeichnet. Ergebnisse 86

Nebenniere relativ stark exprimiert; im Verdauungstrakt zeigt vor allem Gewebe des Magens eine starke Expression. In Hodengewebe ist die Expression am stärksten von allen verfügba- ren Proben. In fötalem Gewebe ist das BAT2-Transkript in Herz und Niere überdurchschnitt- lich stark nachzuweisen (Abb. 35). Von den verfügbaren Zelllinien sind besonders HeLa, K562 und SW480 zu nennen, in denen die BAT2-Expression überdurchschnittlich stark ist. In Raji- und HL-60-Zellen ist die Expres- sion vergleichsweise schwächer. Bei den Negativkontrollen ist ein leichtes Hintergrundsignal für die E. coli-DNA zu beobachten. Laut Beschreibung des Herstellers ist ein solches Signal möglich und unproblematisch, solange nicht mehrere Negativkontrollen ein Signal liefern.

3.3.1.3 In-situ-Hybridisierung mit einer BAT2-Sonde (Mausembryonen) In einem weiteren Versuch sollte untersucht werden, ob während der Embryonalentwicklung von Mäusen BAT2-mRNA nachgewiesen werden kann. Aufgrund der hohen Homologie von humanem und murinem BAT2 wurde wiederum eine humane Sonde verwendet, um murines BAT2 zu detektieren. In 12 Tage alten Mausembryonen (C57/Bl6) konnte das BAT2-Trans- kript in den Somiten des Schwanzbereiches nachgewiesen werden, in anderen Geweben war keine Expression nachzuweisen (Abb. 36).

3.3.1.4 In-situ-Hybridisierung (adulte Testis) Da das BAT2-Transkript besonders stark in Hoden exprimiert war, wurde eine BAT2-Sonde hergestellt, mit der von Dr. Gromoll (Universität Münster) die Expression in Hodengewebe von Ratten und Java-Affen untersucht wurde. Aufgrund der hohen Homologie der bekannten Sequenzen von humanem, murinem und Ratten-BAT2 wurde eine humane BAT2-Sonde (die im Rahmen dieser Arbeit hergestellte komplette cDNA) verwendet. Die Hybridisierung der Gewebeschnitte mit der RNA-Sonde wurde von Dr. Gromoll durchgeführt. Das BAT2-Transkript konnte in beiden Spezies in einem zeitlich eng umgrenzten Rahmen während der Spermatogenese nachgewiesen werden (Abb. 37). Die Abbildung zeigt einen Querschnitt durch die Samenkanäle, die Spermienreifung schreitet von den Außen- zu den Innenregionen fort. Beim untersuchten Rattengewebe konnte BAT2 in relativ unreifen Sper- mien in der Außenzone der Samenkanäle nachgewiesen werden, beim Java-Affen wurde BAT2 dagegen zu einem etwas späteren Entwicklungszeitpunkt nachgewiesen. Aufgrund der hohen Homologie der bekannten Sequenzen der humanem, murinen und Rat- ten-cDNA wurde für BAT3 ebenfalls eine humane Sonde (komplette cDNA) verwendet, um Ergebnisse 87

Abb. 36: In-situ-Hybridisierung mit einer BAT2-Antisense-Sonde in 12 Tage alten Mausembryonen. Gesamtansicht und Detail mit Färbung im Bereich der Somiten. Ergebnisse

Java-Affe

Ratte

10 x 63 x

Abb. 37: BAT2-Expression in Hoden von Java-Affe und Ratte. In-situ-Hybridisierung mit einer BAT2-antisense-Sonde. 88 10fache (links) und 63fache Vergrösserung (rechts). Mit freundlicher Genehmigung von Dr. Gromoll (Universität Münster). Ergebnisse

Abb. 38: In situ-Hybridisierung mit einer BAT3-Sonde in Testis von Makaken. Mit freundlicher Genehmigung von Dr. Gromoll (Universität Münster). 89 Ergebnisse 90 BAT3 antisense-Sonde BAT2 antisense-Sonde Hybridisierung einer BAT2-Sonde (links) und einer BAT3-Sonde (rechts) in Testis von Makaken. Mit In situ-

Abb. 39: freundlicher Genehmigung von Dr. Gromoll (Universität Münster). 3fceVergrößerung 63-fache Ergebnisse 91 das Transkript in Hoden von Makaken nachzuweisen. Das BAT3-Transkript konnte wiederum in einem zeitlich eng umgrenzten Rahmen während der Spermatogenese nachgewiesen werden. Beim untersuchten Gewebe konnte BAT3 in den fast reifen Spermien in der Innenzone der Samenkanäle nachgewiesen werden (Abb. 38). Im Vergleich zum BAT2-Transkript findet die BAT3-Expression bei der Entwicklung der Spermatocyten später statt (Abb. 39).

3.4 Proteinbiochemische Ergebnisse

3.4.1 Expression von BAT2 in eukaryontischen Zellen

Die BAT2 cDNA wurde mittels Site-directed Mutagenese um einen carboxyterminalen His6- Tag erweitert. Dazu wurde die Plasmid-DNA des cDNA-Klons 22479 mit den Primern BAT2-His-Tag und BAT2-Selection (Selektionsprimer) um sechs Histidinreste direkt nach dem kodierenden Bereich verlängert und zu Selektionszwecken die BglII-Schnittstelle an

Position 5822 ohne Änderung der Aminosäuresequenz deletiert. Aus dem His6-getaggten cDNA-Klon 22479-His wurde das BglII-NotI-Fragment in die entsprechenden Schnittstellen der kompletten cDNA eingefügt. Um die cDNA in eukaryontischen Zellen zu exprimieren, wurde der Expressionsvektor pTracer-SV40 durch Insertion eines KpnI-AscI-HpaI-NotI-Linkers (AscI-NotI-sense und AscI-NotI-antisense in die KpnI und NotI-Schnittestellen modifiziert (pTracer-SV40-AN). Die gleichen Schnittstellen wurden mit entgegengesetzter Orientierung eingesetzt (NotI-AscI- sense und NotI-AscI-antisense), um die einklonierte Sequenz wahlweise auch als Antisense- Transkript exprimieren zu können (pTracer-SV40-NA). Die BAT2-cDNA und die His6- getaggte BAT2-cDNA wurden anschließend über die angefügten AscI- und NotI-Schnitt- stellen eingeführt (pTracer-SV40-BAT2 sense bzw. antisense sowie pTracer-SV40-BAT2-His sense bzw. antisense). Die Konstrukte wurden in der in-vitro-Translation getestet und ergaben, wie von der Länge des offenen Leserasters erwartet, ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von ca. 220 kDa. Das Polypeptid konnte im Western Blot von zwei der aufgereinigten Antikörper nachgewiesen werden (anti-BAT2-1 und anti-BAT2-4, s.o., Abb. 24). Die gleichen Konstrukte wurden transient in COS7-Zellen zur Expression gebracht. Obwohl mehrere Parameter variiert wurden (DNA-Konzentration und Dauer der Expression, Menge des verwendeten Antikörpers), konnten mit C-terminalen Tags in der Immunpräzipitation keine Signale erhalten werden. Der anti-His (C-term) Antikörper (Invitrogen), der andere Ergebnisse 92

Konstrukte mit C-terminalen His6-tags (GB-His, BAT3-V5-His) einwandfrei präzipitiert, lie- ferte unter keiner der getesteten Bedingungen Signale für transient mit pTracer-SV40-BAT2- His transfizierte COS7-Zellen. Auch mit den Antiseren konnten weder in der Immunpräzipita- tion noch im Western Blot Signale nachgewiesen werden. Um die Eignung der Antiseren für den Nachweis von BAT2-Peptiden in transfizierten Zellen zu überprüfen, wurden drei Fusionsproteine entworfen, die aus einem N-terminalen Fragment der 31 kDa-Isoform der murinen invarianten Kette (Aminosäure 1- 79, also einschließlich der Transmembrandomäne) und einem Fragment von BAT2 bestehen. Mittels der Primerpaare BAT2Fusion.102.F/BAT2Fusion.2565.R und BAT2Fusion.2566.F/BAT2Fusion.4420.R sowie BAT2 Fusion.4421.F/BAT2Fusion.6572.R wurden mit der BAT2 cDNA als Matrize drei PCR-Produkte gewonnen, die mit HindIII verdaut wurden und in den HindIII-geschnittenen Vektor pcDNA3.1-Ii31 ligiert wurden. Es ergeben sich die drei Konstrukte pcDNA3.1AEN.Ii31-BAT2#1, -BAT2#2 und -BAT2#3 mit einem erwarteten Moleku- largewicht von ca. 97, 63 bzw. 84 kDa. Die Lage dieser Proteine relativ zu den GST- Fusionsproteinen ist Abb. 40 zu entnehmen. Aufgrund des N-terminalen Ii31-Epitops können diese Fusionsproteine mit dem monoklonalen Antikörper In-1 nachgewiesen werden. Im Wes- tern Blot konnte der gegen das GST-Fusionsproteine BAT2-6 erzeugte Antikörper (anti- BAT2-6) das C-terminale Konstrukt detektieren (Abb. 41).

BAT2 (1-2157)

GST-BAT2-1(1-253) GST-BAT2-4(826-1439)

GST-BAT2-5 (1440-1791)

GST-BAT2-6 (1792-2157)

Ii-BAT2-1(1-821)

Ii-BAT2-2(822-1440)

Ii-BAT2-3(1441-2097)

Abb. 40: GST-BAT2-Fusionsproteine und Ii-BAT2-Fusionsproteine und die Lage ihrer BAT2- Fusionsanteile in Relation zum BAT2-Polypeptid. Ergebnisse

Anti-BAT2-6 In-1

176 Ii-BAT2-3 84

30 1 1 1 1 2 2 5 5 keine DNA keine DNA µ µ µ µ µ µ µ µ g CgIi g g g g g g g CgIi

Ii-BAT2-3 Ii-BAT2-3

Abb. 41: Detektion des Ii-BAT2-3-Fusionsproteins im Western Blot. COS7-Zellen wurden mit der invarianten Kette (CGIi) bzw. verschiedenen Mengen des Ii-BAT2-3-Konstrukts transfiziert. NP40-Lysate wurden mit einem affinitätsgereinigten anti-BAT2-Antikörper µ (1 g/ml, links) bzw. mit dem monoklonalenAntikörper In-1 (einfach konzentrierter Hybridomüberstand, rechts) detektiert. 93 Ergebnisse 94

Die bisher beschriebenen Konstrukte erlaubten keine Expression bzw. keinen Nachweis des kompletten BAT2-Proteins in transfizierten Zellen. Daher wurden weitere Konstrukte mit N- terminalen Epitopen hergestellt. Der erste Ansatz verwendete die ersten 20 bzw. die ersten 29 Aminosäuren der murinen invarianten Kette, da aufgrund der vorliegenden Informationen hier das Epitop des monoklonalen Antikörpers In-1 vermutet wurde. Mittels des Oligonukleotids Ii1-20-BAT2-F bzw. des Oli- gonukleotids Ii1-29-BAT2-F und des Primers BAT2.3254.R wurden mittels PCR zwei N-terminale Fragmente von BAT2 erzeugt, die N-terminal die ersten 20 bzw. 29 Aminosäuren der murinen invarianten Kette tragen. Diese PCR-Produkte wurden in den pcDNA3.1D-V5-His- TOPO Vektor kloniert und für die transiente Expression in COS7-Zellen verwendet. In der Immunpräzipitation konnten die Konstrukte nicht nachgewiesen werden; im Western Blot konnte das Konstrukt mit dem längeren Epitop der invarianten Kette mit dem Antikörper In-1 nachgewiesen werden. Durch Einklonieren des fehlenden C-terminalen Teils von BAT2 über die EcoRI-NotI-Schnittstellen konnte das Volllängen-BAT2 zur Expression gebracht und mittels des Antikörpers In-1 nachgewiesen werden. Um Auswirkungen des Ii31-Epitops auf die Expression des BAT2-Proteins auszuschließen, wurden anschließend Konstrukte mit den Epitopen V5 (aus SV5) und myc hergestellt. Diese Konstrukte wurden auf gleiche Weise wie die zuvor beschriebenen Ii1-20-Konstrukte über PCR mit einem entsprechenden Vorwärtsprimer und dem reversen Primer BAT2.3255.R erzeugt und in den Expressionsvektor pcDNA3.1D-V5-His-TOPO kloniert. Wie zuvor beschrieben, wurden der C-Terminus von BAT2 mittels EcoRI und NotI-Schnittstelle an das Konstrukt angefügt. Die Konstrukte mit dem N-terminalen V5-Epitop konnten im Western Blot nachgewiesen werden; keines der Konstrukte konnte in der Immunpräzipitation detektiert werden.

3.4.2 Expression und Detektion von BAT3 in COS7-Zellen

Die BAT3 cDNA wurde transient in COS7-Zellen zur Expression gebracht. Aus Lysaten von metabolisch markierten Zellen konnte das BAT3-Protein mittels der anti-V5- und anti-His (C- term)-Antikörper (beide Invitrogen) als Doppelbande mit einem apparenten Molekularge- wicht von 150 kDa immunpräzipitiert werden. Im Western Blot konnte das BAT3-Protein mit dem anti-V5-Antikörper nachgewiesen werden (Abb. 42). Ergebnisse 95

175

47,5 BAT3-V5 keine DNA keine

Abb. 42: Nachweis von BAT3-V5 im Western Blot. NP40- Lysate transfizierter COS7-Zellen wurden mit dem monoklonalenAntikörper anti-V5 detektiert.

3.4.3 Subzelluläre Fraktionierung zur Lokalisierung der BAT-Proteine in transfizierten Zellen

COS7-Zellen wurden mit dem Konstrukt Ii1-29-BAT2 transfiziert und nach zwei Tagen geerntet. 1 x 107 Zellen wurden mechanisch aufgeschlossen und in eine Kern-, eine Membran- und eine zytoplasmatische Fraktion aufgetrennt. Die Fraktionen wurden zusammen mit Spezi- fitätskontrollen im Western Blot mit dem Antikörper In-1 analysiert. BAT2 konnte in der Kernfraktion und in der zytoplasmatischen Fraktion nachgewiesen werden (Abb. 43 oben). Das BAT3-Protein wurde ausschließlich in der Kernfraktion nachgewiesen, die Kontrolle mit einem Hsp70-spezifischen Antiserum zeigt für Hsp70 die erwartete Verteilung zwischen Kern und Zytoplasma; in der Membranfraktion ist weder BAT3 noch Hsp70 nachzuweisen (Abb. 43 unten).

3.4.4 Immunfluoreszenz mit transient transfizierten Zellen

COS1-Zellen wurden transient transfiziert mit den Konstrukten V5-BAT2 und BAT3-V5 und auf Kammerobjektträger ausgesät. Nach zwei Tagen wurden die Zellen mit Paraformaldehyd oder alternativ mit Methanol-Aceton fixiert und mit dem Antikörper V5 und dem Sekundär- Ergebnisse 96

BAT3-V5

Hsp70 yolsaiceFraktion Zytoplasmatische Kernfraktion Membranfraktion Gesamtlysat Zellenuntransfizierte

Abb. 43: Subzellulare Lokalisierung von V5-BAT2 und BAT3-V5. COS7-Zellen.wurden mit V5-BAT2 bzw. BAT3-V5-cDNA transfiziert und mechanisch aufgeschlossen. Durch differenzielle Zentrifugation wurde eine Kern-, eine zytoplasmatische und eine Membranfraktion präpariert. Äquivalente Mengen der so erhaltenen Fraktionen wurden zusammen mit äquivalenten Mengen Gesamtlysat von transfizierten Zellen (”Gesamtlysat”) und untransfizierten Zellen (”untransfizierte Zellen”) in der SDS-PAGE getrennt und mit anti-V5-Antikörper (200 ng/ml) im Western Blot detektiert. antikörper anti-Maus-Ig-DTAF gefärbt. Die Auswertung im Fluoreszenzmikroskop zeigte für BAT2 eine diffuse Färbung, die teilweise im Kern, teilweise im kernnahen Zytoplasma lokalisiert war (Abb. 44 oben). Die mit BAT3 transfizierten Zellen zeigten eine intensive Anfär- bung des Kerns; im Zytoplasma oder an der Zellmembran war kein BAT3 nachweisbar (Abb. 44 unten).

Ergebnisse 97

BAT3-V5 V5-BAT2 Immunfluoreszenz 20 µm 20 µm 20 µm Phasenkontrast 20 µm 20 µm Abb. 30: COS1-Zellen wurden mit dem Konstrukt V5-BAT2 transfiziert, fixiert (Methanol- Abb. 30: COS1-Zellen wurden mit dem Konstrukt V5-BAT2 gefärbt. Phasenkontrast (links) Aceton) und mit den Antikörpern anti-V5 anti-Maus-DTAF und Fluoreszenzaufnahmen (rechts), jeweils 40fache Vergrösserung. Ergebnisse 98

3.4.5 Einfluss von BAT2 und BAT3 auf die proteasomale Degradation des Glukokortikoidrezeptors

Chaperone erkennen inkorrekt gefaltete Proteinsubstrate und fördern den korrekten Faltungsvorgang. Bleibt der Faltungsvorgang erfolglos, können fehlgefaltete Proteine degradiert werden (Wickner et al. 1999). Kürzlich wurde gezeigt, dass die Chaperon-Kofaktoren BAG-1 und CHIP an der Kooperation von Hsc/Hsp70 mit dem Ubiquitin-Proteasom-System beteiligt sind (Demand et al. 2001). CHIP hat dabei die Wirkung einer Ubiquitinligase für Chaperonsubstrate wie den Glukokortikoidrezeptor (GR). BAG-1 funktioniert als Kopp- lungsfaktor zwischen dem Proteasom und dem Hsc/Hsp70-System und interagiert direkt mit CHIP. BAG-1 fördert so die CHIP-vermittelte Degradation von GR in vivo. Das BAT3- Protein besitzt wie BAG-1 eine aminoterminale ubiquitinähnliche Domäne und eine carboxy- terminale BAG-Domäne und wird in diesem Zusammenhang auch als BAG-6 bezeichnet. In einem Kotransfektionsexperiment wurden GR, CHIP, BAT2 und BAT3 transient in COS7- Zellen exprimiert und die Proteine BAT2, BAT3, GR und CHIP im Western Blot detektiert (Abb. 45). Die densitometrische Analyse der Daten zeigte, dass die Menge des GR-Proteins in CHIP-exprimierenden Zellen in Anwesenheit von BAT2 (Spur 3), BAT3 (Spur 4) oder BAT2 und BAT3 (Spur 3) deutlich reduziert war gegenüber Zellen, die nur CHIP und GR exprimieren (Spur 2). Zellen, die nur mit BAT2, BAT3 und GR transfiziert wurden, besitzen dem- gegenüber deutlich mehr GR.

3.5 Second Mitochondrial Activator of Caspases (Smac)

Bei Studien zu dem Protein Scythe, einem Xenopus-Homolog des BAT3, wurde das Dro- sophila-Protein Reaper (rpr) als Interaktionspartner von Scythe beschrieben (Thress et al. 1998). Reaper bindet wie zwei andere Apoptose-fördernde Proteine, Grim und Hid, an Inhibitoren der Apoptose (IAP), fördert die Aktivierung von Caspasen und übt so eine proapoptotische Wirkung aus. In Säugerzellen ist kein Sequenzhomolog zu Reaper bekannt; ein mögliches funktionales Säu- gerhomolog zu Reaper ist das proapoptotische Protein Smac (im Menschen, Du et al. 2000) bzw. DIABLO (in der Maus, direct IAP binding Protein with low pI, Verhagen et al. 2000). Smac wird in einer inaktiven Proform exprimiert, die in die Mitochondrien transportiert und dort prozessiert wird. Nach Abspaltung eines 55 Aminosäuren langen Propeptids liegt humanes Smac in seiner aktiven Form im Intermembranbereich der Mitochondrien vor und wird Ergebnisse 99

+++++-

- ++ ++-

+++- - -

++- + - -

18267

9782

5544 5550 5835

122

20000

17500

15000

12500

Densitometr. Auswertung 10000

7500

5000

rel. Intensität

2500

0 1 2 3 4 5 6

Abb. 45: Einfluss von BAT2 und BAT3 auf die proteasomale Degradation des Glukokortikoidrezeptors (GR). COS7-Zellen wurden transient mit BAT2, BAT3, CHIP und GR transfiziert und die Proteinmengen im Western Blot bestimmt. Die Menge von GR wurde densitometrisch bestimmt und als relative Menge unten dargestellt. Ergebnisse 100

bei apoptotischen Stimuli nach Permeabilisierung der mitochondrialen Membran ins Zyto- plasma freigesetzt. Dort kann es an IAPs binden und so seine apoptotische Wirkung ausüben. Die Ähnlichkeit zwischen den Drosophila-Proteinen und Smac ist auf eine N-terminale Re- gion der (im Fall von Smac prozessierten) Polypeptide beschränkt (Abb. 46). Die Drosophila- Proteine untereinander sind in den ersten 14 Aminosäuren homolog, und für ihre Bindung an IAPs ist dieser N-Terminus erforderlich. Im Fall von Smac sind die ersten vier Aminosäuren der prozessierten Form für die Bindung an IAPs essentiell, und die ersten 7 Aminosäuren sind ausreichend, um die Interaktion zu vermitteln. Zwischen den Drosophila-Proteinen und Smac besteht in diesen für die Interaktion wichtigen N-terminalen Regionen eine Sequenzhomolo- gie in zwei Resten, ein weiterer Aminosäurerest ist zwischen Hid und Smac konserviert (Abb. 46, Silke et al. 2000).

Grim : MAIAYFIPDQAQLL : 14 Reaper : MAVAFYIPDQATLL : 14 Hid : MAVPFYLPEGGADD : 14 Smac human : -AVPIAQKSEPHSL : 68 Diablo : -AVPIAQKSEPHSL : 66 Smac porcin: -AVPIAQKSEPHSL : Smac bovin : -AVPIAQKPEPHSL : erforderlich für Interaktion mit IAPs ausreichend für Interaktion mit IAPs

Abb. 46: Sequenzhomologien der Drosophila-Proteine Grim, Reaper, Hid mit Smac bzw. Diablo. Die Homologie zwischen den Drosophila-Proteinen ist auf eine N-terminale Region von 14 Aminosäuren Länge beschränkt. Für die Bindung der Drosophila-Proteine an IAPs ist der N-Terminus erforderlich. Im Fall von Smac sind die ersten vier Aminosäuren der prozessierten Form für die Bindung an IAPs essentiell, und die ersten 7 Aminosäuren sind ausreichend, um die Interaktion zu vermitteln. Zwischen den Drosophila-Proteinen und Smac besteht in diesen für die Interaktion wichtigen N-terminalen Regionen eine Sequenzhomologie (Modifiziert nach Silke et al. 2000)

3.5.1 Klonierung einer Smac-cDNA

Aus Raji-Zellen gewonnene Gesamt-RNA wurde für die Synthese zufällig geprimter cDNA verwendet. Mit den Primern Smac.46F.XbaI und Smac.726R.NotI wurde ein PCR-Produkt hergestellt und in den Vektor pCRII-TOPO kloniert. Die Sequenz des klonierten Produkts wurde bestimmt (GATC) und stimmt mit der publizierten Sequenz von Smac überein (Du et al. 2000). Um die klonierte cDNA zu exprimieren, wurde die Smac-cDNA mit den Restriktionsenzymen XbaI und NotI ausgeschnitten und in die Vektoren pcDNA3.1-V5-His und pcDNA3.1(-)/myc- his-C kloniert. Ergebnisse 101

3.5.2 Expression in eukaryontischen Zellen

Die Smac-cDNA wurde transient in COS7-Zellen zur Expression gebracht. In der Immun- präzipitation wurden mit dem anti-His(C-term)- und dem anti-myc-Antikörper drei Banden detektiert: eine Bande von ca. 29-31 kDa, was ungefähr dem erwarteten Molekulargewicht von unprozessiertem Smac mit den V5-His- bzw. myc-his-Tags entspricht und eine Doppel- bande bei ca. 25 kDa, was dem Molekulargewicht der prozessierten Form von Smac entspricht und mit publizierten Daten übereinstimmt. Im Western Blot ergibt sich mit dem Konstrukt Smac-V5-His ein ähnliches Bandenmuster (Abb. 47).

Western Blot (anti-V5) 47,5

32,5

25 1133µg DNA Smac-V5 Kontrolle (LacZ-myc)

IP (anti-myc) IP (anti-His)

30 kDa

125100 125100µg DNA Smac-myc-his Smac-myc-his

Abb. 47: Expression von Smac in COS1-Zellen. Smac-V5-his (oben) kann im Western Blot mit anti-V5 nachgewiesen werden. Smac-myc-his kann aus Lysaten transfizierter Zellen mit monoklonalen Antikörpern gegen die myc- und his-Epitope präzipitiert werden (metabolisch35 S-Methionin-markierte Zellen, unten).

3.5.3 Koexpression von Smac mit BAT3

Um eine mögliche Interaktion von Smac mit BAT3 zu untersuchen, wurden CHO-Zellen stabil mit dem BAT3-V5-His-Konstrukt transfiziert. Stabil exprimierende Klone mit hoher Ergebnisse 102

Expression wurden selektiert und transient mit Smac-myc-His transfiziert. Transfizierte Zel- len wurden metabolisch markiert, lysiert und die geteilten Lysate wurden für Immunpräzipitationen gegen BAT3 (anti-V5) bzw. Smac (anti-myc) verwendet. Beide Prote- ine konnten nachgewiesen werden, eine Koisolation der beiden Proteine konnte jedoch nicht nachgewiesen werden (Abb. 48).

BAT3 (anti-V5) Smac (anti-myc)

220

96 69

12 5 10 0 12 5 10 0 µg Smac-myc-his-DNA µg Smac-myc-his-DNA

Abb. 48: Untersuchung der Assoziation von BAT3 und Smac. BAT3-V5-exprimierende CHO-Zellen wurden mit verschiedenen Mengen Smac-myc-his-DNA transient transfiziert. Aus den metabolisch35 S- Methionin-markierten Zelllysaten wurde BAT3 (links) bzw. Smac (rechts) immunpräzipitiert. Diskussion 103

4 Diskussion

4.1 Molekularbiologie von BAT2

Die Sequenz der humanen BAT2 cDNA wurde 1990 erstmals von Banerji et al. publiziert, 1993 wurden mit der Identifikation der ersten 25 Exons partielle genomische Daten verfügbar (Iris et al. 1993). Zum Zeitpunkt der vorliegenden Untersuchungen lagen keine weiteren Informationen vor. Die BAT2 cDNA wurde daher kloniert, komplett sequenziert und die fehlende Intron-Exon-Struktur bestimmt. Die als Teil der vorliegenden Arbeit klonierte cDNA besitzt ein offenes Leseraster von 6471 Basenpaaren und ist damit 45 Basenpaare länger als die von Banerji et al. veröffentlichte Sequenz. Auf genomischer Ebene wurden durch Sequen- zierung eines genomischen Subklons und Vergleich mit der cDNA-Sequenz insgesamt 31 Exons identifiziert. Im Vergleich zu der Sequenz von Banerji et al. und der auf Exonebene weitgehend identi- schen Sequenz von Iris et al. wurden zahlreiche Differenzen gefunden. Im einzelnen sind dies zahlreiche Basenaustausche, insgesamt 16 Unterschiede im Leseraster und zwei Insertionen bzw. Deletionen (siehe Anhang 2). Abgesehen von den Rasterverschiebungen, die offensichtlich auf technische Probleme beim Sequenzieren dieser sehr GC-reichen Sequenz zurückzu- führen sind, weist die vorliegende cDNA gegenüber der von Banerji et al. klonierten cDNA eine zusätzliche Sequenz von 36 Basenpaaren auf, die im Exon 11 liegt. Iris et al. haben diese zusätzliche Sequenz in Exon 11 ebenfalls beschrieben. Die Datenbank des NCBI (Version) führt mittlerweile zwei Isoformen der BAT2 cDNA auf: die hier vorliegende Form (NM- 080686) und die von Banerji et al. beschriebene, kürzere Variante (NM-004638). Diese beiden Transkripte werden irrtümlicherweise als Spleißvarianten bezeichnet, obwohl die fragli- che Sequenz inmitten von Exon 11 liegt und somit nur auf einen Polymorphismus auf genomischer Ebene oder auf ein Klonierungsartefakt zurückgeführt werden kann. Diese Erklärung ist denkbar, da die Quellen für die analysierten cDNA-Klone unterschiedlich waren: die cDNA von Banerji et al. wurde aus einer HPB-ALL-Bibliothek kloniert, die genomische Sequenz von Iris et al. beruht auf einer Cosmid-Bibliothek aus der für den MHC homozygoten Zelllinie 9031 Boleth, und die vorliegende cDNA-Sequenz beruht zu Teilen auf cDNA aus Primärgeweben (IMAGE cDNA-Klone), teilweise aus cDNA-Sequenzen aus der Raji-Zelllinie. Eine Recherche in der dbEST-Datenbank, die eine Sammlung von cDNA-Da- ten darstellt, ergibt keine Klone, die der Banerji-Isoform in diesem Punkt entsprechen. Die Sequenzdaten von Iris et al. (auf Basis der Boleth-Zelllinie) sind kritisch zu beurteilen, da sie Diskussion 104 von anderen Sequenzdaten aus der Zelllinie Boleth und anderen untersuchten Zelllinien abweichen (Guilladeux et al. 1998, O’hUigin et al. 2000). Die hier vorgelegten cDNA-Daten werden dagegen durch die zwischenzeitlich veröffentlich- ten Daten des humanen Genomprojekts gestützt, die cDNA-Sequenzen der NCBI-Datenbank sind bis auf wenige Basenaustausche identisch, und es gibt keine Unterschiede im Leseraster. Betreffend der Basenaustausche ist festzustellen, dass unsere abgeleitete Aminosäuresequenz mit der NCBI-Sequenz bis auf sieben Aminosäuren identisch ist. Es ist unwahrscheinlich, dass diese Unterschiede auf Fehler der thermostabilen Polymerase im Verlauf der PCR- Amplifikation zurückzuführen sind, da nur einer von diesen Basenaustauschen in einem Be- reich liegt, der über das RT-PCR-Verfahren kloniert wurde. Es ist vielmehr davon auszugehen, dass die Unterschiede Polymorphismen des BAT2-Gens widerspiegeln: vier der sieben Diffe- renzen befinden sich an Positionen, für die bereits allelische (allerdings bisher lediglich synonyme) Unterschiede in der dbSNP verzeichnet sind. Insgesamt sind bisher 100 SNPs für das BAT2-Gen erfasst worden, davon 17 nichtsynonyme Austausche, die sich in einer Änderung der Aminosäuresequenz niederschlagen. Die dbSNP führt desweiteren sieben synonyme Basenaustausche an sowie 44 SNPs in Introns und jeweils 11 im 5’- bzw. 3’-untranslatierten Bereich (dbSNP Build 114, 28. April 03). Die dbSNP umfasst zur Zeit 4,1 Millionen nicht-redundante Einträge, so dass durchschnittlich etwa 12 SNPs pro 10 kb des Genoms vorkommen. Eine etwas ältere Studie hat ausgehend von 1,4 Millionen SNPs die SNP-Dichte der verschiedenen Chromosomen untersucht (The Inter- national SNP Map Working Group 2001). Bei einer mittleren SNP-Dichte von 5,2 SNPs pro 10 kb (die Dichte schwankt zwischen 4,5 und 8,4 SNPs pro 10 kb auf den Autosomen) fällt das Chromosom 6 mit 5,8 SNPs pro 10 kb nicht auf, obwohl es den hochpolymorphen MHC- Lokus enthält. Betrachtet man die Verteilung von SNPs auf dem Chromosom 6, hebt sich der MHC-Lokus mit lokalen SNP-Dichten von bis zu 32 SNPs pro 10 kb allerdings deutlich hervor (The International SNP Map Working Group 2001). Das BAT2-Gen ist mit ca. 60 SNPs pro 10 kb also offensichtlich ein Gen mit einer überdurch- schnittlich hohen Dichte von SNPs. Ein direkter Vergleich mit Ergebnissen aus anderen Stu- dien ist aber schwierig, da die Anzahl der bekannten SNPs für ein Gen stark abhängig ist von der Gesamtanzahl der katalogisierten SNPs. Für die Maus sind beispielsweise weniger als 200000 SNPs erfasst und die mittlere SNP-Dichte liegt zur Zeit nur bei 0,82 pro 10 kb (dbSNP Build 114, 28. April 03). EST-basierte Methoden der SNP-Entdeckung führen ferner dazu, dass stark transkribierte Gene zwangsläufig überrepräsentiert sind und Variationen von seltenen Transkripten nicht detektiert werden. Diskussion 105

Der Startpunkt der BAT2-mRNA ist von Banerji et al. ursprünglich mittels des am 5’-Ende längstmöglichen cDNA-Klons definiert worden; in diesem Leseraster liegen vor dem ersten Methioninkodon mehrere Stopkodons. Iris et al. haben ebenfalls kein längeres Leseraster finden können, schlagen aber einen alternativen mRNA-Startpunkt 180 bp vor dem von Banerji als Start von Exon 1 publizierten Punkt vor. Mittels RACE wurde in der vorliegenden Arbeit der Startpunkt der BAT2-mRNA genauer definiert. Zahlreiche Klone stimmten mit dem publizierten mRNA-Start überein. Einige Klone hatten einen Startpunkt erst inmitten Exon 1 oder 2, und andere Klone begannen deutlich vor Exon 1, bis hin zu dem Punkt, der von Iris et al. vorgeschlagen wird. Die vorliegenden Ergebnisse legen die Vermutung nahe, dass der von Iris vorgeschlagene Startpunkt der tatsächliche Startpunkt der BAT2-mRNA ist; der hohe lokale GC-Gehalt von 74 % (für die gesamte mRNA: 61 %) und daraus resultierende Sekun- därstrukturen sind vermutlich dafür verantwortlich, dass während der cDNA-Synthese die reverse Transkriptase die Erststrangsynthese abbricht und viele RACE-Klone daher nicht die volle Länge des Transkripts wiedergeben. Das Phänomen des hohen GC-Gehalts im 5’- untranslatierten Bereich ist bei eukaryontischen mRNAs weit verbreitet und ist wahrscheinlich auf die Präsenz von CpG-Inseln am 5’-Ende vieler Gene von Säugetieren zurückzuführen (Pesole et al. 2001). Darüber hinaus hat das RACE-Experiment ergeben, dass die Hälfte der untersuchten Klone ein längeres Exon 2 mit einem früheren Startpunkt enthält. Diese Klone enthalten eine zusätz- liche Sequenz von 37 Basenpaaren. Durch eine Datenbankrecherche konnte bestätigt werden, dass der alternative Startpunkt von Exon 2 keine Besonderheit von Raji-Zellen ist, deren mRNA das Ausgangsmaterial dieses Experiments war. Auch die relative Häufigkeit der beiden Spleißvarianten wurde durch die Daten der EST-Datenbank bestätigt. Alternativ gespleißte Sequenzen im 5’-untranslatierten Bereich (UTR) einer mRNA sind nicht ungewöhnlich; die Häufigkeit solcher Spleißereignisse unterscheidet sich nicht vom translatierten Bereich (Brett et al. 2000). Frühere Studien hatten sogar die Mehrzahl aller alternativen Spleißereignisse im 5’-UTR angesiedelt (Mironov et al. 1999), neuere Studien belegen aber, das 70-90 % dieser Ereignisse den translatierten Bereich betreffen (Modrek & Lee 2002). Die Funktion des verlängerten Exons 2 ist unklar, da sie im untranslatierten Bereich liegt und ihre Bedeutung wohl nur in einer direkten Beeinflussung des Transkripts auf Translations- ebene oder in einem Einfluss auf die Stabilität des Transkripts liegen kann. Die Steuerung der Translationseffizienz durch alternativ gespleißte Sequenzen im 5’-UTR ist für verschiedene Transkripte beschrieben worden (z.B. für Cathepsin L und Proinsulin, Arora et al. 2002, Shalev et al. 2002). Diskussion 106

4.2 Molekularbiologie von BAT3

Ausgehend von der publizierten Sequenz (Banerji et al. 1990) wurde mittels RT-PCR aus der Raji-Zelllinie eine BAT3-cDNA amplifiziert und kloniert. Die hier vorgelegte cDNA-Se- quenz entspricht weitgehend den Sequenzen von Banerji et al. bzw. denen der NCBI Genbank. Drei nichtsynonyme Austausche im kodierenden Bereich werden nicht durch SNP-Daten abgedeckt und stellen eventuell neue SNPs dar. Mit insgesamt 32 SNPs ist die Anzahl der bekannten Polymorphismen für BAT3 deulich geringer als für BAT2: drei SNPs treten im 5’- UTR auf, zwei im 3’-UTR; drei nichtsynonyme Austausche sind im kodierenden Bereich bekannt und 24 SNPs liegen in Introns. Synonyme Basenaustausche sind für BAT3 bisher nicht beschrieben. Die SNP-Dichte liegt damit bei 23,5 pro 10 kb des Gens und ist deutlich niedri- ger als für das BAT2-Gen ermittelt. Die unterschiedliche Dichte der SNPs für BAT2 und BAT3 ist überraschend, da die Gene eng benachbart und sich in der Aminosäurezusammen- setzung ähnlich sind. Den SNP-Datenbanken ist nicht zu entnehmen, ob das BAT3-Transkript ähnlich stark in den Ausgangsdaten repräsentiert war wie das BAT2-Transkript und somit die verfügbaren Daten vergleichbar sind. Das BAT3-Transkript besitzt wie BAT2 im 5’-UTR eine alternativ gespleißte Sequenz. 15 % der Transkripte in der EST-Datenbank entsprechen der von Banerji veröffentlichten Sequenz, die übrigen Klone enthalten ein um 24 bp verkürztes Exon 1. Über die Funktion lässt sich momentan nur spekulieren, eine regulatorische Funktion ist auch hier denkbar. Im kodierenden Bereich enthält die klonierte cDNA ein zusätzliches Exon 11B; Exon 24 fehlt, und im Vergleich zu Banerji et al. wird ein anderer Startpunkt von Exon 7 benutzt. Die von Banerji et al. veröffentlichte cDNA-Sequenz benutzt für Exon 7 eine Exongrenze, die nicht den Konsensussequenzen entspricht. In der EST-Datenbank findet sich lediglich ein Klon, der dieser Variante entspricht; vermutlich handelt es sich um ein fehlgespleißtes Pro- dukt oder eine seltene Spleißvariante. Die vorliegende cDNA verwendet einen 18 bp später gelegenen Startpunkt für Exon 7, der an der Exongrenze den Konsensussequenzen entspricht. Praktisch alle cDNA-Klone der EST-Datenbank enthalten diesen Startpunkt von Exon 7. Die ENSEMBL-Datenbank führt einen anderen, gegenüber Banerji 24 bp früher gelegenen Start- punkt für Exon 7 an, der zwar die formellen Kriterien erfüllt, aber nicht in der EST-Daten- bank vertreten ist. Es ist daher davon auszugehen, dass die hier vorgestellte Sequenz korrekt ist und die Variante von Banerji eventuell eine seltene Spleißvariante darstellt. Das neu beschriebene Exon 11B ist 108 bp lang, die Nukleotide an den Intron-Exon-Grenzen entsprechen den kanonischen Sequenzen, und computergestützte Exonvorhersagen für das BAT3-Gen sagen Exon 11B mit „guter“ Wahrscheinlichkeit voraus (GRAIL, Xu & Uber- Diskussion 107 bacher 1997). Das Leseraster bleibt erhalten. Eine Analyse der EST-Datenbank ergibt, dass über 25 % aller relevanten BAT3-Klone das Exon 11B enthalten. Die klonierte cDNA enthält kein Exon 24; das Leseraster wird hierdurch nicht verändert. Ein Drittel der BAT3-cDNA-Klone der dbEST enthält kein Exon 24; es ist also nicht davon auszugehen, dass es sich um eine fehlgespleißte Form oder eine seltene Variante handelt. Die erste veröffentlichte BAT3-cDNA-Sequenz aus Rattus norvegicus enthält ebenfalls kein Exon 24 und enstpricht diesbezüglich der hier vorgestellten cDNA-Sequenz (Ozaki et al. 1999). Die Konservierung alternativer Spleißereignisse über die Speziesgrenzen deutet auf eine funktionale Bedeutung hin. Eine Analyse der verfügbaren EST-Daten mit Hilfe der PALSdb ergibt weitere potentielle alternative Spleißereignisse für Exon 5, Exon 11, Exon 11 und 11B sowie Exon 22. Rechnerisch ergeben sich somit acht verschiedene mögliche Varianten, wenn man die Exons 1, 11B und 24 betrachtet; bei Berücksichtigung der potentiellen Spleißereignisse erhöht sich dies Zahl auf 128. Es ist nicht bekannt, welche Kombinationen der alternativ gespleißten Bereiche tatsächlich vorkommen, da die verfügbaren Daten auf cDNA-Fragmenten beruhen und keine individuellen Volllängenklone repräsentieren. Über funktionale Unterschiede der vorliegenden Spleiß- variante zu anderen Varianten von BAT3 kann noch keine Aussage gemacht werden, da andere Transkriptvarianten nicht zur Verfügung standen. Alternatives Spleißen ist im menschlichen Genom weit verbreitet, und es wird geschätzt, dass bis zu 38 % aller Gene alternativ prozessiert werden (Brett et al. 2000). Andere Studien gehen davon aus, dass in allen menschlichen Genen alternative Spleißvorgänge stattfinden und die Entdeckung zur Zeit noch durch zu geringe Datenbestände in den EST-Datenbanken behin- dert wird (Kan et al. 2002). In anderen Organismen (von C.elegans bis zu M. musculus) wird die Häufigkeit alternativen Spleißens ähnlich hoch wie beim Menschen eingeschätzt (Brett et al. 2002). Spleißvarianten, die die Proteinsequenz beeinflussen, sind mit einer Vielzahl von Phänome- nen in Verbindung gebracht worden, die von der Geschlechtsbestimmung bei Drosophila, Ausbildung von Synapsen und Steuerung des Axonwachstums reichen (diskutiert in Graveley 2001). Am letztgenannten Beispiel ist das dscam-Gen beteiligt, von dem bis zu 38000 verschiedene Varianten generiert werden können (Graveley 2001). Alternative Spleiß- vorgänge in untranslatierten Bereichen sind mit der Steuerung der Translation in Verbindung gebracht worden (s. Abschnitt 4.1). Diskussion 108

Die Bedeutung alternativen Spleißens für ein Gen ist teilweise schwer zu analysieren, wenn einer Spleißvariante kein Phänotyp zugeordnet werden kann. Für die effiziente Charakterisie- rung neuer Spleißvarianten werden RNAi-Techniken (RNA-mediated interference) vorgeschlagen, die durch Ausbildung doppelsträngiger RNA-Komplexe gezielt die Degradation eines Transkripts fördern können (Graveley 2001). Die Kontrolle alternativer Spleißereignisse ist komplex und noch weitgehend unklar. Eine Reihe von Faktoren sind bekannt, die bei der Kontrolle eine Rolle spielen. Diese gehören größtenteils zur Gruppe der hnRNP-Proteine (heterologous nuclear RNP proteins), die im Kern mit primären Transkripten assoziieren und an der Bildung von RNP-Komplexen (Ribo- nukleoprotein-Partikel) beteiligt sind, oder zur Gruppe der SR-Proteine, die bei Überexpres- sion das Spleißmuster verändern können (Smith & Valcarcel 2000). Es ist unbekannt, durch welche Signaltransduktionsereignisse Spleißereignisse beeinflusst werden.

4.3 Transkriptionsmuster von BAT2 und BAT3

Das BAT2-Transkript wird ubiquitär exprimiert; wie unsere Ergebnisse des MTE-Blots zeigen, ist die ursprünglich von Banerji et al. für BAT2 und BAT3 postulierte Beschränkung auf Zellen leukämischen Ursprungs nicht gegeben. Diese Ergebnisse werden auch durch eine Auswertung der EST-Datenbanken bestätigt. Eine Vielzahl adulter und fötaler normaler humaner Gewebe und Tumorgewebe werden als Quelle von BAT2-cDNA-Klonen verzeichnet, darunter sind Hirn, Niere, Leber und Testis. Abgesehen von der ubiquitären Expression zeigt der MTE-Blot, dass das BAT2-Gen speziell in Testis sehr stark transkribiert wird. BAT2 ist kein seltenes Transkript; eine Auswertung von EST-Daten mittels der Genecard- Datenbank (Rebhan et al. 1997) ergibt eine Transkripthäufigkeit von durchschnittlich 1 x 10-4. Eine Ausnahme ist eine cDNA-Minibibliothek aus menschlichem Knochenmark, in der das BAT2-Transkript 1,08 % aller Transkripte ausmacht (Bibliothek MT0179 (dbEST Library ID.8051)). Mit 677 analysierten Klonen ergibt diese Minibibliothek aber wahrscheinlich kein repräsentatives Bild. Das BAT3-Transkript wird ebenfalls ubiquitär exprimiert; in der EST-Datenbank finden sich BAT3-Klone aus zahlreichen normalen Geweben und Tumoren. Laut Genecard ist das BAT3- Transkript mit einer Frequenz von etwas unter 1 x 10-4 ähnlich häufig wie BAT2. In einer Minibibliothek aus Hals und Kopf (Bibliothek HT0198 (dbEST Library ID.3317)) ist BAT3 mit 1,08 % stark vertreten. Die Bibliothek umfasst allerdings nur 277 sequenzierte Klone, so Diskussion 109 dass die statistische Signifikanz gering ist. Das Rattenortholog von BAT3 ist ebenfalls ubiqui- tär exprimiert und zwar besonders stark in Testis (Wang & Liew 1994, Ozaki et al. 1999). Da sich die Expressionsmuster von BAT2 und BAT3 ähneln, wurde die Expression in Testis mittels in-situ-Hybridisierung genauer untersucht. Die Untersuchung von Gewebe aus Ratte und Java-Affe zeigt, dass das BAT2-Gen in einem zeitlich eng umgrenzten Zeitraum der Spermatogenese transkribiert wird. BAT3 wird demgegenüber später in der Spermienent- wicklung transkribiert. In reifen Spermien sind beide Transkripte anscheinend nicht vorhanden. Von der Gegenwart des Transkripts kann nicht direkt auf die Menge des Translationspro- dukts geschlossen werden; es ist möglich, dass das BAT2- und BAT3-Protein während der Spermatogenese gleichzeitig in den Spermatozyten exprimiert sind. Das beschriebene Transkriptionsmuster ähnelt dem Transkriptionsmuster des humanen mutS-Homologs MSH5. Wie die BAT2- und BAT3-Gene ist das MHC-kodierte MSH5 in verschiedenen Geweben exprimiert und in Hoden stark exprimiert. Die Expression ist ebenfalls zeitlich streng reguliert, und MSH5 kann nur in Spermatozyten, aber nicht mehr in reifen Spermien nachgewiesen werden. MSH5 spielt eine Rolle bei der Meiose (Bocker et al. 1999). Während der Embryonalentwicklung kann BAT2 ebenfalls zeitlich begrenzt in Somiten nachgewiesen werden. Die zeitlich kontrollierte, starke Expression von BAT2 und BAT3 während der Spermatoge- nese und Embryonalentwicklung lässt einen Zusammenhang mit Prozessen der Zellteilung oder Differenzierung vermuten.

4.4 Das BAT2-Polypeptid

Das BAT2-Protein ist ein großes, prolinreiches Polypeptid ohne Verwandtschaft zu anderen bekannten Proteinsequenzen. Über den Expressionsstatus der paralogen Kopien ist nichts bekannt. Strukturvorhersagen liefern keine Vorhersagen der Domänenstruktur, da aufgrund des Prolinreichtums für den Großteil des Proteins eine Schleifen-Sekundärstruktur (Loop) vorhergesagt wird. Die Relevanz der repetitiven Sequenzen in BAT2 ist unklar, da die Homologie untereinander relativ gering ist. Bis auf eine Ausnahme stimmen die Repeats nicht mit Exongrenzen überein, so dass nicht davon auszugehen ist, dass es sich um konservierte Domänen handelt, die durch Duplikation von Exons entstanden sind. RGD-Motive sind durch ihre Rolle bei Zell-Zell-Kontakten zwischen Integrinen und extra- zellulären Proteinen bekanntgeworden. Die alleinige Anwesenheit von RGD-Motiven reicht Diskussion 110 allerdings nicht aus, um eine entsprechende Funktion nahezulegen, da weitere strukturelle Kriterien erfüllt sein müssen, um ein funktionales Motiv zu erhalten (Torshin 2002). Eventu- ell spielt das RGD-Motiv auch eine allgemeine Rolle bei Protein-Protein-Wechselwirkungen: zahlreiche intrazelluläre Proteine besitzen potentiell funktionale RGD-Motive (Torshin 2002).

Die Volllängen-cDNA von BAT2 wurde mit C-terminalen Antikörperepitopen versehen. Ein Nachweis dieser Konstrukte mit gegen diese Epitope gerichteten Antikörpern war nicht mög- lich. N-terminale Epitope ermöglichten den Nachweis des Polypeptids im Western Blot, allerdings nicht unter den nichtdenaturierenden Bedingungen der Immunpräzipitation. Der Schluss liegt nahe, dass die N- und C-Termini des BAT2-Proteins im Inneren des Proteins unzugäng- lich sind und nur nach Denaturation des Proteins für Antikörper zugänglich sind. Die Antiseren, die durch Immunisierung mit GST-BAT2-Fusionsproteinen hergestellt und aufgereinigt wurden, konnten das native Protein nicht detektieren; lediglich in-vitro-Translati- onsprodukte und überexprimierte, als Fusion mit der invarianten Kette exprimierte Fragmente konnten im Western Blot nachgewiesen werden. Eventuell waren die zur Immunisierung verwendeten Fusionsproteinpräparationen zu stark degradiert oder die Affinität der gewonnenen Antikörper war zu gering, um das intakte BAT2-Protein aus transfizierten Zellen nachzuweisen. Ein weiterer Grund liegt vermutlich in der hohen Empfindlichkeit des BAT2-Poypeptids gegenüber endogenen Proteasen. In Western Blot-Experimenten konnte BAT2 besser nachgewiesen werden, wenn eine proprietäre Proteaseinhibitormischung (Roche) anstatt der in der vorliegenden Arbeit verwendeten Mischung aus Aprotinin und PMSF verwendet wurde (A. König und A. Hentsch, pers. comm.). In der Immunfluoreszenz konnte BAT2 in einer diffusen Färbung am und in der Nähe des Kerns nachgewiesen werden. In Ermangelung von Daten eines konfokalen Mikroskops kann noch keine abschließende Aussage getroffen werden, ob BAT2 im Kern oder nur in Kernnähe lokalisiert ist. Die Ergebnisse der Zellfraktionierung legen den Schluss nahe, das BAT2 teilweise im Kern und teilweise im Zytoplasma vorhanden ist. Ein mechanischer Zellaufschluss mit anschließender differentieller Zentrifugation erzeugt keine absolut reinen subzellulären Fraktionen, so dass eine absolut zuverlässige Aussage noch nicht möglich ist.

4.5 Das BAT3-Polypeptid

Das BAT3-Protein zeigt aufgrund seines Prolinreichtums gewisse Ähnlichkeiten zum BAT2- Protein. Wie BAT2 besitzt BAT3 ein repetitives Sequenzmotiv, dessen Bedeutung unklar ist. Diskussion 111

BAT3 besitzt eine N-terminale Ubiquitin-ähnliche Domäne und eine C-terminale BAG-Do- mäne (Thress et al. 2001) und wird daher auch als BAG-6 bezeichnet. Der vorliegende cDNA-Klon ist eine Transkriptvariante, die kein Exon 24 besitzt und somit nur einen Teil der BAG-Domäne kodiert. BAG-Domänen bestehen aus drei Alpha-Helizes; die Interaktion mit Hsp-70-Proteinen findet über D2 und D3 statt (Sondermann et al. 2001). BAT3 aus Xenopus interagiert mit Hsp-70-Proteinen, obwohl nicht alle der für die Interaktion erforderlichen Aminosäurereste konserviert sind. Das klonierte BAT3 besitzt nur die D3-He- lix; D1 und D2 fehlen. Die Funktion der BAG-Domäne ist daher vermutlich teilweise einge- schränkt. Es ist aber anzunehmen, dass dieser Spleißvariante eine spezifische Rolle zukommt, da auch in der Ratte diese Spleißvariante existiert (Ozaki et al. 1999). Die Funktion des zusätzlichen Exons 11B ist unklar und kann nur durch weitere Vergleichs- experimente mit cDNA-Konstrukten ohne Exon 11B ermittelt werden. BAT3 lässt sich über C-terminale Antikörperepitope im Western Blot und in der Immun- präzipitation nachweisen. BAT3 ist ein nukleäres Protein, das ausschließlich im Zellkern vorkommt und in der Immunfluoreszenz nicht in den Nukleoli nachgewiesen werden kann. Die Ergebnisse der subzellulären Fraktionierung bestätigen die Ergebnisse der Immunfluores- zenz. Eine andere Studie hat gezeigt, dass Mutationen in der Kernlokalisierungssequenz zu einer zytoplasmatischen BAT3-Form führen (Manchen & Hubberstey 2001). Die bekannten Spleißvarianten und auch die mittels Datenbankrecherche ermittelten putativen Varianten berühren nicht das Kernlokalisierungssignal, so dass im Gegensatz zu BAG-1 (Packham et al. 1997) keine zytoplasmatischen Varianten von BAT3 zu erwarten sind.

4.6 Assoziation von BAT3 mit Smac

BAT3 aus Xenopus kann in vitro das Drosophila-Protein Reaper binden (Thress et al. 1998). Reaper ist ein IAP-bindendes Protein und kann auch in Säugerzellen Apoptose auslösen. Smac ist das erste bekannte IAP-bindende Protein aus Säugerzellen und besitzt am prozessierten N-Terminus eine Sequenzhomologie von mehreren Aminosäureresten mit Reaper. Daher wurden die Bindungseigenschaften von Smac mit BAT3 überprüft. In Koisolationsexperimenten aus transfizierten Zellen konnte keine Assoziation der beiden Proteine nachgewiesen werden. Für die Interaktion von BAT3 mit Smac oder mit dem Dro- sophila-Protein Reaper sind keinerlei Modelle verfügbar. Möglicherweise erfordert die Bin- dung von Smac an BAT3 eine komplette BAG-Domäne, die in dem hier verwendeten BAT3 (ohne Exon 24) nicht vorhanden ist. Diskussion 112

4.7 Einfluss von BAT3 und BAT2 auf die CHIP-vermittelte Degrada- tion des Glukokortikoidrezeptors

BAG-1 kann direkt mit dem Proteasom und mit Hsp-70 interagieren (Lüders et al. 2000). Als Kopplungsfaktor kann BAG-1 dann in Zusammenarbeit mit der Ubiquitinligase CHIP die proteasomale Degradation chaperongebundener Substrate fördern (Demand et al. 2001). BAT3 besitzt wie BAG-1 eine Ubiquitin-ähnliche Domäne und eine BAG-Domäne; in einem Experiment wurde daher untersucht, ob BAT3 eine ähnliche Funktion wie BAG-1 ausüben kann, und ob BAT2 einen Einfluß auf diesen Prozess nimmt. In der Gegenwart von CHIP führt die Transfektion von BAT3, BAT2 (bzw. BAT2 und BAT3) dazu, dass die Menge des Chaperonsubstrats GR deutlich reduziert wird gegenüber Zellen, die nur CHIP exprimieren. In der Abwesenheit von CHIP weisen Zellen, die mit BAT2, BAT3 und GR transfiziert wurden, deutlich höhere Mengen an GR auf. BAT2 und BAT3 scheinen also einen Einfluss auf die Degradation von GR zu haben. Die konstante Expression der verschiedenen Konstrukte war problematisch; die CHIP-Men- gen sind im gezeigten Experiment nicht vollständig konstant, so dass weitere Studien erforderlich sind, um eine definitive Aussage zu treffen. Um die Beteiligung von proteasomalen Prozessen zu zeigen, müssen weitere Kontrollexperimente in Gegenwart eines Proteaso- meninhibitors durchgeführt werden. Es stellt sich die interessante Frage, wie sich verschiedene BAT3-Konstrukte in ihrer Wirkung auf den GR-Abbau unterscheiden.Im vorliegenden Experiment wurde der BAT3-Klon ohne Exon 24 und mit Exon 11B verwendet, der nur einen Teil der BAG-Domäne enthält. Da Exon 24 solche Aminosäurereste kodiert, die in anderen BAG-Domänen für die Interaktion mit Hsp-70 erforderlich sind, ist zu erwarten, dass cDNA-Konstrukte mit Exon 24 ein anderes Verhalten in Degradationsversuchen zeigen. Literaturverzeichnis 113

5 Zusammenfassung Die MHC Klasse III-Region ist ein Bereich hoher Gendichte und enthält eine Vielzahl noch uncharakterisierter Gene. Am telomeren Ende der Klasse III-Region bilden BAT2 und BAT3 ein benachbartes Genpaar, dessen Transkripte für zwei prolinreiche Polypeptide kodieren. Die vorliegende Arbeit charakterisiert beide Gene auf molekularbiologischer und die Genpro- dukte auf proteinbiochemischer Ebene. Das BAT2-Gen ist 19 kb groß und besteht aus 31 Exons, der Translationsstart liegt in Exon 2. Der Transkriptionsstart wurde mittels RACE definiert, eine komplette cDNA kloniert und exprimiert. Für BAT3 wurde ebenfalls eine cDNA kloniert und exprimiert. BAT2 und BAT3 sind beide ubiquitär exprimiert; besonders hoch ist die Expression in Testis. Beide Gene werden während der Spermatogenese zu einem bestimmten Entwicklungszeit- punkt transkribiert. Für BAT2 und BAT3 wurden im 5’-untranslatierten Bereich neue, alternativ gespleißte Sequenzen definiert. BAT2 verfügt über zwei alternative Startpunkte für Exon 2, während BAT3 zwei alternative Endpunkte für Exon 1 besitzt. Eine Rolle dieser alternativ gespleißten Sequenzen bei der Regulation der Proteinexpression ist denkbar. Für BAT3 werden weitere alternative Spleißereignisse beschrieben; die vorliegende Arbeit charakterisiert eine neue Transkriptvariante aus Raji-Zellen, in der das Exon 24 fehlt und die ein neues Exon 11B ent- hält. Durch Datenbankanalysen konnten vier weitere potentielle Spleißereignisse im kodierenden Bereich von BAT3 identifiziert werden. BAT2 ist ein Protein von 230 kDa Größe, das im Zellkern oder in seiner Nähe exprimiert wird. BAT3 ist ein kernlokalisiertes Protein von 130 kDa Größe; am aminoterminalen Ende besitzt es eine Ubiquitin-ähnliche Domäne und am carboxyterminalen Ende eine BAG-Do- mäne. BAT3 gehört damit zur Familie der BAG-Proteine, die unter anderem die Aktivität von Hsp70-Proteinen modulieren, mit dem Proteasom interagieren und bei der Regulation der Apoptose eine Rolle spielen können. Zahlreiche Interaktionen von Proteinen der BAG-Fami- lie werden über die BAG-Domäne vermittelt, die in der hier charakterisierten Spleißvariante ohne Exon 24 nur teilweise enthalten ist. Erste Hinweise auf eine Rolle von BAT2 und BAT3 bei der Kontrolle der proteasomalen Proteindegradation liegen vor. BAT3 aus Xenopus interagiert mit dem IAP-bindenden Protein Reaper aus Drosophila und spielt bei Reaper-induzierter Apoptose eine Rolle. In Säugetieren ist das mitochondriale Pro- tein Smac als potentielles Reaper-Analog vorgeschlagen worden. Die hier untersuchte Spleißvariante von BAT3 assoziiert jedoch nicht mit dem IAP-bindenden Protein Smac. Es ist nicht auszuschließen, dass eine BAT3-Variante mit einer kompletten BAG-Domäne (also mit Exon 24) mit Smac interagieren könnte. Funktionelle Vergleiche der hier beschriebenen Spleißvariante von BAT3 mit anderen Varianten eröffnen eine Perspektive für neue Studien. Literaturverzeichnis 114

6 Literaturverzeichnis

Abi-Rached, L., Gilles, A., Shiina, T., Pontarotti, P. & Inoko, H. (2002): Evidence of en bloc duplication in vertebrate genomes. Nat. Genet. 31, 100-105.

Adrain, C., Creagh, E.M. & Martin, S.J. (2001): Apoptosis-associated release of Smac/DIABLO from mitochondria requires active caspases and is blocked by Bcl-2. EMBO J. 20, 6627-6636.

Aguado, B. & Campbell, R.D. (1995): The novel gene G17, located in the human major histocompatibility complex, encodes PBX2, a homeodomain-containing protein. Genomics 25, 650-659.

Aguado, B. & Campbell, R.D. (1998): Characterization of a human lysophosphatidic acid acyltransferase that is encoded by a gene located in the class III region of the human major histocompatibility complex. J Biol. Chem. 273, 4096-4105.

Aguado, B. & Campbell, R.D. (1999): Characterization of a human MHC class III region gene product with S- thioesterase activity. Biochem. J 341, 679-689.

Ahn, J., Won, T.W., Zia, A., Reutter, H., Kaplan, D.E., Sparks, R. & Gruen, J.R. (2001): Peaks of linkage are localized by a BAC/PAC contig of the 6p reading disability locus. Genomics 78, 19-29.

Albertella, M.R. & Campbell, R.D. (1994): Characterization of a novel gene in the human major histocompatibility complex that encodes a potential new member of the I kappa B family of proteins. Hum. Mol. Genet. 3, 793-799.

Albertella, M.R., Jones, H., Thomson, W., Olavesen, M.G. & Campbell, R.D. (1996): Localization of eight additional genes in the human major histocompatibility complex, including the gene encoding the casein kinase II beta subunit (CSNK2B). Genomics 36, 240-251.

Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J. (1997): Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25, 3389- 3402.

Amersham Biosciences. The GST Gene Fusion System Handbook. (2001).

Andree, B., Duprez, D., Vorbusch, B., Arnold, H.H. & Brand, T. (1998): BMP-2 induces ectopic expression of cardiac lineage markers and interferes with somite formation in chicken embryos. Mech. Dev. 70, 119-131.

Arnt, C.R., Chiorean, M.V., Heldebrant, M.P., Gores, G.J. & Kaufmann, S.H. (2002): Synthetic Smac/DIABLO peptides enhance the effects of chemotherapeutic agents by binding XIAP and cIAPI in situ. J. Biol. Chem. 277, 23644-43.

Arora, S. & Chauhan, S.S. (2002): Identification and characterization of a novel human cathepsin L splice variant. Gene 293, 123-131. Literaturverzeichnis 115

Banerji, J., Sands, J., Strominger, J.L. & Spies, T. (1990): A gene pair from the human major histocompatibility complex encodes large proline-rich proteins with multiple repeated motifs and a single ubiquitin-like domain. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 87, 2374-2378.

Beck, S. & Trowsdale, J. (2000): The human major histocompatability complex: lessons from the DNA sequence. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 1:117-37., 117-137.

Beg, A.A. & Baldwin, A.S., Jr. (1993): The I kappa B proteins: multifunctional regulators of Rel/NF-kappa B transcription factors. Genes Dev. 7, 2064-2070.

Bennett, M., D'Orazio, T., Kumar, V., Stenoien, D., Blomer, K.C. & Lindahl, K.F. (1995): Bone marrow cell transplants involving donors and hosts with haplotypes derived from spretus mice. Transplantation 59, 1452- 1459.

Bird, A.P. (1986): CpG-rich islands and the function of DNA methylation. Nature 321, 209-213.

Black, D.L. (2000): Protein diversity from alternative splicing: a challenge for bioinformatics and post-genome biology. Cell 103, 367-370.

Bober, E., Franz, T., Arnold, H.H., Gruss, P. & Tremblay, P. (1994): Pax-3 is required for the development of limb muscles: a possible role for the migration of dermomyotomal muscle progenitor cells. Development 120, 603-612.

Bocker, T., Barusevicius, A., Snowden, T., Rasio, D., Guerrette, S., Robbins, D., Schmidt, C., Burczak, J., Croce, C.M., Copeland, T., Kovatich, A.J. & Fishel, R. (1999): hMSH5: A Human MutS Homologue That Forms a Novel Heterodimer with hMSH4 and Is Expressed during Spermatogenesis. Cancer Res 59, 816.

Bodmer, J.G., Marsh, S.G.E., Albert, E.D., Bodmer, W.F. & Bontrop, R.E. (1999): Nomenclature for factors of the HLA system. Eur. J. Immunogenet. 26, 81-116.

Boeckmann, B., Bairoch, A., Apweiler, R., Blatter, M.C., Estreicher, A., Gasteiger, E., Martin, M.J., Michoud, K., O'Donovan, C., Phan, I., Pilbout, S. & Schneider, M. (2003): The SWISS-PROT protein knowledgebase and its supplement TrEMBL in 2003. Nucleic Acids Res. 31, 365-370.

Boguski, M.S., Lowe, T.M. & Tolstoshev, C.M. (1993): dbEST--database for "expressed sequence tags". Nat. Genet. 4, 332-333.

Bonner, W.M. & Laskey, R.A. (1974): A film detection method for tritium-labelled proteins and nucleic acids in polyacrylamide gels. Eur. J. Biochem. 46, 83-88.

Bonten, E., van der, S.A., Fornerod, M., Grosveld, G. & d'Azzo, A. (1996): Characterization of human lysosomal neuraminidase defines the molecular basis of the metabolic storage disorder sialidosis. Genes Dev. 10, 3156-3169. Literaturverzeichnis 116

Braud, V.M., Allan, D.S., O'Callaghan, C.A., Soderstrom, K., D'Andrea, A., Ogg, G.S., Lazetic, S., Young, N.T., Bell, J.I., Phillips, J.H., Lanier, L.L. & McMichael, A.J. (1998): HLA-E binds to natural killer cell receptors CD94/NKG2A, B and C. Nature 391, 795-799.

Brett, D., Pospisil, H., Valcarcel, J., Reich, J. & Bork, P. (2002): Alternative splicing and genome complexity. Nat. Genet. 30, 29-30.

Brett, D., Hanke, J., Lehmann, G., Haase, S., Delbruck, S., Krueger, S., Reich, J. & Bork, P. (2000): EST comparison indicates 38% of human mRNAs contain possible alternative splice forms. FEBS Letters 474, 83-86.

Briknarova, K., Takayama, S., Brive, L., Havert, M.L., Knee, D.A., Velasco, J., Homma, S., Cabezas, E., Stuart, J., Hoyt, D.W., Satterthwait, A.C., Llinas, M., Reed, J.C. & Ely, K.R. (2001): Structural analysis of BAG1 cochaperone and its interactions with Hsc70 heat shock protein. Nat. Struct. Biol. 8, 349-352.

Briknarova, K., Takayama, S., Homma, S., Baker, K., Cabezas, E., Hoyt, D.W., Li, Z., Satterthwait, A.C. & Ely, K.R. (2002): BAG4/SODD protein contains a short BAG domain. J Biol. Chem. 277, 31172-31178.

Brocke, P., Garbi, N., Momburg, F. & Hammerling, G.J. (2002): HLA-DM, HLA-DO and tapasin: functional similarities and differences. Curr. Opin. Immunol 14, 22-29.

Brown, M.A., Pile, K.D., Kennedy, L.G., Campbell, D., Andrew, L., March, R., Shatford, J.L., Weeks, D.E., Calin, A. & Wordsworth, B.P. (1998): A genome-wide screen for susceptibility loci in ankylosing spondylitis. Arthritis Rheum. 41, 588-595.

Brown, S.E., Campbell, R.D. & Sanderson, C.M. (2001): Novel NG36/G9a gene products encoded within the human and mouse MHC class III regions. Mamm. Genome 12, 916-924.

Brown, W.R. & Bird, A.P. (1986): Long-range restriction site mapping of mammalian genomic DNA. Nature 322, 477-481.

Cain, K., Bratton, S.B. & Cohen, G.M. (2002): The Apaf-1 apoptosome: a large caspase-activating complex. Biochimie 84, 203-214.

Campbell, R.D., Dunham, I., Kendall, E. & Sargent, C.A. (1990): Polymorphism of the human complement component C4. Exp. Clin. Immunogenet. 7, 69-84.

Carrillo, M.B., Milner, C.M., Ball, S.T., Snoek, M. & Campbell, R.D. (1997): Cloning and characterization of a sialidase from the murine histocompatibility-2 complex: low levels of mRNA and a single amino acid mutation are responsible for reduced sialidase activity in mice carrying the Neu1a allele. Glycobiology 7, 975-986.

Carson, J.P., Behnam, M., Sutton, J.N., Du, C., Wang, X., Hunt, D.F., Weber, M.J. & Kulik, G. (2002): Smac is required for cytochrome c-induced apoptosis in prostate cancer LNCaP cells. Cancer Res. 62, 18-23.

Chai, J., Du, C., Wu, J.W., Kyin, S., Wang, X. & Shi, Y. (2000): Structural and biochemical basis of apoptotic activation by Smac/DIABLO. Nature 406, 855-862. Literaturverzeichnis 117

Chai, J., Shiozaki, E., Srinivasula, S.M., Wu, Q., Datta, P., Alnemri, E.S., Shi, Y. & Dataa, P. (2001): Structural basis of caspase-7 inhibition by XIAP. Cell 104, 769-780.

Chandra, D., Liu, J.W. & Tang, D.G. (2002): Early mitochondrial activation and cytochrome c upregulation during apoptosis. J. Biol. Chem. 277, 50842-54.

Chauhan, D., Hideshima, T., Rosen, S., Reed, J.C., Kharbanda, S. & Anderson, K.C. (2001): Apaf-1/cytochrome c-independent and Smac-dependent induction of apoptosis in multiple myeloma (MM) cells. J. Biol. Chem. 276, 24453-24456.

Chen, J., Xiong, J., Liu, H., Chernenko, G. & Tang, S.C. (2002): Distinct BAG-1 isoforms have different anti- apoptotic functions in BAG-1-transfected C33A human cervical carcinoma cell line. Oncogene 21, 7050-7059.

Chomczynski, P. (1992): One-hour downward alkaline capillary transfer for blotting of DNA and RNA. Analytical Biochemistry 201, 134-139.

Christich, A., Kauppila, S., Chen, P., Sogame, N., Ho, S.I. & Abrams, J.M. (2002): The damage-responsive Drosophila gene sickle encodes a novel IAP binding protein similar to but distinct from reaper, grim, and hid. Curr. Biol. 12, 137-140.

Claveria, C., Albar, J.P., Serrano, A., Buesa, J.M., Barbero, J.L., Martinez, A. & Torres, M. (1998): Drosophila grim induces apoptosis in mammalian cells. EMBO J 17, 7199-7208.

Claveria, C., Caminero, E., Martinez, A., Campuzano, S. & Torres, M. (2002): GH3, a novel proapoptotic domain in Drosophila Grim, promotes a mitochondrial death pathway. EMBO J 21, 3327-3336.

Cokol, M., Nair, R. & Rost, B. (2000): Finding nuclear localization signals. EMBO Rep. 1, 411-415.

Creagh, E.M. & Martin, S.J. (2001): Caspases: cellular demolition experts. Biochem. Soc. Trans. 29 , 696-702.

Cross, S.J. & Thomson, W. (1990): DNA polymorphism of the C2 and factor B gene. Exp. Clin. Immunogenet. 7, 53-63.

Cross, S.J., Tonks, S., Trowsdale, J. & Campbell, R.D. (1991): Novel detection of restriction fragment length polymorphisms in the human major histocompatibility complex. Immunogenetics 34, 376-384.

Culligan, K.M., Meyer-Gauen, G., Lyons-Weiler, J. & Hays, J.B. (2000): Evolutionary origin, diversification and specialization of eukaryotic MutS homolog mismatch repair proteins. Nucleic Acids Res 28, 463-471.

Cuvillier, O. & Levade, T. (2001): Sphingosine 1-phosphate antagonizes apoptosis of human leukemia cells by inhibiting release of cytochrome c and Smac/DIABLO from mitochondria. Blood 98, 2828-2836.

D'Alfonso, S., Borelli, I., Dall'Omo, A., Bolognesi, E., Partanen, J., Levo, A., Pociot, F., Fan, L., Juji, T., Hammond, M., Tosi, R. & Richiardi, P.M. (1998): The natural history of an HLA haplotype and its recombinants. Immunogenetics 48, 8-15. Literaturverzeichnis 118

Dai, Y., Landowski, T.H., Rosen, S.T., Dent, P. & Grant, S. (2002): Combined treatment with the checkpoint abrogator UCN-01 and MEK1/2 inhibitors potently induces apoptosis in drug-sensitive and -resistan myeloma cells through an IL-6-independent mechanism. Blood 100, 3333-3343.

Dangel, A.W., Shen, L., Mendoza, A.R., Wu, L.C. & Yu, C.Y. (1995): Human helicase gene SKI2W in the HLA class III region exhibits striking structural similarities to the yeast antiviral gene SKI2 and to the human gene KIAA0052: emergence of a new gene family. Nucleic Acids Res 23, 2120-2126.

Dawkins, R., Leelayuwat, C., Gaudieri, S., Tay, G., Hui, J., Cattley, S., Martinez, P. & Kulski, J. (1999): Genomics of the major histocompatibility complex: haplotypes, duplication, retroviruses and disease. Immunol Rev. 167, 275-304. de Baey, A., Fellerhoff, B., Maier, S., Martinozzi, S., Weidle, U. & Weiss, E.H. (1997): Complex expression pattern of the TNF region gene LST1 through differential regulation, initiation, and alternative splicing. Genomics 45, 591-600. de Vet, E.C., Aguado, B. & Campbell, R.D. (2001): G6b, a novel immunoglobulin superfamily member encoded in the human major histocompatibility complex, interacts with SHP-1 and SHP-2. J. Biol. Chem. 276, 42070- 42076.

Degli-Esposti, M.A., Abraham, L.J., McCann, V., Spies, T., Christiansen, F.T. & Dawkins, R.L. (1992): Ancestral haplotypes reveal the role of the central MHC in the immunogenetics of IDDM. Immunogenetics 36, 345-356.

Demand, J., Alberti, S., Patterson, C. & Hohfeld, J. (2001): Cooperation of a ubiquitin domain protein and an E3 ubiquitin ligase during chaperone/proteasome coupling. Curr. Biol. 11, 1569-1577.

Deng, Y., Lin, Y. & Wu, X. (2002): TRAIL-induced apoptosis requires Bax-dependent mitochondrial release of Smac/DIABLO. Genes Dev. 16, 33-45.

Denzin, L.K. & Cresswell, P. (1995): HLA-DM induces CLIP dissociation from MHC class II alpha beta dimers and facilitates peptide loading. Cell 82, 155-165.

Deshmukh, M., Du, C., Wang, X. & Johnson, E.M., Jr. (2002): Exogenous smac induces competence and permits caspase activation in sympathetic neurons. J. Neurosci. 22, 8018-8027.

Doong, H., Vrailas, A. & Kohn, E.C. (2002): What's in the 'BAG'?--A functional domain analysis of the BAG- family proteins. Cancer Lett. 188, 25-32.

Dower, W.J., Miller, J.F. & Ragsdale, C.W. (1988): High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Res. 16, 6127-6145.

Du, C., Fang, M., Li, Y., Li, L. & Wang, X. (2000): Smac, a mitochondrial protein that promotes cytochrome c- dependent caspase activation by eliminating IAP inhibition. Cell 102, 33-42. Literaturverzeichnis 119

Ducoroy, P., Micheau, O., Perruche, S., Dubrez-Daloz, L., De Fornel, D., Dutartre, P., Saas, P. & Solary, E. (2003): LF 15-0195 immunosuppressive agent enhances activation-induced T-cell death by facilitating caspase-8 and caspase-10 activation at the DISC level. Blood 101, 194-201.

Dunham, I., Sargent, C.A., Kendall, E. & Campbell, R.D. (1990): Characterization of the class III region in different MHC haplotypes by pulsed-field gel electrophoresis. Immunogenetics 32, 175-182.

Ekert, P.G. & Silke, J. (2001): Till death do us part. Cell Death. Differ. 8, 662-664.

Ekert, P.G., Silke, J., Hawkins, C.J., Verhagen, A.M. & Vaux, D.L. (2001): DIABLO promotes apoptosis by removing MIHA/XIAP from processed caspase 9. J. Cell Biol. 152, 483-490.

Ferri, K.F. & Kroemer, G. (2001): Mitochondria-the suicide organelles. Bioessays 23, 111-115.

Flajnik, M.F. & Kasahara, M. (2001): Comparative genomics of the MHC: glimpses into the evolution of the adaptive immune system. Immunity. 15, 351-362.

Fortini, M.E. & Artavanis-Tsakonas, S. (1993): Notch: neurogenesis is only part of the picture. Cell 75, 1245- 1247.

Freisewinkel, I. Die Assoziation der MHC Klasse II Moleküle mit der Invarianten Kette. 1995. Universität Bonn, Dissertation.

Froesch, B.A., Takayama, S. & Reed, J.C. (1998): BAG-1L protein enhances androgen receptor function. J Biol. Chem. 273, 11660-11666.

Fugger, L., Morling, N., Ryder, L.P., Jakobsen, B.K., Svejgaard, A., Spies, T. & Strominger, J.L. (1990): Restriction fragment length polymorphism (RFLP) of two HLA-B-associated transcripts (BATs) genes in healthy Danes. Tissue Antigens 36, 57-61.

Fugger, L., Morling, N., Ryder, L.P., Jakobsen, B.K., Andersen, V., Oxholm, P., Dalhoff, K., Heilmann, C., Karup, P.F., Friis, J. & . (1991): Restriction fragment length polymorphism of two HLA-B-associated transcripts genes in five autoimmune diseases. Hum. Immunol. 30, 27-31.

Fulda, S., Wick, W., Weller, M. & Debatin, K.M. (2002): Smac agonists sensitize for Apo2L/TRAIL- or anticancer drug-induced apoptosis and induce regression of malignant glioma in vivo. Nat. Med. 8, 808-815.

Fulda, S., Meyer, E. & Debatin, K.M. (2002): Inhibition of TRAIL-induced apoptosis by Bcl-2 overexpression. Oncogene 21, 2283-2294.

Gallagher, G., Eskdale, J. & Miller, S. (1997): A highly polymorphic microsatellite marker in the human MHC class III region, close to the BAT2 gene. Immunogenetics 46, 357-358.

Gardiner-Garden, M. & Frommer, M. (1987): CpG islands in vertebrate genomes. J Mol. Biol. 196, 261-282. Literaturverzeichnis 120

Gasser, D.L., Sternberg, N.L., Pierce, J.C., Goldner-Sauve, A., Feng, H., Haq, A.K., Spies, T., Hunt, C., Buetow, K.H. & Chaplin, D.D. (1994): P1 and cosmid clones define the organization of 280 kb of the mouse H-2 complex containing the Cps-1 and Hsp70 loci. Immunogenetics 39, 48-55.

Gaudieri, S., Giles, K.M., Kulski, J.K. & Dawkins, R.L. (1997): Duplication and polymorphism in the MHC: Alu generated diversity and polymorphism within the PERB11 gene family. Hereditas 127, 37-46.

Gaudieri, S., Kulski, J.K., Dawkins, R.L. & Gojobori, T. (1999): Extensive nucleotide variability within a 370 kb sequence from the central region of the major histocompatibility complex. Gene 238, 157-161.

Gomez-Escobar, N., Chou, C.F., Lin, W.W., Hsieh, S.L. & Campbell, R.D. (1998): The G11 gene located in the major histocompatibility complex encodes a novel nuclear serine/threonine protein kinase. J. Biol. Chem. 273, 30954-30960.

Goyal, L., McCall, K., Agapite, J., Hartwieg, E. & Steller, H. (2000): Induction of apoptosis by Drosophila reaper, hid and grim through inhibition of IAP function. EMBO J. 19, 589.

Graveley, B.R. (2001): Alternative splicing: increasing diversity in the proteomic world. Trends Genet. 17, 100- 107.

Groh, V., Rhinehart, R., Randolph-Habecker, J., Topp, M.S., Riddell, S.R. & Spies, T. (2001): Costimulation of CD8alphabeta T cells by NKG2D via engagement by MIC induced on virus-infected cells. Nat. Immunol 2, 255- 260.

Gruen, J.R. & Weissman, S.M. (1997): Evolving views of the major histocompatibility complex. Blood 90, 4252-4265.

Gruss, H.J. & Dower, S.K. (1995): Tumor necrosis factor ligand superfamily: involvement in the pathology of malignant lymphomas. Blood 85, 3378-3404.

Guillaudeux, T., Janer, M., Wong, G.K.-S., Spies, T. & Geraghty, D.E. (1998): The complete genomic sequence of 424,015 bp at the centromeric end of the HLA class I region: Gene content and polymorphism. PNAS 95, 9494.

Guo, F., Nimmanapalli, R., Paranawithana, S., Wittman, S., Griffin, D., Bali, P., O'Bryan, E., Fumero, C., Wang, H.G. & Bhalla, K. (2002): Ectopic overexpression of second mitochondria-derived activator of caspases (Smac/DIABLO) or cotreatment with N-terminus of Smac/DIABLO peptide potentiates epothilone B derivative- (BMS 247550) and Apo-2L/TRAIL-induced apoptosis. Blood 99, 3419-3426.

Guo, Y., Srinivasula, S.M., Druilhe, A., Fernandes-Alnemri, T. & Alnemri, E.S. (2002): Caspase-2 induces apoptosis by releasing proapoptotic proteins from mitochondria. J. Biol. Chem. 277, 13430-13437.

Haining, W.N., Carboy-Newcomb, C., Wei, C.L. & Steller, H. (1999): The proapoptotic function of Drosophila Hid is conserved in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A 96, 4936-4941. Literaturverzeichnis 121

Harfouche, R., Hassessian, H.M., Guo, Y., Faivre, V., Srikant, C.B., Yancopoulos, G.D. & Hussain, S.N. (2002): Mechanisms which mediate the antiapoptotic effects of angiopoietin-1 on endothelial cells. Microvasc. Res. 64, 135-147.

Harlow, E. & Lane, D. Antibodies. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988.

Hashimoto, M., Nakamura, N., Obayashi, H., Kimura, F., Moriwaki, A., Hasegawa, G., Shigeta, H., Kitagawa, Y., Nakano, K., Kondo, M., Ohta, M. & Nishimura, M. (1999): Genetic contribution of the BAT2 gene microsatellite polymorphism to the age-at-onset of insulin-dependent diabetes mellitus. Hum. Genet. 105, 197- 199.

Hauptmann, G., Tappeiner, G. & Schifferli, J.A. (1988): Inherited deficiency of the fourth component of human complement. Immunodefic. Rev. 1, 3-22.

Hawkins, C.J., Silke, J., Verhagen, A.M., Foster, R., Ekert, P.G. & Ashley, D.M. (2001): Analysis of candidate antagonists of IAP-mediated caspase inhibition using yeast reconstituted with the mammalian Apaf-1-activated apoptosis mechanism. Apoptosis. 6, 331-338.

Hegde, R., Srinivasula, S.M., Zhang, Z., Wassell, R., Mukattash, R., Cilenti, L., DuBois, G., Lazebnik, Y., Zervos, A.S., Fernandes-Alnemri, T. & Alnemri, E.S. (2002): Identification of Omi/HtrA2 as a mitochondrial apoptotic serine protease that disrupts inhibitor of apoptosis protein-caspase interaction. J. Biol. Chem. 277, 432- 438.

Henry, H., Thomas, A., Shen, Y. & White, E. (2002): Regulation of the mitochondrial checkpoint in p53- mediated apoptosis confers resistance to cell death. Oncogene 21, 748-760.

Her, C. & Doggett, N.A. (1998): Cloning, Structural Characterization, and Chromosomal Localization of the Human Orthologue of Saccharomyces cerevisiae MSH5 Gene. Genomics 52, 50-61.

Higashi, Y., Yoshioka, H., Yamane, M., Gotoh, O. & Fujii-Kuriyama, Y. (1986): Complete nucleotide sequence of two steroid 21-hydroxylase genes tandemly arranged in human chromosome: a pseudogene and a genuine gene. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A 83, 2841-2845.

Hofman, K. & Stoffel, W. (1993): TMbase - A database of membrane spanning proteins segments. Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374, 166.

Holcik, M. (2002): Deletion of Smac/DIABLO has no effect on apoptosis in vivo. Trends Cell Biol. 12, 359.

Holley, C.L., Olson, M.R., Colon-Ramos, D.A. & Kornbluth, S. (2002): Reaper eliminates IAP proteins through stimulated IAP degradation and generalized translational inhibition. Nat. Cell Biol. 4, 439-444.

Holzinger, I., de Baey, A., Messer, G., Kick, G., Zwierzina, H. & Weiss, E.H. (1995): Cloning and genomic characterization of LST1: a new gene in the human TNF region. Immunogenetics 42, 315-322. Literaturverzeichnis 122

Hsieh, S.L. & Campbell, R.D. (1991): Evidence that gene G7a in the human major histocompatibility complex encodes valyl-tRNA synthetase. Biochem. J 278, 809-816.

Huang, Y., Park, Y.C., Rich, R.L., Segal, D., Myszka, D.G. & Wu, H. (2001): Structural basis of caspase inhibition by XIAP: differential roles of the linker versus the BIR domain. Cell 104, 781-790.

Huang, Y.H., Chen, Y.T., Lai, J.J., Yang, S.T. & Yang, U.C. (2002): PALS db: Putative Alternative Splicing database. Nucleic Acids Res. 30, 186-190.

Hubbard, T., Barker, D., Birney, E., Cameron, G., Chen, Y., Clark, L., Cox, T., Cuff, J., Curwen, V., Down, T., Durbin, R., Eyras, E., Gilbert, J., Hammond, M., Huminiecki, L., Kasprzyk, A., Lehvaslaiho, H., Lijnzaad, P., Melsopp, C., Mongin, E., Pettett, R., Pocock, M., Potter, S., Rust, A., Schmidt, E., Searle, S., Slater, G., Smith, J., Spooner, W., Stabenau, A., Stalker, J., Stupka, E., Ureta-Vidal, A., Vastrik, I. & Clamp, M. (2002): The Ensembl genome database project. Nucleic Acids Res. 30, 38-41.

Hubberstey, A., Yu, G., Loewith, R., Lakusta, C. & Young, D. (1996): Mammalian CAP interacts with CAP, CAP2, and actin. J. Cell Biochem. 61, 459-466.

Imai, Y., Ibata, I., Ito, D., Ohsawa, K. & Kohsaka, S. (1996): A novel gene iba1 in the major histocompatibility complex class III region encoding an EF hand protein expressed in a monocytic lineage. Biochem. Biophys. Res. Commun. 224, 855-862.

Iris, F.J., Bougueleret, L., Prieur, S., Caterina, D., Primas, G., Perrot, V., Jurka, J., Rodriguez-Tome, P., Claverie, J.M., Dausset, J. & . (1993): Dense Alu clustering and a potential new member of the NF kappa B family within a 90 kilobase HLA class III segment. Nat. Genet. 3, 137-145.

Jenkins, S.C., March, R.E., Campbell, R.D. & Milner, C.M. (2000): A novel variant of the MHC-linked hsp70, hsp70-hom, is associated with rheumatoid arthritis. Tissue Antigens 56, 38-44.

Kan, Z., States, D. & Gish, W. (2002): Selecting for functional alternative splices in ESTs. Genome Res. 12, 1837-1845.

Kang, I. & Inoye, M. (1993): One-step insertion of oligonucleotide linkers or adaptors to DNA using unphosphorylated oligonucleotides. Biotechniques 15, 659-667.

Kasahara, M., Hayashi, M., Tanaka, K., Inoko, H., Sugaya, K., Ikemura, T. & Ishibashi, T. (1996): Chromosomal localization of the proteasome Z subunit gene reveals an ancient chromosomal duplication involving the major histocompatibility complex. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 93, 9096-9101.

Kasahara, M. (1999): Genome dynamics of the major histocompatibility complex: insights from genome paralogy. Immunogenetics 50, 134-145.

Kasahara, M. (1999): The chromosomal duplication model of the major histocompatibility complex. Immunol Rev. 167, 17-32. Literaturverzeichnis 123

Kaye, F.J., Modi, S., Ivanovska, I., Koonin, E.V., Thress, K., Kubo, A., Kornbluth, S. & Rose, M.D. (2000): A family of ubiquitin-like proteins binds the ATPase domain of Hsp70-like Stch. FEBS Lett. 467, 348-355.

Kendall, E., Sargent, C.A. & Campbell, R.D. (1990): Human major histocompatibility complex contains a new cluster of genes between the HLA-D and complement C4 loci. Nucleic Acids Res 18, 7251-7257.

Kermer, P., Krajewska, M., Zapata, J.M., Takayama, S., Mai, J., Krajewski, S. & Reed, J.C. (2002): Bag1 is a regulator and marker of neuronal differentiation. Cell Death. Differ. 9, 405-413.

Khanna, A. & Campbell, R.D. (1996): The gene G13 in the class III region of the human MHC encodes a potential DNA-binding protein. Biochem. J 319, 81-89.

King, A., Hiby, S.E., Gardner, L., Joseph, S., Bowen, J.M., Verma, S., Burrows, T.D. & Loke, Y.W. (2000): Recognition of trophoblast HLA class I molecules by decidual NK cell receptors--a review. Placenta 21, S81- S85.

Koch, N., Koch, S. & Hammerling, G.J. (1982): Ia invariant chain detected on lymphocyte surfaces by monoclonal antibody. Nature 299, 644-645.

Koller, B.H., Geraghty, D.E., Shimizu, Y., DeMars, R. & Orr, H.T. (1988): HLA-E. A novel HLA class I gene expressed in resting T lymphocytes. J Immunol 141, 897-904.

Kominsky, D.J., Bickel, R.J. & Tyler, K.L. (2002): Reovirus-Induced Apoptosis Requires Mitochondrial Release of Smac/DIABLO and Involves Reduction of Cellular Inhibitor of Apoptosis Protein Levels. J. Virol. 76, 11414- 11424.

Kullmann, M., Schneikert, J., Moll, J., Heck, S., Zeiner, M., Gehring, U. & Cato, A.C. (1998): RAP46 is a negative regulator of glucocorticoid receptor action and hormone-induced apoptosis. J Biol. Chem. 273, 14620- 14625.

Kulski, J.K., Gaudieri, S., Inoko, H. & Dawkins, R.L. (1999): Comparison between two human endogenous retrovirus (HERV)-rich regions within the major histocompatibility complex. J Mol. Evol. 48, 675-683.

Kumanovics, A. & Lindahl, K.F. (2001): G7c in the lung tumor susceptibility (Lts) region of the Mhc class III region encodes a von Willebrand factor type A domain protein. Immunogenetics 53, 64-68.

Kumanovics, A., Takada, T. & Lindahl, K.F. (2003): Genomic organization of the mammalian MHC. Annu. Rev. Immunol. 21, 629.

Laemmli, U.K. (1970): Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685.

Lafuse, W.P., Lanning, D., Spies, T. & David, C.S. (1992): PFGE mapping and RFLP analysis of the S/D region of the mouse H-2 complex. Immunogenetics 36, 110-116. Literaturverzeichnis 124

Lanier, L.L., Gutman, G.A., Lewis, D.E., Griswold, S.T. & Warner, N.L. (1982): Monoclonal antibodies against rat immunoglobulin kappa chains. Hybridoma 1, 125-131.

Lanning, D. & Lafuse, W.P. (1997): Localization of the casein kinase II beta-subunit gene within the mouse H-2 complex class III region and comparison of expression with Bat genes. Mamm. Genome 8, 519-521.

Lehner, B., Williams, G., Campbell, R.D. & Sanderson, C.M. (2002): Antisense transcripts in the human genome. Trends Genet. 18, 63-65.

Lennon, G., Auffray, C., Polymeropoulos, M. & Soares, M.B. (1996): The I.M.A.G.E. Consortium: an integrated molecular analysis of genomes and their expression. Genomics 33, 151-152.

Lepin, E.J., Bastin, J.M., Allan, D.S., Roncador, G., Braud, V.M., Mason, D.Y., van der Merwe, P.A., McMichael, A.J., Bell, J.I., Powis, S.H. & O'Callaghan, C.A. (2000): Functional characterization of HLA-F and binding of HLA-F tetramers to ILT2 and ILT4 receptors. Eur. J Immunol 30, 3552-3561.

Leung, D.W. (2001): The structure and functions of human lysophosphatidic acid acyltransferases. Front Biosci. 6, D944-D953.

Li, S., Zhao, Y., He, X., Kim, T.H., Kuharsky, D.K., Rabinowich, H., Chen, J., Du, C. & Yin, X.M. (2002): Relief of extrinsic pathway inhibition by the Bid-dependent mitochondrial release of Smac in Fas-mediated hepatocyte apoptosis. J. Biol. Chem. 277, 26912-26920.

Lindsay, S. & Bird, A.P. (1987): Use of restriction enzymes to detect potential gene sequences in mammalian DNA. Nature 327, 336-338.

Liu, J., Sentman, C.L., Kumar, V. & Bennett, M. (1997): Murine marrow coexpressing H2-Dsp2 and H2-Db on host natural killer cell rejection. Transplantation 63, 444-449.

Liu, Z., Sun, C., Olejniczak, E.T., Meadows, R.P., Betz, S.F., Oost, T., Herrmann, J., Wu, J.C. & Fesik, S.W. (2000): Structural basis for binding of Smac/DIABLO to the XIAP BIR3 domain. Nature 408, 1004-1008.

Lopez, A.J. (1998): Alternative splicing of pre-mRNA: developmental consequences and mechanisms of regulation. Annu. Rev. Genet. 32, 279-305.

Luetjens, C.M., Kogel, D., Reimertz, C., Dussmann, H., Renz, A., Schulze-Osthoff, K., Nieminen, A.L., Poppe, M. & Prehn, J.H. (2001): Multiple kinetics of mitochondrial cytochrome c release in drug-induced apoptosis. Mol. Pharmacol. 60, 1008-1019.

Lutter, M., Perkins, G.A. & Wang, X. (2001): The pro-apoptotic Bcl-2 family member tBid localizes to mitochondrial contact sites. BMC. Cell Biol. 2, 22.

Lüders, J., Demand, J., Papp, O. & Hohfeld, J. (2000): Distinct isoforms of the cofactor BAG-1 differentially affect Hsc70 chaperone function. J Biol. Chem. 275, 14817-14823.

MacFarlane, M. (2002): SMAC agonists blaze the TRAIL to tumor cells. Trends Pharmacol. Sci. 23, 501-502. Literaturverzeichnis 125

MacFarlane, M., Merrison, W., Bratton, S.B. & Cohen, G.M. (2002): Proteasome-mediated Degradation of Smac during Apoptosis: XIAP Promotes Smac Ubiquitination in Vitro. J. Biol. Chem. 277, 36611-36616.

MacKenzie, A. & LaCasse, E. (2000): Inhibition of IAP's protection by Diablo/Smac: new therapeutic opportunities? Cell Death. Differ. 7, 866-867.

Madesh, M., Antonsson, B., Srinivasula, S.M., Alnemri, E.S. & Hajnoczky, G. (2002): Rapid kinetics of tBid- induced cytochrome c and Smac/DIABLO release and mitochondrial depolarization. J. Biol. Chem. 277, 5651- 5659.

Mallya, M., Campbell, R.D. & Aguado, B. (2002): Transcriptional analysis of a novel cluster of LY-6 family members in the human and mouse major histocompatibility complex: five genes with many splice forms. Genomics 80, 113-123.

Manchen, S.T. & Hubberstey, A.V. (2001): Human Scythe contains a functional nuclear localization sequence and remains in the nucleus during staurosporine-induced apoptosis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 287, 1075- 1082.

Mao, J.R., Taylor, G., Dean, W.B., Wagner, D.R., Afzal, V., Lotz, J.C., Rubin, E.M. & Bristow, J. (2002): Tenascin-X deficiency mimics Ehlers-Danlos syndrome in mice through alteration of collagen deposition. Nat. Genet. 30, 421-425.

Marsh, S.G., Albert, E.D., Bodmer, W.F., Bontrop, R.E., Dupont, B., Erlich, H.A., Geraghty, D.E., Hansen, J.A., Mach, B., Mayr, W.R., Parham, P., Petersdorf, E.W., Sasazuki, T., Schreuder, G.M., Strominger, J.L., Svejgaard, A. & Terasaki, P.I. (2002): Nomenclature for factors of the HLA system, 2002. Eur. J Immunogenet. 29, 463- 515.

Martinez, O.P., Longman-Jacobsen, N., Davies, R., Chung, E.K., Yang, Y., Gaudieri, S., Dawkins, R.L. & Yu, C.Y. (2001): Genetics of human complement component C4 and evolution the central MHC. Front Biosci. 6, D904-D913.

Martins, L.M., Iaccarino, I., Tenev, T., Gschmeissner, S., Totty, N.F., Lemoine, N.R., Savopoulos, J., Gray, C.W., Creasy, C.L., Dingwall, C. & Downward, J. (2002): The serine protease Omi/HtrA2 regulates apoptosis by binding XIAP through a reaper-like motif. J. Biol. Chem. 277, 439-444.

Mathew, P.A., Kumar, V., Bennett, M. & Flaherty, L. (1995): Identification of a recombinational breakpoint at the BAT5 locus in three intra-H-2 recombinant inbred mouse strains. Exp. Clin. Immunogenet. 12, 261-267.

Matsuyama, S. & Reed, J.C. (2000): Mitochondria-dependent apoptosis and cellular pH regulation. Cell Death. Differ. 7, 1155-1165.

Matsuzaka, Y., Makino, S., Nakajima, K., Tomizawa, M., Oka, A., Bahram, S., Kulski, J.K., Tamiya, G. & Inoko, H. (2001): New polymorphic microsatellite markers in the human MHC class III region. Tissue Antigens 57, 397-404. Literaturverzeichnis 126

McCarthy, J.V. & Dixit, V.M. (1998): Apoptosis Induced by Drosophila Reaper and Grim in a Human System. attenuation by inhibitor of apoptosis proteins (cIAPs). J. Biol. Chem. 273 , 24009.

McGuire, W., Hill, A.V., Allsopp, C.E., Greenwood, B.M. & Kwiatkowski, D. (1994): Variation in the TNF- alpha promoter region associated with susceptibility to cerebral malaria. Nature 371, 508-510.

McLysaght, A., Hokamp, K. & Wolfe, K. (2002): Extensive genomic duplication during early chordate evolution. Nat. Genet. 31, 200-204.

Mignot, E. & Thorsby, E. (2001): Narcolepsy and the HLA system. N. Engl. J Med. 344, 692.

Milner, C.M. & Campbell, R.D. (1990): Structure and expression of the three MHC-linked HSP70 genes. Immunogenetics 32, 242-251.

Milner, C.M., Smith, S.V., Carrillo, M.B., Taylor, G.L., Hollinshead, M. & Campbell, R.D. (1997): Identification of a sialidase encoded in the human major histocompatibility complex. J Biol. Chem. 272, 4549- 4558.

Milner, C.M. & Campbell, R.D. (2001): Genetic organization of the human MHC class III region. Front Biosci. 6, D914-D926.

Mironov, A.A., Fickett, J.W. & Gelfand, M.S. (1999): Frequent Alternative Splicing of Human Genes. Genome Res. 9, 1288.

Mitchell, A. (2000): DIABLO is double trouble. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 8-9.

Mizuki, N., Ando, H., Kimura, M., Ohno, S., Miyata, S., Yamazaki, M., Tashiro, H., Watanabe, K., Ono, A., Taguchi, S., Sugawara, C., Fukuzumi, Y., Okumura, K., Goto, K., Ishihara, M., Nakamura, S., Yonemoto, J., Kikuti, Y.Y., Shiina, T., Chen, L., Ando, A., Ikemura, T. & Inoko, H. (1997): Nucleotide sequence analysis of the HLA class I region spanning the 237-kb segment around the HLA-B and -C genes. Genomics 42, 55-66.

Modrek, B. & Lee, C. (2002): A genomic view of alternative splicing. Nat. Genet. 30, 13-19.

Morel, Y. & Miller, W.L. (1991): Clinical and molecular genetics of congenital adrenal hyperplasia due to 21- hydroxylase deficiency. Adv. Hum. Genet. 20, 1-68.

Morelle, G. (1989): A plasmid extraction procedure on a miniprep scale. BRL Focus 11, 7-8.

Nakai, K. & Horton, P. (1999): PSORT: a program for detecting sorting signals in proteins and predicting their subcellular localization. Trends Biochem. Sci. 24, 34-36.

Neeper, M., Schmidt, A.M., Brett, J., Yan, S.D., Wang, F., Pan, Y.C., Elliston, K., Stern, D. & Shaw, A. (1992): Cloning and expression of a cell surface receptor for advanced glycosylation end products of proteins. J Biol. Chem. 267, 14998-15004. Literaturverzeichnis 127

Neville, M.J. & Campbell, R.D. (1997): Alternative splicing of the LST-1 gene located in the Major Histocompatibility Complex on human chromosome 6. DNA Seq. 8, 155-160.

Neville, M.J. & Campbell, R.D. (1999): A new member of the Ig superfamily and a V-ATPase G subunit are among the predicted products of novel genes close to the TNF locus in the human MHC. J Immunol 162, 4745- 4754.

Nicholson, D.W. (2001): Apoptosis. Baiting death inhibitors. Nature 410, 33-34.

Nielsen, H., Engelbrecht, J., Brunak, S. & von Heijne, G. (1997): Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Eng 10, 1-6.

Niyaz, Y., Frenz, I., Petersen, G. & Gehring, U. (2003): Transcriptional stimulation by the DNA binding protein Hap46/BAG-1M involves hsp70/hsc70 molecular chaperones. Nucleic Acids Res 31, 2209-2216.

Nunes, M., Peelman, L., Vaiman, M., Bourgeaux, N. & Chardon, P. (1994): Characterization of six new loci within the swine major histocompatibility complex class III region. Mamm. Genome 5, 616-622.

O'hUigin, C., Satta, Y., Hausmann, A., Dawkins, R.L. & Klein, J. (2000): The implications of intergenic polymorphism for major histocompatibility complex evolution. Genetics 156, 867-877.

O'Regan, S., Traiffort, E., Ruat, M., Cha, N., Compaore, D. & Meunier, F.M. (2000): An electric lobe suppressor for a yeast choline transport mutation belongs to a new family of transporter-like proteins. PNAS 97, 1835.

Okada, H., Suh, W.K., Jin, J., Woo, M., Du, C., Elia, A., Duncan, G.S., Wakeham, A., Itie, A., Lowe, S.W., Wang, X. & Mak, T.W. (2002): Generation and characterization of Smac/DIABLO-deficient mice. Mol. Cell Biol. 22, 3509-3517.

Okamoto, K., Makino, S., Yoshikawa, Y., Takaki, A., Nagatsuka, Y., Ota, M., Tamiya, G., Kimura, A., Bahram, S. & Inoko, H. (2003): Identification of I kappa BL as the second major histocompatibility complex-linked susceptibility locus for rheumatoid arthritis. Am. J Hum. Genet. 72, 303-312.

Olson, M.R., Holley, C.L., Yoo, S.J., Huh, J.R., Hay, B.A. & Kornbluth, S. (2003): Reaper is regulated by IAP- mediated ubiquitination. J Biol. Chem. 278, 4028-4034.

Ozaki, T., Hanaoka, E., Naka, M., Nakagawara, A. & Sakiyama, S. (1999): Cloning and characterization of rat BAT3 cDNA. DNA Cell Biol. 18, 503-512.

Packham, G., Brimmell, M. & Cleveland, J.L. (1997): Mammalian cells express two differently localized Bag-1 isoforms generated by alternative translation initiation. Biochem. J 328, 807-813.

Parham, P. & Ohta, T. (1996): Population Biology of Antigen Presentation by MHC Class I Molecules. Science 272, 67. Literaturverzeichnis 128

Peelman, L.J., Chardon, P., Nunes, M., Renard, C., Geffrotin, C., Vaiman, M., Van Zeveren, A., Coppieters, W., Van de, W.A., Bouquet, Y. & . (1995): The BAT1 gene in the MHC encodes an evolutionarily conserved putative nuclear RNA helicase of the DEAD family. Genomics 26, 210-218.

Peelman, L.J., Chardon, P., Vaiman, M., Mattheeuws, M., Van Zeveren, A., Van de, W.A., Bouquet, Y. & Campbell, R.D. (1996): A detailed physical map of the porcine major histocompatibility complex (MHC) class III region: comparison with human and mouse MHC class III regions. Mamm. Genome 7, 363-367.

Pei, J., Choo, S.Y., Spies, T., Strominger, J.L. & Hansen, J.A. (1991): Association of four HLA class III region genomic markers with HLA haplotypes. Tissue Antigens 37, 191-196.

Pende, D., Parolini, S., Pessino, A., Sivori, S., Augugliaro, R., Morelli, L., Marcenaro, E., Accame, L., Malaspina, A., Biassoni, R., Bottino, C., Moretta, L. & Moretta, A. (1999): Identification and molecular characterization of NKp30, a novel triggering receptor involved in natural cytotoxicity mediated by human natural killer cells. J Exp. Med. 190, 1505-1516.

Pesole, G., Mignone, F., Gissi, C., Grillo, G., Licciulli, F. & Liuni, S. (2001): Structural and functional features of eukaryotic mRNA untranslated regions. Gene 276, 73-81.

Pinkoski, M.J. & Green, D.R. (2002): Lymphocyte apoptosis: refining the paths to perdition. Curr. Opin. Hematol. 9, 43-49.

Ploegh, H.L., Orr, H.T. & Strominger, J.L. (1981): Major histocompatibility antigens: the human (HLA-A, -B, - C) and murine (H-2K, H-2D) class I molecules. Cell 24, 287-299.

Rebhan, M., Chalifa-Caspi, V., Prilusky, J. & Lancet, D. (1997): GeneCards: encyclopedia for genes, proteins and diseases. Weizmann Institute of Science, Bioinformatics Unit and Genome Center (Rehovot, Israel) http://bioinformatics.weizmann.ac.il/cards.

Ribas, G., Neville, M., Wixon, J.L., Cheng, J. & Campbell, R.D. (1999): Genes encoding three new members of the leukocyte antigen 6 superfamily and a novel member of Ig superfamily, together with genes encoding the regulatory nuclear chloride ion channel protein (hRNCC) and an N omega-N omega-dimethylarginine dimethylaminohydrolase homologue, are found in a 30-kb segment of the MHC class III region. J Immunol 163, 278-287.

Riedl, S.J., Renatus, M., Schwarzenbacher, R., Zhou, Q., Sun, C., Fesik, S.W., Liddington, R.C. & Salvesen, G.S. (2001): Structural basis for the inhibition of caspase-3 by XIAP. Cell 104, 791-800.

Roberts, D.L., Merrison, W., MacFarlane, M. & Cohen, G.M. (2001): The inhibitor of apoptosis protein-binding domain of Smac is not essential for its proapoptotic activity. J. Cell Biol. 153, 221-228.

Rock, K.L., Reiser, H., Bamezai, A., McGrew, J. & Benacerraf, B. (1989): The LY-6 locus: a multigene family encoding phosphatidylinositol-anchored membrane proteins concerned with T-cell activation. Immunol Rev. 111, 195-224. Literaturverzeichnis 129

Rollinger-Holzinger, I., Eibl, B., Pauly, M., Griesser, U., Hentges, F., Auer, B., Pall, G., Schratzberger, P., Niederwieser, D., Weiss, E.H. & Zwierzina, H. (2000): LST1: A Gene with Extensive Alternative Splicing and Immunomodulatory Function. J Immunol 164, 3169.

Rost, B. (1996): PHD: predicting one-dimensional protein structure by profile-based neural networks. Methods Enzymol. 266, 525-539.

Roth-Isigkeit, A., Hasselbach, L., Ocklitz, E., Bruckner, S., Ros, A., Gehring, H., Schmucker, P., Rink, L. & Seyfarth, M. (2001): Inter-individual differences in cytokine release in patients undergoing cardiac surgery with cardiopulmonary bypass. Clin. Exp. Immunol. 125, 80-88.

Ruoslahti, E. & Pierschbacher, M.D. (1986): Arg-Gly-Asp: a versatile cell recognition signal. Cell 44, 517-518.

Ruoslahti, E. (1996): RGD and other recognition sequences for integrins. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 697.

Sadasivan, B., Lehner, P.J., Ortmann, B., Spies, T. & Cresswell, P. (1996): Roles for calreticulin and a novel glycoprotein, tapasin, in the interaction of MHC class I molecules with TAP. Immunity 5, 103-114.

Sambrook, J., Fritsch, E.F. & Maniatis, T. Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989).

Sambrook, J.G., Russell, R., Umrania, Y., Edwards, Y.J., Campbell, R.D., Elgar, G. & Clark, M.S. (2002): Fugu orthologues of human major histocompatibility complex genes: a genome survey. Immunogenetics 54, 367-380.

Sargent, C.A., Dunham, I., Trowsdale, J. & Campbell, R.D. (1989): Human major histocompatibility complex contains genes for the major heat shock protein HSP70. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 86, 1968-1972.

Savli, H., Aalto, Y., Nagy, B., Knuutila, S. & Pakkala, S. (2002): Gene expression analysis of 1,25(OH)2D3- dependent differentiation of HL-60 cells: a cDNA array study. Br. J. Haematol. 118, 1065-1070.

Schmid, S.R. & Linder, P. (1992): D-E-A-D protein family of putative RNA helicases. Mol. Microbiol. 6, 283- 291.

Schmidt, A.M., Yan, S.D., Yan, S.F. & Stern, D.M. (2001): The multiligand receptor RAGE as a progression factor amplifying immune and inflammatory responses. J Clin. Invest 108, 949-955.

Schneider, A., Mijalski, T., Schlange, T., Dai, W., Overbeek, P., Arnold, H.H. & Brand, T. (1999): The homeobox gene NKX3.2 is a target of left-right signalling and is expressed on opposite sides in chick and mouse embryos. Curr. Biol. 9, 911-914.

Schroeder, H.W., Jr., Zhu, Z.B., March, R.E., Campbell, R.D., Berney, S.M., Nedospasov, S.A., Turetskaya, R.L., Atkinson, T.P., Go, R.C., Cooper, M.D. & Volanakis, J.E. (1998): Susceptibility locus for IgA deficiency and common variable immunodeficiency in the HLA-DR3, -B8, -A1 haplotypes. Mol. Med. 4, 72-86.

Schuler, M. & Green, D.R. (2001): Mechanisms of p53-dependent apoptosis. Biochem. Soc. Trans. 29, 684-688. Literaturverzeichnis 130

Schultz, J., Milpetz, F., Bork, P. & Ponting, C.P. (1998): SMART, a simple modular architecture research tool: Identification of signaling domains. PNAS 95, 5857.

Shalev, A., Blair, P.J., Hoffmann, S.C., Hirshberg, B., Peculis, B.A. & Harlan, D.M. (2002): A Proinsulin Gene Splice Variant with Increased Translation Efficiency Is Expressed in Human Pancreatic Islets. Endocrinology 143, 2541.

Sherry, S.T., Ward, M. & Sirotkin, K. (1999): dbSNP-database for single nucleotide polymorphisms and other classes of minor genetic variation. Genome Res. 9, 677-679.

Shi, Y. (2001): A structural view of mitochondria-mediated apoptosis. Nat. Struct. Biol. 8, 394-401.

Shi, Y. (2002): Mechanisms of caspase activation and inhibition during apoptosis. Mol. Cell 9, 459-470.

Shibata, M., Hattori, H., Sasaki, T., Gotoh, J., Hamada, J. & Fukuuchi, Y. (2002): Subcellular localization of a promoter and an inhibitor of apoptosis (Smac/DIABLO and XIAP) during brain ischemia/reperfusion. Neuroreport 13, 1985-1988.

Shiels, C., Islam, S.A., Vatcheva, R., Sasieni, P., Sternberg, M.J.E., Freemont, P.S. & Sheer, D. (2001): PML bodies associate specifically with the MHC gene cluster in interphase nuclei. J Cell Sci 114, 3705.

Sievers, E. Assoziation von Herpes Simplex Virus Typ 1 Glykoprotein B und MHC Klasse II-Molekülen. 2002. Dissertation, Universität Bonn.

Silke, J., Verhagen, A.M., Ekert, P.G. & Vaux, D.L. (2000): Sequence as well as functional similarity for DIABLO/Smac and Grim, Reaper and Hid? Cell Death. Differ. 7, 1275.

Silke, J., Ekert, P.G., Day, C.L., Hawkins, C.J., Baca, M., Chew, J., Pakusch, M., Verhagen, A.M. & Vaux, D.L. (2001): Direct inhibition of caspase 3 is dispensable for the anti-apoptotic activity of XIAP. EMBO J. 20, 3114- 3123.

Silke, J. & Vaux, D.L. (2001): Two kinds of BIR-containing protein - inhibitors of apoptosis, or required for mitosis. J. Cell Sci. 114, 1821-1827.

Silke, J., Hawkins, C.J., Ekert, P.G., Chew, J., Day, C.L., Pakusch, M., Verhagen, A.M. & Vaux, D.L. (2002): The anti-apoptotic activity of XIAP is retained upon mutation of both the caspase 3- and caspase 9-interacting sites. J. Cell Biol. 157, 115-124.

Singal, D.P., Li, J., Ye, M. & Lei, K. (1998): D6S273 microsatellite polymorphism and susceptibility to rheumatoid arthritis. Tissue Antigens 52, 353-358.

Singal, D.P., Li, J. & Zhu, Y. (1999): Genetic basis for rheumatoid arthritis. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz. ) 47, 307-311.

Singal, D.P., Li, J. & Lei, K. (1999): Genetics of rheumatoid arthritis (RA): two separate regions in the major histocompatibility complex contribute to susceptibility to RA. Immunol. Lett. 69, 301-306. Literaturverzeichnis 131

Singal, D.P., Li, J. & Zhu, Y. (2000): HLA class III region and susceptibility to rheumatoid arthritis. Clin. Exp. Rheumatol. 18, 485-491.

Smith, C. & Valcarcel, J. (2000): Alternative pre-mRNA splicing: the logic of combinatorial control. Trends Biochem. Sci. 25, 381-388.

Snoek, M., Albertella, M.R., van Kooij, M., Wixon, J., van Vugt, H., de Groot, K. & Campbell, R.D. (2000): G7c, a novel gene in the mouse and human major histocompatibility complex class III region, possibly controlling lung tumor susceptibility. Immunogenetics 51, 383-386.

Sondermann, H., Scheufler, C., Schneider, C., Hohfeld, J., Hartl, F.U. & Moarefi, I. (2001): Structure of a Bag/Hsc70 Complex: Convergent Functional Evolution of Hsp70 Nucleotide Exchange Factors. Science 291, 1553.

Song, J., Takeda, M. & Morimoto, R.I. (2001): Bag1-Hsp70 mediates a physiological stress signalling pathway that regulates Raf-1/ERK and cell growth. Nat. Cell Biol. 3, 276-282.

Sorek, R. & Safer, H.M. (2003): A novel algorithm for computational identification of contaminated EST libraries. Nucl. Acids. Res. 31, 1067.

Soyombo, A.A., Yi, W. & Hofmann, S.L. (1999): Structure of the human palmitoyl-protein thioesterase-2 gene (PPT2) in the major histocompatibility complex on chromosome 6p21.3. Genomics 56, 208-216.

Spies, T., Bresnahan, M. & Strominger, J.L. (1989): Human major histocompatibility complex contains a minimum of 19 genes between the complement cluster and HLA-B. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 86, 8955- 8958.

Spies, T., Blanck, G., Bresnahan, M., Sands, J. & Strominger, J.L. (1989): A new cluster of genes within the human major histocompatibility complex. Science 243, 214-217.

Spring, J. (1997): Vertebrate evolution by interspecific hybridisation-are we polyploid? FEBS Lett. 400, 2-8.

Spring, J. (2002): Genome duplication strikes back. Nat. Genet. 31, 128-129.

Springs, S.L., Diavolitsis, V.M., Goodhouse, J. & McLendon, G.L. (2002): The kinetics of translocation of Smac/DIABLO from the mitochondria to the cytosol in HeLa cells. J. Biol. Chem. 277, 45715-8.

Srinivasula, S.M., Datta, P., Fan, X.J., Fernandes-Alnemri, T., Huang, Z. & Alnemri, E.S. (2000): Molecular determinants of the caspase-promoting activity of Smac/DIABLO and its role in the death receptor pathway. J. Biol. Chem. 275, 36152-36157.

Srinivasula, S.M., Hegde, R., Saleh, A., Datta, P., Shiozaki, E., Chai, J., Lee, R.A., Robbins, P.D., Fernandes- Alnemri, T., Shi, Y. & Alnemri, E.S. (2001): A conserved XIAP-interaction motif in caspase-9 and Smac/DIABLO regulates caspase activity and apoptosis. Nature 410, 112-116. Literaturverzeichnis 132

Srinivasula, S.M., Datta, P., Kobayashi, M., Wu, J.W., Fujioka, M., Hegde, R., Zhang, Z., Mukattash, R., Fernandes-Alnemri, T., Shi, Y., Jaynes, J.B. & Alnemri, E.S. (2002): sickle, a novel Drosophila death gene in the reaper/hid/grim region, encodes an IAP-inhibitory protein. Curr. Biol. 12, 125-130.

Srivastava, P.K., Udono, H., Blachere, N.E. & Li, Z. (1994): Heat shock proteins transfer peptides during antigen processing and CTL priming. Immunogenetics 39, 93-98.

Sugaya, K., Fukagawa, T., Matsumoto, K., Mita, K., Takahashi, E., Ando, A., Inoko, H. & Ikemura, T. (1994): Three genes in the human MHC class III region near the junction with the class II: gene for receptor of advanced glycosylation end products, PBX2 homeobox gene and a notch homolog, human counterpart of mouse mammary tumor gene int-3. Genomics 23, 408-419.

Sugaya, K., Sasanuma, S., Nohata, J., Kimura, T., Fukagawa, T., Nakamura, Y., Ando, A., Inoko, H., Ikemura, T. & Mita, K. (1997): Gene organization of human NOTCH4 and (CTG)n polymorphism in this human counterpart gene of mouse proto-oncogene Int3. Gene 189, 235-244.

Sun, X.M., Bratton, S.B., Butterworth, M., MacFarlane, M. & Cohen, G.M. (2002): Bcl-2 and Bcl-xL inhibit CD95-mediated apoptosis by preventing mitochondrial release of Smac/DIABLO and subsequent inactivation of X-linked inhibitor-of-apoptosis protein. J. Biol. Chem. 277, 11345-11351.

Tachibana, M., Sugimoto, K., Fukushima, T. & Shinkai, Y. (2001): SET Domain-containing Protein, G9a, Is a Novel Lysine-preferring Mammalian Histone Methyltransferase with Hyperactivity and Specific Selectivity to Lysines 9 and 27 of Histone H3. J. Biol. Chem. 276, 25309.

Tachibana, M., Sugimoto, K., Nozaki, M., Ueda, J., Ohta, T., Ohki, M., Fukuda, M., Takeda, N., Niida, H., Kato, H. & Shinkai, Y. (2002): G9a histone methyltransferase plays a dominant role in euchromatic histone H3 lysine 9 methylation and is essential for early embryogenesis. Genes Dev. 16, 1779.

Takahashi, N., Yanagihara, M., Ogawa, Y., Yamanoha, B. & Andoh, T. (2003): Down-regulation of Bcl-2- interacting protein BAG-1 confers resistance to anti-cancer drugs. Biochem. Biophys. Res Commun. 301, 798- 803.

Takayama, S., Sato, T., Krajewski, S., Kochel, K., Irie, S., Millan, J.A. & Reed, J.C. (1995): Cloning and functional analysis of BAG-1: a novel Bcl-2-binding protein with anti-cell death activity. Cell 80, 279-284.

Takayama, S., Krajewski, S., Krajewska, M., Kitada, S., Zapata, J.M., Kochel, K., Knee, D., Scudiero, D., Tudor, G., Miller, G.J., Miyashita, T., Yamada, M. & Reed, J.C. (1998): Expression and location of Hsp70/Hsc- binding anti-apoptotic protein BAG-1 and its variants in normal tissues and tumor cell lines. Cancer Res 58, 3116-3131.

Takayama, S., Xie, Z. & Reed, J.C. (1999): An evolutionarily conserved family of Hsp70/Hsc70 molecular chaperone regulators. J Biol. Chem. 274, 781-786.

Takayama, S. & Reed, J.C. (2001): Molecular chaperone targeting and regulation by BAG family proteins. Nat. Cell Biol. 3, E237-E241. Literaturverzeichnis 133

Tang, S.C., Shehata, N., Chernenko, G., Khalifa, M., Wang, X. & Shaheta, N. (1999): Expression of BAG-1 in invasive breast carcinomas. J Clin. Oncol. 17, 1710-1719.

Tassabehji, M., Strachan, T., Anderson, M., Campbell, R.D., Collier, S. & Lako, M. (1994): Identification of a novel family of human endogenous retroviruses and characterization of one family member, HERV-K(C4), located in the complement C4 gene cluster. Nucleic Acids Res 22, 5211-5217.

The International SNP Map Working Group. (2001): A map of human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms. Nature 409, 928-933.

The MHC sequencing consortium. (1999): Complete sequence and gene map of a human major histocompatibility complex. Nature 401, 921-923.

Thress, K., Henzel, W., Shillinglaw, W. & Kornbluth, S. (1998): Scythe: a novel reaper-binding apoptotic regulator. EMBO J 17, 6135-6143.

Thress, K., Evans, E.K. & Kornbluth, S. (1999): Reaper-induced dissociation of a Scythe-sequestered cytochrome c-releasing activity. EMBO J 18, 5486-5493.

Thress, K., Song, J., Morimoto, R.I. & Kornbluth, S. (2001): Reversible inhibition of Hsp70 chaperone function by Scythe and Reaper. EMBO J 20, 1033-1041.

Tikoo, A., O'Reilly, L., Day, C.L., Verhagen, A.M., Pakusch, M. & Vaux, D.L. (2002): Tissue distribution of Diablo/Smac revealed by monoclonal antibodies. Cell Death. Differ. 9, 710-716.

Ting, J.P. & Trowsdale, J. (2002): Genetic control of MHC class II expression. Cell 109, S21-S33.

Torshin.I.Y. (2002): Structural criteria of biologically active RGD-sites for analysis of protein cellular function - a bioinformatics study. Med. Sci. Monit. 8, BR301-12.

Townsend, P.A., Cutress, R.I., Sharp, A., Brimmell, M. & Packham, G. (2003): BAG-1: a multifunctional regulator of cell growth and survival. Biochim. Biophys. Acta 1603, 83-98.

Trowsdale, J. (2001): Genetic and functional relationships between MHC and NK receptor genes. Immunity 15, 363-374.

Trowsdale, J. (2002): The gentle art of gene arrangement: the meaning of gene clusters. Genome Biol. 3, 2002.1- 2002.5.

Troy, C.M., Friedman, J.E. & Friedman, W.J. (2002): Mechanisms of p75-mediated death of hippocampal neurons. Role of caspases. J. Biol. Chem. 277, 34295-34302.

Turner, B.C., Krajewski, S., Krajewska, M., Takayama, S., Gumbs, A.A., Carter, D., Rebbeck, T.R., Haffty, B.G. & Reed, J.C. (2001): BAG-1: a novel biomarker predicting long-term survival in early-stage breast cancer. J Clin. Oncol. 19, 992-1000. Literaturverzeichnis 134

Uhl, J., Penzel, R., Sergi, C., Kopitz, J., Otto, H.F. & Cantz, M. (2002): Identification of a CTL4/Neu1 fusion transcript in a sialidosis patient. FEBS Lett. 521, 19-23.

Usuda, J., Chiu, S.M., Azizuddin, K., Xue, L.Y., Lam, M., Nieminen, A.L. & Oleinick, N.L. (2002): Promotion of photodynamic therapy-induced apoptosis by the mitochondrial protein Smac/DIABLO: dependence on Bax. Photochem. Photobiol. 76, 217-223.

Utans, U., Quist, W.C., McManus, B.M., Wilson, J.E., Arceci, R.J., Wallace, A.F. & Russell, M.E. (1996): Allograft inflammatory factory-1. A cytokine-responsive macrophage molecule expressed in transplanted human hearts. Transplantation 61, 1387-1392.

Van Loo, G., Saelens, X., Matthijssens, F., Schotte, P., Beyaert, R., Declercq, W. & Vandenabeele, P. (2002): Caspases are not localized in mitochondria during life or death. Cell Death. Differ. 9, 1207-1211.

Van Loo, G., Saelens, X., Van Gurp, M., MacFarlane, M., Martin, S.J. & Vandenabeele, P. (2002): The role of mitochondrial factors in apoptosis: a Russian roulette with more than one bullet. Cell Death. Differ. 9, 1031- 1042.

Venter, J.C., Adams, M.D., Myers, E.W., Li, P.W., Mural, R.J., Sutton, G.G., Smith, H.O., Yandell, M., Evans, C.A., Holt, R.A., Gocayne, J.D., Amanatides, P., Ballew, R.M., Huson, D.H., Wortman, J.R., Zhang, Q., Kodira, C.D., Zheng, X.H., Chen, L., Skupski, M., Subramanian, G., Thomas, P.D., Zhang, J., Gabor Miklos, G.L., Nelson, C., Broder, S., Clark, A.G., Nadeau, J., McKusick, V.A., Zinder, N., Levine, A.J., Roberts, R.J., Simon, M., Slayman, C., Hunkapiller, M., Bolanos, R., Delcher, A., Dew, I., Fasulo, D., Flanigan, M., Florea, L., Halpern, A., Hannenhalli, S., Kravitz, S., Levy, S., Mobarry, C., Reinert, K., Remington, K., Abu-Threideh, J., Beasley, E., Biddick, K., Bonazzi, V., Brandon, R., Cargill, M., Chandramouliswaran, I., Charlab, R., Chaturvedi, K., Deng, Z., Di, F., V, Dunn, P., Eilbeck, K., Evangelista, C., Gabrielian, A.E., Gan, W., Ge, W., Gong, F., Gu, Z., Guan, P., Heiman, T.J., Higgins, M.E., Ji, R.R., Ke, Z., Ketchum, K.A., Lai, Z., Lei, Y., Li, Z., Li, J., Liang, Y., Lin, X., Lu, F., Merkulov, G.V., Milshina, N., Moore, H.M., Naik, A.K., Narayan, V.A., Neelam, B., Nusskern, D., Rusch, D.B., Salzberg, S., Shao, W., Shue, B., Sun, J., Wang, Z., Wang, A., Wang, X., Wang, J., Wei, M., Wides, R., Xiao, C., Yan, C., Yao, A., Ye, J., Zhan, M., Zhang, W., Zhang, H., Zhao, Q., Zheng, L., Zhong, F., Zhong, W., Zhu, S., Zhao, S., Gilbert, D., Baumhueter, S., Spier, G., Carter, C., Cravchik, A., Woodage, T., Ali, F., An, H., Awe, A., Baldwin, D., Baden, H., Barnstead, M., Barrow, I., Beeson, K., Busam, D., Carver, A., Center, A., Cheng, M.L., Curry, L., Danaher, S., Davenport, L., Desilets, R., Dietz, S., Dodson, K., Doup, L., Ferriera, S., Garg, N., Gluecksmann, A., Hart, B., Haynes, J., Haynes, C., Heiner, C., Hladun, S., Hostin, D., Houck, J., Howland, T., Ibegwam, C., Johnson, J., Kalush, F., Kline, L., Koduru, S., Love, A., Mann, F., May, D., McCawley, S., McIntosh, T., McMullen, I., Moy, M., Moy, L., Murphy, B., Nelson, K., Pfannkoch, C., Pratts, E., Puri, V., Qureshi, H., Reardon, M., Rodriguez, R., Rogers, Y.H., Romblad, D., Ruhfel, B., Scott, R., Sitter, C., Smallwood, M., Stewart, E., Strong, R., Suh, E., Thomas, R., Tint, N.N., Tse, S., Vech, C., Wang, G., Wetter, J., Williams, S., Williams, M., Windsor, S., Winn-Deen, E., Wolfe, K., Zaveri, J., Zaveri, K., Abril, J.F., Guigo, R., Campbell, M.J., Sjolander, K.V., Karlak, B., Kejariwal, A., Mi, H., Lazareva, B., Hatton, T., Narechania, A., Diemer, K., Muruganujan, A., Guo, N., Sato, S., Bafna, V., Istrail, S., Lippert, R., Schwartz, R., Walenz, B., Yooseph, S., Allen, D., Basu, A., Baxendale, J., Blick, L., Caminha, M., Carnes-Stine, J., Caulk, P., Chiang, Y.H., Coyne, M., Dahlke, C., Mays, A., Dombroski, M., Donnelly, M., Ely, Literaturverzeichnis 135

D., Esparham, S., Fosler, C., Gire, H., Glanowski, S., Glasser, K., Glodek, A., Gorokhov, M., Graham, K., Gropman, B., Harris, M., Heil, J., Henderson, S., Hoover, J., Jennings, D., Jordan, C., Jordan, J., Kasha, J., Kagan, L., Kraft, C., Levitsky, A., Lewis, M., Liu, X., Lopez, J., Ma, D., Majoros, W., McDaniel, J., Murphy, S., Newman, M., Nguyen, T., Nguyen, N. & Nodell, M. (2001): The sequence of the human genome. Science 291, 1304-1351.

Verhagen, A.M., Ekert, P.G., Pakusch, M., Silke, J., Connolly, L.M., Reid, G.E., Moritz, R.L., Simpson, R.J. & Vaux, D.L. (2000): Identification of DIABLO, a mammalian protein that promotes apoptosis by binding to and antagonizing IAP proteins. Cell 102, 43-53.

Verhagen, A.M., Coulson, E.J. & Vaux, D.L. (2001): Inhibitor of apoptosis proteins and their relatives: IAPs and other BIRPs. Genome Biol. 2, Reviews 3009.

Verhagen, A.M. & Vaux, D.L. (2002): Cell death regulation by the mammalian IAP antagonist Diablo/Smac. Apoptosis. 7, 163-166.

Verhagen, A.M., Silke, J., Ekert, P.G., Pakusch, M., Kaufmann, H., Connolly, L.M., Day, C.L., Tikoo, A., Burke, R., Wrobel, C., Moritz, R.L., Simpson, R.J. & Vaux, D.L. (2002): HtrA2 promotes cell death through its serine protease activity and its ability to antagonize inhibitor of apoptosis proteins. J. Biol. Chem. 277, 445-454.

Vucic, D., Deshayes, K., Ackerly, H., Pisabarro, M.T., Kadkhodayan, S., Fairbrother, W.J. & Dixit, V.M. (2002): SMAC negatively regulates the anti-apoptotic activity of melanoma inhibitor of apoptosis (ML-IAP). J. Biol. Chem. 277, 12275-12279.

Wang, H.G., Takayama, S., Rapp, U.R. & Reed, J.C. (1996): Bcl-2 interacting protein, BAG-1, binds to and activates the kinase Raf-1. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A 93, 7063-7068.

Wang, R. & Liew, C.C. (1994): The human BAT3 ortholog in rodents is predominantly and developmentally expressed in testis. Mol. Cell Biochem. 136, 49-57.

Wang, S.L., Hawkins, C.J., Yoo, S.J., Muller, H.A. & Hay, B.A. (1999): The Drosophila caspase inhibitor DIAP1 is essential for cell survival and is negatively regulated by HID. Cell 98, 453-463.

Waterhouse, N.J., Ricci, J.E. & Green, D.R. (2002): And all of a sudden it's over: mitochondrial outer-membrane permeabilization in apoptosis. Biochimie 84, 113-121.

White, K., Grether, M.E., Abrams, J.M., Young, L., Farrell, K. & Steller, H. (1994): Genetic control of programmed cell death in Drosophila. Science 264, 677-683.

Wickner, S., Maurizi, M.R. & Gottesman, S. (1999): Posttranslational quality control: folding, refolding, and degrading proteins. Science 286, 1888-1893.

Wilkinson, D.G. In situ hybridization: A practical Approach. D.G.Wilkinson (ed.), pp. 75-83 (IRL Press, Oxford,1992). Literaturverzeichnis 136

Winand, N.J., Panzer, J.A. & Kolodner, R.D. (1998): Cloning and characterization of the human and Caenorhabditis elegans homologs of the Saccharomyces cerevisiae MSH5 gene. Genomics 53, 69-80.

Wolfsberg, T.G. & Landsman, D. (1997): A comparison of expressed sequence tags (ESTs) to human genomic sequences. Nucleic Acids Res 25, 1626-1632.

Wright, C.W. & Clem, R.J. (2002): Sequence requirements for Hid binding and apoptosis regulation in the baculovirus inhibitor of apoptosis Op-IAP. Hid binds Op-IAP in a manner similar to Smac binding of XIAP. J. Biol. Chem. 277, 2454-2462.

Wu, G., Chai, J., Suber, T.L., Wu, J.W., Du, C., Wang, X. & Shi, Y. (2000): Structural basis of IAP recognition by Smac/DIABLO. Nature 408, 1008-1012.

Wu, J.W., Cocina, A.E., Chai, J., Hay, B.A. & Shi, Y. (2001): Structural analysis of a functional DIAP1 fragment bound to grim and hid peptides. Mol. Cell 8, 95-104.

Wu, L.C., Morley, B.J. & Campbell, R.D. (1987): Cell-specific expression of the human complement protein factor B gene: evidence for the role of two distinct 5'-flanking elements. Cell 48, 331-342.

Xie, T., Aguado, B., Ahearn, M.E., Madan, A., Qin, S., Campbell, R.D., Hood, L. & Rowen, L. (2002): Cross- species comparisons between the human and mouse MHC class III regions. Tissue Antigens 59, 7.

Xu, N. & Dahlback, B. (1999): A novel human apolipoprotein (apoM). J Biol. Chem. 274, 31286-31290.

Xu, Y. & Uberbacher, E.C. (1997): Automated gene identification in large-scale genomic sequences. J Comput. Biol. 4, 325-338.

Yamauchi, H., Adachi, M., Sakata, K., Hareyama, M., Satoh, M., Himi, T., Takayama, S., Reed, J.C. & Imai, K. (2001): Nuclear BAG-1 localization and the risk of recurrence after radiation therapy in laryngeal carcinomas. Cancer Lett. 165, 103-110.

Yang, Z., Shen, L., Dangel, A.W., Wu, L.C. & Yu, C.Y. (1998): Four ubiquitously expressed genes, RD (D6S45)-SKI2W (SKIV2L)-DOM3Z-RP1 (D6S60E), are present between complement component genes factor B and C4 in the class III region of the HLA. Genomics 53, 338-347.

Yoshikawa, H., Nakajima, Y. & Tasaka, K. (2001): IFN-gamma induces the apoptosis of WEHI 279 and normal pre-B cell lines by expressing direct inhibitor of apoptosis protein binding protein with low pI. J. Immunol. 167, 2487-2495.

Zeiner, M. & Gehring, U. (1995): A protein that interacts with members of the nuclear hormone receptor family: identification and cDNA cloning. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A 92, 11465-11469.

Zhang, X.D., Zhang, X.Y., Gray, C.P., Nguyen, T. & Hersey, P. (2001): Tumor necrosis factor-related apoptosis- inducing ligand-induced apoptosis of human melanoma is regulated by smac/DIABLO release from mitochondria. Cancer Res. 61, 7339-7348. Anhang 137

7 Anhang

* 20 * 40 * 60 * 80 * 100 cloned : MSDRSGPTAKGKDGKKYSSLNLFDTYKGKSLEIQKPAVAPRHGLQSLGKVAIARRM PPPANLPSLKAENKGNDPNVSLVPKDGTGWASKQEQSDPKSSDA : 100 Genbank : MSDRSGPTAKGKDGKKYSSLNLFDTYKGKSLEIQKPAVAPRHGLQSLGKVAIARRM PPPANLPSLKAENKGNDPNVSLVPKDGTGWASKQEQSDPKSSDA : 100 Banerji : MSDRSGPTAKGKDGKKYSSLNLFDTYKGKSLEIQKPAVAPRHGLQSLGKVAIARRM RPPANLPSLKAENKGNDPNVSLVPKDGTGWASKQEQSDPKSSDA : 100 P/R(dbSNP:1062968)

* 120 * 140 * 160 * 180 * 200 cloned : STAQPPESQPLPASQTPASNQPKRPPAAPENTPLVPSGVKSWAQASVTHGAHGDGGRASSLLSRFSREEFPTLQAAGDQDKAAKE RESAEQSSGPGPSLR : 200 Genbank : STAQPPESQPLPASQTPASNQPKRPPAAPENTPLVPSGVKSWAQASVTHGAHGDGGRASSLLSRFSREEFPTLQAAGDQDKAAKERESAEQSSGPGPSLR : 200 Banerji : STAQPPESQPLPASQTPASNQPKRPPAAPENTPLVPSGVKSWAQASVTHGAHGDGGRASSLLSRFSREEFPTLQAAGDQDKAAKERESAEQSSGPGPSLR : 200 L/P(dbSNP 2280801)

* 220 * 240 * 260 * 280 * 300 cloned : PQNSTTWRDGGGRGPDELEGPDSKLHHGHDPRGGLQPSGPPQFPPYRGMMPPFMYPPYLPFPPPYGPQGPYRYPTPDGPSRFPRVAGPRGSGPPMRLVEP : 300 Genbank : PQNSTTWRDGGGRGPDELEGPDSKLHHGHDPRGGLQPSGPPQFPPYRGMMPPFMYPPYLPFPPPYGPQGPYRYPTPDGPSRFPRVAGPRGSGPPMRLVEP : 300 Banerji : PQNSTTWRDGGGRGPDELEGPDSKLHHGHDPRGGLQPSGPPQFPPYRGMMPPFMYPPYLPFPPPYGPQGPYRYPTPDGPSRFPRVAGPRGSGPPMRLVEP : 300

* 320 * 340 * 360 * 380 * 400 cloned : VGRPSILKEDNLKEFDQLDQENDDGWAGAHEEVDYTEKLKFSDEEDGRDSDEEGAEGHRDSQSASGEERPPEADGKKGNSPNSEPPTPKTAWAETSRPPE : 400 Genbank : VGRPSILKEDNLKEFDQLDQENDDGWAGAHEEVDYTEKLKFSDEE DGRDSDEEGAEGHRDSQSASGEERPPEADGKKGNSPNSEPPTPKTAWAETSRPPE : 400 Banerji : VGRPSILKEDNLKEFDQLDQENDDGWAGAHEEVDYTEKLKFSDEEDGRDSDEEGAEGHRDSQSASGEERPPEADGKKGNSPNSEPPTPKTAWAETSRPPE : 400

* 420 * 440 * 460 * 480 * 500 cloned : TEPGPPAPKPPLPPPHRGPAGNWGPPGDYPDRGGPPCKPPAPEDEDEAWRQRRKQSSSEISLAVERARRRREEEERRMQEERRAACAEKLKRLDEKFGAP : 500 Genbank : TEPGPPAPKPPLPPPHRGPAGNWGPPGDYPDRGGPPCKPPAPEDEDEAWRQRRKQSSSEISLAVERARRRREEEERRMQEERRAACAEKLKRL DEKFGAP : 500 Banerji : TEPGPPAPKPPLPP------GDYPDRGGPPCKPPAPEDEDEAWRQRRKQSSSEISLAVERARRRREEEERRMQEERRAACAEKLKRLDEKFGAP : 488

* 520 * 540 * 560 * 580 * 600 cloned : DKRLKAEPAAPPAAPSTPAPPPAVPKELPAPPAPPPASAPTPEKEPEEPAQAPPAQSTPTPGVAAAPTLVSGGGSTSSTSSGSFEASPVEPQLPSKEGPE : 600 Genbank : DKRLKAEPAAPPAAPSTPAPPPAVPKELPAPPAPPPASAPTPE KEPEEPAQAPPAQSTPTPGVAAAPTLVSGGGSTSSTSSGSFEASPVEPQLPSKEGPE : 600 Banerji : DKRLKAEPAAPPAAPSTPAPPPAVPKELPAPPAPPPASAPTPETEPEEPAQAPPAQSTPTPGVAAAPTLVSGGGSTSSTSSGSFEASPVEPQLPSKEGPE : 588 K/T (dbSNP:1046080)

* 620 * 640 * 660 * 680 * 700 cloned : PPEEVPPPTTPPVPKVEPKGDGIGPTRQPPSQGLGYPKYQKSLPPRFQRRQQEQLLKQQQQHQWQQHQQGSAPPTPVPPSPPQPVTLGAVPAPQAPPPPP : 700 Genbank : PPEEVPPPTTPPVPKVEPKGDGIGPTRQPPSQGLGYPKYQKSLPPRFQR QQQEQLLKQQQQHQWQQHQQGSAPPTPVPPSPPQPVTLGAVPAPQAPPPPP : 700 Banerji : PPEEVPPPTTPPVPKVEPKGDGIGPTRQPPSQGLGYPKYQKSLPPRFQR QQQEQLLKQQQQHQWQQHQQGSAPPTPVPPSPPQPVTLGAVPAPQAPPPPP : 688 K/Q(dbSNP:2844469)

* 720 * 740 * 760 * 780 * 800 cloned : KALYPGALGRPPPMPPMNFDPRWMMIPPYVDPRLLQGRPPL DFYPPGVHPSGLVPRERSDSGGSSSEPFDRHAPAMLRERGTPPVDPKLAWVGDVFTATP : 800 Genbank : KALYPGALGRPPPMPPMNFDPRWMMIPPYVDPRLLQGRPPL DFYPPGVHPSGLVPRERSDSGGSSSEPFDRHAPAMLRERGTPPVDPKLAWVGDVFTATP : 800 Banerji : KALYPGALGRPPPMPPMNFDPRWMMIPPYVDPRLLQGRPPL EFYPPGVHPSGLVPRERSDSLGLSSEPFDRHAPAMLRERGTPPVDPKLAWVGDVFTATP : 788 D/E(dbSNP:1046081) R/G(dbSNP:3204001)

* 820 * 840 * 860 * 880 * 900 cloned : AEPRPLTSPLRQAADEDDKGMRSETPPVPPPPPYLASYPGFPENGAPGPPISRFPLEEPGPRPLPWPPGSDEVAKIQTP PPKKEPPKEETAQLTGPEAGR : 900 Genbank : AEPRPLTSPLRQAADEDDKGMRSETPPVPPPPPYLASYPGFPENGAPGPPISRFPLEEPGPRPLPWPPGSDEVAKIQTPPPKKEPPKEETAQLTGPEAGR : 900 Banerji : AEPRPLTSPLRQAADEDDKGMRSETPPVPPPPPYLASYPGFPENGAPGPPISRFPLEEPGPRPLPWPPGSDEVAKIQTPPPKKEPPKEETAQLTG PEAGR : 888

* 920 * 940 * 960 * 980 * 1000 cloned : KPARGVGSGGQGPPPPRRESRTETRWGPRPGSSRRGIPPEEPGAPPRRAGPIKKPPPPTKVEELPPKPLEQGDETPKPPKPDPLKITKGKLGGPKETPPN : 1000 Genbank : KPARGVGSGGQGPPPPRRESRTETRWGPRPGSSRRGIPPEEPGAPPRRAGPIKKPPPPTKVEELPPKPLEQGDETPKPPKPDPLKITKGKLGGPKETPPN : 1000 Banerji : KLP--ASRSGAGPPPPRRESRTETRWGPRPGSSRRGIPPEEPGAPPRRAGPIKKPPPPTKVEELPPKPLEQGDETPKPPKPDPLKITKGKLGGPKETPPN : 986

* 1020 * 104 0 * 1060 * 1080 * 1100 cloned : GNLSPAPRLRRDYSYERVGPTSCRGRGRGEYFARGRGFRGTYGGRGRG --ARSREFRSYREFRGDDGRGGGTGGPNHPPAPRGRTASETRSEGSEYEEIP : 1098 Genbank : GNLSPAPRLRRDYSYERVGPTSCRGRGRGEYFARGRGFRGTYGGRGRG --ARSREFRSYREFRGDDGRGGGTGGPNHPPAPRGRTASETRSEGSEYEEIP : 1098 Banerji : GNLSPAPRLRRDYSYERVGPTSCRGRGRGEYFARGRGFRGTYGGRGRG GQANSAVTESFEEMMG---VEVGQGDQTTLLLPEAAMPARHGARVQSMRKSP : 1083 A/G (dbSNP:1046082)

* 1120 * 1140 * 1160 * 1180 * 1200 cloned : KRRRQRGSETGSETHESDLAPSDKEAPTPKEGTLTQVPLAPPPPGAPPSPAPARFTARGGRVFTPRGVPSRRGRGGGRPPPQVCPGWSPPAKSLAPKKPP : 1198 Genbank : KRRRQRGSETGSETHESDLAPSDKEAPTPKEGTLTQVPLAPPPPGAPPSPAPARFTARGGRVFTPRGVPSRRGRGGGRPPPQVCPGWSPPAKSLAPKKPP : 1198 Banerji : SGAGSGAQKQAARPMRVIWLLQTRRLPHPRREHSPRSSRSPTTRSPTLHRAPARFTCPGVGESSLPEGAISPGPRRREAPPQVCPGWSPPAKSLAPKKPP : 1183 R/C (dbSNP:1046084) G/R(dbSNP:1046086)

* 1220 * 1240 * 1260 * 128 0 * 1300 cloned : TGPLPPSKEPLKEKLIPGPLSPVARGGSNGGSNVGMEDGERPRRRRHGRAQQQ GKPPRFRRLKQERENAARGSEGKPSLTLPASAPGPEEALTTVTVAPA : 1298 Genbank : TGPLPPSKEPLKEKLIPGPLSPVARGGSNGGSNVGMEDGERPRRRRHGRAQQQ DKPPRFRRLKQERENAARGSEGKPSLTLPASAPAPEEALTTVTVAPA : 1298 Banerji : TGPLPPSKEPLKEKLIPGPLSPVARGGSNGGSNVGMEDGERPRRRRHGRAQQQ DKPPRFRRLKQERENAARGSEGKPSLTLPASAPGPEEALTTVTVAPA : 1283 A/G (dbSNP:2736158)

* 1320 * 1340 * 1360 * 1380 * 1400 cloned : PPRAAAKSPDLSNQNSDQANEEWETASESSDFTSERRGDKEAPPPVLLTPKAVGTPGGGGGGAVPGISAMSRGDLSQRAKDLSKRSFSSQRPGMERQNRR : 1398 Genbank : PRRAAAKSPDLSNQNSDQANEEWETASESSDFTSERRGDKEAPPPVLLTPKAVGTPGGGGGGAVPGISAMSRGDLSQRAKDLSKRSFSSQRPGMERQNRR : 1398 Banerji : PPRAAAKSPDLSNQNSDQANEEWETASESSDFTSERRGDKEAPPPVLLTPKAVGTPGGGGGGAVPGISAMSRGDLSQRAKDLSKRSFSSQRPGMERQNRR : 1383

* 1420 * 1440 * 1460 * 1480 * 1500 cloned : PGPGGKAGSSGSSSGGGGGGPGGRTGPGRGDKRSWPSPKNRSRPPEERPPGLPLPPPPPSSSAVFRLDQVIHSNPAGIQQALAQLSSRQGSVTAPGGHPR : 1498 Genbank : PGPGGKAGSSGSSSGGGGGGPGGRTGPGRGDKRSWPSPKNRSRPPEERPPGLPLPPPPPSSSAVFRLDQVIHSNPAGIQQALAQLSSRQGSVTAPGGHPR : 1498 Banerji : PGPGGKAGSSGSSSGGGGGGPGGRTGPGRGDKRSWPSPKNRSRPPEERPPGLP LPPPPPSSSAVFRLDQVIHSNPAGIQQALAQLSSRQGSVTAPGGHPR : 1483 A/G(dbSNP:2857703) Anhang 138

* 1520 * 1540 * 1560 * 1580 * 1600 cloned : HKPGPPQAPQGPSPRPPTRYEPQRVNSGLSSDPHFEEPGPMVRGVGGTPRDSAGVSPFPPKRRERPPRKPELLQEESLPPPHSSGFLGSKPEGPGPQAES : 1598 Genbank : HKPGPPQAPQGPSPRPPTRYEPQRVNSGLSSDPHFEEPGPMVRGVGGTPRDSAGVSPFPPKRRERPPRKPELLQEESLPPPHSSGFLGSKPEGPGPQAES : 1598 Banerji : HKPGPPQAPQGPSPRPPTRYEPQRVNSGLSSDPHFEEPGPMVRGVGGTPRDSAGVSPFPPKRRERPPRKPELLQEESLPPPHSSGFLGSKPEGPGPQAES : 1583 P/L(dbSNP:2272593)

* 1620 * 1640 * 1660 * 1680 * 1700 cloned : RDTGTEALTPHIWNRLHTATSRKSYRPSSMEPWMEPLSPFEDVAGTEMSQSDSGVDLSGDSQVSSGPCSQRSSPDGGLKGAAEGPPKRPGGSSPLNAVPC : 1698 Genbank : RDTGTEALTPHIWNRLHTATSRKSYRPSSMEPWMEPLSPFEDVAGTEMSQSDSGVDLSGDSQVSSGPCSQRSSPDGGLKGAAEGPPKRPGGSSPLNAVPC : 1698 Banerji : RDTGTEALTPHIWNRLHTATSRKSYRPTSMEPWMEPLSPFEDVAGTEMSQSDSGVDLSGDSQVSSGPCSQRSSPDGGLKGAAEGPPKRPGGSSPLNAVPC : 1683

* 1720 * 1740 * 1760 * 1780 * 1800 cloned : EGPPGSEPPRRPPPAPHDGDRKELPREQPLPPGPIGTERSQ RTDRGTEPGPIRPSHRPGPPVQFGTSDKDSDLRLVVGDSLKAEKELTASVTEAIPVSRD : 1798 Genbank : EGPPGSEPPRRPPPAPHDGDRKELPREQPLPPGPIGTERSQ HTDRGTEPGPIRPSHRPGPPVQFGTSDKDSDLRLVVGDSLKAEKELTASVTEAIPVSRD : 1798 Banerji : EGPPGSEPPRRPPPAPHDGDRKELPREQPLPPGPIGTERSQ RTDRGTEPGPIRPSHRPGPPVQFGTSDKDSDLRLVVGDSLKAEKELTASVTEAIPVSRD : 1783 H/R(dbSNP:1046089) A/G(dbSNP:2844491) * 1820 * 1840 * 1860 * 1880 * 1900 cloned : WELLPSAAASAEPQSKNLDSGHCVPEPSSSGQRLYPEVFYGSAGPSSSQISGG AMDSQLHPNSGGFRPGTPSLHPYRSQPLYLPPGPAPPSALLSGVALK : 1898 Genbank : WELLPSAAASAEPQSKNLDSGHCVPEPSSSGQRLYPEVFYGSAGPSSSQISGG AMDSQLHPNSGGFRPGTPSLHPYRSQPLYLPPGPAPPSALLSGVALK : 1898 Banerji : WELLPSAAASAEPQSKNLDSGHCVPEPSSSGQRLYPEVFYGSAGPSSSQISGG SHGLSITSKQWRLRPGTPSLHPYRSQPLYLPPGPAPPSALLSGVALK : 1883 L/V (dbSNP:3132453) * 1920 * 1940 * 1960 * 1980 * 2000 cloned : GQFLDFSTMQATELGKLPAGGVLYPPPSFLYSPAFCPSPLPDTSLLQVRQDLPSPSDFYSTPLQPGGQSGFLPSGAPAQQMLLPMVDSQLPVVNFGSLPP : 1998 Genbank : GQFLDFSTMQATELGKLPAGGVLYPPPSFLYSPAFCPSPLPDTSLLQVRQDLPSPSDFYSTPLQPGGQSGFLPSGAPAQQMLLPMVDSQLPVVNFGSLPP : 1998 Banerji : GQFLDFSTMQATELGKLPAGGVLYPPPSFLYSPAFCPSPLPDTSLLQVRQDLPSPSDFYSTPLQPGGQSGFLPSGAPAQQMLLPMVDSQLPVVNFGSLPP : 1983

* 2020 * 2040 * 2060 * 2080 * 2100 cloned : APPPAPPSLSLLPVGPALQPPSLAVRPPPAPATRVLPSPARPFPASLGRAELHPVELKPFQDYQKLSSNLGGPGSSRTPPTGRSFSGLNSRLKATPSTYS : 2098 Genbank : APPPAPPPLSLLPVGPALQPPSLAVRPPPAPATRVLPSPARPFPASLGRAELHPVELKPFQDYQKLSSNLGGPGSSRTPPTGRSFSGLNSRLKATPSTYS : 2098 Banerji : APPPAPPPLSLLPVGPALQPPSLAVRPPPAPATRVLPSPARPFPASLGRAELHPVELKPFQDYQKLSSNLGGPGSSRTPPTGRSFSGLNSRLKATPSTYS : 2083 P/S(dbSNP:10885)

* 2120 * 2140 * cloned : GVFRTQRVDLYQQASPPDALRWIPKPWERTGPPPREGPSRRAEEPGSRGDKEPGLPPPR : 2157 Genbank : GVFRTQRVDLYQQASPPDALRWIPKPWERTGLPPREGPSRRAEEPGSRGDKEPGLPPPR : 2157 Banerji : GVFRTQRVDLYQQASPPDALRWIPKPWERTGPPPREGPSRRAEEPGSRGDKEPGLPPPR : 2142 P/L (dbSNP1046756)

Anhang 1: Alignment der abgeleiteten BAT2 Aminosäuresequenz mit anderen publizierten BAT2-Sequenzen. Oben: die hier beschriebene, klonierte cDNA (cloned), Mitte: NCBI (Genbank), unten: BAT2 cDNA nach Banerji et al. (1990). Bekannte Polymorphismen sind eingezeichnet, soweit sie eine Auswirkung auf die Aminosäuresequenz haben; die Datenbankreferenzen sind angegeben (dbSNP). Anhang 139

Mensch : MSDRSGPTAKGKDGK-KYSSLNLFDTYKGKSLEIQKPAVAPRHGLQSLGKVAIARRMPPPANLPSLKAENKGNDPNVSLVPKDGTGWASKQEQSDPKSSD : 99 Maus : MSDRSGPTAKGKDGK-KYSSLNLFDTYKGKSLEIQKPAVAPRHGLQSLGKVAIARRMPPPANLPSLKAENKGNDPNVSLVPKDGTGWASKQEQSDPKSSD : 99 Ratte : MSDRSGPTAKGKDGK-KYSSLNLFDTYKGKSLEIQKPAVAPRHGLQSLGKVAIARRMPPPANLPSLKAENKGNDPNVSLVPKDGTGWASKQEQSDPKSSD : 99 Fugu : MSERSGQTAKGKEGKTKYASLNLFDTYKGKSLETQKPVVPPRHGLQSLGKVASARRMPPPANLPSLKAENKGNDPNVLLVPKDGTGWASKQEQADPKSTD : 100

Mensch : ASTAQPPESQPLPASQTPASNQPKRPPAAPENTPLVPSGVKSWAQASVTHGAHGDGGRASSLLSRFSREEFPTLQAAGDQDKAAKERESAEQSSGPGPSL : 199 Maus : ASTAQPPESQPLPASQTPASNQPKRPPTAPENTPSVPSGVKSWAQASVTHGAHGDGGRASNLLSRFSREEFPTLQAAGDQDKAAKERESAEQSSGPGPSL : 199 Ratte : ASTAQPPESQPLPASQTPASNQPKRPPTAPENTPSVPSGVKSWAQASVTHGAHGDGGRASSLLSRFSREEFPTLQAAGDQDKAAKERESAEQSSGPGPSL : 199 Fugu : PSSTPQPESQQSSASPTPAPTRPRTPPIS------EAAGVRSWAQASVTPGVXGDGGKGSNQPSPFSREEFPTLQAAGDQDKAGREQGTVDQWYGPGPSL : 194

Mensch : RPQNSTTWRDGGGRGPDELEGPDSKLHHGHDPRGGL-QPSGPPQFPPYRGMMPPFMYPPYLPFPPPYGPQGPYRYPTP-DGPS-RFPR-VAGPRG---SG : 292 Maus : RPQNSTTWRDGGGRGPDDLEGPDSKLHHGH-PRGGL-QPSGPPQFPPYRGMMPPFMYPPYLPFPPPYGPQGPYRYPTP-DGPS-RFPR-VAGPRG---SG : 291 Ratte : RPQNSTTWRDGGGRGPDELEGPDSKLHHGHDPRGGL-QPSGPPQFPPYRGMMPPFMYPPYLPFPPPYGPQGPYRYPTP-DGPS-RFPR-VAGPRG---SG : 292 Fugu : RPQNVTSWRDGGGRAMAPTLSGEGAADGGSNPVLPLPQPPVGPGFPQYRGIMPPFMFPPYMPFPGPYGPQGPYRYPAPGEGPSPRFSRGQSGPDSRPQGG : 294

Mensch : PPMRLVEPVGRPSILKEDNLKEFDQLDQENDDGWAGAHEEVDYTEKLKFSDEEDGRDSDEEGAEGHRDSQSASGEERP------PEADGKKGNSP : 381 Maus : PPMRLVEPVGRPSILKEDNLKEFDQLDQENDDGWAGAHEEVDYTEKLKFSDEEDGRDSDEEGAEGHKDSQSAAAEE------PETDGKKGTSP : 378 Ratte : PPMRLVEPVGRPSILKEDNLKEFDQLDQENDDGWAGAHEEVDYTEKLKFSDEEDGRDSDEEGAEGHKDSQSAAGEE------PETDGKKGTSP : 379 Fugu : TRDACGEVLKRPSILKQDDLKELDELDHDGDEGWAGAHEEIDYSAKLKFSDDEGDEEGEEEPTESSNESRYETKFEFDTSAVEILTNLCFALDPSEQQMP : 394

Mensch : NSEPPTPKTAWAETSRPPETEP-GPPAPKPPLPPPHRGPAGNWGPPGDYPDRGGPPCKPPAPEDEDEAWRQRRKQSSSEISLAVERARRRREEEERRMQE : 480 Maus : GSELPPPKTAWTENARPSETEP-APPTPKPPPPPPHRGPVGNWGPPGDYPDRGGPPCKPPAPEDEDEAWRQRRKQSSSEISLAVERARRRREEEERRMQE : 477 Ratte : GSELPPPKTAWTENSRPSETEPAAPPIPKPPPPPPHRGPVGNWGPPGDYPDRGGPPCKPPAPEDEDEAWRQRRKQSSSEISLAVERARRRREEEERRMQE : 479 Fugu : QDVPPAGSRSRASDSSEETRHTSSSNADKDPQPPSSK---PGWAEEGGNGWQGGPPNYQ--GDDEDETWRQRRKQSSTEISAAVERARRRREEEERRMEE : 489

Mensch : ERRAACAEKLKRLDEKFGAPDKRLKAEPAAPPAAPSTPAPPPAVPKELPAPPAPPPAS-APTPEKEPEEPAQAPPAQSTPTPGVAAAPTLVSGGG-STSS : 578 Maus : ERRAACAEKLKRLDEKFGAPDKRLKAEPAAPPVTPAAPALPPVVPKEIPAAPALPPTP-TPTPEKEPEEPAQAPPVQAAPSPGVAPVPTLVSGGGCTANS : 576 Ratte : ERRAACAEKLKRLDEKFGAPDKRLKAEPAAPPVTPPAPALPPVVPKETPTPPALPPTP-TPTPEKDPEEPAHAPPVQSAPTQAGPPAPTPVSGGG-TASS : 577 Fugu : ERRAACAEKLKRLDEKQQQQHGTNVGVGGSSSKSPSLDGNSTTATAGSLSPSVSVSSPNTSQPPSPCVDPEEPPPFAGQPTS----NPLVGEQQRGSTVS : 585

Mensch : TSSGSFEASPVEPQLPSKEGPEPPEEVPPPTTPPVPKVEPKGDGIGPTRQPPSQ-GLGYPKYQKSLPPRFQRRQQEQLLKQQQQHQ--WQQHQQGSAPPT : 675 Maus : NSSGSFEASPVEPQLPSKEGPEPPEEVPPPTTPPAPKMEPKGDGVGSTRQPPSQ-GLGYPKYQKSLPPRFQRQQQEQLLKQQQQQQ-QWQQQQQGTAPPA : 674 Ratte : TSSGSFEASPAEPQLPSKEGPEPPEEVPAPTTPPAPKVEPKGDGVGPTRQPPSQ-GLGYPKYQKSLPPRFQRQQQEQLLKQQQQQQWQQQQQQQGTAPPA : 676 Fugu : QAPQAAMDRPLPGEIKDETAGCTHGRTGSGNERGVDQVKIETAGSGASRPAGGLPNQGYSKYQKSLPPRFQRQQQSQLSPQ------PQA : 669

Mensch : PVPPSPPQPVTLGAVPAPQAPPPPPKALYPGALGRPPPMPPMNFDPRWMMIPPYVDPRLLQGRPP-LDFYPPGVHPSGLVPRERSDSGGSSSEPFDRHAP : 774 Maus : PVPPSPPQPVTLGAVPAPQAPPPPPKALYPGALGRPPPMPPMNFDPRWMMIPPYVDPRLLQGRPP-LDFYPPGVHPSGLVPRERSDSGGSSSEPFERHAP : 773 Ratte : PVPPSPPQPVTLGAVPAPQAPPPPPKALYPGALGRPPPMPPMNFDPRWMMIPPYVDPRLLQGRPP-LDFYPPGVHPSGLVPRERSDSGGSSSEPFERHAP : 775 Fugu : PSAGSTPQ-----SGPGPKQGGP---LYQPSSMVRPPPLP--IIDPRWMMMP-YMDPRMMQGRPPPMDFYSAGIHPSGLIGRERSDSGGSGSEPFDRQQP : 758

Mensch : AMLR-ERGTPPVDPKLAWVGDVFTATPAEPRPLTSPLRQAADEDDKGMRSETPPVPPPPPYLASYPGFPENGAPGPPISRFPLEE---PGPRPLPWPPGS : 870 Maus : PLLR-ERGTPPVDPKLAWVGDVFTTTPTDPRPLTSPLRQAADEEEKSMRSETPPVPPPPPYLANYPGFPENGTPGPPISRFPLEESAPPGPRPLPWPPGN : 872 Ratte : PLLR-ERGTPPVDPKLAWVGDVFTTTPTDPRPLTSPLRQAADEEEKSLRSETPPVPPPPPYLANYPGFPENGTPGPPISRFPLEESAPPGPRPLPWPPGN : 874 Fugu : LPGQPQRGTPPMDPKLAWGPEVFPG-PGEGRGLASPLRQKQGMDEDD------: 804

Mensch : DEVAKIQTPPPKKEPPKEETAQLTGPEAGRKPARGVGSGGQGPPPPRRESRTETRWGPRPGSSRRGIPPEEPGAPPRRAGPIKKPPPPTKVEELPPKPLE : 970 Maus : DEAAKMQAPPPKKEPSKEEPPQLSGPEAGRKPAR----GGQGPPPPRRENRTETRWGPRPGSCRRGIPPEEPGVPPRRAGPIKKPPPPVKVEELPPKSLE : 968 Ratte : DEAAKMQAPPPKKEPPKEEPAQLSGPEAGRKPARGVGGGGQGPPPPRRENRTETRWGPRPGSCRRGIPPEDPGVPPRRAGPIKKPPPPVKADELPPKSLE : 974 Fugu : ------: -

Mensch : QGDETPKPPKPDPLKITKGKLGGPKETPPNGNLSPAPRLRRDYSYERVGPTSCRGRGRGEYFARGRGFRGTYGGRGRGARSREFRSYREFRGDDGRGGGT : 1070 Maus : QGDETPKVPKPDALKTAKGKVG-PKETPPGGNLSPAPRLRRDYSYERVGPTSCRGRGRGEYFARGRGFRGTYGGRGRGARSREFRSYREFRGDDGRGGGS : 1067 Ratte : PGDETPKAPKPDALKTAKGKVG-PKETPAGGNLSPAPRLRRDYSYERVGPTSCRGRGRGEYFARGRGFRGTYGGRGRGARSREFRSYREFRGDDGRGGGS : 1073 Fugu : ------: -

Mensch : GGPNHPPAPRGRTASETRSEGSEYEEIPKRRRQRGSETGSETHESDLAPSDKEAP TPKEGTLTQVPLAPPPPGAPPSPAPARF-TARGGRVFTPRGVPSR : 1169 Maus : GGTNHPSAPRGRTASETRSEGSEYEEIPKRRRQRGSETGSETHESDLAPSDKEAP PPKEGVLGQVPLAPPQPGAPPSPAPARFSTARGGRVFTPRGVPSR : 1167 Ratte : GGTNHPSAPRGRTASETRSEGSEYEEIPKRRRQRGSETGSETHESDLAPSDKEAP PPKEGVLAQVPLAPPQPGAPPSPAPARFSTARGGRVFTPRGVPSR : 1173 Fugu : ------: -

Mensch : RGRGGGRPPPQVCPGWSPPAKSLAPKKPPTGPLPPSKEPLKEKLIPGPLSPVARGGSNGGSNVGMEDGERPRRRRHGRAQQQGKPPRFRRLKQERENAAR : 1269 Maus : RGRGGGRPPP-VCSGWSPPAKSLVPKKPPTGPLPPSKEPLKEKLISGPLSPMSRAGNMG---VGMEDGERPRRRRHGRAQQQDKPPRFRRLKQERENAAR : 1263 Ratte : RGRGGGRPPP-VCSGWSPPAKSLVPKKPPTGPLPPNKEPLKEKLISGPLSPMSRAGNMG---VGMEDGERPRRRRHGRAQQQDKPPRFRRLKQDRENAAR : 1269 Fugu : ------: -

Anhang 140

Mensch : GSEGKP-SLTLPASAPGPEEALTTVTVAPAPPRAAAKSPDLSNQNSDQANEEWETASESSDFTSERRGDKEAPPPVLLTPKAVGTPGGGGGGAVPGISAM : 1368 Maus : GADGKPPSLTLAASTPGPEETLTAATVPPPPRRTAAKSPDLSNQNSDQANEEWETASESSDFASERRGDKETPPAALMTSKAVGTPGANAGGAGPGISAM : 1363 Ratte : GTDGKPPPITLPASTPAPTETLATVAAPPPPRRTAAKSPDLSNQNSDQANEEWETASESSDFASERRGDKETPPAALITSKAVGTPGGNSGGAGPGISTM : 1369 Fugu : ------: -

Mensch : SRGDLSQRAKDLSKRSFSSQRPGMERQNRRPGPGGKAGSSGSSSGGGGGGPGGRTGPGRGDKRSWPSPKNRSRPPEERPPGLPLPPPPPSSSAVFRLDQV : 1468 Maus : SRGDLSQRAKDLSKRSFSSQRPGMDRQNRRPGTGGKTGSGGGSSGGGGAGPGGRTGPGRGDKRSWPSPKNRSRPPEERPPGLPLPPPPPSSSAVFRLDQV : 1463 Ratte : SRGDLSQRAKDLSKRSFSSQRPGMDRQNRRPGAGGKTG-GGGSSGGGGAGPGGRTGPGRGDKRSWPSPKNRSRPPEERPPGLPLPPPPPSSSAVFRLDQV : 1468 Fugu : ------: -

Mensch : IHSNPAGIQQALAQLSSRQGSVTAPGGHPRHKPGPPQAPQGPSPRPPTRYEPQRVNSGLSSDPHFEEPGPMVRGVGGTPRDSAGVSPFPPKRRERPPRKP : 1568 Maus : IHSNPAGIQQALAQLSSRQGNVTAPGGHPRPKPGPPQAPQGSSPRPPTRYDPPRASSAISSDPHFEEPGPMVRGVGGTPRDSAGVNPFPPKRRERPPRKP : 1563 Ratte : IHSNPAGIQQALAQLSSRQGNVTAPGGHPRPKPGPPQAPQGSSPRPPTHYDPPRASNAISSDPHFEEPGPMVRGVGGTPRDSAGVNPFPPKRRERPPRKP : 1568 Fugu : ------: -

Mensch : ELLQEESLPPPHSSGFLGSKPEGPGPQAESRDTGTEALTPHIWNRLHTATSRKSYRPSSMEPWMEPLSPFEDVAGTEMSQSDSGVDLSGDSQVSSGPCSQ : 1668 Maus : ELLQEETVPASHSSGFLGSKPEVPGPQEESRDSGTEALTPHIWNRLHTATSRKSYQPGSIEPWMEPLSPFEDVAGTEMSQSDSGVDLSGDSQVSSGPCSQ : 1663 Ratte : ELLQEETVPASHSSGFLGSKPEVPGPQEESRDSGTEALTPHIWNRLHTATSRKSYQPGSIEPWMEPLSPFEDVAGTEMSQSDSGVDLSGGSQVSSGPCSQ : 1668 Fugu : ------: -

Mensch : RSSPDGGLKGAAEGPPKRPGGSSPLNAVPCEGPPGSE---PPRRPPPAPHDGDRKELPREQPLPPGPIGTERSQRTDRGTEPGPIRPSHRPGPPVQFGTS : 1765 Maus : RSSPDGGLKGSAEGPPKRPGGPSPLNAVPGESASGSEPSEPPRRRPPASHEGERKELPREQPLPPGPIGTERSQRTDRGPEPGPLRPAHRPGSQVEFGTT : 1763 Ratte : RSSPDGGLKGSAEGPPRRPGGPSPLKAVPGESSSASEPSEPHRRRPPASHEGERKELPREQPLPPGPIGTERSQRTDRGPEPGPLRPAHRAGSQVEFGTT : 1768 Fugu : ------: -

Mensch : DKDSDLRLVVGDSLKAEKELTASVTEAIPVSRDWELLPSAAASAEPQSKNLDSGHCVPEPSSSGQRLYPEVFYGSAGPSSSQISGGA-MDSQLHPNSGGF : 1864 Maus : NKDSDLCLVVGDTLKGEKELVASATEAVPISRDWELLPSASTSAEPQPKSLGSGQCVPEPSPSGQRPYPEVFYGSPGPPNSQVSGGAPIDSQLHPNSGGF : 1863 Ratte : NKDSDLCLVVGDTLKGEKELAASATEAVPVSRDWELLPSASASAEPQAKSLGSGQCGPEPSPSGQRLYPEVFYGSPGPPNSQVSGGAPIDSQLHPSSGGF : 1868 Fugu : ------: -

Mensch : RPGTPSLHPYRSQPLYLPPGPAPPSALLSGVALKGQFLDFSTMQATELGKLPAGGVLYPPPSFLYSPAFCPSPLPDTSLLQVRQDLPSPSDFYSTPLQPG : 1964 Maus : RPGTPSLHQYRSQPLYLPPGPAPPSALLSGVALKGQFLDFSALQATELGKLPAGGVLYPPPSFLYSAAFCPSPLPDPPLLQVRQDLPSPSDFYSTPLQPG : 1963 Ratte : RPGTPSVHQYRSQPLYLPPGPAPPSALLSGVALKGQFLDFSALQATELGKLPAGGVLYPPPSFLYSAAFCPSPLPDPPLLQVRQDLPSPSDFYSTPLQPG : 1968 Fugu : ------: -

Mensch : GQSGFLPSGAPAQQMLLPMVDSQLPVVNFGSLPPAPPPAPP SLSLLPVGPALQPPSLAVRPPPAPATRVLPSPARPFPASLGRAELHPVELKPFQDYQKL : 2064 Maus : GQSGFLPSGAPAQQMLLPVVDSQLPVVNFGSLPPAPPPAPP PLSLLPVGPALQPPNLAVRPPPAPAARVLPSPARPFAPSLGRAELHPVELKPFQDYRKL : 2063 Ratte : GQSGFLPSGAPAQQMLLPVVDSQLPVVNFGSLPPAPPPAPP PLSLLPVGPALQPPNLAVRPPPAPAARVLPSPARPFPASLGRAELHPVELKPFQDYRKL : 2068 Fugu : ------: -

Mensch : SSNLGGPGSSRTPPTGRSFSGLNSRLKATPSTYSGVFRTQRVDLYQQASPPDALRWIPKPWERTGPPPREGPSRRAEEPGSRGDKEPGLPPPR : 2157 Maus : SSNLGGPGSSRTPPSGRPFSGLNSRLKAPPSTYSGVFRTQRIDLYQQASPPDALRWMPKPWERAGPPSREGPPRRAEEPGSRGEKEPGLPPPR : 2156 Ratte : SSNLGGPGSSRAPPSGRSFSGLNSRLKAPPSTYSGVFRTQRIDLYQQASPPDALRWMPKPWERTGPPSREGPPRRAEEPGPRGEKEPGLPPPR : 2161 Fugu : ------: -

Anhang 2: Alignment der translatierten BAT2 cDNA mit BAT2-Sequenzen aus Maus, Ratte und Fugu rupripes. Anhang 141

* 20 * 40 * 60 * 80 * 100 Banerji : MEPNDSTSTAVEEPDSLEVLVKTLDSQTRTFIVGAQMNVKEFKEHI RASVSIPSEKQRLIYQGRVLQDDKKLQEYNVGGKVIHLVERAPPQTHLPSGASS : 100 Genbank : MEPNDSTSTAVEEPDSLEVLVKTLDSQTRTFIVGAQMNVKEFKEHIAASVSIPSEKQRLIYQGRVLQDDKKLQEYNVGGKVIHLVERAPPQTHLPSGASS : 100 cloned : MEPNDSTSTAVEEPDSLEVLVKTLDSQTRTFIVGAQMNVKEFKEHI AASVSIPSEKQRLIYQGRVLQDDKKLQEYNVGGKVIHLVERAPPQTHLPSGASS : 100

* 120 * 140 * 160 * 180 * 200 Banerji : GTGSASATHGGGSPPGTRGPGASVHDRNANSYVMVGTFNLPSDGSAVDVHINMEQAPIQSEPRVRLVMAQHMIRDIQTLLSRME TLPYLQCRGGPQPQHS : 200 Genbank : GTGSASATHGGGSPPGTRGPGASVHDRNANSYVMVGTFNLPSDGSAVDVHINMEQAPIQSEPRVRLVMAQHMIR DIQTLLSRME------CRGGPQPQHS : 194 cloned : GTGSASATHGGGSPPGTRGPGASVHDRNANSYVMVGTFNLPSDGSAVDVHINMEQAPIQSEPRVRLVMAQHMIRDIQTLLSRME ------CRGGPQPQHS : 194

* 220 * 240 * 260 * 280 * 300 Banerji : QPPPQPPAVTPEPVALSSQTSEPVESEAPPREPMEAEEVEERAPAQNPELTPGPAPAGPTPAPETNAPNHPSPAEYVEVLQELQRLESRLQPFLQRYYEV : 300 Genbank : QPPPQPPAVTPEPVALSSQTSEPVESEAPPREPMEAEEVEERAPAQNPELTPGPAPAGPTPAPETNAPNHPSPAEYVEVLQELQRLESRLQPFLQRYYEV : 294 cloned : QPPPQPPAVTPEPVALSSQTSEPVESEAPPREPMEAEEVEERAPAQNPELTPGPAPAGPTPAPETNAPNHPSPAEYVEVLQELQRLESRLQPFLQRYYEV : 294 H/P(dbSNP:3130049)

* 320 * 340 * 360 * 380 * 400 Banerji : LGAAATTDYNNNHEGREEDQRLINLVGESLRLLGNTFVALSDLRCNLACTPPRHLHVVRPMSHYTTPMVLQQAAIPIQINVGTTVTMTGNGTRPPPTPNA : 400 Genbank : LGAAATTDYNNNHEGREEDQRLINLVGESLRLLGNTFVALSDLRCNLACTPPRHLHVVRPMSHYTTPMVLQQAAIPIQINVGTTVTMTGNGTRPPPTPNA : 394 cloned : LGAAATTDYNNNHEGREEDQRLINLVGESLRLLGNTFVALSDLRCNLACTPPRHLHVVR PMSHYTTPMVLQQAAIPIQINVGTTVTMTGNGTRPPPTPNA : 394

* 420 * 440 * 460 * 480 * 500 Banerji : EAPPPGPGQASSVAPSSTNVESSAEGAPPPGPAPPPATSHPRVIRISHQSVEPVVMMHMNIQDSGTQPGGVPSAPTGPLGPPGHGQTLG ------: 489 Genbank : EAPPPGPGQASSVAPSSTNVESSAEGAPPPGPAPPPATSHPRVIRISHQSVEPVVMMHMNIQDSGTQPGGVPSAPTGPLGPPGHGQTLG ------: 483 cloned : EAPPPGPGQASSVAPSSTNVESSAEGAPPPGPAPPPATSHPRVIRISHQSVEPVVMMHMNIQDSGTQPGGVPSAPTGPLGPPGHGQTLG STLIQLPSLPP : 494

* 520 * 540 * 560 * 580 * 600 Banerji : ------QQVPGFPTAPTRVVIARPTPPQARPSHPGGPPVSGTLQGAGLGTNASLAQMVSGLVGQLLMQPVLVAQGTPGMAP : 564 Genbank : ------QQVPGFPTAPTRVVIARPTPPQARPSHPGGPPVSGTLQGAGLGTNASLAQMVSGLVGQLLMQPVLVAQGTPGMAP : 558 cloned : EFMHAVAHQITHQAMVAAVASAAAGQQVPGFPTAPTRVVIARPTPPQARPSHPGGPPVSGTLQGAGLGTNASLAQMVSGLVGQLLMQPVLVAQGTPGMAP : 594

* 620 * 640 * 660 * 680 * 700 Banerji : PPAPATASASAGTTNTATTAGPAPGGPAQPPPTPQPSMADLQFSQLLGNLLGPAGPGAGG PGVASPTITVAMPGVPAFLQGMTDFLQATQTAPPPPPPPP : 664 Genbank : PPAPATASASAGTTNTATTAGPAPGGPAQPPPTPQPSMADLQFSQLLGNLLGPAGPGAGG SGVASPTITVAMPGVPAFLQGMTDFLQATQTAPPPPPPPP : 658 cloned : PPAPATASASAGTTNTATTAGPAPGGPAQPPPTPQPSMADLQFSQLLGNLLGPAGPGAGG SGVASPTITVAMPGVPAFLQGMTDFLQATQTAPPPPPPPP : 694 P/S(dbSNP:1052486)

* 720 * 740 * 760 * 780 * 800 Banerji : PPPPAPEQQTMPPPGSPSGGAGSPGGLGLESLSPEFFTSVVQGVLSSLLGSLGARAGSSESIAAFIQRLSGSSNIFEPGADGALGFFGALLSLLCQNFSM : 764 Genbank : PPPPAPEQQTMPPPGSPSGGAGSPGGLGLESLSPEFFTSVVQGVLSSLLGSLGARAGSSESIAAFIQRLSGSSNIFEPGADGALGFFGALLSLLCQNFSM : 758 cloned : PPPPAPEQQTMPPPGSPSGGAGSPGGLGLESLSPEFFTSVVQGVLSSLLGSLGARAGSSESIAAFIQRLSGSSNIFEPGADGALGFFGALLSLLCQNFSM : 794

* 820 * 840 * 860 * 880 * 900 Banerji : VDVVMLLHGHFQPLQRLQPQLRSFFHQHYLGGQEPTPSNIRMATHTLITGLEEYVRESFSLVQVQP GVDIIRTNLEFLQEQFNSIAAHVLHCTDSGFGAR : 864 Genbank : VDVVMLLHGHFQPLQRLQPQLRSFFHQHYLGGQEPTPSNIRMATHTLITGLEEYVRESFSLVQVQPGVDIIRTNLEFLQEQFNSIAAHVLHCTDSGFGAR : 858 cloned : VDVVMLLHGHFQPLQRLQPQLRSFFHQHYLGGQEPTPSNIRMATHTLITGLEEYVRESFSLVQVQPGVDIIRTNLEFLQEQFNSIA AHVLHCTDSGFGAR : 894

* 920 * 940 * 960 * 980 * 1000 Banerji : LLELCNQGLFECLALNLHCLGGQQMELAAVINGRIRRMSRGVNPSLVSWLTTMMGLRLQVVLEHMPVGPDAILRYVRRVGDPPQPLPEEPMEVQGAERAS : 964 Genbank : LLELCNQGLFECLALNLHCLGGQQMELAAVINGRIRRMSRGVNPSLVSWLTTMMGLRLQVVLEHMPVGPDAILRYVRRVGDPPQPLPEEPMEVQGAERAS : 958 cloned : LLELCNQGLFECLALNLHCLGGQQMELAAVINGRIRRMPRGVNPSLVSWLTTMMGLRLQVVQEHMPVGPDAILRYVRRVGDPPQPLPEEPMEVQGAERAS : 994

* 1020 * 1040 * 1060 * 1080 * 1100 Banerji : PEPQRENASPAPGTTAEEAMSRGPPPAPEGGSRDEQDGASAETEPWAAAVPPEWVPIIQQDIQSQRKVKPQPPLSDAYLSGMPAKRRK TMQGEGPQLLLS : 1064 Genbank : PEPQRENASPAPGTTAEEAMSRGPPPAPEGGSRDEQDGASAETEPWAAAVPPEWVPIIQQ DIQSQRKVKPQPPLSDAYLSGMPAKRRKTMQGEGPQLLLS : 1058 cloned : PEPQRENASPAPGTTAEEAMSRGPPPAPEGGSRDEQDGASAETEPWAAAVPPEWVPIIQQDIQSQRKVKPQPPLSDAYLSGMPAKRRK ------: 1082

* 1120 * 1140 * 1160 Banerji : EAVSRAAKAAGARPLTSPESLSRDLEAPEVQESYRQQLRSDIQKRLQEDPNYSPQRFPNAQRAFADDP : 1132 Genbank : EAVSRAAKAAGARPLTSPESLSRDLEAPEVQESYRQQLRSDIQKRLQEDPNYSPQRFPNAQRAFADDP : 1126 cloned : ------LRSDIQKRLQEDPNYSPQRFPNAQRAFADDP : 1113 A/G(dbSNP:1065503)

Anhang 3: Alignment der abgeleiteten Aminosäuresequenz von BAT3 mit anderen publizierten BAT3-Sequenzen. Oben: BAT3 cDNA nach Banerji et al. (1990), Mitte: NCBI (Genbank), unten: die hier beschriebene, klonierte cDNA (cloned). Bekannte Polymorphismen sind eingezeichnet, soweit sie eine Auswirkung auf die Aminosäuresequenz haben; die Datenbankreferenzen sind angegeben (dbSNP). Anhang 142

cloned : MEPNDSTSTAVEEPDSLEVLVKTLDSQTRTFIVGAQMNVKEFKEHIAASVSIPSEKQRLIYQGRVLQDDKKLQEYNVGGKVIHLVERAPPQTHLPSGASS : 100 murine : MEPSDSASTAMEEPDSLEVLVKTLDSQTRTFIVGAQMNVKEFKEHIAASVSIPSEKQRLIYQGRVLQDDKKLQEYNVGGKVIHLVERAPPQTQLPSGASS : 100 rat : MEPSDSTSTAMEEPDSLEVLVKTLDSQTRTFIVGAP-DVKEFKEHIAASVSIPSEKQRLIYQGRVLQDDKKLQDYNVGGKVIHLVERAPPQTQLPSGASS : 99 Fugu : LNPHRYRSTMEEQAADVEVTVKTLDSQSRTYTVAPQLTVKEFKEHIAPSVGIPVDKQRLIYQGRVLQDDRTLADYNVGGKVIHLVERAPPP---PSQSNS : 97

cloned : GTGSASATHGGGSPPGTRGPGASVHDRNANSYVMVGTFNLPSDGSAVDVHINMEQAPIQSEPRVRLVMAQHMIRDIQTLLSRME------CR : 186 murine : GTGSASATHGGAPLPGTRGPGASVHDRNANSYVMVGTFNLPSDGSAVDVHINMEQAPIQSEPRVRLVMAQHMIRDIQTLLSRME------CR : 186 rat : GTGSASATHGGGPLPGTRGPGASGHDRNANSYVMVGTFNLPSDGSAVDVHINMEQAPIQSEPRVRLVMAQHMIRDIQTLLSRME------CR : 185 Fugu : GTG-GSTTDSGAASSSQGPSTMPPHDRNANSYVMLGTFNLPNNG-SVNVHIDLDQH-VQSEPRLRLVLAENLLRDISNVVQRMEG------QS : 181

cloned : GGPQPQHSQPPPQPP-AVTPEPVALSSQTSEPVESEAPPREPMEAEEVEERAPAQNPELTP-GPAPAG-----PTPAPETNAPNHPSPAEYVEVLQELQR : 279 murine : GGTQAQASQPPPQTPQTVASETVALNSQTSEPVESEAPPREPMESEEMEERPPTQTPELAPSGPAPAGPAPAGPAPAPETNAPNHPSPAEHVEVLQELQR : 286 rat : GGTQAQASQPPPQTP-TVASETVALNSQTSEPVESEAPPREPMESEEMEERPPTQTPELPPSGPAPAG-----PAPAPETNAPNHPSPAEHVEVLQELQR : 279 Fugu : GDSSTQLDSSPASAAAPPSSSSTTSTPSPSQPMDTSPPPTTPPPPPTSSTQSDAPTPQPGPNCVTNTG------IGHSFFSHPSPAELAEMLSELQR : 272

cloned : LESRLQPFLQRYYEVLGAAATTDYNNNHEGREEDQRLINLVGESLRLLGNTFVALSDLRCNLACTPPRHLHVVRPMSHYTTPMVLQQAA---IPIQINVG : 376 murine : LQRRLQPFLQRYCEVLGAAATTDYNNNHEGREEDQRLINLVGESLRLLGNTFVALSDLRCNLACAPPRHLHVVRPMSHYTTPMVLQQAA---IPIQINVG : 383 rat : LQRRLQPFLQRYCEVLGAAATTDYNNNHEGREEDQRLINLVGESLRLLGNTFVALSDLRCNLACAPPRHLHVVRPMSHYTTPMVLQQAA---IPIQINVG : 376 Fugu : MEERLQPFIQRAHAILETATNAEYNN-HTEREEDQRILVLTFEALRLLGNAIVALSDLRLNLLGPAPRHLHVLRPFSHYAPSVALPGAVHHHIPVQMNLG : 371

cloned : TTVT--MTGNGTRPPPTPNAEAPPPGPGQASSVAPSSTNVESSAEGAPPPGPAPPPATSHPRVIRISHQSVEPVVMMHMNIQDSGTQPGGVPSAPTGPLG : 474 murine : TTVT--MTGNGARPPPAPGAEAATPGSAQATSLPPSSTTVDSSTEGAPPPGPAPPPASSHPRVIRISHQSVEPVVMMHMNIQDSGAQPGGVPSAPTGPLG : 481 rat : TTVT--MTGNGARPPPAPGAEAASPGSGQASSLPPSSATVDSSTEGAPPPGPAPPPATSHPRVIRISHQSVEPVVMMHMNIQDSGAQPGGVPSAPTGPLG : 474 Fugu : ATMTSNMEGQASTPPSSNQTEQAGQGQTYPPQTAPSNQQTGQGQAG------PRVIRISHQAVP-VVMMQMN------: 436

cloned : PPGHGQTLGSTLIQLPSLPPEFMHAVAHQITHQAMVAAVASAAAGQQVPGFPTAPTRVVIARPTPPQARPSHPGGPPVSGTLQGAGLGTNASLAQMVSGL : 574 murine : PPGHGQTLG------QQVPGFPTAPTRVVIARPTPPQARPSHPGGPPVSGALQGAGLGTNTSLAQMVSGL : 545 rat : PPGHGQSLG------QQVPGFPTAPTRVVIARPTPPQARPSHPGGPPVSGALG-AGLGTNTSLAQMVSGL : 537 Fugu : ------TRCVVPYPP------QMKCFT : 451

cloned : VGQLLMQPVLVAQGTPGMAP------PPAPATASASAGTTNTATTAGPAPGGPAQPPPTPQPSMADLQFSQLLGNLLGPAGPGA : 652 murine : VGQLLMQPVLVAQGTPGMAQAQAQAQAQAQAQAQAPAPAPAPAPAPATASASAGTTNTATTAGPAPGGPAQPPP-PQPSAADLQFSQLLGNLLGPAGPGA : 644 rat : VGQLLMQPVLVAQGTPGMAP--ASASAPATAQAQAPAPAPAPAPAPATASASAGTTNTATTAGPAPGGPAQPPP-PQPSAADLQFSQLLGNLLGPAGPGA : 634 Fugu : VYDILQASISFSTMGPSPSP------DANAGSNSEANSTESLP--QEMPP------DLRQLLGSVFGVAG-GA : 509

cloned : GGSGVASPTITVAMPGVPAFLQGMTDFLQATQTAPPPPPPPPPPPPAPEQQTMPPPGSPSGGAGSPGGLGLESLSPEFFTSVVQGVLSSLLGSLGARAGS : 752 murine : GGPGMASPTITVAMPGVPAFLQGMTDFLQASQTAPPPPPPPPPPPPAPEQQSTPPPGSPSGGTASPGGLGPESLPPEFFTSVVQGVLSSLLGSLGARAGS : 744 rat : GGPSLASPTITVAVPGVPAFLQGMTEFLQASQAAPPPPPPPPPPPPAPEQQTTPPPGSPSGGTASPGGLGPESLPPEFFTSVVQGVLSSLLGSLGARAGS : 734 Fugu : GATSVGAPTITVTTTGVPGFIQGVSEFMQ--QASQPIFSPPPPPSGASRAAGPNPTPNPPG------AAESLNPELFTEIVRGVLSTMMGSLGQAQND : 599

cloned : SESIAAFIQRLSGSSNIFEPGADGALGFFGALLSLLCQNFSMVDVVMLLHGHFQPLQRLQPQLRSFFHQHYLGGQEPTPSNIRMATHTLITGLEEYVRES : 852 murine : SESIAAFIQRLSGSSNIFEPGADGALGFFGALLSLLCQNFSMVDVVMLLHGHFQPLQRLQPQLRSFFHQHYLGGQEPTPSNIRMATHTLITGLEEYVRES : 844 rat : SESIAAFIQRLSGSSNIFEPGADGALGFFGALLSLLCQNFSMVDVVMLLHGHFQPLQRLQPQLRSFFHQHYLGGQEPTSSNIRMATHTLITGLEEYVRES : 834 Fugu : TESIAQFMQRLSQATNIFISPED-PTGFFGELLMLVCQTFTMSDLVMLLHGQHQPLGRIQPQLFQFFTQNYLNGREPSDENISAAANSLVNELEEYITES : 698

cloned : F--SLVQVQPGVDIIRTNLEFLQEQFNSIAAHVLHCTDSGFGARLLELCNQGLFECLALNLHCLGGQQMELAAVINGRIRRMPRGVNPSLVSWLTTMMGL : 950 murine : F--SLVQVQPGVDIIRTNLEFLQEQFNSIAAHVLHCTDSGFGARLLELCNQGLFECLALNLHCLGGQQMELAAVINGRIRRMSRGVNPSLVSWLTTMMGL : 942 rat : F--SLVQVQPGVDIIRTNLEFLQEQFNSIAAHVLHCTDSGFGARLLELCNQGLFECLALNLHCLGGQQMELAAVINGRIRRMSRGVNPSLVSWLTTMMGL : 932 Fugu : FRESSVTVLEGVDATQTNMSFFRQQLQLFATHILRCTDESFGPRLLQMCNQALFECLALNLHCLRGDQRALTAVINHRIRRMSSDISPSLVNWMTSMMTM : 798

cloned : RLQVVQEHMPVGPDAILRYVRRVGDPPQPLPEEPMEVQGAERASPEPQRE--NASPAPGTTAEEAMSRGPPPAPEGGSRDEQDGASAETEPWAAAVPPEW : 1048 murine : RLQVVLEHMPVGPDAILRYVRRVGDPPQTLPEEPMEVQGAERTSPEPQRE--NASPAPGTTAEEAMSRGPPPAPEGGSRDEQDGASADAEPWAAAVPPEW : 1040 rat : RLQVVLEHMPVGPDAILRYVRRIGDPPQALPEEPMEVQGAERTSPEPQRE--DASPAPGTTAEEAMSRGPPPAPEGGSRDEQDGASADAEPWAAAVPPEW : 1030 Fugu : RLQVILEHMPITQEQIQAYIVHTKNGEGLSPAAATTAEEAMSVSPEPRASSRDVRVVPGDLGGTAALGSEAAGAEGGSEE----SAQESEAWAAAVPPEW : 894

cloned : VPIIQQDIQSQRKVKPQPPLSDAYLSGMPAKRRK------LRSDIQKRLQEDPNYSP : 1099 murine : VPIIQQDIQSQRKVKPQPPLSDAYLSGMPAKRRKTMQGEGPQLLLSEAVSRAAKAAGARPLTSPESLSRDLEAPEVQESYRQQLRSDIQKRLQEDPNYSP : 1140 rat : VPIIQQDIQSQRKVKPQPPLSDAYLSGMPAKRRK------LRSDIQKRLQEDPNYSP : 1081 Fugu : VPIIRHDIMTQRKMKAQPPLSDAYLHGMPAKRRKTGQSGENLLSLS------DAVSQAARTAGVKPITSP : 958

cloned : QRFPN------AQRAFADDP : 1113 murine : QRFPN------AHRAFADDP : 1154 rat : QRFPN------AHRAFADDP : 1095 Fugu : EQLQEDLETQELKEAYSDQV : 978

Anhang 4: Alignment der translatierten klonierten BAT3 cDNA (cloned) mit BAT3- Sequenzen aus Maus (murin), Ratte (rat) und Fugu rupripes (Fugu). BAT2 –Sequenz mit Exongrenzen und SNPs Anhang 1 CCTAGGCCCGGGTCCCGGATCCCCGCGCACCCGGCCAGgtgagtctgggtgaaccgtgcgctgacgcccttttccggcgcgggagaggtggtggcggtgg Ex. 1

101 cggtggcggtggcggcggcggcggcggtggtgggccggggggaggagaagctgccattagccgccgccattttgtcctcctgctgccgggcctgcttgcc

201 cctccccctccggtacctctactccgggacccgcacctccggcagttcattcaggatccgtagtctgcccctaaccacccaccgtcttggcttcaggggg

301 tgacccctgcgcctgggtccgtaactccctaccctccgctgcgctcctggcttttcacccccatttgtgggccccctccccggctgccgccccgtggtgg

401 gccgcgcccgacggttctctcggaagggcgcttttcctccatattggaccccctcctatcatccagcgctgtgttcccccctctggacgcccctcttcgt

501 gtcgagccactcccactctagaatcctgcttttatcccagcatctttgctttctatgttgctcagtcgccctatgtctgctttttcatttttcctgttcc

601 tcgtctcctttctcccccaaccccgtttttcttcttgggcctctgcccccttacttcgttgtctacatcctttttttttttgccattcctgtttccatat

701 attttccacctgctttcgtattcattattttctgttagttttggtctattcgctacatgactcttgtattcgttttcccttcatatatttatcttcacag

801 attggcctcctcaaacacctacgaagcaacatccatcttatctctagcttgtcataaagttctttctccccaattttagctttcattctgggcctgtctg

901 gatttccctgctttcttccccactatttctcatctctttacactgttcccgtccataaacgaatgcctggtcactctggaatggactgagagacctgtcg

1001 tccggcttgcttagggagctggaggtatcgagtaaagaaacactggtgatggacatttttaatgaggataggaaaacgaaggtggctctggccttggccc

1101 tctgttttctggcccatggttacagggtgctaaggtggctccataatgctttttctcagttcttcatatggtaaaacagtatttcatctggaggcgattt

1201 tttccaggagccaatacaggagcaagtttaggaaaagatgggatatttcaaatacttgaggttcctatagcctgggagtatgtacagccctagttgttct 14

1301 atgaggatttctctggtaccaacccccattccggctgagcaagctcataaaatccttaaactcccagcataccttcctgcaaaccttcccagatggacac 3 BAT2 –Sequenz mit Exongrenzen und SNPs Anhang

1401 gaggctgctgggctgggagcctggggtacagggccctgggggcatgattagggagcttgtgtccaataaacagggaatctaaagtgttgtttcttcttct

1501 ctgatggaattgtatgcttcttttttagttttctcttgcttgaatttgtcctgttgtaagtctctgaaacgattttggtggagagagaagagattattac

1601 ttgtagggaattactctttgtagacaggcacaaagggcagagtgtttatactaggaggatgctggatttttacttagatttccttgacaaaggtgtctgg

1701 gggaaaggagggaacatggcatttgagctatgagggagctaagtagatcatggttgcttaagaagagtgggcagtttacatagactggaggaaaagacac

1801 cagagggcctcatatctgagtccctaatgataatgcaatggagtttttaagtttctgttatggtctgtacaggggacagagactgagacacttgctgtct

MetSerAspArgSerGlyProThrAlaL Ex. 2 1901 ggcccacagGCTCTGGCACGTTTTGGGGGAGGTGCCTGCAGGACCCAACATACTCAATGAGCTTCCAGCGCAATGTCCGATCGCTCGGGGCCGACTGCCA

ysGlyLysAspGlyLysLysTyrSerSerLeuAsnLeuPheAspThrTyrLysGlyLysSerLeuGluIleGlnLysProAla 2001 AGGGAAAGGATGGAAAGAAGTATTCCTCGCTCAACCTGTTTGATACGTATAAGGGCAAGTCCTTAGAGATCCAGAAACCCGCTGgtgagagtcctgcaaa

2101 gatgcttctgatggttgaaagctaggcatgcatggggcatacgttttagagctctttaaagggaagtggctgtagtagaaataccaaaagactagaggag

2201 atttcccaactttacactgggtcctttaaagggggtgtgggctctgggtgaacaccagttatcctcctacaaaggcgtgtctgtggttccctgtctttgg

2301 acatgtaagaattggaggaaaataaatgtggatttgggaaactttgaggccagcttgcttcttgcaggctcatgatcaaccaatctcacataaaagtatt

2401 gaatgttacatatctcagccttcttgatagggatttcatagattttttttttttttttttttgagaccaagtttagctcctgttgcccaggctggagtgc

2501 aatggtgtgatcttgacttaccacaacctccacctcctgggtttaagcgattatcctgcctcagcctcctgagtagctgggattacaggcatgcgccacc 14 4 BAT2 –Sequenz mit Exongrenzen und SNPs Anhang 2601 acacccggctaattttgtatttttagtagagacagggtttctccattttggtcaagctggtcttgaactcctgacctcaggtgatccgcctgcctcggcc

2701 tgccaaagtgctgggattgcaaagtgtgagccaccacaatcagcgcgatttcagagattattaagggcaggggaaggaatcccttctaagagaagtttgg

2801 aggaagtaggtaataaaatattcaacatgtataaatgtgtcccaggataggaggccatcagatctcccacatgaggcattttcgaccctctctccgtctt

Arg (SNP) ValAlaProArgHisGlyLeuGlnSerLeuGlyLysValAlaIleAlaArgArgMetProProProAlaAsnLeuProSerLeuLysAlaGl Ex. 3 2901 gttctccagTTGCCCCTCGCCATGGCCTGCAGAGTCTCGGGAAAGTTGCCATTGCCCGGCGTATGCCACCTCCAGCCAACCTTCCAAGCCTGAAAGCCGA CGA

uAsnLysGlyAsnAspProAsnValSerLeuValProLysAspGlyThrGlyTrpAlaSerLysGlnGluGlnSerAspProLysSer 3001 GAACAAAGGCAATGACCCCAATGTCTCACTAGTGCCAAAAGACGGAACAGGATGGGCAAGCAAACAGGAGCAGTCCGACCCCAAGAGgtagacagaggct

3101 tgggggacctagagtgatgggtattttaacttgaacttcagggagcattggggcttggtttagtccagccacgtctgagccagagacgaagaggtccctt

3201 tcttacctattgcaggttccttgttaaatgactaaggaatggtactaaactttagctttttgtcttggagagagagcatgaaaaaatagacaacagccta

3301 caaaggatgacaaaattattttgtccttgtatttgtaaatggtagcaatgggcatgatttcagtcctgagtctccaccagttggagaagtcagggaggca

Leu (SNP) SerAspAlaSerThrAlaGlnProProGluSerGlnProLeuProAlaSerGlnThrProA 3401 tctcaggtgtgaataaccttcccattctgtcccctcagTTCCGATGCCTCAACCGCTCAGCCGCCGGAATCGCAGCCACTGCCGGCTTCACAGACGCCTG Ex. 4 CTG

laSerAsnGlnProLysArgProProAlaAlaProGlu 3501 CCTCCAACCAGCCGAAACGACCCCCAGCAGCCCCCGAGgtacctggagaactggaggggtggggaggaagaatggttcatagctgccccacccacatcat

AsnThrProLeuValProSerGlyValLysSerTrpAlaGlnAlaSerValThrHisGlyAlaHisGlyAsp 3601 ttatcatctttctgaacacttccccagAACACTCCTTTGGTTCCAAGCGGGGTAAAGTCCTGGGCACAAGCCAGCGTCACCCATGGAGCACATGGAGATG Ex. 5

3701 gtgagtgcagcacttaattggggagctgtgtctgggcaccatgggatgcatgaaccctgcactgtattttcagccaagtgaccttggtcctctttggcta 14 5 BAT2 –Sequenz mit Exongrenzen und SNPs Anhang

3801 aatcaaggaccacccatattcagtttcatggaggcacatgagcaagtttaagtctcagtcttatatgatggagtgtagtggtgccagaactgacctcctt

3901 ggggaataagcagttattctgtaggggggtgagtttgaaggcgggaaacctgatggtctggtacctgtcagagccttccactttttttttttttgagacg

4001 gagtctcattctgtcacccaggctggagtgcagtggcgcaatctcggctcactgcaacctctgcctcctgggttcaagcgattttcctgcctcagcctcc

4101 agagtagcgggactacaggcacacgccaacacacccagctaattttttgtgtgtttttagtagagatggggtttcacatgttggccaggatggtctcgat

4201 ctcttgacctcgtgatccgctcgcctcagcctcccagagtgctgggattacaggcgtgagccaccgcgcccagccagagtcttccacttttatagcatgt

GlyGlyArgAlaSerSerLeuLeuSerArgPheSerArgGluGluPheProTh 4301 cctcaggaaatgtcttctgtctcctgttctgcatccccatcctaatagGTGGAAGGGCATCAAGCCTACTGTCACGATTCTCTCGAGAGGAATTTCCGAC Ex. 6

rLeuGlnAlaAlaGlyAspGlnAspLysAlaAlaLysGluArgGluSerAlaGluGlnSerSerGlyProGlyProSerLeuArgProGln 4401 CCTGCAGGCGGCTGGCGACCAGGACAAGGCTGCCAAGGAAAGGGAGTCTGCCGAACAGTCGTCTGGGCCCGGACCAAGCCTCCGCCCCCAAAgtgagtgg

4501 ctgccttttggccaagacattacctattgcatctcagagctaggtgctggcttattcaccttcctccccatcactttcagctgtgttcacttgtcctcca

AsnSerThrThrTrpArgAspGlyGlyGlyArgGlyProAspGluLeuGluGlyProAspSerL 4601 atcattgatacctctctctaccttttccaaaatacagATTCTACAACTTGGAGGGACGGAGGTGGGCGTGGCCCTGATGAGCTGGAGGGCCCGGACTCCA Ex. 7

ysLeuHisHisGlyHisAspProArgGlyGlyLeuGlnProSerGlyProProGlnPheProProTyrArgGlyMetMetProProPhe 4701 AACTTCATCATGGTCATGATCCCCGGGGTGGGCTACAGCCTTCAGGCCCACCCCAGTTCCCTCCCTACCGCGGAATGATGCCGCCTTTCgtgagtcttgg

4801 tgtcttgtcttggaacgattacactggaagctggagagctaggaatcaggacttagtctttgacctatgagatagaggggagggtgggaggatgattgat 14 MetTyrProProTyrLeuProPheProProP 6 4901 agcaggcttaaggagctagaagggtatatgactgtccctctgagcagctactgttggacccttttacagATGTATCCCCCATATCTCCCGTTCCCTCCGC Ex. 8 BAT2 –Sequenz mit Exongrenzen und SNPs Anhang

roTyrGlyProGlnGlyProTyrArgTyrProThrProAspGlyProSer 5001 CCTATGGACCCCAGGGGCCTTACCGATACCCCACTCCTGATGGGCCCAGgtgagcaatccaggtctgggtttgtggctgggggcaggggaagcttattgg Ex. 8

Ar 5101 gggaggagatggttttctagccaggaggctcagtctaggatcagtctcgcatgtggttatacaacatgccatatttcattttcttttttgtgtacagCCG

gPheProArgValAlaGlyProArgGlySerGlyProProMetArgLeuValGluProValGlyArgProSerIleLeuLysGluAspAsnLeuLysGlu 5201 TTTTCCCCGTGTGGCGGGCCCCCGAGGCTCAGGGCCACCAATGCGCTTAGTAGAGCCTGTGGGTCGTCCCTCTATTCTCAAAGAGGATAATCTCAAAGAG Ex. 9

PheAspGlnLeuAspGlnGluAsnAspAspGlyTrpAla 5301 TTTGATCAGTTGGATCAGGAGAATGATGATGGTTGGGCAGgtaagtggatattaagggtcaagaatttggatcttgaaaggcaaaacctaatgaggaaaa

5401 aaaaatacagggttatgtgggtgaaaggcagacattgaagtgtaggaagaccaggcccaatggctcacatctgtaatcccagtgctttgggagtgttagg

5501 tgagaggatcgcttgaagccaggagttcaagaccagcctgggcaacacagcaagaccccccacctctacaaaaaaaaaaaatttttttagttgggtgtgg

5601 actgtgcatctgtggtcccagctactctggaggttgtggtgggaggatcagttgagcccaggagttggaggtcacagtgagctatgatcgtgccactgaa

5701 ctccatcctgggcaacagagcgagacttttaaaaggaaaaaaaaaaaagagtaggggaggatggatggggaataccaagtccttgcaaagtggtgagagg

5801 agtaagaatgacaagacttcattggtggatctagacttcggagggaaggatattggcattggtagtccatcttgttacatagttccagactacctcccaa

GlyAlaHisGluGluValAspTyrThrGluLysLeuLysPheSerAspGluG 5901 gattggagggcagaatgcttgggttactaatactcatatttcccctcagGGGCCCATGAAGAGGTTGACTACACTGAAAAGCTCAAGTTCAGCGATGAGG Ex. 10

luAspGlyArgAspSerAspGluGluGlyAlaGluGlyHis 6001 AAGATGGGCGAGACTCTGATGAGGAGGGAGCTGAGGGCCAgtgagttagggccatcaggggagaagaggagggggtcttggtttgtattttggtaatata 14 7 BAT2 –Sequenz mit Exongrenzen und SNPs Anhang

ArgAspSerGlnSerAlaSerGlyGluGluArgProProG 6101 ctcttagaggagtatattagttgcagctgattttaatttcactgttgatctgctcacagCAGGGATTCCCAATCAGCTTCTGGTGAGGAACGGCCCCCTG

luAlaAspGlyLysLysGlyAsnSerProAsnSerGluProProThrProLysThrAlaTrpAlaGluThrSerArgProProGluThrGluProGlyPr 6201 AAGCAGATGGCAAAAAGGGCAACTCCCCCAACAGCGAACCGCCCACTCCTAAGACGGCCTGGGCAGAAACCTCTCGGCCTCCAGAGACAGAGCCGGGACC Ex. 11

oProAlaProLysProProLeuProProProHisArgGlyProAlaGlyAsnTrpGlyProProGlyAspTyrPro 6301 TCCTGCCCCAAAGCCTCCCCTACCCCCACCTCACCGGGGCCCCGCCGGGAACTGGGGCCCCCCTGGGGACTACCCAgtgagtgtctccaataagggattg

6401 agagggtcagctgtgggaaattggtgtcagctgagtaattgaagcggttgtgatatagaggaaggggggtgctaaaaatgggctgtgtgaagtgccaggc

6501 tgcagaacatcctgggaagcttttaaatatctttggtaataggggagtctgggtaagaagtgagaaactgggatgctaatgaggaaagaagaaaaaggag

6601 ccctgggtgtttgggtttcggaaggagagagggaacagaaaaataaaaagactagggtggctagatagctggatctgttagtatgcatcagtagtccaag

6701 ctactcagcaggctgaagcagaaggatcacttgagcccaagttcaagaccagcctgggcaacatagcaagacgtggtctcaaagaagaccaggataatga

6801 gtttgtcaccacccagagagatcaaccccaaagcctgggtcgttgcatcctgcaagtagcgacagttgatttgttgtaaaagagatggtagaaagcatag

AspArgGlyGlyProProCysLysProProAlaProGluAspGluAspGluAlaTrpA 6901 taactgattcccctggccctgctgggtcttgccaattgacagGATCGTGGGGGTCCTCCCTGCAAGCCCCCAGCACCTGAAGATGAGGATGAGGCATGGC

rgGlnArgArgLysGlnSerSerSerGluIleSerLeuAlaValGluArgAlaArgArgArgArgGluGluGluGluArgArgMetGlnGluGluArgAr 7001 GGCAGCGACGAAAGCAGTCGTCATCTGAGATTTCCCTGGCAGTGGAGCGGGCCCGGCGACGGCGAGAAGAAGAGGAGCGGCGCATGCAAGAAGAGCGCCG Ex. 12

gAlaAlaCysAlaGluLysLeuLysArgLeuAspGluLysPheGlyAlaProAspLysArgLeuLysAlaGluProAlaAlaProProAlaAlaProSer 7101 GGCAGCCTGTGCTGAGAAGCTCAAGCGACTCGATGAAAAGTTTGGGGCACCTGACAAGCGGCTCAAAGCAGAGCCTGCTGCCCCACCTGCTGCCCCTTCT 14 8 BAT2 –Sequenz mit Exongrenzen und SNPs Anhang

Thr (SNP) ThrProAlaProProProAlaValProLysGluLeuProAlaProProAlaProProProAlaSerAlaProThrProGluLysGluProGluGluProA 7201 ACCCCAGCTCCACCACCTGCAGTCCCTAAAGAACTCCCTGCACCTCCAGCTCCACCTCCAGCATCAGCCCCAACACCAGAGAAAGAACCTGAAGAGCCAG Ex. 12 ACA

laGlnAlaProProAlaGlnSerThrProThrProGlyValAlaAlaAlaProThrLeuValSerGlyGlyGlySerThrSerSerThrSerSerGlySe 7301 CACAGGCCCCTCCTGCCCAATCTACTCCTACTCCAGGTGTGGCTGCGGCTCCCACTCTGGTGAGTGGTGGTGGCAGTACCAGTAGCACCAGCAGTGGCAG

rPheGluAlaSerPro 7401 CTTCGAAGCCAGCCCAGgtatggagatggggataggtactaccagatgtcagatcactgcttcaaggtgcttaaaggtgcagggtggtaaggctggggat

7501 aaatgaagtagaaggcagttgttttggtttattggactatcagtgatagtgttctatcatttgtatatctgaaggagggaaggttttgtctggaatctta

7601 ggttgtagtctaataccatttcttggcagagtactgtagctcacgcctataatcccaacacttagggaggcttggggtggaggatcgcttgagcctaggg

7701 agtttgagaccagcctgggcaacaaagcaagaccctgtcggccaggcatggtggctcacacttgtaatcccagcactctgggaggccgaggcgggcagaa

7801 catgaggtcaggagttcaagatcagcctggccaacatagtgaaacccgtctctactaaaaatacaaaaattagccaagtgtggtggcatgtgcttgtagt

7901 cccagctgcttgggaggctgaggtagtagaatcgctttaacccgggaggcagagatttctgtgagccaagaccatgccattgcactccagcctgggtgac

8001 agagcaagactctgtctcaaaaaaaaatcctgtctcacaagaaatacataaataaaaatgaaaactatttcctataggccaagactgaagaaagtactgt

8101 tgttctaatggtttcatagaaagttaatgccaccaccataggctcatgagaggccatgaagtgctttaatgggtcttaaatgggaggggcttcaatagaa

8201 tagatgttgaatagaatattttagtcttaagggagctagagatgagacgtgagattcctggggtgttcatggagtgtctattgttggactagatcactct

ValGluProGlnLeuProSerLysGluGlyProGluProProGluGluValProProProThrThrProProValProLy 8301 gttgtgttttttccgatgcagTGGAACCACAACTGCCCTCAAAAGAGGGTCCTGAACCACCAGAAGAGGTTCCTCCTCCTACCACACCCCCAGTTCCAAA Ex. 13 14 9 BAT2 –Sequenz mit Exongrenzen und SNPs Anhang

sValGluProLysGlyAspGlyIleGlyProThrArgGlnProProSerGlnGlyLeuGlyTyrProLysTyrGlnLysSerLeuProProArgPheGln 8401 GGTGGAACCCAAGGGTGATGGGATTGGTCCCACCCGCCAGCCCCCTAGTCAGGGCTTGGGCTACCCCAAATATCAGAAGTCGTTGCCTCCTCGTTTCCAG Ex. 13

ArgGlnGlnGln 8501 CGGCAGCAGCAGgtgaaatcaagttgtttaccctctaagggctgcttttcttcctggcttcggtccctaattctcttcataagttaccttctgggtccct

8601 ttgcttctttgtccagttgtctccattgtcacgccaatttcccctagtccaagttttttctttgctgattcctttgtccatgtgtgctttgagcctctct

GluGlnLeuLeuLysGlnGlnGlnGlnHisGlnTrpGlnGlnHisGlnGlnGlySerAlaProProThrProVal 8701 catcttgtctttcctcctttcctagGAGCAGCTCCTGAAGCAGCAGCAGCAGCACCAGTGGCAGCAGCATCAACAGGGCTCTGCCCCTCCTACCCCAGTG

Lys (SNP) ProProSerProProGlnProValThrLeuGlyAlaValProAlaProGlnAlaProProProProProLysAlaLeuTyrProGlyAlaLeuGlyArg 8801 CCCCCATCACCACCACAGCCTGTGACCCTGGGGGCTGTGCCAGCTCCACAGGCTCCACCCCCGCCCCCCAAGGCCCTGTACCCAGGTGCTCTGGGCCGGC Ex. 14 AAG

Glu (SNP) roProProMetProProMetAsnPheAspProArgTrpMetMetIleProProTyrValAspProArgLeuLeuGlnGlyArgProProLeuAspPheTy 8901 CCCCACCCATGCCCCCAATGAACTTTGATCCCCGATGGATGATGATTCCTCCTTATGTGGACCCCCGGCTCCTCCAGGGTCGTCCCCCTCTAGACTTCTA GAG

rProProGlyValHisProSer 9001 CCCTCCTGGTGTGCATCCCTCTGgtaagggggcatgggaggagtgagaaacaggaaagtcccctcagtcttaggcattggatattagggtcttactgtga

9101 ctctggtacgataggttttgcccatcatagtgatgagggaagggcatatgcttggcactgctgagatagctctgttgcaaaaatgggcttagttaagaaa

9201 taagcagtggttggccaggcattgtggctcacgcctgtaatcccagcacttagggaggccgaggtgggcagatcaactgagttcaggagttcgagaccac

9301 catggctaacgtggtgaaaccccatttctactaaaaatacaaaaaagtagccggcgtggtggcgctcgcctgtagtcccagctactcgggagactgaggc 1 50 9401 aggagaaacgcttgaacccaggaggtggaggttgtagtgagccgagattgtgccatcgcactccagcttaggcaacgagcgaaactccgtctcaaaaatg BAT2 –Sequenz mit Exongrenzen und SNPs Anhang

9501 aatgaatgaatagcacaactccatctcaaaaatgaatgaatgaatgaaagaagcagtggtccttcatttgccaggatttatttggggtgggttgattctc

9601 ttgtagggaatctgagtggataaccttgttatataagagcaggcaaggcccggacctactgggaacaagagatggaagagctgacttgaccgcgagggga

GlyLeuValProArgGluArgSerAspSerGly 9701 gatgctttttgggctggagggcttgtgacatgaataggattatttttctttttctttggtttcttcagGCCTAGTTCCCCGAGAGCGTTCAGACAGTGGG

Arg (SNP) GlySerSerSerGluProPheAspArgHisAlaProAlaMetLeuArgGluArgGlyThrProProValAspProLysLeuAlaTrpValGlyAspValP 9801 GGCTCAAGCTCAGAGCCATTTGACCGTCATGCACCTGCTATGTTACGGGAACGGGGCACTCCACCGGTGGATCCAAAGTTGGCCTGGGTAGGAGATGTCT Ex. 15 CGC

heThrAlaThrProAlaGluProArgProLeuThrSerProLeuArgGlnAlaAlaAspGluAspAspLysGlyMetArg 9901 TCACCGCCACACCCGCTGAACCCCGCCCACTTACCTCACCTCTGCGCCAGGCTGCGGATGAGGATGACAAGGGGATGAGgtgagtcttggtcatgagaaa

10001 tgggtgagttcacagtgaaaggatctaggcctgggagaaaggtactttgggttagtggtagggatagggatgaacgggaaaggagaggctggatggagtg

10101 gctcatgcctgtaatcccagcattttgggaggctgaggcaagaagattgcttgagcccagcagttcgagactagcctcggcaactggatgccatctctgc

10201 caaaacaaacagaaaaatagtaaaagagagtctgcatcataataaagtgttcttttcccacctagttctggttttcctgagatacttatttccattcttt

SerGluThrProProValProProProProProTyrLeuAlaSerTyrProGlyPheProGluAsnGlyAlaProGlyProPr 10301 ctgtctgtctcttcagGAGCGAGACTCCTCCAGTACCTCCCCCACCACCCTATCTGGCCAGTTATCCAGGCTTTCCTGAGAATGGAGCCCCTGGGCCCCC

oIleSerArgPheProLeuGluGluProGlyProArgProLeuProTrpProProGlySerAspGluValAlaLysIleGlnThrProProProLysLys 10401 AATCTCTCGCTTTCCTCTGGAGGAACCAGGGCCCCGTCCACTCCCCTGGCCCCCAGGCAGTGATGAAGTGGCCAAGATACAAACTCCACCACCCAAGAAG 1 51 BAT2 –Sequenz mit Exongrenzen und SNPs Anhang GluProProLysGluGluThrAlaGlnLeuThrGlyProGluAlaGlyArgLysProAlaArgGlyValGlySerGlyGlyGlnGlyProProProProA 10501 GAGCCCCCTAAGGAGGAGACTGCACAGCTGACGGGGCCAGAAGCAGGCCGAAAGCCTGCCCGCGGAGTCGGGAGTGGAGGCCAGGGCCCCCCACCACCAC Ex. 16

rgArgGluSerArgThrGluThrArgTrpGlyProArgProGlySerSerArgArgGlyIleProProGluGluProGlyAlaProProArgArgAlaGl 10601 GCAGAGAGAGTCGCACAGAGACCCGCTGGGGCCCTCGTCCAGGGAGCAGTCGTCGTGGAATCCCTCCAGAGGAGCCAGGGGCCCCACCCCGCCGGGCTGG

yProIleLysLysProProProProThrLysValGluGluLeuProProLysProLeuGluGlnGlyAspGluThrProLysProProLysProAspPro 10701 GCCTATAAAGAAACCTCCACCACCTACAAAAGTAGAAGAGCTGCCTCCCAAGCCCCTCGAACAGGGGGATGAAACCCCCAAACCCCCAAAGCCAGACCCA

LeuLysIleThrLysGlyLysLeuGlyGlyProLysGluThrProProAsnGlyAsnLeuSerProAlaProArgLeuArgArgAspTyrSerTyrGluA 10801 CTCAAGATAACCAAGGGGAAGCTAGGGGGCCCCAAGGAGACCCCACCCAATGGAAATCTTTCCCCTGCCCCAAGGCTTCGGAGGGACTATTCGTATGAAA

Gly (SNP) rgValGlyProThrSerCysArgGlyArgGlyArgGlyGluTyrPheAlaArgGlyArgGlyPheArgGlyThrTyrGlyGlyArgGlyArgGlyAlaAr 10901 GAGTGGGTCCTACCTCTTGCCGGGGTCGGGGCCGAGGCGAGTATTTTGCCAGAGGGAGGGGTTTTCGGGGGACCTATGGGGGACGAGGGCGGGGAGCCCG GGC

gSerArgGluPheArgSerTyrArgGluPheArgGlyAspAspGlyArgGlyGlyGlyThrGlyGlyProAsnHisProProAlaProArgGlyArgThr 11001 AAGCCGGGAATTCCGCAGTTACCGAGAGTTTCGAGGAGATGATGGGCGTGGAGGTGGGACAGGGGGACCAAACCACCCTCCTGCTCCCCGAGGCCGCACT

Cys (SNP) AlaSerGluThrArgSerGluGlySerGluTyrGluGluIleProLysArgArgArgGlnArgGlySerGluThrGlySerGluThrHisGluSerAspL 11101 GCCAGCGAGACACGGAGCGAGGGTTCAGAGTATGAGGAAATCCCCAAGCGGCGCCGGCAGCGGGGCTCAGAAACAGGCAGCGAGACCCATGAGAGTGATC Ex. 16 TGC

euAlaProSerAspLysGluAlaProThrProLysGluGlyThrLeuThrGlnValProLeuAlaProProProProGlyAlaProProSerProAlaPr 11201 TGGCTCCTTCAGACAAGGAGGCTCCCACACCCAAGGAGGGAACACTCACCCAGGTCCCTCTCGCTCCCCCACCACCAGGAGCCCCACCTTCACCAGCCCC

Arg (SNP) oAlaArgPheThrAlaArgGlyGlyArgValPheThrProArgGlyValProSerArgArgGlyArgGlyGlyGlyArgProProProGlnValCysPro

11301 AGCCCGCTTCACTGCCCGGGGTGGGCGAGTCTTCACTCCCAGAGGGGTGCCATCTCGCCGGGGCCGAGGAGGAGGGAGGCCCCCTCCTCAAGTTTGCCCA 1 5

CGG 2 BAT2 –Sequenz mit Exongrenzen und SNPs Anhang

GlyTrpSerProProAlaLysSerLeuAlaProLysLysProProThrGlyProLeuProProSerLysGluProLeuLysGluLysLeuIleProGlyP 11401 GGCTGGAGCCCTCCAGCCAAGTCTCTGGCTCCCAAGAAACCTCCCACAGGCCCTTTGCCACCAAGTAAGGAGCCTTTGAAAGAGAAGTTGATCCCAGGGC

roLeuSerProValAlaArgGlyGlySerAsnGlyGlySerAsnValGlyMetGluAspGlyGluArgProArgArgArgArgHisGlyArgAlaGlnGl 11501 CTCTGTCCCCTGTGGCGCGCGGAGGCAGCAATGGAGGTAGCAATGTGGGCATGGAAGATGGGGAGCGACCCCGAAGGAGGCGACATGGGAGGGCTCAGCA

nGlnAspLysProProArgPheArgArgLeuLysGlnGluArgGluAsnAlaAlaArgGlySerGluGlyLysProSerLeuThrLeuProAlaSerAla 11601 GCAGGATAAACCGCCTCGTTTCCGGAGGCTGAAGCAGGAACGGGAGAATGCCGCAAGGGGGTCTGAGGGCAAGCCCTCCCTAACCCTTCCAGCCTCCGCT

Ala (SNP) ProGlyProGluGluAlaLeuThrThrValThrValAlaProAlaProArgArgAlaAlaAlaLysSerProAspLeuSerAsnGlnAsnSerAspGlnA 11701 CCTGGACCTGAGGAGGCCCTCACAACAGTCACAGTGGCCCCAGCACCTCGCCGGGCAGCTGCCAAGTCTCCTGATCTGTCAAACCAGAACTCAGACCAAG GCA

laAsnGluGluTrpGluThrAlaSerGluSerSerAspPheThrSerGluArgArgGlyAspLysGluAlaProProProValLeuLeuThrProLysAl 11801 CCAATGAGGAATGGGAGACTGCATCAGAGAGCAGTGACTTCACCAGTGAGCGCCGAGGGGACAAAGAGGCACCCCCACCAGTACTGCTGACACCCAAGGC

aValGlyThrProGlyGlyGlyGlyGlyGlyAlaValProGlyIleSerAlaMetSerArgGlyAspLeuSerGlnArgAlaLysAspLeuSerLysArg 11901 TGTGGGAACTCCTGGGGGAGGTGGAGGTGGAGCCGTACCAGGTATTTCAGCCATGTCCCGCGGAGATCTGAGCCAGAGAGCCAAGGATTTGAGTAAACGG Ex. 16

Ala (SNP) SerPheSerSerGlnArgProGlyMetGluArgGlnAsnArgArgProGlyProGlyGlyLysAlaGlySerSerGlySerSerSerGlyGlyGlyGlyG 12001 AGCTTCTCAAGTCAGCGGCCAGGCATGGAACGGCAGAATCGGCGCCCTGGCCCAGGGGGCAAGGCTGGCAGCAGTGGCAGCAGCAGTGGAGGAGGCGGTG GCC

lyGlyProGlyGlyArgThrGlyProGlyArgGlyAspLysArgSerTrpProSerProLysAsnArgSer 12101 GGGGTCCTGGAGGAAGGACCGGGCCAGGACGAGGCGACAAGAGGAGCTGGCCCTCTCCCAAGAACCGAAGgtgggtaggaacaaacaaatttattgtggt 1

12201 ttaaaaattggaggagggggaaaaagcctgagggaaagataagtttgggtggagtggagattgtggcctgaggggccatgggctctagaatgtcagtagg 53 BAT2 –Sequenz mit Exongrenzen und SNPs Anhang

12301 atttccatgtctggctaaggcaactggaaagcggttggtagggtgttagagtcaagaacacccacctatgtattcattgctggttctttgctttccagtc

12401 tgtgcatctgtatgcataggaatccttagaaggactcaaaaacacctggactttaatagggaagagaataggttgtaagcagaagttgggaaacataact

ArgProProGluGluArgProProGlyLeuProLeuProProP 12501 tgtgggaaaaagtaacgatttagtggatactggagctaatgctctgttttctccagTCGTCCTCCAGAGGAGCGTCCCCCGGGGCTTCCCCTGCCTCCCC

roProProSerSerSerAlaValPheArgLeuAspGlnValIleHisSerAsnProAlaGlyIleGlnGlnAlaLeuAlaGlnLeuSerSerArgGlnGl 12601 CACCTCCCAGCAGTTCTGCTGTCTTCCGCCTGGACCAAGTTATCCACAGCAACCCTGCTGGCATCCAACAGGCTCTGGCCCAGCTTAGTAGCCGTCAAGG Ex. 17

Leu (SNP) ySerValThrAlaProGlyGlyHisProArgHisLysProGlyProProGlnAlaProGlnGlyProSerProArgProProThrArgTyrGluProGln 12701 GAGTGTAACTGCACCAGGGGGTCATCCAAGGCACAAGCCTGGGCCTCCCCAAGCCCCTCAGGGCCCCTCTCCTAGGCCCCCAACCCGATACGAGCCCCAG Ex. 17 CTT

ArgValAsnSerGlyLeuSerSer 12801 AGGGTCAACAGCGGCCTCAGTTCTGgtaagctggaggggttatgggtgggaatatctccatccccagagaaggtcaagtgctggagggagcgggtggaga

12901 acctggcctagggaccctgctgctgggtgcgtttctgcagggagcaagggtagaagaattgggaggtggagtagagaggaaaagttagggtcagtggcag

AspProHisPheGluGluProGlyProMetValArgGlyValGlyGlyThrProArgAspSerAl 13001 agccaggcagatgctgaccctttttctctttcccagACCCCCACTTTGAGGAGCCGGGGCCAATGGTGAGAGGGGTGGGTGGGACTCCTCGGGACTCTGC Ex. 18

aGlyValSerProPheProProLysArgArgGluArgProProArgLysProGluLeuLeuGlnGlu 13101 CGGGGTTAGTCCCTTTCCCCCTAAACGTCGGGAGCGGCCTCCCAGAAAACCAGAGCTGCTACAGGAGgtaagggatgggtttgagattgtgcttcactgc

13201 actcttactcgtgaaaattcttctgggttatgttttctctgttttctttcctgtttctttcactgtgtttttactccagaattctcagtattagtctccc 1 54 13301 atgtgtctcccttgttgtccccacaccctgtgtcaccccactctgtcctggcttcctataattcccaattcccacccaattcatgttttgcttctggccc BAT2 –Sequenz mit Exongrenzen und SNPs Anhang

GluSerLeuProProProHisSerSerGlyPheLeuGlySerLysProGluGlyProGlyProGlnAlaGluSerArgAspThrGly 13401 ttctcatctgtagGAATCTTTGCCACCTCCTCATAGCTCTGGATTCTTGGGCTCTAAGCCTGAGGGCCCAGGCCCTCAGGCAGAGTCCAGAGATACAGGC Ex. 19

ThrGluAlaLeuThrProHisIleTrpAsnArgLeuHisThr 13501 ACAGAGGCCCTGACCCCTCACATCTGGAACCGTTTACATACTGgtgagtaaagctgagtgaaaggactatggtagaagggttaagaatgagaggggcttc

AlaThrSerArgLysSerTyrArgProSerSerMetGluProTrpMetGluP 13601 tgaactgtcatctcctcacttctcttctggttggtgctcccttctccagCCACTAGCCGAAAGAGTTACCGGCCCAGCTCCATGGAGCCTTGGATGGAGC Ex. 20

roLeuSerProPheGluAspValAlaGlyThrGlu 13701 CCCTGAGTCCTTTTGAGGATGTGGCTGGCACAGAAgtgagtgagggtgggagggtgtgtctgagctgggacttttttgagcactggtcataccccccacc

13801 tgctctgggttgagtctggagctgttctctcacttggctgtcccctttctgcagtttgtatgtgtgcatcagtcaggtattggggtgctttctaccctga

MetSerGlnSerAspSerGlyValAspLeuSerGlyAspSerGlnValSerSerGlyProCysSerGlnA 13901 cttaactagctccttctccactcctctcagATGAGTCAGTCTGACAGTGGGGTGGACCTGAGTGGGGATTCTCAGGTGTCATCAGGTCCCTGCAGCCAGC

rgSerSerProAspGlyGlyLeuLysGlyAlaAlaGluGlyProProLysArgProGlyGlySerSerProLeuAsnAlaValProCysGluGlyProPr 14001 GAAGTTCCCCTGATGGAGGACTCAAGGGGGCAGCAGAGGGACCCCCCAAGAGGCCTGGAGGCTCCTCACCCCTGAATGCTGTTCCTTGTGAGGGTCCACC Ex. 21

oGlySerGluProProArgArgProProProAlaProHisAspGlyAspArgLys 14101 TGGCTCTGAACCTCCTAGGAGACCACCACCTGCCCCCCACGATGGGGACAGAAAGgtaaaagaccaaaaaaggataaggggaatgtttccaggaatctga

14201 ctttggccctacctttttctgctttttctctctgcgtgtgtgttctgggcattccaatttggatttccctttccctcccccaatgcactttactgtgtgc

His (SNP) Ala (SNP) GluLeuProArgGluGlnProLeuProProGlyProIleGlyThrGluArgSerGlnArgThrAspArgGlyThrGluProGlyProIleA

14301 ccaatccagGAGCTGCCCCGGGAGCAGCCTCTGCCCCCTGGCCCCATTGGCACAGAACGATCACAGCGTACAGACCGAGGCACAGAGCCTGGCCCCATTC Ex. 22 1 CAT GCA 55 BAT2 –Sequenz mit Exongrenzen und SNPs Anhang

rgProSerHisArgProGlyProProValGlnPheGlyThrSerAspLys 14401 GGCCATCCCATCGACCTGGTCCCCCAGTCCAGTTTGGCACTAGTGACAAGgtctgtgtgggctggatctgggtatcctgagttgggtggagagaagggaa

AspSerAspLeuArgLeuValValGlyAs 14501 ggactaaaggtgggacatagaggacacatgtctgtcacgggacaatgtctcctgccttcttgtgatcacagGACTCAGACTTACGCCTAGTGGTAGGAGA Ex. 23

pSerLeuLysAlaGluLysGluLeuThrAlaSerValThrGlu 14601 CAGCTTGAAAGCAGAGAAGGAGCTAACAGCATCAGTCACTGAGgtaagtgggagtaagagtttggtggaaaggcccaagatttctggggaagattgctgg

AlaIleProValSerArgAspTrpGluLeuLeuProSerAl 14701 gagtgaccagggcgtccaggatgccagacatccctctccacgaggcctctccttcccagGCCATTCCTGTATCACGAGACTGGGAGCTGCTTCCCAGTGC Ex. 24

aAlaAlaSerAlaGluProGlnSerLysAsnLeuAspSerGlyHisCysValProGluProSerSerSerGlyGlnArgLeuTyrProGluValPheTyr 14801 TGCTGCCTCTGCTGAGCCACAATCCAAGAACCTGGATTCTGGGCACTGTGTCCCGGAGCCCAGCTCCTCAGGCCAGCGCCTGTATCCTGAGGTTTTCTAT Ex. 24

GlySerAlaGlyProSerSerSerGln 14901 GGCAGTGCTGGGCCTTCCAGTTCTCAGgtaggccccgcttcccattgcatgaccccttcagtgaataataatttttttctgcctggtatgtgtttataat

15001 caagcctttctacgttgcagagttgtgagataccactttgtcacatcatttttctccctactttttgcttctatgggtgggatggtgatcttttttcttg

IleSerGlyGlyAlaMetAspSerGlnLeuHisProAsnSerGlyGlyPheArgPr 15101 accacagatactaaagctgtttcaaccgtgctcctctcctgcagATCTCTGGGGGAGCCATGGACTCTCAATTACATCCAAACAGTGGAGGCTTCCGCCC Ex. 25

oGlyThrProSerLeuHisProTyrArg 15201 TGGGACACCCTCACTGCACCCTTACAGgtaagactcgatgcctgtggatcacagaagtacttggagatgtgtttcggggagagggaaggggaagacacag

SerGlnProLeuT 1

15301 ttctagggtactagaagctagtggacttaaggcattgctaggactctggcttcctaacagcttttctccccacaatttattttcagATCACAGCCCCTAT 56 BAT2 –Sequenz mit Exongrenzen und SNPs Anhang

Leu (SNP) Pro (SNP) yrLeuProProGlyProAlaProProSerAlaLeuLeuSerGlyValAlaLeuLysGlyGlnPheLeuAspPheSerThrMetGlnAlaThrGluLeuGl 15401 ACCTACCCCCGGGCCCAGCCCCTCCCTCAGCACTGCTCTCTGGGGTAGCTCTCAAGGGCCAGTTTCTGGATTTCTCCACAATGCAAGCTACAGAGCTGGG Ex. 26 TTA CCC

yLysLeuProAlaGlyGlyValLeuTyrProProProSerPheLeuTyrSerProAlaPheCysProSerProLeuProAspThrSerLeuLeuGln 15501 GAAGTTGCCGGCTGGAGGAGTTCTCTACCCTCCACCTTCCTTCCTCTACTCTCCGGCTTTCTGCCCCAGTCCTTTGCCTGACACATCGTTGCTTCAGgta

ValArgGlnAspL 15601 agaggggggcaggtattagatattgggggatagggtagggagaatgattttgtgggggttgatatatttctccctgtttcccgacagGTACGCCAGGATC Ex. 27

euProSerProSerAspPheTyrSerThrProLeuGlnProGlyGlyGlnSerGlyPheLeuProSerGlyAlaProAlaGlnGln 15701 TGCCATCCCCTTCGGATTTTTATTCTACTCCTCTGCAGCCTGGTGGCCAAAGTGGCTTTCTCCCTTCAGGGGCTCCTGCCCAGCAGgtatattgtatctt

15801 cacacttccccttcatttgatttctctgtccagttgctggctttgattttccctggttttctgacattcctccctgcccccaacatgcacacccaaattt

MetLeuLeuProMetValAspSerGlnLeuProValValAsnPheGlySerLeuProProAlaProProProAlaProProProLeuSer 15901 cttgttacagATGCTTCTACCCATGGTAGACTCACAGCTGCCTGTGGTGAACTTTGGCTCCCTGCCGCCAGCACCACCTCCTGCCCCACCTCCCCTTTCT

LeuLeuProValGlyProAlaLeuGlnProProSerLeuAlaValArgProProProAlaProAlaThrArgValLeuProSerProAlaArgProPheP 16001 CTGTTACCTGTGGGCCCTGCTCTGCAGCCCCCCAGCCTGGCTGTGCGGCCCCCACCTGCTCCTGCTACTCGGGTGCTGCCTTCACCTGCCAGGCCCTTCC Ex. 28

roAlaSerLeuGlyArgAlaGlu 16101 CCGCTAGCTTGGGGCGAGCAGAGgtaaggtacaggaactgaggggctagggagcgccaagacttgggagtagggattctgtatttcaaggtaggcagctc

LeuHisProValGluLeuLysProPheGlnAspTyrGlnLysLeuSerSerAsnLeuGlyGlyProGlySerSerArgThr 16201 atgatttttttcccctcagCTGCATCCAGTGGAACTAAAGCCGTTCCAGGATTATCAAAAACTGAGCAGCAACCTTGGGGGACCTGGATCATCACGGACT Ex. 29 1

ProProThrGlyArg 57 16301 CCCCCAACTGGAAGgtgaaacggaatagggatgtggactttccaagtgcttccttactttggaaccagggtctggatcctaggcttgccttagacgccct BAT2 –Sequenz mit Exongrenzen und SNPs Anhang

SerPheSerGlyLeuAsnSerArgLeuLysAlaThrProSerThrTyrSerGlyValPheArgThrGlnArgValAspLeuTyrGlnG 16401 tcttcccttagGTCCTTCTCTGGCCTCAATTCCCGTCTCAAGGCCACGCCTTCCACCTACAGTGGAGTCTTCCGCACCCAGCGCGTCGACCTTTACCAGC Ex. 30

ln 16501 AGgtgaaggagaaacccttgtggccccaactctaaattcgagttgccacctgatttcctgtccttccgtctcatcgctgacctctcactgtgactcactc

Leu (SNP) AlaSerProProAspAlaLeuArgTrpIleProLysProTrpGluArgThrGlyProProProArgGluGlyProSe 16601 tttaacacatgcctgtcccctagGCCTCCCCACCAGATGCCCTGCGCTGGATACCTAAGCCTTGGGAGCGGACAGGGCCGCCACCTCGAGAAGGGCCCTC Ex. 31 CTG

rArgArgAlaGluGluProGlySerArgGlyAspLysGluProGlyLeuProProProArg*** 16701 CCGACGGGCAGAGGAGCCTGGGTCCCGAGGGGACAAGGAGCCTGGGTTGCCCCCACCCCGCTGAGGGAGTTCCTCTTGCCCCCTACCCCCGGGGCTTGTA

16801 TATAGATTATAAATATATAAGGGGGAAAGGGGTGGGCGGGGAGGGGTTGTGGGGCTGGGGCCTCACTTCCCCTCCTCCCCCTTCCCCTGGTCCCCTGTCC

16901 CTGGGGCTGTTTGTTAAAAAAGAGTAATaaaaggatttaaaaaaaaaaacttctacaatgatttgggggatgagttgtttgcattgtcttaaagcatggt

17001 gctgagtgatctgtagtttcagtcagggaaatattcattacttattccagtgagctgttgaaactaaaaacatgaccatcgtattggatctttaaatttt

17101 tgtgagtctggaatttgggctgagctcagctggataaatctgcttttttgtgccagtgagcgaggtcaactggttatcagtctgcagctgacacctgggc

17201 tggtcccaatatggcttcctttgcatatctagggccttggtgggacatctgtaacattactgggttatcaaccagtgtcttcacatggactctccagcag

17301 gcctgttaaatgtccgtgagctcatgttccaagaggtctagctggaattttctaagcttatgccatgcttagttgatagagcactaaactagccaaggta 1 17401 ggggatgggggggtttagaagggacttcaactgcatctcaaagggactagcaaagaatttgcagccatgggacttcagttctttatgatgaactaagggg 58 Anhang

BAT2 –Sequenz mit Exongrenzen und SNPs

17501 aaatctctgttaaggcctcaatgttggagcacacttaaggggctctttgaattggatagaccaattccagcattgtcaaactaagtgggatttcacatgg

17601 taacgctgcatgctagttatgctaaagactatacttaggtctgcagctgctcagaaactttttttgatgggtaatttgagagctctatgctagtgtgcac

17701 ctggaatatgctcccaactcaaaatacaggttttttatttatatataaagtgctttcgcacaaaaaatacaaacaccaggctgggcgcggtagcccacgc

17801 ctgtaattccagcactttgggaggccaaggcgggtggatcacaaggtcaggagttcgagaccagcctggccaatatggtgaaaccctgtctctactaaaa

17901 atacaaaaattagccgggcgtggtggcggacgcctgtagtcccagctactcaggaggctgaggcatgagtgagaatcacttgaacccgggaggtggaggt

18001 tgtagtgagccgagctcgagatcgggccactgcactccagcctgggagacagcaatactctgtctcaaaaaaaaaaaaaaacaaacatcaaaactggctt

18101 gtacaatttagcgtgctgagtagaacacaacagtgttccaaggaagtattaatttaaaaaagttcacacaagattaagggacacactacctaatggagac

18201 aat 1 59 Anhang – BAT3 Sequenz mit Exongrenzen und SNPs Anhang 1 cgGGCGACAGCGGTGGCGGCTCCTCGGGGTGCTCGGCTCCCTCCCACCTAGGCCGGCCCCGGCCCGACTCGCCCTCAGAAACTCACTGTTTGGGGCTGCG Ex. 1

101 GACTTTCTCGTCGTGCCCCACAAAAGTAAAGCTTGGGGACCTGGGGGGAGCCGGAAGTATCGCTTCGAGATCCCCAAATACTATCGGGGAAACGGAAGTG

201 GCCGTCGGTGGCAGGTTTGGGGGAGACCGGAAGTGACGgtccgtggggaagtcgggggcggagccgcggggtggtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtg

301 tgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtttggctgtgggttagttgtgccgttctgctggaacaccgtgggaaggcagtagacgcgggcagtcagctag

401 caggtctgtcgccccgtgagtgccgtttcgggtctatagtgagttaggagggttcgatgggcgtggcgcgcgtgcgcgaaaccactttctccgcagagtg

501 tggggcgaccaccgctttcgcgttgtcccaggattttccgacctctggggcgcttgtcctgccgtgaccggtgatgacactagtctctggtctcgtgctt

601 ccttcctaatctgactggctccctgcttattgtgattggcgtcgtggagcccctcccacctctcgtcctccagctccctaagccgtcgatctcctgccct

701 ttgtgtttctctccctgtgccccggaatcagaagggggatggggacaggtgtgaatgtgtgtgtgtgcaggagatactttttaggtattggggcagggat

MetGluProAsnAs 801 taatgctagggagtctttcgggtacactctggtctgggcaacagcgggccttccttccttcgttcttctttagAGACCTGTCGGCCATGGAGCCTAATGA

pSerThrSerThrAlaValGluGluProAspSerLeuGluValLeuValLysThrLeuAspSerGlnThrArgThrPheIleValGlyAlaGln 901 TAGTACCAGTACCGCTGTGGAGGAGCCTGACAGCTTGGAGGTGTTGGTGAAGACCTTGGACTCTCAAACTCGTACCTTTATTGTGGGGGCCCAGgtgaga Ex. 2

1001 cacctcactagttctggaagacacctttagcttttcctcgtttaggccccttagcctgagagatgagcttgattttctggtcaccagattttcttttttt

1101 ttcttttttttgagatggagtcacgccctgtcttccaggctggagtgcagtggcgcgatctcgactcactgaaacttccacctcttgggttcaagcgatt 1

1201 ttcctatctcagcctcctgagtagctgggattataggcgtgtgccactatacccagctgatttttgtatttttagtagagacggggtttcaccatgttgg 60 Anhang – BAT3 Sequenz mit Exongrenzen und SNPs Anhang

1301 tcaggctggtctcgaactccttacctcaggtgatgtgccctcctcggcctcccaaagtgctggtattacaggcatgagccaccgcacctggcctcagatt

1401 ttctttttattgatccctttgttcgtattccagtagaacgttttctgatgttttgtgagtgaggctgattttgttctgtcctccacatggatagaactta

1501 atgcagagggaaatacagaggaaggaagaatctgtgtgtcatcatcatgggtggaccccaacccaaagggacaggcatggctctggcctttgggaaggga

1601 aacagcacaggaaccctaagcaagtgtgtcttactgatagacattggtcaggtctatgctgtgtttttaaagggtagaaatcagaacccataatggagat

1701 aggtccttgatagactgttgagtgaaattactaatttttatggcatagcttgagtctcttgagcttaaagccttggacatagctatctgtgtctttactc

1801 ctgtaatacttggagacaaattgcatgtggggtggtccatggttttctaaaatgtgatattacctggatataagaaagccatatatagacttgtgattag

1901 atgtatataaatactctggtacttcccaagagtcagtttgtagttaggaaaaatatttctctttttgcttttttttttttttttgagatggagttttgct

2001 cttgttgcccaggatggagggctggggcgcaatctcagctcactgcaacctctgcctcctgggttcaagcaattttcctgcctcagcctcctgagtatct

2101 gggattacagacgacgcctactaccacgcccggctaatttttgtatttttagtagagacagggttttaccgtgttggccaggctggtcttgaactcctga

2201 cctcaggtgatccacctgcctcggcctcccaaagtgctgggattacaggtgtgagccactgtgctgggaccttttttgctttcttatcttcttagtcttt

2301 cttcattaacctgataccagaccccatcttctttgccattttttaatcttggaaatcacaggagagtctggtaaataaactggtatcatcttgtgtttgg

2401 aaaggggtcactgatgtctctagacacatactcccttggatgccagacagataatataatgtccatgtgttttttttttgtttttcatccgtgttatttt

2501 tcctggatctataacctgagcttcattaagtttatttatttaattttttgagatggagtccctctctgtcacccaggctagagtgtagtgatgcgatctc 1 61 Anhang – BAT3 Sequenz mit Exongrenzen und SNPs Anhang 2601 ggctcactgcaacctccgcctcccgaattcaagtgattctcttgcttcagcctccctagtagctgggattacaggcgaccaccatgcctggcttattttt

2701 ttgtatttttggtaaaaaaggggttttaccatgttggccaggctggtctcgaactcctgacctaatgtgatctgcctgccttggcctcccaaagtgctgg

2801 gattacaggtgtgagccaccgcgccaagccaaatttattgtctgtattttgacagctgttactttagtttaagggtttgcacagtaatgatctcacggtc

2901 aagacaaacgggtagtgattctgtggtggtttttacccctcacctccacaactcggttgtctgtctttgttcttcctctttcctccattctttccattcc

MetAsnValLysGluPheLysGluHisIleAlaAlaSerValSerIleProSerGluLysGlnArgLeuIleTyrGln 3001 tgtgcatgcctcttcttttcagATGAATGTAAAAGAGTTTAAGGAGCACATTGCTGCCTCTGTCAGCATCCCATCTGAAAAACAACGGCTCATTTACCAG Ex. 3

GlyArgValLeuGlnAspAspLysLysLeuGlnGluTyr 3101 GGACGAGTTCTGCAAGATGATAAGAAGCTTCAGGAATACAgtaagggggctggggaggcagttcagaggttggggctactgtctggagggatgaactgag

AsnValGlyGlyLysValIleHisLeuValGluArgAlaProProGl 3201 gccatgggtttacctgttcatactatgttttggtgtgtgtctatttttctgcagATGTTGGGGGAAAGGTTATCCACCTGGTGGAACGGGCTCCTCCTCA Ex. 4

nThrHisLeuProSerGlyAlaSerSerGlyThrGlySerAlaSerAlaThrHisGlyGlyGlySerProProGlyThrArgGlyProGlyAlaSerVal 3301 GACTCACCTCCCTTCTGGGGCATCTTCTGGGACGGGATCTGCCTCAGCCACTCATGGTGGGGGATCCCCCCCTGGTACTCGGGGGCCTGGGGCCTCTGTT

HisAspArgAsnAlaAsnSerTyrValMetValGlyThrPheAsnLeuPro 3401 CATGACCGGAATGCCAACAGCTATGTCATGGTTGGAACCTTCAATCTTCCTgtaagcttatgttccacaggggagggcttttgtgggtagctttggttgt

3501 ggtagcaccagggaattaataagatagatgcttccatctttagattgggttcagggggccctgtggtgtgctattggtctcagtctttaaggagaaaagg

SerAspGlySerAla 3601 aggtagggctccagggaatgaattggaggtgtggaggccttagtgttggcttctcccagaacaacttcccttaccctttccccagAGTGACGGCTCTGCT Ex. 5 1 62 Anhang – BAT3 Sequenz mit Exongrenzen und SNPs Anhang ValAspValHisIleAsnMetGluGlnAlaProIleGln 3701 GTGGATGTTCACATCAACATGGAACAGGCCCCGATTCAGgtattgaggggcctccgagggtcagggaaggggatctgggagaaggaggctgggaggtggg

Se 3801 gtggacctggctgagagatggctgggacctgatttagtaggtggtagaactcatggcttcatctgtaacctaccctgataaaccttctctcattgtagAG

rGluProArgValArgLeuValMetAlaGlnHisMetIleArgAspIleGlnThrLeuLeuSerArgMetGln 3901 TGAGCCCCGGGTACGGCTGGTGATGGCTCAGCACATGATCAGGGATATACAGACCTTACTATCCCGGATGGAGgtaagtgggcaaggctggctagggtct Ex. 6

4001 ctctccaccctccctctcccttttctctcagcctgggagttagggcttcactggccacatccacagggtttggccttcataatctagtcttctctgcagt

4101 attcattcttttgggcagaaaaagtatctttgtgaggctctctcatttctgccaatcctcttggtgcctggtatctggggagtttgtttcagacttagtc

4201 tcatggcatctcttttcaattaaaggattctactctcttaacttgtggaggctgggaaaccaacttgtggaggaaaggaaaccacaatctctactctttg

4301 ttagaaatttatttacaaatattacagatgctgtggccgggtgtggtggctcctgcctgtaatcccagcactttgggtcgccatggcagggggataacgt

4401 gtggtcaggagttccaatccagcctggccaacatggtgaaaccctgtctctactacaagtacaaaaattagttgggtgtggtggcacgcgcctgtaggcc

4501 tggctacttagaaggctgaggcaagagaatttcttgaacctgggaggcggaggttacagtgagctgagatcatgccactgcactccagcctgggcaacag

4601 agcgagactctgtctcaaaaaaaaaaaaaaaaattacagatgcttattatgcatctaatttgtgtcagtcttatgctagttgctagcgagtcggagataa

4701 aattgcagagccatgccttcagggagtctagttaggatactttctctgttcagtctcctgtagagtaatcctctgcagcagtcttaccctgcctttggta

CysArgGlyGlyProGlnProGlnHisSerGlnProProProGlnProProAlaValThrProGluProValAlaLe 4801 tcctgactctcccctaccttcagTGTCGAGGAGGGCCCCAACCGCAGCACAGTCAGCCGCCCCCGCAGCCACCGGCTGTGACCCCGGAGCCAGTAGCCTT Ex. 7 1 63 Anhang – BAT3 Sequenz mit Exongrenzen und SNPs Anhang uSerSerGlnThrSerGluProValGluSerGluAlaProProArgGluProMetGluAlaGluGluValGluGluArgAlaProAlaGlnAsnProGlu 4901 GAGCTCTCAAACGTCAGAACCAGTTGAAAGTGAAGCACCTCCCCGGGAGCCCATGGAGGCAGAAGAAGTGGAGGAGCGTGCCCCAGCCCAGAACCCGGAG

His (SNP) LeuThrProGlyProAlaProAlaGlyProThrProAlaProGluThrAsnAlaProAsn 5001 CTCACTCCTGGCCCAGCCCCAGCGGGCCCAACACCTGCCCCGGAAACAAATGCACCCAAgtgagagatggagggaatctttagtgggtggggaatcctaa CAT

5101 gtgaagtatggggagaaggaaatgaaccatggcaagggagggaaaggattacttggaggtcttagttgaagggttagcattgaggggcgaggaggggctc

5201 tctcggtataggtaaatgacgctaggacaggcagctgagaagaactgctgctctccctacggcaaggaaatccaaatggtatctcctgagcctgatcgga

5301 attctcctctgagttcacgaaggcctgctctctttcttagaattagtctttcaccattgtaggtgcaggattgtggtggggagggtgggagcagttcatt

5401 ttcttctccctatcctctcatgggtgggagtaaagaatagaagctttggctgggtgcagtggctcatgcctgtaatctcagcactttgggaggcagaggc

5501 gggcagatcacctgaggtcaggagttcgagaccagcctggccaacatggtgaaaccctgtctctactaaaaaatacaggccgggcacagtggctcacgcc

5601 tgtaatcccagcactttgggaggccgaggcgggtggatcatgaggtcaagagatcgagactatcctggctaacatgatgaaaccccgtctctactaaaaa

5701 tacaaaaaattagctgggcatggtggcgggcacctgtagtcccagctactcgggaggctgagtcaggagaatggtgtgaacccaggagacggagcttgca

5801 gtgagctgaggtcgcaccactgcactccagcctgggtgatagagcgagactctgtctcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaacaaaaattagccgggt

5901 gtggtggcaggcaacttaatcccagctacttgggaggcagaggcaggagaatcgtttgaacctgggaggcggaggttgaagagaatagaagctctgctgg

6001 tccagagaaggattgggccagggctctgggagaccagggagaaagagggcacatgtggtccctgttgactgtgagggtgggaatctgaggaaggctttgg 1 64 Anhang – BAT3 Sequenz mit Exongrenzen und SNPs Anhang HisProSerProAlaGluTyrValGluValLeuGlnGluLeuGlnArgLeuGluSerArgLeuGlnProPhe 6101 ctcattgccccttgggtttgtccacagCCATCCTTCCCCTGCGGAGTATGTCGAGGTGCTCCAGGAGCTACAGCGGCTGGAGAGTCGCCTCCAGCCCTTC Ex. 8

LeuGlnArgTyrTyrGluValLeuGlyAlaAlaAlaThrThrAspTyrAsnAsnAsn 6201 TTGCAGCGCTACTACGAGGTTCTGGGTGCTGCTGCCACCACGGACTACAATAACAATgtgagccctttgatggccctgccctttctcctcagccccagta

6301 ctcccaaaacagaacaggctgaaatacagataactctttccctccctggaaaaacattgcaacagggccaggtgcagtggctcacgcctgtaatcccagc

6401 actttgggaggccaaggtgggcggatcatctgagatcgggagtttgagaccagcctggccaacatggtgcaaccccatctctactgaaaatataaacatt

6501 agctggatgtagtggtgcacacctgtaatcccagctactcaggaggctgaggcaggagaatcgctagaactcgggaggagggggttgcagtgagccgaga

6601 ttgcactactgcactctagcctgggtgacagagcgagactgtctcaaaaaacaaaacaaaacaaaaaaacacacattgcaacaaaacaatttctctctaa

6701 acctgtaagtgattttgtcctcccttacagagaaggtgataatctttgctgtaagcactgtcctcgtatcgtaccccttgtgcccctgaatgaatttaga

6801 aaatgtaaagtacaggagatcagtatatgatgacttactgattcatagtagtgttttaataggatgttccttatgtgaataagatataatttatttgcaa

6901 agatttggtctacatgtaaacttccaaggatataactgaaagttttggaggacatggtattctcagtaggcattattgcttttattagtgagatggactc

HisGluGlyArgGluGluAspGlnArgLeuIleAsnLeuValGlyGluSerLeu 7001 cagcttgatattttctgcctttttgtgtttggctggttgtgcgcagCACGAGGGCCGGGAGGAGGATCAGCGGTTGATCAACTTGGTAGGGGAGAGCCTA

ArgLeuLeuGlyAsnThrPheValAlaLeuSerAspLeuArgCysAsnLeuAlaCysThrProProArgHisLeuHisValValArgProMetSerHisT 7101 CGACTGCTGGGCAACACCTTTGTTGCACTGTCTGACCTGCGCTGCAATCTGGCCTGCACGCCCCCACGACACCTGCATGTGGTCCGGCCTATGTCTCACT Ex. 9

yrThrThrProMetValLeuGlnGlnAlaAlaIleProIleGln 1

7201 ACACCACCCCCATGGTGCTCCAGCAGGCAGCCATTCCCATACAGgtgggttagggggagtctggcctgagggagagtgaggggtgttgatagagtgaccc 65 Anhang – BAT3 Sequenz mit Exongrenzen und SNPs Anhang

7301 agggtagctactgggcctgaaggaggttaggaaaggaggagactggaaacatggtgatgaaggctggagatactttagaggtttatcatgaggttttctt

IleAsnValGlyThrThrValThrMetThrGlyAsnGlyThrArgPro 7401 ggttaggctcttgtatttttctcacatctgcctgtccatctgtctttttcagATCAATGTGGGAACCACTGTGACCATGACAGGAAATGGGACTCGGCCC

ProProThrProAsnAlaGluAlaProProProGlyProGlyGlnAlaSerSerValAlaProSerSerThrAsnValGluSerSerAlaGluGlyAlaP 7501 CCCCCAACTCCCAATGCAGAGGCACCTCCCCCTGGTCCTGGGCAGGCCTCATCCGTGGCTCCGTCTTCTACCAATGTCGAGTCCTCAGCTGAGGGGGCTC Ex. 10

roProProGlyProAlaProProProAlaThrSerHisProArgValIleArgIleSerHisGlnSerValGluProValValMetMetHisMetAsnIl 7601 CCCCGCCAGGTCCAGCTCCCCCGCCAGCCACCAGCCACCCAAGGGTCATCCGGATTTCCCACCAGAGTGTGGAACCCGTGGTCATGATGCACATGAACAT

eGln 7701 TCAAGgtgagaatagttgctggcgagaagagcaggatcagcatgatgagggaggttcatgctgaggtgtgagggaacagggtggggaagggagaggcaca

7801 tgctggtggtggtagcctggggaccagagcagaagcttaagtagacagatgtggggggtgtgggggttggtttgtctttggaggtgtgtttgtgtggtga

7901 agggagtacctctccctgtttagatggagggaaaggcaggctttctgattgggggattatgggcctgaagtatgcctgatctcagaaggatatagttagg

AspSerGlyThrGlnProGlyGlyValProSerAlaProThrGlyProLeuGl 8001 ccttggccctacctacctcagggccactgtctctgtctccctgcccagATTCTGGCACACAGCCTGGTGGTGTTCCGAGTGCTCCCACTGGCCCCCTGGG Ex. 11

yProProGlyHisGlyGlnThrLeu 8101 ACCCCCTGGTCATGGCCAAACCCTGGgtaagagtgagggcatcagggcaggctgagctctgggtagagaaagggaagggctgagtgggtgggttgaaggg

GlySerThrLeuIleGlnLeuProSerLeuProProGluPheMetHisAlaValAlaHisGlnIl 8201 gtccaggttcaaggttacatcagacccgccccccagGCTCCACCCTCATCCAGCTGCCCTCCCTGCCCCCTGAGTTCATGCACGCCGTCGCCCACCAGAT Ex. 11B 1

eThrHisGlnAlaMetValAlaAlaValAlaSerAlaAlaAla 66 8301 CACTCATCAGGCCATGGTGGCAGCTGTTGCCTCCGCGGCCGCAGgtaatgacctggaaggggaggcttgggaggtagggcacagtccatggtggcagctg Anhang – BAT3 Sequenz mit Exongrenzen und SNPs Anhang

GlyGlnGlnValProGlyPheProThrAlaProThrArgValVal 8401 gctggcaagggcctggccctcagccctcttcggtctgtctcttctgccacccacagGACAGCAGGTGCCAGGCTTCCCAACAGCTCCAACCCGGGTGGTG Ex. 12

IleAlaArgProThrProProGlnAlaArgProSerHisProGlyGlyProProValSerGlyThrLeu 8501 ATTGCCCGGCCCACTCCTCCACAGGCTCGGCCTTCCCATCCTGGAGGGCCCCCAGTCTCTGGGACACTGgtgagcaagggtcggggagttctagtgcgta

GlnGlyAlaGlyLeuGlyThrAsnAla 8601 acagtctagggagagactcctgtggtggtgcatggaagggcaggtctgaagttctcccttgctctctatccagCAGGGCGCCGGTCTGGGTACCAATGCC Ex. 13

SerLeuAlaGlnMetValSerGlyLeuValGlyGlnLeuLeuMetGlnProValLeuVal 8701 TCGTTGGCCCAGATGGTGAGCGGCCTTGTGGGGCAGCTTCTTATGCAGCCAGTCCTTGTGGgtgagttttcattcttccccactcagagtttaaactcct

8801 ttcctagtctgctcactggcactttccagttctttccatattttcttggttcctgctttcctggaatggggctgctgtagtgtcttgtgtcttcaggttt

8901 cagctttttttttttttttgagatggagtctcactctgttgctaggctggagtgcagtgtacaatcttggctcactgcaacctctgcctcccgggttcaa

9001 gtgattctcctgcctcagcctcctgagtagctgggactacaggtgcacgccaccacgcccagctaattttttatgtttttagtagagaagggggtttcac

9101 catgttggccaggatggtctcgaactcttgaccttgtgatccacccaccttggcctcccaaagtgctgggattacaggcttgagccatcgtgcccggcca

9201 gcttttttcttttttttttaagttacagagtcttgctctgtcacccagactggagtgcagtggtgcaatccagtgagttaaagctcactgtaaccttgaa

9301 ctcctgggctcaaacagttctcccacctcagcctcctgagtagctagcagtactagctcctggctagtaattgtctttttttttttctggtagagatggg

9401 gtcttgctatgtggcctagactcctgggctcaagcagttctcatgccttggcctcccaaagttgctaggattacagccaagagccaccatgctcagccca 1 67 AlaGlnGlyThrProGlyMetAlaProProProAlaProAlaThrAlaSerAlaSerAlaGlyThrThrAsnThrA Anhang – BAT3 Sequenz mit Exongrenzen und SNPs Anhang 9501 gctttctttttttggtttcttacagCTCAGGGGACCCCAGGTATGGCTCCACCGCCAGCCCCTGCCACTGCTTCTGCCAGTGCTGGCACCACCAACACAG

laThrThrAlaGlyProAlaProGlyGlyProAlaGlnProProProThrProGlnProSerMetAlaAspLeuGlnPheSerGlnLeuLeuGlyAsnLe 9601 CTACCACAGCTGGCCCCGCTCCTGGGGGGTCTGCCCAGCCTCCACCCACCCCTCAACCCTCCATGGCTGATCTTCAGTTCTCTCAGCTTCTGGGGAACCT Ex. 14

Pro (SNP) uLeuGlyProAlaGlyProGlyAlaGlyGlySerGlyValAlaSerProThrIleThrValAlaMetProGlyValProAlaPheLeuGlnGlyMetThr 9701 GCTAGGGCCTGCAGGGCCAGGGGCTGGAGGGCCTGGTGTGGCTTCTCCCACCATCACTGTGGCGATGCCTGGTGTCCCTGCCTTTCTCCAAGGCATGACT CCC

AspPheLeuGln 9801 GACTTCTTGCAGgtgagtggctggcttgccattcacctcatcttcctgtcccccggcccagccaggcagtggtaccttcttgccattacataaccactgg

9901 gtaagagcccctagtgacatgttaggggaaggggccctgggaattcattgactctgaacctttcattttaaagatgaagaaaatgaggtttagaaaaaga

10001 aagtatagtaattagtgtcactgctttctgacaacctgttcagaggaagaggtaggtaagttgtgctgcctgactctgttaaatacctaccatacttctg

10101 ctttaagcagtgaagatcagaatgtaactccccatcttcccagacccgttggtttgtgccctcttgatgccgtattatttccgtgtgtcttcattctcac

AlaThrGlnThrAlaProProProProProProProProProProProProAlaProGluGlnGlnT 10201 ctcactttctgttctttgttctttatttgccagGCAACACAGACAGCCCCTCCACCACCCCCACCTCCTCCACCCCCACCACCTGCCCCAGAGCAGCAGA

hrMetProProProGlySerProSerGlyGlyAlaGlySerProGlyGlyLeuGlyLeuGluSerLeuSerProGluPhePheThrSerValValGlnGl 10301 CCATGCCCCCACCAGGCTCCCCTTCTGGTGGCGCAGGGAGTCCTGGAGGCCTGGGTCTTGAGAGCCTGTCACCGGAGTTTTTTACCTCAGTGGTGCAGGG Ex. 15

yValLeuSerSerLeuLeuGlySerLeuGlyAlaArgAlaGlySerSerGluSerIleAlaAlaPheIleGlnArgLeuSerGlySerSerAsnIlePhe 10401 TGTGCTCAGCTCCCTGCTGGGCTCCCTGGGGGCTCGGGCTGGCAGCAGTGAAAGTATTGCTGCCTTCATACAACGCCTCAGTGGATCCAGCAACATCTTT

GluProGlyAlaAspGlyAlaLeu 1

10501 GAGCCTGGAGCTGATGGGGCCCTTGgtgagcaaaaaggatgctttggcttgctccaggaaggggcagccagaggaatgtagatggccttggtttaggggt 68 Anhang – BAT3 Sequenz mit Exongrenzen und SNPs Anhang

GlyPhePheG 10601 attgccaaggtgggatgaggttgatgatctggttgtgggtgggcaggccaggtggtaaaggccattgctaacatctgcccttgtcccccagGATTCTTTG Ex. 16

lyAlaLeuLeuSerLeuLeuCysGlnAsnPheSerMetValAspValValMetLeuLeuHisGlyHisPheGlnProLeuGlnArgLeuGlnProGlnLe 10701 GGGCCTTGCTTTCTCTTCTGTGCCAGAACTTCTCTATGGTGGACGTAGTGATGCTTCTCCATGGGCATTTCCAGCCACTACAACGGCTCCAGCCCCAGCT

uArgSerPhePheHisGlnHisTyrLeuGlyGlyGlnGluProThrProSerAsnIleArg 10801 GCGATCCTTCTTCCACCAGCACTACCTGGGTGGTCAGGAGCCCACACCCAGTAACATCCGGgtaaatgaaggccaggggccccagaactctcctcttttg

10901 cacattttattccttatttctgactgcttctctgccaggtaaagctccaattgcccccacacaagccctggacttgttggggtcgaggtggaagtcttgg

MetAlaThrHisThrLeuIleThrGlyLeuGluGluTyrValArgGluSerPhe 11001 gaggactgaggctttgaactaaacctgttctgtttcctccacagATGGCAACCCACACATTGATCACGGGGCTAGAAGAGTATGTGCGGGAGAGTTTTgt Ex. 17

11101 gagtaacccttctctattcctttcctctcctgggtctggtcaaggcagctgcctcctccactcccagtcttatgattcttgattttgggatctttgtgtt

SerLeuValGlnValGlnProGlyValAspIleIleArgThrAsnLeuGluPheLeuGlnGluGlnPheAsnSerIleAlaAlaHi 11201 atcttgtctctcagTCCTTGGTGCAGGTTCAGCCAGGTGTGGACATCATCCGGACAAACCTGGAATTTCTCCAAGAGCAGTTTAATAGCATTGCTGCGCA Ex. 18

sValLeuHisCysThr 11301 TGTGCTGCATTGCACAGgtcaggggctggccaggcgggggcaagtggggcctgttgcatgtgcagggctgccacgtgccagcattccctccttgtatttt

AspSerGlyPheGlyAlaArgLeuLeuGluLeuCysAsnGlnGlyLeuPheGluCysLeuAlaLeuAsnLeuHisCysLeuGlyGlyGlnGln 11401 gcccacagATAGTGGATTTGGGGCCCGGTTGCTGGAGTTGTGTAACCAAGGCCTGTTTGAATGCCTGGCCCTAAACCTGCACTGCTTGGGGGGACAGCAG Ex. 19

MetGluLeuAlaAlaValIleAsnGlyArgIle 11501 ATGGAGCTTGCTGCTGTTATCAATGGCCGAATTgtaagcaccacctagccccagatccttagccttttgtttcctgaggtttccattctctgcagttttc 1 69 Anhang – BAT3 Sequenz mit Exongrenzen und SNPs Anhang Ar 11601 atttttcttttctaaactgacattctgtaacctggatctaatctatttctaaaggtggttgagggttttgtgttctaaatctgctttctgtccctcagCG

Ser (Abweichung zu NCBI-Daten) Leu (Abweichung zu NCBI-Daten) gArgMetProArgGlyValAsnProSerLeuValSerTrpLeuThrThrMetMetGlyLeuArgLeuGlnValValGlnGluHisMetProValGlyPro 11701 TCGTATGCCTCGTGGGGTGAATCCCTCCTTGGTGAGCTGGCTGACCACTATGATGGGACTGAGGCTTCAGGTGGTACAGGAGCACATGCCTGTAGGCCCT Ex. 20 CTT CTG

AspAlaIleLeuArgTyrValArgArgValGlyAspProProGln 11801 GATGCCATTCTCAGATACGTTCGCAGGGTTGGTGATCCCCCCCAGgtaagggacctgttgggcgatggggtcagggtacttgagagaactggagagatct

ProLeuProGluGluProMetGluValGlnGlyAlaGluArgAlaSerProGluProGln 11901 gagaggaagtatggtgttctttaatttcacagCCACTTCCTGAGGAGCCAATGGAAGTTCAGGGAGCAGAAAGAGCTTCCCCTGAGCCTCAGgtactcta Ex. 21

12001 gagagggggaggttgaggggccagataatgtggagtggagggctgggggagaaaggtttggaggctaaaaattctgaagcctggctcttcccgccatctg

ArgGluAsnAlaSerProAlaProGlyThrThrAlaGluGluAlaMetSerArgGlyProProProAlaProGluGlyGlySerArgAspGl 12101 acacccagCGGGAGAATGCTTCCCCAGCCCCTGGAACAACAGCAGAAGAGGCCATGTCCCGAGGTCCACCTCCTGCTCCTGAGGGGGGCTCCCGGGATGA Ex. 22

uGlnAspGlyAlaSerAlaGluThrGluProTrpAlaAlaAlaValProPro 12201 ACAGGATGGAGCTTCAGCTGAGACAGAACCTTGGGCAGCTGCAGTCCCCCCAgtaagtgtcaggaagtaatccagtgggtcatggcagctgaaagtcaag

GluTrpValProIleIleGlnGlnAspIleGlnSerGlnArgLysValLysProGlnProProLeuSerA 12301 gacattactattttctcttttcctccccagGAATGGGTCCCTATTATCCAGCAGGACATTCAGAGCCAGCGGAAGGTGAAACCGCAGCCCCCTCTGAGTG Ex. 23

spAlaTyrLeuSerGlyMetProAlaLysArgArgLys 12401 ATGCCTACCTCAGTGGTATGCCTGCCAAGAGACGCAAGgttggttttcctcttccctaagcctctctctctatccaggtttccccgtcatgcctggaatc

12501 aaactatgtagagatggtgggagctcttgttattcagtctcccctcccctcgtttaatgaggaaactttttctgggattcagacttgctcttggttgttg 1 70 Anhang – BAT3 Sequenz mit Exongrenzen und SNPs Anhang 12601 cataaccatacaggacttgaccttagtctgtttgctagcagtcctgtattagttgctcagctgcctaatccccatgtgcttagatcccattttcctttaa

12701 ggtgggtttcctcttgtggattacctagctctgaatcccggatggcttgaccccttctgcctttcgttttgaagagcacgttcaagcacattcactttag

12801 ttttggctagtgccaaagagaattaggaaggcatttctgctgtaaaaaccacatcctggactcttaatttcccctctctccactagcatggagactcagt

ThrMetGlnG 12901 ggagtggttgactcatggaaagggtgagccggatggtggcactggatctgacgttgatcctcttttccctcccaaccccctgtcccccagACGATGCAGG

lyGluGlyProGlnLeuLeuLeuSerGluAlaValSerArgAlaAlaLysAlaAlaGlyAlaArgProLeuThrSerProGluSerLeuSerArgAspLe 13001 GTGAGGGCCCCCAGCTGCTTCTCTCAGAGGCTGTGAGCCGGGCAGCTAAGGCAGCCGGAGCTCGGCCCCTGACGAGCCCCGAGAGCCTGAGCCGGGACCT Ex. 24

uGluAlaProGluValGlnGluSerTyrArgGlnGln 13101 GGAGGCACCAGAGGTTCAGGAGAGCTACAGGCAGCAGgtgccaccttgaagcagaatagggatggtctagtgggaggggttgggctagggtccctcttcc

13201 ctggatcccttcagcgatgaactggtcagcctggtgctaccatttgttttcccctttggcatctgggaaggcttgacagtgccaccccgggctatttgac

13301 agtgtgcttggggggggaaatgttagcttctgagggatggccttgtgtgcttgctgggatcatagggacttggccagcgtttctccaacctgcttacttt

Gly (SNP) LeuArgSerAspIleGlnLysArgLeuGlnGluAspProAsnTyrSerProGlnArgPheProAsnAlaGlnArgAlaPheAlaAspAsp 13401 ttctctttagCTCCGGTCTGATATACAAAAACGACTGCAGGAAGACCCCAACTACAGTCCCCAGCGCTTCCCCAATGCCCAGCGGGCCTTTGCTGATGAT Ex. 25 GGC

Pro*** 13501 CCTTAGCTCTTTGCTCTATGGCCCTTCCTCATCAGGGGACCGTTTCCCCCCTCTTCCTTCACAGTATTTAAGAAATAAAAGTCGGATTTTTCTGGCtgct

13601 ttctctctacattgtctccattaggtagtgtgtcccttaatcttgtgtgaacttttttaaattaatacttccttggaacactgttgtgttctactcagca 1 71 Anhang – BAT3 Sequenz mit Exongrenzen und SNPs Anhang 13701 cgctaaattgtacaagccagttttgatgtttgtttttttttttttttgagacagagtattgctgtctcccaggctggagtgcagtggcccgatctcgagc

13801 tcggctcactacaacctccacctcccgggttcaagtgattctcactcatgcctcagcctcctgagtagctgggactacaggcgtccgccaccacgcccgg

13901 ctaatttttgtatttttagtagagacagggtttcaccatattggccaggctggtctcgaactcctgaccttgtgatccacccgccttggcctcccaaagt

14001 gctggaattacaggcgtgggctaccgcgcccagcctggtgtttgtattttttgtgcgaaagcactttatatataaataaaaaacctgtattttgagttgg

14101 gagcatattccaggtgcacactagcatagagctctcaaattacccatcaaaaaaagtttctgagcagctgcagacctaagtatagtctttagcataacta

14201 gcatgcagcgttaccatgtgaaatcccacttagtttgacaatgctggaattggtctatccaattcaaagagccccttaagtgtgctccaacattgaggcc

14301 ttaacagagatttccccttagttcatcataaagaactgaagtcccatggctgcaaattctttgctagtccctttgagatgcagttgaagtcccttctaaa

14401 cccccccatcccctaccttggctagtttagtgctctatcaactaagcatggcataagcttagaaaattccagctagacctcttggaacatgagctcacgg

14501 acatttaacaggcctgctggagagtccatgtgaagacactggttgataacccagtaatgttacagatgtcccaccaaggccctagatatgcaaaggaagc

14601 catattgggaccagcccaggtgtcagctgcagactgataaccagttgacctcgctcactggcacaaaaaagcagatttatccagctgagctcagcccaaa

14701 ttccagactcacaaaaatttaaagatccaatacgatggtcatgtttttagtttcaacagctcactggaataagtaatgaatatttccctgactgaaacta

14801 cagatcactcagcaccatgctttaagacaatgcaaacaactcatcccccaaatcattgtagaagtttttttttttaaatcctttt 1 72 Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Juni 1997 bis Dezember 2002 unter Anleitung von Prof. Dr. Norbert Koch am Institut für molekulare Physiologie und Entwicklungsbiologie der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn, Abteilung Immunbiologie angefertigt. Sie wurde vom Graduiertenkolleg Funktionelle Proteindomänen und über den Sonderforschungsbereich 284 gefördert.

Danksagung

Herrn Prof. Dr. N. Koch danke ich für die Möglichkeit, diese Promotionsarbeit in seinem Institut durchführen zu können, für sein stetes Interesse am Fortgang dieser Arbeit und für die mir gewährte Unterstützung.

Herrn Prof. Dr. K.-H. Scheidtmann danke ich für die Übernahme der Koreferenz der vorliegenden Arbeit.

Ich danke allen jetzigen und ehemaligen Mitarbeitern der Abteilung Immunbiologie für ihre Hilfe und Unterstützung während meiner Arbeit und für die freundliche Arbeitsatmosphäre. Mein besonderer Dank gilt Angelika König und Dr. G. Keresztes für ihre wertvollen Rat- schläge und Hilfestellungen.

Herrn Prof. Dr. J. Höhfeld und seiner Arbeitsgruppe, insbesondere Britta Westhoff, danke ich für anregende wissenschaftliche Diskussionen und Anleitung bei der Durchführung der Proteinabbauassays.

Der Abteilung für Molekulare Genetik der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität danke ich für die Bereitstellung des Isotopen- und Photolabors.

Der Abteilung Biochemie des Instituts für Organische und Biochemie (Abt. Prof. Dr. K. Sandhoff) danke ich für die Benutzung des Phosphorimagers.

Andreas Hentsch danke ich für Ihre aufmerksame Durchsicht des Manuskripts.

Ich danke meinen Eltern, die mir in allen Phasen meiner Arbeit, auch und besonders in der Abschlussphase, stets aufmunternd und voller Geduld und Hilfsbereitschaft zur Seite standen.. Ich versichere, dass ich die von mir vorgelegte Dissertation selbstständig und ohne unzulässige Hilfe angefertigt, die benutzten Quellen und Hilfsmittel vollständig angegeben und die Stellen der Arbeit - einschließlich Tabellen und Abbildungen - , die anderen Werken im Wortlaut oder dem Sinn nach entnommen sind, in jedem Einzelfall als Entlehnung kenntlich gemacht habe; dass die Dissertation noch keiner anderen Fakultät zur Prüfung vorgelegen hat; dass sie, abgesehen von der unten angegebenen zur Veröffentlichung eingereichten Teilpublikation, noch nicht vollständig veröffentlicht worden ist, sowie dass ich eine solche Veröffentlichung vor Abschluss des Promotionsverfahrens nicht vornehmen werde. Die Bestimmungen der geltenden Promotionsordnung sind mir bekannt.