Charakterisierung und Expression der MHC-kodierten BAT2- und BAT3-Gene Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades (Dr. rer. nat.) der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn vorgelegt von Johannes Winkler aus Bonn Bonn (Juni) 2003 i 1 Einleitung............................................................................................................1 1.1 Der Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) .................................................1 1.1.1 Der MHC Klasse I-Bereich................................................................................. 4 1.1.2 Der MHC Klasse II-Bereich ............................................................................... 6 1.1.3 Der MHC Klasse III-Bereich.............................................................................. 6 1.2 BAT2.................................................................................................................13 1.3 BAT3.................................................................................................................14 1.4 Zielsetzung der Arbeit.......................................................................................18 2 Material und Methoden.....................................................................................19 2.1 Geräte................................................................................................................19 2.2 Verbrauchsmaterialien ......................................................................................20 2.2.1 E.coli-Bakterienstämme.................................................................................... 22 2.2.2 Zelllinien........................................................................................................... 23 2.2.3 Antikörper......................................................................................................... 23 2.2.4 Peptide...............................................................................................................24 2.2.5 Oligonukleotide ................................................................................................ 24 2.2.6 Crosslinker........................................................................................................ 26 2.2.7 Tierstämme ....................................................................................................... 26 2.3 Methoden ..........................................................................................................27 2.3.1 Zellkultur .......................................................................................................... 27 2.3.2 Bakterienkultur ................................................................................................. 27 2.3.3 Isolierung von RNA aus eukaryontischen Zellen............................................. 27 2.3.4 Northern Blot .................................................................................................... 27 2.3.5 Multiple Tissue Expression-Array (MTE)........................................................ 28 2.3.6 In-situ-Hybridisierung ...................................................................................... 29 2.3.7 Reverse Transkription....................................................................................... 30 2.3.8 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ................................................................... 30 2.3.9 Rapid amplification of cDNA ends (RACE) ....................................................30 2.3.10 Bestimmung einer DNA-Sequenz durch Sequenzierung.................................. 31 2.3.11 Isolierung von Plasmid-DNA aus E.coli........................................................... 31 2.3.12 Restriktionsverdau ............................................................................................ 32 2.3.13 Agarosegelektrophorese und Elution von DNA aus Agarosegelen.....................................................................................................32 2.3.14 Klonierung von DNA-Fragmenten ................................................................... 33 ii 2.3.15 Klonierung von Oligonukleotiden .................................................................... 33 2.3.16 Klonierung von PCR-Produkten durch TOPO-Klonierung.............................. 34 2.3.17 Identifikation rekombinanter Klone durch Kolonie-PCR................................. 34 2.3.18 Ortsspezifische Mutagenese (Site-directed mutagenesis)................................. 35 2.3.19 Expression rekombinanter Proteine in E. coli .................................................. 35 2.3.20 Affinitätsreinigung rekombinanter GST-Fusionsproteine................................ 36 2.3.21 Kopplung von Peptiden an Trägerproteine....................................................... 37 2.3.22 Herstellung von Antiseren in Kaninchen.......................................................... 37 2.3.23 ELISA zur Bestimmung des Antikörpertiters................................................... 38 2.3.24 Affinitätsreinigung von Antikörpern ................................................................ 38 2.3.25 Transiente Proteinexpression in eukaryontischen Zellen ................................. 39 2.3.26 Stabile Proteinexpression in eukaryontischen Zellen ....................................... 39 2.3.27 Metabolische Markierung von eukaryontischen Zellen.................................... 40 2.3.28 Herstellung von Zelllysaten.............................................................................. 40 2.3.29 Immunpräzipitation........................................................................................... 40 2.3.30 Reduzierende SDS-PAGE ................................................................................ 41 2.3.31 Nachweis von Proteinen im SDS-PAGE-Gel...................................................41 2.3.32 Fluorographie.................................................................................................... 41 2.3.33 Western Blot .....................................................................................................42 2.3.34 Immunfluoreszenz ............................................................................................ 42 2.3.35 In-vitro-Transkription/Translation.................................................................... 43 3 Ergebnisse.........................................................................................................44 3.1 Molekularbiologie von BAT2...........................................................................44 3.1.1 Bestimmung der humanen BAT2-cDNA-Sequenz........................................... 44 3.1.2 Bestimmung des Transkriptionsstarts von BAT2 durch 5’-RACE .................. 46 3.1.3 Bestimmung der Genorganisation von BAT2 .................................................. 47 3.1.4 Sequenzanalyse der humanen BAT2-cDNA .................................................... 47 3.1.5 Sequenzvergleiche mit anderen Spezies........................................................... 54 3.1.6 BAT2-verwandte Sequenzen ............................................................................ 54 3.1.7 Zusammensetzen eines vollständigen BAT2 cDNA-Klons.............................. 60 3.1.8 Herstellung rekombinanter GST-BAT2-Fusionsproteine................................. 61 3.1.9 Immunisierung von Kaninchen mit GST-Fusionsproteinen und BAT2- abgeleiteten Peptiden ........................................................................................64 3.1.10 Aufreinigung der BAT2-Antiseren................................................................... 66 iii 3.2 Molekularbiologie von BAT3...........................................................................74 3.2.1 Klonierung und Sequenzierung einer BAT3-cDNA......................................... 74 3.2.2 Sequenzanalyse der BAT3-cDNA.................................................................... 79 3.2.3 Sequenzvergleich der BAT3-cDNA mit anderen Spezies................................ 83 3.2.4 BAT3-verwandte Sequenzen ............................................................................ 83 3.3 Gewebeverteilung der BAT2- und BAT3-mRNA............................................83 3.4 Proteinbiochemische Ergebnisse ......................................................................92 3.4.1 Expression von BAT2 in eukaryontischen Zellen ............................................ 92 3.4.2 Expression und Detektion von BAT3 in COS7-Zellen .................................... 95 3.4.3 Subzelluläre Fraktionierung zur Lokalisierung der BAT-Proteine in transfizierten Zellen ..........................................................................................96 3.4.4 Immunfluoreszenz mit transient transfizierten Zellen...................................... 96 3.4.5 Einfluss von BAT2 und BAT3 auf die proteasomale Degradation des Glukokortikoidrezeptors ...................................................................................99 3.5 Second Mitochondrial Activator of Caspases (Smac) ......................................99 3.5.1 Klonierung einer Smac-cDNA........................................................................ 101 3.5.2 Expression in eukaryontischen Zellen ............................................................ 102 3.5.3 Koexpression von Smac mit BAT3 ................................................................ 102 4 Diskussion.......................................................................................................104