CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DEL GEN 16S EN LA ESPECIE Atractus crassicaudatus Y ANÁLISIS DE LA RELACIÓN FILOGENÉTICA DEL GÉNERO Atractus (Serpentes: Dipsadidae)
MARÍA CAMILA GÓMEZ ÁVILA LUIS ALEJANDRO YATE SÁNCHEZ
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN BIOLOGÍA BOGOTA D.C. 2019
CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DEL GEN 16S EN LA ESPECIE Atractus crassicaudatus Y ANÁLISIS DE LA RELACIÓN FILOGENÉTICA DEL GÉNERO Atractus (Serpentes: Dipsadidae)
MARÍA CAMILA GÓMEZ ÁVILA LUIS ALEJANDRO YATE SÁNCHEZ
Proyecto de Trabajo de Grado para optar al título de Licenciado en Biología
Dr. LUIS FRANCISCO BECERRA GALINDO Licenciado en Biología. Msc. Ciencias Biológicas. Grupo de investigación: Biología molecular BIOMOL Director
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN BIOLOGÍA BOGOTA D.C. 2019
2
Nota de la Universidad
―La universidad no se hace responsable de las ideas, ni del contenido del presente trabajo, debido a que estas hacen parte única y exclusivamente de los autores‖.
Capítulo XV, Artículo 117, Acuerdo NÚMERO 029 DE 1988 del Consejo Superior de la
Universidad Distrital Francisco José de Calda
3
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a la Universidad Distrital Francisco José de Caldas nuestra alma mater, al proyecto Curricular de Licenciatura en Biología, por ser pilares en la construcción de esta investigación. De nuestra formación como Docentes, profesionales enfocados en la enseñanza e investigación, sujetos en pro al desarrollo de conocimientos que puedan implementarse y generen cambios significativos en sociedades futuras.
4 Al finalizar este trabajo de grado y pese a las dificultades inevitables de una investigación, es de suma importancia reconocer que sin la participación de personas e instituciones que contribuyan en la construcción de este, no sería posible culminar la tesis. Por lo cual quiero expresar mis agradecimientos más profundos.
Gracias infinitas a la mujer de mi vida, mi mamá Aurora Angélica del Carmen, por ser un ejemplo de lucha, por enseñarme que el amor que se otorga viene de la mano con sabias palabras, sus palabras me enseñaron que sin importar los momentos de tribulación o los momentos en los que las fuerzas se comienzan agotar, el cuerpo se niega andar, el alma sucumbe ante la aflicción y se vive en sombras, siempre existe la esperanza de ver la vida más allá de una ausencia de color o una absorción de todos ellos, la vida es la percepción visual que se decida usar llena de múltiples posibilidades que pueden generen cambios significativos. A mi hermano Roy Alejandro por enseñarme que la paciencia es necesaria y una virtud de pocos, que sin importar lo complejo que sea el camino siempre puede encontrase una solución en diversas proposiciones. A mi viejo, mi querido viejo, desde cualquier lugar del universo seguirá inspirándome siendo el capitán de este navío, este
Título siempre será por ti y para ti!.
A mi querida amiga Alejandra Beltrán que sin su mano amiga que siempre están para levantarme ante alguna caída, a sus palabras llenas de cariño y conocimiento que te hacen ver y sentir la vida en una forma extensa así como los multiversos.
A mi compañero Luis Alejandro por ser un cimiento ante los momentos de adversidad durante este proyecto. Gracias por persistir y creer en nuestra investigación.
Camila Avila.
5 La formación profesional y personal que he vivido los últimos años no habría sido posible sin los aportes de un gran número de personas que han creido en mí y en este proyecto de vida, les ruego que me perdonen si su nombre se me escapa en estas cortas líneas, se que en su espíritu vive la satisfacción de haber sido esa ayuda, guía, apoyo y comprensión en cada una de las trivialidades que representa una formación profesional y el desarrollo del presente proyecto de investigación.
Quiero agradecer a mis padres, Patricia y Luis por su inmensa paciencia, por su apoyo económico, por sus regaños, por su atención y en general por su crianza, en la cual he aprendido que vale la pena luchar por ser cada dia mejor y que todo buen proceder tiene su recompensa, deseo que esta meta que se culmina con esta tesis los llene de orgullo y sirva como medio de pago para la deuda que tengo con ustedes, la deuda de la vida. A Gabriel por ser el motor de la inspiración para embaracar este viaje, este triunfo es por ti. A las personas maravillosas que conoci en todo este proceso, a Sandra Rios por ser esa ayuda divina en el momento más difícil de mi vida y mi carrera, a Andres Berbeo por su amistad incondicional y por enseñarme que con disciplina todo es posible. A Diego, David, Matias,
Sergio, Cristian y Julián, gracias por las grandes anécdotas, siempre recordare las vivencias con nostalgia. A mi compañera Camila Avila, por luchar junto conmigo en el difícil camino de la investigación. A Angie por los bonitos recuerdos de estos últimos años en la universidad y el lugar que siempre tendrá en mi corazón. Finalmente a la Universidad
Distrital Francisco José de Caldas, mi gloriosa UD, Por ser la institución que transformo mi vida, por ser mi segundo hogar, por hacer parte de los mejores años de mi vida, gracias,
¡MUCHAS GRACIAS!
Alejandro Yate
6 RESUMEN
Actualmente Colombia cuenta con alrededor de 270 especies de serpientes, cerca de un 8% de la diversidad mundial de este grupo, con una amplia distribución sobre el territorio nacional, exceptuando la costa Caribe y alturas mayores a los 3.500m, estos animales cumplen papeles fundamentales en los ecosistemas, sin embargo es importante efectuar cambios en las concepciones de estudios de la ofidiofauna colombiana y contribuir en investigaciones que representen un enfoque genético. El objetivo principal de esta investigación fue secuenciar un segmento del gen 16s mtDNA de la especie Atractus crassicaudatus y construir mediante análisis bioinformáticas las posibles relaciones filogenéticas con el género Atractus, esto tras el estudio de la secuencia obtenida junto con
29 secuencias de ADN, recuperadas de la base de datos genómica Genbank. Como resultado se obtuvo una secuencia de 364 pb, con un total de 3 regiones conservadas en 65 posiciones, además se propone la construcción de un árbol filogenético del género. Lo anterior permite inferir cercanía filogenética con especies descritas para el sur de Colombia y Ecuador. Estos resultados constituyen un aporte al conocimiento molecular de las especies colombianas, al ser la primer descripción de un gen para Atractus crassicaudatus, lo que a su vez ofrece una aproximación a la resolución del interrogante de las relaciones filogenéticas dentro del género perteneciente a la familia Colubridae.
Palabras claves: Serpientes, Atractus, secuencias, molecular, máxima verosimilitud.
7
ABSTRACT
Currently Colombia has around 270 species of snakes, about 8% of the world's diversity of this group, with a wide distribution over the national territory, except the Caribbean coast and heights greater than 3,500m, these animals fulfill fundamental roles In ecosystems, however, it is important to make changes in the conceptions of Colombian ophidian studies and contribute to research that represents a genetic approach. The main objective of this investigation was to sequence a segment of the 16s mtDNA gene of the species Atractus crassicaudatus and to construct by bioinformatic analysis the possible phylogenetic relationships with the genus Atractus, this after the analysis of the sequence obtained together with 29 DNA sequences recovered from the genbank Genbank database. As a result, a sequence of 364 bp was obtained, with a total of 3 regions conserved in 65 positions. It is also proposed the construction of a phylogenetic tree of the genus, which allows inferring phylogenetic proximity with species described for southern Colombia and
Ecuador. These results constitute a contribution to the molecular knowledge of Colombian species, being the first description of a gene for Atractus crassicaudatus, which in turn offers an approach to the resolution of the question of phylogenetic relationships within the genus belonging to the Colubridae family.
Keywords: Snakes, Atractus, sequences, molecular, maximum likelihood.
8 ÍNDICE DE CONTENIDO
RESUMEN………………………………………………………………….….…VII
ABSTRACT…………………………………………………………………..… VIII
ÍNDICE DE CONTENIDO …………………………… …………………….…...IX
LISTA DE FIGURAS……………………………… …………………..…….....XIII
LISTA DE TABLAS………………………………………………………...……XV
LISTA DE ANEXOS ….………………………………………………………...XVI
Pag.
INTRODUCCIÓN....…………………………………………………………………17
1.PLANTEAMIENT ..…….……………...... 19
1.1 DESCRIPCIÓN DEL PROBLEMA………………………… …….…...……....19
1.1.2 PREGUNTA PROBLEMA……………………… …………………...……....20
1.1.2 HIPOTESIS…………………………………………………………………….20
1.3JUSTIFICACIÓN…………………………………………………….…...…...…..21
1.4OBJETIVOS………………………………………………………………………..23
9 2. MARCO TEÓRICO……………………………………………………...……...... 24
2.1 ANTECEDENTES ……………………………………………………………...... 24
2.2GENERALIDADES DE ATRACTUS CRASSICAUDATUS……………..…...... 27
2.3TAXONOMÍA…………………………………………… ……….…….……….29
2.4 GENBANK……………………………………………… ………………… …...31
2.5MARCADORES MOLECULARES………………………………………….. ...32
2.6GEN 16S …………………………………………..…………..…………..………..34
2.7 HOMOLOGÍA DE SECUENCIAS …………………………………….… …...... 35
2.8 ALINEAMIENTOS ………………………………………………………...... 35
2.9ALINEAMIENTOS MÚLTIPLES………………………………………….. …....36
2.10DISTANCIA GENÉTICA ………………….……..…………………..…… …..36
2.11 ESTIMACIÓN DE ÁRBOLES FILOGENÉTICOS ………………………..…37
2.12 ÁRBOL CONSENSO………………………………………………………...…37
3. MATERIALES Y MÉTODOS…………………...……………………………….39
3.1FASE DE CAMPO ……………………………………………………………….39
3.1.1 UBICACIÓN DEL ÁREA………………………………………..……………..39
3.1.2 DESCRIPCIÓN DE ÁREA DE COLECTA……………………………………40
10 3.1.3 DESCRIPCIÓN DE INDIVIDUOS CAPTURADOS …………………………40
3.2FASE DE LABORATORIO ……………………………………………………41
3.2.1 ÁREA DE LABORATORIO……………………..……………………………41
3.2.2 EQUIPOS Y REACTIVOS ……………...……………………………………41
4. PROCEDIMIENTOS ……………………………………………………………43
4.1 PROTOCOLO DE DISECCIÓN…………………………………………………43
4.2PROTOCOLO DE ESTANDARIZACIÓN EXTRACCIÓN ADN Y
CUANTIFICACIÓN………………...... 45
4.3 PROTOCOLO EXTRACCIÓN mt DNA BAENA. PROTOCOLO EXTRACCIÓN
MT DNA A PARTIR DE MUESTRAS DE TEJIDO ( HÍGADO, CORAZÓN,
RIÑÓN)……………………………….…..…………………………………………46.
4.4 PROTOCOLO CONDICIONES DE LA ESTANDARIZACIÓN PARA
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) …………………….……..…….47
4.4.1 CURVAS DE CLORURO DE MAGNESIO……………………………………48
4.4.2 CONCENTRACIÓN DE PRIMER´S……………………………………………...... 49
4.4.3 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA ( PCR)………………… 50
11 4.5 PROTOCOLO PARA ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA AL
1%...... 50
4.6 PROCESO DE SECUENCIAS……………………………………………...….…51
4.7 ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO -...... ……………………………….…51
4.7.1 ALINEAMIENTOS MÚLTIPLES……………………………………………54
4.7.2 MODELO EVOLUTIVO…………………………………………………...... 55
4.7.3 ÁRBOL FILOGENÉTICO……………………………………………………55
5.RESULTADOS Y DISCUSIÓN……………………………………………… .57
5.1 CUANTIFICACIONES DE MUESTRAS DE ADN EXTRAÍDO ………….…..57
5.2 CUANTIFICACIONES DE DILUCIONES DE ADN PARA PCR………………59
5.3REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA ……………………………60
5.4SECUENCIACIÓN DEL GEN 16S………………………………………………61
5.5DISTANCIAS GENETICAS……………………………………… ……………62
5.6ANÁLISIS FILOGENÉTICO……………………………………………………...67
6. CONCLUSIONES…………………………………………………………….....71
12 7. RECOMENDACIONES………………………………………………………..73
8. ANEXOS ………………………………………………………………………...74
9. BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………...... 87
13
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Imagen tomada de GOOGLE MAPS de ubicación geográfica del Parque
Ecológico Cantarrana……………………………………………………………………....39
Figura 2. Imagen satelital del Parque Ecológico Cantarrana, encerrada en una figura azul el
área exacta de trabajo………………………………………………………………………40
Figura 3. Fotografía de especímenes de Atractus con longitud de 17cm………….….....41
Figura 4. Escamas del espécimen dorsales y ventrales…………………………….……43
Figura 5.En la imagen se observa tejido epitelial, tejido muscular y órganos cubiertos por mesenterio…………………………………………………………………………….…... 43
Figura 6. Se observa epitelio escamoso, una capa muscular y la columna vertebral….…44
Figura 7. La imagen muestra Intestino grueso………………………………………..….44
Figura 8. Debido al desarrollo morfológico de las serpientes se observa una bolsa alargada de color claro corresponde al pulmón más desarrollado, el hígado de un color más oscuro y el corazón ………………………………………………………………………………….45
Figura 9. Termociclador THERMO SCIENTIFIC® Esco Swift Max Pro para ajustar las condiciones de temperatura y tiempo de la PCR…………………………………………..47
Figura 10 . Fragmento del gen 16s secuenciado…………………………………………..62
Figura 11. En el gráfico de barras se observa la distancia genética de las diferentes especies del género Atractus y del outgroup en relación al gen 16S , se emplea el algoritmo filogenético UPGMA para su análisis. …………………………………………………….63
14 Figura 12. Topología de filogenia molecular de 30 especies del género Atractus y el outgroup (Sibon nebulata), el árbol es inferido con el método de máxima verosimilitud, modelo GTR. ………………………………………………………………………...69
15 LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Taxonomía de la especie Atractus crassicaudatus…………………………………31
Tabla 2. Relación de marcadores moleculares teóricos tomados de artículos publicados…………………………………………………………………………………34
Tabla 3. Concentración y volumen para la elaboración de la PCR para un MIX de 4 tubos
Nota: tomado de ―Guía práctica sobre la técnica de PCR,‖ L. Espinosa, 2009, Ecología
Molecular, p. 525………………………………………………………………………..…48
Tabla 4. Relación de la concentración y volumen del MgCl2 para la mezcla maestra de la
PCR……………………………………………………………………………………………………49
Tabla5. Matriz de voucher y números de accesos del GenBank…………………………..52
Tabla 6. Concentración de la muestra de ADN en longitud de onda de 260nm y relación de la absorbancia(grado de pureza) medido en A260/280 y A260/230……………………….58
Tabla 7. Cuantificación concentración inicial de extracción de ADN y concentración final con diluciones………………………………………………………………………………59
Tabla 8. Información de concentración de muestras enviadas a Macrogen Korea®..61
Tabla 9. Matriz de distancias genéticas usando el gen 16S………………………………64
Tabla 10. En la matriz se analiza la relación 8 especies pertenecientes a los dos nodos principales marcados en la figura del árbol………………………………………….…..70
16 LISTA DE ANEXOS
Anexo 1. Procedimiento para la elaboración de electroforesis…………………………..74
Anexo 2. Grafica de cuantificaciones……………………………………………………..75
Anexo3. Alineaciones de las secuencias del género Atractus y un Outgroup (Sibon
Nebulata), la alineación se realiza con el software ClustalX………………………………76
Anexo 4. En las siguientes dos tablas se observan las secuencias obtenidas a partir de las muestras de tejido tomadas de los especímenes del género Atractus (H:Hígado,
M:Músculo, R:Riñón)...... 77
Anexo5. A continuación se realiza la descripción de características generales de cada especie consultada en la investigación. Se consigna Autor y fecha de descripción……....79
17 INTRODUCCIÓN
Atractus es un género perteneciente a la familia Colubridae (Oppel, 1811), que cuenta con una amplia distribución neotropical de gran abundancia en Sudamérica y parte de
Centroamérica, este grupo taxonómico cuenta con una dispersión abundante, es así que se reportan avistamientos desde el Norte de la República Argentina con representantes como,
A. paraguayensis, A. reticulatus y A. taeniatus, hasta el Noroccidente de Panamá
(Myers,2003) con especies tales como, A. darienensis, A. hostilitractus, A. imperfectus, A. depressiocellus y A. clarki. Para Colombia, se describe la presencia de especies del género a lo largo de la cordillera de los Andes (Lynch, 2012). El género Atractus se caracteriza por sus hábitos fosoriales o semi fosoriales, su alimentación es a base de pequeños artrópodos y otros invertebrados como lombrices (Fraga, 2017), su dentición es aglifa, es decir carecen de glándulas y conductos de inoculación de veneno (Sierra, 2011).
A pesar de la abundancia en estudios de este género enfocados en características de distribución, ecología y morfología, las investigaciones donde el objetivo de desarrollo está centrado en análisis genéticos son escasos, teniendo apenas unas cuantas publicaciones en los últimos años con investigaciones como las de Oliveira y Fernández (2016), Arteaga et al. (2017) y Mejía (2018), Anterior a dichas publicaciones se datan estudios de Vidal et al.
(2000) y Zaher et al. (2009). A pesar de los esfuerzos de dichos autores, las contribuciones al conocimiento genético del género solo presentan soluciones parciales a los interrogantes como la composición genética de las especies y las relaciones filogenéticas que estas puedan tener.
18 Posso (2013) menciona que en las últimas décadas se ha expresado un auge exponencial en estudios moleculares, en este sentido la presente investigación ofrece una aproximación al conocimiento molecular de la especie Atractus crassicaudatus y el género Atractus, centrándose en el uso de diferentes metodologías del laboratorio de biología molecular, que permitan la extracción, cuantificación, amplificación y secuenciación de un fragmento del gen 16s de ADN mitocondrial, el cual abre espacios a la elaboración de análisis de construcciones filogenéticas con las cuales se puede fundamentar, identificar y reconocer las posibles relaciones evolutivas de la especie, con base en la variabilidad genética que exhiben regiones del gen en comparación con secuencias disponibles de organismos pertenecientes al género y con ayuda de software especializado que permiten el modelamiento de los datos, mediante el uso de algoritmos bioinformáticos, donde se realiza la comparación de secuencias de ADN, lo que se convierte en un paso más encaminado a comprender la estructura, función y organización del código genético de la especie, así como la construcción y la conservación de bases de datos biológicas. (Escobar,
2011).
19 1. PLANTEAMIENTO
1.1 DESCRIPCIÓN DEL PROBLEMA
La serpiente Atractus crassicaudatus (Dumeril y Dibron, 1854), o serpiente sabanera, conocida comúnmente bajo este nombre, fue clasificada en el género Atractus por
Boulenger (1894). En la actualidad los estudios para dicha especie están centrados en aspectos ecológicos y biológicos, A pesar de los grandes avances en estudios de biología molecular en el país, esta especie no presenta investigaciones en el campo de la genética molecular. Si bien, en la actualidad se evidencian los avances en investigaciones en el campo de las relaciones filogenéticas en las diferentes especies de reptiles, es conveniente mencionar que a pesar de esto, no es amplia la información consignada en bases de datos genómicas, para interés particular, en secuencias genéticas del género Atractus, que permitan esclarecer las historias evolutivas de este grupo.
Partiendo de la premisa anterior, la investigación corresponde a un estudio de secuencias particulares de ADN. Por medio de la amplificación y secuenciación de un fragmento del gen 16s mtDNA, en el cual la información genética reduce considerablemente la tasa de mutaciones y recombinaciones, es así que mediante protocolos de disección de material biológico de tejidos cardíaco, muscular y conectivo, se extrajo material genético mediante método Salting Out, por el cual se obtuvo ADN mitocondrial, el cual se cuantificó para su posterior amplificación por PCR, para analizar fragmentos de pares de bases (pb).
20 Se plantea la necesidad de secuenciar el gen 16s mtDNA y efectuar el alineamiento de secuencias múltiples frente a secuencias obtenidas de la base de datos genómica GenBank, lo que permite sistematizar la información de secuencias, para caso particular del gen 16s mtDNA, en programas bioinformáticas cuyos algoritmos reconstruyen historias evolutivas.
1.1.2 PREGUNTA PROBLEMA
¿Es posible obtener un árbol filogenético de la especie Atractus crassicaudatus, con relación al género, a partir de la secuenciación y análisis bioinformático del gen 16S mt-
DNA?
1.1.2 HIPOTESIS
A partir de la pregunta problema se plantea la siguiente hipótesis: Las relaciones filogenéticas de la especie Atractus crassicaudatus con respecto al genero Atractus, pueden deberse a especiación por procesos geográficos.
21 1.3 JUSTIFICACIÓN
En colombia se estiman un aproximado de 270 especies de fauna ofídica, el cual constituye el 8% de la diversidad del planeta, categorizando a Colombia entre los 10 países con mayor cantidad de serpientes, entre ellas encontramos a la familia Leptotyphlopidae con un solo género, 30 para Elapidae, 19 para Viperidae y al menos 48 géneros para Colubridae, entre otros. (Lynch, 2012)
La serpientes son animales que suscitan un gran interés para la humanidad, es así que se genera la importancia de ampliar el conocimiento científico sobre dichas especies , en este caso el género Atractus y la especie Atractus crassicaudatus (Dumeril y Dibron, 1854), partiendo de esta premisa y al existir una ausencia de información genética de la especie mencionada, se constituye una investigación con el objetivo de describir un segmento del gen 16s mtDNA, a partir de extracción y amplificación PCR, que conlleven a la obtención del fragmento de dicho gen. El segmento de gen descrito permite la elaboración árboles filogenéticos mediante análisis bioinformáticos, con los cuales se ofrece una hipótesis sobre las relaciones de parentesco y los cambios acumulados, entendiéndose como eventos evolutivos.
Con este proyecto de investigación se amplía el conocimiento molecular del grupo de los ofidios y se representa la primera descripción molecular para la especie, al estandarizar y protocolizar métodos de extracción de ADN de tejidos y de PCR del gen 16S, dicho fragmento será comparado con otras secuencias pertenecientes a bases de datos del género.
A partir de una reconstrucción filogenética basada en el criterio de máxima verosimilitud
22 sustentada en el modelo evolutivo acorde a la estructura de las secuencias, el cual propiciará la información sobre posibles relaciones filogenéticas entre las especies, lo que permite determinar si los resultados son o no relevantes para el conocimiento molecular.
23 1.4 OBJETIVOS
1.4.1 OBJETIVO GENERAL
● Secuenciar un segmento del gen 16s mtDNA de la especie Atractus crassicaudatus
con el fin de obtener información molecular que permita establecer posibles
relaciones filogenéticas dentro del género Atractus.
1.4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
● Amplificar y secuenciar el gen 16s mitocondrial (mtDNA) de la especie Atractus
crassicaudatus mediante técnicas y protocolos de laboratorio de biología molecular.
● Determinar las relaciones filogenéticas de la especie Atractus crassicaudatus, con
respecto al género Atractus a partir de la comparación de secuencias del gen 16s.
● Construir un árbol filogenético en base a secuencias genéticas dispuestas en el
Genbank, con el fin de ubicar a la especie Atractus crassicaudatus en relación con
el género Atractus.
24 2. MARCO TEÓRICO
2.1 ANTECEDENTES
Al partir de los estudios de Linneo en el siglo XV acerca de las categorías taxonómicas, el cual abre paso a los fundamentos taxonómicos de las especies (Lanteri, 1995). Reig (1979) propone tres conceptos que aluden a las categorías de especie, taxones especie y bioespecie, de los cuales se puede distinguir que el concepto especie se encuentra en una jerarquía linneana, por la cual los taxónomos se rigen y proponen las clasificaciones de las especies, de lo que se deriva la disciplina sistemática filogenética o cladismo, formulada por los principios de Henning (1968) y que en la década de los 80 predominó en el campo de la escuela clasificatoria de las especies (Lanteri, 1989). Cole (1985) describe que los análisis de secuencias moleculares permiten reconocer linajes partenogenéticos, en algunos casos poliploides, grupos monofiléticos de organismos de reproducción sexual o asexual caracterizados en secuencias particulares de ADN; lo que permite deducir que la reconstrucción de filogenias ofrece la posibilidad de obtener cladogramas con hipótesis filogenéticas más simples, es decir, con menos homoplasias, en comparación a las reconstrucciones filogenéticas con base a caracteres morfológicos, a su vez, los cladogramas basados en caracteres moleculares pueden ser reforzados por análisis morfológicos; además se resalta que los estudios basados en caracteres moleculares permite tener nociones más amplias sobre la resolución de problemas de clasificación taxonómica, evolución y filogenia de las especies (Lanteri, 1995). Los análisis de secuencias para filogenias tomaron fuerza con la llegada de técnicas de secuenciamiento rápido (PCR) a finales de los 80 (Mullis y Falloona, 1987), lo que ha permitido una comparación más útil de los genomas desde ese momento, Sanz (2005) menciona que los bancos de datos
25 genéticos no han parado de crecer. Churchill et al., (1992) enuncian que “Para el trabajo comparativo de secuencias moleculares se suelen usar genes (o regiones) y proteínas universales, como los ARNr o los genes (ADNr) que los codifican” (Tomado de Sanz,
2005), Manhart (1994) describe que los genes o regiones moderadamente conservados son los más convenientes para resolver parentescos en los niveles medios de la jerarquía taxonómica (orden, familia, género). Sanz (2005) postula que el genoma mitocondrial
(ADNmt) es uno de los más viables para ser usado en animales donde se presenta compacto y con pocos genes e intrones, además de una relación paralela con el desarrollo de “más y más potentes programas de ordenador para el alineamiento de secuencias homólogas lo que permiten detectar las posiciones en las que se han producido cambios, modelizar la evolución molecular, encontrar el árbol que mejor describa las relaciones filogenéticas de la secuencias (criterios de optimización), para dibujar los árboles, para comprobar la robustez (estadística) de la posición de las ramas en el árbol (como los procedimientos bootstrap)” (Sanz, 2005).
Los estudios filogenéticos en serpientes datan desde el siglo XIX con los aportes de obras clásicas como las de Dumeril (1854), Jan (1863) y Cope (1895) y que posteriormente permitieron ampliar la información sobre los clados de Caenophidie (Xenophidia), en cuanto a las definiciones de algunas unidades monofiléticas como familias y sub-familias en los estudios de McDowell (1987) (Grazziotin, 2012). Después, en la década de los 90 aparecen los estudios filogenéticos basados en evidencia molecular que permitieron corroborar algunos puntos de vista sugeridos en análisis morfológicos y sugiriendo nuevas hipótesis de clasificación (Alfaro et al., 2008), Zaher (1999) sintetizó la evidencia morfológica disponible, principalmente de hemipenes, y asignó todos los géneros
26 "colubridos" a subfamilias, basados en parte en listas publicadas por Dowling y Duellman
(1978), McDowell (1987), Williams y Walach (1989) y Meirte (1992). Zaher (1999) reconoció el supuesto origen monofilético a las familias Atractaspididae y Colubridae ostensiblemente parafilético incluyendo doce subfamilias: Xenodermatinae, Pareatinae,
Calamariinae, Homalopsinae, Boodontinae, Psammophiinae, Pseudoxyrhophiinae,
Natricinae, Dipsadinae y Xenodontinae. Lawson et al. (2005) revisó la asignación de muchos géneros en función de la filogenia molecular de 100 Xenophidias que representa todas las subfamilias reconocidas por Zaher (1999), allí se reconocieron a las familias
Colubridae, Elapidae, Homalopsidae, Pareatidae y Viperidae, y acomodaron al grupo
Acrochordus como el taxón hermano de todos los demás xenophidios. Sin embargo, su análisis máximo de parsimonia (MP) no se resolvió bien, apoyó nodos más profundos entre las cinco familias de colubridos, además de Pareatidae, que era el taxón hermano de un clado, incluidos los cuatro restantes (Grazziotin, 2012). Vidal et al. (2007, 2008) estudiaron patrones amplios de relaciones filogenéticas entre xenophidios basado en un análisis de secuencias de aproximadamente 25-30 taxa, principalmente de África, donde revisó parte de la taxonomía de las serpientes en función de su análisis. Zaher et al., (2009) Presentan un análisis filogenético molecular de serpientes xenophidias, usando secuencias de dos genes mitocondriales (ARNr 12S y 16S) y uno nuclear (c-mos), (1681 pares de bases totales) y con 131 taxa terminales muestreados de todas partes del planeta, principalmente linajes xenophidios, pero se centra en xenodontinas neotropicales. Grazziotin et al., (2012) describen un análisis filogenético de los dipsadidos del Nuevo Mundo basado en una matriz de datos ampliada que incluye 246 taxones terminales, de los cuales 196 son dipsadidos, muestreados para ocho genes (12S, 16S, cytb, nd2, nd4, bdnf, c-mos, rag2 ) Los datos se
27 exploran utilizando dos procedimientos de búsqueda distintos: máxima parsimonia y máxima verosimilitud y dos estrategias de alineación: homología dinámica y homología estática. Arteaga et al., (2017) presentan una filogenia molecular del género serpiente
Atractus, con un muestreo taxonómico mejorado que incluye 29 de las 140 especies actualmente reconocidas. El árbol filogenético apoya la existencia de al menos tres nuevas especies en las tierras bajas del Pacífico y las laderas andinas adyacentes de los Andes ecuatorianos.
2.2 GENERALIDADES DE ATRACTUS CRASSICAUDATUS
La especie Atractus crassicaudatus (Dumeril y Dibron, 1854), cuyo nombre original fue
Rhabdosoma crassicaudatum y posteriormente clasificada en el género Atractus por
Boulenger en 1894, basado en la característica de ausencia de escamas preoculares (Savage,
1960). La especie se caracteriza por presentar una longitud total entre 400 y 440 mm
(Lynch y Rengifo, 2001), además con dimorfismo sexual notable al tener machos con longitud de cola y número de escamas subcaudales mayor al de las hembras (Passos y
Arredondo, 2009), El cuerpo es cilíndrico y la cabeza es pequeña y escasamente distinguible del cuello (Boulenger, 1894); posee seis escamas supralabiales, siete infralabiales y generalmente cuatro líneas de escamas gulares (Passos y Lynch, 2010). Es frecuente la presencia de una banda postorbital de color crema muy evidente (Pérez-Santos y Moreno, 1988), 17 hileras de escamas dorsales sin reducción, de 140 a 170 escamas ventrales; escama anal entera y subcaudales divididas (21 a 33 en machos y 14 a 26 en hembras), las escamas corporales son lisas y sin fosetas apicales (Passos y Arredondo,
28 2009). ―Maxila con 8 a 11 dientes, de longitud similar y con tendencia decreciente hacia la parte posterior de la boca. Los hemipenes presentan un surco espermático bifurcado de manera distal, ligeramente bilobulado, semicapitado y semicaliculado, y sin proyecciones lobulares laterales” (Paternina y Capera, 2017). Enorme variabilidad en patrones de coloración, de dorso negro con algunas líneas generalmente transversales distribuidas irregularmente de color amarillo claro, rojo, ocre, gris o naranja, con el vientre en una mezcla equilibrada de amarillo y negro, o sin el patrón de diferenciación dorso– ventral, llegando a ser monocromáticos con el pigmento negro muy difuso o totalmente ausente, la región vertebral se mantiene siempre más oscura (Paternina y Capera, 2017).
Especie terrestre y excavadora, de movimientos lentos (Lynch y Rengifo 2001), que al sentirse amenazada puede moverse rápidamente (amplias ondulaciones laterales del cuerpo) durante la huida entrando bajo rizomas de pastos, excavando en sustratos suaves y disgregados (Lynch y Rengifo 2001), o levantando alternadamente o al tiempo la cabeza y la cola. Los periodos de actividad son variables, prefiriendo la noche o el crepúsculo
(Sánchez et al. 1995), siendo las horas de mayor movilidad entre 19:00 y 22:00 horas.
Habita generalmente en ambientes húmedos en cercanías a cuerpos de agua como humedales, quebradas y principalmente pastizales (Lynch y Rengifo 2001). Se puede encontrar debajo de piedras o estructuras de concreto, bajo material vegetal acumulado y en descomposición, troncos caídos, y maderas abandonadas. Es común encontrarlas cuando se está removiendo tierra en obras civiles o cuando se está preparando la tierra en cultivos y jardines (DAMA 2003). No representa peligro para el hombre ya que no posee veneno; cuando es manipulada libera un almizcle de olor desagradable acompañado de un movimiento errático. A. crassicaudatus se alimenta de lombrices de tierra (Lynch y Rengifo
29 2001), aunque datos para otras especies del género sugieren que también puede consumir artrópodos como opiliones y otros invertebrados que se encuentren en su microhábitat.
Según Dunn (1944), los dientes del maxilar son de longitud uniforme o decreciente posteriormente, indicando una dieta conformada principalmente por invertebrados. La especie es ovípara y las hembras depositan los huevos debajo de piedras, troncos caídos o bajo tierra (Lynch y Rengifo 2001). De acuerdo con estos autores, los nacimientos de las crías tienen lugar durante los meses de octubre a diciembre.
Entre los factores que amenazan el equilibrio de las poblaciones de A. crassicaudatus se encuentran: 1) destrucción del hábitat, principalmente en localidades dentro de la ciudad de
Bogotá o cerca de asentamientos humanos (humedales y sus alrededores); 2) potenciales cambios en su nicho térmico debido al cambio climático, ya que al ser especies ectotérmicas de alta montaña son susceptibles a este tipo de alteraciones en la temperatura;
3) la tradicional percepción negativa que las personas tienen de este tipo de organismos y que termina en el sacrificio injustificado de las serpientes.( Paternina 2016)
2.3 TAXONOMÍA
Atractus crassicaudatus fue inicialmente descrita por Duméril, Bibron y Duméril (1854) como Rhabdosoma crassicaudatum con base en una serie de ejemplares colectados en los alrededores de Bogotá, dichos ejemplares actualmente se encuentra en París,. Sin embargo,
Dunn (1944) sugirió que los especímenes pudieron haber sido colectados por Humboldt y
Bonpland en 1801, o por Lozano o Goudot unos pocos años después. Posteriormente, en
1865 Jan llamó a la especie Rabdosoma crassicaudatum y para el año de 1894 Boulenger la
30 incluyó dentro del género Atractus (Tabla1); como característica de este género, se presenta la ausencia de escamas preoculares y la loreal (más larga que la 19 postnasal, revisar Figura3) entrando en contacto con el ojo (Savage 1960). Passos y Lynch (2010), a partir 20 de análisis de caracteres cuantitativos y cualitativos colocaron, a Atractus longimaculatus (Prado, 21 1940) y Atractus colombianus (Prado, 1940) bajo la sinonimia de A. crassicaudatus. Atractus crassicaudatus pertenece a la subfamilia Dipsadinae, familia
Dipsadidae, un clado monofilético de serpientes soportado por diversos estudios (Vidal et al. 2007; Zaher et al. 2009) cuya diversidad se encuentra principalmente en Centro
América y norte de Sur América (Vidal et al. 25 2007; Zaher et al. 2009; Pyron 2011).
Atractus crassicaudatus es fácilmente distinguible de sus especies más cercanas geográficamente A. wagleri y A. werneri por la siguiente combinación de caracteres: A. crassicaudatus presenta 147-170 escamas ventrales (♀), 14-26 escamas subcaudales (21-
33 ♂) y la cola representa el 8-13,7% (11-17% ♂) de la longitud de cuerpo, mientras que A. wagleri presenta 174-180 ventrales (♀), 43-44 subcaudales (46-56 ♂) y la cola representa el 13,6-15,3% (21,61% ♂) del cuerpo, por su parte A. werneri : presenta 158-174 31 ventrales (♀), 21-36 subcaudales (27-37 ♂) y la cola representa el 8,7-15,2% (13,2-17,1%
♂) del cuerpo (Passos y Arredondo, 2009; Passos y Lynch, 2011); de manera que A. crassicaudatus tiene el cuerpo y la cola, proporcionalmente más corta de las tres especies.
31 .Reino Animalia
Phylum Chordata
Clase Reptilia
Orden Squamata
Suborden Serpentes
Familia Colubridae
Subfamilia Dipsadidae
Género Atractus
Especie Atractus crassicaudatus
(Duméril, Bibron &
Duméril, 1854)
Tabla 1. Taxonomía de la especie Atractus crassicaudatus
2.4 GENBANK
La investigación en genética molecular de los últimos años ha tomado cada vez más fuerza en los centros de investigación biológica del mundo, marcando la necesidad de establecer una base de datos que contenga la mayor cantidad de información posible en cuanto a estudios moleculares, es así como el National Center for Biotechnology Information
(NCBI) diseña el proyecto Genbank (Benson et al, 2008), que corresponde a la principal
32 base de datos que comienza a recopilar secuencias de ADN, el GenBank es la colaboración de DNA Data Bank de Japón (DDBJ) (Sugawara et al., 2007), European Nucleotide
Archive (ENA) (Kulikova et al., 2006) y GenBank en NCBI (estas tres organizaciones intercambian datos diariamente en las que se incluye secuencias de ARN con regiones codificantes, ADN genómico correspondiente a uno o varios genes y ARN ribosómico.
Además se presente la existencia de varias secuencias para un mismo gen.
2.5 MARCADORES MOLECULARES
El principal argumento en pro a emplear caracteres moleculares para los diversos tipos de investigaciones en poblaciones, es que cuentan con la premisa de su universalidad
(Simpson, 1997). Por consiguiente se adopta que los marcadores moleculares son definidos como una herramienta necesaria en muchos campos de la biología como evolución, ecología, bio-medicina, ciencias forenses y estudios de diversidad, utilizándose para localizar y aislar genes de interés. Además Simpson (1997) expresa que existen varias técnicas moleculares que nos permiten conocer cómo se encuentran las proporciones de genes en las poblaciones naturales de manera indirecta, como con los análisis de proteínas, o de manera directa con estudios de ADN. Los diferentes tipos de marcadores se distinguen por su capacidad de detectar polimorfismos en loci únicos o múltiples y son de tipo dominante o co-dominante.
Marcadores moleculares bibliográficos
Se realizó la revisión bibliográfica relacionada con el gen a amplificar, de estos artículos se sintetizaron los cebadores utilizados por los autores (Tabla 2)
33 AUTORES GEN TÍTULO ARTÍCULO
AF158487, Phylogenetic relationships of
AF158471, xenodontine snakes inferred Vidal et al., 2000 AF158485, from 12S and 16S ribosomal
AF158486 RNA sequences
Molecular phylogeny of
advanced snakes (Serpentes,
GQ457726 Caenophidia) with an emphasis Zaher et al., (2009)
on South American
Xenodontines
KY610046,
KY610047,
KY610051, Molecular phylogeny of KY610052, Atractus (Serpentes, KY610053, Arteaga et al., Dipsadidae), with emphasis on KY610057, (2017) Ecuadorian species and the KY610058, description of three new taxa KY610059,
KY610060,
KY610061,
34 KY610062,
KY610064,
KY610065,
KY610066,
KY610067,
KY610069,
KY610070,
KY610071,
KY610072.
Tabla 2. Relación de marcadores moleculares teóricos tomados de artículos publicados. Cebador encontrado solo para las descripciones de Arteaga et al., (2017). L— CGCCTGTTTATCAAAAACAT HR-- CCGGTCTGAACTCAGATCACGT
2.6 GEN 16S
En la Actualidad se utilizan para estudios de árboles filogenéticos y esquemas evolutivos, el gen 16S, puesto que sus secuencias permite la adjudicación de relaciones naturales, debido a que este gen ha logrado mantenerse uniforme a lo largo de la evolución y por eso se ve claramente las diferencias entre las distintas especies. (Cuadra, 2017). Debido a que la molécula del 16S contiene regiones altamente variables, es usualmente posible el encontrar regiones de 20 a 30 bases que son completamente exclusivas de una sola especie. (Cuadra,
2017)
35 2.7 HOMOLOGÍA DE SECUENCIAS
González, d. (1996) menciona que en los análisis filogenético basados en secuencias génicas, con correspondencia histórica y relación mecánica si dos secuencias son similares estas provienen de un ancestro común, es así que, se considera que estas son homólogas. A partir de una secuencia ancestral y en el transcurso de las generaciones, las mutaciones entre las copias acumulan algunos cambios en los nucleótidos (Mindel,1991) .
2.8 ALINEAMIENTOS
Pinzón (2010), afirma que un alineamiento es un procedimiento mediante el cual se organizan dos secuencias con la finalidad de medir el grado de homología y divergencia entre ellas. El resultado de un alineamiento indica la cantidad de bases nitrogenadas (en
ADN o ARN) o aminoácidos (en proteínas) que se conservan entre las secuencias. Sin embargo, más informativo, es la cantidad de sitios que no se conservan. La manera en que dos secuencias pueden divergir, es mediante (a) procesos de sustitución (mutaciones) o (b) procesos de inserción o eliminación (indels). Los procesos de mutación, pueden dar cierta información sobre la evolución de la secuencia. Sin embargo para poder extraer de manera significativa esta información, es necesario considerar que cada base nitrogenada o aminoácido tiene un comportamiento similar al modelo de segregación de los alelos, los cuales se segregan de manera independiente (Madrigal 2017).
2.9 ALINEAMIENTOS MÚLTIPLES
El alineamiento de secuencias permite que a partir de secuencias almacenadas en bases de datos y con ayuda de algoritmos computacionales basados en propiedades matemáticas y estadísticas, permitan optimizar la distribución y así descubrir patrones y relaciones
36 evolutivas, la formación y la comparación de genomas (Escobar,2011).El alineamiento de pares es fundamental en la búsqueda de similitudes de características para lograr un perfil de alineamiento múltiples (Xion,2006)(Anexo3)
2.10 DISTANCIA GENÉTICA
Las distancias genéticas nos permiten observar el rango de similitud entre las poblaciones que son reflejadas por las frecuencias alélicas que expresan una composición genética sin conjeturas de posibles historias evolutivas, no obstante por otro lado las distancias pueden basarse en acciones causadas por mutaciones construyendo hipótesis evolutivas.
(Demarchi,2009).Matriz de distancias (Tabla9)
Para poder identificar algún tipo de proceso evolutivo, es necesario proveer al dendrograma con una medida cuantitativa. Consideremos los procesos evolutivos de sustitución, en donde cada base puede ser sustituida por otra con una frecuencia. Los modelos de evolución molecular explican la acumulación de mutaciones en términos de la tasa mutacional y el tiempo (Anexo6). De hecho, la cantidad se denomina distancia genética.
Esta distancia, en general es una función logarítmica de las probabilidades de cambio p.
Este caso es el más sencillo, que es el de transiciones del tipo Jukes-Cantor (Vargas, 2018).
2.11 ESTIMACIÓN DE ÁRBOLES FILOGENÉTICOS
Un árbol filogenético es una representación de algunas relaciones biológicas entre algunas formas de vida. En la representación topológica de un árbol, la longitud de las ramas son proporcionales o bien a la distancia evolutiva entre las secuencias, o el tiempo de divergencia entre las secuencias. Los nodos corresponden a la secuencia ancestral
37 hipotética a partir de la cual derivaron las secuencias en los grupos incluidos a partir de ese punto. Los grupos que cumplen con esto, se denominan monofiléticos y cada uno de ellos se denomina taxa o clado (Maher, 2002). Si el árbol tiene raíz, entonces este nodo general representa un ancestro común para todas los clados incluidos. El concepto de ―árbol filogenético‖ es una visión algo limitada: un grupo monofilético, es equivalente a suponer que las secuencias que conforman un clado descendieron directamente del ancestro común, y se diferencian de él solo por procesos mutacionales que acumularon sustituciones.(Figura12). En otras palabras, los procesos biológicos como recombinación, duplicación y evolución paralela, transferencia horizontal, o selección natural, no se reflejan claramente en este tipo de representaciones (Caballero, 1999).
2.12 ÁRBOL CONSENSO
En general, un árbol filogenético es una perspectiva de la historia evolutiva de las especies, de un conjunto de secuencias determinado, se pueden derivar distintas árboles, y por tanto distintos procesos ecológicos o biológicos. Una metodología que sirve para resumir estas posibles historias es la construcción de un árbol consenso. Este incluye una cantidad de
árboles plausibles biológicamente que son congruentes, estos corresponden a una síntesis de la posible filogenia ( Luna,2005) .
38 3. MATERIALES Y MÉTODOS
la investigación realizada es de orden cuantitativo, en la cual para la obtención de un fragmento de secuencia del gen 16s en la especie Atractus crassiudatus se establecieron tres fases de abordaje, denominadas fase de campo, fase de laboratorio y análisis bioinformático.
3.1 FASE DE CAMPO
3.1.1 UBICACIÓN DEL ÁREA
Para el desarrollo de esta fase se realizó un trabajo de campo en el Parque Ecológico
Cantarrana, un atractivo ambiental ubicado en la localidad (5) Usme de la ciudad de Bogotá
D.C. Se encuentra situado geográficamente en la carrera 1A No.100-11 sur, entre los barrios Monteblanco y Brazuelos, en la subcuenca del río Tunjuelito.
Figura 1 Imagen tomada de GOOGLE MAPS de ubicación geográfica del Parque Ecológico Cantarrana
39
Figura 2. Imagen satelital del Parque Ecológico Cantarrana, encerrada en una figura azul el área exacta de trabajo.
3.1.2 DESCRIPCIÓN DE ÁREA DE COLECTA
El Parque Ecológico Cantarrana ubicado en la zona suroriental de la ciudad cuenta con unas colinas bajas y un paisaje de montaña el cual aglomera una franja de transición urbano-rural con el desarrollo de reservas hídricas como el de la cuenca media y alta del Río Tunjuelito con alturas que van desde 2.600 hasta 3.800 msnm.
3.1.3 DESCRIPCIÓN DE INDIVIDUOS CAPTURADOS
Se estudia un total de 2 individuos de la especie mencionada con anterioridad, caracterizadas por tener escamas lisas, de un tamaño corto y cuello sin definición, los ejemplares se caracterizan por tener patrones de coloración amarillo en forma longitudinal y algunos transversales.
40 Yate-Avila 2019 Figura 3. Fotografía de especímenes de Atractus con longitud de 17cm.
3.2 FASE DE LABORATORIO
3.2.1 ÁREA DE LABORATORIO.
La extracción de material genético, cuantificación, diseño de primers, estandarización de las condiciones de la PCR y la verificación de los productos se realizó en los laboratorios de Biología Molecular y Genética de la Conservación (BIOMOL- C) de la Facultad
Ciencias y Educación, de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas, ubicada en la sede Macarena B Cra. 4 No. 26B – 54 de la ciudad de Bogotá.
3.2.2 EQUIPOS Y REACTIVOS. para el desarrollo de protocolos de biología molecular se utilizaron Equipos, instrumentación y reactivos situados en las instalaciones de la Universidad Distrital
Francisco José de Caldas, para el desarrollo de dichos protocolos se mencionan los equipos usados a continuación: Balanza Adventure OHAUS® AL0640, Cámara de electroforesis
BIORAD® Mini Sub Cell GT, Cámara de flujo laminar AIR CLEAN® System 600 PCR
Work Station, Cámara de flujo laminar AIR CLEAN® System 600 PCR Work Station,
Cámara de revelado BIORAD® Molecular Imager Gel Doc ™, Centrífuga – 4°C
41 Eppendorf® 5010R, Micropipeta electrónica BRAND® de 100 a 1000 µl,Micropipeta electrónica BRAND® de 10 a 100 µl, Micropipeta electrónica BRAND® de 1 a 20 µl,
Micropipeta electrónica BRAND® de 0,5 a 1 µl, Nanodrop THERMO SCIENTIFIC®
2000C, Nevera – 4°C HACEB®, Nevera – 80°C THERMO SCIENTIFIC® Forma 900
Series, Nevera – 20°C THERMO SCIENTIFIC®, Plancha de calentamiento THOMAS
SCIENTIFIC ® hot late – stirrer, Termociclador THERMO SCIENTIFIC® Esco Swift Max
Pro (Figura9) y Vortex THOMAS SCIENTIFIC®.
Los reactivos e insumos de laboratorio empleados en esta investigación serán nombrados a continuación: Agarosa, Azul de Bromofenol, Colorante SYBR Safe®, Kit para extracción de DNA MO BIO®, Kit para PCR BIOLASE™ DNA Polymerase, BIOLINE®, Marcador de peso molecular HyperLadder IV, BIOLINE®, TRIS BORATO EDTA: TBE al 1%,
Batas de laboratorio color blanco, Guantes, Puntas para micropipeta de 0,5 a 10 µl, Puntas para micropipeta de 10 a 100 µl, Puntas para micropipeta de 10 a 100 µl, Tapabocas, Tubos eppendorf de 2ml y Tubos eppendorf para PCR.(Tabla 3) (Tabla4).
42 4. PROCEDIMIENTOS
4.1 PROTOCOLO DE DISECCIÓN
Este protocolo se realizó con el fin de obtener material biológico necesario para la extracción de material genético
-Los especímenes son refrigerados a -20° por 15 minutos para su sacrificio
Yate-Avila 2019 Figura 4. Escamas del espécimen dorsal y ventral
-Se realiza una incisión con las tijeras o con un bisturí, la apertura se traza desde la zona cloacal hasta la cabeza, es necesario que la incisión sea lo más superficialmente posible para evitar el daño de los órganos.
Yate-Avila 2019
Figura 5.En la imagen se observa tejido epitelial, tejido muscular y órganos cubiertos por mesenterio.
43
Yate-Avila 2019 Figura 6. Se observa epitelio escamoso, una capa muscular y la columna vertebral.
-Se observa un conducto alargado de color rosa oscuro que corresponde tracto digestivo final y una serie de protuberancias blanquecinas que corresponde al sistema reproductor.
Yate-Avila 2019 Figura 7. La imagen muestra Intestino grueso
-A medida que se aproxima a la zona anterior se observará el pulmón, el hígado bilobulado a la altura aproximada del estómago y el corazón.
44
Yate-Avila 2019 Figura 8. Debido al desarrollo morfológico de las serpientes se observa una bolsa alargada de color claro corresponde al pulmón más desarrollado, el hígado de un color más oscuro y el corazón.
-Los demás órganos no son tenidos en cuenta, debido a la necesidad de la investigación, los restos son depositados como muestras para coleccion.
4.2 PROTOCOLO DE ESTANDARIZACIÓN EXTRACCIÓN ADN Y
CUANTIFICACIÓN
La extracción del ADN se realizó por medio del Kit de extracción DNA biomolc, se seleccionaron protocolos de extracción DNA-mt a partir de tejido, para que las muestras sean óptimas el coeficiente de absorción 280 nm debe encontrarse dentro del rango cociente A260/A280 el cual se presenta de 1,8 y 2,0 ng/μl; mientras que la absorción de
230 nm es indicativo de muestras de cociente A260/A230 se deben un rango de 2,2 ng/μl aproximadamente (Poms, 2001).
45 4.3 PROTOCOLO EXTRACCIÓN mt DNA BAENA. a partir de muestras de tejido
( hígado, corazón y músculo)
-Se seleccionaron muestras de tejido de hígado, músculo, corazón y riñón, los cuales fueron extraídos mediante técnica de disección de tejido fresco de especímenes capturados y depositados los especímenes en la colección del Museo de la Universidad Distrital
Francisco José de Caldas. El fragmento del tejido se lava con etanol (70%) y agua destilada (2 lavados de 20 minutos para cada uno)
-Se coloca la muestra en un tubo de microcentrífuga nuevo y estéril, se le agregan 0.5 ml de buffer de digestión ( 0.05 tris HCL: 0.01 M EDTA; 0.1 M NaCl, pH= 8.0), y 0.04M DTT,
10% de SDS y 2mg/ml de proteinaza K. La muestra se incuba por 12-18 horas a 37 OC
Para la digestión del tejido.
-La muestra es extraída dos veces con igual volumen de Alcohol 25:24:1 y una vez con n- butanol (La centrifugación se hizo a 11.000 rpm en microcentrífuga)
-El ADN se precipita agregando 0.1% del volumen de acetato de sodio saturado (6M) y 1.1 volumen de etanol absoluto (-20 OC). La mezcla se coloca a –20ºC durante 45 minutos y posteriormente se centrifuga a 13.000 rpm por 10 minutos y el sobrenadante se elimina
-El botón se lava con etanol 70% y se seca al vacío por 16 horas. La muestra se resuspende en 100µ de TE 1X y se guarda a 4 OC para su análisis posterior.
46
4.4 PROTOCOLO CONDICIONES DE LA ESTANDARIZACIÓN PARA
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR).
Este procedimiento se realizará utilizando el termociclador, THERMO SCIENTIFIC® Esco
Swift Max Pro, el cual permitirá ajustar las condiciones de temperatura, número de ciclos, tiempo y volumen del contenido para cada tubo Eppendorf® en la PCR (Sharrocks, 2004)
Yate-Avila 2019 Figura 9. Termociclador THERMO SCIENTIFIC® Esco Swift Max Pro
Para la elaboración de la mezcla maestra se sugiere usar las diferentes concentraciones y volúmenes de los reactivos (Espinosa, 2009)
47 Cantidad µl de
Concentración Concentración reactivo por MIX para 4
Componentes inicial por reacción tubo muestras
DNTP’s 40 mM. 5 µl. 2 mM. 8µl.
MgCl2 50 mM. 15 µl. 0,75 mM. 3µl.
Buffer de reacción 10X 5 X. 10µl. 40µl.
Primer reverse 50 mM. 0,6 µl. 1 µl. 4µl.
Primer foward 50 mM. 0,6 µl. 1 µl. 4µl.
Enzima Taq 1x. 1x 1/µl. 4µl.
DNA 35ng/mL 12ng/mL . 5µl. ______
H2O ______0.25µl. 37µl.
Volumen total
100µl. 25µl.
Tabla 3. Concentración y volumen para la elaboración de la PCR para un MIX de 4 tubos Nota: tomado de ―Guía práctica sobre la técnica de PCR,‖ L. Espinosa, 2009, Ecología Molecular, p. 525.
4.4.1 CURVAS DE CLORURO DE MAGNESIO
48 Este procedimiento generará la concentración óptima de MgCl2, el cual generalmente se encuentra en el rango de 1.5 a 3.0 mM (Erlich, 1990), dependiendo del grado de la concentración de dicha sal incidirá directamente en la incorporación de los desoxirribonucleótidos dNTP´s, (dATP, dCTP, dTTP y dGTP) en la actividad de la polimerasa y en la Tm de los primer’s. Se usará la relación de concentración y volumen del cloruro de magnesio.
Mezcla Mezcla Mezcla Mezcla Mezcla Mezcla Mezcla
1 2 3 4 5 6 7
Concentración 1,5 1,75 2 2,25 2,5 2,75 3 de MgCl2 mM. mM. mM. mM. mM. mM. mM.
Volumen de 1,5 µl. 1,74 µl. 2 µl. 2,24 µl. 2,5 µl. 2,74 µl. 3 µl. MgCl2
Tabla 4. Relación de la concentración y volumen del MgCl2 para la mezcla maestra de la PCR.
4.4.2 CONCENTRACIÓN DE PRIMER´S.
Nos permite generar los datos cuantitativos de la dilución de las alícuotas de los primer´s, de modo que se usará la siguiente ecuación aritmética (es importante tener en cuenta que aplica para los primer´s foward y reverse):
49
Es decir:
Alicuota de
Alicuota de
Alicuota de
En donde la alícuota del primer a utilizar en la mezcla maestra para la PCR será de 5 µl.
4.4.3 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA ( PCR)
Se efectuo la reacción de cadena de la polimerasa enzimática la cual permitirá la amplificación de miles de secuencias de ADN, es decir, las enzimas, los oligonucleótidos o primers, los dNTPs (Adenina Citosina, Guanina y Timina). El ion magnesio, buffer y H2O
(Sln amortiguadora), estos elementos interactúan en tres etapas, la desnaturalización, hibridación y extensión. Este proceso se realiza en un Termociclador, el cual tendrá una temperatura y tiempo específicos que no tendrá variaciones en cada ciclo. (Tamay de Dios et.al 2013) (Figura9)
4.5 PROTOCOLO PARA ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA AL 1%
VERIFICACIÓN DE LOS PRODUCTOS DE LOS GENES.
Este procedimiento se realizó utilizando la cámara de electroforesis BIORAD® mini
SubCell, para esto se debe preparar el gel de agarosa al 1%, es decir, se agrega 0,45 gr de
50 agarosa a 30 ml de TBE al 1% (TRIS Borato EDTA) (Dorado, 2008) y se adiciona 2 µl de
SYBR. Al momento de sembrar en el gel se añadieron 2 µl del producto de la PCR con 2 µl de buffer carga (Azul de bromofenol) (Dieffenbach & Dveksler, 2003), para un total de 4 µl por pozo (Anexo1). Finalmente se conectó la cámara con la fuente de poder eléctrica, programandose de la siguiente forma: 110 mV, 200 mA, por 40 min. Finalmente se lleva el gel a la cámara de revelado BIORAD® usando la opción de SYBR Safe® en el programa computarizado de Image Lab para así visualizar el resultado final de la electroforesis
4.6 PROCESOS DE SECUENCIAS
La secuenciación de los productos PCR se realizó mediante el servicio de Macrogen INC.
Korea. Las secuencias de las cadenas Forward y Reverse se editaron con ayuda del programa Sequencher versión 5.4 (Gene Codes Corp., Ann Arbor, MI, USA). La obtención de la secuencia consenso se realizó a partir del alineamiento múltiple de las secuencias escritas mediante el algoritmo clustal en el software BioEdit V.2.1 (Hall, 1999) (Anexo 4)
4.7 ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO
Los análisis bioinformáticos fueron realizados en las instalaciones del laboratorio de
Biología Molecular del Proyecto Curricular de Licenciatura en Biología de la Universidad
Distrital Francisco José de Caldas. Los equipos utilizados para dicho análisis constan de:
Un (1) equipo Lenovo MT - M 10AM, procesador Intel Core i7 (8 núcleos reales, 16 núcleos en total).
51
Se realizó una matriz de las secuencia obtenida junto a 30 secuencias más del gen 16s de otras especies del género Atractus obtenidas del GenBank de NCBI (Clark et al. 2015) y como grupo externo se postula la especie Sibon nebulata basados en la cercanía taxonómica entre los géneros (Arteaga et al. 2017, Zaher et al. 2009). (Tabla 5)
Especie Voucher GenBank 16S Pares de bases (bp)
A. albuquerquei GQ457726 418 bp ATAL001
A. badius AF158485 369 bp ///////////////////////// //
A. carrioni KY610046 520 bp MZUTI 4195
A. cerberus KY610047 544 bp
MZUTI 4330
A. crassicaudatus 364bp
A. duboisi KT944041 517 bp MZUTI62
A. dunni MZUTI2189 KY610048 524 bp
A. elaps DHMECN 10179 KY610052 513 bp
A. esepe MZUTI3758 KY610053 522 bp
A. flammigerus AF158471 537 bp ///////////////////////// //
A. gigas MZUTI3286 KT944043 518 bp
52 A. iridescens MZUTI3680 KY610056 519 bp
A. lehmanni KY610058 514 bp DHMECN7644
A. major DHMECN8343 KY610059 516 bp A. microrhynchus MZUTI5109 KY610060 469 bp
A. modestus MZUTI 4760 KY610061 521 bp
A. multicinctus MZUTI5106 KY610062 523 bp
A. occidentalis MZUTI3323 KY610065 521 bp
A. paucidens KY610067 520 bp MZUTI5105
A. pyroni KY610068 518 bp MZUTI 5107
A. resplendens KT944042 517 bp MZUTI3996
A. roulei KY610069 516 bp
MZUTI 4544
A. savagei KY610070 515 bp MZUTI 4916
A. schach AF158486 369 bp ///////////////////////// //
A. sp. KT944040 531 bp
MZUTI4178
53 A. tartarus KX926018 473 bp BIOTA 1185
A. touzeti KY610071 519 bp
ANF 2390
A. trihedrurus GQ457727 418 bp
ATTR001
A. typhon KY610072 517 bp
DHMECN 9632
A. zidocki AF158487 367 bp ///////////////////////// //
Sibon nebulata AF544806 393 bp {outgroup} ///////////////////////// //
Tabla 5. Matriz de Voucher y números de accesos al GenBank y pares de bases correspondiente a las secuencias de los 30 especímenes del genero Atractus del gen 16s y el outgroup usados en la reconstrucción filogenética. Los valores en blanco representan a las secuencias que no lograron ser obtenidas.
4.7.1. ALINEAMIENTOS MÚLTIPLES
Con el fin de obtener una matriz pareada y que permitiese distinguir similaridad entre las secuencias se realizó un alineamiento múltiple en el software CLUSTALX 2.1 (Larkin et al. 2007). El alineamiento se realizó bajo el algoritmo clustal (Thompson et al, 1997), que consiste en tres pasos; el primero es realizar un matriz de distancias entre cada par de secuencias, seguido a esto, se determina la topología de alineamiento progresivo, para
54 finalmente realizar un alineamiento global entre las secuencias (Li, 2003). El alineamiento se efectuó con un parámetro de penalización de gaps o ―huecos‖ de 15 para inicio y 6,66 para extensión del gap. La generación de árboles para el alineamiento se realizó mediante el método de combinación de vecindad (Neighbour-Joining-NJ) (Saitou et al. 1987). El alineamiento obtenido se sometió a un análisis de regiones conservadas mediante el software BioEdit V.2.1 (Hall, 1999) con un parámetro de incertidumbre máxima de 0,2 y un mínimo posible de región conservada de 15 pares de bases.
4.7.2 MODELO EVOLUTIVO
El alineamiento obtenido de CLUSTALX 2.1 se extrajo en un formato de archivo NEXUS
(Maddison et al. 1997) y se insertó en el programa jModelTest 2 (Darriba et al. 2012), donde se realizó la obtención del modelo evolutivo que más se ajusta al patrón de las secuencias, el algoritmo probabilístico utilizado para obtener el modelo de sustitución fue el de máxima verosimilitud (Guidon et al. 2003), la información para el modelo de substitución fue solicitada al programa mediante el criterio de información corregido
(AICc) (Jarreta, 2010) bajo un análisis de tres esquemas de sustitución (24 modelos posibles).
4.7.3ÁRBOL FILOGENÉTICO
Para la construcción del árbol filogenético se utilizó el programa MEGA X (Kumar et al.
2018), donde por búsqueda heurística se infirió la relacion filogenética mediante el método
55 de máxima verosimilitud (ML) y utilizando como modelo de sustitución el modelo general reversible en el tiempo (GTR) (Tavaré, 1986), el análisis fue ejecutado bajo el método de repetición bootstrap con 10.000 réplicas. Los árboles se obtuvieron aplicando los algoritmos de Vecindad-Unión (Saitou y Nei, 1987) y BioNJ a una matriz de distancias con una distribución Gamma de 5 categorías. La observación, enraizamiento y descripción de nodos para posterior exportación de el árbol obtenido se realizó en el software FigTree
(Rambaut, 2007).
56 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1 CUANTIFICACIONES DE MUESTRAS DE ADN EXTRAÍDO
La obtención del fragmento del gen 16s se hace a partir de un protocolo de estandarización, protocolo de extracción mtDNA BAENA y una cuantificación de ADN con el método Salting Out, con ayuda del espectrofotómetro Nanodrop 2000 (Scientific,
2009), al tomar diferentes muestras de tejidos muscular y conectivo (hígado, riñón, músculo y corazón) de dos individuos de la especie Atractus crassicaudatus.
Posteriormente las cuantificaciones muestran las diferentes relaciones de pureza y absorbancia de las muestras obtenidas de ADN, de las cuales podemos analizar que 8 muestras cumplen un rango óptimo de la concentración de ADN en valores A260/280, las muestras cuyo valor está entre 1.8-2.0 son óptimas y aquellas que son inferiores a este rango < 1.6 han sido contaminadas posiblemente debido a factores como compuestos aromáticos ya sean fenoles o por proteínas. Las muestras de la relación A260/230 cumplen los rangos, si su concentración está entre 1.5- 2.2 y las que son inferiores a < 1,5, podemos afirmar que han sido contaminadas debido a agentes como las sales caotrópicas, fenoles o carbohidratos. (Tabla 6)
57 Para la absorbancia de 280/260 las muestras que cumplen el rango son 1,2,4,5,6 y 7 y para absorbancia 260/230 cumplen el grado de pureza las muestras 1,2,3,4,5,6,7,8.
# Nombre Concen Uni. A 280/260 A 260/230 tipo Factor tration (ng/ul) Acidos nucleic os
1 H 171,7 ng/μl 1,84 1,72 ADN 50,00
2 H 26,4 ng/μl 1,83 1,73 ADN 50,00
3 M 176,3 ng/μl 1,74 1,61 ADN 50,00
4 M 51,1 ng/μl 1,874, 1,52 ADN 50,00
5 M 31,0 ng/μl 1,85 1,64 ADN 50,00
6 M 255,2 ng/μl 1.81 1.88 ADN 50,00
7 R 114,7 ng/μl 1,82 1,71 ADN 50,00
8 R 49,7 ng/μl 1,70 1,64 ADN 50,00
9 R 22,4 ng/μl 0,87 0,14 ADN 50,00
10 H 3,2 ng/μl 1,07 0,89 ADN 50,00
11 H 20,5 ng/μl 1,52 1,32 ADN 50,00
12 R 34,6 ng/μl 1,46 1,09 ADN 50,00
13 M 14,4 ng/μl 0,32 0,89 ADN 50,00
Tabla 6. Concentración de la muestra de ADN en longitud de onda de 260nm y relación de la absorbancia(grado de pureza) medido en A260/280 y A260/230. En el cuadro se muestran los valores de concentración inicial de los ácidos nucleicos en la primera extracción.
58 5.2 CUANTIFICACIONES DE DILUCIONES DE ADN PARA PCR
Se cuantificó la concentración inicial de los ácidos nucleicos en la primera extracción y la concentración de las cuantificaciones después de pasar por diluciones con lisis 6 (con ayuda de la fórmula de concentración y de volumen se realizaran las diluciones), para las muestras de R: riñón, M: músculo e H: Hígado no aprobaron el rango de 2.0 ng/µl como valor mínimo de concentración de ácidos nucleicos, es así que se se descartaron y no podrán emplearse para la secuenciación. (Tabla 7)
# Nombre de Número de diluciones Concentració Concentración tejido n inicial de final de ácidos cuantificación nucleicos (lisis 6)
1 Corazón 1 4 204.3 ng/µl 19.6 ng/µl
2 Corazón 2 0 48.1 ng/µl 48.1ng/µl
3 Corazón 3 DESCARTADO 1.2 ng/µl -
4 Corazón 4 DESCARTADO -6.0ng/µl -
5 Corazón 5 DESCARTADO 8.4ng/µl -
6 Corazón 6 DESCARTADO 2,2ng/µl -
4 Músculo 1 7 4392.0 ng/µl 23.1 ng/µl
5 Músculo 2 8 4617.5 ng/µl 21.6 ng/µl
6 Músculo 3 3 2282.1 ng/µl 21.9 ng/µl
7 Músculo 4 DESCARTADO 2.8ng/µl --
8 Músculo 5 10 6406ng/µl 30.2ng/µl
9 Músculo 6 5 341.4ng/µl 34.14ng/µl
10 Músculo 7 0 93.9ng/µl 93ng/µl
11 Músculo 8 1 116.3ng/µl ng/µl
12 Músculo 9 DESCARTADO 8.6ng/µl -
59 13 Músculo 10 DESCARTADO 165.2ng/µl 12.608ng/µl
14 Músculo 11 1 270.0ng/µl 21.6ng/µl
15 Músculo 12 0 20.8ng/µl 20ng/µl
16 Gónada 1 DESCARTADO 123.5 ng/µl 3.3 ng/µl
17 Gónada 2 DESCARTADO -144.6 ng/µl -
18 Hígado 1 9 11447.6 ng/µl 17.7 ng/µl
19 Hígado 2 5 3183.6ng/µl 63.672ng/µl
20 Hígado 3 3 1427.3ng/µl 57.09ng/µl
21 Hígado 4 DESCARTADO 2.6vng/µl -
22 Hígado 5 7 664.2ng/µl 26.56ng/µl
23 Hígado 6 10 4092.7ng/µl 40.92ng/µl
24 Hígado 7 0 28.8ng/µl 28.8ng/µl
25 Riñón 1 2 10411.2 ng/µl 35.9 ng/µl
26 Riñón 2 4 2719.6 ng/µl 21.9 ng/µl
Tabla 7. Cuantificación concentración inicial de extracción de ADN y concentración final con diluciones.
5.3 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realizó bajo las siguientes condiciones, por tubo se añadió 2 mM. de DNTP’s , 0,75 mM. de MgCl2 ,, 10µl. de Buffer de reacción,
1 µl. Primer reverse, 1 µl. de primer foward, 1/µl. de Enzima taq, 5µl. de DNA y por
último 0.25µl. de H2O, para un volumen total de 25 µl x 4 muestras, estas son colocadas en la columna 9 del termociclador, es así que se da inicio a un proceso de desnaturalización del material genético con una temperatura de 95 ºC, posterior a esto el termociclador realiza un ajuste de temperatura de 40 ºC y 60 ºC que será el momento del alineamiento y
60 finalmente permitirá amplificar pequeñas regiones del gen 16s en un rango de 364 (pb) para la especie en investigación, usando el THERMO SCIENTIFIC® Esco Swift Max Pro , material que fue enviado a Macrogen Korea® para su respectiva secuenciación.
Sample Name Primer Sample Product size (bp) Name Concentration (ng/ul)
Individuo A
1 Músculo 1 Atractus 176, 3 ng 400bp
2 Músculo 2 Atractus 176, 3 ng 400bp
3 Riñon 1 Atractus 34,6 ng 400bp
4 Hígado 1 Atractus 171,7 ng 400bp
Individuo B
1 Hígado 2 Atractus 1427,3 ng 400bp
2 Hígado 3 Atractus 3186,6 ng 400bp
3 Músculo 3 Atractus 664,2 ng 400bp
4 Músculo 4 Atractus 4092,7 ng 400bp
5 Músculo 5 Atractus 25,8 ng 400bp Tabla 8. Información de concentración de muestras enviadas a Macrogen Korea®
5.4 SECUENCIACIÓN DEL GEN 16S
La secuencia consenso se obtiene con ayuda del software BioEdit V.7 (Hall, 1999), la cual cuenta con 364 pb (Figura 12) , este es el resultado de ocho secuencias de 8 muestras, 2 de hígado, 4 de músculo y 2 de riñón (Ver anexo ). La secuencia cuenta con un porcentaje de
61 concentración de Timina (T) del 23.07%, para Guanina (G) del 15.65%, para Citosina (C) del 23.89% y para Adenina (A) del 37.36%.
> secuencia consenso especie Atractus crassicaudatus
Figura 10.Fragmento del gen 16s secuenciado.
La secuencia obtenida presenta un alto grado de similaridad con las secuencias extraídas del GenBank, para ello se obtuvieron los valores de regiones conservadas, por medio del software BioEdit V.7 (Hall, 1999) y el alineamiento realizado por el algoritmo Clustal X
(Thompson et al., 1997), allí se determinó que la secuencia del gen 16s de Atractus crassicaudatus en comparación a las 29 secuencias del género presenta 3 regiones conservadas con un total de 65 posiciones, la primera región conservada se encuentra entre la posición 116 y 134 del alineamiento, la segunda región comprende las posiciones 198 a
213 y la tercera región conservada va desde la posición 222 a 254 con valores de incertidumbre media de 0,0154, 0,0 y 0,017 respectivamente.
|5.5 DISTANCIA GENÉTICA
A Continuación se realiza un gráfico teniendo en cuenta el número de diferencias de bases por sitio entre secuencias, la variación de la tasa entre los sitios se modeló con una
62 distribución gamma (parámetro de forma = 5), este análisis involucró 31 secuencias de nucleótidos, se eliminaron todas las posiciones que contienen huecos y datos faltantes
(opción de eliminación completa). Hubo un total de 227 posiciones en el conjunto de datos final, los análisis evolutivos se realizaron en MEGA X. (Kumar,2018). Los datos se calculan a partir de la media aritmética para cada una de las especies pertenecientes al género Atractus y para el grupo hermano con el que se realiza la comparación (Outgroup), entre pares de poblaciones se toman para describir el grado de diferencia genética entre las secuencias, es decir, A. alburquequei cuenta con el valor de mayor distancia a nuestra serpiente de estudio y A. cerberus con una media de 0,291 (0,700 ± 0,079) de mayor proximidad.
Distancias
Especie
Figura 11. En el gráfico de barras se observa la distancia genética de las diferentes especies del género Atractus y del outgroup en relación al gen 16S , se emplea el algoritmo filogenético UPGMA para su análisis. (Unweighted Pair Group Method using Arithmetic averages). Los valores más altos fueron para A.alburquequei y A. carrioni como géneros con distancias considerables a nuestra serpiente tierrera de estudio A. crassicaudatus.
63
Especie Xi (Xi-X) (Xi-X)2
Atractus albuquerquei 0 0 0
Atractus badius 0,692 0,534 0,285
Atractus carrioni 0,39 0,39 0,152
Atractus cerberus 0,291 0,291 0,085
Atractus crassicaudatus 0,218 0,218 0,048
Atractus duboisi 0,196 0,196 0,039
Atractus dunni 0,176 0,176 0,031
Atractus elaps 0,08 0,08 0,006
Atractus esepe 0,191 0,191 0,036
Atractus flammigerus 0,132 0,132 0,017
Atractus gigas 0,135 0,135 0,018
Atractus iridescens 0,117 0,117 0,014
Atractus lehmanni 0,109 0,109 0,012
64 Atractus major 0,119 0,119 0,014
Atractus microrhynchus 0,103 0,103 0,011
Atractus modestus 0,107 0,107 0,011
Atractus multicinctus 0,096 0,096 0,009
Atractus occidentalis 0,091 0,091 0,008
Atractus paucidens 0,098 0,098 0,01
Atractus pyroni 0,096 0,096 0,009
Atractus resplendens 0,084 0,084 0,007
Atractus roulei 0,084 0,084 0,007
Atractus savagei 0,095 0,095 0,009
Atractus schach 0,092 0,092 0,008
Atractus sp. 0,09 0,09 0,008
Atractus tartarus 0,082 0,082 0,007
Atractus touzeti 0,097 0,097 0,009
Atractus trihedrurus 0,088 0,088 0,008
Atractus typhon 0,073 0,073 0,005
65 Atractus zidocki 0,091 0,091 0,008
Sibon nebulata (outgroup) 0,584 0,584 0,341
Número de datos 31
Valor medio 0,158 Suma 1,233
Desviación 0,1994149
Tabla 9. Matriz de distancias genéticas usando el gen 16S. A continuación los valores estimados se dan a partir de la media aritmética,el promedio=0,15, la varianza que equivale a 0,04 y la desviación estándar equivale a 0,19.
Las distancias exhiben considerablemente la variación de las poblaciones en proporciones relativas (Savage, 1960), a la revisión de los posibles cambios generados a partir de mutaciones en los nucleótidos, asumiendo que los marcadores están sujetos a un modelo de genes infinitos (Nei, 1972), partiendo de dicha premisa se combinó la información de 31 especies correspondientes a 227 datos, almacenados en una matriz de media aritmética no corregida con valores con rendimiento de 0,15. Con el valor de la desviación estándar
(0.19) se determina que el comportamiento de dispersión actúa próximo a la media (0.15), esta diferencia indica que las variaciones entre las zonas no conservadas se constituyen por la variación de frecuencias (Demarchi, 2009). A diferencia de la construcción de distancias génicas de Mejía (2018) donde las medias de su investigación en relación a las distancias génicas cambian significativamente por el número repetido de individuos de la
66 misma especie consignados en su matriz. Para Atractus crassicaudatus encontramos que el nodo principal se constituye de una diferencia de 0,25, con respecto a Atractus cerberus, la diferencia con el estudio de Arteaga et.al (2017) radica en una menor variedad de individuos y la investigación de un solo gen, es así que los datos de Arteaga et al. (2017) dan una mayor confiabilidad en términos de distancias.
5.6 ANÁLISIS RELACIÓN FILOGENÉTICA
El análisis filogenético es construido a partir de una matriz de 31 secuencias de nucleótidos alineados, correspondientes al gen 16s mt-DNA, con un total de 583 conjuntos de datos, empleando el método estadístico de máxima verosimilitud (ML) y el modelo de substitución de nucleótidos GTR, no obstante debido a la falta de uniformidad de las tasas evolutivas entre las diferentes secuencias, se agregó al modelo una distribución Gamma
(+G) ( 0.9437) para reducir las frecuencias que presentaran variaciones mayores a 1 con respecto a los valores asumidos o estimados del sesgo de transición/transversión (R)
(3,60633). Se tuvo en cuenta las frecuencias obtenidas para Adenina (A) de 0,35159, la frecuencia de Timina (T) de 0,24621, la frecuencia de la Citosina (C) de 0,22921 y por
último la frecuencia de la Guanina (G) de 0,17285.
Como resultado de la topología podemos observar que el género Atractus constituye un grupo monofilético en el cual las longitudes de las ramas corresponden al número relativo de sustituciones por sitio, el árbol obtuvo datos de verosimilitud de 0,6 de distancia en el nodo ancestral, lo cual evidencia la necesidad de una mayor cantidad de datos que puedan contribuir en los soportes de la relación del género , se puede observar la relación entre la especie A. crassicaudatus y A. cerberus como taxas cercana con una verosimilitud de 0,62
67 las cuales comparten patrones de coloración ventral amarillas, coloración dorsal con bandas negras longitudinales y (7) escamas infralabiales (Arteaga et al., 2017); al desglosar la topología del árbol es preciso mencionar que A. flammigerus (0,63), A. alburquequei (0,71) y A. badius (0,64) presentan una configuración de taxas alejadas filogenéticamente en relación a la especie problémica A.crassicaudatus (Dumeril y Dibron, 1854).
En relación a la propuesta de Arteaga et al (2017) se observan variaciones en la ubicación de las taxas, este resultado puede deberse a modificaciones en la información del material genético y sus expresiones, no obstante, mantienen zonas conservadas que serán las características que los incluyen en el género; además se observa que el Outgroup como grupo cercano Sibon Nebulata se polariza por completo.
Para el nodo en el que se encuentran las serpientes cercanas a la especie en investigación se puede caracterizar que de las seis especies que conforman este nodo (Atractus gigas,
Atractus pyroni, Atractus typhon, Atractus savagei, Atractus paucidens y Atractus modestus) la cantidad de Gaps es constante, además se ve reflejada una variación en Indels
(Inserción/Deleción), para la caracterización de este nodo se puede comparar con el árbol filogenético presentado por Arteaga et al. (2017) donde A.gigas, A. typhon, A. savagei, A. paucidens y A. modestus comparten un mismo nodo, mientras que para la especie A. pyroni nuestro análisis no apoya la relación filogenética propuesta por Arteaga et al (2017).
68
Figura 12. Topología de filogenia molecular de 30 especies del género Atractus y el outgroup (Sibon nebulata), el árbol es inferido con el método de máxima verosimilitud, modelo GTR.
El análisis del árbol filogenético permite determinar que A. crassicaudatus se encuentra emparentada con especies distribuidas hacia los Andes ecuatorianos, puesto que conforma un nodo próximo filogenéticamente a las especies A. cerberus descrita para la Provincia del Manabí en Ecuador (Arteaga et al. 2017), A. gigas cuya distribución está determinada para la vertiente del pacífico en los andes ecuatorianos y el Noroeste de Perú (Passos et al.
2010), A. pyroni que se ubica en la Provincia del Bilovan (Ecuador) según reportes de
69 Arteaga et al. (2017), A. typhon caracterizada para el municipio de Barbacoas en Nariño
(Colombia) (Passos et al. 2009), A. savagei descrita para la Provincia del Carchi en
Ecuador por Salazar et al. (2014), A. paucidens determinada para la Provincia del Pichincha
(Ecuador) (Arteaga et al. 2017) y A. modestus, que según reportes de Passos et al. (2007), se encuentra distribuida entre la región del Pichincha Ecuatoriano y Perú. En contraste, los nodos más basales permiten evidenciar a especies más distantes a A. crassicaudatus, entre las cuales se pueden caracterizar a ciertos taxas como A. thrihedurus distribuida en el sur de Brasil, específicamente en el estado de Santa Catarina y el noroeste de Argentina
(Cacciali et al, 2007), A. schach cuya descripción biogeográfica está determinada para la
Guyana Francesa (Wallach et al. 2014), A. tartarus ubicada en el Estado de Pará en Brasil
(De Oliveira y Hernández, 2016) y A. zidocki que posee una amplia distribución que comprende la amazonia colombiana, brasilera y parte de la Guyana Francesa (Passos y
Hernández, 2008)
El análisis de reconstrucción filogenética podría representar una hipótesis de especiación por vicarianza, el cual actúa como un mecanismo histórico alternativo para explicar las disyunciones geográficas, este da paso a la reconstrucción de las relaciones de distribución que se presentan entre las diferentes especies pertenecientes al género Atractus, en el cual la posibilidad de que un ancestro ocupará un área específica y este a su vez con el tiempo presenta divisiones menores debido a la aparición de barreras geográficas, como resultado se obtendrá el aislamiento de la especies debido a barreras geográficas, seguido de la especiación. Se presenta esta hipótesis de vicarianza en relación a la cercanía de la especie
A. crassicaudatus y A. cerberus. Cabe destacar que Arteaga et al., (2017) menciona que las relaciones filogenéticas del género aún siguen sin responderse en su totalidad. Con la
70 inclusión de A. crassicaudatus a los análisis moleculares se marca la hipótesis de especiación dada por el factor geografico del surgimiento de la cordillera de los Andes.
Nodo1 Región Gaps Indels Número de zonas Conservados
A.crasicaudatus 2 1 0 79
A.cerberus 2 5 0 79
Nodo2 Región Gaps Indels Número de zonas Conservados
A.paucidens 12 3 15 79
A.modestus 12 4 16 79
A.savagei 13 3 13 79
A.typon 14 3 11 79
A.pyroni 15 3 22 79
A.gigas 15 3 22 79
Tabla 10. En la matriz se analiza la relación 8 especies pertenecientes a los dos nodos principales marcados en la figura del árbol, cada secuencia se analizó en relación a la especie en investigación (Atractus crassicaudatus).
71 6. CONCLUSIONES
Se concluye que a partir de protocolos de extracción y amplificación en muestras de tejido de órganos como hígado, riñón y músculo de dos especímenes colectados, se logra obtener la secuencia de un fragmento que consta en 364 pares de bases del gen 16s de ADN mitocondrial, lo que representa la primera caracterización molecular para la especie
Atractus crassicaudatus.
El alineamiento múltiple entre las secuencias del género Atractus obtenidas del GenBank, en relación con la secuencia descrita para Atractus crassicaudatus permite evidenciar similaridades entre las regiones de ADN del gen 16s, esto gracias a la ubicación de tres regiones conservadas a lo largo de las secuencias, lo que soporta la cercanía evolutiva entre las especies de dicho género y una correcta clasificación taxonómica.
La construcción del árbol filogenético obtenido mediante el modelo evolutivo General
Reversible en el Tiempo (GTR) y el criterio estadístico de Máxima Verosimilitud (ML) evidencia la cercanía evolutiva de Atractus crassicaudatus, en comparación con los géneros con descripción molecular del gen 16s, con la representación de un cladograma, en el cual los valores de verosimilitud del nodo se encuentran entre el 0,63 y el 0,92, lo que permite inferir una cercanía evolutiva aceptable entre las especies utilizadas para la investigación.
La especie Atractus crassicaudatus conforma un clado monofilético junto con A. cerberus,
A. gigas, A. typhon, A. pironi, A. savagei, A. paucidens y A. modestus con un porcentaje de
72 cobertura del nodo de 0,90, la monofilia de dicho clado es similar a la reportada por investigaciones anteriores.
La organización de las especies dentro del árbol filogenético obtenido permiten evidenciar la diversificación del género Atractus, donde la especie problémica Atractus crassicaudatus se encuentra más próxima a especies descritas hacia el sur de la Cordillera de los Andes, lo que permite plantear la hipótesis de posibles diversificaciones dadas por el surgimiento de la cadena montañosa, sin embargo la verdadera construcción evolutiva presenta incertidumbres al no poseerse la totalidad de descripciones moleculares de las 140 especies que contiene el género.
73 7. RECOMENDACIONES
Se recomienda ampliar el uso de marcadores moleculares tales como Cytb, ND4, CMOS,
RAG1 y NT3, los cuales podrán permitir la obtención de un árbol filogenético con soportes de confiabilidad más óptimos.
Para Obtener una mayor confiabilidad en la filogenia del género es recomendable realizar descripciones moleculares de un mayor número de especies, puesto que la amplitud del grupo (140 especies) no se ha descrito molecularmente en su totalidad, es necesario mencionar la carencia de datos en especies colombianas lo que plantea la necesidad de centrar investigaciones de este tipo para el país.
Es necesario evaluar genéticamente los distintos morfotipos de la especie Atractus crassicaudatus, ya que pueden presentar diferencias en cuanto a secuencias de marcadores moleculares, lo que permitiría inferir la plasticidad de la especié o posibles procesos de especiación.
74 8. ANEXOS
ANEXO1. El procedimiento para realizar electroforesis se describe a continuación:
1. 0,45g de agarosa
2. En un Erlenmeyer adicionar 30ml de TBE a una concentración de 1X, posteriormente llevarlo en una plancha de calentamiento.
3. Cuando el TBE esté en su punto de ebullición, se debe adicionar 0,45g de agarosa (agitar con la ayuda de una barra magnética)
4. Retirar el Erlenmeyer con la solución y en 3 min adicionar 2 μLde gel RED
5. Servir la mezcla en la cámara con el peine de pozos previamente fijado
6. Dejar polimerizar el gel por 20 min (aprox.)
Nota: Es importante cubrir la cámara, ya que la exposición a luz puede afectar directamente el rendimiento y funcionalidad del gele, por lo que se recomienda realizar el montaje con mínimas condiciones de luz.
7. Retirar cuidadosamente el peine de la cámara con el gel
8. Ubicar la cámara a la cámara de electroforesis, teniendo en cuenta la ubicación de los polos eléctricos de la misma
9. Servir las muestras por pozo, en donde:
● 2 ul de 5x DNA Loading buffer blue (BIOLINE)
● 2 ul de Marcador Hyperlade
● 2 ul de producto de PCR
75 Anexo 2. Gráfica de cuantificaciones
76
Anexo 3.Alineaciones de las secuencias del género Atractus y un Outgroup (Sibon nebulata), la alineación se realiza con el software ClustalX, las columnas con * representan las zonas más conservadas de las secuencias, en las otras zonas se observan gaps e indels.
77 Anexo 4. En las siguientes dos tablas se observan las secuencias obtenidas a partir de las muestras de tejido tomadas de los especímenes del género Atractus (H:Hígado,
M:Músculo, R:Riñón)
Especimen A
H cctgttttacaaaaacataacctttagccaaacaaatattaaaggcaacgcctgcccagtgaccaattaaacggccgcg gtaccctaaccgtgcaaaggtagcgtaatcatttgtctattaattgtagaccagtatgaaaggcacaatgagggtccacc tgtctcttatagtaaatcgataaactgatcttctagtaaaaaagctaaaatacacacacaagaccagaagaccctgtgaa gcttaaactaaactattaaaccctataatacctactttcggttggggcgaccttggaaaaaaaaagaacttccaaatatat gaccataactcacacaccggcctacaagcctacacagac
Ma cctgttttacaaaaacataacctttagccaaacaaatattaaaggcaacgcctgcccagtgaccaattaaacggccgcg gtaccctaaccgtgcaaaggtagcgtaatcatttgtctattaattgtagaccagtatgaaaggcacaatgagggtccacc tgtctcttatagtaaatcgataaactgatcttctagtaaaaaagctaaaatacacacacaagaccagaagaccctgtgaa gcttaaactaaactattaaaccctataattatacctactttcggttggggcgaccttggaaaaaagaacttccaaatatat gaccataactcacacaccggcctacaagcctacacagac
Mb cctgttttacaaaaacataacctttagccaaacaaatattaaaggcaacgcctgcccagtgaccaattaaacggccgcg gtaccctaaccgtgcaaaggtagcgtaatcatttgtctattaattgtagaccagtatgaaaggcacaatgagggtccacc tgtctcttatagtaaatcgataaactgatcttctagtaaaaaagctaaaatacacacacaagaccagaagaccctgtgaa gcttaaactaaactattaaaccctataataaatactttcggttggggcgaccttggaaaaaaaaagaacttccaaatata tgaccataactcacacaccggcctacaagcctacacagac
R cctgttttaaaaaaaacataacctttagccaaacaaatattaaaggcaacgcctgcccagtgaccaattaaacggccgc ggtaccctaaccgtgcaaaggtagcgtaatcatttgtctattaattgtagaccagtatgaaaggcacaatgagggtccac ctgtctcttatagtaaatcgataaactgatcttctagtaaaaaagctaaaatacacacacaagaccagaagaccctgtga agcttaaactaaactattaaaccctataatacctactttcggttggggcgaccttggaaaaaaaaagaacttccaaatat atgaccataactcacacaccggcctacaagcctacacagac
Especimen B
H cctgttttacaaaaacataacctttagccaaacaaatattaaaggcaacgcctgcccagtgaccaattaaacggccgcg
78 gtaccctaaccgtgcaaaggtagcgtaatcatttgtctattaattgtagaccagttgaaaggcacaatgagggtccacct gtctcttatagtaaatcgataaactgatcttctagtaaaaaagctaaaatacacacacaagaccagaagaccctgtgaa gcttaaactaaactattaaaccctataatacctactttcggttggggcgaccttggaaaaaaaaagaacttccaaatatat gaccataactcacacaccggcctacaagcctacacagac
M cctgttttacaaaaacataacctttagccaaacaaatattaaaggcaacgcctgcccagtgaccaattaaacggccgcg gtaccctaaccgtgcaaaggtagcgtaatcatttgtctattaattgtagaccagtatgaaaggcacaatgagggtccacc tgtctcttatagtaaatcgataaactgatcttctagtaaaaaagctaaaatacacacacaagaccagaagaccctgtgaa gcttaaactaaactattaaaccctataattatacctactttcggttggggcgaccttnccaaaaagaacttccaaatatat gaccataactcacacaccggcctacaagcctacacagac
M cctgttttacaaaaacataacctttagccaaacaaatattaaaggcaacgcctgcccagtgaccaattaaacggccgcg gtaccctaaccgtgcaaaggtagcgtaatcatttgtctattaattgtagaccagtatgaaaggcacaatgagggtccacc tgtctcttatagttaaatcgataaactgatcttctagtaaaaaagctaaaatacacacacaagaccagaagaccctgtga agcttaaactaaactattaaaccctataataaatactttcggttggcgaccttggaaaaaaaaagaacttccaaatatat gaccataactcacacaccggcctacaagcctacacagac
R cctgttttaaaaaaaacataacctttagccaaacaaatattaaaggcaacgcctgcccagtgaccaattaaacggccgc ggtaccctaaccgtgcaaaggtagcgtaatcatttgtctattaattgtagaccagtatgaaaggaacaatgagggtccac ctgtctcttatagtaaatcgataaactgatcttctagtaaaaaagctaaaatacacacacaagaccagaagaccctgtga agcttaaactaaactattaaaccctataatacctactttcggttggggcgaccttggaaaaaaaaagaacttccaaatat atgaccataactcacacaccggcctacaagcctacacagac
79 Anexo5. A continuación se realiza la descripción de características generales de cada especie consultada en la investigación. Se consigna Autor y fecha de descripción
● Atractus roulei (Despax, 1910): Esta especie se caracteriza por una coloración
dorsal uniformemente marrón, muy similar a Atractus Carrioni distinguible en el
número de escamas ventrales, su distribución está determinada para el suroeste del
Ecuador y la Cordillera de Huancabamba en Perú (Passos et al. 2013). La
descripción del gen 16s de la especie se encuentra dada por Arteaga et al. (2017) en
una construcción filogenética del genero Atractus con énfasis en especies
ecuatorianas.
● Atractus pyroni (Arteaga, Mebert, Valencia, Cisneros-Heredia, Peñafiel, Reyes-
Puig, Vieira-Fernandes & Guayasamin, 2017): Para la descripción de esta especie
se notifica un tono marrón dorsal con escamas paravertebrales de color dorado, su
distribución se encuentra en la Provincia De Bolívar, Ecuador (Arteaga et al. 2017).
La descripción del gen 16s de la especie se encuentra dada por Arteaga et al. (2017)
en una construcción filogenética del genero Atractus con énfasis en especies
ecuatorianas.
● Atractus paucidens (Despax, 1910): Esta especie se caracteriza por tener coloración
negro en la parte dorsal con bandas de color crema a los costados, su distribución
está determinada para la Provincia de Pichincha, Ecuador (Passos et al. 2009). La
descripción del gen 16s de la especie se encuentra dada por Arteaga et al. (2017) en
una construcción filogenética del genero Atractus con énfasis en especies
ecuatorianas.
80 ● Atractus occidentalis (Savage, 1955): Esta especie se diferencia de sus congéneres
ecuatorianos por coloraciones en forma de rayas longitudinales rotas o incompletas.
Su distribución está determinada para la Provincia de Pichincha, Ecuador (Wallach
et al. 2014). La descripción del gen 16s de la especie se encuentra dada por Arteaga
et al. (2017) en una construcción filogenética del genero Atractus con énfasis en
especies ecuatorianas.
● Atractus multicinctus (Jan 1865): Se caracteriza por poseer un color beige del
fondo del dorso con franjas negras anchas que se alternan en los lados, su
distribución está determinada para el departamento del Valle del Cauca, Colombia
(Castro y Vargas, 2008). La descripción del gen 16s de la especie se encuentra dada
por Arteaga et al. (2017) en una construcción filogenética del genero Atractus con
énfasis en especies ecuatorianas.
● Atractus modestus (Boulenger, 1894): Como caracter diagnostico de esta especie se
puede distinguir un dorso color marrón oscuro con un collar claro nucal y bandas
paraventrales en especímenes juveniles, su distribución está determinada para el
occidente de ecuador y el Perú (Passos et al. 2007). La descripción del gen 16s de la
especie se encuentra dada por Arteaga et al. (2017) en una construcción
filogenética del genero Atractus con énfasis en especies ecuatorianas.
● Atractus microrhynchus (Cope, 1868): Esta especie se puede distinguir por su
coloración dorsal marrón acompañada de una banda occipital incompleta, su
distribución está determinada para la región del Tumbes en la frontera entre
Ecuador y Perú (Passos et al. 2012). La descripción del gen 16s de la especie se
81 encuentra dada por Arteaga et al. (2017) en una construcción filogenética del
genero Atractus con énfasis en especies ecuatorianas.
● Atractus major (Boulenger 1894): Esta especie presenta un patrón de coloración
que consiste en manchas de color marrón oscuro con bordes amarillos en su parte
dorsal, la distribución de esta especie se determina para una amplia zona que
comprende a Venezuela, Colombia, ecuador, Perú y Brasil (Esqueda et al. 2005).
La descripción del gen 16s de la especie se encuentra dada por Arteaga et al. (2017)
en una construcción filogenética del genero Atractus con énfasis en especies
ecuatorianas.
● Atractus iridescens (Peracca, 1896): esta especie es visiblemente caracterizada por
una coloración pardo rojizo disperso con manchas oscuras pequeñas e irregulares en
su parte dorsal, la distribución de esta especie está determinada para Colombia y
Ecuador (Passos et al. 2009). La descripción del gen 16s de la especie se encuentra
dada por Arteaga et al. (2017) en una construcción filogenética del genero Atractus
con énfasis en especies ecuatorianas.
● Atractus esepe (Arteaga, Mebert, Valencia, Cisneros-Heredia, Peñafiel, Reyes-
Puig, Vieira-Fernandes & Guayasamin, 2017): Esta especie, muy cercana al grupo
de A. Iridescens se caracteriza por una coloración dorsal de fondo marrón con un
patrón de líneas oscuras completas, su distribución está determinada para la
Provincia De Esmeraldas en Ecuador (Arteaga et al. 2017). La descripción del gen
16s de la especie se encuentra dada por Arteaga et al. (2017) en una construcción
filogenética del genero Atractus con énfasis en especies ecuatorianas.
82 ● Atractus elaps (Günter, 1858) : Esta especie se caracteriza por una visibilidad de
colores en su parte dorsal que comprenden unos anillos rojos con negro, la
distribución de esta especie está descrita para Colombia, Ecuador, Perú, Brasil,
Venezuela y Bolivia (Passos et al. 2013). La descripción del gen 16s de la especie
se encuentra dada por Arteaga et al. (2017) en una construcción filogenética del
genero Atractus con énfasis en especies ecuatorianas.
● Atractus dunni (Savage, 1955): Esta especie se puede caracterizar por presentar un
patrón de cinco franjas oscuras longitudinales y dos series de manchas en la región
dorsal, su distribución está determinada para Ecuador (Cisneros, 2015). La
descripción del gen 16s de la especie se encuentra dada por Arteaga et al. (2017) en
una construcción filogenética del genero Atractus con énfasis en especies
ecuatorianas.
● Atractus cerberus (Arteaga, Mebert, Valencia, Cisneros-Heredia, Peñafiel, Reyes-
Puig, Vieira-Fernandes & Guayasamin, 2017): Visiblemente esta especie se
caracteriza por tener una coloración dorsal marrón con bandas negras tenues, la
distribución está determinada para Ecuador (Arteaga et al. 2017). La descripción
del gen 16s de la especie se encuentra dada por Arteaga et al. (2017) en una
construcción filogenética del genero Atractus con énfasis en especies ecuatorianas.
● Atractus carrioni (Parker, 1930): Se caracteriza por una coloración uniformemente
gris o marrón, su distribución está determinada para Ecuador (Passos y Arredondo,
2009). La descripción del gen 16s de la especie se encuentra dada por Arteaga et al.
(2017) en una construcción filogenética del genero Atractus con énfasis en especies
ecuatorianas.
83 ● Atractus schach (Boie, 1827): Esta especie se caracteriza por una coloración dorsal
marrón claro con manchas negras rectangulares alternas y una línea vertebral negra
(Hoogmoed, 1980) la distribución de esta especie está determinada para la región de
Guyana (Wallach et al. 2014). La secuencia del gen 16s de la especie fue descrita
por Vidal et al (2000) en su estudio de relaciones filogenéticas de serpientes
Dipsadinas.
● Atractus badius (Boie, 1827): Descripciones de esta especie la caracterizan por una
cabeza corta y puntiaguda, además de una coloración roja con pares de bandas
negras (Hoogmoed, 1980), su distribución está determinada para Colombia, Brasil,
Guyana, Perú y Suriname (Wallach et al. 2014). La secuencia del gen 16s de la
especie fue descrita por Simões et al. (2016) en un análisis evolutivo de serpientes.
● Atractus flammigerus (Boie, 1827): una característica autopomórfica de esta
especie es que tiene quillas sobresalientes en hileras de escamas dorsales del cuerpo,
sobretodo en machos, la distribución de esta especie está determinada para la región
de Guyana, Brasil y Perú (Passos et al. 2017). La secuencia del gen 16s de la
especie fue descrita por Vidal et al (2000) en su estudio de relaciones filogenéticas
de serpientes Dipsadinas.
● Atractus resplendens (Werner, 1901): Para esta especie se describe un color marrón
hasta negro en su parte dorsal, la distribución está determinada para el amazonas
ecuatoriano (Wallach, 2014). La descripción del gen 16s de la especie fue dada por
Pyron et al. (2015) en un estudio sistemático de las relaciones entre la tribu
Nothopsini del grupo de Dipsadinos en la costa pacífica entre los territorios de
Ecuador y Colombia.
84 ● Atractus gigas (Myers y Schargel, 2006): Está especie presenta variaciones en su
coloración que se caracterizan por imitar a una coral, la distribución de esta especie
esta determinada para Ecuador y Perú (Passos et al. 2010). La descripción del gen
16s de la especie fue dada por Pyron et al. (2015) en un estudio sistemático de las
relaciones entre la tribu Nothopsini del grupo de Dipsadinos en la costa pacífica
entre los territorios de Ecuador y Colombia.
● Atractus duboisi (Boulenger, 1880): Esta especie presenta una coloración dorsal
negra con puntos paravertebrales amarillentos, su distribución está determinada para
Ecuador (Passos et al. 2009). La descripción del gen 16s de la especie fue dada por
Pyron et al. (2015) en un estudio sistemático de las relaciones entre la tribu
Nothopsini del grupo de Dipsadinos en la costa pacífica entre los territorios de
Ecuador y Colombia.
● Atractus lehmani (Boettger, 1898): Se caracteriza por una coloración marrón dorsal
y se emparenta morfológicamente con Atractus resplendens, su distribución esta
determinada para el Valle del Cauca en Colombia y Ecuador (Passos et al. 2009). La
descripción del gen 16s de la especie se encuentra dada por Arteaga et al. (2017) en
una construcción filogenética del genero Atractus con énfasis en especies
ecuatorianas.
● Atractus zidocki (Gasc y Rodríguez 1979): Se caracteriza por su coloración pardo
oscura con pequeñas manchas negras en su cabeza, esta especie se distribuye por la
amazonia colombiana, la región del Pará brasileño, la Guyana Francesa y Guyana
(Silva, 2004). La secuencia del gen 16s de la especie fue descrita por Vidal et al
(2000) en su estudio de relaciones filogenéticas de serpientes Dipsadinas.
85 ● Atractus tartarus (Prudente y Lynch 2016): Se caracteriza por colores dorsales que
varían entre el marrón y beige, color ventral blanco, esta especie se distribuye en el
estado de Pará en Brasil (Passos et al. 2016). La secuencia del gen 16s fue descrita
por De Oliveira y Hernández (2016) en su estudio de variaciones morfológicas de la
especie acompañado de una filogenia preliminar del género.
● Atractus trihedrurus (Amaral 1926): Se caracteriza por poseer un dorso
uniformemente beige, marrón grisáceo o negro en especímenes adultos y beige o
rojo crema con bandas negras en especímenes juveniles, esta especie se distribuye
hacia el sur de Brasil en el estado de Santa Catarina y el noroeste de Argentina
(Cacciali et al, 2007). La secuencia del gen 16s en la especie fue descrita por Zaher
et al. (2009) en su estudio de análisis filogenético de Dipsadinas con énfasis en
especies de América del sur.
● Atractus albuquerquei (Da Cunha y Do Nascimento, 1983): Según descripciones de
Holotipos esta especie se caracteriza por la coloración dorsal de la cabeza y el
cuerpo marrón claro desde la sección rostral hasta el final de la cola y la superficie
ventral del cuerpo con tonos cremas uniformemente claros, su distribución está
determinada para el estado de Pará al norte de Brasil (Zaher et al. 2005). La
secuencia del gen 16s se encuentra descrita por Zaher et al. (2009) en su estudio de
análisis filogenético de Dipsadinas con énfasis en especies de América del sur.
● Atractus typhon (Passos, Mueses-Cisneros, Lynch y Fernandes, 2009): Esta
especie se caracteriza por tener un color de fondo dorsal beige, franjas negras
alternadas por cuadros de color marrón y su distribución está determinada para el
sur occidente de Colombia, específicamente en el departamento de Nariño (Passos
86 et al., 2009). La descripción del gen 16s de la especie fue dada por Pyron et al.
(2015) en un estudio sistemático de las relaciones entre la tribu Nothopsini del
grupo de Dipsadinos en la costa pacífica entre los territorios de Ecuador y
Colombia.
● Atractus touzeti (Schargel, Lamar, Passos, Valencia, Cisneros-Hereda & Campbell,
2013): Las descripciones para esta especie determinan un patrón de color dorsal de
bandas cruzadas pálidas cortas rodeadas por bordes negros, su distribución está
descrita para la Cordillera De Los Guacamayos en la Provincia Del Napo, Ecuador
(Schargel et al. 2018). La descripción del gen 16s de la especie fue dada por
Arteaga et al. (2017) en una construcción filogenética del genero Atractus con
énfasis en especies ecuatorianas.
● Atractus savagei (Salazar-Valenzuela, Torres-Carvajal & Passos, 2014): Esta
especie se caracteriza por tener un color dorsal marrón con puntos de color negro en
las márgenes de las escamas y dos líneas longitudinales negras a cada lado del
cuerpo, su distribución está determinada para la Provincia del Carchi, Ecuador
(Salazar et al. 2014). La descripción del gen 16s de la especie se encuentra dada por
Arteaga et al. (2017) en una construcción filogenética del genero Atractus con
énfasis en especies ecuatorianas.
87 Anexo5. A continuación se oberva el árbol filogenético obtenido mediante análisis bayesiano. La especie Atractus crassicaudatus mantiene relación con su grupo hermano
Atractus cerberus.
88
9. BIBLIOGRAFÍA
● 2010ª.-Estado de la Cuestion en la Gestion de los Recursos Zoogenetico,
Marcadores Moleculares: Una Herramienta para explorar la Diversidad
Genetica:393-416- Disponible en:
http://www.fao.org/docrep/012/a1250s/a1250s17.pdf
● Alcántara, M. R. (2007). Breve revisión de los marcadores moleculares. Ecología
molecular, 541-566.
● Alfaro, M.E.; Karns, D.R.; Voris, H.K.; Brock, C.D. & Stuart, B.L. 2008.
Phylogeny, evolutionary history, and biogeography of Oriental–Australian rear-
fanged wáter snakes (Colubroidea: Homalopsidae) inferred from mitochondrial and
nuclear DNA sequences. Molecular Phylogenetics and Evolution, 46:576-593
● Amaral, A. do 1926. Novos gêneros e expécies de ophidios brasileiros. Arch. Mus.
Nac. Brazil, Rio de Janeiro 26: 1-27
● Arteaga, A., Mebert, K., Valencia, J. H., Cisneros-Heredia, D. F., Peñafiel, N.,
Reyes-Puig, C., & Guayasamin, J. M. (2017). Molecular phylogeny of Atractus
(Serpentes, Dipsadidae), with emphasis on Ecuadorian species and the description
of three new taxa. ZooKeys, 661, 91.
● Baxevanis, A. D. (2001). The Molecular Biology Database Collection: an updated
compilation of biological database resources. Nucleic Acids Research, 29(1), 1-10.
● Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., & Sayers, E. W.
89 (2008). GenBank. Nucleic acids research, 37(suppl_1), D26-D31.
● Boie, F. V. (1827). Bemerkungen über Merrem’s Versuch eines Systems der
Amphibien, 1. Lieferung: Ophidier. Isis van Oken, 20, 508-566.
● Boulenger, G. A. (1880). Reptiles et Batraciens recueillis par M. Emile de Ville
dans les Andes de l’équateur. Bulletin de la Société Zoologique de France, 5, 41-48.
● Boulenger, George A. 1894. Catalogue of the snakes in the British Museum
(Natural History). Volume II., Containing the Conclusion of the Colubridæ
Aglyphæ. British Mus. (Nat. Hist.), London, xi, 382 pp
● Caballero, E. J. L., & Suárez, G. P. (1999). Métodos de análisis en la
Reconstrucción Filogenética. Bol. SEA, 26, 45-56.
● Cacciali, P., Villalba, R., & Yanosky, A. A. (2007). A new species of Atractus
(Serpentes: Colubridae: Dipsadinae) from the Atlantic forest of alto Paraná,
Paraguay. South American Journal of Herpetology, 2(2), 83-89.
● Castro-Herrera, F., & Vargas-Salinas, F. (2008). Anfibios y reptiles en el
departamento del Valle del Cauca, Colombia. Biota Colombiana, 9(2).
● Churchill, G. A.; Von Haesler, A. & Navidi, W.C. (1992). Sample size for a
phylogenetic inference. Molecular Biology and Evolution, 9: 753-765
● Cisneros-Heredia, D. F. (2005). Rediscovery of the Ecuadorian snake Atractus
dunni Savage, 1955 (Serpentes: Colubridae). Journal of the National Museum
(Prague), Natural History Series, 174(1-4), 87-94.
● Clark, K., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., & Sayers, E. W. (2015).
GenBank. Nucleic acids research, 44(D1), D67-D72.
90 ● Cole, C. J. (1985). Taxonomy of parthenogenetic species of hybrid origin.
Systematic Zoology, 34(3), 359-363.
● Cope, E. D. (1868). An examination of the Reptilia and Batrachia obtained by the
Orton Expedition to Equador and the Upper Amazon, with notes on other species.
Proceedings of the Academy of Natural Sciences of Philadelphia, 96-140.
● Cope, E.D. (1895). The classification of the Ophidia. Transactions of the American
● Cuadra, J. M. M. H. (2017). Filogenia mediante el análisis del rRNA 16S.
● Darriba, D., Taboada, G. L., Doallo, R., & Posada, D. (2012). jModelTest 2: more
models, new heuristics and parallel computing. Nature methods, 9(8), 772.
● De Oliveira, E. A., & Ruz, E. J. H. Morphological variation in Atractus tartarus
(Serpentes: Dipsadidae) from the Xingu River, east Amazon, Brazil and preliminary
phylogenetic relationship in Atractus..
● Demarchi, D. A. (2009). Microsatélites, distancias genéticas y estructura de
poblaciones nativas sudamericanas. Revista Argentina de antropología biológica,
11.
● Despax, R. (1910). Mission géodésique de l'Équateur: collections recueillies par M.
le Dr. Rivet. Liste des ophidiens et description des espèces nouvelles. Bulletin du
Muséum National d’Histoire Naturelle de Paris, 16, 368-376.
● Dowling, H.G., & Duellman, W.E. "1974-1978" [1978]. Systematic Herpetology: a
Synopsis of Families and Higher Categories. HISS Publications (privated printed by
the senior author), New York. Generale. A. Lombardi, Milan.
● Escobar, C. A. M., Murillo, L. V. R., & Soto, J. F. (2011). Tecnologías
91 bioinformáticas para el análisis de secuencias de ADN. Scientia et technica, 3(49),
116-121.
● Esqueda, L. F. (2005). Revisión taxonómica y biogeográfica (con descripción de
cinco nuevas especies) del género Atractus (Colubridae: Dipsadinae) en los Andes
de Venezuela. Herpetotropicos, 2(1).
● Fraga, R., de Almeida, A., Cerneiro, L., Gordo, M., Pirani, R., Rojas, R., de
Carvalho, V., Passos, P. y Werneck, F. (2017). Narrow endemism or insufficient
sampling? Geographic range extension and morphological variation of the poorly
known Atractus riveroi Roze, 1961 (Serpentes : Dipsadidae ). Herpetological
Review, 48, 281–284.
● Gasc, J. P., & Rodrigues, M. T. (1980). Liste préliminaire des serpents de la Guyane
française. Bulletin du Muséum National d’Histoire Naturelle, Paris, 4e série, 2,
559-598.
● Giraudo, A. R., & Scrocchi, G. J. (2000). The genus Atractus (Serpentes:
Colubridae) in north-eastern Argentina. Herpetological Journal, 10(3), 81-90.
● González, d. (1996). codlflcaclón de las lnserclones-deteclones en el análisis
filogenetico de secuencias genicas
● Grazziotin, F. G. (2011). Filogenia molecular da família Dipsadidae (serpentes:
Colubroidea).
● Grazziotin, F. G., Zaher, H., Murphy, R. W., Scrocchi, G., Benavides, M. A.,
Zhang, Y. P., & Bonatto, S. L. (2012). Molecular phylogeny of the new world
Dipsadidae (Serpentes: Colubroidea): a reappraisal. Cladistics, 28(5), 437-459.
92 ● Günther, A. C. L. G. (1858). Catalogue of colubrine snakes in the collection of the
British Museum (Vol. 4). order of the Trustees.
● Haad, J. J. S. (2004). Las serpientes del género Atractus Wagler, 1828 (Colubridae,
Xenodontinae) en la Amazonia colombiana. Revista de la Academia Colombiana de
Ciencias Exactas, Físicas y Naturales, 28(108), 1-446.
● Hall, T.A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and
analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. 41:95-98
● Hennig, W., & Hennig, W. (1968). Elementos de una sistemática filogenética (No.
Sirsi) a437524).
● Hernandez E. (2016) . Variación morfológica en Atractus tartarus de (Snake:
Dipsadidae) del río Xingu, este de la Amazonía, Brasil y relación filogenética
preliminar en Atractus. Universidad Federal de Pará.
● Higgins, D. G., Thompson, J. D., & Gibson, T. J. (1996). [22] Using CLUSTAL for
multiple sequence alignments. In Methods in enzymology (Vol. 266, pp. 383-402).
Academic Press.
● Hoogmoed, M. S. (1980). Notes on the herpetofauna of Surinam: VII. Revision of
the genus Atracus in Surinam, with the resurrection of two species (Colubridae,
Reptilia). Zoologische Verhandelingen, 175(1), 3-47.
● Jan, G. 1863. Elenco sistematico degli Ofidi descritti e disegnati per l'Iconographia
● Jan, G. 1865. Iconographie générale des ophidiens. 13.Livraison. [Homalosoma
mite] J.B. Bailière et Fils, Paris
● Jarreta, J. A. (2010). Análisis teórico-práctico de métodos de inferencia filogenética
93 basados en selección de modelos y métodos de superárboles (ANEXOS).
● Kulikova, T., Akhtar, R., Aldebert, P., Althorpe, N., Andersson, M., Baldwin, A., ...
& Castro, M. (2006). EMBL nucleotide sequence database in 2006. Nucleic acids
research, 35(suppl_1), D16-D20.
● Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C., and Tamura K. (2018). MEGA X:
Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms. Molecular
Biology and Evolution 35:1547-1549.
● LANTERI, A. (1989). Análisis comparativo de las escuelas clasificatorias actuales.
In Actas 1 Congreso Argentino de Entomología, pág (pp. 51-60).
● Lanteri, A. (1995). La sistemática filogenética y los conceptos de especie
● Larkin, M. A., Blackshields, G., Brown, N. P., Chenna, R., McGettigan, P. A.,
McWilliam, H., ... & Thompson, J. D. (2007). Clustal W and Clustal X version 2.0.
bioinformatics, 23(21), 2947-2948.
● Lawson, R.; Slowinski, J.B.; Crother, B.I. & Burbrink, F.T. (2005). Phylogeny of
the Colubroidea (Serpentes): new evidence from mitochondrial and nuclear genes.
Molecular Phylogenetics and Evolution, 37:581-601.
● Li Yang, Zongqing Tan, Daren Wang, Ling Xue, Min-xin Guan, Taosheng Huang
& Ronghua L (2014) Identificación de especies a través del análisis genético de
ARNr mitocondrial. Scientific Reports
● Li, K. B. (2003). ClustalW-MPI: ClustalW analysis using distributed and parallel
computing. Bioinformatics, 19(12), 1585-1586.
● Luna, E., Guerrero, J. A., & Chew-Taracena, T. (2005). Sistemática biológica:
94 avances y direcciones en la teoría y los métodos de la reconstrucción filogenética.
Hidrobiológica, 15(3), 351-370.
● Lynch, J. D. (2012). El contexto de las serpientes de Colombia con un análisis de
las amenazas en contra de su conservación. Revista de la Academia Colombiana de
Ciencias Exactas, Físicas y Naturales, 36(140), 435-449.
● Lynch, J. D., & Renjifo, J. M. (2001). Guía de anfibios y reptiles de Bogotá y sus
alrededores. Departamento Técnico Administrativo del Medio Ambiente (DAMA).
● Maddison, D. R., Swofford, D. L., & Maddison, W. P. (1997). NEXUS: an
extensible file format for systematic information. Systematic biology, 46(4), 590-
621.
● Madrigal-Valverde, K. A. (2017). Using tools for sequence alignment and outline of
phylogenetic trees to determine species. Revista Tecnología en Marcha, 30, 30-34.
● Maher, B. A. (2002). Uprooting the tree of life: a proposed theory has researchers
debating life's origins--again. The Scientist, 16(18), 26-28.
● Manhart, J. R. (1994). Phylogenetic analysis of green plant rbcL sequences.
Molecular phylogenetics and evolution, 3(2), 114-127.
● McDowell, S.B. (1986). The architecture of the corner of the mouth of colubroid
snakes. Journal of Herpetology, 20:353-407
● Meirte, D. 1992. Clés de determination des serpents d’Afrique. Museum Royal
d’Afrique Centrale, Tervuren Belgique Annual Series Octavo Science Zoologique,
267:1-152.
● Mejía Guerrero, M. A. (2018). Revisión taxonómica de las serpientes tierreras
95 Atractus del grupo iridescens Arteaga et al. 2017 (Bachelor's thesis, PUCE-Quito).
● Mindell, D. P. (1991). Aligning DNA sequences: homology and phylogenetic
weighting. Phylogenetic analysis of DNA sequences, 73-89.
● Mullis, K. B. & Falloona, J. (1987). Specific synthesis of DNA in vitro via
polimerase catalized chain reaction. Methods in Enzymology, 155: 335-350.
● Myers, C. W. (2003). Rare snakes—five new species from eastern Panama: reviews
of northern Atractus and southern Geophis (Colubridae: Dipsadinae). American
Museum Novitates, 1-47.
● Myers, C. W., & Schargel, W. E. (2006). Morphological extremes—two new snakes
of the genus Atractus from northwestern South America (Colubridae: Dipsadinae).
American Museum Novitates, 1-13.
● Nascimento Paiva F., de Avila-Pires y da Cunha Rodrigues O. 1987. Os repteís da
área de Carajas. Pará Brasil (Squamata) II. Boletim do Museu Paraense Emilio
Goeldi. Serie Zoología. 3(1): 3-63.
● Nascimento, F. P. D., & Cunha, O. R. D. (1983). Ofídios da Amazônia XX–as
espécies de Atractus Wagler, 1828, na Amazônia oriental e Maranhão.(Ophidia,
Colubridae). Boletim do Museu Paraense Emílio Goeldi. Nova série Zoologia.
● Octavio-Aguilar, P., & Ramos-Frías, J. (2014). Aplicación de la genética de
poblaciones en el ámbito de la medicina. Biomédica, 34(2).
● Parker, H. W. (1930). XV.—A new colubrine snake from Eucador. Annals and
Magazine of Natural History, 5(26), 207-209.
● Passos, P., & Arredondo, J. C. (2009). Rediscovery and redescription of the Andean
96 earth-snake Atractus wagleri (Reptilia: Serpentes: Colubridae). Zootaxa, 1969, 59-
68.
● Passos, P., & Lynch, J. D. (2010). Revision of Atractus (Serpentes: Dipsadidae)
from middle and upper Magdalena drainage of Colombia. Herpetological
Monographs, 24(1), 149-173.
● Passos, P., Chiesse, A., Torres-Carvajal, O., & Savage, J. M. (2009). Testing
species boundaries within the Atractus occipitoalbus complex (Serpentes:
Dipsadidae). Herpetologica, 65(4), 384-403.
● Passos, P., Cisneros-Heredia, D. F., & Salazar-v, D. (2007). Rediscovery and
redescription of the rare Andean snake Atractus modestus. The Herpetological
Journal, 17(1), 1-6.
● Passos, P., Dobiey, M., & Venegas, P. J. (2010). Variation and natural history notes
on giant groundsnake, Atractus gigas (Serpentes: Dipsadidae). South American
Journal of Herpetology, 5(2), 73-83
● Passos, P., Echevarría, L. Y., & Venegas, P. J. (2013). Morphological variation of
Atractus carrioni (Serpentes: Dipsadidae). South American Journal of Herpetology,
8(2), 109-121.
● Passos, P., Kok, P. J., De Albuquerque, N. R., & Rivas, G. A. (2013). Groundsnakes
of the Lost World: a review of Atractus (Serpentes: Dipsadidae) from the Pantepui
region, northern South America. Herpetological Monographs, 27(1), 52-86.
● Passos, P., Mueses-Cisneros, J. J., Lynch, J. D., & Fernandes, R. (2009). Pacific
lowland snakes of the genus Atractus (Serpentes: Dipsadidae), with description of
97 three new species. Zootaxa, 2293, 1-34.
● Passos, P., Prudente, A. L., & Lynch, J. D. (2016). Redescription of Atractus
punctiventris and description of two new Atractus (Serpentes: Dipsadidae) from
Brazilian Amazonia. Herpetological Monographs, 30(1), 1-20.
● Passos, P., Ramos, L. O., Fouquet, A., & Prudente, A. L. (2017). Taxonomy,
Morphology, and Distribution of Atractus flammigerus (Serpentes: Dipsadidae).
Herpetologica, 73(4), 349-363.
● Passos, P.; Ana L.C. Prudente and John D. Lynch (2016). Redescription of Atractus
punctiventris and Description of Two New Atractus (Serpentes: Dipsadidae) from
Brazilian Amazonia. Herp. Monographs 30 (1): 1-20
● Paternina, R. F., & Capera-M, V. H. (2017) ANFIBIOS Y REPTILES DE
COLOMBIA.
● Paternina-Cruz, Ricardo,F. (2016) Atractus crassicaudatus. Catalogo de Anfibios y
Reptiles de Colombia. National University of Colombia
● Pearson, W. R. (1994). Using the FASTA program to search protein and DNA
sequence databases. In Computer Analysis of Sequence Data (pp. 307-331).
Humana Press.
● Peracca, M. G. (1896). Sopra alcuni ofidii nuovi o poco noti dell’America
meridionale. Anatomia Comaprada della Universitá di Torino, 11, 1-12.
● Pérez-Santos, C., & Moreno, G. A. (1988). Ofidios de Colombia. Museo Regionale
di Scienze Naturali. Torino. Monografía VI. Philosophical Society, 18:186-219 +
pls. 14-33
98 ● Pinzon, A. M. (2010) Alineamiento: Análisis computacional de secuencias. Centro
de Bioinformática, Instituto de Biotecnología. Universidad Nacional de Colombia.
Recuperado de http://bioinf. ib un. unal. edu.co/cbib/estudiantes/1-07/alineamiento.
pdf.
● Posso-Peláez, C. Evaluación del estatus taxonómico del cocodrilo del orinoco
Crocodylus intermedius (Graves, 1819) en Colombia mediante marcadores
mitocondriales como herramienta para establecer estrategias de conservación de la
especie (Doctoral dissertation, Universidad Nacional de Colombia).
● Prado, A. (1945). Um novo Atractus de Colombia. Ciencia (Mexico), 6, 61.
● Pyron, R. A., Guayasamin, J. M., Peñafiel, N., Bustamante, L., & Arteaga, A.
(2015). Systematics of Nothopsini (Serpentes, Dipsadidae), with a new species of
Synophis from the Pacific Andean slopes of southwestern Ecuador. ZooKeys, (541),
109.
● Rambaut, A. (2007). FigTree, a graphical viewer of phylogenetic trees
● Red List -Castro, F., Ines Hladki, A., Ramírez Pinilla, M., Renjifo, J., Stafford, P.,
Urbina, N. & Caicedo, J. 2015. Atractus crassicaudatus. The IUCN Red List of
Threatened Species 2015: e.T176352A44948356.
http://dx.doi.org/10.2305/IUCN.UK.2015-4.RLTS.T176352A44948356.en.
Downloaded on 11 June 2019.
● Reig, O. A. (1979). Proposiciones para una solucion al problema de la realidad de
las especies biologicas.(Propositions pour une solution du problème de la réalité des
espèces biologiques). Revista Venezolana de Filosofia Caracas, 11, 79-106.
99 ● Romero, P., & Ramírez, R. (2011). Divergencia intraespecífica y código de barras
de ADN en Systrophia helicycloides (Gastropoda, Scolodontidae). Revista peruana
de Biología, 18(2), 201-208.
● Ruiz-Garcia, m. a. n. u. e. l. (2011) estrategias de análisis genético poblacionales y
filogenéticos utilizando marcadores bioquímicos y moleculares (alozimas, mtdna y
microsatelites) aplicados a la conservación
● Saitou, N., & Nei, M. (1987). The neighbor-joining method: a new method for
reconstructing phylogenetic trees. Molecular biology and evolution, 4(4), 406-425.
● Salazar-Valenzuela, D., Torres-Carvajal, O., & Passos, P. (2014). A new species of
Atractus (Serpentes: Dipsadidae) from the Andes of Ecuador. Herpetologica, 70(3),
350-363.
● Sanz, M. M. (2005). De la taxonomía tradicional a las filogenias moleculares. Real
Sociedad Española de Historia Natural, 1-4.
● Savage, J. M. (1955). Descriptions of new colubrid snakes, genus Atractus, from
Ecuador. Proceedings of the Biological Society of Washington, 68, 11-20.
● Savage, J. M. (1960). A revision of the Ecuadorian snakes of the colubrid genus
Atractus.
● Schargel, W. E., Lamar, W. W., Passos, P., Valencia, J. H., Cisneros-Heredia, D. F.,
& Campbell, J. A. (2013). A new giant Atractus (Serpentes: Dipsadidae) from
Ecuador, with notes on some other large Amazonian congeners. Zootaxa, 3721(5),
455-474.
● Scientific, T. F. (2009). NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer V1. 0 User
100 Manual. Wilmington, DE, 19810.
● Sierra, C. M., & Xarau, S. N. (2011). Ofidismo en la península Ibérica.
SEMERGEN-Medicina de Familia, 37(3), 136-141.
● Silva J. (2004). Las serpientes del género Atractus Wagler, 1828 (Colubridae,
Xenodontinae) en la Amazonia colombiana. Revista de la Academia Colombiana de
Ciencias Exactas, Físicas y Naturales, 28(108), 1-446.
● Simões, B. F., Sampaio, F. L., Douglas, R. H., Kodandaramaiah, U., Casewell, N.
R., Harrison, R. A., ... & Gower, D. J. (2016). Visual pigments, ocular filters and
the evolution of snake vision. Molecular biology and evolution, 33(10), 2483-2495.
● Simpson J. 1997. Amplified fragment length polymorphisms. Bol. Soc. Bot.
Méx. 60:73-76.
● Sugawara, H., Ogasawara, O., Okubo, K., Gojobori, T., & Tateno, Y. (2007).
DDBJ with new system and face. Nucleic acids research, 36(suppl_1), D22-
D24.
● Tamay de Dios, L., Ibarra, C., & Velasquillo, C. (2013). Fundamentos de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real.
Investigación en discapacidad, 2(2), 70-78.
● Tautz D., P. Arctander, A. Minelli, R. Thomas & A. Vogler. 2003. A plea for DNA
taxonomy. Trends Ecol. Evol. 18: 70-74.
● Tavaré, S. (1986). Some probabilistic and statistical problems in the analysis of
DNA sequences. Lectures on mathematics in the life sciences, 17(2), 57-86.
● Van Brussel, E. CLASIFICACIÓN Y CARACTERÍSTICAS BIOLÓGICAS.
101 ● Vargas Vivanco, R. E. (2018). Simulación computacional de modelos
probabilísticos de evolución del ADN (Bachelor's thesis, Quito, 2018.).
● Vidal, N.; Branch, W.R.; Pauwels, O.S.G.; Hedges, S.B.; Broadley, D.G.; Wink,
M.; Cruaud, C.; Joger, U. & Nagy, Z.T. (2008). Dissecting the major African snake
radiation: a molecular phylogeny of the Lamprophiidae Fitzinger (Serpentes,
Caenophidia. Zootaxa, 1945:51-66.
● Wallach, V., Williams, K. L., & Boundy, J. (2014). Snakes of the world: a
catalogue of living and extinct species. CRC press.
● Werner, F. (1901). Ueber reptilien und batrachier aus Ecuador und Neu-Guinea.
Verhandlungen des Zoologisch-Botanischen Vereins in Wien, 50, 593-614.
● Williams, K.L., & Wallach, V. 1989. Snakes of the World, Vol. 1, Synopsis of
Snake Generic Names. Krieger Publishing Co., Malabar, FL
● XION, Jin. Essential Bioinformatics. Estados Unidos de América: Cambridge
University Press, 2006. 331p. ISBN 978-0-511-16815-4.
● Zaher, H. 1999. Hemipenial morphology of the South American xenodontine
snakes, with a proposal for a monophyletic Xenodontinae and a reappraisal of
colubroid hemipenes. Bulletin of the American Museum of Natural History, 240:1-
168
● Zaher, H., Grazziotin, F. G., Cadle, J. E., Murphy, R. W., Moura-Leite, J. C. D., &
Bonatto, S. L. (2009). Molecular phylogeny of advanced snakes (Serpentes,
Caenophidia) with an emphasis on South American Xenodontines: a revised
classification and descriptions of new taxa. Papéis Avulsos de Zoologia (São
102 Paulo), 49(11), 115-153.
● Zaher, H., Souza, I., Gower, D. J., Hingst-Zaher, E., & Silva Jr, N. J. D. (2005).
Redescription of Atractus albuquerquei (Serpentes: Colubridae: Dipsadinae), with
comments on geographical distribution and intraspecific variation. Papéis Avulsos
de Zoologia, 45(2), 19-32.
103