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23. Agroalimentario Aplicación de un Enfoque Metagenómico al Estudio de la Diversidad Bacteriana asociada a Suelo, Rizósfera y Vinos de la Región Bonaerense Argentina Autor: Rivas, Gabriel Alejandro; e.mail: [email protected] Orientador: Delfederico, Lucrecia; e.mail: [email protected] Departamento de Ciencia y Tecnología Universidad Nacional de Quilmes Resumen Durante la fermentación malolática (FML) las bacterias del ácido láctico (BAL) decarboxilan el ácido L-málico transformándolo en ácido L-láctico y contribuyen a la calidad del vino al reducir su acidez y aportar a su aroma y sabor. De este modo, las BAL aportan al terroir característico de cada vino, y su diversidad en el viñedo dependerá de factores como clima, suelo, varietal vínico y prácticas culturales y de vinificación. En la región vitícola bonaerense (Argentina) no existen aún estudios sobre la diversidad microbiológica asociada a suelos, vides, mostos y vinos, conocimiento crucial para seleccionar cepas indígenas con fines enológicos. Para iniciar este análisis se realizó la secuenciación masiva del gen 16S rRNA de muestras de suelo, rizósfera, mosto y vinos de dos bodegas del SO bonaerense (Saldungaray y Al Este, Buenos Aires, Argentina), obteniéndose 123.379 secuencias y 5.323 OTUs. Se observaron índices de diversidad elevados, con diferencias significativas entre muestras de suelo y rizósfera respecto de mosto y vino. Los análisis taxonómicos mostraron como filo mayoritario en suelo y rizósfera a Proteobacteria (especialmente Alphaproteobacteria, con predominancia de Rhizobiales), y en mosto y vino a Proteobacteria, con predominancia de las Alphaproteobacteria Rhodospirillales y Sphingomonadales. Estos hallazgos, constituyen un primer aporte al conocimiento de las comunidades bacterianas de una región vitivinícola en desarrollo y contribuirán a optimizar procesos productivos y prácticas agrícolas sustentables. Palabras Claves: Diversidad bacteriana, secuenciación masiva, terroir Introducción por bacterias del ácido láctico (BAL), principalmente Oenococcus oeni y La vinificación involucra dos fermentaciones Lactobacillus plantarum, que consiste en la sucesivas, una primaria o alcohólica (FA), conversión del ácido L-málico en ácido L- llevada a cabo por levaduras, y una láctico y CO2. La FML juega un rol secundaria o maloláctica (FML), conducida importante, especialmente en la producción importancia en vitivinicultura, ya que de vinos tintos, generando una relaciona los atributos sensoriales del vino deacidificación que conduce a la estabilidad con las condiciones ambientales del viñedo. microbiológica por remoción del malato como Se lo puede definir como un ecosistema potencial fuente de energía. Desde el punto interactivo en un determinado ambiente, que de vista organoléptico, el metabolismo de las incluye clima, suelo y planta, así como las BAL provoca cambios en los contenidos de técnicas locales de viticultura y vinificación. diversos compuestos orgánicos que Se ha demostrado que los factores contribuyen a modificar el aroma y mejoran la geográficos, de variedad de uva y climáticos calidad del producto. En particular, las dan forma a las comunidades de bacterias y actividades enzimáticas como β- glucosidasa hongos de las uvas, a través del tiempo de con capacidad de hidrolizar glicoconjugados cultivo de las vides (Bokulich et al. 2013, no volátiles presentes en la uva, liberando así 2014) y que existen diferencias genéticas compuestos aromáticos, esterasas, significativas entre comunidades microbianas proteasas, enzimas involucradas en el de diferentes localizaciones geográficas, que metabolismo del citrato y en la degradación afectan diferencialmente el fenotipo del vino de ácidos fenólicos (Swiegers et al. 2005, (Knight et al, 2015). Se ha estudiado también Lerm et al. 2011, Iorizzo et al. 2016). el rol que las interacciones microbianas juegan en la sanidad de la vid, la calidad del En Argentina, las prácticas tradicionales de fruto y del vino (Barata et al. 2012). vinificación fomentan las FML espontáneas, conducidas por la microbiota nativa, para La vitivinicultura bonaerense constituyó una realzar la tipicidad regional de los vinos. Sin pujante agroindustria hasta mediados del s. embargo, la falta de predictibilidad de los XX (Ospital, 2003), resultando finalmente procesos naturales, sumado a los riesgos de relegada por motivos económicos, políticos y paradas de fermentación y de contaminación sociales. Desde principios de los 2000 se ha microbiana, puede incidir negativamente en iniciado su recuperación a través de los costos de producción. Por esto, el empleo emprendimientos que hoy muestran distinto de cultivos iniciadores desarrollados con grado de desarrollo. En la prov de B Hay 49 cepas autóctonas de cada región vitivinícola viñedos, con 145 ha cultivadas, que es hoy una práctica internacional muy representan el 0,2% del total de viñedos extendida, por su mejor adaptación al registrados y el 0,07% de la superficie proceso de vinificación y por mantener la cultivada de vid en Argentina. Hasta el tipicidad regional. presente no existen estudios sobre la diversidad biológica de suelos asociados a El concepto de terroir reviste suma vides, mostos y vinos de la región vitícola bonaerense y todo programa de selección de al. (2016) probaron que los consorcios de cepas indígenas de BAL con fines enológicos hongos y bacterias involucrados en las implica conocer la extensión y diversidad de fermentaciones vínicas, correlacionan con la la biota autóctona con la cual la cepa/s composición química de los vinos terminados seleccionada/s deberá/n competir. Se y permiten predecir la abundancia de propone iniciar el análisis de esa diversidad metabolitos en los mismos. Los estudios aplicando, en una primera etapa, métodos metagenómicos, fundamentalmente la metagenómicos y bioinformáticos para secuenciación basada en amplicones de estudiar la microbiota de suelo, rizósfera, marcadores filogenéticos (secuencias mostos y vinos en viñedos y bodegas del SO parciales de los genes 16S rRNA en bacterias bonaerense. Posteriormente, y con vistas a la y arqueas, o 18S rRNA en eucariotas, o del formulación de cultivos malolácticos nativos, espaciador interno transcripto - ITS, en capaces de contribuir a la expresión del hongos y levaduras), que se complementan terroir diferencial de estos vinos, se con estudios transcriptómicos (secuenciación realizarán aislamientos de las especies de de cDNA) y tecnologías funcionales como BAL predominantes en FML espontáneas y proteómica y metabolómica, brindan exitosas. Los mismos serán identificados, información no sólo de la estructura de la tipificados y caracterizados enológica y comunidad (riqueza de especies, diversidad tecnológicamente para luego seleccionar y distribución) sino también de la función aquellas cepas con capacidad de llevar a potencial de la misma. cabo una FML controlada. Finalmente se Objetivos evaluarán las estrategias de implantación en mosto y vino y el desempeño de las cepas en El objetivo general del trabajo fue iniciar la cada caso, en ensayos de vinificación a caracterización de la diversidad de la escala de laboratorio. La propuesta integra microbiota procariota de suelos y rizósfera un proyecto general orientado al diseño de asociada a vides y vinos del varietal Malbec, cultivos malolácticos formulados con cepas en dos bodegas del SO de la provincia de de BAL indígenas de diferentes regiones Buenos Aires, Argentina y analizar la posible vitivinícolas del país, y la búsqueda de las correlación entre las poblaciones de condiciones óptimas de empleo para la bacterias y arqueas presentes en suelo y obtención de vinos de calidad diferenciada. rizósfera, con las presentes en los vinos. Materiales y Métodos Mediante metodologías de secuenciación masiva (high-throughput sequencing) y Recolección de muestras: Suelo y cromatografía líquida de ultra alta rizósfera: Se tomaron muestras del varietal performance (UHPLC/QTOF MS), Bokulich et Malbec, de las bodegas Saldungaray y Al Este, 2 a 3 semanas previas a la vendimia muestras de vino, la etapa de lisis de dicho 2017. Se ingresó al interior de las parcelas procedimiento no fue exitoso y debio para realizar la recolección a 20-30 cm de modificarse. Dell pellet lavado con buffer TE, profundidad a partir de la base de 3 plantas, y resuspendido en buffer PBS, se colocó 1 dejando una planta por medio. A su vez, mL en tubos Eppendorf con beads (provistos hilera por medio, se volvió a repetir 2 veces por el kit), y se realizó la lisis en diferentes más,obteniendo 9 muestras, que se condiciones: A. Tratamiento con lisozima 30’ agruparon aleatoriamente de a tres, logrando a 37°C y ciclo de 40” de bead beater. B. así los triplicados biológicos. Tratamiento con lisozima 35’ a 37 °C, Vino: Las muestras se tomaron durante el agregado de buffer de Lisis MT (provisto por proceso fermentativo, obteniéndose así el kit), y ciclo de 10” de bead-beater. C. Buffer mosto, fermentación alcohólica final y de Lisis MT, un ciclo de 5’ de bead-beater, e fermentación malolática, correspondientes al incubación con lisozima 30’. D. Buffer de Lisis varietal Malbec, de la vendimia 2017. Para la MT, dos ciclos de 1’ 30’’, con incubación de 2’ vendimia 2018, debido a las condiciones de hielo entre cada ciclo. E. Buffer de Lisis climáticas desfavorables, sólo se logró MT, dos ciclos de 1’ 30’’, con recuperación de obtener una muestra de mosto para sobrenadante entre ciclo. F. Buffer de Lisis elaboración de Champagne, conformada por MT, dos ciclos de 1’ 10’’, con recuperación de