Drought Stress Responses in Medicago Truncatula and Glycine Max: System Biology Approaches
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Departamento de Ciencias del Medio Natural Natur Ingurunearen Zientzien Saila Tesis Doctoral Drought stress responses in Medicago truncatula and Glycine max: system biology approaches Memoria presentada por Dña. Amaia Seminario Huarriz para optar al grado de Doctor con Mención de Doctor Internacional Pamplona, marzo de 2017 This work was funded by “Ministerio Español de Economía y Competitividad” (AGL-2011- 23738/AGR), “Gobierno de Navarra” (2016/PI013 LEGUMINOSAS) and “Fundación Caja Navarra” (FUNCAN, 07442). Amaia Seminario Huarriz has been holder of a PhD fellowship from the Public University of Navarra and she has received two mobility grants from the same institution: “Programa de ayudas de movilidad predoctoral” (1710/2012, 1506/2013). AGRADECIMIENTOS-ACKNOWLEDGEMENTS En primer lugar, me gustaría dar las gracias a mis directoras, las Dras Esther González y Estíbaliz Larrainzar, por haberme dado la oportunidad de realizar esta tesis doctoral. Gracias a las dos por vuestro tiempo, dedicación, consejos, apoyo… Esther, gracias por estar siempre disponible y dispuesta a escuchar y por haberme enseñado tanto. Gracias Esti por tu ayuda, por aportarme tantos conocimientos y por esos sabios consejos tanto profesionales como personales. Gracias a todas las personas del departamento de Ciencias del Medio Natural y especialmente a aquellos pertenecientes al Área de fisiología vegetal. Eskerrik asko Iker por tus aportaciones en este trabajo. Gracias a Susana, Gustavo y Berta por compartir grandes momentos tanto en cafés como en comidas de tupper. Y también gracias a mis compañeros de despacho, Juan y Yueh-Hsin. I would also like to thank Michael Udvardi from The Samuel Roberts Noble Foundation in Oklahoma, EEUU, for giving me the opportunity to participate in his experiments to improve my knowledge in plant science. My stay there was amazing thanks to Yun and to Ivone, Igor, Catalina, Lia and Shulan, who taught me a lot of things. It was a pleasure working with you!! Moreover, I want to thank Yanina, Alan, Bárbara, Ella, Mayra, Ewelina, Djordje and Pato for enjoying my life-besides-work, and making all the moments even more special. Pero sobre todo, gracias a la madrileña que conocí allá, muchas gracias Ana por explorar conmigo la ciencia y el estilo de vida de Ardmore. Hope to see you again! La realización de esta tesis me ha permitido dirigir Trabajos Fin de Carrera, Máster, Grado… No me olvido de agradecer a todas las personas que han participado conmigo en experimentos y sus aportaciones en esta tesis: gracias a Maite Rodríguez, Ana Litago, Unai Pérez y Nahikari López. Eskerrik asko Joseba por esos cafés y comidas tan productivos, por los buenos ratos pasados y por estar siempre al otro lado de la pared dispuesto a escuchar y ayudar. Especialmente gracias a Oskar, fue una suerte trabajar contigo y aprender de tí tanto en lo laboral como en lo personal. Erena…mila esker! Fue una pena no coincidir más tiempo contigo pero fuiste un ejemplo a seguir y aprendí de ti en otras facetas. Gracias por tu apoyo y por los momentos vividos fuera de la uni! Eskerrik asko Miriam por tu apoyo y ayuda en esta última etapa de la tesis, por tu compañía cuando más lo necesitaba y por los buenos ratos pasados... eskerrik asko por todo Txantxita!! Gracias a Bea y Ane por empezar este camino de la mano y por los buenos momentos juntas durante el máster! Gracias David por esos buenismos ratos que en el último año me han ayudado a desconectar! Y gracias a Libertad también por hacer que esos ratos fueran especiales! Gracias también a todos los que han pasado por el departamento durante este tiempo; Laura, Cristina, Esti U., Maren, Sergio, Iván, Inma, Vero, Maitane, Raquel, Olaya, Karla, Amaia Z, Idoia, Janaina, Ester, Manu... y en especial a Maribel, Ainhoa e Irantzu, muchas gracias por todos los buenos ratos vividos! Gracias a todos aquellos, ahora biólogos, que experimentaron conmigo mi etapa en la universidad. En especial, me gustaría agradecer su continuo apoyo a Jorge, María, Marijose, Javi y Ariane porque, a pesar de estar ahora cada uno en una punta, siempre nos quedarán los buenos momentos vividos juntos. Y en especial a Álvaro, por tu interés y continuo apoyo en estos años y por los momentos compartidos. También me gustaría agradecer a ese grupo de chicas que finde a finde sacaba lo mejor de mí simplemente con la ayuda de un balón; risas y buenos momentos que merecen la pena! Eskerrik asko…Aupa Ostiralak!!!! Después de haber intentado explicaros un montón de veces lo qué he estado haciendo en estos últimos años, espero que con esta tesis os quede un poco más claro. Iosune y Bea, gracias por esos raticos juntas, por vuestra amistad, por apoyarme a seguir adelante y por vuestro continuo interés. Gracias también a mis “Ojo avizor” Ainhoa, Itzi y Raquel, por las continuas risas y grandes momentos pasados juntas ayudándome a desconectar, eskerrik asko!! Je tiens également à adresser mes sincères remerciements á la famille Baslam pour leur soutien constant et leur grand intérêt, même en étant à plusieurs kilomètres du Pampelune. Un trés gran MERCI à Fatiha, Lahcen, Badreddine et Abdel Mounaim. Muchísimas gracias a Marouane!! Gracias por guiarme en este camino, por ser mi apoyo en todos los momentos, por tus ánimos a seguir hacia adelante, por tu visión para ver las cosas y sobre todo, por estar siempre a mi lado! Gracias Abuela por ser un ejemplo a seguir, por tu cariño incondicional. Mención especial a tí abuelo, que allá donde estés, seguro me has seguido de cerca en esta etapa. Gracias a Tari, por estar siempre ahí y a Arantxa. Gracias también a Juanito, Jose e Igor. A mis primos Seminario y por último, a esa amplia familia zubiritarra. Eskerrik asko ere nire Urnietako familiari. Y en general, a toda la gente que me ha apoyado día tras día. Y por último, gracias a mis padres Tere y Pedro, porque sin ellos no habría llegado hasta donde he llegado. Gracias por apoyarme en todo momento, por todo lo que he aprendido de vosotros y porque a pesar de no saber muy bien lo qué hacía, siempre me animabais a tirar para adelante. Gracias también a mi hermana Izaskun, por animarme y apoyarme en esta etapa. Gracias a los tres por estar siempre ahí! MUCHAS GRACIAS A TODOS!!! ABBREVIATIONS AP2 Apetala2 AsA Ascorbic Acid AZ Absorption zone C Control D Drought D1 Drought 1 D2 Drought 2 DHA Dehydroascorbic acid DTT Dithiothreitol DW Dry weight ERF Ethylene response factors ETR Electron transport rate through PSII ETRc Electron flow to the carboxylation reaction of Rubisco ETRo Electron flow to the oxygenation reaction of Rubisco FW Fresh weight GABA γ-aminobutyric acid GalL L-galactono-1,4-lactone GalLDH L-galactono-1,4-lactone dehydrogenase GC-MS Gas chromatography-mass spectrometry GSH Reduced Glutathione GST Glutathione S-transferase LOX Lipoxygenase MD Moderate drought MDA Malondialdehyde MPa Megapascal MS Mild stress MSTFA Methyltrimethylsilyltrifluoroacetamide PEG Polyethylene glycol qRT-PCR Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction QTL Quantitive trait locus RH Root hair zone RNA-Seq Ribonucleic acid-sequencing ROS Reactive oxygen species SD Severe drought SE Standard error TBA Thiobarbituric acid TCA Trichloroacetic acid TF Transcription factor TMSC N-methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide TRIS Tris(hydroxymethyl)aminomethane UHPLC Ultra-high-performance liquid chromatography VMS Very mild stress w/v Weight by volume WC Water content Ψw Water potential SUMMARY After cereals, legumes are crops of great economic importance. However, legume plants are very sensitive to abiotic stresses, being drought one of the most harmful stress in terms of crop production. The general aim of the present work is to gain further insights into two legume species (Medicago truncatula and Glycine max) drought responses at the shoot and root level by using a combination of physiological, morphological, transcriptomic and metabolomic approaches. Ascorbic acid (AsA) is one of the most abundant water-soluble antioxidant compound present in plant tissues involved in plant enzymatic and non-enzymatic detoxification mechanisms. Nevertheless, little is known on the regulation of this antioxidant biosynthesis pathway under drought stress. In chapter 1, through a combination of molecular and physiological approaches, we observed that AsA biosynthesis was severely affected by drought in soybean plants. These analyses showed that drought triggered multiple control points regulating AsA biosynthesis at the GDP-D-mannose pyrophosphorylase and GDP- D-mannose 3´, 5´-epimerase level of soybean plants. In parallel, these responses were also observed in the model legume M. truncatula. In chapter 2, work presented here showed the tight link between above- and below- ground organs in M. truncatula plants and the fact that, under drought stress conditions, adult plants prioritized root growth over leaf development. Actually, different analyses showed responses which suggest a passive survival strategy for leaves coexisting with an active engagement of the root in drought-stressed plants. New non-destructive and non-toxic protocols are needed to simulate drought conditions to better characterize plant responses under controlled conditions. To that end, in chapter 3, a new simple, efficient and reproducible method is presented to simulate in vitro drought stress conditions in M. truncatula seedlings grown on plates containing different agar concentrations. After validating of this method, it was observed that roots, rather than shoots, play a key role in plant adaptation to stress conditions. The relative simplicity of the method allows for its large-scale application in studies such as population screening for drought resistance traits in a variety of plants. Additionally, in chapter 4 we applied this method in combination with physiological, transcriptomic and metabolomic analyses in one of the most important parts of the root, the absorption zone, responsible for absorbing water and nutrients thus allowing the plant growth.