Exploring Polar Microbiomes as Source of Bioactive Molecules Adriana Isabel Correia Rego Mestrado em Biologia Celular e Molecular Departamento de Biologia da Faculdade de Ciências da Universidade do Porto Dissertação de Mestrado 2016/2017 Orientador: Pedro Leão, Investigador FCT, Centro Interdisciplinar de Investigação Marinha e Ambiental (CIIMAR) Co-orientador: Catarina Magalhães, Investigador FCT, Centro Interdisciplinar de Investigação Marinha e Ambiental (CIIMAR) e Professora Auxiliar Convidada FCUP FCUP ii Exploring Polar Microbiomes as Source of Bioactive Molecules Todas as correções determinadas pelo júri, e só essas, foram efetuadas. O Presidente do Júri, Porto, ______/______/_________ FCUP iii Exploring Polar Microbiomes as Source of Bioactive Molecules Agradecimentos Antes de mais, quero agradecer aos meus pais, sem o apoio dos quais nada disto se teria tornado possível. Agradecer aos meus orientadores, Pedro Leão e Catarina Magalhães, pela confiança depositada, por todos os conhecimentos partilhados e tempo despendido e pela oportunidade de fazer um trabalho de investigação desafiante e concretizador. Quero também agradecer à Teresa Martins, António Sousa e Inês Ribeiro, companheiros desta jornada, por toda a partilha de bons momentos e entreajuda. Em especial à Teresa pela amizade e ajuda incansável na química, ao António pela ajuda e paciência na análise bioinformática e à Inês, pela companhia e ajuda na realização dos ensaios. Agradecer à equipa do laboratório Ecobiotec, em especial à Fátima Carvalho e à Mafalda Baptista pela ajuda nos isolamentos bacterianos. Ao grupo de Bioinformática, à Maria Paola e ao António, por todos os ensinamentos e momentos de boa disposição. A toda a equipa do BBE, particularmente ao João, à Raquel e ao Vítor pelo fornecimento das estirpes da coleção de culturas e DNAs. Ao Tiago por toda a ajuda fornecida na realização dos ensaios de citotoxicidade. Também ao Jorge, pela companhia nos almoços e por ter sempre uma palavra de incentivo. Por fim, agradecer ao Alfredo, pelo apoio incondicional. Agradeço também ao NORTE2020, Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER), programas estruturados R&D&I MarInfo - NORTE-01-0145-FEDER-000031 e R&D&I INNOVMAR - NORTE-01-0145-FEDER-000035, NOVELMAR e ao Programa Polar Português (PROPOLAR) pelo financiamento. FCUP iv Exploring Polar Microbiomes as Source of Bioactive Molecules Resumo Com o aumento da incidência de estirpes bacterianas multirresistentes aos antibióticos e doenças como o cancro, existe uma necessidade imperativa de encontrar novos potenciais fármacos. Os produtos naturais de origem microbiana estão na base de uma séride de fármacos de grande importância, utilizados atualmente para combater uma grande variedade de enfermidades. As estratégias adotadas mais recentemente para a pesquisa de novas moléculas assentam na análise genética de clusters de genes biossintéticos ou genomas, assim como na pesquisa de genes biossintéticos (em particular do tipo PKS e NRPS), em combinação com uma pesquisa guiada pela bioatividade e estrutura. O estudo de microorganismos que habitam ambientes extremos é igualmente uma estratégia promissora, dado que é expectável que grande parte dos microorganismos sejam ainda desconhecidos e possuam estratégias adaptativas únicas ao seu habitat, incluindo a produção de novas moléculas. Neste trabalho, conjugamos ambas as estratégias, pesquisa de genes biosintéticos e testes de bioatividade para avaliar o potencial bioativo de um microbioma polar, os Vales Secos da Antártida. Dois objetivos principais foram definidos: (1) O desenho de primers capazes de amplificar os domínios biosintéticos, KS e A, dos genes PKS e NRPS, respetivamente. (2) A análise da diversidade microbiana de dados de pirosequenciação, assim como o isolamento de microorganismos de amostra ambientais da Antártida, e uma triagem do potencial bioativo dos isolados através da realização de bioensaios. Dois novos pares de primers foram desenvolvidos neste trabalho, capazes de eficientemente amplificar os domínios biossintéticos (KS e A) de estirpes bacterianas pertencentes a pelo menos, os filos de Actinobactéria, Cianobactéria, Proteobactéria e Planctomicetes, úteis para triagem de isolados bacterianos em grande escala e estudos de bioprospecção de metagenómica. Caso validações futuras comprovem a sua eficiência, tais primers poderão vir a tornar-se um novo padrão para bioprospecção metagenómica com base em PCR. As amostras ambientais da Antártida revelaram uma grande diversidade de filos quimicamente prolíficos, em particular de actinobactérias e cianobactérias. Foram obtidos isolados bacterianos dos filos Actinobacteria, Firmicutes e Proteobacteria e ainda espécies de fungos. Verificou-se que muitos dos isolados demonstravam FCUP v Exploring Polar Microbiomes as Source of Bioactive Molecules bioatividade em diferentes ensaios, em particular um extrato fraccionado com propriedades antimicrobianas produzido por um fungo do género Penicillium. Duas potenciais novas espécies de dois géneros diferentes são apresentadas e que têm também capacidade genética de produção de metabolitos secundários. Palavras-chave Produtos naturais, metabolismo secundário, primers, diversidade microbiana, PKS, NRPS, bioatividade FCUP vi Exploring Polar Microbiomes as Source of Bioactive Molecules Abstract With the increase in incidence of antibiotic multi-resistant bacterial species and diseases as cancer, there is an urgent necessity to find new potential drugs. Microbial natural products have yielded a variety of currently used pharmaceutically important compounds. Presently the strategies adopted to find new molecules rely on the genetic analysis of the biosynthetic gene clusters/genomes as well as gene mining (for PKS and NRPS genes), combined with bioactivity- and structure-guided discovery. Furthermore, the study of microorganisms inhabiting extreme environments is also pointed as an auspicious strategy, as it is expected that a large fraction of their microbiota is still unknown and that these organisms possess unique adaptations to their habitats, including the production of novel molecules. Here, we combine both biosynthetic gene mining and bioactivity-guided strategies to survey the bioactive potential of a polar microbiome, the McMurdo Dry Valleys, in Antarctica. To achieve this, two main objectives were pursued: (1) the design of a primer pair to amplify the KS and A domain of PKS and NRPS genes from a wide range of chemically-prolific bacterial phyla and, (2) biodiversity analysis of pyrosequencing data, isolation and growth of microorganisms from Antarctic environmental samples and screening of the bioactive potential of the isolates through in vitro assays. Improved primer pairs, able to efficiently amplify the biosynthetic domains from Actinobacteria, Cyanobacteria, Proteobacteria and Planctomycetes bacterial strains, at least, were obtained, useful for large-scale screening of bacterial isolates and bioprospection in metagenomic studies. If further validation confirms the efficiency, our primers may become a new standard for PCR-based metagenomics bioprospection. Antarctic samples revealed to harbour a large diversity of prolific phyla, mainly Actinobacteria and Cyanobacteria. Bacterial strains from Actinobacteria, Firmicutes, and Proteobacteria phyla, and Fungi strains were isolated. Bioactivity was reported for the first time for several strains, and a potential antimicrobial compound from a fungi Penicillium is described. Furthermore, two potential novel species from two genera are reported and according to the biosynthetic domain mining, are worth exploring. Keywords natural products, secondary metabolism, primers, microbial diversity, PKS, NRPS, bioactivity FCUP vii Exploring Polar Microbiomes as Source of Bioactive Molecules Table of contents Agradecimentos ............................................................................................................ iii Resumo ....................................................................................................................... iv Abstract ....................................................................................................................... vi List of Figures ............................................................................................................... x List of Tables ............................................................................................................... xii List of presentations .................................................................................................... xiv List of abreviations ...................................................................................................... xv Polyunsaturated fatty acid .................................................................................... xvi I – Introduction ............................................................................................................ 1 1 - A new era in Natural products - Gene and Genome mining for discovery of (novel) molecules ...................................................................................................... 4 1.1 - Culture-dependent approach ......................................................................... 4 1.2 - Culture independent approach – Metagenomics ............................................ 7 Chapter 1 - Design of primer pairs targeting the biosynthetic domains of PKS and NRPS genes in Bacteria ..........................................................................................