DIVERSIDAD GENETICA y FILOGENIA MOLECULAR DEL GENERO ()

Pintaud Jean-Christophe, Gluchy Delphine y Ludeña Bertha

Laboratorio de Genética Molecular Colaboración IRD-PUCE Escuela de Ciencias Biológicas Pontificia Universidad Católica del Ecuador Apartado 17-01-2184

RESUMEN

El género de palmeras Astrocaryum (Arecoideae, Cocoeae, Bactridinae) comprende cerca de 35 especies y está presente en toda la región neotropical continental, con un centro de diversificación principal en la Amazonía. El género se divide en 2 sub-géneros : Monogynanthus y P/eiogynanthus. La variabilidad genética ha sido evaluada anteriormente por la técnica de AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) que permitió poner en evidencia 4 grupos genéticos. El actual estudio está enfocado al análisis de la diversida.d genética y al establecimiento de la filogenia del género Astrocaryum en base al secuenciamiento de tres espaciadores intergénicos c1oroplásticos ( amplificados en 10 individuos, representantes de 6 especies diferentes) y al análisis de diez loci microsatélite nucleares provenientes de la palma africana E/aeis guineensis, así como de 16 loci tomados del dátil Phoenix dactylifera que fueron probados en 6 individuos representantes de 6 especies diferentes. Las secuencias c1oroplásticas exhiben una variabilidad genética importante entre las secciones del sub-género Monogynanthus. Las substituciones nucleotídicas constituyen el polimorfismo más importante, pero numerosas secuencias repetidas en tandem han sido igua.lmente identificadas. De igual modo, se ha detectado un polimorfismo de inversión. Los resultados obtenidos con los marcadores nucleares demuestran que los microsatélites de E/aeis son altamente transferibles al género Astrocaryum mientras que aquellos de Phoenix, que está mucho más alejado filogenéticamente, son sensiblemente menos transferibles.

249 INTRODUCCION polinizad< El género Astrocaryum pertenece a la tribu de las Cocoeae, (Listrabat cuyo caracter distinctivo principal es el fruto tricarpelar con mamffero endocarpio lefioso, provisto de un poro germinativo en cada carpelo. peces en Dentro de las Cocoeae, Astrocaryum pertenece a la sub-tribu neotropical de Bactridinae, caracterizada por la presencia de E espinas de orfgen epidérmica sobre la mayor parte de organos por Burre (tronco, hojas, en ocasiones inclusive sobre las flores y frutos). El sub-géner género Astrocaryum se diferencia de géneros vecinos coma Bactris flores tell' por un espeso revestimiento de cera blancuzca en la cara inferior de sub-géner los foliolos (Tabla 1). base de 1; en dos SE Tabla 1. Posicién taxonémica dei género Astrocaryum dentro de la familia présenta l de las palmeras, en base a la nomenclatura de Uhl & Dransfield, 1987. las especi Ayri, Kahr Familia: Arecaceae 0 Palmae El analisi~ Sub-familia: Arecoideae Second 1! Tribu Cocoeae cuatro gr Sub-tribu Bactridinae corresponc Géneros: Astrocaryum Bactris Munbaca Desmoncus incluye trE Aiphanes finalmente Acrocomia incluye pl Gastrococos individuali2 dei analisi~ Astrocaryum comprende alrededor de 35 especies interior de ampliamente distribuidas desde el sur de México (A. mexicanum), relaciones América central (A. a/atum, A. confertum), los valles interandinos marcadore: colombianos (A. ma/ybo, A. triandrum) , la costa dei Pacffico de espaciador Ecuador y Colombia (A. stand/eyanum) hasta el Mata Atlantica dei trnS-trnfM. sur dei Brasil (A. acu/eatissimum), las savanas, cerrados y galerfas de las tas; forestales peri-amazonianos (A. campestre, A. huaimi, A. gratum, A. registrada chonta), y sobre todo la Amazonfa en sf misma, que es el centro principales mayor de diversidad dei género con 26 especies. Astrocaryum puntuales, presenta una gran diversidad de tipos biologicos. Existen especies de bases de tronco reducido y subterraneo (ex. A. acau/e) , otras con un tronco tandem (Hé unico de dimensiones moderada a grande, y finalmente, especies relaciones con tallos multiples de dimension diversa (Kahn & de Granville, no son suf;( 1992). En el piano ecol6gico, Astrocaryum es también muy diverso, relaciones incluyendo especies selvaticas de soto bosque y de canopea, afines. COI especies savanfcolas, y palustres. Las especies de Astrocaryum son hemos utili .. 250 -,----r- r1 polinizadas por insectos, principalmente por pequenos cole6pteros

~ocoeae, (Listrabath 1992), y los frutos son dispersados principalmente por mamfferos, en particular por roedores (Sist, 1989) 0 inclusive por 31ar con peces en el caso de especies anfibias (A. jauart). l carpelo. sub-tribu El género Astrocaryum ha sido dividido en dos sub-géneros ~ncia de por Burret (1934), en base a la estructura de la inflorescencia. El 6rganos sub-género Pleiogynanthus se caracteriza por la presencia de varias rutos). El o Bactris flores femeninas en la base de cada raqueola, rnientras que en el nferior de sub-género Monogynanthus, las flores femeninas son solitarias en la . base de las raqueolas. Burret divide el sub-género Monogynanthus en dos secciones, Munbaca, que incluye las especies cuyo fruto a la familia présenta un epicarpio dehiscente en la madurez, y Ayri, que incluye 1987. las especies con epicarpio indehiscente. AI interior de la secci6n Ayri, Kahn y Millan (1992) distinguen 4 grupos de especies (1 a 4). El analisis con los marcadores AFLP en Astrocaryum (Kahn & Second 1999), muestra que en efecto el género se estructura en cuatro grupos de especies bien distintas. El primer grupo corresponde al sub-género Pleiogynanthus, el segundo a la secci6n Munbaca de Monogynanthus; el tercero, al grupo 1 de Ayri que incluye tres especies de las Guyanas y de Amazonia centra', y finalmente el ultimo corresponde a los grupos 2-3-4 de Ayri que incluye principalmente a especies dei oeste-amazoniano. La individualizaci6n deI sub-género Monogynanthus no aparece a nivel dei analisis de AFLP, y las relaciones entre estos cuatro grupos y al especies interior de cada unD no han sido resueltas. A fin de precisar las lexicanum) , relaciones filogenéticas entre especies, hemos utilizado otros lterandinos marcadores moleculares. Por una parte hemos secuenciado Pacffico de espaciadores c1oroplasticos intergénicos, trnD-trnT, trnQ-rps16 y U/antica dei trnS-trnfM. Se trata de regiones no codificantes, que presentan una s y galerfas de las tasas de evoluci6n molecular mas elevada que haya sido . gratum, A. registrada al interior de la molécula de ADN c1oroplastico. Las 3S elcentro principales mutaciones observadas son substituciones nucleotfdicas 4strocaryum puntuales, deleciones de dimensi6n variable (desde algunos pares m especies de bases hasta 1kb), .y repeticiones directas de secuencias en on un tronco tandem (Hahn, 2002). Estos marcadores son l.Jtiles para establecer e, especies relaciones filogenéticas entre grupos principales de especies, pero je Granville, no son suficientemente variables para proveer informaci6n sobre las muy diverso, relaciones existentes al interior de complejos de especies muy de canopea, afines. Con el objetivo de acceder a esta escala de diferenciaci6n, "Ocaryum so n 1' hemos utilizado marcadores microsatélites, altamente polim6rficos. 251 l; t En primera instancia, se estudi6 la transferabilidad de loci aislados en gel dE de Elaeis guineensis (palma africana) y de Phoenix dactylifera purificadc (datil). Se tiene igualmente planificado probar loci de Bactris gasipaes (palmito) y luego pasar a marcadores especfficos de Secuenc Astrocaryum. L MATERIALES y MÉTODOS placas de purificadc Material vegetal utilizado - Las especies de Astrocaryum terminato fueron colectadas en la natura.leza 0 en jardines botanicos. Se secuencie recogieron foliolos, idealmente provenientes de una hoja aun no amplificac abierta 0 ligeramente abierta (poco esclarificada y desprovista de palmeras parasitos y epifilos). Posteriormente fueron cortadas en pedazos e en los le inmediatamente puestas a secar en una boisa ZIPLOC con gel de France. sflice anhidro (100 9 de gel de silice por 10 9 de tejido fresco). ", Analisis c Extracci6n de ADN

Los pedazos de hojas secas fueron homogeneizados hasta Lo convertirse en polvo fine con la ayuda de un triturador de analisis ensamblac DNASTAF (IKA A10), provisto de una cuchilla en cruz, durante un minuta aproximadamente. El triturador fue inmediatamente limpiado con el progran programa una soluci6n de hipoclorito de sodio a 12% y luego con etanol a comparad< 90%, para evitar todo vestigio de contaminaci6n entre las muestras. Cocoeae ( El ADN total fue enseguida extraido a partir de 20-30 mg de polvo con la ayuda dei kit DNeasy Minikit, siguiendo el protocolo dei Amplificac fabricante (Qiagen).

Amplificaci6n para secuenciamiento 10 amplificacie Astrocaryu Los espaciadores c1oroplasticos fueron amplificados 2001), dei mediante la utilizaci6n de primers universales para espermatofitas ined) fuero: descritas por Demesure et al. (1995) y Hahn (2002). Cerca de 25 ng diferentes ' de ADN total son amplifica.dos mediante PCR en las siguientes scophilum, condiciones : mezcla reaccional : 25 !JI ; concentraciones finales: amplificacié primers Forward y Reverse 0,2 IJM, premix E 1X Y mix enzimatico reducido (1 0,625 U (Failsafe PCR kit, Epicentre). Las condiciones de PCR son Las amplifie las siguientes : denaturaci6n inicial, 2 min. a 95°C, luego 35 ciclos a positivo (E 95°C (30 s), annealing a 52-65°C de acuerdo a los primers (30 s), contra/ados extensi6n a 72°C (2,5 min.) y extensi6n final 72°C durante 7 positivos, e minutos. Los praductos de amplificaci6n son enseguida contrai ados fin de idel

252 '1- , . j lislados en gel de agarosa coloreado con bromuro de etidio y posteriormente ctylifera r purificados con el kit Qiaquick PCR purification kit (Qiagen). Bactris 1 icos de j Secuenciamiento

Las reacciones de secuenciamiento fueron preparadas en placas de 96 pozos, conteniendo cada una 50 ng de producto PCR purificado, 10 pmoles de un primer y la mezcla de reacci6n SigDye ;)caryum terminator (Applied Siosystems). Las regiones estudiadas fueron ,cos. Se secuenciadas en los dos sentidos utilizando primers de aun no amplificaci6n, luego un par de primers internos especificos de Ivista de palmeras (Hahn, 2002 e ined.). El secuenciamiento fue subtratado ldazos e en los laboratorios Génopole Languedoc-Roussillon, Perpignan, ln gel de France. »). Analisis de secuencias

Los cromatogramas (documentos Trace .abi) fueron los hasta ensamblados y editados con la ayuda dei programa Seqman de ~ analisis DNASTAR (Lasergene), las secuencias alineadas manualmente en n minuta el programa PAUP 4.010b (Sinauer) y estudiados con la ayuda dei liado con programa MacClade 4.0 (Sinauer). Las secuencias obtenidas fueron etanol a comparadas a aquellas de un muestreo representativo de la tribu de muestras. Cocoeae (Hahn 2002 e ined.). de polvo tocolo dei Amplificaciones de loci microsatélites

10 loci microsatélites de Elaeis guineensis con una amplificaci6n positiva en al menos una de tres especies: Astrocaryum sciophilum, A. paramaca y A. vulgare (Sillotte et al. nplificados 2001), dei mismo que 16 loci de Phoenix dactylifera (Sillotte et al. ~rmatofitas ined) fueron probados en 6 individuos representantes de 6 especies 3 de 25 ng diferentes de Astrocaryum (A. alatum, A. chambira, A. chonta, A. siguientes scophilum, A. urostachys et A. scopatum). El protocolo de 3S finales: amplificaci6n difiere dei precedente por un volumen reaccional enzimatico reducido (12,5 1-11), Y una duraci6n de elongaci6n mas corta (1 min.). ~ PCR son Las amplificaciones han sido efectuadas en presencia de un testigo 35 ciclos a positivo (Elaeis 0 Phoenix segun el locus de origen), luego lers (30 s), controlados en gel de agarosa, y finalmente, para los productos durante 7 positivos, en gel de poliacrilamida coloreado con nitrato de plata, a ::;ontrolados fin de identificar precisamente el patr6n de bandas. Los loci

253 i 1 L retenidos para un genotipage ulterior fueron aquellos que (1) mie presentaron uno 0 dos alelos en la zona aléliea esperada de la polinuch especie de origen, 0 a proximidad de ella. de secui RESULTADOS y (3) sut freeuentl Secuencias cloroplasticas Tabla 3.. Se obtuvo 23 seeuencias para 10 individuos (Tabla 2). de las sec

Tabla 2. Lista de las secuencias de espaciadores intergénicos cloroplasticos Tipo de p( adquiridas. Microsatéli VNTRs Especie,accesi6n y Lugarde Secuencia Secuencia Secuencia Inversione~ grupo infragenérico origen trnQ-rps16 trnS- Substitueio trnD-trnT trnsfM tral tral Aalatum JCP 371 Miami, USA Completa Completa Completa (Monogynanthus) (cultivado) Asciophilum JCP 312 Guyana Completa LI (Ayri 1) frcsa repetitivm A javarense JCP 308 Peru Completa Completa repetitiva~ (Ayri 2) A javarense JCP 309 Peru Parcial Microsaté (Ayri 2) A huicungoJCP 313 Peru Completa Completa (Ayri 2) Tc A huicungo JCP 315 Peru Completa Completa Completa en todas (Ayri 2) 60% de 10: A chonta JCP 306 Peru Pareial Completa Completa a 6, de las (Ayri 4) A chonta JCP 307 Peru Completa Completa Completa DISCUSlé (Ayri 4) A murumuru JCP 310 Guyana Completa Completa (Ayri 4) frcsa Se A murumuru JCP 311 Guyana Completa Completa Completa poteneialm (Ayri 4) frcsa numerosas secuencias Los individuos seeuenciados representan tres de euatro muestreo : grupos de especies identificados por AFLP: Monogynanthus substitucior (Astrocaryum a/atum) , Ayri grupo 1 (A. sciophilum, pero unicamente infragenéric para trnD-trnT), y Ayri grupos 2-3-4 (A. javarense, A. huicunga, A. facilmente chanta, A. murumuru). La seeuencia trnS-trnfM eomprende 1250 probablemE posiciones alineadas, la seeueneia trnD-trnT, 990, y la secuencia entre esos trnQ-rps16, 1130, es deeir un total de 3370 caracteres. El puede esr polimorfismo observado al interior de Astrocaryum es de tres tipos : substitucion variaciones 254 ,- r- '0 1 ï ! os que l (1) microsatélites mono- y dinucleoHdicos, y otras secuencias J. ja de la polinucleotfdicas repetitivas en tandem (VNTRs) ; (2) polimorfismo de secuencia inversa (reemplazo por la secuencia complementaria) y (3) substituciones puntuales, que constituyen el polimorfismo mas frecuente (Tabla 3).

Tabla 3. Sinopsis de los polimorfismos observados en Astrocaryum a nivel 2). de las secuencias de los tres espaciadores c1oroplasticos.

roplasticos Tipo de polimorfismo No. promedio/kb Microsatélites mononucleotfdicos 1,8 VNTRs 1,2 5ecuencia Inversiones 0,3 trnS­ Substituciones 5,9 trnsfM transiciones : 2,1 transversiones : 3,8 Completa Los microsatélites mononucleotfdicos son los motivas repetitivos mas numerosos. Las secuencias polinucleotidfcas repetitivas en tandem conllevan pocas repeticiones (una 0 dos).

Microsatélites

Todos los loci de Elaeis guineensis utilizados amplificaron en todas las especies de Astrocaryum analizadas, mientras que Completa 60% de los loci de Phoenix dactylifera fueron transferibles a, entre 4 Completa a 6, de las especies analizadas.

Completa DISCUSION

Secuencias c1oroplasticas Las substituciones, Completa potencialmente informativas desde el punta de vista filogenético son numerosas y estan regularmente repartidas dentro de las secuencias estudiadas (en promedio 5,9/kb). Si bien es cierto que el de cuatro muestreo es aun incompleto, parecerfa que muchas de esas )gynanthus substituciones son sinapomorfias de los grupos principales unicamente infragenéricos. Estas secuencias deberfan entonces permitir uicungo, A. facilmente encontrar los cuatro grupos identificados en AFLP, Y -ende 1250 probablemente dar igualmente informaciones sobre las relaciones l secuencia entre esos grupos. AI interior de los mismos, la resoluci6n que se acteres. El puede esperar es ciertamente débil, aun cuando ciertas ~ tres tipos : substituciones parecerfan ser caracterfsticas de cada especie. Las variaciones a nivel de los motivos repetitivos en tandem

255 corresponden, igualmente en gran parte, a grupos principales. En todo caso, un microsatélite mononucleotrdico en trnQ-rps16, (T)12­ A. Micro 14 Y un dinucleotrdico en trnD-trnT (AT)12-16, presentan una gran Astrocar variabilidad inter- e intra-especffica, y podrfan ser utilizadas en Astrocar. Astrocar: genotipaje para el analisis de un polimorfismo poblacional. Otro tipo Astrocar: de polimorfismo intra-especffico ha sido identificado. Se trata de Astroca.rJ inversiones correspondientes al complemento de una corta Astroca.rJ secuencia. Este tipo de polimorfismo, aun poco estudiado, parece AstrocaI} ser muy interesante. En Astrocaryum huicungo, parece que se AstrocaI} corroborran las barreras geogrâficas (Figura 1).

B. Micros Microsatélites nucleares filogenét

La alta transferabilidad de loci de Elaeis a Astrocaryum se explica par la proximidad filogenética de Bactridinae y de Elaeidinae Astrocaryl Phoenix (grupos hermanos, Hahn 2002). El género se encuentra muy Astrocaryl alejado de Astrocaryum; pertenece a una sub-familia diferente Astrocaryl (Coryphoideae) y esta muy aislado filogenéticamente (Asmussen & Astrocaryt Chase 2001). Sin embargo, la mayorfa de loci de Phoenix amplificaron lo,.strocaryl: en Astrocaryum, 10 cual demuestra que las secuencias Iimftrofes a los Astrocaryu microsatélites nucleares estan bien conservadas en toda la familia de Astrocaryu palmeras, por tante consideramos la posibilidad de utilizar marcadores Astrocaryu generados para otras especies. _lo.strocaryu Astrocaryu; Disponemos entonces de marcadores tante de filogenia y de_ diversidad genética para Astrocaryum, provenientes de dos C. Polimœ compartimientos celulares distintos (nûcleo y cloroplasto) que podran complementc ser utilizados en todo el género, asf como para analisis huicungo. interpoblacionales en complejos de especies afines.

Astrocaryum Astrocaryum Astrocaryum Astrocaryum Astrocaryum Astrocaryum Astrocaryum

Figura 1. Aigi espaciadores

256 laIes. En A. Microsatélite mononucleotidico (trnQ-rps16) 6, (T)12­ Astrocaryum alatum 371 GGAAATAAATATCTTTTTTTTTTTT----AATTCAAAAAA Jna gran Astrocaryum javarense 308 GGAAATAAATATCTTTTTTTTTTTTT---AATTCAAAAAA adas en Astrocaryum huicungo 313 GGAAATAAATATCTTTTTTTTTTTTT---AATTCAAAAAA Otro tipo Astrocaryum huicungo Ji5 GGAAATAAATATCTTTTTTTTTTTTTT -- ~ AATTCAAAAAA trata de Astrocaryum chonta 306 GGAAATAAATATCTTTTTTTTTTTTT---AATTCAAAAAA la corta Astrocaryum chonta 307 GGAAATAAATATCTTTTTTTTTTTTT---AATTCAAAAAA ), parece Astrocaryum murumuru 310 GGAAATAAATATCTTTTTTTTTTTTTT--AATTCAAAAAA ) que se Astrocaryum murumuru 311 GGAAATAAATATCTTTTTTTTTTTTTT--AATTCAAAAAA

B. Microsatélite dinucleotidico alterado por mutaciones filogenéticamente informativas (trnD-trnT) 850 860 870 880 aryum se ~Iaeidinae Astrocaryum a1atum 371 TATGCATATATGTACATATATACATATATACATATATG 3ntra muy Astrocaryum sciophi1urn 312 · T.A .. T TATATAT------G diferente Astrocaryum javarense 308 · T. T ..T .. , TTTATAT------G nussen & Astrocaryum javarense 309 ...... T.T ..T TATATATATAT----G nplificaron Astrocaryum huicunga 313 · T. T .. T TATTTAT------G ofes a los Astrocaryum huicunga 315 · T. T .. T TATTTAT------G familia de Astrocaryum chonta 306 · T. T .. T TTTATAT------G larcadores Astrocaryum chanta 307 ...... T.T .. T TTTATAT------G Astrocaryum rnurumuru 310 · .. , T. T .. T TTTATAT------G Astrocaryum rnurumuru 311 · T. T .. T TTTATAT------G Jenia y de de dos C. Polimorfismo de inversion por reemplazo de una secuencia por su ue podran complemento (trnD-trnT). Notar el polimorfismo dentro de Astrocaryum l analisis buicungo.

290 300 310

Astrocaryum sciophilurn 312 TTAATTAAGA------TTAAGTATCATTAATCT Astrocaryum javarense 308 TTAATTAAGA------TTAAGTATCATTAATCT Astrocaryum huicungo 313 TTAA------TCTTAATTAAGTATCATTAATCT Astrocaryum huicungo 315 TTAATTAAGA------TTAAGTATCATTAATCT Astrocaryurn chonta 307 TTAATTAAGA------TTAAGTATCATTAATCT Astrocaryurn rnururnuru 310 TTAA------TCTTAATTAAGTATCATTAATCT Astrocaryum rnurumuru 311 TTAA------TCTTAATTAAGTATCATTAATCT

Figura 1. Aigunos ejemplos dei polimorfismo de secuencias en los espaciadores c1oroplasticos.

257 AGRADECIMIENTOS listrab; Agradecemos a Francis Kahn (IRD) por haber guiado la investigaci6n en Astrocaryum y provisto de una parte de material de estudio, a Scott Zona dei Fairchild Tropical Garden de Miami por Uhl N.\ haber permitido que se realicen muestreos en el jardin botanico, a Bill Hahn de Columbia University de New York por las secuencias de Sist P. Cocoeae y de primers puestos a nuestra disposici6n. Finalmente, agradecemos al personal de Génopôle Languedoc-Roussillon por el secuenciamiento realizado.

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