Patologický Vliv Bazálních Linií Výtrusovců (Apicomplexa) Na Tkáň Hostitele

PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA

Patologický vliv bazálních linií výtrusovců (Apicomplexa) na tkáň hostitele

Bakalářská práce

KAROLÍNA POLÁKOVÁ

Vedoucí práce: RNDr. Andrea Bardůnek Valigurová, Ph.D.

Ústav botaniky a zoologie program Ekologická a evoluční biologie

Brno 2020

PATOLOGICKÝ VLIV BAZÁLNÍCH LINIÍ VÝTRUSOVCŮ (APICOMPLEXA) NA TKÁŇ HOSTITELE

Bibliografický záznam

Autor: KAROLÍNA POLÁKOVÁ Přírodovědecká fakulta Masarykova univerzita Ústav botaniky a zoologie

Název práce: Patologický vliv bazálních linií výtrusovců (Apicomplexa) na tkáň hostitele

Studijní program: Ekologická a evoluční biologie

Vedoucí práce: RNDr. Andrea Bardůnek Valigurová, Ph.D.

Rok: 2020

Počet stran: 76

Klíčová slova: gregariny, kryptosporidie, patologie, apikální komplex, životní cyklus, hostitel, parazit

PATOLOGICKÝ VLIV BAZÁLNÍCH LINIÍ VÝTRUSOVCŮ (APICOMPLEXA) NA TKÁŇ HOSTITELE

Bibliographic record

Author: KAROLÍNA POLÁKOVÁ Faculty of Science Masaryk University Department of Botany and Zoology

Title of Thesis: Pathological effect of selected representatives of basal Apicomplexa on host tissue

Degree Programme: Ecological and Evolutionary Biology

Supervisor: RNDr. Andrea Bardůnek Valigurová, Ph.D.

Year: 2020

Number of Pages: 76

Keywords: gregarines, cryptosporidians, pathology, apical complex, life cycle, host, parasite

PATOLOGICKÝ VLIV BAZÁLNÍCH LINIÍ VÝTRUSOVCŮ (APICOMPLEXA) NA TKÁŇ HOSTITELE

Abstrakt

Bazálním liniím Apicomplexa není v současnosti věnována příliš velká pozornost, jelikož jejich zástupci nejsou považováni za ekonomicky nebo medicínsky významné. Jsou ovšem nezbytné pro pochopení fylogeneze a biologie celé skupiny Apicomplexa. Důležitými biologickými aspekty k pochopení evolučních drah výtrusovců jsou interakce vznikající mezi parazitem a hostitelem a patologický vliv parazita na hostitele. Teoretická část této práce je zaměřená na charakteristiku bazálních linií výtrusovců a popis mechanismů, jakými parazit negativně ovlivňuje svého hostitele. Rešerše zahrnuje i zhodnocení metodických postupů použitých v doposud publikovaných studiích. Praktická část se zaměřuje na vybrané histologické postupy vhodné pro studium patologie, zahrnuje popis použitých metod a získané výsledky včetně fotodokumentace.

PATOLOGICKÝ VLIV BAZÁLNÍCH LINIÍ VÝTRUSOVCŮ (APICOMPLEXA) NA TKÁŇ HOSTITELE

Abstract

The early branching lineages of Apicomplexa are not given much attention due to the low economical and medical significance of their representatives. However, they are essential for understanding the phylogeny and biology of Apicomplexa in general. Parasite-host interactions and pathological effect of the parasite on host organism are important biological aspects to understand the evolutionary pathways of apicomplexans. The theoretical part of the thesis focuses on the characterisation of basal apicomplexan lineages and a description of the mechanisms by which the parasite negatively affects its host. The literature review also includes an evaluation of methodical approaches used in previously published studies. The practical part, focusing on selected histological methods suitable for the study of pathology, comprises methods used in this thesis and results obtained including photodocumentation.

PATOLOGICKÝ VLIV BAZÁLNÍCH LINIÍ VÝTRUSOVCŮ (APICOMPLEXA) NA TKÁŇ HOSTITELE

Čestné prohlášení

Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením vedoucího práce s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.

V Brně 18. května 2020 ...... KAROLÍNA POLÁKOVÁ

PATOLOGICKÝ VLIV BAZÁLNÍCH LINIÍ VÝTRUSOVCŮ (APICOMPLEXA) NA TKÁŇ HOSTITELE

Poděkování

V této části bych velmi ráda poděkovala své vedoucí RNDr. Andree Bardůnek Valigurové, Ph.D. za ochotu a trpělivost. V tomto nelehkém období vynaložila veškeré úsilí, aby mi pomohla při vypracovávání této práce. Také bych chtě-la poděkovat své spolužačce Kateřině Hartmanové, která byla skvělou kolegyní při práci v laboratoři. V neposlední řadě děkuji své rodině a partnerovi, kteří mi byli po celou dobu oporou.

Obsah

1 Úvod 13

2 Teoretická část 14 2.1 Obecná charakteristika Apicomplexa ...... 14

2.2 Proces invaze výtrusovců do hostitelské buňky ...... 17

2.3 Životní cyklus Apicomplexa ...... 18

2.4 Charakteristika bazálních skupin výtrusovců ...... 21

2.5 Patologie parazitóz a metodické postupy používané při jejich výzkumu u bazálních výtrusovců ...... 28

3 Praktická část 41 3.1 Materiál a metodika ...... 41

3.2 Výsledky a diskuze ...... 47

4 Závěr 62

Použité zdroje 63

ÚVOD

1 Úvod

Výtrusovci (Apicomplexa) jsou bezpochyby jednou z nejdůležitějších skupin parazitických protist. Zahrnují ekonomicky a medicínsky významné patogeny způsobující závažná onemocnění člověka i zvířat, jako je malárie nebo toxoplazmóza. Díky různým evolučním tlakům si tito parazité vytvořili různé strategie pro invazi a přichycení k hostitelské buňce, což vedlo k enormní diverzifikaci jejich buněčné architektury. Během procesu invaze dochází k modifikaci hostitelské buňky nebo tkáně, která je nezbytná pro další vývoj a přežití parazita v hostiteli. Většina současných poznatků o Apicomplexa je založena na studiích zaměřených na prakticky významné a evolučně pokročilé zástupce, převážně intracelulární kokcidie. Až na kryptosporidie, které představují původce medicínsky a veterinárně významných onemocnění gastrointestinálního (případně respiračního) traktu obratlovců včetně člověka (Kuhnert-Paul et al., 2012), nejsou zástupci bazálních linií výtrusovců považováni za prakticky důležité. Nicméně představují významný stupeň evolučního vývoje a slouží k hlubšímu pochopení biologie vyšších výtrusovců, a proto si zasluhují větší pozornost. U blastogregarin a gregarin napadajících různé orgány a tělní dutiny širokého spektra vodních i terestrických druhů bezobratlých se nepředpokládá přílišný patologický vliv na hostitelskou tkáň a v současné době se dokonce spekuluje, zda se u gregarin nejedná o komenzalismus (Rueckert et al. 2019). I přesto, že gregariny parazitující laboratorně chovaný hmyz, jsou snadno dostupným a ekonomicky nenáročným modelem pro různé experimentální postupy, existuje jen málo prací zabývajících se problematikou jimi vyvolané patologie.

TEORETICKÁ ČÁST

2 Teoretická část

2.1 Obecná charakteristika Apicomplexa

Alveolata (Cavalier-Smith 1991) je monofyletická skupina podříše SAR (Burki et al. 2008, Adl et al. 2019), tvořená jednobuněčnými eukaryoty, které se vyznačují velkou rozmanitostí ve způsobu příjmu potravy, jako jsou predace, fotoautotrofie a parazitismus. Většina Alveolata spadá pod jednu ze tří hlavních tradičních skupin: nálevníci (Ciliata), obrněnky (Dinoflagellata) a výtrusovci (Apicomplexa) (Cavalier- Smith a Chao 2004; Leander a Keeling 2004). Několik linií, které nespadají do již zmíněných skupin, vytvořilo během evoluce nové samostatné větve, například rody Colpodella nebo Perkinsus. Za vznikem nových linií stojí zejména nejisté postavení některých zástupců, kteří nesou znaky jak parazita, tak i predátora a přestavují tak vhodný modelový organismus pro studium rané evoluce skupiny Alveolata (Siddall et al. 2001; Leander et al. 2003a, b; Cavalier-Smith a Chao 2004; Adl et al. 2019). Apicomplexa (Levine 1970) zahrnují velký počet druhů parazitů suchozemských i vodních bezobratlých a obratlovců, včetně člověka. Výtrusovci obsahují významné původce humánních onemocnění, jakou je malárie, toxoplazmóza, babezióza nebo kryptosporidióza, jejichž genomy jsou hojně studovány. Tato skupina obligátních parazitů se vyvinula z fotosyntetizujícího předka a je úzce spjata s volně žijícími jednobuněčnými predátory (Oborník et al. 2011, Schrével et al. 2016). Hypotéza, že Apicomplexa jsou evolučně odvozena od mixotrofních řas, se poprvé objevila po sekvenování plastidového genomu zástupců rodu Plasmodium a jeho lokalizaci v kryptické, nefotosyntetizující organele zvané apikoplast (Gardner et al. 1991a; McFadden et al. 1996; Wilson et al. 1996). Apikoplast je plastid ohraničený čtyřmi membránami, odvozený od sekundárního endosymbiontu, který bezprostředně sousedí s Golgiho aparátem. Zástupci Apicomplexa vykazují velkou variabilitu morfologických znaků v závislosti na taxonu a stádiu životního cyklu. Všeobecně výtrusovce rozdělujeme na Aconoidasida (Mehlhorn et al. 1980); Conoidasida

TEORETICKÁ ČÁST

(Levine 1988), které zahrnují Blastogregarinea (Chatton a Villeneuve 1936), Gregarinasina (Dufour 1828) a prakticky nejvýznamnější a evolučně nejvyspělejší linii Coccidia (Leuckart 1879); a dvě skupiny, Protococcidiorida (Kheisin, 1956) a Agamococcidiorida (Levine, 1979), s fylogeneticky nejistou pozicí v rámci Apicomplexa (Adl et al. 2019). Název Apicomplexa je odvozen od aparátu, který se nachází v přední části buňky parazita, tzv. apikální komplex, což je soubor organel charakteristický pro invazní, pohyblivá stádia výtrusovců (zoity) a sloužící k přichycení a invazi do hostitelské buňky. Souhrnný název zoit označuje různé typy invazivních stádií jako jsou sporozoit, merozoit, tachyzoit nebo bradyzoit (Chobotar a Scholtyseck 1982). Sporozoit představuje první fázi v životním cyklu výtrusovců v těle hostitele. Je výsledkem sexuálního procesu, během kterého dochází ke genomové rekombinaci a odlišuje se tak od asexuálního množení během vegetativní fáze, kterou představuje fáze merogonie a schizogonie (Perkins et al., 2000). Apikální komplex zoitu se skládá z kuželovitého konoidu ze spirálovitě organizovaných mikrotubulů (umožňuje invazi a může být zatahován do apikálního pólového prstence); apikálního pólového prstence (jedno ze tří center organizující mikrotubuly) a ze sekrečních organel – roptrií a mikronem (obr. 1). Dalšími mikrotubuly organizujícími centry jsou póly dělícího vřeténka a centrioly/bazální tělísko (Sinden 1978; Chobotar a Scholtyseck 1982). Proteiny produkované sekrečními organelami slouží zejména k pohybu parazita, přichycení na hostitelskou buňku a vytvoření niky parazita v/na hostitelské buňce (např. parazitoforní vakuola nebo vak) (Aikawa 1971; Valigurová et al. 2007, 2008). Na povrchu buňky parazita se nachází pro výtrusovce charakteristická krycí struktura zvaná pelikula (epicyt u gregarin), skládající se ze tří membrán: vnější plazmatické membrány a dvou kortikálních cytomembrán, které tvoří tzv. vnitřní membránový komplex. Vnitřní membránový komplex se skládá z jednoho či více zploštělých váčků, spojených ve švu a tvořících mozaiku (Morrissette a Sibley 2002). Na rozdíl od mikrotubulů, které u většiny zoitů sahají pouze do dvou třetin parazita, pokrývá vnitřní membránový komplex celou buňku s 15

TEORETICKÁ ČÁST výjimkou apikálního pólu parazita a mikroporu (obdoba cytostomu neboli buněčná ústa u výtrusovců). Je zřejmé, že se tento membránový komplex vyvinul jako vysoce všestranný systém plnící různé specifické funkce během celého životního cyklu parazita (Mann et al. 2001; Gould et al. 2008; Bullen et al. 2009). Důležitý význam má zejména při pohybu, dělení buňky, invazi a vytváření polarity parazita. Pelikula je propojena s cytoskeletem, zejména s aktinem, myozinem, mikrotubuly a proteiny, připomínající intermediální filamenta, a to vše utváří tzv. buněčný kortex (Morrissette a Sibley 2002).

Obr. 1. Schematické znázornění apikálního komplexu organel u invazivního stadia výtrusovců (upraveno podle Lecointre a Guyader 2001).

TEORETICKÁ ČÁST

2.1 Proces invaze výtrusovců do hostitelské buňky

Obecně Apicomplexa vykazují specifické adaptace pro invazi a přežití v hostiteli, které se vyvinuly pod různými evolučními tlaky, což vedlo zejména k vytvoření různých strategií parazitismu. Ty vedly k různým modifikacím jejich pohybu a způsobu přichycení na hostitelskou buňku, přičemž se zdá, že nejvyšší diverzitu těchto strategií vykazují především bazální skupiny výtrusovců (Valigurová 2019). Podle lokalizace na hostiteli jsou všeobecně parazité rozlišováni na endoparazity (parazitují uvnitř těla hostitele) a ektoparazity (parazitují na povrchu těla hostitele). Apicomplexa jsou endoparaziti a rozlišujeme u nich formy extracelulární (mimobuněčné), epicelulární (na povrchu buňky), intracelulární epiplazmatické (pronikají těsně pod hostitelskou plazmalemu), intracelulární (vnitrobuněčné), intercelulární (mezibuněčné), mezitkáňové a extracelulární (mezibuněčné) (Sheffield et al. 1971; Valigurová 2019). Invazivní stádia výtrusovců, zoity, se přesouvají na pevný substrát vázaným klouzavým pohybem, který nevyžaduje přítomnost bičíků ani pseudopodií. Pohyb zoitů umožňuje jedinečný a pro výtrusovce charakteristický mechanismus tzv. glideosom, tvořený aktino-myozinovým motorem, subpelikulárními mikrotubuly a substrátem, po kterém se zoit pohybuje díky vylučování proteinů z mikronem (Kappe et al. 2004). Glideosom představuje komplex propojující substrát s plazmatickou membránou a cytoskeletem parazita. Samotný průnik zoitu do hostitelské buňky spočívá v sekvenci rychle po sobě jdoucích procesů (Scholtyseck 1979; Perkins et al. 2000). Po nalezení vhodné hostitelské buňky se zoit uchytí k jejímu povrchu a orientuje se tak, aby se jí dotýkal apikálním koncem s konoidem. Následuje rozrušení povrchu a postupný průnik zoitu do buňky. Obsah roptrií a mikronem se vylije a inkorporuje do membrány vznikající parazitoforní vakuoly (případně vaku). Po dalším průniku zoit odhodí svůj antigenní povrch a dojde k dotvoření jeho niky (parazitoforní vakuoly nebo vaku) (Scholtyseck a Mehlhorn

TEORETICKÁ ČÁST

1970; Aikawa 1971; Carruthers et al. 1999; Morrissette a Sibley 2002a; Valigurová et al. 2007, 2008).

2.2 Životní cyklus Apicomplexa

Životní cykly výtrusovců rozlišujeme monoxenní (přímý, jednohostitelský) a heteroxenní (nepřímý, vícehostitelský) (obr. 2).

Obr. 2. Životní cyklus Apicomplexa (Morrissette a Sibley 2002).

TEORETICKÁ ČÁST

Monoxenní vývojový cyklus, charakteristický například pro kryptosporidie a většinu gregarin, je možno rozdělit do 4 hlavních fází: excystace oocyst, merogonie (chybí u některých skupin výtrusovců), gametogonie a sporogonie. Monoxenní cyklus je zde popsán na příkladě kryptosporidií (obr. 3). Během excystace dochází k uvolnění sporozoitů z oocysty (po pozření oocysty vhodným hostitelem) v místě, resp. tkáni, finální lokalizace v hostiteli. Pohybliví sporozoiti vyhledávají vhodné hostitelské buňky. Pomocí specifických receptorů se sporozoiti přichytí na membránu hostitelské buňky a vytváří parazitoforní vak hostitelského původu, který postupně obrůstá parazita lokalizovaného na luminálním povrchu hostitelské buňky (Valigurová et al. 2007, 2008; Fayer 2008). Takto ukotvený sporozoit se postupně zakulacuje a mění na vegetativní stadium zvané trofozoit. Zralý trofozoit se transformuje do stadia merontu I. typu a následuje dělení jeho jádra procesem nepohlavního dělení, tzv. merogonie. Během merogonie I. typu dochází k mnohočetnému mitotickému dělení, jehož výsledkem je 6-8 rohlíčkovitých merozoitů. Merozoiti I. typu se uvolňují z parazitoforního vaku a neomezeně cyklují (za příznivých podmínek). Část merozoitů napadá další hostitelské buňky a vytváří meronty II. typu, které produkují 4 merozoity (Current a Reese 1986; Melicherová et al. 2014). Následně se merozoiti II. typu transformují na pohlavní stádia zvané gamonty. Zatímco se některé merozoity mění na samčí mikrogamonty, jiné se transformují na samičí makrogamonty. Jádro mikrogamontu se mnohonásobně dělí a vznikají početné mikrogamety, což jsou protáhlé bezbičíkaté buňky. Makrogamonti se nedělí, pouze rostou a po oplodnění mikrogametou se mění na jediné diploidní stádium v životním cyklu, tzv. zygotu. Zygota se obalí pevným obalem a procesem sporogonie vzniká oocysta se 4 invazivními sporozoity. Dochází k uvolnění oocysty z parazitoforního vaku a jejímu vyloučení s exkrementy hostitele do vnějšího prostředí.

TEORETICKÁ ČÁST

Obr. 3. Životní cyklus Cryptosporidium parvum (zdroj: CDC 2013).

TEORETICKÁ ČÁST

Typicky heteroxenní je cyklus původce malárie Plasmodium spp. (obr. 2), který parazituje u zhruba 50 druhů plazů, ptáků a savců (Archibald et al. 2017). Přenašečem (vektorem) zástupců parazitujících na člověku je samička komára rodu Anopheles. Životní cyklus plasmodií začíná inokulací patogenu do těla hostitele během bodnutí hmyzím vektorem. Následuje exoerytrocytární fáze, kdy sporozoiti putují do hepatocytů hostitele. Zde dochází k merogonii a sporozoit se postupně mění v meront. Dochází k rychlému dělení jeho jádra a po následném rozdělení cytoplazmy vzniká velké množství merozoitů, kteří mohou migrovat a napadat erytrocyty – erytrocytární fáze. U druhů P. vivax a P. ovale může latentní stadium, tzv. hypnozoity, přetrvávat v játrech a způsobovat relapsy tím, že se uvolní do krevního řečiště, a to i po mnoha letech. Merozoiti, kteří pronikli do erytrocytů se mění v meronty. Výsledkem je namnožení parazita, degradace hemoglobinu erytrocytů a následné prasknutí hostitelské buňky, což je vysoce synchronizovaný proces způsobující horečnatý malarický záchvat. Část merozoitů se v erytrocytech diferencuje na samčí a samičí gametocyty. Prasknutí erytrocytu způsobuje opětovné vypuštění gametocytů do krevního řečiště, odkud můžou být znovu nasáty samičkou komára, kde probíhá sexuální fáze (sporogonie). Ve střevě komára dochází k vývoji gametocytů v makrogametocyty a mikrogametocyty a následné změně v makro- a mikrogamety. Splynutím gamet vzniká zygota, která se mění v protáhlý pohyblivý ookinet. Ten proniká stěnou střeva a na jeho vnější straně dochází k vývoji oocysty. Sporozoiti uvolnění z oocysty putují do slinných žláz komára, odkud po bodnutí putují do těla mezihostitele a jsou zdrojem nové infekce (Cowman a Crabb 2006; Volf a Horák 2007).

2.3 Charakteristika bazálních skupin výtrusovců

Bazální linie výtrusovců představují důležitou skupinu zejména z hlediska evoluce. Předpokládala se existence několika linií bazálních výtrusovců: blastogregariny, gregariny, kryptosporidie, agamokokcidie a protokokcidie (Valigurová 2019), ale

TEORETICKÁ ČÁST dle nejnovějších fylogenetických analýz u posledních dvou skupin byli někteří zástupci odhaleni jako sesterští k medicínsky významným výtrusovcům (Mathur et al. 2019; Janouškovec et al. 2019). Srovnávací morfologie potvrzuje, že si tyto bazální linie (zejména blastogregariny a gregariny) zachovávají charakteristické znaky předchůdců všech výtrusovců, jako jsou např. přerostlá extracelulární stádia životního cyklu, monoxenní životní cyklus a u některých zástupců (archigregariny) i vazba na bezobratlé hostitele z mořského prostředí. Zástupci bazálních linií se odlišují od ostatních výtrusovců především tím, že převážná většina jejich zástupců je epicelulární se specializovanými přichycovacími organelami a zachovávají si alespoň do určité míry pohyblivost u pozdějších vývojových stadií, tj. u trofozoitů a gamontů. Je zřejmé, že u těchto skupin dochází k využití různých druhů buněčné motility v závislosti na modifikaci jejich buněčného kortexu (Kováčiková et al. 2012, 2017, 2019; Valigurová et al. 2013, 2017).

2.3.1 Blastogregariny Blastogregariny (Blastogregarinida Chatton a Villeneuve, 1936), jejichž taxonomická pozice v rámci Apicomplexa byla donedávna nejasná, přestavují menší skupinu střevních parazitů mořských mnohoštětinatců. Komplexní molekulární a morfologická studie vyčlenila blastogregariny jako vývojově samostatný taxon Blastogregarinea (Simdyanov et al. 2018). Vykazují kombinace znaků dvou fylogeneticky vzdálených skupin výtrusovců – gregarin a kokcidií. Stavba jejich buňky připomíná archigregariny, ale na rozdíl od gregarin, stejně jako kokcidie, postrádají syzygii (=kopula, pohlavní spojení dvou gamontů). Jejich endogenní stadia se vyvíjejí epicelulárně na kartáčovém lemu enterocytů, přičemž k hostitelské buňce jsou ukotveny pomocí unikátní přichycovací organely, zvané mukron, lokalizované v přední části parazita. Mukron zároveň umožňuje výživu parazita procesem myzocytózy (modifikované fagocytózy), kdy dojde k narušení povrchu hostitelské buňky a vysátí cytoplazmy (Simdyanov a Kuvardina 2007; Simdyanov et al. 2018). Blastogregariny vykazují plesiomorfní znaky, a to, že si během celého 22

TEORETICKÁ ČÁST

života zachovávají organely apikálního komplexu a subpelikulární mikrotubuly charakteristické pro stadium zoitu u ostatních skupin výtrusovců (tzv. hypertrofický zoit neboli hypersporozoit) (Simdyanov et al. 2018). Jejích protáhlá a štíhlá buňka je kryta buněčným kortexem o podobné organizaci jako u archigregarin. Dosud jediné dva podrobně studované druhy blastogregarin, Siedleckia nematoides a Chattonaria mesnili, vykazují odlišnou stavbu mukronu jako i různou pohyblivost, která souvisí s modifikací jejich buněčného kortexu (Simdyanov et al. 2018). Pohybují se vlněním, kýváním a kroucením celé buňky, bez potřeby kontaktu s pevným substrátem (Valigurová et al. 2017, Simdyanov et al. 2018). Podobně jako u archigregarin rodu Selenidium, jsou hlavním motorem pohybu subpelikulární mikrotubuly uspořádané v jedné nebo více vrstvách pod pelikulou, pravděpodobně poháněné energií z početných mitochondrií nacházejících se pod vrstvou mikrotubulů (Schrével 1971; Valigurová et al. 2017). Blastogregariny vykazují jedinečné znaky odlišující je od ostatních výtrusovců, a to zejména přetrvávající mnohojadernost trofozoitů. Nejmladší stádium nediferencovaného trofozoitu je mononukleární buňka podobná sporozoitu. Počet jeho jader roste během vývoje. Proces merogonie a gamogonie probíhá u jednoho jedince, tzv. merogamontu, během celého života. Makrogamont má jádra uspořádaná v jedné řadě a mikrogamont má jádra roztroušená ke konci buňky. Tito gamonti procesem pučení na zadním konci buňky produkují jedno- a mnohojaderné pupeny, což Chatton a Villeneuve (1936) považovali za proces gamogonie se vznikem makrogamet a mnohojaderných mikrogametocytů, produkujících malé dvoujaderné mikrogamety. Zmínění autoři objevili v zadní části střeva obsah, který interpretovali jako kopulující gamety a zygoty. Oocysty v trusu hostitele obsahují 10-16 banánovitých volných sporozoitů (Caullery a Mesnil 1898; Chatton a Villeneuve 1936a).

TEORETICKÁ ČÁST

2.3.2 Gregariny Gregarinasina Dufour, 1828 jsou vysoce diverzifikovanou skupinou Apicomplexa vyskytující se u širokého spektra jak vodních, tak i terestrických druhů bezobratlých (Desportes a Schrével 2013). Tradičně jsou gregariny rozděleny do tří skupin: Archigregarinorida Grassé, 1953; Eugregarinorida Léger, 1900 a Neogregarinorida Grassé, 1953 (Perkins et al. 2000). Díky plesiomorfním znakům byly gregariny považovány za „primitivní“ v porovnání s výtrusovci s komplexnějšími životními cykly zahrnujícími obratlovce. Molekulární, fylogenetické i ultrastrukturální údaje však dokazují, že jsou gregariny daleko více diverzifikované, než se všeobecně předpokládá (Théodoridès 1984; Vivier a Desportes 1990; Cox 1994; Leander 2008). Vegetativní fáze životního cyklu u gregarin začíná interakcí mezi sporozoitem a hostitelskou buňkou a jeho přeměnou na trofozoit. Vývoj trofozoitu je u většiny druhů epicelulární. Trofozoit jako vegetativní stadium zajišťuje růst parazita, přičemž jeho buňka může být rozdělena na jednotlivé segmenty (epimerit, protomerit a deutomerit s jádrem) pomocí sept (monocystidní druhy vs. polycystidní druhy). Po oddělení od buňky hostitele se trofozoit mění v gamonta. Za charakteristický znak odlišující gregariny od ostatních výtrusovců můžeme považovat přítomnost sexuálního spojení (kopuly) mezi dvěma, obvykle stejně velkými, haploidními gamonty různého pohlaví, tzv. syzygie a z ní vzniklé gametocysty. Uvnitř gametocysty dochází k dělení jader gamontů a ke gamogonii, jejímž výsledkem je produkce stejného množství samčích a samičích gamet. Schopnost produkce stejného počtu samičích a samičích gamet je další významný rys oddělující gregariny od ostatních druhů výtrusovců (Desportes a Schrével 2013). Po splynutí gamet uvnitř gametocysty vznikají zygoty a dochází ke sporogonii. V tomto stádiu, někdy označovaném jako sporoblast, dochází k meiotickému dělení a vzniku sporozoitů. Oocysty eugregarin obvykle obsahují osm sporozoitů, až na výjimku archigregarin, kde jsou pouze čtyři (Desportes a Schrével 2013). 24

TEORETICKÁ ČÁST

Archigregariny (Archigregarinorida Grassé, 1953) parazitují v trávícím traktu výlučně mořských bezobratlých, především mnohoštětinatců (Schrével a Desportes 2013). Trofozoity archigregarin jsou k hostitelské buňce připojeny pomocí mukronu, který podobně jako u blastogregarin, umožňuje myzocytózu skrze dobře vyvinuté organely apikálního komplexu (Schrével 1971b; Simdyanov a Kuvardina 2007; Schrével et al. 2016; Paskerova et al. 2018). Vyznačují se přetrváváním apikálního komplexu s uzavřeným konoidem, uzpůsobeným k invazi a absencí sept rozdělujících buňku na segmenty. Jsou charakteristické monoxenním vývojovým cyklem a zachováním si procesu merogonie (Desportes a Schrével 2013). Stavbou buňky se jejich trofozoity podobají invazivnímu zoitu (tzv. hypertrofický zoit, hypersporozoit), čímž vykazují plesiomorfní znaky stejně jako blastogregariny (Valigurová et al. 2017, Simdyanov et al. 2018). Na rozdíl od zoitu jsou však mnohem větších rozměrů a někdy jsou zploštělé (Schrével 1971a, b; Leander 2008a). Svým celkovým vzhledem a způsobem pohybu (motorem jsou subpelikulární mikrotubuly) se nápadně podobají blastogregarinám (Valigurová et al. 2017, Simdyanov et al. 2018). Díky celkové charakteristice a dostupným molekulárním fylogenetickým výzkumům lze předpokládat, že se jedná o parafyletickou kmenovou skupinu, ze které se vyvinuly gregariny i ostatní Apicomplexa (Grassé 1953; Théodoridès 1984; Vivier a Desportes 1990; Cox 1994; Leander a Keeling 2003; Cavalier-Smith a Chao 2004; Leander et al. 2003b, 2006; Leander 2006, 2007, 2008a). Eugregariny (Eugregarinorida Léger, 1900) představují poměrně velké parazity s monoxenním vývojovým cyklem, který postrádá merogonii. Jsou to parazité hostitelsky a tkáňově specifičtí. Stejně jako kryptosporidie a protokokcidie jsou unikátní svou epicelulární lokalizací s poměrně komplikovaným přichycovacím aparátem (Valigurová et al. 2007, 2008, 2009, 2015; Valigurová a Koudela 2005, 2008). Eugregariny se často dělí na skupiny (dříve podřády) rozlišované podle monocystidních – aseptátních (Aseptatorina Chakravarty 1959) a polycystidních – septátních (Septatorina Lankester 1885) forem trofozoitů. Buňka aseptátních 25

TEORETICKÁ ČÁST eugregarin nebývá rozdělena septem a v přední části obsahuje přichycovací organelu podobnou mukronu. Naopak septátní druhy jsou charakterizovány přítomnosti přepážek neboli sept, rozdělující trofozoit na tři části: epimerit (organela, která ukotvuje parazita k buňce hostitele a pravděpodobně slouží k absorpci živin), navazující protomerit a deutomerit s velkým jádrem (Desportes a Schrével 2013). Většina sporozoitů eugregarin uvolněných z pozřené oocysty penetruje peritrofickou membránu hostitele a napadá buňky střevního epitelu nebo následně po penetraci střevního epitelu migruje do cílových orgánů (např. tukové těleso, Malpigiho žlázy, gonády) nebo dutin hostitele. U eugregarin byla potvrzena přítomnost apikálního komplexu pouze u stádia sporozoitu. Pro přichycení na hostitelskou buňku využívají eugregariny buď 1) mukronu podobnou organelu, 2) jednoduchý nebo složitý epimerit, vybavený různými strukturami např. filamenty, háčky nebo trny; 3) modifikovaný protomerit s rhizoidy nebo přísavkovitý protomerit (Valigurová et al. 2007, 2009; Valigurová 2019). Epimerit eugregarin parazitujících u býložravců má jednoduchý knoflíkový tvar, naproti tomu eugregariny napadající masožravce mají složitý epimerit se silnými háčky a četnými filamenty (Schrével a Philippe 1993). Zajímavostí je, že u trofozoitů Digyalum oweni byl pozorován mukron se zachovalým apikálním komplexem a roptriemi, který ale neobsahoval konoid (Dyson et al. 1994). Nicméně fylogenetická pozice tohoto organismu není dosud objasněná a je možné že se vůbec nejedná o výtrusovce (Valigurová, personální komunikace). Epicyt eugregarin tvoří na povrchu buňky podélné záhyby epicytu umožňující klouzavý pohyb. Neogregariny (Neogregarinorida Grassé, 1953) se považuji za evolučně pokročilejší skupinu gregarin s charakteristickým habitatem v tukovém tělese, Malpigiho trubicích nebo ve střevě hmyzu. Lokalizace neogregarin je intracelulární (nejčastěji) nebo mezitkáňová s redukovanou oblastí sloužící k připojení k hostitelské buňce či bez ní, nebo epicelulární s mukronem (Valigurová 2019). Existuje hypotéza, že vzhledem k tomu, že vykazují rysy jak eugregarin, tak kokcidií, představují „chybějící článek“ mezi eugregarinami a kokcidiemi (Vávra a 26

TEORETICKÁ ČÁST

McLaughlin 1970). Životní cyklus neogregarin zahrnuje sekundárně získanou merogonii. Při přemnožení je jejich vliv značně patogenní. Přítomnost apikálního komplexu u pozdějších vývojových stadií neogregarin není zcela objasněna. Nicméně u druhu Mattesia grandis byla přítomnost apikálního komplexu potvrzena u všech vývojových stádií (s výjimkou jednojaderných a čtyřjaderných merontů, kde byla tato struktura přeměněna na dočasný mukron) (Vávra a McLaughlin 1970).

2.3.3 Kryptosporidie Kryptosporidie (Cryptogregarinorida Cavalier-Smith 2014; Adl et al. 2019) jsou významnými parazity širokého spektra obratlovců, které dle nedávných fylogenetických a morfologických studií představují sesterskou skupinu gregarin (Carreno et al. 1999; Leander et al. 2003; Barta a Thompson 2006; Valigurová et al. 2007, 2008, 2015; Aldeyarbi a Karanis 2016; Simdyanov et al. 2017). Dle poslední revize klasifikace eukaryot řadíme kryptosporidie do Gregarinasina (Dufour 1828) (Adl et al. 2019). Představují celosvětově rozšířené a medicínsky i veterinárně významné patogeny parazitující epiteliální buňky gastrointestinálního a dýchacího traktu všech skupin obratlovců včetně člověka. K nákaze dochází po pozření sporulovaných oocyst se 4 sporozoity. Životní cyklus kryptosporidií byl podrobně popsán v kapitole 2.1. Díky nedávným výzkumům dvou evolučně vzdálených druhů kryptosporidií, u kterých byl sledován proces uchycení a počáteční vývoj trofozoitů, bylo navrženo použití termínu „epicelulární“ jako vhodnější pro vyjádření lokalizace kryptosporidií v hostiteli, namísto termínu „intracelulární extracytoplasmatický“ jak bylo uváděno doposud (Valigurová et al. 2007, 2008). Vývoj endogenních stádií těchto parazitů s monoxenním cyklem je tedy epicelulární a odehrává se v parazitoforním vaku hostitelského původu, obvykle na povrchu gastrointestinálního epitelu s mikroklky (Scholtyseck a Mehlhorn 1970; Aikawa 1971; Carruthers et al. 1999; Morrissette and Sibley 2002a; Valigurová et al. 2007, 2008; Simdyanov et al. 2018). Hostitelská specifita kryptosporidií varíruje od zástupců napadajících několik druhů hostitelů až po druhy vysoce specifické. 27

TEORETICKÁ ČÁST

2.4 Patologie parazitóz a metodické postupy používané při jejich výzkumu u bazálních výtrusovců

Obecně patogenní vliv parazita na hostitele závisí na jeho lokalizaci na/v buňce nebo tkáni hostitele. Navíc různá vývojová stadia výtrusovců mohou vykazovat různou patogenitu. Vzhledem k praktické významnosti kryptosporidií je jim věnována větší pozornost v dosavadním výzkumu, z čehož plyne i využití širšího spektra metodických postupů, které jsou často sofistikovanější a finančně nákladnější. Proto je vyhodnocení patologie a použitých metodických postupů rozděleno podle skupin bazálních výtrusovců.

2.4.1 Blastogregariny a gregariny Patologický vliv archigregarin a blastogregarin přichycených k hostitelské buňce pomocí relativně mělce zanořeného mukronu je zkoumán pouze okrajově, a to zejména s pomocí elektronové mikroskopie. Až na oblast hostitelské plazmatické membrány v přímém kontaktu s cytostomem blastogregarin S. nematoides a C. mesnili, která vykazovala vyšší elektronovou denzitu a u S. nematoides i zdánlivou perforaci glykokalyxového buněčného kabátu, žádné jiné modifikace parazitovaných nebo sousedících enterocytů nebyly detekovány (Simdyanov et al. 2018). U archigregarin Selenidium pendula byl dokumentovaný tropismus parazita k epitelovým buňkám bohatým na granula (Schrével et al. 2016). Ve střevě mnohoštětinatců Scolelepis squamata mohou trofozoity nebo syzygie S. pendula vytvářet shluky, avšak důsledky pro infikovaného hostitele nejsou známy (Schrével et al. 2016). Zřejmý patogenní účinek mukronu archigregariny S. hollandei na tkáň hostitele byl prokázán u mnohoštětinatců Sebellaria alveolata, kde přichycená archigregarina indukovala lytické změny hostitelské buňky (Schrével 1969a). U eugregarin není předpokládán přílišný patologický vliv na tkáň hostitele, přičemž existují spekulace, zda se v určitých případech vůbec jedná o parazitismus (Rueckert et al. 2019; Valigurová 2012). Převážná většina eugregarin parazituje ve střevě svého hostitele, ale mohou napadat i jiné orgány. Obecně se předpokládá, že 28

TEORETICKÁ ČÁST způsobují spíše mechanické a fyziologické poškození buněk střevního epitelu, ovlivňují vylučování toxinů a metabolitů během pinocytózy. Mezi sekundární vlivy parazitů na hostitele patří např. změna výživy hostitele, poškození varlat nebo semenných váčků s částečnou kastrací (Loubatières 1955). Názory autorů na fenomén parazitizmu u eugregarin se rozcházejí, a to dokonce u toho samého druhu. Například některé studie popisují značně pozitivní vliv eugregarin z larev potemníka moučného (Tenebrio molitor) na rychlost růstu a snížení úmrtnosti larev a považují je za komenzály až mutualisty (Sumner 1936; Valigurová 2012; Bollatti a Ceballos 2014). Značný vliv na patogenitu má však intenzita parazitace hostitele (Rodriguez et al. 2007), a to zejména z důvodu sníženého příjmu potravy, zablokování nebo perforace střeva. Pro studium morfologických a funkčních změn způsobených druhem G. cuneata ve střevě potemníka hnědého (Tribolium castaneum) využil Gigliolli et al. (2015) mimo běžné metody také biochemickou analýzu esteráz na polyakrylamidovém gelu (PAGE). Tato metoda umožnila stanovení celkového obsahu proteinů, aktivitu amylázy, expresi a související aktivitu esteráz. Ve střevech parazitovaných jedinců byla díky této metodě prokázána snížená aktivita amylázy. Ačkoliv byly v endokrinních buňkách pozorovány jen malé morfologické změny, výsledky naznačují, že by mohla být narušena syntéza a/nebo uvolňování hormonů. Autoři se domnívají, že gregariny mění fyziologii a morfologii střeva hostitele a mohou mít za následek nutriční vyčerpání a zhoršení jiných fyziologických procesů, jako je vývoj a reprodukce hostitele. Parazité tedy mohou značně negativně ovlivnit konečnou hmotnost larválních stadií a jejich schopnost dokončit vývoj ve chvíli, kdy byli infikovaní jedinci vystaveni dietnímu stresu (Harry 1967). K stanovení prevalence parazitů byla mimo jiné použita metoda vlhkého roztěru střevního obsahu, přičemž preparáty byly fixovány a obarveny kyselým fuchsinem (Sumner 1936). Eugregariny jsou často považovány za patogeny zejména proto, že během epicelulárního, intercelulárního nebo intracelulárního vývoje trofozoitů dochází ke zničení jednotlivých buněk střevního epitelu hostitele. Tyto buňky se ale poměrně 29

TEORETICKÁ ČÁST rychle obnovují, a proto je celková virulence eugregarin slabá. Poškození střevních buněk je však obvykle příčinou vstupu ostatních patogenů do tělní dutiny (Lipa 1967). Druhy osidlující slepé přívěsky střeva mohou způsobit jeho hypertrofii, a dokonce až rupturu vedoucí k sekundární infekci a bakteriální septikémii, a proto jsou většinou více patogenní než ty, které se nachází ve střední části střeva (Tanada a Kaya 1993). Podobně byly v přední části luminu střeva lýkožrouta smrkového (Ips typographus), který způsobuje značné ekonomické ztráty, nalezeny stádia G. typhographi ničící střevní výstelku působením svých metabolitů a umožňující tak vstup jiným mikroorganismům (Yaman 2007). Se stupněm poškození jednotlivých buněk parazitované tkáně také úzce souvisí typ přichycovací organely (jednoduchý epimerit vs. komplikovaný epimerit s trny nebo háčky), a také způsob uvolnění zralých trofozoitů z hostitelské tkáně. Harry (1965) během studie ranného vývoje eugregariny G. garnhami, která parazituje zejména v caecu a střevě sarančete Schistocerca gregaria, využil několik zajímavých výzkumných přístupů. Pro studium změn trávícího epitelu hostitele během procesu svlékání, byla použita speciální fixáž Yao-Nan (původně navržena pro studium cytologie střeva hmyzu), v kombinaci s impregnací Steedmanovým voskem a barvením Massonovým trichromem. Při sledování vývoje parazita byly na infikovaná střeva použity dva druhy fixace (oxid osmičelý v acetonovém pufru a Yao-Nan), přičemž byl postup vymývání fixáže upraven, kvůli redukci artefaktů vznikajících v důsledku osmotických změn. Vzorky byly obarveny v Heidenhainově železitém hematoxylinu. Výsledkem této metody byly konzistentní tenké řezy (0,5 - 2 µm) umožňující využití vysokého rozlišení mikroskopu s fázovým kontrastem, které podle autora umožňují získat výsledky kvalitativně mezi běžnou světelnou a elektronovou mikroskopii. Během tohoto experimentu bylo prokázáno, že to, co ostatní autoři považovali za ranná intracelulární stádia parazita, nepochybně představovalo chromatická granula produkovaná degenerací epiteliálních buněk, což je běžným jevem u členovců během svlékání. Dle autora tento proces protlačování buněk sousedními buňkami a následná degenerace také vyvrátil hypotézu Kamm (1920), že se jedná o proces 30

TEORETICKÁ ČÁST penetrace sporozoity. Navíc, Harry (1965) prokázal, že si oddělené trofozoity svůj epimerit zachovávají a že k odloučení od hostitelské buňky může dojít ve kterékoli fázi vývojového cyklu parazita, nejedná se tedy o výsadu zralého trofozoitu. K podobnému závěru dospěl i Lucarotti (2000), který při světelné mikroskopii (pozorovaní nativních preparátů pomocí fázového kontrastu, Giemsou barvené roztěry, polotenké řezy barvené toluidinovou modří) a TEM studii eugregariny Leidyana canadensis z larev motýlů Lambdina fiscellaria fixoval střeva v agaróze a epoxidové pryskyřici pro TEM zpracování. Tímto postupem zachoval integritu obsahu střev a polotenké řezy barvil toluidinovou modří. Pro svá pozorovaní využil také světelně mikroskopickou analýzu nativních roztěrů (z fragmentů parazitovaného střeva) pomocí fázového kontrastu a Giemsou barvených roztěrových preparátů. Podle autora epimerit ve skutečnosti neproniká do hostitelské buňky, ale způsobuje invaginaci plazmatické membrány buňky, kterou obklopují mikrotubuly a mitochondrie v cytoplazmě hostitelské buňky. Tyto pozorování byly v rozporu s předpokladem většiny studií, že během uvolnění trofozoita z hostitelské buňky dochází ke kompletnímu oddělení (odlomení) epicelulárniho epimeritu od volné části trofozoitu. Valigurová a Koudela (2008) na základě pozorování s využitím elektronové mikroskopie, nastolili hypotézu, že je epimerit zpětně zatahován do protomeritu a představuje tedy velmi dynamickou strukturu. Jako podporu pro tyto závěry předložili komplexní mikroskopickou analýzu zahrnující jak metody konfokální laserové skenovací (fluorescenční značení kontraktilních elementů v oblasti epimeritu), tak elektronové mikroskopie (zahrnující transmisní elektronovou mikroskopii – TEM a vysokorychlostní skenovací elektronovou mikroskopii – FE SEM) provedenou na druhu G. polymorpha (Valigurová et al. 2009). Na místě původního epimeritu na vrcholu protomeritu se u zkoumaných zástupců Gregarina spp. pravidelně vyskytuje centrální deprese pokrytá hladkou plazmatickou membránou bez poškození (což by se po úplném oddělení epimeritu nebylo možné). Jejich studie také zdůrazňuje fakt, že oddělení ne zcela zralých trofozoitů, může být výsledkem předčasné smrti hostitelské buňky 31

TEORETICKÁ ČÁST nebo mechanického poškození během zpracování tkáně (Valigurová a Koudela 2008; Valigurová et al. 2009; Valigurová 2012). Je nutno zmínit, že důležitou metodou pro studium vlivu gregarin na hostitele je provedení experimentální infekce zdravého hostitele (Sumner 1936; Er a Gökçe 2005; Rodriguez et al. 2007; Valigurová et al. 2007,2009; Valigurová 2012). Další studie vyžívají statistické metody pro vyhodnocení míry patogenity gregarin na hostitele, přičemž se sledují parametry jako je prevalence parazita a intenzita parazitace, hmotnost a rozměry hostitele, hledání potravy, produktivita kolonie a mortalita hostitele (Bollatti a Ceballos 2014; Er a Gökçe 2005). Studie vlivu blíže neurčeného druhu eugregariny na hledání potravy, produktivitu kolonie a mortalitu dospělců Polybia occidentalis odchycených ve volné přírodě dospěla k závěru, že ačkoliv infekce eugregarinami negativně korelovala s rychlostí hledání potravy a sníženou plodností kolonií, pozitivní vliv infekce vykazoval delší životaschopnost dospělých jedinců (Bouwma et al. 2005). Autoři se domnívají, že pozitivní vliv na dlouhověkost je způsoben tím, že infikovaní dospělci hledají potravu méně a tím snižují riziko úhynu. Lantová et al. (2011) prokázali, že infekce kotoulů Phlebotomus sergenti eugregarinou Psychodiella sergenti v laboratorních podmínkách negativně ovlivňuje přežití nezralých stádií hostitele. Hlavní příčinou vyšší úmrtnosti hostitele by mohla být kompetice o živiny a energii mezi parazitem a hostitelem. V jednom z provedených experimentů byl vliv na úmrtnost výraznější v případě, kdy byly infikované larvy chovány ve větší hustotě. Výsledky naznačují, že výživnější strava (krevní moučka) umožňuje infikovaným gravidním samičkám překonat negativní účinek parazita. Lze tedy usoudit, že delší přežití samiček by mohlo mít pozitivní vliv na gregariny: čím déle samička žije, tím vyšší je šance na produkci vajíček a přenos parazita. Ke sledování vývojového cyklu tohoto parazita kotoulů byly použity metody elektronové mikroskopie (SEM- světelné elektronové mikroskopie, k detekci přenosu oocyst eugregariny přilepených na chorionu vajíček, TEM k detekci invazivních stadií) a světelné mikroskopie (nativní preparáty a histologické řezy) (Lantová a Volf 2012). Barvením histologických řezu celých těl larev a dospělců Ph. 32

TEORETICKÁ ČÁST sergenti barvených pomocí histochemické PAS (Periodic Acid Schiff) reakce pro důkaz polysacharidů a Ehrlichovým kyselým hematoxylinem autoři zjistili, že eugregarina parazituje ve střevě larev většinou v ektoperitrofickém prostoru (pod peritrofickou matrix) ale u dospělců se vyskytuje v tělní dutině a sexuální vývoj prodělává výlučně v samičkách sajících krev. Lord a Omoto (2012) testovali účinek eugregariny Pyxinia crystaligera na růst, vývoj a náchylnost k dalším patogenům ve střevě kožojeda Dermestes maculatus. Výsledky ukázaly, že nakažené larvy vážily podstatně méně, ale jejich vývoj v dospělce nebyl významně ovlivněn. Zajímavým zjištěním bylo, že těžká infekce poskytla částečnou ochranu před patogeny, neogregarinou Mattesia trogodermae a eukokcidií Adelina tribolii, přenesenými per os. Oproti ostatním skupinám gregarin, jsou neogregariny mnohem více patogenní a jejich pomnožení v hostiteli je téměř vždy fatální. Ke studiu jejich vlivu na hostitele byly nejvíc použity metody TEM a světelné mikroskopie včetně histologie a barvených roztěrů. Proliferace intracelulárních stádií neogregarin způsobuje destrukci hostitelských tkání, což umožňuje přenos infekčních oocyst do vnějšího prostředí. Mnoho neogregarin působí jako patogen hmyzích skladištních škůdců, tedy hmyzu vyskytujícího se například v mouce nebo obilí, které je často kontaminováno jejich oocystami. Na místech, kde je jídlo skladováno za podmínek podporujících shromažďování hmyzu, mohou neogregariny způsobit masivní infekci. Infikovaný hmyz je méně tolerantní ke změnám kyslíku ve vodě, vystavení rentgenovým paprskům a chemickým insekticidům (Weiser 1953). Neogregarina M. dispora, napadající mnoho druhů hmyzu, primárně parazituje v tukovém tělese a způsobuje lyzi buněk a vakuolizaci hostitelské tkáně a infikované kukly hynou před vylíhnutím. Valigurová a Koudela (2005) ve své práci navíc pozorovali u larev zavíječe (Ephestia kuehniella) změnu barvy do růžové a letargii s omezeným příjmem potravy před jejich úhynem v důsledku masivní parazitace. Navíc bylo zjištěno, že vývoj druhu M. grandis významně ovlivňuje množství lipidů v tukovém tělese hostitele (McLaughlin 1965b). Infekce druhem M. geminata je zase neobvyklá 33

TEORETICKÁ ČÁST pro svou lokalizaci v hypodermis kukel mravenců Solenopsis geminata, kde způsobuje poruchy vývoje očí, melanizaci kutikuly a smrt kukel (Jouvenaz a Anthony 1979).

2.4.2 Kryptosporidie U kryptosporidií se důsledky infekce a patogenita u jednotlivých druhů liší, přičemž závažnost a průběh onemocnění u kryptosporidií ovlivňuje hlavně imunitní stav hostitele. U imunokompetentních jedinců se může objevit mírné, až závažné akutní onemocnění, zatímco u imunodeficitních jedinců mohou tito parazité způsobovat vyčerpávající chronické onemocnění až smrt. V důsledku infekce střevního epitelu se nejčastěji objevují akutní vodnaté průjmy, malátnost, únava, zvracení, bolesti a křeče (Fayer a Xiao 2007). U většiny savců je dobře vyvinuta hostitelská obrana ve formě jednovrstevného epitelu, oddělujícího sterilní hostitelskou tkáň od obsahu střevního lumina. Střevní infekce kryptosporidiemi se tedy jeví jako primární událost způsobující narušení této bariéry (Adams et al. 1994). K vyhodnocení patologických změn tkáně parazitované kryptosporidiemi se, stejně jako u gregarin, využívají především přístupy světlené a elektronové mikroskopie (SEM, TEM). Navíc se k vyhodnocení specifity a patogenity parazita využívají experimentální křížové infekce skrze orální inokulaci samotných infekčních stadií kryptosporidií (oocysty a sporozoiti) (Melicherová et al. 2014) nebo za použití stěru infikované tkáně, jako bylo použito u rybího patogenu C. molnari u dvou druhů mořských ryb (Sparrus aurata, Dicentrarchus labrax) (Alvarez-Pellitero a Sitja-Bobadilla 2002). Pro vyšetření byly použity stěry žaludku barvené Giemsou, histologické řezy žaludku barvené toluidinovou modří a PAS reakcí, a ultratenké řezy pro TEM. Dále se autoři pokusili infikovat zdravé ryby společným soužitím s nakaženými. V mnohých studiích byla pomocí křížových infekcí prokázaná různá reakce na kryptosporidie včetně rozdílných klinických a

TEORETICKÁ ČÁST histopatologických příznaků v závislosti na druhu hostitele (Alvarez-Pellitero a Sitja-Bobadilla 2002; Kváč et al. 2008; Melicherová et al. 2014). Valigurová et al. (2018) s použitím FE SEM a konvenční histologie (barvení parafinových řezů hematoxylin-eozinem) potvrdili výskyt mírných patologických změn, jako např. dilataci žaludečních žláz, u rané nákazy myší druhem C. proliferans. Byl pozorovaný ostrůvkovitý charakter nákazy, kdy parazit osídlil sousedící žaludeční žlázy obklopené zdravou tkání. Výrazné patologické změny byly prokázány až tři měsíce po inokulaci, kdy došlo značnému pomnožení parazita a byly zasažené větší (a taky četnější) okrsky žaludeční mukózy. Na makroskopické úrovni byla žaludeční sliznice charakterizována květákovitým vzhledem a celková hmotnost a výška epitelu byla vyšší než u neinfikovaných jedinců. Studie uvádí zvláště patrné skládání žaludku pod FE SEM, způsobené proliferací epitelu do luminárního prostoru. Žaludeční žlázy plné různých vývojových stádií C. proliferans a nekrotického materiálu byly výrazně rozšířeny a hypertrofovány. Práce uvádí zajímavý fakt, že navzdory chronické infekci nebyly u infikovaných hlodavců pozorovány žádné klinické příznaky. Další žaludeční druh, C. muris, byl pozorován u několika savců, zejména hlodavců, koček, psů, skotu a velbloudů (Tyzzer 1907). Infekce je většinou asymptomatická, přechází do chronické formy a může doživotně přetrvávat. Navzdory asymptomatickému průběhu žaludeční kryptosporidiózy, byl při silné infekci popsán značný patologický vliv C. muris na tkáň hostitele, zahrnující rozšíření žaludečních žláz a hypertrofii. Parazitované žlázy ztratily svou normální buněčnou architekturu a byly lemovány mnoha nediferencovanými buňkami (Taylor et al. 1999; Valigurová et al. 2007, 2008). C. parvum je patogenem převážně epiteliálních buněk tenkého střeva (nenapadá hlubší vrstvy) širokého spektra hostitelů, kde způsobuje oslabení mikroklků, submukózní edém nebo zánětlivé onemocnění, v jehož důsledku dochází k infiltraci neutrofilů a mononukleárních fagocytů do lamina propria (Vítovec a Koudela 1988; Laurent et al. 1997). Pomocí imunochemických metod (ELISA) Laurent et al. (1997) studovali u člověka expresi a produkci protizánětlivých cytokinů střevního epitelu 35

TEORETICKÁ ČÁST po inokulaci tímto parazitem. I přesto, že se parazit vyskytuje převážně v jejunu a ileu, silně zasaženo může být i tlusté střevo bez postižení tenkého střeva. Abnormální projevy kryptosporidiózy byly však pozorovány především u imunodeficitních pacientů, zejména s AIDS, kde byla nákaza zkomplikována antrálním zúžením a rozvojem onemocnění pneumatosis cystoides intestinlis (PCI, tvorba plynových cyst ve stěně střeva) pravděpodobně vedoucí k perforaci střeva (Garone et al. 1986; Cersosimo et al. 1992; Sidhu et al. 1994). Pro medicínské účely (kryptosporidie jsou oportunní parazité, a proto se ve většině případů jedná o imunosuprimované pacienty) se k vyhodnocení používají bioptické odběry tkáně (Lefkowitch et al. 1984). U pacientů s AIDS byly potvrzeny i případy nákazy žlučových cest (Forbes et al. 1993; Lopez-Velez et al. 1995; Vakil et al. 1996), ojediněle pak kostní dřeně a transplantovaných orgánů (Goddard et al. 2000; Westrope a Acharya 2001; Abdo et al. 2003). Míra patologických změn tkáně se v jednotlivých oblastech liší. Ultrastrukturální studie převážně prokazují, že střevní sliznice zůstává neporušená a subcelulární organizace enterocytů zůstává poměrně zachovaná (Lefkowitch et al. 1984; Modigliani et al. 1985). V místech masivní parazitace jsou podlouhlé buňky nahrazeny degenerovanými buňkami podléhajícími nekróze (Orenstein et al. 1997). Enterocyty se většinou jeví jako vakuolizované, s nejasným rozhraním, a mikroklky jsou při větším zvětšení zjevně deformované. V souvislosti se závažným průjmem byla ve střevech nakažených jehňat popsána fúze a křížení epitelu mezi klky a atrofie klků (Tzipori et al. 1981). Jako jeden z hlavních enteropatogenů doprovázený novorozeneckým průjem, způsobuje C. parvum značný úhyn jehňat (de Graaf et al. 1999). U C. parvum byly také popsány silné reaktivní změny epitelu a neutrofilní infiltrace u HIV pozitivních pacientů (Lumadue et al. 1998). Ke studiu projevů kryptosporidiózy se využívají i postupy (imuno)histochemické, jako například ve studii Dubey et al. (2002), kde autoři zkoumali přítomnost kryptosporidií v žaludku makaka (Macaca fascicularis). Mukózní epiteliální buňky v postižených žlázách (zejména horní třetině fundu) obsahovaly zvýšené množství 36

TEORETICKÁ ČÁST hlenu složeného převážně z kyselých mukosubstancí, který se díky PAS reakci s alciánovou modří obarvily tmavě modře. V oblastech, kde se parazité nevyskytovali, obsahovaly slizniční buňky převážně neutrální hlen barvící se jasně červeno-fialově. Speciální barvení dle studie Genta et al. (1994), kombinující tři běžně dostupné barvicí postupy – stříbření dle Steinera, barvení hematoxylin- eozinem a alciánovou modří (pH 2.5) a navrženo pro detekci Helicobacter pylori, umožnilo autorům výše zmíněné studie pozorovat buňky se změnou produkce hlenu zbarvené do modra, zatímco normální povrchový epitel byl šedý (Dubey et al. 2002). Během studie Masuno et al. (2006) byla provedena morfologická a imunohistochemická analýza nákazy C. andersoni v žaludku dobytka. Ačkoliv nebyly pozorovány žádné klinické příznaky, histologické vyšetření odhalilo závažnou infekci ve slezu infikovaného skotu. TEM potvrdilo výskyt různých fází životního cyklu parazita na epitelové výstelce žaludečních žláz. Nákaza se projevovala zvýšenou fragmentaci jader a zesílením apoptózy epitelových buněk. Imunohistochemické barvení bylo provedeno pomocí primárných protilátek rozpoznávajících stádia parazita, cytokinetiky hostitelských buněk (Ki-67 antigen) a avidin-biotinového komplexu. U studenokrevních plazů (např. hadi, ještěrky a želvy) představuje kryptosporidióza život ohrožující onemocnění (Brownstein et al. 1997; Cranfield a Graczyk 2006). Histologie prokázala, že C. serpentis infikující převážně žaludek hadů a ještěrek způsobuje hypertrofickou gastritidu, zúžení lumina žaludku, edém, cystické změny žaludečních žláz a v krajních případech slizniční nekrózu (Cranfield a Graczyk 1994; Brownstein et al. 1997). Akutní enteritidou, bakteriální gastritidou, hyperplazií a zánětem tenkého střeva se u ještěrek zase běžně projevuje nákaza druhem C. varanii (Dillehay et al. 1986; Frost et al. 1994; Taylor et al. 1999; Terrel et al. 2003). Onemocnění dýchacího traktu je nejčastější formou kryptosporidiózy u kuřat (Dhillon et al. 1981; Goodwin et al. 1988a; Latimer et al. 1988; Nakamura a Abe 1988; Fernández et al. 1990). Pomocí metod světelné mikroskopie (nativní 37

TEORETICKÁ ČÁST preparáty mukózního seškrabu) byl popsán druh C. Bailey, způsobující respirační kryptosporidiózu, který nejčastěji parazituje v burze, kloace a dýchacím traktu kuřat (Current et al. 1986). Byl potvrzen i ojedinělý výskyt parazita v ledvinách a tenkém střevě, kde v důsledku onemocnění došlo k hypertrofii a hyperplasticitě buněk sběrného kanálku, distálních tubulů a močovodu (Nakamura a Abe 1988; Lindsay a Blagburn 1990). Nákaza druhem C. meleagridis, původně parazitující tenké a tlusté střevo krocanů (Meleagris gallopavo), je nejčastěji doprovázena enteritidou (Slavin 1955; Lindsay a Blagburn 1990) způsobující atrofii klků, hypertrofii krypt a také výskytem lymfocytů v lamina propria (Goodwin et al. 1988b). Histologické a ultrastrukturální studie potvrdily vysoký počet vývojových stádii kryptosporidií ve střední a koncové části tenkého střeva krůtí drůbeže, projevující se silným průjmem. Vysoká mortalita způsobená C. meleagridis byla potvrzena zejména u křepelek a hrdliček. Druh C. galli zase napadá výhradně proventrikulus a způsobuje závažné onemocnění a úhyn ptáků (Pavlásek et al. 1999; Ryan et al. 2003b). Histopatologie nakažené tkáně pěnkav prokázala nekrózu a hyperplazii buněk epitelu, spojenou s výskytem velkého počtu oocyst parazita na jejich povrchu (Morgan et al. 2001). U všech druhů ptáků jsou klinické příznaky podobné a zahrnují plicní šelesty, kašel, kýchání a dušnost. Zasažená tkáň vykazuje hypertrofii a hyperplazii napadených buněk (Lindsay a Blagburn 1990). Využitím imunofluorescence v kombinaci s konfokální laserovou skenovací mikroskopií Elliott a Clark (2000) objasnili cytoskeletální změny, ke kterým dochází ve střevních buňkách infikovaných C. parvum. Práce odhalila, že kryptosporidie indukují přeskupení cytoskeletu hostitelské buňky tím, že inkorporují hostitelský aktin a α-aktinin do rozhraní mezi buňkou hostitele a parazita. Využití aktinu hostitelské buňky je v mikrobiálním prostředí běžným mechanismem patogeneze a jako takový byl tento proces pozorován například u druhů E. coli, Salmonella, a také u dalších výtrusovců jako například protokokcidie Eleutheroschizon duboscqi ze střeva mořského mnohoštětinatce (Valigurová et al. 2015). Tato protokokcidie je zajímavá zejména tím, že až donedávna byla považována za bazálního zástupce a 38

TEORETICKÁ ČÁST vykazuje podobnou strategii epicelulárního parazitizmu ve vaku hostitelského původu jako kryptosporidie. Zdá se, že kryptosporidie (i protokokcidie) využívají filamentózní aktin, jako strukturální složku pro posílení hostitelsko-parazitického spojení a také se předpokládá jeho aktivní role v invazním procesu. Jako experimentální modely pro studium hostitelsko-parazitických interakcí a patologického vlivu kryptosporidií se čím dál tím víc využívají levnější a hlavně šetrnější alternativy pokusů na laboratorních zvířatech, a to konkrétně tkáňové kultury. Melicherová et al. (2018) srovnáním skutečné a simulované (pomocí polystyrénových mikrokuliček čistých a potažených antigenem parazita) infekce buněčných linií HCT-8 žaludečním druhem C. proliferans demonstrovali, že parazit indukuje svou enkapsulaci záhybem hostitelské membrány, bez nutnosti aktivní invaze nebo pohybu sporozoitů. V další práci použitím mnohovrstevných kultur enterocytů Adams et al. (1994) dokumentovali poškození buněk narušením těsných buněčných spojů, ztrátu bariérové funkce, uvolnění intracelulární laktát dehydrogenázy a zvýšenou buněčnou smrt spojenou s nákazou C. parvum. Pomocí kultivace C. parvum na buněčných liniích cholangiocytů Chen et al. (1999) prokázali, že cytopatologický účinek na neinfikované okolní buňky epitelu je zprostředkován apoptózou infikovaných buněk. K analýze byla použita fluorescenční vizualizace buněčné kultury s parazitem barveným pomocí DAPI a speciálního kitu pro detekci apoptózy. Studie prokázala, že neinfikované buňky kvůli okolní infekci prodělávají zrychlenou apoptózu, která je zprostředkována prostřednictvím mechanismu závislého na Fas/Fas ligandu, což je transmembránový protein interagující s transmembránovým receptorem Fas na cílových buňkách. Stejný kolektiv autorů (Chen et al. 2001) také prokázal že C. parvum aktivuje jaderný faktor kappa B, který zabraňuje apoptóze infikovaných epitelových buněk. Z výsledků vyplývá, že je parazit schopen ovlivnit buněčnou apoptózu, aby usnadnil svůj růst a vyvolat programovanou buněčnou smrt v okolní neinfikované tkáni. Widmer et al. (2000) poznamenali, že buněčná apoptóza je snížena růstem buněk na bázi obsahující laminin. Tato pozorování naznačují, že oddělení buněk a apoptóza v buněčné kultuře 39

TEORETICKÁ ČÁST infikované C. parvum negativně ovlivňují přežití parazita in vitro. Je zřejmé, že endogenní vývojová stádia kryptosporidií inhibují apoptózu v době infekce, kdy parazit závisí na hostitelské buňce pro svůj růst a další vývoj (McCole et al. 2000; Mele et al. 2004). Lze tedy usoudit, že kryptosporidie mohou zabránit masivní epiteliální reakci, aby se podpořil jejich vývoj a proliferace, a stejně tak mohou omezit zánětlivou odpověď hostitele (Sasahara et al. 2003). Je tedy možné zkonstatovat, že Cryptosporidium spp. je schopné manipulovat s obranným mechanismem svého hostitele a apoptózou zasažených buněk ve svůj vlastní prospěch.

PRAKTICKÁ ČÁST

3 Praktická část

3.1 Materiál a metodika

Pro praktickou část bakalářské práce byly jako modelový organismus použity larvy potemníka moučného T. molitor z laboratorního chovu školitelky. Pravděpodobnost nákazy byla přibližně 1:2. Mezi barvenými preparáty jsou zařazeny i vzorky z parafinových bločků z archivu školitelky, které obsahují více druhů gregarin a kryptosporidie z různých hostitelů.

3.1.1 Pitva larev a detekce parazitů Materiál: • larvy potemníka moučného • AFA fixační činidlo (směs etanolu, formaldehydu, kyseliny octové a destilované vody)

• Ringerův fyziologický roztok pro hmyz (7,5 g NaCl, 0,35 g KCl a 0,21 g CaCl2 rozpuštěno v 1 l destilované vody • pitevní souprava, pipety, Petriho misky, mikrozkumavky • preparační mikroskop

Pracovní postup: • usmrcení larvy, oddělení hlavové a koncové části těla • vypreparování celého střeva, přenos do Ringerova roztoku • kontrola infekce pod preparačním mikroskopem a v případě pozitivní infekce, stanovení stádia infekce (raná, pokročilá, masivní zahrnující víc stadií parazita) • rozdělení tkáně do označených zkumavek s AFA činidlem (objem fixáže musí odpovídat alespoň desetinásobnému objemu fixované tkáně) • fixace (ideálně přes noc)

PRAKTICKÁ ČÁST

3.1.2 Zalití vzorků do parafínu (dle Valigurová 2007) Materiál: • plastové kazety pro zalévání vzorků • 70 % etanol, vzestupná alkoholová řada a xylen • 3 parafínové lázně a parafín na zalití vzorku (opakovaně přetavené) • inkubátor s nastavením teploty na 56–57 °C • vodní lázeň

Pracovní postup: • přenos vzorků do zalévacích kazet, vymytí fixáže pomocí 70 % ethanolu • dehydratace vzorků vzestupnou alkoholovou řadou o 80 % etanol po dobu 2x30 min o 90 % ethanol po dobu 2x30 min o 100 % etanol po dobu 3x15 min • projasnění xylenem o směs 100 % etanolu a xylenu (1:1) po dobu 2x10 min o xylen 1 po dobu 10 min o xylen 2 po dobu 10-40 min • prosycení vzorků čistým parafínem, 3 postupné parafinové lázně umístěné v inkubátoru (po dobu 1hod, 1hod a poslední lázeň přes noc) • orientace tkáně v zalévací kazetě a zalití roztaveným parafínem • ponechaní do ztuhnutí parafinu (ve vodní lázni, v lednici nebo v při pokojové teplotě)

3.1.3 Montáž bločků, krájení, tvorba preparátů Materiál: • kahan, dřevěné bločky, špachtle, skalpel • rotační mikrotom, štětce, destilovaná voda, pipeta

PRAKTICKÁ ČÁST

• vyhřívací plotýnka, podložná mikroskopická sklíčka potažená želatinou

Pracovní postup: • vyjmutí vzorků ze zalévacích komůrek, trimovaní bločku do tvaru hranolu pomocí skalpelu • nahřátí a roztavení zbytků parafínu nad ohněm pomocí špachtle, montáž vzorků na označené dřevěné bločky, tuhnutí • krájení histologických řezů (ideálně „řetízky“ seriálních řezů), přemístění pomocí štětců na sklíčka s destilovanou vodou umístěná na nahřívací plotýnce (cca 39 °C) • schnutí a adheze řezů na sklíčku v inkubátoru (přes noc na 39 °C)

3.1.4 Deparafinizace a barvení vzorků Každé z níže provedených barvení bylo provedeno minimálně s jedním opakováním. Množství chemikálií bylo upraveno pro naše potřeby. Po celou dobu barvení byly preparáty kontrolovány pod světelným mikroskopem a na základě pozorování byly upraveny časy jednotlivých procedur. Deparafinizace a rehydratace (provádíme u všech vzorků, postup dle Valigurová 2007): o xylen 1 po dobu 5 min o xylen 2 po dobu 5 min o 100 % etanol po dobu 5 min o 96 % etanol po dobu 5 min

3.1.5 Barvení zeleným trichromem podle Massona (dle Humason 1967) Časy působení jednotlivých chemikálií byly na základě pozorování upraveny dle potřeby.

Materiál: • barviva Weigertův hematoxylin, fuchsin Ponceau de xylidin a Fast green

PRAKTICKÁ ČÁST

• směs kyseliny fosfomolybdenové a kyseliny fosfowolframové • kyselá voda - 1% roztok kyseliny octové v destilované vodě

Postup: • deparafinizace a rehydratace řezů • barvení preparátů Weigertovým hematoxylinem (10 min) • oplach pod teplou tekoucí vodou (10 min) • oplach v destilované vodě • barvení směsí Ponceau fuchsinem (15 min) • oplach v destilované vodě • diferenciaci v roztoku kyseliny fosfowolframové/fosfomolybdenové (15 min) • barvení ve Fast green (50 min) • diferenciace v 1% kyseliny octové • oplach v destilované vodě • dehydratace a čištění xylenem a montáž preparátů do kanadského balzámu

3.1.6 Lillieho reakce pro průkaz melaninu (dle Humason 1967) Při druhém barvení dle Lillieho jsme upravili protokol a IAC (železitý acetokarmín) jsme nahradili azokarmínem. Výsledek v prvním pokusu barvení ale nebyl optimální, zabarvení azokarmínem bylo příliš intenzivní a přebarvilo téměř všechny struktury, proto jsme při druhém pokusu zkrátili čas působení barviva.

Materiál: • barvení – síran železnatý, hexakyanoželezitan draselný a azokarmín • destilovaná voda, kyselý alkohol, kyselá voda - 1% roztok kyseliny octové v destilované vodě

Pracovní postup: • deparafinizace a rehydratace vzorků 44

PRAKTICKÁ ČÁST

• ponoření vzorků do síranu železnatého (1,5 hod) • oplach v destilované vodě (4 x po dobu 5 min) • ponoření do vodního roztoku hexakyanoželezitanu draselného a kyseliny octové po dobu 60 minut • oplach v 1 % kyselině octové • barvení v azokarmínu (30 min) - čas nutno upravit podle intenzity zbarvení u konkrétní tkáně • diferenciace v kyselém alkoholu – dle potřeby možno vynechat, závisí na intenzitě zbarvení azokarmínem • oplach ve vodě z vodovodu do zfialovění (5 min až 3 hod) • dehydratace a čištění xylenem • montáž preparátů a fixace do kanadského balzámu

3.1.7 Barvení Heidenhainovým AZAN trichromem (dle Humason 1967) Při druhém barvení jsme značně upravili doporučené časy. Barvení azokarmínem bylo stejně jako u metody dle Lillie příliš výrazné. Na základě získaných výsledků se jeví jako vhodné snížit čas barvení azokarmínem a zvýšit čas u diferenciace.

Materiál: • barviva – azokarmín, modř anilinová • anilín alkohol, kyselý alkohol, kyselina fosfowolframová • kyselá voda - 1% roztok kyseliny octové v destilované vodě

Pracovní postup: • deparafinizace a rehydratace • ponoření do anilín alkoholu (45 min) • ponoření do kyselého alkoholu (1-2 min) • barveni v azokarmínem, umístění do inkubátoru s teplotou 56 °C (30 min), 30 min při pokojové teplotě

PRAKTICKÁ ČÁST

• oplach v destilované vodě • diferenciace v anilín alkoholu (5 min) • inkubace v kyselém alkoholu (1-2 min) • inkubace v kyselině fosfowolframové (3,5 hod) • oplach v destilované vodě • barvení v anilínové modři (1,5 hod) • oplach v destilované vodě • inkubace v kyselině fosfowolframové (3 min) • oplach v destilované vodě • oplach v kyselé vodě (2 min) • dehydratace a čištění xylenem • montáž preparátů a fixace do kanadského balzámu

PRAKTICKÁ ČÁST

3.2 Výsledky a diskuze

3.2.1 Lillieho reakce pro průkaz melaninu Výsledkem barvení Lillieho reakcí je slabě zelená nebo bezbarvá cytoplazma a tmavě zelený melanin (Humason 1967). Jádra zbarvená do purpurové jsou výsledkem podbarvení azokarmínem. U celých larev T. molitor byla tato metoda použita s cílem detekovat případnou obrannou reakci hmyzího hostitele, při které dochází k hromadění melaninu (melanizace) v místě poškození tkáně, přičemž dochází k nodulaci nebo enkapsulaci patogenu (Sugumaran a Barek 2016). Mimostřevní nákaza ani obranná reakce v jiných tkáních larev T. molitor nebyla pozorována, a proto je následující fotodokumentace zaměřena pouze na střevní epitel (obr. 4–6). V důsledku barvení lze zřetelně rozlišit protomerit eugregarin od deutomeritu a jejich oddělení septem. Jádra parazitů se stejně jako jádra hostitelských buněk barví intenzivně červeně. Zajímavým výsledkem této metody je zbarvení povrchu s mikroklky střevního epitelu hmyzího hostitele do světle zelené barvy. Mimo apoptózující hostitelskou buňku, lze také pozorovat probíhající apoptózu buněk okolní tkáně, při které dochází k vypuzení výrazně velkých jader do střevního lumina. Nelze ale s jistotou určit, zda je tento jev spojen s přirozenou obměnou epitelových buněk nebo s parazitickou nákazou (Harry 1965). Na povrchu mikroklků epitelových buněk je viditelná tmavě zeleně zbarvená kompaktní vrstva, která je narušena v oblasti zanořených epimeritů. Lze předpokládat, že se jedná o tvořící se peritrofickou matrix (membránu), která představuje přirozenou ochrannou bariéru střevního epitelu u hmyzu (Lonc et al., 2007). Na základě hloubky zanoření epimeritu (zasahuje pouze do vrstvy mikroklků), lze usuzovat, že se jedná o trofozoit v procesu postupného uvolňování z hostitelské tkáně (Valigurová et al. 2009). Vzhledem k menším rozměrům trofozoitu a viditelnému poškození přilehlé epiteliální buňky se s největší pravděpodobností jedná o nezralý trofozoit, opouštějící buňku v důsledku jejího značného poškození (Harry 1965, Lucarotti 2000, Valigurová 2012).

PRAKTICKÁ ČÁST

Obr. 4. Zrající trofozoit eugregariny (pravděpodobně Gregarina polymorpha) ve střevě larvy T. molitor, barvení Lillieho reakcí (podbarvení azokarmínem). PM – protomerit; DM – deutomerit, černá šipka – zřetelně rozlišitelné septum, bílá šipka – epimerit, červená šipka – epitelová buňka podléhající apoptóze, x – domnělá peritrofická matrix.

Zatahující se epimerit u zralých trofozoitů je na histologických řezech téměř nepatrný (obr. 5). V místech epitelu s masivnější infekcí je zřetelné značné poškození povrchu s mikrokly epitelových buněk, jako i kompletní poškození a diskontinuita peritrofické matrix. Zdá se, že kolem zanořeného trofozoitu dochází k prodloužení mikroklků zasažených buněk, podobně jako bylo pozorováno u kryptosporidií (např. Melicherová et al. 2018). V takovém případě by se jednalo o reakci hostitele na parazitaci přestavbou cytoskeletálních struktur mikroklků.

PRAKTICKÁ ČÁST

Obr. 5. Zralý trofozoit eugregariny Gregarina polymorpha ve střevě larvy T. molitor, barvení Lillieho reakcí (podbarvení azokarmínem). PM – protomerit; DM – deutomerit, bílá šipka – epimerit, červená šipka – epitelová buňka podléhající apoptóze, x – domnělá peritrofická matrix.

Zdravá střevní tkáň larev T. molitor bez přítomnosti eugregarinové nákazy vykazovala méně známek apoptózy, což bylo patrné i díky intenzívnímu barvení jader epitelových buněk do purpurové barvy (obr. 6). Povrch s mikroklky epitelových buněk je viditelně nepoškozený, s pravidelným uspořádáním a pokryt kontinuální tmavě zelenou kompaktní vrstvou. Lze předpokládat, že se jedná o zmíněnou a v tomto případě neporušenou peritrofickou matrix.

PRAKTICKÁ ČÁST

Obr. 6. Zdravá střevní tkáň larvy T. molitor, barvení Lillieho reakcí (podbarvení azokarmínem). x – domnělá peritrofická matrix.

U celkových řezů střevem cvrčka Gryllus assimilis parazitovaného eugregarinou Leidyana sp. byla jasně odlišitelná peritrofická matrix, která se místy dotýká (podobně jako u larev T. molitor) povrchu s mikroklky epitelových buněk (obr. 7). V tentýž řezu se nacházely zvlněné úseky peritrofické matrix ve větší vzdálenosti od epitelu, což odpovídá pozorování Woodring a Lorenz (2007). Lokalizace parazitů na dalším řezu (obr. 8) potvrzuje, že během invaze eugregariny pronikají přes peritrofickou matrix a v dalším vývoji se již nacházejí v ektoperitrofickém prostoru (tj. mezi epitelem a peritrofickou matrix). Dle velikosti buňky, granulace cytoplazmy a stupně vývoje sept oddělujících jejích jednotlivé části (Valigurová et al. 2007) lze usoudit, že na řezech se nacházejí různá stadia eugregariny včetně mladých trofozoitů a volných gamontů (obr. 7, 8). 50

PRAKTICKÁ ČÁST

Obr. 7, 8. Celkový a detailní pohled na řez střevem cvrčka Gryllus assimilis nakaženého eugregarinou Leidyana sp., barvení Lillieho reakcí (podbarvení azokarmínem). Černá šipka – peritrofická matrix, žlutá šipka – mladý trofozoit, oranžová šipka – gamont, bílá šipka – zanořený epimerit.

PRAKTICKÁ ČÁST

Zajímavostí je, že střevo kožojeda Dermestes vulpinus nevykazuje zjevné známky poškození (obr. 9), ačkoliv se jedná o parazitaci eugregarinou Beloides tenius, jejíž epimerit je vybaven periferním prstencem zpětně zahnutých háčků a s dlouhým centrálním stylem (Geus, 1969), kde by se dalo předpokládat mechanické poškození tkáně. Okolní tkán rovněž nevykazovala známky poškození.

Obr. 9. Trofozoit eugregariny Beloides tenius přichycený ke střevnímu epitelu dospělce Dermestes vulpinus, barvení Lillieho reakcí (podbarvení azokarmínem). Výřez představuje optické zvětšení oblasti zanořeného epimeritu, kde jsou patrné háčky.

Výsledkem Lillieho reakce a podbarvení azokarmínem na řezech savčím žaludkem s masivní kryptosporidiovou infekcí (obr. 10) jsou fialově se barvící jádra hostitelských buněk s výrazně červenými jadérky, přičemž se parazité zobrazují jako malé nazelenalé kulovité útvary s nevýrazně červeně zbarvenými jádry uvnitř

PRAKTICKÁ ČÁST

žaludeční žlázy, kterou mimo jiné vyplňuje i buněčný detrit. Parazitované žaludeční žlázy jsou výrazně dilatované. V souladu s již publikovanými studiemi, je pokročilá infekce příčinou výrazné mukózní hypertrofie, která je charakteristická zvětšením žaludečních záhybů a intenzivní epiteliální hyperplazií (Melicherová et al. 2014; Valigurová et al. 2018).

Obr. 10. Řez žaludkem Mastomys coucha napadené Cryptosporidium proliferans, barvení Lillieho reakcí (podbarvení azokarmínem). Černá šipka – hostitelská buňka, hvězdička – žlázka vyplněná různými stádii parazita.

Na základě pozorování lze říci, že tato metoda by mohla nalézt své uplatnění ve sledování patologických procesů u bezobratlých, zejména členovců parazitovaných bazálními výtrusovci, nezdá se však být přínosná pro obdobné studie zaměřené na obratlovce. 53

PRAKTICKÁ ČÁST

3.2.2 Barvení zeleným trichromem podle Massona Massonův zelený trichrom barví kolagen a hlen do zelena, svalovinu do červena, obarvená jádra jsou tmavá až černá, cytoplazma a keratin se barví do červena (Humason 1967). Toto barvení je často využívané zejména ke studiu patologie svalů a pojiv různé etiologie. Metoda se ukázala být přínosná u vizualizace histopatologických změn během masivní parazitace žaludku druhem C. proliferans, doprovázenou značnou dilatací žaludečních žláz a pokročilou buněčnou nekrózou. Postižené žlázy zcela mění svou strukturu, nekrotické buňky žláz ztrácejí svou architekturu a v preparátu se jeví jako neforemné „šmouhy“ (obr. 11).

Obr. 11. Celkový pohled řezem žláznaté části žaludku Mastomys coucha hojně napadené Cryptosporidium proliferans, Massonův trichrom. Modrá šipka – lamina propria. 54

PRAKTICKÁ ČÁST

Parazitické organismy se barví mírně do zelena a spolu s buněčnými zbytky vyplňují prostor nakažených žláz. Naše pozorování jsou v souladu se studií Amarnath et al. (2019), kde se parazité jevili jako „modré kuličky“. Jelikož u zdravé žláznaté tkáně žaludku se pojiva nacházejí především v oblasti lamina propria (Zahariev et al. 2009), významná je i koncentrace zeleně zbarvených kolagenních vláken kolem žláz, patrná zejména při větším mikroskopickém zvětšení řezu (obr. 12). Ve zdravé tkáni je koncentrace kolagenu v oblasti žláz významně nižší, lze tedy předpokládat, že se jedná o reakci hostitele na parazita. Bashandy a Saleem (2014) uvádí, že distribuce kolagenu v poškozených žlázách souvisí se stárnutím, hladověním a patogeny. Jejich závěry se tedy shodují s naším pozorováním.

Obr. 12. Řez žaludkem Mastomys coucha hojně napadené Cryptosporidium proliferans, Massonův trichrom. Černá šipka – žaludeční žláza s četnými stadii parazita, modrá šipka – kolagenní vlákna.

PRAKTICKÁ ČÁST

U hmyzí střevní tkáně nakažené eugregarinami je díky barvení jasně odlišitelná zelená spodní pojivová vrstva od fialového epitelu (obr. 13, 14). Značné poškození epitelu, pravděpodobně v důsledku masivní infekce a útlaku přilehlé tkáně rozměrnými parazity, je viditelné zejména u sarančete S. gregaria parazitovaného eugregarinou G. garnhami (obr. 13).

Obr. 13. Eugregarina Gregarina garnhami ve střevě Schistocerca gregaria, Massonův trichrom. P – buňka parazita, černá šipka – pojivová tkáň hostitele, x – peritrofická matrix.

V místě zanoření parazita u larev potemníka moučného je zřejmé narušení kartáčového lemu na povrchu epitelových buněk. Jádra parazitů i hostitelských buněk se barví do červena (obr. 14). Na rozdíl od výše zmiňovaných sarančat, mimo apoptickou epitelovou buňku s výrazně velkým jádrem není zřejmá deformace

PRAKTICKÁ ČÁST okolní tkáně. Zajímavé je i nazelenalé zbarvení kartáčového lemu střevní epitelové tkáně, což naznačuje přítomnost hlenu na povrchu střevní výstelky (Humason 1967). Barvení zároveň usnadnilo identifikovat eugregariny díky jasně fialovému zbarvení jejích cytoplazmy.

Obr. 14. Trofozoit eugregariny přichycený k střevním epitelu larvy Tenebrio molitor, Massonův trichrom. Černá šipka – deutomerit s jádrem.

PRAKTICKÁ ČÁST

3.2.3 Barvení Heidenhainovým AZAN trichromem Toto barvení umožnuje rozlišení modrých kolagenních vláken, bledě modře zbarvené bazofilní cytoplazmy a karmínově červených jader, oranžovo-červené zbarvení acidofilní cytoplazmy a červené až žluté zbarvení svaloviny (Humason 1967). Jedná se o metodu využívanou při studiu patologie parazitóz u vyšších výtrusovců (Benajiba et al. 1994). Stejně jako Massonův trichrom, se tato metoda ukázala být přínosnou ke zviditelnění histopatologických změn žaludku s masivní parazitací druhem C. proliferans (obr. 15), doprovázených výše popsanými změnami včetně zvýšené kumulace kolagenních vlakem kolem postižených žaludečních žláz (Bashandy a Saleem 2014). Buňky produkující hlen se barvily výrazně do modra (Leknes 2015).

Obr. 15. Řez žaludkem Mastomys coucha hojně napadené Cryptosporidium proliferans, AZAN barvení. Černá šipka – žaludeční žláza s četnými stadii parazita. 58

PRAKTICKÁ ČÁST

U střevní tkáně hmyzu parazitovaného eugregarinami je díky barvení jasně odlišitelná modrá spodní pojivová vrstva od nafialovělého epitelu s karmínovými jádry (obr. 16-17). Opět jsou zjevné apoptické buňky kolem zanořených epimeritů trofozoitů eugregarin (obr. 16, 17). Zajímavé je i modré zbarvení cytoplazmy gregarin, a to zejména v oblasti protomeritu (obr. 16-18), což by bylo za normálních okolností důkazem toho že jejich cytoplazma je bazofilní (Humason 1967). Nicméně do modra se touto metodou barví i hlen (Tam a Avenant-Oldewage 2006) a v cytoplazmě eugregarin ze střeva T. molitor byla pomocí barvení alciánovou modří při nízkém pH prokázaná velká koncentrace hlenovitých substancí (Valigurová et al. (2013).

Obr. 16. Zralý trofozoit Gregarina polymorpha ve střevě Tenebrio molitor, AZAN barvení. HE – hostitelský epitel, černá šipka – zbarvený protomerit.

PRAKTICKÁ ČÁST

Do zřetelně karmínové se zabarvila i velká jadérka v kulovitých jádrech všech detekovaných stádií parazitů (od trofozoitů až po gamonty) (obr. 16-18). Na některých řezech bylo patrné červené zbarvení kruhovité svaloviny na vnější straně střeva (obr. 17). Do modra se zbarvil i kartáčový lem střevní epitelové tkáně u zkoumaného hmyzu, což potvrzuje přítomnost buněk produkujících hlen, stejně jako v žaludků krysy na obr. 15 (Leknes 2015; Tam a Avenant-Oldewage 2006).

Obr. 17. Zralé trofozoity eugregariny (pravděpodobně Gregarina polymorpha) přichycené k epitelové výstelce střeva larvy Tenebrio molitor, AZAN barvení. HE – hostitelský epitel; červená šipka – apoptická buňka.

PRAKTICKÁ ČÁST

Obr. 18. Volní gamonti eugregariny G. cuneata ve střevě larvy Tenebrio molitor, AZAN barvení. HE – host