UNIVERSITA’ DI NAPOLI FEDERICO II

DOTTORATO DI RICERCA IN BIOCHIMICA

E BIOLOGIA CELLULARE E MOLECOLARE

XXV CICLO

Giorgia Montano

Role of WT1-ZNF224 interaction in the regulation of

leukemia cells apoptosis

Academic Year 2011/2012

UNIVERSITA’ DI NAPOLI FEDERICO II

DOTTORATO DI RICERCA BIOCHIMICA E BIOLOGIA CELLULARE E MOLECOLARE XXV CICLO

Role of WT1-ZNF224 interaction in the regulation of leukemia cells apoptosis

Candidate Giorgia Montano

Tutor Coordinator Prof. Paola Costanzo Prof. Paolo Arcari

Academic Year 2011/2012

"DEDICATO A QUELLO CHE SI CELA NEL PROFONDO...PER SEMPRE" L.F.

Riassunto

WT1 é un fattore trascrizionale a dita di zinco che regola l’espressione di un elevato numero di geni coinvolti nel differenziamento, nel ciclo cellulare e nell’apoptosi. Originariamente è stato identificato come oncosoppressore coinvolto nella patogenesi del tumore di Wilms, un tumore renale pediatrico. Successivamente è stato descritto anche un ruolo di oncogene per WT1 in diversi tumori solidi e leucemie. La capacità di WT1 di attivare e/o reprimere la trascrizione dei suoi geni bersaglio è fortemente influenzata dal contesto cellulare e dall’interazione con alcuni cofattori. Recentemente abbiamo identificato la Kruppel-like zinc finger ZNF224, come nuovo interattore molecolare di WT1 e abbiamo dimostrato che ZNF224 può promuovere l’attivazione trascrizionale da parte di WT1 sul per il recettore della vitamina D (VDR), noto gene bersaglio di WT1. Questi dati ci hanno spinto ad indagare l’effetto dell’ interazione ZNF224/WT1 su altri geni coinvolti nel processo apoptotico in cellule di leucemia mieloide cronica K562 che esprimono elevati livelli di WT1 endogeno. I nostri esperimenti dimostrano che ZNF224 esercita un duplice effetto sulla espressione dei geni bersaglio di WT1, agendo da co-attivatore di WT1 nella regolazione dei geni pro-apoptotici Bax, Bak e VDR e impedendo a WT1 di attivare i geni anti-apoptotici bag3 e A1-Bfl-1. Successivamente, avendo osservato che ZNF224 è poco espressa in linee cellulari di leucemia mieloide rispetto a WT1, abbiamo deciso di approfondire il ruolo di ZNF224 nel processo apoptotico. A tale scopo abbiamo valutato se ZNF224 venisse modulata in cellule K562 in seguito a trattamento con citarabina (ara- C), un farmaco chemioterapico comunemente impiegato nel trattamento delle leucemie mieloidi. Abbiamo osservato che l'espressione di ZNF224 è indotta da citarabina e che tale induzione aumenta la sensibilità delle cellule K562 al farmaco. I nostri risultati dimostrano l’importante ruolo che il complesso trascrizionale ZNF224/WT1 svolge nella modulazione di geni apoptotici e che l’aumento di ZNF224 indotto da ara-C può rappresentare uno dei meccanismi attraverso cui il farmaco induce apoptosi in cellule leucemiche.

Summary

The transcription factor Wilms’ tumour gene 1, WT1, is implicated both in normal developmental processes and in the generation of a variety of solid tumors and hematological malignancies. Physical interactions of other cellular with WT1 are known to modulate its function. We previously identified the Krüppel-like zinc finger protein, ZNF224, as a novel human WT1-associating protein that enhances the transcriptional activation of the human vitamin D receptor promoter by WT1. Here, we have analyzed the effects of WT1/ZNF224 interaction on the expression of apoptosis-regulating in the chronic myelogenous leukemia (CML) K562 cell line. The results demonstrated that ZNF224 acts in fine tuning of WT1- dependent control of gene expression, acting as a co-activator of WT1 in the regulation of proapoptotic genes and suppressing WT1 mediated trans-activation of antiapoptotitc genes. Moreover, the DNA damaging drug cytosine arabinoside (ara-C) induces expressio