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Características morfológicas de la gástrula en stolzmanni (Anura: ). Juan Diego Santillana Ortiz y Eugenia M. del Pino Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Escuela de Ciencias Biológicas, Laboratorio de Biología del Desarrollo, 12 de Octubre 1076 y Roca, Quito, Ecuador [email protected] RESUMEN: Se estudió la morfología de la gástrula y néurula en embriones de Cer- atophrys stolzmanni (el sapo bocón de la costa). Los huevos, cuyo diámetro al comienzo de la gastrulación es de 2,2 mm, se desarrollan rápidamente. El proceso de gastrulación dura aproximadamente cinco horas. Los embriones fueron fijados y analizados en monta- je entero, bisecciones y secciones de vibrátomo. Se encontró que los huevos tienen pig- mento oscuro al igual que en Xenopus laevis, pero tienen un tamaño mayor. La morfología de la gástrula de C. stolzmanni es similar a la descrita para Ceratophrys ornata (el sapo cornudo argentino) por otros autores. Los estadios de gástrula tardía y néurula temprana, estudiados mediante secciones con tinción fluorescente para núcleos celulares, revelan ausencia de endodermo que recubra al notocordio y a los somitas en la parte dorsal poste- rior del embrión. Esta región se denomina GRP (Gastrocoel roof plate, por sus siglas en inglés) y tiene importancia en la determinación del eje izquierdo-derecho en anfibios. En este estudio se caracterizó el GRP de C. stolzmanni al nivel morfológico.

PALABRAS CLAVE: Ceratophrys ornata, Ceratophrys stolzmanni, Gastrulación, GRP, Xenopus laevis.

ABSTRACT: The gastrula morphology of Ceratophrys stolzmanni (the Pac-man ) was studied. Its eggs, whose diameter at the beginning of the gastrulation process is 2.2 mm in diameter, develop rapidly. The gastrulation process requires five hours approxi- mately. The embryos were fixed and analyzed in whole-mount, in bisections, and vibratome sections. The eggs of C. stolzmanni were pigmented, as in Xenopus laevis, but their size was bigger. The gastrula morphology of C. stolzmanni is similar to the one described for Ceratophrys ornata (the argentine horned-frog) by other authors. The late gastrula and early neurula stages, studied with vibratome sections stained for cell nuclei, revealed lack of endoderm covering both the posterior notochord and the somites found on this region. This region is called the GRP (Gastrocoel roof plate) and it plays a major role in the development of the left-right axis in . In this work the GRP of C. stolzmanni was characterized at the morphological level.

KEYWORDS: Ceratophrys ornata, Ceratophrys stolzmanni, Gastrulation, GRP, Xenopus laevis.

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INTRODUCCIÓN Una rana lejanamente relacionada con las anteriores especies es Ceratophrys Las diferencias en el desarrollo tem- stolzmanni (Steindachner, 1882) (el sapo prano de las ranas, tales como el tamaño bocón de la costa). Esta rana vive bajo el de los embriones, el proceso de gastru- suelo en ambientes xéricos del sur del lación y la velocidad del desarrollo, son Ecuador y norte del Perú y deposita sus aspectos necesarios de estudio para la huevos en charcas temporales cuando comprensión del desarrollo embrionario. comienza la estación lluviosa. Ésta es una En particular, el proceso de gastrulación especie interesante para ser estudiada en diversas especies de anfibios muestra debido a su diferente estrategia reproducti- la existencia de tres patrones distintos. va. Si bien el desarrollo embrionario de C. Estos patrones se relacionan con la veloci- stolzmanni no se había estudiado, sí se dad del desarrollo de las especies. Por un conocen aspectos del desarrollo en una lado, las ranas de desarrollo rápido, como especie cercana a ésta: la rana cornuda argentina Ceratophrys ornata. El anuro C. Xenopus laevis (Daudin, 1802), extienden ornata tiene un modo de vida terrestre pero el arquenterón y alargan el notocordio deposita sus huevos, de 1,5 - 2,0 mm de durante la gastrulación; mientras que diámetro, en el agua. Su desarrollo desde la ranas de desarrollo lento, como Gas- fertilización hasta convertirse en renacuajo trotheca riobambae (Fowler, 1913), es sumamente rápido, entre 24-48 horas. posponen el alargamiento del notocordio a De su desarrollo temprano se conoce que la post gástrula (1). Esto sugiere que el presenta mesodermo superficial en el techo proceso de gastrulación es modular, es del gastrocele el mismo que ingresa a las decir que la expansión del arquenterón y capas mesodermales profundas durante la el cierre del blastoporo son procesos regu- neurulación (2). lados de forma independiente y a distinto Este mesodermo superficial forma una tiempo (1). Los estudios comparativos estructura en el techo del arquenterón que entre ranas que difieren en sus modos de está expuesta a la cavidad del gastrocele reproducción, tales como Epipedobates (3). En los anfibios a esta estructura se la machalilla (Coloma, 1995) y Epipedo- conoce como placa del techo del gastro- bates tricolor (Boulenger, 1899b) (repro- cele, GRP, gastrocoel roof plate, por sus ducción terrestre), G. riobambae siglas en inglés (3). El GRP es una región (incubación en una bolsa materna) y la con células ciliadas que promueven un rana acuática X. laevis sugieren que las flujo de sustancias no determinadas en sen- diferencias en el desarrollo embrionario tido izquierdo. Este flujo es el evento que temprano están relacionadas con distintas permite el establecimiento de la cascada de estrategias reproductivas (1). Es impor- la señal molecular Nodal para la especifi- tante entonces ampliar los estudios com- cación asimétrica del cuerpo. El GRP está parativos y describir los procesos de bordeado por las crestas laterales endoder- desarrollo para especies con diversas males (4) las que gradualmente lo cubren estrategias reproductivas. (1). El GRP es análogo a estructuras simi- lares encontradas en otros vertebrados (3).

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En X. laevis y Xenopus tropicalis la metodología de tinción fluorescente (Wagler 1827) el GRP mide aproximada- para núcleos celulares (tinción Hoechst mente 260 µm y 150 µm de largo respec- 33258). Se documentaron las observa- tivamente. Los cilios tienen una longitud ciones mediante microfotografías usando promedio de 5 µm (5). Por el significado una cámara digital acoplada a un esté- del GRP en el establecimiento del eje reomicroscopio o a un microscopio de izquierdo-derecho es importante demos- fluorescencia. Todas estas técnicas se trar su presencia en embriones de ranas enmarcan en metodologías estándar del con modos divergentes de gastrulación Laboratorio de Biología del Desarrollo de como es C. stolzmanni. la PUCE. Los estadios de los embriones se determinaron de acuerdo a la tabla ge- neral para el desarrollo de anuros (6) y MATERIALES Y MÉTODOS para C. ornata (2).

Los embriones con los que se realizó este estudio fueron donados por el Labo- RESULTADOS ratorio de Herpetología de la Pontificia Universidad Católica del Ecuador Morfología de la gástrula de C. (PUCE). Estos embriones provinieron de stolzmanni.- El proceso de gastrulación dos posturas: La primera de ranas colec- duró aproximadamente 5 horas. La tadas en la provincia de El Oro, Ecuador; gástrula temprana (estadio 10,5; 2,2 mm y la segunda de ranas criadas en cautive- de diámetro) se caracterizó por la forma- rio dentro del programa de investigación ción del labio dorsal del blastoporo, en “Balsa de los sapos”. forma de hendidura, en la región sub-ecu- Los embriones se cultivaron en reci- atorial del embrión. Se detectaron células pientes de plástico. La temperatura en forma de botella en dicha hendidura. ambiente fue de 30 °C y 26 °C la del Se observó pigmento ocre oscuro en el agua. Los acuarios fueron artificialmente polo del embrión así como un pig- oxigenados. mento blanco claro en el polo vegetal. Se estudió la morfología externa de la La gástrula media (estadio 11) se carac- gástrula y néurula mediante montajes terizó por la extensión lateral y ventral del enteros de embriones fijados en el fijativo labio del blastoporo, el mismo que tuvo de Smith. La estructura interna de los forma de herradura (Fig. 1A). Internamente embriones fue descrita mediante bisec- el blastocele ocupó la mayor parte de la ciones y secciones. Para realizar las sec- región animal. El arquenterón inició su for- ciones los embriones fueron primero mación pero no se expandió. embebidos en gelatina, luego montados en cubos de agarosa y, mediante el uso del vibrátomo, se obtuvieron secciones de 40-50 µm de grosor. Algunas de estas sec- ciones fueron también estudiadas usando

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Fig. 1. Desarrollo temprano de C. stolzmanni: gástrula y néurula. (A) Gástrula media. (B) Néurula media. (C) Estadio de cerramiento del tubo neural. Abreviaturas: lb, labio del blastoporo; pn, pliegues neu- rales; bp, blastoporo; tb, tubo neural; ab, arco branquial; ah, arco hioideo; am, arco mandibular. Todas las bar- ras corresponden a 250 µm.

La gástrula tardía (estadio 12) exter- el techo del arquenterón. En el estadio 14,5 namente mostró una disminución gradual (2,4 mm de largo) los pliegues neurales del diámetro del tapón de yema. Interna- fueron más prominentes (Fig. 1B). mente los movimientos de convergencia y Durante el estadio medio de pliegues neu- extensión dorsales permitieron el rales (estadio 15; 2,7 mm de largo) los alargamiento y expansión del arquenterón. pliegues neurales se acercaron pero el tubo En el estadio 12,5 se observó que el tapón neural permaneció abierto. En el estadio de yema continuaba su gradual reducción. de cerramiento del tubo neural (estadio En una sección sagital de un embrión de 16), el tubo neural se cerró pero per- este estadio, teñido para núcleos celulares, maneció abierto en la región rostral. En la se observaron el labio dorsal y ventral del misma región se observaron los arcos blastoporo así como el cleft de Brachet branquiales: mandibular, hioideo y bran- que separa el ectodermo del endomeso- quial (Fig. 1C). dermo. La eclosión ocurrió en el segundo día. Este tiempo de desarrollo es comparable Morfología de la néurula de C. stolz- con X. laevis (7). manni.- Los embriones en el estadio 13 muestran una reducción del tapón de Morfología del techo del ar- yema. En el estadio temprano de forma- quenterón en C. stolzmanni.- El techo ción de pliegues neurales (estadio 14) se del arquenterón se estudió en bisecciones observó alargamiento del embrión (2,3 de embriones de estadios 13-15 con el mm de largo) y la formación de pliegues objeto de determinar sus características neurales. En una sección horizontal para morfológicas. En la región caudal del este mismo estadio, al nivel del tapón de techo del arquenterón de un embrión de yema y teñida para núcleos celulares, se estadio 13 (Fig. 2A) se observó un área observó que el notocordio está expuesto en pigmentada triangular, el GRP (Fig. 2B).

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Fig. 2. Techo del arquenterón de C. stolzmanni. (A) Gástrula temprana. (B) Bisección de gástrula tem- prana. (C) GRP. Abreviaturas: ty, tapón de yema; a, arquenterón; GRP, placa del techo del gastrocele; bp, blastoporo. Todas las barras corresponden a 250 µm. Esta estructura se observó como una rollo rápido, comparable al de la rana región con tres bandas más oscuras loca- acuática X. laevis y diferente al de las lizadas en la región central y lateral. Las especies de reproducción terrestre E. bandas del GRP convergieron en la parte machalilla, E. tricolor (1) y G. riobambae media anterior (Fig. 2C). (9). Por otro lado el tamaño del huevo es En secciones transversales de estadios mayor que en X. laevis 1,3 mm (7) y 2,2 13 y 14, teñidas para núcleos celulares y mm de diámetro respectivamente, y es efectuadas a diferentes niveles del eje comparable al tamaño de los huevos de E. antero-posterior, se evidenció que el noto- tricolor de 2 mm de diámetro (1). La pig- cordio y los somitas estaban recubiertos mentación oscura del polo animal es com- por endodermo en la parte anterior y descu- parable a X. laevis (7). El proceso de gas- biertos en la región posterior. Es decir, en trulación es similar al de C. ornata ya que estos estadios se encontró que el mesoder- en ambas especies el labio dorsal del mo está expuesto en la parte posterior del blastoporo se forma más cerca del ecuador techo del arquenterón correspondiente a la que en comparación con X. laevis (2) (7). región del GRP. Se encontró también que el En la morfología externa de la néurula no embrión de C. stolzmanni presenta un co- se observaron diferencias significativas llar circumblastoporal prominente incluso con el patrón de otros anuros (7) (8) (10). en embriones que tienen tapón de yema y El análisis de la morfología del techo muestran al GRP. En secciones del estadio del arquenterón de C. stolzmanni sugiere 15 el notocordio y somitas estuvieron recu- la presencia del GRP. Al igual que en X. biertos por endodermo. laevis esta estructura fue visible entre la gástrula tardía y néurula temprana (7), aunque de mayor tamaño y más visible. DISCUSIÓN Además un estudio en progreso ha revela- do la presencia de cilios en esta estructura En este estudio se demostró que C. (Sáenz-Ponce, et al. comunicación per- stolzmanni es una especie que tiene desar- sonal). La comparación del techo del

Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biológicas - Vol. XXX Números 1 y 2: 50-56, octubre 2009 Características morfológicas de la gástrula en Ceratophrys stolzmanni 55 arquenterón entre C. ornata y C. stolz- notocordio se encuentra aún expuesto manni revela gran similitud. En ambas (Fig. 3B). Tanto los somitas como el especies, en embriones del estadio 13, la notocordio han sido recubiertos total- región anterior-media del techo del mente por endodermo en embriones de arquenterón está recubierta por endoder- estadio 18 (Fig. 3C) de acuerdo con (2). mo, mientras que la parte posterior está En embriones del estadio 13 de C. stolz- descubierta. En la figura 3 se esquemati- manni nuestras observaciones za la ausencia de endodermo que recubra demostraron que el notocordio y los al notocordio y somitas en C. ornata (Fig. somitas se encuentran expuestos en la

Fig. 3. Esquema comparativo del techo del arquenterón entre C. ornata y C. stolzmanni. C. ornata: (A) Néurula temprana, (B) Néurula tardía, y (C) Estadio tail bud; C. stolzmanni: (St. 13, néurula temprana): (D) Región posterior, (E) Región media, y (F) Región anterior. Las flechas señalan el límite de la región mesodér- mica expuesta en el techo del arquenterón, el GRP. Abreviaturas: ec, ectodermo; me, mesodermo, en, endoder- mo; n, notocordio; pn, pliegues neurales; tn, tubo neural. Dibujos de C. ornata modificados de (2).

3 A-C) y C. stolzmanni (Fig. 3 D-F). En la región media-posterior (Fig. 3D-F). El región media del embrión de estadio 13 color del GRP en C. stolzmanni posible- de C. ornata el notocordio y los somitas mente se deba a que durante los se encuentran expuestos en el techo del movimientos morfogenéticos de la gas- arquenterón (Fig. 3A). En embriones de trulación el mesodermo superficial, que estadio 15 las crestas endodermales la- tiene pigmento oscuro, se ha internaliza- terales han recubierto los somitas, pero el do y ocupa la región dorsal del techo del

Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biológicas - Vol. XX Números 1 y 2: 50-56, octubre 2009 56 Juan Diego Santillana Ortiz y Eugenia M. del Pino arquenterón. La acumulación de pigmen- 11888. to puede ser una consecuencia de la con- 2.- PURCELL, S.M. & KELLER, R. 1993. A stricción apical en las células del GRP different type of mesoderm como se observa en C. ornata (2). morphogenesis in Ceratophrys ornata. Este estudio señala la importancia de Development, 117: 307-317. 3.- BLUM, M., WEBER, T., BEYER, T. y determinar la modularidad del GRP en VICK, P. 2008. Evolution of leftward especies de ranas con distintas estrate- flow. Seminars in cell and developmental gias reproductivas para comprender biology. [Epub ahead of print - PMID: mejor el establecimiento del eje izquier- 19056505 - PubMed - as supplied by pub- do-derecho. lisher]. 4.- KELLER, R. & SHOOK, D. 2004. Gastru- lation in amphibians. En: STERN, C. ed. AGRADECIMIENTOS Gastrulation: From cells to embryo. 171- 203. Cold spring harbor laboratory press. Agradecemos a los Drs. L.A. Coloma New York. E.E.U.U. 5.- SCHWEICKERT, A., WEBER, T., BEYER, y D. Almeida-Reinoso así como a los T. VICK, P., BOGUSC, S., FEISTEL, K. otros miembros del Laboratorio de Her- & BLUM, M. 2007. Cilia-driven leftward petología de la PUCE por la donación de flow determines laterality in Xenopus. posturas de C. stolzmanni. La reproduc- Current biology, 17: 60-66. ción de esta rana recibió apoyo económi- 6.- GOSNER, K.L. 1960. A simplified table for co del programa de investigación “Balsa staging anuran embryos and larvae with de los sapos”. A los colaboradores del notes on identification. Herpetologica, 16: Laboratorio de Biología del Desarrollo de 183-190. la misma universidad se agradece por sus 7.- NIEUWKOOP, P.D. & FABER, J. 1994. comentarios y soporte experimental. Este Normal table of Xenopus laevis (Daudin). Garland publishing. London. 252pp. trabajo recibió el apoyo de la beca de 8.- DEL PINO, E.M., ÁVILA, M.E., PÉREZ, investigación de la PUCE-2008 al proyec- O.D., BENÍTEZ, M.S., ALARCÓN, I., to Expresión génica en el desarrollo de NOBOA, V. & MOYA, I. 2004. Develop- ranas ecuatorianas. ment of the dendrobatid frog Colostethus machalilla. Developmental biology, 48: 663-670. BIBLIOGRAFÍA 9.- MOYA, I.M., ALARCÓN, I. & DEL PINO, E.M. 2007. Gastrulation of Gastrotheca 1.- DEL PINO, E.M., VENEGAS-FERRÍN, riobambae in comparison with other . M., ROMERO-CARVAJAL, A., MON- Developmental biology, 304: 467-478. TENEGRO-LARREA, P., SÁENZ- 10.- DUELLMAN, W.E. & TRUEB, L. 1994. PONCE, N., MOYA, I.M., ALARCÓN, I., Biology of amphibians. The John Hopkins SUDOU, N., YAMAMOTO, S. & TAIRA, University Press. Baltimore, USA. M. 2007. A comparative analysis of frog early development. Proceedings of the national academy of sciences, 104: 11882-

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