Universidad Politécnica Salesiana Sede Quito
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UNIVERSIDAD POLITÉCNICA SALESIANA SEDE QUITO CARRERA: INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA DE LOS RECURSOS NATURALES Trabajo de titulación previo a la obtención del título de: INGENIERO EN BIOTECNOLOGÍA DE LOS RECURSOS NATURALES TEMA: IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE ESPECIES DE ORQUÍDEAS DEL GÉNERO DRACULA, MEDIANTE EL SISTEMA BARCODE AUTOR: MARIO LEÓN IZA ARTEAGA TUTOR: MARCO FERNANDO CERNA CEVALLOS Quito, Enero del 2018 Dedicatoria “Los sueños se cumplen, no gracias a la suerte, sino más bien al esfuerzo y dedicación”. Colin Powell A Dios, por brindarme día a día la fortaleza, salud y sabiduría para saber sobrellevar la vida universitaria lejos de mi familia. A mis padres Mario Iza y Evita Arteaga quienes me motivaban a esforzarme cada día más y nunca desmayar hasta alcanzar mi meta. Especialmente a mi madre que día a día luchó para solventar los gastos económicos que se requerían. Hermanos y hermana por ser parte de este logro alcanzado. Dedico también a Arianna por ser un pilar fundamental en este logro y por estar siempre a mi lado desde el inicio hasta el final de esta meta alcanzada. Atte. Mario Agradecimientos A la Universidad Politécnica Salesiana, por ser el lugar que me abrió las puertas para realizar mis estudios, donde tuve la oportunidad de conocer excelentes docentes de alta calidad profesional y de llevarme gratos recuerdos y enseñanzas. Agradezco especialmente a mi tutor, Dr. Marco Cerna Ph.D., quien supo brindarme el apoyo y la confianza para realizar este trabajo experimental. Agradezco infinitamente al Lic. Luis Baquero por su asesoría en este trabajo, de igual manera agradezco a todo el personal de los laboratorios de Biotecnología, al Orquideario de Sarina, al grupo de Investigación NUNKUI WAKAN por sus cooperaciones en la realización de este trabajo y a todas las personas que me apoyaron moralmente y se hicieron partícipes en este trayecto de mi vida. Índice Introducción ................................................................................................................. 1 CAPÍTULO I................................................................................................................ 3 1. Marco conceptual ................................................................................................. 3 1.1 Familia Orchidaceae ....................................................................................... 3 1.2 Taxonomía: ..................................................................................................... 5 1.3 Importancia de la Familia: .............................................................................. 5 1.4 Género Dracula .............................................................................................. 6 1.4.1 Descripción botánica y morfológica ........................................................ 6 1.4.2 Cápsulas y semillas .................................................................................. 8 1.4.3 Micorrizas ................................................................................................ 9 1.4.4 Polinización ............................................................................................ 10 1.5 Diversidad y distribución del género ............................................................ 11 1.6 Marcadores moleculares ............................................................................... 16 1.7 Marcadores moleculares en orquídeas .......................................................... 18 1.7.1 Región MatK .......................................................................................... 18 1.7.2 Región rpoC1 ......................................................................................... 19 1.7.3 Región rpoB ........................................................................................... 20 1.8 ADN Barcode ............................................................................................... 20 CAPÍTULO II ............................................................................................................ 23 2. Materiales y métodos:......................................................................................... 23 2.1 Colección muestras ....................................................................................... 23 2.2 Estudio molecular ......................................................................................... 23 2.2.1 Extracción de ADN ................................................................................ 24 2.2.2 Cuantificación de ADN .......................................................................... 25 2.2.3 Amplificación de ADN .......................................................................... 26 2.2.4 Secuenciación ......................................................................................... 28 2.2.5 Filogenia ................................................................................................. 28 2.3 Georreferenciación: ...................................................................................... 29 CAPÍTULO III ........................................................................................................... 30 3. Resultados y Discusión....................................................................................... 30 3.1 Colección de muestras .................................................................................. 30 3.2 Estudio Molecular ......................................................................................... 34 3.2.1 Extracción de ADN: ............................................................................... 34 3.2.2 Amplificación ......................................................................................... 35 3.2.3 Secuenciación ......................................................................................... 37 3.2.4 Análisis de secuencias ............................................................................ 37 3.2.5 Filogenia ................................................................................................. 38 3.3 Georreferenciación........................................................................................ 47 4. Conclusiones .......................................................................................................... 50 5. Recomendaciones ................................................................................................... 51 6. Bibliografía ............................................................................................................ 52 7. Anexos ................................................................................................................... 61 Índice de Tablas Tabla 1 Especies del género Dracula descritas en Ecuador……………………. 12 Tabla 2 Clasificación subgenérica actual del género Dracula…………………… 16 Tabla 3 Esquema sintético de trabajos comparativos de varios locus propuestos como códigos de barras genéticos en plantas………………………………….......22 Tabla 4 Preparación de la mezcla PCR con Green PCR Master mix (2x)….......... 26 Tabla 5 Preparación de la mezcla PCR con Phire Plant Direct PCR Master Mix……………………………………………………………………………….. 26 Tabla 6 Primers utilizados para la amplificación de regiones cloroplásticas de ADN………………………………………………………………………......27 Tabla 7 Listado de todas las especies Dracula (Orchidaceae) colectadas para este estudio……………………………………………………………………………. 30 Índice de Figuras Figura 1. Flor de orquídea (Odontoglossum crispum). ................................................ 4 Figura 2. Subfamilias de la familia (Orchidaceae)....................................................... 5 Figura 3. Descripción morfológica de Dracula gigas. ................................................. 7 Figura 4. Estadios del desarrollo de protocormos de semillas de orquídeas. ............... 8 Figura 5.Regiones de ADN designadas para el sistema BARCODE en plantas. ...... 17 Figura 6. Estructura de la región matK (maturase K) de angiospermas..................... 19 Figura 7. Bandas de DNA de diferente tamaño (5000 – 100 pb) que migran de forma distinta en electroforesis en gel de agarosa. ........................................................ 25 Figura 8. Productos extraídos de ADN usando el método Doyle y Doyle, (1987) modificado por Massensini Jr., (2013). Gel agarosa 1%. ................................... 35 Figura 9. Productos de amplificación con el marcador matK. ................................... 36 Figura 10. Productos de amplificación con el marcador rpoC1. Gel de agarosa al 1%. 4uL de muestra.................................................................................................... 36 Figura 11. Productos de amplificación con el marcador rpoB. Gel de agarosa al 1%. 4uL de muestra.................................................................................................... 37 Figura 12. Árbol filogenético Neighbor-Joining de la región matK mediante el método Jukes-Cantor y bootstrap de 1000 réplicas. ........................................... 39 Figura 13. Árbol filogenético Neighbor-Joining de la región rpoC1 mediante el método Jukes-Cantor y bootstrap de 1000 réplicas. ........................................... 40 Figura 14. Árbol filogenético Neighbor-Joining de la región rpoB mediante el método Jukes-Cantor y bootstrap de 1000 réplicas. ........................................... 41 Figura 15. Árbol filogenético Neighbor-Joining concatenadas las regiones matK y rpoC1 mediante el método Jukes-Cantor y bootstrap de 1000 réplicas. ............ 42 Figura