UNIVERSIDADE ESTATUAL PAULISTA – UNESP
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS – CÂMPUS DE RIO CLARO
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
MESTRADO EM ZOOLOGIA
DIVERSIDADE GENÉTICA E CONSIDERAÇÕES SOBRE
Elachistocleis cesarii (MIRANDA-RIBEIRO, 1920)
Aluno: Vinicius Simões de Almeida Loredam
Orientador: Célio Fernando Baptista Haddad
Co-Orientador: Victor Goyannes Dill Orrico
Rio Claro
2015
VINICIUS SIMÕES DE ALMEIDA LOREDAM
DIVERSIDADE GENÉTICA E CONSIDERAÇÕES SOBRE Elachistocleis cesarii (MIRANDA-RIBEIRO, 1920)
Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências do Campus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Zoologia).
Orientador: Célio Fernando Baptista Haddad
Co-Orientador: Victor Goyannes Dill Orrico
Rio Claro
2015
597.6 Loredam, Vinicius L868d Diversidade genética e considerações sobre Elachistocleis cesarii (Miranda-Ribeiro, 1920) / Vinicius Loredam. - Rio Claro, 2015 86 f. : il., figs., gráfs., tabs., fots., mapas
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Rio Claro Orientador: Célio Fernando Baptista Haddad Coorientador: Victor Goyannes Dill Orrico
1. Anfíbio. 2. Anura. 3. Microhylidae. 4. 16S. 5. CO1. I. Título.
Ficha Catalográfica elaborada pela STATI - Biblioteca da UNESP Campus de Rio Claro/SP
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer primeiramente ao Prof. Dr. Célio Haddad e o Prof. Dr. Victor Dill pela confiança em mim depositada e toda a assistência prestada durante o desenvolvimento deste projeto. Agradeço a Mariana Lyra, Délio Baeta, Bianca Berneck, Ariadne Sabbag, Francisco Brusquetti, Thais Condez, Nadya Pupin, Leo Malagolli e todas as pessoas que me ajudaram direta ou indiretamente nesse aprendizado e pelo convívio agradável do dia a dia. Agradeço aos pesquisadores, curadores e as coleções herpetológicas que contribuíram de maneira tão significativa para a realização deste estudo: Dra. Cynthia Prado — UNESP Jaboticabal Dr. Daniel Loebmann — FURG Francisco Brusquetti — IIPBH Dra. Glaucia Pontes — PUC-RS Dr. Hussam Zaher — MZUSP Dr. Julian Faivovich — MACN Dr. Marcelo Napoli — UFBA Dr. Miguel Trefaul — USP Dr. Natan Maciel — UFG Dra. Paula Valdujo — WWF Dr. Paulo Garcia — UFMG Dr. Pedro Peloso — AMNH / MPEG Dr. Robson Ávilla — URCA
Agradeço também ao Idea Wild pelo belo trabalho desenvolvido, em especial Ann Marie Gage por todo o apoio e pela doação de equipamentos, que sem dúvida foi e será de grande valia.
Ao Centro de Estudos de Insetos Sociais, UNESP, Rio Claro (CEIS), em especial ao Prof. Dr. Maurício Bacci Jr., pela permissão no uso de suas instalações para as análises moleculares. A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) por tornar essa pesquisa possível financeiramente (processo 2013/19490-8).
“A noble spirit embiggens the smallest man”
Jebediah Springfield
LISTA DE SIGLAS
Para instituições:
CFBH Coleção de anfíbios “Célio F. B. Haddad” - UNESP Rio Claro UNESP Universidade Estadual Paulista USP Universidade de São Paulo UFMG Universidade Federal de Minas Gerais UFG Universidade Federal de Goiás URCA Universidade Regional do Cariri UFBA Universidade Federal da Bahia FURG Fundação Universidade Federal do Rio Grande MNRJ Museu Nacional, Rio de Janeiro MPEG Museu Paraense “Emílio Goeldi” MCP Museu de Ciências e Tecnologia da PUC-RS MACN Museo Argentino de Ciencias Naturales “Bernardino Rivadavia” IIBP Instituto de Investigaciones Biológicas del Paraguay AMNH American Museum of Natural History – Estados Unidos da América
Para as espécies e amostras:
BB Elachistocleis bumbameuboi OV Elachistocleis ovalis BC Elachistocleis bicolor PE Elachistocleis pearsei CS Elachistocleis cesarii PN Elachistocleis panamensis CV Elachistocleis carvalhoi PS Elachistocleis piauiensis HE Elachistocleis helianneae SU Elachistocleis surumu MN Elachistocleis magnus sp. espécie não identificada MO Elachistocleis matogrosso Para o grupo externo:
DM Dermatonotus muelleri MH Microhyla heymonsi
Para os países:
AR Argentina PN Panamá BO Bolívia PY Paraguai BR Brasil UR Uruguai CO Colômbia VE Venezuela GU Guiana XX Localidade desconhecida
RESUMO O gênero Elachistocleis é composto atualmente por 16 espécies além de Elachistocleis ovalis, considerada espécie inquirenda. Diversos autores indicam a necessidade de uma revisão taxonômica do gênero em seus trabalhos, alegando a presença de complexos de espécies ainda a serem descritos e, apesar do avanço da genética como ferramenta taxonômica nas últimas duas décadas, nenhum trabalho desse tipo foi realizado para as espécies do gênero. Nesse estudo foi avaliada a diversidade genética de Elachistocleis cesarii com considerações taxonômicas, além de buscar entender suas relações com as demais espécies do gênero. Uma abordagem integrativa, usando dados moleculares e morfológicos, foi utilizada. Foram encontrados baixos valores de divergência genética dentro da espécie e em comparação com as demais de ventre manchado, assim como uma sobreposição geográfica e de caracteres morfológicos, nos levando a crer que o gênero Elachistocleis contém espécies que devem ser sinonimizadas. Palavras-chave: Anura. Microhylidae. 16S. CO1.
ABSTRACT The genre Elachistocleis is currently composed of 16 species aside from Elachistocleis ovalis, considered species inquirenda. Several authors indicate the necessity of an taxonomic revision in their work, citing the presence of complex of species to be described and, despite the advance of genetic and taxonomic tools in the last two decades, no such work was carried out from this genre. In this study we evaluated the genetic diversity of Elachistocleis cesarii with taxonomic considerations, and seek to understand it relationship with the other species of the genus. An integrative approach, using molecular and morphological data was used. Low genetic diversity values were found within species and compared with other spotted belly, as well as geographical and morphological characters overlap, leading us to believe that the Elachistocleis genus contains species that should be synonymized. Keywords: Anura. Microhylidae. 16S. CO1.
SUMÁRIO Página
1. INTRODUÇÃO ...... 10
OBJETIVOS ...... 14
2. MATERIAIS E MÉTODOS ...... 15
2.1. MATERIAL DE ESTUDO ...... 15
2.2. TRABALHO DE CAMPO ...... 15
2.3. DADOS MOLECULARES ...... 15 2.3.1. Análise dos dados moleculares ...... 17 2.3.2. Grupo Externo ...... 19 2.3.3. Teste de mantel ...... 19
2.4. DADOS MORFOLÓGICOS E MORFOMÉTRICOS ...... 20 2.4.1. Caracteres Morfométricos ...... 20 2.4.2. Caracteres morfológicos e seus estados ...... 22 2.4.3. Análise dos dados morfométricos e morfológicos ...... 26
3. RESULTADOS ...... 28
3.1. DISTÂNCIAS GENÉTICAS...... 28 3.1.1. Clados ...... 32
3.2. TESTE DE MANTEL ...... 39
3.3. DADOS MORFOMÉTRICOS E MORFOLÓGICOS ...... 40
4. DISCUSSÃO ...... 46
4.1. ELACHISTOCLEIS CESARII ...... 46 4.1.1. Diagnose de Elachistocleis cesarii ...... 46 4.1.2. Vocalização de Elachistocleis cesarii ...... 47
4.3. TESTE DE MANTEL ...... 50
4.4. MORFOLOGIA ...... 51 4.4.1. Estágios larvais em Elachistocleis ...... 51
4.5. OUTROS AGRUPAMENTOS ...... 53
5. CONCLUSÕES ...... 55
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 57 APÊNDICES ...... 64
APÊNDICE A – LISTA DE EXEMPLARES AMOSTRADOS NESSE ESTUDO ...... 64
APÊNDICE B – PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO DE DNA ...... 75
APÊNDICE C – LISTA DE TECIDOS USADOS NESTE ESTUDO...... 76
APÊNDICE D – ÁRVORES 16S E CO1 DAS AMOSTRAS USADAS ...... 81
APÊNDICE E – DISTÂNCIAS GENÉTICAS ENTRE AS UMTOs DESTE ESTUDO...... 85
APÊNDICE F – ELACHISTOCLEIS CESARII DA FIGURA 18...... 86
10
1. INTRODUÇÃO
A Família Microhylidae Günther, 1858 é representada atualmente por 564 espécies distribuídas em 11 subfamílias e totalizando 68 gêneros. As subfamílias mais numerosas são Asterophryinae (298 spp.), Cophylinae (66 spp.), Gastrophryninae (70 spp.) e Microhylinae (82 spp.), totalizando 572 espécies, aproximadamente 90% do total de espécies desta família (FROST, 2015). O gênero Elachistocleis Parker, 1927 faz parte da família Gastrophryninae e é composto atualmente por 16 espécies válidas, além de E. ovalis, considerado nomen dubium associado a species inquirenda por Caramaschi (2010) — lista das espécies na Tabela 1. Este gênero apresenta uma ampla distribuição pela América do Sul cis- andina e América Central, possuindo registros desde a Argentina até o Panamá (FROST, 2015).
O histórico taxonômico do grupo é extenso, incluindo as designações genéricas Rana L., 1758 (SCHNEIDER, 1799), Bufo GARSAULT, 1764 (DAUNDIN, 1802), Engystoma FITZINGER, 1826, Microps WAGLER, 1830, Dactylethra CUVIER, 1829, Stenocephalus TSCHUDI, 1838, Gastrophryne STEJNEGER, 1910 e finalmente Elachistocleis com a descrição do gênero por Parker em 1927, separando-o de Gastrophryne (Engystoma) e Chiasmocleis – detalhes e comentários em FROST, 2015.
A espécie designada por Parker (1927) para representar o gênero foi Elachistocleis ovale (SCHNEIDER, 1799) e as características diagnósticas propostas por ele para o gênero foram: pupila redonda; língua elíptica, inteira e livre posteriormente; palato posteriormente com dois sulcos transversais, lisos ou ligeiramente crenulados, o anterior ligeiramente curvado; clavícula presente, minúscula, curvada, não passando lateralmente do meio do coracóide; omosterno ausente; o esterno é uma placa cartilaginosa; pontas dos dedos não dilatadas; falanges terminais simples (PARKER, 1927). Na época o gênero apresentava duas variedades, E. ovale ovale (SCHNEIDER, 1799) e E. ovale bicolor (GUÉRIN- MÉNEVILLE, 1838). Uma informação importante vem na sequência da descrição de Parker (1927):
“Estas duas formas ocorrem lado a lado na mesma área na Bolívia e não parecem interagir; parece provável, 11
portanto, que as duas sejam realmente espécies distintas, intimamente próximas e morfologicamente quase indistinguíveis. Existem, no entanto, as diferenças constantes na cor, embora a cor das superfícies dorsal, o que anteriormente vinha sendo utilizado para distingui-los, não forneça nenhuma distinção definitiva”.
Parker (1927) concluiu que a característica que distinguia as duas espécies era a coloração ventral sendo E. o. ovale com ventre vermiculado e E. o. bicolor com ventre imaculado (PARKER, 1927). No entanto, em sua monografia, Parker (1934) muda sua definição, passando a considerar E. bicolor como a variedade de ventre manchado, além de fazer uma breve menção à presença de espinhos dérmicos no dorso, mãos, pés, queixo e gula de alguns machos.
Dunn et al. (1948) descrevem Chiasmocleis panamensis, que em 2012 passaria a fazer parte do gênero Elachistocleis (ver de Sá et al. 2012). Em 1949, Dunn resgata a ideia original de Parker (1927) sobre a questão da coloração ventral e adiciona uma observação sobre E. pearsei, ressaltando ter visto E. pearsei e E. ovalis em campo e, portanto, não considerando-as raças vicariantes, corroborando a anotação de Ruthven (1914) de que elas ocorriam juntas em Fundación, Colômbia.
Durante os anos seguintes poucos trabalhos envolveram espécies do gênero, com destaque para Cochran (1955), Nelson (1973), Caramaschi & Jim (1983) e Kwet & Di-Bernardo (1998). Até que em 2003, Lavilla e colaboradores descreveram uma espécie nova para o gênero e fizeram uma revisão histórica das espécies descritas até então. Inclusive, apresentando a transcrição da descrição original de Rana ovalis SCHNEIDER, 1799 e de Bufo surinamensis DAUDIN, 1802 — ver Apêndice I de Lavilla et al. (2003). Eles propuseram uma maneira prática para identificação, afirmando que espécies de Elachistocleis com ventre pintado que não fossem E. skotogaster, E. piauiensis e nem E. erythrogaster deveriam ser consideradas E. ovalis, assim como as que tivessem ventre imaculado deveriam ser consideradas como E. bicolor. Ressaltando, no entanto, que mais estudos deveriam ser feitos, já que certamente esses agrupamentos operacionais tratavam-se de complexos de espécies. 12
A proposta operacional de Lavilla et al. (2003) ganhou força como pode ser observado em diversas coleções e trabalhos publicados (e.g. Rossa-Feres & Nomura, 2006; Rossa-Feres et al. 2011) onde as designações E. ovalis e E. bicolor ainda são usadas frequentemente, mesmo após a revalidação de E. cesarii por Toledo et al. (2010) e a descrição de oito espécies novas desde então.
Além dos problemas taxonômicos intraespecíficos, há também problemas de identificação, sendo comum que exemplares depositados em coleções zoológicas sejam encontrados sem uma identificação ao nível específico (“aff.”, “cf.” ou “sp.” são registros usuais). Essa falta de precisão pode se perpetuar em listas de espécies e levantamentos de anurofauna, impactando negativamente em programas que visam à proteção da biodiversidade, além de dificultar o entendimento da evolução e da distribuição geográfica do grupo (e.g. Rossa-Feres et al., 2011; Magalhães et al., 2013).
Miranda-Ribeiro (1920) determinou três variedades de Engystoma ovale encontradas no Museu Paulista (atual MZUSP), são elas Engystoma ovale cesarii (18 spp.), E. ovale lineatum (2spp.) e E. ovale concolor (5 spp.), além de reportar a presença de um indivíduo num frasco com a seguinte informação manuscrita “Engystoma cesarii mottæ, Iher. S. Paulo”. Miranda-Ribeiro apresenta apenas o município de origem dos indivíduos e não determinando um tipo ou localidade tipo dessas variedades, sendo todas do estado de São Paulo (Os Perus, Ypiranga, Alto da Serra, Rio Grande da Serra, Cubatão e Piquete). Com o fim do segundo império, o estado e a cidade de São Paulo tiveram um crescimento econômico e populacional que transformou um centro regional em uma metrópole nacional (PMSP, 2005). Essa expansão demográfica e econômica trouxe consigo transformações ambientais significativas resultando em poucas áreas ainda não antropizadas.
Nos anos seguintes, Parker (1927, 1934) e Dunn (1949) publicaram trabalhos importantes para o gênero e E. cesarii passou a ser visto como sinônimo de E. ovalis desde então. Toledo et al. (2010), baseados nas características morfológicas de material fresco e a compatibilidade delas com a descrição de Engystoma ovale cesarii feita por Miranda-Ribeiro (1920), decidem revalidar e redescrever a espécie, tendo como diagnose a combinação dos seguintes caracteres morfológicos: 13
coloração ventral branca ou amarelada com reticulado cinza; presença de uma glândula comissural e tímpano indistinto (TOLEDO et al., 2010).
Tabela 1: Espécies de Elachistocleis, localidades tipo e autores.
Estado / Espécie Município Departamento País Autor
E. bicolor Buenos Aires Capital Federal Argentina Guérin-Méneville (1838)
E. bumbameuboi São Luis Maranhão Brasil Caramaschi (2010)
E. carvalhoi Aragominas Tocantins Brasil Caramaschi (2010)
E. cesarii Piquete São Paulo Brasil Miranda-Ribeiro (1920)
E. erythrogaster São Francisco de Paula Rio Grande do Sul Brasil Kwet & Di Bernardo (1998)
E. haroi El Algorrobal Jujuy Argentina Pereyra et al (2013)
E. helianneae Humaitá Amazonas Brasil Caramaschi (2010)
E. magnus Espigão D'oeste Rondônia Brasil Toledo (2010)
E. matogrosso Cuiabá Mato Grosso Brasil Caramaschi (2010)
E. muiraquitan Xapuri Acre Brasil Nunes de Almeida & Toledo (2012)
E. surumu Pacaraima Roraima Brasil Caramaschi (2010)
E. panamensis El Cope Old Panamá Panamá Dunn et al. (1948)
E. pearsei - Fundacíon Colômbia Ruthven (1914)
E. piauiensis Picos Piauí Brasil Caramaschi & Jim (1983)
E. skotogaster El Toldos Salta Argentina Lavilla et al (2003)
E. surinamensis - - Suriname Daudin (1802)
E. ovalis - - - Schneider (1799)
Apesar dos estudos recentes, ainda existem várias questões taxonômicas associadas às espécies de Elachistocleis, com indícios que reforçam a necessidade de uma exaustiva revisão taxonômica que permita reavaliar a riqueza de espécies do gênero (e.g. Lavilla et al., 2003; Caramaschi, 2010). Essas questões estão relacionadas, em parte, ao grande aumento de material disponível em coleções nas últimas décadas, o que culminou no aumento exponencial de dados disponíveis, nos permitindo avaliar melhor as variações intra e interespecíficas das espécies a partir de diferentes fontes de dados. A continuidade no uso do binômio Elachistocleis ovalis pela comunidade cientifica (e.g. Schalk et al., 2013, exceto no Brasil e Argentina, é mais um ponto que reforça a necessidade de novos estudos.
A ampla distribuição geográfica e os diferentes ambientes ocupados pela espécie somados às variações fenotípicas levantaram a suspeita da existência de 14
um complexo de espécies ainda indistintas sob o nome Elachistocleis cesarii. Uma abordagem integrativa é proposta para solucionar essas questões taxonômicas, com enfoque principal em dados genéticos, que permitem o reconhecimento de eventuais novas linhagens ou linhagens parafiléticas ou polifiléticas, e em dados morfológicos, para que pudéssemos confrontar as diagnoses propostas. O uso da genética como ferramenta taxonômica vem crescendo ao longo dos últimos 20 anos, no entanto nenhum trabalho foi publicado tendo como enfoque espécies do gênero, fazendo desse o primeiro trabalho filogenético do grupo. Há, no entanto, trabalhos envolvendo microhilídeos que incluíram dados de Elachistocleis (e.g. de SÁ et al., 2012).
O status de conservação das espécies do gênero é, de maneira geral, pouco preocupante. A exceção é E. erythrogaster, conhecido apenas para a localidade tipo e áreas próximas, além de longo período sem coleta (T. G. Santos, com. pess.). Para Elachistocleis cesarii, o status é “menos preocupante” (Least Concern - LC), segundo a Lista Nacional de Espécies Ameaçadas de Extinção (SUBIRÁ et al., 2012); porém a espécie não consta na lista vermelha da IUCN. É importante ressaltar que o status está sujeito a mudanças de acordo com novos estudos de revisão taxonômica e distribuição geográfica das espécies.
OBJETIVOS
Os objetivos desse estudo foram avaliar a diversidade genética de Elachistocleis cesarii (Miranda-Ribeiro, 1920) e informações morfológicas, e suas implicações taxonômicas.
15
2. MATERIAIS E MÉTODOS
Este estudo foi baseado prioritariamente no uso de dados moleculares e morfológicos de Elachistocleis cesarii e de outras espécies do gênero, obtidos a partir de coleções zoológicas e de tecido.
2.1. MATERIAL DE ESTUDO Foram utilizadas amostras de tecidos e exemplares das seguintes coleções: CFBH, FURG, URCA, UFBA, UNESP — Jaboticabal, PUC-RS, UFMG, MTUR, UFG, MACN e IIBP.
Foi realizada uma visita ao MZUSP para a observação dos exemplares de E. cesarii descritos por Miranda-Ribeiro e também para o levantamento de dados morfológicos. Para material examinado, ver Apêndice A.
2.2. TRABALHO DE CAMPO Os esforços de coleta foram pontuais, restringindo-se a duas localidades da série tipo de E. cesarii, de forma a complementar os dados obtidos em coleções.
A primeira delas foi à cidade de São Paulo (SP), mais especificamente no Projeto Pomar Urbano, localizado na margem do rio Pinheiros; neste local foi coletado um exemplar de Elachistocleis ovalis em 2006, durante um levantamento de herpetofauna (VIZIOLI, 2007). Entretanto, nossa visita não foi bem sucedida e outras tentativas foram descartadas devido às características do ambiente, como constantes remodelagens do local com obras e paisagismo.
A segunda localidade foi a cidade de Piquete, localizada no interior do estado de São Paulo, entre a Serra do Mar e a Serra da Mantiqueira. Durante as buscas o canto da espécie foi ouvido em diversos trechos e três exemplares foram coletados.
2.3. DADOS MOLECULARES Para as análises moleculares utilizamos algumas sequências de DNA recuperadas da base de dado online Genbank e outras de populações de Elachistocleis, em especial das espécies de ventre manchado. O processo de extração de DNA foi realizado a partir de amostras de tecido (músculo ou fígado), 16
utilizando o Protocolo de Extração de DNA por Acetato de Amônio (MANIATIS et al., 1982), com algumas adaptações (Mariana Lyra, Lab. Herpeto UNESP-RC) ver apêndice B.
Foram escolhidos dois fragmentos de genes mitocondriais frequentemente usados na literatura (e.g. Vences et al., 2005a; 2005b; de Sá et al., 2012; Peloso et al., 2014) e de fácil comparação. São eles: CO1 (Cythocrome oxidase Subunit 1) e 16S. Os primers usados foram: Anf1 e AnR1 (JUNGFER et al., 2013) para CO1 e 16S AR e 16S BR (PALUMBI et al., 2002) para 16S (ver tabela 2), ambos os primers com caudas, M13_F (CTGGCCGTCGTTTAC) e M13_R (CAGGAAACAGCTATA). As sequências foram amplificadas usando o método de PCR (Polymerase Chain Reaction) em termociclador com as seguintes configurações: 3 minutos para desnaturação inicial a 95ºC, seguido por 36 ciclos de 20 segundos para desnaturação a 95ºC; 20 segundos para anelamento a 51ºC e 60 segundos para extensão a 60ºC. Ao final é realizada uma etapa para extensão por 7 minutos a 60ºC.
Após esse processo uma alíquota das amostras é aplicada em gel de agarose a 1% em cuba de eletroforese, onde ficavam de 25 a 40 minutos dependendo das proporções geométricas do gel e da corrente aplicada. Por fim, as amostras funcionais foram enviadas para sequenciamento na empresa MACROGEN (Seul, Coréia do Sul).
Tabela 2: Sequências dos primers usados. Primers Sequências 16S AR 5'-CGCCTCTTGCTTAAAAACAT-3' 16S BR 3'-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-5' CO1 AnF1 5'-ACHAAYCAYAAAGAYATYGG-3' CO1 AnR1 3'-CCRAARAATCARAADARRTGTTG-5'
A nomenclatura usada para identificar as amostras apresentadas nas árvores filogenéticas foi: Sigla da fonte da sequência (VL — Vinicius Loredam; PT — Pedro Peloso; ML — Mariana Lyra; GB — Genbank), número da sequência, seguido da identificação original da espécie, representada por duas letras e terminada pela sigla 17
do estado/país de origem da amostra (e.g. VL025_OV_SP), informações detalhadas das amostras no Apêndice C. Para os estados brasileiros foi utilizado o padrão usual de abreviação. Para as espécies: OV = Elachistocleis ovalis; BC = E. bicolor; CS = E. cesarii; CV = E. carvalhoi; PS = E. piauiensis; BB = E. bumbameuboi; HE = E. helianneae; MO = E. matogrosso; MN = E. magnus; PN = E. panamensis; PE = E. pearsei; SU = E. surumu.
2.3.1. Análise dos dados moleculares
As sequências obtidas de cada gene foram editadas para remoção dos primers e trechos de baixa qualidade no software SEQUENCER 4.5 (Gene Codes Corporation, Michigan, USA) e as sequências forward e reverse foram unidas em uma única sequência consenso. Estas foram exportadas como arquivos de texto no formato FASTA. Posteriormente as sequências foram alinhadas, juntamente com as sequências do grupo externo, no software MEGA 6.0 (TAMURA et al., 2013) utilizando o algoritmo MUSCLE com configurações em default, além de eventuais correções manuais. Nesse mesmo software, foram realizadas análises preliminares em busca por sequências contaminadas e outros eventuais problemas.
Essas matrizes foram então convertidas em formato TNT com auxilio do software MESQUITE 2.75 (MADDISON & MADDISON, 2011), no qual as matrizes dos genes foram concatenadas.
As análises filogenéticas e a geração das árvores foram realizadas no software TNT 1.1 (GOLOBOFF et al., 2000), a partir das matrizes dos genes 16S, CO1 e concatenadas, uma de cada vez, como dados de entrada. As árvores dos genes separados apresentam alguns terminais e clados que não estão presentes na árvore concatenada devido à falta de complementaridade, o que fazia com que os valores de suporte caíssem bruscamente. Essas árvores estão disponíveis no apêndice D. As configurações das análises foram as mesmas para todas as matrizes, sendo primeiramente definido o grupo externo (amostra GB44_MH_XX — Microhyla heymonsi), seguido da análise propriamente dita, com a opção “New Technology search” e nível inicial de 50. Com essa configuração o programa sugere o uso dos algoritmos sectorial search, tree drifting e tree fusing (GOLOBOFF, 1999). 18
As configurações sugeridas foram aceitas sem alterações nos parâmetros e buscando 250 vezes por árvores com menor quantidade de passos.
O algoritmo sectorial search trabalha com partes pequenas do conjunto de dados de forma a rearranjá-los e realocá-los diversas vezes, enquanto o algoritmo tree drift aceita árvores com valores subótimos nos rearranjos e, por fim, o algoritmo tree-fusing combina e compara clados compatíveis em diferentes árvores, sempre com a finalidade de encontrar a árvore mais parcimoniosa (GOLOBOFF, 1999).
Após análise a árvore consenso (conjugado das árvores mais parcimoniosas) foi salva para então ser reamostrada (resampling) usando jackknife (FARRIS et al., 1996) (algoritmo de remoção independente de caracteres) no valor padrão (36), replicando a busca 1000 vezes usando os mesmos parâmetros da busca inicial, apenas limitando a quantidade de encontros da melhor árvore para 5.
Os clados [ou tecnicamente mais apropriado nesse caso, Molecular Operational Taxonomic Unit – MOTU (BLAXTER et al., 2005), em português Unidade Molecular Taxonômica Operacionais – UMTO], foram agrupados com base na estrutura da árvore mais parcimoniosa, sempre mantendo o monofiletismo e valores de suporte ≥70 de Jackknife. Essas UMTOs foram nomeadas tentativamente a partir de dados geográficos. Desses clados definidos inicialmente, foram calculadas as divergências genéticas dentro dos clados e entre eles, buscando evidências que corroborassem a delimitação dos agrupamentos; algumas mudanças foram feitas nos grupos que apresentavam valores discrepantes comparados aos demais.
Algumas premissas precisam ser preenchidas para que os dados moleculares tenham eficiência taxonômica, como ter divergências altas o suficiente para sobrepor diferenças intraespecíficas e baixas o suficiente para garantir a detecção de novas espécies emergentes. Além disso, a amplificação e o sequenciamento devem ser confiáveis, independente de condições laboratoriais e protocolos e o alinhamento deve ser possível mesmo entre táxons pouco relacionados (VENCES et al., 2005a). No entanto, deve-se ter em vista os processos contínuos e distintos da formação e evolução de espécies, que podem ser mais rápidos ou mais lentos (de QUEIROZ, 1999), além de introgressões, que levam a características genéticas pouco diferenciadas, podendo culminar em casos de falsos negativos (FOUQUET et al., 19
2007) ou casos de linhagens genéticas muito divergentes que não representam espécies distintas (falsos positivos) (MEYERS & PAULAY, 2005).
Vences et al. (2005a, 2005b) sugerem valores de divergência genética de 5% e 10%, para os genes 16S e CO1 em anfíbios, respectivamente. Em teoria, esses valores representariam um ponto de clara distinção entre as divergências intraespecíficas e interespecíficas em anfíbios; porém, eles podem variar e não devem ser encarados como pontos de corte absolutos, necessitando de uma análise caso a caso.
Com base nos agrupamentos recuperados na árvore filogenética e corroborados pelo distanciamento genético dos espécimes, os clados foram organizados e a distância genética média entre e dentro dos grupos foi calculada no software MEGA 6.0.
Os gaps (ou indels) foram interpretados como quinto estado, estando presentes apenas nas sequências 16S e, em geral, devido ao alinhamento com as sequências do grupo externo.
2.3.2. Grupo Externo O grupo externo foi escolhido com base em grupos previamente utilizados na literatura (e.g. de SÁ et al., 2012; PELOSO et al., 2014). Foram utilizadas sequências de DNA, obtidas principalmente no Genbank e as espécies escolhidas foram Dermatonotus muelleri (Gastrophryninae), grupo irmão de Elachistocleis e Microhyla heymonsi (Microhylinae), uma espécie mais afastada, ambos da Família Microhylidae.
2.3.3. Teste de mantel O teste de Mantel tem como objetivo testar a dissimilaridade entre duas matrizes de distância, no caso distância genética e geográfica, em busca de co- dependência entre as variáveis.
Foi realizado um teste de Mantel simplificado através do software Alleles in Space v.1.0 (MILLER, 2005) com 10.000 réplicas. Para essa análise foram utilizadas como entrada duas matrizes com dados apenas das espécies de ventre manchado, uma matriz de coordenadas geográficas contendo o nome das amostras, seguida 20
pelas coordenadas de latitude e longitude em grau decimal e outra matriz contendo o nome das amostras e as respectivas sequências do gene 16S. Resultado apresentado na figura 10.
2.4. DADOS MORFOLÓGICOS E MORFOMÉTRICOS Foram observados 14 caracteres da morfologia externa e quatro caracteres morfométricos, além das relações entre esses caracteres, de 458 indivíduos adultos e fixados de diversas populações do gênero Elachistocleis. Desses, 67 indivíduos foram identificados a priori como E. cesarii. A escolha dos caracteres que foram mensurados seguiu alguns caracteres já usados em outros trabalhos, como nas descrições das espécies do gênero. A tabela 3 apresenta uma lista de todos os caracteres morfológicos e morfométricos usados por nós juntamente com a informação de que outros pesquisadores também usaram. Os espécimes foram sexados com base nos caracteres sexuais secundários, como presença de saco vocal nos machos e presença de ovócitos maduros nas fêmeas. Eventualmente, a presença de fendas vocais (exclusividade dos machos) também foi verificada. Para a observação de caracteres diminutos foram usadas lupa e estereomicroscópio (Zeiss) e para os dados morfométricos foi usado um paquímetro digital de precisão 0,01 mm (Mitutoyo).
2.4.1. Caracteres Morfométricos
- Comprimento Rostro-Cloacal (CRC) (sensu Duellman, 2001) Comprimento da ponta do focinho até a cloaca (Fig. 1).
- Comprimento da Cabeça (CC) (sensu Duellman, 2001) Comprimento da comissura bucal até a ponta do focinho (Fig. 1).
- Largura da Cabeça (LC) (sensu Duellman, 2001) Largura da cabeça obtida entre as comissuras bucais (Fig. 1).
- Largura do Corpo na Altura da Axila (LA) 21
Largura do corpo medida entre as axilas. A adoção desta medida foi uma tentativa de diminuir a interferência causada por fêmeas ovadas que, em geral, são muito mais largas, e assim obter medidas e proporções corpóreas mais realistas para comparações (Fig. 1).
Também foram calculadas as relações: CC/LC; CC/CRC; LC/LA e LA/CRC. Esses resultados são apresentados nas figuras 14a — 14d em valores percentuais. A utilização de proporções aparece em alguns trabalhos de descrição de espécies do gênero Elachistocleis (e.g. Caramaschi & Jim, 1983; Caramaschi, 2010; Toledo, 2010).
Tabela 3: Lista de caracteres morfométricos e morfológicos usados neste estudo e por alguns outros autores. Descrição dos caracteres abaixo.
Caracteres morfológicos e morfométricos CC/ CC/
CRC CC LC LC CRC CD LD CV CVM LDVC LF LT AXL VIR GPC
Toledo et X - - X - X X X - - X X X X X al. (2010) Caramaschi X X X X - X X X - - X X X X X (2010) Toledo X - X X X - - X X X X X (2010) Nunes de Almeida & X X X X - X X - - X - X X X Toledo (2012) Caramaschi & Jim X X X - X X X - - X - X X X
(1983) Pereyra et X X X X X X X X - X X X - - - al. (2013) Ruthven X - - - - X X X X X - X X - (1914) Dunn et al. X - - - - X X X X X X X - - - (1948)
22
Figura 1: Diagrama esquemático das medidas usadas neste estudo (adaptado de DUELLMAN, 2001). Veja o texto para maiores detalhes.
2.4.2. Caracteres morfológicos e seus estados
Os caracteres morfológicos, baseados em cor e forma, geralmente carregam consigo um grande peso de subjetividade relativa ao ponto de vista do observador devido às condições de iluminação, conservação do espécime e o próprio observador. De forma a minimizar esses efeitos, tentamos eliminar as variáveis subjetivas e os dados morfológicos foram observados e analisados da maneira mais simples possível.
- Coloração Dorsal (CD): Coloração dorsal predominante.
1 – Cinza uniforme 2 – Marrom 3 – Cinza com pontos claros dispersos 4 – Cinza com pontos escuros dispersos 23
- Linha Dorsal (LD): Linha medial dorsal, comumente branca ou clara, que pode ou não estar presente. Quando presente, esta pode apresentar formas irregulares (não completamente retilíneas), com larguras e comprimento diversos.
0 – Ausente 1 – Branca 2 – Preta* 3 – Preta e branca
* Apesar da coloração dorsal dos exemplares ser geralmente escura, é possível observar uma linha bem definida e mais escura em alguns exemplares.
- CV (Coloração Ventral) e CVM (Coloração Ventral dos Membros):
A coloração ventral (CV) e a coloração ventral dos membros (CVM) foram baseadas no padrão predominante de cor e se tratam de caracteres relevantes principalmente considerando-se a viabilidade prática de observá-los em exemplares preservados, bem como durante atividades de campo. Os estados desses caracteres podem ser vistos na prancha da Figura 2 e uma descrição formal de cada estado segue abaixo:
0 - Imaculada: Matriz amarelada (creme) ou branca, por vezes com uma grande mancha de mesma coloração e tonalidade mais intensa, no tórax. Não apresenta outros tipos de mancha. 1 – Branco com manchas escuras: Matriz predominantemente clara com pontuações acinzentadas e agrupamentos esparsos de pontos pretos formando manchas discretas e disformes. 2 – Marrom com manchas claras: Matriz clara evidenciada por manchas de tamanho médio em meio ao predomínio de manchas escuras (geralmente marrons) dando uma impressão de “escuro com manchas claras”. 3 – Marmoreado claro e escuro: Predomínio da matriz clara (às vezes branca leitosa) com aglomerados discretos, disformes e esparsos de pontuações escuras (tons de marrom ou preto). 24
4 – Escuro com manchas claras: Matriz clara ou marrom claro evidenciada por manchas de tamanho pequeno e predomínio de manchas escuras pouco densamente pontuadas, dando uma impressão de “escuro com manchas claras”. 5 – Claro com manchas escuras (variando de marrom a preto): Predomínio da matriz clara que fica evidente através de manchas grandes e aglomerados disformes de pontos escuros com adensamento variado. 6 – Claro com manchas escuras: Predomínio da matriz clara, com pontos mais claros esparsos e pequenos aglomerados escuros densamente pontuados e disformes.
- Limite Dorso-Ventral de Coloração (LDVC):
0 – Bem definido: Quando ocorre uma clara distinção entre a coloração ventral e dorsal. 1 – Progressivo: Quando as colorações do flanco dorsal e ventral apresentam gradiente, sem que seja possível uma clara distinção dos limites.
- Linha Femoral - Retilínea (LFR): Mancha femoral em formato de linha, comumente de coloração clara que cruza a parte posterior da coxa, podendo ou não passar sobre a região cloacal e apresentar diversidade na largura e na regularidade das bordas.
0 – Ausente 1 – Presente
- Linha Femoral - Não Retilínea (LFNR): Mancha femoral em formato de pontuações na parte posterior da coxa, comumente de coloração clara, podendo ou não passar sobre a região cloacal e de intensidade variável (pouco manchada até muito manchada).
0 – Ausente 1 – Presente
25
- Linha Tibial - Retilínea (LTR): Mancha tibial em formato de linha na parte interior da tíbia. Geralmente de cor clara. Pode apresentar largura variada e irregularidades nas bordas.
0 – Ausente 1 – Presente
- Linha Tibial - Não Retilínea (LTNR): Mancha tibial em formato de pontuação na parte interior da tíbia, sendo geralmente de cor clara. Pode apresentar largura e quantidade de pontuações variável além de formato irregular.
0 – Ausente 1 – Presente
- Manchas axilares (AXL): Manchas claras presentes na região axilar (axila, parte posterior do braço e região lateral do tórax próximos às axilas), podendo variar de uma mancha única até várias manchas pequenas aglomeradas.
0 – Ausentes 1 – Presentes
- Manchas Inguinais (VIR): Manchas claras presentes na região inguinal (virilha, parte anterior da coxa e região lateral do tórax próximos à virilha), podendo variar de uma mancha única ou várias manchas pequenas aglomeradas.
0 – Ausentes 1 – Presentes
- Glândula pós-comissural (GPC): A glândula pós-comissural é uma estrutura aparentemente glandular (não existem cortes histológicos disponíveis) que se desenvolve próximo ao canto da boca; historicamente, quando presente, era diferenciada entre bem desenvolvida e pouco desenvolvida. Caso realmente seja uma estrutura glandular, ela sofre efeitos 26
diretos e indiretos de hormônios que podem ou não estar ligados ao estado reprodutivo (WOODLEY, 2015), levando a observações, eventualmente, enviesadas. Preferimos, portanto, ser conservativos e manter apenas dois estados para esse caractere.
0 – Ausente 1 – Presente
- Espinhos Dérmicos Cloacais (EDC) e Gulares (EDG): A presença de espinhos dérmicos é comum entre os microhilídeos (e.g. PARKER, 1934; NELSON, 1973; LEHR & TRUEB, 2007; PELOSO et al., 2014). Estes são projeções, aparentemente queratinizadas, levemente curvas e pequenas, geralmente visíveis apenas com auxílio de estereomicroscópio, na região posterior do corpo, próximas à cloaca, eventualmente encontrado na superfície dorsal da coxa e posterior do dorso (EDC). Os espinhos dérmicos gulares (EDG) são menores que os EDC e visíveis apenas com auxilio de estereomicroscópio em grandes aumentos, sendo encontrados na região do arco mandibular e, eventualmente, na superfície gular. Também são observados na parte interior dos membros anteriores de alguns indivíduos.
0 – Ausentes 1 – Presentes
2.4.3. Análise dos dados morfométricos e morfológicos Para a análise dos dados morfométricos (quantitativos) foi realizada uma análise de PCA (Principal Component Analysis) no software PAST 3.07 (HAMMER et al., 2001), buscando identificar algum grau de variação entre as UMTOs analisadas. Também foram gerados gráficos “Box Plot”, que calculam a mediana e os quartis (inferior = 25% dos menores valores; superior = 75% de todas as medidas) — representados pela “caixa” e segmentos de reta que conectam os extremos da caixa aos valores extremos.
Para os dados morfológicos (qualitativos) foram realizadas comparações diretas entre os caracteres e clados em busca de alguma informação exclusiva. 27
Figura 2: Prancha usada para identificar os padrões de coloração ventral (CV e CVM): 0 — Imaculada; 1 — branco com manchas escuras; 2 — escuro com manchas claras; 3 — marmoreado claro e escuro; 4 — escuro com manchas claras; 5 — claro com granulações escuras; 6 — claro com manchas escuras.
28
3. RESULTADOS
Foram analisadas 191 sequências do gene 16S (~545 pb) e 180 do gene CO1 (~645 pb), ambos mitocondriais, resultando nas árvores do Apêndice D. Uma matriz com os genes concatenados foi gerada e todas as sequências que não apresentavam os dois genes foram removidas, já que se agrupavam aleatoriamente, gerando uma matriz com 158 terminais e cerca de 1190 pares de bases. Foi realizada análise de parcimônia usando o método de busca New Technology Search, obtendo o melhor score de 837 com retenção de 213 árvores, um consenso seguido de reamostragem foi realizado resultando na árvore da Figura 3, que será detalhada ao longo do texto (Figuras 4 — 8).
Devido a grande quantidade de árvores retidas (213), foi realizado o processo de pruning pelo TNT que, grosso modo, busca por terminais que estejam instáveis na topologia da árvore, causando o acumulo de árvores similares. Foram testados valores entre 1 e 15, sem melhoria dos resultados.
Em todas as árvores geradas observou-se a presença de dois grandes clados muito bem suportados (jackknife = 100) que, após a análise morfológica dos exemplares testemunhos, percebemos que correspondiam às populações de ventre imaculado e às de ventre manchado. Cada um desses clados está subdividido em subclados que foram nomeados, em sua maioria, tentativamente com base em dados geográficos, como maior proximidade à localidade tipo, além de dados morfológicos. No entanto, as únicas populações com identidade confirmada são E. bumbameuboi (holótipo) e E. cesarii. Portanto, a utilização de UMTOs foi uma forma operacional de viabilizar as análises.
3.1. DISTÂNCIAS GENÉTICAS
As UMTOs foram agrupados com base na estruturação das árvores filogenéticas e nomeados, majoritariamente, com base nas referências geográficas. Como Elachistocleis cesarii é uma espécie de ventre manchado, as espécies de ventre imaculado foram subamostradas. A partir desses agrupamentos foi elaborado o mapa da Figura 9 onde é apresentada a distribuição geográfica das UMTOs. 29
Tabela 4: Distâncias genéticas médias e erro padrão dentro dos clados. Valores expressos em %. N refere-se ao total de amostras para cada gene. Elachistocleis cesarii destacada em negrito.
CLADOS 16S N (191) CO1 N (180) OG1 - 1 - 1 OG2 - 1 - 1 BICOLOR 0,334 ± 0,16 5 0,979 ± 0,27 4 HELIANNEAE 1,673 ± 0,54 2 2,492 ± 0,61 2 MATOGROSSO 1,087 ± 0,26 29 1,795 ± 0,32 11 CESARII 0,521 ± 0,13 67 0,980 ± 0,20 70 BUMBAMEUBOI 0,485 ± 0,16 18 1,163 ± 0,23 20 PANAMENSIS 0,186 ± 0,18 2 0,468 ± 0,25 2 PEARSEI 0,186 ± 0,18 2 - 0 SURUMU 0,310 ± 0,13 6 0,427 ± 0,19 4 SP3 0,173 ± 0,08 15 0,681 ± 0,17 18 SP4 0,037 ± 0,04 10 0,350 ± 0,14 9 SP5 0 3 0,305 ± 0,15 4 SP6 0,146 ± 0,07 26 0,634 ± 0,17 30 SP7 0,124 ± 0,12 4 1,211 ± 0,31 4
Todas as UMTOs amostradas apresentaram divergência genética intraespecífica abaixo dos valores sugeridos na literatura para serem considerados como espécies distintas (e.g. Vences et al., 2005a, 2005b).
Tabela 5: Distância genética entre grupos das UMTOs de ventre manchado. Gene 16S abaixo da diagonal e CO1 acima. Valores médios e erro-padrão expressos em %. Tabela com valores de todos os clados analisados no Apêndice E.
UMTOs: CS = CESARII; BB = BUMBAMEUBOI; PN = PANAMENSIS; PE = PEARSEI; SU = SURUMU. 31
Figura 3: Visão geral da árvore consenso (score: 837) dos genes concatenados dividida nos subclados “OG” - Outgroup, “Ventre Imaculado” e “Ventre Manchado”, que são detalhados ao longo do texto. 32
3.1.1. Clados
Grupos Externos
Figura 4: Grupos externos (outgroup) usados para enraizar as análises. Microhyla heymonsi – MH (Microhylinae) e Dermatonotus muelleri – DM (Gastrophryninae).
As distâncias genéticas médias entre Microhyla heymonsi e as espécies de Elachistocleis variaram acima de 11,5% no gene 16S e 17,5% em CO1. No caso de Dermatonotus muelleri, as distâncias foram menores por se tratar de uma espécie da mesma subfamília que Elachistocleis; apesar disso, os valores ficaram acima de 8,5% e 16,5% para 16S e CO1, respectivamente. Para todos os valores de distância genética ver Apêndice E.
Imaculados
Devido à baixa amostragem denominamos os clados de ventre imaculado baseados nas informações geográficas e distribuições conhecidas para as espécies.
Figura 5: UMTOs de ventre imaculado com três táxons bem suportados. A esquerda da figura uma versão miniaturizada da árvore toda com destaque para a área ampliada. 33
Podemos observar a presença de três UMTOs, de espécimes com ventre imaculado, bem suportadas (Fig. 5). Sendo essas identificadas como HELIANNEAE (AM), BICOLOR (RS) e MATOGROSSO (MT, MS, RO e SP).
A UMTO MATOGROSSO apresenta uma topologia composta por três ramos principais e primariamente foi tratada como três UMTOs distintas; porém, as distâncias internas e entre os grupos eram mais baixas do que as encontradas nos outros grupos. Não foi possível analisar a morfologia de todos os exemplares. Analisamos somente os exemplares de São Paulo, que são compatíveis com E. matogrosso, nos levando a crer que se trata de apenas uma UMTO, cuja topologia é reflexo da estrutura populacional.
A amostra VL085 é de um exemplar coletado na área da Usina Hidrelétrica APM Manso (Aproveitamento Múltiplo de Manso), aproximadamente 100 km de Cuiabá, MT — localidade tipo da espécie.
As amostras de Rondônia estavam identificadas originalmente como Elachistocleis magnus; no entanto, não foi possível a análise morfológica de nenhum desses testemunhos e devido aos resultados genéticos aqui apresentados, acreditamos que o mais provável seja erro de identificação dos espécimes ou das amostras, de forma que mais amostras e exemplares testemunhos devem ser analisados.
Por fim, a presença de E. matogrosso no estado de São Paulo já havia sido documentada na literatura como E. bicolor e variações “cf.” e “aff.” (e.g. Prado & Rossa-Feres, 2014; Ribeiro-Junior & Bertolucci, 2009; Rossa-Feres et al., 2011; Provete et al., 2011; Araujo et al., 2013) e de forma concordante com os nossos resultados por Nunes de Almeida & Toledo (2012).
Os ramos que contemplam as UMTOs de ventre manchado foram subdivididos em três partes:
- SURUMU, SP7, SP5 e SP6 (Figura 6);
- SP4, SP3 e BUMBAMEUBOI (Figura 7);
- CESARII (Figura 8). 34
Manchados
Figura 6: Porção da árvore de consenso estrito contemplando as UMTOs SURUMU, SP5, SP6 e SP7. Valores sobre os nós correspondem a valores de jackknife. Valores abaixo de 50% foram suprimidos.
35
Figura 7: Continuação da árvore filogenética dos espécimes de ventre manchado. O clado BUMBAMEUBOI foi nomeado com base na sequência do holótipo (PT536_BB_MA), para os demais clados não foi possível atribuir um nome disponível.
36
Figura 8: Parte final da árvore filogenética com destaque para o clado CESARII. Espécimes de Piquete/SP em destaque: VL113, VL125 e VL126_CS_SP. 37
Tecnicamente as UMTOs SP5 e SP6 (figura 6) poderiam ser consideradas uma só devido ao baixo suporte (jackknife = 59) no ramo que as une. No entanto, apesar da baixa amostragem, preferimos deixá-las separadas visto que SP5 é formado exclusivamente por espécimes da Bahia e SP6 apresenta espécimes de outros estados, majoritariamente do Tocantins. Apesar da distribuição geográfica próxima entre os espécimes das duas UMTOs, o suporte interno de cada uma é muito elevado (jackknife = 100), justificando mantê-las separadas nas análises.
Caso semelhante ocorre entre as UMTOs SP4, SP3 e BUMBAMEUBOI (figura 7), porém com a diferença que há um suporte elevado no ramo que as une (jackknife = 99). Os espécimes da UMTO SP4 são exclusivamente do Ceará e identificados originalmente como E. piauiensis. Apesar disso, espécimes da UMTO SP6 estão praticamente equidistante da localidade tipo de E. piauiensis em relação aos espécimes de SP4. Além disso, existe um espécime da UMTO SP7, geograficamente muito próximo desses espécimes. Somando-se a esses fatos a sobreposição de caracteres morfológicos, não foi possível atribuir nomes.
Dentro da UMTO SP3 temos amostras identificadas como E. carvalhoi e que morfologicamente são coerentes. No entanto, as amostras identificadas como E. magnus certamente estão identificadas erroneamente, sendo morfologicamente compatíveis com E. bumbameuboi. Portanto, devido a sobreposições morfológicas preferimos deixar essa UMTO sem nome específico.
Por fim, a UMTO BUMBAMEUBOI foi nomeada com base nas sequências do holótipo da espécie, representado pelo terminal PT536_BB_MA. O suporte do ramo que une esses subclados é elevado (jackknife = 94) e sua topologia decorre da distribuição geográfica dos espécimes.
A UMTO CESARII foi nomeada a partir de sequências de Piquete — SP, uma das localidades da série tipo, representados pelos terminais VL113, VL125 e VL126_CS_SP. Apresenta um suporte global de 84 (jackknife) e internamente alguns subclados com baixo suporte, notadamente sendo agrupamentos geográficos.
38
Figura 9: Mapa de distribuição geográfica dos espécimes amostrados neste estudo. Quadrados coloridos para espécimes de ventre imaculado e círculos coloridos para espécimes de ventre manchado. Quadrados pretos representam as localidades-tipo: A = Elachistocleis cesarii; B = E. bumbameuboi; C = E. surumu; D = E. pearsei; E = E. panamensis; F = E. matogrosso; G = E. bicolor; H = E. helianneae; I = E. surinamensis; J = E. piauiensis; K = E. erythrogaster; L = E. skotogaster; M = E. magnus; N = E. carvalhoi; O = E. muiraquitan; P = E. haroi.
Podemos observar a proximidade geográfica de diversas UMTOs, o que dificultou nomear alguns clados com base em dados geográficos.
3.2. TESTE DE MANTEL
Figura 10: Gráfico do Teste de Mantel correlacionando distâncias genéticas e geográficas. Valores de correlação: r = 0,254; Probabilidade de observar uma corelação maior ou igual à encontrada: P = 0,00470; e menor ou igual à encontrada: P = 0,995. 40
3.3. DADOS MORFOMÉTRICOS E MORFOLÓGICOS
Foi realizada uma análise de componentes principais (PCA) com os dados morfométricos na tentativa de recuperar alguma informação representativa. O resultado para as UMTOs de ventre manchado pode ser observado na Figura 11.
Figura 11: Gráfico da Análise de Componentes Principais (PCA) para as UMTOs de ventre manchado. CRC e LA são os maiores contribuidores para os eixos dos Componentes Principais 1 e 2, respectivamente. Os valores apresentados estão em função dos autovalores (eigenvalue).
O CRC explica aproximadamente 87,4% da variação total, seguido pela LA com aproximadamente 6,68%, sendo todas as correlações positivas para o Componente 1 e alternadas no Componente 2, indicando respectivamente “tamanho” e “forma” de acordo com Humphries et al. (1981).
Situação semelhante ocorre na PCA das UMTOs de ventre imaculado (figura 12 e tabela 7). 41
Dessa forma, os dados morfométricos não fornecem nenhum grau de separação entre as espécies, visto a sobreposição das UMTOs de ventre manchado no gráfico da figura 11.
Tabela 6: Valores encontrados na PCA das UMTOs de ventre manchado.
Comp. Principal Autovalor % Variância 1 3,498 87,442 2 0,267 6,677 3 0,138 3,454 4 0,097 2,427
Figura 12: Gráfico da Análise de Componentes Principais (PCA) para as UMTOs de ventre imaculado. CRC e LA são os maiores contribuidores para os eixos dos Componentes Principais 1 e 2, respectivamente. Os valores apresentados estão em função dos autovalores (eigenvalue).
Tabela 7: Valores encontrados na PCA das UMTOs de ventre imaculado.
Comp. Principal Autovalor % Variância 1 32,935 96,551 2 1,035 3,035 3 0,108 0,317 4 0,033 0,097
42
Os gráficos “Box Plot” obtidos para cada medida e relações podem ser vistos no conjunto de Figuras 13 e 14.
Figura 13a — d: Box plot das medidas CRC, CC, LC e LA (em mm), respectivamente.
Na medida do CRC (Fig. 13a) a maior variação foi encontrada na UMTO BICOLOR (~21 mm — 45 mm) sendo a mediana aproximadamente 25 mm. Na medida de CC (Fig. 13b) a maior variação foi encontrada na UMTO SP6 (~4,6 mm — 7,7 mm) sendo a mediana aproximadamente 6,1 mm. Na medida LC (Fig. 13c) as maiores variações foram encontradas nas UMTOs BICOLOR e SP6, sendo de aproximadamente 4 mm em cada. Na medida LA (Fig. 13d) a maior variação foi encontrada na UMTO CESARII (~10 mm — 24 mm) sendo a mediana aproximadamente 14 mm. 43
Figura 14a — d: Box plot das relações CC/LC, CC/CRC, LA/CRC e LC/LA (em %), respectivamente.
Na relação CC/LC (Fig. 14a) a maior variação foi encontrada na UMTO MATOGROSSO (~76% — 93%). Na relação CC/CRC (Fig. 14b) as maiores variações foram encontradas nas UMTOs BICOLOR (~17% — 22,5%) e CESARII (~16% — 21,5%). Na relação LA/CRC (Fig. 14c) a maior variação foi encontrada em CESARII (~39% — 58%), assim como na relação LC/LA (Fig. 14d) (~36% — 60%).
Outra informação morfológica levantada foi a presença de espinhos dérmicos (já relatada por Parker, 1934 — pg.121), relativamente comuns entre os Microhylidae como Chiasmocleis (e.g., Peloso et al., 2014). Essas estruturas foram encontradas, em geral, próximo à abertura cloacal de algumas fêmeas, e na região gular de alguns machos. Também foram observados em alguns machos espinhos dérmicos 44
na face superior dos membros anteriores, alcançando o antebraço e parte das mãos, principalmente dedos II e III. Ver figuras 15 a 17.
Figura 15: Espinhos dérmicos espalhados próximos à abertura cloacal (pontos mais claros) e à face posterior da coxa de uma fêmea da UMTO SP6 (CFBH 13220).
45
Figura 16: Espinhos dérmicos no membro anterior – antebraço, dorso da mão e superfície dorsal dos dedos III e IV — de um macho de E. ovalis – Aguiarnópolis, Tocantins (CFBH 19902).
Figura 17: Espinhos dérmicos gulares, encontrados na região gular de um macho da UMTO SP6 – Darcinópolis, Tocantins (CFBH 16998). 46
4. DISCUSSÃO
4.1. ELACHISTOCLEIS CESARII
De acordo com as evidências resgatadas por esse estudo, Elachistocleis cesarii não se trata de um complexo de espécies, como predito por nossa hipótese inicial, sendo uma espécie com ampla distribuição geográfica nos estados de São Paulo, Minas Gerais, Espírito Santo, Goiás e Mato Grosso, abrangendo mais de 1.400 km de distribuição Leste-Oeste e mais de 1.000 km Norte-Sul e muitas variações fenotípicas que a tornam de difícil identificação quando colocada lado a lado com outras espécies de ventre manchado. Analisando a morfologia de diversas populações de E. cesarii do estado de São Paulo, observou-se grande variedade no padrão ventral dos espécimes como descrito anteriormente, indo desde colorações quase uniformemente claras (creme, amarelada, acinzentada) (CFBH 35043 — Campinas), passando por vários estágios de manchas com padrões que se sobrepõem às colorações ventrais de Elachistocleis piauiensis (CFBH 21353 — Pirassununga; CFBH 31879 — Luis Antônio), E. bumbameuboi (CFBH 20004 e CFBH 20008 — Assis), E. carvalhoi (CFBH 04133 — Rio Claro; CFBH 06635 — Itirapina) e E. surumu (CFBH 06576 — Rio Claro; CFBH 26075 — União de Minas, MG). Também se observa padrões ventrais escuros e quase sem manchas (CFBH 31875 [PT604_CS_SP] e CFBH 31876 — Luis Antônio), como pode ser visto na figura 18.
4.1.1. Diagnose de Elachistocleis cesarii
As características diagnósticas apontadas por Toledo et al. (2010) são apresentadas e discutidas a seguir:
- Coloração ventral branca ou amarelada com reticulado cinza — essa é uma descrição bastante vaga e subjetiva já que todas as espécies de Elachistocleis de ventre manchado apresentam alguma variação desse padrão.
- Presença de glândula pós-comissural — estrutura relativamente comum no gênero, podendo ter estados de turgescência variados e, como discutido anteriormente, em se tratando de fato de uma estrutura glandular, estaria sujeita a variações hormonais. 47
- Tímpano indistinto — característica comum para o gênero e diversos outros, portanto não sendo uma diagnose no nível de espécie.
- Canto de anúncio com frequência média dominante de aproximadamente 3,5 kHz. — As características do canto são influenciadas por muitas variáveis, como a temperatura do ambiente (GERHARDT, 2005), tipo de gravação (analógica ou digital), entre outros, sendo difícil uma comparação direta usando apenas dados da literatura.
4.1.2. Vocalização de Elachistocleis cesarii
Segundo a análise da vocalização realizada por Giaretta et al. (2012), em diversas populações de Elachistocleis de várias localidades (Triângulo Mineiro - Uberlândia, Perdizes e Ituiutaba - MG; Pontal do Araguaia - MT; Campinas - SP; Alto Paraíso de Goiás - GO), todas essas populações apresentam vocalização similar à descrita por Toledo et al. (2010), assim como o descrito para “E. ovalis” de Poços de Caldas (MG) por Haddad et al. (1988). Há também a indicação de que existem diferenças mínimas entre a vocalização dessas populações brasileiras quando comparadas às vocalizações de populações bolivianas (DE LA RIVA et al., 1996; DE LA RIVA et al., 2000), sob o nome E. ovalis, sugerindo que possam ser a mesma espécie.
No trabalho de revalidação de E. cesarii, foram analisados o canto de oito indivíduos apresentando uma variação de 3,45 — 3,60 kHz na frequência dominante (temperatura do ar: 23,1ºC, Rio Claro, SP) sendo esses valores comparados a gravações de 18 indivíduos de E. piauiensis que apresentam variação na frequência dominante entre 4,48 — 4,65 kHz (temperatura do ar: 22 — 27ºC, Caucaia, CE) (TOLEDO et al., 2010).
Nelson (1973) analisa o canto de 12 populações de Elachistocleis de diversas localidades (ver tabela 8), sendo quatro do município de Santo André/SP, que corresponderiam a E. cesarii. Os dados compilados por ele apresentam uma variação maior na frequência dominante (2,1 — 3,6 kHz) e duração do canto (3,2 — 4,1 segundos) quando comparados com os dados de Toledo et al. (2010) (3,45 — 3,60 kHz) e (1,49 — 2,66 segundos). Um ponto que merece destaque é que Nelson 48
(1973) apresenta cantos de populações de várias localidades, em geral gravados por outros pesquisadores ou disponíveis em coleções. Esse autor não distingue entre espécies e não associa o canto a características morfológicas que poderiam nos levar a alguma identificação, de modo que extrapolações dessas informações podem resultar em comparações errôneas.
Tabela 8: Transcrição da tabela de cantos de Elachistocleis sintetizada por Nelson (1973).
Estado / Temp. ºC Nº Duração (s) Freq. Intervalo Município Depart. País Ar/ Água Cantos Média ± Desv. Pad. Dominante (Hz) Harmônico (Hz) Santo André São Paulo Brasil 14,0 4 3,2 — 41 2100 — 3600 180 - 3,7 ± 0,5 3097 ± 414 - Villavicencio Meta Colômbia 20,7 6 3,0 — 4,6 3500 — 4200 160 — 200 24,0 4,3 ± 0,6 3820 ± 227 189 ± 18 Villa Lola Bolívar Venezuela 24,0 37 2,0 — 4,1 3650 — 4150 125 — 142 24,0 2,9 ± 0,5 3834 ± 157 140 ± 7 David Chiriqui Panamá - 5 2,2 — 4,2 3400 — 3600 200 24,0 2,9 ± 0,5 3500 ± 100 - Paramaribo Suriname 25,0 9 2,1 — 2,4 4000 — 4200 200 — 220 - 2,3 ± 0,1 4133 ± 71 211 ± 7 Tunacuna Trinidad 25,0 15 1,3 — 1,7 4100 — 4300 100 — 112 - 1,6 ± 0,2 4133 ± 59 102 ± 4 Cerro la Panamá Panamá - 4 2,0 —- 4,0 3000 — 4100 167 — 220 Compaña 25,2 2,9 ± 1,0 3450 ± 384 210 ± 42 Bejuco Panamá Panamá - 8 2,0 — 3,0 2400 — 4150 220 — 260 25,5 2,2 ± 0,4 3860 ± 173 240 ± 9 Lethem Rupununi Guiana 26,7 8 2,3 — 2,6 4000 — 4800 244 — 260 25,5 2,5 ± 0,1 4425 ± 242 255 ± 7 David Chiriquí Panamá - 13 1,4 — 4,6 3000 — 4000 200 — 230 26,0 2,7 ± 1,6 3455 ± 230 208 ± 11 Maturín Monogas Venezuela 26,0 2 2,1 — 2,4 4000, 4200 216, 220 26,0 - - - San Fernando Apure Venezuela 27,8 1 2,3 4700 113 de Apure 26,7 - - -
Figura 18: Variação da coloração ventral e comprimento em Elachistocleis cesarii. Detalhes e localidades no Apêndice F. 50
4.2. DADOS MOLECULARES
Com base nos dados de distância genética das Tabelas 4 e 5 vemos uma baixa variação genética dentro e entre as populações do gênero Elachistocleis. As implicações dessa baixa variação, no nosso caso, são: o baixo valor de suporte para alguns clados na árvore consenso já que os terminais podem ficar “pulando” entre os ramos e, consequentemente, baixos níveis de resolução quando usados valores de suporte mais confiáveis (ex. ≥70, jackknife), resultando numa grande politomia com todas as UMTOs de ventre manchado.
Durante a busca pelas árvores nos deparamos com uma grande quantidade de árvores ótimas retidas. Isso pode acontecer por diversas causas, como problemas no alinhamento das sequências, contaminação, baixa amostragem ou sequências altamente conservadas. Os alinhamentos foram revistos e problemas de contaminação foram descartados. Ocorre baixa amostragem em algumas UMTOs (PE, PN, SP4 e SP5), o que poderia explicar parcialmente o problema. No entanto, o principal fator são as sequências altamente conservadas ou mesmo idênticas, que resultam em terminais instáveis em diversos pontos na árvore, gerando várias topologias ótimas.
Em termos geográficos vemos diversas áreas de sobreposição das UMTOs, especialmente nas regiões Centro-Oeste e Nordeste do Brasil.
4.3. TESTE DE MANTEL
Os resultados obtidos a partir do teste de Mantel apresentam baixa correlação positiva (r = 0,254), ou seja, a distância geográfica explica pouco da variação genética, como pode ser visto em diversos casos com distâncias geográficas superiores a 3000 km e genéticas inferiores a 3% (Figura 10). Isso pode ser reflexo de sequências gênicas extremamente conservadas e, nesse caso, não sendo um bom fator de resolução taxonômica.
Algumas relações apresentaram valores de divergência genética relativamente altos, especialmente entre amostras do clado PANAMENSIS e SP3 (> 7%), esse grau de divergência pode ser explicado pelo fato de algumas sequências 51
do clado SP3 terem comprimento menor devido a dados faltantes no início ou fim da sequência.
4.4. MORFOLOGIA
Os caracteres morfométricos amostrados apresentaram completa sobreposição das UMTOs como demonstrado nos gráficos box plot e PCA (figuras 11 — 14), sugerindo que não são diagnósticos. Houve um problema na metodologia utilizada para a obtenção dos dados morfológicos, sendo que nem todos os exemplares amostrados molecularmente foram amostrados morfologicamente, em especial os testemunhos de outras coleções herpetológicas. Portanto, não foi possível a realização de análises conjuntas com os dados moleculares (evidência total), como estava previsto, e nem análises estatísticas. No entanto, os dados morfológicos possibilitaram comparações diretas com as características diagnósticas de várias espécies de ventre manchado como, por exemplo, o padrão das manchas e coloração ventral, que assim como a linha dorsal e glândula pós-comissural, apresentaram variações correspondentes às encontradas em mais de uma espécie, mesmo quando observados exemplares dentro de uma mesma UMTO. Possivelmente, esse resultado é reflexo da grande quantidade de exemplares de diversas populações amostrados neste estudo, mostrando uma distribuição mais heterogênea e sobreposta das características diagnósticas, em relação ao que foi originalmente proposto na literatura. Essas informações podem significar que novas características diagnósticas devem ser buscadas ou corroborar os dados genéticos obtidos nesse estudo, que sugerem a sinonímia de várias espécies de ventre manchado.
4.4.1. Estágios larvais em Elachistocleis
Existem poucos trabalhos que descrevem os estágios larvais de espécies de Elachistocleis, entre eles Magalhães et al. (2012) para E. cesarii (coletados em Macaíba, Rio Grande do Norte); Rossa-Feres & Nomura (2006) para E. bicolor (Nova Itapirema, São Paulo) e E. sp. (Vitória Brasil, São Paulo); Kenny (1969) para 52
E. ovalis e E. surinamensis (diversas localidades da ilha de Trinidad). No entanto, a identificação desses espécimes podem estar equivocadas.
De maneira geral, as características morfológicas descritas para as diferentes espécies são muito similares, sendo elas: comprimento total do corpo de 20 mm — 30 mm; corpo deprimido, arredondado em vista dorsal e triangular em vista lateral; olhos pequenos e lateralmente dirigidos; espiráculo ventral sinistro, longo e largo, com abertura direcionada dorsalmente; coloração marrom escura com listras e manchas claras pelo corpo; disco oral sem partes queratinizadas ou papilas.
Comportamentalmente as características também são similares, sendo girinos pouco ativos que se mantêm imóveis próximos à superfície onde se presume que se alimentam por filtração; também se alimentam de matéria orgânica no fundo das poças, adotando uma posição de cabeça abaixada (KENNY, 1969).
Uma característica que parece divergir é a presença de abas dérmicas pareadas na porção anterior da boca, geralmente com bordas regulares em E. bicolor e E. ovalis (Kenny, 1969 trata Elachistocleis ovalis como sendo uma espécie de ventre imaculado), e abas dérmicas pareadas com bordas irregulares (denticuladas) em E. sp. e E. surinamensis.
Figura 19: Abas dérmicas orais pareadas — adaptado de Kenny (1969).
Aparentemente existe uma correlação entre as abas dérmicas com bordas regulares e espécies de ventre imaculado e abas com bordas irregulares e espécies de ventre manchado; no entanto, não podemos descartar erros de identificação das 53
espécies, o que poderia invalidar essa aparente correlação. Também não se pode descartar a possibilidade de ocorrência de polimorfismo larval, em decorrência de condições ecológicas e ambientais, como as descritas por Pfenning (1992) para Spea multiplicata [Scaphiopus multiplicatus] (Cope, 1863), que poderiam gerar confusões, principalmente em áreas de simpatria.
4.5. OUTROS AGRUPAMENTOS
Incluímos aqui Elachistocleis surinamensis, E. surumu, E. pearsei e E. panamensis com o intuito de discutir e levantar hipóteses. Primeiramente, a relativa proximidade geográfica, cerca de 550 km, entre a localidade tipo de E. surinamensis e E. surumu, além de características morfológicas semelhantes na descrição das espécies, podem indicar tratar-se de sinônimos. Não obtivemos sequências de topotipos e nem de espécimes com identidade confirmada dessas espécies. No entanto, temos sequências de algumas localidades de Roraima e outras da Venezuela e Guiana (GenBank) que estão dentro da distribuição geográfica conhecida para essas espécies – UMTO SURUMU (gene 16S apêndice D). Essas sequências (UMTO SURUMU) formam um agrupamento com baixo suporte (jackknife = 23), podendo esse valor ser reflexo da pequena quantidade de sequências amostradas, mas também pode indicar que E. surumu e E. surinamensis sejam a mesma espécie. E nesse caso, Elachistocleis surumu CARAMASCHI, 2010 deve ser considerado sinônimo junior de Elachistocleis surinamensis (DAUDIN, 1802).
A UMTO SURUMU tem como grupo irmão as UMTOs PEARSEI e PANAMENSIS, que apresentam um valor de suporte elevado (jackknife = 91). No entanto, o ramo que suporta essas UMTOs apresenta valor de suporte jackknife = 65, de forma que necessitamos de mais evidências para compreender as relações filogenéticas dessas UMTOs.
Apesar de não aparecerem na árvore concatenada devido à falta de complementaridade de sequências, as amostras da Colômbia e Panamá formaram o grupo irmão da UMTO SURUMU, com dois subclados que representam, ao menos em teoria, E. pearsei e E. panamensis na árvore do gene 16S — ver apêndice D. Apesar do nó que une esses clados apresentar suporte jackknife de 91, as amostras 54
do Panamá apresentam suporte jackknife (62) abaixo do valor de confiança (≥ 70), e como demonstrado nas tabelas 4 e 5, as distâncias genéticas são baixas o suficiente para que sejam consideradas a mesma espécie, sendo a estrutura encontrada na árvore apenas reflexo de estrutura populacional.
As outras espécies de ventre manchado conhecidas são Elachistocleis erythrogaster e Elachistocleis skotogaster que não foram amostradas nem molecularmente e nem morfologicamente.
55
5. CONCLUSÕES
Dentro do clado das espécies de ventre manchado observamos uma politomia, composta por diversos subclados que apresentam topologia que parece derivar majoritariamente da estrutura populacional. Isso fica evidente nas baixas distâncias genéticas encontradas dentro e entre as UMTOs, apesar da ampla distribuição geográfica e da variação morfológica dos espécimes.
As variações morfológicas observadas, incluindo as características consideradas diagnósticas das espécies descritas, apresentam sobreposição, indicando que a morfologia, baseada nos caracteres usados até então, não explica a diversidade de espécies válidas atualmente.
Apesar de existir na literatura descrições do canto de algumas espécies de Elachistocleis e essas apresentarem diferenças em um primeiro momento, não foi possível compará-las de forma adequada devido, em alguns casos, às variáveis intrínsecas das gravações como, condições climáticas e metodologia, e em outros à falta de informações a respeito das populações estudadas. Sem dúvida os cantos podem trazer uma nova luz sobre a taxonomia do gênero, mas, no momento, as informações são inconclusivas.
Portanto, com base nos dados aqui expostos, é possível que as espécies Elachistocleis piauiensis Caramaschi & Jim, 1983; E. bumbameuboi, E. carvalhoi e E. surumu Caramaschi, 2010 sejam sinonímias de Elachistocleis cesarii (Miranda- Ribeiro, 1920). Estas sinonímias tornariam E. cesarii em uma espécie de distribuição ainda mais ampla, abrangendo os seguintes estados brasileiros: São Paulo, Minas Gerais, Espírito Santo, Mato Grosso, Goiás, Tocantins, Bahia, Piauí, Ceará, Maranhão, Pará, Roraima (presente estudo), Rio de Janeiro (SILVEIRA et al., 2010) e Rio Grande do Norte (MAGALHÃES et al., 2013).
Ficam em aberto às questões levantadas a respeito de Elachistocleis surumu e E. surinamensis no que diz respeito a possibilidade de E. surumu ser sinônimo junior de E. surinamensis. Caso se confirme essa suspeita, de que ambas são uma única espécie, a combinação E. cesarii proposta aqui passaria a ser E. surinamensis (DAUDIN, 1802) devido à regra de prioridade do Código Internacional de Nomenclatura Zoológica (ICZN). 56
Outras espécies de Elachistocleis com ventre manchado que não foram amostradas adequadamente no presente estudo (E. skotogaster, E. erythogaster, E. panamensis e E. pearsei) necessitam de maior investigação a fim de se comprovar a validade das mesmas e de se entender as relações com as demais espécies do gênero.
Certamente novos estudos, buscando sequenciar mais exemplares, são necessários, principalmente no que se refere às populações pouco amostradas. Outras áreas do conhecimento como a anatomia e o canto, devem ser exploradas, de forma a buscar compreender cada vez mais a taxonomia e as relações evolutivas das espécies.
57
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APÊNDICES
APÊNDICE A – LISTA DE EXEMPLARES AMOSTRADOS NESSE ESTUDO, ORGANIZADOS POR ESTADO.
Coleção Testemunho Identificação original Município Estado
PUC-RS MCP 11450 E. helianneae - AM CFBH CFBH 36012 E. sp. Manacapuru AM UFBA UFBA 06180 E. cesarii Camaçari BA UFBA UFBA 06233 E. cesarii Camaçari BA UFBA UFBA 06234 E. cesarii Camaçari BA UFBA UFBA 12378 E. cesarii Camaçari BA MTUR CFBH 20542 E. ovalis Jaborandi BA MZUSP A143967 E. cesarii Jaborandi BA MZUSP A143040 E. ovalis Pilão Arcado BA MZUSP A144031 E. ovalis São Desidério BA MTUR A144032 E. ovalis São Desidério BA MTUR CFBH 20565 E. ovalis São Desidério BA MZUSP A142648 E. sp. São Desidério BA CFBH CFBH 27668 E. cesarii Serra do Ramalho BA CFBH CFBH 27669 E. cesarii Serra do Ramalho BA CFBH CFBH 27670 E. cesarii Serra do Ramalho BA CFBH CFBH 36161 E. cesarii Serra do Ramalho BA MZUSP A143045 E. ovalis Umburanas BA URCA URCA-H 7620 E. piauiensis Aiuaba CE URCA URCA-H 7622 E. piauiensis Aiuaba CE URCA URCA-H 9679 E. piauiensis Caririaçu CE URCA URCA-H 9678 E. piauiensis Farias Brito CE URCA URCA-H 9117 E. piauiensis Icó CE URCA URCA-H 8519 E. piauiensis Lavras da Mangabeira CE URCA URCA-H 8520 E. piauiensis Lavras da Mangabeira CE URCA URCA-H 8522 E. piauiensis Lavras da Mangabeira CE URCA URCA-H 8525 E. piauiensis Lavras da Mangabeira CE CFBH CFBH 29469 E. piauiensis Milagres CE CFBH CFBH 29472 E. piauiensis Milagres CE URCA URCA-H 8761 E. piauiensis Missão Velha CE URCA URCA-H 8762 E. piauiensis Missão Velha CE URCA URCA-H 8804 E. piauiensis Missão Velha CE CFBH CFBH 15880 E. piauiensis Viçosa do Ceará CE CFBH CFBH 15901 E. piauiensis Viçosa do Ceará CE CFBH CFBH 15902 E. piauiensis Viçosa do Ceará CE CFBH CFBH 15903 E. piauiensis Viçosa do Ceará CE CFBH CFBH 23465 E. piauiensis Viçosa-do-Ceará CE CFBH CFBH 23466 E. piauiensis Viçosa-do-Ceará CE CFBH CFBH 23467 E. piauiensis Viçosa-do-Ceará CE CFBH CFBH 23468 E. piauiensis Viçosa-do-Ceará CE 65
CFBH CFBH 23469 E. piauiensis Viçosa-do-Ceará CE CFBH CFBH 23470 E. piauiensis Viçosa-do-Ceará CE CFBH CFBH 23471 E. piauiensis Viçosa-do-Ceará CE URCA URCA-H 7242 E. piauiensis - CE URCA URCA-H 7908 E. piauiensis - CE URCA URCA-H 9570 E. piauiensis CE MZUSP A083247 E. sp. Brasília DF MZUSP A083248 E. sp. Brasília DF CFBH CFBH 00689 E. ovalis Baliza GO MZUSP A151637 E. cesarii Campinaçu GO CFBH CFBH 26180 E. ovalis Indiara GO MZUSP A140851 E. ovalis Luziânia GO MZUSP A140852 E. ovalis Luziânia GO MZUSP A140854 E. ovalis Luziânia GO MZUSP A140855 E. ovalis Luziânia GO MZUSP A140856 E. ovalis Luziânia GO MZUSP A140626 E. ovalis Montes Claros de Goiás GO MZUSP A140820 E. ovalis Montes Claros de Goiás GO CFBH CFBH 26119 E. ovalis Palmeiras de Goiás GO CFBH CFBH 26149 E. cf. ovalis Palmeiras de Goiás GO CFBH CFBH 03768 E. bicolor Pontalina GO MZUSP A138978 E. ovalis Ponte Alta GO MZUSP A138979 E. ovalis Ponte Alta GO MZUSP A138980 E. ovalis Ponte Alta GO CFBH CFBH 29257 E. cf. cesarii Porangatu GO CFBH CFBH 26040 E. ovalis São Simão GO MZUSP A072628 E. ovalis Serra da Mesa GO MZUSP A072629 E. ovalis Serra da Mesa GO MZUSP A072630 E. ovalis Serra da Mesa GO MZUSP A090177 E. ovalis UHE Serra da Mesa GO MZUSP A090178 E. ovalis UHE Serra da Mesa GO MZUSP A090180 E. ovalis UHE Serra da Mesa GO MZUSP A090181 E. ovalis UHE Serra da Mesa GO MZUSP A090182 E. ovalis UHE Serra da Mesa GO MZUSP A090187 E. ovalis UHE Serra da Mesa GO MZUSP A090188 E. ovalis UHE Serra da Mesa GO MZUSP A090189 E. ovalis UHE Serra da Mesa GO MZUSP A090190 E. ovalis UHE Serra da Mesa GO MZUSP A090192 E. ovalis UHE Serra da Mesa GO MZUSP A090195 E. ovalis UHE Serra da Mesa GO MZUSP A090196 E. ovalis UHE Serra da Mesa GO MZUSP A090197 E. ovalis UHE Serra da Mesa GO MZUSP A090198 E. ovalis UHE Serra da Mesa GO MZUSP A090202 E. ovalis UHE Serra da Mesa GO MZUSP A090204 E. ovalis UHE Serra da Mesa GO MZUSP A090205 E. ovalis UHE Serra da Mesa GO 66
MZUSP A090216 E. ovalis UHE Serra da Mesa GO MZUSP A090218 E. ovalis UHE Serra da Mesa GO MZUSP A090222 E. ovalis UHE Serra da Mesa GO MZUSP A090223 E. ovalis UHE Serra da Mesa GO MZUSP A090225 E. ovalis UHE Serra da Mesa GO CFBH CFBH 26604 E. piauiensis Barreirinhas MA MTUR A144578 E. sp. Estreito MA CFBH CFBH 08135 E. ovalis Porto Franco MA CFBH CFBH 09198 E. ovalis Porto Franco MA CFBH CFBH 09199 E. ovalis Porto Franco MA CFBH CFBH 25952 E. piauiensis Porto Franco MA CFBH CFBH 24327 E. piauiensis Santo Amaro do Maranhão MA MZUSP A142457 E. ovalis Aiuruoca MG MZUSP A142458 E. ovalis Aiuruoca MG MZUSP A142477 E. ovalis Aiuruoca MG MZUSP A142478 E. ovalis Aiuruoca MG MZUSP A142534 E. ovalis Antonio Dias MG MZUSP A142250 E. cesarii Conceição do Mato Dentro MG MZUSP A145480 E. cesarii Conceição do Mato Dentro MG MZUSP A128283 E. ovalis Formoso MG MZUSP A128284 E. ovalis Formoso MG MZUSP A132683 E. sp. Lambari MG MTUR A149800 E. ovalis Marliéria MG MTUR A149801 E. ovalis Marliéria MG CFBH CFBH 34294 E. cesarii Sacramento MG CFBH CFBH 34297 E. cesarii Sacramento MG CFBH CFBH 34298 E. cesarii Sacramento MG CFBH CFBH 34299 E. cesarii Sacramento MG CFBH CFBH 34302 E. cesarii Sacramento MG CFBH CFBH 34367 E. cesarii Sacramento MG CFBH CFBH 34368 E. cesarii Sacramento MG CFBH CFBH 36329 E. cesarii Sacramento MG CFBH CFBH 36330 E. cesarii Sacramento MG CFBH CFBH 36331 E. cesarii Sacramento MG CFBH CFBH 36332 E. cesarii Sacramento MG CFBH CFBH 36333 E. cesarii Sacramento MG CFBH CFBH 36334 E. cesarii Sacramento MG CFBH CFBH 36335 E. cesarii Sacramento MG CFBH CFBH 36336 E. cesarii Sacramento MG CFBH CFBH 36337 E. cesarii Sacramento MG CFBH CFBH 36338 E. cesarii Sacramento MG CFBH CFBH 30759 E. ovalis Santana do Riacho MG CFBH CFBH 30760 E. ovalis Santana do Riacho MG CFBH CFBH 30761 E. ovalis Santana do Riacho MG CFBH CFBH 35056 E. ovalis Santana do Riacho MG CFBH CFBH 26075 E. ovalis União de Minas MG 67
MZUSP A069596 E. ovalis Anaurilândia MS MZUSP A069597 E. ovalis Anaurilândia MS MZUSP A069598 E. ovalis Anaurilândia MS MZUSP A125375 E. ovalis Bataguaçu MS MZUSP A125376 E. ovalis Bataguaçu MS MZUSP A125377 E. ovalis Bataguaçu MS CFBH CFBH 03521 E. bicolor Corumbá MS CFBH CFBH 08993 E. bicolor Corumbá MS MZUSP A082504 E. sp. São Vicente MS MZUSP A082505 E. sp. São Vicente MS MZUSP A082506 E. sp. São Vicente MS CFBH CFBH 13608 E. ovalis Três Lagoas MS CFBH CFBH 13609 E. ovalis Três Lagoas MS CFBH CFBH 13610 E. ovalis Três Lagoas MS CFBH CFBH 15792 E. ovalis Três Lagoas MS CFBH CFBH 18479 E. ovalis Três Lagoas MS CFBH CFBH 18480 E. ovalis Três Lagoas MS CFBH CFBH 19613 E. ovalis Três Lagoas MS CFBH CFBH 22628 E. ovalis Três Lagoas MS CFBH CFBH 24022 E. cf. ovalis Três Lagoas MS CFBH CFBH 24031 E. cf. ovalis Três Lagoas MS CFBH CFBH 24032 E. cf. ovalis Três Lagoas MS CFBH CFBH 25755 E. ovalis Três Lagoas MS CFBH CFBH 26665 E. matogrosso Três Lagoas MS CFBH CFBH 26666 E. matogrosso Três Lagoas MS MTUR A152128 E. ovalis Água Boa MT MZUSP A152129 E. cesarii Água Boa MT MZUSP A152130 E. cesarii Água Boa MT MZUSP A152131 E. cesarii Água Boa MT MZUSP A152132 E. cesarii Água Boa MT MZUSP A152133 E. cesarii Água Boa MT MZUSP A152134 E. cesarii Água Boa MT CFBH CFBH 21867 E. sp. Alta Floresta MT CFBH CFBH 36725 E. magnus Alta Floresta MT CFBH CFBH 36726 E. magnus Alta Floresta MT CFBH CFBH 36727 E. magnus Alta Floresta MT MZUSP A148608 E. ovalis Alto Araguaia MT MZUSP A148609 E. ovalis Alto Araguaia MT MZUSP A036483 E. ovalis Barra do Garças MT MTUR A152168 E. cesarii Barra do Garças MT MZUSP A152169 E. cesarii Barra do Garças MT MTUR A152170 E. ovalis Barra do Garças MT MZUSP A152172 E. cesarii Barra do Garças MT MZUSP A152271 E. cesarii Barra do Garças MT MZUSP A090929 E. ovalis Cáceres MT MZUSP A091740 E. ovalis Cocalinho MT 68
MZUSP A148761 E. ovalis Comodoro MT MZUSP A148762 E. ovalis Comodoro MT MZUSP A148763 E. ovalis Comodoro MT MZUSP A148764 E. ovalis Comodoro MT MZUSP A083817 E. ovalis Gaucha do Norte MT MZUSP A139981 E. ovalis Guiratinga MT MZUSP A141869 E. bicolor Itaúba MT MZUSP A151978 E. ovalis Juína MT MZUSP A148638 E. ovalis Lambari D'oeste MT MZUSP A148639 E. ovalis Lambari D'oeste MT MZUSP A149066 E. ovalis Lambari D'oeste MT MZUSP A149067 E. ovalis Lambari D'oeste MT MZUSP A149068 E. ovalis Lambari D'oeste MT MZUSP A091036 E. ovalis Pindaíba MT MZUSP A091037 E. ovalis Pindaíba MT MZUSP A091406 E. ovalis Pindaíba MT MZUSP A091407 E. ovalis Pindaíba MT MZUSP A091408 E. ovalis Pindaíba MT MZUSP A091409 E. ovalis Pindaíba MT CFBH CFBH 00201 E. ovalis Poconé MT MZUSP A132998 E. ovalis Porto Estrela MT MZUSP A148994 E. ovalis Rosário D'oeste MT MZUSP A148995 E. ovalis Rosário D'oeste MT MZUSP A148996 E. ovalis Rosário D'oeste MT MZUSP A098761 E. ovalis UHE Manso MT MZUSP A098762 E. ovalis UHE Manso MT MZUSP A098763 E. ovalis UHE Manso MT MZUSP A091738 E. ovalis Vila Bela da Santíssima Trindade MT MZUSP A091739 E. ovalis Vila Bela da Santíssima Trindade MT MZUSP A148823 E. ovalis Vila Bela da Santíssima Trindade MT MZUSP A148824 E. ovalis Vila Bela da Santíssima Trindade MT MZUSP A148825 E. ovalis Vila Bela da Santíssima Trindade MT MZUSP A148826 E. ovalis Vila Bela da Santíssima Trindade MT MZUSP A148827 E. ovalis Vila Bela da Santíssima Trindade MT MZUSP A148879 E. ovalis Vila Bela da Santíssima Trindade MT MZUSP A148880 E. ovalis Vila Bela da Santíssima Trindade MT MZUSP A148881 E. ovalis Vila Bela da Santíssima Trindade MT MZUSP A148882 E. ovalis Vila Bela da Santíssima Trindade MT MZUSP A148883 E. ovalis Vila Bela da Santíssima Trindade MT MZUSP A091941 E. ovalis Vila Rica MT MZUSP A091942 E. ovalis Vila Rica MT MZUSP A091943 E. ovalis Vila Rica MT MZUSP A091944 E. ovalis Vila Rica MT MZUSP A091945 E. ovalis Vila Rica MT MZUSP A091947 E. ovalis Vila Rica MT MZUSP A070080 E. ovalis Rio Vermelho PA 69
CFBH CFBH 19844 E. ovalis Bandeirantes PR MZUSP A076814 E. sp. Bituruna PR MZUSP A076815 E. sp. Bituruna PR MZUSP A076816 E. sp. Bituruna PR MZUSP A076817 E. sp. Bituruna PR MZUSP A084934 E. sp. Bituruna PR MZUSP A084935 E. sp. Bituruna PR MZUSP A084936 E. sp. Bituruna PR MZUSP A084937 E. sp. Bituruna PR MZUSP A084939 E. sp. Bituruna PR MZUSP A084940 E. sp. Bituruna PR CFBH CFBH 04212 E. bicolor Guaratuba PR CFBH CFBH 17252 E. bicolor Maringá PR CFBH CFBH 17254 E. bicolor Maringá PR CFBH CFBH 17257 E. bicolor Maringá PR CFBH CFBH 07580 E. bicolor Matinhos PR MTUR A129306 E. cf. bicolor Ortigueira PR MZUSP A149144 E. ovalis Chupinguaia RO MZUSP A149145 E. ovalis Chupinguaia RO MZUSP A149146 E. ovalis Chupinguaia RO MZUSP A076958 E. ovalis Porto Velho RO MZUSP A076960 E. ovalis Porto Velho RO MZUSP A076961 E. ovalis Porto Velho RO MZUSP A082464 E. ovalis Porto Velho RO MZUSP A082465 E. ovalis Porto Velho RO MZUSP A082500 E. ovalis Porto Velho RO MZUSP A082501 E. ovalis Porto Velho RO MZUSP A082502 E. ovalis Porto Velho RO MZUSP A082503 E. ovalis Porto Velho RO MZUSP A143311 E. ovalis Porto Velho RO MZUSP A143312 E. ovalis Porto Velho RO MZUSP A143423 E. ovalis Porto Velho RO MZUSP A151276 E. magnus Porto Velho RO MZUSP A151278 E. magnus Porto Velho RO MZUSP A151279 E. magnus Porto Velho RO MZUSP A151833 E. helianneae Porto Velho RO MZUSP A151834 E. helianneae Porto Velho RO MZUSP A152743 E. magnus Porto Velho RO MZUSP A152744 E. magnus Porto Velho RO MZUSP A068747 E. ovalis Missão Catrimani RR MZUSP A068748 E. ovalis Missão Catrimani RR MZUSP A068749 E. ovalis Missão Catrimani RR MZUSP A068750 E. ovalis Missão Catrimani RR MZUSP A068751 E. ovalis Missão Catrimani RR MZUSP A068607 E. ovalis Mucajaí RR MZUSP A068608 E. ovalis Mucajaí RR 70
MZUSP A068754 E. ovalis Murupu RR MZUSP A076602 E. surumu Surumu RR MZUSP A076603 E. surumu Surumu RR MZUSP A076604 E. surumu Surumu RR MZUSP A084375 E. surumu Surumu RR MZUSP A084381 E. surumu Surumu RR MZUSP A084365 E. surumu UHE Serra da Mesa RR PUC-RS MCP 09967 E. bicolor Arroio dos Ratos RS CFBH CFBH 18199 E. cf. ovalis Bom Jesus RS PUC-RS MCP 11495 E. bicolor Caxias do Sul RS PUC-RS MCP 09905 E. bicolor Cerro Largo RS PUC-RS MCP 11232 E. bicolor Esmeralda RS PUC-RS MCP 12503 E. bicolor Faxinal do Soturno RS CFBH CFBH 06956 E. ovalis Machadinho RS CFBH CFBH 06957 E. ovalis Machadinho RS CFBH CFBH 06958 E. ovalis Machadinho RS FURG CHFURG 0063 E. bicolor Rio Grande RS FURG CHFURG 0132 E. bicolor Rio Grande RS FURG CHFURG 1011 E. bicolor Rio Grande RS FURG CHFURG 1518 E. bicolor Rio Grande RS FURG CHFURG 2584 E. bicolor Rio Grande RS FURG CHFURG 2642 E. bicolor Rio Grande RS FURG CHFURG 2667 E. bicolor Rio Grande RS FURG CHFURG 2706 E. bicolor Rio Grande RS MZUSP A082349 E. sp. São Leopoldo RS PUC-RS MCP 11366 E. bicolor São Sepé RS PUC-RS MCP 11333 E. bicolor Sinimbu RS CFBH CFBH 02861 E. aff. bicolor Terra de Areia RS CFBH CFBH 14611 E. ovalis Três Lagoas RS CFBH CFBH 13631 E. ovalis Campos Novos SC MZUSP A134599 E. ovalis Guatambu SC CFBH CFBH 04010 E. bicolor Ipuaçu SC MZUSP A055933 E. bicolor São Bento do Sul SC CFBH CFBH 03841 E. ovalis São Domingos SC CFBH CFBH 03859 E. bicolor São Domingos SC CFBH CFBH 36285 E. ovalis São Domingos SC CFBH CFBH 36286 E. ovalis São Domingos SC CFBH CFBH 36287 E. ovalis São Domingos SC CFBH CFBH 36288 E. ovalis São Domingos SC CFBH CFBH 36289 E. ovalis São Domingos SC CFBH CFBH 36290 E. ovalis São Domingos SC MZUSP A097042 E. bicolor UHE Itá SC MZUSP A097045 E. bicolor UHE Itá SC MZUSP A097051 E. bicolor UHE Itá SC MZUSP A139749 E. bicolor Barra dos Coqueiros SE MZUSP A139750 E. bicolor Barra dos Coqueiros SE 71
MZUSP A139751 E. bicolor Barra dos Coqueiros SE MZUSP A139752 E. bicolor Barra dos Coqueiros SE MZUSP A139753 E. bicolor Barra dos Coqueiros SE CFBH CFBH 23136 E. ovalis Angatuba SP MZUSP A143937 E. cesarii Arthur Nogueira SP CFBH CFBH 18851 E. bicolor Assis SP CFBH CFBH 18852 E. bicolor Assis SP CFBH CFBH 20004 E. cf. ovalis Assis SP CFBH CFBH 20005 E. cf. ovalis Assis SP CFBH CFBH 20006 E. cf. ovalis Assis SP CFBH CFBH 20007 E. ovalis Assis SP CFBH CFBH 20008 E. cf. ovalis Assis SP CFBH CFBH 20035 E. bicolor Assis SP CFBH CFBH 20036 E. bicolor Assis SP CFBH CFBH 20037 E. bicolor Assis SP MZUSP A013476 E. ovalis Bariri SP MZUSP A012530 E. ovalis Boituva SP CFBH CFBH 34001 E. cesarii Botucatu SP CFBH CFBH 34010 E. cesarii Botucatu SP CFBH CFBH 36361 E. cesarii Botucatu SP MTUR A134926 E. cesarii Buri SP MTUR A134927 E. cesarii Buri SP MTUR A134928 E. cf. bicolor Buri SP MTUR A134929 E. ovalis Buri SP CFBH CFBH 04248 E. ovalis Campinas SP CFBH CFBH 34288 E. ovalis Campinas SP CFBH CFBH 34949 E. cesarii Campinas SP CFBH CFBH 34955 E. cesarii Campinas SP CFBH CFBH 35035 E. ovalis Campinas SP CFBH CFBH 35042 E. ovalis Campinas SP CFBH CFBH 35043 E. ovalis Campinas SP CFBH CFBH 35294 E. ovalis Campinas SP CFBH CFBH 35433 E. ovalis Campinas SP MZUSP A076773 E. sp. Campos do Jordão SP MZUSP A076774 E. sp. Campos do Jordão SP MZUSP A076775 E. sp. Campos do Jordão SP MZUSP A082639 E. sp. Campos do Jordão SP MZUSP A082640 E. sp. Campos do Jordão SP MZUSP A082641 E. sp. Campos do Jordão SP MZUSP A082643 E. sp. Campos do Jordão SP MZUSP A082646 E. sp. Campos do Jordão SP MZUSP A082648 E. sp. Campos do Jordão SP MZUSP A138349 E. ovalis Itararé SP MZUSP A138350 E. ovalis Itararé SP MZUSP A138351 E. ovalis Itararé SP MZUSP A138352 E. ovalis Itararé SP 72
CFBH CFBH 04997 E. ovalis Itirapina SP CFBH CFBH 05595 E. ovalis Itirapina SP CFBH CFBH 05703 E. ovalis Itirapina SP CFBH CFBH 05841 E. ovalis Itirapina SP CFBH CFBH 06635 E. ovalis Itirapina SP CFBH CFBH 11382 E. sp. Itirapina SP CFBH CFBH 21938 E. ovalis Itirapina SP CFBH CFBH 31875 E. cesarii Luis Antonio SP CFBH CFBH 31876 E. cesarii Luis Antonio SP CFBH CFBH 31877 E. cesarii Luis Antonio SP CFBH CFBH 31878 E. cesarii Luis Antonio SP CFBH CFBH 31879 E. cesarii Luis Antonio SP MZUSP A150887 E. cesarii Luiz Antonio SP MZUSP A150888 E. cesarii Luiz Antonio SP CFBH CFBH 24743 E. cf. ovalis Mogi-Guaçu SP CFBH CFBH 24742 E. cf. ovalis Mogi-Guaçu SP CFBH CFBH 24744 E. cf. ovalis Mogi-Guaçu SP MZUSP A012523 E. ovalis Nova Luzitânia SP MZUSP A132749 E. ovalis Ourinhos SP CFBH CFBH 35567 E. ovalis Paulínia SP CFBH CFBH 13987 E. cf. ovalis Pedregulho SP CFBH CFBH 38064 E. cesarii Piquete SP CFBH CFBH 38065 E. cesarii Piquete SP CFBH CFBH 38066 E. cesarii Piquete SP CFBH CFBH 20491 E. cf. ovalis Pirassununga SP CFBH CFBH 21353 E. cf. ovalis Pirassununga SP CFBH CFBH 04132 E. sp. Rio Claro SP CFBH CFBH 04133 E. sp. Rio Claro SP CFBH CFBH 04134 E. cf. ovalis Rio Claro SP CFBH CFBH 04135 E. cf. ovalis Rio Claro SP CFBH CFBH 04136 E. cf. ovalis Rio Claro SP CFBH CFBH 04137 E. cf. ovalis Rio Claro SP CFBH CFBH 04147 E. sp. Rio Claro SP CFBH CFBH 04148 E. sp. Rio Claro SP CFBH CFBH 04209 E. sp. Rio Claro SP CFBH CFBH 04230 E. sp. Rio Claro SP CFBH CFBH 04231 E. sp. Rio Claro SP CFBH CFBH 04232 E. sp. Rio Claro SP CFBH CFBH 04233 E. sp. Rio Claro SP CFBH CFBH 04234 E. sp. Rio Claro SP CFBH CFBH 04235 E. sp. Rio Claro SP CFBH CFBH 04236 E. sp. Rio Claro SP CFBH CFBH 04237 E. sp. Rio Claro SP CFBH CFBH 04256 E. sp. Rio Claro SP CFBH CFBH 04257 E. sp. Rio Claro SP CFBH CFBH 05847 E. cf. ovalis Rio Claro SP 73
CFBH CFBH 06575 E. sp. Rio Claro SP CFBH CFBH 06576 E. sp. Rio Claro SP CFBH CFBH 06577 E. sp. Rio Claro SP CFBH CFBH 06578 E. sp. Rio Claro SP CFBH CFBH 07153 E. ovalis Rio Claro SP CFBH CFBH 28043 E. cesarii Rio Claro SP CFBH CFBH 26893 E. sp. São Carlos SP MZUSP A009962 E. ovalis São Paulo SP MZUSP A124226 E. sp. São Paulo SP CFBH CFBH 04225 E. sp. Tabapuã SP CFBH CFBH 06289 E. ovalis Taubaté SP CFBH CFBH 10056 E. bicolor Teodoro Sampaio SP CFBH CFBH 10057 E. bicolor Teodoro Sampaio SP CFBH CFBH 10058 E. bicolor Teodoro Sampaio SP CFBH CFBH 10062 E. bicolor Teodoro Sampaio SP CFBH CFBH 10063 E. bicolor Teodoro Sampaio SP CFBH CFBH 10064 E. bicolor Teodoro Sampaio SP CFBH CFBH 10066 E. bicolor Teodoro Sampaio SP CFBH CFBH 10068 E. bicolor Teodoro Sampaio SP CFBH CFBH 10069 E. bicolor Teodoro Sampaio SP CFBH CFBH 10070 E. bicolor Teodoro Sampaio SP CFBH CFBH 10071 E. bicolor Teodoro Sampaio SP CFBH CFBH 10117 E. bicolor Teodoro Sampaio SP CFBH CFBH 18374 E. bicolor Teodoro Sampaio SP CFBH CFBH 18389 E. bicolor Teodoro Sampaio SP CFBH CFBH 10907 E. ovalis Ubatuba SP CFBH CFBH 10908 E. ovalis Ubatuba SP MZUSP A126645 E. ovalis UHE Sergio Motta SP MZUSP A126646 E. ovalis UHE Sergio Motta SP CFBH CFBH 19902 E. ovalis Aguiarnópolis TO CFBH CFBH 10305 E. ovalis Araguacema TO MZUSP A126913 E. sp. Babaçulândia TO CFBH CFBH 23832 E. ovalis Brejinho de Nazaré TO CFBH CFBH 28309 E. cf. piauiensis Brejinho de Nazaré TO CFBH CFBH 16998 E. ovalis Darcinópolis TO MZUSP A144430 E. ovalis Goiatins TO MZUSP A144431 E. ovalis Goiatins TO MZUSP A144432 E. ovalis Goiatins TO MZUSP A144433 E. ovalis Goiatins TO MZUSP A144434 E. ovalis Goiatins TO MTUR A144448 E. sp. Goiatins TO MTUR A127152 E. sp. Guaraí TO CFBH CFBH 22041 E. ovalis Gurupi TO MZUSP A127302 E. ovalis Ipueiras TO MZUSP A127303 E. ovalis Ipueiras TO MZUSP A127304 E. ovalis Ipueiras TO 74
CFBH CFBH 22062 E. ovalis Lavandeira TO CFBH CFBH 22063 E. ovalis Lavandeira TO CFBH CFBH 13220 E. cf. bicolor Lizarda TO MZUSP A133001 E. ovalis Mateiros TO MZUSP A137795 E. ovalis Miracema do Tocantins TO MZUSP A137802 E. ovalis Miracema do Tocantins TO MZUSP A137805 E. ovalis Miracema do Tocantins TO MZUSP A137808 E. ovalis Miracema do Tocantins TO MZUSP A092290 E. ovalis Palmas TO MZUSP A092291 E. ovalis Palmas TO MZUSP A092293 E. ovalis Palmas TO MZUSP A092303 E. ovalis Palmas TO MZUSP A092345 E. ovalis Palmas TO MZUSP A092354 E. ovalis Palmas TO MZUSP A092355 E. ovalis Palmas TO MZUSP A092356 E. ovalis Palmas TO MZUSP A092357 E. ovalis Palmas TO MZUSP A092359 E. ovalis Palmas TO MZUSP A092361 E. ovalis Palmas TO MZUSP A092363 E. ovalis Palmas TO MZUSP A092364 E. ovalis Palmas TO MZUSP A092375 E. ovalis Palmas TO MZUSP A144435 E. ovalis Palmeirante TO MZUSP A144440 E. ovalis Palmeirante TO MZUSP A144441 E. ovalis Palmeirante TO MZUSP A144443 E. ovalis Palmeirante TO MZUSP A144444 E. ovalis Palmeirante TO MZUSP A144445 E. ovalis Palmeirante TO MZUSP A144446 E. ovalis Palmeirante TO MZUSP A111693 E. piauiensis Paranã TO MZUSP A111696 E. piauiensis Paranã TO MTUR A111698 E. piauiensis Paranã TO MTUR A111699 E. piauiensis Paranã TO MZUSP A111702 E. piauiensis Paranã TO MZUSP A129711 E. piauiensis Peixe TO MZUSP A129712 E. piauiensis Peixe TO MZUSP A129713 E. piauiensis Peixe TO MZUSP A129714 E. piauiensis Peixe TO MZUSP A129715 E. piauiensis Peixe TO MZUSP A129717 E. piauiensis Peixe TO MZUSP A129729 E. piauiensis Peixe TO CFBH CFBH 28395 E. cf. cesarii Porto Nacional TO CFBH CFBH 28940 E. cf. cesarii Sucupira TO
75
APÊNDICE B – PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO DE DNA
Adaptação de Maniatis et al. (1982):
Com o tecido seco (sem álcool): 1. Colocar o tecido em 250 μl de solução de lise. 2. Adicionar 5 l de Proteinase-K (20mg/ml). Inverter o tubo de 10 a 20 vezes e incubar a 55ºC overnight ou até que o tecido esteja completamente diluído (mínimo de 4 horas). 3. Resfriar as amostras à temperatura ambiente e adicionar 250 l de acetato de amônia (7,5M). Vortexar e incubar no gelo por 30 minutos. 4. Centrifugar por 15 minutos (13.000 RPM; centrífuga refrigerada 4ºC se possível; usar função "soft"). Transferir o sobrenadante para tubos novos (Manter as amostras no gelo enquanto retira o sobrenadante). 5. Adicionar 500 l de isopropanol absoluto e inverter o tubo gentilmente. Coloque as amostras a -20 ºC por 2 horas (ou overnight para ajudar a precipitar o DNA para tecidos com baixo rendimento de extração). A precipitação também pode ser feita no -80 ºC por 20 minutos. 6. Centrifugar por 15 minutos (13.000 RPM) e descartar o sobrenadante. Nessa fase o sobrenadante pode ser descartado invertendo o tubo. 7. Adicionar 500l de etanol 95% e inverter o tubo várias vezes para lavar o “pellet” de DNA. 8. Centrifugar por 15 minutos (13.000 RPM). Descartar o etanol cuidadosamente. Nessa fase é recomendado retirar o sobrenadante cuidadosamente com a ponteira, sem encosta-lá no fundo do tubo. 9. Inverter o tubo em papel absorvente e secar o pellet em estufa (55ºC) ou bomba de vácuo por 15 minutos. Também pode deixar à temperatura ambiente overnight. Importante assegurar que não haja etanol no pellet antes de ressuspender. 10. Ressuspender o DNA em solução tamponante 1T.E.(Tris-EDTA) (50 a 200 l; em geral 100l) overnight na geladeira ou à temperatura ambiente. Estocar em freezer -20 ºC. 76
APÊNDICE C – LISTA DE TECIDOS USADOS NESTE ESTUDO. BB = BUMBAMEUBOI; BC = BICOLOR. CS = CESARII; CV = CARVALHOI; PE = PEARSEI; PN = PANAMENSIS; OS = PIAUIENSIS; SU = SURUMU.
Clados Coleção Amostra Testemunho 16S COI Município Estado País BC CFBH PT577_BC_RS CFBH 02861 S S Terra de Areia RS BR BC CFBH PT596_OV_RS CFBH 18199 S S Bom Jesus RS BR BC FURG VL046_BC_RS CHFURG 0132 S S Rio Grande RS BR BB CFBH PT571_OV_MA CFBH 09199 S S Porto Franco MA BR Brejinho de BB CFBH ML33_OV_TO CFBH 23832 N S Nazaré TO BR BB CFBH PT593_PS_MA CFBH 26604 S S Barreirinhas MA BR Brejinho de BB CFBH PT597_PS_TO CFBH 28309 S S Nazaré TO BR BB CFBH PT598_CS_TO CFBH 28395 S S Porto Nacional TO BR BB CFBH PT599_CS_TO CFBH 28940 S S Sucupira TO BR BB CFBH PT600_CS_GO CFBH 29257 S S Porangatu GO BR BB MNRJ PT536_BB_MA MNRJ 53378 S S São Luiz MA BR BB MPEG PT557_CV_PA MPEG 31808 S S Marabá PA BR BB MTUR PT628_sp_MA A144578 S S Estreito MA BR BB MTUR VL075_sp_MA A144578 S S Estreito MA BR BB MTUR VL091_OV_MT A152168 S S Barra do Garças MT BR BB MTUR VL069_OV_TO LAJ 168 S S UHE Lajeado TO BR Miracema do BB MTUR PT626_sp_TO LAJ 170 S S Tocantins TO BR BB MTUR VL070_OV_TO LAJ 194 S S UHE Lajeado TO BR BB MTUR VL071_OV_TO LAJ 195 S S UHE Lajeado TO BR BB MTUR PT623_sp_TO PNA 094 S S PN Araguaia TO BR BB MTUR VL066_sp_TO PNA 148 S S PN Araguaia TO BR BB MTUR VL067_sp_TO PNA 149 S S PN Araguaia TO BR BB UFG VL052_CS_GO ZUFG 7053 S S Niquelândia GO BR CS CFBH VL001_OV_SP - S S Santa Branca SP BR CS CFBH VL002_OV_SP - S S Santa Branca SP BR CS CFBH VL003_OV_SP - S S Santa Branca SP BR CS CFBH VL004_OV_MG - S S Gurinhatã MG BR CS CFBH PT564_OV_SP CFBH 05847 S S Rio Claro SP BR CS CFBH VL105_OV_SP CFBH 06289 S S Taubaté SP BR CS CFBH ML38_OV_SP CFBH 06571 S S Itirapina SP BR CS CFBH VL009_OV_SP CFBH 06571 S S Itirapina SP BR CS CFBH PT566_OV_SP CFBH 06572 S S Itirapina SP BR CS CFBH VL010_OV_SP CFBH 06572 S S Itirapina SP BR CS CFBH VL011_OV_SP CFBH 06586 S S Itirapina SP BR CS CFBH PT567_OV_SP CFBH 06588 S S Itirapina SP BR CS CFBH VL012_OV_SP CFBH 06588 S S Itirapina SP BR CS CFBH PT574_OV_SP CFBH 10907 S S Ubatuba SP BR CS CFBH PT575_OV_SP CFBH 10908 S S Ubatuba SP BR CS CFBH VL106_OV_SP CFBH 10908 S S Ubatuba SP BR 77
CS CFBH VL013_OV_SP CFBH 11538 S S Santa Branca SP BR CS CFBH VL006_OV_SP CFBH 13653 S S Rio Claro SP BR CS CFBH VL007_OV_SP CFBH 13654 S S Rio Claro SP BR CS CFBH VL008_OV_SP CFBH 13655 S S Rio Claro SP BR CS CFBH PT580_OV_SP CFBH 13987 S S Pedregulho SP BR CS CFBH PT584_OV_SP CFBH 20004 S S Assis SP BR CS CFBH PT585_OV_SP CFBH 20005 S S Assis SP BR CS CFBH VL123_OV_SP CFBH 20006 S N Assis SP BR CS CFBH PT335_CS_SP CFBH 20007 S S Assis SP BR CS CFBH PT586_OV_SP CFBH 20491 S S Pirassununga SP BR CS CFBH ML29_CS_SP CFBH 21938 N S Itirapina SP BR CS CFBH PT591_OV_SP CFBH 24742 S S Mogi-Guaçu SP BR CS CFBH PT592_OV_SP CFBH 24744 S S Mogi-Guaçu SP BR CS CFBH VL015_OV_SP CFBH 28634 S S Rio Claro SP BR Santana do CS CFBH PT601_OV_MG CFBH 30759 S S Riacho MG BR Santana do CS CFBH PT602_OV_MG CFBH 30760 S S Riacho MG BR CS CFBH PT604_CS_SP CFBH 31875 S S Luis Antonio SP BR CS CFBH PT605_CS_SP CFBH 31878 S S Luis Antonio SP BR CS CFBH VL109_CS_MG CFBH 34294 S S Sacramento MG BR CS CFBH VL110_CS_SP CFBH 34949 S S Campinas SP BR CS CFBH VL124_CS_SP CFBH 34955 S S Campinas SP BR CS CFBH VL047_CS_SP CFBH 36631 S S Botucatu SP BR CS CFBH VL125_CS_SP CFBH 38064 S S Piquete SP BR CS CFBH VL126_CS_SP CFBH 38065 S S Piquete SP BR CS CFBH VL113_CS_SP CFBH 38066 S S Piquete SP BR CS CFBH PT568_BC_SP CFBHT 00911 S S Santa Fé do Sul SP BR CS CFBH PT569_BC_SP CFBHT 00912 S S Santa Fé do Sul SP BR CS CFBH VL108_OV_MG CFBHT 07488 S S Três pontas MG BR Santana do CS CFBH PT603_OV_MG CFBHT 15607 S S Riacho MG BR CS GB GB03_OV_MG 1055 DQ347340 N - MG BR Santana do CS GB GB22_CS_MG ZUEC:DCC3301 JN604511 N Riacho MG BR CS MTUR PT675_CS_SP A134926 S S Buri SP BR CS MTUR VL089_OV_SP A134926 S S Buri SP BR CS MTUR PT676_CS_SP A134927 S S Buri SP BR Dores do Rio CS MTUR PT292_sp_ES MTR 15828 S S Preto ES BR CS MTUR PT646_CS_ES MTR 15829 S S PN Caparaó ES BR CS MTUR PT647_CS_ES MTR 15830 S S PN Caparaó ES BR Alto Araguaia, CS MTUR VL092_OV_MT PHV 3077 S S Eixo MT BR PCH CS MTUR VL084_OV_MT RRT 15 S S Rondonópolis MT BR CS MTUR PT644_CS_MG URB 07 S S Curvelo MG BR CS MTUR PT645_CS_MG URB 08 S S Curvelo MG BR CS UFG VL051_XX_GO ZUFG 5412 S S Mineiros GO BR Alto Paraíso de CS UFG VL048_CS_GO ZUFG 6286 S S Goiás GO BR CS UFG VL049_CS_MG ZUFG 6363 S S Diamantina MG BR 78
Alto Paraíso de CS UFMG MG03_OV_GO UFMG 04037 S S Goiás GO BR CS UFMG MG02_OV_MG UFMG 04101 S S Jaboticatubas MG BR Congonhas do CS UFMG MG05_CS_MG UFMG 04398 S S Norte MG BR CS UFMG MG06_CS_MG UFMG 05194 S S Mariana MG BR CS UFMG MG07_CS_MG UFMG 05200 S S Santa Bárbara MG BR CS UFMG MG08_CS_MG UFMG 05405 S S Catas Altas MG BR CS UFMG MG09_CS_MG UFMG 05407 S S Catas Altas MG BR CS UFMG MG10_CS_MG UFMG 05434 S S Morro do Pilar MG BR São José da CS UFMG MG04_CS_MG UFMG 06334 S S Safira MG BR CS UFMG MG11_CS_MG UFMG 06558 S S Morro do Pilar MG BR Santana do CS UFMG MG01_OV_MG UFMG 07316 S S Riacho MG BR CS UFMG MG12_CS_MG UFMG 09589 S S Jaboticatubas MG BR CS UFMG MG13_CS_MG UFMG 09590 S S Lima Duarte MG BR CS UFMG MG15_CS_MG UFMG 10140 S S Buenópolis MG BR São João CS UFMG MG18_BC_MG UFMG 11591 S S Evangelista MG BR São João CS UFMG MG19_CS_MG UFMG 12991 S S Evangelista MG BR HE CFBH VL111_HE_AM CFBH 36012 S S Manacapuru AM BR HE GB GB28_OV_VE E54 KC179999 N - Zulia VE MO CFBH PT573_BC_SP CFBH 10057 S S Teodoro Sampaio SP BR MO CFBH PT572_BC_SP CFBH 10058 S S Teodoro Sampaio SP BR MO CFBH PT583_BC_SP CFBH 18851 S S Assis SP BR MO CFBH ML19_BC_SP CFBH 20037 N S Assis SP BR MO CFBH PT589_OV_MS CFBH 24022 S S Três Lagoas MS BR MO CFBH PT590_OV_MS CFBH 24032 S S Três Lagoas MS BR MO MTUR PT677_BC_SP A134928 S S Buri SP BR MO MTUR PT674_CS_PR II - H037 S S Pinhalão PR BR MO MTUR VL103_sp_SC MTR 26597 S S São Joaquim SC BR MO UFMG MG16_BC_MS UFMG 08268 S S Caarapó MS BR MO UFMG MG17_BC_MS UFMG 08269 S S Caarapó MS BR OG1 GB GB44_MH_XX KC179993 EF396055 - - XX OG2 CFBH VL107_DM_TO CFBH 16997 S S Darcinópolis TO BR KRL 1136 PN GB GB05_OV_PN (NMNH) FJ784469 N La Pintada Cocle PN KRL 1137 PN GB GB06_OV_PN (NMNH) FJ784470 N La Pintada Cocle PN PN GB GB35_OV_PN MVUP 1923 N FJ766754 - Cocle PN PN GB GB34_OV_PN USNM 572735 N FJ766753 - Cocle PN PE GB GB27_PE_CO JDL 26194 KC179983 N - - CO PE GB GB24_PE_CO JDL 26585 KC179979 N - - CO MO MTUR VL085_sp_MT 5558 S S APM Manso MT BR MO MTUR PT650_MN_RO H 0832 S S Mutum RO BR MO MTUR PT651_MN_RO H 0847 S S Mutum RO BR MO MTUR VL087_MN_RO H 2021 S S Mutum RO BR MO MTUR VL088_MN_RO H 3505 S S UHE Jirau RO BR SP3 CFBH PT576_OV_TO CFBH 10305 S S Araguacema TO BR SP3 CFBH VL014_OV_RR CFBH 11539 S S - RR BR 79
SP3 CFBH PT587_sp_MT CFBH 21867 S S Alta Floresta MT BR SP3 CFBH ML09_MN_MT CFBH 36601 S S Paranaíta MT BR SP3 CFBH ML05_MN_MT CFBH 36602 S S Paranaíta MT BR SP3 CFBH ML01_MN_MT CFBH 36603 S S Paranaíta MT BR SP3 CFBH ML03_MN_MT CFBH 36634 S S Paranaíta MT BR SP3 CFBH ML06_MN_MT CFBH 36639 S S Paranaíta MT BR SP3 CFBH ML04_MN_MT CFBH 36725 N S Alta Floresta MT BR SP3 CFBH ML07_MN_MT CFBH 36726 N S Alta Floresta MT BR SP3 CFBH ML02_MN_MT CFBH 36727 N S Alta Floresta MT BR SP3 MTUR VL083_OV_MT A152128 S S Água Boa MT BR SP3 MTUR VL062_CV_PA BM 148 S S Vitória do Xingu PA BR SP3 MTUR VL063_CV_PA BM 349 S S Vitória do Xingu PA BR SP3 MTUR PT621_sp_TO PNA 092 S S PN Araguaia TO BR SP3 MTUR VL068_sp_TO PNA 092 S S PN Araguaia TO BR SP3 MTUR PT622_sp_TO PNA 093 S S PN Araguaia TO BR SP3 MTUR VL064_sp_TO PNA 146 S S PN Araguaia TO BR SP3 MTUR VL065_sp_TO PNA 147 S S PN Araguaia TO BR SP4 CFBH PT581_PS_CE CFBH 15880 S S Viçosa do Ceará CE BR SP4 CFBH ML10_sp_CE CFBH 31629 S S Nova Russas CE BR SP4 URCA VL057_PS_CE URCA 1342 S N Crato CE BR SP4 URCA VL016_PS_CE URCA-H 4570 S S Barro CE BR SP4 URCA VL019_PS_CE URCA-H 7619 S S Aiuaba CE BR SP4 URCA VL020_PS_CE URCA-H 7620 S S Aiuaba CE BR SP4 URCA VL021_PS_CE URCA-H 7622 S S Aiuaba CE BR Lavras da SP4 URCA VL022_PS_CE URCA-H 8514 S S Mangabeira CE BR Lavras da SP4 URCA VL023_PS_CE URCA-H 8519 S S Mangabeira CE BR Lavras da SP4 URCA VL024_PS_CE URCA-H 8520 S S Mangabeira CE BR SP5 MTUR VL079_OV_BA A144032 S S São Desidério BA BR SP5 MTUR VL081_OV_BA CFBH 20542 S S Jaborandi BA BR SP5 MTUR VL090_OV_BA CFBH 20565 N S São Desidério BA BR SP5 MTUR VL080_OV_BA PHV 1488 S S Jaborandi BA BR SP6 CFBH ML08_sp_MA CFBH 08135 N S Porto Franco MA BR SP6 CFBH PT579_BC_TO CFBH 13220 S S Lizarda TO BR SP6 CFBH ML35_OV_TO CFBH 16998 N S Darcinópolis TO BR SP6 MPEG PT588_OV_MA - S S Tasso Fragoso MA BR SP6 MPEG PT155_PS_PI MPEG 27839 S S Floriano PI BR SP6 MPEG PT156_PS_PI MPEG 27840 S S Floriano PI BR SP6 MTUR PT624_PS_TO A111698 S S Paranã TO BR SP6 MTUR VL093_PS_TO A111698 S S Paranã TO BR SP6 MTUR PT625_PS_TO A111699 S S Paranã TO BR SP6 MTUR PT276_sp_TO A144448 S S Goiatins TO BR SP6 MTUR VL077_sp_TO A144448 S S Goiatins TO BR SP6 MTUR PT275_sp_MA ESTR 00251 S S Colina MA BR SP6 MTUR VL074_sp_MA ESTR 00252 S S Carolina MA BR SP6 MTUR VL076_sp_TO ESTR 01901 S S Goiatins TO BR SP6 MTUR VL078_sp_MA ESTR 01986 S S Estreito MA BR 80
SP6 MTUR PT671_PS_PI MTR 02750 S S Uruçuí Una PI BR SP6 MTUR PT670_PS_PI MTR 02784 S S Uruçuí Una PI BR SP6 MTUR PT668_PS_PI MTR 02812 S S Uruçuí Una PI BR SP6 MTUR PT667_PS_PI MTR 02813 S S Uruçuí Una PI BR SP6 MTUR VL072_PS_TO MTR 04040 S S Paranã TO BR SP6 MTUR VL073_PS_TO MTR 04382 S S Paranã TO BR SP6 MTUR VL096_sp_TO MTR 14140 S S EESGT TO BR SP6 MTUR VL097_sp_TO MTR 14223 S S EESGT TO BR SP6 MTUR PT640_sp_TO MTR 14224 N S EESGT TO BR SP6 MTUR PT641_sp_TO MTR 14299 S S EESGT TO BR SP6 MTUR VL098_sp_TO MTR 14333 S S EESGT TO BR SP6 MTUR PT288_sp_TO MTR 14423 S S EESGT TO BR SP6 MTUR VL099_sp_TO MTR 14670 S S EESGT TO BR SP6 MTUR PT642_CS_BA MTR 14948 S S EESGT BA BR SP6 MTUR PT643_CS_BA PHV 2140 S S EESGT BA BR SP6 - PT672_PS_XX - N S - - BR SP7 MTUR PT634_sp_BA MTR 11218 S S Santo Inácio BA BR SP7 MTUR VL095_sp_BA MTR 11218 S S Santo Inácio BA BR SP7 MTUR PT635_sp_BA MTR 11257 S S Santo Inácio BA BR SP7 UFBA VL061_CS_BA UFBA 12378 S S Camaçari BA BR SP7 URCA VL017_PS_CE URCA-H 5474 S S Missão Velha CE BR SU GB GB37_OV_XX 146MC N EF396049 - - XX SU GB GB31_SU_VE E51 KC180031 N - Trincheiras VE SU GB GB23_BC_BR USFS 8793 JQ268479 N - - BR SU GB GB02_OV_GU USNM 566234 DQ283405 N - Berbice GU SU MTUR VL100_sp_RR MTR 20593 S S E. E. Maracá RR BR SU MTUR VL101_sp_RR MTR 20881 S S Tepequém RR BR SU MTUR VL102_sp_RR MTR 23179 S S Campos Novos RR BR
81
APÊNDICE D – ÁRVORES 16S E CO1 DAS AMOSTRAS USADAS Árvore 16S:
82
Árvore 16S (Continuação):
83
Árvore CO1:
84
Árvore CO1 (Continuação):
5 8 APÊNDICE E – DISTÂNCIAS GENÉTICAS ENTRE AS UMTOs DESTE ESTUDO.
Abaixo da diagonal gene 16s, acima gene CO1. Valores médios ± erro padrão em %. Valores em destaque são menores que os valores esperados para relações interespecíficas (5% 16S e 10% CO1).
OG1 = Microhyla heymonsi; OG2 = Dermatonotus muelleri; BC = BICOLOR; HE = HELIANNEAE; MO = MATOGROSSO; CS = CESARII; BB = BUMBAMEUBOI; PN = PANEMENSIS; PE = PEARSEI; SU = SURUMU. 86
APÊNDICE F – ELACHISTOCLEIS CESARII DA FIGURA 18.
Testemunho Município Estado Testemunho Município Estado CFBH 35043 Campinas SP CFBH 04136 Rio Claro SP CFBH 21353 Pirassununga SP CFBH 04133 Rio Claro SP CFBH 20491 Pirassununga SP CFBH 04237 Rio Claro SP CFBH 31879 Luis Antonio SP CFBH 35294 Campinas SP CFBH 10907 Ubatuba SP CFBH 04148 Rio Claro SP CFBH 34298 Sacramento MG CFBH 06576 Rio Claro SP CFBH 24744 Mogi-Guaçu SP CFBH 05841 Itirapina SP CFBH 34949 Campinas SP CFBH 26893 São Carlos SP CFBH 38064 Piquete SP CFBH 06635 Itirapina SP CFBH 38066 Piquete SP CFBH 06575 Rio Claro SP CFBH 38290 Rio Claro SP CFBH 11382 Itirapina SP CFBH 23136 Angatuba SP CFBH 24743 Mogi-Guaçu SP CFBH 20006 Assis SP CFBH 31878 Luis Antonio SP CFBH 36338 Sacramento MG CFBH 04137 Rio Claro SP CFBH 35042 Campinas SP CFBH 26075 União de Minas MG CFBH 20008 Assis SP CFBH 34001 Botucatu SP CFBH 20004 Assis SP CFBH 34010 Botucatu SP CFBH 24742 Mogi-Guaçu SP CFBH 05703 Itirapina SP CFBH 04232 Rio Claro SP CFBH 38065 Piquete SP CFBH 04234 Rio Claro SP CFBH 36631 Botucatu SP CFBH 04134 Rio Claro SP CFBH 38720 Manduri SP CFBH 04256 Rio Claro SP CFBH 31876 Luis Antônio SP CFBH 06578 Rio Claro SP CFBH 31875 Luis Antônio SP
Lista de espécimes e localidades dos exemplares de E. cesarii apresentados na figura 16, a ordem dos exemplares é esquerda para a direita e de baixo para cima. Em negrito, espécimes de Piquete/SP.