Arbeitsbereich Soil Microbial Ecology Zentrum für Umweltforschung und nachhaltige Technologien UFT Universität Bremen

Reduzierung der Keimbelastung in Vorflutern durch Behandlung des Kläranlagenablaufs in einem neuartigen bepflanzten Bodenfilter mit Untersuchungsfokus auf antibiotikaresistente Bakterien

Abschlussbericht über ein Entwicklungsprojekt, gefördert unter dem AZ: 32081 von der Deutschen Bundesstiftung Umwelt

von

Dr. Stefan Knauth (Projektbearbeitung) Dr. Thilo Eickhorst (Projektleitung)

September 2016

Dr. Stefan Knauth Tel.: +49 421 218 63447 E-Mail: [email protected]

Dr. Thilo Eickhorst Tel.: +49 421 218 63446 E-Mail: [email protected]

Universität Bremen Zentrum für Umweltforschung und nachhaltige Technologien (UFT) Soil Microbial Ecology Leobener Str., UFT 28359 Bremen

10/01 Projektkennblatt der Deutschen Bundesstiftung Umwelt

Az 32081/01 Referat 23 Fördersumme 121.200 € Antragstitel Reduzierung der Keimbelastung in Vorflutern durch Behandlung des Klär- anlagenablaufs in einem neuartigen bepflanzten Bodenfilter mit Untersu- chungsfokus auf antibiotikaresistente Bakterien

Stichworte Verfahren, Filter, Screening Laufzeit Projektbeginn Projektende Projektphase(n) 18 Monate 01.11.2014 30.04.2016 1 Zwischenberichte

Bewilligungsempfänger Universität Bremen Tel. 0421/218-63446 FB 2 Biologie/Chemie Fax Soil Microbial Ecology Projektleitung: Herr Dr. Thilo Eickhorst Dr. Thilo Eickhorst Leobener Str. im UFT Bearbeiter: 28359 Bremen Dr. Stefan Knauth Kooperationspartner Wasserversorgung Sulinger Land, Nechtelsen 11, 27232 Sulingen

Mikrobiologisches Labor - Dr. Michael Lohmeyer GmbH, Mendelstraße 11, 48149 Münster

Meyer Umweltservice GmbH & Co. KG, Ellerchenhausen 1, 27239 Twistringen

Zielsetzung und Anlass des Vorhabens Antibiotikahaltige Abwässer führen in Aufbereitungsanlagen und Kleinkläranlagen zur Bildung von multi- resistenten Bakterien. Die Emission dieser Bakterien in den natürlichen hydrologischen Kreislauf kann zu einer breiten Übertragung der Resistenzgene auf autochthone Mikroorganismen führen und später direkt oder über den Umweg der Nahrungskette zum Menschen gelangen, wo sie zur Verschlechterung der be- reits bestehenden Antibiotika-Therapieprobleme führen können. Ziel des Vorhabens ist, ein am Zentrum für Umweltforschung und nachhaltige Technologien (UFT) der Universität Bremen entwickeltes innovatives Bodenfilterverfahren hinsichtlich der bakteriellen Eliminati- onsleistung von vorgeklärten Abwässern einer kleineren kommunalen Kläranlage zu bewerten. Im Fokus der Überprüfung steht der Einfluss des Filtrationsverfahrens auf Antibiotika-resistente, klinisch relevante Bakterien. Die Reduzierung der Keime dient dabei nicht nur der zusätzlichen hygienischen Entlastung, sondern verhindert indirekt auch eine Ausbreitung von Resistenzgenen in die Gewässer und somit eine mögliche Übertragung auf die dortige Mikroflora und humanpathogene Erreger in die Umwelt.

Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten Methoden Das Vorhaben zielt auf eine Bewertung der Keimreduktion durch den Einsatz des innovativen bepflanz- ten Bodenfilters und einer Verringerung der Emission Antibiotika-resistenter Keime in den Vorfluter. Die mikrobielle Belastung im Zu- und Ablauf des Bodenfilters sowie der einzelnen Substratzonen wird analysiert und bewertet, was die Grundlage zur weiteren Verfahrensoptimierung liefert. Es werden aktu- elle, moderne molekularbiologische Verfahren wie die Hochdurchsatz-Sequenzierung (NGS) und DNA- Anfärbung zur bestmöglichen phylogenetischen Charakterisierung und Quantifizierung der hygienischen Eliminationsleistung des Bodenfilters verwendet. Bedeutende Antibiotika-Resistenzgene von klinisch re- levanten Bakteriengruppen werden mit Hilfe des Verfahrens der Real-time PCR quantifiziert. Zusätzlich werden Antibiogramme von Indikator-Mikroorganismen (Escherichia coli) angefertigt, um potentielle Bil- dungen von Multiresistenzen identifizieren zu können. Ergänzt werden diese Analysen mit klassischen Verfahren der Kultivierung, sowohl der insgesamt vorhandenen Kolonie bildenden Einheiten (KbE) als auch selektiv der Coliformen und E. coli KbE, sowie Respirationsmessungen der Bodenfiltersubstrate. Die Untersuchungen wurden über einem Zeitraum von April bis Dezember 2015 an einem an der Kläran- lage Sulingen installierten Bodenfilter (DBU AZ 28722) durchgeführt. Deutsche Bundesstiftung Umwelt  An der Bornau 2  49090 Osnabrück  Tel 0541/9633-0  Fax 0541/9633-190  http://www.dbu.de

Ergebnisse und Diskussion Die Eliminationsleistung des bepflanzten Bodenfilters konnte sowohl mit klassischen als auch molekular- biologischen Methoden nachgewiesen werden. Im Versuchsverlauf zeigten sich deutliche Schwankun- gen sowohl bei der Keimbelastung des Klärwassers als auch bei der Eliminationsleistung. Letztere zeigte vor allem im Sommer bei der Reduktion coliformer Keime eine gute Leistung (im Mittel -85%). Sobald die Keimbelastung im Klärwerksablauf einen Schwellenwert von ca. 2 Mio. Keimen je ml unterschreitet, kann der Bodenfilter allerdings keine weitere Reduktion erreichen. Hinsichtlich der mikrobiellen Diversität gleicht sich die Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaft im Bodenfilterablauf dem Substrat des Bodenfilters an und zeigt eine wesentlich geringere Ähnlichkeit mit der Zusammensetzung im Klärwerksablauf (<50%). In beiden Abwässern konnten spezifische Zu- und Abnahmen untersuchter Bakteriengruppen identifiziert werden. Ähnliche Tendenzen konnten bei der quantitativen Analyse der Resistenzgene festgestellt werden, was für 3 der untersuchten 6 Resistenzge- ne eine Zunahme an einzelnen Terminen im Ablauf des Bodenfilters bedeutete. Die Analyse der Antibiotikaresistenz isolierter E. coli Keime zeigte eine Verschiebung der Antibiotikare- sistenz-Muster zwischen Klärwerksablauf und Bodenfilterablauf. Dabei kam es in letzterem zum Auftre- ten neuer Resistenzen, deren Auswirkung aber relativ zur deutlich geringeren Keimbelastung des Filter- ablaufs gesehen werden muss. Nichts desto trotz führt der Bodenfilter zu Veränderungen der mikrobiel- len Qualität des Abwassers, die sich über die allgemeine Bestimmung von KbE oder Analyse der mikro- biellen Aktivität als Summenparameter nicht ableiten lassen.

Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation Im Rahmen dieses Projektes wurden der Forschungsgegenstand und Teilergebnisse zu verschiedenen Gelegenheiten präsentiert und mit unterschiedlichen Zielgruppen diskutiert. Bereits zu Beginn des Projektes wurde das Vorhaben im Rahmen eines Zeitungsartikels in der Nord- westzeitung vom 24.04.2015 zusammen mit dem DBU Projekt AZ 28722 thematisiert. Eine weitere Er- wähnung fand das Projekt in einem Zeitungsartikel im Weser-Kurier vom 13.10.2015, in dem Böden und deren Rolle bei der Filtration von Wasser thematisiert wurden. Darüber hinaus wurde das Projekt der Fachöffentlichkeit in Form zweier Tagungsbeiträge („Influence of soil filters on the bacterial diversity in the effluent of a wastewater treatment plant“, KIII Tagung der DBG, 17.-18.03.2015; „Einfluss eines bepflanzten Bodenfilters auf die Elimination von Bakterien aus dem Ab- lauf eine Kleinkläranlage unter Berücksichtigung von Antibiotika resistenten Keimen und deren Resis- tenzgenen“, Jahrestagung der Deutschen Bodenkundlichen Gesellschaft, 05.-10.09.2015) präsentiert. Zu den Beiträgen wurde ein Abstract angefertigt und veröffentlicht. Zudem wurden die methodischen Aspek- te des Projektes während der Teilnahme am 3rd International Symposium on the Environmental Dimen- sion of Antibiotic Resistance (EDAR-3; 17.-21.05.2015) mit Experten dieser Thematik diskutiert. Eine Vorstellung des Projektes unter Fachleuten aus der Anwendungspraxis erfolgte im Rahmen eines Projekttreffens (zusammen mit DBU AZ 28722; 26.05.2015). Die vorgestellten Ergebnisse wurden im Plenum und in vertieften Fachgesprächen diskutiert. Die Endergebnisse des Projektes sollen im Rahmen eine Bodenfilter-Workshops am UFT Bremen gegen Ende 2016 zusammen mit weiteren am UFT ge- wonnenen Ergebnissen vorgestellt werden. Derzeit sind zwei Veröffentlichungen aus diesem Projekt vorgesehen, wobei eine eher auf die Praxisan- wendung ausgerichtet sein wird und eine weitere die methodischen Erkenntnisse aus dem Vorhaben in einer internationalen Fachzeitschrift thematisieren wird.

Fazit Durch das Verfahren des bepflanzten Bodenfilters können Bakterien, insbesondere E. coli und Coliforme aus dem Klärwasserablauf effizient eliminiert werden. Das entsprechende Abwasser aus dem Filterab- lauf trägt somit zur hygienischen Entlastung des Vorfluters und damit auch der gesamten Umwelt bei. Die hochauflösende molekularbiologische Analyse der mikrobiellen Diversität in den untersuchten Ab- wässern des Klärwerks und des Bodenfilters ließen neben der Elimination einzelner Keimgruppen auch ein vermehrtes Auftreten bisher nicht im Klärablauf identifizierter Keime erkennen. Hinsichtlich der Resistenzgene zeigte sich, dass ein Teil der analysierten, klinisch relevanten Gene re- duziert wurden, aber auch eine Zunahme weniger Gene detektiert wurde. Weiterführende Analysen der Resistenzspektren von E. coli Isolaten zeigten ebenso, dass sich neben der Verringerung bestimmter Resistenzen auch gegenüber dem Klärwerksablauf neue Antibiotikaresistenzen im Bodenfilterablauf zeigten. Diese Effekte bezüglich der Resistenzen müssen aber relativiert werden, da bereits die hohe Eliminationsleistung des Bodenfilters das Ausmaß im Bodenfilterablauf deutlich reduziert. Für eine weitere Optimierung des Verfahrens sollte eine Anpassung hinsichtlich der gezielten Elimination spezifischer Bakteriengruppen und damit einhergehend spezifischer Resistenzen vorgenommen werden. Zudem sollte eine Bewertung der verbliebenen bzw. veränderten mikrobiellen Beschaffenheit des Ab- wassers bezüglich ihrer potentiell neuen ökologischen Relevanz im Vorfluter vorgenommen werden.

Deutsche Bundesstiftung Umwelt  An der Bornau 2  49090 Osnabrück  Tel 0541/9633-0  Fax 0541/9633-190  http://www.dbu.de

Inhaltsverzeichnis

Projektkennblatt

Inhaltsverzeichnis

Verzeichnis von Abbildungen und Tabellen

Abkürzungen

Zusammenfassung 1 1 Einleitung 3 2 Material und Methoden 5 2.1 Material 5 2.1.1 Der untersuchte Bodenfilter 5 2.1.2 Chemikalien und Verbrauchsmaterial 5 2.2 Methoden 6 2.2.1 Entnahme von Wasserproben des Klärwerksablaufes und des Bodenfilters 6 2.2.2 Entnahme von Substratproben aus dem Bodenfilter 6 2.2.3 Herstellung bakterieller Wachstumsmedien 6 2.2.4 Kultivierung der Bakterien aus den Abläufen 6 2.2.5 Extraktion von Gesamt-Nukleinsäure aus Abwasserproben 7 2.2.6 Ermittlung von Zellzahlen mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie 7 2.2.7 Bestimmung der Kolonie bildenden Einheiten (KbE) und Koloniezahlen von 7 Escherichia coli sowie coliformen Bakterien 2.2.8 Hochdurchsatz-Sequenzierung der bakteriellen 16S rRNA Genfragmente 8 (illumina MiSEQ) 2.2.9 Quantifizierung von ausgewählten Resistenzgenen mit Hilfe der quantitativen 8 Real-time PCR 2.2.10 Anfertigung von Antibiogrammen/Resistenzspektren 9 2.2.11 Überprüfung der Escherichia coli Isolate durch Sequenzierung der 16S rRNA- 9 Gene 2.2.12 Mikrobielle Aktivität des Bodenfiltersubstrates 10 3 Ergebnisse 11 3.1 Bakterielle Zellzahlen DAPI, KbE sowie E. coli und Coliforme 11 3.1.1 Zellzahlen nach fluoreszierender Markierung durch DAPI 11 3.1.2 Zahl der Kolonie bildenden Einheiten (KbE) 12 3.1.3 Kolonienzahlen von E. coli und Coliformen 12 3.1.4 Bakterielle Eliminationsleistung des Bodenfilters 13 3.2 Hochdurchsatz-Sequenzierung bakterieller 16S rRNA Genfragmente 14 3.2.1 Clusteranalyse der bakteriellen Klassen 14 3.2.2 Clusteranalyse der bakteriellen Gattungen 17

I 3.3 Quantifizierung von Resistenzgenen mit Hilfe der quantitativen Real- 18 time PCR 3.4 Antibiogramme / Resistenzspektren 21 3.5 Mikrobiologische Aktivität der Bodenfiltersubstrate 25 4 Diskussion 27 4.1 Zellzahlen DAPI, KbE sowie E. coli und Coliforme 27 4.2 Bakterielle Diversität und 16S rRNA-OTU-Zahlen 28 4.3 Quantifizierung ausgesuchter Resistenzgene 29 4.4 Antibiogramme / Resistenzspektren 29 4.5 Mikrobiologische Aktivität der Bodenfiltersubstrate 31 5 Fazit 33 6 Literaturverzeichnis 35 Anhang

II Abbildungsverzeichnis

Abb. 1 Schematischer Aufbau des Bodenfilters. 5 Abb. 2 Zellzahlen (DAPI) ermittelt durch Fluoreszenzmikroskopie aus dem Klärwerks 11 (KA)- und Filterablauf (FA). Abb. 3 Koloniezahlen (KbE) ermittelt durch Kultivierung aus dem Klärwerks (KA)- 12 und Filterablauf (FA) Abb. 4 Koloniezahlen (E. coli und Coliforme) ermittelt durch Kultivierung aus dem 13 Klärwerks (KA)- und Filterablauf (FA) Abb. 5 Heatmap und Cluster-Analyse (UPGMA, Bray Curtis) der ermittelten 15 bakteriellen Klassen Abb. 6 Bakterielle Klassen mit mindestens 2% OTU Anteil in einer Probe. 16 Klärwerksablauf (KA), Filterablauf (FA), Filtersubstrat (FS). Abb. 7 Bakterielle Klassen der Filtersubstrate (FS) und der mit mindestens 2% OTU 17 Anteil. Klärwerksablauf (KA), Filterablauf (FA), Filtersubstrat (FS). Abb. 8 Cluster-Analyse (UPGMA, Bray-Curtis) der bakteriellen OTU auf 18 Gattungsebene Abb. 9a 9a Addierte Resistenzen der jeweils 50 E. coli Antibiogramme aus dem 22 Klärwerks- und Filterablauf. Abb. 9b Addierte Resistenzen der jeweils 50 E. coli Antibiogramme aus dem 23 Klärwerks- und Filterablauf Abb. 9c Addierte Resistenzen der jeweils 50 E. coli Antibiogramme aus dem 24 Klärwerks- und Filterablauf Abb. 10 Respirationsraten aus den Bodenfiltersubstraten in Abhängigkeit 25 verschiedener Tiefen Abb. 11 Darstellung einer Plattierung vom Klärwerksablauf (A) und von drei 30 Ausstrichen

III Tabellenverzeichnis

Tab. 1 Zielgene, Sequenzen und Referenzen der verwendeten Primer und Sonden 8 für die qPCR Tab. 2 Zielgene, Oligo-Konzentrationen, PCR-Konditionen und Effizienzen der 9 qPCR Tab. 3 Eliminationsleistung des Bodenfilters von Mikroorganismen in Prozent 14 Tab. 4 Zahl der Resistenzgene pro 16S rRNA Genkopie für vanA, mecA und ampC 19 Tab. 5 Zahl der Resistenzgene pro 16S rRNA Genkopie für blaTEM, blaCTX-M und 20 intl1 Tab. 6 Kolonienzahlen auf selektivem Endo-Agar (mit Ciprofloxacin) pro Liter 21

IV Abkürzungen

3-APB 3-Amino-Phenyl-Borat 16S 16 Svedberg Einheiten (ein Sedimentationskoeffizient) cm Zentimeter DAPI 4',6-Diamidino-2-phenylindol DNA Desoxyribonucleic acid E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendinitrilotetraessigsäure FA Filterablauf FS Filtersubstrat KA Klärwerksablauf KbE Kolonie bildende Einheiten nm Nanometer mm Millimeter MRGN Multiresistente Gram-negative NGS Next Generation Sequencing OTU Operational Taxonomic Unit PCR Polymerase Chain Reaction (Polymerase Kettenreaktion) qPCR Quantitative Real-time PCR RNA ribonucleic acid (Ribonukleinsäure) rRNA ribosomal ribonucleic acid (ribosomale Ribonukleinsäure)

V

Zusammenfassung In Kläranlagen, in denen Abwässer mit verschiedensten Verschmutzungen z.B. medizinischen Wirkstoffen wie Antibiotika zusammen kommen, kann es durch den intensiven Kontakt der Mikroorganismen im wässrigen Milieu zur Bildung von multiresistenten Bakterien kommen. Die Emission dieser Keime in den natürlichen hydrologischen Kreislauf kann zu einer breiten Übertragung von Resistenzgenen auf autochthone Mikroorganismen kommen und potentiell über natürliche Stoffkreisläufe zum Menschen gelangen, wo sie zur weiteren Verschlechterung der Antibiotika-Therapieprobleme bei Patienten führen können. Es wurden klassische Methoden der Kultivierung sowie aktuelle molekularbiologische Verfahren wie die Hochdurchsatz-Sequenzierung (NGS), quantitative Real-time PCR und DNA-Färbung zur bestmöglichen Charakterisierung und Quantifizierung der hygienischen Eliminationsleistung des Bodenfilterverfahrens eingesetzt. Die Untersuchungen wurden über den Zeitraum von April bis Dezember 2015 an einem an der Kläranlage Sulingen installierten Bodenfilter (DBU AZ 28722) durchgeführt. Klassische und molekularbiologische Methoden bestätigen die Elimination von bakteriellen Keimen durch den Bodenfilter. Die Hochdurchsatz-Sequenzierung (NGS) zur detaillierten Charakterisierung der bakteriellen Diversität identifizierte viele bisher wenig erforschte bakterielle Gruppen und enthüllte einen klaren Einfluss des Bodenfilterverfahrens auf die bakterielle Zusammensetzung des filtrierten Wassers. Untersuchungen durch Real-time PCR zur Analyse von Veränderungen der Genkopienzahl ausgesuchter Resistenzgene zeigen sowohl die Zunahme als auch die Abnahme von manchen Genkopienzahlen im Bodenfilter. Bei drei der untersuchten sechs Resistenzgene bedeutete dies eine Zunahme an einzelnen Terminen im Ablauf des Bodenfilters. Die Resistenzspektren (Antibiogramme) von E. coli Isolaten im Mikrodilutionstest sollten ebenfalls Auskunft über mögliche Bildung von Multiresistenzen im Bodenfilter liefern und zeigten eine Variation von Resistenzmustern der Isolate im Klärwerks- und Filterablauf. In beiden Abwässern konnten spezifische Zu- und Abnahmen der untersuchten Resistenzen ermittelt werden. Für eine weitere Optimierung des Filtrationsverfahrens sollte eine Anpassung hinsichtlich der gezielten Elimination spezifischer Bakteriengruppen und damit einhergehend spezifischer Resistenzen vorgenommen werden. Zudem sollte eine Bewertung der verbliebenen bzw. veränderten mikrobiellen Beschaffenheit des Abwassers bezüglich ihrer potentiell neuen ökologischen Relevanz im Vorfluter vorgenommen werden. Die vielschichtigen Arbeiten und deren Umsetzung erfolgten in enger Zusammenarbeit mit den Projektkooperationspartnern Wasserversorgung SULINGER LAND, Mikrobiologisches Labor Dr. Lohmeyer GmbH und dem Umweltservice Meyer GmbH & Co. KG. Das Forschungsvorhaben wurde von der Deutschen Bundesstiftung Umwelt (DBU) unter dem Aktenzeichen AZ32081 gefördert.

1

1 Einleitung Abwasseraufbereitungsanlagen und Kleinkläranlagen wurden aktuell als Quellen multiresistenter Bakterien identifiziert [CB12], [NT13]. Auf Grund der im Abwasser befindlichen Antibiotika kommt es verstärkt zur Übertragung von Resistenzgenen [BD13]. Die Mikroorganismen gelangen aus den Kläranlagen in den natürlichen hydrologischen Kreislauf, wo dann eine breite Übertragung der Antibiotika- Resistenzgene auf dortige autochthone Mikroorganismen stattfinden kann [CB12]. Die Gefahr hierbei ist, dass bereits niedrige Konzentrationen das Wachstum resistenter Keime und die Gefahr einer Genübertragung begünstigen [GA11]. Die resistenten Keime können so direkt oder über den Umweg der Nahrungskette zum Menschen gelangen, wo sie zu ernsthaften Therapieproblemen führen können [FS99]. Die Reinigung von Abwasser durch bepflanzte Bodenfilter wird von einzelnen Haushalten und auch kleineren Kommunen praktiziert und ist seit langer Zeit etabliert. Der Reinigungseffekt der Filter basiert auf einem komplexen System in dem chemische, physikalische und biologische Vorgänge den Abbau von organischen chemischen Verbindungen katalysieren. Bei der Reinigung von kommunalem Schmutzwasser in Mischsystemen gewinnen sie zunehmend an Bedeutung. Studien, die bisher das Potential von Boden- und Pflanzenfiltern zur Eliminierung von Bakterien untersuchten [FW03; GL09; DS13] verwendeten Methoden, die auf der Kultivierung der Mikroorganismen basieren. Auf Grund der geringen Kultivierbarkeit der meisten Bakterien wird bei dieser Herangehensweise eine Vielzahl der Organismen nicht erfasst [TD90]. Demgegenüber bietet die Anwendung von Zellfärbetechniken, wie die Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) [AS95; SE13], die Möglichkeit zur spezifischen Detektion aller Zellen mit hoher Genauigkeit. Zur phylogenetischen Charakterisierung von Bakterien verwenden molekularbiologische Methoden die genetische Information der Mikroorganismen (16S rRNA Gene). Bisher erfolgte diese Charakterisierung durch relativ zeitaufwendige und teure Amplifikation durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) sowie das Klonieren und Sequenzieren der Zielgene [KR05]. Kürzlich etablierte Methoden wie die Hochdurchsatz-Sequenzierung ermöglichen eine schnelle, günstige und exakte Identifizierung der in der untersuchten Probe vorhandenen Mikroorganismen. Auch Bakterien, die mit heutigen Mitteln nicht kultiviert werden können, werden dadurch erfasst [Met10; AK13]. Für die Quantifizierung funktioneller Gene, zu denen auch Antibiotika Resistenzgene zählen, ist die quantitative Real-time PCR (qPCR) als sensitives und vielseitiges Verfahren etabliert und bewährt. Alternative Methoden, wie z.B. die Dot-blot-Hybridisierung oder Microarray, werden selten verwendet und erreichen nicht die Sensitivität der qPCR [MP03; FP13; KL13]. Zur Identifizierung von Empfindlichkeiten einzelner Mikroorganismen in Reinkultur gegen Antibiotika stehen derzeit drei Gruppen von Verfahren zur Verfügung a) Diffusionsverfahren, b) Dilutionsverfahren (Bouillon- oder Agar-Dilution) und c) E-Test. Neben der Agar-Dilution wird am häufigsten der Mikrodilutionstest zur Erstellung von Antibiogrammen angewendet [BD13]. Dieses Verfahren, insbesondere die Mikrobouillon-Dilution, wird ebenfalls von der DVG-Arbeitsgruppe „Antibiotikaresistenz“ als Methode der Wahl für Routinediagnostik, Forschung und Monitoring empfohlen. Als nachgeschaltete Klärstufe kann der Bodenfilter die bakterielle Last um ein Vielfaches reduzieren und verhindert stärker als in der Praxis üblich, dass Antibiotika-resistente Bakterien in die Umwelt gelangen. Eine daraus resultierende Gefahr einer möglichen Übertragung auf natürliche Umweltmikroorganismen wird dadurch ebenso verringert. In diesem Zusammenhang ist eine verbesserte Datengrundlage über das Vorkommen antibiotikaresistenter Bakterien im Abwasserpfad von großer Bedeutung und bietet eine wichtige Grundlage bei der Bewertung von umweltrelevanten Klärwässern. Durch eine detaillierte

3 Kenntnis der Keimzusammensetzung sollen Verfahren zur Beseitigung von Keimen, insbesondere antibiotikaresistente Bakterien aus Kläranlagenabläufen, überprüft und weiterentwickelt werden. Das Verfahren zielt im Wesentlichen auf den Einsatz in Kleinkläranlagen unter Berücksichtigung der Umweltrelevanz der in den Vorfluter einzuleitenden Klärwässer. Ziel des Projektes ist es, das Potential eines am UFT entwickelten, innovativen Bodenfilterverfahrens (DBU Projekt AZ 28722) [DS13] zur Reduzierung der bakteriellen Belastung im Wasser am Beispiel des Ablaufes einer kleineren kommunalen Kläranlage zu ermitteln. Im Fokus der Überprüfung soll dabei der Einfluss des Filtrationsverfahrens auf Antibiotika-resistente Bakterien stehen. Im genannten Projekt konnten bereits Reduzierungen der Keimbelastung des bepflanzten Bodenfilters anhand von Kolonie- bildenden Einheiten (KbE) nachgewiesen werden [DS13]. Durch diesen Beitrag zur Umweltentlastung soll darüber hinaus ein Eintreten von Antibiotika-resistenten Bakterien in die Umwelt maßgeblich reduziert werden. Die Reduzierung der Keime dient dabei nicht nur der hygienischen Entlastung sondern verhindert indirekt auch eine Ausbreitung von Resistenzgenen in die Gewässer und somit eine mögliche Übertragung auf die autochthone Mikroflora und humanpathogene Erreger. Aktuelle und innovative molekularbiologische Methoden wie die Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) und Hochdurchsatz-Sequenzierungstechniken (Next Generation Sequencing, NGS) ermöglichen dabei erstmals eine detaillierte Abbildung der durch den Bodenfilter reduzierten Keimzahlen und Mikroorganismengruppen. Die Analyse ausgewählter Resistenzgene von Mikroorganismengruppen (MRSA, VRE, MRGN), die im Krankenhausalltag durch ihre Antibiotikaresistenz eine besonders kritische Rolle einnehmen [NE12], bietet erstmalig Information über den Einfluss eines bepflanzten Bodenfilters auf resistente Mikroorganismen. Die im Projekt gewonnenen Daten zur Eliminierungsleistung von den gewählten Modell-Bakterien lassen sich sowohl auf die Gesamtheit der resistenten Mikroorganismen als auch auf andere Boden- und Pflanzenfilterverfahren übertragen. Nach einer Optimierung und Anpassung der molekularbiologischen Methoden an die physikochemischen Bedingungen des Abwassers soll die Gesamtkeimbelastung mit Hilfe von DNA-Färbung erfasst werden. Parallel dazu erfolgt ein Screening der phylogenetischen Mikroorganismengruppen mit Hilfe der Hochdurchsatz-Sequenzierung, was den innovativen Charakter des Projektes unterstreicht. Basierend auf diesen Ergebnissen soll weiterführend eine gruppenspezifische Quantifizierung relevanter Bakteriengruppen durchgeführt werden. Für eine Vergleichbarkeit der Keimreduzierung des Bodenfilters mit vorangegangenen Studien, dienen bakterielle Nährmedien zur Bestimmung der Kolonie bildenden Einheiten (KbE) von Indikator-Mikroorganismen. Zur Erfassung des Einflusses des Bodenfilters auf Antibiotika-resistente Mikroorganismen und der Belastung des Abwassers mit Antibiotika-Resistenzgenen, soll eine spezifische Charakterisierung und molekularbiologische Quantifizierung der Resistenzgene (Quantitative Real-time PCR) von vorgenannten relevanten Keimen erfolgen. Zusätzlich soll der Effekt des Bodenfilters auf die Eliminierung oder mögliche Bildung von Multiresistenzen durch die Erstellung von Antibiogrammen von Indikator-Mikroorganismen untersucht werden. Somit liegt ein weiterer Schwerpunkt dieses Vorhabens neben der Erfassung und Bewertung der Keimreduzierung auf der Identifikation und Quantifizierung relevanter Resistenzgene. Durch neueste molekularbiologische Methoden soll die detaillierte Analyse der Eliminationsleistung einen Beitrag zur Überprüfung und Aufrechterhaltung des Umweltentlastungspotentials an Bodenfiltern und Pflanzenkläranlagen leisten.

4 2 Material und Methoden 2.1 Material 2.1.1 Der untersuchte Bodenfilter

Die Erstellung des Bodenfilters einschließlich Zulaufbauwerk, Drainagesystem, Befüllung und Ablaufbauwerk (Kontrollschacht) erfolgte im August 2013. Die Bepflanzung wurde Anfang September in das Filtersubstrat eingebracht. Der eigentliche Filterkörper ist aus verschiedenen, in Horizonten orientierten Substraten aufgebaut (Abb. 1) und baut auf einer zu Grunde liegenden Filterfolie auf. Die Basis begründet eine Schicht Kies in der das Drainagesystem eingelassen ist. Es folgt eine etwa 70 Zentimeter mächtige Schicht aus einem gleichmäßig verteilten Sand/Pflanzenkohle-Gemisch mit einem Anteil von 15 Volumenprozenten Pflanzenkohle. Anschließend wurde oberflächennah eine ca. 10 bis 20 Zentimeter mächtige Sandschicht mit Anteilen von Silikatkolloid und Strukturkompost eingefügt und diese abschließend mit einer reinen Sandschicht (10 cm) abgedeckt. Diese Schicht wurde mit den Pflanzenspezies Phalaris arundinacea, Lythrum salicaria und Iris pseudacorus bepflanzt, wobei in jedes Pflanzloch etwa 20 ml Mykorrhizapilz-Inokulum gegeben wurde. Der Bodenfilter ist für einen Tagesdurchfluss von etwa 100 Litern pro Quadratmeter ausgelegt und wurde während des gesamten Beprobungszeitraumes mit der doppelten dieser Durchflussmenge betrieben [DS16].

Abb. 1: Schematischer Aufbau des Bodenfilters.

2.1.2 Chemikalien und Verbrauchsmaterial

Die Chemikalien für die Kultivierung der Bakterien (siehe Tab. A1-A3) wurden von Fluka, Sigma-Aldrich und Roth bezogen. Sämtliche Oligonukleotide für die PCR und Real-time PCR wurden von der Firma Biomers verwendet. Die Mastermixe für die Real-time PCR stammen von Promega. Die Chemikalien für die Standard PCR wurden von Thermo Scientific Fisher bezogen. Die DNA-Extraktionskits (NucleoSpin Soil) stammen von Macherey-Nagel. Verbrauchmaterialien wie Pipettenspitzen, Mikro-Reaktionsgefäße, Reagiergefäße, Petrischalen wurden von der Firma Sarstedt bezogen. Abweichungen, sofern vorhanden, sind in den entsprechenden Abschnitten vermerkt.

5 2.2 Methoden 2.2.1 Entnahme von Wasserproben des Klärwerksablaufes und des Bodenfilters

Die Entnahme der Wasserproben wurde sofern möglich an Tagen mit ähnlichen Witterungsbedingungen wie Niederschlag durchgeführt. Dabei wurden die Termine möglichst monatlich gelegt. Beprobt wurde für Vorversuche vor der Hochleistungsphase des Bodenfilters [DS16] und für die eigentliche mikrobielle Analyse des Bodenfilters während der Hochleistungsphase (April 2015 - Dezember 2015). In dieser Phase wurde der Filter mit dem doppelten Wasservolumen belastet (200 Liter pro Tag und Quadratmeter) als üblich.

2.2.2 Entnahme von Substratproben aus dem Bodenfilter

Zur physikochemischen Charakterisierung und mikrobiologischen Analyse des Bodenfiltersubstrats wurde zum Ende des Probenahmezeitraums im Oktober 2015 eine Bohrstockbeprobung durchgeführt. Mit Hilfe eines Bodenprobenehmers nach Pürckhauer wurden an drei Positionen entlang einer Diagonale auf der Bodenfilterfläche (Ecke, Mitte, Ecke) jeweils drei Tiefenprofile (0-80 cm) entnommen und in 10 cm Abschnitten beprobt. Das Bodenfiltersubstrat der drei parallelen Tiefenprofile je Position auf dem Bodenfilter wurde luftgetrocknet und homogenisiert. Anschließend wurden größere Pflanzenwurzeln aus den Proben entfernt.

2.2.3 Herstellung bakterieller Wachstumsmedien

Die Medien R2A, Endo und LB wurden entsprechend der Medienzusammensetzung (Anhang, Tab. A1- A3) eingewogen und nachfolgend durch Autoklavieren sterilisiert.

2.2.4 Kultivierung der Bakterien aus den Abläufen

Kultivierung zur Bestimmung der Kolonie bildenden Einheiten (KbE)

Zur Bestimmung der Zellzahlen von Kolonie bildenden Einheiten (KbE) wurden 10 µl des Klärwerks- und Bodenfilterablaufes auf Kulturplatten mit R2A-Agar ausplattiert und drei Tage bei 28°C inkubiert. Anschließend wurden die gebildeten Kolonien auf einem Weißlicht-Transilluminator gezählt.

Kultivierung zur Bestimmung der Koloniezahlen von Escherichia coli und Coliformen Zur Bestimmung der Koloniezahlen von E. coli und Coliformen wurden 50 µl des Klärwerks- und Bodenfilterablaufes auf Kulturplatten mit Endo-Agar ausplattiert und über Nacht für mindestens 16 Stunden bei 36°C inkubiert. Kolonien mit grün-goldenem Glanz wurden als E. coli und Kolonien mit einer dunkelroten Verfärbung wurden als Coliforme identifiziert. Als Vergleichsstämme zur Absicherung der Identifizierung wurden die Bakterienstämme DSM 1103 (E. coli) und DSM 30053 (Enterobacter aerogenes, Coliforme) eingesetzt.

6 2.2.5 Extraktion von Gesamt-Nukleinsäure aus Abwasserproben

Die DNA der Wasserproben wurde durch die Kombination von Filtration und anschließender Verwendung des DNA Extraktionskits NucleoSpin Soil (Machery-Nagel) durchgeführt. Hierzu wurden jeweils mindestens 250 ml Wasser, durch Anlegen eines Vakuums (800 mbar), durch einen 50 mm Membranfilter aus Nylon (Sartorius) mit einem Porendurchmesser von 0,22 µm gefiltert. Der Filter wurde dann in ein steriles 8 ml Plastik-Röhrchen überführt, wobei die Seite mit dem Filtrat zur Innenseite zeigte. Anschließend wurden Glasperlen (1400 mg  = 1 mm; 800mg  = 0,1 mm) und 1400 µl SL1 Puffer sowie 300 µl SX Puffer Enhancer zugefügt. Die Röhrchen wurden in einer Schwingmühle MM200 (Retsch) 1 min bei 25 Hz gemahlen. Anschließend wurde nach Angaben des Herstellers fortgefahren, wobei die Volumina der entsprechenden Puffer an das größere (doppelte) Startvolumen der Puffer angepasst wurden. Zuletzt wurde die DNA in 50 µl EB Puffer eluiert und bei -20°C bis zur weiteren Verwendung gelagert.

2.2.6 Ermittlung von Zellzahlen mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie

Der Fluoreszenzfarbstoff 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) wurde verwendet, um bakterielle Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop sichtbar zu machen und so deren Abundanz ermitteln zu können. DAPI gehört zu den Nukleinsäure-Farbstoffen und hat eine besondere Affinität zu AT-reichen Bereichen der DNA. Es wird angenommen, dass DAPI an dem Phosphatrückgrat der DNA bindet oder diese interkaliert.

Bei einer Anregungswellenlänge im ultravioletten Bereich (λmax = 372 nm) fluoresziert es weißlich-blau bei

λmax = 456 nm. Bei Bindung an DNA erhöht sich die Fluoreszenz etwa um den Faktor 20. Zu jedem Probenahmetermin wurden aus je 1 l Abwasserprobe des Ablaufs des Klärwerks und des Ablaufs des Bodenfilters eine Teilmenge (je 200 µl in 10 ml sterilem Wasser verdünnt) auf Membranscheiben (25 mm Durchmesser) aus Polycarbonat mit 0,2 µm Porendurchmesser filtriert (unter Vakuum bei 800 mbar). Die einzelnen Filter wurden in 35 µl Low-Melting-Point Agarose (60°C) eingebettet und Luft getrocknet. Anschließend wurden die Filter in Segmente geschnitten und in einem Antibleichmedium mit DAPI (Vectashield H-1200, Vector Laboratories, Burlingame, USA) auf einem Objektträger positioniert und mit einem Deckglas versehen. Die Zählung der Bakterien wurde mit Hilfe eines Epi-Fluoreszenz-Mikroskops (Anregungswellenlänge 350 nm) an 3 Filtersegmenten je Abwasserprobe und Beprobungstermin durchgeführt. Es wurden 20 Stellen pro Filtersegment im festgelegten Zählraster für eine gleichmäßige Auswertung der Filter gezählt. Dabei wurden immer Zellzahlen im gesamten Okularzählfeld erfasst. Die Berechnung der Zellzahlen erfolgte pro ml Abwasser.

2.2.7 Bestimmung der Kolonie bildenden Einheiten (KbE) und Koloniezahlen von Escherichia coli sowie coliformen Bakterien

Zur Feststellung der mikrobiologischen Eliminationsleistung wurden zwei verschiedene Kulturmedien verwendet, um eine Vergleichbarkeit der Ergebnisse mit anderen Arbeiten zu ermöglichen. Es wurden die Kolonie bildenden Einheiten (KbE) mit Hilfe des R2A Agars (Tab. A1) sowie die Zahl von Escherichia coli und Coliformen (Klebsiella, etc.) auf Endo-Agar (Tab. A2) ermittelt.

7 2.2.8 Hochdurchsatz-Sequenzierung der bakteriellen 16S rRNA Genfragmente (illumina MiSEQ)

Die Konzentration der extrahierten DNA wurde mit Hilfe eines Nanodrop Photometers bestimmt, um genügend DNA für die Sequenzierung einsetzen konnte. Die Hochdurchsatzsequenzierung wurde von der Firma LGC Genomics (Berlin) durchgeführt. Verwendet wurde dabei die 300 Basenpaar Paired-End- Read Technik mit einem Illumina MiSeq Sequenzierer unter Einsatz der V3 Chemikalien und der Primer für die Vervielfältigung bakterieller 16S rRNA-Gene 341F (CCTACGGGNGGCWGCAG) und 785R (GACTACHVGGGTATCTAATCC) [KG13]. Die erste Prozessierung der Sequenzier-Daten, das Demultiplexing aller Libraries für jede Spur, wurde mit der Illumina Software bcl2fastq 1.8.4 durchgeführt, wobei ein Mismatch im Barcode erlaubt war. Es wurden die Barcode- und Primer-Sequenzen entfernt sowie Reads mit weniger als 100 Basenpaar Länge aus dem Datensatz entfernt. Die Forward und Reverse Reads der Sequenzierung wurden mit der Software BBMerge 34.48 (http://bbmap.sourceforge.net/) miteinander kombiniert. Die kombinierten Sequenzen wurden von den Adapter und Primer-Sequenzen befreit und in FastQ- Dateien gespeichert. Die Prozessierung der FastQ-Dateien wurde mit Mothur 1.35.1 (http://www.mothur.org/) durchgeführt. Mit Hilfe des 16S Mothur-Silva SEED r119 Referenz-Alignment wurden die Sequenzen einer Phylogenie zugeordnet und Chimären durch den Uchime Algorithmus aus dem Datensatz entfernt. Die OTU-Bestimmung für verschiedenen Phylogenetische Ebenen wurde durch die Clusterung auf 97% Identitätslevel durchgeführt (cluster.split Methode) QIIME 1.9.0 (http://qiime.org/).

2.2.9 Quantifizierung von ausgewählten Resistenzgenen mit Hilfe der quantitativen Real-time PCR

Die Quantitative Real-time PCR wurde mit einem LightCycler 480 (Roche, Mannheim) durchgeführt. Die für die Real-time PCR verwendeten Primer und Sonden sind in Tab. 1 aufgelistet.

Tab. 1: Zielgene, Sequenzen und Referenzen der verwendeten Primer und Sonden für die qPCR. Zielgen Oligo Sequenz (5'-3') Referenz mecA mecA-f TGGTCTTTCTGCATTCCTGGA Francois et al., 2003 mecA-r CATTGATCGCAACGTTCAATTTAAT Böckelmann et al., 2009 mecA-p FAM-CTATGATCCCAATCTAACTTCCACATACC-BHQ-1 vanA vanA-r CTGTGAGGTCGGTTGTGCG Volkmann et al., 2004 vanA-f TTTGGTCCACCTCGCCA vanA-p (FAM)-CAACTAACGCGGCACTGTTTCCCAAT-(BHQ-1) ampC ampC-f GGGAATGCTGGATGCACAA Volkmann et al., 2004 ampC-r CATGACCCAGTTCGCCATATC ampC-p FAM-CCTATGGCGTGAAAACCAACGTGCA-BHQ-1

blaTEM TEM-f TTCCTGTTTTTGCTCACCCAG Narciso-da-Rocha et al., TEM-r CTCAAGGATCTTACCGCTGTTG 2014

blaCTX-M CTX-M-f ATGTGCAGYACCAGTAARGTKATGGC Birkett et al., 2007 CTX-M-r ATCACKCGGRTCGCCNGGRAT intl1 int-f CCTCCCGCACGATGATC Narciso-da-Rocha et al., int-r TCCACGCATCGTCAGGC 2014 16S rRNA E1052-f TGCATGGYTGTCGTCAGCTCG Wang & Qian, 2009 E1193-r CGTCRTCCCCRCCTTCC -f = forward primer, -r = reverse primer, -p = Probe (Sonde)

8 Für die quantitative Real-time PCR (qPCR) wurden sowohl Assays mit dem Farbstoff SYBR Green als auch mit Hydrolyse-Sonde verwendet. Verwendet wurden hierfür der GoTaq qPCR Mastermix und GoTaq Probe qPCR Mastermix (Promega).

Für die benötigten Standardkurven wurden PCR-Produkte von den zu untersuchenden Genen (mecA, vanA ampC blaTEM, blaCTX-M) erzeugt, mit Hilfe von Gelelektrophorese separiert und durch Elution aufgereinigt. Für die 16S rRNA-Gen Quantifizierung wurde ein PCR-Produkt von E. coli K12 verwendet. Allen qPCR-Reaktionen ging eine zweiminütige Aktivierung der Polymerase voraus.

Tab. 2: Zielgene, Oligo-Konzentrationen, PCR-Konditionen und Effizienzen der qPCR. Zielgen Konzentrationen F/R/P PCR-Konditionen Effizienz [nM] mecA 400 / 400 / 250 45 Zyklen: 95°C, 10s - 60°C, 30s - 72°C, 1s 1,897 vanA 300 / 300 / 250 45 Zyklen: 95°C, 10s - 60°C, 30s - 72°C, 1s 1,902 ampC 350 / 350 / 250 45 Zyklen: 95°C, 10s - 60°C, 30s - 72°C, 1s 1,525

blaTEM 400 / 400 / ----- 40 Zyklen: 95°C, 10s - 60°C, 20s - 72°C, 3s 1,893

blaCTX-M 350 / 350 / ----- 40 Zyklen: 95°C, 10s - 60°C, 20s - 72°C, 5 2,039 intl1 350 / 350 / ----- 40 Zyklen: 95°C, 10s - 59°C, 15s - 72°C, 5s 1,891 16S rRNA 400 / 400 / ----- 40 Zyklen: 95°C, 10 - 60°C, 20s - 72°C, 3s 1,984 F: forward primer / R: reverse primer / P: Taqman-Sonde

2.2.10 Anfertigung von Antibiogrammen/Resistenzspektren

Um Antibiogramme erstellen zu können, mussten Reinkulturen gewonnen werden. Zur Selektion von Escherichia coli wurden 250 ml Klärwerksablauf oder 250 ml Ablauf des Bodenfilters auf Membranfilterscheiben mit 0,45 µm Porendurchmesser filtriert. Dieser Filter wurde auf Endo-Agar gelegt der 10 mg l-1 Ciprofloxacin enthielt und bei 36°C über Nacht inkubiert. Die gewachsenen Kolonien wurden auf Endo-Agar zur weiteren Vereinzelung ausgestrichen und bei 36°C über Nacht inkubiert.

Die Antibiogramme oder auch Resistenzspektren wurden durch den Kooperationspartner Mikrobiologisches Labor Dr. Lohmeyer GmbH in Münster erstellt. Hierzu wurden Mikrotiterplatten (Micronaut-S MDR MRGN-Screening) im Mikrodilutionstest nach Angaben des Herstellers verwendet.

2.2.11 Überprüfung der Escherichia coli Isolate durch Sequenzierung der 16S rRNA-Gene

Die auf Endo-Agar auf Grund der Koloniefärbung selektierten E. coli Isolate wurden zur Kontrolle mit Hilfe der Sequenzierung ihrer 16S rRNA-Gene überprüft werden. Hierzu wurde von dem Isolat eine Flüssigkultur in LB-Medium (Tab. A3) erstellt und bei 36°C über Nacht inkubiert. Von der Flüssigkultur wurden 2 ml Zellen pelletiert (10.000×g, 4°C, 10 min). Das Pellet wurde mit dem SL1 Puffer des NucleoSpin Soil Kits (Macherey-Nagel) resuspendiert und in das Extraktionsröhrchen des Kits überführt. Alle weiteren Schritte wurden entsprechend der Anweisung des Herstellers durchgeführt, wobei eine Schwingmühle MM200 (Retsch) zur Disruption der Zellen eingesetzt wurde (30 s, 25 Hz.). Die 16S rRNA-Gene wurden durch PCR mit Hilfe der Primer 27F (AGRGTTTGATCMTGGCTCAG) und 907r (CCGTCAATTCCTTTRAGTTT) amplifiziert. Das PCR-Programm beinhaltete eine Denaturierung bei 95°C, 1 min gefolgt von 25 Zyklen (95°C, 20 s - 55°C, 20 s - 72°C, 20 s). Die PCR-Produkte wurden durch das GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific) aufgereinigt. Die reinen PCR-Produkte

9 wurden mit dem 27F Primer entsprechend den Vorgaben von LGC Genomics (Berlin) versetzt und dort sequenziert. Die Sequenzen wurden mit Hilfe einer Blast-Suche (Nucleotide Blast; https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast) überprüft.

2.2.12 Mikrobielle Aktivität des Bodenfiltersubstrates

Die mikrobielle Aktivität des Bodenfiltersubstrates wurde in Form seiner mikrobiellen Respirationsleistung ermittelt. Dazu wurde die Freisetzung von CO2 aus einer definierten Menge Bodenfiltersubstrat über die

Zeit bestimmt und als Respirationsrate (µmol CO2 / 24h / g Substrat) berechnet. Je Probeentnahmepunkt wurde in 10 cm Abschnitten eine Substratprobe entnommen, von der ca. 5 g Substrat in 20 ml Glasfläschchen überführt, die anschließend gasdicht mit einem Septum verschlossen wurden. Nach einer Inkubationszeit von einem Tag wurden 250 µl des Headspace-Volumens beprobt und mit einem Gaschromatographen analysiert. Abschließend folgte die Trocknung des Filtersubstrats in den Fläschchen, um die Respirationsrate auf die exakte und nach Trocknung vergleichbare Menge Substrat beziehen zu können.

10 3 Ergebnisse 3.1 Bakterielle Zellzahlen DAPI, KbE sowie E. coli und Coliforme

Die Eliminationsleistung des Bodenfilters wurde durch eine molekulare Methode und durch klassische Kultivierungen bestimmt. Bei den Kultivierungen wurden die Gesamtheit der Kolonie bildenden Einheiten (KbE) und die Kolonien von Indikatororganismen wie Escherichia coli sowie von coliformen Bakterien ermittelt.

3.1.1 Zellzahlen nach fluoreszierender Markierung durch DAPI

Die durch DAPI-Färbung bestimmten Zellzahlen liegen für den Klärwerksablauf und den Bodenfilterablauf in der Größenordnung von Millionen Zellen pro Milliliter (Abb. 2). Die im Klärwerksablauf gezählten Zellen waren bis auf an zwei Terminen stets höher als im Filterablauf. Der niedrigste Wert lag bei etwa 300.000 Zellen und der höchste bei 13,2 Millionen. Hier zeigt sich die sehr ausgeprägte Heterogenität des Klärwerkablaufes bei Schwankungen der Zellzahlen um den Faktor 44.

Abb. 2: Zellzahlen (DAPI) ermittelt durch Fluoreszenzmikroskopie aus dem Klärwerks (KA)- und Filterablauf (FA). Fehlerbalken: Standardfehler (n=5).

Der Ablauf des Bodenfilters zeigt fast immer niedrigere Zahlen als der Klärwerksablauf. Die maximal ermittelten Werte liegen bei etwa 4,7 und die niedrigsten bei etwa 1,3 Milionen Zellen. Die Schwankungen liegen hier bei einem Faktor von 3,6. Die im Bodenfilterablauf ermittelten Zellzahlen unterliegen geringeren Schwankungen als die im Klärwerksablauf (Abb. 2).

11 3.1.2 Zahl der Kolonie bildenden Einheiten (KbE)

Die Zahl der KbE liegt im Klärwerksablauf im vier- bis fünfstelligen Bereich. Wie auch schon bei den DAPI-Zahlen zu erkennen, zeigt sich nicht an allen Beprobungsterminen eine Reduktion der Zellzahlen. Bis auf an zwei Terminen waren die KbE des Klärwerksablauf jedoch höher als im Filterablauf. Die höchste Zahl der KbE lag bei 82000 und die niedrigste bei 5540 Zellen pro Milliliter (Abb. 3). Die Schwankung der KbE liegt bei Faktor 14. Die im Filterablauf ermittelten KbE lagen bei maximal 29820 und minimal 914 Kolonien. Das ist eine Schwankung um etwa den Faktor 32. Die Schwankungen der KbE im Filterablauf (Standardfehler) sind ausgeprägter als im Klärwerksablauf, liegen jedoch auf einem niedrigeren Niveau. Insbesondere in den Sommermonaten kommt es zu einem deutlichen Anstieg der KbE im Klärwerksablauf, der sich auch im Filterablauf widerspiegelt.

Abb. 3: Koloniezahlen (KbE) ermittelt durch Kultivierung aus dem Klärwerks (KA)- und Filterablauf (FA). Fehlerbalken: Standardfehler (n=5).

3.1.3 Kolonienzahlen von E. coli und Coliformen

Die Zahl der Kolonien von E coli und Coliformen (Abb. 4) liegen im zwei bis vierstelligen Bereich. Anders als bei den DAPI-Zahlen und den KbE ist eine Reduktion der Indikatororganismen an jedem der beprobten Termine sichtbar. Die höchste Zahl im Klärwerksablauf liegt bei 1978 und die niedrigste bei rund 15 Kolonien. Die Werte schwanken um den Faktor 131. Für den Bodenfilterablauf wurden Werte von maximal 388 und minimal 7 Kolonien ermittelt. Die Werte des Filterablaufes schwanken damit um den Faktor 55. Bei den Indikatororganismen unterliegt der Klärwerksablauf größeren Schwankungen als der Filterablauf. Insbesondere im Zeitraum von Mitte Juni bis Mitte September zeigt sich ein deutlicher Anstieg von E. coli und Coliformen im Klärwerksablauf, der sich aber nur sehr schwach im ersten Monat dieses Zeitraums im Filterablauf widerspiegelt.

12

Abb. 4: Koloniezahlen (E. coli und Coliforme) ermittelt durch Kultivierung aus dem Klärwerks (KA)- und Filterablauf (FA). Fehlerbalken: Standardfehler (n=5).

3.1.4 Bakterielle Eliminationsleistung des Bodenfilters

Basierend auf den Zellzahlen ermittelt durch DNA-Färbung und Kultivierung wurde die Eliminationsleistung des Bodenfilters in Prozent bestimmt (Tab. 3). Nur an zwei der untersuchten Terminen, am 21.05.15, 29.07.15 zeigte die DAPI-Zählung keine Verringerung der Bakterien durch den Bodenfilter. Die Verringerung der Bakterien lag mindestens bei rund 19 Prozent und erreichte maximal fast 89 Prozent. Auch die KbE zeigten am 21.05.15 und auch am 30.09.15 keine Verringerung der Werte, wobei in beiden Fällen für beide Zählungen (KbE und DAPI) die Zahlen im Filterablauf auf gleichbleibend niedrigem Niveau lagen. An allen Terminen zeigten die Zahlen von E. coli und Coliformen eine Verringerung dieser Indikatorbakterien durch den Bodenfilter. Dabei lag die Elimination bei minimal 26,5 und maximal bei 94,6 Prozent mit einer mittleren Eliminationsleistung in den Sommermonaten von 85%. Im Mittel ergeben die DAPI Werte eine Reduktion der Bakterien aus dem Klärwerksablauf von 65,88%, verteilt über den Zeitraum der Beprobungstermine. Bei den KbE-Zahlen zeigt sich eine Elimination der bakteriellen Keime um durchschnittlich 57,05%. Bei den Koloniezahlen von E. coli und den Coliformen reduziert der Bodenfilter die bakterielle Fracht um durchschnittlich 63,56% berechnet für den Beprobungszeitraum. Die mittlere Eliminationsleistung des Bodenfilters bewegt sich also entsprechend der drei Bestimmungsmethoden (DAPI, KbE und E. coli/ mit Coliformen) um die 60%.

13 Tab. 3: Eliminationsleistung des Bodenfilters von Mikroorganismen in Prozent. Termine DAPI KbE E. coli und Coliforme

30.04.2015 52.8 83.5 26.5 21.05.2015 * * 30.3 27.05.2015 63.8 39.1 19.0 18.06.2015 64.9 48.5 94.6 25.06.2015 69.4 55.2 80.4 01.07.2015 67.2 87.5 74.3 23.07.2015 18.7 - - 29.07.2015 * - - 18.08.2015 81.8 63.6 89.3 03.09.2015 70.2 50.1 87.8 30.09.2015 69.5 * 40.3 20.10.2015 59.6 68.0 48.7 29.10.2015 88.7 56.7 84.4 14.12.2015 84.0 18.3 87.2 - keine Werte vorhanden; * keine Elimination der Zellzahlen

3.2 Hochdurchsatz-Sequenzierung bakterieller 16S rRNA Genfragmente

Die Hochdurchsatz-Sequenzierung bakterieller 16S rRNA Genfragmente (Next Generation Sequencing) durch die Illumina-Technik (MiSeq) wurde durchgeführt, um den Effekt des Bodenfilters auf den Klärwerksablauf hinsichtlich der Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft zu untersuchen.

3.2.1 Clusteranalyse der bakteriellen Klassen

Zunächst wurden unter den sogenannten Operational Taxonomic Units (OTU) die dominanten und somit relevanten Klassen der Bakterien ermittelt. Hierbei wurden 127 Klassen bestimmt. Für eine Visualisierung dieser Klassen und deren Häufigkeitsverteilung in den Klärwerks- und Bodenfilterabläufen zu den beprobten Terminen und den unterschiedlichen Tiefen des Filtersubstrats (0-10 cm, 30-40 cm und 70- 80 cm) wurde eine Heat-Map mit Hilfe der Software R [Rde15] erstellt (Abb. 5). Gleichzeitig wurde von den bakteriellen Klassen eine Clusteranalyse nach Bray Curtis durchgeführt, welche die Ähnlichkeiten der untersuchten Proben verdeutlichen soll. Die Analyse zeigt, dass zwar viele bakterielle Klassen innerhalb der Proben vorkommen, es jedoch nur wenige Klassen gibt deren Anteil über 5 Prozent liegt. Zu den Dominanten Klassen zählen die Acidobacteria und die Planctomycetacia, die vor allem in den Filtersubstraten vorkommen. Auch die bisher nicht weiter charakterisierte Gruppe der Candidate Division OD1 die häufiger in den Abläufen und in geringeren OTU-Zahlen im Filtersubstrat vorkommt. Die Gruppen der Alpha-, Beta-, Gamma und Delta- Proteobacteria kommen sowohl in den Abläufen als auch in den Substraten vor. Basierend auf den OTU-Zahlen der bakteriellen Klassen ergeben sich schon hier eindeutige Clusterbildungen von einem Großteil der Proben von Klärwerks- und Filterablauf sowie den Filtersubstraten. Nur wenige Proben des Filterablaufes (30.04 und 27.05.15) erscheinen hier als eigene Gruppe. Jeweils eine Probe aus dem Klärwerks- und Filterablauf, beide vom 30.09.15 gruppieren stärker mit den Filtersubstraten.

14 A2 15 5 15 4 27 FA 15 30 7 FA 15 6 23 15 KA 7 18 KA 1 15 6 KA 15 5 25 KA 15 4 27 KA 30 KA 15 12 14 KA 15 10 15 20 KA 9 15 10 29 KA 3 15 8 KA 15 7 18 15 KA 7 29 KA 1 15 6 FA 15 6 25 FA 18 15 FA 15 10 7 20 FA 15 7 23 FA 15 8 29 15 FA 9 18 FA 3 15 FA 12 14 15 FA 10 15 9 29 FA 15 9 30 KA 30 FA 0 FS - 0 FS - 0 FS - 0 FS - 0 FS - 0 FS - 0 FS - 0 FS - 0 FS - 0.0. 0.0. 0.0. 0.0. 1B 1A 1C 4C 8A 8C 8B 4A 4B 0. .0 . .0 . .0 . .0 .. . .0 . .0 . .0 ...... 0 0. .0 . .0 . .0 . .0 . .0 ...... 0 . .0 . .0

A cidobacteria A cidobacteria Holophagae A cidobacteria S ubgroup 22 A cidobacteria S ubgroup 26 Acidobacteria unclassified Actinobacteria Acidimicrobiia A ctinobacteria A ctinobacteria Cor iobacter iia Actinobacteria MB−A2−108 Actinobacteria Nitr iliruptoria Actinobacteria OPB41 A ctinobacteria Rubro A ctinobacteria Ther moleophilia A ctinobacteria unclassified A r matimonadetes A rmatimonadia A rmatimonadetes Chthonomonadetes A rmatimonadetes unclassified BD1−5 unclassified BHI80−139 unclassified B acteroidetes B D2−2 Bacteroidetes BSV13 B acteroidetes B acteroidia B acteroidetes Cytophagia B acteroidetes Fla vobacter iia B acteroidetes S B −1 B acteroidetes S B −5 B acteroidetes S M1A 07 B acteriodetes S phingobacter iia Bacteroidetes V C2.1_Bac22 B acteroidetes WCHB 1−32 B acteroidetes unclassified B acteroidetes vadin HA17 Candidate division B RC1 unclassified Candidate division OD1 unclassified Candidate division OP 11 unclassified Candidate division OP 3 unclassified Candidate division S R1 unclassified Candidate division TM7 unclassified Candidate division WS 3 unclassified Candidate division WS 6 unclassified Chlamydiae Chlorobia Igna vi Chlorobibacteria unclassified Chloroflexi A naerolineae Chloroflexi A rdenticatenia Chlorofle xi Caldilineae Chlorofle xi Chlorofle xia Chlorofle xiGitt−GS−136 Chlorofle xi JG30−KF−CM66 Chloroflexi KD4−96 Chlorofle xi K tedono Chlorofle xi MSB−5B 2 Chlorofle xi P2−11E Chlorofle xi S085 Chloroflexi S A R202 clade Chlorofle xi SHA−26 Chloroflexi TK10 Chlorofle xi Thermomicrobia Chlorofle xi unclassified Cyano bacteria Cyanobacteria ML635J−21 Cyanobacteria Melaina Cyanobacteria unclassified Deferr ibacteres Deinococci E lusimicrobia Fibro bacteria Bacilli Firmicutes Clostr idia Fir micutes E rysipelotr ichia Fir micutes Negativicutes Fi r mi cutes OP B 54 Firmicutes unclassified Fusobacter iia GOUTA4 unclassified Gemmatimonadetes JL−ETNP−Z39 unclassified Lentisphaer ae DE V 055 Lentisphaer ia Oligosphaer ia Lentisphaer ae P B S −III−20 Lentisphaer ae RFP 12 gut group Lentisphaer ae WCHB 1−25 Lentisphaer ae WCHB 1−41 Lentisphaer ae unclassified NPL−UPA2 unclassified Nitrospir a OC31 unclassified P lanctomycetes 028H05−P−BN−P5 Planctom ycetes BD7−11 P lanctomycetes OM190 Phycisphaer ae Planctomycetes Pla3 lineage Planctomycetes Pla4 lineage Planctomycetacia P lanctom ycetes S GS T604 Planctomycetes SPG12−401−411−B72 Planctom ycetes unclassified P lanctom ycetes vadinHA 49 A lphaproteo bacteria B etaproteo bacteria Deltaproteo bacteria E psilonproteo bacteria Gammaproteo bacteria P roteobacteria MA CA −EFT26 P roteobacteria S C3−20 Proteobacteria SPOTS OC T00m83 P roteobacteria TA18 P roteobacteria unclassified SHA−109 un classified S M2F11 unclassified S pirochaetes S ynergistia TA 06 unclassified TM6 unclassified Mollicutes Ther motogae Verr ucomicrobia OP B 35 soil group Verr ucomicrobia Opitutae Verr ucomicrobia S −BQ2−57 soil group Verr ucomicrobia S parto bacteria Verr ucomicrobia UA 11 V err ucomicrobia Incer tae S edis Verr ucomicrobia Verr ucomicrobiae V err ucomicrobia unclassified WCHB1−60 unclassified Relative Abundanz [%] 025 Abb. 5:Heatmap und Cluster-Analyse (UPGMA, Bray Curtis) der ermittelten bakteriellen Klassen in den Abläufen und Substratproben. Klärwerksablauf (KA), Filterablauf (FA), Filtersubstrat (FS). A, B, C: Wiederholungen der Substratproben innerhalb des Bodenfilters.

15 Für eine deutlichere Darstellung der bedeutendsten bakteriellen Klassen mit mehr als 2 % relativem OTU-Anteil in mindestens einer Probe wurde die Darstellung der Anteile als Balkengrafik gewählt. Die bedeutendsten Klassen innerhalb der Proben mit mindestens 2 % Anteil an den Sequenzen sind die Acidobacteria, Actinobacteria, Candidate phylum TM6 BD1-5, Bacteroidia, Flavobacteria, Sphingobacteriia, Candidate Division OD1 (unclassified), Candidate Division TM7 (unclassified), Chlamydiae, Gemmatimonadetes, Planctomycetes Phycisphaerae, Planctomycetes Planctomycetacia, Alpha-Proteobacteria, Beta-Proteobacteria, Delta-Proteobacteria, Gamma-Proteobacteria, Proteobacteria (unclassified) und Candidate Phylum TM6 (unclassified) (Abb. 6). Besonders deutlich werden die Unterschiede zwischen den Abläufen, betrachtet man die Anteile der Acidobacteria, Chlamydiae und der unbekannten Klasse TM6, alle Gruppen jeweils grau gefärbt.

Termine Prozentuale Anteile der Bakterienklassen

0 12 24 36 48 60 72 84 96 % FA 30.04.15 FA 27.05.15 FA 18.06.15 FA 25.06.15 FA 01.07.15 FA 23.07.15 FA 29.07.15 FA 18.08.15 FA 03.09.15 FA 30.09.15 FA 20.10.15 FA 29.10.15 FA 14.12.15 KA 30.04.15 KA 27.05.15 KA 18.06.15 KA 25.06.15 KA 01.07.15 KA 23.07.15 KA 29.07.15 KA 18.08.15 KA 03.09.15 KA 30.09.15 KA 20.10.15 KA 29.10.15 KA 14.12.15

Acidobacteria; Acidobacteria Chlamydiae; Chlamydiae Actinobacteria; Actinobacteria Gemmatimonadetes; Gemmatimonadete BD1-5; unclassified Planctomycetes; Phycisphaerae Bacteroidetes; Bacteroidia Planctomycetes; Planctomycetacia Bacteroidetes; Flavobacteriia Proteobacteria; Alphaproteobacteria Bacteroidetes; Sphingobacteriia Proteobacteria; Betaproteobacteria Bacteroidetes; unclassified Proteobacteria; Deltaproteobacteria Candidatedivision OD1; unclassified Proteobacteria; Gammaproteobacteria Candidatedivision TM7; unclassified Proteobacteria; unclassified TM6; unclassified Abb. 6: Bakterielle Klassen mit mindestens 2% OTU Anteil in einer Probe. Klärwerksablauf (KA), Filterablauf (FA), Filtersubstrat (FS).

16 Im Klärwerksablauf hingegen überwiegen die Actinobacteria (blau), die Candidate Division OD1 (gelb) und die Beta-Proteobacteria (braun). Im Vergleich der Filtersubstrate zu den Abläufen am 29.10.15 fällt auf, dass besonders die Acidobacteria (grau) und die Actinobacteria (blau) stärker im Filtersubstrat vorkommen. Etwas geringer als in den Abläufen ist auch das Vorkommen der nicht näher beschriebenen Gruppe BD1-5 (orange).

Substrate/ Prozentuale Anteile der Bakterienklassen Te rmi n 0 12 24 36 48 60 72 84 96 % FS -10 A FS -10 B FS -10 C FS -40 A FS -40 B FS -40 C FS -80 A FS -80 B FS -80 C FA 29.10.15 KA 29.10.15

Acidobacteria; Acidobacteria Chlamydiae; Chlamydiae Actinobacteria; Actinobacteria Gemmatimonadetes; Gemmatimonadete BD1-5; unclassified Planctomycetes; Phycisphaerae Bacteroidetes; Bacteroidia Planctomycetes; Planctomycetacia Bacteroidetes; Flavobacteriia Proteobacteria; Alphaproteobacteria Bacteroidetes; Sphingobacteriia Proteobacteria; Betaproteobacteria Bacteroidetes; unclassified Proteobacteria; Deltaproteobacteria Candidatedivision OD1; unclassified Proteobacteria; Gammaproteobacteria Candidatedivision TM7; unclassified Proteobacteria; unclassified TM6; unclassified Abb. 7: Bakterielle Klassen der Filtersubstrate (FS) und der mit mindestens 2% OTU Anteil. Klärwerksablauf (KA), Filterablauf (FA), Filtersubstrat (FS).

3.2.2 Clusteranalyse der bakteriellen Gattungen

Aus den bakteriellen Klassen ließen sich 885 Gattungen ableiten, worunter sich aber auch verschiedene und nach heutigem Wissenstand nicht weiter differenzierbare (unclassified) Gattungen befinden. Die Analyse der bakteriellen Gattungen der Abläufe aus dem Klärwerk und dem Bodenfilter sowie der Filtersubstrate aus unterschiedlichen Tiefen des Filterkörpers zeigt eine klare Gruppierung von den Abläufen und den Substraten (Abb. 8). Dabei zeigen die Filtersubstrate allgemein höhere Ähnlichkeit zueinander mit mindestens 74%. Es ist ein Trend der Bildung einzelner Cluster in Abhängigkeit der beprobten Tiefen erkennbar. Es deutet sich an, dass die Proben aus der Tiefe bis -10 cm eine Gruppierung zeigt, wobei sich die Probe FS-40 C innerhalb des Clusters befindet. Eigene kleinere Gruppierungen bilden auch die Proben FS -80 A und FS -80 C sowie die Proben FS -40 A, FS -40 B und FS -80 B. Dadurch zeigt sich eine Zonenbildung von unterschiedlichen Bakterienpopulationen im Bodenfiltersubstrat bis zu einer Tiefe von 40 cm und von 40 bis 80 cm. Deutlich ist auch, dass sich die Substrate, die am 29.10.15 dem Filter entnommen wurden, stets von den Proben des Klärwerks- und Bodenfilterablaufes unterscheiden. Die bakteriellen Populationen der Termine aus dem Filterablauf bilden ebenfalls ein eigenes Cluster, wobei zwei Termine (30.04.15 und 27.05.15) sich relativ stark auf einem eigenen Arm ausgrenzen

17 (Abb. 8). Eine Gruppierung entsprechend der Beprobungszeit und somit Jahreszeit ist hier nicht zu erkennen, da Termine aus dem August und Dezember zusammen in eine Gruppe fallen. Bei den Proben aus dem Klärwerksablauf hingegen deutet sich eine leichte Gruppierung entsprechend der Beprobungstermine oder auch entsprechend der Jahreszeiten an. Das große Cluster der Termine des Klärwerksablaufes untergliedert sich in zwei kleinere Gruppierungen. In die eine Gruppe fallen die Termine vom 30.04 bis zum 29.07.15, die zweite Gruppierung besteht aus den Terminen vom 18.08 bis 14.12.15.

0.48 0.54 0.60 0.66 0.72 0.78 0.84 0.90 0.96 Ähnlichkeit [%]

KA 14.. 1215 KA 18.0 8 . 15 KA 0.0. 3 9 15 KA 20.. 1015 KA 29.. 1015 KA 30.0 9 . 15 KA 0.0. 1 7 15 KA 18.0 6 . 15 KA 25.0 6 . 15 KA 23.0 7 . 15 KA 29.0 7 . 15 KA 27.0 5 . 15 KA 30.0 4 . 15 FA 27.0 5 . 15 FA 30.0 4 . 15 FA 14.. 12 15 FA 18.0 8 . 15 FA 0.0. 3 9 15 FA 23.0 7 . 15 FA 29.0 7 . 15 FA 20.. 10 15 FA 29.. 10 15 FA 30.0 9 . 15 FA 0.0. 1 7 15 FA 18.0 6 . 15 FA 25.0 6 . 15 FS -8A 0 FS -8C 0 FS -4A 0 FS -4B 0 FS -8B 0 FS -1B 0 FS -1C 0 FS -4C 0 FS -1 0 A Abb. 8: Cluster-Analyse (UPGMA, Bray-Curtis) der bakteriellen OTU auf Gattungsebene von Klärwerksablauf (KA), Filterablauf (FA) und Filtersubstrat (FS; Tiefen 0-10, 30-40 und 70-80 cm).

3.3 Quantifizierung von Resistenzgenen mit Hilfe der quantitativen Real-time PCR

Die Quantifizierung von ausgewählten Resistenzgenen sollte Informationen darüber liefern, ob das biologische Bodenfilterverfahren zu Veränderungen der quantitativen Zusammensetzung von bakteriellen Resistenzgenen führt. Hierzu wurden Resistenzgene gewählt, die bei Krankenhaus relevanten Keimen vorkommen. Untersucht wurden die Resistenzgene von multiresistenten Staphylococcus aureus MRSA (Methicillin Resistenz, mecA), Vancomycin resistenten Enterokokken VRE (Vancomycin Resistenz, vanA) und Beta-Lactam resistente Bakterien wie z.B. Escherichia coli und Klebsiella-Stämmen (ampC, blaTEM, blaCTX-M). Das Klasse 1 Integrase-Gen (intl1) wurde ausgewählt, weil es sich hier um einen Baustein

18 eines komplexen genetischen Elementes handelt, welches zwischen Bakterien horizontal übertragbar ist und eine Vielzahl an Resistenzgenen tragen kann. Die ermittelten Kopienzahlen der Resistenzgene (Tab. 4 und Tab. 5) wurden auf die ebenfalls durch die Real-time PCR ermittelten bakteriellen 16S rRNA Gene bezogen. Um den Vergleich der Werte zwischen Klärwerks- und Bodenfilterablauf einfacher zu machen, wurden die Werte für das jeweilige Gen auf denselben Exponenten gebracht.

Tab. 4: Zahl der Resistenzgene pro 16S rRNA Genkopie für vanA, mecA und ampC. Termine Resistenzgene mecA vanA ampC[1] KA FA KA FA KA FA

30.04.15 n.d. n.d. n.d. n.d. 11.91 n.d. 27.05.15 n.d. n.d. n.d. n.d. 32.53 61.98 18.06.15 n.d. n.d. n.d. n.d. 49.14 83.11 25.06.15 n.d. n.d. n.d. n.d. 73.90 217.21 01.07.15 n.d. n.d. n.d. n.d. 139.65 70.89 23.07.15 n.d. n.d. n.d. n.d. 56.57 108.31 29.07.15 n.d. n.d. n.d. n.d. 29.64 402.85 18.08.15 n.d. n.d. n.d. n.d. 11.45 14.20 03.09.15 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 16.01 30.09.15 n.d. n.d. n.d. n.d. 6.60 n.d. 20.10.15 n.d. n.d. n.d. n.d. 9.67 35.69 29.10.15 n.d. n.d. n.d. n.d. 1253.87 7.47 14.12.15 n.d. n.d. n.d. n.d. 53.62 297.64 n.d. = nicht detektierbar; [1] : alle Werte mit 10-4 Exponenten; KA: Klärwerksablauf; FA: Filterablauf

In Tab. 4 sind die Werte für mecA, vanA und ampC festgehalten. Zu keinem der 13 Beprobungstermine konnte im Klärwerks- und Bodenfilterablauf Genkopien von mecA und vanA nachgewiesen werden. Für ampC konnte an fast allen Terminen die Genkopienzahl ermittelt werden. Am 03.03.2015 lag die Kopienzahl unterhalb der Nachweisgrenze und am 30.04 und am 30.09.2015 waren im Bodenfilterablauf keine Gene nachweisbar. Die Kopienzahl von ampC schwankt sowohl im Klärwerksablauf als auch im Bodenfilterablauf über den Zeitraum der Beprobungen. Der höchste Wert im Klärwerksablauf beträgt 1253,87×10-4 Genkopien pro 16S rRNA-Genkopie der niedrigste Wert beträgt 6,6×10-4. Der im Filterablauf höchste ermittelte Wert liegt unterhalb des höchsten Wertes vom Klärwerksablauf und beträgt 402,85×10-4. Der niedrigste Wert liegt bei 7,47×10-4 und damit etwa auf dem Niveau des Wassers aus dem Klärwerk. Die für den Bodenfilterablauf ermittelten Genkopienzahlen von ampC liegen an neun von 13 Beprobungsterminen über den Werten des Klärwerksablaufes. In beiden Abläufen wurden über den Zeitraum der Beprobungen starke Schwankungen der Genkopienzahl von ampC ermittelt. Die Werte zeigen keine Tendenz zu trendartigen erhöhten oder erniedrigten Zahlen während warmer Sommertermine oder kalter Herbst- und Wintertermine. Bildet man den Mittelwert der Kopienzahlen über den Beprobungszeitraum so beträgt die Kopienzahl für den Klärwerksablauf 132,96×10-4 und 109,64×10-4 für den Bodenfilterablauf.

19 Für die Gene blaTEM, blaCTX-M und intl1 konnte an allen Terminen die Kopienzahl bestimmt werden (Tab. 5). Ebenso wie bei ampC kann kein jahreszeitlicher Trend der Genkopienzahlen beobachtet werden. Über den gesamten Beprobungszeitraum zeigen sich mal höhere und mal niedrigere Werte.

Tab. 5: Zahl der Resistenzgene pro 16S rRNA Genkopie für blaTEM, blaCTX-M und intl1. Termine Resistenzgene [1] [2] [2] blaTEM blaCTX-M intl1 KA FA KA FA KA FA

30.04.15 11.2 6.1 27.78 107.10 67.56 26.47 27.05.15 11.8 28.6 41.60 63.89 66.22 27.48 18.06.15 29.5 23.6 21.56 119.10 189.71 42.15 25.06.15 30.7 73.1 20.77 117.52 88.08 34.66 01.07.15 35.4 9.8 123.75 33.61 179.43 27.24 23.07.15 14.0 10.4 32.96 125.54 183.05 27.95 29.07.15 6.5 3.8 21.01 148.67 111.95 24.68 18.08.15 19.7 0.9 3.54 16.32 75.58 59.30 03.09.15 19.6 4.8 6.59 20.58 124.74 107.42 30.09.15 5.4 1.2 15.67 22.00 65.04 345.51 20.10.15 14.5 12.9 6.16 12.12 89.15 70.42 29.10.15 5.7 7.5 4.54 9.36 112.05 74.70 14.12.15 74.4 3.5 7.24 7.04 305.86 106.08 n.d. = nicht detektierbar; [1] : alle Werte mit 10-6 Exponenten; [2]: alle Werte mit 10-3 Exponenten; KA: Klärwerksablauf; FA: Filterablauf

Die für den Bodenfilterablauf ermittelten Kopienzahlen von blaTEM liegen nur an drei Terminen über denen des Klärwerksablaufes. Der höchste ermittelte Wert kommt im Klärwerksablauf vor und liegt bei 74,4×10-6 Kopien pro 16S rRNA Genkopie (14.12.15), der niedrigste Wert beträgt 5,4×10-6. Die größte Kopienzahl im Ablauf des Bodenfilters wurde am 25.06.15 ermittelt und beträgt 73,1×10-6, die kleinste Zahl beträgt -6 1,2×10 für den Termin vom 30.09.15. Die Kopienzahl von blaTEM war allgemein niedriger und lag nur an drei von 13 Terminen über der Zahl des Klärwerkablaufes. Bildet man den Mittelwert der Kopienzahlen über den Beprobungszeitraum so beträgt die Kopienzahl für den Klärwerksablauf 21,42×10-6 und 14,32×10-6 für den Bodenfilterablauf.

Bei den Kopienzahlen von blaCTX-M verhält es sich anders als bei blaTEM und so liegt die Zahl der im Bodenfilterablauf befindlichen Kopien an elf von 13 Terminen oberhalb der des Klärwerksablaufes, wobei die Werte an manchen Terminen (27.05, 30.09 und 20.10.15) nicht immer viel höher als die Werte des Klärwerksablaufes sind. Die höchste Kopienzahl im Bodenfilter wurde am 29.07.15 ermittelt und betrug 148,67×10-3. Die niedrigste Zahl von 7,04×10-3 wurde am 14.12.15 detektiert. Dagegen stehen die höchste Zahl von 123,75×10-3 und die niedrigste Zahl von 3,54×10-3 im Klärwerksablauf. Bildet man den Mittelwert der Kopienzahlen für über den Beprobungszeitraum so betrug die Kopienzahl für den Klärwerksablauf 25,63×10-3 und 61,75×10-3 für den Bodenfilterablauf. Die Kopienzahl des Klasse 1 Integrase-Gens intl1 lag nur an einem Termin (30.09.15) oberhalb der Werte des Klärwerkablaufes und bildet hier auch schon den größten Wert von 345,51×10-3 Genkopien pro 16S rRNA-Gen. Der kleinste Wert lag am 29.07.15 vor und betrug 24,68×10-3. Im Klärwerksablauf fanden sich fast immer höhere Werte wobei der höchste 305,86×10-3 und der niedrigste 65,04×10-3

20 betrug. Bildet man den Mittelwert der Kopienzahlen für über den Beprobungszeitraum so betrug die Kopienzahl für den Klärwerksablauf 127,57×10-3 und 74,93×10-3 für den Bodenfilterablauf. Bezüglich der Mittelwerte der ermittelten Genkopien aller Gene von allen untersuchten Terminen ergibt sich eine Reihenfolge für die Größe der nachgewiesenen Kopienzahl. Am häufigsten kommen Genkopien von intl1 vor, gefolgt von blaCTX-M und ampC. Die geringsten Zahlen ergeben sich für Genkopien von blaTEM.

3.4 Antibiogramme / Resistenzspektren

Die Erstellung von Antibiogrammen sollte Information darüber liefern, ob im Ablauf des Bodenfilters vermehrt multiresistente Keime gefunden werden. Abweichend von der ursprünglichen Planung wurden nur Stämme der Spezies E. coli und nicht zusätzlich Coliforme Bakterien analysiert. Diese Entscheidung war notwendig, um eine größere und somit repräsentativere Zahl Bakterien gleicher Art untersuchen zu können und so Ergebnisse mit höherer Aussagekraft zu erhalten. Bei der Isolierung der Reinkulturen aus den Wasserproben des Klärwerks und des Bodenfilters fiel auf, dass ebenfalls Pilze auf den Agarplatten wuchsen. Vor allem Proben des Klärwerks waren höher belastet (Tab. 6).

Tab. 6: Kolonienzahlen auf selektivem Endo-Agar (mit Ciprofloxacin) pro Liter. Organismus Klärwerksablauf Bodenfilterablauf Mittelwert Standardfehler Mittelwert Standardfehler Escherichia coli 14 1,73 3 0,58 Coliforme 62 4,62 26 2,89 Pilze 11 2,08 3 0

Die Werte in Tab. 6 beziehen sich auf die ersten Isolierungsversuche. Für spätere Isolierungen wurde zur Vermeidung von Pilzkolonien das Antibiotikum Cycloheximid eingesetzt. Die Werte zeigen eine deutlich geringere Kolonienzahl von Ciprofloxacin resistenten E. coli und Coliformen sowie Pilzen pro Liter im Filterablauf im Vergleich zum Klärwerksablauf. Bei der Isolierung der E. coli Reinkulturen fiel zusätzlich auf, dass die Stämme nur schwer zu vereinzeln waren. Dies machte sich durch eine unklare Färbung der Kolonie auf dem chromogenen Selektivmedium (Endo-Medium) bemerkbar. Die zum Vergleich herangezogenen Referenzstämme DSM 1103 (Escherichia coli) und DSM 30053 (Enterobacter aerogenes) zeigten eine eindeutige Koloniefärbung auf dem Festmedium. Versuche, die Zellen einer Kolonie durch weiteres Ausstreichen auf Endo-Agar zu vereinzeln, waren sehr zeitintensiv und führten nur in wenigen Fällen zum Erfolg. Der Versuch der Vereinzelung wurde pro Stamm nur einfach durchgeführt, um die Gefahr der Veränderung der Resistenzeigenschaften des Isolates zu vermeiden. Die aus dem Klärwerks- und Bodenfilterablauf isolierten Reinkulturen wurden deshalb an verschiedenen Beprobungsterminen auf Endo-Agar isoliert und dann an den Kooperationspartner Mikrobiologisches Labor Dr. Lohmeyer GmbH übergeben, wo anschließend die Antibiogramme der Isolate erstellt wurden. Um einen Überblick über die Resistenzhäufigkeit in den jeweils 50 Stämmen aus dem Klärwerksablauf und dem Filterablauf zu erhalten, wurden die eindeutigen Resistenzen und die intermediären Resistenzen der Stämme in Abb. 9a, Abb. 9b und Abb. 9c aufgelistet. Die Antibiogramme oder auch Resistenzmuster

21 der untersuchten E. coli Isolate aus den Abläufen zeigen insgesamt Unterschiede. Allen Stämmen gemeinsam ist eine Resistenz gegen Ciprofloxacin (Abb. 9c) da mit diesem Antibiotikum selektiert wurde. Es fällt auf, dass bestimmte eindeutige Resistenzen ausschließlich im Klärwerks- oder im Filterablauf vorkommen. Aus dem Klärwerksablauf besitzen 84 % der Isolate eine Resistenz gegen 8 µg/ml und noch 42 % gegen 16 µg/ml Chloramphenicol. Im Filterablauf sind lediglich intermediär resistente Isolate zu finden. Ähnliches gilt bei Temocillin, wofür jedoch nur eine Resistenz und eine intermediäre Resistenz gegen 32 µg/ml gefunden wurden. Im Filterablauf gab es nur zwei intermediäre Resistenzen. Nur im Bodenfilterablauf (Abb. 9a) finden sich Resistenzen gegen Amikazin (4, 8, 16 µg/ml), Ceftazidim (alle Konzentrationen), und Cefotaxim (beide Konzentrationen). Im Klärwerksablauf sind nur intermediäre Resistenzen vorhanden und insgesamt mit deutlich niedrigeren Zahlen.

Konzentrationen Klärwerksablauf Bodenfilterablauf Antibiotika / Zusätze 50 40 30 20 10 0 10 20 30 40 50 Piperracillin 16 µg/ml Piperracillin 8 µg/ml Piperacillin / Tazobactam 64/4 µg/ml Piperacillin / Tazobactam 32/4 µg/ml Piperacillin / Tazobactam 16/4 µg/ml Piperacillin / Tazobactam 8/4 µg/ ml Piperacillin / Tazobactam 4/4 µg/ ml Tigecyclin 4 µg/ ml Tigecyclin 2 µg/ ml Tigecyclin 1 µg/ml Tigecyclin 0,5 µg/ml Tigecyclin 0,25 µg/ ml Levofloxacin 4 µg/ml Levofloxacin 2 µg/ml Levofloxacin 1 µg/ml Levofloxacin 0,5 µg/ml Colistin 8 µg/ml Colistin 4 µg/ml Colistin 2 µg/ml Colistin 1 µg/ml Fosfomycin 64 µg/ml Fosfomycin 32 µg/ml Fosfomycin 16 µg/ml Fo sfo myci n 8 µg /m l Trimethoprim / Sulfamethoxazol 8/ 152 µg/ml Trimethoprim / Sulfamethoxazol 4/ 76 µg/ml Trimethoprim / Sulfamethoxazol 2/ 38 µg/ml Trimethoprim / Sulfamethoxazol 1/ 19 µg/ml Abb. 9a: Addierte Resistenzen der jeweils 50 E. coli Antibiogramme aus dem Klärwerks- und Filterablauf. Dunkle Balken: eindeutige Resistenzen; helle Balken: intermediären Resistenzen.

Bei Ceftazidim mit APB gibt es bei den Bodenfilterisolaten ebenfalls Resistenzen gegen alle getesteten Konzentrationen. Bis zu einer Konzentration von 8 µg/ml sind über 60 % der Isolate resistent. Im Klärwerksablauf kommen nur Resistenzen bei den drei Konzentrationen 0,25, 0,5 und 1 µg/ml vor. Bei 0,25 µg/ml liegt die Zahl der Resistenzen höher als im Filterablauf, 39 zu 36 resistente Isolate. Auch die Zahl der intermediär resistenten Zellen liegt mit 11 über den fünf des Filterablaufes. Bei den Konzentrationen von 0,5 und 1 µg/ml kommt im Klärwerksablauf eine Resistenz vor, im Filterablauf fanden sich jeweils 36.

22 Bei den Antibiotika Piperacillin, Piperacillin (mit Tazobactam), Tigecyclin, Levofloxacin, Colistin, Fosfomycin, Trimethoprim (mit Sulfmethoxazol), Ceftazidim (mit 3-Amino-Phenyl-Borat, 3-APB) besitzen die Isolate aus beiden Abläufen Resistenzen, wobei diese nicht bei allen Konzentrationen vorkommen (Abb. 9a, Abb. 9b).

Konzentrationen Klärwerksablauf Bodenfilterablauf Antibiotika / Zusätze 50 40 30 20 10 0 10 20 30 40 50 Temocillin 128 µg/ml Temocillin 32 µg/ml Chloramphenicol 16 µg/ml Chloramphenicol 8 µg/ml Amikacin 32 µg/ml Amikacin 16 µg/ml Amikacin 8 µg/ml Amikacin 4 µg/ml Ceftazidim 128 µg/ml Ceftazidim 64 µg/ml Ceftazidim 32 µg/ml Ceftazidim 16 µg/ml Ceftazidim 8 µg/ml Ceftazidim 4 µg/ml Ceftazidim 2 µg/ml Ceftazidim 1 µg/ml Ceft azidim+ 350 µg/ml 3-AP B 32 µg/ ml Ceft azidim+ 350 µg/ml 3-AP B 16 µg/ ml Ceft azidim+ 350 µg/ml 3-AP B 8 µg/ml Ceft azidim+ 350 µg/ml 3-AP B 4 µg/ml Ceft azidim+ 350 µg/ml 3-AP B 2 µg/ml Ceft azidim+ 350 µg/ml 3-AP B 1 µg/ml Ceft azidim+ 350 µg/ml 3-AP B 0,5 µg/ml Ceft azidim+ 350 µg/ml 3-AP B 0,25 µg/ml Cefotaxim 2 µg/ml Cefotaxim 1 µg/ml Abb. 9b: Addierte Resistenzen der jeweils 50 E. coli Antibiogramme aus dem Klärwerks- und Filterablauf. Dunkle Balken: eindeutige Resistenzen; helle Balken: intermediären Resistenzen.

Besondere Stellung nehmen die Carbapeneme, Doripenem, Imipenem, Ertapenem sowie Meropenem ein (Abb. 9c). Diese Wirkstoffgruppe entscheidet unter anderem ob es sich um multiresistente gramnegative Bakterien (MRGN) der Gruppe 3- oder 4-MRGN handelt. In beiden Abläufen kommen nur vereinzelt Resistenzen vor wobei die Gesamtheit der Resistenzen im Filterablauf höher als im Klärwerksablauf ist. Bei den Wirkstoffen Meropenem mit 0,4 mM EDTA (0,25 µg/ml) gibt es drei und bei Meropenem mit 350 µg/ml 3-APB (0,25 µg/ml, 0,5 µg/ml und 1 µg/ml) gibt es neun resistente Isolate und jeweils ein resistentes Isolat im Klärwerksablauf. Je ein Isolat aus dem Filterablauf besitzt bei allen Konzentrationen von Imipenem eine Resistenz. Gegen Ertapenem besitzen zwei Isolate gegen 0,25 µg/ml und ein Isolat gegen 0,5 µg/ml Resistenzen. Gegen Meropenem mit EDTA ist im Filterablauf ein Isolat resistent bei 0,25 und 0,5 µg/ml. Wie im Klärwerksablauf kommen die höchsten Resistenzzahlen im Filterablauf gegen Meropenem mit APB vor. Bei 0,25 µg/ml sind 32 Isolate resistent. Bei 0,5 µg/ml sind acht, bei 1 µg/ml sind zwei und bei 2 bis 32 µg/ml ist jeweils eine Resistenz vorhanden. Auch die intermediären Resistenzen zeigen bei Meropenem mit APB die größten Zahlen. Im Klärwerksablauf gibt es intermediäre Resistenzen bis 2 µg/ml wobei die höchste Zahl (20) bei 0,25 µg/ml

23 vorkommt. Im Filterablauf ist bei dieser Konzentration ebenfalls die höchste Zahl mit neun intermediären Resistenzen zu finden.

Konzentrationen Klärwerksablauf Bodenfilterablauf Antibiotika / Zusätze 50 40 30 20 10 0 10 20 30 40 50 Doripenem 4 µg/ml Doripenem 2 µg/ml Doripenem 1 µg/ml Doripenem 0,5 µg/ml Imipenem 8 µg/ml Imipenem 4 µg/ml Imipenem 2 µg/ml Imipenem 1 µg/ml Ertapenem 2 µg/ml Ertapenem 1 µg/ml Ertapenem 0,5 µg/ml Ertapenem 0,25 µg/ml Meropenem 128 µg/ml Meropenem 64 µg/ml Meropenem 32 µg/ml Meropenem 16 µg/ml Meropenem 8 µg/ml Meropenem 4 µg/ml Meropenem 2 µg/ml Meropenem 1 µg/ml Meropenem + 0,4 mM EDTA 32 µg/ ml Meropenem + 0,4 mM E DTA 16 µg/ ml Meropenem + 0,4 mM E DTA 8 µg/ml Meropenem + 0,4 mM E DTA 4 µg/ml Meropenem + 0,4 mM E DTA 2 µg/ml Meropenem + 0,4 mM E DTA 1 µg/ml Meropenem + 0,4 mM E DTA 0,5 µg/ml Meropenem + 0,4 mM E DTA 0,25 µg/ml Meropenem + 350 µg/ml 3-AP B 32 µg/ ml Meropenem + 350 µg/ml 3-AP B 16 µg/ ml Meropenem + 350 µg/ml 3-AP B 8 µg/ml Meropenem + 350 µg/ml 3-AP B 4 µg/ml Meropenem + 350 µg/ml 3-AP B 2 µg/ml Meropenem + 350 µg/ml 3-AP B 1 µg/ml Meropenem + 350 µg/ml 3-AP B 0,5 µg/ml Meropenem + 350 µg/ml 3-AP B 0,25 µg/ml Ciprofloxacin 2 µg/ml Ciprofloxacin 1 µg/ml Ciprofloxacin 0,5 µg/ml Abb. 9c: Addierte Resistenzen der jeweils 50 E. coli Antibiogramme aus dem Klärwerks- und Filterablauf. Dunkle Balken: eindeutige Resistenzen; helle Balken: intermediären Resistenzen.

Die Resistenzen gegen Temocillin (32 µg ml-1) und Chloramphenicol sind ausschließlich bei Stämmen aus dem Klärwerksablauf gefunden worden. Nur im Filterablauf wurden Resistenzen gegen Amikazin, Ceftazidim und Cefotaxim. Gegen die drei vorgenannten Antibiotika sind jedoch im Klärwerksablauf intermediäre Resistenzen vorhanden. Die Zahl dieser intermediären Resistenzen liegen allerdings auf einem niedrigeren Niveau als die Resistenzen im Filterablauf. Während bei Amikazin (4 µg ml-1) im Filterablauf 26 Resistenzen detektiert wurden, so sind es im Klärwerksablauf nur 9 intermediäre Resistenzen. Bei dem Antibiotikum Piperacillin wurden für beide untersuchten Konzentrationen mehr Resistenzen im Filterablauf als im Klärwerksablauf gefunden. Bei der Anwendung von Piperacillin zusammen mit

24 Tazobactam in fünf verschiedenen Konzentrationen wurden ebenfalls vorrangig im Filterablauf und bei allen Konzentrationen Resistente Keime ermittelt.

3.5 Mikrobiologische Aktivität der Bodenfiltersubstrate

Zur Analyse der mikrobiologische Aktivität der Bodenfiltersubstrate wurde deren Respirationsrate

(µmol CO2 / 24h / g Substrat) mit Hilfe der Gaschromatographie in n=3 Wiederholungen bestimmt. Insbesondere die oberste Schicht des Bodenfilters (0-10 cm Tiefe) zeigte eine deutlich höhere mikrobielle Aktivität, die innerhalb der nächsten Schicht (10-20 cm Tiefe) auf knapp die Hälfte zurückging. Über die folgenden 60 cm war ein kontinuierlicher Rückgang mit vergleichsweise geringer Variation unter den drei beprobten Stellen innerhalb des Bodenfilters zu verzeichnen und sich auf ca. 500

µmol CO2 / 24h / g Substrat einpendelt (Abb. 10). Ein signifikanter Unterschied zwischen dem Sand- Kompost- oder Sand-Pflanzenkohle-Gemisch konnte hinsichtlich der mikrobiellen Aktivität nicht gefunden werden.

Abb. 10: Respirationsraten aus den Bodenfiltersubstraten in Abhängigkeit verschiedener Tiefen. Fehlerbalken: Standardfehler (n=3).

25

4 Diskussion 4.1 Zellzahlen DAPI, KbE sowie E. coli und Coliforme

Die Bestimmung der Kolonie bildenden Einheiten (KbE) heterotropher Bakterien oder die Bestimmung der Koloniezahl von Indikatororganismen wie Escherichia coli und Coliformer Bakterien (Klebsiella spp. etc.) gilt als eine Möglichkeit zur Bestimmung von Gewässergüte. Die Bestimmung der Zellzahlen durch fluoreszierende Farbstoffe in Kombination mit Fluoreszenzmikroskopie wird allgemein eher im wissenschaftlichen Bereich verwendet und weniger zur Feststellung der Gewässergüte. Im Vergleich zu den KbE oder den Koloniezahlen von E. coli wird durch die Bestimmung der Zellzahlen durch DAPI die Zahl der nicht kultivierbaren und die Zahl der dormanten (schlafenden) Zellen erfasst, die auf Kulturmedium nicht wachsen würden. Dies führt zu einer wesentlich sichereren Ermittlung der bakteriellen Zahlen. So ist es verständlich, dass die Zellzahlen der DAPI-Bestimmung wesentlich höher liegen. Die DAPI-Zellzahlen und die KbE zeigen für die meisten Beprobungstermine eine deutliche Reduktion der bakteriellen Keimbelastung. Die Eliminationsleistung bestimmt durch KbE ist vergleichbar mit vorherigen Untersuchungen des Bodenfilters [DS16]. Allerdings wurden auch Termine ermittelt, bei denen scheinbar keine Elimination der Bakterien durch den Bodenfilter zu beobachten war. Diese Beobachtung trat dann auf, wenn die Keimzahlen im Klärwerksablauf besonders niedrig (unter 2 Millionen Keime je ml) waren. Dies deutet darauf hin, dass der Bodenfilter als lebendiges Habitat für eine Vielzahl von Mikroorganismen eine gewisse Emissionsleistung bezüglich Bakterien besitzt, die dann relativ gesehen erhöht wirken kann und eine fehlende Eliminationsleitung fälschlich andeutet. Dass der Bodenfilter zu jedem Beprobungstermin, also auch an den Terminen, an denen scheinbar keine Eliminationsleistung besteht, einen Einfluss auf die bakterielle Zusammensetzung hat und somit eine Elimination besteht, zeigt die Clusteranalyse der bakteriellen Gattungen nach der Hochdurchsatz- Sequenzierung. Wegen der schwierigen Unterscheidbarkeit der Kolonien wurden die Zellzahlen von E. coli und Coliformen nicht separat bestimmt sondern zu einem Wert zusammengeführt. Die Zellen von E. coli sowie von den Coliformen wurden zu fast jedem der beprobten Termine eliminiert (Abb. 4). Dies deutet darauf hin, dass der Bodenfilter besonders diese Gruppe der Mikroorganismen sehr effektiv aus dem Klärwerksablauf reduzieren kann und zu einer ökologischen Entlastung beiträgt. Jeder der drei Ansätze zur Bestimmung der Zell- oder Koloniezahl zeigt jedoch eine starke Heterogenität der Abläufe bezüglich der ermittelten Zellzahlen über den Zeitraum der Beprobung. Hier sollte eine verstärkte Probenentnahme auch am jeweiligen Termin erfolgen, um Schwankungen, auch über den Tag, sicherer erfassen zu können. Einen Einfluss auf die Zell- und Koloniezahlen durch schwankende Tagesdurchflüsse in der untersuchten Kläranlage in Sulingen kann ausgeschlossen werden, da diese Durchflüsse zu den Beprobungsterminen auf fast gleichem Niveau liegen (Tab. A8). Die erstmalige detaillierte molekularbiologische Quantifizierung von Gesamtkeimzahlen liefert neueste Erkenntnisse der Eliminationsleitung des Bodenfilters, wobei die Zahlen um ein vielfaches genauer sind als bei bisher eingesetzten, stark fehlerbehafteten kulturbasierten Methoden zur Keimzahlbestimmung und –Bewertung.

27 4.2 Bakterielle Diversität und 16S rRNA-OTU-Zahlen

Die bisher etablierten Methoden zur Bestimmung der Gewässergüte beinhalten vor allem die Kultivierung von bestimmten Indikatororganismen wie z.B. E. coli. Der Einsatz von Hochdurchsatz-Sequenzierungen stellt eine Innovation dar und kann zu völlig neuen Erkenntnissen der Einteilung von Gewässergüten führen. Es konnte gezeigt werden, dass sich in den Abläufen des Klärwerks bisher nicht ausreichend charakterisierte Bakterienklassen befinden, deren Bedeutung in der Umwelt und deren mögliche Wirkung auf den Menschen noch gänzlich unerforscht sind. Ein Vergleich der Ergebnisse der Hochdurchsatz-Sequenzierung ist erschwert, weil sich in der Literatur keine direkt vergleichbaren Studien finden lassen. Die Analyse der 16S rRNA-Gene der ermittelten Gattungen zeigt jedoch einen klaren Einfluss des Bodenfilters auf die Zusammensetzung der bakteriellen Keime. Auch im Substrat des Bodenfilters zeigt sich eine klar unterschiedliche Zusammensetzung der bakteriellen Population. Diese Veränderung war anzunehmen, weil der Bodenfilter ein eigenes Habitat darstellt und nur entsprechend angepasste Keime in diesem Habitat überleben und sich anreichern können. Bei den sich relativ stark abgrenzenden Terminen vom 30.04 und 27.05.15 aus dem Cluster der Filterabläufe ist eventuell noch der Beginn der Hochleistungsphase abzuleiten, der dann im weiteren Verlauf der Beprobungen zu einer konsequenteren Bildung eines Clusters führte. Die Analyse der 16S rRNA-Genen ergab zudem ein gehäuftes Vorkommen an Flavobacterium, Planctomyces, unklassifizierte Rickettsiales und Myxococcales, Aquicella sowie Legionella (Tab. A9). Wieso diese Gattungen häufiger im Bodenfilterablauf auftreten, kann eigentlich nur durch das Vorhandensein von passenden Zwischenwirten (eukaryotische Einzeller wie Amöben) erklärt werden, die letztendlich zu einer Anreicherung der parasitären bakteriellen Keime führt. Das fast vollständige Fehlen von Sequenzen im Datensatz von Keimen wie Escherichia, Shigella, Staphylokokken und Enterokokken (Tab. A9) ist überraschend und kaum erklärbar. Mögliche Gründe können vielseitig sein und beginnen bei der DNA-Extraktion und enden bei der Wahl der Sequenzier- Primer für die Hochdurchsatz-Sequenzierung. Hier wäre weiterer Forschungsbedarf zu untersuchen, ob und welche methodischen Zwischenschritte sich hier auf die Analyse ausgewirkt haben könnten. Die Bewertung der Abwasserqualität durch Hochdurchsatzsequenzierung erweist sich trotzdem als moderne und Zukunftsträchtige Methode, vor allem bei Analysen über eine längeren Zeitraum hinweg. Auch in der Literatur häufen sich entsprechende Untersuchungen, die es erlauben, z.B. die bakterielle 16S rRNA zur Identifikation neuer bakterieller Keime zu verwenden, die als weitere Indikatororganismen dienen könnten, wie z.B. die Organismen aus der Candidate Division OD1 (Abb. 6). Zusätzlich eignet sich die Sequenzierung der ganzheitlichen, gesamten DNA einer Umweltprobe, der metagenomischen DNA, um die gesamten vorhandenen genetischen Kapazitäten zu enthüllen und zu charakterisieren. Auch die Gesamtheit der RNA steht zur Analyse zur Verfügung, um mit Hilfe der Metatranskriptomik die Aktivitäten aufzuzeigen, welche funktionellen Gene oder auch Resistenzgene innerhalb des Habitats wie z.B. dem Bodenfilter oder im Filterablauf aktiv sind. Beide Analysen von DNA und RNA liefern Erkenntnisse über die mögliche Produktion und Biodegradation von Toxinen und Resistenzgenen [TT15]. Begrüßenswert wäre eine Begleitung der Hochdurchsatz-Sequenzier-Methode mit Aktivitätsparametern in Form von kulturbasierten Ansätzen, molekularbiologisch basiertem Life-Dead-Staining oder die Fluoreszenzanalyse mit speziellen Sonden, die an die vorhandenen 16S rRNA binden und so ebenfalls als Parameter für die Aktivität dienen könnten. Wie bei jedem von Wasser durchflossenem Lebensraum lösen sich aus den Substraten Zellen, die dann im Ablauf des Bodenfilters zu finden sind. Dies wirft die Frage auf, ob sich die Substrate des Bodenfilters

28 so verändern lassen, dass sich die Emission der bakteriellen Keime gezielt steuern lässt. Dies hätte eine große ökologische Bedeutung und würde das Verfahren des bepflanzten Bodenfilters weiter anpassbar an die Bedürfnisse der Anwendung machen. Zudem würde sich dies höchstwahrscheinlich auch positiv auf die Vermarktung des Verfahrens durch entsprechende kleine und mittelständische Unternehmen auswirken.

4.3 Quantifizierung ausgesuchter Resistenzgene

Die Quantifizierung der ausgewählten klinisch relevanten, bakteriellen Resistenzgene im Abwasser liefert wichtige quantitative Informationen über den Einfluss des Bodenfilters auf Antibiotika-resistente Bakterien. Die Gene mecA (Methicillin-Resistengen) und vanA (Vancomycin-Resistenzgen) konnten nicht durch quantitative Real-time PCR nachgewiesen werden. Es ist durchaus denkbar, dass diese Gene unterhalb der Nachweisgrenze liegen. In der Literatur sind ebenfalls Untersuchungen bekannt, bei denen an verschiedenen Beprobungsterminen und auch unterschiedlichen Orten bestimmte Gene (ampC, vanA, mecA, blaSHV) nicht nachweisbar waren [BG09]. Der Vergleich mit den Sequenzen aus der Hochdurchsatz-Sequenzierung zeigt zudem (Tab. A9), dass die Keime, die diese Gene tragen, in verschwindend geringen OTU-Zahlen vorkommen. Folglich liegt es höchst wahrscheinlich an den niedrigen Konzentrationen von mecA und vanA, dass sie nicht nachweisbar sind. Alle weiteren untersuchten Resistenzgene waren nachweisbar. Die Zahl der im Versuchsverlauf ermittelten Resistenz-Genkopien zeigt keine stete Erhöhung im Bodenfilterablauf. Insbesondere die Gene blaTEM (Beta-Lactamase Resistenzgen) und intl1 (Klasse 1 Integrase Gen)zeigten fast immer geringe Kopienzahlen gegenüber dem Klärwerksablauf. Die im Filterablauf meist höheren Zahlen der Genkopien von blaCTX-M (Beta-Lactamase Resistenzgen) und ampC (Beta-Lactamase Resistenzgen) erscheinen nicht gravierend erhöht und bedenkt man die Eliminationsleitung des Bodenfilters, werden pro Liter Abwasser weniger Genkopien in die Umwelt abgegeben als es beim Klärwerksablauf ist. In aktuellen wissenschaftlichen Arbeiten gibt es Vorschläge, das Klasse 1-Integrase Gen intl1 als einen Indikator zur Anzeige anthropogener Verschmutzung einzuführen [GZ15]. Dabei eignet sich das Gen besonders als Indikator, weil es in pathogenen und nicht-pathogenen Keimen vorkommt.

4.4 Antibiogramme / Resistenzspektren

Die Antibiogramme von jeweils 50 Isolaten aus dem Klärwerks- und Bodenfilterablauf sollten Information darüber liefern, ob sich in den Isolaten aus dem Klärwerksablauf mehr Resistenzen nachweisen lassen. Die Untersuchung wurde vom Mikrobiologischen Labor GmbH in Doppelbestimmung mit Hilfe eines Mikrodilutionstests durchgeführt. Die Isolate, die im Doppelansatz Resistenzen zeigten, galten als eindeutig resistent. Manche Isolate zeigten nur in einem der Ansätze eine Resistenz gegen entsprechende Antibiotika und wurden deshalb als intermediär resistent eingestuft. Bei der Gewinnung der Reinkulturen von Escherichia coli aus dem Klärwerks- und Bodenfilterablauf für die Antibiogramme ergaben sich Probleme bei der tatsächlichen Reinheit der Kultur. Es zeigte sich, dass Kolonien nach dem Ausplattieren und bebrüten der Kultur auf Endo-Agar entweder eine klare Mischkultur entstand (Abb. 11) oder eine Kolonie mit der Ausbildung einer eindeutigen Färbung. Besonders viele der

29 eindeutig gefärbten Kolonien waren trotzdem keine reine Kultur, was ein zur Sicherheit durchgeführtes erneutes Ausstreichen zeigte (Abb. 11). Überraschend war dabei, dass z.B. eine ursprünglich als zu E. coli zugehörig identifizierte Kolonie nach dem Ausstreichen zur weiteren Einzelkolonie eine gänzlich andere Färbung zeigte als die parentale Kolonie (Abb. 11 D). Ähnliches war bei als Coliformen identifizierten Kolonien zu beobachten (Abb. 11 B, C). Das zusätzliche Kontrollieren der Kulturen durch Ausstreichen erforderte einen stark erhöhten Arbeits- und Zeitaufwand. Um sicherzustellen, dass ausschließlich reine Isolate gewonnen wurden, wurde die DNA der Isolate gewonnen und mit Hilfe der Sanger-Sequenzierung analysiert. Zusätzlich wurden in der Abteilung Mikrobiologie an der Materialprüfungsanstalt Bremen Tests mit Hilfe eines MALDI Biotypers an Stichproben durchgeführt, durch die sich die gewonnenen Isolate eindeutig als E. coli identifizieren ließen.

Abb. 11: Darstellung einer Plattierung vom Klärwerksablauf (A) und von drei Ausstrichen zur Gewinnung von Reinkulturen für die Antibiogramme (B, C und D). Vereinzelung der Kolonie eines potentiell coliformen Bakteriums (C, D) und Vereinzelung von einer potentiellen E. coli Kolonie (D) ursprünglich als Reinkultur charakterisiert. Deutliche Verschiebung der Färbung der neuen Einzelkolonien erkennbar.

Die ergänzende Erstellung von Antibiogrammen ist eine neuartige Vorgehensweise, um die Bildung von Multiresistenzen ausgesuchter Indikator-Mikroorganismen zu untersuchen. Die Antibiogramme von den E. coli Isolaten aus dem Klärwerksablauf sowie dem Bodenfilterablauf zeigen insgesamt unterschiedliche Resistenzprofile (Abb. 9a-c).

Bei den intermediär resistenten Isolaten ist die Interpretation unsicher, ob diese eher als resistent oder als nicht resistent einzuordnen sind. Die intermediär resistenten Bakterien kommen jedoch vornehmlich bei wenigen Antibiotika vor, im Wesentlichen bei den Wirkstoffen Amikazin und Ceftazidim (im Klärwerksablauf) und bei Chloramphenicol sowie Tigecyclin (im Filterablauf). Da die Antibiotika zu unterschiedlichen Wirkstoffgruppen gehören, die auch unterschiedliche Angriffspunkte innerhalb der bakteriellen Zelle haben, ist es schwierig Argumente zu finden, wieso gerade diese Wirkstoffe zu dem entsprechenden Resultat führen. Eine Wiederholung der Messungen mit mehr als zwei Wiederholungen sollte hier bei zukünftigen Tests für Klarheit sorgen.

30 Deutlich mehr Resistenzen sind bei den Isolaten des Bodenfilterablaufes bei bestimmten Antibiotika zu finden. Dazu gehören Piperacillin (auch mit Tazobactam), Trimethoprim/Sulfamethoxazol, Ceftazidim (auch mit 3-APB). Es stellt sich die Frage, ob jedes E. coli Isolat zu denselben Resistenzmechanismen greift, oder ob unterschiedliche Mechanismen zum Tragen kommen. Es könnte bei einem Isolat die Zahl der Porine reduziert sein, während das Andere stärkere Efflux-Pumpen besitzt und ein weiteres Isolat entsprechende Enzyme wie AmpC exprimiert, die es vor dem entsprechenden Antibiotikum schützen. Als positiv einzuschätzen ist das geringe Vorkommen von Resistenzen gegen Carbapeneme. Dies zeigt, dass, wenn überhaupt, im Bodenfilter nur sehr geringe Zahlen von multiresistenten Gramnegativen Bakterien der Klasse 4 (4MRGN) entstehen. Eher ist klar ersichtlich, dass eine Verschiebung der Resistenzmuster von Klärwerksablauf und Filterablauf vorhanden ist, was genauer untersucht werden sollte. Man kann annehmen, dass dieses auf Klebsiella und andere Gramnegative-Bakterien übertragbar ist. Bei der Wahl der zu untersuchenden bakteriellen Keime muss darauf geachtet werden, dass sich diese durch klassische Kultivierung oder molekulare Methoden eindeutig identifizieren lassen. Ebenso sollte in Voruntersuchungen geklärt werden, ob sich durch einfaches Ausplattieren reine Stämme isolieren lassen und nicht wie bei E. coli beobachtet Probleme bei der Vereinzelung auftreten.

4.5 Mikrobiologische Aktivität der Bodenfiltersubstrate

Die mikrobiologische Aktivität in den Bodenfiltersubstraten zeigte deutlich höhere Werte (Respirationsraten) in der obersten Schicht (0-10 cm) des Bodenfilters, was vor allem durch die relativ hohe Wurzeldichte in diesem Bereich und damit einhergehend einer hohen Substratverfügbarkeit und Durchlüftung. In dem darunterliegenden Filtersubstratkörper gibt es einen leichten Rückgang der mikrobiellen Aktivität, was für vergleichbare Tiefenprofile in Böden durchaus üblich ist. Demzufolge ist in der obersten Schicht des Bodenfilters von einem deutlich höheren mikrobiellen Abbaupotential auszugehen als in den darunterliegenden Schichten. Grundsätzlich kann aber festgehalten werden, dass der gesamte Substratkörper des Bodenfilters eine mikrobielle Aktivität in Form von Respiration zeigt und somit auch neben den positiven physikochemischen Eigenschaften als (mikro)biologisch aktiv bezeichnet werden kann. Die Hochdurchsatz-Sequenzierung der Filtersubstrate in den Tiefen von 0 bis 40 cm zeigt eine relativ stabile Zusammensetzung der relativen Zahlen der OTU-Klassen (Abb. 7). In der Tiefe bis 80 cm dagegen ist eine Veränderung der relativen Zusammensetzung zu beobachten. Es kann eine Reduktion des Anteils der OTU-Zahlen der Flavobacteria und der Candidate Division TM7 gezeigt werden während die relative Zahl der Candidate Division OD1 zunimmt. Besonders diese Klasse scheint damit im potentiell mikroaeroben Bereich der Substratschicht eine größere Bedeutung zu haben. Dieser Vergleich zeigt, dass sich zwar die mikrobielle Aktivität als Summenparameter kaum mit zunehmender Tiefe verändert, wobei das Bodenfiltersubstrat aber sehr wohl über eine qualitativ andere Zusammensetzung verfügt.

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32 5 Fazit

Der bepflanzte Bodenfilter erweist sich als wirksames Verfahren zur Eliminierung von bakteriellen Zellen, was durch molekularbiologische Methoden und klassische Kultivierung nachgewiesen wurde. Das gesteckte Ziel der Quantifizierung und Charakterisierung des Verfahrens hinsichtlich der Diversität aller Bakterien und der Antibiotika resistenter Bakterien sowie deren Resistenz-Gene wurde erreicht. Dabei konnte ein Effekt des Bodenfilters auf die bakterielle Zusammensetzung des geklärten Abwassers gezeigt werden. Ein negativer Effekt des Bodenfilters auf die Abundanz und Weitergabe von Resistenzgenen konnte nicht gezeigt werden. Allerdings sollte die Verschiebung der mikrobiellen Diversität sowie der relativen Abundanz von Resistenzgenen des Klärwerksablaufes, durch den Bodenfilter, weiter besondere Beachtung finden und entsprechend untersucht werden. Hier ist insbesondere die Bewertung der entsprechenden Umweltrelevanz wichtig wie auch die Auswirkungen auf die Ökologie des Vorfluters. Zudem kann eine fundierte Ursachenforschung zur Optimierung der mikrobiellen Eigenschaften und damit Habitate im Bodenfilter, die eine entsprechende Entwicklung begünstigen, genutzt werden, um das Verfahren des innovativen bepflanzten Bodenfilters weiter zu verbessern und das positive Potential des bepflanzten Bodenfilters weiter herauszuarbeiten. Weitere Analysen mit hochauflösenden Aufnahmen der bakteriellen Diversität helfen, das Verfahren des Bodenfilters weiter zu verfeinern und zu Ergebnissen zu gelangen, die zu einer exakteren, schnelleren und sicheren Einschätzung des Bodenfilterverfahrens und der Gewässergüte führen. Insgesamt zeigt die Untersuchung durch molekulare Methoden neue Erkenntnisse über bepflanzte Bodenfilter und deren Verfahrensweise.

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Anhang

Tab. A1: Zusammensetzung des Nährmediums R2A. Komponenten 1 L Yeast extract 0.5 g Proteose peptone 0.5 g Caseine hydrolysate 0.5 g D-Glucose 0.5 g Starch, soluble (Stärke, löslich) 0.5 g

di-Potassium hydrogen phosphate (K2HPO4) 0.3 g

Magnesium sulfate (MgSO4) 0.024 g Natrium pyruvate (Brenztraubensäure) 0.3 g

Agar (optional) 14 g

Tab. A2: Zusammensetzung des Nährmediums Endo. Komponenten 1 L Peptone from meat, peptic digest 10 g Lactose 10 g

di-potassium hydrogen phosphate (K2HPO4) 2.5 g

Sodium sulfite (Na2 SO3) 3.3 g Fuchsin (basic, basisch) 300 mg

Agar (optional) 14 g

Tab. A3: Zusammensetzung des Nährmediums LB. Komponenten 1 L Yeast extract 10 g NaCl 10 g Trypton 5 g

Agar (optional) 14 g

A1 Tab. A4: Mittelwerte und Standardfehler der Zellzahlen von KA und FA nach DAPI-Färbung.

KA FA Termin Mittelwert Standardfehler Mittelwert Standardfehler 30/04/2015 4153290.8 324835.3 1959830 53538.8 21/05/2015 309060.4 74985.07 2670736 299572.4 27/05/2015 9510782.3 294976.8 3440383 255514.3 18/06/2015 13234859.7 831586.9 4648588 485835.5 25/06/2015 12849702.4 246526.2 3929673 140755.9 01/07/2015 10700965.1 1888305 3514477 236643.0 23/07/2015 3559868.2 200409.7 2893686 138514.2 29/07/2015 725591.0 227029.4 2381701 224495.2 18/08/2015 5849451.5 350480.8 1067360 195557.4 03/09/2015 8405374.1 210291.2 2504524 209111.9 30/09/2015 7486203.2 475806.2 2280238 97038.2 20/10/2015 7934107.1 354451.5 3203414 229180.1 29/10/2015 12415148.8 681391.7 1397781 58998.8 14/12/2015 7938779.8 66581.3 1270285 177412.7

Tab. A5: Mittelwerte und Standardfehler der Koloniezahlen (KbE) von KA und FA. KA FA Termin Mittelwert Standardfehler Mittelwert Standardfehler 30/04/2015 5540 428.3 914 111.6 21/05/2015 11612 972.9 17552 2333.5 27/05/2015 13580 2277.5 8264 360.7 18/06/2015 11272 604.5 5808 766.9 25/06/2015 54720 3600.8 24520 856.9 01/07/2015 14376 563.5 1790 48.9 23/07/2015 - - - - 29/07/2015 - - - - 18/08/2015 82000 1748.2 29820 2023.7 03/09/2015 52560 1528.9 26240 6168.4 30/09/2015 9320 1156.9 9496 1035.8 20/10/2015 13240 2895.1 4240 747.3 29/10/2015 37680 3096.8 16320 2567.5 14/12/2015 19480 3652.7 15920 1013.1

A2 Tab. A6: Mittelwerte und Standardfehler der Koloniezahlen von KA und FA, von E. coli und Coliformen Bakterien.

KA FA Termin Mittelwert Standardfehler Mittelwert Standardfehler 30/04/2015 272 46.2 200 30.80 21/05/2015 15.2 2.6 10.6 3.84 27/05/2015 63 12.6 51 10.27 18/06/2015 1164 20.1 63.4 11.73 25/06/2015 1978 186.8 388 33.08 01/07/2015 974 85.0 250 27.75 23/07/2015 - - - - 29/07/2015 - - - - 18/08/2015 676 49.6 72 13.5 03/09/2015 360 25.3 44 19.3 30/09/2015 63.6 1.7 38 1.3 20/10/2015 119 9.0 61 7.5 29/10/2015 61.4 7.2 9.6 0.5 14/12/2015 53 3.1 6.8 1.3

A3 Tab. A7a: Ermittelte Resistenzzahlen aus den Antibiogrammen der Escherichia coli Isolate.

KA FA Antibiotikum Resistent Intermediär Resistent Intermediär

Piperracillin 16 µg/ml 29 0 39 0 Piperracillin 8 µg/ml 29 1 39 0 Piperacillin / Tazobactam 64/4 µg/ml 0 0 19 3 Piperacillin / Tazobactam 32/4 µg/ml 0 0 22 2 Piperacillin / Tazobactam 16/4 µg/ml 0 3 26 5 Piperacillin / Tazobactam 8/4 µg/ml 0 12 31 5 Piperacillin / Tazobactam 4/4 µg/ml 10 11 31 5 Tigecyclin 4 µg/ml 1 4 0 2 Tigecyclin 2 µg/ml 1 6 0 6 Tigecyclin 1 µg/ml 1 9 0 7 Tigecyclin 0,5 µg/ml 4 29 0 17 Tigecyclin 0,25 µg/ml 28 21 13 33 Levofloxacin 4 µg/ml 50 0 50 0 Levofloxacin 2 µg/ml 50 0 50 0 Levofloxacin 1 µg/ml 50 0 50 0 Levofloxacin 0,5 µg/ml 50 0 50 0 Colistin 8 µg/ml 0 1 0 1 Colistin 4 µg/ml 0 1 0 4 Colistin 2 µg/ml 1 5 1 3 Colistin 1 µg/ml 14 5 3 6 Fosfomycin 64 µg/ml 23 0 0 0 Fosfomycin 32 µg/ml 23 0 0 1 Fosfomycin 16 µg/ml 23 0 1 4 Fosfomycin 8 µg/ml 23 2 2 13 Trimethoprim / Sulfamethoxazol 8/152 µg/ml 25 0 36 0 Trimethoprim / Sulfamethoxazol 4/76 µg/ml 25 0 36 2 Trimethoprim / Sulfamethoxazol 2/38 µg/ml 26 2 36 2 Trimethoprim / Sulfamethoxazol 1/19 µg/ml 26 4 36 2

A4

Tab. A7b: Ermittelte Resistenzzahlen aus den Antibiogrammen der Escherichia coli Isolate.

KA FA Antibiotikum Resistent Intermediär Resistent Intermediär

Temocillin 128 µg/ml 0 0 0 0 Temocillin 32 µg/ml 1 1 0 2 Chloramphenicol 16 µg/ml 21 16 0 6 Chloramphenicol 8 µg/ml 42 1 0 36 Amikacin 32 µg/ml 0 0 0 0 Amikacin 16 µg/ml 0 0 1 11 Amikacin 8 µg/ml 0 3 4 15 Amikacin 4 µg/ml 0 9 26 7 Ceftazidim 128 µg/ml 0 1 3 6 Ceftazidim 64 µg/ml 0 1 18 8 Ceftazidim 32 µg/ml 0 1 32 0 Ceftazidim 16 µg/ml 0 2 33 0 Ceftazidim 8 µg/ml 0 6 33 1 Ceftazidim 4 µg/ml 0 10 36 2 Ceftazidim 2 µg/ml 0 10 36 2 Ceftazidim 1 µg/ml 0 24 36 3 Ceftazidim+ 350 µg/ml 3-APB 32 µg/ml 0 0 5 7 Ceftazidim+ 350 µg/ml 3-APB 16 µg/ml 0 0 24 2 Ceftazidim+ 350 µg/ml 3-APB 8 µg/ml 0 0 32 1 Ceftazidim+ 350 µg/ml 3-APB 4 µg/ml 0 0 34 9 Ceftazidim+ 350 µg/ml 3-APB 2 µg/ml 0 2 34 6 Ceftazidim+ 350 µg/ml 3-APB 1 µg/ml 1 5 36 4 Ceftazidim+ 350 µg/ml 3-APB 0,5 µg/ml 1 9 36 5 Ceftazidim+ 350 µg/ml 3-APB 0,25 µg/ml 39 11 36 5 Cefotaxim 2 µg/ml 0 4 36 0 Cefotaxim 1 µg/ml 0 15 36 3

A5

Tab. A7c: Ermittelte Resistenzzahlen aus den Antibiogrammen der Escherichia coli Isolate.

KA FA Antibiotikum Resistent Intermediär Resistent Intermediär

Doripenem 4 µg/ml 0 0 0 0 Doripenem 2 µg/ml 0 0 0 0 Doripenem 1 µg/ml 0 1 0 0 Doripenem 0,5 µg/ml 0 4 0 1 Imipenem 8 µg/ml 0 1 1 0 Imipenem 4 µg/ml 0 1 1 0 Imipenem 2 µg/ml 0 1 1 0 Imipenem 1 µg/ml 0 4 1 3 Ertapenem 2 µg/ml 0 0 0 0 Ertapenem 1 µg/ml 0 0 0 0 Ertapenem 0,5 µg/ml 0 0 1 0 Ertapenem 0,25 µg/ml 0 3 2 5 Meropenem 128 µg/ml 0 0 0 0 Meropenem 64 µg/ml 0 0 0 0 Meropenem 32 µg/ml 0 0 0 0 Meropenem 16 µg/ml 0 0 0 0 Meropenem 8 µg/ml 0 0 0 0 Meropenem 4 µg/ml 0 0 0 0 Meropenem 2 µg/ml 0 0 0 2 Meropenem 1 µg/ml 0 2 3 1

A6

Tab. A7d: Ermittelte Resistenzzahlen aus den Antibiogrammen der Escherichia coli Isolate.

KA FA Antibiotikum Resistent Intermediär Resistent Intermediär

Meropenem + 0,4 mM EDTA 32 µg/ml 0 0 0 0 Meropenem + 0,4 mM EDTA 16 µg/ml 0 0 0 0 Meropenem + 0,4 mM EDTA 8 µg/ml 0 0 0 0 Meropenem + 0,4 mM EDTA 4 µg/ml 0 0 0 0 Meropenem + 0,4 mM EDTA 2 µg/ml 0 0 0 0 Meropenem + 0,4 mM EDTA 1 µg/ml 0 0 0 0 Meropenem + 0,4 mM EDTA 0,5 µg/ml 0 0 1 0 Meropenem + 0,4 mM EDTA 0,25 µg/ml 3 5 1 1 Meropenem + 350 µg/ml 3-APB 32 µg/ml 0 0 1 0 Meropenem + 350 µg/ml 3-APB 16 µg/ml 0 0 1 0 Meropenem + 350 µg/ml 3-APB 8 µg/ml 0 0 1 0 Meropenem + 350 µg/ml 3-APB 4 µg/ml 0 0 1 0 Meropenem + 350 µg/ml 3-APB 2 µg/ml 0 1 1 1 Meropenem + 350 µg/ml 3-APB 1 µg/ml 1 1 2 0 Meropenem + 350 µg/ml 3-APB 0,5 µg/ml 1 6 8 9 Meropenem + 350 µg/ml 3-APB 0,25 µg/ml 9 20 32 9 Ciprofloxacin 2 µg/ml 50 0 50 0 Ciprofloxacin 1 µg/ml 50 0 50 0 Ciprofloxacin 0,5 µg/ml 50 0 50 0

A7 Tab. A8: Tagesdurchflüsse der Sulinger Kläranlage.

Termin Tagesdurchfluss: m³ d-1 Niederschlag: l m-2

30.04.15 2299 -

27.05.15 1794 -

18.06.15 1783 -

25.06.15 1885 -

01.07.15 2012 -

23.07.15 1925 -

29.07.15 2258 5

18.08.15 2937 5

03.09.15 2026 - - 30.09.15 1609

- 20.10.15 2074

29.10.15 1912 -

14.12.15 2093 -

A8 Tab. A9: Phylogenetische Zuordnung der OTU auf Gattungsebene und Gesamt-Zahlen. Gesamt

Consensus lineage OTU Zahl Bacteria; Acidobacteria; Acidobacteria; Acidobacteriales; Acidobacteriaceae_(Subgroup_1); Edaphobacter 1 Bacteria; Acidobacteria; Acidobacteria; Acidobacteriales; Acidobacteriaceae_(Subgroup_1); Granulicella 4 Bacteria; Acidobacteria; Acidobacteria; Acidobacteriales; Acidobacteriaceae_(Subgroup_1); Terriglobus 2 Bacteria; Acidobacteria; Acidobacteria; Acidobacteriales; Acidobacteriaceae_(Subgroup_1); unclassified 7 Bacteria; Acidobacteria; Acidobacteria; Subgroup_3; AKIW659; unclassified 1 Bacteria; Acidobacteria; Acidobacteria; Subgroup_3; Elev-16S-1166; unclassified 6 Bacteria; Acidobacteria; Acidobacteria; Subgroup_3; PAUC26f; unclassified 6 Bacteria; Acidobacteria; Acidobacteria; Subgroup_3; SJA-149; unclassified 8 Bacteria; Acidobacteria; Acidobacteria; Subgroup_3; Unknown_Family; Bryobacter 49 Bacteria; Acidobacteria; Acidobacteria; Subgroup_3; Unknown_Family; Candidatus_Solibacter 11 Bacteria; Acidobacteria; Acidobacteria; Subgroup_4; 11-24; unclassified 35 Bacteria; Acidobacteria; Acidobacteria; Subgroup_4; DS-100; unclassified 11 Bacteria; Acidobacteria; Acidobacteria; Subgroup_4; RB41; unclassified 14 Bacteria; Acidobacteria; Acidobacteria; Subgroup_4; Unknown_Family; Blastocatella 30 Bacteria; Acidobacteria; Holophagae; Acanthopleuribacterales; Acanthopleuribacteraceae; Acanthopleuribacter 4 Bacteria; Acidobacteria; Holophagae; Holophagales; Holophagaceae; Geothrix 1 Bacteria; Acidobacteria; Holophagae; Holophagales; Holophagaceae; Holophaga 4 Bacteria; Acidobacteria; Holophagae; Holophagales; Holophagaceae; marine_group 2 Bacteria; Acidobacteria; Holophagae; Holophagales; Holophagaceae; unclassified 7 Bacteria; Acidobacteria; Holophagae; Subgroup_10; ABS-19; unclassified 37 Bacteria; Acidobacteria; Holophagae; Subgroup_10; CA002; unclassified 6 Bacteria; Acidobacteria; Holophagae; Subgroup_10; NS72; unclassified 2 Bacteria; Actinobacteria; Acidimicrobiia; Acidimicrobiales; Acidimicrobiaceae; CL500- 29_marine_group 15 Bacteria; Actinobacteria; Acidimicrobiia; Acidimicrobiales; Acidimicrobiaceae; Ilumatobacter 4 Bacteria; Actinobacteria; Acidimicrobiia; Acidimicrobiales; Acidimicrobiaceae; unclassified 4 Bacteria; Actinobacteria; Acidimicrobiia; Acidimicrobiales; Acidimicrobiales_Incertae_Sedis; Aciditerrimonas 1 Bacteria; Actinobacteria; Acidimicrobiia; Acidimicrobiales; Acidimicrobiales_Incertae_Sedis; Candidatus_Microthrix 20 Bacteria; Actinobacteria; Acidimicrobiia; Acidimicrobiales; Iamiaceae; Iamia 50 Bacteria; Actinobacteria; Acidimicrobiia; Acidimicrobiales; OM1_clade; unclassified 5 Bacteria; Actinobacteria; Acidimicrobiia; Acidimicrobiales; Sva0996_marine_group; unclassified 4 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Actinomycetales; Actinomycetaceae; Actinobaculum 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Actinomycetales; Actinomycetaceae; Actinomyces 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Bifidobacteriales; Bifidobacteriaceae; Bifidobacterium 3 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Catenulisporales; Actinospicaceae; Actinospica 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Catenulisporales; Catenulisporaceae; Catenulispora 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Corynebacteriales; Corynebacteriaceae; Corynebacterium 2 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Corynebacteriales; Corynebacteriales_Incertae_Sedis; Tomitella 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Corynebacteriales; Dietziaceae; Dietzia 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Corynebacteriales; Mycobacteriaceae; Mycobacterium 16 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Corynebacteriales; Nocardiaceae; Gordonia 3 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Corynebacteriales; Nocardiaceae; Nocardia 2 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Corynebacteriales; Nocardiaceae; Rhodococcus 6 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Corynebacteriales; Nocardiaceae; Smaragdicoccus 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Corynebacteriales; Nocardiaceae; Williamsia 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Corynebacteriales; Tsukamurellaceae; Tsukamurella 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Frankiales; Acidothermaceae; Acidothermus 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Frankiales; Cryptosporangiaceae; Fodinicola 6 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Frankiales; Frankiaceae; Frankia 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Frankiales; Frankiaceae; Jatrophihabitans 2 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Frankiales; Geodermatophilaceae; Blastococcus 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Frankiales; Geodermatophilaceae; Modestobacter 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Frankiales; Nakamurellaceae; Nakamurella 7 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Frankiales; Sporichthyaceae; Candidatus_Planktophila 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Frankiales; Sporichthyaceae; Sporichthya 3 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Frankiales; Sporichthyaceae; hgcI_clade 23 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Frankiales; Sporichthyaceae; unclassified 8 A9 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Kineosporiales; Kineosporiaceae; Angustibacter 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Kineosporiales; Kineosporiaceae; Kineococcus 2 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Kineosporiales; Kineosporiaceae; Kineosporia 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Kineosporiales; Kineosporiaceae; unclassified 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Beutenbergiaceae; Salana 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Brevibacteriaceae; Brevibacterium 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Cellulomonadaceae; Actinotalea 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Cellulomonadaceae; Cellulomonas 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Demequinaceae; Demequina 2 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Demequinaceae; unclassified 2 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Dermabacteraceae; unclassified 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Dermatophilaceae; Kineosphaera 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Intrasporangiaceae; Aquipuribacter 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Intrasporangiaceae; Ornithinibacter 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Intrasporangiaceae; Phycicoccus 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Intrasporangiaceae; Tetrasphaera 9 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Intrasporangiaceae; unclassified 19 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Microbacteriaceae; Agrococcus 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Microbacteriaceae; Agromyces 4 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Microbacteriaceae; Alpinimonas 3 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Microbacteriaceae; Candidatus_Rhodoluna 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Microbacteriaceae; Frondihabitans 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Microbacteriaceae; Leucobacter 3 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Microbacteriaceae; Lysinimonas 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Microbacteriaceae; Microbacterium 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Microbacteriaceae; unclassified 87 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Micrococcaceae; Acaricomes 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Micrococcaceae; Arthrobacter 4 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Micrococcaceae; Kocuria 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Micrococcaceae; Micrococcus 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Micrococcaceae; Rothia 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Micrococcaceae; unclassified 2 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Promicromonosporaceae; Promicromonospora 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micromonosporales; Micromonosporaceae; Actinoplanes 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micromonosporales; Micromonosporaceae; Catellatospora 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micromonosporales; Micromonosporaceae; Luedemannella 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micromonosporales; Micromonosporaceae; unclassified 7 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Propionibacteriales; Nocardioidaceae; Aeromicrobium 5 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Propionibacteriales; Nocardioidaceae; Kribbella 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Propionibacteriales; Nocardioidaceae; Marmoricola 4 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Propionibacteriales; Nocardioidaceae; Nocardioides 41 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Propionibacteriales; Nocardioidaceae; unclassified 2 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Propionibacteriales; Propionibacteriaceae; Aestuariimicrobium 2 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Propionibacteriales; Propionibacteriaceae; Brooklawnia 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Propionibacteriales; Propionibacteriaceae; Friedmanniella 2 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Propionibacteriales; Propionibacteriaceae; Microlunatus 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Propionibacteriales; Propionibacteriaceae; Micropruina 3 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Propionibacteriales; Propionibacteriaceae; Propionibacterium 3 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Propionibacteriales; Propionibacteriaceae; Propionicicella 2 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Propionibacteriales; Propionibacteriaceae; Propioniciclava 7 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Propionibacteriales; Propionibacteriaceae; Tessaracoccus 7 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Propionibacteriales; Propionibacteriaceae; unclassified 21 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Pseudonocardiales; Pseudonocardiaceae; Actinomycetospora 2 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Pseudonocardiales; Pseudonocardiaceae; Actinophytocola 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Pseudonocardiales; Pseudonocardiaceae; Amycolatopsis 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Pseudonocardiales; Pseudonocardiaceae; Lentzea 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Pseudonocardiales; Pseudonocardiaceae; Pseudonocardia 8 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Pseudonocardiales; Pseudonocardiaceae; unclassified 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Streptomycetales; Streptomycetaceae; Streptomyces 3 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Streptomycetales; Streptomycetaceae; unclassified 6 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Streptosporangiales; Streptosporangiaceae; Nonomuraea 1 A10 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Streptosporangiales; Streptosporangiaceae; Thermopolyspora 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Streptosporangiales; Streptosporangiaceae; unclassified 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Streptosporangiales; Thermomonosporaceae; Actinocorallia 2 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Streptosporangiales; Thermomonosporaceae; Actinomadura 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Streptosporangiales; Thermomonosporaceae; Thermomonospora 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Streptosporangiales; Thermomonosporaceae; unclassified 1 Bacteria; Actinobacteria; Coriobacteriia; Coriobacteriales; Coriobacteriaceae; Adlercreutzia 1 Bacteria; Actinobacteria; Coriobacteriia; Coriobacteriales; Coriobacteriaceae; Atopobium 1 Bacteria; Actinobacteria; Coriobacteriia; Coriobacteriales; Coriobacteriaceae; Collinsella 1 Bacteria; Actinobacteria; Coriobacteriia; Coriobacteriales; Coriobacteriaceae; Eggerthella 1 Bacteria; Actinobacteria; Coriobacteriia; Coriobacteriales; Coriobacteriaceae; Enterorhabdus 1 Bacteria; Actinobacteria; Coriobacteriia; Coriobacteriales; Coriobacteriaceae; Gordonibacter 1 Bacteria; Actinobacteria; Coriobacteriia; Coriobacteriales; Coriobacteriaceae; unclassified 4 Bacteria; Actinobacteria; Nitriliruptoria; Euzebyales; Euzebyaceae; Euzebya 1 Bacteria; Actinobacteria; Nitriliruptoria; Nitriliruptorales; Nitriliruptoraceae; Nitriliruptor 1 Bacteria; Actinobacteria; Rubrobacteria; Rubrobacterales; Rubrobacteriaceae; Rubrobacter 1 Bacteria; Actinobacteria; Thermoleophilia; Gaiellales; Gaiellaceae; Gaiella 18 Bacteria; Actinobacteria; Thermoleophilia; Solirubrobacterales; 0319-6M6; unclassified 3 Bacteria; Actinobacteria; Thermoleophilia; Solirubrobacterales; 288-2; unclassified 1 Bacteria; Actinobacteria; Thermoleophilia; Solirubrobacterales; 480-2; unclassified 11 Bacteria; Actinobacteria; Thermoleophilia; Solirubrobacterales; Conexibacteraceae; Conexibacter 3 Bacteria; Actinobacteria; Thermoleophilia; Solirubrobacterales; Elev-16S-1332; unclassified 1 Bacteria; Actinobacteria; Thermoleophilia; Solirubrobacterales; Patulibacteraceae; Patulibacter 21 Bacteria; Actinobacteria; Thermoleophilia; Solirubrobacterales; Solirubrobacteraceae; Solirubrobacter 4 Bacteria; Actinobacteria; Thermoleophilia; Solirubrobacterales; TM146; unclassified 6 Bacteria; Armatimonadetes; Armatimonadia; Armatimonadales; Armatimonadaceae; Armatimonas 3 Bacteria; Armatimonadetes; Chthonomonadetes; Chthonomonadales; Chthonomonadaceae; Chthonomonas 8 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Bacteroidaceae; Bacteroides 26 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Marinilabiaceae; Mangroviflexus 3 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; PL-11B8_wastewater-sludge_group; unclassified 2 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Porphyromonadaceae; Barnesiella 1 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Porphyromonadaceae; Butyricimonas 1 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Porphyromonadaceae; Coprobacter 1 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Porphyromonadaceae; Dysgonomonas 5 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Porphyromonadaceae; Macellibacteroides 1 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Porphyromonadaceae; Odoribacter 1 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Porphyromonadaceae; Paludibacter 10 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Porphyromonadaceae; Parabacteroides 2 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Porphyromonadaceae; Petrimonas 2 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Porphyromonadaceae; Proteiniphilum 3 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Porphyromonadaceae; unclassified 1 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Prevotellaceae; Alloprevotella 2 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Prevotellaceae; Paraprevotella 1 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Prevotellaceae; Prevotella 15 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Rikenellaceae; Alistipes 8 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Rikenellaceae; Blvii28_wastewater- sludge_group 4 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Rikenellaceae; U29-B03 1 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Rikenellaceae; dgA-11_gut_group 1 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Rikenellaceae; unclassified 1 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Rikenellaceae; vadinBC27_wastewater- sludge_group 5 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; S24-7; unclassified 7 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Cyclobacteriaceae; Algoriphagus 3 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Cytophagaceae; Adhaeribacter 1 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Cytophagaceae; Arcicella 1 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Cytophagaceae; Chryseolinea 22 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Cytophagaceae; Cytophaga 9 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Cytophagaceae; Dyadobacter 6 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Cytophagaceae; Emticicia 12 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Cytophagaceae; Fibrella 1 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Cytophagaceae; Flectobacillus 1 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Cytophagaceae; Flexibacter 3 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Cytophagaceae; Hymenobacter 16 A11 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Cytophagaceae; Larkinella 2 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Cytophagaceae; Leadbetterella 6 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Cytophagaceae; Meniscus 1 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Cytophagaceae; Ohtaekwangia 29 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Cytophagaceae; Pseudarcicella 1 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Cytophagaceae; Runella 2 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Cytophagaceae; Spirosoma 2 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Cytophagaceae; Sporocytophaga 4 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Cytophagaceae; unclassified 52 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Flammeovirgaceae; Candidatus_Amoebophilus 1 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Flammeovirgaceae; Ekhidna 2 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Flammeovirgaceae; Marinoscillum 2 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Flammeovirgaceae; Reichenbachiella 3 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; MWH-CFBk5; unclassified 1 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Order_II; Rhodothermaceae; Rubrivirga 1 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Order_II; Rhodothermaceae; unclassified 1 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Cryomorphaceae; Crocinitomix 4 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Cryomorphaceae; Cryomorpha 1 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Cryomorphaceae; Fluviicola 38 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Cryomorphaceae; NS10_marine_group 2 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Cryomorphaceae; Owenweeksia 1 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Cryomorphaceae; unclassified 16 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Flavobacteriaceae; Aequorivita 1 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Flavobacteriaceae; Aquimarina 1 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Flavobacteriaceae; Bergeyella 1 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Flavobacteriaceae; Chryseobacterium 20 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Flavobacteriaceae; Cloacibacterium 1 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Flavobacteriaceae; Empedobacter 1 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Flavobacteriaceae; Epilithonimonas 2 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Flavobacteriaceae; Flavobacterium 353 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Flavobacteriaceae; Gillisia 1 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Flavobacteriaceae; Myroides 1 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Flavobacteriaceae; NS3a_marine_group 1 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Flavobacteriaceae; Sediminibacter 1 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Flavobacteriaceae; Subsaxibacter 2 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Flavobacteriaceae; Wautersiella 1 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Flavobacteriaceae; Weeksella 2 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Flavobacteriaceae; unclassified 42 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; NS9_marine_group; unclassified 40 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; AKYH767; unclassified 22 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Chitinophagaceae; Chitinophaga 13 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Chitinophagaceae; Ferruginibacter 42 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Chitinophagaceae; Filimonas 9 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Chitinophagaceae; Flavihumibacter 1 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Chitinophagaceae; Flavisolibacter 2 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Chitinophagaceae; Flavitalea 1 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Chitinophagaceae; Hydrotalea 5 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Chitinophagaceae; Lacibacter 2 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Chitinophagaceae; Niabella 1 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Chitinophagaceae; Niastella 4 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Chitinophagaceae; Parasegetibacter 1 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Chitinophagaceae; Sediminibacterium 9 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Chitinophagaceae; Segetibacter 2 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Chitinophagaceae; Taibaiella 46 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Chitinophagaceae; Terrimonas 33 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Chitinophagaceae; unclassified 120 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; FFCH9454; unclassified 3 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; KD1-131; unclassified 2 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; KD3-93; unclassified 15 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; LiUU-11-161; unclassified 41 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; NS11-12_marine_group; unclassified 83 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; PHOS-HE51; unclassified 47 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; ST-12K33; unclassified 1 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Saprospiraceae; Aureispira 3 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Saprospiraceae; Haliscomenobacter 1 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Saprospiraceae; Lewinella 1 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Saprospiraceae; Portibacter 3 A12 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Saprospiraceae; Rubidimonas 1 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Saprospiraceae; unclassified 135 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Sphingobacteriaceae; Arcticibacter 1 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Sphingobacteriaceae; Mucilaginibacter 39 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Sphingobacteriaceae; Nubsella 1 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Sphingobacteriaceae; Pedobacter 18 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Sphingobacteriaceae; Solitalea 6 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Sphingobacteriaceae; Sphingobacterium 5 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Sphingobacteriaceae; unclassified 26 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; WCHB1-69; unclassified 5 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; env.OPS_17; unclassified 85 Bacteria; Chlamydiae; Chlamydiae; Chlamydiales; Chlamydiales_Incertae_Sedis; Criblamydia 3 Bacteria; Chlamydiae; Chlamydiae; Chlamydiales; Parachlamydiaceae; Candidatus_Metachlamydia 3 Bacteria; Chlamydiae; Chlamydiae; Chlamydiales; Parachlamydiaceae; Candidatus_Protochlamydia 63 Bacteria; Chlamydiae; Chlamydiae; Chlamydiales; Parachlamydiaceae; Neochlamydia 23 Bacteria; Chlamydiae; Chlamydiae; Chlamydiales; Parachlamydiaceae; Parachlamydia 1 Bacteria; Chlamydiae; Chlamydiae; Chlamydiales; Parachlamydiaceae; unclassified 184 Bacteria; Chlamydiae; Chlamydiae; Chlamydiales; Simkaniaceae; Simkania 4 Bacteria; Chlamydiae; Chlamydiae; Chlamydiales; Simkaniaceae; unclassified 11 Bacteria; Chlamydiae; Chlamydiae; Chlamydiales; Waddliaceae; Waddlia 4 Bacteria; Chlorobi; Chlorobia; Chlorobiales; OPB56; unclassified 30 Bacteria; Chlorobi; Chlorobia; Chlorobiales; SJA-28; unclassified 19 Bacteria; Chlorobi; Ignavibacteria; Ignavibacteriales; BSV26; unclassified 23 Bacteria; Chlorobi; Ignavibacteria; Ignavibacteriales; Ignavibacteriaceae; Ignavibacterium 1 Bacteria; Chlorobi; Ignavibacteria; Ignavibacteriales; IheB3-7; unclassified 1 Bacteria; Chlorobi; Ignavibacteria; Ignavibacteriales; PHOS-HE36; unclassified 2 Bacteria; Chlorobi; Ignavibacteria; Ignavibacteriales; SR-FBR-L83; unclassified 1 Bacteria; Chloroflexi; Anaerolineae; Anaerolineales; Anaerolineaceae; Anaerolinea 2 Bacteria; Chloroflexi; Anaerolineae; Anaerolineales; Anaerolineaceae; unclassified 128 Bacteria; Chloroflexi; Caldilineae; Caldilineales; Caldilineaceae; Litorilinea 8 Bacteria; Chloroflexi; Caldilineae; Caldilineales; Caldilineaceae; unclassified 80 Bacteria; Chloroflexi; Chloroflexia; Chloroflexales; Chloroflexaceae; Chloroflexus 1 Bacteria; Chloroflexi; Chloroflexia; Chloroflexales; Roseiflexaceae; Roseiflexus 26 Bacteria; Chloroflexi; Chloroflexia; Herpetosiphonales; Herpetosiphonaceae; Herpetosiphon 5 Bacteria; Chloroflexi; Thermomicrobia; Sphaerobacterales; Sphaerobacteraceae; unclassified 3 Bacteria; Cyanobacteria; Cyanobacteria; SubsectionI; FamilyI; Snowella 1 Bacteria; Cyanobacteria; Cyanobacteria; SubsectionII; FamilyII; Pleurocapsa 1 Bacteria; Cyanobacteria; Cyanobacteria; SubsectionIII; FamilyI; Chamaesiphon 3 Bacteria; Cyanobacteria; Cyanobacteria; SubsectionIII; FamilyI; Geitlerinema 1 Bacteria; Cyanobacteria; Cyanobacteria; SubsectionIII; FamilyI; Leptolyngbya 4 Bacteria; Cyanobacteria; Cyanobacteria; SubsectionIII; FamilyI; Microcoleus 1 Bacteria; Cyanobacteria; Cyanobacteria; SubsectionIII; FamilyI; Phormidium 3 Bacteria; Cyanobacteria; Cyanobacteria; SubsectionIII; FamilyI; Planktothrix 2 Bacteria; Cyanobacteria; Cyanobacteria; SubsectionIII; FamilyI; unclassified 4 Bacteria; Deferribacteres; Deferribacteres; Deferribacterales; PAUC34f; unclassified 3 Bacteria; Deinococcus-Thermus; Deinococci; Deinococcales; Deinococcaceae; Deinococcus 4 Bacteria; Deinococcus-Thermus; Deinococci; Deinococcales; Deinococcaceae; unclassified 2 Bacteria; Deinococcus-Thermus; Deinococci; Deinococcales; Trueperaceae; Truepera 2 Bacteria; Deinococcus-Thermus; Deinococci; Thermales; Thermaceae; Meiothermus 1 Bacteria; Elusimicrobia; Elusimicrobia; Elusimicrobiales; Elusimicrobiaceae; Elusimicrobium 2 Bacteria; Fibrobacteres; Fibrobacteria; Fibrobacterales; Fibrobacteraceae; possible_genus_04 16 Bacteria; Fibrobacteres; Fibrobacteria; Fibrobacterales; Fibrobacteraceae; possible_genus_06 3 Bacteria; Fibrobacteres; Fibrobacteria; Fibrobacterales; Fibrobacteraceae; unclassified 3 Bacteria; Fibrobacteres; Fibrobacteria; Fibrobacterales; possible_family_01; unclassified 1 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Alicyclobacillaceae; Alicyclobacillus 1 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Aeribacillus 1 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus 10 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Calditerricola 1 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Fictibacillus 1 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Geobacillus 3 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Ureibacillus 1 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; unclassified 2 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Family_XII; Exiguobacterium 1 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Listeriaceae; Brochothrix 1 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Paenibacillaceae; Aneurinibacillus 1 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Paenibacillaceae; Brevibacillus 2 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Paenibacillaceae; Cohnella 3 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Paenibacillaceae; Paenibacillus 23 A13 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Paenibacillaceae; unclassified 5 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Planococcaceae; Lysinibacillus 1 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Planococcaceae; Rummeliibacillus 1 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Planococcaceae; Solibacillus 1 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Planococcaceae; Sporosarcina 1 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Planococcaceae; unclassified 2 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Sporolactobacillaceae; Tuberibacillus 1 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Staphylococcaceae; Staphylococcus 1 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Thermoactinomycetaceae; Planifilum 3 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Thermoactinomycetaceae; Thermoactinomyces 2 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Thermoactinomycetaceae; unclassified 1 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Lactobacillales; Carnobacteriaceae; Trichococcus 2 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Lactobacillales; Enterococcaceae; Enterococcus 2 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Lactobacillales; Lactobacillaceae; Lactobacillus 3 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Lactobacillales; Leuconostocaceae; Oenococcus 1 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Lactobacillales; Streptococcaceae; Lactococcus 2 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Lactobacillales; Streptococcaceae; Streptococcus 5 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Caldicoprobacteraceae; Caldicoprobacter 4 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Christensenellaceae; unclassified 7 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Clostridiaceae_1; Clostridium_sensu_stricto_1 6 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Clostridiaceae_1; Clostridium_sensu_stricto_12 3 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Clostridiaceae_1; Clostridium_sensu_stricto_13 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Clostridiaceae_1; Clostridium_sensu_stricto_7 2 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Clostridiaceae_1; Clostridium_sensu_stricto_9 2 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Clostridiaceae_1; Proteiniclasticum 3 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Clostridiaceae_1; Sarcina 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Clostridiaceae_1; unclassified 3 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Defluviitaleaceae; Incertae_Sedis 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Eubacteriaceae; Acetobacterium 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Eubacteriaceae; Anaerofustis 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Eubacteriaceae; Garciella 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Family_XI; Anaerosphaera 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Family_XI; Gallicola 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Family_XI; Incertae_Sedis 2 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Family_XI; Tissierella 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Family_XI; unclassified 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Family_XII; Acidaminobacter 2 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Family_XII; Fusibacter 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Family_XIII; Anaerovorax 4 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Family_XVII; Thermaerobacter 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Lachnospiraceae; Anaerostipes 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Lachnospiraceae; Blautia 6 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Lachnospiraceae; Butyrivibrio 2 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Lachnospiraceae; Coprococcus 2 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Lachnospiraceae; Dorea 2 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Lachnospiraceae; Epulopiscium 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Lachnospiraceae; Incertae_Sedis 13 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Lachnospiraceae; Lachnospira 3 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Lachnospiraceae; Pseudobutyrivibrio 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Lachnospiraceae; Roseburia 2 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Lachnospiraceae; Shuttleworthia 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Lachnospiraceae; unclassified 17 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; P._palm_C-A_51; unclassified 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Peptococcaceae; Desulfitibacter 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Peptococcaceae; Desulfotomaculum 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Peptococcaceae; Pelotomaculum 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Peptostreptococcaceae; Incertae_Sedis 4 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Peptostreptococcaceae; Peptostreptococcus 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Peptostreptococcaceae; Proteocatella 2 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Peptostreptococcaceae; unclassified 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Ruminococcaceae; Anaerofilum 3 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Ruminococcaceae; Faecalibacterium 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Ruminococcaceae; Fastidiosipila 2 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Ruminococcaceae; Incertae_Sedis 8 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Ruminococcaceae; Ruminococcus 3 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Ruminococcaceae; Saccharofermentans 2 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Ruminococcaceae; Subdoligranulum 2 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Ruminococcaceae; unclassified 28 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Syntrophomonadaceae; Syntrophomonas 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; vadinBB60; unclassified 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Halanaerobiales; Halanaerobiaceae; Halocella 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Thermoanaerobacterales; Family_III; Thermoanaerobacterium 1 A14 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Thermoanaerobacterales; Thermoanaerobacteraceae; Gelria 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Thermoanaerobacterales; Thermoanaerobacteraceae; Syntrophaceticus 1 Bacteria; Firmicutes; Erysipelotrichia; Erysipelotrichales; Erysipelotrichaceae; Asteroleplasma 1 Bacteria; Firmicutes; Erysipelotrichia; Erysipelotrichales; Erysipelotrichaceae; Erysipelothrix 3 Bacteria; Firmicutes; Erysipelotrichia; Erysipelotrichales; Erysipelotrichaceae; Incertae_Sedis 1 Bacteria; Firmicutes; Erysipelotrichia; Erysipelotrichales; Erysipelotrichaceae; Turicibacter 1 Bacteria; Firmicutes; Erysipelotrichia; Erysipelotrichales; Erysipelotrichaceae; unclassified 2 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Acidaminococcaceae; Acidaminococcus 3 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Acidaminococcaceae; Phascolarctobacterium 2 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Acidaminococcaceae; Succiniclasticum 1 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Acidaminococcaceae; Succinispira 1 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Acidaminococcaceae; unclassified 2 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Veillonellaceae; Allisonella 1 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Veillonellaceae; Anaeroarcus 2 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Veillonellaceae; Anaerosinus 1 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Veillonellaceae; Anaerospora 2 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Veillonellaceae; Anaerovibrio 3 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Veillonellaceae; Dendrosporobacter 1 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Veillonellaceae; Dialister 5 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Veillonellaceae; Megamonas 2 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Veillonellaceae; Megasphaera 3 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Veillonellaceae; Mitsuokella 4 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Veillonellaceae; Pectinatus 1 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Veillonellaceae; Pelosinus 1 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Veillonellaceae; Selenomonas 1 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Veillonellaceae; Veillonella 4 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Veillonellaceae; Zymophilus 3 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Veillonellaceae; unclassified 2 Bacteria; Fusobacteria; Fusobacteriia; Fusobacteriales; Fusobacteriaceae; Fusobacterium 1 Bacteria; Fusobacteria; Fusobacteriia; Fusobacteriales; Hados.Sed.Eubac.3; unclassified 1 Bacteria; Fusobacteria; Fusobacteriia; Fusobacteriales; Leptotrichiaceae; Leptotrichia 2 Bacteria; Fusobacteria; Fusobacteriia; Fusobacteriales; Leptotrichiaceae; Sebaldella 3 Bacteria; Gemmatimonadetes; Gemmatimonadetes; Gemmatimonadales; Gemmatimonadaceae; Gemmatimonas 30 Bacteria; Gemmatimonadetes; Gemmatimonadetes; Gemmatimonadales; Gemmatimonadaceae; unclassified 152 Bacteria; Lentisphaerae; Lentisphaeria; Victivallales; Victivallaceae; Victivallis 14 Bacteria; Lentisphaerae; Oligosphaeria; Oligosphaerales; Oligosphaeraceae; unclassified 1 Bacteria; Nitrospirae; Nitrospira; Nitrospirales; 0319-6A21; unclassified 12 Bacteria; Nitrospirae; Nitrospira; Nitrospirales; 4-29; unclassified 8 Bacteria; Nitrospirae; Nitrospira; Nitrospirales; Nitrospiraceae; Leptospirillum 3 Bacteria; Nitrospirae; Nitrospira; Nitrospirales; Nitrospiraceae; Nitrospira 29 Bacteria; Planctomycetes; Phycisphaerae; Phycisphaerales; Phycisphaeraceae; AKYG587 13 Bacteria; Planctomycetes; Phycisphaerae; Phycisphaerales; Phycisphaeraceae; CL500-3 16 Bacteria; Planctomycetes; Phycisphaerae; Phycisphaerales; Phycisphaeraceae; I-8 6 Bacteria; Planctomycetes; Phycisphaerae; Phycisphaerales; Phycisphaeraceae; Phycisphaera 61 Bacteria; Planctomycetes; Phycisphaerae; Phycisphaerales; Phycisphaeraceae; SM1A02 134 Bacteria; Planctomycetes; Phycisphaerae; Phycisphaerales; Phycisphaeraceae; Urania-1B- 19_marine_sediment_group 1 Bacteria; Planctomycetes; Phycisphaerae; Phycisphaerales; Phycisphaeraceae; unclassified 16 Bacteria; Planctomycetes; Planctomycetacia; Brocadiales; Brocadiaceae; unclassified 3 Bacteria; Planctomycetes; Planctomycetacia; Planctomycetales; Planctomycetaceae; Blastopirellula 26 Bacteria; Planctomycetes; Planctomycetacia; Planctomycetales; Planctomycetaceae; Candidatus_Anammoximicrobium 2 Bacteria; Planctomycetes; Planctomycetacia; Planctomycetales; Planctomycetaceae; Candidatus_Nostocoida 18 Bacteria; Planctomycetes; Planctomycetacia; Planctomycetales; Planctomycetaceae; Gemmata 167 Bacteria; Planctomycetes; Planctomycetacia; Planctomycetales; Planctomycetaceae; Isosphaera 12 Bacteria; Planctomycetes; Planctomycetacia; Planctomycetales; Planctomycetaceae; Pir3_lineage 3 Bacteria; Planctomycetes; Planctomycetacia; Planctomycetales; Planctomycetaceae; Pir4_lineage 122 Bacteria; Planctomycetes; Planctomycetacia; Planctomycetales; Planctomycetaceae; Pirellula 178 Bacteria; Planctomycetes; Planctomycetacia; Planctomycetales; Planctomycetaceae; Planctomyces 265 Bacteria; Planctomycetes; Planctomycetacia; Planctomycetales; Planctomycetaceae; Rhodopirellula 16 Bacteria; Planctomycetes; Planctomycetacia; Planctomycetales; Planctomycetaceae; Schlesneria 19 Bacteria; Planctomycetes; Planctomycetacia; Planctomycetales; Planctomycetaceae; Singulisphaera 21 Bacteria; Planctomycetes; Planctomycetacia; Planctomycetales; Planctomycetaceae; Zavarzinella 17 A15 Bacteria; Planctomycetes; Planctomycetacia; Planctomycetales; Planctomycetaceae; unclassified 329 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Caulobacterales; Caulobacteraceae; Asticcacaulis 7 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Caulobacterales; Caulobacteraceae; Brevundimonas 29 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Caulobacterales; Caulobacteraceae; Caulobacter 20 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Caulobacterales; Caulobacteraceae; Phenylobacterium 17 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Caulobacterales; Caulobacteraceae; unclassified 27 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Caulobacterales; Hyphomonadaceae; Hirschia 41 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Caulobacterales; Hyphomonadaceae; Hyphomonas 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Caulobacterales; Hyphomonadaceae; Woodsholea 53 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Parvularculales; Parvularculaceae; Parvularcula 10 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; A0839; unclassified 29 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Aurantimonadaceae; Aureimonas 3 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; B142; unclassified 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; BCf3-20; unclassified 3 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Beijerinckiaceae; Camelimonas 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Beijerinckiaceae; Chelatococcus 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Beijerinckiaceae; Methylovirgula 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Beijerinckiaceae; unclassified 4 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Bradyrhizobiaceae; Bosea 3 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Bradyrhizobiaceae; Rhodopseudomonas 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Bradyrhizobiaceae; unclassified 11 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Brucellaceae; Ochrobactrum 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; D05-2; unclassified 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; DUNssu044; unclassified 4 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; DUNssu371; unclassified 5 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; F0723; unclassified 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; FukuN57; unclassified 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Hyphomicrobiaceae; Devosia 8 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Hyphomicrobiaceae; Hyphomicrobium 27 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Hyphomicrobiaceae; Pedomicrobium 18 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Hyphomicrobiaceae; Prosthecomicrobium 3 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Hyphomicrobiaceae; Rhodomicrobium 3 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Hyphomicrobiaceae; Rhodoplanes 12 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Hyphomicrobiaceae; Vasilyevaea 4 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Hyphomicrobiaceae; unclassified 32 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; JG34-KF-361; unclassified 9 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; JG35-K1-AG5; unclassified 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; KF-JG30-B3; unclassified 8 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; MNG7; unclassified 9 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Methylobacteriaceae; Meganema 5 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Methylobacteriaceae; Methylobacterium 3 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Methylobacteriaceae; Microvirga 4 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Methylocystaceae; Methylosinus 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Methylocystaceae; Pleomorphomonas 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Methylocystaceae; unclassified 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Phyllobacteriaceae; Aliihoeflea 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Phyllobacteriaceae; Aminobacter 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Phyllobacteriaceae; Mesorhizobium 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Phyllobacteriaceae; Phyllobacterium 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Phyllobacteriaceae; unclassified 16 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Rhizobiaceae; Kaistia 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Rhizobiaceae; Rhizobium 8 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Rhizobiaceae; Shinella 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Rhizobiaceae; unclassified 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Rhizobiales_Incertae_Sedis; Agaricicola 3 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Rhizobiales_Incertae_Sedis; Bauldia 20 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Rhizobiales_Incertae_Sedis; Candidatus_Liberibacter 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Rhizobiales_Incertae_Sedis; Nordella 3 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Rhizobiales_Incertae_Sedis; Rhizomicrobium 60 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Rhodobiaceae; Parvibaculum 4 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Rhodobiaceae; Rhodobium 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Rhodobiaceae; Rhodoligotrophos 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Rhodobiaceae; unclassified 1 A16 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Xanthobacteraceae; Ancylobacter 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Xanthobacteraceae; Labrys 3 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Xanthobacteraceae; Pseudolabrys 11 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Xanthobacteraceae; Pseudoxanthobacter 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Xanthobacteraceae; Xanthobacter 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Xanthobacteraceae; unclassified 4 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; alphaI_cluster; unclassified 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodobacterales; Rhodobacteraceae; Amaricoccus 10 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodobacterales; Rhodobacteraceae; Defluviimonas 5 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodobacterales; Rhodobacteraceae; Falsirhodobacter 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodobacterales; Rhodobacteraceae; Paracoccus 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodobacterales; Rhodobacteraceae; Pseudorhodobacter 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodobacterales; Rhodobacteraceae; Rhodobacter 5 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodobacterales; Rhodobacteraceae; Rubellimicrobium 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodobacterales; Rhodobacteraceae; Tabrizicola 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodobacterales; Rhodobacteraceae; unclassified 163 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; AKYH478; unclassified 9 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; AT-s3-44; unclassified 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Acetobacteraceae; Acetobacter 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Acetobacteraceae; Acidicaldus 4 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Acetobacteraceae; Acidiphilium 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Acetobacteraceae; Belnapia 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Acetobacteraceae; Craurococcus 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Acetobacteraceae; Oleomonas 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Acetobacteraceae; Roseococcus 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Acetobacteraceae; Roseomonas 10 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Acetobacteraceae; Stella 14 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Acetobacteraceae; Zavarzinia 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Acetobacteraceae; unclassified 52 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; B79; unclassified 9 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; CCU22; unclassified 3 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; DA111; unclassified 11 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; I-10; unclassified 20 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; JG37-AG-20; unclassified 4 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; KCM-B-15; unclassified 5 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; KCM-B-60; unclassified 3 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; MNC12; unclassified 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; MND8; unclassified 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Rhodospirillaceae; Azospirillum 3 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Rhodospirillaceae; Candidatus_Riegeria 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Rhodospirillaceae; Defluviicoccus 8 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Rhodospirillaceae; Desertibacter 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Rhodospirillaceae; Dongia 6 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Rhodospirillaceae; Elstera 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Rhodospirillaceae; Ferrovibrio 8 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Rhodospirillaceae; Inquilinus 6 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Rhodospirillaceae; Insolitispirillum 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Rhodospirillaceae; Magnetospira 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Rhodospirillaceae; Magnetospirillum 4 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Rhodospirillaceae; Novispirillum 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Rhodospirillaceae; Skermanella 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Rhodospirillaceae; Telmatospirillum 3 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Rhodospirillaceae; Thalassobaculum 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Rhodospirillaceae; Thalassospira 5 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Rhodospirillaceae; unclassified 21 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Rhodospirillales_Incertae_Sedis; Candidatus_Alysiosphaera 7 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Rhodospirillales_Incertae_Sedis; Geminicoccus 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Rhodospirillales_Incertae_Sedis; Reyranella 83 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales; AKIW1012; unclassified 8 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales; Anaplasmataceae; 1 A17 Candidatus_Xenohaliotis Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales; EF100-94H03; unclassified 3 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales; Holosporaceae; unclassified 18 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales; LR_A2-29; unclassified 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales; LWSR-14; unclassified 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales; RB446; unclassified 7 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales; Rickettsiaceae; Rickettsia 31 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales; Rickettsiaceae; unclassified 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales; Rickettsiales_Incertae_Sedis; Candidatus_Captivus 44 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales; Rickettsiales_Incertae_Sedis; Candidatus_Lariskella 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales; Rickettsiales_Incertae_Sedis; Candidatus_Odyssella 20 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales; Rickettsiales_Incertae_Sedis; Constrictibacter 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales; Rickettsiales_Incertae_Sedis; unclassified 14 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; 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Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Alcaligenaceae; Oligella 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Alcaligenaceae; Parasutterella 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Alcaligenaceae; Pigmentiphaga 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Alcaligenaceae; Pusillimonas 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Alcaligenaceae; Sutterella 3 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Alcaligenaceae; unclassified 62 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Burkholderiaceae; Burkholderia 5 A18 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Burkholderiaceae; Chitinimonas 14 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Burkholderiaceae; Cupriavidus 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Burkholderiaceae; Lautropia 10 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Burkholderiaceae; Limnobacter 5 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Burkholderiaceae; Pandoraea 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Burkholderiaceae; Polynucleobacter 14 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Burkholderiaceae; Ralstonia 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Burkholderiaceae; unclassified 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Burkholderiales_Incertae_Sedis; Thiomonas 2 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Acidovorax 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Aquabacterium 6 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Aquincola 2 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Azohydromonas 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Caenimonas 3 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Chlorochromatium 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Comamonas 5 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Curvibacter 2 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Delftia 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Diaphorobacter 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Giesbergeria 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Hydrogenophaga 3 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Hylemonella 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Ideonella 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Inhella 3 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Leptothrix 2 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Limnohabitans 19 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Macromonas 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Methylibium 3 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Ottowia 2 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Paucibacter 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Piscinibacter 2 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Polaromonas 5 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Pseudorhodoferax 3 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Ramlibacter 3 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Rhizobacter 11 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Rhodoferax 7 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Rubrivivax 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Simplicispira 5 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Variovorax 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Verminephrobacter 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; unclassified 366 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Oxalobacteraceae; Collimonas 2 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Oxalobacteraceae; Duganella 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Oxalobacteraceae; Herbaspirillum 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Oxalobacteraceae; Herminiimonas 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Oxalobacteraceae; Janthinobacterium 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Oxalobacteraceae; Massilia 10 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Oxalobacteraceae; Oxalicibacterium 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Oxalobacteraceae; Paucimonas 3 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Oxalobacteraceae; Pseudoduganella 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Oxalobacteraceae; Undibacterium 7 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Oxalobacteraceae; unclassified 81 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Hydrogenophilales; Hydrogenophilaceae; Ferritrophicum 2 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Hydrogenophilales; Hydrogenophilaceae; Sulfuricella 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Hydrogenophilales; Hydrogenophilaceae; Thiobacillus 5 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Methylophilales; Methylophilaceae; Methylobacillus 2 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Methylophilales; Methylophilaceae; Methylophilus 2 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Methylophilales; Methylophilaceae; Methylotenera 7 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Methylophilales; Methylophilaceae; PRD01a011B 3 A19 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Methylophilales; Methylophilaceae; unclassified 13 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales; Neisseriaceae; Andreprevotia 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales; Neisseriaceae; Aquaspirillum 4 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales; Neisseriaceae; Chitinibacter 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales; Neisseriaceae; Deefgea 2 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales; Neisseriaceae; Formivibrio 3 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales; Neisseriaceae; Laribacter 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales; Neisseriaceae; Leeia 7 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales; Neisseriaceae; Microvirgula 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales; Neisseriaceae; Paludibacterium 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales; Neisseriaceae; Uruburuella 2 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales; Neisseriaceae; Vitreoscilla 2 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales; Neisseriaceae; Vogesella 2 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales; Neisseriaceae; unclassified 7 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Nitrosomonadales; Gallionellaceae; Candidatus_Nitrotoga 4 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Nitrosomonadales; Nitrosomonadaceae; Nitrosomonas 18 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Nitrosomonadales; Nitrosomonadaceae; Nitrosospira 2 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Nitrosomonadales; Nitrosomonadaceae; unclassified 37 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Rhodocyclales; Rhodocyclaceae; 12up 7 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Rhodocyclales; Rhodocyclaceae; Azospira 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Rhodocyclales; Rhodocyclaceae; Candidatus_Accumulibacter 3 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Rhodocyclales; Rhodocyclaceae; Dechloromonas 7 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Rhodocyclales; Rhodocyclaceae; Denitratisoma 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Rhodocyclales; Rhodocyclaceae; Ferribacterium 3 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Rhodocyclales; Rhodocyclaceae; Georgfuchsia 5 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Rhodocyclales; Rhodocyclaceae; Methyloversatilis 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Rhodocyclales; Rhodocyclaceae; Propionivibrio 6 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Rhodocyclales; Rhodocyclaceae; Sterolibacterium 2 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Rhodocyclales; Rhodocyclaceae; Sulfuritalea 12 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Rhodocyclales; Rhodocyclaceae; Thauera 4 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Rhodocyclales; Rhodocyclaceae; Uliginosibacterium 13 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Rhodocyclales; Rhodocyclaceae; Zoogloea 14 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Rhodocyclales; Rhodocyclaceae; unclassified 78 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Bdellovibrionales; Bacteriovoracaceae; Bacteriovorax 6 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Bdellovibrionales; Bacteriovoracaceae; Peredibacter 62 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Bdellovibrionales; Bacteriovoracaceae; unclassified 6 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Bdellovibrionales; Bdellovibrionaceae; Bdellovibrio 240 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Bdellovibrionales; Bdellovibrionaceae; OM27_clade 71 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Deltaproteobacteria_Incertae_Sedis; Syntrophorhabdaceae; Syntrophorhabdus 1 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Desulfarculales; Desulfarculaceae; Desulfarculus 1 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Desulfobacterales; Desulfobacteraceae; Candidatus_Desulfamplus 2 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Desulfobacterales; Desulfobacteraceae; Desulfobacter 1 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Desulfobacterales; Desulfobacteraceae; Desulfobacterium 1 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Desulfobacterales; Desulfobacteraceae; Desulforegula 2 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Desulfobacterales; Desulfobacteraceae; unclassified 1 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Desulfobacterales; Desulfobulbaceae; Desulfobulbus 3 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Desulfobacterales; Desulfobulbaceae; unclassified 1 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Desulfobacterales; Nitrospinaceae; Candidatus_Entotheonella 3 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Desulfovibrionales; Desulfomicrobiaceae; Desulfomicrobium 1 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Desulfovibrionales; Desulfovibrionaceae; Bilophila 1 Bacteria; 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Tolumonas 2 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Aeromonadales; Aeromonadaceae; unclassified 3 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Aeromonadales; Succinivibrionaceae; Succinivibrio 1 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Alteromonadales; Alteromonadaceae; BD1- 7_clade 10 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Alteromonadales; Alteromonadaceae; C1-B045 2 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Alteromonadales; Alteromonadaceae; Haliea 6 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Alteromonadales; Alteromonadaceae; Simiduia 6 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Alteromonadales; Alteromonadaceae; unclassified 13 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Alteromonadales; Shewanellaceae; Shewanella 1 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Chromatiales; Chromatiaceae; Nitrosococcus 1 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Chromatiales; Chromatiaceae; Rheinheimera 10 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; 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