Centro De Investigacion Y De Estudios Avanzados Del Instituto Politecnico Nacional
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CENTRO DE INVESTIGACION Y DE ESTUDIOS AVANZADOS DEL INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL UNIDAD ZACATENCO DEPARTAMENTO DE GENÉTICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR “Genómica comparativa y funcional de fagos que infectan Pseudomonas aeruginosa” Tesis que presenta M. en C. ADRIÁN CAZARES LÓPEZ para obtener el Grado de Doctor en Ciencias en la Especialidad de Genética y Biología Molecular DIRECTOR DE LA TESIS: DR. GABRIEL GUARNEROS PEÑA CIUDAD DE MÉXICO DICIEMBRE, 2016 Adrián Cazares López Tesis de Doctorado ASESORES Dr. Rosa Ma. Bermúdez Cruz Departamento de Genética y Biología Molecular, Cinvestav-IPN Dr. Luis Kameyama Kawabe Departamento de Genética y Biología Molecular, Cinvestav-IPN Dr. Javier Hernández Sánchez Departamento de Genética y Biología Molecular, Cinvestav-IPN Dra. Norma Oviedo de Anda Unidad de Investigación en Infectología e Inmunología, Centro Médico Nacional La Raza, IMSS Dr. Gabriel Moreno Hagelsieb Departamento de Biología, Wilfrid Laurier University Ontario, Canadá Adrián Cazares López Tesis de Doctorado Este trabajo se realizó bajo la dirección del Dr. Gabriel Guarneros Peña en el laboratorio 8 del Departamento de Genética y Biología Molecular del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional. El autor de este trabajo agradece que durante la realización del mismo fue becario del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (no. de registro: 233018). Adrián Cazares López Tesis de Doctorado Agradecimientos A mi familia: A mis padres. A mi madre por enseñarme con el ejemplo que el trabajo, la perseverancia y el sacrificio representan la única fórmula a seguir para convertirse en un mejor ser humano. A mi padre QEPD por mostrarme que aun el recuerdo puede soportar la unión de una familia y los sueños de un individuo. No existen palabras suficientes para agradecer no solo el darme la vida sino mostrarme el camino para vivirla sin reservas. A mi hermano, por ser cómplice de vida, metas y sueños desde el principio. Por mostrarme el espíritu de competitividad y dedicación en su máxima expresión. Por hacerme sentir orgulloso de trabajar contigo y ser testigo de tus logros. Gracias por brindarme la mejor amistad que un individuo podría pedir. A mi novia, por convertirte en una compañera incondicional de trabajo, de viajes, de ilusiones, de vida. Por el apoyo y compresión brindado durante la realización de este trabajo. Por el presente y el futuro. Por ser parte de mi familia. A mis amigos: A la Dra. Fabiola, por el apoyo absoluto y la ayuda brindada durante todo mi doctorado, particularmente en mis visitas a CCG. A Thomas, por la ayuda invaluable, por convertirse en mi mejor amigo durante mi estancia en Canadá. Al Dr. Cesar y Ramiro por ser extraordinarios compañeros y amigos y hacer de mi estancia en WLU una aventura aún más enriquecedora. Al Dr. Fabiano por ser un excelente compañero de laboratorio y amigo y por su ayuda durante mi estancia en San Diego. A Daniel y Geni por hacerme sentir bienvenido en SDSU y hacer mi estancia más placentera. Al Dr. Rodolfo García por todas las charlas constructivas, por permitirme trabajar con su equipo y la amistad brindada hacia mi persona. A Enith, por ser una compañera de trabajo y colaboradora ejemplar. A la Dra. Eva Martínez, por toda la ayuda, enseñanzas y apoyo ofrecidos durante mi estancia en Adrián Cazares López Tesis de Doctorado CINVESTAV. Al M. en C. Marco Magos, por su valiosa ayuda y amistad durante estos últimos años. Al señor Aurelio y la señora Flor, por todos los consejos y su interés hacia mi persona. A Gabriela Mora, por su auxilio constante durante todo el doctorado. A mis asesores: A los Doctores Luis Kameyama, Norma Oviedo, Rosa M. Bermúdez, Gabriel Moreno y Javier Hernández por los comentarios y sugerencias que contribuyeron a construir el presente trabajo y por la disposición y tiempo dedicados al asesoramiento de esta tesis. A los doctores Luis Kameyama, Norma Oviedo y Rosa M. Bermúdez, en particular, por el interés mostrado durante todo el doctorado hacia mi desarrollo académico. Gracias por todos los consejos personales. Al Dr. Gabriel Guarneros por dirigir esta tesis. Por fungir como un director de tesis crítico y objetivo hacia mi trabajo, lo cual contribuyó a mejorar la calidad del mismo y a mi formación en la investigación. Al Dr. Gabriel Moreno por recibirme en su laboratorio en Canadá y su disposición para compartir ideas y conocimientos durante mi estancia. A los Doctores Pablo Vinuesa y Robert Edwards por fungir como asesores de este trabajo a pesar de no serlo oficialmente. Gracias por recibirme en sus laboratorios y proporcionarme conocimientos invaluables de su área de investigación además de su interés en mi desarrollo dentro de la investigación. A la Dra. Guadalupe Ortega Pierres, un agradecimiento especial por el interés y apoyo mostrado hacia mi desarrollo profesional. Adrián Cazares López Tesis de Doctorado Índice Índice I Índice de Figuras II Índice de Tablas III Resumen IV Abstract V Lista de abreviaturas VI 1. Introducción 1 1.1. Generalidades de bacteriófagos 1 1.2. Genómica de bacteriófagos 6 2. Antecedentes 11 3. Justificación 16 4. Objetivos 17 4.1 Objetivo general 17 4.2 Objetivos particulares 17 5. Esquema General de Trabajo 18 6. Materiales y métodos 19 7. CAPÍTULO 1: Caracterización y clasificación genómica de 30 bacteriófagos de P. aeruginosa aislados en México Resultados 30 Discusión 49 Conclusiones 53 8. CAPÍTULO 2: Análisis del grupo D3112virus 55 Resultados 55 Discusión 69 Conclusiones 73 9. CAPÍTULO 3: Caracterización genómica del grupo F116virus 75 Resultados 75 Discusión 105 Conclusiones 110 10. CAPÍTULO 4: Análisis comparativo y funcional del grupo B3-like 111 Resultados 111 Discusión 120 Conclusiones 125 11. CAPÍTULO 5: Identificación In silico de profagos en genomas de P. 126 aeruginosa Resultados 126 Discusión 136 Conclusiones 141 12. Perspectivas 143 13. Material Suplementario 145 14. Referencias 156 15. Anexos 160 Adrián Cazares López Tesis de Doctorado Índice de Figuras Capítulo 1 Figura 1.1. Distribución de tamaños genómicos de fagos de 43 Pseudomonas Figura 1.2. Contenido de GC en genomas de fagos de 44 Pseudomonas Figura 1.3. Comparación entre secuencias genómicas de Ps54 y 47 regiones profágicas putativas de la cepa DHS01 Capítulo 2 Figura 2.1. Loci de inserción de profagos del grupo D3112virus 59 Figura 2.2. Árbol Neighbor-joining de los genomas D3112virus 61 comparados en este studio Figura 2.3. Mapa del pangenoma del grupo D3112virus 62 Figura 2.4. Frecuencia de ORFs accesorios en los genomas 63 D3112virus analizados Figura 2.5. Caracterización por PCR de regiones genómicas 68 variables de fagos tipo D3112virus Capítulo 3 Figura 3.1. Mapas genómicos de fagos del grupo F116virus 76 Figura 3.2. Mapa del pangenoma del grupo F116virus 82 Figura 3.3. Frecuencia de homólogos para ORFs del pangenoma 83 de fagos tipo F116virus Figura 3.4. Regiones genómicas bacterianas homólogas a 89 genomas F116virus Figura 3.5. Comparación nucleotídica de genomas F116virus con 90 regiones profágicas Figura 3.6. Sitios de inserción probables para los fagos H66 y 91 LKA5 Figura 3.7. Dominios conservados identificados en las secuencias 92 proteicas de las integrasas de los fagos H66 y LKA5 Figura 3.8. Sitios att candidatos de fagos tipo F116virus LKA5- 96 like Figura 3.9. Sitios att candidatos de fagos tipo F116virus H66-like 97 Figura 3.10. Estandarizacion de PCR para identificar inserción 102 de fagos tipo F116virus Figura 3.11. Análisis de Integración del fago H66 mediante PCR 103 Figura 3.12. Análisis de Integración del fago LKA5 mediante 104 PCR Capítulo 4 Figura 4.1. Comparación genómica de bacteriófagos del grupo 117 B3-like Adrián Cazares López Tesis de Doctorado Figura 4.2. Mapa del pangenoma del grupo B3-like 118 Figura 4.3. SGS-PAGE de las proteínas estructurales del virión 120 del fago Fc02 Capítulo 5 Figura 5.1. Características de las secuencias genómicas de P. 127 aeruginosa depositadas en la base de datos de ensamble de NCBI Figura 5.2. Número de elementos fágicos identificados por los 129 programas PHAST y PhiSpy Figura 5.3. Número de proteínas bacterianas que contienen 129 Dominios Conservados presentes en proteínas fágicas Figura 5.4. Mapeo de los elementos fágicos identificados en el 130 genoma de la cepa NCGM 1984 con tres diferentes estrategias de búsqueda Figura 5.5. Mapeo de las proteínas bacterianas de la cepa NCGM 132 1984 que contienen CD’s relacionados y no relacionados a fagos según su descripción Figura 5.6. Elemento fágico identificado por PHAST en la cepa 133 39016 Figura 5.7. Mapeo de los elementos fágicos identificados en el 135 genoma de la cepa LESB58 con tres diferentes estrategias de búsqueda y aquellos reportados por Winstanley et al 2009 Material Suplementario Figura S1. Mapas y comparación genómica de fagos tipo 150 D3112virus Figura S2. Mapas y comparación genómica de profagos tipo 151 D3112virus Figura S3. Comparación genómica de bacteriófagos del grupo 152 F116virus Figura S4. SGS-PAGE de las proteínas estructurales de los 153 viriones de H66 y LKA5 Figura S5. Localización de los oligos para la determinación de 154 integración de fagos del tipo F116virus. Figura S6. Regiones profágicas identificadas en el genoma de la 155 cepa LESB58 Adrián Cazares López Tesis de Doctorado Índice de Tablas Capítulo 1 Tabla 1.1. Estatus de secuenciación de la colección de fagos del 31 laboratorio Tabla 1.2. Clasificación taxonómica de fagos de Pseudomonas 36 Capítulo 2 Tabla 2.1. Oligos para la caracterización de fagos del grupo 64 D3112virus Tabla 2.2. Amplicones esperados en la caracterización por PCR 65 de fagos del grupo D3112virus Capítulo 3 Tabla 3.1. Oligos para la identificación de inserción de fagos del 100 grupoF116virus en la cepa PAO1 Capítulo 5 Tabla 5.1.