Spongiaires Irciniidae De Méditerranée

UNIVERSITE DE LA MEDITERRANEE AIX-MARSEILLE II

ECOLE DOCTORALE SCIENCES DE L’ENVIRONNEMENT

Thèse de Doctorat en Océanographie

Présentée et soutenue publiquement par

Charline ABED

Le 25 Novembre 2011

Spongiaires Irciniidae de Méditerranée :

chimiotaxonomie, métabolites volatils et bio-indicateurs de pollution par les éléments traces métalliques.

Jury :

Rapporteurs : AL-MOURABIT Ali DR2 CNRS, ICSN, Gif / Yvette CULIOLI Gérald MC, Université du Sud Toulon - Var Examinateurs : VACELET Jean DR1 CNRS, Centre d’Océanologie de Marseille BITAR Ghazi Professeur, Université Libanaise, Beyrouth, Liban Directeurs de thèse : FERAL Jean-Pierre DR1 CNRS, Centre d’Océanologie de Marseille MEHIRI Mohamed MC, Université de Nice Sophia - Antipolis

REMERCIEMENTS

Je remercie le Docteur Jean-Pierre Féral, directeur du laboratoire de DIMAR – UMR 6540, du Centre d’Océanologie de Marseille, Université de la Méditerranée, d’avoir accepté de diriger cette thèse.

Mes remerciements vont au laboratoire LCMBA (Laboratoire de Chimie des Molécules Bioactives et des Arômes) - UMR 6001, de l’Université de Nice Sophia - Antipolis et à son directeur le Docteur Pierre Vierling pour m’avoir acceuilli tout au long de ma thèse.

Je suis très honorée que le Docteur Ali Almourabit, directeur de recherche à l’Institut de Chimie des Substances Naturelles, Gif / Yvette et le Docteur Gérald Culioli, maître de conférences à l’Université du Sud Toulon - Var, aient accepté de juger ce travail. Qu’ils trouvent ici l’expression de ma considération et de mes remerciements.

Je remercie également le Docteur Jean Vacelet, directeur de recherche au Centre d’Océanologie de Marseille pour ses conseils précieux concernant la taxonomie des espèces et ses remarques pour le manuscrit.

Je tiens à remercier le Conseil National de la Recherche Scientifique (CNRS) au Liban de m’avoir attribué une bourse interne pour ma thèse, ainsi que le soutien financier d’EGIDE (Ambassade de France au Liban), de l’Université de Nice Sophia - Antipolis et du CNRS en France qui m’a été accordé par les laboratoires LCMBA et DIMAR. Je remercie également le GDR BioChiMar pour la bourse attribuée à ma participation au « 6th European Conference on Marine Natural Products » à Porto, (Portugal) et qui m’a permis d’exposer une partie de mes résultats.

Je remercie tous les membres du programme ECIMAR ANR-Biodiversité, plongeurs et non- plongeurs, qui ont participé à la récolte des échantillons provenant de plusieurs sites de la mer Méditerranée.

Mes remerciements au Docteur Philippe Amade, directeur de l’équipe Substances Naturelles Marines au Laboratoire LCMBA de l’Université de Nice Sophia - Antipolis, pour ses précieux conseils et remarques concernant ce travail. J’exprime toute ma gratitude envers les Docteurs Charlotte Hurel, Cécilia Castel et Jean- Jacques Filippi pour leur agréable encadrement au cours de mes expériences au sein de leurs unités de recherche.

Je tiens à exprimer toute ma reconnaissance à mon co-directeur de thèse et encadrant, le Docteur Mohamed Mehiri, pour ses conseils et sa disponibilité au quotidien ; son aide et sa confiance m’ont été d’une importance cruciale pour le déroulement de ma thèse. Je lui exprime ma gratitude pour tout le soutien qu’il continue à m’accorder.

Je remercie profondément ma sœur pour sa présence, son support moral et ses encouragements me donnaient un énorme élan à chaque fois que j’en avais besoin.

Ma plus grande gratitude et mon profond respect à mon père pour son support et ses conseils précieux qui ont été essentiels à ma vie et mes études.

Cette thèse a principalement été préparée au sein des trois laboratoires suivants :

Laboratoire de Chimie des Molécules Bioactives et des Arômes (LCMBA) UMR 6001 Equipe Substances Naturelles Marines Université de Nice – Sophia Antipolis, UFR Sciences 28 avenue de Valrose, F – 06108 Nice, Cedex 2, France

Laboratoire Diversité, Evolution et Ecologie Fonctionnelle Marine (DIMAR) UMR 6540 Centre d’Océanologie de Marseille Rue de la Batterie des Lions, 13007 Marseille, France

Centre National des Sciences Marines (CNSM) Conseil National de la Recherche Scientifique (CNRS) – Liban P.O. Box 534, Batroun, Liban

RESUME

Spongiaires Irciniidae de Méditerranée : chimiotaxonomie, métabolites volatils et bioindicateurs de pollution par les éléments traces métalliques

Le projet de recherche qui m’a été confié concerne l’étude des éponges Irciniidae de Méditerranée : Ircinia oros, I. variabilis, I. dendroides, Sarcotragus spinosulus et S. foetidus ; collectées, dans le cadre du programme ECIMAR (ANR Biodiversité 2006), dans huit différents sites : détroit de Gibraltar (Ceuta - Espagne), bassin nord occidental (Costa Blanca et l’Estartit – Espagne et Banyuls, Marseille et l’île de Corse - France) et le bassin oriental (Crète - Grèce et Liban) . La famille Irciniidae est actuellement constituée de trois genres : Ircinia, Sarcotragus et Psammocinia. La systématique de ces éponges est relativement complexe. Ainsi, le statut de Sarcotragus est considéré comme incertain et la distinction entre certaines espèces d’Ircinia fait encore l’objet de nombreuses discussions. Pour tenter de clarifier ce désordre de la classification biologique, nous avons choisi, dans un premier temps, une étude chimiotaxonomique basée sur la RMN 1H et les analyses multivariées. Par cette approche de métabolomique des différentes espèces, nous avons pu démontrer que les genres Ircinia et Sarcotragus sont caractérisés, d’un point de vue chimique, par des marqueurs chimiotaxonomiques appartenant respectivement à la famille des furanoterpènes et des hydroquinones prénylées. Dans un second temps, nous avons mené une étude comparative des composés volatils présents dans les espèces I. oros, I. variabilis, I. dendroides et S. spinosulus, provenant de trois sites : Marseille, Ceuta et Costa blanca. En effet, des composés volatils comme le diméthylsulfure, le méthylisocyanate et le méthylisothiocyanate, sont présents dans Ircinia felix et ils sont responsables de la forte odeur caractéristique et nauséabonde de cette espèce. L’identité et le rôle écologique potentiel de l’ensemble des volatils sont encore peu étudiés. Plusieurs hypothèses concernant leurs origines ont été proposées (éponge et/ou symbiote) sans toutefois parvenir à une conclusion certaine. De plus, les composés volatils présents dans les éponges Sarcotragus n’ont pas été étudiés, bien qu’elles se distinguent également par une forte odeur. Dans ce cadre, nous avons mis au point un protocole d’étude des composés volatils des spongiaires en utilisant la microextraction SPME de l’espace de tête et l’analyse par CG-SM et/ou CG*CG-MS. Les composés identifiés sont des alcanes, des alcènes, des aldéhydes, des dérivés furaniques et soufrés, issus fort probablement de la dégradation de terpénoïdes par les bactéries associées aux éponges. Enfin, nous avons réalisé une étude comparative de la bioaccumulation d’éléments trace métalliques (ETM) par I. oros, I. variabilis et S. spinosulus, afin d’identifier de potentiels bioindicateurs de pollution par les ETM dont la contamination a considérablement augmenté en Méditerranée pendant ces 20 dernières années. Notre étude a révélé que les différentes espèces semblent bioaccumuler l’arsenic, le chrome, le cuivre, le fer et le plomb, alors qu’elles régulent le cadmium.

Mots clefs : Irciniidae, mer Méditerranée, marqueurs chimiotaxonomiques, composés volatiles, SPME, bio-indicateurs.

ABSTRACT

The Irciniidae marine sponges from the Mediterranean Sea: secondary metabolism, volatile compounds and potential bio-indicators of a heavy metal pollution

Marine sponges of the Irciniidae family (I. oros, I. variabilis, I. dendroides, S. spinosulus and S. foetidus) collected during the french ANR program ECIMAR from eight different areas over the Mediterranean Sea: Gibraltar Straits (Ceuta - Spain), North Western basin (Costa Blanca and Estartit – Spain and Banyuls, Marseille and Corsica Island - France, and Monaco) and Eastern basin (Crete - Greece and Lebanon) were studied. We used first a chemotaxonomical approach based on 1H NMR chemical fingerprints and multivariate analysis to better characterize the species. Systematic of the Irciniidae family is still unclear, notably the status of Sarcotragus is viewed as uncertain and the distinction of some Ircinia species remains difficult. To clarify this biological classification disorder, we used a chemosystematics strategy. In the present study, we showed that Ircinia and Sarcotragus genera are chemically characterized by chemotaxonomic markers belonging to furanoterpenes and prenylated hydroquinones families respectively. We report also a comparative GC-MS analysis of the volatile components of S. spinolusus, I. oros, I. variabilis and I. dendroides using static headspace solid phase microextraction (HS- SPME). Sponges of the genus Ircinia were described to exude low-molecular-weight volatile compounds (e.g., dimethyl sulfide, methyl isocyanide, methyl isothiocyanate) that give these sponges a characteristic strong and unpleasant odor. To date, the volatile constituents of sponges of the genus Sarcotragus have not been studied, though their odor is no lighter than the associated genus Ircinia from the same family. The impact of different parameters (e.g., sample weight, fiber coating, extraction time and temperature) was evaluated to determine the best conditions of analysis. The types of compounds identified include alkanes, alkenes, aldehydes, ketones, furans, and sulfides probably produced from bacterial degradation of naturally occurring terpenoids. Finally, we performed a comparative study on metal bioaccumulation by I. oros, I. variabilis, and S. spinosulus to select the most suitable species for metal monitoring. Contamination by heavy metals has increased drastically in the coastal Mediterranean during the last 20 years. Arsenic, chromium, copper, iron and lead bioaccumulation were shown to fit an accumulation strategy, while cadmium seemed to be bio-regulated.

Keywors: Irciniidae, Mediterranean Sea, chemotaxonomic markers, volatile compounds, SPME, bio-indicators.

TABLE DES MATIERES

INTRODUCTION ...... 1 I. INTRODUCTION GENERALE ...... 4 1. Le phylum Porifera ...... 4 1. 1. Cytologie ...... 4 1. 2. Taxonomie ...... 6 1. 3. Utilisation de la biologie moléculaire ...... 8 1. 4. Problèmes de classification des éponges cornées ...... 9 2. Les Irciniidae ...... 11 2. 1. Généralités ...... 11 2. 1. 1. Cycle de vie ...... 11 2. 1. 2. Relations symbiotiques ...... 12 2. 2. Systématique des Irciniidae ...... 13 2. 2. 1. Le genre Ircinia ...... 15 2. 2. 2. Le genre Sarcotragus ...... 18 2. 2. 3. Le genre Psammocinia ...... 20 2. 3. Métabolites secondaires des Irciniidae ...... 22 2. 3. 1. Structures chimiques ...... 22 2. 3. 2. Rôles écologiques ...... 23 2. 3. 3. Activités biologiques ...... 25 3. Présentation du sujet ...... 25 3. 1. Ecologie chimique marine ...... 26 3. 1. 1. Les Relations intraspécifiques ...... 26 3. 1. 2. Les relations interspécifiques ...... 27 3. 1. 3. Le biofouling ou les épibioses ...... 28 3. 2. Projets sur l’écologie chimique marine...... 29 3. 3. Le projet ECIMAR ...... 30 3. 4. Objectifs de la thèse ...... 32 II. ETUDE CHIMIOTAXONOMIQUE DES IRCINIIDAE...... 37 1. Introduction...... 37 2. Les métabolites secondaires des Irciniidae ...... 39 2. 1. Polypeptides cycliques ...... 40 2. 2. Alcaloïdes et autres dérivés azotés ...... 41 2. 3. Macrolides ...... 42 2. 4. Dérivés soufrés ...... 43 2. 5. Stérols ...... 44 2. 6. Furanosesterterpènes et dérivés ...... 45 2. 7. Polyprénylhydroquinones et dérivés ...... 55 3. Bilan et objectifs ...... 56 4. Les outils analytiques utilisés pour l’étude des profils métabolomiques ...... 58 5. Les analyses par RMN ...... 59 6. Métabolomique par RMN 1H ...... 60 6. 1. Prétraitement et normalisation ...... 60 6. 2. Echantillonnage ...... 60 6. 3. Régions d’intérêts et exclusions ...... 63 7. Les outils statistiques...... 63 7. 1. Analyse en composantes principales (ACP) ...... 64 7. 2. Analyse discriminante (PLS) ...... 64 7. 3. Classification ...... 66 8. Résultats ...... 66 8. 1. Taxonomie ...... 66 8. 2. Métabolomique par RMN 1H ...... 69 8. 2. 1. Ircinia oros ...... 69 8. 2. 2. Ircinia dendroides ...... 71 8. 2. 3. Ircinia variabilis ...... 73 8. 2. 4. Sarcotragus foetidus ...... 75 8. 2. 5. Sarcotragus spinosulus ...... 77 9. Etude de Sarcotragus spinosulus (090618Ce7-05) ...... 79 10. Analyses statistiques multivariées...... 84 11. Discussion ...... 90 12. Conclusion ...... 94 13. Matériels et Méthodes ...... 95 13. 1. Généralités ...... 95 13. 2. Sites et protocole d’échantillonnage ...... 97 13. 3. Détermination taxonomique ...... 97 13. 4. Protocole d’extraction des éponges ...... 100 13. 5. Signatures chimiques des espèces par HPLC, HPLC/MS et RMN 1H ...... 101 13. 5. 1. Ircinia oros (080728Ba1-18) ...... 103 13. 5. 2. Ircinia dendroides (090614Cb3-05) ...... 106 13. 5. 3. Ircinia variabilis (090702Ma5-06) ...... 109 13. 5. 4. Sarcotragus foetidus (080612Co1-05) ...... 113 13. 5. 5. Sarcotragus spinosulus (090618Ce7-05) ...... 120 13. 6. Signature chimique par RMN 1H ...... 131 13. 6. 1. Ircinia oros ...... 131 13. 6. 2. Ircinia dendroides ...... 132 13. 6. 3. Ircinia variabilis ...... 133 13. 6. 4. Sarcotragus foetidus ...... 134 13. 6. 5. Sarcotragus spinosulus ...... 135 III. LES COMPOSES VOLATILS DES IRCINIIDAE ...... 136 1. Introduction...... 136 1. 1. Les Composés Organiques Volatils ...... 136 1. 2. Généralités sur les composés volatils en milieu marin ...... 137 1. 3. Les composés volatils chez les Irciniidae ...... 138 1. 4. Objectif du travail ...... 139 2. Techniques métabolomiques pour l’étude de composés de faible poids moléculaire ...... 140 2. 1. Techniques d’extraction de composés de faible poids moléculaire ...... 140 2. 1. 1. Technique d’extraction utilisée : HS-SPME ...... 141 2. 2. Techniques d’analyse de composés de faible poids moléculaire ...... 145 2. 2. 1. Techniques d’analyse utilisées : GC×GC-MS ...... 145 2. 2. 2. Les indices de rétention ...... 147 2. 2. 3. Les détecteurs ...... 148 3. Matériels et méthodes ...... 149 3. 1. Sites et protocole d’échantillonnage ...... 149 3. 2. Mise au point du protocole utilisé pour l’acquisition des signatures chimiques (GC-MS) 151 3. 2. 1. Préparation des échantillons et optimisation des paramètres ...... 151 3. 2. 2. Types et conditionnement des fibres SPME ...... 151 3. 2. 3. Analyses par GC-MS ...... 152 3. 2. 4. Description et paramétrage de la GC-MS ...... 152 3. 2. 5. Identification des composés volatils ...... 153 4. Résultats et discussions ...... 153 4. 1. Sélection de la fibre SPME ...... 154 4. 2. Evaluation des paramètres d’incubation et d’extraction ...... 155 4. 2. 1. Evaluation du paramètre temps ...... 156 4. 2. 3. Evaluation du paramètre température ...... 156 4. 3. Identification des composés volatils des éponges étudiées ...... 157 5. Conclusions et perspectives ...... 172 IV. ETUDE COMPARATIVE DE LA BIOACCUMULATION D’ELEMENTS TRACES METALLIQUES PAR LES IRCINIIDAE EN MEDITERRANEE ...... 174 1. Introduction générale ...... 174 2. Les éléments traces métalliques (ETM) ...... 175 2. 1. Généralités ...... 175 2. 2. Sources anthropiques ...... 176 2. 3. Impacts des ETM sur la santé ...... 177 3. Les ETM dans le milieu marin ...... 178 3. 1. Généralités ...... 178 3. 2. Dynamique des ETM en milieu marin ...... 179 3. 2. 1. Dynamique verticale ...... 180 3. 2. 2. Dynamique spatiale et temporelle ...... 182 3. 3. Les ETM en Méditerranée ...... 182 4. Quantification des ETM dans le milieu marin ...... 184 4. 1. La colonne d’eau ...... 185 4. 2. Les sédiments ...... 185 4. 3. Les organismes marins ...... 186 4. 3. 1. Les mollusques ...... 188 4. 3. 2. Les vers polychaetes ...... 189 4. 3. 3. Les crustacés ...... 190 4. 3. 4. Les spongiaires ...... 190 5. Objectif du travail ...... 192 6. Matériels et méthodes ...... 192 6. 1. Sites d’échantillonnage en Méditerranée ...... 192 6. 2. Minéralisation ...... 195 6. 3. Analyse des éléments par ICP-OES ...... 197 6. 4. Traitement statistique ...... 198 7. Résultats et discussion ...... 198 7. 1. Résultats ...... 198 7. 1. 1. Bioaccumulation des ETM par Ircinia oros ...... 198 7. 1. 2. Bioaccumulation des ETM par Ircinia variabilis ...... 201 7. 1. 3. Bioaccumulation des ETM par Sarcotragus spinosulus ...... 205 7. 2. Discussions ...... 207 8. Conclusion ...... 213 V. CONCLUSION GENERALE ...... 214 VI. OUVRAGES ET REALISATIONS ...... 217 VII. REFERENCES ...... 232 VIII. ANNEXES ...... 285 Annexe 1 : Les différentes espèces acceptées appartenant à la famille des Irciniidae selon World Porifera Database (http://www.marinespecies.org/porifera/porifera.php?p=taxlist)...... 285 Annexe 2 : Les échantillons récoltés selon les différentes zones et sites, ainsi que les études réalisées pour chaque échantillon...... 288 Annexe 3 : Chromatogrammes correspondants aux 1er et 2ème fractionnements de l’échantillon Ircinia dendroides (090614Cb3-05)...... 289 Annexe 4 : Chromatogrammes correspondants aux 1ers fractionnements de l’échantillon 090702Ma5-06 Ircinia variabilis...... 290 Annexe 5 : Chromatogrammes correspondants aux 1ers et 2èmes fractionnements de Sarcotragus foetidus (080612Co1-05)...... 291 Annexe 6 : Chromatogrammes correspondants au fractionnement de Sarcotragus spinosulus (090618Ce7-05)...... 294 Annexe 7 : Comparaison des différents résultats d’identifications effectués pour chaque échantillon ...... 296 Annexe 8 : Profil GC-MS 2D de l’espèce Sarcotragus spinosulus ...... 297 Profil GC-MS 2D de l’espèce Ircinia dendroides ...... 298 Profil GC-MS 2D de l’espèce Ircinia oros ...... 299 Profil GC-MS 2D de l’espèce Ircinia variabilis ...... 300 Annexe 9 : Caractéristiques des ETM analysés par ICP-OES...... 301 INTRODUCTION

Les spongiaires, plus connus sous le nom d’éponges, constituent l’embranchement le moins évolué des métazoaires, à la frontière entre le monde des protozoaires (animaux unicellulaires) et le véritable monde des métazoaires (animaux pluricellulaires). Les éponges sont largement réparties dans le monde et il est possible d’en trouver dans toutes les mers, des pôles à l’équateur ; elles occupent verticalement l’ensemble de l’espace, du médiolittoral aux plaines abyssales. Elles forment un groupe fortement diversifié principalement étudié en tant que :  Source de biomatériaux ;  Bio-indicateurs environnementaux potentiels ;  Source potentielle de métabolites secondaires au large éventail d'activités biologiques pour les industries pharmaceutiques. Les éponges sont bien connues du grand public pour leur utilisation domestique, bien que les véritables éponges naturelles soient aujourd’hui devenues rares. L’exploitation des éponges a débuté en Méditerranée chez les civilisations Phéniciennes et Egyptiennes il y a environ 2000 ans (Chiavarà, 1920), puis chez les grecs, les romains et les crétois. Actuellement, la Tunisie, la Grèce et la Lybie sont les principaux pays producteurs (Milanese et al., 2008), avec l’Egypte et la Turquie (Pronzato et Manconi, 2008). Les espèces couramment exploitées sont Spongia officinalis, la véritable éponge de toilette, et Hippospongia communis ou éponge de cheval, ainsi nommée car, de consistance plus rigide que l’éponge de toilette, elle était surtout utilisée pour les travaux domestiques. De nombreuses espèces semblent être menacées aujourd’hui du fait de leur sur-exploitation. En France, aucune espèce d’éponge n’est protégée directement par la réglementation en application des articles L. 211-1 et L 211-2 du Code rural, qui est l’outil réglementaire classique pour protéger une espèce animale ou végétale. Toutefois, la France a ratifié la convention de Berne, relative à la conservation de la vie sauvage et du milieu naturel de l’Europe et, dans l’annexe II de cette convention (J.O. décrets n° 99-615 & 99-616 du 7 juillet 1999) relative aux espèces animales strictement protégées, on trouve quatre espèces d’éponges : *Aplysina cavernicola ; * Asbestopluma hypogea ; * Axinella polyploides ; * Petrobiona massiliana. Ces quatre espèces sont présentes dans les eaux françaises et ne peuvent donc plus être récoltées, ni tuées, ni perturbées en période de reproduction. De plus, l’annexe III de cette

1 convention, liste également quatre éponges dites "cornées" qui sont exploitées en Méditerranée : * Hippospongia communis ; * Spongia agaricina ; * Spongia officinalis ; * Spongia zimocca. Par ailleurs, les éponges cornées de Méditerranée du genre Ircinia subissent chaque année, depuis quelques années entre septembre et novembre, les conséquences d’une épidémie bactérienne qui semble être liée à l'élévation anormale de la température de l’eau de mer au mois d’août (Moldano et Sanchez-Tocino, 2010). Il s’agit donc aussi d’espèces menacées.

De façon générale, les éponges cornées et globalement les Dictyoceratida, les Dendroceratida (ou Keratosa) et les Verongida, sont les éponges qui ont toujours intéressé le plus les chimistes. En effet, avec plus de 2000 composés isolés et identifiés, les éponges cornées regroupent près de la moitié de l’ensemble des molécules recensées dans le phylum depuis les années 1970 (Kornprobst, 2005). Elles continuent à faire l’objet d’une recherche intensive en raison des nombreuses molécules, souvent originales, qu’elles contiennent. Les propriétés cytotoxiques qui leurs sont associées en font d’excellentes sources potentielles de produits anticancéreux. Les principales limitations dans leur valorisation thérapeutique restent leur stabilité relative et l’identification des espèces qui, basée essentiellement sur des critères morphologiques, est particulièrement difficile, notamment pour les Irciniidae.

La famille Irciniidae est actuellement constituée de trois genres : Ircinia, Sarcotragus et Psammocinia. Les éponges de cette famille ont principalement été identifiées sur la base de caractères morphologiques avec plus ou moins de succès. Par ailleurs, les premières études phylogénétiques réalisées ont rapidement révélé leurs limitations. Au bilan, le statut de Sarcotragus est considéré comme incertain et les fines distinctions entre certaines espèces d’Ircinia font encore l’objet de discussions. Parmi les différentes approches pour la classification des éponges marines, l’étude des profils métabolomiques en combinaison avec les analyses multivariées, bien qu’elles puissent constituer un plus, n’ont pas été envisagées. Une étude conjointe des critères morphologiques et des empreintes métabolomiques peut sans doute offrir des espoirs pour obtenir la taxonomie la plus précise.

Par ailleurs, ces espèces, principalement les Ircinia, sont caractérisées par de nombreux composés organiques volatils (COV) dont certains, les dérivés soufrés, sont responsables de la forte odeur nauséabonde à l’origine de leur nom : Hircus signifie bouc pour Ircinia. De façon générale, les composés volatils en milieu marin peuvent être responsables de plusieurs effets

écologiques (défense, dissuasion ou attraction) ou même influencer les cycles biogéochimiques par leur émission dans l’atmosphère ; leur origine peut toutefois être confondue avec ceux d’origine anthropique. Pour les Ircinia, l’identité et le rôle écologique potentiel de l’ensemble des COV sont encore peu étudiés. Plusieurs hypothèses concernant leurs origines (éponge et/ou symbiote) ont été proposées sans toutefois parvenir à une conclusion certaine. De plus, les COV présents dans les éponges du genre Sarcotragus n’ont pas été étudiés, bien qu’elles se distinguent également par une forte odeur.

Enfin, il s’agit d’espèces très répandues en Méditerranée, une zone qui subit une forte pression anthropique depuis plus de 20 ans, avec une forte contamination de nombreux polluants, notamment les éléments traces métalliques (ETM) comme le plomb et le cadmium, en particulier. Pour évaluer et suivre le degré de pollution, de nombreux programmes basés sur différentes approches (colonne d’eau, sédiments et organismes marins) ont vu le jour. C’est dans ce cadre, que la notion de bio-indicateurs a été développée : un organisme est choisi pour ses caractéristiques de bioaccumulation d’un ou plusieurs ETM. Parmi les organismes marins, les éponges, en raison des nombreuses caractéristiques qui leurs sont propres, ont été étudiées en tant qu’organismes sentinelles dans le cadre de la surveillance environnementale du milieu marin. Les espèces modèles étudiées à ce jour, Spongia officinalis ou Crambe crambe, ont rapidement montré certaines limitations notamment par leurs capacités à réguler le plomb et le cadmium. Une étude basée sur les Irciniidae en tant qu’espèces sentinelles potentielle d’une pollution par les ETM à l’échelle Méditerranéenne est sans précédent.

Dans ce cadre, le projet de recherche qui m’a été confié s’intéresse à ces trois problématiques chez les Irciniidae, que nous abordons dans ce manuscrit qui est divisé en quatre parties : le premier chapitre est dédié aux spongiaires et en particulier aux Irciniidae, ainsi qu’aux objectifs précis du projet de recherche qui m’a été confié ; le second chapitre développe les résultats obtenus pour la taxonomie usuelle et la métabolomique par RMN 1H, pour une bien meilleure caractérisation des différentes espèces, une étape nécessaire pour aborder les deux autres problématiques ; le troisième chapitre est consacré à une étude comparative des composés organiques volatils des différentes espèces ; et enfin, le quatrième chapitre est dédié à une étude comparative de la bioaccumulation des éléments traces métalliques par ces éponges.

I. INTRODUCTION GENERALE

Dans ce chapitre, après quelques généralités sur les spongiaires, nous aborderons plus en détail le modèle d’étude choisi : les éponges cornées Irciniidae de Méditerranée ; puis les objectifs du projet de recherche qui m’a été confié.

1. Le phylum Porifera

Les éponges sont à la fois les métazoaires les plus simples et les plus anciens. Ce groupe constitue le Phylum des «Porifères» ou Porifera (Grant, 1836). L’origine étymologique est une combinaison de deux mots latins : « porus » pour pore ou petit trou et « fero » pour porter, et signifiant « Les éponges portent des pores ». Historiquement, les «Spongiida» ou «Spongiae» ont tout d’abord été reconnues, selon la classification de Linné, comme un taxon distinct, puis ont été classées jusqu’en 1765 dans le règne des végétaux et enfin dans celui des animaux par Ellis (1755), Pallas (1766), Ellis et Solander (1786). Des hypothèses sur le fait qu’elles soient des colonies représentatives de protozoaires unicellulaires (Clark, 1867 ; Saville Kent, 1880 - 1882) ou sur leur appartenance aux Cœlentérés (Haeckel, 1872) ont été émises. En 1872, Lütken suggère de classer les «Spongozoa» dans un groupe indépendant. En 1876, elles possèdent leur propre section dans le périodique Zoological Record. Elles sont ensuite classées de nouveau dans un taxon intermédiaire : le sous-règne des Parazoaires (Hentschel, 1923) ; puis dans un phylum situé à la base des Métazoaires (Hyman, 1940 ; Brien, 1967). Les éponges appartiennent désormais sans nul doute au règne des Métazoaires (Müller, 1998 ; Boury-Esnault et Solé-Cava, 2004). Le nombre d’espèces d’éponges connues dans le monde varie entre 3000 et 10000 espèces selon les auteurs. Il se situe plus probablement autour de 9000 car le nombre réel des espèces, tenant compte des espèces encore inconnues, peut probablement être multiplié par deux.

1. 1. Cytologie

La fermeté de l’éponge est assurée à la fois par (i) un squelette organique constitué de fibres de collagène et de spongine, et/ou (ii) d’un squelette inorganique constitué soit de carbonate de calcium (CaCO3), soit de silice (SiO2). Le squelette inorganique se représente soit sous 4 forme de spicules pouvant quelques fois être fusionnés (cas des Lithistides), soit sous forme d’un squelette minéral basal hypercalcifié (cas du groupe polyphylétique des Sclérosponges). Le matériel organique et inorganique est produit par plusieurs types de cellules tels que les scléroblastes pour les spicules et les spongioblastes pour les fibres (Hooper et al., 2002). Cependant, plusieurs éponges n’ont pas de squelette minéral comme les éponges cornées, Chondrosia, Oscarella et les éponges de l’ordre Halisarcida. Chez les spongiaires, en l’absence de tissus et donc d’organes spécialisés, toutes les fonctions vitales sont assurées par des cellules plus ou moins spécialisées avec à l’origine des cellules non différenciées, dites totipotentes, qui peuvent se transformer en n’importe quel autre type de cellules. Les différents types de cellules sont munis d’une grande motricité au sein du mésohyle constitué d’une matrice de fibrilles de collagène (Hooper et al., 2002). Cette grande motricité cellulaire est cruciale pour la morphogénèse, l’homéostasie, la locomotion et finalement pour la survie des différentes espèces (Fry, 1970 ; Bond, 1992). Les principaux types de cellules rencontrés sont :  les choanocytes, ou cellules à collerette, qui assurent notamment le mouvement de l’eau dans le corps de l’éponge, mais qui jouent également un rôle lors de la reproduction. L’eau pénètre par des orifices appelés les ostioles, de diamètre allant de 10 à 100 µm, traverse les canaux vers les chambres choanocytaires où elle est filtrée pour être finalement, conduite le long des canaux efférents, rejetée par le grand orifice exhalant appelé l’oscule. Les choanocytes participent, grâce à leurs flagelles, à l'apport en dioxygène, l'éjection des déchets et à la capture de nourriture, jouant également un rôle direct dans la nutrition. Les éponges sont des suspensivores qui se nourrissent généralement de bactéries et de picoplanctons présents dans l’eau.  les amibocytes, cellules mobiles assurant notamment le transfert d’éléments nutritifs ;  les scléroblastes (ou sclérocytes) et les spongioblastes, qui secrètent le squelette interne des éponges (spicules et spongine) ;  les pinacocytes, qui protègent l’éponge du monde extérieur sont des cellules plates, jointives et uni-stratifiées ;  les porocytes, qui bordent les pores inhalants de l’éponge ;  les archéocytes, qui ont plusieurs fonctions chez l’éponge, comme le transport des éléments respiratoires et alimentaires à travers le corps de l’éponge. Les archéocytes possèdent une totipotence leur permettant d’évoluer en plusieurs autres types de cellules selon

5 le besoin de l’éponge, procurant à cette dernière une plasticité à son organisation (Hooper et al., 2002) ;  les collencytes, cellules allongées qui sécrètent du collagène ;  les cellules contractiles, cellules allongées dont la structure ressemble à celle des cellules musculaires lisses, qui sont doués de propriétés contractiles.

1. 2. Taxonomie

La classification actuelle selon Hooper et Van Soest (2002a) et World Porifera Database (http://www.marinespecies.org/porifera/porifera.php?p=search) que nous utilisons est :

 La classe Calcarea Bowerbank, 1864 (éponges calcaires ou calcisponges) dont le squelette est exclusivement constitué de spicules extracellulaires di-, tri-, tetra-, et/ou polyactines, de calcite (CaCO3), avec quelques fois un squelette basal hypercalcifié. Ces éponges sont exclusivement marines et à distribution cosmopolite. Elles sont souvent considérées comme les plus primitives. Elles sont caractérisées par l’absence d'une différenciation des spicules en microsclères et mégasclères. Les formes de bauplans rencontrées vont des plus simples (type ascon) aux plus complexes qui comportent en plus des chambres choanocytaires et des canaux inhalants et exhalants (type leucon), en passant par les formes intermédiaires n'ayant en plus que des chambres choanocytaires (type sycon). Leurs larves sont des blastulas et leur mode de reproduction est vivipare. Elles sont les plus abondantes et diversifiées dans les eaux peu profondes :< 100 m (Manuel et al., 2002).

 La classe Hexactinellida Schmidt, 1870 (éponges siliceuses ou éponges de verre) dont le squelette est composé de spicules siliceux (SiO2) triaxoniques appelés hexactines. Certains spicules sont de grande taille (les mégasclères) et d’autres sont plus petits (les microsclères). Les mégasclères sont agencés en un réseau siliceux complexe sans matrice protéique. Le tissu des éponges hexactinellides est constitué d’un syncytium de cellules somatiques : ainsi, il n’existe pas de pinacoderme, ni de choanoderme qui est remplacé par un choanosyncytium qui bourgeonne des structures semblables à des choanocytes. Ces éponges sont vivipares et produisent des larves trichimellas. Elles sont très répandues entre 200 et 2000 m (zone bathyale) et en zone abyssale (Reiswig, 2002).

 La classe Demospongiae Sollas, 1885, dont tous les types sont leuconoïdes, à l’exception de la famille des Cladorhizidae vivant dans les eaux profondes et qui a perdu son système aquifère pour adopter un système de nutrition carnivore. Le squelette des Démosponges, qui est plus ou moins rigide, est constitué de fibres de spongine éparpillées ou agrégées, secrétées par les spongioblastes, et de fibrilles de collagènes omniprésentes et/ ou de spicules siliceux mégasclères ou microsclères, monoaxoniques ou tetraxoniques. Les Démosponges renferment 85% de toutes les espèces récentes décrites, avec à peu près 15 ordres différents, 88 familles et environ 500 genres valides. Ces éponges se reproduisent par viviparité ou par oviparité, à larves parenchymella ou blastula. Elles sont majoritairement marines, mais quelques unes sont trouvées en eau douce. Elles vivent à des profondeurs variées, des zones intertidales aux plus grandes profondeurs (Hooper et Van Soest, 2002b). Des données morphologiques (Van Soest, 1984 ; Vacelet, 1985 ; Reitner, 1992) et moléculaires (Chombard et al., 1997) ont permis de classer un groupe longtemps considéré comme une quatrième classe d’éponges (Hartman, 1969) : les Sclérosponges (ou éponges corallines) ; dans la classe des Démosponges. Cette sous-classe qui a un squelette calcaire basal avec des spicules siliceux ou calcaires, est polyphylétique.

Les Archéocyathidés constituent un groupe ayant disparu à la fin du Cambrien. Cette classe apparentée aux Démosponges, est dépourvue de spicules. Les adultes ont typiquement la forme d'un cône renversé muni de deux parois (interne et externe) jointes par des cloisons verticales (septums), pourvues de pores, et de cloisons horizontales, appelées planchers. Au centre du cône se trouve un espace également conique, qui serait l'équivalent de l'atrium des éponges actuelles, avec à la base des rhizoïdes qui assurent la fixation au substrat. Les archéocyathes vivaient dans des mers peu profondes, à proximité des rivages.

 La classe des Homoscleromorpha regroupe des éponges qui ont longtemps été considérées comme appartenant à la classe des Démosponges. Elle contient la famille des Plakinidae et celle des Oscarellidae, avec 7 genres et une centaine d’espèces décrites (Gazave et al., 2010). Les éponges de cette classe vivent à des profondeurs variées allant de quelques mètres aux zones abyssales de 2460 m. Leur squelette est siliceux, elles sont de type leuconoïde, et la totalité des genres possèdent des exo- et endopinacocytes flagellés reposant sur une lame basale à fibrilles de collagène, ainsi que des chambres choanocytaires sphériques ou ovales. Leurs larves sont des cinctoblastulas.

La plupart des taxons ne possèdent qu'un nombre limité de caractères complexes. La diversité des éléments du squelette est faible, les caractéristiques de l’arrangement sont souvent difficiles à détecter et la variabilité morphologique induite par l’environnement conduit à des interprétations difficiles. Ceci se traduit souvent par des homoplasies et conduit à des classifications quelque fois erronées. De plus, l’évolution des traits du squelette n’est pas complètement comprise. L’ensemble de ces facteurs rend la spéciation des éponges fortement cryptique et conduit donc à une sous estimation de la diversité réelle des espèces.

1. 3. Utilisation de la biologie moléculaire

La systématique des éponges a subi de nombreux bouleversements ces dernières années avec l’apparition des techniques d’analyse de l’ADN. Elle a longtemps été basée uniquement sur l’observation des divers éléments du squelette : taille, forme et arrangement ; avec en particulier l’étude de la nature et de la forme des spicules. L’examen des spicules demeure crucial pour la définition de certains taxons. Cependant, une classification erronée est obtenue lorsque des spicules d’une espèce sont incorporés en tant que corps étrangers dans d’autres éponges qui les conservent au sein de leur squelette. Par ailleurs, certaines démosponges sont dépourvues de spicules, en particulier les éponges cornées, et parfois même de squelette : Halisarca (Halisarcida), Hexadella (Verongida), Oscarella, Chondrosia, et Thymosia.

D’un point de vue morphologique : Les éponges sont définies par :  une grande motilité de cellules totipotentes ;  un système aquifère inhalant et exhalant à pores externes ;  la présence de choanocytes. De nombreuses éponges ne possèdent ni de chambre choanocytaire, ni de système aquifère, comme la famille des Cladorhizidae (Vacelet et Boury-Esnault, 1995). Ces observations compliquent la classification qui est basée sur la morphologie des éponges, puisque l’absence primitive d’un caractère est difficile à distinguer de sa perte secondaire.

D’un point de vue moléculaire : Bien que la classification actuelle soit essentiellement basée sur des critères morphologiques ou anatomiques, l’apparition des techniques d’analyse de l’ADN a permis de réaliser certaines avancées. Cependant, les relations phylogénétiques entre de nombreux groupes ne sont pas encore très claires. Plusieurs hypothèses ont été émises et continuent à être étudiées (Hooper et al., 2002). Elles ont permis entre autre de découvrir que des groupes aujourd’hui apparentés n’ont que très peu de points communs dans leurs gènes ou, à l’inverse, que des éponges aujourd’hui classées dans des groupes distincts sont en fait très proches génétiquement. De façon générale, plusieurs résultats appuyant la paraphylie des Porifères ont été proposés (Zrzavy et al., 1998 ; Borchiellini et al., 2001 ; Nielsen, 2008). Ainsi, des données ultrastructurales (Woollacott et Pinto, 1995) et moléculaires basées sur l’ADNr 28S (Lafay et al., 1992), l’ADNr 18S (Cavalier-Smith et al., 1996 ; Borchiellini et al., 2001) et les PKCc (Kruse et al., 1998) avaient proposé des assemblages paraphylétiques des différentes classes, rapprochant les Calcarea des Eumétazoaires diploblastiques. De même, des données basées sur des séquences d’acides nucléiques HSP 70 cytoplasmique (Borchellini et al., 1998), ainsi que d’autres basées sur les ADNr 18S (Collins 1998 ; Kim et al., 1999) et les ADNr 18S et 28S (Medina et al., 2001), avaient regroupé les éponges au sein des Eumétazoaires, avec les Cnidaria et les Cténophora. Quelques auteurs ont rejeté la relation de groupement sœur entre les Calcarea et les autres classes d’éponges en utilisant également des données de l’ADNr 18S (Adams et al., 1999). Actuellement, un retour à la monophylie de ces dernières est retenu : l’alignement de données sur 128 gènes de métazoaires conforte la monophylie des Porifères ainsi que leur subdivision en quatre classes différentes (Philippe et al., 2009). Il apparaît cependant important dans l’avenir de combiner les données génétiques avec les données morphologiques, afin de pouvoir améliorer la classification des éponges (Hooper et Van Soest, 2002a).

1. 4. Problèmes de classification des éponges cornées

Les éponges cornées forment trois taxons : les Verongida, les Dendrocératides et les Dictyocératides.

D’un point de vue morphologique : Les éponges cornées ne possèdent pas de squelette minéral, que l’on retrouve dans la plupart des autres Démosponges, mais un squelette organique constitué de fibres de spongine. D’une façon générale, les fibres de spongine sont constituées de collagène, souvent avec une moelle lacunaire située à l’intérieur d’une gaine plus dense. La présence exclusive de fibres de spongine confère aux éponges des trois groupes mentionnés une consistance souple et élastique, qui est celle de l’éponge commerciale (espèces des genres Hippospongia, Spongia et Coscinoderma). C’est l’arrangement des fibres de spongine au sein des éponges qui a été utilisé pour leur classification qui initialement ne regroupait que les deux ordres des Dendrocératides et Dictyocératides. Pour les premières, les fibres de spongine sont organisées de manière dendritique, alors que pour les secondes les fibres sont anastomosées en réseau qui forme un treillis tridimensionnel (Lévi, 1973). Ce squelette organique ne possède qu’une faible complexité morphologique qui rend l'étude de ce groupe particulièrement difficile, même pour les taxonomistes expérimentés. De plus, la longue conservation des espèces dans l’éthanol se traduit par un changement de couleur des spécimens et un dessèchement des tissus qui rend la comparaison morphologique difficile.

D’un point de vue moléculaire : La monophylie des séquences de Dictyocératides a été démontrée dans la plupart des arbres phylogénétiques (Borchiellini et al., 2004 ; Nichols, 2005 ; Holmes et Blanch, 2007 ; Redmond et al., 2007). Cependant, le nombre de travaux relatifs aux relations phylogénétiques internes au sein des Dictyocératides reste faible. Les études réalisées par Redmond et al. (2007) ont permis de montrer qu’Ircinia et Spongia sont en relation de groupement sœur avec les Dysideidae qui divergent à la base ; les Dysideidae (Dysidea et Pleraplysilla) étant paraphylétiques, selon la reconstruction de l’ARNr 18S et 28S (Addis et Peterson, 2005 ; Borchiellini et al., 2004). En 1978, Bergquist décrit la famille des Thorectidae avec des fibres laminées et des chambres choanocytaires diplodales, alors que celle des Spongiidae est caractérisée par des fibres homogènes (non laminées). En se basant sur les éléments du squelette et la chimie terpénique, Bergquist et Wells (1983) proposent qu’une nouvelle famille regroupant Ircinia, Psammocinia et Sarcotragus soit établie. Finalement, Hooper et Wiedenmayer (1994) attribuent par erreur, tous les taxons des Thorectidae ainsi que les Irciniidae, à la famille des Irciniidae ; Ce qui fut rectifié par Bergquist (1995) qui sépare les deux groupes.

2. Les Irciniidae

D’un point de vue étymologique, les termes Ircinia et Irciniidae proviennent tous les deux du latin « Hircin » ou « Hircus » qui signifie bouc. Les éponges Ircinia ont été désignées ainsi par Nardo en raison de la forte odeur soufrée caractéristique. Nardo a d'abord orthographié Ircinia puis Hircinia qui a été longtemps utilisé. Cependant, l’utilisation d’Ircinia reste prioritaire puisqu’elle a été attribuée en premier.

2. 1. Généralités

Les Irciniidae sont des Dictyocératides à large spectre de distribution (Cook et Bergquist, 1999). Elles vivent à des profondeurs variables : de 5 mètres maximum pour Ircinia felix aux Bermudes (Sterrer, 1986), à 400 mètres pour Ircinia turrita en Nouvelle-Zélande (Cook et Bergquist, 1999). Ces éponges ont généralement une coloration qui peut être due à des pigments organiques, à des sels métalliques (oxydes de fer, par exemple), à des cyanobactéries ou à des bactéries symbiontes (Hooper et al., 2002). La coloration éventuelle de l’endoderme des Irciniidae est due à des particules d’oxyde de fer (lépidocrocite) présentes dans les filaments à l’origine de cette coloration orangeâtre caractéristique.

Les différentes espèces rescencées sont présentées au niveau de l’annexe 1.

2. 1. 1. Cycle de vie

Comme une grande majorité des éponges, les Irciniidae se reproduisent de façon sexuée, sans toutefois posséder des organes sexuels. Elles sont hermaphrodites. Lors de la reproduction sexuée, elles produisent soit des gamètes mâles, soit des gamètes femelles. Le sperme dérive des choanocytes situés dans le mésohyle, alors que les œufs se développent à partir des archéocytes dans le mésohyle (Rupert et al.., 2004). L’espèce Ircinia sp. développe ses cystes spermatiques durant toute l’année (Hoppe, 1988). Le sperme relargué par les éponges est capté par les choanocytes d’autres individus. Ces choanocytes sont ensuite transformés en cellules amiboïdes transportant le sperme au niveau des œufs, dans le mésohyle, pour les

11 féconder. Chez Ircinia sp. la production d’oocytes et de larves n’a été observée que pendant 8 mois de l’année (Hoppe, 1988). Enfin, Ircinia sp. est une éponge incubante (Hoppe, 1988) qui libère après un certain temps, des larves parenchymella ovales et fortement ciliées (Sterrer, 1986), qui se posent sur un substrat dur et forment des nouveaux individus après métamorphose. La détermination de ces larves est un caractère de diagnostic du niveau de l’ordre chez ces éponges (Ereskovsky et Tokina, 2004). La reproduction asexuée n’est pas organisée dans cette famille.

2. 1. 2. Relations symbiotiques

Les Irciniidae sont impliquées dans plusieurs types de relations symbiotiques. Ces éponges vivent en symbiose avec des bactéries et des cyanobactéries qui leur offrent l’avantage de fixer des nutriments. Les ratios isotopiques de carbone et d’azote permettent de mettre en évidence l’azote nouvellement fixé chez Ircinia (Weisz et al., 1985). Une relation symbiotique est observée chez quelques espèces avec des cyanobactéries photosynthétiques qui fournissent un apport énergétique assez important grâce au processus de la photosynthèse. Les principales cyanobactéries identifiées chez Ircinia sp. sont : Synechococcus spongarium (Usher et al., 2004), Aphanocapsa feldmani (ou Synechococcus feldmani, Maldonado et Young, 1998) et Aphanocapsa raspaigellae. A. feldmani est plus abondante que A. raspaigellae dans l’espèce Ircinia variabilis (Vacelet, com. pers.). Ces cyanobactéries sont localisées à la surface des éponges, dans les zones bien éclairées. Les produits de la photosynthèse fournies par les cyanobactéries explique l’absence de l’espèce Ircinia felix en dessous de cinq mètres de profondeurs dans les Bermudes (Sterrer, 1986) car la lumière à cette profondeur n'est plus suffisante pour que les cyanobactéries puissent transmettre suffisamment de matériel photosynthétique à l’éponge pour un maintien énergétique favorable. Les parties profondes du corps des éponges ne contiennent cependant que des bactéries non photosynthétiques.

On observe d’autres relations symbiotiques au sein de cette famille avec les polychètes et des nudibranches, en voici deux exemples : - La relation entre la morphologie des éponges de l’espèce Ircinia felix avec les différents polychètes vivants dans les éponges a été étudiée (Neves et Omena, 2002). Ainsi, cette éponge est largement infestée par le polychète carnivore Haplosyllis spongicola qui se

12 nourrit des autres invertébrés qui tentent d’infester l'éponge. En échange, l’éponge fournit un abri aux polychètes ainsi qu’un apport de nourriture établi grâce au courant d’eau provoqué par son système aquifère. De cette façon, une relation bénéfique est établie entre les deux partenaires ; - Le nudibranche Discodoris indecora peut être observé sur sa proie Ircinia variabilis en parfait camouflage de forme et de couleur. Se nourrissant de cette éponge, ce nudibranche stocke la variabiline et la palinurine, deux métabolites secondaires produits par l’éponge, transférés à partir de ses glandes digestives, dans des glandes unicellulaires situées au niveau de son manteau dorsal. La localisation de ces métabolites sur le dos du nudibranche suggère le rôle défensif de la variabiline et la palinurine. En effet, Discodoris indecora lorsqu’il est stressé, secrète un mucus blanc, visqueux, riche en ces deux composés, indiquant un comportement typique de défense (Marin et al., 1997). Par ce genre de comportement, le nudibranche camouflé, repousse également les prédateurs de l’éponge.

2. 2. Systématique des Irciniidae

La systématique des Irciniidae reste exclusivement basée sur des critères morphologiques macro et microscopiques. Les Irciniidae (Gray, 1867) possèdent des caractéristiques autapomorphiques qui leur permettent d’être distinguées des autres espèces au sein des Démosponges. Le critère principal pris en compte dans l’appartenance d’une espèce à la famille Irciniidae est la présence de longs filaments de collagène particuliers, en forme de corde à sauter. Si l’attribution du genre est quelques fois accessible, la distinction des différentes espèces reste relativement complexe, ce qui augmente la probabilité d’existence d’espèces cryptiques parmi les spécimens connus.

Du point de vue macroscopique : le recouvrement par du sable de l’ectoderme, bien qu’il s’agisse d’un critère subjectif, permet en combinaison avec d’autres caractères de distinguer les différents genres. Ainsi, les espèces des genres Psammocinia et Ircinia, sont respectivement totalement et partiellement recouvertes de sable. En revanche, Sarcotragus ne l’est pas ; La forme externe varie, selon les genres et les espèces, d’une forme globuleuse à une forme massive et irrégulière, ou même ramifiée à rampante ou encroûtante ;

La coloration peut être blanc-grisâtre, passant par le gris et le jaunâtre, jusqu’aux couleurs rougeâtres violacées et marrons, et même noire ; De même, l’espacement et la hauteur des conules varient également d’une espèce à l’autre.

Du point de vue microscopique, le squelette des différentes espèces est constitué de : fins filaments de collagène dont le diamètre varie de 1 à 13 µm selon les espèces. La longueur des fibres est difficile à déterminer en raison de leur fragilité lors de leur isolement (Vacelet, 1959). Les filaments de collagène, spécifiques à la famille Irciniidae, sont fins et élargis au niveau des extrémités. Ils contribuent à la formation du squelette et donnent aux éponges la propriété de résister au déchirement. Bien que leur abondance varie selon les espèces, cette caractéristique n’est pas prise en compte dans leur distinction; fibres primaires et secondaires laminées. Ces dernières sont constituées de spongine et forment un réseau où les fibres primaires à diamètre relativement large, s’anastomosent par l’intermédiaire des fibres secondaires au diamètre moins important. Les fibres primaires peuvent posséder une moelle et des corps étrangers, et former une dense fasciculation. Inversement, les fibres secondaires n’ont pas de moelle mais contiennent, pour certaines espèces, des corps étrangers. Les espèces de type Sarcotragus ne présentent pas de corps étrangers dans les fibres. De plus, les filaments de collagène sont très fins ce qui constitue une des caractéristiques de ce genre (Vacelet, 1959 ; Bergquist, 1980b). Cependant, certaines espèces de Psammocinia, notamment celles décrites en Nouvelle-Zélande (Cook et Bergquist, 1998) et non recensées sur la Grande Barrière de corail en Australie, présentent également des filaments très fins (Cook et Bergquist, 2002). Dès lors, les espèces appartenant au genre Sarcotragus sont caractérisées par la fasciculation des fibres primaires et la rare présence ou l’absence de corps étrangers (Cook et Bergquist, 2002). En effet, on observe une claire distinction entre la fasciculation massive des fibres primaires chez Ircinia et la fasciculation relativement moins importante chez Sarcotragus.

Une analyse phylogénétique préliminaire réalisée sur les «éponges cornées» semble indiquer que les Irciniidae forment un groupement monophylétique (Sarcotragus et Ircinia) (Erpenbeck et al., 2007a). Par ailleurs, les travaux récents de Pöppe et al. (2010) ont démontré que le fragment de gène (COI) (fragment de gène du génome mitochondrial codant pour la première sous-unité de la cytochrome oxydase) révèle l’existence de plusieurs nouvelles espèces appartenant aux genres Ircinia et Psammocinia de l’Indopacifique, sans toutefois être capable de "barcoder" certaines espèces en raison du faible niveau d’évolution du marqueur.

Près de 182 espèces, réparties dans les trois genres Ircinia (Nardo, 1833), Sarcotragus (Schmidt, 1862) et Psammocinia (Lendenfeld, 1889) sont distinguées, selon World Porifera Database (http://www.marinespecies.org/porifera/porifera.php?p=taxlist).

2. 2. 1. Le genre Ircinia

De façon générale, les éponges du genre Ircinia forment un groupe relativement important au sein des Irciniidae, puisqu’il regroupe l’ensemble des espèces partiellement recouvertes de sable. Le genre Ircinia a été initialement décrite brièvement par Nardo en 1833, qui n’identifia pas l’espèce de façon précise mais dressa uniquement une liste de noms tous considérés nomina nuda (de Laubenfels, 1948). En 1834, il les désigne par Hircinia au lieu de Ircinia, classiquement plus correct, mais en contradiction avec la pratique de la nomenclature standard. Depuis, la plupart des auteurs ont utilisé cette dénomination de façon erronée. Les espèces appartenant au genre Ircinia présentent un large spectre de formes différentes. La consistance de ces éponges va du souple au dur, avec pour principale caractéristique une très forte résistance au déchirement. Elles présentent une surface conuleuse et un squelette constitué de fibres primaires fortement fasciculées, de fibres secondaires et de filaments de collagène. Les fibres primaires contiennent des corps étrangers tels que du sable et des morceaux de spicules que l’on retrouve dans toutes les fibres, mais pas dans la totalité de chaque fibre, leur épaisseur pouvant aller de 120 à 250 μm. Les fibres secondaires sont simples et ne contiennent pas de corps étrangers. Les filaments sont épais par rapport à ceux du genre Sarcotragus, et vont de 3 à 13 μm (Figure 1). Il n’est pas évident de confirmer l’organisation structurale de ces éponges en raison de l’arrangement irrégulier du squelette de fibres ou bien de reconnaître le critère de robustesse permettant de distinguer plus facilement les espèces et même des groupes génériques et sous-génériques (Cook et Bergquist, 2002). Les Ircinia présentent une forte variation écomorphique due à la nature plastique de ce genre. Cette caractéristique est à l’origine d’une difficulté dans la différenciation des espèces, non seulement à une échelle géographique donnée mais aussi sur une échelle globale (Cook et Bergquist, 2002).

d b

c 0,1 mm

Figure 1 : Eléments microscopiques caractérisant le genre Ircinia : coupe au niveau du mésohyle (x10) ; a : fibre primaire ; b : corps étrangers ; c : fibre secondaire ; d : filaments.

Historiquement et même récemment, plusieurs espèces ont été décrites de façon insuffisante. De plus, les descriptions réalisées ont été basées en grande partie sur des spécimens secs. En effet, la surface subie des changements et les détails morphologiques internes ne peuvent être déterminés lorsque l’éponge est sèche. De même, dans plusieurs parties du monde où Ircinia est un genre commun, peu d’espèces ont été vérifiées vivantes depuis leur description originale. L’interprétation des caractères morphologiques de ce genre par différents auteurs a mené à des attributions incorrectes pour quelques espèces. A titre d’exemple, de nombreuses espèces Ircinia sont en réalité des Psammocinia, c'est-à-dire proches mais différentes (Cook et Bergquist, 1998). De même, il existe d’autres espèces d’Ircinia n’appartenant pas à ce genre, mais les caractères morphologiques nécessaires à leur identification correcte restent difficiles à distinguer. Enfin, les espèces du genre Ircinia possèdent particulièrement une odeur nauséabonde et soufrée (Cook et Bergquist, 2002). Du point de vue historique, la première espèce décrite en tant que Ircinia a été Spongia fasciculata (Pallas, 1766) de Méditerranée par réattribution à Filifera (Hircinia) de Schmidt (1862). Elle est nommée Ircinia variabilis par Schmidt qui indique qu’il s’agit de sa propre nouvelle espèce en synonymie avec S. fasciculata Esper. En réalité, il s’agit d’un simple transfert (Wiedenmayer, 1977b) puisque la description réalisée vient clairement de la re- description de l’espèce de Pallas par Esper (1794). Le spécimen d’Esper a été conservé à Strasbourg et décrit de nouveau par Topsent (1920c, 1933), alors que S. fasciculata a été considérée comme nomen dubium puisque le type Méditerranéen de Pallas a été perdu. Par conséquent, de Laubenfels (1948) désigna un néotype de Ircinia fasciculata (Pallas), sensu Schmidt (1862) comme espèce type. La validité de cette action est sujette à caution. Se basant 16 sur l’Art. 75d (v) de l’ICZN (1985), Wiedenmayer déclare en 1977b l’invalidité du néotype I. fasciculata de Laubenfels, puisqu’il s’agit d’un spécimen qui provient des Dry Tortugas en Floride et non pas de la Méditerranée. Aujourd’hui, il n’existe pas de néotype désigné I. fasciculata. Wiedenmayer (1977b) propose que tous les Ircinia fasciculata de l’ouest des Indes occidentales se réfèrent à Ircinia felix (Duchassing et Michelotti, 1864). Or, cette proposition ne peut pas être facilement acceptée puisqu’elle implique que toutes les Ircinia fasciculata des Indes occidentales soient basées sur des identifications correctes (Cook et Bergquist, 2002). Il s’agit d’un genre à large répartition en zones tropicales et tempérées. De nombreuses sub- divisions ont été proposées, non sans difficulté, par Cook et Bergquist (1999), en raison du nombre relativement important d’espèces de ce genre (Annexe 1). Les espèces méditerranéennes auxquelles nous nous sommes intéressés sont : Ircinia variabilis ; Ircinia dendroides ; Ircinia oros.

Ircinia variabilis. L’espèce Ircinia variabilis de Schmidt a également été appelée I. fasciculata var. variabilis (Vacelet, 1959) indiquant la possibilité de l’existence de plusieurs variétés. Il n’existe pas de description complète de cette espèce en raison de la difficulté de la caractériser par rapport aux espèces similaires et l’absence d’une description précise dans les travaux anciens (Cook et Bergquist, 2002). Il s’agit d’une espèce qui présente une grande variabilité écomorphique puisqu’elle change de forme et de couleur en fonction des conditions écologiques. Elle est décrite comme étant, massive, de forme irrégulière et encroûtante. Sa surface est conuleuse et recouverte de sable de façon irrégulière. Sa couleur est variable : blanchâtre, noire, rouge, violet ou marron. Les oscules sont éparpillés de façon irrégulière sur l’éponge qui présente une consistance assez ferme. Les fibres primaires, qui atteignent un diamètre de 200 à 250 µm, sont fasciculées et contiennent toujours des corps étrangers, alors que les fibres secondaires en sont dépourvues. Les filaments de 2 à 8 µm de diamètre, sont nombreux et denses (Lendenfeld, 1889a ; Vacelet, 1959 ; Topsent, 1920c, 1933). Enfin, ces éponges possèdent deux sortes de cyanobactéries lui procurant sa couleur ectosomique violette : Aphanocapsa raspaigellae qui est une grosse cellule ronde et dont le diamètre varie de 10 à 12 µm à la surface de l’éponge et de 17,5 µm dans l’endosome ; et, Aphanocapsa feldmani, nommé également Synechococcus feldmani, qui possède une forme plus allongée, une longueur comprise entre 2 et 4 µm et dont la présence est plus probable que

17 la précédente. A proximité de l’endosome, la densité de ces cyanobactéries diminue, alors que celle de bactéries de 1 µm de diamètre s'accroît. La distinction entre cette espèce d’Ircinia et Ircinia fasciculata a historiquement été une source de confusion (Cook et Bergquist, 2002) et des études supplémentaires seraient nécessaires pour pouvoir les distinguer clairement. Cependant, des approches chimiotaxonomiques ayant pour but de comparer la composition chimique du métabolome propre à chaque espèce, fourniraient des espoirs pouvant éclaircir les ambiguïtés de classification.

Ircinia dendroides. D’abord considérée comme une variété d’Ircinia variabilis par Schulze (1880), l’espèce Ircinia dendroides a été admise en tant que nouvelle espèce par Lendenfeld (1889a). Elle est caractérisée par sa forme branchue, ses filaments allant de 3,5 à 4,8 µm de diamètre, ses fibres primaires, dont le diamètre varie de 120 à 200 µm, sont dépourvues de moelle et peuvent contenir des corps étrangers et des fibres secondaires de 30 à 90 µm de diamètre .

Ircinia oros. Cette espèce a été décrite par Schmidt en 1864, puis abandonnée par Schulze. Topsent, par la suite, la reclasse en tant que variété d’Ircinia variabilis. Sa couleur est d’un gris foncé particulier et très constant, et elle est caractérisée par sa forme massive souvent lobée, pouvant atteindre une grande taille. Ces lobes sont le plus souvent coniques et terminés par un oscule surélevé de 1 cm au minimum. Les lobes sont dressés et de grande taille, pouvant atteindre une dizaine de cm de long, sur 4 à 5 cm d’épaisseur. L’épiderme présente un réseau d’épaississements, à fines mailles régulières, qui se dessinent en blanchâtre sur le reste de la peau gris noirâtre. Les conules sont aplatis et dispersés, distants de 3 à 4 mm. Le squelette n’est pas différent de celui de Ircinia variabilis ; seuls les filaments sont plus épais : 9 à 13 µm, mais ils sont très amincis avant un renflement terminal, où ils ne mesurent plus que 5 à 7 µm ; les renflements sont de forme ovale de 22 µm sur 15 µm environ. L’endoderme contient des granules de lépidocrocite, lui donnant sa couleur rouille. Cette espèce peut porter une Reniera encroûtante ou d’autres Ircinia (Vacelet, 1959).

2. 2. 2. Le genre Sarcotragus

De façon générale, les éponges du genre Sarcotragus sont non recouvertes de sable. Leur squelette est constitué de fibres à moelle, d'une épaisseur de 90 à 180 μm, dépourvues de

18 corps étrangers quoique pouvant parfois contenir quelques débris de spicules étrangers. Schmidt avait en 1862 distingué le sous-genre Sarcotragus d'Adriatique, distinct des véritables Ircinia par la présence de filaments plus fins et plus nombreux (0,7 à 2 μm), puis il abandonna plus tard cette sous-division; mais Lendenfeld la conserve tout en divisant aussi les autres Ircinia en plusieurs autres sous-genres (Vacelet, 1959). Ces éponges possèdent une consistance tenace et compressible qui reflète la densité des filaments dans le mésohyle (Figure 2, Vacelet, 1959).

a c a

0,1 mm

Figure 2 : Eléments microscopiques caractérisants le genre Sarcotragus : coupe au niveau du mésohyle (x5) ; a : fibre primaire ; b : fibre secondaire ; c : filaments.

Le statut de Sarcotragus est considéré comme incertain et des études supplémentaires en Méditerranée sont nécessaires pour qu’une éventuelle révision soit envisagée. Les espèces méditerranéennes auxquelles nous nous sommes intéressés sont : Sarcotragus spinosulus Sarcotragus foetidus

Sarcotragus spinosulus. Cette espèce de forme massive et assez régulière, est souvent globuleuse avec une base un peu rétrécie. L’épiderme est très épais, présentant rarement des épaississements réticulés, parfois un peu ensablé. La couleur des deux premiers millimètres depuis sa surface varie du noir profond au gris et l’endoderme est blanc ou rougeâtre lorsque ses filaments renferment des granules de lépidocrocite. Les oscules sont repartis de façon désordonnée, la surface est irrégulièrement conuleuse et les conules mesurent de 1 à 2 mm de haut. Le squelette se compose de fibres très nettement stratifiées, peu nombreuses, qui forment un réseau peu serré. Les fibres primaires, de 90 à 180 µm de diamètre, sont fasciculées, ne comportent pas ou très peu de corps étrangers et sont pourvues d’une large 19 moelle fibrillaire occupant le plus souvent plus de la moitié de la fibre. Cet important caractère avait pourtant échappé à Schmidt bien qu’il ait lui-même étiqueté les spécimens Sarcotragus spinosulus qui avaient une moelle dans les fibres primaires (Vacelet, 1959). Les fibres secondaires, de 50 à 100 µm, sont dépourvues de corps étrangers et de moelle, sauf parfois quelques points entre les strates. Enfin, les filaments sont très fins, de 0,7 à 2 µm de diamètre, extrêmement long et serrés, et la consistance de l’éponge est ferme et extrêmement résistante. Lorsque les caractères extérieurs ne permettent pas de distinguer cette espèce, la faible épaisseur des filaments et la structure des fibres primaires permettent de la différencier très nettement des autres espèces (Vacelet, 1959).

Sarcotragus foetidus. Cette espèce possède une forme massive et irrégulière. Elle atteint une taille allant de 20 à 50 cm pour celles de Méditerranée orientale. La couleur, très variable, peut être noire, jaunâtre ou marron, et la même éponge peut d’ailleurs présenter plusieurs teintes. Son épiderme est très épais et sa surface est très irrégulière, parsemée de conules à base large dont les pointes hautes de 2 à 3 mm sont espacées de 8 à 15 mm. Le squelette se compose de fibres à moelle. Les filaments sont fins et mesurent de 0,8 à 1,5 µm. Sarcotragus foetidus est peut-être synonyme de Ircinia (Sarcotragus) strobilina (Lamarck), espèce des Indes occidentales, re-décrite par de Laubenfels (1948).

2. 2. 3. Le genre Psammocinia

De façon générale, les éponges du genre Psammocinia peuvent présenter une forme en digitation, lamellaire en croissants et/ou entassées, fistulée, compacte ou amorphe. Elles sont caractérisées par une surface totalement recouverte de sable, quelques fois conuleuse, avec des alvéoles profondes et discrètes sur les côtés élevés. Ces alvéoles deviennent plus élargies et incomplètes sur la surface convexe de l’éponge ou couverte de tubercules ronds. L’éponge est ferme et incompressible. Le sable et les débris, incorporés dans le mésohyle, tendent à la rendre plus fragile. Ce n’est que lorsque les filaments sont présents en grande quantité que l’éponge devient difficile à déchirer. Son squelette fibreux est réticulé et régulier. La distinction entre les fibres primaires et secondaires n’est pas toujours évidente du fait de la similarité de leurs diamètres. Ainsi, les fibres primaires d’un diamètre de 800 µm, incluent toujours des corps étrangers. Les fibres primaires peuvent former des fascicules typiquement à la surface de l’éponge, connectées entre elles par de larges fibres secondaires de spongine.

Les fibres secondaires, avec un diamètre de 300 à 500 µm, peuvent ou non contenir du sable qui augmente alors leur diamètre à 800 µm.

Les espèces Psammocinia ont d’abord été classées par Lendenfeld (1889a) en tant que sous- genre de Hircinia (= Ircinia). En effet, les espèces étudiées à cette époque ont de nombreux caractères identiques à ceux des Ircinia, avec tout de même un certain nombre d’exceptions. Elles sont caractérisées par une abondance de sable et une concentration plus importante de fibres et leur mésohyle, la fasciculation et la finesse de leurs fibres primaires, ainsi que l’abondance de corps étrangers à leur surface. Malgré les grandes études de systématiques sur les Dictyocératides (de Laubenfels, 1948 ; Vacelet, 1959), tous les auteurs avaient ignoré Psammocinia jusqu'à ce que Bergquist (1980b) la classe en tant que genre. La présence et la densité des fibres primaires fasciculées sont des indicateurs utiles pour distinguer, lorsque cela est difficile, les espèces Psammocinia et Ircinia. En effet, les Psammocinia possèdent typiquement des fibres primaires simples avec une fasciculation quelques fois modérée. En revanche, les Ircinia possèdent des fibres massivement fasciculées. Se basant sur ces critères, Cook et Bergquist (1998) admettent qu’il est possible de distinguer, sans difficulté, des spécimens appartenant à un genre ou à l’autre. Finalement, les études menées par Sim et Lee (Sim et Lee, 1999) ont révélé la présence de filaments du squelette fibreux émergeant des pores. Ceci n’a pas été observé dans d’autres espèces de Psammocinia, mais ce critère n’a pas été recherché. Ce caractère peut potentiellement constituer une alternative dans la détermination des espèces (Cook et Bergquist, 2002).

De façon générale, les éponges cornées des ordres Dendrocératides, Dictyocératides et Verongida regroupent des éponges qui ont depuis toujours le plus intéressé les chimistes. En effet, les trois ordres regroupent près de la moitié des molécules recensées dans le phylum depuis les années 1970, avec plus de 2000 composés isolés (Kornprobst, 2005).

2. 3. Métabolites secondaires des Irciniidae

2. 3. 1. Structures chimiques

Une étude comparative des métabolites secondaires des ordres Dendrocératides, Dictyocératides et Verongida a permis de révéler que les deux premiers ordres contiennent des terpènes qui sont pratiquement absent du troisième, au profit de très nombreux dérivés de la bromotyrosine, dont le métabolisme semble être ainsi spécifique de l’ordre des Verongida. La distribution des terpènes entre les Dendrocératides et les Dictyocératides, étudiée par Bergquist et Wells (1983), comporte six classes (A-F) : les trois premières (A-C) concernent les furanoterpènes, les deux suivantes (D, E) des diterpènes tricycliques et tétracycliques, et la dernière (F) les polyprénylhydroquinones (Figure 3).

Figure 3 : Distribution des terpènes en classes selon Bergquist et Wells (1983).

Les furanoterpènes (classes A, B, C) sont très variés et l’on trouve de nombreux exemples d’acides tétroniques, de furanoterpènes en C21, de terpènes dégradés et de sesterterpènes constitués de plusieurs cycliques furaniques. Les acides tétroniques sont des -méthylène- lactones portant une fonction énol qui leur confère un caractère acide. De nombreuses éponges Dendrocératides, et surtout Dictyocératides, contiennent à la fois des sesterterpènes portant un acide tétronique terminal et la forme dégradée correspondante en C21. Le sesterterpène est d’origine symbiotique ou provient de la chaîne alimentaire alors que le furanoterpène en C21 résultant est produit par l’éponge (Minale, 1978).

Les Dendrocératides contiennent en majorité des terpènes de classe E (et quelques représentants des classes A et B) alors que les Dictyocératides présentent de nombreux représentants dans les six classes, avec une prédominance des furanoterpènes linéaires. L’ordre des Dictyocératides est le premier « producteur » de sesterterpènes de la nature. En effet, les éponges Dictyocératides sont très riches en terpènes polycycliques des classes D (sesterterpènes) et E (diterpènes), avec toutefois une forte prédominance de la première. Ces sesterterpènes sont néanmoins davantage produits par les genres appartenant aux deux familles des Spongiidae et des Thorectidae, la famille Irciniidae (Ircinia et Sarcotragus) n’ayant fourni qu’un faible nombre de ces structures. Les diterpènes de la classe E (squelette carboné du spongiane) semblent également quasiment spécifiques du genre Spongia. Par ailleurs, aucun diterpène de la classe E n’a encore été isolé d’une espèce de la famille Irciniidae. Les terpènes de la classe F sont quasiment spécifiques de la famille des Irciniidae, et en particulier des genres Ircinia et Sarcotragus. On peut s’interroger sur l’espèce réellement à l’origine des métabolites secondaires de la classe F. Quelques métabolites sont sulfatés sur l’une des fonctions phénols ce qui leur confère des propriétés cytotoxiques, antivirales, ou inhibitrice de certaines enzymes.

2. 3. 2. Rôles écologiques

Les éponges marines produisent beaucoup de métabolites secondaires à travers des processus physiologiques normaux, présentant un intérêt pharmaceutique grâce à leurs activités biologiques potentielles (Faulkner, 2000). La complexité structurale ainsi que la fréquente abondance de ces métabolites admettent que leur synthèse se produit selon des coûts métaboliques de l’organisme, leur redevant de fournir par la suite un certain bénéfice à l’éponge (Paul, 1992 ; Pawlik, 1993 ; McClintock et Baker, 2001). Les métabolites secondaires peuvent agir en tant qu’inhibiteurs du biofouling (Henrikson et Pawlik, 1995, 1996) et de la croissance de micro-organismes (Newbold et al., 1999 ; Zea et al., 1999), ils empêchent la dégradation causée par les radiations Ultra-Violettes (Paul, 1992), ou bien agissent en tant qu’agents allélopatiques (Sullivan et al., 1983 ; Porter et Targett, 1988 ; Engel et Pawlik, 2000). Leur fonction la plus hypothétique est la dissuasion des prédateurs (Pawlik, 1993 ; Pawlik et al., 1995 ; Chanas et al., 1996 ; McClintock, 1997 ; Wilson et al., 1999 ; Waddell et Pawlik, 2000a, b).

De perturbations imposées sur l’organisme tel que les changements environnementaux, le stress physiologique, le stress abiotique, le stress nutritionnel, la mutation et les évènements transgéniques peuvent causer des changements dans le métabolome. Ainsi, des altérations au niveau du génome, de la transcription des gènes, du niveau d’expression et des modifications post-traductionnelles des protéines, ainsi que du métabolisme primaire et secondaire reflètent une adaptation aux stimuli environnementaux.

De nombreuses études ont tenté d’évaluer le rôle écologique des métabolites secondaires produits par les Irciniidae, en particulier des furanoterpènes (classe A, B, C) qui sont constitués d’une partie acide tétronique (FTA). Ils semblent être impliqués dans la défense contre les prédateurs (Burns et al., 2003) et Pawlik et al. (1995) montre que sur les extraits organiques de 71 éponges Caraïbes, trois espèces du genre Ircinia (I. felix, I. strobilina et I. campana) sont les moins comestibles pour le prédateur généraliste téléostéen Thalassoma bifasciatum. Ces études ont révélé plus tard l’existence d’un gradient de concentration de FTA au niveau de l’éponge et une forte influence de l’éclairage sur la concentration. Ainsi, au niveau de l’espèce Ircinia felix, la quantité de FTA est plus importante dans les couches profondes de l’éponge qu’au voisinage de la surface. Par ailleurs, les espèces produisent plus de FTA lorsqu’elles sont transplantées ou localisées dans des milieux éclairés, mais également lorsqu’elles sont blessées de façon intentionnelle (Zea et al., 1999). Dans ce cas, on constate que les FTA ne sont pas relargués dans la colonne d’eau avoisinante. L’implication des composés volatiles dans le phénomène direct de défense chimique ou indirect, par émission de signaux vis-à-vis des prédateurs potentiels ou d'organismes invasifs, est aussi suggérée (Zea et al., 1999 ; Duque et al., 2001). Cette hypothèse a été rejetée plus tard par Pawlik et ses collaborateurs (2002), qui confirment le rôle dissuasif des FTA, et non pas des composés volatiles, des trois mêmes espèces d’éponges utilisées dans leurs études en 1995 sur le prédateur Thalassoma bifasciatum en aquarium ainsi que sur une variété de poissons téléostéens en milieu naturel. Ces résultats ont également été confirmés par des études réalisées avec l’extrait organique et la variabiline provenant d’Ircinia strobilina du Brésil, qui, placés dans des boulettes alimentaires d'alginate de calcium, provoquent une non-palatabilité d’un ensemble naturel de poissons téléostéens récifaux (Epifanio et al., 1999). De même, d’après une étude sur l’effet des extraits d’éponges Caraïbes sur l’adhésion bactérienne, le traitement d’un morceau d'agar par l’extrait organique d’Ircinia felix diminue l’adhésion bactérienne de 80 % par rapport à un morceau de référence non traité (Kelly et al., 2003).

Certains prédateurs, poissons téléostéens et invertébrés, semblent être insensibles aux défenses chimiques développées par Ircinia sp. (Pawlik et al., 2002). Par exemple, Ircinia strobilina a été trouvée dans l’estomac de cinq poissons téléostéens spongivores (Randall et Hartman, 1968) et Ircinia sp. a été consommée par des étoiles de mer (Wulff, 1995; Waddell et Pawlik, 2000a) mais évitée par le crabe ermite (Waddell et Pawlik, 2000b).

2. 3. 3. Activités biologiques

Les nombreux terpènes essentiels à la survie des Irciniidae, présentent également une grande variété de propriétés biologiques : antibactériennes, antivirales, cytotoxiques et anti- inflammatoires (Perry et al., 1987 ; Bergquist, 1978) ; qui intéressent particulièrement les industries pharmaceutiques. A titre d’exemple, la variabiline trouvée uniquement chez les Irciniidae, constitue un antibiotique chez Ircinia variabilis (Faulkner, 1973) et s’est avérée cytotoxique dans le genre Psammocinia (Choi et al., 2004). Elle possède également une activité anti-inflammatoire (Escrig et al., 1997).

Bien que la chimie des sesterterpènes isolés d’éponges sans spicules ait été initiée dans les années 1970 et malgré l’apparente simplicité des molécules linéaires isolées, la découverte régulière de nouvelles structures est encore fréquente : les variations structurales concernant la stéréochimie des doubles liaisons centrales et la partie acide tétronique.

3. Présentation du sujet

Le projet de recherche qui m’a été confié s’inscrit en grande partie dans le cadre d’un programme d’écologie chimique marine en Méditerranée (ECIMAR). L’écologie chimique a pour objectif principal l’étude de l’impact des substances naturellement présentes dans l’interaction entre les organismes. En effet, le milieu marin est le siège d’une grande compétition entre les divers organismes benthiques pour l’occupation du biotope ou la survie. Pour de nombreuses espèces d’invertébrés, le système de défense est lié à la production de médiateurs spécifiques, qui sont parfois des vecteurs de la communication chimique. Bien que les recherches en écologie chimique marine soient encore au début de leurs développement, il est raisonnable de supposer qu’à terme elles vont permettre de mieux comprendre l’impact

25 des dérèglements et déséquilibres de la balance naturelle qui menacent la richesse et parfois la survie de l’écosystème marin.

3. 1. Ecologie chimique marine

Les premières études globales sur les interactions entre organismes marins au sein de leurs biotopes ont été publiées dans les années 1980 (Barbier, 1981 ; Aubert et al., 1981 ; Bakus et al., 1986 ; Le Gal, 1988). L’écologie chimique peut se résumer aux différentes approches d’un phénomène très général : la reconnaissance du soi et du non soi qui s’exprime par toutes les formes d’interactions entre organismes vivants. L’échange de ces informations s’établit de façon identique pour tous les organismes, par l’intermédiaire du milieu aquatique qui permet l’instauration d’un gradient de concentration pour une ou plusieurs substances. Ce gradient est perçu par l’organisme récepteur qui réagit en se rapprochant ou en s’éloignant de l’organisme émetteur. Les molécules d’information, télémédiateurs ou écomones, sont très nombreuses mais en même temps difficiles à identifier en tant que telles. D’une part, plusieurs dizaines de molécules diffusibles, constituant un bouquet moléculaire, peuvent être isolées d’un même organisme avec des variations qualitatives et quantitatives au cours du temps, comme c’est souvent le cas pour les éponges. Par ailleurs, lorsqu’une molécule vectrice de la communication chimique est caractérisée, il est souvent difficile d’en déterminer le rôle exact pour son organisme récepteur. Une grande partie des interactions sont réalisées, en milieu marin, par des systèmes de communication chimique qui permettent d’établir des relations entre espèces identiques (intraspécifiques) ou différentes (interspécifiques). Cette communication chimique se déroule en trois étapes : la synthèse et la sécrétion de la substance, son émission dans l’environnement, et sa réception par un autre individu au niveau duquel il va provoquer une réponse spécifique (Le Gal, 1988).

3. 1. 1. Les Relations intraspécifiques

La communication chimique entre espèces identiques concerne surtout les phéromones sexuelles et d’alerte. La reproduction est contrôlée par les phéromones sexuelles. Elles sont indispensables lorsque la fécondation a lieu en pleine eau car cela implique à la fois une

26 certaine synchronisation dans l’émission des gamètes, et des moyens d’attraction entre ces gamètes pour éviter une dispersion qui serait préjudiciable à la pérennité de l’espèce (Babcok et al., 1986 ; Dulka et al., 1987 ; Le Gal, 1988). Il existe également des phéromones d’alerte, ou d’alarme, qui permettent à un individu d’une espèce donnée de prévenir ses congénères d’un danger immédiat.

3. 1. 2. Les relations interspécifiques

Il existe deux types de substances allélochimiques principalement mises en jeu dans ce genre de relations : (i) les allomones procurant un avantage à l’organisme émetteur et (ii) les kairomones procurant un avantage adaptatif ou sélectif à l’organisme récepteur. Ces deux types de substances sont à l’origine de phénomènes très importants, en particulier les systèmes de défense pour les invertébrés fixés (éponges, cnidaires, bryozoaires, ascidies), les stimulants alimentaires (appêtants), la lutte contre les épibioses (biofouling) dont les possibilités d’applications sont considérables, et les problèmes liés à la reconnaissance du « non-soi utile » dans le cas des symbioses.

 Les Kairomones : elles procurent un avantage adaptatif ou sélectif à l’organisme récepteur, sans toutefois apporter d’avantages particuliers à l’organisme émetteur. C’est le cas notamment des molécules produites par des invertébrés qui induisent la métamorphose des larves d’un autre organisme sans qu’il y ait des relations entre eux ;

 Les Allomones : elles sont très nombreuses car tous les invertébrés fixés se protègent de l’attaque de prédateurs ou des agressions bactériennes ou fongiques, par des substances répulsives. Les allomones sont produites par l’invertébré seul ou en symbiose avec des micro-organismes (inter ou intra-cellulaires), ou sont issues d’autres invertébrés pour être stockées dans les tissus externes. Ce dernier cas trouve son illustration par les Nudibranches prélevant leurs allomones de défense sur des éponges appartenant à de nombreux ordres tels que les Astrophorida, Halichondrida, Haplosclerida et Poecilosclerida, certaines éponges calcaires, et les éponges cornées. Les allomones peuvent être impliquées dans une succession de mécanismes complexes de reconnaissance de l’utilité du symbionte et de la nocivité des autres microorganismes, surtout

27 lorsqu’une association intracellulaire avec le symbionte se présente (Taylor, 1973 ; Trench, 1981 ; Wilkinson et al., 1981 ; Webster et Taylor, 2011). A noter qu’il existe deux types d’associations éponges/bactéries symbiontes :  Les HMA sponges (high microbial association) appelés aussi « bactériosponges » : les éponges dans ce cas sont massives et représentent une forte densité tissulaire. Les bactéries associées sont très nombreuses, présentent plusieurs types de morphologie et occupent un volume supérieur à celui des cellules de l’éponge ;  Les LMA sponges (low microbial association) : les éponges présentent une faible densité tissulaire et un système aquifère développé. Les bactéries sont rares et ne présentent en général qu'une morphologie de type filamenteux.

Il existe des allomones qui sont bénéfiques pour le receveur mais particulièrement néfastes pour l’émetteur. Ce type de substance entre dans la catégorie des attractifs alimentaires. Ces derniers sont libérés par certains organismes et perçus par les prédateurs comme des signaux de nourriture vers lesquels ils vont se diriger grâce à leur chemoréception. La prise de nourriture peut être facilitée et amplifiée par d’autres substances qui sont alors des stimulants alimentaires (feeding-stimulant ou phagostimulants). Ces substances sont très différentes selon que les prédateurs sont herbivores ou carnivores (Kornprobst, 2005).

3. 1. 3. Le biofouling ou les épibioses

Dans la compétition pour l’occupation de l’espace, les invertébrés ont développé des méthodes chimiques qui interviennent dans les différentes étapes de la formation des épibioses : sécrétion de substances antibactériennes et cytotoxiques, inhibiteurs de la fixation et régulateurs de la métamorphose des larves. Les éponges produisent des métabolites qui favorisent la formation ou au contraire qui limite la formation de biofilm. De nombreux antifouling naturels sont produits par les invertébrés fixés, et en particulier les éponges.

On distingue différentes étapes dans la formation des épibioses. Lorsqu’une surface est immergée dans la mer, elle commence par adsorber les molécules organiques présentes dans le milieu (exopolymères, glycoprotéines, acides humiques) de manière à former le « film primaire ». Les bactéries vont se fixer de manière réversible sur le film primaire puis, grâce en partie à la sécrétion de polymères extracellulaires (exopolysaccharides), cette fixation

28 réversible va se transformer en adhésion irréversible. Cette fixation va alors permettre le développement de couches successives de colonies bactériennes qui vont former un voile bactérien, que l’on désigne souvent par le terme « biofilm ». Ce biofilm est alors apte à servir de support pour la fixation et le développement de cellules eucaryotes, puis de larves, et enfin après leurs métamorphoses, d’organismes sessiles qui, très rapidement, occuperont la totalité de la surface disponible. Les épibioses sont surtout connues à travers les phénomènes de salissures marines et du fouling des coques de navire ou des ouvrages portuaires (Figure 4).

Figure 4 : Le biofouling en milieu marin (reprise de Haras, 2005).

3. 2. Projets sur l’écologie chimique marine

Depuis ses débuts dans les années 1980, l’écologie chimique marine, n’a cessé de se développer pour devenir une science à part entière, en particulier ces dix dernières années en raison des avancées des techniques d’analyse. Elle est devenue un enjeu politique avec la tenue de grandes conférences internationales sur la biodiversité, et l’impact anthropique sur la disparition des espèces et le réchauffement global (Baker et Weisberg, 1995 ; Gyllenhaal et McChesney, 1996). La conservation des richesses de l’écosystème marin, la nécessité d’évaluer la biodiversité marine pour mieux la protéger (inventaires et identification des espèces endémiques) et pour son développement (pharmaceutique et cosmétique), ont incité de nombreux pays à investir dans les programmes de recherche qui s’intéressent à ces problématiques. Dans ce cadre, les projets financés en France au titre de l’édition 2006 du programme biodiversité, en rapport avec les écosystèmes marins, sont les suivants : BIOTAS : The southwest Indian Ocean biodiversity hotspot : a biota-level study of diversification on land and sea ; DEEPOASES : Biodiversité des écosystèmes chimiosynthétiques dans l’océan profond ;

FRESHWATER FISH : Modèles prédictifs de la diversité spécifique et fonctionnelle des communautés de poissons d’eau douce : outils de réponse aux effets de l’anthropisation et du changement climatique annoncé ; INBIOPROCESS : Linking biodiversity and ecological processes in the subsurface/surface water interfaces for sustainable ground water management ; PICOFUNPAC : Pico phytoplancton dans une région océanique hyperoligotrophe : diversité fonctionnelle et impact sur les bactéries ; ECIMAR : Ecologie chimique marine : indicateurs de biodiversité et valorisation.

Le sujet de thèse qui m’a été confié s’inscrit en partie dans le cadre du projet ECIMAR. La chimiodiversité benthique méditerranéenne, fortement étudiée dans les années 1970, a été délaissée au profit des « hotspots » de biodiversité plus exotique. Ces substances qui sont essentielles au maintien de la vie et à la survie des espèces (métabolites secondaires) traduisent également la diversité des organismes vivants. L’originalité de leurs structures chimiques (chimiodiversité) est également associée à une grande variété des propriétés biologiques.

3. 3. Le projet ECIMAR

Le projet ECIMAR (2007-2011) soutenu par l’Agence Nationale de la Recherche Biodiversité et l'Institut de Chimie des Substances Naturelles ICSN, est un programme labellisé par le pôle mer PACA. Il profite de la progression des techniques d’analyses évoluées ces 30 dernières années dans le but d'évaluer la richesse que peut offrir la communauté benthique de substrat dur méditerranéenne (diversité des espèces et chimiodiversité). La sensibilité des appareils ayant considérablement augmenté, la détection de composés minoritaires devient envisageable, tout en préservant les ressources naturelles par la possibilité d’analyser de faibles quantités d’organismes.

Le projet ECIMAR a pour but d’évaluer le potentiel que représente la biodiversité marine méditerranéenne en terme de chimiodiversité et de mieux comprendre l’expression et la variation de cette diversité chimique au niveau spatial et temporel (Figure 5). Les objectifs du projet ECIMAR, répartis en trois « Work Package (WP) » ou délivrables, sont :

 L’évaluation de la chimiodiversité au sein des communautés benthiques de substrats durs méditerranéennes par (i) un échantillonnage et une détermination des différentes espèces récoltés autour de la Méditerranée, (ii) l’acquisition d’empreintes chimiques des différentes espèces, (iii) l’isolement et la caractérisation des métabolites secondaires, (iv) puis l’évaluation de la bioactivité des molécules isolées (WP1) ;  la production de métabolites secondaires cibles, par (i) l’identification de nouveaux précurseurs biosynthétiques et l’étude de leur biosynthèse in vivo et sur des extraits cellulaires, (ii) ou par la contribution microbienne (bactéries, cyanobactéries et champignons associés aux invertébrés marins) au métabolisme secondaire (WP2) ;  l’identification des facteurs biotiques et abiotiques contrôlant l’expression des métabolites secondaires et ceux à l’origine des fluctuations de cette expression, ainsi que l’influence de stress aigu sur le métabolisme secondaire pour sélectionner des métabolites bioindicateurs, puis l’étude de la relation entre génotype et chimiotype (WP3).

Figure 5 : Schéma récapitulatif des objectifs de l’ANR ECIMAR.

Ainsi, l’élaboration d’un inventaire de la biodiversité et de la chimiodiversité d’une communauté modèle, servira de référence pour suivre l'évolution d'un biotope soumis à diverses pressions environnementales.

3. 4. Objectifs de la thèse

Le projet de recherche qui m’a été confié concerne principalement l’étude des éponges Irciniidae de Méditerranée collectées dans six différents sites : détroit de Gibraltar (Ceuta - Espagne), bassin nord occidental (Marseille et Corse - France, et Monaco) et le bassin oriental (Crète - Grèce et Liban) pendant la durée du projet ECIMAR. Il comporte trois volets principaux :  Une étude chimiotaxonomique des Irciniidae de Méditerranée ;  Une étude comparative des composés volatils présents dans les espèces I. oros, I. variabilis, I. dendroides et S. spinosulus, des différents sites de la Méditerranée (Marseille, Ceuta et Costa blanca) ;  Le dosage de éléments bioaccumulés par les différentes espèces.

Première partie : Dans un premier temps, nous avons entrepris une étude métabolomique par RMN (Résonance Magnétique Nucléaire) des Irciniidae de Méditerranée. La famille des Irciniidae a permis de caractériser de nombreux terpènes bioactifs présentant des activités antibactériennes, antivirales, cytotoxiques et anti-inflammatoires, qui intéressent particulièrement les industries pharmaceutiques, à conditions que l’identification des espèces (non basée sur des critères exclusivement morphologiques) soit réalisée de façon certaine. La famille Irciniidae est actuellement constituée de trois genres : Ircinia, Sarcotragus et Psammocinia. La classification taxonomique des éponges de la famille des Irciniidae est encore peu claire. Ainsi, la distinction entre certaines espèces appartenant à cette famille fait encore l’objet de nombreuses discussions. Pour tenter de clarifier ce désordre de la classification biologique, nous avons choisi une approche chimiotaxonomique. La chimiotaxonomie ou chimiosystématique a pour objet de tenter de classer ou d’identifier les organismes (originalement pour les plantes) en se basant sur des différences et des ressemblances significatives d’un point de vue de leurs compositions biochimiques (étude du métabolome).

Le développement des outils analytiques et informatiques ainsi que la génération d’un grand flux de données obtenues par RMN à partir de matériels biologiques variés (cellules, tissus, fluides biologiques) ont permis l’émergence de nouvelles disciplines : la Métabolomique

(étudiant l'ensemble des métabolites tels que les sucres, les acides aminés, et les acides gras, présents dans une cellule, un organe ou un organisme) et la Métabonomique (mesurant l'empreinte des perturbations biochimiques causées par les maladies, les médicaments ou des produits toxiques). Tout comme la Génomique, la Transcriptomique ou la Protéomique, qui utilisent le suffixe "omique", ces disciplines s’intéressent aux métabolites. Si la Génomique s'applique à l'étude de l’ensemble des gènes, la Transcriptomique s’intéresse à l’ARN, la Protéomique aux protéines, la Métabolomique et la Métabonomique concernent l’exploration des métabolites. Les métabolites se situent au dernier échelon de l’organisme puisqu’ils sont la résultante de l'effet des gènes, de la régulation des protéines et de l'environnement auquel est soumis l’individu. Ce sont des molécules qui résultent du catabolisme et de l’anabolisme de métabolites primaires de l’organisme tels que les sucres, les acides aminés et les acides gras. Nombre d’entre d’eux sont connus et ont déjà été dosés mais certains sont encore inconnus ou inexploités. Dans ce cadre, les objectifs sont multiples (Figure 6) :  Empreintes chimiques par RMN des différentes espèces collectées. Chaque organisme sera soumis à une étude chimique exhaustive qui permettra d’obtenir une vision globale de sa composition en métabolites secondaires ;  Traitement des données obtenues par différents types d’analyses multivariées (PCA, PLS-DA, HCA) ;  Isolement et élucidation structurale des différents métabolites secondaires. Bien que la chimie des sesterterpènes isolés d’éponges sans spicules ait été initiée dans les années 1970 et malgré l’apparente simplicité des molécules linéaires isolées, de nouvelles structures continuent d’être découvertes régulièrement dont les variations structurales concernent la stéréochimie des doubles liaisons centrales et la partie acide tétronique ;  Valorisation des différents métabolites isolés pour leurs propriétés biologiques. Les molécules isolées seront évaluées sur diverses cibles pharmacologiques, cosmétiques et/ou en tant qu’agents antifouling.

Figure 6 : Diagramme des différentes étapes d’une étude chimiotaxonomique.

Deuxième partie : Dans un second temps, nous avons mené une étude comparative des composés volatils présents dans les espèces I. oros, I. variabilis, I. dendroides et S. spinosulus, provenant de différent sites de Méditerranée (Marseille, Ceuta et Costa blanca). En effet, des composés volatiles (diméthylsulfure, méthylisocyanate et méthylisothiocyanate) sont présents dans Ircinia felix ; ils sont responsables de la forte odeur nauséabonde, caractéristique de cette espèce. L’identité et le rôle écologique potentiel de l’ensemble des volatils restent encore faiblement étudiés. Plusieurs hypothèses concernant leurs origines (éponge et/ou symbiote) ont été proposées sans toutefois parvenir à une conclusion certaine. De plus, les composés volatils présents dans les éponges du genre Sarcotragus n’ont pas été étudiés à notre connaissance, bien qu’elles se distinguent également par une forte odeur. Enfin, l’étude des composés volatils peut sans doute fournir de précieuses informations sur les voies de biosynthèse de l’hôte et/ou du symbiote associé. En effet, les composés volatiles peuvent être également les précurseurs et/ou les produits de dégradation de métabolites secondaires plus lourds. Dans ce cadre, nous avons souhaité bénéficier des avancées en termes des techniques d’analyse notamment avec la chromatographie en phase gazeuse mono- et bidimensionnelle couplée à la spectrométrie de masse (Figure 7). Les objectifs sont multiples :  Mise au point d’un protocole standardisé d’étude des composés volatils des spongiaires en utilisant la microextraction par SPME de l’espace de tête et l’analyse par CG- SM et/ou CG*CG-MS (chromatographie en phase gazeuse mono- et bidimensionnelle couplée à la spectrométrie de masse) ;  Tenter d’identifier pour chacune des espèces étudiées la nature des composés volatiles. Ce travail sera réalisée par comparaison des temps de rétention avec ceux de standards commerciaux purs, par comparaison avec les données présentes dans des bases de données commerciales (Wiley, MassFinder 2.1 Library), mais également en utilisant les bases de données du laboratoire construite à partir de l’analyse de composés purs et des données de la littérature ;  Enrichir la liste des composés volatiles issus du milieu marin, qui peut présenter de fortes similitudes avec celle du monde terrestre, mais qui peut également présenter de nettes différences. En effet, il n’existe pas à ce jour de bases de données spécifiques aux composés volatiles marins, contrairement à ceux du milieu terrestre.

Figure 7 : Acquisition par SPME des empreintes chimiques des composés volatils.

Une fois les composés volatiles identifiés, leur rôle écologique potentiel pourra être étudié ultérieurement (en dehors du cadre de ce travail de thèse).

Troisième partie : Finalement, nous avons entrepris de doser différents éléments contaminants accumulés par les Irciniidae collectés sur des sites répartis autour de la Méditerranée (huit régions : Ceuta, Costa Blanca et l’Estartit en Espagne, Banyuls, Marseille et la Corse en France, Grèce et Liban ; et 19 sites de ces régions) lors des campagnes d’échantillonnages étalées sur trois ans consécutifs (2007-2009), dans le cadre du programme ECIMAR. Le milieu marin est contaminé par de nombreux produits chimiques dont des éléments métalliques rejetés par les industries, l’agriculture et les communautés urbaines. Les zones estuariennes et côtières, sous forte influence continentale, sont les plus touchées par cette contamination. Afin de connaître et de suivre l’évolution de la contamination chimique côtière, des programmes de recherche et de surveillance basées sur les dosages des métaux dans l’eau et les sédiments, ont été mis en œuvre. Les concentrations de la plupart des métaux dans l’environnement sont de l’ordre de quelques nanogrammes par litre d’eau, ce qui rend les techniques de prélèvement et de mesure complexes. Les risques de contamination au moment de l’échantillonnage et de l’analyse sont nombreux, rendant les mesures délicates. Ces problèmes ont été surmontés par l’utilisation de techniques d'échantillonnages « ultra-propres ». Cependant, la mesure directe des contaminants dans l’eau fait appel à des techniques analytiques sophistiquées, difficilement applicables en routine le long d’un linéaire côtier important. Par ailleurs, la variabilité temporelle du milieu littoral ne confère que peu de représentativité à une mesure ponctuelle dans la colonne d’eau. Enfin, le suivi de ces concentrations totales dans le milieu ne renseigne pas directement sur les concentrations des espèces chimiques biodisponibles. Les dosages concernent le plus souvent la totalité des espèces chimiques et non spécifiquement les formes 35 biodisponibles des contaminants étudiés, information indispensable quant à la protection des écosystèmes et à la compréhension des processus de contamination. C’est dans cette optique que Goldberg (1975) a proposé de suivre, à l’échelle internationale, les concentrations des contaminants dans les organismes vivants pour surveiller le milieu. C’est le principe des « bioindicateurs quantitatifs » basé sur le fait que les organismes marins concentrent les contaminants, en particulier les métaux divalents, en relation avec les concentrations présentes dans le milieu (Goldberg, 1975; Philips, 1977; Goldberg et al., 1978; Phillips, 1980; Philips et Segar, 1986). Les stratégies de surveillance développées sont diverses et l’utilisation de mollusques fixés et de poissons relativement sédentaires sont les plus couramment développés dans les programmes de surveillance (ex. Ospar). La majorité des études sur la pollution en éléments traces métalliques (ETM) ont été conduites sur les moules et les huîtres. Les éponges, en raison de leur motilité réduite, leur grande diversité et leur capacité à filtrer le milieu environnant, pourraient constituer des bio-indicateurs potentiels pour ce type pollution. Dans ce cadre, nous avons entrepris de doser différents métaux accumulés par les Irciniidae collectés en Méditerranée dans le cadre du programme ANR ECIMAR.

En bref, le modèle des Irciniidae a été choisi afin d’être étudié dans ces trois volets : cette famille est « cosmopolite » et relativement peu d’études ont été effectuées sur les sujets abordés dans ce manuscrit. Dans cette thèse, nous avons essayé de mieux évaluer le métabolome de ce modèle tant pour ses composés de grands et que de faibles poids moléculaires, dans les buts de pouvoir trouver d’autres outils de classification, ou pour la simple détermination de la carte chimique représentative des métabolites secondaires présents dans ces extraits. Nous avons également recherché la capacité de ces éponges à retenir des éléments relativement nocifs de leurs environnements, afin de pouvoir refléter la meilleure représentation de ces derniers qui pourraient servir alors de bioindicateurs (Annexe 2).

II. ETUDE CHIMIOTAXONOMIQUE DES IRCINIIDAE

1. Introduction

Dans le chapitre précédent, nous avons vu que la famille Irciniidae est actuellement constituée de trois genres : Ircinia, Sarcotragus et Psammocinia. La systématique de ces éponges reste relativement complexe. A ce jour, le statut de Sarcotragus est considéré comme incertain et la distinction entre certaines espèces d’Ircinia fait encore l’objet de nombreuses discussions. Les éponges ont historiquement été difficiles à classer en raison de l’absence de caractères phénotypiques complexes qui s’est traduite par plusieurs changements des relations phylogénétiques hypothétiques durant les dernières années (Erpenbeck et Wörheide, 2007). D’une façon générale, la classification des éponges marines est basée sur des critères morphologiques, génétiques et métabolomiques. Toutes ces méthodes qui présentent des avantages et des inconvénients sont parfois combinées pour fournir le plus d’arguments possibles au taxonomiste.

La classification selon les critères morphologiques : Traditionnellement, la systématique des éponges repose presque complètement sur l’étude des différents aspects du squelette et en particulier l’observation des spicules qui constituent la partie minérale du squelette. Cependant, la complexité des spicules et leur contenance en information est très souvent limitée. La morphogénèse et l’évolution des spicules ont été étudiées d’une façon intensive (Dendy, 1921 ; Jones, 1997 ; Uriz et al., 2003), mais les résultats obtenus ont peu contribué à la résolution des problèmes de classifications des éponges. D’autres caractères morphologiques variés tel que la forme, la surface, la texture ou la couleur, dépendent des conditions du micro-habitat ou des saisons (Jones, 1984) ou bien sont présents uniquement in situ. La pertinence des composantes cytologiques a été étudiée (Boury-Esnault et al., 1994), elle a montré une efficacité au niveau de quelques taxons élevés, mais reste pourtant insuffisante pour répondre à des questions plus poussées de phylogénétiques. Il a été démontré que les aspects morphologiques des éponges ont fréquemment été biaisés par des homéoplasies qui bloquent les analyses cladistiques (Manuel et al., 2003), de ce fait, les études ont de plus en plus été orientées vers les caractères non- morphologiques comme solution additives ou alternatives (Erpenbeck et Wörheide, 2007).

La classification selon les critères métabolomiques : La composition en métabolites secondaires a été proposée en alternative aux caractères morphologiques dans la systématique des éponges (Berquist, 1978, 1979). De fait, les données et résultats chimiotaxonomiques sur les éponges ont significativement augmentées dans la littérature récente (Van Soest et Braekman, 1999 ; Erpenbeck et Van Soest, 2007), puis diminuées dernièrement, à cause des difficultés qui sont apparues pour : (i) l’identification du réel producteur (éponge ou symbionte), (ii) l’homogénéisation des voies de biosynthèses et les difficultés expérimentales, et, (iii) la facilité d’obtenir des données sur les acides nucléiques par rapport à d’autres méthodes (Kelly-Borges et al., 1991).

La classification selon les critères génétiques : L’analyse des ADN procure en théorie une importante quantité d’informations phylogénétiques supplémentaires. Par comparaison aux autres phylums de métazoaires, les méthodes moléculaires appliquées aux éponges sont relativement très couteuses, en temps ainsi qu’en argent, puisqu’il existe peu de connaissances sur leur évolution moléculaire (Erpenbeck et Wörheide, 2007). Pourtant, ce phylum est essentiel pour (i) la compréhension de l’évolution des métazoaires et (ii) l’importante quantité de composés bioactifs produits par ces invertébrés valorisables dans le secteur de la biotechnologie. Le génome mitochondrial des éponges a été très peu étudié et les résultats obtenus ne couvrent pas toutes les classes. Un grand nombre de taxons reste non résolus (Erpenbeck et Wörheide, 2007).

Classification des Irciniidae : Les Irciniidae ont principalement été identifiées sur la base de caractères morphologiques avec plus ou moins de succès. La seule étude phylogénétique réalisée (Pöppe et al., 2010), basée sur l’étude du fragment de gène (COI), a rapidement révélée ses limitations en raison du faible niveau d’évolution du marqueur. A part quelques travaux d’isolement et d’élucidation structurale réalisés au cours de la recherche de molécules bioactives, aucune étude globale basée sur les profils métabolomiques n’a été réellement entreprise. Dans le cadre de cette thèse, nous avons choisi une approche chimiotaxonomique basée sur la RMN 1H et les analyses multivariées, pour tenter d’obtenir une caractérisation conjointe des différentes espèces, tant du point de vue taxonomique que métabolomique pour améliorer la classification “traditionnelle”. Ainsi, après une analyse précise des différents métabolites

38 secondaires isolés d’espèces Irciniidae et des outils métabolomiques, nous exposerons les différents résultats obtenus.

2. Les métabolites secondaires des Irciniidae

Nous avons recensé dans la littérature la majorité des métabolites secondaires isolés à partir des espèces de la famille Irciniidae (Figure 8).

Figure 8 : Répartition globale des métabolites secondaires dans la famille Irciniidae toute espèce confondue.

Après une description sommaire des grandes familles des métabolites secondaires : peptides cycliques, macrolides, alcaloïdes et dérivés, macrolides ; nous nous attarderons en particulier sur les structures des furanoterpènes et des polyprénylhydroquinones qui constituent les classes principales des molécules isolées d’Irciniidae.

2. 1. Polypeptides cycliques

Quatre peptides cycliques originaux ont été isolés à partir d’éponges Irciniidae (Figure 9) : la cyclocinamide A, le waiakeamide et les cyclotheonamides (E4 et E5).

O S

Br O N NH O O H NH O N N O N N HN H H O N O NH O S N O HN O Cl H H N N N HO H O O NH2 O S O

Cyclocinamide A Waiakeamide Psammocinia wistarii Ircinia dendroides Clark, W.D. et al., 1997 Mau et al. 1996 Grieco & Reilly, 1998

R O HN HN O O H O NH O O N H N N H O N O

H2N NH

Cyclotheonamide E4 (R=H) Cyclotheonamide E5 (R=H) Ircinia sp. Murakami et al., 2002

Figure 9 : Structuresdu cyclocinamide A, duwaiakeamide et des cyclotheonamides (E4 et E5).

Le cyclocinamide A, isolé de Psammocinia wistarii, est un hexapeptide cytotoxique contenant un bromotryptophane et un N-méthylchloropyrrole (Clark,Vz.O. et a1., 1997; Grieco Er Reilly, 1998). Le waiakeamide est également un hexapeptide cyclique contenant deux sulfoxydes de méthionine, deux prolines et un acide aminé inhabituel : la thiazoylphénylalanine. Isolé d’lrcinia dendroides d’Indonésie (Mau et al., 1996), il s’agit du premier exemple d'un peptide cyclique contenant de la méthionine sous forme sulfoxyde.

Enfin, deux cyclothéonamides ont été isolés d’une Ircinia sp. du Japon (Okinawa). Ces dérivés, qui sont des inhibiteurs de la tryptase, une enzyme intervenant dans la réaction inflammatoire, sont susceptibles d’être utilisés pour le traitement de maladies allergiques comme l’asthme (Murakami et al., 2002).

2. 2. Alcaloïdes et autres dérivés azotés

Plusieurs dérivés indoliques ont été isolés d'éponges du genre Ircinia (Figure 10).

HO HO O O

HN HN O O N HO N HO H H

konbamidine Tryptophol Ircinia spinosula Erdogan et al., 2000 Figure 10 : Structures de la Konbamine (A) et du Tryptophol (B).

Le tryptophol, dérivé indolique isolé d’Ircinia spinulosa, est un constituant bien connu chez les plantes et les microorganismes. Le tryptophol qui n’a jamais été isolé auparavant d’un organisme marin, aurait, comme chez les plantes, un rôle dans la régulation de la croissance de l’éponge. La konbamidine est le second exemple d’alcaloïde indolique isolé d’une Ircinidae (Ircinia sp. d’Okinawa), il est cytotoxique vis-à-vis des cellules HeLa in vitro, avec une IC50 de 5,4 µg/mL.

Les ircinals A et B, isolés d’Ircinia sp., sont des intermédiaires plausibles dans la biosynthèse des manzamines puisqu’ils ont été isolés avec deux nouveaux congénères : les manzamines H et J (Figure 11 et 12, Kondo et al., 1992).

H O H O H H HN N N N H H H H H N OH N OH

N OH N OH H N HN

HN HN

ircinal A ircinal B manzamine H manzamine J

Figure 11 : Ircinal (A et B) et Manzamines H et J. 41

H O N HN N H NH2 N H H H H H N H [OX] N OH N OH N OH

HN HN HN

ircinal B manzamine H manzamine J Figure 12 : Mécanisme hypothétique de biosynthèse des Manzamines H et J, à partir de l’ircinal.

Les ircinals A et B, comme les manzamines H et J, sont cytotoxiques.

2. 3. Macrolides

On distingue deux types de macrolides : les chondropsines et les hatérumalides. La chondropsine C et la 73-désoxychondropsine A ont respectivement été isolées en 2001 de l’espèce australienne Ircinia ramosa et d'une Ircinia sp. récoltée aux Philippines. Les chondropsines ont été extraites d'une éponge du genre Chondropsis (Figure 13, Cantrell et al., 2000). Ces depsipeptides cycliques sont cytotoxiques au nanomolaire sur le mélanome humain LOX et la leucémie humaine MOLT-4, avec des IC50 de 0,8 et 0,2 ng/mL, respectivement (Rashid et al., 200l).

OH OH H N 50 R1 OH O 60 O 73 HO

HN O 25 OH OH 34 O OH OH OH O O O 5 H 1 15 N O OH O O O HO 36 OH Chondropsine C (R1=H) Ircinia sp. 73-Déoxychondropsine A (R1=CO2Me) Ircinia ramosa Rashid et al., 2001 Figure 13 : Chondropsine et 73-Déoxychondropsine.

Les hatérumalides NA-ND sont des macrolides d’un type nouveau, plus simples que les précédents, isolés, la même année et par la même équipe, d'une éponge du genre Ircinia

42 récoltée autour de l'île d'Hateruma, dans l'archipel d'Okinawa (Figure 14, Ueda et Hu, 1999). Tous ces macrolides possèdent le même cycle lactonique à 14 éléments et contiennent un chlore vinylique.

HO Cl OH Cl OH O O O O

O O O O O O OH O O O

haterumalide NA haterumalide NC Ircinia sp. Ircinia sp.

HO Cl O OH Cl OH O O O

O O O O O O O OH O O

haterumalide NB haterumalide ND Ircinia sp. Ircinia sp.

Figure 14 : Structure des hatérumalides.

2. 4. Dérivés soufrés

Deux dérivés soufrés ont été isolés d’éponges Irciniidae : les acides irciniasulfoniques et l’ircininamine. Les acides irciniasulfoniques, isolés en 2001 d'une Ircinia sp. récoltée au Japon (Tsutsumi Island), sont en fait un mélange de trois esters formés d'une partie commune, elle-même constituée par l'association de l'acide iséthionique et d'un nouvel acide en C21, et d'une partie variable qui est un acide à longue chaîne de 22 à 24 atomes de carbone (Figure 15). Les dérivés sulfatés (liaison O-S) sont particulièrement fréquents chez les organismes marins, au contraire des acides sulfoniques (liaison C-S). Les acides irciniasulfoniques réduisent la résistance multidrogues (MDR) et pourraient être utilisés dans la chimiothérapie des cancers (Kawakami et al., 2001).

acide iséthionique acide 3-méthyl-9(R)-hydroxy-décèn-2-oïque

O O -O S Acides Irciniasulfonique O Ircinia sp. O O Kawakami et al., 2001 R

O Figure 15 : Acides Irciniasulfonique.

Enfin, l’ircinamine, qui est un autre dérivé soufré atypique isolé d'une Ircinia sp. du Japon, est dotée de propriétés cytotoxiques (Figure 16, Kuramoto et a1., 2002).

O Ircinamine O Ircinia sp. Kuramoto et al., 2002 S N H Figure 16 : Ircinamine.

2. 5. Stérols

Les éponges du genre Ircinia sont également une source riche d’une variété de stéroïdes. Les stéroïdes isolés d’éponges sont souvent des mélanges complexes de composés hautement fonctionnalisés qui n’ont pour la plupart pas d’équivalents terrestres (Figure 17).

H H HO O 5a,6a-epoxy-26,27-dinorergosta-7,22-enol Figure 17 : Structure d’un stérol isolé d’une éponge Irciniidae.

2. 6. Furanosesterterpènes et dérivés

De nombreux furanoterpènes, principalement de la classe B, ainsi que leurs dérivés, ont été isolés d’éponges Irciniidae, depuis la fin des années 1970. Globalement, ils possèdent la structure générale présentée dans la Figure 18.

O Partie terpénique centrale O Furane O Acide tétronique

Figure 18 : Structure générale des furanoterpènes.

La variabiline, un furanosesterterpène aux propriétés antimicrobiennes isolé d’Ircinia variabilis (Faulkner, 1973), est constituée d’une partie acide tétronique avec une double liaison en position 7,8.

Les dérivés de la variabiline ayant une double liaison 8,10 sont des strobilinines. La strobilinine, sans indications sur la stéréochimie, ni sur la géométrie de la double liaison, a d’abord été décrite par Rothberg et Shubiak (1975) à partir de l’éponge Ircinia strobilina. En 1994, Davis et Capon ont montré que la strobilinine était en réalité un mélange de deux molécules (isomères) désignées : (8E, 13Z, 20Z)-strobilinine et (8Z, 13Z, 20Z)-strobilinine. Par la suite, plusieurs stéréo- et régioisomères de la variabiline et de la strobilinine ont été décrits (Figure 19).

OH OH

O O O O Fasciculatine O O Ircinia fasciculata Cafieri et al., 1972 (7Z,13Z,18R,20Z)-Félixinine OH OH

O O O O O O Palinurine (8Z,13Z,20Z)-strobilinin Ircinia variabilis Alfano et al., 1979 HO OH O O O O O O O Variabiline Ircinia variabilis, Faulkner, 1973 Ircinin-1 Sarcotragus sp., Barrow et al., 1988 Ircinia oros Cimino et al., 1972 HO OH O O O O O O O Ircinin-2 Ircinia oros Cimino et al., 1972 Palominine Ircinia sp. Garcia & Rodriguez, 1990 Figure 19 : Structures de quelques sesterterpènes.

Une grande majorité de ces composés, en raison de la présence d’une partie furane et de l’acide tétronique (-méthylène-lactone portant une fonction énol), est relativement instable. Les produits de dégradation sont constitués d’une partie furane et/ou d’un dérivé oxygéné, comme les -lactones, -lactames ou les méthyls acétals à une extrémité, et d’une partie acide tétronique, acide carboxylique ou diesters diméthyliques, à l’autre extrémité (Figure 20).

O N O Acide carboxylique R -lactame

O Partie terpénique centrale O Furane O Acide tétronique

O OH O OH O O -lactone OH O O diesters diméthylique

Figure 20 : Structure de quelques dérivés furanosesterterpéniques.

Les furanosesterterpènes acide tétronique sont relativement instables, surtout en présence d’oxygène (Figure 21).

R1 R2 R1 R2 R 1O 2 MeOH O O HO O O O O

Figure 21 : Mécanisme d’oxydation du furane.

L’instabilité de ces métabolites secondaires est liée au caractère acide de la partie acide tétronique. Ces dérivés sont bien connus pour réagir en milieu basique avec une perte de quatre carbones, selon le mécanisme présenté dans la Figure 22 (Faulkner, 1977).

O O O HO Variabiline (C25-furanosesterterpène)

O O O OH

H2O

O O O OH

OH HO + O O O OH

C21-furanoterpène

Figure 22 : Mécanisme hypothétique de dégradation des sesterterpènes en C21furanoterpènes.

De nombreuses éponges Dendrocératides et surtout Dictyocératides contiennent à la fois des sesterterpènes (C25 terpène) portant un acide tétronique terminal et la forme dégradée correspondante en C2l. S'il est acquis que dans plusieurs cas le sesterterpène est d'origine symbiotique ou provient de la chaîne alimentaire, le C2l furanoterpène correspondant est produit par l'éponge (Minale, 1978). La forte réactivité associée à la présence de l’acide tétronique a conduit à l’isolement de nombreux sesterterpènes et des C21furanoterpènes contenant du chlore ou des groupes sulfatés. Les dérivés chlorés sont en général des norsesterterpènes qui semblent provenir de l'ouverture de la partie acide tétronique. La konakhine 141 et les dérivés chlorés isolés d'Ircinia oros, semblent ainsi provenir respectivement de la fasciculatine et des ircinines, selon un schéma proposé dans la Figure 23.

OH Konakhine Ircinia sp. O O Cl N'diaye et al., 1991

O O O Cl Ircinia oros Cl De Gulio et al., 1999

OH O O O

Figure 23 : Structure de norsesterterpènes chlorés.

L’isolement de ces dérivés norsesterterpènes chlorés a permis de conforter l’hypothèse biogénétique selon laquelle les C21furanoterpènes sont issus de sesterterpènes, à la suite de la perte de 4 atomes de carbone (Figure 24). Il raisonnable de supposer que ces dérivés chlorés sont formés en deux étapes : dégradation des sesterterpènes et introduction d’un atome de chlore par action de la chloroperoxidase.

O O Fasciculatine O H O O

O O O

H O O

O O O

-CO2

OH Cl

O O

OH Cl

O O Konakhine Figure 24 : Mécanisme hypothétique de la biosynthèse de sesterterpènes chlorés.

Les premiers exemples de furanoterpènes sulfatés sont les sels de potassium des énols sulfatés de la variabiline, de la palinurine et de la fasciculatine, qui ont été isolés des espèces Ircinia variabilis, I. fasciculata et I. oros, récoltées en mer Tyrrhénienne (Figure 25).

OSO3 K Variabilin-22-O-sulfate Ircinia variabilis/I. oros De Rosa et al., 1996 O O O

OSO3 K Palinurine-22-O-sulfate Ircinia variabilis De Rosa et al., 1997 O O O Figure 25 : Sesterterpènes 22-O-sulfate.

Un autre furanoterpène sulfaté original est un dérivé à 31 atomes de carbone (homotriterpène) isolé d’une lrcinia sp., récoltée à 450 m de profondeur sur la Ride de Norfolk, au sud de la Nouvelle-Calédonie (Figure 26, Bifulco et al., 1995).

Na+ O O- S O O O Ircinol sulfate Ircinia sp. Bifulco et al., 1995 Figure 26 : Ircinol sulfate.

Une série de 9 esters de la (7E, 12E, 18R, 20Z)-variabiline, avec des acides gras à longues chaînes et diversement ramifiés, a été isolée des espèces Ircinia felix et I. oros (Martinez et al., 1995, 1997). Cette combinaison rare des différents acides gras avec la (7E, 12E, 18R, 20Z)-variabiline est sans précédent dans la nature (Figure 27).

O R Ircinia felix, Ircinia oros O O Martinez et al., O 1995, 1997

Figure 27 : Structure de conjuguées acide gras-(7E, 12E, 18R, 20Z)-variabiline.

En ce qui concerne les dérivés dont la partie furane a été modifiée, une série originale de dérivés constitués d’un noyau pyrrole N-substitué à la place du furane, a été isolé d'une éponge Sarcotragus récoltée en Corée, autour de l’île Cheju (Liu et al., 2001, 2002, 2003). Ces dérivés se présentent par couples de diastéréoisomères. Cette éponge contient par ailleurs des furanoterpènes de structures équivalentes : les sarcotines A-M, ainsi que les sarcotragines A et B qui correspondent à l'ouverture de l'acide tétronique en ester méthylique (Figure 28, Shine et al., 2001b).

OH N OH O N O O Sarcotragine B Sarcotragine A O O O Sarcotragus sp. O O Sarcotragus sp. Na

OH OH O O O Sarcotine A O Sarcotine B O Sarcotragus sp. O Sarcotragus sp.

O OH O O O O HO O Sarcotine C O Sarcotine D Sarcotragus sp. Sarcotragus sp.

O O OH HO O O O O Sarcotine A Sarcotine E Sarcotragus sp. O Sarcotragus sp.

OH OH O O O O Sarcotine C O Sarcotine B Sarcotragus sp. O Sarcotragus sp.

OH OH N O O O epi-Sarcotine A O Sarcotrine A Sarcotragus sp. Sarcotragus sp. O O

OH OH N O N O O O sarcotrine C O O epi-sarcotrine C

OH OH O O N O O O O O sarcotrine D O sarcotin F

OH O O O O O O O O O O O sarcotin G sarcotin H

O O Na O O O O OH OH sarcotin J sarcotin I

O O O O

sarcotin K sarcotin L

OH HO O O sarcotin M O

O O O OH O sarcotin N OH

OH O O OH sarcotin O OH O

OH O O O O epi-sarcotin F O

N O O O O sarcotrine E Na+ -O

OH O N O O O -O isosarcotrine E Na+

N O O OH O Na+ -O sarcotrine F

Figure 28 : Sesterterpènes pyrrole.

Enfin, certaines éponges Irciniidae produisent des sesterterpènes atypiques. Parmi celles-ci, les wistarines (Figure 29), premiers exemples connus d'énantiomères naturels dont les antipodes ont été isolés de deux espèces différentes du genre Ircinia, et l'ircinianine, dont le dérivé sulfaté a été découvert que 20 ans plus tard, probablement à cause de sa grande instabilité, dans la même espèce Ircinia wistarii (Coll et al., 1997).

H H H H H O O HOH HO O O O O O O

O O

Ircinianine (+)-Wistarine (-)-Wistarine Ircinia wistarii Ircinia wistarii Ircinia sp. Hofheinz & Shonhozer, 1977 Gregson & Cuvrier, 1982 Fontana et al., 1999

Figure 29 : Ircinianine, (+)-Wistarine et (-)-Wistarine.

Les furanosesterterpènes acide tétronique présentent diverses activités biologiques : antibactériennes, antivirales, antitumorales, anti-inflammatoires, antispasmodique et ichtyotoxiques. La partie acide tétronique semble être essentielle pour l’activité antibactérienne. De façon générale, les furanosesterterpènes constitués d’une partie acide tétronique non conjuguée sont légèrement plus actifs que les analogues conjugués correspondants. Enfin, parmi les furanosesterterpènes conjugués, les isomères 20E sont légèrement plus actifs que les isomères 20Z.

2. 7. Polyprénylhydroquinones et dérivés

Les polyprénylhydroquinones et dérivés sont quasiment spécifiques de la famille des Irciniidae, et en particulier des genres Ircinia et Sarcotragus (Figure 30). Beaucoup de dérivés sont par ailleurs sulfatés sur l'une des fonctions phénols, conférant des propriétés cytotoxiques, antivirales ou inhibitrices de certaines enzymes.

Structure n espèces OH 4 Ircinia sp. H 5 Ircinia sp. n Sarcotragus sp. 6 Ircinia sp. OH Ircinia spinosula Sarcotragus sp. 7 Ircinia spinosula 8 Ircinia spinosula O O 5 Sarcotragus sp. S Na O O H 7 Ircinia fasciculata

n 8 Sarcotragus sp. OH 9 Sarcotragus sp.

5 Ircinia sp. OH H 6 Ircinia sp. Sarcotragus spinosula n O 7 O Ircinia sp. S O 8 Ircinia spinosula Na O Sarcotragus spinosula

4 Ircinia sp. O 5 Ircinia sp. H 6 Ircinia sp. n 7 Sarcotragus spinosula O 8 Sarcotragus spinosula

4 Ircinia sp.

O H 5 Ircinia sp. n 6 Ircinia sp. HO Ircinia fasciculata 7 Sarcotragus spinosula

5 Ircinia sp. O H Sarcotragus spinosula 6 Sarcotragus spinosula n O O S O 7 Sarcotragus spinosula O Na

Figure 30 : Structure de quelques polyprénylhydroquinones et dérivés.

3. Bilan et objectifs

Une lecture attentive des différents travaux d’isolement et d’élucidation structurale réalisés jusqu’à présent, nous a permis de tirer les observations suivantes :  Seules trois études menées de façon indépendantes sur des Sarcotragus ont conduit à l’isolement de métabolites furanoterpéniques. Une seule Sarcotragus sp., collectée en 56

Coréea permis l’isolement de plus de 33 furanoterpènes ainsi que leurs dérivés (Liu et al., 2001, 2002, 2003, 2008). La description de l’éponge reste sommaire et un doute subsiste : Sarcotragus ou Ircinia ? A part ces rares exceptions, une grande majorité des métabolites secondaires isolés des espèces du genre Sarcotragus (pour certaines anciennement sous le nom d’Ircinia) sont des polyprénylhydroquinones ;  Les polyprénylhydroquinones, qui sont les formes réduites des polyprénylhydroquinones, sont présentes en majorités dans les extraits, alors que les formes chroménols et chromènes semblent, dans certains cas, être des produits de dégradation des polyprénylhydroquinones correspondantes ;  Les polyprénylhydroquinones sulfates sont instables en milieu acide ; l’utilisation de silice pour réaliser les séparations ou la conservation des métabolites dans le chloroforme, sont ainsi à éviter.

Les données de la littérature, qu’elles soient basées sur la taxonomie des espèces ou sur les travaux d’isolement et d’élucidation structurale des métabolites secondaires bioactifs de cette famille d’éponge, semblent toutes converger vers une séparation claire entre les espèces Ircinia et Sarcotragus. Les études menées sur les espèces Psammocinia restent relativement marginales. Du point de vue métabolomique, les Ircinia semblent être caractérisées par des métabolites secondaires furanoterpéniques avec leurs dérivés. En revanche, la situation est plus complexe pour les Sarcotragus. En effet, elles semblent être à l’origine exclusivement tantôt de métabolites secondaires furanoterpéniques (et leurs dérivés) tantôt des métabolites secondaires de type polyprénylhydroquinones (et leurs dérivés). En revanche, lorsque l’on tient compte de la révision proposée en 2002, ainsi que de la correction de certaines attributions taxonomiques relativement anciennes (i.e, Sarcotragus spinosulus pour l’ancien nom Ircinia spinosula et Ircinia muscarum pour l’ancien nom Sarcotragus foetidus), sans même tenir compte des erreurs d’identification éventuelles, on observe une tendance claire qui tend à converger vers le fait que les Sarcotragus sont bien distincts des Ircinia et produisent des métabolites secondaires de la famille des polyprénylhydroquinones (ainsi que leurs dérivés). Il semble donc nécessaire de vérifier et de confirmer cette observation du point de vue expérimental en se basant sur une étude métabolomique complète des différentes espèces de cette famille. C’est dans ce cadre que nous avons entrepris une étude basée sur l’étude à la fois taxonomique et métabolomique des différentes espèces de la famille Irciniidae collectées en 57

Méditerranée dans le cadre du programme ECIMAR de l’ANR Biodiversité. En ce qui concerne l’approche métabolomique, nous avons privilégié les empreintes chimiques des différentes espèces en nous basant principalement sur la RMN 1H. En effet, il s’agit globalement d’une famille riche en métabolites secondaires très voisins du point de vue structural (plusieurs stéréo- et régioisomères). Par ailleurs, les données de la littérature semblent indiquer les difficultés dans la caractérisation de métabolites secondaires de polyprénylhydroquinones par les méthodes de spectrométrie de masse (problèmes de détection en raison d’un problème d’ionisation). Les différences, particulièrement fines entre certaines espèces, ne pourront être mise à jour si à la base la méthode d’analyse est discriminante. Enfin, une bonne partie des métabolites sont relativement instables (air, pH) et requièrent de nombreuses précautions lors de l’étude envisagée.

Dans la suite de ce chapitre, avant d’aborder plus en détail les études taxonomiques et l’étude des profils chimiques par RMN du proton avec les analyses multivariées associées, nous allons présenter de façon succincte quelques généralités sur la métabolomique, les méthodes d’analyse et les outils statistiques utilisés dans ce manuscrit.

4. Les outils analytiques utilisés pour l’étude des profils métabolomiques

L’étude du métabolome (un grand nombre de métabolites synthétisés par un système biologique) et du profil métabolomique (l’ensemble des métabolites choisis pour caractériser unorganisme biologique) a commencé au début des années 80. L’étude de profils métabolomiques à partir d’extraits de cellules, de tissus de végétaux ou d’animaux, permet d’estimer la composition biochimique totale (Glassbrook et Ryals 2001 ; Gidman et al., 2003). Le profil métabolomique peut changer selon les effets de l’environnement, des variétés et des traitements. Cette étude permet aussi d’évaluer la réponse métabolomique à court terme d’un tissu, à un moment donné du développement ou du métabolisme d’un système biologique (Morot-Gaudry et Briat, 2004). Une autre application très répandue ces dernières années est l’étude d’empreintes métabolomiques basée sur l’analyse d’un grand nombre de métabolites sur une série d’échantillons (Fiehn, 2002). On ne s’intéresse pas à la quantification de chaque métabolite dans l’extrait, mais on analyse la

58 variabilité par des méthodes statistiques, ce qui permet de discriminer les différents traitements en trouvant les variables qui expliquent la variabilité (Fiehn, 2001). La chromatographie liquide haute performance (CLHP), aussi utilisée couplée avec la spectrométrie de masse ou MS (LC/MS), est une technique très sensible et sélective (Morot- Gaudry et Briat, 2004). Elle permet d’identifier de nombreux composés. La sensibilité est excellente et elle permet la détection de très faibles quantités de produits. La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) est une technique bien adaptée aux études de certains métabolites in vivo ou après extraction des composés (Fan,1996). C’est un outil utilisé dans les domaines médical, chimique, physique et biologique (Boesch,1999 ; Antti et al., 2002).

5. Les analyses par RMN

L’analyse par RMN est devenue aujourd’hui une méthode de routine pour les études du fonctionnement cellulaire des systèmes biologiques. Des nombreux noyaux atomiques peuvent être détectés par RMN. Les noyaux les plus utilisés sont le proton (1H), le carbone (13C), le phosphore (31P), l’azote (15N), le sodium (23Na), le potassium (39K) et le fluor (19F) (Fan 1996). C’est une méthode sélective qui permet le dosage et l’identification de plusieurs métabolites dans un mélange complexe, simultanément (Szwergold, 1992 ; Ratcliffe, 1994 ; Yan et al., 1996 ; Diakou et al., 1997 ; Maniara et al., 1998 ; Kosir et Kidric, 2001 ; Warne et al., 2001). Cette méthode permet de quantifier des métabolites in vivo et in vitro à partir de la résonance de 1H, 13C et 31P, des atomes largement représentés dans les biomolécules (Santos et al. 1993 ; Wasser et al. 1996 ; Yan et al. 1996 ; Dufour et Bayonove 1999 ; Richard et al. 2001). La rapidité de l’obtention des résultats, l’exigence minimale pour la préparation des échantillons (utilisation de l’extrait brut), le fait qu’il s’agisse d’une méthode non-destructive et la grande aptitude à déceler les transformations structurales, sont quelques uns des avantages de la spectrométrie RMN (Fan, 1996 ; Thillart et Waarde, 1996 ; Forveille et al., 1996 ; Belton et al., 1998 ; Ramos et Santos,1999 ; Fiehn, 2001). La RMN 1H comparée à la RMN 13C est plus sensible. Le proton est présent à 99,9% dans la nature, tandis que l’abondance naturelle du 13C est seulement de 1,1%. Tous les métabolites organiques qui contiennent des 1H sont susceptibles de donner des signaux. La RMN du proton est utilisée pour caractériser le profil métabolomique de systèmes biologiques, elle permet une acquisition rapide d’un signal de façon quantitative (Saucier et al., 1997 ; Akoka 59 et al., 1999 ; Roessner et al., 2001). On peut obtenir des informations sur des changements dans les matrices complexes dus à des effets de l’environnement ou à des conditions de préparation des échantillons (Glabgen et al. ; Guyot et al. 1996). Ces méthodes permettent de construire des bases de données et d’automatiser les manipulations (Lommen et al., 1998 ; Noteborn et al., 2000).

Dans la suite de ce chapitre, nous présentons les techniques les plus courantes utilisées en métabolomique par RMN1H afin de formaliser les données brutes et les rendre exploitables par les outils statistiques et in fine interprétables.

6. Métabolomique par RMN 1H

En général, les études de métabolomique par RMN 1H, combinées aux analyses multivariées, comprennent trois grandes étapes : le prétraitement et la normalisation, l’échantillonnage et le choix des régions spectrales d’intérêts.

6. 1. Prétraitement et normalisation

L’acquisition terminée, le prétraitement des spectres RMN (ajustement des phases, correction de la ligne de base, calibrage en fréquence) et de mise en forme des données RMN, débutent. L’objectif de cette étape est de fournir un jeu de données dont la variabilité est principalement dépendante de la biologie.

6. 2. Echantillonnage

De nombreux logiciels permettent de transformer les spectres RMN 1H en une matrice de k lignes (individus ou échantillons) et n colonnes (variables ou déplacements chimiques). La plus évidente des caractéristiques est certainement la dissymétrie importante des tableaux de données. En effet, le nombre de conditions expérimentales (i.e., le nombre d’échantillons)

60 est bien souvent très faible par rapport aux nombres d’observables (variables métabolomiques) analysés. Une base de spectres est introduite dans le logiciel. Chaque spectre est ensuite découpé à intervalles réguliers ou non, définis par l’utilisateur. Il s’agit de l’échantillonnage. Pour chaque intervalle, l’aire sous la courbe du spectre est un «bucket» : littéralement, une tranche de spectre. La Figure 31 montre comment un spectre est transformé en un histogramme représentant l’aire du spectre pour chaque intervalle échantillonné.

Figure 31 : (a) exemple de Spectre RMN 1H, (b) représentation du spectre échantillonné par pas de 0,01 ppm.

Les données obtenues sont des valeurs algébriques qui correspondent aux intensités des différents signaux formant le spectre de RMN. Elles sont issues de l’échantillonnage du spectre. L’intensité totale du spectre est donc la somme de l’ensemble des fractions échantillonnées. Chaque fraction échantillonnée correspond au signal des protons d’un métabolite ou d’un groupe de métabolites parfaitement identifié ou identifiable, et est normalisée par rapport à la somme de l’ensemble des fractions échantillonnées. La Figure 32 représente une partie d’une matrice de données obtenue après le découpage des spectres. Les individus sont représentés sur les lignes et les variables sur les colonnes.

Figure 32 : Matrice des données.

Le nombre de variables générées est bien supérieur au nombre d’individus étudiés. Par exemple, il est fréquent d’obtenir des fichiers contenant plusieurs centaines de variables pour seulement vingt individus, alors que pour réaliser des analyses statistiques, il est préférable d’avoir une matrice carrée. Afin d’obtenir une représentation la plus proche de la réalité, il est donc nécessaire de diminuer autant que possible, le nombre de variables avant de réaliser les analyses statistiques. Pour diminuer la taille de la matrice, il est possible d’augmenter la largeur des «buckets» c'est-à-dire le pas d’échantillonnage des spectres. Mais cette action peut entraîner une perte d’information. En effet, en augmentant le pas, on diminue la précision d’analyse des variables responsables de la représentation des individus. Une autre possibilité pour diminuer le nombre de variables sans perdre la précision spectrale consiste tout simplement à réaliser plusieurs analyses statistiques sur des zones de spectres plus petites. Dans ce cas, l’intérêt d’utiliser des méthodes multivariées est perdu. La seule et véritable manière de résoudre correctement ce problème de taille de la matrice est d’augmenter considérablement le nombre d’individus. Cependant, ceci implique une collecte d’échantillons suffisante, ce qui n’est pas toujours possible ou réalisable suivant les études.

Enfin, pour contraindre les variables qui proviennent de mesures d’origines différentes à faire partie du même espace, elles doivent être centrées et réduites et non pas seulement normalisées par rapport à la somme des « buckets », comme c’est souvent le cas lorsque nous travaillons avec des données d’une seule origine. Cette normalisation a pour effet de donner le même potentiel informationnel à chaque variable, en l’occurrence à chaque « bucket ». Cependant, un des effets pervers de la normalisation des données spectroscopiques est de ramener les variables provenant de signaux fortement influencés par le bruit, au même niveau que les variables pertinentes du signal. Ainsi, des valeurs proches de 0 dans la matrice non

62 normée prennent autant de poids que toutes les autres variables lors de la réalisation d’une ACP normée. Ceci aboutit à une perte du pouvoir discriminant des variables par bruitage de l’information pertinente. Il faut donc éliminer, avant la normalisation, les variables qui sont soit fortement influencées par le bruit, soit non porteuses d’une information pertinente.

6. 3. Régions d’intérêts et exclusions

La définition des régions d’intérêt pour l’analyse statistique est la dernière étape du traitement des données acquises par RMN. Il apparaît avec l’expérience que cette étape correspond plus à la sélection des régions d’exclusions pour des raisons techniques, méthodologiques, ou simplement de choix liés aux objectifs de l’étude. On commence naturellement par la suppression des régions associées aux signaux de l’eau. Pratiquement cela correspond à la fenêtre spectrale allant de 4,6 à 5,0 ppm.

Pour chaque « bucket », la valeur de l’intégrale du spectre est insérée dans un tableau qui sera ensuite traité avec le logiciel de statistique.

7. Les outils statistiques

L’objectif des statistiques est de recueillir, traiter et interpréter les données. Il existe de nombreuses méthodes d’analyse statistique qui dépendent du type (variables quantitatives ou qualitatives) et du nombre de données à analyser. En analyse chimique, on utilise généralement les méthodes statistiques univariées ou multivariées. Les méthodes univariées sont adaptées à l’analyse d’un faible nombre de variables. Dans le cas de la spectroscopie RMN, leur utilisation va entraîner de nombreuses pertes d’information principalement à cause de la superposition des signaux qui ne seront donc pas exploitables. Les analyses statistiques multivariées sont un ensemble de méthodes destinées à synthétiser l'information issue d’un grand nombre de variables afin d’en simplifier la représentation et l’interprétation. Elles permettent, dans le cas de la RMN, de révéler l’importance d’une variable discriminante qui aurait été ignorée lors d’une analyse univariée.

Les méthodes multivariées, les plus utilisées pour l’analyse de données issues des analyses spectroscopiques et des profils métabolomiques, sont : l’analyse en composantes principales (ACP) et l’analyse par régression partielle (PLS) (Kemsley 1998). Parmi les méthodes de classification non supervisée, l’ACP est la méthode la plus employée en métabolomique. La PLS, méthode de classification supervisée la plus employée en métabolomique, repose sur un principe auquel on applique des contraintes (Boulesteix & Strimmers, 2007). Dans notre étude, nous avons utilisé ces deux méthodes pour la discrimination des groupes d’échantillons. L’ACP ou la PLS présentent le grand avantage de permettre l’établissement de modèle de « diagnostics » simples et visuels. Typiquement, un modèle prédictif se présentera sous la forme d’un graphique (1D, 2D ou 3D) dont l’espace de projection sera divisée en surface prédictive. Le positionnement spatial d’un nouvel échantillon dans cet espace de projection fera office de classification.

7. 1. Analyse en composantes principales (ACP)

L’objectif de cette méthode est de réduire la dimension de l’espace des données en déformant le moins possible la réalité. Pratiquement, l’ACP consiste en la détermination d’une suite d’axes orthogonaux, non corrélés, conservant au mieux les distances entre les individus. Ces axes sont appelés axes principaux d’inertie ou composantes principales, et forment un nouvel espace dimensionnel pour les données. Ce modèle est facilement interprétable graphiquement et la présence d’un point extérieur à la « surface de normalité » s’explique par un examen de son profil métabolomique. Ces données, une fois « nettoyées » des cas aberrants, peuvent être soumises à une analyse de type supervisée ou non supervisée.

7. 2. Analyse discriminante (PLS)

Les méthodes PLS développées au cours des années 80 (Wold et al., 1983), sont des techniques d’analyse de données particulièrement bien adaptées pour l’étude de problèmes de type métabolomique (Wold, 1991).

La PLS est une méthode assez utilisée dans le domaine biologique qui permet une optimisation de la discrimination entre groupes de variables analysées sur un grand nombre d’individus. Elle permet l’introduction du choix du groupe, ce qui permet une meilleure séparation des groupes lors de la création du modèle statistique. Ainsi, la formation des groupes de variables avec la PLS est faite a priori, étant optimisée pour la séparation sur le premier axe (Kemsley, 1998). Elle permet également d’identifier les variables qui participent à la spécificité des groupes (Figure 33).

Figure 33:Exemple de classification selon la PLS.

La génération d’un modèle ACP, bien qu’il permette de déterminer des classes, prend en compte la variabilité globale des données. Les différences entre les profils métabolomiques des deux groupes sont suffisantes pour permettre une classification. Cependant l’amélioration notable obtenue en se basant sur un modèle PLS‐DA, démontre clairement quelle information métabolomique liée à l’appartenance aux différents groupes est partiellement masquée par la variabilité biologique naturelle. Un autre intérêt de ces méthodes statistiques est la possibilité d’introduire de nouveaux individus dans un modèle précédemment créé. Ceux-ci vont être projetés dans le graphique, sans modifier la structure initiale des PCs ou PLS qui expliquaient les variations des groupes d’échantillons. Les nouveaux individus seront visualisés dans le graphique de façon comparative avec les individus et les variables précédemment analysées. La phase d’interprétation des deux modèles repose sur l’examen des variables prépondérantes dans la génération de l’ACP et de la PLS‐DA.

Deux paramètres, Q² et R²Y, sont classiquement utilisés pour juger de la qualité des modèles produits. L'indice Q² cumulé est une mesure globale de la qualité de l'ajustement et de la qualité prédictive des modèles. La qualité de l'ajustement est classiquement jugée comme « satisfaisante » lorsque Q² est supérieur à 0,5 au moins. Les R²Y cumulés correspondent aux corrélations entre les composantes et les variables de départ. Lorsque cette valeur tend vers 1, les composantes sont alors bien représentatives des Y.

7. 3. Classification

La classification regroupe un ensemble de techniques utilisées pour classifier des objets. L'analyse de classification est un outil de découverte : une méthode d'analyse multivariée permettant de former des groupes homogènes d'individus ou d'objets selon un critère. Il existe de nombreuses techniques de classification qui visent toutes à répartir les individus caractérisés par p variables (X1, X2, …, Xp) en un certain nombre m de sous-groupes aussi homogènes que possible. Il existe deux grandes familles de techniques de classification : • la classification non hiérarchique : décomposition de l’ensemble de tous les individus en m classes d’équivalences, m étant fixé ; • la classification hiérarchique : pour un niveau de précision fixe, des individus seront ou non dans le même groupe, selon ce niveau. Cette dernière méthode met davantage l’accent sur les individus que sur les variables. Il existe un grand nombre de variantes de ces méthodes. Afin d’obtenir une « bonne » classification, on peut être amené à appliquer plusieurs de ces méthodes sur un même jeu de données.

8. Résultats

8. 1. Taxonomie

Le recouvrement de l’ectoderme par du sable, bien qu’il s’agisse d’un critère subjectif, nous a permis de distinguer deux groupes d’éponges : les espèces partiellement recouvertes de sable,

66 et les espèces non recouvertes de sable. Toutes les éponges collectées possèdent une résistance au déchirement ce qui est le premier critère d’appartenance à la famille Irciniidae. Les espèces du premier groupe, potentiellement du genre Ircinia, sont caractérisées par des filaments de 3 à 13 μm de diamètre et des fibres primaires de 120 à 250 μm de diamètre. Les espèces Ircinia oros se distinguent clairement des autres Ircinia par la dimension des fibres qui est de 9 à 13 μm, alors qu’elle ne varie qu’entre 3 et 8 μm chez les autres espèces d’Ircinia. Enfin, nous nous sommes basés principalement sur la morphologie externe pour distinguer deux autres sous-groupes au sein des Ircinia : Ircinia variabilis et Ircinia dendroides. En effet, ces deux espèces présentent des caractères histologiques relativement proches, excepté la présence quelque fois de cellules rondes au niveau de l’endosome pour Ircinia variabilis (Figure 34 I et III). De façon générale, le second groupe est composé d’éponges constituées de filaments de fibres primaires à moelle, d'une épaisseur de 50 à 180 μm, dépourvues de corps étrangers. Elles possèdent une consistance tenace et compressible qui reflète la densité des filaments dans le mésohyle (Vacelet, 1959). Il s’agit bien du point de vue taxonomique d’espèces méditerranéennes du genre Sarcotragus (Figure 34 I, II, III, V, VI). Cette étude taxonomique a permis de déterminer par les critères microscopiques l’appartenance de plusieurs échantillons non identifiés récoltés au Liban et à Ceuta (Espagne) à l’espèce Ircinia variabilis, sachant que les échantillons du Liban présentent, avec leur couleur jaunâtre, une morphologie externe différente des Ircinia variabilis récoltées ailleurs (Figure 34 IV). Ce résultat nous amène à considérer l’appartenance d’I. variabilis du Liban, à une variété différente de celle de Ceuta. Les critères microscopiques ont également confirmé l’appartenance de quelques échantillons récoltés au Liban à l’espèce Sarcotragus spinosulus (Figure 34 VII).

Figure 34 : Illustration par des coupes semi-fines des différentes espèces à une échelle de 0,1 mm. I : Ircinia dendroides 080613Co2.25 ; I. A : Coupe au niveau de l’ectosome (x10) ; a : conule ; b : fibre primaire ; c : corps étrangers ; I. B : coupe au niveau du mésohyle (x10) ; a : fibre primaire ; b : corps étrangers ; c : fibre secondaire. II : Ircinia oros 090701Ma8.04 ; II. A : Coupe au niveau de l’ectosome (x10) ; a : fibre primaire ; II. B : coupe au niveau du mésohyle (x10) ; a : fibre primaire en coupe longitudinale ; b : fibre primaire en coupe transversale ; c : filament. III : Ircinia variabilis080528Gr3.23 ; III. A : Coupe au niveau de l’ectosome (x5) ; a : conule ; b : fibre primaire ; III. B : coupe au niveau du mésohyle (x10) ; a : fibre primaire en coupe longitudinale ; b : filament. IV : Ircinia variabilis du Liban 090503Lb3.01 ; IV. A : Coupe au niveau de l’ectosome (x5) ; a : fibre primaire ; b : filament ; IV. B : coupe au niveau du mésohyle (x10) ; a : fibre primaire en coupe longitudinale ; b : filament. V : Sarcotragus spinosulus 070630Ce1.03 ; V. A : Coupe au niveau de l’ectosome (x10) ; a : conule ; b : fibre primaire ; V. B : coupe au niveau du mésohyle (x5) ; a : fibre primaire en coupe longitudinale ; b : fibre secondaire ; c : filament. VI : Sarcotragus foetidus 080612Co1.05 ; VI. A : Coupe au niveau de l’ectosome (x5) ; a : fibre primaire ; b : épibionte (hydrozoaire) ; VI. B : coupe au niveau du mésohyle (x10) ; a : fibre primaire en coupe longitudinale ; b : fibre secondaire ; c : filament. VII : Sarcotragus spinosulus du Liban 090510Lb8.01 ; VII. A : Coupe au niveau de l’ectosome (x10) ; a : conule ; b : fibre primaire ; VII. B : coupe au niveau du mésohyle (x5) ; a : fibre primaire en coupe longitudinale ; b : filament.

La liste des échantillons collectés et retenus pour cette étude chimiotaxonomique est indiquée dans le Tableau 1 :

Tableau 1 : Identification taxonomique des différentes espèces étudiées.

Sites de Récolte Taxonomie Codes des Echantillons* Taxonomie Sites de Récolte Codes des Echantillons foetidus Corse 080612Co1-05 080613Co2-24 foetidus Corse 080612Co1-05 080613Co2-24 Ceuta 090616Ce2-01 090618Ce7-05 Ceuta 090616Ce2-01 090618Ce7-05 Sarcotragus Costa Blanca 090613Cb2-01 Sarcotragus Costa Blanca 090613Cb2-01 spinosulus spinosulus Grèce/Crête 080526Gr1-21 080527Gr2-03 Grèce / Crête 080526Gr1-21 080527Gr2-03 Liban 070612Lb8-01 Liban 070612Lb8-01 Corse 080613Co2-25 dendroides Corse 080613Co2-25 090614Cb3-05 dendroides Costa Blanca Costa Blanca 090614Cb3-05 Banyuls 080728Ba1-18 080729Ba2-07 Banyuls 080728Ba1-18 080729Ba2-07 Corse 080616Co4-12 Estartit 080627Es1-08 Corse 080616Co4-12 Ircinia oros Grèce/Crête 080526Gr1-10 080526Gr1-13 080526Gr1-18 Estartit 080627Es1-08 080605Ma4-05 080625Ma3-22 080626Ma8-16 Ircinia oros M arseille Grèce / Crête 080526Gr1-10 080526Gr1-13 080526Gr1-18 090625Ma3-02 090701Ma8-04 080605Ma4-05 080625Ma3-22 080626Ma8-16 M arseille 080623Ma4-17 090702Ma5-06 Marseille variabilis 090625Ma3-02 090701Ma8-04 Liban 080524Lb3-02 Marseille 080623Ma4-17 090702Ma5-06 variabilis Liban 090702Ma5-07 Détail du code échantillon * Détails du Code Echantillon : exemple de 080605Ma4-05 Exemple de 080605Ma4-05 Ba : Banyuls ; Ce : Ceuta ; 80605 Date de récolte : 5 juin 2008 080605 Date Récolte : 5 juin 2008 Cb : Costa Blanca ; Co : Corse ; Ma Site : Marseille Ma Site : M arseille Es : Estartit ; Lb : Liban ; 4 N° Station du Site Ma : Marseille . -05 N° Echantillon de la Station 4 N° Station du Site 05 N° Echantillon de la Station

Dans un second temps, nous avons comparé la classification obtenue par la méthode de la taxonomie usuelle avec les résultats de l’identification basée sur la chimiotaxonomie.

8. 2. Métabolomique par RMN 1H

Dans le cadre de cette étude, nous nous sommes intéressés aux profils chimiques par RMN 1H pour les cinq espèces Ircinia oros, Ircinia variabilis, Ircinia dendroides, Sarcotragus foetidus et Sarcotragus spinosulus.

8. 2. 1. Ircinia oros

Deux profils par RMN 1H, réalisés sur l’extrait brut des espèces identifiées comme étant Ircinia oros, sont présentés au niveau de la Figure 35.

1 Figure 35 : Profils par RMN H (CD3OD+0,1% DSS, 500 MHz) pour les espèces Ircinia oros.

Tous les profils sont principalement caractérisés par la présence d’un mélange de deux métabolites secondaires : l’ircinine-1 et l’ircinine-2 (Figure 36).

14 12 14 H 12 19 19 10 13 16 10 13 16 HO HO 7 8 22 25 7 8 15 22 25 11 11 H 17 21 21 6 18 23 6 17 18 23 5 9 15 5 9 O H O O H O 3 24 O 3 24 O 20 20 2 4 2 4 1 O 1 O Ircinine-1 Ircinine-2

Figure 36 : Structures de l’ircinine-1 et de l’ircinine-2.

L’ircinine-1 et l’ircinine-2, présentées sur la Figure 36, sont constituées :

 de deux unités furanes liées l’une à l’autre par un CH2 (méthylène) en position 5 (en bleu) ;

 d’un méthyle (CH3-14) porté par une double liaison et d’un méthyle (CH3-18) porté par CH-18 (en noir) ; et,  d’une unité acide tétronique conjuguée, avec une double liaison en position 20,21 (en rouge). La différence entre l’ircinine-1 et l’ircinine-2 réside dans la position de la double liaison au niveau de la partie centrale. Pour l’ircinine-1, la double liaison est située en position 12,13, alors que pour l’ircinine-2, la double liaison est située en position 13,15.

Pour l’ensemble des profils par RMN 1H, les 5 signaux (singulets larges) à 7,38 (H-1), 6,30 (H-4), 7,31 (H-9), 3,68 (s) et 3,69 (s) (H-5), et 5,90 ppm (H-7), sont caractéristiques des deux unités furanes liées l’une à l’autre par CH2-5.

Les signaux à 1,71 et 1,72 ppm (CH3-25) d’une part, et à 5,26 (d, J = 9,72) et 5,25 (d, J = 10,13) (H-20) d’autre part, sont caractéristiques de l’unité acide tétronique conjugué. Enfin, les signaux à 1,51 ppm et 1,02 (d, J = 6,7), puis à 1,03 (d, J = 6,7), sont caractéristiques des méthyles CH3-14 et CH3-19, respectivement. Pour certaines espèces I. oros, une analyse plus fine des profils par RMN 1H et 13C, révèle que l’ircinine-1 et l’ircinine-2 sont présentes également, avec des géométries différentes au niveau de la double liaison 20,21 au voisinage de la partie acide tétronique (présence d’un signal déblindé à 3,41 ppm au lieu de 2,69 ppm pour H-18) significatif de la présence des isomères 20E et 20Z, aussi bien pour l’ircinine-1 que pour l’ircinine-2. L’ensemble des attributions réalisées est en accord avec les données RMN 1H et 13C obtenues sur le mélange de l’ircinine-1 et l’ircinine-2, isolés en tant que composés standards au cours de notre étude (cf. § Matériel et Méthodes), ainsi que les données de la littérature (Manes et al., 1986 ; Cimino et al., 1972 et Liu et al., 2001).

8. 2. 2. Ircinia dendroides

Les profils de RMN 1H, réalisés à partir des extraits bruts des deux espèces identifiées comme étant Ircinia dendroides, sont présentés au niveau de la Figure 37.

1 Figure 37 : Profils par RMN H (CD3OD+0,1% DSS, 500 MHz) pour les espèces Ircinia dendroides.

Les profils sont principalement caractérisés par la présence de dérivés de la palinurine (Figure 38).

OH 5 7 10 12 15 17 20 2 3 13 8 18 21 22 25 1 6 16 11 O 23 O 4 19 9 14 24 O

Palinurine

Figure 38 : Structure de la palinurine.

La palinurine est constituée :  d’une unité furane substituée en position  (position 3, en bleu) ;  de trois doubles liaisons (position 8,10, 11,12 et 17,18), de deux méthyles portés par

des doubles liaisons (méthyles vinyliques) CH3-9 et CH3-19, et un méthyle CH3-14 porté par CH-13 sur la partie centrale (en noir) ; et,  d’une unité acide tétronique non conjugué (pas de double liaison en position 20,21, en rouge). La présence d’une unité furane substituée en position  (en position 3) est confortée par les signaux (singulets larges) à 7,37 (H-1), 7,24 (H-4) et 6,28 (H-2) ppm (Figure 36). La présence d’un fragment acide tétronique non conjugué est confortée par la présence des signaux à 1,64 ppm pour CH3-25 et 4,71 ppm pour CH3-21. Le profil de RMN 1H révèle la présence d’une double liaison trisubstituée (H-17 à 5,24 ppm) et d’un diène 1,1,4-trisubstitué (6,20 (dd, J = 14,98, J = 10,73) pour H-11, 5,76 (d, J =10,7) pour H-10 et 5,36 (dd, J = 8,39, J = 14,98) pour H-12. La double liaison 11,12 est de configuration E (J = 14,98 Hz). Enfin, les signaux à 1,71 et 1,62 ppm (à 1,71 et 1,57 ppm pour l’autre isomère) sont caractéristiques de CH3-9 et CH3-19, alors que le doublet à 0,98 ppm l’est pour le méthyle

CH3-14 porté par CH-13. Une analyse plus fine des profils obtenus par RMN 1H et13C pour les deux espèces a permis de révéler une différence significative pour le dérivé palinurine pour les deux espèces. Pour l’une, Ircinia dendroides de Corse, il s’agit de l’isomère E pour la double liaison 17,18 alors que pour l’autre, Ircinia dendroides collectée à Costa Blanca, il s’agit de l’isomère Z. L’ensemble des attributions réalisées est en accord avec les données RMN 1H et 13C obtenues sur la palinurine relativement pure, isolée en tant que composé standard au cours de notre étude de l’espèce Ircinia dendroides collectée en Corse, ainsi que des données de la littérature (Alfano et al., 1979 et Liu et al., 2001).

8. 2. 3. Ircinia variabilis

Les profils RMN 1H réalisés à partir des extraits bruts des espèces identifiées comme étant Ircinia variabilis sont présentés au niveau de la Figure 39.

1 Figure 39 : Profils RMN H (CD3OD+0,1% DSS, 500 MHz) pour les espèces Ircinia variabilis.

Les profils sont principalement caractérisés par la présence de dérivés de la fasciculatine (Figure 40). OH 5 7 10 12 15 17 20 2 3 13 8 18 21 22 25 1 6 16 11 O 23 O 4 19 9 14 24 O Figure 40 : Structure de la fasciculatine.

La différence principale entre la palinurine et la fasciculatine est la présence d’une partie acide tétronique conjuguée (fasciculatine) et non conjuguée (palinurine), ainsi que la présence ou non d’une insaturation en position 17,18. La fasciculatine est constituée :  d’une unité furane substituée en position  (position 3, en bleu) ;  de deux doubles liaisons (8,10 et 11,12), d’un méthyle porté par une double liaison

CH3-9, et deux méthyles CH3-14 (porté par CH-13) et CH3-19 (porté par CH-18) sur la partie centrale (en noir) ; et,  d’une unité acide tétronique conjuguée (une double liaison en 20,21, en rouge).

La présence d’une unité furane substituée en position 3 est confortée par les signaux (singulets larges) à 7,36 (H-1), 7,23 (H-4) et 6,28 (H-2) ppm. La présence d’un fragment acide tétronique conjuguée est déduite de la présence de signaux à 1,72 ppm pour CH3-25 et 5,25 ppm (d, J =10,4) pour CH-20. Le profil de RMN 1H révèle la présence d’un diène 1,1,4-trisubstitué (6,20 (dd, J = 11,10, J = 14,70) pour H-11, 5,76 (d, J = 10,7) pour H-10 et 5,36 (dd, J = 8,17, J = 14,70) pour H-12. La géométrie de la double liaison en position 11 a été déterminée comme étant E à partir de la valeur de la constante de couplage : J = 14,70 Hz. Les deux doublets à 1,04 ppm (J = 6,7) et 0,96 ppm (J = 6,7) sont caractéristiques des méthyles CH3-19 et CH-14, respectivement. L’ensemble des attributions réalisées est en accord avec les données RMN 1H et 13C obtenues sur la fasciculatine relativement pure, isolée en tant que composé standard au cours de notre étude à partir de l’espèce Ircinia variabilis collectée au Liban, ainsi que les données de la littérature (Cafieri et al., 1972 ; Alfano et al., 1979) .

8. 2. 4. Sarcotragus foetidus

Les profils RMN 1H, réalisés sur l’extrait brut des espèces Sarcotragus foetidus, sont présentés dans la Figure 41.

1 Figure 41 : Profils de RMN H (CD3OD+0,1% DSS, 500 MHz) pour les espèces Sarcotragus foetidus.

Les profils sont principalement caractérisés par la présence de deux types de métabolites secondaires : un ou plusieurs dérivés polyprényhydroquinones et un ou plusieurs dérivés de l’acide 4’-hydroxy-3’-polyprénylbenzoïque (Figure 42).

OH OH 4' 1 H 1' H 5' 6' 3' 2 2' n-1 6' 2' 5' 3' n 1' 4' O OH OH

Acide 4'-hydroxy-3'-polyprénylbenzoique Polyprénylhydroquinone

Figure 42 : Structure générale des polyprénylhydroquinones et de l’acide 4’-hydroxy-3’-polyprénylbenzoïque.

Les polyprénylhydroquinones et les dérivés 4’-hydroxy-3’-polyprénylbenzoïque sont constitués (Figure 42) :  d’un noyau aromatique trisubstitué (en rouge ou vert) ;  d’une chaîne latérale constituée de n unités isoprénylées (en noir).

On observe deux systèmes de signaux qui correspondent à ces deux types de métabolites secondaires. Les doublets à 6,56 ppm (J = 8,5 Hz) et 6,52 ppm (J = 3,0 Hz), ainsi que le doublet de doublets à 6,57 ppm (J = 8,5 et 3,0 Hz) sont caractéristiques du noyau aromatique trisubstitué des polyprénylhydroquinones. Les doublets à 7,75 ppm (J = 1,7 Hz) et 7,70 ppm (J = 3,0 Hz), ainsi que le doublet de doublets à 7,70 ppm (J = 8,5 et 1,7 Hz) sont caractéristiques du noyau aromatique trisubstitué des dérivés de l’acide 4’-hydroxy-3’-polyprénylbenzoïque. Par ailleurs, les signaux à 5,30 ppm et 5,10 ppm sont caractéristiques des protons portés par les doubles liaisons de la chaîne prényle. Enfin, on observe la présence de signaux caractéristiques de méthyles vinyliques ( 1,68-1,54 ppm). L’ensemble des attributions réalisées est en accord avec les données RMN 1H et 13C obtenues sur le tétraprénylhydroquinone et l’acide 4’-hydroxy-3’-polyprénylbenzoïque isolés en tant que standards au cours de notre étude à partir de l’espèce Sarcotragus foetidus collectée en Corse, ainsi que les données de la littérature (Baz et al., 1996, Cimino et al., 1972) .

8. 2. 5. Sarcotragus spinosulus

Les profils RMN 1H, réalisés sur l’extrait brut des espèces Sarcotragus spinosulus, sont présentés dans la Figure 43.

1 Figure 43 : Profils de RMN H (CD3OD+0,1% DSS, 500 MHz) pour les espèces Sarcotragus spinosulus.

Les profils sont principalement caractérisés par la présence d’un ou plusieurs polyprényhydroquinones ainsi que les dérivés sulfates (Figure 44).

OSO3Na OH 1' 1 1 H 1' H 6' 6' 2' 2 2' 2 5' 3' n-1 5' 3' n-1 4' 4' OH OH

Polyprénylhydroquinone Polyprénylhydroquinone sulfate

Figure 44 : Structure générale des polyprénylhydroquinones et dérivés sulfates.

On observe deux types de systèmes de signaux qui correspondent à ces différents types de métabolites secondaires. Les doublets à 6,56 ppm (J = 8,5 Hz) et 6,52 ppm (J = 3,0 Hz), ainsi que le doublet de doublets à 6,57 ppm (J = 8,5 et 3,0 Hz), sont caractéristiques du noyau aromatique trisubstitué des polyprénylhydroquinones. Les doublets à 7,18 ppm (J = 8,5 Hz) et 6,60 ppm (J = 3,0 Hz), ainsi que le doublet de doublets à 6,52 ppm (J = 8,5 et 3,0 Hz), sont caractéristiques du noyau aromatique trisubstitué des polyprénylhydroquinones sulfates. Par ailleurs, les signaux à 5,30 ppm et 5,10 ppm sont caractéristiques des protons portés par les doubles liaisons de la chaîne prényle. Enfin, on observe la présence de signaux caractéristiques de méthyles vinyliques ( 1,68-1,54 ppm). L’ensemble des attributions réalisées est en accord avec les données RMN 1H et 13C de la littérature (T Wakimoto et al., 1999 ; Baz et al., 1996).

9. Etude de Sarcotragus spinosulus (090618Ce7-05)

Durant l’été 2009, un spécimen de Sarcotragus spinosulus (090618Ce7-05) a été prélevé dans le cadre d’une mission de récolte d’organismes marins à Ceuta (Callejones). L’éponge lyophilisée (20 g) a été extraite à 4 reprises par 150 mL d’un mélange MeOH/CH2Cl2 (1:1, v/v) pour conduire à 2,2 g d’extrait brut. L’extrait brut obtenu a été ensuite fractionné par chromatographie liquide sur silice C18. L’élution a été réalisée avec des solvants de polarité décroissante H2O, H2O/MeOH (1:1, v/v), MeOH, MeOH/CH2Cl2 (1:1, v/v) et CH2Cl2 (Figure 45).

Figure 45 : Protocole d’extraction et d’isolement des métabolites secondaires de l’éponge S. spinosulus.

La fraction MeOH, la plus riche en composés, a été ensuite soumise à une purification par HPLC semi-préparative (Figure 46).

Figure 46 : Profil HPLC de purification de la fraction MeOH de Sarcotragus spinosulus (090618Ce7-05) Colonne semi-préparative Phenomenex Luna, 250×10 mm id, 5 µm, -1 Gradient: H2O/CH3CN/acide formique 96:04:0,1 à 0:100:0,1 en 30 minutes (débit : 3,0 mL.min ).

Une analyse préliminaire des données spectrales associées aux composés 1, 2 et 3 montre de fortes similitudes qui suggèrent la présence d’un squelette 2-polyprenylhydroquinone. Les trois composés présentent les mêmes caractéristiques en UV (280 nm) et IR (3350, 1500, 1445, 910, 785, 730 cm-1) évoquant une structure de type hydroquinone monosubstitué. Cette hypothèse est confirmée par la présence de trois signaux caractéristiques des aromatiques en RMN 1H : deux doublets à 6,56 (J = 8,5 Hz) et 6,52 (J = 3,0 Hz), et un doublet de doublets à  6,57 (J = 8,5 and 3,0 Hz). Une étude approfondie de l’ensemble des données spectrales de 1 et 2 (IR, UV, RMN 1D et 2D et spectres de masse) a permis de les identifier respectivement à

80 l’hepta- et l’octaprenylhydroquinone, en accord avec les données de la littérature (Pouchus et al., 1988 ; Waetjen et al., 2009 ).

(1)

(2)

OH OH

(3)

OH Figure 47 : Strutures des composés 1, 2 et 3 isolés à partir de Sarcotragus spinosulus (090618Ce7-05).

Les spectres RMN 1H et 13C du composé 3 sont identiques à ceux des composés 1 et 2, exceptée la présence de signaux à H 4,06 (2H) et C 60,0 ppm (Tableau 2) indiquant la présence d’une fonction alcool primaire sur la chaîne latérale, ainsi que des petites différences de déplacement chimiques autour du groupe OH. Une analyse plus précise (Figure 48) a permis d’identifier une polyprénylhydroquinone hydroxylée, un métabolite secondaire analogue de dérivés précédemment isolés de S. spinosulus (Cimino et al., 1972 ; Tziveleka et al., 2005 ; Bifulco et al., 1995 ; Erdogan et al., 1999).

Figure 48 : Spectres RMN 1H et 13C du composé 3.

La formule brute C51H78O3 du composé 3 a été déduite des analyses HR-MALDITOF-MS qui montrent la présence d’un ion pseudomoléculaire à m/z 845,4874 [M+Ag]+ (845,5001 : 107 calculé pour C51H78 AgO3). Ainsi, la combinaison des données RMN et MS a permis de déduire qu’il s’agissait d’une nonaprénylhydroquinone hydroxylée dans laquelle un des méthyles a été oxydé en hydroxyméthylène. La position du groupe OH a été assignée sans ambigüité au niveau de la seconde unité isoprènique, en raison du déplacement chimique en RMN 1H du proton H-6 (5,25 vs 5,10 dans un polyprénylhydroquinone), ainsi que les corrélations clés H-4/H-5/H-6 dans le spectre RMN COSY. Les corrélations H-38/C-6, H- 38/C-7 et H-38/C-8, observées dans le spectre RMN HMBC ont permis de conforter cette attribution (cf. § Matériel et Méthodes). Ainsi, le nouveau composé 3 est la 2’-[38- Hydroxy]nonaprenyl-1’,4’-hydroquinone. Finalement, les déplacements chimiques en RMN 1 13 H et C NMR des méthyles vinyliques (C 1,68-1,54 et H 17,8-16,1), permettent de déduire la configuration E des doubles liaisons.

1 13 Tableau 2 : Données H NMR (500 MHz, CD3OD) et C NMR (125 MHz, CD3OD) du composé 3.

N° δC * mult. δH * J mult. COSY HMBC N° δC * mult. δH * mult. COSY HMBC 1' 148,9 qC 2' 130,2 qC 21 27,7 CH2 2,05 m 3' 117,2 CH 6,52 3.0 d 1 1, 1', 4', 5' 22 125,6 CH 5,1 m 4' 151,1 qC 23 135,8 qC 5' 113,8 CH 6,41 8,5, 3,0 dd 6' 3', 4' 24 40,9 CH2 1,96 m 6' 116,5 CH 6,56 8,5 d 5' 1, 1', 2, 5' 25 27,7 CH2 2,05 m 1 29,1 CH2 3,22 7,3 d 2 1', 2', 3, 3' 26 125,6 CH 5,1 m 2 124.0 CH 5,3 m 1 1, 4 27 135,8 qC 3 136,8 qC 28 40,9 CH2 1,96 m 4 40,9 CH2 1,98 m 5 29 27,7 CH2 2,05 m 5 27,7 CH2 2,16 m 4, 6 3, 4, 6, 7 30 125,6 CH 5,1 m 6 128,8 CH 5,25 m 5 31 135,8 qC 7 139,4 qC 32 40,9 CH2 1,96 m 8 35,9 CH2 2,11 m 9 9, 6, 10, 38 33 27,7 CH2 2,05 m 9 27,7 CH2 2,05 m 8, 10 34 125,6 CH 5,1 m 10 125,6 CH 5,1 m 9 35 135,8 qC 11 135,8 qC 36 25,9 CH3 1,65 s 34, 45 12 40,9 CH2 1,96 m 37 16,2 CH3 1,69 s 1, 2 2, 3, 4 13 27,7 CH2 2,05 m 38 60.0 CH2 4,06 s 6, 7, 8 14 125,6 CH 5,1 m 39 16,2 CH3 1,58 s 15 135,8 qC 40 16,2 CH3 1,58 s 16 40,9 CH2 1,96 m 41 16,2 CH3 1,58 s 17 27,7 CH2 2,05 m 42 16,2 CH3 1,58 s 18 125,6 CH 5,1 m 43 16,2 CH3 1,58 s 19 135,8 qC 44 16,2 CH3 1,58 s 20 40,9 CH2 1,96 m 45 17,8 CH3 1,58 s * δC et δH en ppm, J en Hz. * δC et δH en ppm.

10. Analyses statistiques multivariées

La première analyse est une ACP globale réalisée sur l’ensemble des données acquises par RMN 1H (Figure 49).

Figure 49 : Analyse en composante principale réalisée sur les données de RMN 1H.

Cette première étape a permis de vérifier l’absence de cas non homogènes pour une analyse métabolomique plus fine. Une analyse PLS a été réalisée par la suite qui est présentée dans la Figure 50.

Figure 50 : Analyse en PLS réalisée sur les données de RMN 1H.

Les valeurs Q2 obtenues sont largement en la faveur d’un modèle PLS-DA (0,82 contre 0,48) (Figure 51).

Figure 51 : Comparaison statistique des modèles ACP et PLS-DA.

Nous avons réalisé une analyse par classification hiérarchique ascendante (CHA) afin de tenter de comparer les différentes espèces. Le dendrogramme obtenu est représenté au niveau de la Figure 52.

Figure 52: Analyse par CHA des profils de RMN 1H des différentes Irciniidae étudiées (méthode de Ward, avec une distance Euclidienne).

Nous constatons que deux groupes d’éponges présentent une divergence de 75 % environ, avec des résultats similaires pour l’ensemble des analyses par HCA réalisées avec différentes méthodes. Le premier groupe est uniquement constitué des éponges du genre Sarcotragus. Les espèces Sarcotragus foetidus et Sarcotragus spinosulus collectées en Grèce-Crète présentent des signatures chimiques en RMN 1H relativement proches (moins de 1% de divergence) et différentes de celles des autres espèces Sarcotragus spinosulus (environ 15% de divergence). Le second groupe est constitué des trois espèces : Ircinia dendroides, Ircinia variabilis et Ircinia oros. Les espèces Ircinia dendroides et Ircinia variabilis forment un groupe relativement homogène : moins de 3% de divergence ; et divergent du groupe formé par les espèces Ircinia oros : environ 20 % de divergence.

Il est possible de visualiser la répartition des échantillons (« scores ») ou des variables (« loadings plot ») dans un nouvel espace formé par les composantes principales. L’interprétation simultanée des deux graphiques (« scores plot » et « loadings plot ») permet de mettre en évidence les relations entre les échantillons et les variables, et donc de comprendre l’origine factorielle de l’arrangement relatif des échantillons. Autrement dit, ces

86 deux graphiques facilitent l’interprétation en indiquant visuellement les variables (déplacements chimiques en RMN 1H) caractéristiques de tels ou tels échantillons. La Figure 53 présente les « loadings plot » associés aux I. oros. Ces espèces se distinguent des autres principalement pour les signaux associés aux protons H-1, H-4, H-9, H-2, H-7, H-5 et H-18 des ircinines : ircinine-1 et ircinine-2.

Figure 53 : « Loadings plot » selon la composante 1 associés aux espèces I. oros.

La Figure 54 présente les « loadings plot » associés aux I. dendroides. Ces espèces se distinguent des autres principalement par les signaux associés aux protons H-4, H-11 et H-10 de la palinurine.

Figure 54 : « Loadings plot » selon la composante 1 associés aux espèces I. dendroides.

La Figure 55 présente les « loadings plot » associés aux I. variabilis. Ces espèces se distinguent des autres principalement par les signaux associés aux protons H-1, H-4, H-11, H- 10, H-5, H-9, H-14 et H-19 de la fasciculatine.

Figure 55 : « Loadings plot » selon la composante 1 associés aux espèces I. variabilis.

La Figure 56 présente les « loadings plot » associés aux S. foetidus. Ces espèces se distinguent des autres principalement par les signaux associés aux protons H-2’ et H-6’ de l’acide 4’- hydroxy-3’-polyprénylbenzoïque.

Figure 56 : « Loadings plot » selon la composante 1 associés aux espèces S. foetidus.

La Figure 57 présente les « loadings plot » associés aux S. spinosulus. Ces espèces se distinguent des autres principalement par les signaux associés aux protons H-2’ et H-6’ des polyprénylhydroquinones sulfates.

Figure 57 : « Loadings plot » selon la composante 1 associés aux espèces S. spinosulus.

11. Discussion

Ircinia variabilis. Il n’existe pas de description complète de cette espèce en raison de la difficulté de la caractériser par rapport aux espèces similaires et l’absence d’une description précise dans les travaux anciens (Cook et Berquist, 2002). Cette espèce présente une grande variabilité écomorphique puisqu’elle change de forme et de couleur en fonction des conditions écologiques. Nous avons rencontré ces difficultés pour les espèces I. variabilis du Liban qui sont différentes du point de vue macroscopique des autres échantillons de la même espèce. Seul un examen précis des caractères microscopiques nous a permis de les identifier comme étant des I. variabilis. Les travaux antérieurs menées sur I. variabilis ont conduit à l’isolement de dérivés de la variabiline (Faulkner et al., 1973), de la palinurine et de la fasciculatine (Alfano et al., 1979). Tous les échantillons appartenant à I. variabilis que nous avons étudiés sont caractérisés par la présence de fasciculatine. Cependant, le faible nombre d’échantillons exploitables ne nous permet pas de conclure clairement.

Ircinia dendroides. D’abord considérée comme une variété d’I. variabilis par Schulze (1880), l’espèce I. dendroides a été admise en tant que nouvelle espèce par Lendenfeld (1889a). Les études antérieurs menées sur les espèces I. dendroides ont conduit à l’isolement de dérivés de la variabiline (Gonzalès et al., 1983) et du waiakeamide (Mau et al., 1996). Les espèces I. dendroides que nous avons étudiées semblent être caractérisées par la présence de palinurine, isolée pour la première fois de cette espèce d'Ircinia. Cependant, le faible nombre d’échantillons collectés ne nous permet pas de conclure clairement, d’autant que la palinurine et ses dérivés ont été isolés lors de travaux antérieurs d'I. variabilis (Alfano et al., 1979).

Ircinia oros. Le squelette n’est pas différent de celui d'I. fasciculata : seuls les filaments sont plus épais. Les espèces I. oros semblent être caractérisées par le mélange des ircinines -1et-2. Les études antérieurs menées sur les espèces I. oros ont conduit à l’isolement des ircinines -1 et -2 (Cimino et al., 1972), des ircinines -3 et -4 (Cimino et al., 1972), de norsesterterpènes chlorés (Di Giulio et al., 1990), de la strobiline et de la variabiline (Hoeller et al., 1997). Par ailleurs, le mélange ircinine -1 et -2 a été isolé d’une Sarcotragus sp. (Liu et al., 1972). Du point de vue chimiotaxonomique, le mélange des ircinines -1 et -2 pourrait-il être considéré comme un marqueurde l’espèce I. oros ?

L’approche métabolomique par RMN 1H semble efficace pour différencier les Ircinia. Les I. oros forment un groupe bien distinct des autres espèces, tant pour la taxonomie (dimensions des fibres entre 9 et 13 μm) que pour la composition en métabolites secondaires (ircinines -1 et -2). Cependant, plusieurs limitations, principalement liées à la nature même des espèces, sont observées. Bien que les espèces Ircinia dendroides et Ircinia variabilis soient relativement bien séparées du point de vue chimique la situation reste relativement confuse. Il s’agit de la conséquence d’une part, du faible nombre d’échantillons exploitables et, d’autre part, de la complexité de l’étude de ces espèces. Du point de vue taxonomique, la distinction entre I. dendroides et I. variabilis reste difficile puisqu’elle est basée principalement sur les caractères morphologiques externes en raison de l’absence d’une différenciation histologique. Les dérivés de la variabiline isolés de ces espèces, sont en général relativement instables, ce qui est un obstacle majeur pour les études métabolomiques. Dans notre étude, les profils obtenus restent simples et, finalement, seuls les échantillons qui renferment des dérivés à priori stables, la fasciculatine et la palinurine, ont pu être caractérisés. De nombreux échantillons n’ont pu être exploités, fort probablement du fait d’une dégradation de façon

91 précoce des métabolites secondaires présents dans leurs extraits, malgré les nombreuses précautions d’usage.

Sarcotragus foetidus. Cette espèce semble être caractérisée par des métabolites secondaires de la famille des polyprénylhydroquinones. La présence de dérivés de l’acide 4’-hydroxy-3’- polyprénylbenzoïque identifiés dans les deux échantillons que nous avons étudiés, semble la différencier des autres espèces Sarcotragus. Les travaux antérieurs d’isolement et d’élucidation structurale menés sur S. foetidus (anciennement Ircinia muscarum) ont également conduit aux dérivés de l’acide 4’-hydroxy-3’-polyprénylbenzoïque et à des polyprénylhydroquinones (Baz et al., 1996, Cimino et al., 1972). Ainsi, les dérivés acide 4’-hydroxy-3’-polyprénylbenzoïque peuvent-ils être considérés comme des marqueurs chimiotaxonomiques de Sarcotragus foetidus ?

Sarcotragus spinosulus. Ces espèces semblent être caractérisées par des métabolites secondaires de type polyprénylhydroquinones ainsi que par les dérivés sulfates. Ces derniers semblent être totalement absents des S. foetidus que nous avons étudiées. Par ailleurs, la présence de polyprénylhydroquinones hydroxylées permettrait, dans certains cas, de les différencier des autres espèces Sarcotragus. En effet, à partir de l’espèce S. spinosulus collectée à Ceuta, nous avons pu isoler et caractériser un nouveau dérivé, une nonaprénylhydroquinone hydroxylée sur la seconde position terpénique. Il s’agit de la première nonaprénylhydroquinone hydroxylée isolée. A ce jour, quatre polyprénylhydroquinoneshydroxylées ont été isolées (Cimino et al., 1972 ; Tziveleka et al., 2005 ; Bifulcoet al., 1995 ; Erdoganet al., 1999) : deux heptaprénylhydroquinones portant un OH en première et cinquième position de la partie prényle ; et, deux dérivés octaprényles portant le groupe OH en 4ème et 5ème position de l’unité isoprénique. Du point de vue chimiotaxonomique, les polyprénylhydroquinones hydroxylées peuvent-elle être considérées comme des marqueurs chimiotaxonomiques des espèces de type S. spinosulus ?

L’approche métabolomique par RMN 1H semble efficace pour différencier les Sarcotragus, mais avec deux limitations principales. D’une part, les espèces qui présentent uniquement de simples polyprénylhydroquinones avec différentes unités prényles, ne pourront être différenciées finement entre-elles. Le nombre d’unités prényles n’est pas un critère robuste de différenciation des espèces. En outre, les données de la littérature ne semblent pas non plus

92 indiquer une relation entre l’identité des espèces et le nombre d’unités prényles dans les métabolites secondaires isolés. D’autre part, les polyprénylhydroquinones sont souvent présentent sous différentes formes : quinone, quinol, chroménol et chromène, ainsi que les équivalents sulfates. Ces différentes formes, aux fonctions sans doute très diverses au sein de ces espèces, peuvent conduire à des erreurs de classification pour le taxonomiste avec l’utilisation de la RMN 1H. En revanche, si les espèces sont au préalable identifiées de façon certaine, l’influence de facteurs biotiques et abiotiques pourrait être rapidement mise en évidence à partir de l’évolution des profils métabolomiques obtenus par RMN 1H. Il s’agit d’un outil qui peut se révéler très utile dans le cas des Sarcotragus pour réaliser des études de métabolomiques environnementales.

En 1983, Bergquist et Wells ont montré que les terpènes de la classe F (polyprénylhydroquinones et dérivés) sont spécifiques de la famille Irciniidae. La révision proposée en 2002 (Cook et Berquist, 2002) a remis sérieusement en question la position d’un sous-genre Sarcotragus dans le genre Ircinia. Les travaux d’isolement et d’élucidation structurale réalisés avant 2002, tendaient à montrer que les terpènes de la classe F étaient principalement isolés d’éponges Ircinia, avec une forte incertitude sur la taxonomie : Ircinia ou Sarcotragus ? Seules les éponges Sarcotragus spinosulus (anciennement Ircinia spinosula) ont pu être déterminées. Il semble donc que les terpènes de la classe F soient principalement produits par des espèces du genre Sarcotragus. Par ailleurs, la présence de furanoterpènes (ou dérivés) au sein des Sarcotragus n’est pas très claire. En effet, un nombre relativement faible d’éponges identifiées en tant que Sarcotragus contiennent des dérivés de la variabiline (Perry et al., 1987). Bien que les travaux de Liu (Liu et al., 2001, 2002, 2003) décrivent l’isolement de plus de 35 dérivés furanoterpéniques (sarcotines et sarcotragines) à partir d’une espèce du genre Sarcotragus, il est légitime de s’interroger sur l’identification des espèces étudiées. En effet, les mêmes dérivés sont décrits quelques années plus tard par le même groupe à partir d’une espèce Psammocinia (Liu et al., 2008). D’autre part, la première étude basée sur une approche chimiotaxonomique, réalisé par le groupe de Liu, met en avant les difficultés liées à l’identification des espèces collectées (Liu et al., 2007). La portée de ce type d’étude reste limitée parce qu’elle est uniquement basée sur l’isolement du métabolite secondaire majoritaire. Enfin, il est également important de souligner que les dérivés furanoterpéniques et les terpènes de la classe F ne sont jamais présents de façon simultanée dans une même espèce.

12. Conclusion

Dans la première partie du projet de recherche qui m’a été confié, nous avons mené une étude comparative des profils métabolomiques par RMN 1H associés aux analyses multivariées d’espèces Irciniidae de Méditerranée. Les résultats obtenus ont permis de montrer que les genres Ircinia et Sarcotragus forment deux groupes bien distincts avec, en particulier, des profils chimiques obtenus par RMN qui montrent une nette différence entre les différentes espèces. Les Ircinia sont caractérisées par des métabolites secondaires furanoterpéniques (fasciculatine, palinurine, ircinine -1 et ircinine -2), alors que les Sarcotragus sont caractérisées par des dérivés de type polyprénylhydroquinone (acide 4’-hydroxy-3’- polyprénylbenzoïque, polyprénylhydroquinones, polyprénylquinones, polyprénylchromenol, polyprénylchromène et dérivés sulfates). Il s’agit de la première approche métabolomique globale réalisée sur les éponges Irciniidae de Méditerranée, dont la convergence des résultats avec les critères morphologiques met en évidence l’intérêt d’utiliser conjointement la taxonomie classique et l’étude métabolomique.

Une étude de systématique basée à la fois sur des caractères morphologiques et de métabolomique permettraient sans doute de mieux appréhender les fines différences qui existent entre les différentes espèces, notamment pour les Ircinia, afin de mieux les identifier, les caractériser et les classer. Si les espèces du genre Psammocinia nécessitent des études plus approfondies, l’ensemble des données convergent en faveur des deux genres bien distincts : Ircinia et Sarcotragus. Enfin, la meilleure caractérisation des différentes espèces nous a permis de mieux appréhender les objectifs des deux parties suivantes de ce rapport :  l’étude comparative des composés volatils au sein de cette famille et notamment Sarcotragus ; puis ;  la bioaccumulation des éléments traces métalliques par les Irciniidaede Méditerranée.

13. Matériels et Méthodes

13. 1. Généralités

CCM : Les chromatographies sur couche mince (CCM) sont réalisées sur des plaques de verres recouvertes de gel de silice normal ou greffée (0,2 mm d’épaisseur) : Si60 F254, Diol F254 et

C18 F254 disponibles chez Merck. Divers révélateurs sont utilisés suivant les échantillons étudiés : L’acide sulfurique seul à 5% dans l’éthanol ou en présence d’anisaldéhyde utilisé comme révélateur universel.

Colonnes ouvertes : Les colonnes ouvertes sont réalisées sur gel de silice Si60 (70-200 µm, SDS), gel de silice greffée Diol (40-63 µm LiChroprep, Merck) et gel de silice greffée C18 (40-63 µm, SDS). Les solvants d’élution proviennent tous de chez SDS.

Chromatographie Liquide Haute Pression : Les études CLHP analytiques et semi-préparatives sont réalisées sur deux chaînes CLHP Waters pilotées par le logiciel Millenium. Elles sont composées des éléments suivants :  une pompe 600 ;  un injecteur automatique 717 plus ;  un détecteur à barrettes de diodes 996 ;  un détecteur évaporatif à diffusion de lumière Sedex 55.

Les colonnes analytiques et semi-préparatives utilisées sont les suivantes :

 Symmetry C18 (4,6 × 150 mm ; 3,5 µm), Waters ;

 SymmetryPrep C18 (7,8 × 300 mm ; 3,5 µm), Waters ;

 Luna C18 (4,6 × 150 mm ; 5 µm), Phenomenex ;

 Luna C18 (10 × 250 mm ; 5 µm), Phenomenex ;  Luna Phenylhexyl (4,6 × 150 mm ; 5 µm), Phenomenex ;  Luna Phenylhexyl (10 × 250 mm ; 5 µm), Phenomenex.

L’eau utilisée pour les systèmes d’éluants CLHP est de l’eau MilliQ. Les autres solvants d’élution sont tous des solvants CLHP grade de chez Sigma-Aldrich.

Résonnance Magnétique Nucléaire : Les spectres RMN sont obtenus sur un appareil Bruker Avance 500 pour tous composés dont la quantité est inférieure à 10 mg et sur un appareil Bruker Avance 200 dans le cas contraire.

Les solvants deutérés (CD3OD δH = 3,31 ppm δC = 49,0 ppm ; CDCl3 δH = 7,26 ppm δC =

77,16 ppm ; [D6]-DMSO δH =2,50 ppm δC = 39,5 ppm) sont fournis par Sigma-aldrich. Les déplacements chimiques (δ) sont exprimés en ppm par rapport au solvant deutérés utilisés comme étalon interne. Les constantes de couplage (J) sont exprimées en Hertz (Hz) et leur multiplicités sont indiquées par les abréviations suivantes : s = singulet, d = doublet, t = triplet, q = quadruplet, quint. = quintuplet et m = multiplé.

Spectrométrie de Masse : Les analyses de masse sont réalisées sur un appareil Bruker Esquire 3000 plus équipé de systèmes d’Ionisation Electrospray (IES) et Ionisation Chimique à Pression Atmosphérique (ICPA). Cet appareil est couplé à une chaîne CLHP Alliance (Waters 2695) équipé d’un détecteur UV à deux longueurs d’onde (Waters 2487) et permet donc les études en CLHP-SM.

Spectrométrie de Masse Haute Résolution : Les analyses SMHR ont été réalisées à l’ICSN sur un appareil Perseptive Voyager MALDI- TOF (Perseptive Biosystems, Framingham, MA, USA).

UV : Les analyses UV sont réalisées au laboratoire sur un spectrophotomètre UV-Visible Cary 300 (Varian).

IR : Les IR sont enregistrés sur un appareil Perkis-Elmer Paragon 1000 FT. Les échantillons en solution dans du CH2Cl2 sont déposés sur une pastille de bromure de potassium.

Traitement statistique : Les analyses statistiques (ACP, PLS) ont été réalisées en utilisant les programmes SIMCA-P+ et R.

13. 2. Sites et protocole d’échantillonnage

Dix sept sites appartenant à huit régions tout au long de la Méditerranée (Ceuta, Costa Blanca et Blanes en Espagne, Banyuls, Marseille et Corse en France, Grèce et Liban) ont été sélectionnés (Figure 58). Vingt cinq échantillons appartenant aux deux genres Ircinia et Sarcotragus de la famille des Irciniidae, ont été récoltés par plongée sous-marine à des profondeurs variant entre 10 et 25 mètres. Pour la détermination taxonomique, des morceaux d’environ 1 cm3, ont été conservés après leur échantillonnage dans de l’éthanol à 95 %, jusqu’à leur analyse taxonomique. Pour le reste des analyses chimiques, des quantités plus importantes (de 5 cm3 minimum) appartenant à ces mêmes échantillons, ont été congelés à -20 ºC immédiatement après leur récolte.

Figure 58 : Localisation des huit sites d’échantillonnage des Irciniidae en Méditerranée.

13. 3. Détermination taxonomique

Pour cette détermination, nous nous sommes basés sur le manuscrit « Répartition générale des éponges et systématique des éponges cornées de la région de Marseille et de quelques stations Méditerranéennes » par Vacelet (1959) et « Systema Porifera : A Guide to the Classification of Sponges (2002) ». Les critères morphologiques de classification reposent sur

97 des caractères macroscopiques (Figure 59. A) et microscopiques (Figure 59. B), et sont rassemblés de façon synthétique pour les espèces récoltés dans le tableau 3.

A B réticulations fibre I corps étrangers conule fibre II oscule filaments

Figure 59 : Représentation de quelques éléments macroscopiques (2. A) et microscopiques (2. B) utiles pour la classification taxonomique des Irciniidae.

Tableau 3 : Caractères de classification taxonomique des cinq espèces étudiées.

De très fins morceaux de l’ectoderme ainsi que de l’endoderme ont été coupés, sous un stéréoscope (WILD – Heerbrugg Switzerland – M5-52693), par des lames de rasoirs. De façon identique des fibres appartenant à différentes couches de l’éponge ont été retirées par des pinces. Le tout a été déposé dans une goutte d’eau sur une lame et couvert par une lamelle pour une observation sous un microscope (WILD – Heerbrugg Switzerland – M20-25006) aux grossissements de (x 4), (x 10), (x 20) et (x 40). Pour chaque échantillon, l’arrangement, la forme et les dimensions des différents éléments cités dans le Tableau 3 ont été observés et mesurés, puis selon les différents critères morphologiques macroscopiques et microscopiques, l’espèce a été déterminée. Pour la conservation des préparations, les différents éléments de l’éponge ont été colorés par de la fuchsine acide, déshydratés par de l’alcool absolu, puis placé dans de l’acétone permettant une meilleur pénétration de l’araldite, avant d’être fixés dans cette résine sur une lame et couverts par une lamelle. Les préparations sont ensuite placées à l’étuve pendant huit heures minimum pour une polymérisation de l’araldite. Pour une meilleure illustration histologique, des lames semi-fines appartenant aux différentes espèces, ont été préparés. Pour ceci, des morceaux coupés avec une lame ont été trempés successivement dans des bains de fuchsine acide saturée à l’éthanol à 100 % pendant une heure, deux bains successifs d’éthanol à 100 % d’une heure chacun, puis deux heures pour chacun des bains d’acétone, acétone/araldite et araldite, pour être finalement inclus dans des moules d’araldite et laissés se polymériser pendant 24 heures dans une étuve à 60 ºC. Après la polymérisation, des coupes de 80 µm ont été effectués sur un microtome, puis polis des deux cotés sur un disque tournant polissant, pour être ensuite collées sur des lames par de l’araldite et laisser polymériser pendant 8 heures minimum à 60 ºC. Les mesures des filaments et fibres primaires et secondaires ont été faites à l’aide du programme Visilog 7.

13. 4. Protocole d’extraction des éponges

Après avoir lyophilisé et broyé le matériel biologique, il est pesé et conservé au congélateur à - 20°C.

100

Extraction :

2 g (pesés précisément) de matériel biologique sont extraits avec le mélange de solvant

MeOH/CH2Cl2 1:1 (3 x 20 mL, ultrasons 3 x 10 min). Après filtration sur coton, l’extrait est ensuite évaporé en présence de silice greffée C18 (environ 1 g) pour obtenir un dépôt solide. Le volume de solvant d’extraction est calculé proportionnellement à la masse exacte d’échantillon.

Dessalage de l’extrait brut :

Le dessalage sur phase solide (Cartouche SPE Phenomenex Strata C18-E, V = 12 mL, 2 g de silice) est réalisé en chambre à vide. La cartouche SPE est conditionnée par 10 mL d’un mélange de solvant organique MeOH/CH2Cl2 2:1 (lavage/activation) puis rincée avec 10 mL d’eau Milli-Q. Le dépôt solide de l’extrait est placé sur la cartouche SPE puis lavé par 10 mL d’eau Milli-Q pour éliminer les sels de d’extrait. La cartouche est laissée environ 15 min sous vide pour éliminer l’eau résiduelle. Les molécules organiques sont éluées par 9 mL de mélange MeOH/CH2Cl2 1:1 dans une fiole jaugée qui est ensuite complétée à 10 mL. L’extrait organique A est ainsi obtenu. Les 10 mL d’extrait A obtenu sont séparés en 3 :  1 mL est prélevé pour être transvasé dans un vial pour passeur d’échantillon afin de réaliser une analyse par HPLC (filtration sur filtre seringue 0,2 µm). Cette fraction est nommée A1 ;  1 mL est prélevé pour être transvasé dans un vial pour passeur d’échantillon afin d’effectuer une analyse LC/MS. Cette fraction est identifiée A2 ;  Les 8 mL restant sont évaporés et lyophilisés avant d’être pesés. Cette fraction est nommée A3. 20 mg de cet extrait sont envoyés à l’ICSN afin effectuer différents tests d’activité biologiques (Stockage des extraits obtenus à – 20 °C).

13. 5. Signatures chimiques des espèces par HPLC, HPLC/MS et RMN 1H

L’empreinte chimique de chaque échantillon est obtenue par HPLC, LC/MS (Ircinia) et RMN 1H.

101

Signatures chimiques par HPLC : Les analyses HPLC (DAD/DEDL) (extraits A1) sont réalisées sur une colonne Luna Phenylhexyl (4,6 × 150 mm ; 5 µm ; d = 0,5 mL.min-1). Deux systèmes de solvant sont testés :

H2O/CH3CN (Système d’élution 1) et H2O/CH3CN + 1‰ Ac. Formique (Système d’élution 2) ; Remarque : Ce protocole standardisé a été établi avant le ralentissement de la production d’acétonitrile. Actuellement, lorsque cela est possible, l’acétonitrile est remplacée par du méthanol lors des analyses HPLC pour l’établissement des différentes empreintes chimiques.

 20 µL des extraits A1 sont injectés. Si l’HPLC est équipée d’un four, la température de la colonne est fixée à 30° C. Si le profil HPLC ainsi obtenu montre une saturation de la détection UV, l’analyse est refaite en injectant 10 ou 5 µL des extraits A1.  Le gradient d’élution utilisé est représenté sur la Figure 60 :

% de solvant organique

Minutes

Figure 60 : Gradient d’élution des analyses HPLC pour l’établissement des empreintes chimiques.

Les profils DEDL et UV à 210, 254 et 280 nm sont enregistrés pour l’établissement des empreintes chimiques. Les analyses LC/MS (extraits A2) sont réalisées dans les mêmes conditions que précédemment en utilisant le système d’élution 2.

Signatures chimiques par RMN 1H :

20 mg de la fraction A3 sont solubilisés dans 0,75 ml d’un mélange CD3OD + 0,1% de DSS acide (4,4-diméthyl-4-silapentane-1-sulfonique) utilisé en tant qu’étalon interne.

Lorsque les empreintes chimiques d’une espèce sont intéressantes d’un point de vue chimique (espèce peu étudiée, présence de métabolites dont la masse molaire est inconnue dans l’espèce

102 ou même dans les produits naturels, etc.), l’isolement et la caractérisation des différents métabolites secondaires sont envisagés. Dans ce cas, l’extrait brut est préparé en suivant le protocole défini pour l’acquisition de l’empreinte chimique. En revanche, le dessalage est remplacé par un fractionnement par chromatographie Flash sur une cartouche de silice greffée

C18. Après un lavage à l’eau Milli-Q, pour éliminer les sels, cinq fractions sont récupérées :

H2O/MeOH 1:1, H2O/MeOH 1: 3 ou 1 : 1, MeOH 100%, MeOH/CH2Cl2 1:1 et CH2Cl2 100%. La suite du fractionnement et de la purification est à adapter par chaque partenaire en fonction des espèces étudiées et/ou de la famille chimique.

13. 5. 1. Ircinia oros (080728Ba1-18)

Protocole d’extraction, de fraction et d’isolement :

Figure 61 : Protocole d’extraction, de fractionnement et d’isolement des métabolites secondaires d’Ircinia oros (080728Ba1-18).

Profil HPLC semi-préparatif :

Figure 62 : Profil HPLC de purification de la fraction MeOH d’Ircinia oros (080728Ba1-18). Colonne semi- préparative Phenomenex Luna, 250×10 mm id, 5 µm, -1 Gradient : H2O/CH3CN/acide formique 04:96:0,1 à 0:100:0,1 en 30 minutes (débit : 3,0 mL.min ).

103

Structure :

14 12 14 H 12 19 19 10 13 16 10 13 16 HO HO 7 8 22 25 7 8 15 22 25 11 11 H 17 21 21 6 18 23 6 17 18 23 5 9 15 5 9 O H O O H O 3 24 O 3 24 O 20 20 2 4 2 4 1 O 1 O Ircinine-1 Ircinine-2

Figure 63 : Structures de l’ircinine-1 et de l’ircinine-2 isolés d’Ircinia oros (080728Ba1-18).

Spectres RMN du mélange ircinine-1 et -2 :

1 Figure 64 : Spectre RMN H (CD3OD, 500 MHz) du mélange ircinine-1 et -2 isolé de Ircinia oros (080728Ba1- 18).

104

13 Figure 65 : Spectre RMN C (CD3OD, 125 MHz) du mélange ircinine-1 et -2 isolé de Ircinia oros (080728Ba1-18).

1 1 Figure 66 : Spectre RMN COSY H- H (CD3OD, 500 MHz) du mélange ircinine-1 et -2 isolé de Ircinia oros (080728Ba1-18). 105

Figure 67: Spectre RMN HSQC (CD3OD) du mélange ircinine-1 et -2 isolé de Ircinia oros (080728Ba1-18).

13. 5. 2. Ircinia dendroides (090614Cb3-05)

Protocole d’extraction, de fractionnement et d’isolement :

Figure 68 : Protocole d’extraction et de fractionnement d’Ircinia dendroides (090614Cb3-05).

106

Profil CCM :

Figure 69 : Profil CCM réalisé sur les extraits d’Ircinia dendroides (090614Cb3-05).

Les chromatogrammes HPLC des différentes fractions sont représentés dans l’annexe 3.

Profil HPLC semi-préparatif :

Figure 70 : Profil HPLC réalisé sur l’extrait MeOH d’Ircinia dendroides (090614Cb3-05). Colonne semi-préparative Phenomenex Luna, 250×10 mm id, 5 µm, -1 Gradient : H2O/CH3CN/acide formique 13:87:0,1 à 0:100:0,1 en 30 minutes (débit : 3,0 mL.min ).

Structure : OH 5 7 10 12 15 17 20 2 3 13 8 18 21 22 25 1 6 16 11 O 23 O 4 19 9 14 24 O

Figure 71 : Structure de la palinurine isolée d’Ircinia dendroides (090614Cb3-05).

107

Spectres RMN de la palinurine :

1 Figure 72 : Spectre RMN H (CD3OD, 500 MHz) de la palinurine isolée d’Ircinia dendroides (090614Cb3-05).

13 Figure 73 : Spectre RMN C (CD3OD, 125 MHz) de la palinurine isolée d’Ircinia dendroides (090614Cb3- 05).

108

13. 5. 3. Ircinia variabilis (090702Ma5-06)

Protocole d’extraction, de fractionnement et d’isolement :

Figure 74 : Protocole d’extraction et de fractionnement d’Ircinia variabilis (090702Ma5-06).

Profil CCM :

Figure 75 : Profil CCM réalisé sur les extraits d’Ircinia variabilis (090702Ma5-06).

Les chromatogrammes HPLC des différentes fractions sont représentés dans l’annexe 4.

Profil HPLC :

Figure 76 : Profil HPLC réalisé sur l’extrait MeOH d’Ircinia variabilis (090702Ma5-06). Colonne semi- préparative Phenomenex Luna, 250×10 mm id, 5 µm, -1 Gradient : H2O/CH3CN/acide formique 15:85:0,1 à 0:100:0,1 en 30 minutes (débit : 3,0 mL.min ).

109

Structure de la fasciculatine :

OH 2 5 7 10 12 15 17 20 3 8 13 18 21 22 25 1 6 16 11 O 23 O 4 19 9 14 24 O Figure 77 : Structure de la fasciculatine isolée d’Ircinia variabilis (090702Ma5-06).

1 Figure 78 : Spectre RMN H (CD3OD, 500 MHz) de la fasciculatine isolée d’Ircinia variabilis (090702Ma5- 06).

110

13 Figure 79 : Spectre RMN C (CD3OD, 125 MHz) de la fasciculatine isolée d’Ircinia variabilis (090702Ma5- 06).

1 1 Figure 80 : Spectre RMN COSY H- H (CD3OD, 500 MHz) de la fasciculatine isolée d’Ircinia variabilis (090702Ma5-06).

111

Figure 81 : Spectre RMN HSQC (CD3OD, 500 MHz) de la fasciculatine isolée d’Ircinia variabilis (090702Ma5-06).

Figure 82 : Spectre RMN HMBC (CD3OD, 500 MHz) de la fasciculatine isolée d’Ircinia variabilis (090702Ma5-06).

112

13. 5. 4. Sarcotragus foetidus (080612Co1-05)

Protocole d’extraction, de fractionnement et d’isolement :

Figure 83 : Protocole d’extraction et de fractionnement Sarcotragus foetidus (080612Co1-05).

Profils CCM :

Figure 84 : Profils CCM réalisés sur les 1ers et 2èmes fractionnements des extraits de Sarcotragus foetidus (080612Co1-05).

Les chromatogrammes HPLC des différentes fractions sont représentés dans l’annexe 5.

113

Structure du composé 1 :

17 18 19 20 OH 1' 1 5 9 13 6' 3 7 11 15 2' 2 4 6 8 10 12 14 16 5' 3' 4' OH Figure 85 : Structure de la tétraprénylhydroquinone isolée de Sarcotragus foetidus (080612Co1-05).

Spectres RMN du composé 1 :

1 Figure 86 : Spectre RMN H (CD3OD, 500 MHz) de la tétraprénylhydroquinone isolée de Sarcotragus foetidus (080612Co1-05).

114

13 Figure 87 : Spectre RMN C (CD3OD, 125 MHz) de la tétraprénylhydroquinone isolée de Sarcotragus foetidus (080612Co1-05).

1 1 Figure 88 : Spectre RMN COSY H- H (CD3OD, 500 MHz) de la tétraprénylhydroquinone isolée de Sarcotragus foetidus (080612Co1-05).

115

Figure 89 : Spectre RMN HSQC (CD3OD) de la tétraprénylhydroquinone isolée de Sarcotragus foetidus (080612Co1-05).

Figure 90 : Spectre RMN HMBC (CD3OD) de la tétraprénylhydroquinone isolée de Sarcotragus foetidus (080612Co1-05).

116

Structure du composé 2 :

17 18 19 20 OH 4' 1 5 9 13 5' 3 11 15 3' 2 4 6 7 8 10 12 14 16 6' 2' 1' O OH Figure 91 : Structure de l’acide 4’-hydroxy-3’-tétraprénylbenzoïque isolé de Sarcotragus foetidus (080612Co1- 05).

Spectres RMN de l’acide 4’-hydroxy-3’-tétraprénylbenzoïque :

1 Figure 92 : Spectre RMN H (CD3OD, 500 MHz) l’acide 4’-hydroxy-3’-tétraprénylbenzoïque isolé de Sarcotragus foetidus (080612Co1-05).

117

13 Figure 93 : Spectre RMN C (CD3OD, 125 MHz) l’acide 4’-hydroxy-3’-tétraprénylbenzoïque isolé de Sarcotragus foetidus (080612Co1-05).

1 1 Figure 94 : Spectre RMN COSY H- H (CD3OD, 500 MHz) de l’acide 4’-hydroxy-3’-tétraprénylbenzoïque isolé de Sarcotragus foetidus (080612Co1-05).

118

Figure 95 : Spectre RMN HSQC (CD3OD) de l’acide 4’-hydroxy-3’-tétraprénylbenzoïque isolé de Sarcotragus foetidus (080612Co1-05).

Figure 96 : Spectre RMN HMBC (CD3OD) de l’acide 4’-hydroxy-3’-tétraprénylbenzoïque isolé de Sarcotragus foetidus (080612Co1-05).

119

13. 5. 5. Sarcotragus spinosulus (090618Ce7-05)

Protocole d’extraction, de fractionnement et d’isolement :

Figure 97 : Protocole d’extraction, de fractionnement et d’isolement des métabolites secondaires de Sarcotragus spinosulus (090618Ce7-05).

Profil CCM :

Figure 98 : Profil CCM réalisé sur les extraits de Sarcotragus spinosulus (090618Ce7-05).

Les chromatogrammes HPLC des différentes fractions sont représentés dans l’annexe 6.

Profil HPLC semi-préparatif :

120

Figure 99 : Profil HPLC de purification de la fraction MeOH de Sarcotragus spinosulus (090618Ce7-05) Colonne semi-préparative Phenomenex Luna, 250×10 mm id, 5 µm, -1 Gradient: H2O/CH3CN/acide formique 04:96:0,1 à 0:100:0,1 en 30 minutes (débit : 3,0 mL.min ).

Structure composé 1 :

29 30 31 32 33 34 35 OH 1' 1 5 9 13 17 21 23 25 6' 3 7 11 15 19 27 2' 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 5' 3' 4' OH Figure 100 : Structure du composé 1 isolé de Sarcotragus spinosulus (090618Ce7-05).

+ 107 HR-MALDITOF-MS : m/z 693,3808 [M+Ag] (Calculé pour C41H62 AgO2 693,3795)

Spectres RMN du composé 1 :

121

1 Figure 101 : Spectre RMN H (CD3OD, 500 MHz) du composé 1 isolé de Sarcotragus spinosulus (090618Ce7- 05).

13 Figure 102 : Spectre RMN C (CD3OD, 125 MHz) du composé 1 isolé de Sarcotragus spinosulus (090618Ce7-05).

122

1 1 Figure 103: Spectre RMN COSY H- H (CD3OD, 500 MHz) du composé 1 isolé de Sarcotragus spinosulus (090618Ce7-05).

Figure 104 : Spectre RMN HSQC (CD3OD) du composé 1 isolé de Sarcotragus spinosulus (090618Ce7-05).

123

Figure 105 : Spectre RMN HMBC (CD3OD) du composé 1 isolé de Sarcotragus spinosulus (090618Ce7-05).

Structure composé 2 :

33 34 35 36 37 38 39 40 OH 1' 1 5 9 13 17 21 25 29 6' 3 7 11 15 19 23 27 31 2' 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 5' 3' 4' OH Figure 106 : Structure du composé 2 isolé de Sarcotragus spinosulus (090618Ce7-05).

+ 107 HR-MALDITOF-MS : m/z 761,4389 [M+Ag] (Calculé pour C46H70 AgO2 761,4421). . Spectres RMN du composé 2 :

124

1 Figure 107 : Spectre RMN H (CD3OD, 500 MHz) du composé 2 isolé de Sarcotragus spinosulus (090618Ce7- 05).

13 Figure 108 : Spectre RMN C (CD3OD, 125 MHz) du composé 2 isolé de Sarcotragus spinosulus (090618Ce7-05).

125

1 1 Figure 109 : Spectre RMN COSY H- H (CD3OD, 500 MHz) du composé 2 isolé de Sarcotragus spinosulus (090618Ce7-05).

Figure 110 : Spectre RMN HSQC (CD3OD) du composé 2 isolé de Sarcotragus spinosulus (090618Ce7-05).

126

Figure 111 : Spectre RMN HMBC (CD3OD) du composé 2 isolé de Sarcotragus spinosulus (090618Ce7-05).

Structure composé 3 :

37 OH 39 40 41 42 43 44 45 OH 38 1' 1 5 9 13 17 21 25 29 33 6' 2' 3 7 11 15 19 23 27 31 35 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 5' 3' 4' OH 2'-[38-Hydroxy]nonaprenyl-1',4'-hydroquinone Figure 112 : Structure du composé 3 isolé de Sarcotragus spinosulus (090618Ce7-05).

+ 107 HR-MALDITOF-MS : m/z 845,4874 [M+Ag] (Calculé pour C51H78 AgO3, 845,5001).

127

Spectres RMN du composé 3 :

1 Figure 113 : Spectre RMN H (CD3OD, 500 MHz) du composé 3 isolé de Sarcotragus spinosulus (090618Ce7- 05).

13 Figure 114 : Spectre RMN C (CD3OD, 500 MHz) du composé 3 isolé de Sarcotragus spinosulus (090618Ce7- 05).

128

1 1 Figure 115 : Spectre RMN COSY H- H (CD3OD, 500 MHz) du composé 3 isolé de Sarcotragus spinosulus (090618Ce7-05).

Figure 116 : Spectre RMN HSQC (CD3OD) du composé 3 isolé de Sarcotragus spinosulus (090618Ce7-05).

129

Figure 117 : Spectre RMN HMBC (CD3OD) du composé 3 isolé de Sarcotragus spinosulus (090618Ce7-05).

130

13. 6. Signature chimique par RMN 1H

13. 6. 1. Ircinia oros

1 Figure 118 : Spectres RMN H (CD3OD + 0,1 DSS, 500 MHz) réalisés sur l’extrait des espèces I. oros. 131

13. 6. 2. Ircinia dendroides

1 Figure 119 : Spectres RMN H (CD3OD + 0,1 DSS, 500 MHz) réalisés sur l’extrait des espèces I. dendroides.

132

13. 6. 3. Ircinia variabilis

1 Figure 120 : Spectres RMN H (CD3OD + 0,1 DSS, 500 MHz) réalisés sur l’extrait des espèces I. variabilis.

133

13. 6. 4. Sarcotragus foetidus

1 Figure 121 : Spectres RMN H (CD3OD + 0,1 DSS, 500 MHz) réalisés sur l’extrait des espèces S. foetidus.

134

13. 6. 5. Sarcotragus spinosulus

1 Figure 122 : Spectres RMN H (CD3OD + 0,1 DSS, 500 MHz) réalisés sur l’extrait des espèces S. spinosulus.

135

III. LES COMPOSES VOLATILS DES IRCINIIDAE

1. Introduction

1. 1. Les Composés Organiques Volatils

De manière générale, les composés organiques volatils (COV) recouvrent une grande variété de substances chimiques composées de carbone et volatiles à température ambiante. Ils peuvent être regroupés au sein de grandes familles définies en fonction de leur constitution chimique, avec pour chacune des propriétés particulières, bien qu’il puisse exister parfois des différences majeures, notamment sur le plan leur toxicité individuelle ou commune (Cicolella, 2008).

L’article 2 de la directive 1999/13/CE du Conseil Européen du 11 mars 1999, relatif à la réduction des émissions de composés organiques volatils (COV) liées à l’utilisation de solvants organiques dans certaines activités et installations, donne les définitions suivantes :  un composé organique est un composé carboné (à l’exception des oxydes de carbone, des carbonates et des bicarbonates inorganiques) pouvant contenir : H, O, P, Si, N, ainsi que des halogènes ;  un composé organique volatil (COV) est un composé organique qui aurait à une température de 293,15 K, une pression de vapeur supérieur ou égale à 0,01 kPa ; entre autre, c’est un composé organique qui dans des conditions bien particulières, aurait une volatilité correspondante.

Une définition plus restrictive des COV peut parfois être trouvée si la réglementation traite spécifiquement de la pollution photochimique. La directive 2008/50/CE du Conseil Européen relative à l’ozone dans l’air ambiant définit ainsi les COV : « tous les composés organiques provenant de sources anthropiques et biogènes autres que le méthane, capables de produire des oxydants photochimiques par réaction avec des oxydes d’azote sous l’effet du rayonnement solaire ».

136

Les composés organiques volatils sont des gaz à effet de serre, leur caractère volatil leur permet de se propager plus ou moins loin de leur lieu d'émission ; ils peuvent alors avoir des impacts directs et indirects. Les COV constituent avec les terpènes, les peptides cycliques et les alcaloïdes, le groupe des composés allélopathiques. Ils fonctionnent selon différents modes d’action tels que l’inhibition de la photosynthèse, le stress oxydatif ou la paralysie cellulaire (Leflaive et Ten- Hage, 2007), la dissuasion contre les herbivores(Hay et al., 1998 ; Schnitzler et al., 2001 ; Pelletreau et Muller-Parker, 2002 ; Pohnert, 2002), l’inhibition du fouling fongique et bactérien (Bakuset al., 1986 ; Davis et al., 1989 ; Melton et Bodnar, 1988), et la suppression du voisinage compétiteur (Suzuki et al., 1998).

1. 2. Généralités sur les composés volatils en milieu marin

Les composés volatils en milieu marin peuvent être responsables de plusieurs effets écologiques tels que l’induction de défense contre le broutage des macrophytes et du phytoplancton ou bien la dissuasion du prédateur (Steinke et al., 2002). Ils peuvent également jouer un rôle attractant vis-à-vis des brouteurs (Akakabe et Kajiwara, 2008), varier leur taux d’expression selon l’état physiologique et la nature de l’espèce (Bravo-Linares et al., 2010), ou même influencer par leur émission dans l’atmosphère les cycles biogéochimiques (Leblanc et al., 2006 ; Bravo-Linares et al., 2010). Leur origine peut toutefois être confondue avec ceux d’origine anthropique (Colomb et al., 2008).

Chez les macrophytes marins ainsi que chez les phytoplanctons, des gaz tels que des composés hydrocarbures, des organohalogénés, l’ammoniaque, des méthylamines et du diméthylsulfure ont été étudiés (Leblanc et al., 2006 ; Colomb et al., 2008 ; Bravo-Linares et al., 2010). Les travaux de Roose et Brinkman (2000) ont permis de classer des organismes marins de la mer du Nord (algues macrophytes, poissons téléostéens, crustacés et oiseaux marins) en fonction des différents types de COV libérés, sans toutefois parvenir à classer ces organismes selon les paramètres biologiques, géographiques ou temporels. Cette étude a également proposé l’utilisation de ces organismes comme outil de surveillance des taux de COV en milieu marin par rapport au niveau de sécurité. Cet ensemble de données offre des possibilités de recherche assez importantes sur les composés volatils.

137

Ainsi, une étude réalisée en 1989 par Christophersen et ses collaborateurs sur les éponges marines, détermine le trisulfure de diméthyle comme composé responsable de l’odeur nauséabonde de l’espèce Halichondria panicea et identifie trois autres composés : le disulfure de diméthyle et le sulfure de benzyle et de méthyle. Dans cette étude, le rôle des endosymbiontes responsables de la production de ces composés volatils est écarté. De même, une étude comparative entre les deux espèces Plakortis lita et P. angulospiculatus identifie les hydrocarbures oxygénés et la (E)-7-méthyloct-4-én-3-one comme composés majoritaires de la première espèce et les hydrocarbures non-oxygénés et le 1-butyl-2-éthylcyclopentane comme composés majoritaires de la seconde (Roussis et Mazomenos, 1995). Cette étude propose également la combinaison de la composition chimique avec les caractères morphologique comme outil d’identification des espèces.

1. 3. Les composés volatils chez les Irciniidae

Nous nous sommes intéressé à la famille des Irciniidae dont les composés volatils libèrent l’odeur caractéristique de cette famille et sont responsables de l’attribution du nom Ircinia : «Hircus» en latin et signifiant bouc. Les composés volatils chez le genre Ircinia correspondent à un mélange de composés soufrés et azotés tels que le sulfure de diméthyle, l’isocyanate de méthyle et l’isothiocyanate de méthyle (Duque et al., 2001). Ces composés correspondraient à des sous-produits métaboliques, issus de la digestion du phytoplancton (Pile, 1997) ou des bactéries endosymbiotiques (Simpson, 1984) par Ircinia sp.; ou bien de la digestion du phytoplancton par le zooplancton qui libère le sulfure de diméthyle (Dacey and Wakeham, 1986). Le rôle responsable du phytoplancton a été rejeté par Duque et al. (2001), justifiant cela par une subsistance de l’odeur caractéristique chez des espèces d’Ircinia vivant à de grandes profondeurs, où l’absence de lumière empêche toute présence de phytoplancton L’implication des composés tels que le sulfure de diméthyle, l’isocyanate de méthyle et l’isothiocyanate de méthyle dans la défense chimique écologique d’Ircinia sp. a été proposé (Duque et al., 2001) ; ces composés pouvant agir soit par action directe contre la prédation, l’envahissement ou le fouling, soit par action indirecte en tant que signaux marquant la présence d’acides tétroniques furanoterpéniques (ATF) dans les tissus de l’éponge. Leur rôle de signal (action défensive indirecte) contre une agression a été suggérée suite à des expériences de blessures intentionnelles réalisée sur Ircinia sp. (Zea et al., 1999; Duque et al., 2001), au cours desquelles une augmentation de la concentration de ces composés (Duque et

138 al., 2001) et une absence de libération d’acides tétroniques furanoterpéniques (ATF) dans la colonne d’eau ont été démontrées (Zea et al., 1999). Leur rôle de barrière chimique protectrice (action défensive directe) a été rejetée plus tard, après qu’un test de palatabilité réalisé sur des poissons téléostéens récifaux a confirmé l’effet dissuasif des ATF sur les prédateurs (Pawlik et al., 2002). Le rôle antimicrobien de ces composés volatils a bien été confirmé (Duque et al., 2001). Les COV ont également montré une capacité d’inhibition du transport du Ca2+ (Beveridge et al., 1995). Ils seraient produits selon des coûts métaboliques de l’organisme (Pawlik et al., 2002). Leurs fonctions écologiques probables en tant qu’agents antifouling et/ ou de résister à l’envahissement n’ont pas encore été étudiées et, par conséquent, ne peuvent être exclues (Pawlik et al., 2002).

A ce jour, il n’existe encore aucune connaissance sur les composés volatils du genre Sarcotragus, sachant que leur odeur est aussi forte que celle du genre Ircinia.

1. 4. Objectif du travail

La littérature sur la détermination des composés volatils des éponges est très pauvre (Christophersen et al., 1989 ; Roussis et Mazomenos, 1995 ; Duque et al., 2001). L’objectif du travail est de mener une étude comparative des composés volatils présents chez les espèces Sarcotragus spinosulus, Ircinia oros, Ircinia variabilis et Ircinia dendroides. Appartenant toutes à la famille des Irciniidae méditerranéennes, ces éponges ont été récoltées de Ceuta (au détroit de Gibraltar), à Costa Blanca (en Espagne) et à Marseille (en France). Nous avons développé une méthodologie basée sur la Micro Extraction en Phase Solide (SPME) de l’espace de tête, suivie d’une analyse en Chromatographie Gazeuse (GC) couplée à la Spectrométrie de Masse (MS). Ceci a été réalisé dans le but de pouvoir visualiser une représentation globale et obtenir un signal intense en (MS) des différents composés de faibles poids moléculaires présents dans les échantillons. L’impact de différents paramètres tels que le poids de l’échantillon, le revêtement de la fibre d’extraction utilisée, le temps et la température d’extraction, ont été évalués afin de pouvoir déterminer les meilleures conditions d’analyses.

139

2. Techniques métabolomiques pour l’étude de composés de faible poids moléculaire

Comme nous l’avons indiqué dans le chapitre II, l’étude du métabolome comporte deux grandes étapes : l’extraction de l’échantillon puis son analyse. La première étape est primordiale puisque la qualité et la représentativité de l’analyse en dépendent. Le choix des techniques d’extraction et d’analyse dépend de la matrice ainsi que de l’objectif du processus analytique global.

2. 1. Techniques d’extraction de composés de faible poids moléculaire

L’extraction des composés de faible poids moléculaire peut être réalisée de différentes façons :  les techniques de distillation par la vapeur : elles sont utilisées traditionnellement dans le domaine des arômes et parfums. Il s’agit de la distillation par entraînement à la vapeur et de l’hydrodistillation. Ce sont des techniques classiques aux inconvénients de gaspiller beaucoup de temps et de perdre pas mal de composés en raison d’une faible capacité extractive. Une autre technique la FAMD (Focused Microwave- Assisted Hydrodistillation) entre dans cette même catégorie de techniques : bien que le temps d’extraction soit largement diminué, les irradiations par microondes pourraient cependant détériorer les composés.

 La technique SFE (Supercritical Fluid Extraction), où un flux de fluide tel que le CO2 est maintenu à une pression et température dépassants ses pressions et températures critiques pour en former un fluide supercritique. Ce flux de fluide supercritique solubilise les analytes en question et les entraine vers un autre compartiment afin d’être analysés. C’est une méthode assez rapide et efficace cependant une mise au point du protocole d’extraction s’avère assez critique ;  les techniques de l’espace de tête (Head Space ou HS) sont assez récentes. Elles dépensent peu de matériels (échantillons et produits) avec une importante capacité extractive. Nous distinguons l’espace de tête statique (S-HS) où un équilibre isotherme est établi entre la phase gazeuse et la phase sous-jacente, une partie de l’atmosphère saturée de COV est retirée par une seringue et analysée en GC-MS. Cette procédure

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est assez simple, elle aurait cependant une faible capacité extractive. L’extraction par l’espace de tête dynamique (D-HS) est une méthode largement utilisée qui nécessite des instrumentations assez complexes, ainsi que la standardisation de plusieurs paramètres et procédures d’échantillonnages. Elle consiste à séparer les constituants volatils par un flux de gaz inerte tel que He et les concentrer sur un matériel absorbant tel que le Tenax d’où ils seront désorbés thermiquement. La technique de l’espace de tête sous vide (V-HS) où les composés volatils sont séparés de la matrice grâce à un vide établi dans l’espace de tête, puis la technique de la microextraction en phase solide (SPME) ont été utilisées dans cette étude (c. f. paragraphe 2. 1. 1.).

L’extraction par solvants n’est cependant pas employée dans le cas de l’étude de composés volatils, puisque le contact direct entre la matrice et le solvant entraîne souvent une extraction non désirée de composés lourds conduisant à des difficultés lors de l’étape d’analyse. De plus, l’évaporation du solvant doit être réalisée avec beaucoup de précautions pour ne pas perdre les composés les plus volatils

La technique employée lors de cette étude est la Microextraction en Phase Solide de l’espace de tête ou Headspace Solid Phase Microextraction (HS-SPME). Cette technique réunit l’extraction et la concentration des composés en une seule étape. Elle fournit également une importante performance analytique, tout en exigeant une moindre quantité d’échantillons.

2. 1. 1. Technique d’extraction utilisée : HS-SPME

L’espace de tête ou Head Space (HS) est la phase gazeuse qui se trouve au-dessus d’un échantillon à l’état liquide ou solide quand celui-ci est placé dans un flacon hermétique. Un équilibre se crée entre les deux phases et l’espace de tête se retrouve enrichi en composés volatils. Ce phénomène a été mis à profit pour développer une nouvelle famille de méthodes d’extraction : les techniques de l’espace de tête. Les besoins d’automatisation et de miniaturisation ayant été pris en compte, ce type de procédé permet de s’affranchir, des problèmes liés à l’utilisation de solvants et de la nécessité de disposer d’une grande quantité d’échantillon. Bien que le développement des techniques de l’espace de tête soit toujours d’actualité, elles sont toutes basées sur le même principe : prélèvement puis analyse par GC. La différence se fait sur la manière de prélever l’espace de tête : statique ou par enrichissement sur une phase stationnaire de façon statique ou dynamique. Ces méthodes

141 permettent de mieux analyser les composés volatils et sont donc complémentaires des méthodes d’extraction par solvants. Cependant, la concentration des composés dans l’espace de tête ne correspond pas à leur concentration réelle dans la matrice.

La Microextraction en Phase Solide (SPME) est une technique d’extraction de l’espace de tête développée à la fin des années 80 par Arthur et Pawliszyn (Arthur et al., 1990). Il s’agit d’une méthode d’extraction utilisant une fibre de silice fondue recouverte d’un polymère. La fibre peut se rétracter à l’intérieur d’une aiguille placée dans un support pour l’échantillonnage et la désorption (Figure 123). Elle peut être utilisée pour des échantillons gazeux, liquides et solides.

Figure 123 : Systèmes (fibre-support) de microextraction en phase solide pour un échantillonnage manuel et automatique.

La fibre peut être employée en immersion dans les liquides aqueux ou exposée dans l’espace de tête pour tous les types d’échantillon. Ceux-ci sont placés dans des flacons hermétiques et l’aiguille sert à percer le septum pour permettre l’exposition de la fibre avec l’espace de tête ou l’immersion dans le liquide. Quand l’extraction est terminée, on rétracte la fibre dans l’aiguille et on la retire du flacon. La fibre est ensuite désorbée directement dans l’injecteur d’un appareil de chromatographie ou dans une interface spéciale pour une analyse par HPLC (Figure 124) (Burgot et Pellerin, 2003).

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Figure 124 : Séquence d’extraction/désorption par SPME.

En SPME, il ne s’agit pas d’une extraction totale mais d’un phénomène d’enrichissement sur une phase stationnaire polymérique mettant en jeu des équilibres. Dans le cas d’une immersion, l’équilibre se fait entre le liquide et la phase stationnaire. Par contre, lors de l’utilisation en espace de tête, deux équilibres sont mis en jeu, l’un entre l’échantillon et l’espace de tête et l’autre entre l’espace de tête et la fibre. De plus, selon le type de fibre utilisé, les phénomènes d’équilibre et d’extraction sont différents. Plusieurs phases stationnaires ont été développées pour couvrir un large champ d’applications (Bicchi et al., 2000). Elles peuvent être regroupées en trois classes :  les polymères liquides : le polydiméthylsiloxane (PDMS, Figure 125) est utilisé pour les composés apolaires et le polyacrylate (PA) est la phase stationnaire la plus polaire en SPME. Il s’agit dans ce cas d’un phénomène de partage entre le polymère liquide et la matrice ;  les polymères poreux : le divinylbenzène (DVB, Figure 125) utilisé en association avec le PDMS est adapté pour l’adsorption de composés volatils polaires et plus particulièrement les amines et les composés aromatiques azotés. Le Carbowax® (CW) est du polyéthylèneglycol utilisé en association avec du DVB pour l’extraction des composés polaires, particulièrement les alcools ;  les polymères très poreux : le Carboxen® (Figure 125) est un tamis moléculaire carboné possédant une capacité de rétention très élevée, plusieurs couches de composés peuvent se déposer à sa surface. Il est utilisé en combinaison avec du PDMS, la taille des pores favorise l’adsorption des petites molécules, cette phase est donc utilisée pour les composés très volatils.

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Figure 125 : Structure des polymères utilisés en SPME.

Enfin, une phase contenant du DVB, du Carboxen® et du PDMS a été développée afin de disposer d’une fibre capable d’adsorber différents types de composés permettant un large criblage (Pillonel et al., 2002).

Les caractéristiques des phases stationnaires utilisées en SPME sont présentées dans le Tableau 4.

Tableau 4 : Caractéristiques des phases stationnaires disponibles pour la SPME.

Nature de la phase Epaisseur Température Polarité Composés extraits stationnaire du film maximale 100 et 30 280 ˚C Volatils μm Polydiméthylsiloxane Apolaire Semi-volatils et (PDMS) 7 μm 340 ˚C non-volatils apolaires Semi-volatils Polyacrylate (PA) 85 μm Polaire 320 ˚C polaires Carboxen / Gaz et composés Polydiméthylsiloxane 75 et 85 μm Bipolaire 320 ˚C très volatils (CAR / PDMS) Polydiméthylsiloxane / Divinylbenzène 60 et 65 μm Bipolaire 270 ˚C Volatils polaires (PDMS / DVB) Carbowax / Divinylbenzène 65 et 70 μm Polaire 260 ˚C Polaires (CW/DVB) Divinylbenzène / Carboxen / Volatils et semi- Polydiméthylsiloxane 50 / 30 μm Bipolaire 270 ˚C volatils (DVB / CAR / PDMS)

La SPME est une technique d’extraction sans solvant, très simple, facile à mettre en œuvre et parfaitement automatisable. Le temps de préparation des échantillons est réduit et les fibres peuvent être utilisées une cinquantaine de fois en moyenne ce qui en fait une technique peu onéreuse. De plus, la sensibilité de la SPME permet d’étudier des composés présents en de très faibles concentrations.

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Cependant, les fibres sont fragiles, l’optimisation des conditions d’extraction peut être assez longue et il peut s’avérer difficile d’obtenir des résultats reproductibles. Enfin, une analyse quantitative est possible mais difficile à réaliser en raison de l’affinité différentielle des composés à analyser pour la fibre, mais aussi des équilibres mis en jeu entre les différentes phases (échantillon, espace de tête, fibre).

Cette technique est appliquée dans de nombreux domaines tels que l’environnement, la biologie, la toxicologie, la pharmacie et, plus particulièrement, pour l’analyse des composés volatils de nombreuses matrices alimentaires et végétales (Bicchiet al., 2000 ; Yang et Peppard, 1994).

2. 2. Techniques d’analyse de composés de faible poids moléculaire

Si l’on s’intéresse aux composés volatils comme dans le cas de l’analyse de l’espace de tête, la méthode de choix est la chromatographie en phase gazeuse (GC). De plus, la GC est largement utilisée en couplage avec la spectrométrie de masse (GC/MS, GC/MS-MS). Enfin, les techniques de GC bidimensionnelle telles que la GC×GC représentent une grande avancée en terme de pouvoir de séparation.

2. 2. 1. Techniques d’analyse utilisées : GC×GC-MS

La chromatographie en phase gazeuse est la méthode de référence pour l’analyse des composés volatils et semi-volatils. La diversité des méthodes d’injection, de détection et le grand choix de colonnes permet une analyse de plus en plus poussée de mélanges très complexes (Marriott et al., 2001 ; Lockwood, 2001). Comme toutes les méthodes chromatographiques, la GC repose sur le principe de migration différentielle des constituants d’un mélange au travers d’une phase stationnaire. Cette technique a été pensée dès 1941 par Martin et Synge, a ensuite été développée en 1952 par James et Martin et a connu son véritable essor entre les années 60 et 70 (Bartle et Myers, 2002). Dès lors, son utilité dans de nombreux domaines a entraîné un développement considérable de toutes les parties de cet instrument.

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Jusqu'à la fin des années 70, l’injecteur à liquide dit classique, les colonnes remplies et le catharomètre étaient principalement utilisés. L’apparition des colonnes capillaires a permis d’améliorer considérablement l’efficacité de séparation et en parallèle, les injecteurs « split/ splitless » ont été développés. Parallèlement, au niveau des détecteurs, le catharomètre a été progressivement remplacé par le Détecteur à Ionisation de Flamme (FID), beaucoup plus sensible et quasi-universel envers les composés organiques. Des détecteurs spécifiques aux molécules soufrées, azotées, phosphorées et halogénées ont également été développés et permettent d’augmenter la sensibilité envers ces molécules. De plus, l’identification des constituants d’une matrice complexe analysée par GC nécessite l’utilisation de méthodes couplées. Ces méthodes permettent d’associer la capacité de séparation de la GC au pouvoir de caractérisation des détecteurs spectrométriques (GC/MS) que nous avons utilisés lors de cette étude, spectroscopique GC/FTIR (ou Spectroscopie Infrarouge à Transformée de Fourier) et physiologique GC/O (ou Olfactométrie). Les dernières avancées en GC concernent le développement de la GC bidimensionnelle intégrale que nous avons également utilisé lors de cette étude et qui est très utile dans le cas de mélanges complexes présentant de nombreuses coélutions en GC conventionnelle (Dunn et al., 2004 ; Beens et Brinkman, 2005).

La GCGC ou chromatographie gazeuse bidimensionnelle intégrale (comprehensive bidimensional gaz chromatography en anglais) est une technique d’analyse qui a vu le jour au début des années 1990. La particularité de cette technique est que la séparation des composés volatils se fait à travers deux colonnes capillaires placées l’une à la suite de l’autre dans le(s) four(s) d’un appareil de chromatographie, et couplées à travers un système de modulation. Ainsi, cette technique consiste à faire passer l’intégralité du chromatogramme 1D sur une colonne secondaire (2D). Cette prouesse n’est rendue possible que par une modulation de l’effluent 1D, c'est-à-dire son fractionnement systématique suivant un intervalle de temps régulier appelé temps de modulation. En se basant arbitrairement sur une largeur de pic à la base de 10 à 20 secondes en sortie de première colonne, la période de modulation appliquée ne devra pas excéder 5 à 6 secondes de manière à pouvoir obtenir des pics modulés. Tous les composés élués de la première colonne sont donc successivement soumis à la séparation dans la deuxième colonne. Cette dernière est nécessairement de sélectivité différente (« séparations orthogonales ») et devra permettre une séparation ultra-rapide, ce qui conduira à l’analyse de

146 la totalité de l’échantillon. Un chromatogramme en deux dimensions (2D) est alors obtenu (Figure 126).

Figure 126 : Principe de la modulation et visualisation des chromatogrammes obtenus par retraitement du signal. L’effluent de la colonne de 1ere dimension (1) est divisé, selon un intervalle de temps régulier (temps de modulation, PM) en de multiples fractions qui sont successivement envoyées vers la colonne secondaire. Chaque fraction analysée représente ainsi un sub-chromatogramme. Le signal du detecteur (2) (simple chromatogramme ou bien courant ionique total) est alors découpé selon la durée de la période de modulation PM, et la somme des sub-chromatogrammes (3) obtenus conduit à l’établissement de la carte 2D (4).

2. 2. 2. Les indices de rétention

Chaque composé est caractérisé par son temps de rétention qui dépend de ses propriétés physico-chimiques, de la nature et de l’épaisseur de la phase stationnaire, de la longueur et du diamètre interne de la colonne, mais aussi de la programmation en température du four et du débit du gaz vecteur. C’est pour s’affranchir de l’influence des conditions chromatographiques que les indices de rétention ont été développés, dans un premier temps par Kovats en isotherme (Kováts, 1958), puis ils ont été adaptés pour tenir compte de la programmation de température par Van Den Dool et Kratz (Van Den Dool et Kratz, 1962). Il

147 s’agit d’injecter une série homologue de n-alcanes ou d’esters méthyliques linéaires dans les mêmes conditions opératoires que les échantillons analysés. Les temps de rétention croissent linéairement avec le nombre d’atomes de carbone (n) de l’alcane ou de l’ester. La formule, basée sur les temps de rétention de deux alcanes (ou esters) à n et n+1 carbone qui encadrent le composé inconnu X sur le chromatogramme, est la suivante :

IRX = 100n + 100 [(tr(x) – tr(n) / (tr(n+1) – tr(n))]

Les indices de rétention ne dépendent que de la nature de phase stationnaire choisie et ont permis la construction de banques de données désormais internationalement utilisées comme références (B. A. C. I. S. Boelens Aroma Chemical Information Service, 1999 ; Adams, 1995 ; Jennings et Shibamoto, 1980 ; Davies, 1990). Néanmoins, pour chaque phase stationnaire, plusieurs composés peuvent avoir des indices similaires. C’est pourquoi, on utilise généralement deux types de colonnes de polarités différentes (apolaire et polaire) qui permettent d’obtenir un couple d’indices comparé ensuite à ceux de la littérature.

2. 2. 3. Les détecteurs

Le principe du détecteur à ionisation de flamme est de brûler l’effluent apporté par le gaz vecteur dans une flamme (oxygène et hydrogène), les ions formés lors de la combustion sont collectés par une électrode créant un courant qui est amplifié et mesuré. Ce détecteur qui a l’avantage d’être 1000 à 10 000 fois plus sensible que le catharomètre, est robuste et efficace pour la quasi-totalité des composés organiques, et, de par sa linéarité, est très utile pour les analyses quantitatives. En ce qui concerne la spectrométrie de masse, nous n’aborderons ici que le cas de l’ionisation par impact électronique et de l’analyseur de masse quadripolaire. En sortie de colonne, directement couplée à la source d’ions, les molécules sont bombardées par un faisceau d’électrons de haute énergie. L’impact conduit à la formation d’ions radicalaires (M+.) qui se fragmentent par la suite. L’analyseur permet de séparer les ions produits en fonction de leur rapport masse sur charge (m/z). Dans le cas du quadripôle, celui-ci fonctionne comme un filtre à ions c'est-à-dire qu’à un instant donné, seuls les ions ayant un certain rapport m/z sortent de l’analyseur. Les ions parcourent alors un multiplicateur d’électrons qui va transformer et amplifier le signal pour qu’il soit mesuré et enregistré. On obtient ainsi le

148 courant ionique total ; à chaque pic est associé un spectre de masse correspondant à la fragmentation du composé élué. L’identification des constituants via leurs spectres de masse obtenus est généralement réalisée par comparaison avec des banques de spectres de masse informatisées ou trouvées dans la littérature. Différents types de banque sont utilisés. Les bibliothèques généralistes commerciales (NIST, Wiley) contiennent plusieurs centaines de milliers de spectres de masse et couvrent une large gamme de composés mais peuvent s’avérer rapidement limitées pour l’identification de composés d’une même famille, spécifique à une matrice donnée (McLafferty et Stauffer, 1989).On utilise ainsi le plus souvent des bibliothèques spécialisées (Adams, Massfinder, Jennings et Shibamoto) conçues spécifiquement pour l’analyse des composés aromatisants ou encore des bibliothèques créées au laboratoire (Adams, 1995 ; Jennings et Shibamoto, 1980 ; Joulain et al., 2001). Ces bases de données sont constamment enrichies par l’analyse de nouveaux produits commerciaux ou synthétisés. Lorsque le composé n’est pas présent dans les bases de données, on peut tenter d’interpréter le spectre de masse pour établir sa structure, cependant, il est souvent nécessaire de l’isoler afin de le caractériser par d’autres techniques.

3. Matériels et méthodes

3. 1. Sites et protocole d’échantillonnage

Les éponges étudiées ont été prélevées de trois zones géographiques différentes du bassin Méditerranéen : Ceuta au détroit de Gibraltar, la Costa Blanca en Espagne et Marseille en France, dans le cadre de la mission 2009 du programme ECIMAR de l’ANR Biodiversité (Figure 127).

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Figure 127 : Localisation des trois sites d’échantillonnage des IRCINIIDAE.

Douze échantillons, appartenant aux espèces Sarcotragus spinosulus, Ircinia oros, Ircinia variabilis et Ircinia dendroides, d’un volume humide de 5 cm3 minimum ont été congelés à - 20 ºC immédiatement après leur récolte (Tableau 5).

Tableau 5 : Liste des échantillons utilisés lors de cette étude indiquant leurs codes et leur taxonomie

Code échantillon Genre Espèce 090613Cb2.02 090616Cb4.06 090618Ce7.06 variabilis 090617Ce1.04 090702Ma5.07 Ircinia 090613Cb2.03 090701Ma8.04 oros 090625Ma3.02 090614Cb3.05 dendroides 090613Cb2.01 090618Ce7.05 Sarcotragus spinosulus 090701Ma8.12

Les détails concernant les sites et les zones de prélèvements des différents échantillons sont présentés dans l’annexe 2. Les échantillons ont été déterminés selon la taxonomie usuelle basée sur des critères morphologiques externes et des caractères histologiques, ainsi que selon la chimiotaxonomie basée sur la signature chimique de chacune des espèces (c. f. Chapitre II).

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3. 2. Mise au point du protocole utilisé pour l’acquisition des signatures chimiques (GC-MS)

3. 2. 1. Préparation des échantillons et optimisation des paramètres

Chaque organisme a été plongé dans un Dewar contenant de l'azote liquide pendant 30 minutes. Ceci nous a permis d’éviter la perte de composés volatils et a rendu l’éponge plus rigide afin de pouvoir la broyer au mixeur de façon homogène et obtenir une reproductibilité des résultats. Plusieurs réplicats de 1,5 g ont été transférés dans des tubes de 10 ml. 1,5 ml d'eau ont été ajoutés à chaque tube, muni d'un agitateur. Ce dernier a permis de maintenir un mélange homogène de l’éponge pendant la période d'incubation et d'extraction. Les tubes ont été sertis au moyen de capsules munies de septa en PTFE/silicone (Supelco). L’incubation a été effectuée à différentes températures (40, 60 et 80ºC) et différents temps (30, 60 et 90 minutes) afin de pouvoir déterminer les paramètres optimaux d’incubation. Après avoir fixé ces derniers, l’extraction des composés de faibles poids moléculaires a été effectuée par des fibres de différentes compositions polymériques : divinylbenzène/carboxen/ polydiméthylsiloxane ou DVB/CAR/PDMS ; CAR/PDMS ; DVB/PDMS et PDMS. Ces fibres ont été exposées à l’espace de tête selon des temps différents de 30, 60 et 90 minutes.

L’influence de différents paramètres tels que le poids de l’échantillon, la taille du tube, la présence d’eau et d’agitateur ainsi que la matrice qui constitue la fibre, le temps d’incubation et d’extraction et la température ont tous également été évalués dans le but de déterminer les meilleures procédures et conditions d’analyse. Ainsi, pour les études statistiques, trois réplicats par échantillons ont été effectués. La moyenne de ces trois valeurs et l’écart-type ont également été déterminés pour chaque composé identifié.

3. 2. 2. Types et conditionnement des fibres SPME

Plusieurs fibres commerciales de 1cm de long ont été utilisées pour extraire les composés volatils (Sigma-Aldrich Co. T794123N). Les fibres sélectionnées présentaient les phases stationnaires suivantes : DVB/CAR/PDMS de 50/30 µm d’épaisseur ; CAR/PDMS de 75 µm

151 d’épaisseur ; DVB/PDMS de 65 µm d’épaisseur et PDMS de 30 µm d’épaisseur. Elles ont été conditionnées conformément aux recommandations du fournisseur (Supelco, Bellefonte, PA) en les insérant dans l’injecteur GC à : 270 °C pendant une heure pour la fibre en DVB/CAR/PDMS ; 300 °C pendant une heure pour celle en CAR/PDMS ; 250 °C pendant 30 minutes pour la DVB/PDMS ; et, 250 °C pendant 30 minutes pour la PDMS.

3. 2. 3. Analyses par GC-MS

Après l’incubation, la fibre SPME est retirée du tube échantillon puis insérée dans l’injecteur du chromatographe pour une désorption thermique. L’injection est réalisée en exposant la fibre pendant une période de 2,5 minutes. Avant chaque nouvelle analyse injection, la fibre SPME est systématiquement désorbée pendant 3 minutes à 250°C, afin de s’assurer d’une complète désorption de tous les composés éventuellement imprégnés sur la fibre.

3. 2. 4. Description et paramétrage de la GC-MS

La première partie de cette étude qui a consisté à optimiser les paramètres d’extraction/incubation de la SPME a nécessité l’utilisation d’un système de GC-MS classique Agilent 6890N/5973N. Les analyses ont été réalisées en mode splitless au moyen d’une colonne capillaire de type HP-1 (50 m × 0,20 mm ; épaisseur du film : 0,2 µm). Le système a été programmé comme suit : débit d’hélium constant (1 mL/min) ; température du four : 60 °C pendant 4 min et montée jusqu’à 250 °C à 2 °C/min, puis maintenue en isotherme pendant 30 minutes ; énergie d’ionisation : 70 eV ; spectres de masse enregistrés sur la gamme de 35-400 m/z (assimilés ici à u.m.a).

Les analyses en chromatographie gazeuse bidimensionnelle GC×GC-MS ont été réalisées au moyen d’un couplage GC-MS composé d’un GC Agilent 6890N couplé à un spectromètre de masse Agilent 5973N dont la vitesse d’acquisition a été portée à 10 000 uma.s-1. Le GC a été équipé d’un kit de GCxGC ZOEX KT2003, constitué principalement d’un modulateur cryogénique dual-jet à boucle et d’un Dewar de réserve pour azote liquide. La modulation est obtenue par le jeu de 3 électrovannes pilotées depuis l’ordinateur de contrôle du système. Le système bidimensionnel de colonnes chromatographiques correspond à une colonne Varian

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VF-5MS (30 m × 0,25 mm ; épaisseur du film : 0,2 µm) et d’une colonne J&W Innowax (1,25 m × 0,10 mm ; épaisseur du film :0,1 µm) couplées en série à un capillaire désactivé (1,25 m × 0,10 mm), faisant lui-même office de boucle dans le modulateur. Les analyses sont réalisées en mode splitless et à débit constant d’hélium (0,8 mL/min). Le four principal est programmé de 50 °C jusqu’à 250 °C en augmentant la température à raison de 5 °C/min, puis maintenu à 250 °C pendant 10 min en fin de programme. Le four secondaire est programmé de 60 °C à 252 °C à raison de 6 °C/min puis maintenu à 252 °C pendant 18 min. La période de modulation est fixée à 5,5 secondes et la durée du « hot pulse » est fixée à 350 ms. La température du jet chaud est fixée à 295 °C et sa pression d’entrée à 2 bars. Le débit du jet froid par approvisionnement en N2 gazeux est maintenu constant aux alentours de 7 L/min. En mode de détection par spectrométrie de masse (EI-MS), le détecteur quadripolaire est utilisé sur une gamme de 40-300 m/z correspondant à une vitesse d’acquisition de 21,5 Hz.

3. 2. 5. Identification des composés volatils

L’identification des constituants a été basée sur la comparaison des temps et indices de retentions avec ceux de composés standards et par comparaison de leur spectres de masse avec ceux contenus dans les banques de spectres disponibles au laboratoire (Wiley, NIST08 MassFinder 2,1 Library) et/ ou les données de la littérature (Joulain et König, 1998 ; Joulain et al., 2001 ; McLafferty et Stauffer , 1989 ; Adams, 1995 ; Jennigs et Shibamoto, 1980). Les indices de retentions (RI) ont été mesurés sur une colonne apolaire de type HP-1 ou VF-5MS et calculés à partir d’une série de n-alcanes homologues (C5-C28). Cependant, les bases de données utilisées ici sont celles principalement dédiées à l’analyse des arômes et parfums, étant donné qu’à ce jour, aucune base de données dédiée aux composés volatils des substances naturelles marines n’existe, d’où la difficulté rencontrée lors de l’identification des différents constituants.

4. Résultats et discussions

Les paramètres d’extraction par SPME ont été évalués, afin de déterminer les meilleures conditions d’extraction des composés à faibles poids moléculaires à partir d’un échantillon d’éponge. La fibre d’extraction, la température et le temps d’incubation ainsi que le temps

153 d’extraction ont été variés afin d’obtenir la valeur la plus efficace en matière d’intensité du signal et de la diversification des composés.

4. 1. Sélection de la fibre SPME

Les fibres SPME disponibles commercialement vont du PDMS non polaire, jusqu’au CAR/DVB à polarité très élevée. Pour cette étude, quatre types de fibres ont été comparées selon leurs sélectivités et leurs efficacités d’extraction : polydimethylsiloxane (PDMS), carboxen/polydimethylsiloxane (CAR/PDMS), divinylbenzene/polydimethylsiloxane (DVB/PDMS) et divinylbenzene/ carboxen/ polydimethylsiloxane (DVB/CAR/PDMS). Les paramètres temps et température ont été dans un premier temps fixés à 60 min (incubation/extraction) et 60 °C. Leur optimisation a été réalisée par la suite une fois la fibre choisie. Parmi les 4 fibres testées, la fibre biphasique CAR/PDMS a montré le plus haut pouvoir d’extraction, mais elle est limitée aux composés plutôt volatils : RI <1000. De manière à garder un bonne vision d’ensemble de la diversité moléculaire présentée par les spongiaires, nous avons choisi de travailler dans la suite de l’étude avec une fibre triphasique CAR/DVB/PDMS offrant un pouvoir d’extraction légèrement inférieur à la fibre CAR/PDMS, mais permettant d’étudier une plus large gamme de COV (Figure 128).

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Figure 128 : Comparaison de la sélectivité extractive des fibres SPME selon la volatilité des composés. Ces diagrammes déterminent la somme des airs des pics selon la zone chromatographique : une frontière virtuelle est fixée à 10 min afin de regrouper les composés hautement volatils (<10 min)et ceux légèrement volatils(>10 min).

4. 2. Evaluation des paramètres d’incubation et d’extraction

Les temps et les températures d’incubation et d’extraction influencent l’efficacité de l’extraction par SPME. L’espèce Sarcotragus spinosulus a été utilisée comme éponge de référence pour l’optimisation des paramètres d’extraction. Pour cela, 1,5 g d’éponges ont été extraits à l’aide de la fibre CAR/DVB/PDMS, à différentes températures d’incubation et d’extraction (40, 60 et 80°C pendant 60 minutes), puis à différents temps d’incubation et d’extraction (30, 60 et 90 minutes), afin de déterminer les conditions optimales de temps et de températures pour les analyses SPME.

155

4. 2. 1. Evaluation du paramètre temps

Afin d’évaluer le paramètre temps, la température d’incubation/extraction a été fixée à 60°C et le temps d’extraction a été modulé entre 30, 60 et 90 minutes. Les résultats des Figures 129a et 129b démontrent que du point de vue de l’abondance (TIC ou Total Ion Chromatogram), la quantité de composés volatils extraits par la fibre SPME augmente lorsque le temps d’extraction passe de 30 à 60 minutes. Cependant, l’efficacité extractive n’a pas démontré une amélioration significative du signal et de la quantité de composés volatils extraits lorsque le temps d’exposition passe de 60 à 90 minutes.

Figure 129 : Variation de la quantité de composés extraits par l’optimisation des paramètres temps d’incubation (Xa) et temps d’extraction (Xb), pour l’analyse de l’espèce Sarcotragus spinosulus. La fibre utilisée est la fibre SPME triphasique CAR/DVB/PDMS.

4. 2. 3. Evaluation du paramètre température

La Figure 130 illustre l’effet du changement de la température d’extraction vis-à-vis de la concentration des composés volatils dans l’espace de tête. Les températures élevées permettent théoriquement aux molécules les moins volatiles d’être relarguées plus facilement de la matrice, par conséquent leurs concentrations dans l’espace de tête augmentent aussi. Ainsi, l’efficacité extractive à une température relativement élevée (60 et 80 °C) augmente la concentration des composés dans l’espace de tête ; une apparition de nouveaux composés moins volatils s’est présentée en passant de 40 °C à 60 °C. Cependant, et lors du passage de 60 à 80 °C, une grande partie des composés les plus volatils, est masqué par l’augmentation de la concentration des composés les moins volatils dans l’espace de tête. Une possible détérioration des molécules peut également avoir lieu lors du passage de 60 ˚C à 80 ˚C (Pinelo et al., 2005 ; Hattab et al., 2007).

156

Figure 130 : Variation de la quantité de composés extraits par l’optimisation du paramètre température d’incubation (Xc), pour l’analyse de l’espèce Sarcotragus spinosulus. La fibre utilisée est la fibre SPME triphasique CAR/DVB/PDMS.

C’est en se basant sur ces résultats obtenus pour Sarcotragus spinosulus que les paramètres temps (60 min) et chauffage (60 °C) ont été fixés pour l’extraction par SPME des composés volatils dans le reste de l’étude, étendue cette fois-ci à d’autres espèces : Ircinia oros, Ircinia variabilis et Ircinia dendroides.

En conclusion, les températures d’extraction élevées et/ou les temps d’extraction allongés fournissent une efficacité d’extraction plus élevée des composés les moins volatils ; cependant, ces mêmes conditions diminueraient l’efficacité de l’extraction des composés très volatils.

4. 3. Identification des composés volatils des éponges étudiées

L’avantage apporté par la chromatographie bidimensionnelle intégrale, dite GCGC, réside dans son pouvoir de séparation accru par rapport à la chromatographie gazeuse conventionnelle car elle combine la sélectivité de deux phases stationnaires orthogonales (apolaire et polaire) en une seule analyse. Par ailleurs, elle permet d’obtenir une plus forte sensibilité grâce à la focalisation cryogénique des analytes dans le modulateur du système. Ces deux atouts essentiels sont particulièrement bénéfiques pour des études métabolomiques de composés volatils et ont déjà été abondamment utilisées dans différentes études de la littérature. Ainsi, l’analyse par GCxGC des constituants volatils de Sarcotragus spinosulus, Ircinia oros, Ircinia variabilis et Ircinia dendroides a permis d’obtenir des profils chromatographiques bi- et tridimensionnels pour chaque espèce étudiée (Figure 131). Tous les chromatogrammes sont représentés au niveau de l’annexe 8. L’ensemble des espèces

157 présentent des chromatogrammes avec le benzaldéhyde (tr~16 min) en composé majoritaire, ce qui met en lumière une première caractéristique commune à la famille des Irciniidae méditerranéennes. L’espèce I. dendroides montre un autre pic majoritaire : le 2-propylfurane à 11,2 min ; et pour I. variabilis, la octan-2-one(cétone) à 16,5 min. Ce composé a également été détecté chez Ircinia felix récoltée en Colombie sur la côte Caraïbes (Duque et al., 2000), les composés majoritaires de cette éponge étant cependant le méthanol et le benzène, tandis que les COV ont été extraits par des techniques d’espace de tête dynamiques (D-HS).

Figure 131 : Profils tridimentionnelles des espèces d’Irciniidae étudiées.

Afin d’identifier les composés volatils observés dans les profils GCGC, les échantillons ont été analysés par SPME-GC-MS. L’ensemble des composés identifiés dans chaque éponge a été classifié dans les tableaux ci-dessous de manière à faire apparaitre les familles chimiques principales mais aussi pour tenter de corréler les données avec celles obtenues précédemment lors de l’étude des métabolites secondaires « lourds » (Chapitre II). Dans ce but, nous avons également défini deux classes particulières supplémentaires : la famille des composés aromatiques et celle des dérivés furaniques, puisque les polyprénylhydroquinones sont particulièrement abondantes dans le genre Sarcotragus, tandis que les éponges du genre Ircinia ont montré une certaine richesse en acides tétroniques furanoterpéniques (ATF).

158

Ainsi, pour Sarcotragus spinosulus, 114 composés correspondants à 60,7 % des composés volatils ont été identifiés chez Sarcotragus spinosulus. La majorité des composés volatils sont aromatiques, le composé principal étant le benzaldéhyde. Les constituants volatils identifiés ont des structures hydrocarbonées variées : alcools (1,3 %), aldéhydes (8,1 %), aromatiques (61,6 %), diénones (1,8 %), diones (0,2 %), énones (5,7 %), esters (0,4 %), furanes (4 %), hydrocarbones (3,7 %), cétones (6 %) et des composés soufrés (3,5 %) ; qui sont listés dans le Tableau 6.

Tableau 6 : Composés volatils identifiés par CG/SM chez l’éponge marine Sarcotragus spinosulus. IR Pic I Pic II Quantité Dev. Famille Nom du composé m. m. littér. (min) (sec) (%) Std.

Hexanol 867 12,83 2,61 traces Oct-1-en-3-ol 982 16,13 2,28 0,26 0,12

2-Ethylhexan-1-ol 1032 17,69 2,10 0,10 0,06

Linalol 1103 19,89 1,77 traces

Nonan-1-ol 1175 22,00 2,00 traces

Tridecan-3-ol 1472 29,97 1,07 traces

Alcools (0,78 %) Tetradecan-3-ol 1604 33,27 1,07 0,42 0,12 Isobutyraldéhyde 7,24 1,49 traces

Isovaleraldéhyde 660 8,25 0,56 traces

Pentanal 704 8,98 0,70 traces

Pent-2-enal 758 744 Adams 9,99 1,40 traces

3-Methylbut-2-enal 790 10,72 1,86 traces

Hexanal 804 11,00 0,98 traces

2-Ethyl-3-methylbutanal 841 12,10 0,75 traces

Hex-2-enal 857 846 Adams 12,46 1,49 0,20 0,09 Heptanal 905 901 Adams 13,84 1,03 0,34 0,07 2-Ethylhexanal 957 X 15,40 0,84 traces

Octanal 1009 16,95 1,03 0,71 0,16

(E)-Oct-2-enal 1065 18,70 1,54 0,11 0,03

Nonanal 1109 20,07 0,98 2,19 0,95

déhydes(4,91 %) (E,Z)-Nona-2,6-dienal 1161 21,63 1,72 0,14 0,02

Al (E)-Non-2-enal 1166 21,81 1,35 traces

Decanal 1211 23,10 0,98 0,68 0,20

Neral 1248 24,10 1,68 0,12 0,04

Geranial 1277 24,93 1,77 0,17 0,07

Undecanal 1311 25,85 0,98 0,26 0,06

Tridecanal 1518 31,16 0,93 traces

Pentadecanal 1722 35,84 0,93 traces

(E)-Hept-2-enal 963 traces

Benzonitrile 1000 16,68 4,57 traces

Benzaldéhyde 977 961 Adams 15,95 3,68 32,03 6,35 Phenylacetaldéhyde 1059 18,51 3,73 0,67 0,21

Salicylaldéhyde 1062 18,60 4,33 0,11 0,02

Acetophenone 1082 19,25 3,40 0,18 0,09

Phenylacetone 1141 21,08 3,26 0,20 0,08

Propiophenone 1181 22,18 2,70 0,09 0,02

1-Phenylpropane-1,2-dione 1182 22,27 3,59 0,19 0,06

Methyl phenylacetate 1186 22,36 2,94 0,09 0,02

Aromatiques(37,41 %) p-Hydroxyacetophenone 1201 22,82 1,69 traces

4-Phenylbutane-2,3-dione 1220 23,37 3,26 0,04 0,04

159

4-Phenylbutan-2-one 1258 24,47 2,98 traces

4-Phenylbut-3-en-2-one 1378 27,77 3,96 3,51 0,95

1-Phenylpent-1-en-3-one 1479 30,25 3,17 0,29 0,05

3,5-Octadien-2-one 1076 19,06 2,00 0,47 0,19 Octa-3,5-dien-2-one 1100 19,80 2,19 0,24 0,09

nones (1,06 %)

Dié 6-Methylhepta-3,5-dien-2-one 1109 20,07 2,28 0,35 0,18 Pentane-2,3-dione 700 8,80 1,03 traces

Heptane-2,3-dione 835 11,82 1,07 0,13 0,05

Diones 0,13 %)

( Octane-2,3-dione 985 16,22 1,26 traces

Pent-1-en-3-one 689 x 8,61 0,93 traces Pent-3-en-2-one 739 x 9,62 1,49 0,59 0,31 Hex-4-en-3-one 837 x 11,91 1,44 0,18 0,09

Hept-3-en-2-one 939 927 Adams 14,85 1,54 traces

6-Methylhept-5-en-2-one 987 16,31 1,40 0,78 0,44

5-Methylhept-3-en-2-one 997 16,59 1,40 0,71 0,37

5,6-Dimethylhept-5-en-2-one 1026 17,50 1,30 0,17 0,07

1-Acetylcyclohexene 1038 17,87 1,68 0,13 0,07

5,6-Dimethylhept-5-en-2-one 1041 17,96 1,26 traces

Enones(3,46 %) Non-3-en-2-one 1144 21,08 1,40 traces

5-Ethyl-6-methylhept-3-en-2-one 1146 21,17 1,17 0,25 0,10

Dec-1-en-3-one 1450 29,51 0,98 traces

trans-Geranylacetone 1455 29,70 1,21 0,65 0,10

Methyl isovalerate 775 x 10,35 0,75 0,25 0,18 Ethyl isovalerate 853 849 Adams 12,46 0,75 traces

Esters

(0,25 %) Methyl n-pentadecanoate 1775 37,30 0,89 traces

2-Methylfurane 613 7,60 1,63 traces

2-(2-propenyl)furane 800 x 10,90 1,17 traces

2-Propylfurane 810 861 Berd. 11,18 0,89 traces

Furanes 3-Furaldéhyde 820 x 11,45 5,22 2,42 0,35 (2,42 %) 2-pentylfurane 995 16,50 0,84 traces 1-Iodopentane 934 14,66 0,89 traces

Benzyl chloride 1029 17,60 2,56 traces

1,4-Dichlorobenzene 1032 17,69 1,91 traces

(traces) Heptane, 1-iodo- 1146 21,17 0,84 traces

Halogénés 1-Iodooctane 1252 24,20 0,89 traces

Hexane 600 7,42 1,30 traces 4-Methylheptane 765 10,17 0,28 traces

Toluene 774 10,35 0,89 traces

Oct-1-ene 791 10,81 0,33 traces

Octane 800 10,90 0,33 traces

2,4-Dimethyl-1-heptene 840 12,10 0,33 traces

Ethylbenzene 868 12,83 0,93 traces

Xylene 878 868 Berd. 13,10 0,93 traces

Nonane 900 13,65 0,33 traces

Styrene 902 893 Berd. 13,75 1,49 0,15 0,02 Decane 1000 16,68 0,33 traces

Limonene 1041 17,96 0,65 traces

2,6-dimethyloctane 1059 18,51 0,37 0,20 0,05

Hydrocarbones (2,22 %) Undecane 1100 19,80 0,33 traces

Dodecane 1200 22,82 0,33 traces

Tridecane 1300 25,66 0,37 traces

Tetradecane 1400 28,32 0,33 traces

Pentadecane 1500 30,80 0,37 traces

3-Methylenetridecane 1588 32,90 1,03 0,33 0,16

160

Hexadecane 1600 33,18 0,42 traces

Heptadecane 1700 35,47 0,42 0,71 0,84

Octadecane 1800 37,49 0,51 0,82 0,32 Acétone 6,78 1,54 traces

Butan-2-one 605 597 Berd. 7,42 1,72 traces

Pentan-2-one 693 8,70 0,70 traces

Hexan-2-one 749 9,62 0,79 traces

Heptan-2-one 891 889 Adams 13,38 1,07 0,13 0,04 4-Methylheptan-2-one 939 14,85 0,98 traces

6-Methylheptan-2-one 957 x 15,40 1,03 0,33 0,10 3-Methylcyclohexanone 966 945 Adams 15,67 1,68 traces

Octan-2-one 994 16,50 1,12 0,95 0,23

Nonan-2-one 1094 19,61 1,03 0,98 0,19 Cétones(5,95 %) Decan-2-one 1195 22,64 1,03 1,08 0,43

Undecan-2-one 1295 25,57 0,98 0,18 0,10

Tridecan-3-one 1493 30,61 0,89 0,47 0,11

Tetradecan-3-one 1592 33,00 0,93 1,83 0,42

Methyl isothiocyanate 743 x 9,71 2,61 0,10 0,14 Soufrés 3-(Methylthio)propanal 915 901 Adams 14,11 3,59 0,14 0,05 (2,10 %) Methy benzyl sulfide + Ethyl benzoate 1187 22,36 2,19 1,87 0,33

IR moyen : indice de rétention moyen ; IR: indice de rétention ; m. m. : mesure moyenne de l’indice de rétention ; Littér : indice de rétention dans la littérature ; Quantité (%) : pourcentages des composés par rapport à tous les composés volatils de l’éponge ; Dev. std. : déviation standard de la moyenne des quantités des composés ; Adams : Adams, 1995 ; Berd. : Berdagué et al., 1991.

Pour Ircinia dendroides, 91 composés correspondants à 44,2 % des composés volatils de l’éponge ont été identifiés. La majorité des composés volatils est représentée par des furanes puis des aromatiques, le 2-propylfurane étant le composé principal. Les constituants volatils identifiés sont des : alcools (0,7 %), aldéhydes (9,1 %), aromatiques (20,1 %), diénones (0,9 %), diones (0,3 %), énones (6,8 %), esters (0,2 %), furanes (31,7 %),composés halogénés (1,9 %), hydrocarbones (10,9 %), cétones (6,9 %) et composés soufrés (3,6 %) ; qui sont listés dans le Tableau 7.

Tableau 7 : Composés volatils identifiés par CG/SM chez l’éponge marine Ircinia dendroides. IR Pic I Pic II Quantité Dev. Famille Nom du composé m. m. littér. (min) (sec) (%) Std. Ethanol 6,69 0,75 traces Butan-1-ol 666 653 Berd. 8,34 1,91 traces

Pentan-1-ol 765 762 Adams 10,17 2,52 0,07 0,02 Oct-1-en-3-ol 982 16,13 2,28 0,24 0,05

2,6-dimethylcyclohexanol 1000 16,68 1,91 traces

Alcools (0,31 %) 2-Ethylhexan-1-ol 1032 17,69 2,10 traces Isovaleradehyde 607 7,51 0,61 traces

But-2-enal 653 657 Berd. 8,15 1,17 0,24 0,06 Pent-2-enal 758 744 Adams 9,99 1,40 0,39 0,04 Hexanal 804 11,00 0,98 traces

Hex-2-enal 857 846 Adams 12,46 1,49 0,61 0,10 Heptanal 905 901 Adams 13,84 1,03 0,23 0,06

Aldéhydes(4,01 %) (E,E)-2,4-Hexadienal 918 14,20 2,75 0,03 0,03

161

2-Ethylhexanal 957 x 15,40 0,84 0,23 0,09 Octanal 1009 16,95 1,03 0,63 0,24

Nonanal 1109 20,07 0,98 0,48 0,27

(E,Z)-Nona-2,6-dienal 1161 21,63 1,72 0,20 0,06

(E)-Non-2-enal 1166 21,81 1,35 0,18 0,04

Decanal 1211 23,10 0,98 0,37 0,15

beta-Cyclocitral 1239 23,92 1,49 0,17 0,03

Undecanal 1311 25,85 0,98 0,24 0,04

Benzaldéhyde 977 961 Adams 15,95 3,68 10,82 4,10

Phenylacetaldéhyde 1059 18,51 3,73 0,34 0,05

Phenylacetone 1141 21,08 3,26 0,04 0,03

1-Phenylpropane-1,2-dione 1182 22,27 3,59 0,07 0,05

(11,97 %) 4-Phenylbutan-2-one 1258 24,47 2,98 traces Aromatiques 4-Phenylbut-3-en-2-one 1378 27,77 3,96 0,71 0,04

3,5-Octadien-2-one 1076 19,06 2,00 0,14 0,03 Diénones (0,41 %) Octa-3,5-dien-2-one 1100 19,80 2,19 0,27 0,06

Diones Octane-2,3-dione 985 16,22 1,26 0,15 0,06 (0,15 %) Pent-1-en-3-one 689 x 8,61 0,93 0,22 0,13 Pent-3-en-2-one 739 x 9,62 1,49 0,93 0,07 Hex-4-en-3-one 837 x 11,91 1,44 0,41 0,01 Hept-3-en-2-one 939 927 Adams 14,85 1,54 traces

6-Methylhept-5-en-2-one 987 16,31 1,40 0,45 0,05

5-Methylhept-3-en-2-one 997 16,59 1,40 0,17 0,04

5-Ethyl-6-methylhept-3-en-2-one 1146 21,17 1,17 0,23 0,02

Enones(3,00 %) Alpha-Ionone 1437 29,15 1,40 0,09 0,04

trans-Geranylacetone 1455 29,70 1,21 0,33 0,08

Beta-Ionone 1496 30,70 1,44 0,17 0,08

Methyl isovalerate 775 x 10,35 0,75 0,10 0,01

Ethyl isovalerate 853 849 Adams 12,46 0,75 traces

2-Propenoic acid, 2-methyl-, butyl ester 979 16,04 0,89 traces Esters (0,10 %) Methyl n-pentadecanoate 1775 37,30 0,89 traces 2-Ethylfurane 700 702 Adams 8,80 1,82 0,21 0,01

2-(2-propenyl)furane 800 x 10,90 1,17 0,13 0,13

2-Propylfurane 810 861 Berd. 11,18 0,89 12,71 4,20 3-Furaldéhyde 820 x 11,45 5,22 0,49 0,09 Furfuryl alcool 867 868 Berd. 12,65 3,08 traces

2-pentylfurane 995 16,50 0,84 0,10 0,02

2-Propionylfurane 1006 16,86 3,64 traces

3-Pentylfurane 1015 17,14 0,93 0,10 0,02 Furanes(13,98 %) 4-(5-methyl-2-furanyl)butan-2-one 1155 21,45 2,56 0,09 0,05

E-2-Methyl-5-(fur-3-yl)-pent-2-enal 1352 27,04 3,12 0,13 0,06

Dichloromethane 6,96 3,64 0,65 0,30 1-Iodopentane 934 14,66 0,89 0,18 0,05

Benzyl chloride 1029 17,60 2,56 traces

(0,83 %)

Halogénés Heptane, 1-iodo- 1146 21,17 0,84 traces Hexane 600 7,42 1,30 0,18 0,13

Heptane 700 8,80 0,23 traces

Toluene 774 10,35 0,89 tr

Octane 800 10,90 0,33 3,75 0,25

Xylene 878 868 Berd. 13,10 0,93 0,16 0,02 Nonane 900 13,65 0,33 traces

Styrene 902 893 Berd. 13,75 1,49 traces

1-Ethyl-3-methylbenzene 970 x 15,76 0,98 0,15 0,02

Hydrocarbones (4,81 %) Decane 1000 16,68 0,33 traces

162

Undecane 1100 19,80 0,33 traces

Dodecane 1200 22,82 0,33 traces

Tridecane 1300 25,66 0,37 0,05 0,02

Tetradecane 1400 28,32 0,33 traces

Pentadecane 1500 30,80 0,37 traces

Hexadecane 1600 33,18 0,42 traces

Heptadecane 1700 35,47 0,42 0,52 0,26

Acetone 6,78 1,54 0,42 0,20 Butan-2-one 605 597 Berd. 7,42 1,72 traces

Hexan-2-one 749 9,62 0,79 traces

Heptan-2-one 891 889 Adams 13,38 1,07 0,13 0,01 6-Methylheptan-2-one 957 x 15,40 1,03 0,25 0,06 3-Methylcyclohexanone 966 945 Adams 15,67 1,68 traces

Octan-3-one 988 16,31 0,98 traces

Octan-2-one 994 16,50 1,12 0,44 0,05

2,6-Dimethylcyclohexanone 1012 17,05 1,26 0,13 0,01

étones(3,03 %)

C Nonan-2-one 1094 19,61 1,03 0,86 0,06

Decan-2-one 1195 22,64 1,03 0,54 0,05

Undecan-3-one 1290 25,39 0,89 traces

Undecan-2-one 1295 25,57 0,98 0,27 0,05

Tetradecan-2-one 1596 33,09 0,84 traces

Methyl isothiocyanate 743 x 9,71 2,61 0,45 0,04

3-(Methylthio)propanal 915 901 Adams 14,11 3,59 0,14 0,12 Soufrés (1,57 %) Methy benzyl sulfide + Ethyl benzoate 1187 22,36 2,19 0,98 0,06

IR moyen : indice de rétention moyen ; IR: indice de rétention ; m. m. : mesure moyenne de l’indice de rétention; Littér : indice de rétention dans la littérature ; Quantité (%) : pourcentages des composés par rapport à tous les composés volatils de l’éponge ; Dev. std. : déviation standard de la moyenne des quantités des composés ; Adams : Adams, 1995 ; Berd. : Berdagué et al., 1991.

Concernant Ircinia oros, 84 composés correspondants à 51 % des composés volatils de l’éponge ont été identifiés. La majorité des composés volatils sont aromatiques, le composé principal étant le benzaldéhyde, puis les furanes avec le composé 3-furaldéhyde. Les constituants volatils identifiés sont des : alcools (0,8 %), aldéhydes (12,2 %), aromatiques (39,1 %), diénones (0,9 %), diones (1,6 %), énones (9,6 %), esters (8,5 %), furanes (13,2 %), composés halogénés (0,2 %), hydrocarbures (2 %), cétones (9,1 %) et composés soufrés (3,7 %) ; qui sont listés dans le Tableau 8.

Tableau 8 : Composés volatils identifiés par CG/SM chez l’éponge marine Ircinia oros.

IR Pic I Pic II Quantité Dev. Famille Nom du composé m. m. littér. (min) (sec) (%) Std. Acides Isobutyric acid 839 12,10 0,93 traces (traces) Ethanol 6,69 0,75 traces Alcools Oct-1-en-3-ol 982 16,13 2,28 0,28 0,23 (0,43 %) 2-Ethylhexan-1-ol 1032 17,69 2,10 0,15 0,13

163

Isovaleraldéhyde 660 8,25 0,56 traces

Pent-2-enal 758 744 Adams 9,99 1,40 0,31 0,15 3-Methylbut-2-enal 790 10,72 1,86 traces

Hexanal 804 11,00 0,98 0,41 0,17

2-Ethyl-3-methylbutanal 841 12,10 0,75 traces

Hex-2-enal 857 846 Adams 12,46 1,49 traces

Heptanal 905 901 Adams 13,84 1,03 1,57 0,29 2-Ethylhexanal 957 x 15,40 0,84 0,91 0,14 Octanal 1009 16,95 1,03 1,02 0,22

(E)-Oct-2-enal 1065 18,70 1,54 traces

Nonanal 1109 20,07 0,98 0,85 0,05

(E,Z)-Nona-2,6-dienal 1161 21,63 1,72 traces

Aldéhydes(6,22 %) (E)-Non-2-enal 1166 21,81 1,35 traces

Decanal 1211 23,10 0,98 0,51 0,10

Undecanal 1311 25,85 0,98 0,09 0,01

Dodecanal 1415 28,69 0,84 0,08 0,02

Tridecanal 1518 31,16 0,93 0,19 0,01

Tetradecanal 1620 33,64 0,84 0,10 0,03

Pentadecanal 1722 35,84 0,93 0,18 0,03

4-Ethylphenol 921 14,30 1,07 traces Benzaldéhyde 977 961 Adams 15,95 3,68 17,08 1,69

Phenylacetaldéhyde 1059 18,51 3,73 0,84 0,32

Acetophenone 1082 19,25 3,40 0,12 0,02

Phenylacetone 1141 21,08 3,26 0,06 0,03

1-Phenylpropane-1,2-dione 1182 22,27 3,59 0,05 0,03

Methyl phenylacetate 1186 22,36 2,94 0,39 0,12

p-Hydroxyacetophenone 1201 22,82 1,69 traces

4-Phenylbutane-2,3-dione 1220 23,37 3,26 traces

Ethyl phenylacetate 1252 24,29 2,28 traces

Aromatiques(19,98 %) 4-Phenylbutan-2-one 1258 24,47 2,98 traces

4-Phenylbut-3-en-2-one 1378 27,77 3,96 1,39 0,33

1-Phenylpent-1-en-3-one 1479 30,25 3,17 0,04 0,04 Pentane-2,3-dione 700 8,80 1,03 0,10 0,09

Heptane-2,3-dione 835 11,82 1,07 0,38 0,16

Diones

(0,80 %) Octane-2,3-dione 985 16,22 1,26 0,32 0,04

Pent-3-en-2-one 739 x 9,62 1,49 3,33 0,70

2-Methyl-2-pentene-4 one ou Hex-3-en-2-one 803 11,00 1,21 traces

Hex-4-en-3-one 837 x 11,91 1,44 0,54 0,12 Hept-3-en-2-one 939 927 Adams 14,85 1,54 traces

6-Methylhept-5-en-2-one 987 16,31 1,40 0,67 0,09

5-Methylhept-3-en-2-one 997 16,59 1,40 traces

1-Acetylcyclohexene 1038 17,87 1,68 0,16 0,05

Enones(4,92 %) 5,6-Dimethylhept-5-en-2-one 1041 17,96 1,26 traces

trans-Geranylacetone 1455 29,70 1,21 0,22 0,05 Methyl isovalerate 775 x 10,35 0,75 2,43 1,41 Esters (4,35 %) Ethyl isovalerate 853 849 Adams 12,46 0,75 1,46 0,65 Methyl n-pentadecanoate 1775 37,30 0,89 0,46 0,19

2-Methylfurane 613 7,60 1,63 traces %) 2-Propylfurane 810 861 Berd. 11,18 0,89 0,32 0,16 3-Furaldéhyde 820 x 11,45 5,22 6,40 3,35 Furfural 823 11,55 5,08 traces

Furfuryl alcool 867 868 Berd. 12,65 3,08 traces

Furanes(6,72 2-pentylfurane 995 16,50 0,84 traces Halo- Benzyl chloride 1029 17,60 2,56 0,10 0,06 génés

164

(0,10 %)

4-Methylheptane 765 10,17 0,28 traces Octane 800 10,90 0,33 0,53 0,12

Ethylbenzene 868 12,83 0,93 traces

Xylene 878 868 Berd. 13,10 0,93 0,30 0,09 Nonane 900 13,65 0,33 traces

Trimethylbenzene 979 16,04 0,98 0,18 0,10

Decane 1000 16,68 0,33 traces

Limonene 1041 17,96 0,65 traces

Hydrocarbones (1,01 %) Pentadecane 1500 30,80 0,37 traces Butan-2-one 605 597 Berd. 7,42 1,72 traces

Pentan-2-one 693 8,70 0,70 traces

4-Methylpentan-2-one 739 9,62 0,79 traces

Hexan-2-one 749 9,62 0,79 traces

Heptan-2-one 891 889 Adams 13,38 1,07 0,36 0,08 4-Methylheptan-2-one 939 14,85 0,98 0,35 0,04

6-Methylheptan-2-one 957 x 15,40 1,03 0,86 0,09 3-Methylcyclohexanone 966 945 Adams 15,67 1,68 traces

étones(4,63 %) Octan-2-one 994 16,50 1,12 1,13 0,19

C Nonan-2-one 1094 19,61 1,03 0,92 0,21

Decan-2-one 1195 22,64 1,03 0,67 0,21

Undecan-2-one 1295 25,57 0,98 0,23 0,08

Hexan-2-one 791 0,10 0,01

Methyl isothiocyanate 743 x 9,71 2,61 1,07 0,24 Soufrés 3-(Methylthio)propanal 915 901 Adams 14,11 3,59 0,25 0,10 (1,90 %) Methy benzyl sulfide + Ethyl benzoate 1187 22,36 2,19 0,59 0,23

IR moyen : indice de rétention moyen ; IR: indice de rétention ; m. m. : mesure moyenne de l’indice de rétention; Littér : indice de rétention dans la littérature ; Quantité (%) : pourcentages des composés par rapport à tous les composés volatils de l’éponge ; Dev. std. : déviation standard de la moyenne des quantités des composés ; Adams : Adams, 1995 ; Berd. : Berdagué et al., 1991.

Pour Ircinia variabilis, 87 composés correspondants à 56 % des composés volatils de l’éponge, ont été identifiés. La majorité des composés volatils sont cétones, avec le octan-2- one suivis des aromatiques avec le benzaldéhyde, puis des aldéhydes. Les constituants volatils identifiés sont des : alcools (1,6 %), aldéhydes (14 %), aromatiques (28,4 %), diénones (0,4 %), diones (0,6 %), énones (4,7 %), esters (0,7 %), furanes (2,2 %), composés halogénés (0,2 %), hydrocarbures (5,4 %), cétones (41,6 %) et des composés soufrés (0,4 %) ; qui sont listés dans le Tableau 9.

Tableau 9 : Composés volatils identifiés par CG/SM chez l’éponge marine Ircinia variabilis.

IR Pic I Pic II Quantité Dev. Famille Nom du composé m. m. littér. (min) (sec) (%) Std.

Pentan-1-ol 765 762 Adams 10,17 2,52 0,07 0,04 Oct-1-en-3-ol 982 16,13 2,28 0,16 0,01

2-Ethylhexan-1-ol 1032 17,69 2,10 traces

Alcools (0,92 %) Tridecan-3-ol 1472 29,97 1,07 0,69 0,07

165

But-2-enal 653 657 Berd. 8,15 1,17 0,81 0,36 Isovaleraldéhyde 660 8,25 0,56 0,24 0,25

Pentanal 704 8,98 0,70 0,34 0,20

2-Methylbut-2-enal 743 9,71 1,21 traces

Pent-2-enal 758 744 Adams 9,99 1,40 0,35 0,05 3-Methylbut-2-enal 790 10,72 1,86 0,18 0,15

Hexanal 804 11,00 0,98 0,43 0,10

2-Ethylbut-2-enal 823 11,55 1,21 0,02 0,01

Hex-2-enal 857 846 Adams 12,46 1,49 1,01 0,18 Hept-4-enal 903 13,75 1,30 Traces

Heptanal 905 901 Adams 13,84 1,03 0,80 0,13 (E,E)-2,4-Hexadienal 918 14,20 2,75 0,14 0,10

2-Ethylhexanal 957 X 15,40 0,84 Traces

Octanal 1009 16,95 1,03 1,10 0,16

Aldéhydes(7,85 %) (E)-Oct-2-enal 1065 18,70 1,54 0,13 0,01

Nonanal 1109 20,07 0,98 0,81 0,52

(E,Z)-Nona-2,6-dienal 1161 21,63 1,72 0,24 0,01

(E)-Non-2-enal 1166 21,81 1,35 0,16 0,01

Decanal 1211 23,10 0,98 0,56 0,06

beta-Cyclocitral 1239 23,92 1,49 0,30 0,07

Undecanal 1311 25,85 0,98 0,22 0,12

Dodecanal 1415 28,69 0,84 Traces

(E)-Hept-2-enal 963 Traces Benzonitrile 1000 16,68 4,57 0,04 0,01

Benzaldéhyde 977 961 Adams 15,95 3,68 14,08 5,27

Phenylacetaldéhyde 1059 18,51 3,73 0,17 0,05

Acetophenone 1082 19,25 3,40 0,08 0,01

6 Methyl benzoate 1109 20,07 2,56 0,12 0,04

Phenylacetone 1141 21,08 3,26 0,05 0,02

Ethyl benzoate 1182 22,27 2,10 0,50 0,06

iques(15,9 1-Phenylpropane-1,2-dione 1182 22,27 3,59 0,06 0,06

Methyl phenylacetate 1186 22,36 2,94 0,16 0,03

Ethyl phenylacetate 1252 24,29 2,28 0,15 0,09

Aromat 4-Phenylbutan-2-one 1258 24,47 2,98 Tr

4-Phenylbut-3-en-2-one 1378 27,77 3,96 0,55 0,06

Benzophenone 1664 34,65 3,64 Traces Diénones 3,5-Octadien-2-one 1076 19,06 2,00 0,21 0,02 (0,21 %) Hexane-2,3-dione 783 10,35 0,84 0,21 0,09 Diones Heptane-2,3-dione 835 11,82 1,07 Traces (0,32 %) Octane-2,3-dione 985 16,22 1,26 0,11 0,02

Pent-1-en-3-one 689 X 8,61 0,93 0,31 0,26 Pent-3-en-2-one 739 X 9,62 1,49 0,77 0,09 2-Methyl-2-pentene-4 one ou Hex-3-en-2-one 803 11,00 1,21 Traces

Hex-4-en-3-one 837 X 11,91 1,44 0,30 0,02 Hept-3-en-2-one 939 927 Adams 14,85 1,54 Traces Enones 6-Methylhept-5-en-2-one 987 16,31 1,40 0,19 0,03 (2,62 %) 5-Methylhept-3-en-2-one 997 16,59 1,40 0,21 0,04

5-Ethyl-6-methylhept-3-en-2-one 1146 21,17 1,17 Traces

Alpha-Ionone 1437 29,15 1,40 0,07 0,00

trans-Geranylacetone 1455 29,70 1,21 0,20 0,01

Beta-Ionone 1496 30,70 1,44 0,58 0,17

Esters Ethyl isovalerate 853 849 Adams 12,46 0,75 0,41 0,13 (0,41 %) Furanes 2-Ethylfurane 700 702 Adams 8,80 1,82 0,13 0,07

166

(1,23 %) 3-Ethylfurane 713 9,07 3,03 Traces

3-Methylfurane 757 9,99 2,19 Traces

2-Propylfurane 810 861 Berd. 11,18 0,89 0,38 0,21 3-Furaldéhyde 820 X 11,45 5,22 0,13 0,04 Furfuryl alcool 867 868 Berd. 12,65 3,08 Traces

2-pentylfurane 995 16,50 0,84 0,16 0,03

3-(2-furanyl)pent-3-en-2-one 1248 24,20 4,15 0,09 0,03

E-2-Methyl-5-(fur-3-yl)-pent-2-enal 1352 27,04 3,12 0,36 0,06

Halogénés 1-Iodopentane 934 14,66 0,89 0,08 0,02 (0,08 %) Hexane 600 7,42 1,30 0,53 0,55

Toluene 774 10,35 0,89 0,08 0,11

Xylene 878 868 Berd. 13,10 0,93 0,10 0,01 Styrene 902 893 Berd. 13,75 1,49 0,12 0,02

(3,01 %) Pentadecane 1500 30,80 0,37 0,20 0,14

Hydrocarbones Heptadecane 1700 35,47 0,42 1,99 1,53

Hexan-2-one 749 9,62 0,79 0,13 0,07

Heptan-2-one 891 889 Adams 13,38 1,07 0,10 0,02

4-Methylheptan-2-one 939 14,85 0,98 0,07 0,05

6-Methylheptan-2-one 957 X 15,40 1,03 0,17 0,01 3-Methylcyclohexanone 966 945 Adams 15,67 1,68 Traces

Octan-2-one 994 16,50 1,12 18,60 2,81

2,2,6-trimethylcyclohexanone 1050 18,24 1,07 Traces

étones(23,24 %) Nonan-2-one 1094 19,61 1,03 1,09 0,40 C Decan-2-one 1195 22,64 1,03 0,40 0,13

Undecan-2-one 1295 25,57 0,98 0,50 0,17

Methyl isothiocyanate 743 X 9,71 2,61 0,13 0,04

Dimethyldisulfide 748 9,80 3,91 Traces

Dimethyldisulfide 748 9,80 4,85 Traces

Soufrés Dimethyldisulfide 748 9,80 5,27 Traces (0,22 %) 3-(Methylthio)propanal 915 901 Adams 14,11 3,59 0,09 0,04

IR moyen : indice de rétention moyen ; IR: indice de rétention ; m. m. : mesure moyenne de l’indice de rétention; Littér : indice de rétention dans la littérature ; Quantité (%) : pourcentages des composés par rapport à tous les composés volatils de l’éponge ; Dev. std. : déviation standard de la moyenne des quantités des composés ; Adams : Adams, 1995 ; Berd. : Berdagué et al., 1991.

Globalement, les mêmes familles chimiques ont été trouvées chez les quatre espèces de la famille des Irciniidae méditerranéennes analysées : Sarcotragus spinosulus, Ircinia dendroides, Ircinia oros et Ircinia variabilis. Ces mêmes familles de composés ont également été trouvées dans une Ircinia felix récoltée en Colombie sur les côtes Caraïbes (Duque et al., 2001), bien que la méthode d’extraction de cette dernière soit différente (D-HS). Le benzaldéhyde est l’élément majoritaire de toutes les espèces, cependant, l’occurrence de certains éléments, ainsi que leurs taux d’expression, semblent spécifiques (Figure 132).

167

Ircinia dendroides Sarcotragus spinosulus Alcools Aldéhydes Alcools Aromatiques Aldéhydes Esters Aromatiques Furanes Esters Furanes Halogénés Halogénés Hydrocarbones Hydrocarbones Cétones Cétones Soufrés Soufrés Acides Acides Enones Enones Dienones Dienones Diones Diones

Ircinia variabilis Ircinia oros Alcools Alcools Aldéhydes Aldéhydes Aromatiques Aromatiques Esters Esters Furanes Furanes Halogénés Halogénés Hydrocarbones Hydrocarbones Cétones Cétones Soufrés Soufrés Acides Acides Enones Enones Dienones Dienones Diones Diones

Ircini felix (d'après Duque et al., 2001)

Alcools Aldéhydes Aromatiques Esters Furanes Halogénés Hydrocarbones Cétones Soufrés Acides Enones Dienones Diones

Figure 132 : Pourcentage d’occurrence des différentes familles de composés caractéristiques des Irciniidae.

Au niveau spécifique, les composés majoritaires sont :  le benzaldéhyde (aromatique) pour Sarcotragus spinosulus ;  une prédominance d’un furane : le 2-propylfurane, ainsi que le benzaldéhyde pour Ircinia dendroides ;  l’octan-2-one (cétone) ainsi que le benzaldéhyde pour Ircinia variabilis ;

168

 un léger taux de furane (3-furaldéhyde) et le benzaldéhyde pour Ircinia oros.

Les composés aromatiques : Parmis les composés aromatiques, le benzaldéhyde est trouvé majoritairement au niveau des Irciniidae méditerranéennes étudiées. Ce composé a également été trouvé au niveau de Ircinia felix récoltée dans les Caraïbes (Duque et al., 2001). Sa présence peut être soit d’origine anthropique, soit d’origine biogénique ; il serait alors un métabolite qui aurait un rôle écologique ou son précurseur, ou serait un produit de dégradation d’autres composés. Dans ce cas, les Irciniidae pdémontreraient une forte capacité de bioaccumulation de ce composé qui pourrait alors être un bon bioindicateur. L’origine biogénique ou anthropique du benzaldéhyde pourrait être vérifiée : soit par des analyses isotopiques, soit par des expériences en aquarium où des éponges témoins ne subiraient aucune contamination anthropique. Le benzaldéhyde est un composé qui s’auto-oxyde facilement à l’air libre et à température ambiante pour donner un acide benzoïque dont l’odeur est désagréable. Au cours de nos analyses, l’acide benzoïque n’a pas été détecté. Ceci pouvant être due à sa polarité élevée vis- à-vis de la fibre SPME utilisée. Dans le cas où l’origine anthropique du benzaldéhyde est prouvée, la présence éventuelle de l’acide benzoïque pourrait contribuer à l’odeur désagréable de cette famille d’éponge, en plus des autres composés soufrés détectés. Par ailleurs, Sarcotragus spinolusus est l’éponge parmi les quatre étudiées qui présente la plus large diversité de composés aromatiques oxygénés, ce qui pourrait être relié à la présence importante de dérivés quinones polyprénylées parmi les métabolites secondaires plus lourds.

Les furanes : Les furanes sont trouvés dans leurs plus grandes proportions au niveau de I. oros et I. dendroides. Ils sont également présents au niveau de I. variabilis et S. spinosulus en de plus faibles proportions, et leur présence a été détectée chez I. felix des Caraïbes (Duques et al., 2001). Les furanes sont des composés très réactifs et seraient donc à l’origine de certaines molécules. Leur occurrence en tant que produits de dégradation des acides tétroniques furanoterpéniques est envisagée. La présence de composés volatils de plus haut poids moléculaire tels que la 3-(2-furanyl)pent-3-én-2-one (RI 1248) et le 2-méthyl-5-(fur-3-yl)- pent-2-énal (1352), identifiés dans I. variabilis, permet d’étayer cette hypothèse.

169

Les hydrocarbures :

Les dérivés hydrocarbures dans l’environnement marin peuvent être classés en deux catégories : (i) les hydrocarbones biogéniques synthétisés par les organismes marins, tels que les poissons téléostéens, le plancton et les algues, mais ces composés biogéniques ne sont pas très abondants ; (ii) et les hydrocarbones exogéniques (anthropiques) présents dans la mer et provenant de l’atmosphère, du trafic maritime, des accidents de pétroliers, des raffineries et des stations d’épuration des villes. Les organismes marins sont capables d’accumuler les composés hydrocarbures d’origine anthropique dans leurs corps et en subir des troubles physiologiques (Miranov et al., 1981). Les hydrocarbures obtenus chez les Irciniidae méditerranéennes étudiées sont non-oxygénés dans leur majorité, ce constat est en accord avec les résultats obtenus pour Plakortis angulospiculatus (Roussis et Mazomenos, 1989) et Ircinia felix (Duque et al., 2001).

Les cétones : En dehors des composés hydrocarbures, aromatiques et des aldéhydes, les cétones forment une importante classe de composés volatils. L’octanone trouvé majoritairement dans I. variabilis, provient de l’oxydation d’acides gras. Son origine exacte reste inconnue puisqu’elle peut être produite par l’oxydation de divers acides gras.

Les aldéhydes : Le groupe des aldéhydes : Isobutyraldehyde, Isovaleradehyde, But-2-enal, Isovaleraldehyde, Pentanal, 2-Methylbut-2-enal, Pent-2-enal, 3-Methylbut-2-enal, Hexanal, 2-Ethylbut-2-enal, 2-Ethyl-3-methylbutanal, Hex-2-enal, Hept-4-enal, Heptanal, (E,E)-2,4-Hexadienal, 2- Ethylhexanal, Octanal, (E)-Oct-2-enal, Nonanal, (E,Z)-Nona-2,6-dienal, (E)-Non-2-enal, Decanal, beta-Cyclocitral, Neral, Geranial, Undecanal, Dodecanal, Tridecanal, Tetradecanal, Pentadecanal et (E)-Hept-2-enal) ; existe dans les différentes espèces étudiées. Parmi les différents composés, de nombreux sont sans doute issus de la dégradation d’acides gras poly- insaturés par auto-oxydation ou par action de certaines enzymes telles que les lipoxygénases. Ces aldéhydes sont fortement répandus dans la mesure où ils ont été recensés dans d’autres organismes marins, tels que des algues chlorophytes et phaeophytes (Sugisawa et al., 1990 ; Takahashi et al., 2002), les homards (Lee et al., 2001) et les huitres (Piveteau et al., 2000 ; Pennarunet al., 2002).

170

Des études ont montré que parmi les aldéhydes, l’hexanal, l’hexenal, l’octanal et le nonanal, sont formés par la peroxydation des lipides et peuvent provenir de l’acide linolénique (Enoiu et al., 2000). Ils peuvent provenir également d’autres acides gras poly-insaturés qui semblent être les substrats d’une oxydation enzymatique, conduisant principalement à des aldéhydes et à des alcools (Figure 133).

Figure 133 : Dégradation enzymatique d’un acide gras insaturé (acide linoléique) par la lipoxygénase conduisant à un aldéhyde (hexanal) puis à un alcool (hexanol).

Les alcools : Les alcools possèdent souvent d’importantes fonctions allélopathiques. Les alcools phénoliques, qui ont des propriétés antibactériennes et antimycotiques, possèdent des fonctions de défenses au sein de l’éponge. Ils sont présents dans les composés volatils de bivalves (Chung et al., 2001) et d’algues (Kamenarska et al., 2000), et sont probablement fortement répandus dans la mer. De nombreux alcools sont présents dans les Irciniidae tels que le Butan-1-ol, le Pentan-1-ol et l’Hexanol. Le Butan-1-ol a été décrit à partir d’une algue phaeophytes (Takahashi et al., 2002) mais son origine n’a pas été discutée. Il peut être formé par décomposition d’hydroperoxydes secondaires d’acides gras, comme pour le Pentan-1-ol et l’Hexanol (Tanchotikul et Hsieh), ou par réduction des aldéhydes correspondants (Larrayoz et al., 2001).

Les halogénés : Ce groupe comprend le dichlorométhane, le 1-iodopentane, le chlorure de benzyle, le 1,4- dichlorobenzène, le 1-iodoheptane et le 1-iodooctane. Ces composés sont très rares chez les macrophytes terrestres. Ils occupent une faible proportion dans les éponges Irciniidae étudiées et sont inexistants chez Sarcotragus spinosulus. Le taux le plus élevé est observé chez Ircinia dendroides. Ce type de dérivés halogénés est en général caractéristique des algues rhodophytes (Itoet al., 1989). Les phaeophytes sont également une source de dérivés halogénés et en particulier iodés. La présence de ces composés chez les organismes marins est due à l’importante concentration de Cl et I dans l’eau de mer.

171

Les soufrés : L’odeur caractéristique de cette famille provient surtout des composés soufrés qui ne constituent qu’une faible proportion du total des composés volatils : 2,10 % (S. spinosulus), 1,57 % (I. dendroides), 1,90 % (I. oros) et 0,22 % (I. variabilis). Parmi les composés soufrés, le composé majoritaire est le sulfure de méthyle benzyle, avec le benzoate d’éthyle chez S. spinosulus et I. dendroides, et le isothiocyanate de méthyle chez I. oros et I. variabilis. Ce dernier composé est aussi responsable de l’odeur d’I. felix avec le thiobismethane (ou sulfure de diméthyle) et le isocyanure de méthyle qui n’ont pas été détectés dans les Irciniidae de Méditerranée (Christophersen et al., 1989 ; Duque et al., 2001).

Les analyses des éponges étudiées ont toutes révélé des taux importants de composés inconnus. Beaucoup d’entre eux sont communs aux quatre éponges et sont encore en cours d’étude. Par ailleurs, il est important de rappeler que l’extraction par SPME ne permet pas de fournir de véritables données quantitatives, et les pourcentages indiqués pour chaque constituant ne correspondent pas à leur teneur réelle dans l’éponge. Cependant, le processus global d’extraction/analyse ayant été réalisé dans des conditions identiques pour chaque échantillon, il est possible d’utiliser ces résultats à titre purement comparatif.

Enfin, dans un souci d’assurer la fiabilité et la représentativité des résultats présentés dans ce chapitre, il est important pour la suite de cette étude d’étudier la variabilité chimique des composés volatils au sein d’une même espèce.

5. Conclusions et perspectives

La microextraction en phase solide (SPME) de l’espace de tête démontre une très bonne capacité d’extraction et de concentration des composés volatils tout en gardant une grande sensibilité avec un faible taux d’artefacts. L’utilisation de fibres SPME permet d’éviter l’utilisation des techniques classiques telle que la distillation par vapeur, et la préparation des échantillons peut être effectuée dans un temps minimal. A ce jour, la littérature sur les substances volatiles des spongiaires est succincte. Cette étude a permis d’élargir les connaissances sur la composition en composés de faibles poids moléculaires des éponges Irciniidae, celle du genre Sarcotragus en particulier, dont la

172 composition en composés volatils n’a jamais été étudiée. De même, la comparaison des différentes empreintes chimiques des composés volatils des espèces étudiées montre la présence de familles de composés caractéristiques des Irciniidae, avec une variation de l’abondance de ces composés. Le sulfure de méthyle benzyle avec le benzoate d’éthyle seraient responsables de l’odeur nauséabonde chez S. spinosulus et I. dendroides, alors qu’il s’agirait d’isothiocyanate de méthyle chez I. oros et I. variabilis (Duque et al., 2001). Ce dernier semble être responsable, avec deux autres composés, de l’odeur d’I. felix (Duque et al., 2001) et de celle Halichondria panicea (Christophersen et al., 1989). Les composés volatils des spongiaires qui jouent un rôle non négligeable dans la signalisation chimique en écologie marine (Beveridge et al., 1995 ; Zea et al., 1999; Duque et al., 2001 ; Pawlik et al., 2002), offrent de nombreuses possibilités de recherches futures pour mieux comprendre les influences du biotope ainsi que les relations inter et intra-spécifiques des espèces. Les composés volatils ont de plus un effet sur les cycles biogéochimiques puisque plusieurs des composés clefs émis influencent la composition de l’atmosphère et le climat global (Steinke et al., 2002). De ce fait, la caractérisation des composés volatils des différentes espèces est très importante. Elle nécessite la mise au point des meilleures conditions de leur extraction, ainsi que de leur criblage, pour pouvoir effectuer ultérieurement des études des différentes interactions écologiques, ainsi que des études biogéochimiques.

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IV. ETUDE COMPARATIVE DE LA BIOACCUMULATION D’ELEMENTS TRACES METALLIQUES PAR LES IRCINIIDAE EN MEDITERRANEE

1. Introduction générale

La Méditerranée recèle une biodiversité marine exceptionnelle puisqu'elle représente 8 à 9 % de la diversité spécifique marine mondiale pour beaucoup moins de 1 %de l'ensemble des océans, tant en volume : 0,2 % soit 3,7x106 km3; qu'en surface : 0,7 % soit 2,5x106 km2. Plusieurs espèces marines sont fort probablement dans un état vulnérable ou même sur le point de s’éteindre, sans que l’on soit alerté (Boudouresque, 2004).Ce triste constat est une des conséquences de la très forte pression anthropique sur la Méditerranée qui souffre depuis plusieurs années de nombreux dérèglements liés aux changements climatiques et aux nombreuses catastrophes écologiques dont l'impact influence le fonctionnement et la productivité de sa biodiversité. La nécessité de surveillance et de conservation des richesses de ce milieu apparaît comme une problématique importante de toutes les sociétés, d'autant que le milieu marin fournit actuellement l’alimentation de près d’un être humain sur deux.

La pollution par les Eléments Traces Métalliques (ETM) est l’un des problèmes rencontré suite à l’industrialisation et l’urbanisation croissante des zones côtières. Plusieurs épisodes dramatiques ont eu lieu comme la catastrophe de Minamata au Japon après le rejet de près de 400 tonnes d’oxyde de mercure, pendant plus de 30 ans, qui ont provoqué l’intoxication de dizaines de milliers de personnes. En dépit de ce cas extrême de pollution, il apparaît nécessaire, depuis les années 80 (Nischwitz et Pergantis, 2005 ; Sloth et al., 2003 ; Farrington et al., 1983), de mettre en place des programmes de surveillance des milieux marins afin de pouvoir évaluer la qualité des eaux et des écosystèmes, et de pouvoir réagir rapidement en cas de pollution pour en limiter les atteintes à la biosphère ainsi que ses conséquences le long de la chaîne alimentaire jusqu’à l’Homme. C’est dans cette approche qu'est développée la notion de bioindicateurs, où un organisme est choisi pour ses caractéristiques de bioaccumulation d’un ou plusieurs ETM, pour rendre

174 compte, sur une échelle de temps assez large, des quantités d’ETM auxquels un organisme peut-être exposé.

L’intérêt grandissant pour les éponges marines est lié d’une part à ce qu’elles constituent une des plus grandes réserves sous-marines de biomasse et qu’on les retrouve dans la plupart des eaux du globe, et d’autre part à ce qu’elles abritent une richesse exceptionnelle du point de vue de la chimiodiversité. Ces animaux benthiques qui sont exclusivement filtreurs, pourraient-ils bioaccumuler les Elements Traces Métalliques ? Connues pour résister à de grandes variations des conditions écologiques, les éponges pourraient être un organisme sentinelle dans le cadre de la surveillance environnementale des milieux marins.

Ainsi, dans ce rapport, nous nous sommes consacrés à l'étude de l’accumulation de six éléments traces métalliques (ETM) dans trois espèces d’éponges récoltées autour de la Méditerranée qui appartiennent toutes à la famille des Irciniidae : Ircinia oros, Ircinia variabilis et Sarcotragus spinosulus.

2. Les éléments traces métalliques (ETM)

2. 1. Généralités

Depuis le 5 avril 2001 (rapport du Sénat français N° 261) la notion d’éléments traces métalliques (ETM) tend à remplacer celle de métaux lourds (Miquel, 2001). Cette modification est la conséquence d’un problème au niveau de la définition des « métaux lourds » qui diffère selon les auteurs. Ainsi, les métaux lourds ont souvent été définis comme étant des éléments métalliques :

 possédant une masse volumique supérieure à une valeur minimale variant entre 4000 kg/m3 et 5000 kg/m3, selon les auteurs ;  compris entre le cuivre et le plomb dans le tableau périodique des éléments (excluant donc le fer et le chrome, Tableau 10) ;  à partir de la quatrième période du tableau périodique des éléments.

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Tableau 10 : Tableau périodique des éléments.

IA 0 1 1H IIA IIIA IVA VA VIA VIIA 2He 2 3Li 4Be 5B 6C 7N 8O 9F 10Ne 3 11Na 12Mg IIIB IVB VB VIB VIIB VII VII VII IB IIB 13Al 14Si 15P 16S 17Cl 18Ar 4 19K 20Ca 21Sc 22Ti 23V 24Cr 25Mn 26Fe 27Co 28Ni 29Cu 30Zn 31Ga 32Ge 33As 34Se 35Br 36Kr 5 37Rb 38Sr 39Y 40Zr 41Nb 42Mo 43Tc 44Ru 45Rh 46Pb 47Ag 48Cd 49In 50Sn 51Sb 52Te 53I 54Xe 6 55Cs 56Ba 57La 72Hf 73Ta 74W 75Re 76Os 77Ir 78Pt 79Au 80Hg 81Ti 82Pb 83Bi 84Po 85At 86Rn 7 87Fr 88Ra 89Ac 104Rf 105Db 106Sg 107Bh 108Hs 109Mt 110Ds 111Rg 112Uub 113Uut 114Uuq 115Uup 116Uuh 117Uus 118Uuo

58Ce 59Pr 60Nd 61Pm 62Sm 63Eu 64Gd 65Tb 66Dy 67Ho 68Er 69Tm 70Yb 71Lu 90Th 91Pa 92U 93Np 94Pu 95Am 96Cm 97Bk 98Cf 99Es 100Fm 101Md 102No 103Lr

Les ETM constituent donc les éléments dont la concentration naturelle moyenne dans la croûte continentale supérieure est inférieure à 1000 mg.kg-1. Ils intègrent des métaux et des métalloïdes qui partagent des comportements chimiques, physiques et biologiques proches, potentiellement toxiques envers le biota.

Les ETM sont présents dans tous les compartiments de l’environnement et proviennent d’une source naturelle et/ou anthropique. La source anthropique ayant renforcé cette occurrence.

2. 2. Sources anthropiques

La source anthropique des EMT est fortement liée à leur utilisation pour des applications très variées, comme indiqué dans le Tableau 11. Leurs utilisations sont multiples et très diversifiées et les sources de contamination le sont par conséquent aussi. Durant toutes les phases d’élaboration, d’utilisation et/ou de recyclage de ces produits, ils sont rejetés dans l’environnement, soit directement dans les eaux continentales ou marines, soit dans l’atmosphère où ils sont associés aux aérosols puis transportés par les vents avant de se déposer par voie sèche ou humide à la surface de la terre ou de l’océan.

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Tableau 11 : Sources anthropiques de quelques ETM.

Eléments Sources anthropiques Cr Aciers et aciers inoxydables Fe (alliages) Aciers et aciers inoxydables Ni Aciers et aciers inoxydables Cu Electroniques, fongicides Zn Galvanisation de l'acier As Produits phytosanitaires Ag Bijouterie, argenterie, monnaies, miroirs, électriques et électroniques Cd Batteries d'accumulateurs Au Bijouterie, objets précieux, contacts électriques, dentisterie Hg Amalgames dentaires, piles électriques Ti Réacteurs chimiques (en raison de son inertie chimique) et confection de prothèses Additif dans les carburants, batteries d'accumulateurs, tuyauteries, soudures, peintures Pb anticorrosion et les munitions U Quilles de certains bateaux, munitions anti-blindage (uranium appauvri)

Certains ETM, notamment les oligo-éléments, sont indispensables au bon fonctionnement des processus biologiques. Ainsi, Fe est un constituant essentiel de l’hémoglobine, et Zn et Cu sont des oligo-éléments indispensables à l’être humain. En revanche, d’autres ETM sont toxiques pour diverses formes de vie comme décrit ci-après.

2. 3. Impacts des ETM sur la santé

L’impact toxicologique des ETM sur la santé dépend de leur forme chimique, de leur concentration, du contexte environnemental, de leur biodisponibilité et de la possibilité de passage dans le réseau trophique. C’est, par exemple, le cas du fer (Fe), du cuivre (Cu), du zinc (Zn), du nickel (Ni), du cobalt (Co), du vanadium (V), du sélénium (Se), du molybdène (Mo), du manganèse (Mn), du chrome (Cr), de l’arsenic (As) et du titane (Ti) (Miquel, 2001). Les travaux réalisés par Monnet-Tschudi en 2006 ont révélé que plusieurs EMT, seuls ou en association, sont à l’origine de maladies neuro-dégénératives ou contribuent seulement à les aggraver. Les ETM connus les plus préjudiciables sont : le plomb (Pb), le mercure (Hg), le cadmium (Cd) et l’antimoine (Sb) (Chiffoleau et al., 2001) ; ainsi que certaines formes du chrome (Cr), du nickel (Ni), du zinc (Zn), de l’arsenic (As) et du sélénium (Se). Certains EMT tels que Cr VI (Cr hexavalant : 6ème état d'oxydation du Cr) et Cu oxydé peuvent être très toxiques sous certaines formes.

177

Contrairement à Ti et Au,qui sont considérés comme bio-compatibles et utilisés en chirurgie ou dentisterie, ou bien à Fe, qui est assez commun, Hg, Pb, Cd, Cu et Al sont en revanche à l’origine d'intoxications ou de maladies graves (Tableau 12).

Tableau 12 : Impacts de quelques ETM sur la santé humaine.

Eléments Impacts sur la santé humaine La Myofasciite à macrophages (MFM) : induite par l’intermédiaire de l’hydroxyde d’Al que l’on retrouve Al dans certains vaccins, notamment celui de l’hépatite B (Gherardi et al., 2001) Cu Le Parkinson, et ceci en synergie avec le Pb (Gorell et al., 1999) Cd L’« Itai-itaidisease » : fragilise et déforme les os et atteint les reins et le foie (Hamilton, 2010). L’Hydrargyrisme : induit des problèmes neurotoxiques et néphrotoxiques. Pouvant être à l’origine de plusieurs Hg cas de leucémie. En synergie avec le Pb, il inhibe les cellules nerveuses Le Saturnisme : agit sur le cerveau à un seuil inférieur à celui toléré légalement en France (50 µg.L-1 de sang) Pb (Rapport Afee n°3, 1998), avec des effets beaucoup plus graves chez l’enfant. L’anémie et des troubles digestifs, des cancers, la stérilité et la paralysie conduisant à la mort

A titre d’exemple, l’utilisation d’amalgames dentaires à base de Hg, mais aussi de Ag et de Sn, est restreinte dans certains pays comme la Suède, l'Allemagne et le Danemark, et interdite au Japon, en Russie et en Norvège. Ainsi, les thermomètres au Hg sont interdits à la vente dans l’Union Européenne. La France et la Belgique continuent cependant à utiliser cet élément, dont les avantages restent non compensés et ses preuves de toxicité sont encore trop peu nombreuses pour en déduire une nocivité.

Pour éviter, autant que possible, les rejets dans l’environnement, l’utilisation de certains ETM est réglementée, voire interdite dans certaines applications.

3. Les ETM dans le milieu marin

3. 1. Généralités

Le milieu marin, est caractérisé à la fois par une remarquable stabilité de ses propriétés fondamentales et une grande variabilité de ses micro-constituants. L’eau de mer contient en solution des combinaisons de tous les éléments chimiques mais seulement douze d’entre eux ont des concentrations égales ou supérieures au mg.L-1. Ces douze éléments majeurs interviennent pour 99,4 % en masse du total de la croûte terrestre et sont par ordre d’abondance l’oxygène (O), le silicium (Si), l’aluminium (Al), le fer (Fe), le calcium (Ca), le sodium (Na), le potassium (K), le magnésium (Mg), le titane (Ti), l’hydrogène (H), le

178 phosphore (P) et le manganèse (Mn). Les éléments traces, au nombre de 68, ne représentent en masse que 0,6 % du total et sont à des concentrations inférieures à 10-6 M dans l’eau de mer (Miquel, 2001; Neff, 2002). Ces éléments sont impliqués dans des réactions biochimiques et contribuent à l’équilibre du milieu marin. Mais l’apport de nombreux produits chimiques dont les EMT rejetés par les effluents industriels de l’agriculture et les communautés urbaines par l’intermédiaire de l’atmosphère, des fleuves et de leur estuaire, peut modifier la composition de l’eau de mer qui peut devenir toxique pour la faune et la fore. Les zones estuariennes et côtières, sous forte influence continentale, sont les plus touchées que les zones du large par cette contamination.

Les ETM sont présents dans le milieu marin sous la forme d’un continuum de tailles depuis la phase particulaire (> 0,45 µm) jusqu’à la phase dissoute (< 0,1 µm), en incluant aussi une phase colloïdale intermédiaire (Luoma et Rainbow, 2008). La plupart du temps, la distinction entre phase dissoute et particulaire s’effectue à partir de la filtration à 0,45µm.

3. 2. Dynamique des ETM en milieu marin

Les concentrations en métaux traces dans le milieu marin montrent de fortes variabilités : verticale, spatiale et temporelle (Luoma et Rainbow, 2008). Le tableau 13 présente de façon synthétique quelques valeurs ubiquitaires moyennes. Ces valeurs indiquent les ordres de grandeur de la concentration des principaux ETM dans quelques mers et océans.

179

Tableau 13 : Concentrations ubiquitaires des ETM dans les mers et océans.

Concentrations Eléments Méditerranée Autres Références ubiquitaires*, unités Ag 0,06 - 100 Ppt - 0,03 - 26 (milieu marin) Barriada et al., 2007 Van den Berg et al., 1994 ; 0,01 - 5 Ppb 0,27 - 4,05 - Al Hydes et al., 1988 As 1,1 - 4 Ppb - 1,7 (océans) ; 0,45 - 1,1 (Baltique) Neff, 1997 ; Stoeppler et al., 1986 B 4 – 5 Ppm - 4,5 (océans) WHO - Boron in drinking water Sugiyama et al., 1984 ; Chow, - Ppb - 4,1 - 22 (Pacifique, Californie) Ba 1976 Be - Ppt - - Ca 400 Ppm - - Cd 0,1 - 130 Ppt 3,37 - 8,66 - Morley et al., 1997 Co 0,2 - 18 Ppt 1,3 - 5 - Morley et al., 1997 Cr 0,1 - 0,6 Ppb - - Cu 8 - 390 Ppt 72 - 144 - Morley et al., 1997 Fe 1 - 3000 Ppt 56 - 250 - Morley et al., 1997 Morley et al., 1997 ; 4 - 170 Ppt 8,24 - 203 60 - 174 (milieu marin) Mn Statham et Burton, 1986 Mo - ppb - 10,3 (océans) Sohrin et al., 1999 ; Morris, 1975 Ni 0,1 - 2 ppt 0,11 - 0,26 - Morley et al., 1997 Pb 0,6 - 38 ppb 12 - 76 - Morley et al., 1997 Si 0,03 - 2 ppm - - Ti 1 ppb 4,8 - 7,2 - Van den Berg et al., 1994 V 1 ppt - 1,19 (Atlantique nord) Morris, 1975 Zn 3 - 5000 ppt - - * (Luoma et Rainbow, 2008 ; Cox, 1995 ; The chemical elements and water).

3. 2. 1. Dynamique verticale

La variabilité verticale de certains ETM semble être régie par trois types de processus : conservatif, de recyclage et d’élimination (Luoma et Rainbow, 2008 ; Furness et Rainbow, 1990).  Les éléments conservatifs sont ceux qui interagissent le plus faiblement avec les particules et qui ont le temps de résidence le plus long (> 105 ans). Leur concentration est faiblement affectée par la salinité et la profondeur. On peut citer des éléments + + 2- comme K , Na ou l’anion MoO4 (Luoma et Rainbow, 2008). Le Bore apparaît également conservatif (Savenko et al., 2002 ; Liddicoat et al., 1983) et possède un comportement chimique similaire au Si, tout en étant plus soluble, sous forme de - [B(OH)4] (Cox, 1995).

 Les éléments recyclés présentent des profils verticaux où la concentration en surface de la colonne d’eau est appauvrie puis s’enrichit progressivement en profondeur. En surface, les éléments sont absorbés par le phytoplancton et/ou adsorbés sur des

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particules biologiques, puis relâchés en profondeur par la décomposition microbienne et/ou la dissolution des phases minérales. Le temps de résidence des éléments recyclés est intermédiaire entre celui des éléments conservatifs et celui des métaux éliminés (103 à 105 ans). On peut citer comme exemple d’éléments recyclés Cd, Zn, Asv, Ni, Ag, Cr ou encore V. On peut noter que le profil du Cd comme celui de Asv corrèle bien avec celui du phosphate. De façon identique, le Zn corrèle mieux avec les silicates, de même pour Ag (Luoma et Rainbow, 2008 ; Barriada et al., 2007) ou Al (Caschetto et Wollast, 1979). Concernant Cu, Ni et Cd dans l’ouest de la Méditerranée, Morley et al. a suggéré que ces éléments sont davantage influencés par des processus de mélange que de recyclage (Morley et al., 1997). Le Si dépend également d’un processus de recyclage par des organismes marins tels que les diatomées qui l’utilisent pour former leur squelette (Cox, 1995). Ba semble également être utilisé par les diatomées (Sternberg et al., 2005).

 Enfin, les éléments les plus réactifs sont régis par des processus d’élimination et possèdent le temps de résidence le plus court (< 103 ans) (Luoma et Rainbow, 2008). La concentration de l’ETM est maximale près de la source et diminue ensuite avec la distance, du fait que peu ou aucun mécanisme de recyclage n’intervienne. On retrouve dans cette catégorie des ETM comme Al, Co, Mn, ou encore Pb (Furness et Rainbow, 1990). Par exemple, Mn est éliminé rapidement à travers la colonne d’eau car dans des conditions d’oxygénation normale, l’espèce majoritaire MnVI est très peu soluble. Mn peut ensuite être régénéré dans des conditions de faible oxygénation du fait que MnII est l’espèce thermodynamiquement stable et qu’elle possède une solubilité plus importante (Furness et Rainbow, 1990). Pb quant à lui est majoritairement déposé dans les océans par voie atmosphérique et sa concentration est donc maximale en surface, diminue avec la profondeur.

On note enfin des distributions hybrides, notamment pour Cu et Fe. Leur répartition est régie à la fois par des processus de recyclage et d’élimination et peut varier suivant les conditions de surface et de profondeur (Luoma et Rainbow, 2008). Le calcium est également un élément non-conservatif (Cox, 1995).

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3. 2. 2. Dynamique spatiale et temporelle

La variabilité spatiale et temporelle est causée principalement par des processus de type biogéochimiques et physiques (Luoma et Rainbow, 2008). La distribution horizontale de masses d’eau aux caractéristiques biogéochimiques différentes provoque des distributions complexes en métaux traces à la surface des océans. De plus, l’absorption par le phytoplancton et les mécanismes d’adsorption à la surface de particules minérales et/ou organiques en suspension peuvent amener à l’épuisement en surface d’un métal et un enrichissement dans les couches inférieures par régénération. On observe en revanche des variations en surface beaucoup moins importantes pour les métaux peu absorbés par le phytoplancton, comme le Pb ; les différences observées étant liées principalement aux variations des apports atmosphériques. Enfin, les upwellings, caractérisés par la remontée d’eau profonde froide et riche en nutriments près de certaines côtes ventées, provoquent une augmentation en surface de la concentration en ETM caractéristiques des profondeurs. Les courants marins (changements saisonniers, marées) jouent également un rôle dans la dispersion des métaux (Poulos et al., 2009).

3. 3. Les ETM en Méditerranée

Les ETM en Méditerranée proviennent du lessivage naturel des sols, de l’érosion éolienne et d’apports atmosphériques provenant des régions extérieures au bassin versant (Europe du Nord et régions sahariennes) auxquels s’ajoutent les apports liés aux activités industrielles, agricoles et urbaines du bassin versant. Les premières mesures fiables d’apports atmosphériques et telluriques d’ETM en Méditerranée, réalisées par le programme des Nations Unies pour l’environnement (PNUE ou UNEP, 1984), ont révélé des profils verticaux des ETM très différents en Méditerranée de ceux mesurés dans les océans Atlantique et Pacifique (Ruiz-Pino et al., 1990 (a, b) ; Ruiz- Pino et al., 1991). En effet, dans les océans Atlantique et Pacifique, les profils verticaux de Zn et Cd, tout comme les éléments nutritifs, sont faiblement présents en surface,alors qu’ils sont progressivement importants en profondeur. En revanche, les ETM en Méditerranée sont plus fortement présents dans les couches supérieures que dans les couches inférieures et à

182 concentrations relativement stables. Ce constat est une des conséquences des particularités de cette mer. La Méditerranée est en effet une mer :  quasiment fermée ;

 avec une salinité élevée de 38 (variant de 36 au niveau du détroit de Gibraltar à 39,5 dans le bassin oriental) ;

 ayant un bilan hydrique négatif du fait d’une importante évaporation, malgré les apports hydriques assurés par les fleuves (principalement le Nil, le Rhône, le Pô et l’Ebre) et les précipitations ;

 où les marées sont faibles avec une amplitude moyenne inférieure à 60 cm ;

 où les apports superficiels provenant de l’activité biologique sont plus importants que le transfert vertical. 250 ans sont alors nécessaires pour effectuer un brassage complet (et 90 ans pour le renouvellement des eaux) du fait des mouvements hydrologiques : courant de fond aux caractéristiques assez différentes du courant de surface.

Ces caractéristiques ont ainsi permis d'analyser l'évolution de la concentration des éléments traces métalliques d’origine anthropique (tel que Hg, Cd, Pb, Cu et Zn) provenant de l'atmosphère et des rivières.

Les études sur les apports atmosphériques et telluriques des éléments traces métalliques en Méditerranée ont été développées dans la période 1988 à 1995, lors de la mise en place du programme EROS 2000 (European River Ocean System) par la Commission Européenne. Les résultats sont assez complexes vu que les apports atmosphériques et telluriques sont d’une part très variables dans le temps et l’espace et, que d’autre part, ils concernent du matériel dissous et particulaire, le plus souvent sous forme inorganique. Il n’est donc pas évident de connaître le bilan des apports, qui nécessiterait, pour des échelles de temps et d’espace bien définies, la quantification des différentes formes. Les résultats sur les apports d’ETM par voie atmosphérique dans le bassin occidental (stations de mesures continues) montrent que (Guieu et al., 1997 ; Guerzoni et al., 1997) :  les concentrations en ETM sont quasiment homogènes et sont d’origine européenne et saharienne ;

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 l’origine naturelle ou anthropique est fonction des éléments en question ;

 chaque élément constitue des fractions particulaires et dissoutes qui lui sont propres.

Concernant les apports d’ETM par les rivières et principalement le Rhône pour bassin occidental, le transport particulaire est très supérieur au transport dissous lui-même étant inférieur à l’apport dissous par l’atmosphère. Ceci s’explique par le fait que les mesures géochimiques dans le milieu marin concernent principalement le stock dissous dans la colonne d’eau, permettant ainsi de quantifier les apports dissous à l’échelle spatio-temporelle. Du fait du léger apport dissous fourni par les rivières, l’atmosphère serait donc par la pollution anthropique, le principal vecteur d’apports dissous à la mer. Concernant l’apport particulaire par l’atmosphère et les rivières, il est supposé qu’une importante partie se piège finalement dans le sédiment, hormis une très faible fraction « reprise » par l’activité biologique.

4. Quantification des ETM dans le milieu marin

L’évaluation de la concentration en ETM est un paramètre nécessaire pour juger de la santé d’un écosystème marin et étudier son atteinte anthropique. Trois types de mesures des ETM sont généralement effectués en milieu marin : les dosages dans l’eau de mer, dans les sédiments et dans les organismes vivants (désignés par bioindicateurs). Cependant, et particulièrement pour les ETM, des problèmes analytiques sont souvent rencontrés, ceci étant du (i) à des résultats obtenus proches du seuil de détection limite des appareils, ce qui nécessite alors des étapes de pré-concentration ; (ii) à la variation des concentrations des contaminants dans le temps et dans l’espace, plus particulièrement dans les zones estuariennes et côtières, et dépendant également de plusieurs facteurs tels que les conditions météorologiques, l’hydrodynamisme et les saisons ; et, (iii) à une vision d’une contamination instantanée, ne reflétant pas les réelles conditions potentiellement toxiques pour les organismes marins (Rainbow, 1995).

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4. 1. La colonne d’eau

Il est possible d’analyser les concentrations en ETM dans la colonne d’eau directement. Cependant, trois limitations importantes viennent restreindre la validité de ces analyses. D’abord, la concentration de la plupart des ETM dans l’environnement est de l’ordre de quelques nanogrammes par litre d’eau, ce qui rend les techniques de prélèvement et de mesure complexes. Ensuite, les mesures sont délicates puisque les risques de contamination au moment de l’échantillonnage et de l’analyse sont nombreux. Ces problèmes ont été surmontés par l’utilisation de techniques « ultra-propres » lors de l’échantillonnage. Néanmoins, la mesure directe des contaminants dans l’eau fait appel à des techniques analytiques sophistiquées, difficilement applicables en routine le long d’un linéaire côtier important. Par ailleurs, la variabilité temporelle du milieu littoral ne confère que peu de représentativité à une mesure ponctuelle dans la colonne d’eau. Enfin, les dosages effectués sur des suivis dans le milieu concernent, le plus souvent, les concentrations totales des espèces chimiques et non spécifiquement celles des formes biodisponibles des contaminants étudiés qui représentent l'information la plus importante d’un point de vue écotoxicologique (Rainbow, 1995) pour la protection des écosystèmes et la compréhension des processus de contamination.

4. 2. Les sédiments

Les dosages dans les sédiments éliminent plusieurs des problèmes rencontrés lors des mesures effectuées dans la colonne d’eau. La capacité d’accumulation des ETM dans les sédiments, liée à leur caractéristique fondamentale de se partitionner entre la phase aqueuse (eaux de pores, eaux surnageantes) et la phase solide (sédiments, matière particulaire en suspension), permet de passer outre les problèmes de limites de détection/quantification et de limiter les problèmes de contamination accidentelle. Cependant, l’utilisation de sédiments est fortement affectée par leurs caractéristiques qui varient géographiquement et temporellement, notamment par la taille des particules et la matière organique totale (Luoma, 1990).De plus, cette utilisation représente la fraction totale des ETM et non la fraction biodisponible ; cette dernière possédant une réelle pertinence écotoxicologique (Rainbow, 1995). Afin de surmonter ce problème, des extractions séquentielles complexes de différentes fractions des

185 sédiments sont nécessaires mais ces techniques nécessitent d’être optimisée en fonction de la composition des sédiments, et elles restent peu reproductibles (Tessier et al., 1979 ; Tessier et Campbell, 1987 ; Luoma, 1990).

4. 3. Les organismes marins

L’étude de l’interaction entre les contaminants et les barrières biologiques est un processus assez complexe et d’un intérêt considérable pour la compréhension des phénomènes écotoxicologiques, particulièrement la bioaccumulation et les transferts à travers les chaînes trophiques. Les processus impliqués sont très complexes et sont influencés par :  les propriétés biochimiques de chaque élément contaminant (Bowen, 1966), tels que la taille de la molécule et sa spéciation chimique ;

 des facteurs concernant l’organisme récepteur et variant entre les différents genres et espèces (Eisler, 1981), tels que les propriétés membranaires, la composition chimique de l’organisme et ses processus actifs ;

 le mode alimentaire des organismes ainsi que le mode de respiration, puisqu’ils amènent les particules et/ou les éléments dissous en interaction avec les tissus internes de l’organisme ;

 des facteurs environnementaux intra- et extracellulaire tels que la température et le pH.

En revanche, le grand intérêt de l’utilisation d’organismes biologiques en tant que bioindicateurs est qu’ils reflètent la biodisponibilité des ETM et plus particulièrement celle des métaux divalents, selon leur fonctionnement biologique, leurs modes alimentaires, respiratoire ou de déplacement, par exemple (Goldberg, 1975 ; Philips, 1977 ; Goldberg et al., 1978 ; Phillips, 1980 ; Phillips et Segar, 1986). Ces organismes marins concentrent d’une façon continue les contaminants, en relation avec leur présence dans un milieu donné : c’est le principe des « bioindicateurs quantitatifs ». Cependant, ces contaminants semblent s’accumuler suivants deux types de mécanismes : • La régulation ;

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• L’accumulation nette. Le mécanisme de régulation est l’aptitude que possèdent certains invertébrés à limiter la concentration de certains ETM à un seuil à peu près constant de façon sélective, par rapport à d’autres éléments également présents dans le milieu. L’accumulation nette a lieu lorsque l’espèce n’est pas en mesure d’accumuler ni d’éliminer les ETM à des vitesses équivalentes. Il est bien sûr possible de distinguer plusieurs variantes de ces deux mécanismes extrêmes.

Cette caractéristique d’accumulation a poussé Goldberg en 1975 à proposer un suivi des concentrations des contaminants dans les organismes vivants à l’échelle internationale pour surveiller les milieux : c’est le principe de « monitoring ». La notion générale de « monitoring » désigne la mise en place de programmes de surveillance basée sur des organismes biologiques de référence. Une des fonctions de ces programmes de surveillance est l’utilisation d’organismes en tant que bioindicateurs pour rendre compte de la bioaccumulation d’espèces chimiques telles que des ETM ou des molécules organiques comme les PCB, les HAP ou les pesticides organochlorés (Luoma et Rainbow, 2008). Un certain nombre de critères ont été établis pour le choix d’une espèce en tant que bioindicateur. Ainsi, Butler et al. (1971) et Philips et Rainbow (1994) stipulent que pour être un bon « bioindicateur quantitatif », l’espèce animale doit présenter les critères suivants :  concentrer le contaminant, sans effet létal, aux concentrations rencontrées dans le milieu ;

 être sédentaire afin d’être représentatif de la zone d’échantillonnage ;

 être abondant dans la zone étudiée ;

 avoir une durée de vie suffisamment longue pour permettre l’échantillonnage de plusieurs classes d’âges ;

 avoir une taille suffisante pour permettre le prélèvement d'une quantité de tissus adéquate pour l’analyse chimique ;

 être euryhaline ;

 concentrer suffisamment les éléments à doser pour permettre des dosages sans pré- concentration ;

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 il doit exister une corrélation entre la teneur en contaminants dans l’organisme et la concentration dans l’eau environnante, la concentration dans les tissus reflétant ainsi la biodisponibilité du métal dans le milieu ;

 les effets de variations de la salinité et de la température doivent être connus ;

 à une échelle régionale, une seule et même espèce est exigée; ce qui impliquerait la méthode des transplants, une alternative assez compliquée et coûteuse à établir à l’échelle méditerranéenne.

Touts ces critères concernent une espèce bioindicatrice idéale et ne peuvent pas se trouver réunies à la fois dans une seule espèce. De ce fait, un compromis fut alors recherché et Goldberg proposa en 1975 le concept de « Mussel Watch » comme une première étape dans une surveillance du milieu marin à l’échelle mondiale.

Les stratégies de surveillance par bioindicateurs sont variées.

4. 3. 1. Les mollusques

Le « US Mussel Watch » fût le premier programme de surveillance à grande échelle utilisant le concept de bioindicateur. Le programme utilise particulièrement l’espèce de moule commune Mytilus spp. ainsi que d’autres mollusques bivalves comme les huîtres Crassostrea et Ostrea (Rainbow, 1995 ; Phillips, 1979). Les moules et les huîtres étant des suspensivores épibenthiques, ils accumulent particulièrement les éléments dissous et adsorbés à la surface des particules. Il existe deux types de stratégies de« Mussel Watch » : celle qui utilise les populations indigènes de moules sauvages ou cultivées (biomonitorage passif, et c’est le cas du Réseau National d’Observation de la qualité du milieu marin ou RNO de l’Ifremer - France) (Thibaud et Boutier, 1988 ; Claisse, 1989 ; Claisse et al., 1992 ; Amiard-Triquet et al., 1999 ; Claisse et al., 2001), et celle qui a recourt aux transplants d’individus, provenant d’un site de référence (biomonitorage actif, cas du Réseau INtegrateurs BIOlogiques ou RINBIO de l’Ifremer, l’Agence de l’eau Rhône Méditerranée Corse et l’Institut de Radioprotection et de Sureté Nucléaire ou IRSN - France), sur un site d’étude pour un séjour de plusieurs mois dans l’eau. Dans ce dernier cas, les mollusques accumulent les contaminants jusqu’à atteindre un pseudo-

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équilibre avec le milieu (Kock de, 1983 ; Fabris et al., 1994 ; Buestel, 1997 ; Andral et Stanisiere, 1999 ; Andral et al., 2001). Les espèces utilisées sont très répandues géographiquement, présentes notamment dans les eaux côtières qui sont les plus atteintes par les modifications anthropiques, elles sont sessiles, et surtout très tolérantes quant à la contamination des eaux marines et supportent également des fluctuations dans les paramètres physico-chimiques tels que la salinité ou la température. En ce qui concerne les moules, deux limitations majeures ont été reportées (Rainbow, 1995) : d’une part, bien qu’elles soient d’excellents accumulateurs d’ETM, il apparaît qu’elles régulent partiellement Zn, et Cu dans une moindre mesure, contrairement aux huîtres qui ont l’avantage d’accumuler le Zn ; d’autre part, une seconde limitation vient de la difficulté à identifier les moules au niveau taxonomique de l’espèce, ce qui peut entrainer des problèmes de biais et d’interprétations, puisqu’il a été montré que des espèces proches de moules vivant dans le même écosystème n’accumulaient pas les mêmes quantités de ETM (Lobel et al., 1990).

D’autres bivalves ont pu être utilisés également pour leur capacité de filtration comme la famille des Tellinidae qui est cependant limitée au niveau de sa distribution géographique.

Les stratégies de surveillance par bioindicateurs sont diverses. D’autres organismes marins que les mollusques ont également été utilisés, tels que les vers polychaetes, les crustacés et les spongiaires.

4. 3. 2. Les vers polychaetes

Une autre classe de bioindicateurs concerne les vers polychaetes (Rainbow, 1995) qui possèdent une large répartition de niches écologiques et de régimes alimentaires, couvrant ainsi une gamme de biodisponibilité assez large suivant les genres utilisés. Les Serpulidés sont des suspensivores épibenthiques sessiles, tandis que les Sabellidés ou les Chaetoptéridés sont des suspensivores vivant dans des tubes dans les sédiments sableux ou boueux. Les Arenicolidés ingèrent des sédiments de façon non-sélective, alors que les Ampharetidés et Terébellidés collectent les sédiments nouvellement déposés riches en matières organiques. Beaucoup d’espèces possèdent une répartition assez large, mais l’identification précise reste délicate pour les non-experts.

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4. 3. 3. Les crustacés

Chez les crustacés, les bernacles paraissent être les plus aptes à remplir les caractéristiques d’un bon bioindicateur (Phillips et Rainbow, 1988 ; Rainbow, 1995 ; Rainbow et Blackmore, 2001). Ils sont sédentaires et bioaccumulent les ETM tout au long de leur vie, depuis la colonne d’eau ou les matières en suspension, jusqu’aux réserves de métaux détoxifiés. Un autre groupe de crustacées utilisé est celui des Talitridés. Ces organismes vivent sur le rivage des côtes et se nourrissent de la décomposition des macroalgues déposées par la marée. Ils accumulent ainsi les ETM en solution et depuis leur nourriture. Pour tous ces organismes, le problème de l’identification se pose à chaque fois, sachant que des erreurs dans l’identification précise de tous les éléments échantillonnés peuvent amener à des variations interspécifiques naturelles, faussant l’interprétation des résultats (Rainbow, 1995).

4. 3. 4. Les spongiaires

Depuis une vingtaine d’années, on s’intéresse au potentiel que représentent les spongiaires en tant que bioindicateurs d’une pollution par les ETM.

Patel et al., (1985) et Hansen et al., (1995) proposent de lancer un programme « Sponge Watch » en complément au « Mussel Watch » déjà existant. Cette proposition s’appuie sur plusieurs arguments faisant des éponges de bons bioindicateurs, tels que leur capacité énorme à filtrer l’eau (Battershill et Abraham, 1999 ; Perez 2000). Cette capacité se situe entre 100 et 1200 mL/h.g (Vogel, 1977 ; Riisgard et al., 1993). Ce large volume passant à travers le corps de l’éponge implique que la plupart des cellules sont en contact direct avec le milieu externe, avec aucune autre contrainte de sélection des particules que celle liée à la taille. L’intérêt des éponges en tant que bioindicateur provient également de leur très grande capacité à accumuler un certain nombre d’ETM qu’ils soient en suspension ou dissout (Bowen et Sutton, 1951), ainsi que d’autres substances notamment organiques, telles que les PCB, les pesticides et les composés organochlorées (Venkateswara Rao et al., 2009 ; Cebrian et al., 2007 ; Hansen et al., 1995 ; Perez et al., 2005 ; Araujo et al., 2003 ; Patel et al., 1985 ; Perez et al., 2003). Les éponges possèdent également d’autres caractéristiques qui les rendent attrayantes en tant que bioindicateurs d’ETM ; elles sont sessiles, ce qui évite leur fuite d’une zone contaminée ;elles sont également suffisamment tolérantes pour supporter de grandes variations dans les

190 concentrations en ETM. Il s’est avéré que l’accumulation des contaminants par certains organismes est fonction du taux de ces contaminants dans le milieu, avec un facteur de bioconcentration variant selon les espèces (Richelle-Mauret et al., 1994 ; Hansen et al., 1994 ; Perez et al., 2003). Le Tableau 14 résume les études effectuées sur quelques espèces de spongiaires sélectionnées en tant que bioindicateurs environnementaux.

Tableau 14 : Etudes effectuées sur des spongiaires en tant que « bioindicateurs de pollution » par des ETM.

Classes Espèces Tests effectués Références Spirastrella cupidifera 17 ETM différents (var.) Patel et al., 1985 Prostylyssa foetida 17 ETM différents (var.) Patel et al., 1985 Halichondrida panicea Cd et Cu (+) Olesen et Weeks, 1994 ; Hansen et al., 1995 Hippospongia communis ETM (+) Nakhle., 2003

Cliona viridis Cd (+) Perez et al., 2004 Cacospongia scalaris ETM (+) Perez et al., 2004 Chondrosia reniformis ETM (+) ; Cu (régulé) ; Pb (régulé) Perez et al., 2004 ; Cebrian et al., 2007

Spongia officinalis 10 ETM (+) ; Hg et Cd (régulé) Perez et al., 2004 ; Perez et al., 2005 mospongiae

e Spongia agaricina ETM (+) Perez et al., 2004 D Agelas oroides ETM (+) Perez et al., 2004 Crambe crambe Cu (+) ; Pb (régulé) Cebrian et al. 2007 Phorbas tenacior Cu (+) ; Pb (régulé) Cebrian et al. 2008 Dysidea avara Cu (+) ; Pb (régulé) Cebrian et al. 2009 Suberites domuncula Cd (+) et autres Mueller et al., 1998 Calcarea Scyphaciliata ETM (+) ; Cd (+) Collins et al., 1994 (var.) : résultats variables ; (régulé) : accumulation régulée ; (+) : accumulation.

Tenant compte de la nocivité des ETM accumulés dans les tissus de cet animal filtreur, des effets directs et indirects surviennent sur leur fonctionnement physiologique. Un certain nombre d’étude a été dédié à ce sujet, et à titre d’exemple, il a été remarqué qu’une forte exposition au Cd de l’ordre de 0,01 à 5 μg/mL, provoquerait au bout de 24 heuresun début d’apoptose cellulaire chez la Démosponge Suberites domuncula (Wagner et al., 1998). L’effet de l’exposition à une pollution au Cu de l’espèce Chondrosia reniformis Atlanto- Méditerranéenne (Cebrian et al., 2006) provoque des changements physiologiques chez l’éponge. Ces changements se traduisent par une augmentation de son taux de collagène (suite à une augmentation des composantes cellulaires) et par la suite, une diminution de sa capacité à pomper l’eau, pour provoquer finalement sa mort. Ainsi, l’effet positif à court terme de Cu et Cd sur l’augmentation de l’agrégation cellulaire et sur l’implantation des larves a été étudié chez l’espèce Scopalina lophyropoda (Demospongiae), cependant le fonctionnement cellulaire et la viabilité de l’éponge sont affectés après des expositions prolongées (Cebrian et Uriz, 2007).

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Chez l’espèce Spongia officinalis, la relation entre la production de protéines semblables à la métallothionine (metallothionein-like proteins ou MTLPs) comme système de détoxification contre les ETM et particulièrement contre Cu, Hg et Zn, a été étudiée (Berthet et al., 2005).

5. Objectif du travail

Les éponges bioindicatrices ont souvent été utilisées comme marqueurs environnementaux de crises dans les écosystèmes tropicaux (Carballo et al., 1996 ; Holmes, 1996). Cependant, et tenant compte de tous les avantages qu’elles pourraient fournir dans le domaine de la surveillance du niveau des contaminants, leur rôle de bioindicateur a relativement été peu étudié. Ainsi jusqu’à présent, les études ayant porté sur l’utilisation des spongiaires en tant que bioindicateurs marins n’avaient jamais traité les Irciniidae, d’autant plus, qu’elles n’avaient jamais englobé une zone étendue à l’échelle méditerranéenne (Venkateswara Rao et al., 2009 ; Cebian et al., 2007 ; Topçu et al., 2010 ; Hansen et al., 1995 ; Perez et al., 2005 ; Ajaujo et al., 2003 ; Patel et al., 1985 ; Perez et al., 2003 ; Berthet et al., 2005). Dans cette étude, nous nous intéressons spécifiquement à cette famille. Trois différentes espèces : Ircinia oros, Ircinia variabilis et Sarcotragus spinosulus, récoltées dans huit zones différentes reparties autour de la Méditerranée, ont été récoltées. Une sensibilité des différentes espèces vis-à-vis de chacun des 6 éléments mesurés : As, Cd, Cr, Cu, Fe et Pb ; a été vérifiée, afin d’obtenir une vision globale et comparative sur l’état environnemental méditerranéen par une pollution en ETM.

6. Matériels et méthodes

6. 1. Sites d’échantillonnage en Méditerranée

La zone choisie pour cette étude est la mer Méditerranée dans le cadre du programme ANR ECIMAR. Huit zones de prélèvement décrites ci-après, correspondent aux 19 sites différents qui ont été choisis (Figure 134) : dans le détroit de Gibraltar (Ceuta), en Méditerranée occidentale (la Costa Blanca, l’Estartit, Banyuls, Marseille et la Corse) et en Méditerranée orientale (Liban et Crète).

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Figure 134 : Sites d’échantillonnage des Irciniidae de Méditerranée.

Le détroit de Gibraltar est une zone complexe d’échange entre l’océan Atlantique et la mer Méditerranée. La zone de prélèvement est l’enclave espagnole de Ceuta sur la côte marocaine. Les trois sites d’échantillonnage sont: Ciclon de Fuera (Ce1), Ciclon de Tierra (Ce2) et Callejones (Ce7).

Un seul point de prélèvement à Mazarron, sur la Costa Blanca dans la province d’Alicante en Espagne (Cb2). L’Estartit ne comporte qu’un seul point de prélèvement (Es1). Les deux sites de prélèvements à Banyuls, Cap l’Abeille (Ba1) et Caball Bernat (Ba2) sont situés dans la réserve naturelle marine de Cerbère-Banyuls créée en 1974 qui est relativement protégée. La zone de Marseille dans le Golfe du Lion comporte 4 sites de prélèvement : Niolon (Ma8), Jarre (Ma5), Plane (Ma4) et Riou (Ma3). Niolon (La grotte du Chinois) est situé à l’ouest du golf de Marseille, face au port à quelques mètres de la station d’épuration Le Rouve Niolon et à 2 km de l’ancienne métallurgie Metaleurop de l’Estaque. Les trois autres points de prélèvements : Riou (Impérial de Terre), Jarre (grottes des Mysidacea et Arc en Ciel) et l’île Plane se trouvent à proximité d’un rejet du centre d’épuration de l’agglomération (Figure 135).

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Figure 135 : Sites de prélèvements au niveau de Marseille – France.

En Corse, quatre points de prélèvements ont été choisis près de Calvi : la Pointe de la Revellata (Co1), la Bibliothèque (Co2), la Calanque de Piana dans le Golfe de Porto (Co3) et Punta Bianca (Co4).

En Grèce, c’est la Crète qui est choisie comme zone de prélèvements. Deux points sont sélectionnés : le site touristique à Agia Pelagia (Gr1) et l’île de Dia (Gr2) qui est une île inhabitée (Figure 135).

Figure 136 : Sites de prélèvements en Crète - Grèce.

Enfin, le Liban est la dernière zone où des prélèvements ont été effectués. Deux points sélectionnés, l’un à Selaata (Lb 3 et Lb13) dans le district de Batroun, sous les falaises à l’entrée du port et à proximité d’une usine d’engrais chimiques et le second à Batroun (Lb8) (Figure 137).

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Figure 137 : Sites de prélèvements au Liban.

Vingt six échantillons de trois espèces d’éponges de la famille Irciniidae ont été sélectionnées pour cette étude : Ircinia oros, Ircinia variabilis et Sarcotragus spinosulus. Ces espèces qui sont relativement communes en zone sublittorale, sont susceptibles de présenter une diversité d’habitats sur une zone étendue adaptée à une notre étude. Les éponges sont collectées avec des tailles similaires, afin de limiter les variations de concentrations dues à l’âge. La période d’échantillonnage s’est échelonnée de 2007 à 2009, dans le cadre du projet ANR ECIMAR, majoritairement d’avril à septembre. Un tableau récapitulatif des prélèvements effectués, leurs sites, les dates de récoltes ainsi que les espèces correspondantes, est disponible en Annexe 2.

6. 2. Minéralisation

Après échantillonnage, des morceaux d’éponges d’environ 5 cm3 minimum sont congelés immédiatement à -20 ºC. Ils ont ensuite étés lyophilisés, finement broyés, puis aliquotés en trois réplicats de 0,5 g et conservés à 4 ºC, à l’obscurité. Les aliquats sont par la suite minéralisés par ajout de 8 mL d’acide nitrique à 65 % (HNO3, Fulka, TraceSelect) puis chauffés dans un four microonde (Microwave reaction system, Anton Paar, Multiwave 3000) à 600 W sous 40 bar de pression, selon le graphe de la Figure 138. Un blanc est effectué à chaque cycle. La méthode de minéralisation a été validée à l’aide d’un échantillon standard de référence : un tissu hépato-pancréatique de homard (TORT-2, IEC, Ottawa, Canada).

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Figure 138 : Profil du chauffage au four microonde pour la minéralisation des éponges.

Après minéralisation, les solutions obtenues sont diluées avec environ 30 mL d’eau Milli-Q, puis filtrées à l’aide de filtres seringues d’une porosité de 0,45 µm (Minisart-Sartorius), avant la mesure des concentrations totales en ETM par ICP-OES ou Inductively Coupeled Plasma (Spectrométrie par Torche à Plasma) - Optical Emission Spectrometry (Perkin Elmer, Optima 7000).

Des mesures d’ETM ont également été effectuées par ICP-MS (ICP-Mass Spectrometry). Compte tenu du niveau de concentrations en ETM dans les échantillons d’éponge, nous avons choisi de réaliser la totalité des analyses par ICP-OES afin d’éviter une étape de dilution nécessaire pour l’analyse par ICP-MS.

Analyse du standard de référence certifié : Les valeurs obtenues sont fiables pour la plupart des éléments (Tableau 15) et correspondent aux ordres de grandeur des valeurs reportées sur le certificat d’analyse. Toutefois, les concentrations en Cr et V s’écartent des valeurs moyennes de référence. Ceci peut s’expliquer par des valeurs moyennes mesurées proches voire inférieures aux limites de quantification de l’appareil : 2,00 µg/L et 40,7 µg/L, pour Cr et V, respectivement.

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Tableau 15 : Concentrations des ETM TORT-2 du standard de référence et concentrations mesurées en µg/g.

Eléments Concentrations de référence (µg/g) Concentrations mesurées (µg/g) As 21,60 ± 1,8 19,40 ± 0,43 Cd 26,70 ± 0,6 22,70 ± 0,14 Co 0,51 ± 0,09 0,44 ± 0,02 Cr 0,77 ± 0,15 0,20 ± 0,04 Cu 106,00 ± 10 103,00 ± 0,50 Fe 105,00 ± 13 106,00 ± 0,83 Mn 13,60 ± 1,2 11,50 ± 0,03 Mo 0,95 ± 0,10 0,94 ± 0,04 Ni 2,50 ± 0,19 1,88 ± 0,02 Pb 0,35 ± 0,13 0,44 ± 0,07 V 1,64 ± 0,19 0,87 ± 0,01

6. 3. Analyse des éléments par ICP-OES

Les échantillons ont été analysés par ICP-OES (Perkin Elmer, Optima 7000), équipée d’une chambre cyclonique et d’un nébuliseur de type Meinhard. Les conditions d’analyses sont indiquées dans le Tableau 16. Les concentrations de 26 EMT ont été mesurées. Les caractéristiques de longueur d’ondes λ analysée, la limite de détection et la limite de quantification de ces éléments sont présentées dans le Tableau de l’Annexe 9 où la LD correspond à 3 fois la déviation standard d’un blanc mesuré 20 fois, et la LQ correspond à 10 fois la déviation standard d’un blanc mesuré 20 fois.

Tableau 16 : Principales caractéristiques des conditions d’analyse par l’ICP-OES.

Plasma flux 15 L/min Aux flux 0,2 L/min Nebulizer 0,8 L/min Power 1300 W Plasma view Axial Sample flow rate 1,5 L/min

Pour tous les échantillons et leurs réplicats, la mesure des concentrations des six éléments suivants a été effectuée : As, Cd, Cr, Cu, Fe et Pb. La quantification a été réalisée par étalonnage externe, à partir d’une solution multi- élémentaire certifiée (PlasmaCAL, SCP Science, Canada). Pour chaque élément, l’analyse a été effectuée sur deux longueurs d’onde. Les résultats présentés et utilisés sont ceux pour 197 lesquels la longueur d’onde d’analyse était la plus sensible et la moins interférée. Les concentrations données par l’ICP-OES en mg/L ont été recalculées de façon à ce qu’elles soient exprimées en µg par gramme de masse sèche.

6. 4. Traitement statistique

Les analyses statistiques ont été réalisées en utilisant les programmes SIMCA-P+ et R.

7. Résultats et discussion

7. 1. Résultats

Dans le cadre de cette étude, nous nous sommes intéressés principalement à la bioaccumulation des 6 ETM : As, Cd, Cr, Cu, Fe et Pb ; par les trois espèces Ircinia oros, Ircinia variabilis et Sarcotragus spinosulus.

7. 1. 1. Bioaccumulation des ETM par Ircinia oros

Les éponges Ircinia oros ont principalement été collectées en 2008, en France (Jarre, Niolon et Riou à Marseille, Cap l’Abeille et Caball Bernat à Banuyls, Punta Bianca et la Pointe de la Revellata en Corse), en Espagne (l’Estartit et Costa-Blanca) et en Grèce-Crète (Agia Pelagia). Le Tableau 17 regroupe les concentrations moyennes pour les 6 ETM accumulés dans les tissus d’Ircinia oros pour l’ensemble des sites de collecte.

Tableau 17 : Concentrations moyennes en As, Cd, Cr, Cu, Fe et Pb dans les tissus d’I. oros en µg/g de masse sèche (moyenne ± écart-type).

Références Concentrations des ETM en µg/g Echantillons As ± Cd ± Cr ± Cu ± Fe ± Pb ± Ma5-04 2007 123,22 20,94 0,84 0,17 10,10 1,96 40,04 5,57 7649,30 1611,20 19,28 3,70 Ba1-18 2008 116,21 5,18 0,53 0,03 9,93 0,62 54,41 4,15 5519,50 256,70 8,07 0,22 Ba2-07 2008 138,43 1,85 0,76 0,01 7,80 0,28 43,62 0,49 8091,80 216,60 7,07 0,32 Co1-38 2008 74,92 2,52 0,31 0,02 2,84 0,36 26,68 1,34 584,30 63,80 4,07 2,05 Co4-12 2008 87,68 3,68 0,41 0,02 5,66 0,03 28,24 0,72 422,80 5,50 4,16 0,14 Es1-08 2008 85,70 13,19 0,41 0,04 4,17 1,55 38,64 5,68 4303,60 802,80 14,13 6,04 Gr1-10 2008 86,42 2,24 0,46 0,03 3,61 0,13 47,31 1,01 1680,87 316,63 2,67 1,35 Ma3-22 2008 64,66 13,95 0,21 0,05 2,35 0,29 32,27 6,21 650,60 122,60 2,41 0,52 Ma8-16 2008 178,72 24,99 1,98 0,32 28,47 4,98 80,93 8,35 > 9134* - 187,18 32,14 198

Cb2-03 2009 53,47 10,15 0,07 0,04 3,89 0,61 15,53 3,03 1008,30 49,70 7,21 0,80 Ma3-02 2009 50,16 7,74 0,29 0,06 2,89 0,45 37,35 3,92 1172,10 148,80 6,67 0,93 Ma8-04 2009 124,56 17,93 1,53 0,26 17,11 2,59 103,03 4,08 > 9134* - 109,79 14,76 Ba : Banyuls ; Cb : Costa Blanca ; Co : Corse ; Es : Estartit ; Gr : Grèce ; Ma : Marseille ;* : dépassent la limite supérieure de linéarité.

Nous avons réalisé une analyse par classification hiérarchique ascendante (CHA) afin de comparer les variations spatiales en termes d’accumulation des 6 ETM en 2008. Le dendrogramme obtenu est représenté dans la Figure 139.

Figure 139 : Analyse par CHA des différents ETM bioaccumulés par Ircinia oros en France (Niolon et Riou à Marseille, Caball Bernat et Cap l'Abeille à Banyuls, et Punta Bianca et Pointe de la Revellata en Corse), Espagne (Estartit) et Grèce-Crète (Agia Pelagia) en 2008 (méthode de Ward avec une distance Euclidienne).

On constate que deux groupes de sites présentent une divergence de 85 % environ ; nous avons obtenu des résultats similaires pour l’ensemble des analyses par CHA réalisées avec différentes méthodes. Le premier groupe est constitué par le site de Niolon. Globalement, on observe des concentrations beaucoup plus importantes par rapport aux autres sites (Tableau 17). Les ETM principalement accumulés sont par ordre de concentration décroissante Pb (187,19 µg/g), As (178,72 µg/g) et Cu (80,93 µg/g) ; Fe (> 9134,00 µg/g, exclu de cette analyse). Le second groupe est constitué par : Punta Bianca et Pointe de la Revellata, L'Estartit, Caball Bernat et Cap l'Abeille à Banyuls, Riou et Agia Pelagia. Les espèces prélevées à Banyuls présentent des concentrations en ETM très proches (< 1 % de divergence) et des concentrations en ETM différentes des espèces prélevées des sites de Grèce-Crète (Agia Pelagia), France-Marseille (Riou), Corse (Punta Bianca et Pointe de la Revellata) et Espagne (L'Estartit) (≈ 10 % de divergence). Pour les éponges collectées à Banyuls (Caball Bernat, Cap l'Abeille), les ETM principalement accumulés sont par ordre de concentration décroissante Fe (5519,50 à 8091,80 µg/g), As (116,21 à 138,43 µg/g), Cu (43,62 à 54,41 µg/g) et Pb (7,07 à 8,07 µg/g).

199

Pour le groupe constitué par les éponges collectées en Grèce-Crète (Agia Pelagia), France - Marseille (Riou-Impérial de Terre), Corse (Punta Bianca et Pointe de la Revellata) et Espagne (L'Estartit), les concentrations en ETM accumulés sont relativement homogènes notamment pour As (64,66 à 87,68 µg/g). Au sein de ce groupe, les espèces prélevées en Corse présentent les concentrations les plus faibles en Fe (422,80 à 584,30 µg/g). Inversement, L'Estartit en Espagne se distingue des autres sites par des espèces avec de plus fortes concentrations en Fe (4303,60 µg/g) et Pb (14,13 µg/g). Enfin, pour les sites Niolon et Riou où Ircinia oros a été collectée en 2008 et 2009, les concentrations en ETM obtenues sont sensiblement proches entre les deux années.

Pour les espèces collectées en 2008, la répartition des ETM est la suivante :  As : les concentrations en As sont particulièrement différentes pour les huit sites. Par ordre de concentrations décroissantes, les valeurs obtenues sont particulièrement élevées pour les espèces collectées à Niolon, à Caball Bernat et à Cap l'Abeille (178,72 à 116,21 µg/g) ;

 Cd : les différences de concentrations en Cd sont légères entre les tissus d’éponges des différents sites avec des valeurs assez faibles excepté pour le site de Niolon. Les valeurs la plus forte et la plus faible correspond à Niolon (1,98 µg/g) et Costa Blanca (0,07 µg/g) respectivement ;

 Cr : nous observons des différences significatives pour les concentrations en Cr pour les échantillons des huit sites. Les plus fortes valeurs ont été obtenus par ordre de concentration décroissante à Niolon, Jarre, Caball Bernat et Cap l'Abeille (28,47 à 7,80 µg/g) ;

 Cu : pour les huit sites, les différences en concentrations de Cu dans les tissus d’éponges sont significatives. La plus forte valeur a été enregistrée à Niolon (80,93 µg/g). Les concentrations à Cap l'Abeille, Agia Pelagia, Caball Bernat et L'Estartit sont également fortes et relativement homogènes (54,41 à 38,64 µg/g) par rapport aux autres sites. Entre Banyuls et L’Estartit, les valeurs enregistrées sont homogènes dans cette région. De même pour les échantillons de Corse ;

 Fe : nous observons de grandes différences de concentrations en Fe pour les échantillons des huit sites. Les plus fortes valeurs enregistrées ont été obtenues à Niolon, Caball Bernat Cap l'Abeille, L'Estartit (> 9134 µg/g à 4303,60 µg/g). Une 200

forte concentration est également enregistrée à Agia Pelagia (1680,87 µg/g) par rapport aux autres sites. Enfin, on observe des valeurs assez homogènes en Fe sont trouvées à Riou Marseille, et à la Pointe de la Revellata et Punta Bianca en Corse (422,80 à 650,60 µg/g) ;

 Pb : les concentrations de Pb sont largement différentes dans les tissus d’éponges des huit sites. La plus forte valeur a été obtenue à Niolon (187,19 µg/g). L’éponge récoltée à L’Estartit présente également une forte valeur (14,13 µg/g). Les concentrations en Pb sont élevées et homogène pour les échantillons de Caball Bernat et Cap l'Abeille à Banyuls (7,07 et 8,07 µg/g respectivement), avec une tendance similaire est également observée pour les échantillons récoltés en Corse : Pointe de la Revellata et Punta Bianca (4,07 et 4,16 µg/g, respectivement). Enfin, les plus faibles valeurs ont été enregistrées à Agia Pelagia et Riou (2,27 et 2,41 µg/g respectivement).

Globalement, nous observons des tendances similaires chez les espèces collectées en 2009 à Niolon et de Riou à Marseille à l’exception du Fe et du Pb pour le site de Riou. Pour ces deux éléments, l’espèce Ircinia oros a accumulé des quantités plus importantes en ETM en 2009 qu’en 2008.

7. 1. 2. Bioaccumulation des ETM par Ircinia variabilis

L’espèce Ircinia variabilis a été collectée en France (Plane à Marseille, la Bibliothèque et le Golfe de Porto en Corse), en Grèce-Crète (île de Dia) et Ceuta (Ciclon de Fuera et Callejones) et au Liban (Selaata 1 et 2). Les différents échantillons ont principalement été collectés en 2009. Le Tableau 18 regroupe les concentrations moyennes pour les 6 ETM accumulés dans les tissus d’Ircinia variabilis pour l’ensemble des sites de collecte.

Tableau 18 : Concentrations moyennes en As, Cd, Cr, Cu, Fe et Pb dans les tissus d’ I. variabilis en µg/g de masse sèche sèche (moyenne ± écart-type).

Références Concentrations des ETM en µg/g Echantillons As ± Cd ± Cr ± Cu ± Fe ± Pb ± Ma4-14 2007 71,81 30,13 0,31 0,15 2,23 0,71 32,74 9,76 2406,90 911,50 10,37 1,00 Gr2-09 2008 77,04 6,12 0,46 0,05 3,23 0,13 25,79 1,73 373,50 28,60 1,41 0,17 Co2-19 2008 65,63 2,77 0,47 0,02 7,71 0,48 23,58 2,16 778,30 142,00 1,88 0,28 Co3-08 2008 28,82 6,39 0,22 0,04 4,31 0,13 14,20 3,89 2203,80 365,30 2,16 0,23 Ma4-17 2008 56,80 29,13 0,28 0,18 2,19 0,51 25,67 9,03 2204,20 862,85 5,14 0,81 Ce1-04 2009 549,61 63,43 0,87 0,06 0,69 0,13 10,29 1,36 341,10 40,60 0,44 0,12

201

Ce7-06 2009 39,60 1,48 0,62 0,02 16,79 0,41 10,07 0,20 9004,40 204,10 5,81 0,01 Lb13-01 2009 66,27 6,26 0,89 0,06 17,93 1,13 24,34 2,61 4567,36 317,60 2,85 0,21 Lb3-01 2009 85,86 5,54 0,74 0,07 9,39 1,19 21,65 2,46 2023,00 357,45 1,42 0,28 Ca : Monaco ; Ce : Ceuta ; Co : Corse ; Gr : Grèce ; Lb : Liban ; Ma : Marseille.

De façon identique aux données obtenues pour Ircinia oros, nous avons réalisé une analyse par classification hiérarchique ascendante (CHA) afin de comparer les variations spatiales en termes d’accumulation des 6 ETM en 2009 pour l’ensemble des sites. Le dendrogramme obtenu est représenté dans la Figure 140.

Figure 140 : Analyse par CHA des différents ETM bioaccumulés par l’espèce Ircinia variabilis en France Marseille (Plane à Marseille et La Bibliothèque, le Golfe de Porto en Corse), en Grèce-Crète (île de Dia) en 2008 (méthode de Ward avec une distance Euclidienne).

Nous constatons que deux groupes de sites présentent une divergence de 55 % environ ; nous avons obtenu des résultats similaires pour l’ensemble des analyses par CHA réalisées avec différentes méthodes. Le premier groupe est constitué par les sites Plane et Golfe de Porto, pour lesquels nous observons des concentrations relativement homogènes pour Cd (0,22 et 0,28 µg/g) et Fe (2204,20 et 2203,80 µg/g) et avec une divergence de 45 % pour les autres éléments : As, Cr, Cu et Pb. Les éponges collectées à Plane présentent globalement des concentrations en ETM plus élevées que l’ensemble des autres éponges. Le second groupe est constitué des éponges de deux sites de La Bibliothèque en Corse et de l’île de Dia en Grèce-Crète, qui présentent des concentrations relativement homogènes en As, Cd, Cu et Pb, avec une divergence de moins de 10 %.

Pour les espèces collectées en 2008, la répartition des différents ETM est la suivante :

202

 As : les plus fortes concentrations en As ont été enregistrées par ordre de concentrations décroissantes pour l’île de Dia en Grèce-Crète, la Bibliothèque en Corse et Plane à Marseille (77,04 à 56,80 µg/g). La plus faible concentration a été mesurée dans la Calanque de Piana (Golfe de Porto) en Corse (28,82 µg/g) ;

 Cd : nous observons une variabilité spatiale pour le Cd similaire à celle de l’As ;

 Cr : les concentrations en Cr sont particulièrement élevées au niveau des éponges récoltées en Corse notamment pour le site la Bibliothèque (7,71 µg/g). Au niveau des autres sites les valeurs obtenues sont relativement homogènes ;

 Cu : les concentrations en Cu sont particulièrement élevées et homogènes dans les tissus d’Ircinia variabilis pour l’île de Dia en Grèce-Crète, Plane à Marseille et La Bibliothèque en Corse (23,58 à 25,79 µg/g). La valeur la plus faible est obtenue en Corse au niveau du Golfe de Porto (14,20 µg/g) ;

 Fe : nous observons des concentrations élevées et homogènes en Fe dans les tissus d’éponges des deux sites: Plane à Marseille et le Golfe de Porto en Corse (2204,20 et 2203,80 µg/g). La valeur la plus faible est obtenue pour l’île de Dia en Grèce-Crète (373,50 µg/g) ;

 Pb : la concentration en Pb est particulièrement élevée dans les échantillons récoltés à Plane à Marseille. Les deux sites en Corse (Golfe de Porto et la Bibliothèque), ainsi que l’île de Dia en Grèce-Crète présentent des valeurs plus faibles et relativement homogènes en Pb (1,41 à 2,16 µg/g).

Une seconde analyse par CHA a été réalisée afin de comparer les ETM bioaccumulés dans les tissus d'Ircinia variabilis collectés en 2009, sur 4 sites différents de ceux de 2008 : Ceuta (Ciclon de Fuera et Callejones) et le Liban (Selaata 1 : falaise, à l'entrée du port et Selaata 2 : un peu plus éloigné vers le nord). Pour le dendrogramme de la Figure 141, nous constatons que deux groupes de sites présentent une divergence de 30 % environ ; nous avons obtenu des résultats similaires pour l’ensemble des analyses par CHA réalisées, que Fe soit inclus ou exclut dans les analyses.

203

Figure 141 : Analyse par CHA des différents ETM bioaccumulés par l’espèce Ircinia variabilis à Ceuta (Ciclon de Fuera et Callejones) et au Liban (Selaata 1 et 2) en 2009 (méthode de Ward avec une distance Eulidienne).

Le premier groupe est uniquement constitué de l’échantillon récolté à Ciclon de Fuera. Ce site se distingue des autres par une forte concentration en As (549,61 µg/g) dans les tissus d’Ircinia variabilis. Le deuxième groupe est constitué de Callejones à Ceuta et des deux sites de Selaata 1 et 2 au Liban. Ces deux sites présentent une divergence d’environ 50 % principalement pour les concentrations de Fe, Cu et Pb par ordre de concentration décroissante, alors qu’ils convergent pour les concentrations en As, Cr et Cd, par ordre de concentration décroissante. Enfin, les deux sites de Selaata au Liban divergent de 10 % environ, principalement pour la quantité de Fe bioaccumulée dans les tissus d’éponge Ircinia variabilis.

La répartition des ETM pour les espèces collectées en 2009 est la suivante :

 As : la plus forte concentration en As a été enregistrée pour Ciclon de Fuera à Ceuta (549,61 µg/g), et la plus faible à Callejones - Ceuta (39,60 µg/g). Les deux sites de Selaata - Liban présentent des valeurs relativement homogènes (85,85 et 66,27 µg/g) ;

 Cd : les concentrations en Cd sont relativement homogènes pour l’ensemble des sites étudiés (0,62 à 0,89 µg/g) ;

 Cr : les plus fortes concentrations en Cr ont été enregistrées dans les échantillons de Selaata 2 - Liban et Callejones-Ceuta (17,93 et 16,79 µg/g respectivement). La plus

204

faible concentration a été enregistrée à Ciclon de Fuera-Ceuta (0,69 µg/g). Les deux sites de Selaata au Liban présentent des valeurs très hétérogènes (17,93 µg/g pour Selaata 2 contre 9,39 µg/g pour Selaata 1) ;

 Cu : les plus fortes concentrations en Cu ont été enregistrées au niveau des éponges du Liban : Selaata 1 et Selaata 2 (21,65 et 24,34 µg/g respectivement). De façon identique, on observe des concentrations plus faibles et homogènes à Ceuta Ciclon de Fuera et Callejones (10,29 et 10,07 µg/g respectivement) ;

 Fe : la plus forte concentration en Fe a été enregistrée pour Callejones - Ceuta (9004,40 µg/g), et la plus faible concentration a été mesurée à Ciclon de Fuera - Ceuta (341,10 µg/g). Les tissus d’éponges des deux sites de Selaata au Liban présentent des valeurs élevées et hétérogènes (4567,36 µg/g pour Selaata 2 et 2023,00 µg/g pour Selaata 1) ;

 Pb : nous observons les mêmes caractéristiques que pour la répartition du Fe. La plus forte concentration en Pb dans les tissus d’Ircinia variabilis a été enregistrée pour Callejones - Ceuta (5,81 µg/g), et la plus faible concentration a été mesurée à Ciclon de Fuera - Ceuta (0,44 µg/g). Les deux sites de Selaata - Liban présentent des valeurs bioaccumulées légèrement plus élevées et hétérogènes (1,42 µg/g pour Selaata 1 et 2,85 µg/g pour Selaata 2).

7. 1. 3. Bioaccumulation des ETM par Sarcotragus spinosulus

Les différents échantillons ont été collectés à Ceuta (Ciclon de Tierra), au Liban (Batroun - mur phénicien), en France - Marseille (Niolon) et en Grèce-Crète (Agia Pelagia et île de Dia). Niolon (en 2009) et Agia Pelagia (en 2008) étant des sites de prélèvement communs pour Ircinia oros ; et l’île de Dia (en 2008) étant le site de prélèvement commun pour Ircinia variabilis. Par rapport aux deux autres espèces I. oros et I. variabilis, S. spinosulus est l’espèce pour laquelle nous avons la plus faible représentativité en termes de variabilité spatiale. Le Tableau 19 regroupe les concentrations moyennes pour les 6 ETM accumulés dans les tissus de S. spinosulus, pour l’ensemble des sites étudiés.

205

Tableau 19 : Concentrations moyennes en As, Cd, Cr, Cu, Fe et Pb dans les tissus de Sarcotragus spinosulus en µg/g de masse sèche sèche (moyenne ± écart-type).

Références Concentrations des ETM en µg/g Echantillons As ± Cd ± Cr ± Cu ± Fe ± Pb ± Gr1-21 2008 129,39 0,49 0,28 0,01 2,79 0,11 39,47 0,35 512,40 5,80 0,79 0,02 Gr2-03 2008 119,03 3,52 0,22 0,01 0,14 0,03 36,50 0,87 113,10 3,00 0,24 0,06 Ce2-01 2009 94,69 0,41 0,40 0,02 1,22 0,44 20,09 0,29 1150,80 474,10 0,98 0,24 Lb8-01 2009 90,04 10,42 0,54 0,06 15,09 1,77 40,53 2,05 6322,00 340,50 3,82 0,57 Ma8-12 2009 142,93 13,47 1,57 0,18 18,47 2,17 67,29 4,79 > 9134* - 146,17 9,84 Ce : Ceuta ; Gr : Grèce ; Lb : Liban ; Ma : Marseille ;* : dépassent la limite supérieure de linéarité.

Nous avons réalisé une analyse par CHA pour les 6 ETM accumulés en 2009. Sur le dendrogramme obtenu, représenté dans la Figure 142, nous constatons que deux groupes de sites présentent une divergence de 80 % environ. Deux groupes de bioaccumulation suivant les sites présentent une divergence de 80 % environ.

Figure 142 : Analyse par CHA des différents ETM bioaccumulés par l’espèce Sarcotragus spinosulsus à Marseille (Niolon), Liban (Batroun) et Ceuta (Ciclon de tierra) en 2009 (méthode de Ward avec une distance Euclidienne).

Le premier groupe est uniquement constitué par l’échantillon prélevé à Niolon - Marseille qui se distingue des autres sites par de plus fortes concentrations en ETM. Le second groupe est constitué par les échantillons prélevés des deux sites : Ceuta (Ciclon de Tierra) et le Liban (Batroun mur- phénicien). Ces deux sites présentent une divergence de 18 % environ, principalement pour les concentrations de Fe, Cu, Cr et Pb, par ordre de concentration décroissante, qui sont particulièrement élevées pour le Liban.

Pour les deux espèces collectées en Grèce-Crète (Agia Pelagia et île de Dia) en 2008, les concentrations dans les tissus de l’éponge S. spinosulsus sont sensiblement plus élevées pour Agia Pelagia, en particulier pour Fe (512,40 contre 113,10 µg/g), Cr (0,41 contre 2,79 µg/g) et Pb (0,79 contre 0,24 µg/g).

206

De fortes différences de concentrations en As bioaccumulé sont observées pour les trois sites. La valeur la plus élevée a été obtenue pour Niolon (142,93 µg/g), alors que pour Ceuta (Ciclon de Tierra) et le Liban (Batroun- mur phénicien) les concentrations sont relativement homogènes (94,69 et 90,04 µg/g, respectivement).

7. 2. Discussions

Les résultats que nous avons obtenus semblent indiquer que les éponges étudiées, Ircinia oros, Ircinia variabilis et Sarcotragus spinosulus, ne régulent pas ou très faiblement les concentrations en As, Cr, Cu, Fe et Pb dans leurs tissus, puisque l’on observe une variabilité importante en fonction des sites considérés. Le cas du Cd est plus délicat puisqu’il ne semble pas être accumulé au-delà d’un certain seuil, en particulier chez Ircinia variabilis qui semble, en revanche, se distinguer par sa forte capacité à accumuler As. Les espèces Ircinia oros et Sarcotragus spinosulus semblent pour leur part, posséder une forte capacité à accumuler Pb.

Pour les trois espèces, les fortes variations spatiales pour l’accumulation de certains ETM tendent à indiquer que de nombreux sites en Méditerranée se distingueraient par une forte pollution par certains ETM. C’est notamment le cas pour les sites de Niolon - Marseille, de Ceuta et du Liban.

Le site de Ceuta : Les trois sites d’échantillonnage sont situés le long de la côte marocaine du détroit de Gibraltar, à l’embouchure du port. A Ceuta, de forts courants traversent le détroit, tant verticaux qu’horizontaux, avec des gradients de température et de salinité qui varient constamment, notamment du fait des marées de l’océan Atlantique. Globalement, l’eau de l’Atlantique rentre par le détroit en surface, alors que l’eau de Méditerranée, plus salée et plus pauvre en nutriments, sort en profondeur du fait de sa densité. Il n’y a pas d’activités industrielles importantes à proximité de Ceuta, et par voie de conséquence, la contamination en ETM n’est due qu’aux rejets des égouts, de l’influence urbaine ainsi que de l’activité navale (Guerra-Garcia et Garcia-Gomez, 2005). D’importantes concentrations de Fe

207 bioaccumulées dans les tissus d’I. variabilis et de S. spinosulus et prélevées respectivement à Callejones et à Ciclon de Tierra, marquent très probablement l’influence des rejets d’égouts. La concentration élevée en Cr à Callejones observée au niveau des tissus d’I. variabilis s’explique par la possibilité de son association à des hydrocarbures dont les niveaux sont fortement élevés dans le port voisinant(Guerra-Garcia et Garcia-Gomez, 2005). A Ciclon de Fuera, la concentration particulièrement élevée en As accumulé au niveau des tissus d’I. variabilis, pourrait être la conséquence d’un rejet d’égouts.

Le site de Mazarron : Localisé sur la Costa Blanca dans la Province d’Alicante, c’est un haut lieu du tourisme européen avec 96 % de la côte linéaire urbanisée. Deux anciens sites miniers à 4 km de la côte causent encore un enrichissement en As, Fe et Pb de la rivière la Rambla de las Moreras. Traversant les terres minières ainsi que la ville de Mazarron (Oyarzun et al., 2010), cette rivière se déverse sur la Costa Blanca où les ETM sont bioaccumulés au niveau des tissus de l’espèce Ircinia oros récoltée.

L’Estartit et Banyuls Ces deux sites sont proches géographiquement. L’Estartit est une zone balnéaire au nord-est des côtes espagnoles. Cette zone est considérée comme relativement protégée et est notamment réputée pour ses fonds marins avec les îles Medes à proximité (Cebrian et al., 2007). Cette zone présente une concentration assez élevée en Pb. Ce résultat est sans doute lié au fait que ce site est une zone à haute activité touristique, où la plongée est couramment pratiquée et où le trafic maritime est important. En 2003, la bioaccumulation de certains ETM chez les quatre espèces Chondosia reniformis, Crambe crambe, Phorbas tenacior et Dysidea avara prélevées à La Pilona (à proximité de Blanes) a été mesurée (Cebrian et al., 2007). La physiologie des ces éponges ainsi que la période de leur récolte sont différentes de celles de Ircinia oros prélevée dans la même région en 2008. Cependant, et contrairement aux éponges prélevées en 2003 qui régulent le Pb, Ircinia oros présente des taux d’accumulations de cet élément avoisinant celui du sédiment en 2003. Le Cu est accumulé chez I. oros à des taux relativement élevés par rapport à la moyenne accumulée chez les espèces et le sédiment en 2003.

Banyuls est sur la côte française, près de la frontière de la côte espagnole et séparée de L’Estartit par le parc naturel de Cap Creus. Les valeurs au niveau de cette zone semblent un

208 peu plus élevées que la moyenne. Ceci peut être expliqué par plusieurs facteurs tels que le courant liguro-provençal susceptible de drainer des alluvions du Rhône enrichis en Arsenic, mais aussi le traitement des vignes des coteaux de Banyuls qui forment la principale activité économique des quatre communes de la région viticole.

Le site de Niolon à Marseille :  ce site est à quelques mètres de la station d’épuration Le Rove-Niolon à capacité de 1500 équivalent habitant seulement (http://sierm.eaurmc.fr/rejets-collectivites/infos- gales-step.php?dept=13&station=060913088002&nomStation=LE%20ROVE%20- %20NIOLON) et à environ 2 km du site pollué de l’ancienne métallurgie Metaleurop

de l’Estaque qui était spécialisée dans la fabrication de trioxyde d’arsenic As2O3. Ce site reste actuellement pollué (Sauzade et al., 2007). De ce fait, l’As est bioaccumulé au niveau des deux espèces Ircinia oros et Sarcotragus spinosulus prélevées sur ce site, présentant ainsi les taux les plus élevés d’As parmi tous les échantillons ;

 les valeurs du Cu sont particulièrement élevées pour les espèces I. variabilis et S. spinosulus prélevées sur ce site. La proximité d’anciennes usines spécialisées dans la production d’acide sulfurique par grillage de pyrites cuivreuses peut vraisemblablement expliquer les tendances observées.

Pour Fe, Pb, et Cr bioaccumulés par les échantillons prélevés du site de Niolon, elles marquent fortement l’influence de la station d’épuration :

 la teneur en Pb marque également l’effet de l’anthropisation depuis les années 1920, où 57 % provient de l’activité industrielle et 43 % de l’essence pour les automobiles. Cette teneur a diminuédepuis 1976 suite à la limitation internationale du Pb dans les essences ;

 les fortes concentrations en Fe enregistrées pour les éponges collectées dans la région de Marseille et précisément à Niolon, peuvent être sans doute expliquées par

l’utilisation de FeCl2 en tant qu’agent de coagulation pour le traitement physico- chimique des rejets des eaux usées à la station d’épuration Le Rouve-Niolon.

Des études réalisées sur l’espèce Spongia officinalis récoltée en 1999 au niveau de ce même site (Perez et al., 2005), donnent des concentrations de bioaccumulation en As , Cd, Cu et Fe (> 9134 µg/g) de la même gamme que les espèces Sarcotragus spinosulus et Ircinia oros 209 récoltées en 2008 et 2009. Cependant, les Irciniidae accumulent environ 10 fois plus de Pb et 2 à 3 fois plus de Cr que l’espèce Spongia officinalis.

Les sites Riou, Jarre et Plane à Marseille : Ces trois autres points de prélèvements sont dans la zone de la crique de Cortiou, à l’est de Marseille, où se trouve le rejet du centre d’épuration de l’agglomération marseillaise dont ils subissent plus ou moins l’influence (Perez et al., 2005). Le flux de déchets provenant de ces égouts est principalement dirigé vers l’Ouest par les courants et les vents qui provoquent sa dilution selon un gradient. Depuis 1987, une sédimentation chimique assistée est mise en œuvre, le traitement est à présent adapté pour la filtration de matériel en suspension (> 2 µm) et est également efficace pour le traitement du Cu et du Fe à hauteur de 40 % et 70 % respectivement. La rétention du matériel en suspension s’est traduite par une réduction significative de polluants dans la région de Cortiou. Cependant, une bioaccumulation du Fe relativement élevée reste perceptible au niveau des deux espèces Ircinia oros et Ircinia variablis prélevées dans cette région. Une importante bioaccumulation de Cr est également perceptible au niveau de l’espèce Ircinia oros à Jarre.

De façon générale, les espèces prélevées à Marseille, présentent une très forte accumulation pour de nombreux éléments tels que Fe, As, Cu, Cr et Pb.

Le site de l’île Plane : Les résultats sur Spongia officinalis récoltée en 1999 (Perez et al., 2005) montrent que cette dernière accumule 2 fois plus As et 7 fois plus de Fe que Ircinia variabilis récoltée en 2007 et 2008. La même gamme d’accumulation de Cd, Cu et Cr se présente au niveau des deux espèces. Cependant, Ircinia variabilis en 2007 et 2008 accumule 9 fois plus de Pb que Spongia officinalis en 1999.

Le site de Jarre : L’espèce Ircinia oros récoltée en 2007 accumule 10 fois plus de Fe et de Pb que Spongia officinalis récoltée en 1999 (Perez et al., 2005). Cette bioaccumulation est légèrement plus élevée en Cr et As chez I. oros, tandis que Cu et Cd présentent la même gamme d’accumulation chez les deux espèces.

210

Le site de Riou : L’espèce Spongia officinalis prélevée en 1999 accumule 4 à 6 fois plus de Fe et 2 fois plus d’As que Ircinia oros prélevée en 2008 et 2009. Des niveaux de concentration similaires en Cu, Cd et Cr ont été mesurés pour les deux espèces, alors qu’une concentration de 4 à 10 fois plus en Pb a été mesurée pour I. oros.

En générale, et tout en considérant que la physiologie des éponges varie d’une espèce à l’autre ainsi que d’une année à l’autre, la bioaccumulation du Cr, Cd, Cu s’avère similaire entre les Irciniidae et Spongia officinalis. Cependant, Pb semble être accumulé à des taux largement supérieurs chez les Irciniidae que chez l’espèce S. officinalis.

Ainsi, pour le site de Riou, les espèces Cliona viridis, Cacospongia scalaris, Chondrosia reniformis, Spongia officinalis, Spongia agaricina et Agelas oroides récoltées en été 1998 (Perez et al., 2004), accumulent mieux Cd que Ircinia oros récoltée en 2009 qui le régule. Pour ce même site Cliona viridis, Cacospongia scalaris, Chondrosia reniformis, Spongia officinalis, Spongia agaricina et agelas oroides de 1998 présentent des profils de bioaccumulation du Cr comparables à Ircinia oros de 2009. As semble être accumulé de la même façon par les espèces Cacospongia scalaris et Cliona viridis et Ircinia oros. Les espèces Spongia officinalis de 1998 et Ircinia oros de 2009, semblent bioaccumuler Fe 2 à 3 fois plus que le reste des espèces étudiées par Perez et al., (2004). Pour Cu, il est accumulé chez Ircinia oros de 2009 à des taux similaires que Agelas oroides, Spongia officinalis, Spongia agaricina et Cacospongia scalaris de 1998 (Perez et al., 2004) ; il est cependant moins accumulé chez Cliona viridis et Chondrosia réniformis, les faibles volumes des chambres choanocytaires de cette dernière lui empêche de retenir Cu (Cebrian et al., 2007). Pb est bioaccumulé chez I. oros de 2009 à des taux similaires que Spongia officinalis, Spongia agaricina, Cacospongia scalaris et Cliona viridis de 1998 (Perez et al., 2004) ; ce taux est supérieur à celui d’Agelas oroides et Chondrosia reniformis.

En Corse : Ircinia oros présente à Punta Bianca et à la pointe de la Revellata, les mêmes tendances de bioaccumulations des différents éléments mesurés. Ces faibles concentrations dans les tissus de cette espèce marquent des eaux non contaminées par des ETM. Cependant, pour l’espèce Ircinia variabilis récoltée à la Bibliothèque et dans le Golfe de Porto : des concentrations en

211

Cu et Cr légèrement plus élevées à la Bibliothèque seraient une conséquence des peintures antifouling des bateaux, ainsi que des effluents provenant de Calvi. La concentration en Fe dans le Golfe de Porto est le résultat d’une pollution anthropique des rejets de la ville et du port.

En Grèce : Agia Pelagia est une destination touristique importante. Des concentrations plus ou moins élevées en Cu, Fe et As, ont été obtenues ; Cu provenant probablement des peintures antifouling utilisées pour les bateaux dans une zone assez fréquentée par les touristes. Le taux d’As élevé provenant de l’agro-industrie de la ville, et celui du Fe, des effluents. L’île de Dia (Gr2) se situe près du Cap nord-ouest, est une île inhabitée. Ceci explique un taux relativement bas des différents ETM mesurés, à l’exception de l’As dont la présence non attendue serait la résultante soit d’une contamination accidentelle, soit d’une pollution ponctuelle à l’île.

Les sites de Selaata et Batroun au Liban : Les éponges I. variabilis ou S. spinosulus, présentent une forte bioaccumulation en As, Cu, Cr et Fe au niveau des deux sites. Ces éléments sont entièrement d’origine anthropique, dans un pays où 20 000 usines s’étendent sur une côte de 220 Km de long. Une usine d’engrais chimique à Selaata justifie les taux assez élevés de Fe et de Cu accumulés dans les tissus des éponges récoltées ; Cu provenant également des peintures antifouling utilisées pour les bateaux dans le port de Batroun. Concernant les fortes teneurs en As bioaccumulées chez les deux espèces et au niveau des deux sites, elles sont très probablement les résultantes de la pêche au poison qui utilise l’As comme élément de base. Cette pratique de pêche est fréquente et presque de coutume chez certains pêcheurs libanais. Les concentrations particulièrement élevées en Cr sont caractéristiques de l’activité d’une tannerie située à proximité de ces sites ; les peintures des bateaux contribuent sans doute aussi à ces valeurs importantes. Il est important de signaler que l’usine d’engrais de Selaata libère 0,4 T/an de Cd dans l’atmosphère (Nakhle, 2003). Cet élément, bien qu’il soit régulé par l’éponge, est présent dans ses taux les plus élevés à Selaata, dans Ircinia variabilis. Pour ce site à Selaata, une étude effectuée sur l’espèce Hippospongia communis récoltée en 2001 et 2002 (Nakhle, 2003), révèle des taux d’accumulations en Pb et Cd largement inférieurs (de l’ordre de 100 à 1 000 moins) que ceux de Ircinia variabilis en 2009.

212

8. Conclusion

Dans le cadre de cette troisième partie, nous avons réalisé une étude comparative de l’accumulation de 6 ETM : As, Cd, Cr, Cu, Fe et Pb ; par trois éponges méditerranéennes de la famille Irciniidae : Ircinia oros, Ircinia variabilis et Sarcotragus spinosulus. Il s’agit, à notre connaissance, de la première étude réalisée sur (i) des éponges de la famille Irciniidae, et (ii) un ensemble de sites en Méditerranée. Les résultats que nous avons obtenus semblent indiquer que l’accumulation des ETM par les différentes éponges est sensiblement similaire entre les espèces et très variable en fonction du degré de pollution d'un site considéré. L’ensemble des trois espèces offre des avantages indéniables en termes de biosurveillance d’une pollution par les ETM. En effet, il semble que la bioaccumulation d’une grande majorité des éléments puisse être décrite par une stratégie d’accumulation. On a pu observer également une légère sélectivité pour l’accumulation de certains ETM. Ircinia oros semble présenter une grande aptitude à accumuler Pb, alors que pour Ircinia variabilis, il s’agirait plutôt de As. Des études complémentaires sont nécessaires pour évaluer la localisation cellulaire et les sites de liaisons des ETM, afin d’obtenir des informations essentielles sur les mécanismes de la bioaccumulation et de la détoxification des ETM dans les éponges. Cette étude montre que de nombreux sites en Méditerranée sont et/ou restent relativement très pollués par certains ETM, notamment à Ceuta en Espagne et Marseille en France, et les sites du Liban.

213

V. CONCLUSION GENERALE

Ce mémoire, consacré à l’étude des spongiaires de la famille Irciniidae qui ont été récoltés dans le cadre du programme ECIMAR de l’ANR Biodiversité, comporte trois volets principaux.

Dans un premier temps, nous avons abordé les problèmes d’identification et de classification des différentes espèces par une approche chimiotaxonomique. Jusqu’alors les espèces étaient principalement identifiées sur la base de critères morphologiques avec plus ou moins de succès. Parmi les différentes approches pour la classification des éponges marines, l’étude des profils chimiques ou empreintes métabolomiques en combinaison avec les analyses statistiques multivariées n’a pas été envisagée jusqu’ici. Ainsi, nous avons mené une étude sur des critères morphologiques par la taxonomie usuelle et, de façon conjointe, sur des empreintes chimiques par RMN du proton, pour obtenir autant que possible la description la plus précise pour les différentes espèces. Les résultats obtenus ont permis de montrer que les genres Ircinia et Sarcotragus forment deux groupes bien distincts. Nous avons également pu mettre en évidence plusieurs marqueurs chimiotaxonomiques potentiels des différentes espèces. Ainsi, pour les Ircinia, les ircinines -1 et -2 sont les marqueurs potentiels de I. oros, la palinurine celui de I. dendroides et la fasciculatine celui de I. variabilis. Pour les Sarcotragus, les polyprénylhydroquinones sulfates et, dans certains cas, les polyprénylhydroquinones hydroxylées semblent être des marqueurs chimiotaxonomiques de l’espèce S. spinosulus. Les travaux d’isolement et d’élucidation structurale nous ont permis d’identifier un nouveau congénère de ces derniers : une nonaprénylhydroquinone hydroxylée sur la seconde position isoprène. Enfin, les dérivés acide 4’-hydroxy-3’-polyprénylbenzoïque semblent être caractéristiques des S. foetidus. La métabolomique par RMN du proton s’est révélée particulièrement bien adaptée pour différencier finement, du point de vue chimique, les différentes espèces. Il s’agit d’une méthode très efficace, rapide, riche en informations et convenant parfaitement à l’étude d’une famille d’éponges riche en métabolites secondaires bioactifs qui présentent des différences très fines.

214

La caractérisation détaillée obtenue nous a ainsi permis de mieux appréhender les objectifs des deux parties suivantes : l’étude des composés volatils puis la bioaccumulation des éléments traces métalliques par ces éponges Irciniidae. Bien que les composés volatils jouent un rôle non négligeable dans la signalisation chimique en écologie chimique marine, les données de la littérature restent très faibles en particulier pour les spongiaires. Ce constat est la conséquence des problèmes liés principalement à l’extraction et à l’analyse des substances volatiles. Pour l’ensemble de ces raisons, nous avons développé dans la seconde partie de ce travail, un protocole standardisé d’extraction et d’analyse des composés volatils des spongiaires basé sur la micro-extraction en phase solide (SPME) de l’espace de tête suivie d’une analyse en Chromatographie Gazeuse (GC) couplée à la Spectrométrie de Masse (MS). Cette méthodologie s’est révélée particulièrement efficace pour mener une étude comparative sur les espèces S. spinosulus, I. oros, I. variabilis et I. dendroides récoltées à Ceuta (au détroit de Gibraltar), à Costa Blanca (en Espagne) et à Marseille (en France). Dans cette étude, les espèces étudiées présentent de nombreux composés volatils en commun, notamment ceux issus des différentes voies de dégradation des acides gras ou des dérivés soufrés à l’origine de l’odeur nauséabonde qui les caractérisent. En revanche, elles se distinguent pour certains dérivés probablement issus de la dégradation des métabolites secondaires les plus lourds, ou à l’inverse, dont ils sont les précurseurs. Cette étude nous a permis d’enrichir et d’élargir les connaissances sur la composition en composés de faibles poids moléculaires de cette famille d’éponge, principalement pour Sarcotragus.

Enfin, nous avons réalisé, dans le dernier volet, une étude comparative de la bioaccumulation de six éléments traces métalliques : As, Cd, Cr, Cu, Fe et Pb ; pour les trois espèces : I. oros, I. variabilis et S. spinosulus, récoltées de la Méditerranée occidentale à la Méditerranée orientale. Parmi les différentes approches d’évaluation et de suivi du degré de pollution, celles qui font appel aux spongiaires restent prometteuses. Les éponges marines bio-indicatrices ont été relativement peu utilisées en tant que sentinelles de l’état de l’environnement. Bien qu’elles soient cosmopolitaines et sensibles aux conditions environnementales, les Irciniidae n’ont encore jamais été évaluées en tant qu’espèces modèles. Nos études ont permis d’obtenir une vision globale de la bioaccumulation des ETM par cette famille d’éponges. Les différentes espèces sont le reflet, en fonction de leur capacité de bioaccumulation, du degré de pollution des différents sites étudiés. Entre les espèces, les différences en termes de bioaccumulation sont subtiles, à l’image des fines différences biologiques qui existent entre elles. Ainsi, Pb est préférentiellement bioaccumulé par I. oros et As par I. variabilis. En

215 revanche, Cd semble être plutôt régulé par les trois espèces. Nous avons pu ainsi obtenir une vision globale sur l’état environnemental méditerranéen. Il en ressort que les sites de Ceuta (Espagne), Marseille (France) et Selaata (Liban) sont très pollués par certains ETM.

Au bilan, le projet de recherche dédié aux éponges Irciniidae de Méditerranée qui m’a été confié, est le fruit d’une vision pluridisciplinaire au point de convergence entre le savoir faire du taxonomiste, de l’écologiste et du chimiste des substances naturelles marines. Tout au long de ce travail, nous tentons d’éclaircir certaines incertitudes des données de la littérature et testons quelques approches sans précédents sur cette famille de spongiaires. D’autres études sont bien sûr encore nécessaires afin de mieux comprendre et affiner les modèles que nous avons bâtis pour analyser finement les différences entre les espèces. Ces étapes d’optimisation des méthodes d’analyse et la construction des modèles d’étude sont les premiers pas pour analyser l’influence de facteurs biotiques et abiotiques sur ces espèces. La mortalité massive des éponges Irciniidae en Méditerranée au mois d’août en est un exemple. L’élévation de la température de l’eau de mer semble avoir des effets néfastes sur les bactéries symbiontes associées. Quelles sont les conséquences sur la production des métabolites secondaires ou des composés volatils ?

216

VI. OUVRAGES ET REALISATIONS

Mar. Drugs 2011, 9, 1210-1219; doi:10.3390/md9071210 OPEN ACCESS Marine Drugs ISSN 1660-3397 www.mdpi.com/journal/marinedrugs Article A New Hydroxylated Nonaprenylhydroquinone from the Mediterranean Marine Sponge Sarcotragus spinosulus

Charline Abed 1,2, Nathalie Legrave 1, Maeva Dufies 3, Guillaume Robert 3, Vincent Guérineau 4, Jean Vacelet 2, Patrick Auberger 3, Philippe Amade 1 and Mohamed Mehiri 1,*

1 Chemistry Laboratory of Biomolecules and Aroma, Nice Institute of Chemistry, UFR of Sciences, University of Nice-Sophia Antipolis, UMR-CNRS 6001, Parc Valrose, F-06108 Nice Cedex 02, France; E-Mails: [email protected] (C.A.); [email protected] (N.L.); [email protected] (P.A.) 2 Marseille Oceanology Center, University of Aix-Marseille, CNRS UMR 6540 DIMAR, Endoume Marine Station, Batterie des Lions Street, 13007 Marseille, France; E-Mail: [email protected] 3 INSERM UMR 895, Team 2, Cell Death Differentiation and Cancer, Batiment ARCHIMED, 151 Saint-Antoine de Ginestiere Road, BP2 3194, 06204 Nice Cedex 3, France; E-Mails: [email protected] (M.D.); [email protected] (G.R.); [email protected] (P.A.) 4 Centre de Recherche de Gif, Institut de Chimie des Substances Naturelles, CNRS, Avenue de la Terrasse, 91198 Gif-sur-Yvette Cedex, France; E-Mail: [email protected]

* Author to whom correspondence should be addressed; E-Mail: [email protected]; Tel.: +33-492-076-154; Fax: +33-492-076-151.

Received: 23 May 2011; in revised form: 16 June 2011 / Accepted: 23 June 2011 / Published: 7 July 2011

Abstract: Chemical investigation of the Mediterranean sponge Sarcotragus spinosulus led to the isolation of a new hydroxylated nonaprenylhydroquinone, along with two known metabolites, hepta- and octaprenylhydroquinones. The structure of the new metabolite was assigned by extensive 1D and 2D NMR

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analyses and MS studies. The antileukemic effect of the three compounds towards the chronic myelogenous leukemia (CML) cells line K562 was also evaluated.

Keywords: sponges; Sarcotragus spinosulus; marine natural products; hydroxylated polyprenylhydroquinone; bioactivity

1. Introduction

Several linear and cyclic prenylated hydroquinones and related secondary metabolites have been isolated from sponges [1–6], tunicates [7,8], and algae [9,10]. A large number of linear polyprenylhydroquinones have been isolated from sponges, especially from the Irciniidae family (mainly from the genera Ircinia and Sarcotragus). Biological studies conducted on several polyprenylhydroquinones showed them to have a moderate antibacterial [11,12], antiviral [13], anti-inflammatory [14,15], and phospholipase A2 activity [15]. These linear polyprenylhydroquinones could be further divided in two main groups with polyprenylhydroquinones sulfates [16–20] and hydroxylated polyprenylhydroquinones. To date only four hydroxylated polyprenylhydroquinones [5,6,20,21] have been isolated from Sarcotragus spinosulus (under the name Ircinia spinosula). They have been shown to have an enhanced antibacterial, anti-inflammatory, cytotoxic [12,15], and antioxidant activity [22] potentially associated to the presence of the hydroxyl group on the prenyl side chain. In the course of our search for bioactive marine natural products, we have investigated the Mediterranean marine sponge Sarcotragus spinosulus (Dictyoceratida, Irciniidae) collected from Callejones, Ceuta. In this paper we report the isolation and structural elucidation of a new hydroxylated nonaprenylhydroquinone, along with two known polyprenylhydroquinones, hepta- and octaprenylhydroquinones. We also report the antileukemic effect of the three compounds towards the chronic myelogenous leukemia (CML) cells line K562.

2. Results and Discussion

The CH2Cl2/MeOH (1:1, v/v) crude extract of Sarcotragus spinosulus was fractionated by Flash Vacuum Liquid Chromatography, eluting with a gradient of decreasing polarity from

H2O to MeOH. The subsequent MeOH fraction was purified by semipreparative reverse- phase HPLC (Phenomenex Luna C6-Pheny, 250 × 10 mm id, 5 µm, gradient

H2O/MeCN/Formic Acid, 96:04:0.1 to 0:100:0.1) to afford pure compounds 1 (41.7 mg), 2 (30.6 mg), and 3 (4.7 mg) (Figure 1).

218

Figure 1. Structure of compounds 1, 2, and 3.

37 38 R 39 OH 1 5 9 1' H 3 7 11 2 4 6 8 10 5' 3' n

1 R=H n=4 2 R=H n=5 3 R=OH n=6

A preliminary NMR spectral analysis of all isolated compounds showed similarities and strongly supported the presence of a 2-polyprenylhydroquinone skeleton in each. Compounds 1–3 showed the same UV (280 nm) and IR (3350, 1500, 1445, 910, 785, 730 cm−1) spectra, indicating the presence of a monosubstituted hydroquinone structure. This was supported by the occurrence of three aromatic protons in the 1H NMR spectrum, two doublets at δ 6.56 (J = 8.5 Hz) and 6.52 (J = 3.0 Hz), and a double doublet at δ 6.57 (J = 8.5 and 3.0 Hz). An extensive examination of the spectroscopic data (IR, UV, 1D and 2D NMR, and MS spectra) of 1 and 2 led to their identification as hepta- and octaprenylhydroquinones, respectively. All spectral data of 1 and 2 were in agreement with previous published data [2,4]. The 1H- and 13C-NMR spectra of compound 3 were similar to those of compounds 1 and 2, except for the presence of signals at δ 4.06 (2H) and δ 60.0, respectively, in the 1H and 13C NMR spectra (Table 1), assigned to the primary alcohol group of the side chain, and small differences in the chemical shifts around the OH group. Further examinations of the 1H- and 13C-NMR data of 3 led to its identification as a hydroxylated polyprenylhydroquinone, close analogues of which have been previously isolated from S. spinosulus [5,6,20,21]. The molecular formula C51H78O3 of 3 was deduced from the HR-MALDITOF-MS data which showed a pseudomolecular adduct ion at m/z 845.4874 + 107 [M + Ag] (Calcd. for C51H78 AgO3 845.5001) [23]. Thus, NMR and MS data of 3 led to its identification as a hydroxylated nonaprenylhydroquinone in which one of the methyls has been oxidized to hydroxymethylene. The position of the OH group was unequivocally assigned on the second isoprene unit based on the shift of the olefinic proton H-6 to δ 5.25 (vs. 5.10 in polyprenylhydroquinone), and key H-4/H-5/H-6 COSY correlations. Confirmation was given by the key H-38/C-6, H-38/C-7, and H-38/C-8 HMBC correlations. Thus, the new natural product 3 was identified as 2′-[38-Hydroxy]nonaprenyl-1′,4′-hydroquinone. Finally, the configurations of double bonds were all assigned as E by 1H and 13C NMR chemical shifts (δ 1.68–1.54 and 17.8–16.1 for 1H and 13C, respectively) of the vinyl methyls [24].

219

1 13 Table 1. H NMR (500 MHz, CD3OD) and C NMR (125 MHz, CD3OD) data of compound 3.

No. δC (ppm) Mult. δH (ppm) J (Hz) Mult. COSY HMBC 1′ 148.9 qC

2′ 130.2 qC

3′ 117.2 CH 6.52 3.00 d 1 1, 1′, 4′, 5′ 4′ 151.1 qC

5′ 113.8 CH 6.41 8.50, 3.00 dd 6′ 3′, 4′ 6′ 116.5 CH 6.56 8.50 d 5′ 1, 1′, 2, 5′ 1 29.1 CH2 3.22 7.33 d 2 1′, 2′, 3, 3′ 2 124.0 CH 5.30 m 1 1, 4

3 136.8 qC

4 40.9 CH 1.98 m 5 2 5 27.7 CH 2.16 m 4, 6 3, 4, 6, 7 2 6 128.8 CH 5.25 m 5

7 139.4 qC

8 35.9 CH 2.11 m 9 9, 6, 10, 38 2 9 27.7 CH 2.05 m 8, 10 2 10 125.6 CH 5.10 m 9

11 135.8 qC

12 40.9 CH 1.96 m 2 13 27.7 CH 2.05 m 2 14 125.6 CH 5.10 m

Table 1. Cont. 15 135.8 qC

16 40.9 CH 1.96 m 2 17 27.7 CH 2.05 m 2 18 125.6 CH 5.10 m

19 135.8 qC

20 40.9 CH 1.96 m 2 21 27.7 CH 2.05 m 2 22 125.6 CH 5.10 m

23 135.8 qC

24 40.9 CH 1.96 m 2 25 27.7 CH 2.05 m 2 26 125.6 CH 5.10 m

27 135.8 qC

28 40.9 CH 1.96 m 2 29 27.7 CH 2.05 m 2 30 125.6 CH 5.10 m

31 135.8 qC

32 40.9 CH 1.96 m 2 33 27.7 CH 2.05 m 2 34 125.6 CH 5.10 m

35 135.8 qC

220

36 25.9 CH 1.65 s 34, 45 3 37 16.2 CH 1.69 s 1, 2 2, 3, 4 3 38 60.0 CH 4.06 s 6, 7, 8 2 39 16.2 CH 1.58 s 3 40 16.2 CH 1.58 s 3 41 16.2 CH 1.58 s 3 42 16.2 CH 1.58 s 3 43 16.2 CH 1.58 s 3 44 16.2 CH 1.58 s 3 45 17.8 CH 1.58 s 3 To the best of our knowledge this is the first report on the isolation and structure identification of a hydroxylated nonaprenylhydroquinone. Until now, four hydroxylated polyprenylhydroquinones have been reported: two heptaprenyl bearing the OH group on the first [20] and fifth prenyl moiety [6]; and two octaprenyl congeners bearing the OH group on the fourth [21] and fifth [5] isoprene unit. From a chemotaxonomic point of view hydroxylated polyprenylhydroquinones could constitute potential markers for S. spinosulus species. The metabolites 1–3 were evaluated for their potential antileukemic effect towards the chronic myelogenous leukemia (CML) cells line K562, which is widely used for cytotoxicity assays. The effect of compounds 1–3 was compared with that of Imatinib, the leading compound to treat patients suffering CML. This compound has proven very efficient in killing Bcr-Abl-positive cells in a caspase-dependent manner [25,26]. The IC50 values for Imatinib and compounds 1–3 for loss of cell metabolism (XTT assay) and cell number are given in Table 2. Table 2. IC50 values for Imatinib and compounds 1–3 for loss of cell metabolism (XTT assay) and cell number. Cells (15 × 104/mL) were incubated for 48 h at 37 °C with either increasing concentration of compounds 1–3 in the 2.5–250 µM range or with Imatinib in the 0.1–2.5 µM range. Cell metabolism was measured using the XTT assay and cell numbers was assessed by flow cytometry as indicated in the Experimental section. IC50 values are representative of three experiments made in quadruplicate. Cell metabolism Cell number Compounds (IC50) (IC50) 1 8 7 2 10 12 3 193 191 Imatinib 0.4 0.5

Compounds 1 and 2 inhibited cell metabolism and cell number with very similar IC50 values (around 10 µM). Compound 3 was less efficient that the two former compounds with

IC50 values of 193 and 191 µM, respectively. As a control, Imatinib was shown to inhibit cell metabolism and cell number with IC50 values of 0.4 and 0.5 µM, respectively, in agreement with previous results [26].

221

As compounds 1 and 2 were also found to induce annexin V externalisation in K562 cells (not shown), it is likely that the main mechanism by which both compounds inhibit cells metabolism and cells number is by inducing apoptosis.

3. Experimental Section

3.1. General

All organic solvents used for material extraction were of analytical grade and purchased from Merck (Darmstadt, Germany). Acetonitrile used for HPLC was of HPLC-grade and purchased from Fisher, USA. Formic acid of HPLC grade was purchased from Acros, USA. 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB, used as the matrix for MALDI-TOF experiments, was of the highest grade available and used without further purification) and Silver trifluoroacetate (AgTFA, used as the cationizing agent) were purchased from Sigma Aldrich Co. The Chromabond C18 preparative column used for flash chromatography was obtained from Merck, USA. Imatinib was kindly provided by Novartis Pharma. UV measurements were performed on a Varian Cary 300 Scan UV-visible spectrometer. IR spectra were obtained with a Perkin-Elmer Paragon 1000 FT-IR spectrometer. Flash chromatography was performed on an Armen Instrument Spot Liquid Chromatography system, the detection wavelength was set at 254 nm. HPLC purifications were carried out on a Waters 600 system equipped with a Waters 717 plus autosampler, a Waters 996 photodiode array detector, and a Sedex 55 evaporative light-scattering detector (SEDERE, France). Detection wavelengths were set at 214, 254 and 280 nm. 1H and 13C NMR spectra were recorded with 500 MHz Bruker Avance NMR spectrometers. Chemical shifts (δ) are recorded in ppm with CD3OD (δH 3.31 ppm and δC 49.0 ppm) as internal standards with multiplicity (s, singlet; d, doublet; t, triplet; m, multiplet). High resolution mass spectra (HRMALDITOFMS) were conducted on a Perseptive Voyager DE-STR MALDI-TOF mass spectrometer (Perseptive Biosystems, Framingham, MA, USA), equipped with a 337 nm pulsed nitrogen laser (20 Hz) and a Acqiris® 2 GHz digitizer board, was used for all experiments. Mass spectra were obtained in reflectron positive ion mode with the following settings: accelerating voltage 20 kV, grid voltage 62% of accelerating voltage, extraction delay time of 100 ns. The laser intensity was set just above the ion generation threshold to obtain peaks with the highest possible signal-to- noise (S/N) ratio without significant peak broadening. All data were processed using the Data Explorer software package (Applied Biosystems).

3.2. Sponge Material

A sponge sample of Sarcotragus spinosulus (Schmidt, 1862) (Figure 2) (Demospongiae, Dictyoceratida, Irciniidae) was collected by hand using scuba at a depth of about 10 m from Callejones, Ceuta in June 2009. Taxonomic examination of the sponge was made by the authors (C.A. and J.V). The sponge shape is massive and subspherical. The color in situ is dark grey exterior, white to beige interior, and in EtOH the flesh color turned slightly to reddish. The texture is difficult to tear and has a firm and compressible consistency. The ectosome is unarmoured, thick with conules (1 to 2 mm height) irregularly scattered over the entire surface. The choanosome is cavernous. Its skeleton consists of laminated primary and secondary fibers and comprises very dense spongin filaments. Primary fibers (90 to 180 µm diameter) are pithed and clear of foreign detritus. Secondary fibers (50 to 100 µm diameter) are uncored, and the spongin filaments are long with a very thin diameter of 0.7 to 2 µm. A sponge sample (090618Ce7-05) is kept in the

222 sponge collection of the Centre d’Océanologie de Marseille (Station Marine d’Endoume, France). The sponge was kept frozen until the extraction process.

Figure 2. Sarcotragus spinosulus.

3.3. Extraction and Isolation

A portion of S. spinosulus was freeze-dried and ground to obtain a dry powder (20 g), which was exhaustively extracted with a mixture of MeOH/CH2Cl2 (1:1, v/v) to yield 2.2 g of the crude extract after concentration under reduced pressure. The crude extract was fractionated by RP-C18 flash chromatography (elution with a decreasing polarity gradient of

H2O/MeOH from 1:0 to 0:1, then MeOH/CH2Cl2 from 1:0 to 0:1) (flow: 10 mL/min). The MeOH fraction (448 mg) was then subjected to semi-preparative HPLC-DAD (Phenomenex

Luna C6-Pheny, 250 × 10 mm id, 5 µm) with a gradient of H2O/MeCN/Formic acid 96:4:0.1 to 0:100:0.1) (flow: 3.0 mL/min, injection volume: 100 µL) to afford pure compounds 1–3. All of them were identified by a combination of spectroscopic methods (1D and 2D NMR, MS) and comparison with the literature data [2,4].

3.4. Characterization Data

+ 107 Compound 1: HR-MALDITOF-MS m/z 693.3808 [M + Ag] (Calcd. for C41H62 AgO2, 693.3795); For 1H NMR and 13C NMR data see [2,4].

+ 107 Compound 2: HR-MALDITOF-MS m/z 761.4389 [M + Ag] (Calcd. for C46H70 AgO2, 761.4421); For 1H and 13C NMR data see [2,4].

−1 Compound 3: yellow solid; IR (CHC13) 3350, 1500, 1445, 910, 785, 730 cm , UV λmax (MeOH) 280 nm (ε 2500); HR-MALDITOF-MS m/z 845.4874 [M + Ag]+ (Calcd. for 107 1 13 C51H78 AgO3, 845.5001); For H NMR (500 MHz) and C NMR (125 MHz) data see Table 1.

223

3.5. Biological Activity

Cell Line: The human CML K562 cell line was provided by ATCC and were grown at 37 °C under 10% CO2 in RPMI 1640 medium (Gibco BRL, Paisley, UK) supplemented with 5% FCS (Gibco BRL, Paisley, UK) completed with 50 units/mL penicillin, 50 mg/mL streptomycin and 1 mM sodium pyruvate. Measurement of Cell Metabolism (XTT): Cells (15 × 104/mL) were incubated with 1, 2 or 3 for the times indicated. 50 mL of XTT reagent (sodium 39-[1-(phenylaminocarbonyl)-3,4- tetrazolium]-bis (4-methoxy-6-nitro)benzene sulfonic acid hydrate) was added to each well. Absorbance of the formazan dye produced by metabolically active cells was measured at 490 nm as described earlier [27]. Each assay was performed in quadruplicate. Cell death measurement: After the indicated treatment, cells were harvested and percentage of viability was measured by propidium iodide (PI) staining (0.5 Ag/mL) and flow cytometry analysis in FL-3.

4. Conclusions

A new hydroxylated nonaprenylhydroquinone, 2′-[38-Hydroxy]nonaprenyl-1′,4′- hydroquinone, along with two known metabolites, hepta- and octaprenyl-1′,4′-hydroquinones, have been isolated from the Mediterranean marine sponge Sarcotragus spinosulus. These compounds exhibited a good activity against K562 cells which will warrant further analysis at the molecular level and offer promising opportunities for the development of new antitumor agents.

Acknowledgments

This work was partially funded by the ECIMAR program (ANR-06-BDIV-001) of the French National Agency for Research. We are grateful to the Lebanese National Council for Scientific Research and EGIDE for financial support (C.A). Finally, we are grateful to T. Perez and all the diver scientists of the ECIMAR program who provided us with the specimens.

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224

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225

Dysidea sp. as a proton-potassium ATPase inhibitor. Experientia 1987, 43, 1233–1234. 17. Stonik, V.A.; Makarieva, T.N.; Dmitrenok, A.S. Sarcochromenol sulfates A–C and Sarcohydroquinone sulfates A–C, new natural products from the sponge Sarcotragus spinulosus. J. Nat. Prod. 1992, 55, 1256–1260. 18. De Rosa, S.; Crispino, A.; De Guilio, A.; Iodice, C.; Milone, A. Sulfated polyprenylhydroquinones from the sponge Ircinia spinosula. J. Nat. Prod. 1995, 58, 1450–1454. 19. Wakimoto, T.; Maruyama, A.; Matsunaga, S.; Fusetani N. Octa- and Nonaprenylhydroquinone Sulfates, Inhibitors of αl,3-Fucosyltransferase VII, from an Australian Marine Sponge Sarcotragus sp. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999, 9, 727–730. 20. Bifulco, G.; Bruno, I.; Minale, L.; Riccio, R.; Debitus, C.; Bourdy, G.; Vassas, A.;

Lavayre, J. Bioactive prenylhydroquinones sulfates and a novel C31 furanoterpene alcohol sulfate from the marine sponge, Ircinia sp. J. Nat. Prod. 1995, 58, 1444–1449. 21. Erdogan, I.; Tanaka, J.; Higa, T.; Sener, B. Terpenoids from two sponge species of the Aegean Sea. Nat. Prod. Sci. 1999, 5, 177–180. 22. Tziveleka, L.A.; Kourounakis, A.P.; Kourounakis, P.N.; Roussis, V.; Vagias, C. Antioxidant potential of natural and synthesised polyprenylated hydroquinones. Bioorg. Med. Chem. 2002, 10, 935–939. 23. Direct analysis of long polyprenylhydroquinones by electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) or MALDITOF-MS often produces poor results requiring off- line time and sample-consuming derivatization techniques. Thus, silver trifluoroacetate was used as indicated in the experimental section to promote cationization of the isolated compounds by intense formation of [M + Ag]+ adducts. 24. Formally, the side-chain OH group gives rise to one (Z)-configured C=C bond, but the parent C=C arrangement remains (all-E). 25. Jacquel, A.; Herrant, M.; Legros, L.; Belhacene, N.; Luciano, F.; Pages, G.; Hofman, P.; Auberger, P. Imatinib induces mitochondria-dependent apoptosis of the Bcr-Abl positive K562 cell line and its differentiation towards the erythroid lineage. FASEB J. 2003, 17, 2160–2162. 26. Jacquel, A.; Colosetti, P.; Grosso, S.; Belhacene, N.; Puissant, A.; Marchetti, S.; Breittmayer, J.P.; Auberger, P. Apoptosis and erythroid differentiation triggered by Bcr- Abl inhibitors in CML cell lines are fully distinguishable processes that exhibit different sensitivity to caspase inhibition. Oncogene 2007, 26, 2445–2458. 27. Puissant, A.; Grosso, S.; Jacquel, A.; Belhacene, N.; Colosetti, P.; Cassuto, J.P.; Auberger, P. Imatinib mesylate-resistant human chronic myelogenous leukemia cell lines exhibit high sensitivity to the phytoalexin resveratrol. FASEB J. 2008, 22, 1894–1904.

Samples Availability: Available from the authors.

226

© 2011 by the authors; licensee MDPI, Basel, Switzerland. This article is an open access article distributed under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution license (http://creativecommons.org/licenses/by/3.0/).

227

6th European Conference on Marine Natural Products, Porto – Portugal (19 - 23 Juillet 2009) Communication orale CIIMAR - CEQUIMED (Université de Porto)

Chemotaxonomy as valuable approach to study sponges of the family IRCINIIDAE (Porifera, Dictyoceratida) Charline Abed1, Gaby Khalaf3, Ghazi Bitar4, Olivier P. Thomas2, Mohamed Mehiri2, Thierry Perez1 1 DIMAR - UMR 6540, Station Marine d’Endoume, rue de la Batterie des Lions, 13007 Marseille, France. 2 LCMBA - UMR 6001 - University of Nice Sophia Antipolis, Parc Valrose, 06108 Nice, France. 3 National Centre of Marine Sciences, Batroun, Lebanon, 4 Lebanese University, Hadeth, Lebanon. E-mail: [email protected]

Marine sponges of the Dictyoceratida order represent a rich source of unusual secondary metabolites of the terpene family. Among these sponges, the family IRCINIIDAE yield many bioactive terpenes exhibiting antibacterial, antiviral, cytotoxic and anti-inflammatory activities, but also reported as valuable chemotaxonomic markers.1, 2 The taxonomic classification of the IRCINIIDAE family is still unclear, notably the status of Sarcotragus is viewed as uncertain and the distinction of some Ircinia species remains a polemic subject because of the plastic nature of these species.3 To clarify this biological classification disorder, we used a chemotaxonomical approach. The HPLC chemical fingerprints of 33 sponges of the IRCINIIDAE family collected from six different areas over the Mediterranean Sea: Gibraltar Straits (Ceuta - Spain), North Western basin (Marseilles and Corsica island - France, and Monaco) and Eastern basin (Crete - Greece and Lebanon) were obtained. The data were processed and analyzed by multivariate analyses (HCA) and, according to their synapomorphic chemical markers, we identified seven different chemical groups. In the present study, we showed that Ircinia and Sarcotragus genera are chemically characterized by chemotaxonomic markers belonging to furanoterpenes and prenylated hydroquinones families respectively. The bioactivity of the isolated secondary metabolites was also studied and some of the linear prenylated hydroquinones displayed moderate antioxidant properties compared to Vitamin E.

1 Perry, N. B.; Battershill, C. N.; Blunt, J. W.; Fenwick, G. D.; Munro, M. H. G.; Bergquist, P. R. Biochem. Syst. Ecol. 1987, 15: 373-376. 2 Bergquist, P. R. Sponges; Hutchinson of London: London, 1978; pp 202-216. 3 Cook, S. C. & Bergquist, P. R. 2002. Systema Porifera: A Guide to the classification of sponges. Hooper, J. N. A. & Van Soest, R. W. M. eds. Kluwer Academic/Plenum Publ., New York: 1022 - 1027.

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Etude chimiotaxonomique des éponges de la famille des IRCINIIDAE (Porifera, Dictyoceratida)

ABED Charline*(1), KHALAF Gaby (3), BITAR Ghazi (4), PEREZ Thierry (1), FERAL Jean- Pierre (1), THOMAS P. Olivier (2), AMADE Philippe (2) et MEHIRI Mohamed (2)

(1) DIMAR – UMR 6540, Station Marine d’Endoume, rue de la Batterie des Lions, 13007 Marseille, France. (2) LCMBA – UMR 6001 – Université de Nice Sophia Antipolis, Parc Valrose, 06108 Nice, France. (3) Centre National des Sciences Marines, Batroun, Liban. (4) Université Libanaise, Hadeth, Liban.

Les éponges marines de l’ordre des Dictyocératides sont une source riche en métabolites secondaires non-usuels de nature terpénique. Dans cet ordre, la famille des IRCINIIDAE contient plusieurs terpènes qui : (i) possèdent un large spectre d’activités biologiques (antibactériennes, antivirales, cytotoxiques et anti-inflammatoires) ; (ii) sont considérés comme des marqueurs chimiotaxonomiques potentiels de cette famille.1, 2 La classification taxonomique des IRCINIIDAE n’est toujours pas clarifiée. Le statut de Sarcotragus est incertain et la distinction de certaines espèces d’Ircinia reste un sujet polémique en raison de la nature plastique de ces espèces et l’absence de critères morphologiques robustes permettant de les distinguer facilement.3 Pour tenter de clarifier ce désordre de la classification biologique, nous avons utilisé une approche chimiotaxonomique. Les empreintes chimiques par HPLC de 33 éponges appartenant à la famille des IRCINIIDAE, récoltées dans six différents sites de la Mer Méditerranée : détroit de Gibraltar (Ceuta - Espagne), bassin nord occidental (Marseille et l’île de Corse - France, et Monaco) et bassin oriental (Crète - Grèce et Liban), ont été obtenues. Les résultats ont été traités par analyses multivariées (HCA) et nous avons pu ainsi identifier sept groupes chimiques selon leurs marqueurs synapomorphiques. Ainsi, nous avons pu démontrer que les genres Ircinia et Sarcotragus sont caractérisés, d’un point de vue chimique, par des marqueurs chimiotaxonomiques appartenant, respectivement, aux familles des furanoterpènes et des hydroquinones prénylées. L’activité biologique des métabolites secondaires isolés a également été recherchée et quelques hydroquinones linéaires prénylées ont démontré des propriétés antioxydantes modérées par rapport à la Vitamine E.

Figure 1 : De l’échantillonnage jusqu’au dendrogramme chimiotaxonomique.

[1] Perry, N. B.; Battershill, C. N.; Blunt, J. W.; Fenwick, G. D.; Munro, M. H. G.; Bergquist, P. R. Biochem. Syst. Ecol. 1987, 15: 373-376. [2] Bergquist, P. R. Sponges; Hutchinson of London: London, 1978; pp 202-216. [3] Cook, S. C. & Bergquist, P. R. 2002. Systema Porifera: A Guide to the classification of sponges. Hooper, J. N. A. & Van Soest, R. W. M. eds. Kluwer Academic/Plenum Publ., New York: 1022 - 1027.

* Contact : [email protected] 229

Journées Franco-Italiennes de Chimie 2010, Gêne – Italie (26 – 27 Avril 2010) Poster Société Chimique de France SCF (Section Régionale, PACA)

Comparative Study on the Volatile Constituents of Marine Sponges of The IRCINIIDAE Family Collected From Gibraltar C. Abeda, J. J. Filippib, C. Castelb, J. Vaceleta, G. Bitarc, J. P. Férala, P. Amadeb, M. Mehirib, a DIMAR – UMR 6540, Station Marine d’Endoume, rue de la Batterie des Lions, 13007 Marseille, France b LCMBA – UMR 6001 – Université de Nice Sophia Antipolis, Parc Valrose, 06108 Nice, France c Université Libanaise, Hadeth, Liban

[email protected] Marine sponges of the IRCINIIDAE family (Porifera, Dictyoceratida) represent a rich source of unusual bioactive terpenes exhibiting antibacterial, antiviral, cytotoxic and anti-inflammatory activities. For several species among this family, the knowledge on their volatile constituents and their potential ecological role remains very scarce. Sponges of the genus Ircinia were described to exude low-molecular-weight volatile compounds (e.g., dimethyl sulfide, methyl isocyanide, methyl isothiocyanate) that give these sponges a characteristic strong and unpleasant odor. 1 Their ecological role as potential defenses against predatory fish has been evaluated.2 To date, the volatile constituents of sponges of the genus Sarcotragus have not been studied, though their odor is no lighter than the associated genus Ircinia from the same family. We report a comparative GC-MS analysis of the volatile components of S. spinosulus, I. oros, I. variabilis and I. dendroides, collected from Ceuta and Casablanca (Gibraltar, Mediterranean Sea), using static headspace solid phase microextraction (HS-SPME). The impact of different parameters (e.g., sample weight, fiber coating , extraction time and temperature) were evaluated to determine the best conditions of analysis. Comparison of the volatile chemical fingerprint of the studied species showed some significant differences that can represent a valuable complementary identification tool when combined with the associated non volatile secondary metabolites composition and the morphological characters of the sponges.

1 Duque C., Bonilla A., Bautista E., Zea S., 2001. Exudation of low molecular weight compounds (thiobismethane, methyl isocyanide, and methyl isothiocyanate) as a possible chemical defense mechanism in the marine sponge Ircinia felix. Biochem. Syst. Ecol. 29: 459-467.

2 Pawlik J., McFall G., Zea S., 2002. Does the odor from sponges of the genus Ircinia protect them from fish predators? J. Chem. Ecol. 28: 1103-1115.

230

ETUDE COMPARATIVE DE LA BIOACCUMULATION D’ELEMENTS TRACES METALLIQUES PAR LES IRCINIIDAE EN MEDITERRANEE

ABED Charline, a COUVIDAT Julien, c HUREL Charlotte, c MARMIER Nicolas, c BITAR Ghazi, d VACELET Jean, a FERAL Jean-pierre, a AMADE philippe b et MEHIRI Mohamed b

a DIMAR – UMR 6540, Station Marine d’Endoume, rue de la Batterie des Lions, 13007 Marseille, France. b LCMBA – UMR 6001 – Université de Nice Sophia Antipolis, Parc Valrose, 06108 Nice, France. c LRSAE – UMR 6001 – Université de Nice Sophia Antipolis, Parc Valrose, 06108 Nice, France. d Université Libanaise, Hadeth, Liban.

E-mail: [email protected]

La Méditerranée recèle une biodiversité marine exceptionnelle puisqu'elle représente 8 à 9 % de la diversité spécifique marine mondiale pour beaucoup moins de 1 % de l'ensemble des océans, tant en volume : 0,2 % soit 3,7 x 106 km3 ; qu'en surface : 0,7 % soit 2,5 x 106 km2. Plusieurs espèces marines sont fort probablement dans un état vulnérable ou même sur le point de s’éteindre, sans que l’on soit alerté. Ce triste constat est une des conséquences de la très forte pression anthropique sur la Méditerranée qui souffre depuis plusieurs années de nombreux dérèglements liés aux changements climatiques et aux nombreuses catastrophes écologiques, dont l'impact influence le fonctionnement et la productivité de sa biodiversité.

La pollution par les Eléments Traces Métalliques (ETM) est l’un des problèmes rencontré, conséquence del’industrialisation et l’urbanisation croissante des zones côtières. C’est dans ce cadre que la notion de bioindicateurs a été développée, avec le choix d’un organisme pour ses caractéristiques de bioaccumulation d’un ou plusieurs ETM, pour rendre compte, sur une échelle de temps assez large, des quantités d’ETM auxquels un organisme peut-être exposé. Parmi les différents bioindicateurs potentiels, l’intérêt grandissant pour les éponges marines est lié : d’une part, à ce qu’elles constituent une des plus grandes réserves sous- marines en biomasse et qu’on les trouve dans la plupart des eaux du globe, et, d’autre part, à ce qu’elles abritent une richesse exceptionnelle du point de vue de la chimiodiversité. Ces animaux benthiques (donc caractéristiques d'un biotope) qui sont exclusivement filtreurs, pourraient-ils bioaccumuler les Elements Traces Métalliques ? Connues pour résister à de grandes variations des conditions écologiques, les éponges pourraient être un organisme sentinelle dans le cadre de la surveillance environnementale des milieux marins.

Dans cette étude, nous nous sommes intéressés à l’accumulation de 6 éléments traces métalliques (ETM) par trois espèces d’éponges récoltées autour de la Méditerranée appartenant toutes à la famille des Irciniidae : Ircinia oros, Ircinia variabilis et Sarcotragus spinosulus. Cette étude nous a permis de montrer que de nombreux sites en Méditerranée sont et/ ou restent relativement très pollués par certains ETM, notamment Ceuta (Maroc), Marseille (France) et les sites étudiés au Liban.

231

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VIII. ANNEXES

Annexe 1

Les différentes espèces acceptées appartenant à la famille des Irciniidae selon World Porifera Database (http://www.marinespecies.org/porifera/porifera.php?p=taxlist).

Ircinia acuta (Hyatt, 1877) Ircinia acuta var. longispina (Hyatt, 1877) Ircinia akaroa Cook & Bergquist, 1999 Ircinia anomala (Dendy, 1905) Ircinia arundinacea Carter, 1880 Ircinia arbuscula (Hyatt, 1877) Ircinia aruensis (Hentschel, 1912) Ircinia atrovirens (Keller, 1889) Ircinia aucklandensis Cook & Bergquist, 1999 Ircinia cactiformis Rao, 1941 Ircinia cactus (Lendenfeld, 1889) Ircinia caliculata (Lendenfeld, 1888) Ircinia campana (Lamarck, 1814) Ircinia chevreuxi (Topsent, 1894) Ircinia clathrata Carter, 1881 Ircinia clavata Thiele, 1905 Ircinia collectrix (Poléjaeff, 1884) Ircinia condensa (Topsent, 1894) Ircinia conulosa (Ridley, 1884) Ircinia cuspidata Wilson, 1902 Ircinia cylindracea Vacelet, Vasseur & Lévi, 1976 Ircinia dendroides (Schmidt, 1862) Ircinia dendroides (Polejaeff, 1884) Ircinia dendroides dura (Lendenfeld, 1889) Ircinia dickinsoni (de Laubenfels, 1936) Ircinia digitata (Topsent, 1894) Ircinia echinata (Keller, 1889) Ircinia ectofibrosa (George & Wilson, 1919) Ircinia favosa (Lieberkühn, 1859) Ircinia felix (Duchassaing & Michelotti, 1864) Ircinia felix fistularis Verrill, 1907 Ircinia filamentosa (Lamarck, 1814) Ircinia fistulosa Cook & Bergquist, 1999 Ircinia flagelliformis (Carter, 1886) Ircinia friabilis (Polejaeff, 1884) Ircinia fusca (Carter, 1880) Ircinia hummelincki Van Soest, 1978 Ircinia intertexta (Hyatt, 1877) Ircinia irregularis (Poléjaeff, 1884) Ircinia lendenfeldi de Laubenfels, 1948 Ircinia marginalis (Duchassaing & Michelotti, 1864) 285

Ircinia microconulosa Pulitzer-Finali, 1982 Ircinia mutans Wilson, 1925 Ircinia novaezealandiae Bergquist, 1961 Ircinia oligoceras (Poléjaeff, 1884) Ircinia oros (Schmidt, 1864) Ircinia pauciarenaria Boury-Esnault, 1973 Ircinia paucifilamentosa Vacelet, 1961 Ircinia paupera (Thiele, 1905) Ircinia pellita Rao, 1941 Ircinia pilosa Pulitzer-Finali, 1982 Ircinia pinna Hentschel, 1912 Ircinia procumbens (Polejaeff, 1884) Ircinia ramodigitata Burton, 1934 Ircinia ramosa (Keller, 1889) Ircinia rectilinea (Lamarck, 1813) Ircinia reteplana (Topsent, 1923) Ircinia retidermata Pulitzer-Finali & Pronzato, 1981 Ircinia rubra (Lendenfeld, 1889) Ircinia schulzei Dendy, 1905 Ircinia selaginea (Lamarck, 1814) Ircinia solida (Esper, 1794) Ircinia solida (Carter, 1885) Ircinia spiculosa Hentschel, 1912 Ircinia stipitata (Topsent, 1894) Ircinia strobilina (Lamarck, 1816) Ircinia subaspera Cook & Bergquist, 1999 Ircinia tintinnabula (Duchassaing & Michelotti, 1864) Ircinia tristis (Duchassaing & Michelotti, 1864) Ircinia truncata (Topsent, 1894) Ircinia tuberosa Dendy, 1905 Ircinia turrita Cook & Bergquist, 1999 Ircinia undulans Cook & Bergquist, 1999 Ircinia vallata Dendy, 1887 Ircinia variabilis (Schmidt, 1862) Ircinia verrucosa (Ferrer-Hernandez, 1914) Ircinia vestibulata (Szymanski, 1904) Ircinia wistarii Wilkinson, 1978

Psammocinia amodes Cook & Bergquist, 1998 Psammocinia arenosa (Lendenfeld, 1888) Psammocinia beresfordae Cook & Bergquist, 1996 Psammocinia bulbosa Bergquist, 1995 Psammocinia charadrodes Cook & Bergquist, 1998 Psammocinia compacta (Poléjaeff, 1884) Psammocinia conulosa Lee & Sim, 2004 Psammocinia jejuensis Sim, 1998 Psammocinia halmiformis (Lendenfeld, 1888) Psammocinia hawere Cook & Bergquist, 1996 Psammocinia hirsuta Cook & Bergquist, 1998 Psammocinia lobatus Sim & Lee, 2002

286

Psammocinia mammiformis Sim, 1998 Psammocinia maorimotu Cook & Bergquist, 1998 Psammocinia mosulpia Sim, 1998 Psammocinia papillata Cook & Bergquist, 1998 Psammocinia perforodosa Cook & Bergquist, 1998 Psammocinia rubra Sim & Lee, 2002 Psammocinia samyangensis Sim & Lee, 1998 Psammocinia ulleungensis Lee & Sim, 2004 Psammocinia verrucosa Cook & Bergquist, 1996 Psammocinia vesiculifera (Poléjaeff, 1884) Psammocinia wandoensis Sim & Lee, 1998

Sarcotragus aliger (Burton, 1928) Sarcotragus australis (Lendenfeld, 1888) Sarcotragus coreanus (Sim & Lee, 2002) Sarcotragus fasciculatus (Pallas, 1766) Sarcotragus foetidus Schmidt, 1862 = Sarcotragus muscarum Sarcotragus gapaensis Sim & Lee, 2000 Sarcotragus maraensis Sim & Lee, 2000 Sarcotragus myrobalanus (Lamarck, 1814) Sarcotragus pipetta (Schmidt, 1868) Sarcotragus spinosulus Schmidt, 1862 Sarcotragus tuberculatus (Poléjaeff, 1884)

287

Annexe 2

Les échantillons récoltés selon les différentes zones et sites, ainsi que les études réalisées pour chaque échantillon.

Code Analyses Espèce Année Zone Site échantillon réalisées 080612Co1-05 Corse - Stareso Co1 (Pointe de la Revellata) a foetidus 2008 080613Co2-24 Corse - Stareso Co2 (La Bibliothèque) a

070612Lb8-01 2007 Liban Lb8 (Batroun) a ; c 080526Gr1-21 Grèce - Crète Gr1 (Agia Pelagia) a ; c 2008 080527Gr2-03 Grèce - Crète Gr2 (île de Dia) a ; c 090613Cb2-01 spinosulus Espagne - Mazarron Cb2 (Costa Blanca) a ; b

090616Ce2-01 Sarcotragus Espagne - Ceuta Ce2 (Ciclon de Tierra) a ; c 2009 090618Ce7-05 Espagne - Ceuta Ce7 (Callejones) a ; b 090701Ma8-12 France - Marseille Ma8 (Niolon) b ; c 080613Co2-25 2008 Corse - Stareso Co2 (La Bibliothèque) a dendroides 090614Cb3-05 2009 Espagne - Mazarron Cb3 (Costa Blanca) a ; b 070718Ma5-04 2007 France - Marseille Ma5 (Jarre) c 080526Gr1-10 Grèce - Crète Gr1 (Agia Pelagia) a ; c 080526Gr1-13 Grèce - Crète Gr1 (Agia Pelagia) a 080526Gr1-18 Grèce - Crète Gr1 (Agia Pelagia) a 080605Ma4-05 France - Marseille Ma4 (Plane) a 080612Co1-38 Corse - Stareso Co1 (Pointe de la Revellata) c 080616Co4-12 2008 Corse - Stareso Co4 (Punta Bianca) a ; c 080625Ma3-22 oros France - Marseille Ma3 (Riou) a ; c 080626Ma8-16 France - Marseille Ma8 (Niolon) a ; c 080627Es1-08 Espagne - Estartit Es1 (Estartit) a ; c 080728Ba1-18 France - Banyuls Ba1 (Cap d'Abeille) a ; c 080729Ba2-07 France - Banyuls Ba2 (Caball Bernat) a ; c

090613Cb2-03 Espagne - Mazarron Cb2 (Costa Blanca) b ; c

090625Ma3-02 2009 France - Marseille Ma3 (Riou) a ; b ; c 090701Ma8-04 France - Marseille Ma8 (Niolon) a ; b ; c 070717Ma4-14 Ircinia 2007 France - Marseille Ma4 (Plane) c 080524Lb3-02 Liban Lb3 (Selaata) c 080527Gr2-09 Grèce - Crète Gr2 (île de Dia) c 080613Co2-19 Corse - Stareso Co2 (La Bibliothèque) c 2008 Co3 (Golf de Porto Calanque de 080615Co3-08 Corse - Stareso c Piana) 080623Ma4-17 France - Marseille Ma4 (Plane) a ; c 090612Lb13-01 variabilis Liban Lb13 (Selaata) c 090612Lb3-01 Liban Lb3 (Selaata) c 090613Cb2-02 Espagne - Mazarron Cb2 (Costa Blanca) b 090616Cb4-06 Espagne - Mazarron Cb4 (Costa Blanca) b 090617Ce1-04 2009 Espagne - Ceuta Ce1 (Ciclon de Fuera) b ; c 090618Ce7-06 Espagne - Ceuta Ce7 (Callejones) b ; c 090702Ma5-06 France - Marseille Ma5 (Jarre) a 090702Ma5-07 France - Marseille Ma5 (Jarre) b a : chimiotaxonomie par RMN ; b : identification des composés volatils ; c : bioaccumulation des ETM.

288

Annexe 3

Chromatogrammes correspondants aux 1er et 2ème fractionnements de l’échantillon Ircinia dendroides (090614Cb3-05).

Signature chimique de Ircinia dendroides (090614Cb3-05) :

Fractionnement Fraction H2O:

Fraction MeOH/H2O 1:1 :

Fraction MeOH :

Fraction MeOH/CH2Cl2 1:1 :

289

Fraction CH2Cl2 :

Annexe 4

Chromatogrammes correspondants aux 1ers fractionnements de l’échantillon 090702Ma5-06 Ircinia variabilis.

Fractionnement Fraction H2O :

Fraction MeOH/H2O 1:1 :

Fraction MeOH :

Fraction MeOH/CH2Cl2 1:1 :

290

Fraction CH2Cl2 :

Annexe 5 Chromatogrammes correspondants aux 1ers et 2èmes fractionnements de Sarcotragus foetidus (080612Co1-05).

Signature chimique de Sarcotragus foetidus (080612Co1-05) :

1ers fractionnements Fraction MeOH/H2O 1:1 (CH3CN-H2O) :

Fraction MeOH (CH3CN-H2O) :

Fraction MeOH/CH2Cl2 3:1 (CH3CN-H2O) :

Fraction MeOH/H2O 1:1 (AcOEt-Hexane) :

291

Fraction MeOH (AcOEt-Hexane) :

Fraction MeOH/CH2Cl2 3:1 (AcOEt-Hexane) :

2èmes fractionnements issus de la fraction MeOH Fraction F1 CH2Cl2 (CH3CN-H2O) :

Fraction F2 CH2Cl2 (CH3CN-H2O) :

Fraction F3 CH2Cl2 (CH3CN-H2O) :

292

Fraction F4 CH2Cl2 (CH3CN-H2O) :

Fraction CH2Cl2 /MeOH 95:5 F1 (CH3CN-H2O) :

Fraction CH2Cl2 /MeOH 95:5 F2 (CH3CN-H2O) :

Fraction CH2Cl2 /MeOH 90:10 F1 (CH3CN-H2O) :

Fraction CH2Cl2 /MeOH 90:10 F2 (CH3CN-H2O) :

Fraction CH2Cl2 /MeOH 85:15 (CH3CN-H2O) :

293

Fraction CH2Cl2 /MeOH 80:20 (CH3CN-H2O) :

Fraction CH2Cl2 F3 (AcOEt-Hexane) :

Fraction CH2Cl2 F4 (AcOEt-Hexane) :

Fraction CH2Cl2/MeOH 95:5 F2 (AcOet-Hexane) :

Annexe 6 Chromatogrammes correspondants au fractionnement de Sarcotragus spinosulus (090618Ce7-05).

Signature chimique de Sarcotragus spinosulus (090618Ce7-05) :

294

Fractionnement Fraction H2O :

Fraction MeOH/H2O 1:1 :

Fraction MeOH :

Fraction MeOH CH2Cl2 1:1 :

Fraction CH2Cl2 :

295

Annexe 7

Comparaison des différents résultats d’identifications effectués pour chaque échantillon.

Identification sur le Identification par la Identification par la Code terrain taxonomie usuelle chimiotaxonomie 080612Co1-05 Sarcotragus muscarum foetidus foetidus

080613Co2-24 Sarcotragus sp

070612Lb8-01 Ircinia sp (noire) 080526Gr1-21 Sarcotragus sp 080527Gr2-03 Sarcotragus sp

090613Cb2-01 Sarcotragus sp spinosulus spinosulus

Sarcotragus Sarcotragus

090616Ce2-01 Sarcotragus sp 090618Ce7-05 Sarcotragus sp 090701Ma8-12 Sarcotragus sp 080613Co2-25 Ircinia dendroides dendroides dendroides 090614Cb3-05 Ircinia dendroides 070718Ma5-04 Ircinia oros 080526Gr1-10 Ircinia sp 080526Gr1-13 Ircinia oros 080526Gr1-18 Ircinia sp 080605Ma4-05 Ircinia oros 080612Co1-38 Ircinia sp 080616Co4-12 Ircinia oros 080625Ma3-22 Ircinia oros oros oros 080626Ma8-16 Ircinia oros 080627Es1-08 Ircinia sp 080728Ba1-18 Ircinia oros

080729Ba2-07 Ircinia oros

090613Cb2-03 Ircinia oros

090625Ma3-02 Ircinia oros

Ircinia Ircinia 090701Ma8-04 Ircinia oros 070717Ma4-14 Ircinia variabilis 080524Lb3-02 Ircinia cf fasciculata 080527Gr2-09 Ircinia variabilis 080613Co2-19 Ircinia variabilis 080615Co3-08 Ircinia variabilis 080623Ma4-17 Ircinia sp 090612Lb13-01 Ircinia sp (jaune) variabilis variabilis 090612Lb3-01 Ircinia sp (jaune) 090613Cb2-02 Ircinia sp 090616Cb4-06 Ircinia sp 090617Ce1-04 Ircinia variabilis 090618Ce7-06 Ircinia variabilis 090702Ma5-06 Ircinia variabilis 090702Ma5-07 Ircinia variabilis

296

Annexe 8

Profil GC-MS 2D de l’espèce Sarcotragus spinosulus

297

Profil GC-MS 2D de l’espèce Ircinia dendroides

298

Profil GC-MS 2D de l’espèce Ircinia oros

299

Profil GC-MS 2D de l’espèce Ircinia variabilis

300

Annexe 9

Caractéristiques des ETM analysés par ICP-OES.

Limites de Limites de Eléments λ (nm) détection quantification (µg/L) (µg/L) Ag 328,068 0,2 0,66 Al 396,153 19,64 65,48 As 188,979 13,57 45,22 B 249,772 18,57 61,89 Ba 455,403 0,35 1,15 Be 313,107 0,18 0,59 Ca 317,933 83,81 279,36 Cd 214,440 0,35 1,16 Co 228,616 0,74 2,46 Cr 205,560 0,6 2 Cu 327,393 0,27 0,91 Fe 238,204 2,12 7,06 K 404,721 236 786,67 Mg 285,213 7,44 24,79 Mn 257,610 0,2 0,65 Mo 202,031 1,12 3,74 Na 589,592 39,9 132,99 Ni 231,604 1,07 3,57 Pb 220,353 4,62 15,39 Sb 217,582 5,07 16,91 Se 196,026 12,28 40,93

Si 251,611 4,54 15,14 Ti 336,121 0,13 0,42 Tl 276,787 13,08 43,58 V 310,230 12,22 40,72 Zn 213,857 3,41 11,36

301