MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết Ớt cay không chỉ là loại cây gia vị rất phổ biến trong cuộc sống hằng ngày, mà gần đây, chúng còn được sử dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm và dược liệu để bào chế các thuốc trị ngoại khoa như phong thấp, nhức mỏi, cảm lạnh hay nội khoa như thương hàn, cảm phổi, thiên thời... nhờ chất capsaicine chứa trong trái. Chính vì thế, nhu cầu và diện tích trồng ớt ở nhiều nước có chiều hướng gia tăng. So với lúa và nhiều loại rau màu khác, ớt là cây trồng đem lại hiệu quả kinh tế cao, thu nhập đạt khoảng 200 triệu/ha/năm. Vào những thời điểm giá ớt cao, thu nhập người trồng ớt có thể đạt 300 triệu/ha/năm. Diện tích trồng ớt tại Việt Nam khoảng 5000 ha, được trồng chủ yếu tại 18 tỉnh thành trải dài từ bắc vào nam, trong đó có Bình Phước, Bình Dương, Đồng Nai và Long An. Ở Bình Dương, ớt được trồng chủ yếu tại hai huyện Tân Uyên và Bến Cát với diện tích vào khoảng 15 ha. Diện tích trồng ớt tại các hộ ở mức độ vừa phải, thường không quá 3000 m2. Tuy nhiên, do hiện nay giá trị kinh tế cao mà cây ớt mang lại, nhiều hộ đã trồng tập trung với diện tích lớn hơn và trồng xen canh với các loại cây ăn trái và cây ông nghiệp khác.[30,31,32] Cũng như nhiều loại cây trồng khác, chất lượng và sản lượng ớt bị đe dọa nghiêm trọng bởi các loại dịch bệnh như bệnh thán thư, bệnh đốm trắng lá, bệnh héo xanh, bệnh héo rủ, bệnh thối đọt non... Nguy hiểm nhất trong số đó phải kể đến bệnh thán thư hay còn gọi là bệnh nổ trái. Bệnh do nấm Colletotrichum gây ra. Chủng nấm này rất đa dạng và gây hại trên hầu hết các loại cây trồng[9;13;21;29]. Trên ớt, bệnh xuất hiện trên cả thân, lá, và đặc biệt là trên trái. Trên trái, vết bệnh là những đốm tròn, màu nâu đến đen. Càng về sau, vết bệnh loang rộng và ăn sâu vào trong ruột trái[4], gây thiệt hại rất lớn cho các hộ trồng ớt, sản lượng có thể giảm từ 70-80%. Việc sử dụng các loại thuốc hóa học tràn lan không chỉ gây ảnh hưởng xấu tới môi trường sống, sức khỏe của người tiêu dùng mà còn là nguyên nhân tạo ra các chủng nấm bệnh kháng thuốc. Sử dụng các chủng nấm Trichoderma để kiểm soát các loại nấm bệnh thực vật là một biện pháp an toàn và hiệu quả. Trichoderma là tác nhân kiểm soát sinh học đối với nhiều loại nấm gây bệnh trên cây trồng như Phytophthora, Fusarium, Rhizoctonia, Colletotrichum… Trichoderma tiêu diệt nấm bệnh theo 3 cơ chế: kí sinh, tiết kháng sinh, cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống. So với các loài nấm đối kháng khác, 1

Trichoderma an toàn với sức khỏe con người và có thể phát triển tốt trên nhiều loại cơ chất khác nhau. Đây cũng là hướng thu hút được nhiều sự quan tâm của các nhà nghiên cứu trong những năm gần đây. Từ thực tế trên, chúng tôi đã đề xuất đề tài: Nghiên cứu tạo chế phẩm từ một số chủng Trichoderma kiểm soát bệnh thán thư do Colletotrichum gây ra trên cây ớt (Capsicum frutescens). Đề tài cũng là bước đầu nhằm xây dựng một bộ giống Trichoderma thu thập tại Bình Dương có khả năng phòng tốt các bệnh do nấm gây ra, không chỉ trên cây ớt mà còn trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau tại địa phương. Trong chuyên đề này, một mặt chúng tôi phân lập các chủng Trichoderma từ các khu vực trồng rau màu trên bàn tỉnh Bình Dương. Mặt khác, chúng tôi phân lập các chủng Colletotrichum gây bệnh thán thư từ các mẫu ớt, thu thập từ các chợ và nhà vườn trồng ớt trên địa bàn tỉnh Bình Dương. Mục tiêu của chuyên đề là xác định được các chủng Trichoderma có khả năng đối kháng tốt với các chủng Colletotrichum phân lập được bằng phương pháp nuôi cấy trên đĩa petri có chứa môi trường PGA. 2. Mục tiêu đề tài Tạo được chế phẩm từ các chủng nấm Trichoderma sp. có khả năng phòng bệnh thán thư do Colletotrichum gây ra trên cây ớt ở quy mô vườn thực nghiệm. 3. Cách tiếp cận - Nghiên cứu các tài liệu liên quan đến đề tài trong và ngoài nước, các báo cáo nông nghiệp của Tỉnh. - Phân lập các chủng nấm Colletotrichum gây bệnh thối trái trên ớt từ các mẫu bệnh thu thập tại Bình Dương. - Phân lập các chủng nấm Trichoderma tại các khu vực nông nghiệp ở Bình Dương, các chủng này sẽ có khả năng thích nghi tốt với điều kiện khí hậu và thổ nhưỡng của Tỉnh. - Nghiên cứu khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma phân lập được với các chủng nấm bệnh Colletotrichum. Từ đó chọn ra các chủng có hiệu quả đối kháng tốt nhất. 4. Đối tượng nghiên cứu - Các chủng nấm Trichoderma được phân lập tại các khu vực nông nghiệp thuộc tỉnh Bình Dương. 2

- Các chủng nấm bệnh Colletotrichum được phân lập từ các mẫu trái ớt bệnh thu thập tại các chợ và nhà vườn trên địa bàn tỉnh Bình Dương. 5. Phạm vi nghiên cứu - Phân lập và nghiên cứu khả năng đối kháng trên quy mô Phòng thí nghiệm. - Sản xuất chế phẩm trên quy mô phòng thí nghiệm. - Thử nghiệm khả năng kiểm soát nấm bệnh trên quy mô vườn thực nghiệm.

3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu về cây ớt

1.1.1. Nguồn gốc cây ớt[5] Theo các nhà nghiên cứu phân loại thực vật thì cây ớt có nguồn gốc từ Nam Mỹ (Mehico), bắt nguồn từ một số loài hoang dại và nguồn gốc thứ hai là ở Guatemala. Theo Vavilop, nguồn gốc thứ hai không phải ở Guatemala mà ở Evraz. Hiện nay, cây ớt được trồng phổ biến ở các nước nhiệt đới và á nhiệt đới. Sản lượng toàn thế giới khoảng 9683 triệu tấn, trong đó châu Á chiếm 4263 triệu tấn (FAO, 1992). 1.1.2. Vị trí phân loại[5] Cây ớt có tên khoa học là Capsicum frutescens L., Capsicum annum L., cây ớt thuộc họ cà Solanaceae, chi ớt (Capsium) có khoảng 30 loài nhưng chỉ có 5 loài được trồng là Capsicum pendulum, Capsicum annum, Capsicum flrutescens, Capsicum chinensis. Trong đó, hai loài Capsicum pendulum, Capsicum pubescens được trồng hạn chế ở Trung và Nam Mỹ, loài Capsicum chinensis được trồng ở khu vực Amazon và châu Phi. Hai loài Capsicum annum và Capsicum flrutescens được trồng khắp nơi trên thế giới.

A B

Hình 1.1 Một số loài ớt cay phổ biến. A) Capsicum frutescens. B) Capsicum annum 1.1.3. Đặc điểm thực vật học của cây ớt[5]

4

Cây ớt là cây gia vị, thân thảo, thân dưới hóa gỗ, có thể sống vài năm, có nhiều cành, nhẵn, lá mọc so le, hình thuôn dài, đầu nhọn, hoa mọc đơn độc ở kẽ lá. Các bộ phận của cây ớt như quả, lá và rễ được dùng làm thuốc chữa bệnh. Ớt có rễ cọc phát triển mạnh với nhiều rễ phụ, việc cấy chuyển thường làm cho rễ cọc bị đứt và cho một hệ rễ chùm phát triển. Ớt là cây bụi, hai lá mầm, thân thường mọc thẳng, đôi khi có thể gặp các dạng như thân bò, nhiều cành, chiều cao trung bình từ 0,5 – 1,5 m, có thể là cây hằng năm hoặc lâu năm, nhưng thường được gieo trồng như cây hằng năm. Lá đơn, mọc xoắn trên thân chính. Lá có nhiều dạng khác nhau, nhưng thường mọc nhất là loại lá mác, mép lá ít răng cưa. Lông trên lá tùy thuộc vào từng loại ớt khác nhau, một số có mùi thơm. Lá thường mỏng, có kích thước trung bình từ 1,5- 12 cm x 0,5 – 7,5 cm. Các hoa hoàn thiện thường được sinh đơn độc trên từng nách lá. Hoa có thể mọc thẳng đứng hoặc buông thỏng. Trên cuống hoa thường không có li tầng. Hoa thường có màu trắng, một số giống có màu sữa, xanh lam hoặc màu tím. Hoa có 5 – 7 cánh hoa, cuống dài khoảng 1,5 cm, đài ngắn có dạng chuông, nhụy có màu trắng hoặc tím, đầu nhụy có dạng hình đầu, hoa có 5 – 7 nhị đực với ống phấn màu xanh trời hoặc tía. Thuộc loại quả mọng có nhiều hạt và chia làm nhiều ngăn. Các giống khác nhau có kích thước quả, hình dạng, màu sắc, độ cay và độ mềm của thịt quả rất khác nhau. Quả chưa chín có màu xanh hoặc tím, quả chín có màu đỏ, da cam, vàng, màu kem hoặc hơi tím. Hạt ớt nhỏ dẹp, có dạng thận, màu vàng rơm, chỉ có hạt của Capsicum pubescens có màu đen. Hạt có chiều dài khoảng 3 – 5 mm và trong 1 gram ớt cay có khoảng 220 hạt. 1.1.4. Giá trị dược liệu của cây ớt[5] Ớt được trồng khắp nơi để làm gia vị và làm thuốc. Có hai loại ớt là ớt ngọt và ớt cay. Ở Việt Nam, phổ biến nhất là loại ớt cay. Quả ớt có vị cay, tính nóng, có tác dụng tiêu đàm, ổn trung, giải biểu, kiện vị, tiêu thực gây sung huyết, kích thích chung, giảm đau và sát trùng. Rễ ớt có tác dụng làm hoạt huyết, tán thủng. Lá ớt có vị đắng, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, lợi tiểu.

5

Ớt ngọt được dùng làm rau ăn, ớt cay dùng làm gia vị và làm thuốc. Quả ớt trị tỳ vị hơi lạnh, tiêu chảy, hắc loạn, nôn mửa, dạ dày ruột đầy trướng, mất trương lực, tích trệ, ăn không tiêu, đau nhức nửa đầu, đau lưng, đau khớp, thống phong, đau dây thần kinh, viêm thanh quản và viêm họng. 1.1.5. Giá trị dinh dưỡng của ớt[5] Thành phần chủ yếu của vỏ quả là chất cay, không màu, kết tinh, có tên gọi là

Capsaicin (C17H27NO3), hàm lượng của nó phụ thuộc vào từng loại giống. Quả còn chứa một loại dầu có màu đỏ, không cay, chiết xuất dịch alkaloid khoảng 20 – 25%. Quả ớt xanh, chứa nhiều rutin, là chất được dùng rộng rãi trong y học. Ngoài ra, quả ớt còn chứa nhiều loại vitamin như: A, B1, B2, B6, C, citric acid, nialic acid, lycopene, lutein và beta – carotene. Beta – carotene giúp chống lại sự tấn công của các gốc tự do, ngăn ngừa quá trình lão hóa. Vitamin B6 trong ớt là chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển não bộ và giúp cơ thể sản sinh hormone serotonin và neuroendocrine (ảnh hưởng đến tâm trạng) và melatonin (giúp điều chỉnh nhịp sinh học của cơ thể). Bảng 1.1. Thành phần các chất có trong ớt xanh (100 gam phần ăn được)

Thành phần Hàm lượng Thành phần Hàm lượng

Ẩm độ 85,7 g P 80 mg

Protein 2,9 g Fe 1,2 mg

Chất béo 0,6 g Na 6,5 mg

Chất khoáng 1,0 g K 2,7 mg

Carbonhydrate 3,0 g S 34 mg

Chất xơ 6,8 g Cu 1,55 mg

Ca 30 mg Thiamin 0,19 mg

Mn 24 mg Vitamin A 292 mg

Riboflavin 0,39 mg Vitamin C 111 mg

Acid oxalic 67 mg

6

1.1.6. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây ớt[1] 1.1.6.1. Nhiệt độ Theo Mai Thị Phương Anh (2001), nhiệt độ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và tỷ lệ đậu trái. Nhiệt độ ngày/đêm bằng 25/28 là thích hợp nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của cây ớt. Nhiệt độ ban đêm thấp (8 – 15oC) làm giảm tỷ lệ đậu quả, kích thước quả và quả không hạt. Nhìn chung, cây ớt thích hợp ở nhiệt độ 20 – 30oC[1]. 1.1.6.2. Ánh sáng Theo Mai Thị Phương Anh (2001), cây ớt ít mẫn cảm với ánh sáng và là cây ưa sang ngắn ngày. Nếu trong 1 ngày, thời gian chiếu sáng 9 – 10 giờ sẽ kích thích tăng trưởng, tăng sản phẩm 21 – 24% và tăng chất lượng của quả. Trời âm u thì sẽ giảm tỷ lệ đậu quả, giảm năng suất và chất lượng sản phẩm[1]. 1.1.6.3. Độ ẩm Cũng theo Mai Thị Phương Anh (2001), cây ớt thích hợp ở điều kiện đất ẩm, điều kiện không khí khô hạn sẽ kích thích quá trình chín của quả. Ớt là cây chịu hạn, nếu độ ẩm khoảng 10% thì tỷ lệ rụng quả tới 70%, trong khi độ ẩm 55 – 58% thì tỷ lệ rụng quả chỉ còn 20 – 30%. Nếu độ ẩm thấp hơn 70% trong giai đoạn ra hoa thì quả sẽ bị sần sùi, giảm giá trị nông phẩm. Nếu độ ẩm quá cao (70 – 80%) thì cây ớt sẽ còi cọc, kém phát triển[1]. 1.1.6.4. Đất và dinh dưỡng Theo Mai Thị Phương Anh (2001), cây ớt tương đối dễ trồng, đất phù hợp là đất thịt nhẹ, giàu vôi, pH = 6,0 – 6,5 là thích hợp. Ớt có thể sinh trưởng và cho năng suất cao trên đất cát nếu đảm bảo chế độ nước và dinh dưỡng phù hợp. Đất chua và kiềm thì không phù hợp cho sự phát triển và sinh trưởng của cây ớt. Ớt là cây chịu mặn, nhiều nghiên cứu cho thấy rằng ớt có thể nảy mầm ở nồng độ muối 4000 ppm và pH = 7,6[1].

1.2. Nấm Colletotrichum

1.2.1. Phân loại[9] Giới: Fungi Ngành: Asmycota

7

Ngành phụ: Pezizomycotina Lớp: Sordariomycetes Bộ: Glomerellales Họ: Glomerellaceae Chi: Colletotrichum Loài: Colletotrichum acutatum Colletotrichum agaves Colletotrichum arachidis Colletotrichum capsici Colletotrichum cereale Colletotrichum coccodes Colletotrichum crassipes Colletotrichum dematium Colletotrichum derridis Colletotrichum destructivum Colletotrichum fragariae Colletotrichum gloeosporioides Colletotrichum gossypii Colletotrichum graminicola Colletotrichum higginsianum Colletotrichum kahawae Colletotrichum lindemuthianum Colletotrichum lini Colletotrichum mangenotii Colletotrichum musae Colletotrichum nigrum Colletotrichum orbiculare Colletotrichum pisi Colletotrichum sublineolum Colletotrichum trichellum 8

Colletotrichum trifolii Colletotrichum truncatum 1.2.2. Đặc điểm hình thái của nấm Colletotrichum[9,13]

Nấm Colletotrichum sinh trưởng, phát triển và hình thành bào tử thuận lợi trên môi trường PGA và môi trường tổng hợp. Trên môi trường PGA, khuẩn lạc có màu trắng xám nhạt đến xám đậm hoặc cam nhạt.

Bào tử hình thành trên cành bào tử ngắn, hẹp, trong suốt, có hình trụ, hình lưỡi liềm, hình thoi. Trên môi trường nhân tạo PGA, kích thước và hình dạng của bào tử có thể thay đổi so với trên cây ký chủ.

Đĩa cành hình thành trên các bộ phận của cây, có lông cứng dài, màu nâu, thuôn về phía đỉnh, hơi phồng nhẹ ở phần gốc, chiều dài khoảng 5 µm, đường kính 4 – 8 µm, có từ 1 – 4 vách ngăn[13].

Nấm có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 4oC nhưng nhiệt độ thích hợp nhất cho nấm phát triển là 25 – 29oC và ẩm độ gần 100%. Trong điều kiện này, nấm gây hại nghiêm trọng nhất (Mordue, 1971). Jeffries cho rằng bệnh vẫn có thể xuất hiện trong điều kiện khô khi bào tử hoặc sợi nấm tiềm sinh xâm nhiễm vào mô bị tổn thương và mô già, điều này cho thấy bệnh vẫn có thể gây thành dịch trên quả. Sự xâm nhiễm của nấm Colletotrichum có liên quan chặt chẽ đến điều kiện môi trường. Điều kiện độ ẩm không khí cao tạo thuận lợi cho bào tử nảy mầm và xâm nhiễm vào cây ký chủ[13]. Sợi nấm mảnh, phân nhánh, không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào và gian bào. Nhiều hạt dầu được sản xuất trong mỗi tế bào của hệ sợi nấm. Khi chín sợi nấm trở nên sậm màu và bện xoắn lại thành dạng chất nền nhỏ dưới lớp ngoài cùng. Sợi nấm già đôi khi hình thành vách dày, màu nâu sậm, hình cầu hoặc không đều gọi là hậu bào tử (Chlamydospores). Nó có thể ở tận cùng hoặc chen giữa sợi nấm và tồn tại trong thời gian dài và khi tách ra chúng cũng mọc mầm để hình thành sợi nấm mới. 1.2.3. Sinh sản của nấm Colletotrichum[9,13] Colletotrichum chỉ sinh sản vô tính bằng bào tử đính, bào tử đính phát triển trên cuống bào tử trong dạng thể quả là cụm cuống bào tử. Cụm cuống bào tử có dạng đĩa phẳng, mặt sau có cấu trúc phấn mịn, mỗi cụm cuống bào tử gồm lớp chất nền, bề mặt sản sinh cuống 9 bào tử trong suốt. Cuống bào tử không có vách ngăn kéo dài đơn bào, dạng liềm, cong, bào tử không màu. Cùng với bào tử và cuống bào tử là các tơ cứng trên mỗi cụm cuống bào tử, lông dài cứng, thuôn nhọn, không phân nhánh và đa bào cấu trúc như tơ cứng. Một vài loài của Colletotrichum có hoặc không có tơ cứng, có thể được kiểm soát bởi sự thay đổi độ ẩm (Frost, 1964). Sự hình thành một số lớn của bào tử sẽ gây nứt gãy trên biểu bì vật chủ, gặp điều kiện thuận lợi, mỗi bào tử mọc sẽ từ một đến nhiều ống mầm để hình thành hệ sợi nấm. Đĩa bám là dạng của Colletotrichum trong nuôi cấy. Theo von Arx (1957) ‘Sclerotia’ cũng là một dạng đặc biệt của Colletotrichum Glomerella tucumanensis là một nấm túi (Ascomyceteous) được coi như giai đoạn hoàn chỉnh của Colletotrichum falcatum.

1.2.4. Đặc điểm sinh lý[9,13] Colletotrichum tăng trưởng trong khoảng pH 5,5 - 7,0. Hầu hết các chủng phát triển tốt nhất tại pH 6,0. Một vài chủng có thể phát triển trong điều kiện acid hoặc kiềm như giai đoạn hữu tính của C. musae có thể phát triển tại pH 4 và pH 10. Hầu hết các chủng phát triển tốt nhất tại nhiệt độ 30oC. Nhiệt độ mà Colletotrichum có thể phát triển được nằm trong khoảng 10 - 40oC. Tại 55oC, chủng bị chết. Ánh sáng có tác động rất khác nhau lên sự phát triển và hình thành bào tử của các chủng khác nhau. Trong điều kiện chiếu sáng hay bóng tối liên tục sẽ ức chế sự hình thành bào tử của nấm Colletotrichum graminicola (Chowdhuary, 1936). Bào tử được tạo thành trong điều kiện chiếu sáng không liên tục. Trong khi đó, C. graminicola phân lập từ cây lúa cho số lượng bào tử nhiều trong điều kiện ánh sáng liên tục (Minussia và Kimati, 1978). Ánh sáng ban ngày kích thích sự hình thành bào tử của chủng này. Bệnh sẽ phát triển nhanh hơn khi tiếp xúc liên tục với ban ngày hoặc ở trong tối dài ngày. Nuôi cấy Colletotrichum gloeosporioides theo chu kỳ 12 giờ chiếu sáng xen kẽ 12 giờ bóng tối sẽ làm tăng tối đa tốc độ tăng trưởng và sự hình thành bào tử (Kamanna, 1996). 1.2.5. Đặc điểm dinh dưỡng[9,13] Colletotrichum có thể sử dụng được nhiều nguồn carbon khác nhau như glucose, sucrose, maltose và tinh bột. C. capsici, C. siamense, C. asianum, C. frucicola còn có thể 10 tăng trưởng tốt trên môi trường chứa acid tartaric (muối tartrate). Trong một giới hạn nhất định, sự tăng trưởng của sợi nấm tương quan với việc tăng nồng độ glucose. Chẳng hạn như Colletotrichum gloeosporioides phân lập từ dây trầu tăng trưởng tốt nhất trên môi trường chứa sucrose, tiếp theo là glucose, dextrose, acid citric và mannitol (Naik, 1985). Nuôi cấy đơn bào tử Colletotrichum gloeosporioides trên các môi trường có màu trắng sẽ cho thấy rõ sự tăng trưởng của hệ sợi nấm màu xám. Chủng có thể phát triển tốt trên môi trường Czapek và môi trường có chứa các chất chiết như khoai tây, bột yến mạch. Colletotrichum có thể sử dụng nhiều loại chất vô cơ và hữu cơ khác nhau như là amoni oxalate, KNO3, NaNO3, ure, asparagine, pepton đóng vai trò là nguồn cung cấp nitơ. Colletotrichum capsici tăng trưởng tốt trên môi trường chứa nguồn cung cấp nitơ L-leucine.

Trong khi đó, KNO3 là nguồn nitơ vô cơ tốt nhất và asparagin là nguồn nitơ hữu cơ tốt nhất cho sự phát triển của Colletotrichum gloeosporioides (Rajak, 1983). D-methionine, L- leucine, glycine và histidine cũng là những nguồn nitơ tốt cho sự phát triển của chủng này

(Naik, 1985). Colletotrichum phát triển chậm trên môi trường có nguồn nitơ là NaNO3. Trong các thành phần khoáng, lưu huỳnh có vai trò quan trọng đối với quá trình tăng trưởng của nấm. MgSO4 và Na2SO4 thích hợp cho sự phát triển của C. gloeosporioides (Ekbote, 1994).

1.2.6. Đặc điểm gây bệnh thán thư của nấm Colletotrichum[9,13, 21, 22]

Sự xâm nhiễm ban đầu của các loài nấm Colletotrichum có liên quan đến một loạt các quy trình bao gồm sự tiếp xúc bào tử trên bề mặt cây trồng, sự nảy mầm của bào tử, sự hình thành giác bám, sự xâm nhiễm vào biểu bì của trái.

Các loài nấm Colletotrichum có thể gây bệnh trên hầu hết các bộ phận của cây ớt trong bất kỳ giai đoạn sinh trưởng nào, tuy nhiên bệnh trên quả là có ý nghĩa kinh tế quan trọng hơn cả. Cụm bào tử màu hồng da cam, nấm mọc thành cụm. Triệu chứng trên quả lúc đầu là những vết bệnh dạng ngậm nước và sau đó trở nên mềm nhũn; đồng thời, xuất hiện những vết lõm nhỏ, sạm lại. Vết bệnh có thể bao trùm hết bề mặt quả và xuất hiện những thương tổn phức tạp. Bề mặt của vết bệnh trở nên ẩm ướt thành đĩa cành với những lông gai màu đen trông rất cứng. Những vòng tròn đồng tâm thường xuất hiện bên trong vết lõm (chỉ

11 trong phạm vi vết lõm). Trong vài trường hợp, vết bệnh màu nâu mà không phải là da cam và sau đó cũng hình thành những lông cứng[22].

Nấm thường xuyên xâm nhiễm trên những phần đã chết hay những bộ phận bị tổn thương của cây trồng và thường có mặt trong các mẫu bệnh. Trong điều kiện có ẩm độ và nhiệt độ cao, nấm gây hại rất nghiêm trọng. Trên nhiều loại cây trồng nhiệt đới khi phân lập người ta thường bắt gặp nấm tồn tại dưới hai dạng: nội kí sinh và ngoại kí sinh trên bề mặt mô cây[22].

Nấm bệnh xâm nhập và lan truyền trên đồng ruộng thông qua việc trồng những cây bị nhiễm bệnh hoặc bệnh lây lan từ vụ này sang vụ kia qua tàn dư cây bệnh hoặc trên những cây ký chủ phụ. Những cây ký chủ phụ bao gồm cỏ dại và các loài thuộc họ cà như cà chua, khoai tây. Bào tử nấm từ các mô trên quả bị bệnh hoặc từ các bộ phận khác hay tàn dư cây bệnh phát tán đến toàn cây, toàn ruộng do nước mưa, nước tưới. Các bào tử mới nảy mầm và sinh sản trong mô bệnh và sau đó phân tán sang những quả khác. Người chăm sóc cũng có thể mang bào tử thông qua các thiết bị hay dụng cụ nông nghiệp trong quá trình chăm sóc cây trồng[21].

1.2.7. Kiểm soát nấm bệnh Colletotrichum[9,13] 1.2.7.1. Sử dụng các chất chiết xuất từ thực vật Trong những năm gần đây, việc sử dụng thuốc trừ nấm có khả năng nguy hại trong nông nghiệp ngày càng tăng. Vấn đề này đang thu hút ngày càng nhiều mối quan tâm của các tổ chức y tế, môi trường và công chúng. Các khả năng kiểm soát bệnh thực vật bằng nhiều phương pháp đã được quan tâm nghiên cứu sâu rộng. Việc sử dụng hợp lý các biện pháp kiểm soát sẵn có đang được xem xét. Đặc biệt là với các cây trồng bị nhiễm đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh khác nhau. Các chất chiết xuất từ thực vật, nhân tố sinh học cùng với việc quản lý sức đề kháng bệnh của thực vật đang được coi là một phương pháp mới. Ưu điểm của các biện pháp này là nó ít tốn kém chi phí cho các hóa chất, giảm những mối nguy hại do ô nhiễm môi trường, và đảm bảo được sự cân bằng sinh học (Papavizas, 1973). Các chất chiết xuất từ tỏi, lá của cây rau húng có tác dụng diệt khuẩn và diệt nấm. Chúng có thể ức chế hoàn toàn sự tăng trưởng của C. musae và C. corchori.

12

Chiết xuất từ lá của cây huyền diệp (Polyyalthia longifolia), tỏi (Allium sativum), lá cây xoan (Azadirachta indica), rau húng (Ocimum sanctum), cây đậu dầu (Pongamia pinnata), rau quế (Mentha arvensis) ức chế bào tử nảy mầm và sự tăng trưởng của nấm Colletotrichum gloeosporioides trong điều kiện thí nghiệm. Dầu bạch đàn, dầu từ cây thầu dầu, tỏi, gừng, thân và rễ cây nghệ và chất chiết lá và hoa ngũ sắc (Lantana) kiểm soát đáng kể bệnh thán thư xoài. 1.2.7.2. Sử dụng các nhân tố kiểm soát sinh học Nhiều loài nấm và vi khuẩn có khả năng đối kháng với các chủng nấm Colletotrichum. Người ta đã sử dụng chúng như là các nhân tố kiểm soát sinh học. Trichoderma harzianum Rifai và T. viride Pers phát triển mạnh mẽ, mọc phủ lên khuẩn lạc của Colletotrichum gloeosporioides. Các thử nghiệm cũng cho thấy T. harzianum sinh ra một chất ức chế mạnh mẽ sự phát triển của C. falcatum. Bên cạnh Trichoderma, các chủng Bacillus subtilis, B. cereus và Pseudomonas flourescens cũng có khả năng hạn chế sự phát triển của C. gloeosporioides. B. subtilis tạo ra một lớp màng bao phía bên ngoài, lớp màng này đã ức chế sự nảy mầm của các bào tử C. gloeosporioides. Các biện pháp xử lý bằng nước ấm 48 - 50oC trong khoảng 20 phút cũng giúp kéo dài thời gian bảo quản của các loại trái cây khỏi các loài Colletotrichum gây thối. 1.2.8. Đặc điểm một số loài Colletotrichum gây bệnh trên ớt 1.2.8.1. Colletotrichum acutatum[13] Nấm gây bệnh thán thư trên dâu tây, cao su (Nguyễn Hoàng Dương), nho (Soytong và CS, 2005)

Khuẩn lạc tròn trên PGA, phần mọc lên, lúc đầu có màu cam nhạt hay cam trắng, trưởng thành có màu xám và trở thành cam nhạt khi già, sợi nấm có màu trắng nằm nhô lên trên, mọc dày đặc như bông, khuẩn lạc không có bào tử đính. Phần bên dưới có màu cam tươi sáng nhưng đôi khi có màu hơi vàng nâu ôliu, hay nâu, phát triển rất chậm với tốc độ tăng trưởng 2,3 - 2,6 mm. Không tạo hạch nấm. Không có bào tử đính cũng như sự hình thành lông cứng. Cuống đính bào tử có kích thước 6,0-10 × 2,5-4,0 m, trong suốt, hình xoang hay hình cầu, mịn màng, nhỏ dần tới đỉnh thì cắt vát. Bào tử có kích thước phổ biến

13 trong khoảng 7,0-14 x 2,5-3,5 m, đơn bào, lông sậm, trong pha lê, hình thoi ở cả hai đầu. Cấu trúc xâm nhiễm trong môi trường nuôi cấy có kích thước 7-15 × 5-8 m, màu nâu sẫm, hình trứng, đôi khi có thùy.

Hình 1.2. Colletotrichum acutatum (hình ảnh từ chủng CBS 112996). A-B: cấu trúc sinh bào tử. C-I: bào tử đính. J-Q: cấu trúc xâm nhiễm. R-S: bào tử[8]

1.2.8.2. Colletotrichum truncatum[9,13,21] Colletotrichum truncatum là tác nhân chính gây nhưng vết sưng màu nâu trên cây đậu đũa. Nấm tấn công vào tất cả các bộ phận của cây như: hạt, trụ dưới lá mầm, thân, cuống, hoa, lá và vỏ đậu. Bệnh gây thiệt hại đến 75% năng suất đậu đũa ở miền bắc Nigeria. Giai đoạn sinh sản hữu tính là các vết bệnh thán thư trên cây đậu lăng có tên là Glomerella truncatum theo Latunde-Dada, Lucas (2007) và Damm (2009) thì chúng không có liên hệ với C. truncatum nhưng lại gắn kết với C. destructivum Colletotrichum truncatum gây ra các bệnh loét quan trọng gây thiệt hại kinh tế ở nhiều cây trồng họ đậu và họ cà (Sutton, 1992; Shenoy và cộng sự, 2007, như C. capsici). Theo 14 các dữ liệu có được, C. truncatum có nhiều loài kí chủ trên khắp thế giới, với nhóm cây lớn nhất thuộc vào họ Fabaceae. Hầu hết các họ thực vật đều là hai lá mầm, chỉ có hai trường hợp ngoại lệ CBS 711.70 từ Cyperus rotundus (Cyperaceae) ở Brazil và IMI 266002, được phân lập từ màng sừng chỗ loét trên người ở Nepal. Các đặc điểm nuôi cấy và hiển vi rất khác nhau. Chúng gây ra bệnh thán thư trên các cây họ đậu như đậu nành (Glycine max), đậu phộng (Arachis hypogea), và cỏ linh lăng (Medicago sativa), thán thư trên ớt cay (Capsicum annuum, C. frutescens), và nhiều loài kí chủ khác trong một giới hạn rộng các họ thực vật (Pring và CS, 1995; Shenoy và CS, 2007; Damm và CS, 2009; Farr và CS, 2009). Kết hợp với các triệu chứng của đầu lá chết đen, đốm lá, lá bị thương tổn và đốm quả trên nhiều loại cây trồng khác nhau (Shenoy và CS, 2007). Tác nhân chính của bệnh phức hợp bệnh thán thư trên ớt cay được biết đến là C. capsici. Vi sinh vật tác nhân của bệnh thán thư đậu lăng có liên quan đến C. truncatum (Ford và CS, 2004) thì không thuộc vào các loài này. Latunde-Dada và Lucas (2007) cho thấy rằng C. truncatum phân lập từ cây đậu lăng, đậu hà lan và đậu đũa có sự phân loại tương tự dựa trên các trình tự ITS so với C. destructivum được phân lập từ các hạt đậu tằm và cỏ linh lăng, cũng như C. linicola phân lập từ cây lanh. Cần có những nghiên cứu sâu hơn để làm sáng tỏ cách nhận biết các tác nhân gây bệnh thán thư. Những loài này rất đa dạng và có phạm vi kí chủ rộng (Damm và CS, 2009).

Loài này còn được gọi bằng nhiều tên khác Colletotrichum dematium f. truncatum; Vermicularia capsici; Steirochaete capsici; Colletotrichum capsici; Colletotrichum curvatum.

Trên môi trường tổng hợp nghèo dinh dưỡng (synthetic nutrient-poor agar – SNA): Tơ khí sinh không màu, có vách ngăn, phân nhánh đường kính 1–8 µm. Không có hậu bào tử. Bào tử tạo thành búi, cuống sinh bào tử và tơ cứng hình thành trực tiếp trên khuẩn ty. Tơ cứng không màu cho tới màu nâu nhạt, trơn hoặc nhám, dài 80–150 µm, chia từ 2-5 ngăn, hơi thon, đỉnh từ hơi nhọn cho đến tròn, đáy hình trụ tới hình nón, đường kính 4–6 µm. Cuống sinh bào tử không màu cho tới nâu nhạt, có vách ngăn, phân nhánh, mọc thành cụm dày đặc, chiều dài lên tới 90 µm. Tế bào sinh bào tử từ không màu tới nâu nhạt, hình trụ, có kích thước 6–20 × 2,5–4 µm, ít khi thấy viền. Bào tử không màu, vách từ trơn tới nhám,

15 không phân ngăn, phần trung tâm bào tử kéo dài, hơi cong với các vách song song nhau, kết thục đột ngột với đầu tròn và đáy cụt, thỉnh thoảng thon dần cho tới nhọn và đỉnh cong nhiều hơn, có chứa các hạt bên trong, kích thước 16,5–26 × 3–4,5 µm, tỷ lệ L/W = 5,7; các mẫu phân lập khác có bào tử nhỏ hơn, chẳng hạn như CBS 120709: 15–20 × 3,5–4,5 µm, hoặc lơn hơn như CBS 112998: 24–27 × 3–4 µm. Cấu trúc xâm nhiễm đơn độc, thành từng nhóm hoặc mọc thành các cụm dày đặc, màu sắc từ sang cho tới nâu, sắc cạnh hoàn toàn cho đến có thùy, hình dáng tròn, elip hoặc hình chùy, điểm tiếp xúc với khuẩn ty thường nằm phía trên cấu trúc xâm nhiễm, kích thước 4–19 × 5,5–10 µm, tỷ lệ L/W = 1,5.

Trên mô thực vật: bào tử tập trung thành búi, các cuống sinh bào tử và các tơ cứng hình thành trong một khối tế bào góc cạnh màu nâu nhạt có đường kính 3–5 µm. Các tơ cứng có màu từ nâu nhạt tới nâu ở đỉnh, vách trơn hoặc nhám, dài 45–100(–170) µm, chia thành 1-5 ngăn, thon dần cho tới đỉnh hơi nhọn hoặc tròn, đáy hình trụ hoặc hình cầu, đường kính 4–8 µm. Cuống sinh bào tử màu nâu nhạt, có vách ngăn và phân nhánh, mọc thành cụm dày đặc, chiều dài lên tới 30 µm. Các tế bào sinh bào tử từ không màu tới nâu nhạt, hình trụ, kích thước 5–12 × 2,5–3,5 µm, có viền 0,5 µm. Bào tử không màu, vách trơn, không phân ngăn, phần trung tâm kéo dài và thường cong nhẹ với các vách song song, kết thúc đột ngọt với đáy tròn và cắt vát, thỉnh thoảng thon dần cho tới nhọn và đỉnh cong nhiều hơn, có chứa các hạt có kích thước 21,5–26 × 3,5–4,5 µm, tỷ lệ L/W = 5,6; một số mẫu phân lập khác hình thành bào tử nhỏ hơn như CBS 120709: 15–22,5 × 3–4 µm, hoặc bào tử lớn hơn như CBS 112998: 25–28 × 3,5–4 µm.

16

Hình 1.3. Colletotrichum truncatum (a-h) hình từ chủng CBS 151.35, (i–l) hình từ chủng CBS 120709); (a–c) các cụm; d. cuống sinh bào tử; (e) đỉnh của một tơ cứng; (f) gốc của một tơ cứng; (g,h) cuống sinh bào tử; (i–l) cấu trúc xấm nhiễm; (m–n) bào tử[9]

1.3. Những nghiên cứu về nấm Colletotrichum sp. gây bệnh thán thư ớt và khả năng kiểm soát nấm bệnh của Trichoderma

Nấm Colletotrichum gloeosporioides được nhóm tác giả Park, Lee YS, Ko YH (1987) cho rằng là loài phổ biến trên ớt ở Hàn Quốc đã được xác định rõ[17].

Nấm C. coccodes gây bệnh thán thư trên lá cây ớt con được trồng trên đồng ruộng lần đầu tiên được Hong và Hwang báo cáo ở tỉnh Chungnam, Hàn Quốc vào năm 1988[12].

Năm 1989, tại Đài Loan, Suryaningsih xác định các loài nấm Colletotrichum capsici, Colletotrichum gloeosporioides, Glomerella cingulata gây hại trên quả ớt chín, trong đó 2 loài Colletotrichum capsici, C. gloeosporioides là quan trọng hơn cả[20].

17

Park và Kim xác định các loài gây bệnh thán thư trên ớt ở Hàn Quốc là Colletotrichum gloeosporioides; C. acutatum; C. coccodes ; C. dematium; Glomerella cingulata. Trong đó, loài C. gloeosporioides là phổ biến hơn[15,16].

Tác giả Isaac năm 1992 cho rằng nấm Colletotrichum có giai đoạn hữu tính là Glomerella. Bệnh thán thư do nấm Colletotrichum gây ra là một trong những bệnh có ý nghĩa kinh tế quan trọng nhất, làm giảm năng suất từ 10 - 80% ở một số quốc gia đang phát triển, đặc biệt là Thái Lan. Bệnh thán thư gây hại chủ yếu trên quả ớt chín, gây thiệt hại nghiêm trọng cho quả ớt trước và sau khi thu hoạch.

Tác giả Pring (1995) nhận định nấm Colletotrichum tồn tại qua mùa đông trên các cây ký chủ khác như các cây họ cà hoặc các cây họ đậu, tàn dư thực vật và các quả bị bỏ lại trên đồng ruộng trước khi gây hại cho cây trồng vào vụ sau [20].

Hong và Hwang (1998), và Kim (1999) cho rằng các loài Colletotrichum khác nhau cũng thể hiện vai trò quan trọng khác nhau trong các giai đoạn quả chín khác nhau. Ví dụ: nấm Colletotrichum capsici phổ bến trên quả ớt đỏ, nhưng ngược lại nấm C. acutatum và C. gloeosporioides được xem là phổ biến trên cả quả xanh non và chín. Nấm C. coccodes gây bệnh thán thư không được xem là bệnh nguy hiểm trên quả ớt[12].

Kim (2004) cho rằng, các loài khác nhau gây bệnh ở những bộ phận khác nhau của cây ớt. Ví dụ: nấm C. acutatum và C. gloeosporioides xâm nhiễm vào quả ở tất cả các giai đoạn phát triển, nhưng thường không gây hại trên lá và thân, trong khi lá và thân bị nấm C. coccodes và C. dentitum gây hại mạnh[15].

Trong hệ thống phân loại bệnh học chi Colletotrichum, Simmonds và Freeman đều chỉ ra rằng các loài Colletotrichum khác nhau có thể kết hợp gây ra bệnh thán thư trên cùng cây ký chủ. Các loài Colletotrichum gây nên bệnh thán thư trên ớt ở các quốc gia, các vùng khác nhau là khác nhau. Mặc dù nghiên cứu về các loài đã thu được nhiều kết quả; song, vẫn còn nhiềuđiều cần phải nghiên cứu thêm để biết về quá trình lây bệnh và về mối liên hệ phức tạp liên quan giữa các loài [11,23].

Những nghiên cứu xoay quanh vấn đề sử dụng Trichoderma làm tác nhân đối kháng sinh học với Colletotrichum được tiến hành nhiều trong những năm gần đây. Colletotrichum

18 là chi nấm bệnh gây hại trên rất nhiều loại cây trồng, ảnh hưởng nặng nề đến năng suất, thêm vào đó, các loài Colletotrichum còn có khả năng đề kháng nhanh với nhiều loại thuốc diệt nấm hóa học. Chính vì thế, nghiên cứu về việc sử dụng tác nhân sinh học luôn là vấn đề được quan tâm. Có thể kế đến một vài nghiên cứu tiêu biểu thời gian gần đây:

Bankole (1996) nghiên cứu khả năng kiểm soát sinh học của Trichoderma viride với Colletotrichum truncatum gây bệnh đốm nâu trên cây đậu đũa. Tỷ lệ cây bị bệnh giảm đáng kể khi ngâm hạt giống vào dung dịch bào tử Trichoderma hoặc tưới ướt dung dịch bào tử lên bề mặt đất[24].

Soytong (2005) sử dụng dịch chiết thô từ Trichoderma hamatum phối trộn với các chế phẩm sinh học khác đã làm giảm đáng kế tỷ lệ bệnh thán thư trên lá, nhánh con và trái nho so với khi sử dụng các biện pháp kiểm soát hóa học[25]

L. R. Shovan (2008) đã phân lập các chủng Trichoderma harzianum từ hệ rễ của nhiều loại cây trồng khác nhau. Các chủng này có khả năng ức chế sự phát triển của nấm gây bệnh thán thư trên đậu nành là Colletotrichum dematium lên đến 89%[18]

Nghiên cứu của Sangeetha (2009) cho thấy việc phối trộn một số chủng Trichoderma viride, T. harzianum, T. koningii phân lập từ đất trồng chuối làm giảm tỷ lệ bệnh đồng tiền (thán thư) trên trái chuối ở nhiệt độ phòng và nhiệt độ bảo quản lạnh. So với sử dụng các thuốc diệt nấm thuộc nhóm Carbendazim, các chế phẩm sinh học này có hiệu quả phòng trừ tốt hơn[10]

Nghiên cứu của Svatlana Zivkovic (2010) cũng cho thấy chủng Trichoderma harzianum là tác nhân kiểm soát sinh học đầy tiềm năng trong việc phòng trị các bệnh thán thư do Colletotrichum acutatum và C. gloeosporioides gây ra trên nhiều loại trái cây khác nhau.[26] Colletotrichum gồm nhiều loài khác nhau, gây bệnh trên rất nhiều loại cây trồng khác nhau, đặc biệt là cây ăn trái. Ở Việt Nam, cũng có nhiều nghiên cứu về khả năng đối kháng của Trichoderma với loài nấm gây bệnh thán thư trên trái này. Tuy nhiên, nghiên cứu tập trung vào các chủng Colletotrichum gây bệnh trên ớt thì vẫn còn hạn chế. Tiêu biểu nhất có thể kể đến:

19

Trương Minh Tường (2011) sử dụng hỗn hợp các chủng Trichoderma để phòng trị bệnh thối trái và thối dây thanh long ở Tiền Giang. Kết quả cho thấy không thua kém khi kiểm soát bệnh bằng thuốc hóa học[6]

Nguyễn Thị Thiên Hằng (2012) đã nghiên cứu sự phân bố và động thái của nấm Trichoderma trong đất trồng rau màu tại thành phố Đà Nẵng. Kết quả cho thấy các chủng Trichoderma phân lập được có khả năng đối kháng tốt với các chủng Colletotrichum gây bệnh vàng lá trên cây cà chua[3]

1.4. Giới thiệu về Trichoderma 1.4.1. Vị trí phân loại Trichoderma là nhóm những loài nấm sợi (Ascomycetes) tăng trưởng nhanh (Samuels, 1996) và phân bố rộng khắp trên thế giới (Domsch, 1980; Gams và Bissett, 1998 và Klein và Eveleigh, 1998). Chúng có mặt trong hầu hết các loại đất và thường chiếm ưu thế trong quần thể vi sinh vật đất (Killham, 1994). Trong những loài nấm sợi, Trichoderma được phân vào nhóm có bào tử trần (Domsch và Gams, 1972). Trong những năm gần đây, các phương pháp phân tử đã giúp cho chúng ta cải thiện đáng kể những hiểu biết về hệ gen Trichoderma đến cấp độ loài. Hiện nay, đã có khoảng 75 loài Trichoderma đã được xác định. Trong số đó, có nhiều loài là những nhân tố kiểm soát sinh học như T. hamatum, T. harzianum, T. koningii Oud., T. polysporum (Link ex Pers.) Rifai, T. virens (Harman, 2004; Metcalf, 2004 và Samuels, 1996). Hệ gen Trichoderma có các đặc tính hình thái đặc trưng được dùng để phân biệt và phân loại chúng. Trichoderma là nhóm nấm có vách ngăn. Chúng hình thành nên rất nhiều nhánh mang những cuống bào tử đính tạo thành dạng có hình chóp hoặc hình nón (Rifai, 1969). Trên đỉnh của cuống bào tử đính có mang những cấu trúc dạng cổ chai. Các bào tử dạng chuỗi, còn được gọi là bào tử đính, được hình thành ở đầu mút của cấu trúc cổ chai và chúng tạo thành chóp bào tử đính (Gams và Bissett, 1998). Như những loài khác trong nhóm Deuteromycetes, các loài Trichoderma chỉ có thể sinh sản vô tính thông qua quá trình sinh bào tử mạnh mẽ hoặc chúng có thể tăng trưởng vô tính từ những đoạn sợi (Gams và Bissett, 1998). Tuy nhiên, các loài Trichoderma cũng có một giai đoạn hữu tính được gọi là Hypocrea (Samuels, 1996). Theo đó, giai đoạn sinh sản

20 hữu tính của Trichoderma cũng có các đặc tính quan trọng của giai đoạn sinh sản vô tính. Trong giai đoạn này, chúng tạo thành các nang bào tử. Các loài Trichoderma có giai đoạn hữu tính thường không thuộc nhóm có khả năng kiểm soát sinh học.

A B

C D Hình 1.4. Khuẩn lạc của một số chủng Trichoderma trên môi trường PGA. A: T. parceromosum; B: T. viride; C: T. hamatum và D: T. resei sau 4 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng (Nguyễn Xuân Ánh Nguyệt và cộng sự, 2009).

Trichoderma là loài có đặc tính khuẩn lạc mọc thành dạng khóm (búi) với nhiều màu sắc khác nhau như trắng, vàng, xanh… Trước đây, những đặc điểm này của Trichoderma được sử dụng để phân loại chúng (Rifai, 1969). Ngày nay, việc sử dụng các đặc điểm hình thái để phân loại các loài Trichoderma đang dần được thay thế bằng các phương pháp sinh học phân tử có tính chính xác hơn (Lieckfeldt, 1998). 1.4.2. Đặc điểm sinh thái học Môi trường sống

21

Trichoderma là những loài nấm phổ biến trong đất (Waksman, 1952). Chúng hiện diện trong một dãy rộng các loại cấu trúc đất khác nhau từ vùng có nhiệt độ mát lạnh đến nơi có khí hậu nhiệt đới bao gồm các vùng đất nông nghiệp, đất rừng, đất cây ăn quả, bãi cỏ hay sa mạc (Domsch, 1980; Hagn, 2003 và Roiger, 1991). Nhóm nấm này gồm những nấm hoại sinh nên chúng thường phân bố trên tầng đất mặt. Tại đây, sợi nấm hiện diện với số lượng lớn. Tầng đất này có chứa nhiều lá rụng, rơm… và ẩm ướt nên chúng có thể sinh sản (Danielson và Davey, 1973 và Widden và Abitbol, 1980). Một số loài nấm Trichoderma rất năng động thông qua việc chúng có thể phát triển trên các vùng sinh thái khắc nghiệt như đầm lầy muối, rừng Đước hay bùn cửa sông (Borut và Johnson, 1962; Domsch, 1980 và Lee và Baker, 1972). Ở những vùng sinh thái này, thông thường các loài vi nấm khó có thể tồn tại do các điều kiện áp suất thẩm thấu cao gây bất lợi cho sự phát triển của chúng. Ở những môi trường như thế, người ta thường tìm thấy loài T. viride Pers. Ex Gray, đây là một loài phân bố phổ biến nhất trong số các loài Trichoderma (Domsch, 1980). Một số loài Trichoderma khác như T. harzianum được tìm thấy nhiều ở bầu rễ của các cây (Parkinson, 1963) như lúa mì, khoai tây và thuốc lá. Chúng cũng có thể được phân lập từ rễ của những cây lâu năm như cây liễu (Gochenaur và Backus, 1967). Qua đó cho thấy, hệ gen Trichoderma ít bị giới hạn bởi các điều kiện môi trường sống. Nhiều môi trường gần như bị chiếm hữu bởi hệ gen này. Sự giới hạn về môi trường sống chỉ có thể xảy ra trong quá trình phát tán hoặc tăng sinh của chúng. Sự đa dạng về nguồn cơ chất Các loài nấm hoại sinh như Trichoderma có thể biến dưỡng một dãy rộng các nguồn carbon. Hầu hết các loài này phát triển tốt trên các nguồn carbon đơn giản như sucrose, D- mannose, D-xylose, D-galactose, D-fructose và raffinose (Danielson và Davey, 1973; Domsch, 1980; Klein và Eveleigh, 1998 và Papavizas, 1985). Tuy nhiên, hầu hết các nguồn carbon trong các vật liệu hữu cơ trong đất nằm ở dạng phân tử phức tạp với cấu trúc cao phân tử được gọi là các polysaccharide. Ngoại trừ lignin, các polysaccharide như cellulose, tinh bột, xylan, pectin và chitin dễ dàng bị phân hủy bởi các enzyme polysaccharase do Trichoderma tiết ra (Dix và Webster, 1995 và Klein và Eveleigh, 1998).

22

Vài loài Trichoderma có thể phân hủy các hợp chất có hoạt tính sinh học ngoại bào (xenobiotic) như hydrocarbon, thuốc trừ sâu có chứa gốc chlorine hữu cơ (organochlorine), thậm chí là cả các hợp chất C1 như methanol (Domsch, 1980; Klein và Eveleigh, 1998; Kubicek-Pranz, 1998 và Samuels, 1996). Khả năng phân hủy rất nhiều các hợp chất khác nhau đã một lần nữa chứng tỏ chúng có khả năng tồn tại ở nhiều vùng sinh cảnh khác nhau. Hầu hết các loài nấm hoại sinh đều có nhu cầu về nguồn nitrogen đơn giản và có thể sử dụng các amino acid trong đất (Kubicek - Pranz, 1998). Tuy nhiên, các loài Trichoderma có khả năng biến dưỡng cả nguồn nitơ đơn giản và phức tạp. Khi nguồn carbon là carbohydrate, ammonium thường là nguồn nitơ thích hợp hơn so với nitrate. Các amino acid (alanine, aspartic acid, casamino acid và glutamic acid) là nguồn nitơ tốt nhất cho Trichoderma. Khi nguồn nitơ là nitrate, các loài Trichoderma khác nhau sẽ có khả năng biến dưỡng nguồn nitrogen này rất khác nhau. Trong quá sinh sản xuất BCA từ Trichoderma, các cơ chất dùng làm môi trường nuôi cấy có thể có được từ các phế phụ liệu công nông nghiệp rẻ tiền. Điều may mắn là các cơ chất này lại chính là những cơ chất phù hợp để sản xuất chế phẩm BCA từ Trichoderma, nhất là trong sản xuất bào tử. Các phế phụ liệu phổ biến được dùng trong sản xuất bào tử Trichoderma như lõi bắp, cám mì, bột bắp, cát, bột yến mạch, vách tế bào lúa mạch, lá và thân cây chuối, cám gạo… Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường Thành phần, sinh khối và hoạt tính sinh học của quần thể vi sinh vật trong đất (không loại trừ nấm, đặc biệt là các loài Trichoderma) phụ thuộc nhiều vào các nhân tố hóa lý quan trọng. Các thông số môi trường như độ ẩm, nhiệt độ của đất, không khí, pH, thành phần chất hữu cơ, thành phần dinh dưỡng và các loài thực vật là những yếu tố quan trọng ảnh hưởng lên sự có mặt của các loài Trichoderma trong đất. Các nhà nghiên cứu đã chứng minh rằng sự phân bố của các loài Trichoderma trên thế giới bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ của đất. T. harzianum thường được tìm thấy ở những vùng đất nhiệt đới ấm áp. Trái lại, T. polysporum và T. viride chủ yếu được tìm thấy ở những vùng đất mát lạnh (Danielson và Davey, 1973 và Klein và Eveleigh, 1998). Dãy nhiệt độ cho sự phát triển của các loài Trichoderma tương đối rộng, có thể dưới 0oC (cho loài T. polysporum) và ở 40oC (cho loài T. koningii) (Domsch, 1980 và Tronsmo và Dennis, 1978). 23

Nhiệt độ không chỉ ảnh hưởng trên sự tăng trưởng của các loài Trichoderma mà còn ảnh hưởng lên hoạt tính biến dưỡng của chúng, đặc biệt là sự tổng hợp các loại kháng sinh bay hơi (Tronsmo và Dennis, 1978) và các enzyme. Độ ẩm của đất và điện thế của nước cũng là một yếu tố quan trọng có ảnh hưởng lên sự hình thành quẩn thể các loài Trichoderma cũng như các loài vi sinh vật khác trong đất (Lavelle và Spain, 2001). Điện thế của nước trong đất phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt độ của đất. Điện thế nước càng âm khi nhiệt độ gia tăng (Dix và Webster, 1995). Sự tăng trưởng của hệ sợi, sự tạo thành bào tử và sự nảy mầm của bào tử và hoạt tính kiểm soát sinh học của các loài Trichoderma thường bị ảnh hưởng tiêu cực khi điện thế nước quá âm (Clarkson, 1994 và Eastburn và Butler, 1991). Hầu hết các loài Trichoderma tăng trưởng tối ưu trong điều kiện điện thế nước trong đất thấp. Quần thể của chúng thường sẽ nhiều hơn trong những đống rác, rơm ẩm ướt (Danielson và Davey, 1973). Mặc dù vậy, vài loài Trichoderma có thể tăng trưởng ở nơi có điện thế nước trong đất rất thấp, như T. viride ở -240 MPa (Domsch, 1980). Các loài nấm trong hệ gen Trichoderma chịu sự ảnh hưởng tích cực từ những cơ chất có tính acid. Hầu hết các loài có pH tối ưu trong dãy 3,5 - 5,6 (Domsch, 1980). pH acid có ảnh hưởng tốt lên cả sự tăng trưởng và nẩy mầm của bào tử Trichoderma (Danielson và Davey, 1973). Thậm chí có loài phát triển ở pH 2,1 (Waksman, 1952). Theo Papavizas

(1985), pH đất phụ thuộc mạnh vào hàm lượng CO2 trong đất. CO2 trong đất sẽ kết hợp với + - H2O tạo thành carbonic acid. Acid này dễ dàng phân tách thành H và HCO3 , do đó, làm giảm nhanh pH của đất (Killham, 1994). Qua đó đã cho thấy các loài Trichoderma cũng có thể phát triển trên môi trường cơ chất có tính base yếu nếu như trong môi trường có hàm + lượng CO2 cao (Danielson và Davey, 1973). Bên cạnh đó, nồng độ của ion H cũng ảnh hưởng lên khả năng hòa tan của các loại muối trong đất, do đó, cũng ảnh hưởng lên khả năng sử dụng các ion này (Dix và Webster, 1995) và chất dinh dưỡng của Trichoderma. 1.4.3. Khả năng kiểm soát sinh học Hiện nay, khả năng đối kháng của Trichoderma đã được nghiên cứu trên nhiều loài nấm gây bệnh và cho thấy chúng có hiệu quả đối với các loài như Armillaria, Botrytis, Chondrostereum, Colletotrichum, Dematophora, Diaporthe, Endothia, Fulvia, Fusarium, Fusicladium, Helminthosporium, Macrophomina, Monilia, Nectria, Phoma, Phytophthora, 24

Plasmopara, Pseudoperonospora, Pythium, Rhizoctonia, Rhizopus, Sclerotinia, Sclerotium, Venturia, Verticillium và vài nấm gây mục gỗ khác. Khả năng đối kháng của Trichoderma chủ yếu được đóng góp từ các nhân tố chính là tốc độ tăng trưởng nhanh, các chất biến dưỡng có tính kháng sinh và các đặc tính sinh lý của chúng. Ký sinh Ký sinh ở nấm là hiện tượng một loài nấm tấn công trực tiếp lên một loài nấm khác và thường còn được gọi là sự đối kháng trực tiếp (Dix và Webster, 1995). Khái niệm này được chia thành bốn bước liên tục (Chet, 1998). Bước thứ nhất là giai đoạn tăng trưởng hóa năng. Trong bước này có sự tiết các hóa chất kính thích của các nấm mục tiêu (nấm gây bệnh) tấn công lên nấm đối kháng (Trichoderma) (Chet, 1981 và Steyaert, 2003). Bước hai là sự nhận dạng đặc hiệu, nấm bệnh nhận ra bề mặt tế bào nấm bệnh (Barak, 1985). Bước ba gồm hai quá trình riêng biệt là quá trình sợi nấm Trichoderma quấn quanh sợi nấm bệnh (Chet, 1981 và Papavizas, 1985) và quá trình phát triển đồng thời của sợi nấm Trichoderma với sợi nấm chủ. Bước cuối cùng là sự tiết các enzyme đặc hiệu của Trichoderma để phá vỡ vách tế bào nấm bệnh (Chet, 1998). Các enzyme thủy giải chính gồm β-glucanase, chitinase và proteinase. Hầu hết các loài Trichoderma đều có khả năng tiết các loài enzyme này như T. hamatum có thể tiết β- 1,3-glucanase và chitinase khi phát triển trên môi trường có sự hiện diện của R. solani (Chet và Baker, 1981). Khả năng tiết enzyme có ảnh hưởng lớn lên khả năng kiểm soát sinh học của các loài Trichoderma. Điều này đã được chứng minh khi so sánh chủng T. harzianum đột biến có biểu hiện gen tổng hợp có hoạt tính chitinase, β-1,3-glucanase và β-1,6-glucanase cao hơn chủng hoang dại (Rey, 2001) thì hoạt tính kiểm soát sinh học cũng mạnh hơn. Các chủng Trichoderma đột biến có biểu hiện vượt mức chitinase, endoglucanase và proteinase đã cải thiện được khả năng chống lại Rhizoctonia và Pythium. Các loài Trichoderma còn tiết ra cystein proteinase có hoạt tính ức chế hoạt động của các enzyme thủy giải (đặc biệt là polygalacturonase) của các nấm gây bệnh bằng cách cắt chúng. Các enzyme thủy giải này là những yếu tố gây bệnh quan trọng của Botrytis và một số nấm khác. Cystein proteinase giúp làm giảm bệnh cho cây do nấm bệnh. Tuy nhiên, khi có sự hiện diện của các chất ức chế proteinase này, kết quả bị đảo ngược hoàn toàn. 25

Một số nghiên cứu cũng đã cho thấy rằng thời gian đủ để tiết enzyme để thủy giải vách tế bào nấm bệnh của các chủng Trichoderma khác nhau cũng khác nhau. Các nghiên cứu về sự ký sinh này cũng đã cho thấy rằng sự kết hợp của hoạt động thủy giải của các enzyme và các kháng sinh cũng là một nhân tố giúp tăng cường khả năng ức chế nấm bệnh thực vật của các loài Trichoderma (Kay và Stewart, 1994 và Steyaert, 2003). Các enzyme thủy giải vách nấm bệnh của Trichoderma cũng giúp tăng cường hoạt lực của thuốc diệt nấm.

Sự kháng sinh Sự kháng sinh là sự sản xuất chất kháng sinh của các loài nấm và đặc biệt là trong trường hợp có liên quan đến hệ gen Trichoderma. Loại kiểm soát sinh học này thường được gọi là sự đối kháng không trực tiếp vì không xảy ra sự kết hợp của sợi nấm (Dix và Webster, 1995). Sự kháng sinh thường xảy ra cùng với sự ký sinh (Schirmbock, 1994), các enzyme thủy giải sẽ giúp cho các chất kháng sinh xâm nhập vào bên trong nấm bệnh rồi đến lượt các chất kháng sinh ức chế sự tổng hợp vách tế bào đã giúp tăng cường hoạt động của các enzyme thủy giải (Lorito, 1996). Chất kháng sinh cũng ảnh hưởng lên nấm mục tiêu thông qua các cơ chế ức chế sự tăng trưởng, sự tổng hợp các hợp chất sơ cấp, sự hấp thu dinh dưỡng và sự hình thành bào tử (Howell, 1998 và Wilcox, 1992). Giống như sự ký sinh, sự kháng sinh cũng có tính đặc hiệu loài vì các loài Trichoderma khác nhau sẽ có khả năng khiểm soát sinh học khác nhau để chống lại cùng một loài nấm bệnh. Qua đó cho thấy, các loài Trichoderma khác nhau có hoạt tính kháng nấm khác nhau (Ghisalberti, 1990 và Howell, 1993). Các bằng chứng đã cho thấy vai trò của chất kháng sinh trong việc kiểm soát sinh học khi các chủng T. virens bị đột biến mất khả năng tổng hợp kháng sinh gliotoxin và gliovirin thì mất khả năng kiểm soát các loài nấm gây độc cho rễ cây như Pythium. Thêm vào đó, hoạt tính ức chế bệnh có liên quan trực tiếp đến thời gian và số lượng kháng sinh được tiết ra. Tuy nhiên, không phải các dạng đột biến điều mất khả năng kiểm soát sinh học. Có báo cáo cho thấy chủng T. virens bị đột biến mất khả năng tổng hợp gliotoxin vẫn có khả năng ức chế mạnh nấm gây thối rễ Rhizoctonia. 26

Cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống Tương tác giữa Trichoderma và các loài vi sinh vật khác trong đất được xem như là sự đối kháng gián tiếp. Các loài Trichoderma có thể ức chế các loài nấm bệnh thông qua sự cạnh tranh về không gian, cơ chất của các enzyme, thành phần dinh dưỡng và/hoặc oxygen (Dix và Webster, 1995). Đặc điểm tăng trưởng nhanh cùng với khả năng phát triển được trên nhiều loại cơ chất khác nhau giúp cho chúng là loài vi sinh vật chiếm ưu thế và có thể thay thế những loài vi sinh vật sống chung nhưng kém năng động hơn (Papavizas, 1985). Khả năng chiếm lĩnh của chúng bị ảnh hưởng lớn bởi các yếu tố như pH đất, nhiệt độ và điện thế của nước (Carreiro và Koske, 1992; Danielson và Davey, 1973; Domsch, 1980; Eastburn và Butler, 1988; Klein và Eveleigh, 1998 và Widden và Abitbol, 1980). Vì thế, sự cạnh tranh hữu hiệu khi các điều kiện môi trường sống phù hợp cho sự tồn tại và sự tăng sinh của các loài Trichoderma. Các loài nấm bệnh sống bám trên cây chủ bằng cách thâm nhập trực tiếp hệ sợi của chúng vào bên trong mô cây thông qua lớp cutin và biểu bì. Chúng cũng có thể xâm nhập vào cây qua các vết thương, các mô bị lão hóa hoặc những cơ quan mở như các khí khẩu. Tại những vùng này, hàm lượng dinh dưỡng cao do có sự rò rỉ của đường và các amino acid. Các BCA có thể cạnh tranh một cách hữu hiệu đối với nấm bệnh để giành lấy những dưỡng chất này. Các BCA phát triển nhanh hơn và cạnh tranh hơn so với nấm bệnh, từ đó, chúng có thể thay thế bằng cách ngăn chặn sự nảy mầm của mầm bệnh hoặc sự lây nhiễm của nấm bệnh, đặc biệt là khi BCA hiện diện trước khi có sự xuất hiện nguồn bệnh. Qua đó cho thấy nếu xử lý vết thương, hạt nảy mầm và hoa với Trichoderma sẽ giúp chúng có cơ hội vượt qua sự cạnh tranh của nấm bệnh. Điều hòa tăng trưởng và cảm ứng khả năng kháng Khả năng kích thích và điều hòa tăng sự trưởng thực vật của các loài Trichoderma đã được nghiên cứu trên một số loài cây trồng như dưa chuột, cà chua, củ cải, đậu Hà Lan và các loài hoa (Chang, 1986; Inbar, 1994; Kleifeld và Chet, 1992 và Ousley, 1994). Sự điều hòa tăng trưởng thực vật của các loài Trichoderma có thể bằng cách kích thích trực tiếp sự hấp thu dinh dưỡng của thực vật (Kleifeld và Chet, 1992 và Ousley, 1994) hoặc bằng cách tiết ra các chất điều hòa tăng trưởng như các hormone (Windham, 1986). T. harzianum có khả năng tiết các chất điều hòa tăng trưởng giúp tăng trưởng hệ rễ và lá non khi không có sự 27 hiện diện của nấm bệnh. Ngoài ra, chủng này cũng tiết ra các chất biến dưỡng có khả năng khuếch tán có chức năng hòa tan phosphate và các vi chất giúp tăng mức vi chất bên trong thực vật. Đặc điểm đối kháng của các loài Trichoderma đối với nấm bệnh thực vật cũng trực tiếp giúp cho sự tăng trưởng của thực vật vì chúng ức chế nấm bệnh dẫn đến làm tăng khả năng biến dưỡng của thực vật (Elad, 1987). Điều đáng quan tâm là tất cả các BCA này không làm tổn thương cho thực vật chủ khi chúng xâm nhập vào bên trong mô rễ (biểu bì chính và các tế bào vỏ rễ). Vài BCA chỉ sử dụng một trong những cách trên để kiểm soát sinh học. Tuy nhiên, các BCA hiệu quả nhất thường dùng nhiều cách trên phối hợp với nhau.

28

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Phương pháp nghiên cứu 2.1.1. Phương pháp phân lập nấm bệnh[2] Thu nhận mẫu ớt bệnh tại các chợ và các nhà vườn. Nhẹ nhàng rửa đất khỏi mẫu bệnh. Kiểm tra và ghi lại các triệu chứng. Khử trùng bề mặt mẫu bệnh. Cắt mẫu bệnh thành những lát nhỏ và đặt lên môi trường thạch nước cất. Ủ ở nhiệt độ phòng (30-32oC) cho tới khi các khuẩn lạc xuất hiện. Làm thuần các mẫu nấm bệnh trên môi trường PGA. Sử dụng các chủng nấm phân lập được để gây bệnh nhân tạo và xác định chủng nấm bệnh mục tiêu. 2.1.2. Phương pháp lây bệnh nhân tạo - Gây bệnh trên trái ớt đã thu hoạch Gây vết thương trên trái ớt. Dùng kim nhọn cấy một ít tơ nấm Colletotrichum vào vết thương. Đặt trong hộp vô trùng, có một ít nước để đảm bảo độ ẩm. Giữ ở nhiệt độ phòng. Hằng ngày ghi nhận triệu chứng của vết bệnh. Mẫu đối chứng cũng được gây vết thương nhưng không chủng nấm bệnh. So sánh triệu chứng bệnh trên mẫu ớt được chủng nấm với mẫu đối chứng và triệu chứng thực tế. - Gây bệnh trên trái ớt chưa thu hoạch Gây vết thương trái ớt. Phun dịch bào tử các chủng nấm Colletotrichum phân lập được lên các vết thương. Mẫu đối chứng cũng gây vết thương và phun nước vô trùng lên trên. Dùng nilon bọc các vị trí gây bệnh trên trái lại. Che bằng túi nilon, đặt trong nhà lưới tránh ánh sáng trực tiếp. Quan sát, ghi nhận các triệu chứng của bệnh và so sánh những triệu chứng này với các triệu chứng đã ghi nhận được trên đồng ruộng. 2.1.3. Phương pháp phân lập Trichoderma Thu thập mẫu đất tại các khu vực nông nghiệp. Pha loãng mẫu đất bằng nước cất vô trùng trong dãy nồng độ 10-1; 10-2; 10-3. Hút 0,1 ml ở mỗi nồng độ trải đều lên các đĩa petri có chứa môi trường TSM. Ủ ở nhiệt độ phòng (30-32oC). Sau 3-4 ngày, chọn những khuẩn lạc rời, đặc trưng cho nấm Trichoderma cấy qua môi trường TSM. Các chủng nấm Trichoderma sau khi làm thuần được cấy vào các ống thạch nghiêng chứa môi trường PGA.

29

2.1.4. Phương pháp xác định hiệu quả đối kháng của Trichoderma với nấm bệnh trên môi trường PGA Cắt những miếng thạch có diện tích bằng nhau (0,5x0,5cm) có chứa nấm bệnh và Trichoderma trên các đĩa giống trung gian. Đặt các khối thạch lên đĩa petri có chứa môi trường PGA để tiến hành đối kháng. Hằng ngày, xác định hiệu quả đối kháng Colletotrichum của các chủng Trichoderma. Hiệu quả đối kháng được tính theo công thức: H = (Dđc – Dtt)/Dđc x 100 (%). Với Dđc là bán kính khuẩn lạc nấm bệnh trên đĩa đối chứng; Dtt là bán kính khuẩn lạc nấm bệnh trên đĩa thử thật. 2.1.5. Phương pháp xác định mật độ bào tử Trichoderma Mật độ bào tử Trichoderma được xác định bằng buồng đếm hồng cầu: Dịch bào tử nấm mốc được lọc và pha loãng trong nước muối sinh lý (0,85%) đến độ pha loãng thích hợp rồi cho mao dẫn vào buồng đếm. Quan sát dưới kính hiển vi và xác định số lượng bào tử trong mỗi ô lớn. Chỉ đếm 4 ô lớn ở 4 góc và một ô lớn ở giữa. Mật độ bào tử trong 1ml được tính theo công thức: S = 0,25 x a x L x 106. Với a là số lượng bào tử trung bình trong một ô lớn và L là độ pha loãng. 2.1.6. Phương pháp xử lý số liệu Các thí nghiệm trong đề tài được thực hiện lặp lại ít nhất 3 lần. Tính toán bằng phần mềm Excel 2010. Sai số tính theo công thức sai số chuẩn. 2.2. Nội dung nghiên cứu 2.2.1. Chọn lọc các chủng Trichoderma có khả năng đối kháng tốt với các chủng Colletotrichum trên môi trường PGA 2.2.1.1. Phân lập và làm thuần nấm bệnh Colletotrichum[2] Phân lập và làm thuần Thu nhận mẫu ớt bệnh tại các chợ và các nhà vườn. Nhẹ nhàng rửa đất khỏi mẫu bệnh. Kiểm tra và ghi lại các triệu chứng. Khử trùng bề mặt mẫu bệnh. Cắt mẫu bệnh thành những lát nhỏ và đặt lên môi trường thạch nước cất. Ủ ở nhiệt độ phòng cho tới khi các khuẩn lạc xuất hiện. Dựa vào hình thái, màu sắc và đặc điểm bào tử để chọn lựa các mẫu Colletotrichum. Làm thuần các mẫu nấm bệnh trên môi trường PGA. Sử dụng các chủng nấm phân lập được để gây bệnh nhân tạo và xác định chủng nấm bệnh mục tiêu. Gây bệnh nhân tạo 30

Gây vết thương vào phần dưới của lá hoặc trái ớt. Phun dịch bào tử các chủng nấm Colletotrichum phân lập được lên trên. Mẫu đối chứng cũng gây vết thương và phun nước vô trùng lên trên. Dùng nilon bọc các vị trí vết thương lại. Kiểm tra và so sánh giữa vị trí gây bệnh và đối chứng. So sánh mẫu bệnh nhân tạo với mẫu bệnh ban đầu thu thập trong tự nhiên để khẳng định chủng nấm Coletotrichum gây bệnh. 2.2.1.2. Phân lập và làm thuần nấm Trichoderma Thu thập mẫu đất tại các khu vực nông nghiệp. Cào bỏ lớp đất mặt khoảng 3cm, dùng dụng cụ lấy mẫu thu lớp đất phía bên dưới, độ dày khoảng 5cm. Pha loãng mẫu đất với nước cất vô trùng theo dãy nồng độ 10-1; 10-2; 10-3. Hút 0,1 ml ở mỗi nồng độ trải đều lên các đĩa petri có chứa môi trường TSM. Ủ ở nhiệt độ phòng (30-33oC). Sau 3-4 ngày, chọn những khuẩn lạc rời, đặc trưng cho nấm Trichoderma cấy qua môi trường TSM. Các chủng nấm Trichoderma sau khi làm thuần được cấy vào các ống thạch nghiêng chứa môi trường PGA. Song song đó, chúng tôi cũng xác định một số yếu tố lý hóa của môi trường đất nơi các chủng Trichoderma được phân lập như pH, độ ẩm, thành phần cơ giới của đất. 2.2.1.3. Chọn lọc các chủng Trichoderma có khả năng đối kháng tốt với các chủng Colletotrichum trên môi trường PGA Cắt những miếng thạch có diện tích bằng nhau có chứa Colletotrichum và Trichoderma trên các đĩa giống trung gian. Đặt các khối thạch lên đĩa petri có chứa môi trường PGA để tiến hành đối kháng. Đĩa đối chứng chỉ đạt khối thạch chứa Colletotrichum. Các chủng nấm Trichoderma có khả năng đối kháng sẽ hạn chế sự phát triển của Colletotrichum và mọc tràn lên phía trên tơ của nấm Colletotrichum. Hằng ngày, xác định hiệu quả đối kháng Colletotrichum của các chủng Trichoderma. Hiệu quả đối kháng được tính theo công thức: H = (Dđc – Dtt)/Dđc x 100 (%). Với Dđc là bán kính khuẩn lạc nấm bệnh trên đĩa đối chứng; Dtt là bán kính khuẩn lạc nấm bệnh trên đĩa thử thật. Chọn lọc các chủng Trichoderma có khả năng đối kháng với các chủng Colletotrichum tốt nhất và trong thời gian nhanh nhất 2.2.2. Thử nghiệm khả năng kiểm soát Colletotrichum bằng chế phẩm từ Trichoderma trên cây ớt ở quy mô vườn thực nghiệm 2.2.2.1. Nghiên cứu tạo chế phẩm Trichoderma cấp 2: ảnh hưởng của một số yếu tố lên mật độ bào tử Trichoderma trên môi trường bán rắn 31

Thành phần môi trường bán rắn Nuôi cấy riêng lẻ từng chủng Trichoderma chọn lọc từ mục 2.2.1.3 trên các môi trường bán rắn để thu nhận chế phẩm bào tử cấp 1. Cấy riêng lẻ các chủng này vào các môi trường có thành phần cơ chất bán rắn khác nhau. Mật độ bào tử cấp 1 bổ sung là 107 bào tử/ g môi trường. Tỷ lệ 2 thành phần cơ chất dinh dưỡng và cơ chất tạo độ xốp là 7:3. Ủ ở nhiệt độ phòng. Sau 5 ngày, thu nhận canh trường và xác định mật độ bào tử. Chọn thành phần môi trường cho mật độ bào tử cao nhất. Tỷ lệ cơ chất Nuôi cấy riêng lẻ từng chủng Trichoderma chọn lọc từ mục 2.2.1.3 trên các môi trường bán rắn để thu nhận chế phẩm bào tử cấp 1. Cấy riêng lẻ các chủng này vào các môi trường có thành phần cơ chất bán rắn đã chọn ở mục trên. Mật độ bào tử cấp 1 bổ sung là 107 bào tử/ g môi trường. Trong đó có sự thay đổi tỷ lệ 2 thành phần cơ chất dinh dưỡng và cơ chất tạo độ xốp 5:5; 6:4; 7:3; 8:2 và 9:1. Ủ ở nhiệt độ phòng. Sau 5 ngày, thu nhận canh trường và xác định mật độ bào tử. Chọn tỷ lệ môi trường cho mật độ bào tử cao nhất. Độ ẩm môi trường bán rắn Nuôi cấy riêng lẻ từng chủng Trichoderma chọn lọc từ mục 2.2.1.3 trên các môi trường bán rắn để thu nhận chế phẩm bào tử cấp 1. Cấy riêng lẻ các chủng này vào các môi trường có thành phần và tỷ lệ cơ chất bán rắn đã chọn ở các mục trên. Mật độ bào tử cấp 1 bổ sung là 107 bào tử/ g môi trường. Trong đó có sự thay đổi độ ẩm môi trường bán rắn: 50; 60; 70 và 80%. Ủ ở nhiệt độ phòng. Sau 5 ngày, thu nhận canh trường và xác định mật độ bào tử. Chọn độ ẩm môi trường bán rắn thích hợp cho mật độ bào tử cao nhất. Mật độ giống cấp 1 bổ sung Nuôi cấy riêng lẻ từng chủng Trichoderma chọn lọc từ mục 2.2.1.3 trên các môi trường bán rắn để thu nhận chế phẩm bào tử cấp 1. Cấy riêng lẻ các chủng này vào các môi trường có thành phần và tỷ lệ cơ chất bán rắn, độ ẩm đã chọn ở các mục trên. Trong đó có sự thay đổi mật độ bào tử cấp 1 bổ sung 104; 105; 106; 107 và 108 bào tử/ g môi trường bán rắn. Ủ ở nhiệt độ phòng. Sau 5 ngày, thu nhận canh trường và xác định mật độ bào tử. Chọn mật độ giống cấp 1 thích hợp cho mật độ bào tử trong canh trường cấp 2 cao nhất. Thời gian nuôi cấy

32

Nuôi cấy riêng lẻ từng chủng Trichoderma chọn lọc từ mục 2.2.1.3 trên các môi trường bán rắn để thu nhận chế phẩm bào tử cấp 1. Cấy riêng lẻ các chủng này vào các môi trường có thành phần và tỷ lệ cơ chất bán rắn, độ ẩm và mật độ giống cấp 1 đã chọn ở các mục trên. Trong đó có sự thay đổi thời gian nuôi cấy. Ủ ở nhiệt độ phòng. Sau các khoảng thời gian 2; 3; 4; 5; 6 và 7 ngày, thu nhận canh trường và xác định mật độ bào tử. Chọn thời gian nuôi cấy bắn rắn thích hợp cho mật độ bào tử cao nhất. Sử dụng các yếu tố đã chọn lọc ở trên để nuôi cấy, thu nhận chế phẩm Trichoderma trên quy mô sản xuất nhỏ. Chế phẩm này được sử dụng để thử nghiệm khả năng kiểm soát nấm bệnh Colletotrichum trên cây ớt. 2.2.2.2. Thử nghiệm khả năng phòng trị bệnh thán thư bằng các chế phẩm chứa bào tử Trichoderma sp. trên đồng ruộng Địa điểm thực hiện: ruộng ớt hộ anh Lâm, ấp Bình Chánh, xã Khánh Bình, thị xã Tân Uyên, tỉnh Bình Dương.

33

Thí nghiệm gồm 4 lô, được tiến hành sau khi các cây ớt đã xuống giống được 1 tháng, chế độ nước tưới, thuốc trừ sâu, thuốc dưỡng trái, phân bón… giống nhau giữa các lô thí nghiệm. Lô đối chứng âm (ĐCa): 60 cây, không sử dụng các sản phẩm thuốc kiểm soát nấm bệnh. Lô đối chứng dương (ĐCd): 60 cây, sử dụng nhiều loại thuốc kiểm soát nấm bệnh có nguồn gốc sinh học (Diatin 8SL) và hóa học (Ringo L 20SC), định kì sử dụng 10 ngày/ lần. Lô NT1: 60 cây, sử dụng kết hợp chế phẩm dạng phun xịt định kì 10 ngày/ lần và bón gốc 30 ngày/ lần. Lô NT2: 60 cây, sử dụng chế phẩm dạng bón gốc định kì 10 ngày/ lần. Cách sử dụng các loại chế phẩm: Chế phẩm bón gốc: mật độ tối thiểu 2 x 108 bào tử/g, rải chế phẩm quanh gốc cây, mỗi cây khoảng 20g. Chế phẩm hòa tan: mật độ tối thiểu 2 x 108 bào tử/g, hòa tan 40 g chế phẩm vào 16 lít nước sạch, phun đều lên toàn bộ cây. Sau các khoảng thời gian 2, 3 và 4 tháng, xác định tỷ lệ cây ớt bị bệnh thán thư và một số bệnh bệnh khác như héo vàng do nấm, héo vàng do tuyến trùng.

34

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Phân lập và làm thuần nấm bệnh Colletotrichum 3.1.1. Phân lập và làm thuần Từ 5 mẫu ớt bệnh thu nhận được từ các chợ bán lẻ và nhà vườn (bảng 3.1), chúng tôi ghi nhận triệu chứng của các mẫu bệnh và tiến hành phân lập nấm bệnh trên môi trường PGA và môi trường thạch nước cất. Kết quả phân lập được 5 chủng nấm có đặc điểm tương tự Colletotrichum. Các chủng nấm này được ghi nhận các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, đặc điểm bào tử và tốc độ phát triển trên môi trường PGA. Bảng 3.1. Địa điểm thu mẫu ớt bệnh và kí hiệu các chủng Colletotrichum sp. phân lập Mẫu bệnh Địa điểm thu mẫu Kí hiệu chủng phân lập Trái ớt chỉ thiên chín Chợ Vinh Sơn, đường Trần Văn Ơn, C1 TP.Thủ Dầu Một Trái ớt chỉ thiên chín Chợ Hàng Bông, đường Phú Lợi, CH2 TP. Thủ Dầu Một Trái ớt chỉ thiên chín Nhà vườn tại Uyên Hưng, Tân Uyên C2 Trái ớt sừng trâu chín Chợ Đồng An 2, TX. Thuận An C4 Trái ớt chỉ thiên xanh Nhà vườn tại Khánh Bình, Tân Uyên C5 Nhìn chung, các chủng Colletotrichum sp. phân lập được có đặc điểm khá đa dạng. Có thể chia thành 2 nhóm, các chủng phát triển nhanh (C1, CH2 và C5) có đường kính khuẩn lạc từ 3,4 – 4,1 cm sau 3 ngày nuôi cấy. Các chủng C2 và C4 phát triển chậm, có đường kính tương ứng lần lượt là 1,2 và 2,3 cm sau 3 ngày nuôi cấy. Chủng C1 và CH2 có hình thái tương tự nhau, khuẩn lạc màu xám đậm, tơ dạng bông xốp, phát triển đều từ tâm sau 3 ngày nuôi cấy. Từ ngày thứ 5 trở đi, bề mặt khuẩn xuất hiện những chấm nhỏ mọc nhô cao lên khỏi mặt thạch, có màu đen (chủng C1) hoặc màu trắng đục (chủng CH2). Các chấm này là các đĩa cành tập trung một số lượng lớn bào tử của nấm. Quan sát dưới kinh hiển vi, bào tử các chủng C1 và CH2 có dạng hình cong lưỡi liềm, không có vách ngăn, bên trong chứa nhiều giọt dầu (hình 3.2). Khuẩn ty màu trắng, lớn, không có vách ngăn. Khuẩn lạc chủng C2 có màu cam nhạt, trong khi các chủng C4 và C5 có màu trắng sau 3 ngày nuôi cấy. Khuẩn lạc mọc tròn đều, trong một số trường hợp, chủng C5 mọc không 35

đều, mép khuẩn lạc lượn sóng (hình 3.1). Từ ngày thứ 8 trở đi, bề mặt khuẩn lạc chủng C2 xuất hiện những chấm tròn màu đen, càng để lâu, khuẩn lạc chuyển dần sang màu hồng xám. Mặt dưới khuẩn lạc chủng C4 và C5 có màu đen không liên tục, mọc kéo dài từ tâm ra. Mặt dưới khuẩn lạc chủng C2 có màu đen tập trung ở giữa. Bào tử các chủng C2, C4 và C5 có dạng hình que dài, thuôn hai đầu, không có vách ngăn, bên trong chứa nhiều giọt dầu. Khuẩn ty màu trắng và không có vách ngăn (hình 3.2). 3.1.2. Gây bệnh nhân tạo Tất cả các chủng Colletotrichum sp. phân lập được đều có khả năng gây bệnh cho trái ớt sau thu hoạch. Thời gian xuất hiện triệu chứng bệnh đồng tiền sau 1 – 4 ngày. Hầu hết vết bệnh có màu đậm ở chính giữa, xung quanh lõm xuống (hình 3.3). Càng về sau, vết bệnh thối nhũn, bề mặt vết bệnh xuất hiện những hạt nhỏ li ti màu đen hoặc màu cam, đó là các đĩa cành của nấm Colletotrichum sp. So với triệu chứng của các mẫu bệnh trước khi phân lập, vết bệnh gây nhiễm không có sự khác biệt.

A B C

Hình 3.1. Khuẩn lạc các chủng Colletotrichum sp. trên môi trường PGA sau 5 ngày nuôi cấy. A) Colletotrichum C1; B) Colletotrichum C4; C) Colletotrichum C5

A B C

36

Hình 3.2: Bào tử các chủng Colletotrichum sp. trên môi trường PGA. A) bào tử chủng C1 hình cong lưỡi liềm, không có vách ngăn; B) bào tử chủng C2 có hình que ngắn, thuôn hai đầu, không có vách ngăn; C) bào tử chủng CH2 có hình cong lưỡi liềm, không có vách ngăn, các đĩa cành với tơ cứng màu đen.

A C B Hình 3.3: Gây bệnh nhân tạo các chủng Colletotrichum sp. trên trái ớt. A) chủng C2 gây bệnh trên trái ớt chỉ thiên chín; B) chủng CH2 gây bệnh trên trái ớt chỉ thiên chín; C) chủng C4 gây bệnh trên trái ớt sừng trâu.

B C A Hình 3.4: Gây bệnh nhân tạo các chủng Colletotrichum sp. trên cây thực tế. A) chủng C1 gây bệnh trên trái ớt xanh; B) chủng C2 gây bệnh trên trái ớt xanh; C) chủng C5 gây bệnh trên trái ớt chín. Kết quả phân tích trình tự rRNA 28S và tra cứu trên BLAST SEARCH một số chủng Colletotrichum phân lập được cho thấy chủng C1, và CH2 thuộc loài Colletotrichum truncatum với mức độ tương đồng 99%. Chủng C4 thuộc loài Colletotrichum acutatum với mức độ tương đồng 99%. 3.2. Phân lập và làm thuần nấm Trichoderma

37

Từ 11 mẫu đất thu từ các khu vực trồng rau màu ở các Huyện thuộc tỉnh Bình Dương (bảng 3.2), chúng tôi xác định sơ bộ thành phần cơ giới và pH của đất. Các mẫu bệnh được pha loãng đến độ pha loãng thích hợp và phân lập các chủng thuộc chi nấm Trichoderma trên môi trường TSM. Kết quả phân lập được 16 chủng nấm có đặc điểm tương tự Trichoderma. Các chủng nấm này được ghi nhận các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, đặc điểm bào tử và tốc độ phát triển trên môi trường PGA.

38

Bảng 3.2. Đặc điểm các mẫu đất phân lập Trichoderma STT Địa điểm thu Loại đất/pH Độ ẩm Đặc điểm Kí hiệu chủng mẫu (%) canh tác Trichoderma 1 Suối Cát, TP. Đất thịt /7,3 25,1 Đất trồng đậu ve. Cây T2.1 Thủ Dầu Một đang giai đoạn phát triển T2.2 2 Suối Cát, TP. Đất thịt /7,0 19,4 Đất trồng mướp đang thu T3.2 Thủ Dầu Một hoạch 3 Tân Bình, Đất thịt pha 19,4 Đất trồng dưa leo đang T4 Tân Uyên sét /6,8 thu hoạch 4 Phước Hòa, Đất cát / 6,9 18,8 Đất trồng dưa leo đang T5.1 Phú Giáo thu hoạch T5.2 5 Khánh Bình, Đất cát pha 22,3 Đất trồng bầu đang thu T6.1 Tân Uyên sét / 6,8 hoạch T6.2 6 Khánh Bình, Đất cát /7,19 18,5 Đất trồng ớt đang thu T7.1 Tân Uyên hoạch T7.2 7 Khánh Bình, Đất cát /7,5 18,0 Đất trồng ớt bị bệnh thối T8.1 Tân Uyên cổ rễ T8.2 8 Lái Thiêu, Đất cát pha 24,5 Đất trồng bí xanh đang T9 Thuận An sét / 6,9 thu hoạch 9 Tân Ba, Tân Đất thịt pha 20,2 Đất trồng đậu bắp đang T10 Uyên cát / 6,8 thu hoạch 10 Tân Ba, Tân Đất thịt pha 19,0 Đất trồng khổ qua đang T11 Uyên cát / 6,4 thu hoạch 11 An Điền, Bến Đất thịt / 6,9 20,7 Đất trồng hành lá đang T12 Cát thu hoạch Từ 11 mẫu đất thu nhận tại các khu vực trồng rau màu trên địa bàn tỉnh Bình Dương, chúng tôi phân lập được 16 chủng Trichoderma sp.. Trong mỗi mẫu đất có từ 1- 2 chủng. Nhìn chung, Trichoderma có mặt trong nhiều loại đất khác nhau với pH trong khoảng 6,8 – 7,5, độ ẩm 18 – 25%. Mật độ Trichoderma khoảng 102 – 103 CFU/g, chiếm khoảng 10 – 20% so với tổng số nấm mốc có trong đất. 39

Hầu hết các chủng Trichoderma sp. có tốc độ phát triển nhanh, đường kính vòng tăng trưởng đạt 8 – 10 cm sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường PGA. Bào tử hình thành sau 3 – 4 ngày nuôi cấy, một số chủng hình thành bào tử sau 2 ngày nuôi cấy (chủng T5.1, T6.2 và T7.1). Riêng chủng T6.1 có tốc độ lan tơ rất nhanh nhưng bào tử chỉ hình thành sau khoảng 8 – 10 ngày nuôi cấy. Màu sắc bào tử thay đổi từ xanh nhạt (chủng T6.1 và T12) cho đến xanh oliu đậm (hình 3.5). Trichoderma T3.2, T7.1, T10 và T11 làm môi trường hóa vàng khi phát triển trong khi các chủng còn lại không làm thay đổi màu của môi trường. Hầu hết các chủng có bào tử mọc dày đặc, phủ đều khắp mặt thạch. Trong khi đó, chủng T6.1 và T7.1 có bào tử mọc rải rác thành từng cụm. Cấu trúc cuống sinh bào tử của các chủng không có sự khác biệt đáng kể, có thể quan sát thấy rõ các thể bình đặc trưng của chi Trichoderma.

A B C

Hình 3.5. Khuẩn lạc các chủng Trichoderma sp. trên môi trường PGA sau 5 ngày nuôi cấy. A) chủng T2.2; B) chủng T4; C) chủng T5.1

A B C

Hình 3.6. Bào tử các chủng Trichoderma sp. trên môi trường PGA. A) T2.1; B)T3.2; C) T5.1 3.3. Chọn lọc các chủng Trichoderma có khả năng đối kháng tốt với các chủng Colletotrichum trên môi trường PGA 40

Từ các đĩa giống trung gian, chúng tôi cấy các chủng nấm bệnh trước từ 2 – 3 ngày, tương ứng với đường kính vòng tăng trưởng khoảng 2 cm. Sau đó cấy các chủng Trichoderma sp. và ghi nhận khả năng đối kháng sau 3, 4 và 5 ngày nuôi cấy. Bảng 3.3. Hiệu quả đối kháng (%) của các chủng Trichoderma sp. với Colletotrichum C1 Chủng Hiệu quả đối kháng với chủng Colletotrichum C1 (%)

Trichoderma sp. 3 ngày 4 ngày 5 ngày T2.1 28,6 ± 0.0 45,8 ± 1,5 63,0 ± 8,0 T2.2 34,5 ± 4,5 52,1 ± 7,4 60,2 ± 4,7 T3.2 32,1 ± 5,1 42,7 ± 3,9 52,8 ± 2,3 T4 40,5 ± 1,7 60,4 ± 1,5 91,7 ± 6,0 T5.1 38,1 ± 6,1 47,9 ± 3,9 95,4 ± 6,5 T5.2 44,0 ± 1,7 52,1 ± 1,5 68,5 ± 4,7 T6.1 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 T6.2 48,8 ± 12,1 45,8 ± 3,9 83,3 ± 6,8 T7.1 33,3 ± 3,4 44,8 ± 2,9 53,7 ± 3,5 T7.2 28,6 ± 0,0 39,6 ± 2,9 46,3 ± 2,6 T8.1 34,5 ± 1,7 49,0 ± 1,5 50,0 ± 2,3 T8.2 27,4 ± 1,7 38,5 ± 1,5 46,3 ± 2,6 T9 46,4 ± 2,9 58,3 ± 1,5 82,4 ± 3,5 T10 29,8 ± 1,7 47,9 ± 1,5 57,4 ± 1,3 T11 38,1 ± 3,4 45,8 ± 2,9 57,4 ± 1,3 T12 34,5 ± 4,5 45,8 ± 1,5 59,3 ± 2,6

41

Biểu đồ 3.1. Hiệu quả đối kháng (%) của các chủng Trichoderma sp. với Colletotrichum C1

Bảng 3.4. Hiệu quả đối kháng (%) của các chủng Trichoderma sp. với Colletotrichum C2

Chủng Hiệu quả đối kháng với chủng Colletotrichum C2 (%) Trichoderma sp. 3 ngày 4 ngày 5 ngày T2.1 53,6 ± 2,9 69,8 ± 1,5 75,9 ± 3,5 T2.2 79,8 ± 3,4 83,3 ± 1,5 100,0 ± 0,0 T3.2 82,1 ± 8,7 84,4 ± 7,7 87,0 ± 5,7 T4 76,2 ± 4,5 82,3 ± 1,5 100,0 ± 0,0 T5.1 84,5 ± 3,4 89,6 ± 2,9 100,0 ± 0,0 T5.2 48,8 ± 3,4 72,9 ± 2,9 98,1 ± 2,6 T6.1 53,6 ± 2,9 66,7 ± 1,5 75,9 ± 2,6 T6.2 77,4 ± 3,4 83,3 ± 1,5 100,0 ± 0,0 T7.1 42,9 ± 2,9 55,2 ± 2,9 66,7 ± 0,0 T7.2 67,9 ± 2,9 59,4 ± 2,6 63,9 ± 2,3 T8.1 60,7 ± 2,9 66,7 ± 2,9 70,4 ± 2,6 T8.2 58,3 ± 1,7 81,3 ± 4,4 100,0 ± 0,0 T9 51,2 ± 1,7 71,9 ± 2,6 76,9 ± 3,5 T10 53,6 ± 5,1 58,3 ± 8,2 74,1 ± 3,5 T11 53,6 ± 5,1 69,8 ± 1,5 75,9 ± 3,5 T12 41,7 ± 1,7 52,1 ± 1,5 65,7 ± 1,3

42

Bảng 3.5. Hiệu quả đối kháng (%) của các chủng Trichoderma sp. với Colletotrichum CH2

Chủng Hiệu quả đối kháng với chủng Colletotrichum CH2 (%)

Trichoderma sp. 3 ngày 4 ngày 5 ngày T 2.1 31,0 ± 3,4 47,9 ± 2,9 61,1 ± 3,9

T2.2 35,7 ± 0,0 71,9 ± 2,6 93,5 ± 2,6 T3.2 28,6 ± 2,9 42,7 ± 1,5 50,9 ± 1,3 T4 28,6 ± 0,0 74,0 ± 3,9 84,3 ± 2,6 T5.1 27,4 ± 1,7 56,3 ± 2,6 78,7 ± 3,5 T5.2 22,6 ± 8,4 42,7 ± 1,5 53,7 ± 2,6 T6.1 48,8 ± 1,7 66,7 ± 1,5 77,8 ± 0,0 T6.2 42,9 ± 5,1 69,8 ± 7,8 75,0 ± 6,0 T7.1 39,3 ± 2,9 54,2 ± 3,9 58,3 ± 4,5 T7.2 59,5 ± 3,4 69,8 ± 3,9 74,1 ± 3,5 T8.1 45,2 ± 7,3 69,8 ± 6,4 100,0 ± 0,0 T8.2 41,7 ± 4,5 66,7 ± 11,8 95,4 ± 6,5 T9 40,5 ± 1,7 82,3 ± 2,9 100,0 ± 0,0 T10 42,9 ± 0,0 50,0 ± 0,0 55,6 ± 0,0 T11 46,4 ± 8,7 57,3 ± 1,3 62,0 ± 9,2 T12 41,7 ± 4,5 52,1 ± 1,5 58,3 ± 2,3

43

Biểu đồ 3.3. Hiệu quả đối kháng (%) của các chủng Trichoderma sp. với Colletotrichum CH2

Bảng 3.6. Hiệu quả đối kháng (%) của các chủng Trichoderma sp. với Colletotrichum C4 Chủng Hiệu quả đối kháng với chủng Colletotrichum C4 (%) Trichoderma sp. 3 ngày 4 ngày 5 ngày T2.1 53,6 ± 2,9 57,3 ± 3,9 89,8 ± 2,6 T2.2 48,8 ± 1,7 83,3 ± 1,5 100,0 ± 0,0 T3.2 41,7 ± 1,7 93,3 ± 8,8 96,3 ± 5,2 T4 53,6 ± 2,9 82,3 ± 1,5 100,0 ± 0,0 T5.1 34,5 ± 4,5 56,3 ± 2,6 96,3 ± 5,2 T5.2 45,2 ± 7,3 66,7 ± 7,8 79,6 ± 8,6 T6.1 36,9 ± 1,7 62,5 ± 2,6 100,0 ± 0,0 T6.2 38,1 ± 3,4 60,4 ± 1,5 75,0 ± 3,9 T7.1 32,1 ± 5,1 35,4 ± 3,9 90,7 ± 6,9 T7.2 33,3 ± 3,4 49,0 ± 3,9 65,7 ± 5,7 T8.1 32,1 ± 2,9 50,0 ± 0,0 62,0 ± 5,2 T8.2 39,3 ± 2,9 57,3 ± 1,5 77,8 ± 3,9 T9 40,5 ± 4,5 60,4 ± 3,9 88,9 ± 8,2 T10 26,2 ± 3,4 51,0 ± 5,9 64,8 ± 2,6 T11 31,1 ± 1,7 47,9 ± 1,5 64,8 ± 1,3 T12 34,5 ± 1,7 51,0 ± 2,9 65,7 ± 1,3

44

Biểu đồ 3.4. Hiệu quả đối kháng (%) của các chủng Trichoderma sp. với Colletotrichum C4

Bảng 3.7. Hiệu quả đối kháng (%) của các chủng Trichoderma sp. với Colletotrichum C5 Chủng Hiệu quả đối kháng với chủng Colletotrichum C5 (%)

Trichoderma sp. 3 ngày 4 ngày 5 ngày T 2.1 61,9 ± 1,7 68,8 ± 2,6 84,3 ± 3,5 T2.2 66,7 ± 4,5 74,0 ± 3,9 85,2 ± 4,7 T3.2 67,9 ± 0,0 91,7 ± 6,4 100,0 ± 0,0 T4 61,9 ± 4,5 74,0 ± 3,9 100,0 ± 0,0 T5.1 70,2 ± 4,5 78,1 ± 2,6 97,2 ± 3,9 T5.2 65,5 ± 4,5 72,9 ± 2,9 100,0 ± 0,0 T6.1 70,2 ± 7,3 79,2 ± 2,9 81,5 ± 2,6 T6.2 60,7 ± 2,9 67,0 ± 1,5 78,7 ± 1,3 T7.1 70,2 ± 4,5 89,6 ± 7,4 97,2 ± 3,9 T7.2 58,3 ± 4,5 70,8 ± 2,9 76,9 ± 1,3 T8.1 60,7 ± 2,9 66,7 ± 2,9 74,1 ± 1,3 T8.2 60,9 ± 1,7 80,2 ± 1,5 100,0 ± 0,0 T9 70,2 ± 1,7 84,4 ± 5,5 100,0 ± 0,0 T10 58,3 ± 1,7 65,6 ± 2,6 75,9 ± 1,3 T11 59,5 ± 3,4 69,8 ± 1,5 75,9 ± 3,5 T12 58,3 ± 1,7 63,5 ± 1,5 68,5 ± 1,3

45

Biểu đồ 3.5. Hiệu quả đối kháng (%) của các chủng Trichoderma sp. với Colletotrichum C5

46

A C B Hình 3.7. Đối kháng giữa các chủng Trichoderma koningii và Colletotrichum sp. trên môi trường PGA theo cơ chế kí sinh và cạnh tranh dinh dưỡng. A) Trichoderma T5.1 và Colletotrichum C1; B) Trichoderma T2.2 và Colletotrichum C2; C) Trichoderma T4 và Colletotrichum C4

A B C Hình 3.8. Khuẩn ty của nấm Trichoderma sp. quấn chặt lấy khuẩn ty của Colletotrichum sp. (độ phóng đại 4000 lần). A) khuẩn ty Trichoderma T5.1 và Colletotrichum C1; B, C) khuẩn ty Trichoderma T4 và khuẩn ty Colletotrichum C4

Tất cả các chủng Trichoderma phân lập được đều có khả năng đối kháng với các chủng Colletotrichum ở các mức độ khác nhau. Các chủng Trichoderma T7.1, T8.1, T10 và T11 có khả năng đối kháng Colletotrichum theo cơ chế cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống, nhờ vào tốc độ phát triển nhanh. Bên cạnh tốc độ phát triển nhanh, các chủng Trichoderma còn lại còn có khả năng kí sinh trên khuẩn ty nấm bệnh. Khuẩn ty Trichoderma áp sát và quấn chặt lấy khuẩn ty Colletotrichum, hoặc tiết enzyme và ăn sâu vào bên trong khuẩn ty nấm bệnh (hình 3.8). Trong một số trường hợp, rất có thể Trichoderma hút các chất dinh

47 dưỡng từ khuẩn ty nấm bệnh và phát triển rất mạnh, tạo nhiều bào tử hơn so với khi phát triển trên môi trường PGA (các chủng T2.2 và T8.2).

Hầu hết các chủng Trichoderma có hiệu quả đối kháng rõ ràng sau thời gian 4-5 ngày. Sau 5 ngày, có 7 chủng Trichoderma có khả năng đối kháng với Colletotrichum C5 đạt hiệu quả 100%, 6 chủng Trichoderma đối kháng với C2 đạt hiệu quả 100%, 5 chủng Trichoderma đạt hiệu quả 100% đối với Colletotrichum C4. Chỉ có 3/16 chủng Trichoderma khảo sát đối kháng được với C1 và CH2 đạt hiệu quả 100%. Đặc biệt, chủng Trichoderma T6.1 đối kháng với C1 đạt hiệu quả 100% chỉ sau 3 ngày nuôi cấy. Các kết quả đối kháng cũng phù hợp với nghiên cứu của Svatlana Zivkovic (2010), Trương Minh Tường (2011) và Nguyễn Thị Thiên Hằng (2012), các chủng Trichoderma sp. có khả năng đối kháng đạt hiệu quả 100% với các chủng nấm bệnh trên môi trường PGA sau 5 ngày nuôi cấy.[3,6,26] Trong số 16 chủng Trichoderma sp. khảo sát, chủng T4 và T5.1 có khả năng đối kháng đạt hiệu quả tối đa với 4 chủng Colletotrichum (C1, C2, C4 và C5), chủng Trichoderma T2.2 đối kháng đạt hiệu quả 100% với 3 chủng Colletotrichum C2, CH2 và C4. Các chủng còn lại có khả năng đối kháng tốt với 1 hoặc 2 chủng Colletotrichum. Từ các kết quả thu được, chúng tôi chọn các chủng Trichoderma T2.2, T4 và T5.1 để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Kết quả phân tích trình tự rRNA 28S và tra cứu trên BLAST SEARCH cho thấy cả 3 chủng Trichoderma T2.2, T4 và T5.1 đều thuộc loài Trichoderma koningii (Hypocera koningii) với mức độ tương đồng 98%. 3.4. Nghiên cứu tạo chế phẩm bào tử Trichoderma 3.4.1. Ảnh hưởng của thành phần cơ chất Nuôi cấy bán rắn riêng lẻ 3 chủng Trichoderma T2.2, T4 và T5.1 trên môi trường bán rắn cấp 1. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 4 ngày. Cấy riêng lẻ bào tử các chủng Trichoderma cấp 1 vào môi trường bán rắn cấp 2, trong đó có sự thay đổi thành phần cơ chất bán rắn, đổ ẩm của môi trường bán rắn khoảng 60%. Mật độ bào tử bổ sung khoảng 107. Sau 4 ngày ủ ở nhiệt độ phòng, thu nhận và xác định mật độ bào tử Trichoderma cấp 2 trong các canh trường bán rắn khác nhau.

48

Bào tử trong các canh trường bán rắn được lọc bằng nước cất vô trùng và định mức thành 1 lít. Dịch này tiếp tục được pha loãng 10 lần sau đó đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.8:

Bảng 3.8. Mật độ bào tử Trichoderma khi nuôi cấy trên các môi trường bán rắn có thành phần cơ chất khác nhau Chủng Thành phần cơ chất bán rắn Trichoderma CG/XD CG/TR CM/XD CM/TR BN/XD BN/TR

T2.2 4,4 x 108 7,7 x 108 10,7 x 108 8,9 x 108 10,4 x 108 4,5 x 108

T4 5,8 x 108 5,1 x 108 8,5 x 108 7,2 x 108 8,9 x 108 3,6 x 108

T5.1 4,7 x 108 5,6 x 108 20,7 x 108 19,7 x 108 11,9 x 108 6,2 x 108

Biểu đồ 3.6: Số lượng bào tử Trichoderma trên các môi trường bán rắn khác nhau

Kết quả thí nghiệm cho thấy hai chủng Trichoderma T2.2 và T5.1 khi nuôi cấy trên môi trường bán rắn có thành phần là cám mì (CM) và mụn xơ dừa (XD) cho mật độ bào tử cao nhất. Chủng Trichoderma T4 phát triển trên môi trường cám mì – xơ dừa và bột ngô – xơ dừa cho kết quả tốt nhất và không có sự khác biệt nhiều. Các loại cơ chất dinh dưỡng như cám gạo, bột bắp và cám mì có ảnh hưởng chính đến mật độ bào tử của các chủng Trichoderma. Trong khi đó, trấu và mụn xơ dừa là những cơ chất tạo độ xốp, giúp cho canh trường thoáng khí, không ảnh hưởng trực tiếp đến mật độ bào tử trong canh trường. Do đó,

49 chúng tôi chọn cám mì và mụn xơ dừa để khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ cơ chất lên khả năng sinh bào tử của các chủng Trichoderma chọn loc. 3.4.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ cơ chất Cấy riêng lẻ bào tử các chủng Trichoderma cấp 1 vào môi trường bán rắn cấp 2 có thành phần là cám mì và mụn xơ dừa, trong đó có sự thay đổi tỷ lệ cám mì và mụn xơ dừa: 5:5; 6:4; 7:3; 8:2 và 9:1, đổ ẩm của môi trường bán rắn khoảng 60%. Mật độ bào tử bổ sung khoảng 107. Sau 4 ngày ủ ở nhiệt độ phòng, thu nhận và xác định mật độ bào tử Trichoderma cấp 2 trong các canh trường bán rắn khác nhau bằng cách đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.9: Bảng 3.9. Mật độ bào tử Trichoderma khi nuôi cấy trên các môi trường bán rắn có tỷ lệ cơ chất khác nhau Chủng Tỷ lệ cám mì: mụn xơ dừa Trichoderma 5:5 6:4 7:3 8:2 9:1

T2.2 14,0 x 108 22,9 x 108 19,5 x 108 18,5 x 108 16,4 x 108

T4 6,6 x 108 11,6 x 108 10,9 x 108 10,4 x 108 6,9 x 108

T5.1 7,7 x 108 12,0 x 108 10,2 x 108 8,5 x 108 8,7 x 108

Biểu đồ 3.7. Mật độ bào tử Trichoderma khi nuôi cấy trên các môi trường bán rắn có tỷ lệ cám mì và mụn xơ dừa khác nhau

50

Tỷ lệ giữa cám mì và mụn xơ dừa có ảnh hưởng khá nhiều tới mật độ bào tử của các chủng Trichoderma chọn lọc trong canh trường bán rắn. Cả 3 chủng Trichoderma chọn lọc đều cho số lượng bào tử Trichoderma cao nhất khi nuôi cấy trên môi trường bán rắn có tỷ lệ cám mì và mụn xơ dừa là 6 : 4, với mật độ của các chủng T2.2, T4 và T5.1 lần lượt đạt 2,2 x 109, 1,1 x 109 và 1,2 x 109 bào tử/g canh trường tươi. Môi trường bán rắn có thành phần cơ chất như trên vừa đảm bảo được nguồn chất dinh dưỡng, vừa đảm bảo được độ thoáng khí. Đây là 2 yếu tố cần thiết cho quá trình tạo bào tử của Trichoderma. Do đó chúng tôi chọn môi trường bán rắn có tỷ lệ cám mì và mụn xơ dừa là 6:4 để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.

3.4.3. Ảnh hưởng của lượng nước bổ sung Cấy riêng lẻ bào tử các chủng Trichoderma cấp 1 vào môi trường bán rắn cấp 2 có thành phần cám mì và mụn xơ dừa với tỷ lệ 6:4. Trong đó, có sự thay đổi lượng nước bổ sung vào môi trường bán rắn: 50; 60; 70 và 80%. Mật độ bào tử bổ sung khoảng 107. Ủ ở nhiệt độ phòng. Sau 4 ngày nuôi cấy, thu nhận và xác định mật độ bào tử Trichoderma cấp 2 trong các canh trường bán rắn khác nhau bằng cách đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.10: Bảng 3.10. Mật độ bào tử Trichoderma khi nuôi cấy trên các môi trường bán rắn có lượng nước bổ sung vào môi trường khác nhau Chủng Lượng nước bổ sung vào môi trường (%) Trichoderma 50 60 70 80

T2.2 14,2 x 108 21,1 x 108 11,3 x 108 2,7 x 108

T4 12,1 x 108 17,3 x 108 10,4 x 108 2,4 x 108

T5.1 10,1 x 108 14,7 x 108 12,9 x 108 4,2 x 108

51

Biểu đồ 3.8. Mật độ bào tử Trichoderma khi nuôi cấy trên các môi trường bán rắn có lượng nước bổ sung vào môi trường khác nhau Độ ẩm của môi trường bán rắn có ảnh hưởng lớn đến mật độ bào tử của các chủng Trichoderma chọn lọc. Độ ẩm thấp hoặc cao đều không có ảnh hưởng không tốt tới quá trình tạo bào tử của các chủng Trichoderma này. Chúng tôi nhân thấy, chủng Trichoderma T2.2, T4 và T5.1 đều có khả năng tạo bào tử tốt nhất trên môi trường bán rắn lượng nước bổ sung 60%, với mật độ lần lượt đạt 2,1 x 109, 1,7 x 109, 1,4 x 109 bào tử/g canh trường tươi. 3.4.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống Cấy riêng lẻ bào tử các chủng Trichoderma cấp 1 vào môi trường bán rắn cấp 2 có thành phần cám mì và mụn xơ dừa với tỷ lệ 6:4. Lượng nước bổ sung vào môi trường bán rắn 60%. Trong đó có sự thay đổi tỷ lệ bào tử bổ sung giữa các nghiệm thức: 105, 106, 107, 108 và 109 bào tử. Ủ ở nhiệt độ phòng. Sau 4 ngày nuôi cấy, thu nhận và xác định mật độ bào tử Trichoderma cấp 2 trong các canh trường bán rắn khác nhau bằng cách đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.11: Bảng 3.11. Mật độ bào tử Trichoderma khi nuôi cấy trên các môi trường bán rắn với mật độ bào tử bổ sung khác nhau Chủng Mật độ giống bổ sung (bào tử/ml) Trichoderma 104 105 106 107 108

T2.2 14,2 x 108 15,7 x 108 20,1 x 108 22,8 x 108 15,8 x 108

T4 17,8 x 108 18,5 x 108 18,9 x 108 17,2 x 108 17,4 x 108

52

T5.1 14,2 x 108 15,4 x 108 18,8 x 108 18,5 x 108 18,1 x 108

/ g) / ừ

4

bào t bào 10

8

105

(10

ử 106

bào t bào 7

10 ộ 8

t đ t 10

ậ M

Biểu đồ 3.9. Mật độ bào tử Trichoderma khi nuôi cấy trên các môi trường bán rắn với mật độ bào tử bổ sung khác nhau

Mật độ giống ban đầu bổ sung vào môi trường bán rắn có ảnh hưởng không nhiều tới mật độ giống sau khi ủ của các chủng Trichoderma chọn lọc. Giữa các nghiệm thức, kết quả chỉ chênh lệch khoảng 10%. Chủng Trichoderma T2.2 cho số lượng bào tử nhiều nhất khi bổ sung giống ban đầu với mật độ 107 bào tử. Kết quả tương tự đối với các chủng T4 và T5.1 là 106 bào tử. Do đó chúng tôi chọn các mật độ bào tử này để bổ sung vào canh trường nuôi cấy trong thí nghiệm tiếp theo. 3.4.5. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy Cấy riêng lẻ bào tử các chủng Trichoderma cấp 1 vào môi trường bán rắn cấp 2 có thành phần cám mì và mụn xơ dừa với tỷ lệ 6:4. Lượng nước bổ sung vào môi trường bán rắn 60%. Mật độ bào tử bổ sung 107 bào tử đối với chủng T2.2 và 106 bào tử đối với hai chủng T4 và T5.1. Ủ ở nhiệt độ phòng. Sau các khoảng thời gian khac nhau, thu nhận và xác định mật độ bào tử Trichoderma cấp 2 trong các canh trường bán rắn khác nhau bằng cách đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.12: Bảng 3.12. Mật độ bào tử Trichoderma khi nuôi cấy trên các môi trường bán rắn với các khoảng thời gian khác nhau

53

Chủng Thời gian nuôi cấy (ngày) Trichoderma 2 3 4 5 6 7

T2.2 17,6 x 108 18,3 x 108 22,6 x 108 23,7 x 108 22,8 x 108 23,0 x 108

T4 10,1 x 108 21,9 x 108 22,5 x 108 24,2 x 108 24,4 x 108 23,4 x 108

T5.1 14,1 x 108 19,6 x 108 20,7 x 108 20,9 x 108 22,0 x 108 21,8 x 108

Biểu đồ 3.10. Mật độ bào tử Trichoderma khi nuôi cấy trên các môi trường bán rắn với các khoảng thời gian khác nhau Mật độ bào tử của chủng Trichoderma T2.2 tăng nhanh từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 4, sau đó mật độ dao động trong khoảng 22,6 – 23,7 x 108 bào tử/ g canh trường. Đối với hai chủng Trichoderma T4 và T5.1, mật độ bào tử không tăng nhiều kể từ sau 3 ngày nuôi cấy trở đi. Từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 7, mật độ bào tử chủng Trichoderma T4 và T5.1 dao động lần lượt trong khoảng 21,9 – 24,4 x108 và 19,6 – 22,0 x 108 bào tử/ g canh trường. Từ đó cho thấy, thời gian tối thiểu khi nuôi cấy bán rắn thu nhận bào tử chủng Trichoderma T2.2 là sau 4 ngày. Đối với các chủng Trichoderma T4 và T5.1, chúng ta có thể nhu nhận bào tử sau 3 ngày nuôi cấy. 3.5. Sản xuất chế phẩm bào tử Trichoderma trên quy mô pilot Chúng tôi tiến hành nuôi cấy bán rắn riêng lẻ các chủng Trichoderma sp. chọn lọc với các thông số đã chọn ở mục 3.4. Giống Trichoderma cấp 1 được cấy vào các môi trường bán rắn cấp 2, mỗi mẻ cấy có khối lượng 6 kg, canh trường phân đều lên 6 khay, độ dày canh

54 trường từ 2 – 3 cm. Phủ một lớp vải sạch đã khử trùng lên bề mặt canh trường, hằng ngày phun nước để giữ ẩm cho canh trường. Thu nhận canh trường sau các khoảng thời gian nuôi cấy thích hợp và sấy ở nhiệt độ 45oC cho đến khi độ ẩm canh trường còn khoảng 8 – 10%. Canh trường sau khi sấy khô được sàng qua rây có mắt lưới 75 µm để thu nhận các bào tử (BTP1). Phần canh trường không qua rây (BTP2) được sử dụng như sản phẩm Trichoderma (chế phẩm không tan) dùng bón gốc và ủ phân. Bào tử Trichoderma sau khi rây được phối trộn với các chất mang với tỷ lệ thích hợp để tạo thành chế phẩm hòa tan. Chế phẩm này có mật độ khoảng 2 x 108 bào tử/ g sản phẩm, có thể sử dụng để phun xịt lên các loại cây trồng. Hiệu suất thu nhận và mật độ bào tử trong các canh trường được thể hiện trong bảng 3.13: Bảng 3.13. Hiệu suất thu nhận sản phẩm và mật độ bào tử của các bán thành phẩm Canh trường khô Bán thành phẩm Bán thành phẩm không tan (BTP2) hòa tan (BTP1) Khối Mật độ Khối lượng Mật độ Khối Mật độ lượng (g) (bào tử/g) (g) (bào tử/g) lượng (g) (bào tử/g) Chủng T2.2 100 4,2 x 109 92,0 ± 0,8 1,5 x 109 8,0 ± 0,8 3,1 x 1010

Chủng T4 100 3,7 x 109 94,1 ± 0,5 1,3 x109 5,9 ± 0,5 3,2 x 1010

Chủng T5.1 100 3,5 x 109 96,2 ± 0,8 1,2 x 109 3,8 ± 0,2 3,2 x 1010

Nguyên liệu: (1kg) Gi ống Trichoderma sp. gốc Cám mì: 24%; Mụn xơ dừa 16%; Nước: 60%

Trộn đều môi trường

và hấp khử trùng.

Giống Trichoderma sp. Phối trộn giống Trichoderma sp. bán rắn cấp 1 55

Ủ ở nhiệt độ phòng o (30 C), 4 ngày

Hình 3.9. Quy trình sản xuất chế phẩm Trichoderma sp.

Thuyết minh quy trình:

- Chuẩn bị giống cấp 1: Các chủng Trichoderma sp. được cấy riêng vào các erlen chứa 50 g canh trường bán rắn có 24% thành phần bắp, 16% mụn xơ dừa và 60% nước. Ủ các erlen ở nhiệt độ phòng (30 – 33oC) trong thời gian 5 ngày.

56

- Chuẩn bị môi trường cấp 2: phối trộn đều nguyên liệu bao gồm 24% cám mì, 16% mụn xơ dừa và 60% nước. Hấp khử trùng ở 121oC, 1 atm trong 30 phút. Sau thời gian khử trùng, trải đều để nhiệt độ canh trường giảm xuống còn 40 – 45oC.

- Cấy giống: đảo đều giống cấp 1 trong các erlen. Trộn đều giống cấp 1 vào môi trường cấp 2 sao cho mật độ giống cấp 1 đạt 108 bào tử/ g môi trường đối với chủng T2.2 và 107 bào tử/ g môi trường đối với chủng T4, T5.1. Ủ canh trường ở nhiệt độ phòng (30 – 33oC) trong khoảng thời gian 4 ngày đối với chủng T2.2 và 3 ngày đối với 2 chủng T4 và T5.1.

- Thu nhận canh trường: canh trường sau nuôi cấy được sấy thông gió ở 45oC cho đến khi độ ẩm canh trường còn khoảng 10%. Canh trường khô được rây qua hệ thống rây có cỡ mắt lưới 75µm. Phần qua rây là bán thành phẩm 1, bao gồm bào tử và các đoạn khuẩn ty ngắn. Phần không qua rây là bán thành phẩm 2, bao gồm canh trường nuôi cấy, bào tử và các khuẩn ty có kích thước dài.

- Phối trộn chất mang: các bán thành phẩm 1 và bán thành phẩm 2 được phối trộn với chất mang và các bán thành phẩm khác để tạo thành sản phẩm không tan dùng để bón gốc và sản phẩm hòa tan dùng để phun xịt.

3.6. Thử nghiệm khả năng phòng trị bệnh thán thư trên cây ớt

Thử nghiệm được tiến hành trên vườn ớt đã trồng được 1 tháng tại phường Bình Khánh, thị xã Tân Uyên, tỉnh Bình Dương. Chế phẩm được phun hoặc rải, định kì 10 ngày một lần. Giữa các nghiệm thức có sự thay đổi các chế phẩm Trichoderma.

ĐCa: không sử dụng các chế phẩm phòng trị nấm bệnh

ĐCd: sử dụng các hoạt chất phòng trị thán thư có nguồn gốc sinh học (Diatin 8SL) hoặc hóa học (Ringo L 20SC)

NT1: sử dụng chế phẩm hòa tan, phun xịt trên cây ớt và chế phẩm bón gốc

NT2: sử dụng chế phẩm không tan, rải quanh gốc cây

Hằng tháng, ghi nhận tỷ lệ cây ớt bị bệnh thán thư. Ngoài ra, chúng tôi còn ghi nhận tỷ lệ cây ớt bị héo vàng do thối gốc. Kết quả thử nghiệm được thể hiện trong bảng 3.14:

57

Bảng 3.14: Tỷ lệ cây ớt bị bệnh thán thư và héo vàng (%)

1 tháng 2 tháng 3 tháng 4 tháng Thán Héo Thán Héo Thán Héo Thán Héo thư vàng thư vàng thư vàng thư vàng ĐCa 0 0 0 0 11,4 2,3 63,0 2,3

ĐCd 0 0 0 0 12,2 12,2 82,4 13,4

NT1 0 0 0 0 3,3 0 23,7 1,6

NT2 0 0 0 0 3,3 3,2 27,5 3,2

nh thán thư (%) thư thán nh

ệ

b

ệ

l

ỷ T

Thời gian thử nghiệm

Biểu đồ 3.11: Tỷ lệ cây ớt bị thán thư sau các khoảng thời gian thử nghiệm khác nhau

Thời gian thử nghiệm chế phẩm từ ngày 25 tháng 6 đến 25 tháng 9 năm 2014. Trong tháng 6 và tháng 7, thời tiết mưa ít, độ ẩm không khí trung bình, ngày nắng nhiều, đồng ruộng khô ráo. Từ tháng 8 trở đi, trời mưa nhiều hơn làm cho độ ẩm không khí tăng cao. Đặc biệt là vào những ngày cuối tháng 8, trời mưa liên tục nhiều ngày, đồng ruộng ẩm ướt đã ảnh hưởng nhiều đến việc chăm sóc cây ớt. Nhìn chung, tỷ lệ bệnh thán thư có chiều hướng gia tăng theo thời gian, đặc biệt là vào thời điểm cây cho trái rộ kết hợp với thời tiết mưa nhiều, ngày nắng ít. Nhìn chung, các chế phẩm Trichoderma có khả năng hạn chế bệnh thán thư trên cây ớt. Sau 3 tháng sử dụng, tỷ lệ cây ớt bị bệnh thán thư ở các lô thí nghiệm có sử dụng

58

Trichoderma chiếm khoảng 3,3%, các lô đối chứng có số cây bệnh thán thư 11,4 – 12,2%. Đến cuối tháng thứ 4, điều kiện thời tiết mưa nhiều, ngày nắng ít, gió mạnh, độ ẩm cao và kỹ thuật thu hái đã làm bệnh thán thư bùng phát trên diện rộng. Ở lô đối chứng âm, số cây bị thán thư tăng lên đến 63%, nghiệm thức sử dụng các loại thuốc sinh học và hóa học khác có đến 82,4% số cây bị bệnh thán thư, nhiều cây nhiễm bệnh trên 100% số trái, năng suất thiệt hại hoàn toàn. Trong khi đó, lô thí nghiệm sử dụng chế phẩm phun xịt và chế phẩm bón gốc có tỷ lệ cây bị thán thư lần lượt là 23,7 và 27,5%. Kết quả trên đã cho thấy các chế phẩm chứa Trichoderma có khả năng hạn chế đáng kể bệnh thán thư do Colletotrichum gây ra trên cây ớt. Ngoài ra, sử dụng các chế phẩm Trichoderma cũng hạn chế đáng kể hiện tượng héo vàng do tuyến trùng và nấm Fusarium, số cây bị chết chiếm 1,6 – 3,2% so với lô sử dụng các loại thuốc khác, số cây bị héo vàng lên đến 13,4%. Phun xịt chế phẩm đều trên cây kết hợp với rải chế phẩm quanh gốc là biện pháp khả thi để hạn chế bệnh thán thư.

59

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận Trong tất cả các mẫu trái ớt bị bệnh thán thư đều có sự hiện diện của Colletrotrichum sp. Nhìn chung, các chủng Colletotrichum sp. phân lập được gồm hai loài. Colletotrichum truncatum có khuẩn lạc màu trắng đến xám, có các cấu trúc đĩa cành và tơ cứng, bào tử hình thuyền cong, không có vách ngăn. Colletotrichum acutatum có màu sắc khuẩn lạc từ hồng đến cam, không quan sát thấy cấu trúc đĩa cành, bào tử hình que, hai đầu tròn và không có vách ngăn. Các chủng Colletotrichum phân lập được có khả năng gây bệnh thán thư rất nhanh trên cả trái đã thu hoạch và trái đang phát triển. Thời gian trái biểu hiện bệnh thán thư trong khoảng 2 - 5 ngày. Kết quả này cũng cho thấy Colletotrichum truncatum và Colletotrichum acutatum là tác nhân gây bệnh thán thư phổ biến trên cây ớt tại Bình Dương. Trong số 16 chủng Trichoderma sp. phân lập được từ các khu vực trồng rau màu tại Bình Dương, chúng tôi nhận thấy chủng Trichoderma T2.2, T4 và T5.1 có khả năng đối kháng đạt hiệu quả 100% với 5 chủng Colletotrichum sp. phân lập được sau 5 ngày nuôi cấy. Phân tích trình tự rRNA 28S và tra cứu trên BLAST SEARCH 4 chủng điển hình là Trichoderma T2.2, T4, T5.1 và T6.1 đều cho kết quả thuộc loài Trichoderma koningii (Hypocera koningii). Kết quả này cũng cho thấy Trichoderma koningii hiện diện phổ biến và phù hợp với các điều kiện tự nhiên của Bình Dương. Trên quy mô pilot, các chủng Trichoderma chọn lọc cho mật độ bào tử cao nhất khi nuôi cấy trên môi trường 60% cám mì và 40% mụn xơ dừa, lượng nước bổ sung vào môi trường 60%, tỷ lệ giống bổ sung 107 bào tử/ g canh trường đối với chủng T2.2 và 106 bào tử/ g canh trường đối với chủng T4, T5.1. Sau 4 ngày nuôi cấy, mật độ canh trường đạt 4,2 x 109 bào tử/ g canh trường khô. Hiệu suất thu nhận bào tử đạt trung bình 6%. Sau 4 tháng thử nghiệm trên đồng ruộng, chế phẩm bào tử Trichoderma có khả năng hạn chế bệnh thán thư trên cây ớt lên đến 58,4% so với khi sử dụng các sản phẩm phòng trị bệnh khác.

60

Kiến nghị Tiếp tục thử nghiệm khả năng phòng trị bệnh thán thư trên cây ớt của chế phẩm ở quy mô lớn hơn và trong các thời điểm khác nhau trong năm. Nghiên cứu các điều kiện bảo quản chế phẩm. Nghiên cứu khả năng ứng dụng các chủng Trichoderma chọn lọc để phòng trị của các bệnh do nấm trên các loài cây rau màu ngắn ngày khác như dưa leo, khổ qua…

61

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Mai Thị Phương Anh, (2001), Kỹ thuật trồng một số loại rau cao cấp. NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 2. Lester W. Buger, Timothy E. Knight, Len Tesoriero, Phan Thuy Hien, (2009), Cẩm nang chuẩn đoán cây bệnh ở Việt Nam, Australian Centre for International Agricultural Research. 3. Nguyễn Thị Thiên Hằng, (2012), Nghiên cứu sự phân bố và động thái của nấm Trichoderma trong đất trồng rau màu tại thành phố Đà Nẵng. Luận văn thạc sĩ, ĐH Bách Khoa Đà Nẵng. 4. Vũ Triệu Mân, (2007), Giáo trình bệnh cây chuyên khoa, Trường Đại học Nông nghiệp 1, Hà Nội. 5. Đặng Thanh Tuấn, (2012), Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn Bacillus subtilis kiểm soát nấm bệnh trên cây ớt, Luận văn tốt nghiệp, ĐH Nông Lâm TP. HCM. 6. Trương Minh Tường, Trần Ngọc Hùng, (2011), Nghiên cứu kiểm soát nấm bệnh thối trái và thối dây thanh long tại Chợ Gạo (Tiền Giang) bằng Trichoderma, Diễn đàn Khuyến Nông @ Nông Nghiệp lần thứ 14/2011.

Tiếng nước ngoài

7. Cannon PF, Bridge PD, Monte E, (2000), Linking the Past, Present, and Future of Colletotrichum Systematics. Colletotrichum: Host specificity, Pathology, and Host- pathogen Interaction, St. Paul, Minnesota: APS Press; 2000. pp. 1–20. 8. U. Damm, P. F. Cannon, J. H. C. Woudenberg, P. W. Crous, (2012), The Colletotrichum acutatum species complex, Stud Mycol. 9. Damm, U., Woudenberg, J.H.C., Cannon, P.F. Crous, (2009), Colletotrichum species

with curved conidia from herbaceous hosts, Fungal Diversity 39, pp. 45-87. 10. Ganesan Sangeetha, (2009), Biocontrol with Trichoderma species for management of postharvest crow rot of banana, Faculty of Agriculture, Annamalai University, India.

62

11. Freeman S, Katan T, Shabi E, (1998), Characterization of Colletotrichum species responsible for anthracnose diseases of various fruits, Plant Disease, Vol. 82(6), pp. 596–605. 12. Hong JK, Hwang BK, (1998), Influence of inoculum density, wetness duration, plant age, inoculation method, and cultivar resistance on infection of pepper plants by Colletotrichum cocodes, Plant Disease, Vol. 82(10), pp. 1079–1083. 13. Hyde, K. D. Cai, (2009), Colletotrichum – names in current use. Fungal Diversity, Vol. 39, pp. 147-182. 14. Jeffries P., Dodd J. C., Jeger M. J, Plumbley R. A, (1990), The biology and control of Colletotrichum species on tropical fruit crops, Plant pathology, Vol. 39(3), pp. 343 – 366. 15. Kim, W. G., Cho, E.K. and Lee, E.J, (1986), Two strain of Colletotrichum gloeosporioides Penz. causing anthracnose on pepper fruit, Korean J. Plant Pathol, 2, pp. 107-113. 16. Kim B. S, H.K. Park and W.S. Lee, (1989), Resistance to anthracnose (Colletotrichum spp.) in pepper, In Tomato and pepper Production in the Tropics, AVRDC, Shanhua, Taiwan, China, pp. 184-188. 17. Kim K. K, Yoon JB, Park HG, Park EW, Kim YH, (2004), Structural modifications and programmed cell death of chilli pepper fruits related to resistance responses to Colletotrichum gloeosporioides infection, Genetics and Resistance, Vol. 94, pp. 1295-

1304. 18. L.R. Shovan, M. K. A. Bhuiyan, J. A. Begum and Z. Pervez, (2008), In vitro control of Colletotrichum dematium causing anthranose of soybean by fungicides, plant extracts and Trichoderma harzianum, Department of Plant Pathology, Bangabandhu Sheikh Mujibur Rahman Agricultural University, Bangladesh. 19. Park WM, Park SH, Lee YS, Ko YH, (1987), Differentiation of Colletotrichum spp. causing anthracnose on Capsicum annuum L. by electrophoretic method, Korean Journal of Plant Pathology, Vol. 3, pp. 85–92.

63

20. Pring RJ, Nash C, Zakaria M, Bailey JA, (1995), Infection process and host range of Colletotrichum capsici, Physiological and Molecular Plant Pathology, Vol. 46(2), pp. 137–152. 21. Prihastuti, H., Cai, L., Chen, H., McKenzie, E.H.C. and Hyde, K.D, (2009), Characterization of Colletotrichum species associated with coffee berries in northern Thailand, Fungal Diversity, Vol. 39, pp. 89-109. 22. P. D. Robert, K.L.Pernezny and T.A. Kucharek, (1999), Anthracnose caused by Colletotrichum sp. on pepper, Institute of Food and Agricutural Sciences, pp. 178. 23. Simmonds JH, (1965), study of the species of Colletotrichumcausing ripe fruit rots in Queensland. Queensland Journal Agriculture and Animal Science. Vol. 22, pp. 437– 459. 24. S. A. Bankole and A. Adebanjo, (1996), Biocontrol of brown blotch of cowpea caused Colletotrichum truncatum with Trichoderma viride, Department of Biological Sciences, Ogun State University, Nigeria. 25. Soytong, K., Srinon, W., Rattanacherdchai, K., Kanokmedhakul, S. and Kanokmedhakul, (2005), Application of antagonistic fungi to control anthracnose disease of grape, Journal of Agricultural Biotechnology 1, pp. 33-41. 26. Svetlana zivkovic, (2010), Screening of antagonistic activity of microorganisms against Colletotrichum acutatum and colletotrichum gloeosporioides, Institute for Plant Protection and Environment, 11000 Belgrade, Serbia. 27. Suteki Shinohara, (1989), Vegetable seed production Technology of Japan elucidated with respective variety development histories, particulars, Noshiooi, Shinagawaku, Tokyo, Japan, Vol. 2. 4-7-7., pp. 87-128.

28. P. P. Than, R. Jeewon, K . D. Hyde, S. Pongsupasamit, O. Mongkolporn and P. W. J. Taylor, (2007), Characterization and pathogenicity of Colletotrichumspecies associated with anthracnose on chilli (Capsicum spp.) in Thailand, Plant Pathology, pp. 1365 – 3059. 29. Vinod Tasiwal, (2008), Study on anthranose –a posthavest disease papaya, Derparment plant pathology, College of Agriculture, Dharwad, University of Agricultural Science. Tài liệu báo mạng 64

30. http://baoquangngai.com.vn/channel/2025/201006/binh-duong-trong-ot-cho-thu-nhap- 250-trieu-dongha-1945583/ 31. http://kinhdoanh.vnexpress.net/tin-tuc/doanh-nghiep/trong-ot-lai-hang-tram-trieu-dong- 2734024.html. 32. http://nongnghiep.vn/nongnghiepvn/72/2/2/94861/Trong-ot-chi-thien-lai-F1-Capri-45- lai-cao.aspx

65