Estructuración Genética De Poblaciones De Palmeras En El Neotrópico Derivado De Marcadores Microsatélites (Ssrs)

R. Montúfar-GalárragaEcología en Bolivia & J. M. 45(3): Barreiro 30-43, Diciembre 2010. ISSN 1605-2528.

Estructuración genética de poblaciones de palmeras en el neotrópico derivado de marcadores microsatélites (SSRs)

Genetic structure of Neotropical palms derived from microsatellite markers (SSRs)

Rommel Montúfar-Galárraga & José Manuel Barreiro

Lab. Genética Molecular (113), Pontificia Universidad Católica del Ecuador (PUCE), Av. 12 de Octubre y Av. Patria, Quito, Ecuador, Email: [email protected] Autor de correspondencia, [email protected]

Resumen

El interés por estudios de estructuración genética de poblaciones de palmeras y su implicación en la conservación de la biodiversidad se ha incrementado en los últimos años. El presente documento describe la metodología a ser utilizada por el proyecto PALMS para estudios de estructuración genética de poblaciones silvestres de las palmeras: Oenocarpus bataua, Euterpe precatoria, Ceroxylon echinulatum, Prestoea acuminata y Phytelephas aequatorialis. El estudio se llevará a cabo en las regiones tropicales, subtropicales y montanas de los países integrantes del proyecto PALMS (Colombia, Ecuador, Perú y Bolivia). Se utilizará marcadores microsatélites (SSRs), obtenidos por aislamiento directo de las especies estudiadas o vía transferencia de marcadores disponibles en la literatura, para obtener una aproximación de la dinámica genética de las poblaciones de palmeras en la región. Palabras clave: Arecaceae, Diversidad genética, Estructuración genética, Microsatélites, SSRs.

Abstract

The interest for studies of genetic diversity of palm populations and their use in biodiversity conservation have increased in recent years. This paper describes a methodology to be used by the PALMS project for studies of genetic structure of palm populations. The palm species included in this study are: Oenocarpus bataua, Euterpe precatoria, Ceroxylon echinulatum, Prestoea acuminate, and Phytelephas aequatorialis. This project will be carried out on tropical, subtropical and montane areas of Colombia, Ecuador, Peru, and Bolivia. Genetic studies will apply informative molecular markers as microsatellites (SSRs) described in the literature, and those obtained by SSR marker transfers between closer species. Keywords: Arecaceae, Genetic diversity, Genetic structure, Microsatellites, SSRs.

Introducción Las actividades antropogénicas, como la deforestación, tala selectiva, degradación de hábitat y extractivismo destructivo, amenazan la sobrevivencia de las especies forestales. Estas actividades generan impactos negativos sobre la estructura y diversidad genética de las poblaciones, a través de la alteración de los mecanismos de flujo génico y selección natural en los ecosistemas forestales (Hamilton 1999). Si, la diversidad genética de un especie es erosionada, la resiliencia de la especie y de los ecosistemas será seriamente amenazada frente a cambios climáticos, polución, invasiones, y enfermedades (Schaberg et al. 2008). Por este motivo, el conocimiento

30 Estructuración genética de poblaciones de palmeras en el neotrópico derivado de marcadores microsatélites (SSRs) de la estructura genética de las poblaciones, y 1). A partir del final de la década de los 90, se sus mecanismos involucrados, constituye una publican en revistas internacionales los primeros herramienta para medir la salud ecológica y su artículos explorando la estructura genética de capacidad de resiliencia frente a perturbaciones palmeras en las Américas. La estructuración antropogénicas y naturales. genética de poblaciones, biogeografía, análisis Los estudios de estructuración genética de paternalidad y flujo génico son las principales en poblaciones naturales de palmeras en el temáticas estudiadas. Estos estudios fueron Neotrópico son relativamente escasos (Tabla realizados con un reducido número de Tabla 1. Estudios de estructuración genética aplicados a especies de palmeras en el Neotrópico. Leyenda de siglas en inglés: AFLP = Amplified Fragment Length Polymorphism,ISSR = Inter-Simple Sequence Repeats, SSR = Simple Sequence Repeats (microsatélites).

Marcador Especie Tema Autor molecular Astrocaryum mexicanum Estructuración genética Alozimas Eguiarte et al. 1992 Bactris gasipaes Estructuración genética AFLP Adin et al. 2004 Bactris gasipaes Estructuración genética SSR Cole et al. 2006 Bactris gasipaes Estructuración genética SSR Couvreur et al. 2006 Bactris gasipaes Estructuración genética SSR Hernández et al. 2008 Ceroxylon echinulatum Genética del paisaje SSR Trénel et al. 2008 Ceroxylon echinulatum Estructuración genética SSR Montúfar (no publicado) Ceroxylon sasaimae Estructuración genética SSR Gaitan 2003 Ceroxylon. alpinum Estructuración genética SSR Gaitan 2003 Chamaedorea alternans Taxonomía AFLP Bacon & Bailey 2006 Chamaedorea elatior Estructuración genética Alozimas Luna et al. 2005 Chamaedorea elatior Variabilidad genética Alozimas Luna et al. 2007 Chamaedorea ernesti-augusti Estructuración genética SSR Cibrián-Jaramillo et al. 2009 Chamaedorea tepejilote Estructuración genética Alozimas Luna et al. 2005 Chamaedorea tepejilote Variabilidad genética Alozimas Luna et al. 2007 Chamaedorea tepejilote Taxonomía AFLP Bacon & Bailey 2006 Elaeis oleifera Estructuración genética RAPD Moretzsohn et al. 2002 Euterpe edulis Estructuración genética SSR Gaiottoet al. 2003 Euterpe edulis Estructuración genética AFLP Cardoso et al. 2000 Euterpe edulis Estructuración genética Alozimas Conte et al. 2003 Euterpe edulis Estructuración genética SSR/Alozimas Conte et al. 2008 Geonoma macrostachys Taxonomía ISSR Roncal et al. 2007 Iriartea deltoidea Estructuración genética AFLP Sezen et al. 2007 Oenocarpus bataua Variabilidad genética SSR Montúfar 2007 Oenocarpus bataua Estructuración genética SSR Karubian et al. 2010 Varias especies Variabilidad genética Isozimas/ RAPD Sawazaki et al. 1998

31 R. Montúfar-Galárraga & J. M. Barreiro especies (< 15 especies), de diferentes sistemas Protocolo reproductivos, hábitats y aplicando diferentes Selección de especies a estudiar tipos de marcadores moleculares (isozimas, alozimas, RAPD, AFLP, ISSR, SSR). La selección de especies a estudiar se basó en La falta de marcadores moleculares los siguientes criterios: 1) Amplia distribución informativos es un limitante en el estudio geográfica en los países integrantes del Proyecto de la estructura genética en poblaciones PALMS FP-7 (Colombia, Ecuador, Perú y vegetales del Neotrópico. Durante la última Bolivia), 2) importancia económica actual o década, el desarrollo de nuevas técnicas potencial en la región, 3) disponibilidad de moleculares de secuenciación facilita un marcadores SSRs para la especie. Las especies arsenal de nuevos instrumentos para explorar seleccionadas fueron son las siguientes: de diversidad genética de las especies. En particular, los marcadores microsatélites o • Oenocarpus batua: Es una palmera de dosel SSRs (Simple Sequence Repeats) constituyen ampliamente distribuida en las regiones una poderosa herramienta para estudios tropicales y subtropicales de América genéticos. Lamentablemente, la disponibilidad del Sur, incluyendo poblaciones andinas de información molecular en palmeras, y en alrededor de los 1.200 m. Existen referencias particular de las especies neotropicales, es un que reportan la importancia económica de limitante para el aislamiento y construcción esta especie como una nueva fuente de de marcadores co-dominantes, polimórficos y aceites comestibles proveniente de sus multi-alélicos como los SSRs. frutos (Balick & Gershoff 1981, Montúfar Dentro de las actividades del work package et al. 2010). Adicionalmente, industrias 2 –Resiliencia de ecosistemas y límites de locales en las capitales amazónicas generan funcionamiento- del proyecto PALM FP- un movimiento significativo de este recurso 7, se realizará estudios de estructuración natural con proyecciones económicas a genética para las especies Oenocarpus bataua, mayor escala. Para O. bataua se dispone de Euterpe precatoria y Ceroxylon echinulatum. un juego de 23 marcadores SSRs aislados Estos estudios serán planificados a nivel para la especie (Montúfar et al. 2007) y de regional incluyendo poblaciones de los países ocho marcadores SSRs aislados para la participantes. Para cada especie se planteará un especie hermana O. bacaba (Lepsch-Cunha tema específico de investigación (genética del et al. 2003). paisaje, estructuración genética, biogeografía). • Euterpe precatoria: Es una palmera de La base metodológica de los estudios a realizar dosel con amplia distribución geográfica dentro del programa PALMS sigue lineamientos en regiones tropicales y subtropicales de generales para las especies a ser estudiadas. América del Sur. Esta especie es altamente valorada por su palmito, el cual es Objetivos intensamente comercializado en varias regiones de la Amazonía y en la región El presente documento propone lineamientos del Chocó. Marcadores para especies del generales para una metodología de estudios género Euterpe han sido descritos por en estructuración genética de poblaciones Gaiotto et al. (2001). de palmeras neotropicales con la aplicación • Ceroxylon echinulatum: Palmera de dosel de marcadores microsatélites (SSRs). Se distribuida en las regiones andinas de establece un procedimiento y sugerencias a Ecuador y norte de Perú entre los 1.600 a ser tomados en cuenta para estudios similares 2.200 m. Las hojas jóvenes son intensamente en el Neotrópico. cosechadas durante las festividades

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religiosas de Semana Santa para la basada en tejidos foliares jóvenes. Sin embargo, elaboración de artesanías. Gaitan (2003) la altura de la palmera es un limitante para reporta un amplio juego de marcadores la obtención de este material foliar. Cuando SSRs para C. alpinum y C. sasaimae. la obtención de hojas es inaccesible, una • Adicionalmente, se incluyeron dos opción constituye el aislamiento de ADN modelos locales para estudios de genética proveniente de los tejidos del meristemo apical de poblaciones restringidos a Ecuador. en las raíces adventicias. Estudios y ensayos Prestoea acuminata, que es una palmera realizados actualmente con tejidos radicales cespitosa de sotobosque, ampliamente han proporcionado resultados positivos en el distribuida en las regiones andinas entre los aislamiento de ADN en los géneros Ceroxylon, 1.000 a 2.000 m y Phytelephas aequatorialis: Oenocarpus, Prestoea y Euterpe. Trenel et al. (2008) endémica de los bosques tropicales y secos reportaron el uso del tejido radical en el género del litoral ecuatoriano. Ceroxylon para aislamiento de ADN. Para la obtención de los tejidos radicales adecuados, Área de estudio se obtienen las raíces adventicias jóvenes que generalmente son de color amarillo o rojo. Se El área de estudio del proyecto PALMS corta el meristemo apical, c.a. 5 cm de la raíz, se circunscribe a las regiones tropicales, y posteriormente se guarda este material de subtropicales y andinas de Colombia, Ecuador, raíz en bolsas plásticas con abundante silica Perú y Bolivia. En particular, las actividades gel. Otra opción es la conservación del tejido del WP 2 se limitan a las regiones geográficas de raíz en alcohol al 95%. Para palmeras de de distribución de los modelos biológicos a tamaño mediano, como Prestoea o Phytelephas se estudiar. Estudios de estructuración genética colectaron directamente tejidos foliares jóvenes de Euterpe precatoria serán desarrollados provenientes de la estípula y posteriormente con poblaciones silvestres provenientes de deshidratados con silica gel. las regiones biogeográficas del Chocó, la Amazonía y los Andes, en un rango altitudinal Selección de los marcadores entre 100-1.200 m. Para la palmera Oenocarpus microsatélites (SSRs) bataua se incluirán poblaciones del Chocó, Amazonía y poblaciones andinas hasta los 1.250 Los microsatélites o SSRs (siglas en inglés- m de altitud provenientes de Perú y Ecuador. Simple Sequence repeats) son marcadores Los estudios con Ceroxylon son restringidos a moleculares de segunda generación basados los bosques montanos entre los 1.600 a 2.200 en la técnica de PCR (siglas en inglés: m de altitud de los Andes ecuatorianos. Para Polymerase Reaction Chain) y descritos por la palmera de tagua (Phytelephas aequatorialis) primera vez por Akkaya et al. (1992). Estos se analizarán poblaciones provenientes de marcadores están constituidos de cortos los bosques tropicales y secos del litoral de motivos nucleotídicos (di, tri, tetra o penta) Ecuador y para Prestoea acuminata se planificará que se repiten una tras el otro (en tandem). Un un estudio local de poblaciones en los bosques ejemplo de microsatélites es el di-nucleótido andinos a 1.200-2.500 m de altitud en los Andes 5’…AC…3’, el cual ha sido reportado 80.330 septentrionales de Ecuador. veces en diferentes lugares del genoma humano. Los cebadores (primers) para estos Colección de tejidos vegetales marcadores se construyen sobre las regiones adyacentes de las secuencias repetitivas (en La colección de material vegetal para inglés: flanking regions). Las propiedades que aislamiento de ADN ha sido tradicionalmente han hecho de los microsatélites los marcadores

33 R. Montúfar-Galárraga & J. M. Barreiro más utilizados en estudios de mapeo genético Transferencia de marcadores moleculares y análisis de variabilidad genética son: 1) Los SSRs son abundantes en el genoma La disponibilidad de marcadores SSRs es eucarionte. Por ejemplo, el genoma humano significativamente mayor para especies tiene un microsatélite por cada 2 kb de ADN provenientes de climas templados, subtropicales humano (Hartl & Jones 2009). 2) Los SSRs son y especies de importancia económica. Este altamente polimórficos. El polimorfismo en patrón refleja las limitaciones técnicas de los SSRs radica en el número de repeticiones del países en vías de desarrollo para el aislamiento motivo, generando tantos alelos como tantas de marcadores para especies tropicales y variaciones en el número de motivos. 3) Los endémicas. Ante esta ausencia de marcadores, SSRs son marcadores co-dominantes. Esto se la transferencia de SSRs es un procedimiento refiere a que permiten detectar la presencia de que favorece la optimización de herramientas los dos alelos y consecuentemente determinar genéticas para especies de las cuales no la naturaleza homocigótica o heterocigótica disponemos de información molecular. En base de un individuo para un marcador dado. 4) a una recopilación de estudios de transferencia La amplificación vía técnica PCR de SSRs de SSRs entre los años 1997 y 2006 (Barbara et requiere mínima cantidad de ADN (5-100 ng al. 2007) se detectaron las siguientes tendencias: por reacción) e inclusive marcadores SSRs dan resultados positivos en ADN degradados. 5) 1. El grupo taxonómico influye en el Los SSRs son altamente reproducibles, lo que éxito de transferencia. Mayor éxito de permite la comparación de patrones genéticos transferencia fue reportado entre especies entre laboratorios (Jones et al. 1997). dentro de géneros de reptiles, aves y Una limitante para el uso de marcadores mamíferos. Un importante resultado SSRs en estudios genéticos es la complejidad mencionado por Barbara et al (2007) es la técnica que involucra el aislamiento de estos baja tasa de transferencia en el grupo de marcadores para una especie en particular las monocotiledóneas, tanto entre especies (Squirrell et al. 2003). Este procedimiento dentro de un género, como entre géneros. requiere la construcción de librerías genéticas, Ensayos realizados en la transferencia el aislamiento de secuencias microsatélites de SSRs del género de palmeras Euterpe y la secuenciación de estas regiones para la (Gaiotto et al. 2001) hacia el género Prestoea, construcción de los cebadores en las zonas reportaron una baja tasa de éxito; de 14 adyacentes de las repeticiones del motivo. Las SSRs de Euterpe apenas dos marcadores limitaciones técnicas en la implementación de dieron resultados positivos para Prestoea estos métodos han constituido un impedimento (R. Montúfar, datos no publicados). Sin para el aislamiento de nuevas baterías embargo, se ha reportado resultados microsatélites para especies vegetales y positivos en la transferencia de SSRs del animales. Una opción ante la ausencia de género de palmeras Oenocarpus (Montúfar et marcadores constituye la transferencia de SSRs al. 2007) hacia el género Prestoea (de 25 SSRs, entre especies filogenéticamente relacionados. 13 dieron señal positiva). La evidencia de Si bien, el aislamiento de SSRs es un proceso una baja tasa de transferencia de marcadores técnicamente complejo y costoso, una vez en palmeras no ha sido sistemáticamente seleccionado los marcadores (vía aislamiento estudiada; sin embargo, evidencias aisladas o por transferencia), la aplicación de estos sugieren que es variable y que otros factores marcadores requiere de mínimas demandas como la calidad en el diseño de cebadores técnicas y un bajo costo operacional. podrían determinar el éxito o fracaso de un proceso de transferencia.

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2. La transferencia es más efectiva entre al. 1999, Rivera et al. 1999). Durante la presente especies dentro de un género, seguido de década un número mayor de baterías de SSRs la transferencia entre géneros dentro de son reportados en la literatura. En particular, la una familia. Ensayos de transferencia entre tribu Cocoseae y Euterpeae están relativamente géneros de palmeras ha generado diferentes bien representadas por marcadores, lo contrario resultados dependiendo de las relaciones puede observarse para el resto de subfamilias y filogenéticas entre taxa. Gaitán (2003) otras tribus dentro de Arecoideae. Las especies transfirió diez SSRs de Ceroxylon alpinum de las cuales se dispone marcadores SSRs son a C. sasaimae de un total de 18 marcadores descritas en la tabla 2. A pesar de la importancia disponibles; y 5 SSRs de C. sasaimae a C. de la disponibilidad de marcadores, reportes alpinum de una base de 11 marcadores sobre las tasas de transferencia y polimorfismo disponibles. La transferencia de SSRs entre en Arecaceae son escasamente reportados en géneros de la tribu Euterpeae presentó tasas la literatura. De veinte y tres marcadores SSRs de éxito significativas (Montúfar et al. 2007). aislados de Oenocarpus bataua (Euterpeae), 18 Sin embargo, la transferencia de SSRs del amplificaron en cinco especies hermanas dentro género Bactris (Tribu Cocoseae) al género del género (O. bacaba, O. balicki, O. mapora, O. Prestoea (Tribu Euterpeae) no produjo ningún minor, O. distichus) y 11 de estos mismos loci marcador con señal positiva (R. Montúfar, amplificaron en géneros de la tribu Euterpeae datos no publicados). (Euterpe, Hyospathe, Prestoea, Neonicholsonia; 3. El sistema de reproductivo y tasa Montúfar et al. 2007), reportando una alta generacional de la especie influyen en tasa de transferencia a nivel de tribu. De igual éxito de transferencia. Estos factores no manera, Billote et al. (2004a) describieron la han sido analizados en palmeras. transferencia de 16 marcadores SSRs aislados de Los primeros juegos de SSRs para palmeras Bactris gasipaes a seis especies dentro del mismo fueron asilados de especies de importancia género y para otros géneros (Astrocaryum, económica como Elaeis guineensis (palma Elaeis) dentro de la misma tribu Cocoseae. africana) y Cocos nucifera (cocotero; Perera et Estudios que reportan tasas de transferencia

Tabla 2. Marcadores microsatélites (SSRs) aislados para palmeras neotropicales. Sistema taxonómico según Dransfieldet al. 2008.

No. de Librería Subfamilia Tribu Especie Literatura SSRs genómica Chamaedoreeae Chamaedorea elegans 9 varios Cibrián et al. 2008 Bactris gasipaes 18 GA Billote et al. 2004 Acrocomia aculeata 8 varios Nucci et al. 2008 Cocoseae Elaeis guineensis 21 GA, GT, CCG Billote et al. 2001 Arecoideae Attalea phalerata 14 varios Choo et al. 2010 Attalea amygdalina 23 GA, CA, AT Gaitán 2003 Oenocarpus bataua 23 GA Montúfar et al. 2007 Euterpeae Oenocarpus bacaba 8 varios Lepsch-Cunha et al. 2003 Euterpe edulis 18 AG Gaiottoet al. 2001 Ceroxylon sasaimae 10 Múltiples Gaitán 2003 Ceroxyloideae Ceroxyleae Ceroxylon alpinum 18 GA, CT Gaitán 2003

35 R. Montúfar-Galárraga & J. M. Barreiro de SSRs entre tribus o subfamilias de palmeras grande se colectará el material vegetal revelan tasas variables de éxito. Billote et al. proveniente de individuos que estén separados (2001) reportaron la transferencia de 21 SSRs físicamente, al menos a 10 metros de distancia loci aislados en Elaeis guineensis a E. oleifera y para evitar autocorrelación genética entre Barcella odora (subtribu Elaeidinae) y una baja las muestras obtenidas. Individuos aislados tasa de transferencia en especies de las subtribus serán colectados entre las poblaciones grandes Bactridinae / Attaleinae (Tribu Cocoseae), en la con el objetivo de cubrir áreas desprovistas tribu Euterpeae y en la subtribu Mauritiinae. de información entre las poblaciones y De 16 SSRs descritos para Phoenix dactilifera generar un gradiente continuo en el área (subfamilia Coryphoideae), 12 dieron resultados muestreada. Adicionalmente, se incluirán positivos para seis especies dentro del género algunos individuos de especies próximas a Astrocaryum (subfamilia Arecoideae), y seis para las especies estudiadas como referencias para Elaeis guineensis (subfamilia Arecoideae; Billote et los análisis de divergencia molecular. Los al. 2004b). Transferencias de SSRs positivas son estudios moleculares del proyecto PALMS, se reportadas entre especies dentro de los géneros implementarán en base a una colección de 300 Ceroxylon (Gaitán 2003), Euterpe (Gaiotto et al. muestras para cada especie estudiada. 2001), Chamaedorea (Cibrián-Jaramillo et al. Con la finalidad de asociar los patrones 2008), Bactris (Billote et al. 2004) y Elaeis (Billote genéticos con variables ambientales a macro- et al. 2001). escala se medirá la longitud, latitud y altitud de cada población e individuo. Posteriormente, Selección de marcadores polimórficos se obtendrá información de variables climáticas de las localidades muestreadas proveniente de Los marcadores SSRs que dieron señal positiva bases de datos. durante los análisis de transferencia serán amplificados en un población de referencia Número de muestras y de marcadores de 5-10 individuos de la especies a estudiar, SSRs a implementar en los estudios cada individuo representando diferentes localidades. Estos análisis permiten obtener una aproximación de la variación en el número El número de individuos a ser estudiado de alelos de los marcadores seleccionados. Los dependen de: 1) Las preguntas/hipótesis a ser marcadores que resulten polimórficos serán evaluadas, 2) de la disponibilidad del material utilizados en los análisis. Los marcadores vegetal durante las colectas y 3) de la escala SSRs aislados de O. bataua, y los loci SSRs espacial de estudio. Pruett & Winker (2008) transferidos a E. precatoria, P. acuminata y C. recomendaron realizar estudios con 20 y 30 echinulatum son descritos en el anexo 1. Pruebas muestras para obtener valores confiables de de transferencia de marcadores SSRs para diversidad genética con marcadores SSRs. Sin Phytelephas aequatorialis están en curso. embargo, estos valores son difíciles de obtener para poblaciones silvestres de palmeras con bajas densidades o físicamente inaccesibles. La Diseño experimental mayoría de estudios realizados en palmas (Tabla 1) aplica una amplia variación en el número de El diseño a ser aplicado para los estudios de individuos que caracterizan las poblaciones estructuración genética a nivel regional será estudiadas. La variabilidad en el número de ejecutado, en un promedio, con 10 poblaciones muestras (N) producen sesgos en el cálculo de grandes de 30 individuos distribuidas la diversidad genética, diversidad alélica (A) homogéneamente a lo largo de Colombia, o en la heterocigocidad (He, Ho; Leberg 2002, Ecuador, Perú y Bolivia. De una población Nybom 2004). Con el objetivo de evitar sesgos

36 Estructuración genética de poblaciones de palmeras en el neotrópico derivado de marcadores microsatélites (SSRs) en los estadísticos, se utilizará un número de restante será macerado manualmente. La muestras (N) de 30 individuos para caracterizar Polymerase Chain Reaction (PCR) será llevada a las poblaciones en estudio. a cabo bajo protocolos estándares y con las El número de marcadores SSR utilizados es especificaciones de amplificación detallada variables entre estudios de palmeras. El número para cada microsatélite. Si los marcadores de marcadores analizados varía de tres (Cole microsatélites presentan patrones de múltiples et al. 2006) a 18 SSRs (Gaiotto et al. 2003). Para bandas (en inglés: slippage) ó baja definición en nuestros estudios se realizará el genotipaje con la lectura de geles de acrilamida se procederá un juego de doce marcadores polimórficos. a ajustar los protocolos de cada marcador Un aspecto importante durante el muestreo variando la temperatura de hibridación (PCR) de individuos es la influencia del estadio y la concentración de magnesio. regenerativo en la estructura genética de las De acuerdo a las disponibilidades técnicas de poblaciones. Estudios realizados en los géneros los laboratorios, el genotipage de microsatélites Ceroxylon (Gaitan 2003) y Euterpe (Gaiotto et en las poblaciones colectadas será realizado al. 2003) muestran diferencias en la estructura con (i) la técnica de electroforesis vertical genética entre plántulas versus adultos dentro de en acrilamida (Laboratorio PUCE, Quito) o una misma población. En particular, poblaciones (ii) con el uso de secuenciadores a capilares de plántulas de palmeras presentan mayores ABI PRISM-Genetic Analyser (Laboratorio

índices de endogamia (valores FIS) que en IRD, Montpelier). Para el primer caso, se poblaciones de individuos adultos. Este patrón ha ensamblan geles de acrilamida manualmente sido explicado en función de una selección contra en los cuales los productos PCR migran a individuos homocigotos durante el desarrollo través de la matriz gracias a una electroforesis de las poblaciones de palmeras (Gaiotto et al. vertical, para posteriormente ser revelados 2003). Con el objetivo de evitar sesgos vinculados con la técnica de tinción en nitrato de plata. Si al estadio de los individuos, nuestros estudios bien, este procedimiento involucra un trabajo incluirán solamente individuos juveniles > 2 m manual considerable, constituye una técnica de y adultos para las especies Oenocarpus bataua, fácil implementación en los laboratorios. Las Euterpe precatoria y Ceroxylon echinulatum; y especificaciones técnicas para cada uno de los solamente adultos para Phytelephas aequatorialis pasos son estándares. En el caso de disponer y Prestoea acuminata. de equipos tecnológicos, como secuenciadores (a láser o con capilares), el tiempo de trabajo Técnicas de laboratorio de laboratorio se reduce considerablemente.

Aislamiento de ADN y técnica PCR: Los tejidos Análisis de datos vegetales de origen foliar serán triturados mecánicamente o macerados manualmente Una vez obtenidos los patrones alélicos de hasta obtener un polvo fino de la muestra que los microsatélites estos serán registrados en facilite su extracción. El ADN de las palmeras matrices que serán estudiadas mediante tres será aislado con kits de extracción de ADN tipos de análisis estadísticos: de las casas comerciales Invitrogen (PureLink PLant-Total DNA Purification Kit), Quiagen • Diversidad genética: Para evaluar la (DNeasy Plant Mini Kit) y con protocolos diversidad genética de las especies tradicionales (CTAB; Doyle & Doyle 1987). Las estudiadas se aplican varias pruebas, muestras de raíces serán procesadas eliminando análisis e índices estadísticos de diversa previamente el tejido externo y la región interna naturaleza. Entre éstos están el porcentaje de la raíz rica en fibras vasculares. El producto de loci polimórfico, el número promedio

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de alelos por locus, índices de distancia y libre R y con el programa STRUCTURE similitud genética (índice de Nei), medida (Pritchard et al. 2000). Los estudios en

de diversidad Dest, análisis multivariados de genética del paisaje incluirán a todos los clasificación (UPGMA, Neiborgh Joining), individuos colectados de cada especie análisis molecular de variancia (AMOVA) estudiada. Adicionalmente se aplicaran y análisis de componentes principales pruebas estadísticas paramétricas y (PCA). Los programas estadísticos que se no-paramétricas para la exploración de utilizarán para esta parte del estudio son asociación entre patrones moleculares y ARLEQUIN (Shneider et al. 2005), SMOGD variables ambientales. (Crawford 2010), GENETIX (Belkhir et al. 2000) y GENALEX (Pekall & Smouse 2005). Referencias • Genética de poblaciones clásica: Estas pruebas estadísticas se basan en modelos Adin, A., J.C. Weber, C. Sotelo Montes, H. de equilibrio bajo los supuestos de Hardy- Vidaurre, B. Vosman & M. J. M. Smulders. Weinberg en poblaciones naturales para 2004. Genetic differentiation and trade obtener información de la estructura y among populations of peach palm dinámica de la diversidad genética de (Bactris gasipaes Kunth) in the Peruvian las especies estudiadas. Los análisis de Amazon—implications for genetic genética de poblaciones clásica se aplicarán resource management. Theoretical and a las 10 poblaciones grandes contempladas Applied Genetics 108: 1564-1573. dentro del diseño experimental. Se Akkaya, M. S., A. A. Bhagwat & P. B. Cregan. calcularán el índice de estructuración 1992. Length polymorphisms of simple sequence repeat DNA in soybean. poblacional (Fst), tamaño efectivo de población (N ), heterocigocidad observada Genetics 132: 1131-1139. e Bacon, C. D. & C. D. Bailey. 2006. Taxonomy y esperada (H , H ), índice de endogamia o e and conservation: a case study from (Fis) y número de migrantes por generación Chamaedorea alternans. Annals of Botany (M). Los programas estadísticos que se 98: 755-763. utilizarán son ARLEQUIN, GENEPOP Balick, M. & S.N. Gershoff. 1981. Nutritional (Raymond & Rousset 1995) y GENETIX. evaluation of the Jessenia bataua palm: • Genética del paisaje: Esta nueva aplicación Source of high quality protein and oil de la ecología molecular combina la from Tropical America. Economic Botany información genética de las especies 35: 261-271. estudiadas con variables geográficas como Barbará, T., C. Palma-Silva, G. Paggi, F. Bered, latitud, longitud, altitud y ambientales. M. F. Fay & C. Lexer. 2007. Cross- Los modelos generados asignan a los species transfer of nuclear microsatellite individuos analizados probabilidades de markers: potential and limitations. pertenencia a poblaciones genéticamente Molecular Ecology 16: 3759-3767. homogéneas estructuradas por algoritmos Belkhir, K., P. Borsa, L. Chikhi, N. Raufaste basados en métodos bayesianos. Con & F. Bonhomme. 2000. Genetix v. 4.02, estos análisis se obtiene resultados de la logiciel sous Windows pour la génétique estructura y composición de poblaciones, des populations. Laboratoire Génome, barreras para el flujo génico y áreas con Populations, Interactions, CNRS UMR alta diversidad genética. Los análisis de 5000, Université de Montpellier II, genética del paisaje se realizarán en el Montpellier. programa GENELAND (Guillot et al. 2005) Billote, N., A. M. Risterucci, E. Barcelos, J. L. para el paquete estadístico de software Noyer, P. Amblard & F. C. Baurens.

38 Estructuración genética de poblaciones de palmeras en el neotrópico derivado de marcadores microsatélites (SSRs)

2001. Development, characterization, S. Russell, C. D. Bailey, W. J. Hahn, and across-taxa utility of oil palm (Elaeis S.G. Bridgewater & R. DeSalle. 2009. guineensis Jacq.) microsatellite markers. Population genetics of the understory Genome 44: 413-425. fishtail palm Chamaedorea ernesti-augusti Billotte, N., T. Couvreur, N. Marseillac, P. Brottier, in Belize: high genetic connectivity with B. Perthuis, M. Vallejo, J.L. Noyer, J.P. local differentiation. BMC Genetics 10: 65. Jacquemoud-Collet, A. M. Risterucci Cole, D. M., T. L. White & P. K. R. Nair. 2007. & J.C. Pintaud. 2004a. A new set of Maintaining genetic resources of peach microsatellite markers for the peach palm palm (Bactris gasipaes Kunth): The role (Bactris gasipaes Kunth); characterization and across-taxa utility within the tribe of seed migration and swidden-fallow Cocoeae. Molecular Ecology Notes 4: management in northeastern Peru. 580-582. Genetic Resources and Crop Evolution Billotte, N., N. Marseillac, P. Brottier, J.-L. Noyer, 54:189-204. J.-P. Jacquemoud-Collet, C. Moreau, T. Conte, R., M. Sedrez dos Reis, A. Mantovani Couvreur, M.H. Chevallier, J.C. Pintaud & R. Vencovsky. 2008. Genetic structure & A. M. Risterucci. 2004b. Nuclear and mating system of Euterpe edulis Mart. microsatellite markers for the date palm Populations: A comparative analysis (Phoenix dactylifera L.): characterization using microsatellite and allozyme and utility across the genus Phoenix and markers. Journal of Heredity 99: 476-482. in other palm genera. Molecular Ecology Conte, R., R.O. Nodari, R. Vencovsky & M. Sedrez Notes 4: 256-258. dos Reis. 2003. Genetic diversity and Busby, J. R. 1991. BIOCLIM – a bioclimate recruitment of the tropical palm, Euterpe analysis and prediction system. pp. 64- edulis Mart. in a natural population from 68. En: Margules, C. R. & M. P. Austin the Brazilian Atlantic Forest. Heredity (eds.) Nature Conservation: Cost Effective 91: 401-406. Biological Surveys and Data Analysis. Couvreur T.L.P., N. Billotte, A.-M. Risterucci, CSIRO, Melbourne. C. Lara, Y. Vigouroux, B. Ludeña, J.- Cardoso, S.R.S., N.B. Eloy, J. Provan, M.A. L. Pham & J.-C. Pintaud. 2006. Close Cardoso & C.G. Ferreira. 2000. Genetic genetic proximity between cultivated differentiation of Euterpe edulis Mart. and wild Bactris gasipaes Kunth revealed Populations estimated by AFLP analysis. by microsatellite markers in Western Molecular Ecology 9: 1753-1760. Ecuador. Genetic Resources and Crop Choo, J., H. Isaac, B. Simpson, U. Mueller & Evolution 53: 1361-1373. T. Juenger. 2010. Characterization of 14 Crawford, N. G. 2010. SMOGD: software for microsatellite loci in a tropical palm, the measurement of genetic diversity. Attalea phalerata (Arecaceae). American Molecular Ecology Resources 10: 556-557. Journal of Botany 97:105-106. Doyle, J.J. & J.L. Doyle. 1987. A rapid DNA Cibrián-Jaramillo A., W.J. Hahn & R. Desalle. isolation procedure for small quantities of 2008. Development of microsatellite fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin markers of the Mexican understorey 19: 11-15. palm Chamaedorea elegans, cross-species Dransfield, J., N.W. Uhl, C.B. Asmussen, W.J. genotyping, and amplification in Baker, M.M. Harley & C.E. Lewis. 2008. congeners. Molecular Ecology Resources: Genera palmarum: The evolution and 8: 322-324. classification of palms. 2da. Edic., Kew Cibrián-Jaramillo, A., C. D. Bacon, N. C. Publishing, Royal Botanical Gardens, Garwood, R. M. Bateman, M. M. Thomas, Kew. 732 p.

39 R. Montúfar-Galárraga & J. M. Barreiro

Eguiarte, L. E., N. Perez-Nasser & D. Piñero. and SSR markers in plants by a network 1992. Genetic structure, outcrossing rate of European laboratories. Molecular and heterosis in Astrocaryum mexicanum Breeding 3: 381-390. (tropical palm): implications for evolution Karubian J., V. Sork, V. L. Sork, R. Duares & T. and conservation. Heredity 69: 217-228. B. Smith. 2010. Destination-based seed Gaiotto, F. A., D. Grattapaglia & R. Vencovsky. dispersal homogenizes genetic structure 2003. Genetic structure, mating system, of a tropical palm. Molecular Ecology 19: and long-distance gene flow in heart of 1745-1753. palm (Euterpe edulis Mart.). Journal of Leberg, P. L. 2002. Estimating allelic richness: Heredity 94: 399-406. Effects of sample size and bottlenecks. Gaiotto, F. A., R. P. V. Brondani & D. Grattapaglia. Molecular Ecology 11: 2445-2449. 2001. Microsatellite markers for heart of Lepsch-Cunha N., C.A. Lund & M.B. Hamilton. palm – Euterpe edulis and E. oleracea Mart. 2003. Isolation and characterization (Arecaceae). Molecular Ecology Notes of nuclear microsatellite loci in the 1: 86-88. tropical arboreal palm Oenocarpus bacaba Gaitan, E. 2003. Obtención y uso de secuencias (Arecaceae). Molecular Ecology Notes 3: microsatélites GA/CA en estudios de 435-437. diversidad genética en las especies de Luna, R., B. K. Epperson & K. Oyama. 2005. palmas colombianas Ceroxylon sasaimae, Spatial genetic structure of two sympatric Ceroxylon alpinum y Attalea amygdalina. Neotropical palms with contrasting life Tesis doctoral en Ciencias Agropecuarias, histories. Heredity 95: 298-305. Universidad Nacional de Colombia, Luna, R., B. K. Epperson & K. Oyama. 2007. High Bogotá. 157 p. levels of genetic variability and inbreeding Guillot, G., F. Mortier & A. Estoup. 2005. in two Neotropical dioecious palms with Geneland: aprogram for landscape contrasting life histories. Heredity 99: genetics. Molecular Ecology Notes 5:712- 466-476. 715. Montúfar, R. 2007. Structure génétique, Hamilton, M. B. 1999. Tropical tree gene flow biochimique, morphologique et and seed dispersal. Nature 401: 129-130. écologique de Oenocarpus bataua Mart. Hartl, D. L. & E. W. Jones. 2009. Genetics. Analysis (Arecaceae): perspectives pour la of genes and genomes. 7ma. Edic., Jones valorisation durable d’une ressource & Bartlett Publishers, Sudbury. 763 p. forestière néotropicale. Tesis doctoral Hernández, J. A., J. Mora & O. Rocha. 2008. en biología integrativa, Ècole Nationale Diversidad genética y relaciones de Supérieure Agronomique de Montpellier, parentesco de las poblaciones silvestres Montpellier. 108 p. y cultivadas de pejibaye (Bactris gasipaes, Montúfar, R., C. Mariac, J. L. Pham & J. C. Palmae), utilizando marcadores Pintaud. 2007. Isolation of 23 polymorphic microsatelitales. Revista de Biología microsatellite loci in the Neotropical palm Tropical 56(1):217-245. Oenocarpus bataua Martius (Arecaceae). Jones, C. J., K. Edward, S. Castaglione, M. Molecular Ecology Notes 7: 75-78. Winfield, F. Sala, C. van de Wiel, G. Montúfar, R., A. Laffargue, J-C. Pintaud, S. Bredemeijer, B. Vosman, M. Matthes, Hamon, S. Avallone & S. Dussert. 2010. A. Daly, R. Brettschneider, P. Bettini, M. Oenocarpus bataua Mart. (Arecaceae): Buiatti, E. Maestri, A. Malcevschi, N. rediscovering a source of high oleic Marmiroli, R. Aert, G. Volckaert, J. Rueda, vegetable oil from Amazonia. Journal of R. Linacero, A. Vazquez & A. Karp. 1997. the American Oil Chemists’ Society 87: Reproducibility testing of RAPD, AFLP 167-172.

40 Estructuración genética de poblaciones de palmeras en el neotrópico derivado de marcadores microsatélites (SSRs)

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Artículo recibido en: Septiembre de 2010. Manejado por: Mónica Moraes R. Aceptado en: Noviembre de 2010.

41 R. Montúfar-Galárraga & J. M. Barreiro

Anexo 1. Información de microsatélites (SSRs) utilizados en el proyecto PALMS. Se describe 17 marcadores SSRs aislados de Oenocarpus bataua, 12 marcadores transferidos a Euterpe precatoria, 12 marcadores transferidos a Prestoea acuminata y 7 marcadores transferidos a Ceroxylon echinulatum. Leyenda: 1) Marcador amplificado o transferido a: Ob = O. bataua, Ep = E. precatoria, Pa = P. acuminata, Ce = C. echinulatum; 2) Autor: a = Montúfar et al. 2007; b = Gaiottoet al. 2001; c = Lepsch-Cunha et al. 2003; d = Gaitán 2003.

Amplificado Locus Tamaño Autor Motivo Secuencia de los cebadores o transferido SSRs (bp) a: (1)

OB01 (GA)17 F: TTTGAGTTCCCCAAATCTAATACA 180-220 Ob, Ep, Pa a R: GGATGAGAGGCAAGGCATAA

OB02 (GA)20(CA)10 F: CTGAACCTTATCCCAACTGA 128-153 Ob, a R: CACATAACTTTTCAGGCACA

OB03 (GA)14 F: ATTGTTTCCAGTCATCATCC 110-133 Ob a R: TTGCAAGACAATTTCGTAGA

OB04 (GA)17 F: CCATATACGGGCAAATTAAG 145-190 Ob a R: CATGTGAACACGCTAGGAG

OB05 (GA)15 F: GGATTCTATGAGAACATACCC 160-190 Ob a R: GAGGTAGGCTAGGCCTAAAG

OB06 (GA)17 F: GGATTGCATGTGTTCATTTA 200-235 Ob a R: TTACGCAATGTTTTATTTGG

OB07 (GA)13 F: ATGGCAGTGCTTTGATATTC 180-213 Ob, Pa a R: TTTAATGGAGGGTTTGATTG

OB08 (GA)15GG(T)24 F: GAGGAGGAATTCTTTCCATT 206-230 Ob, Pa a R: AGCCATTAAAATTCATGCAC

OB09 (GA)14 F: AGTCCGTAAAACAGGATCAA 178-193 Ob a R: GGATGGATCCTTCTTCTCAT

OB10 (GA)19 F: GCCTTCTTCCTCCCTATCT 153-193 Ob a R: TCCAAGATACCGAATCTCAC

OB11 (GA)14 F: ATGAGGGATGTCAATGGAT 145-185 Ob a R: AAAATTCTCCTCTCGCTCTT

OB13 (GA)18 F: CCTATCCCCCTGAACTCTAT 170-208 Ob a R: GAGTTGGTGAAGGACTCAGA

OB14 (GA)13 F: TGGCATTCTTGACTTTGCAT 160-178 Ob a R: ACCATGCCAACTGTGACCTT

OB17 (GA)16 F: TAGCTTTAGAGCGAGGGACT 140-160 Ob, Ep, Pa a R: TGAGCCATAGAACTGACCTT

OB18 (GA)18 F: GCTCCAGCTTCCAAGATAC 128-160 Ob a R: ACAAGTGACTGTTCCTCACC

OB19 (GA)18 F: CCGAATCTCACCTAAACAAG 193/233 Ob, Pa a R: CACCACCTAACACTTTCTTTG

OB21 (GA)9-(GA)16 F: AGAGTGCTAGGGGTGCTCAT 213/245 Ob, Pa a R: TGAAATGGTTGATGAATTGAATG

EE3 (AG)11-(AG)16 F: TTCGCGCACACTGAGAG 190-200 Ep, Pa b R: GGTAGCGTTGATTGGTCC

42 Estructuración genética de poblaciones de palmeras en el neotrópico derivado de marcadores microsatélites (SSRs)

Amplificado Locus Tamaño Autor Motivo Secuencia de los cebadores o transferido SSRs (bp) a: (1)

EE15 (AG)21 F: CCACACAGACACGCAGATAG 140-160 Ep, Pa b R: CCTCATGAAGCATCGACCT

EE48 (AG)27 F: CCTACCATTACGTACTGTCG 210-266 Ep b R: CAATATCAAGCTCATCCATC

EE52 (AG)22 F: TTCTGTGGAGAGTCAATCATC 230-260 Ep b R: AATCTGACAAGGCCTCAAC

EE54 (AG)25 F: CATGTATCTAAGGAACAAGG 140-160 Ep b R: CTGTGCTCTCTCATTCTCA

EE59 (AG)16 F: AACCTCTCTTTGGCCTA 84-128 Ep b R: CTTGGCATACTGGAACC

EE63 (AG)18 F: CCGATATGCTCAAATCAATG 106-132 Ep b R: ACGAGAGGAATCAAAGAACC AC5-3#4 CT/GT F: ACTGTCTGCAGACAATCGAC 202-226 Ep, Pa c R: CTTTTGACACCATTAGTCTGC AG5-5#6 CT F: CGGACCAGTGTGGGTGTAAG 139-153 Ep, Pa, c R: TGGCAGAAAGGAATCTATGCAG AG5-7#9 AG F: ATGGTTAGTAGTTATGAGGC 269-297 Pa c R: TCTTCATGGTAGATGGCTTG AG5-5#1 GA F: TGGTTATGAATCTTAGCCTC 169-199 Ep, Pa, c R: AAATCCATGCTCCATAGTCC

Ca13 (GA)22 F: TTTGACCCTCCCTAGACCC 230-240 Ce d R: ATCAGGAGCTAATGTTGACCC

Ca17 (GA)30 F: CAGACATTGGCTTCAAACA 112-116 Ce d R: ATGCGCTTATTTCTGTTCTC

Ca20 (GA)20(GA)29 F:GTATTCCAAGCCCATTTCA 130-158 Ce d R: CAGAGAGATAGAAAACCAAAGC

Cs3 (AC)13(GA)32 F: GAATGTGACCATCTGCTA 145-164 Ce d R: AAATGTAGAGGAATTGCAT

Cs5 (TG)6(GT)4 F: GCATTGTGAGAGCAAGTGC 200-210 Ce d R:GAAACCACCAATCCTCCTTT

Cs24 (CA)20(GA)5 F: CGTGTCCTTCACCAGAGTGTCG 185-215 Ce d R: ACCGTCGTTCATGGCACCA

Cs30 (GA)15 F: GTGCGCCACATGGAACTTAA 234-248 Ce d R: CGAAGCCATCTGCATGGA