Diaphorodoris Luteocincta (Sars, 1870): ¿Dos “Variedades” O Especies Diferentes?

Facultad de Ciencias del Mar y Ambientales Departamento de Biología

Trabajo Fin de Grado Grado en Ciencias del Mar

Diaphorodoris luteocincta (Sars, 1870): ¿dos “variedades” o especies diferentes?

Fernando Cortés Fossati Tutores: Pr. Dr. D. Juan Lucas Cervera Currado, Pr. Dra. Dña. Marta Pola Pérez

Por ada: Fotografía modificada de Marta Pola

Diaphorodoris luteocincta (Sars, 1870): ¿dos “variedades” o especies diferentes?

Memoria presentada por Fernando Cortés Fossati para optar al Grado de Ciencias del Mar por la Universidad de Cádiz.

Fdo.: Fernando Cortés Fossati

Puerto Real, 16 de Septiembre de 2016

LA PRESENTE MEMORIA DE TRABAJO FIN DE GRADO HA SIDO TUTORIZADA POR EL PR. DR. JUAN LUCAS CERVERA CURRADO, DE LA UNIVERSIDAD DE CÁDIZ Y POR LA PR. DRA. MARTA POLA PÉREZ, DE LA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID

Los tutores:

Fdo.: Juan Lucas Cervera Currado Fdo.: Marta Pola Pérez

Puerto Real, 16 de Septiembre de 2016

ÍNDICE

AGRADECIMIENTOS ...... 3

RESUMEN ...... 7

ABSTRACT ...... 7

1. INTRODUCCIÓN ...... 9

1.1 Sobre la Biodiversidad de los “Invertebrados” en el Medio Marino ...... 9

1.2 El debate acerca de la identidad taxonómica de Diaphorodoris luteocincta .. 10

2. OBJETIVOS ...... 12

3. ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS ...... 12

4. MATERIAL Y MÉTODOS ...... 13

4.1 Descripción de las muestras utilizadas en el presente estudio...... 13

4.2 Metodología experimental ...... 15

4.3 Metodología de gabinete ...... 18

5. RESULTADOS ...... 20

6. ANÁLISIS DE RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...... 27

7. CONCLUSIONES ...... 29

8. BIBLIOGRAFÍA ...... 30

Anexo ...... 39

Fotografía modificada de Enric Madrenas

AGRADECIMIENTOS

Quería dedicar unas palabras en este trabajo y acordarme de todos vosotros, porque esto no sólo supone para mí la finalización de un Doble Grado, donde no hubiera llegado sin vuestra ayuda, sino también de una etapa muy importante en mi vida. He aprendido y evolucionado, he vivido muchas bonitas experiencias que no olvidaré, y he conocido a mucha buena gente en este camino...

Los resultados de este proyecto han sido financiados por diferentes proyectos y ayudas: ASSEMBLE grant (nº 227799) para trabajar en el Laboratoire Arago de Banyuls-sur-Mer, Francia, los proyectos del Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO) CGL2006-05182/BOS y CGL2010-17187/BOS y de la Agencia Española de Cooperación Internacional y Desarrollo (AECID) AECID-PCI A/8688/07

Me gustaría agradecer el apoyo a mis padres, a mi hermana, ¡a mi familia entera! (sí , incluyendo mascotas tanto vertebradas como no), a todos los que me han dicho “¡venga que ya queda poco!”, “que tú puedes” y “¡ya verás que sí!” …mis abuelos preocupados y siempre animando a su nieto, mis tíos y primos… sobre todo a mis padres, que han sido los que siempre han estado ahí conmigo para que hoy esté aquí, y siempre me han cuidado de la mejor manera incluso en los momentos “más malos” que pueda haber. Me habéis respetado mi forma de ser y mis inusuales inquietudes, me habéis hecho vivir la infancia más bonita, y… ¡aquí llegué! Sin esos cimientos… esto no podría haber pasado.

Por su puesto al Nudilab. A ver, no sé qué deciros aparte de que sois, para un científico loco, unos súper- compañeros. Me alegro de haber compartido con vosotros tantas buenas vivencias, científicas y no tan científicas. Gracias a todos por hacerme sentir como en casa en el Lab durante tantos años… Ese Lab en el que cuando tenía un mal día, siempre estaba allí mi huequito para cobijarme hasta en mis peores momentos, porque estaba tan a gusto… Y ahí, en ese “cuartito” ha ido creciendo la familia, (¡como que hemos tenido que tirar un muro y todo!) hemos ido evolucionando y diversificándonos, desde las babosas marinas, planarias, pasando por anélidos, crustáceos, ¡peces!... hasta los bichos sensu estricto, ya representando el salto evolutivo a tierra firme… cuidao cuidao que la pala C nos la conquistamos de a pocos.

…qué de recuerdos que me vienen a la memoria… Lucas, cuando me quedaba a hablar contigo después de las clases de Zoología y nos daban las tantas…

…Patri, y nuestra mítica Party Hard con Naftaleno… ¡y las tartas!, y miles de muestreos, tanto de bichos marinos como terrestres, charlas, comidas, tu libro, la Planaria filetitus, qué de años desde que empezamos primero de Ambientales y se juntó el grupito, que de tiempo, qué de revisiones de etanol… qué de años compartidos de Lab… ¡y ya mira dónde andas!

Leila, en el laboratorio con sus cascos rojos y su escritorio lleno de muñequitos y adornos, y fotos de Marilyn Monroe. Que sepas que, junto con Karen, fuisteis mis primeras compañeras de laboratorio y eso ya queda ahí para siempre. Te conocí cuando tenías mi edad ahora, qué fuerte, cuando estabas empezando el doctorado, y ya Doctora, felizmente casada, y vas a ser mami. Me alegro de que todo te esté yendo tan bien, te lo has ganado. Gracias por enviarme las muestras desde Suecia, y mandarme con cariño tus ánimos en forma de Post-It.

Karen…une de mes deux premières compagnes de laboratoire. Je garde cette mémoire avec tendresse. Je me souviens de nos conversations, de ses belles vidéos de plongée et ses méduses…

Naoufal, très gentil, et son boîte de cafetière plein de eppendorfs soingneusement emballès avec paraffine. Jazmín/Deneb (es como Clark Kent/Superman, la primera es la persona de a pie, la segunda es la Científica que va descubriendo) con su “¡sube fotos al iNaturalist!”. Giulia sempre così allegra, dicendomi “tu sei iperattivo!”. Chari y sus bromas todos los días. Yara e sua canção sobre os nudibrânquios, ¡Branch, Branch!. Dyana e il tutorial su come utilizzare pipette nel laboratorio di

molecolare, Sandra con sus peces… y nuestra compra de acciones de Google y por supuesto, esa increíble hartada de dulces que nos dimos en el desayuno en el centro de Cádiz. Josep y su cuadernillo a lo Cuarto Milenio titulado “Expendientes Secretos de Nudis”. Mikel con su estudio de fotografía para Modelos-Cangrejo. Karla e sua exclamação “Fernando!” no Laboratório de Molecular. Eu tenho que admitir que eu deixava Karla bastante nervosa…mas também rimos muito. Felipe…e seu menino com dentes…frango bonito. Obrigado por suas aulas de portuguès. Tó, um grande cientista, sábio, simpático e sorridente, para sempre "The Boss do Churrasco", rimos muito juntos quando imitou uma fada madrinha no jogo Party and Co…. e você ganhou no jogo! Obrigado por responder às minhas perguntas, por compartilhar o seu conhecimento, por este ano que você compartilhou com nós. Obrigado! Ah! Genny, du var vitne min avhengighet til sjokolade…Tonight we are young…

En especial, me gustaría dedicar algo más a unas personas que se lo merecen mucho:

Si alguien merece un párrafo propio, es sin duda alguna mi querido Profesor Doctor Juan Lucas Cervera Currado. Representas algo muy especial para mí. Cuando te conocí en aquel lejano 2011, primer curso de Ciencias Ambientales... Al verte a ti, como Jaz me hizo el símil un día, fue como cuando los marcianitos de Toy Story dijeron con cara de admiración “Oooooh el Gaaaaaancho”. De hecho, nunca mejor dicho, me engaché aún más a la Zoología y acabé como colaborador en tu Lab. Una de las mejores decisiones de mi vida, me lo pasaba pipa y me lo sigo pasando, y todo el párrafo anterior, el estar en un lugar de trabajo tan guay con compañeros geniales haciendo cosas chulas, es en gran parte es gracias a ti. Te admiro como Zoólogo, ya que eres un gran profesional y un sabio de verdad, que le encanta lo suyo y que disfruta con ello, y como persona. Apostaste por mis gustos zoólogos un tanto distintos (nada más, un poquito sólo) a los del Lab (…y a los del Dep. entero) confiándome la tarea de encargarme de la colección de Insectos…que con el paso de los años ya es de Artrópodos Terrestres… y sobre todo para que pudiera hacer mi proyecto sobre insectos, incluso entrevistándonos en casa de entomólogos para ello. Qué orgulloso me sentí cuando defendiste la Cátedra. ¡Te lo mereces! Muchas gracias por tu confianza, por todo tu tiempo, por ser un tutor preocupado, por tus chistes frikis, por nuestras conversaciones guays, por aguantar mis “estoy podrío” y sus consiguientes problemas técnicos, por momentos de risas, de ciencia y a veces de momentos mezcla de los dos, por ser el Catedrático más guay de tó Cai (que no Caí) como mínimo, evidentmente, por supervisar mis trabajos de fin de grado de la forma en que lo has hecho, por tus sublimes habilidades bibliográficas (en contraposición a mis paupérrimas), y por supuesto por corregir frases cortadas por la mitad con aclaraciones de por medio, y mis aclaraciones “la botella es roja, es roja te has enterado que es roja, por cierto es roja, que como no he comentado la botella es roja, mira mira la botella, que es roja como iba diciendo, ¿sabes de qué color es la botella? ¿no? ¡Roja!”. Por todo esto y por muchas mucho más de verdad de verdad... ¡Gracias!

En segundo lugar, escribiendo en su dialecto, a petición de la aludida, a la Doctora (que sí que sí, que cuando yo defienda ya eres Doctora, que te lo has ganado trabajadora) Jazmín Deneb Ortigosa Guitérrez así que, ¡Órale pues! ¡Ándale! ¡Ándale! ¡Ándale! ¡Ay güey! hay una chava súper-padre, una chamaca súper-chida que ayudó y dedicó una súper-cantidad de tiempo en soportar una persona cuyos límites del perfeccionismo no se encuentran… Aun así me aceptó como su cuate de gabinete y de laboratorio, y me hizo el paro muchas veces gracias a su experiencia y sabiduría. Gracias por cada duda resuelta, por muy pinche que fuera. Has sido muy importante para este proyecto, pero no sólo en el ámbito de laboratorio…para mí como persona, eres súper-especial. ¡Gracias por todos tus conocimientos aportados!, por enseñarme todo lo que necesitaba saber en el mundo de los marcadores moleculares, la electroforesis, los geles, el geneious, los análisis, por aportarme bibliografía, por venir cada vez que lo necesitaba incluso interrumpiendo tus cosas, por prestarme tus apuntes, por revisar mi trabajo… Sabemos que el 16s es un hijo de la ching*** madre, pero todo salió adelante, gracias en muy gran parte, a ti. Nunca olvidaré cuando me metiste miedo en el laboratorio de molecular arrojando un libro de instrucciones nuevo a la basura para que no muriéraramos, me salvaste la vida. Bueno, tú y la bata de María Paniw, que gracias a ella he estado protegido todo el curso en el laboratorio de molecular jaja… Si Leila fue mi primera hermana mayor de Laboratorio, tú eres la segunda con honores. ¡Gracias güey! ¿Ahora quién me va a decir que me pase por el Inaturalist? Gracias por todas las vivencias que hemos compartido, te voy a echar de menos.

No nos olvidemos de la Profesora Doctora Marta Pola. Cuando me metí en el lab hace ya ojú de años, había un nombre que estaba en todos lados. La expresión “esto… ¡de Marta! Esto… pues Marta, eso de Marta” era habitual. Ya para mí eras una leyenda del Lab, ¡estabas por todos lados! Así, que ¡Gracias por tu legado! Gracias por encontrar, capturar etiquetar, fotografiar y clasificar tantos tantos Diaphorodoris pacientemente, poniendo etiquetitas y haciendo las hojitas de Excel con tooodos los datos en los muestreos que luego me han sido imprescindibles para este proyecto, que eso parece así que no tiene trabajo, pero anda que no tiene… te lo dice uno que está familiarizado con etiquetar botecitos e incluir en base de datos… ¿qué habría hecho yo sin ese material? Por supuestísimo gracias por dedicarme tu tiempo, por tus exhaustivas correciones, por resolver mis dudas e inquietudes, contestar mis correos, por tus sugerencias, ¡por aquella visita intensiva!, por prestarme tu ayuda e interesarte por cómo iban las cosas. ¡Gracias! por regalarme toda aquella carpeta llena de documentos de Zoología, ¡hubo uno que me vino de perlas para mi proyecto de los Meloidae!

Por otro lado, gracias por supuestísimo a todos aquellos que han colaborado buscado, mandando y/o aportando muestras al proyecto, Lucas Cervera, Marta Pola, Naoufal Tamsouri, Leila Carmona, Bernard Picton, Enric Madrenas (¡vaya fotazas de nudibranquios!), Manuel Martínez Chacón, George Brown, y Klas Malmberg.

También quiero dar las gracias a todos los expertos que nos han resuelto dudas y nos han aclarado información para el estudio vía mail tan rápidamente.

Y por supuesto tengo que agradecer a los Diaphorodoris, los nudibranquios objeto de estudio, por dejarme descubrir su fascinante mundo, y sobre todo, por hacer un sacrificio tan grande como dar su vida para que yo pueda terminar la carrera.

También gracias a los buenos rockeros, a los heavy metaleros, y a la música en general, que me han hecho llevaderos días y momentos pesados y me han hecho concentrarme mejor para trabajar. Esto ha imprescindible para mi día a día universitario.

Gracias a la gente que hacía más ameno ir a la Universidad, y que luego os habéis convertido en mucho más que compañeros ¡Qué de momentos, qué de vivencias y risas! el loco Alberto y nuestros miles de excursiones, momentos absurdos, frikadas y risas, y la creación junto con Juanma de la mejor Sinfonía que la Humanidad ha oído, Virginia, Manolo, Juncal, y ¡demás compañeros estupendos, tanto de Ciencias Ambientales como del Mar!, que habéis hecho que todo esto sea una experiencia! Evidentemente a Yehe y a Fabio, no creíais que me iba a olvidar. Y gracias a María por todo su apoyo. Juanma, te dejo aparte porque eres el mejor amigo de todos los amigos y es que lo abarcas todo. Siempre estás ahí. En resumen “Juanma Yeheeeeeeeeeeeeeeeeeeeeeee tujabéh qijilloascriboajín nimivantendénaide hajnamaá quetúh, jilopeó jadetó esquejivacreé quistih cribijendojen báhco. Jueno quistojiquiviniío jen jurtu ar coto ucal, jimicuetro arredatando lojraesimentoh jidigo... pomejón jenyeheeeeeeee jilerescuerdoh cozacomolojayehebolo, yeheee quetiraolarmehaaaa cerdoooohhhhhh sequeadebae sequadeyó parabapapá traerpacá er encontree que tirodechaira jitejesholahatripah jenuncanahhttoooooohhhhhhh wehete miraobraahhh jiiiiiiiii ji nuehtra primerahjivenciooonn er mrucioooo de dojaquilomentrodejartoo y loavidejo jolinpicooohhh lojamejorehdetoh illooo que paaaajaaaaaaa y matapatocongüejojeitunaa”

Ah ¡Para el que lo entienda!, Oss!

Por último gracias también a esos compañeros de laboratorio y buenos profesores entusiastas de lo suyo, enamorados de aquello que estudian, por sus clases, sus consejos y sus ánimos.

RESUMEN

Diaphorodoris luteocincta (Sars, 1870) es un molusco nudibranquio de la familia Calycidorididae que habita desde las costas noruegas hasta las Islas Canarias, incluyendo el mar Mediterráneo. En 1960, fueron propuestos dos morfotipos distintos para esta especie a partir de material recolectado en las costas mediterráneas francesas, y que se recogen por la bibliografía como “variedades” pero sin valor de rango taxonómico: reticulata, morfotipo original con el que se describió la especie en 1870 en las costas noruegas, y el morfotipo alba, descrito en 1960 en las costas mediterráneas francesas. Si bien esta nomenclatura se ha mantenido desde hace 56 años, algunos autores han manifestado que estos morfotipos podían estar ocultando erróneamente bajo un mismo nombre específico a dos especies diferentes. Con el objetivo de aclarar la identidad taxonómica de los dos morfotipos de D. luteocincta se procedió a la extracción de ADN y la secuenciación de marcadores moleculares mitocondriales (COI y 16S) y nucleares (H3). Posteriormente, se realizó un estudio filogenético mediante el análisis de inferencia bayesiana, así como la obtención de los porcentajes de divergencia genética para el gen COI. Nuestros resultados confirman, sin ningún tipo de duda que las distancias genéticas obtenidas son suficientemente amplias para afirmar que ambos morfotipos constituyen dos especies diferentes.

Palabras clave: Diaphorodoris luteocincta, Calycidorididae, Nudibranchia, Heterobranchia, Mollusca, especies pseudocrípticas, biodiversidad marina.

ABSTRACT

Diaphorodoris luteocincta is a nudibranch mollusc belonging to the family Calycidorididae distributed from the Norwegian coast to the Canary Islands, including the Mediterranean Sea. In 1960, two different morphotypes were proposed for this species, based on material collected in the French Mediterranean coasts. In the literature these morphotypes are named as “varieties”: reticulata, the original morphotype with which the species was described in 1870 in the Norwegian coasts, and the alba morphotype, described in 1960 in the french mediterranean coasts. Although this nomenclature has been kept for 56 years, some autor have stated that these morphotypes could be mistakenly hiding under one a specific name to two different species. With the objective of clarifying the taxonomic identity of Diaphorodoris luteocincta, we carried

out the DNA extraction and sequencing of two mitochondrial (COI and 16S) and one nuclear (H3) molecular markers. Subsequently, we performed a phylogenetic study using Bayesian Inference analyses. Our results confirm without a doubt that obtained genetic distances are large enough to indicate that these morphotypes constitute two different species.

Keywords: Diaphorodoris luteocincta, Calycidorididae, Nudibranchia, Heterobranchia, Mollusca, pseudocryptic species, marine biodiversity.

1. INTRODUCCIÓN 1.1 Sobre la Biodiversidad de los “Invertebrados” en el Medio Marino La biodiversidad del planeta sigue siendo hoy en día objeto de un gran desconocimiento. Actualmente se conocen aproximadamente 1.700.000 especies (Llorente-Bousquets y Ocegueda, 2008), si bien según estimaciones se calcula que puede existir una cantidad igual o superior a los 10 millones o incluso de 100 millones (Bouchet, 2006). De las especies conocidas, aproximadamente 1.300.000 son animales, de los que el 97% del total constituyen un “conjunto” que no se engloba en el filo Cordados (Llorente-Bousquets y Ocegueda, 2008), lo que implica que dicha agrupación carece bien de esqueleto interno (columna vertebral) o bien de notocorda. Se trata de los que comúnmente se conocen como “Invertebrados”. Éstos no constituyen un grupo monofilético y por tanto no tienen validez desde un punto de vista taxonómico. De hecho, englobarían a los Urocordados y Cefalocordados, dos de los tres subfilos de los Cordados, pero que carecen de vértebras (Vargas y Zardoya, 2013).

Por ello, en función de la información disponible, es lógico pensar que dentro de todo ese “conjunto” de especies potencialmente aún no descritas al que nos hemos referido con anterioridad, exista un elevado número de “Invertebrados”, en donde se engloban filos tan dispares como Artrópodos, Moluscos, Nematodos o Equinodermos, y los mencionados subfilos Urocordados y Cefalocordados, perteneciente a los Cordados.

El desconocimiento de la biodiversidad existente se vuelve aún más patente en el ecosistema marino, ya que, aun siendo mucho más antiguo y ocupar un mayor área en el planeta que el medio terrestre, posee un menor número de especies descritas debido en gran parte a la inaccesibilidad para su estudio (Hendriks et al., 2006). La complejidad de este problema se ha visto incrementada desde que se han introducido las herramientas moleculares para el estudio de las relaciones filogenéticas entre los organismos, debido a que la descripción de las especies tradicionalmente se había realizado en función de caracteres morfológicos. Sin embargo, las técnicas moleculares han puesto de manifiesto que muchos grupos bien establecidos hasta la fecha han resultado no ser monofiléticos desde un punto de vista sistemático, o al menos sus relaciones filogenéticas han deparado grandes sorpresas (Baguñà y Riutort., 2004; Struck, 2005; Hugall et al., 2007; Aktipis, et al., 2008; von Reumont et al., 2011). Además, a nivel específico, las herramientas moleculares han permitido la detección de especies crípticas o pseudocrípticas.

Este problema, considerado por algunos autores como uno de los mayores retos a los que la sociedad tendrá que enfrentarse en el futuro (Bickford et al., 2007), debe ser abordado. Actualmente se está produciendo una grave crisis ambiental y las comunidades biológicas están siendo devastadas por la acción humana (Rozzi et al., 2001), lo que conlleva poner en riesgo la propia supervivencia del ser humano.

De continuar esta tendencia, miles de comunidades, especies y variedades se extinguirán en los próximos años (Lawton y May, 1995; Rozzi et al., 2001). Por tanto, investigar y suministrar información antes desconocida para determinadas áreas, o describir nuevas especies con el fin de ampliar los conocimientos existentes, ayudan a comprender la Biodiversidad en general y velar por ella. Por otro lado, diseñar mejores estrategias de Conservación y Gestión del medio marino es un deber crucial en estos tiempos.

1.2 El debate acerca de la identidad taxonómica de Diaphorodoris luteocincta El filo Moluscos, y más concretamente el taxón Heterobranchia, está siendo objeto desde hace unos años de numerosas revisiones sistemáticas de gran importancia a nivel mundial. Se están redescribiendo especies, reestructurando sus relaciones filogenéticas y cuestionando la monofilia de diversos linajes, así como también se están describiendo nuevos géneros y especies, muchos de ellos a partir de la detección de complejos de especies que habían pasado desapercibidos hasta el momento (ver Valdés y Gosliner, 2001; Jörger et al., 2010, 2014; Schrödl et al., 2011; Neusser et al., 2011; Carmona et al., 2013, 2014a,b, 2015a,b; Jörger y Schrödl, 2013; Laetz et al., 2014; Pola et al., 2014; Ortigosa et al., 2014; Schrödl, 2014; Wägele et al., 2014; Hallas y Gosliner, 2015; Shipman y Gosliner, 2015; Kienberger et al., 2016; Lindsay y Valdés, 2016; Kano et al., 2016, entre otros).

Diaphorodoris luteocinta es una especie de nudibranquio de la familia Calycidorididae descrita por Sars (1870) bajo el nombre de Doris luteocincta en Christiania Fjord (actualmente correspondiente al fiordo de Oslo), Noruega. Esta especie se alimenta de briozoos (Thompson y Brown, 1984) y se distribuye desde las costas noruegas hasta las Islas Canarias, incluyendo el mar Mediterráneo (Platts, 1985; Cervera et al., 2006). Posteriormente, Portman y Sandmeier (1960) propusieron la existencia de dos morfotipos en esta especie a partir de material recolectado en las costas mediterráneas

francesas (Banyuls-sur-Mer). Estos morfotipos son citados en la bibliografía como “variedades” pero sin valor de rango taxonómico (Ros, 1975; ros y Altimira, 1977; Ros, 1978; Cattaneo Vietti, 1982; García Gómez, 1983; Luque 1983; Ballesteros, 1985; Ros, 1985; Cattaneo Vietti, 1986; Luque, 1986): Diaphorodoris luteocincta var. reticulata (Fig. 1A), que correspondería al morfotipo original, y Diaphorodoris luteocincta var. alba (Figura 1B).

Estas dos “variedades” se diferencian básicamente por la coloración del noto. Así, la “variedad” reticulata es descrita como blanca con el borde del manto de color amarillo brillante submarginal, papilas prominentemente puntiagudas en el dorso, estando éste manchado de rojo o con un patrón rojo reticulado en el centro (Rudman, 2001), mientras que la “variedad” alba presenta un manto de color blanco, liso y con ausencia de dibujo o patrón rojizo.

A B

Figura 1. A; Diaphorodoris luteocincta var. reticulata, colectado en Banyuls-sur-Mer (2014). Obsérvese la coloración rojiza en el manto del animal. B; variedad alba, con el manto completamente blanco colectado en Banyuls-sur-Mer (2014). Fotografías: Marta Pola.

Sin embargo, autores como Picton y Morrow (1994) y Picton (2001) opinan que cada morfotipo correspondería a dos especies diferentes englobadas erróneamente bajo el mismo nombre. Dicha hipótesis no ha sido testada hasta la fecha.

Por ello, y dada la creciente descripción de complejos de especies dentro del orden de los Nudibranquios en las costas europeas (Tamsouri et al., 2014; Carmona et al., 2014; Shipman y Gosliner, 2015; Kienberger et al., 2016; Padula et al., 2016), se pone de manifiesto la necesidad de testar con una metodología actual la identidad taxonómica de esta especie.

2. OBJETIVOS El presente Trabajo de Fin de Grado tiene como objetivo aclarar la identidad taxonómica de los dos morfotipos de la especie Diaphorodoris luteocincta mediante el uso de técnicas moleculares, para saber si constituyen un complejo de especies o no.

3. ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS Diaphorodoris luteocincta es una especie que fue descrita en 1870 por Michael Sars, bajo el nombre de Doris luteocincta, en Noruega. Sars lo describió como un nudibranquio de cuerpo blanco cuyo noto se encontraba rodeado de una banda amarilla, estando su centro marcado con una mancha roja. Además, indicó que en su dorso se encontraban unas protuberancias de color blanco. Años más tarde, Eliot (1910) cambió la adscripción genérica de esta especie al género Lamellidoris Alder y Hancock, 1855 pasando a ser Lamellidoris luteoncicta. Sin embargo, Iredale y O’Donoghue (1923) propusieron el nuevo género Diaphorodoris, designando a Doris luteocincta como especie tipo de este género, la cual pasó a denominarse Diaphorodoris luteocincta. Por otro lado, Farran (1903) describió la especie Doris beaumonti, la cual fue sinonimizada con Diaphorodoris luteocincta por Iredale y O’ Donoghue (1923). No obstante, Thiele (1931) consideró esta especie como un subgénero de Onchidoris de modo que la especie Diaphorodoris luteocincta pasó a denominarse Onchidoris (Diaphorodoris) luteocincta (Thompson y Brown, 1984). No obstante Pruvot-Fol (1954) había considerado el género Diaphorodoris como válido pero sin basarse en ningún tipo de justificación razonada. Millen (1985) fue quien realizó una discusión comparativa entre las especies conocidas hasta la fecha, reafirmando la validez de Diaphorodoris como género.

Casi 100 años después del trabajo de Sars (1870), Portman y Sandmeier (1960) describieron para la misma especie dos morfotipos a los que llamaron “variedades” a partir de material recolectado en las costas mediterráneas francesas de Banyuls-sur-Mer, Francia. De esta forma, denominaron al morfotipo original variedad reticulata, y describieron un nuevo morfotipo, variedad alba, de cuerpo blanco y borde del manto amarillo, pero sin mancha roja en su dorso. Este morfotipo no presenta protuberancias en el dorso.

Desde entonces se han mantenido estas denominaciones, que carecen de rango taxonómico, ya que no se les asigna al rango de subespecie y tan sólo hace referencia a dos morfotipos de una misma especie. Representa el único caso en la subclase de los

Heterobranquios en el que actualmente a veces se usa el término “variedad”, sin especificar si este término se utiliza como categoría taxonómica o no. Según el World Register of Marine Species (WoRMS, 2016, http://www.marinespecies.org/), actualmente se consideran ambas “variedades” como sinónimos de Diaphorodoris luteocincta, encontrándose además la “variedad” reticulata actualmente como

“sinónimo dudoso” (Rosenberg y Gofas, 2010). Publicaciones como las de Picton y Morrow (1994) o Vicente (2008) sostienen que estos morfotipos son más que probablemente, dos especies diferentes recogidas erróneamente bajo el nombre específico D. luteocincta. Dicha hipótesis nunca ha sido testada ya que no se han realizado estudios filogenéticos para contrastarla. Como ya se comentó con anterioridad, tradicionalmente las descripciones de las especies animales se realizaban atendiendo a la morfología, en muchos casos haciendo referencia a la externa exclusivamente. Portman y Sandmeier (1960), realizaron la disección de los ejemplares de D. luteocincta recolectados. Así, describen la rádula y la disposición de los órganos internos, especialmente el aparato reproductor. Sin embargo, no debieron observar diferencias apreciables entre los individuos de ambas “variedades”, por lo que concluyeron que las diferencias existentes tan sólo se trataban de variaciones morfológicas intraespecíficas.

Por tanto, ante las dudas mostradas por algunos autores, la falta de estudios con técnicas moleculares modernas, así como el creciente descubrimiento de complejos de especies en moluscos nudibranquios, consideramos oportuna la realización del presente trabajo.

4. MATERIAL Y MÉTODOS 4.1 Descripción de las muestras utilizadas en el presente estudio El material de las dos “variedades” de Diaphorodoris luteocincta que se ha secuenciado procede de diversas localidades, todas ellas incluidas en el rango de distribución de la especie (Tabla 1).

Se han utilizado también secuencias de otras especies de nudibranquios publicadas en la base de datos genética digital Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/), incluyendo todas las especies conocidas del género Diaphorodoris y de la familia Calycidorididae (Tabla 1). En total, se han usado 43 secuencias para el marcador molecular COI, 20 para 16 S y 50 para H3, así como 15 para el concatenado de estos tres marcadores.

Todos los ejemplares fueron colectados por inmersión con escafandra autónoma. Éstos fueron fotografiados y posteriormente conservados en etanol al 96% para preservar su ADN.

Tabla 1. Ejemplares incluidos en este estudio, localidad de recolección, y código de las secuencias en Genbank para los tres marccadores usados en el estudio. Los códigos de acceso a Genbank de las secuencias obtenidas en este estudio se encuentran pendientes de asignación.

Especie Localidad Nº Catálogo COI 16S H3 Diaphorodoris luteocincta morf. reticulata Les Tignes , Banyuls-sur-Mer, Francia MOL345 PENDIENTE - PENDIENTE Diaphorodoris luteocincta morf. reticulata Ratón de Guetaria (Puerto de Guetaria), Guetaria, España MOL464 - - PENDIENTE Diaphorodoris luteocincta morf. reticulata Ratón de Guetaria (Puerto de Guetaria), Guetaria, España MOL465 PENDIENTE - PENDIENTE Diaphorodoris luteocincta morf. reticulata Ratón de Guetaria (Puerto de Guetaria), Guetaria, España MOL466 PENDIENTE - PENDIENTE Diaphorodoris luteocincta morf. reticulata Cap du Troc, Banyuls-sur-Mer, Francia MOL476 - - PENDIENTE Diaphorodoris luteocincta morf. reticulata Cap Oullestreil, Banyuls-sur-Mer, Francia MOL477 - - PENDIENTE Diaphorodoris luteocincta morf. reticulata Cap Oullestreil, Banyuls- sur-Mer, Francia MOL478 - - PENDIENTE Diaphorodoris luteocincta morf. reticulata Banyuls sur Mer, Francia MOL484 PENDIENTE - PENDIENTE Diaphorodoris luteocincta morf. reticulata Les Tignes, Banyuls-sur-Mer, Francia MOL485 - - PENDIENTE Diaphorodoris luteocincta morf. reticulata Les Tignes, Banyuls-sur-Mer, Francia MOL486 - - PENDIENTE Diaphorodoris luteocincta morf. reticulata Portaferry, Irlanda MOL517 - - PENDIENTE Diaphorodoris luteocincta morf. reticulata Portaferry, Irlanda MOL518 - - PENDIENTE Diaphorodoris luteocincta morf. reticulata Smögen, Suecia MOL519 PENDIENTE - PENDIENTE Diaphorodoris luteocincta morf. reticulata Smögen, Suecia MOL520 PENDIENTE - PENDIENTE Diaphorodoris luteocincta morf. reticulata Islas Väder, Suecia MOL521 PENDIENTE - PENDIENTE Diaphorodoris luteocincta morf. reticulata Islas Väder, Suecia MOL522 PENDIENTE - PENDIENTE Diaphorodoris luteocincta morf. reticulata El Turó Negre , Mataró, España MOL523 PENDIENTE - PENDIENTE Diaphorodoris luteocincta morf. reticulata Cala Margarida, Palamós, España MOL527 PENDIENTE - PENDIENTE Diaphorodoris luteocincta morf. reticulata L'Estartit, Girona, España MOL528 PENDIENTE - PENDIENTE Diaphorodoris luteocincta morf. alba Centre Helio Marin ,Banyuls-sur-Mer, Francia MOL343 PENDIENTE PENDIENTE PENDIENTE Diaphorodoris luteocincta morf. alba Les Tignes, Banyuls-sur-Mer, Francia MOL344 PENDIENTE PENDIENTE PENDIENTE Diaphorodoris luteocincta morf. alba Ratón de Guetaria (Puerto de Guetaria), Guetaria, España MOL467 PENDIENTE - PENDIENTE Diaphorodoris luteocincta morf. alba Ratón de Guetaria (Puerto de Guetaria), Guetaria, España MOL468 - - PENDIENTE Diaphorodoris luteocincta morf. alba Ratón de Guetaria (Puerto de Guetaria), Guetaria, España MOL469 PENDIENTE - PENDIENTE Diaphorodoris luteocincta morf. alba Ratón de Guetaria (Puerto de Guetaria), Guetaria, España MOL470 PENDIENTE - PENDIENTE Diaphorodoris luteocincta morf. alba Ratón de Guetaria (Puerto de Guetaria), Guetaria, España MOL471 - - PENDIENTE Diaphorodoris luteocincta morf. alba Ratón de Guetaria (Puerto de Guetaria), Guetaria, España MOL472 PENDIENTE - PENDIENTE Diaphorodoris luteocincta morf. alba Ratón de Guetaria (Puerto de Guetaria), Guetaria, España MOL473 PENDIENTE - PENDIENTE Diaphorodoris luteocincta morf. alba Ratón de Guetaria (Puerto de Guetaria), Guetaria, España MOL474 - - PENDIENTE Diaphorodoris luteocincta morf. alba Ratón de Guetaria (Puerto de Guetaria), Guetaria, España MOL475 - - PENDIENTE Diaphorodoris luteocincta morf. alba Roquedo tras Laboratorio Arago, Banyuls sur Mer, Francia MOL479 PENDIENTE - PENDIENTE Diaphorodoris luteocincta morf. alba Roquedo tras Laboratorio Arago, Banyuls sur Mer, Francia MOL480 - - PENDIENTE Diaphorodoris luteocincta morf. alba Cap Oullestreil, Banyuls-sur-Mer, Francia MOL481 - - PENDIENTE Diaphorodoris luteocincta morf. alba Les Tignes, Banyuls-sur-Mer, Francia MOL482 - - PENDIENTE Diaphorodoris luteocincta morf. alba Les Tignes, Banyuls-sur-Mer, Francia MOL483 - PENDIENTE PENDIENTE Diaphorodoris luteocincta morf. alba Islas del Rey, Chafarinas, España MOL487 - - - Diaphorodoris luteocincta morf. alba Port Agadir, Marruecos MOL500 - - - Diaphorodoris luteocincta morf. alba Jebha, Marruecos MOL501 - - - Diaphorodoris luteocincta morf. alba M'diq, Marruecos MOL502 - - - Diaphorodoris luteocincta morf. alba Jebha, Marruecos MOL503 - - - Diaphorodoris luteocincta morf. alba Jebha, Marruecos MOL504 - - - Diaphorodoris luteocincta morf. alba M'diq, Marruecos MOL505 - - - Diaphorodoris luteocincta morf. alba Cabo Negro, Marruecos MOL506 - - - Diaphorodoris luteocincta morf. alba Jebha, Marruecos MOL507 - - - Diaphorodoris luteocincta morf. alba Jebha, Marruecos MOL508 - - - Diaphorodoris luteocincta morf. alba Tarifa, Cádiz, España MOL509 PENDIENTE - PENDIENTE Diaphorodoris luteocincta morf. alba El Turó Negre , Mataró, España MOL524 PENDIENTE - PENDIENTE Diaphorodoris luteocincta morf. alba El Turó Negre , Mataró, España MOL525 PENDIENTE - PENDIENTE Diaphorodoris luteocincta morf. alba L'Estartit, Girona, España MOL526 PENDIENTE - PENDIENTE Diaphorodoris luteocincta morf. alba Pembrokeshire, País de Gales, Reino Unido MN33156 KP340405.1 KP340309 - Diaphorodoris luteocincta Tarifa, Cádiz, España MOL460 - - PENDIENTE Diaphorodoris luteocincta Tarifa, Cádiz, España MOL461 - - - Diaphorodoris luteocincta Cabo de Trafalgar, Cádiz, España MOL462 - - - Diaphorodoris luteocincta Tarifa, Cádiz, España MOL463 - - - Diaphorodoris luteocincta Cabo de Trafalgar, Cádiz, España MOL488 - - - Diaphorodoris luteocincta Bahía de Algeciras, Cádiz, España LACM87A KP340404.1 KP340308.1 KP340423.1 Diaphorodoris luteocincta Atlántico, España AF249796.1 AF249230.1 - Diaphorodoris papillata Cap Oullestreil, Banyuls-sur-Mer, Francia MOL513 - - - Diaphorodoris papillata Banyuls sur Mer, Francia MOL514 - - PENDIENTE Diaphorodoris papillata Cap Oullestreil, Banyuls-sur-Mer, Francia MOL515 - - -

Diaphorodoris papillata Banyuls sur Mer, Francia MOL516 - - - Diaphorodoris papillata Bahía de Algeciras, Cádiz, España LACM86A KP340407.1 KP340311.1 KP340425.1 Diaphorodoris papillata Mar Mediterráneo, España AF249819.1 - -

Diaphorodoris lirulatocauda Duxbury Reef: Marin Co., California CASIZ181212 KM219679.1 KJ653675.1 KM225829.1 Diaphorodoris lirulatocauda Duxbury Reef: Marin Co., California CASIZ184341 KP340403.1 KP340307.1 KP340422.1 Diaphorodoris lirulatocauda Washington, Estados Unidos GQ292027.1 - - Diaphorodoris cf. mitsuii Sepok Point, Filipinas CASIZ185986 KP340406.1 KP340310.1 KP340424.1 Calycidoris guentheri Mar de Chukchi, Alaska CASIZ190966A KP340397 KP340301 KP340417 Acanthodoris planca Table Bay, Provincia Occidental del Cabo, Sudáfrica CASIZ176116 KM219671 KJ653669 KM225822 Adalaria jannae Pillar Point: San Mateo Co., California CASIZ175578 KP340392 KP340296 KP340415 Ancula gibbosa Condado de Cumberland, Maine, Estados Unidos CASIZ182028 KP340388 KP340291 KP340413 Armodoris anudeorum Estrecho de McMurdo, Mar de Ross, Antártida LACM3118 KP340387 KP340290 KP340412 Corambe obscura Bahía de New Castle, New Hampshire, Estados Unidos CASIZ183942 KP340399 KP340303 KP340419 Felimare tema Sao Tome and Principe: Principe Island CASIZ179384 HM162685 HM162594 HM162594 Triopha catilinae San Francisco Yacht Harbor, San Francisco, California CASIZ170648 HM162690 HM162600 HM162506

4.2 Metodología experimental Para proceder a la extracción del ADN, en primer lugar se cortó un pequeño trozo del pie de cada animal, el cual está constituido básicamente de tejido muscular. De esta forma los órganos internos del animal no resultan dañados y los ejemplares son utilizables en el caso de que posteriormente se deba proceder a la disección de los mismos. Este corte se realizó con material totalmente esterilizado, bien por calor, como es el caso de las pinzas de disección, o con hojas de bisturí esterilizadas de un solo uso. En ningún caso se compartió material de corte de un individuo a otro, pues ello podría contaminar las muestras, mientras que las pinzas volvieron a ser esterilizadas cada vez que se cambió de individuo.

Una vez obtenidos los trozos del pie de cada individuo estos fueron procesados para extraer su ADN. Básicamente el proceso tiene como finalidad lisar el tejido mediante un protocolo de extracción para la obtención del ADN de cada ejemplar. El kit usado para ello es el denominado “DNeasy Blood and Tissue Kit” (Qiagen, Valencia, CA, USA;09/2001) de la empresa de Biología Molecular Qiagen N.V. El kit ha sido aplicado mediante el protocolo homónimo, con ligeras modificaciones para mejorar el rendimiento de éste. La modificación más notable fue la introducción de ARNasa, una enzima que permite eliminar posible ARN contaminante en las preparaciones de ADN (Científica Senna S.A., 2015). Para extraer el ADN de dichos trozos cada muestra fue introducida en un pequeño bote “eppendorf” de volumen máximo 1,5 mL libre de ADN contaminante. A cada bote “eppendorf” se adicionaron 180 L de “Buffer ATL” (Qiagen) y 20 L de proteinasa K con el fin de lisar el tejido, en dos partes, dejando así cada vez el bote “eppendorf” al Baño María a 56 ºC durante una hora (total de dos horas, o si fuera necesario, hasta que se lisara el tejido). Luego fueron añadidos 200 L de “Buffer AL” (Qiagen) y el bote

fue pasado por el vórtex. Inmediatamente después se añadieron 200 L de etanol 96- 100% y el bote fue de nuevo pasado por el vórtex. La mezcla fue pipeteada dentro de un “DNeasy Mini spin column” (Qiagen) y centrifugadas a 8000 rpm durante 1 minuto. El ADN queda retenido de forma selectiva en el centrifugado debido a la membrana que posee la “DNeasy Mini spin column”, denominada “DNeasy membrane” (Qiagen). El tubo de colecta del centrifugado, fue sustituido por uno nuevo. A continuación, se añadieron 500 L de Buffer “AW1” (Qiagen) y se centrifugó de nuevo a 8000 rpm durante 1 minuto. De nuevo, se descartó el tubo de recolección del centrifugado y se cambió por uno nuevo y se añadieron 500 L de “AW2” (Qiagen). El “DNeasy Mini spin column” fue centrifugado una vez más, a 14000 rpm durante 3 minutos para secar la membrana “DNeasy membrane”. El tubo de recolección volvió a ser descartado y sustituido esta vez por un bote “eppendorf” de 1,5 mL, ya que el producto de centrifugado realizado a continuación es el resultado final del proceso. Por tanto, se añaden 50 L de “AE” (Qiagen) y por última vez, se realiza un centrifugado a 8000 rpm durante 1 minuto (modificado del DNeasy Blood and Tissue Handbook 07/2006). Una vez obtenido y purificado el contenido de ADN de las muestras, éstas son almacenadas a -20ºC para evitar su deterioro.

A partir de estas muestras de ADN se realiza un protocolo que las preparará para proceder a la realización de la técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction o Reacción en Cadena de la Polimerasa), cuya finalidad es copiar gran cantidad de veces y por tanto amplificar aquellas regiones del ADN, que han sido elegidas en base a estudios anteriores como más convenientes para este tipo de investigación. Estas regiones son seleccionadas de la cadena de ADN mediante pares de “primers” específicos para esos fragmentos concretos. En nuestro caso, se escogieron tres marcadores moleculares que habitualmente son usados exitosamente en este grupo de moluscos gasterópodos (Meyer, 2003; Williams y Reid, 2004; Dinapoli et al., 2006; Frey y Vermeij, 2008; Malaquias y Reid, 2009; Pola y Gosliner, 2010, Carmona et al., 2013, Kienberger et al., 2016), y que posteriormente servirán para inferir en las relaciones filogenéticas entre los individuos usados. Dos de estos marcadores son de tipo mitocondrial (COI y 16S) y el otro es de tipo nuclear (H3). El par de primers usados para el marcador molecular COI fueron, en secuencia 5’- 3’, LCO1490 (F) GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG y HCO2198 (R); TAAACTTCAGGGTGACCAAAAATCA (Folmer et al., 1994). En el

caso del 16S, el par de primers usado fue, en secuencia 5’ – 3’, 16S ar- LCGCCTGTTTATCAAAAACAT y16Sbr-H CCGGTCTGAACTCAGATCACGT (Palumbi et al., 1991). Por, último para el H3, en secuencia 5’ – 3’, el par de primers usado fue H3AD5’3’ (F) ATG-GCT-CGT-ACC-AAG-CAG-ACV-GC y H3BD5’3’ (R) ATA-TCC-TTR-GGC-ATR-ATR-GTG-AC (Colgan et al., 1998).

Por orden de especificidad, el primero es el que ofrece mejores resultados para diferenciar especies, y el último es el más conservado evolutivamente, y por tanto que posee menor especificidad (ver Pola et al., 2007 y Carmona et al., 2013).

La disolución maestra (“master mix”) fue preparada en 25 L de volumen. Estos 25 L están constituidos por 2,5L de “Qiagen Buffer” (Qiagen), 2-3L de ADN, 2,5 de dNTP (2 mM, Qiagen), 5 L de “Q-solution” (Qiagen), 1,5-3,5 M de cloruro de magnesio, 1l de cada uno de los dos constituyentes de cada par de primers (10 M), 0,25 de DNA polimerasa, (250 unidades/L) y agua libre de nucleasas. La reacción se llevó a cabo mediante termocicladores, a los cuales previamente se les introdujeron los programas que contienen los parámetros específicos para la PCR de cada marcador molecular usado. En el caso de que los resultados no fueran fructíferos en un primer intento, se volvió a repetir la PCR para esas muestras, con distintos programas. La diferencia entre éstos reside en la modificación de alguno de los parámetros, como la temperatura de anillamiento, ciclos o tiempo de cada etapa del programa completo de PCR.

La amplificación para el COI fue realizada mediante una desnaturalización inicial de 3 minutos a 94-95 ºC, seguida de 39-40 ciclos de 30-45 s a 94ºC, 30-46s a 46ºC (temperatura de anillamiento), 1-2 minutos a 72ºC y una extensión final de 5 minutos a 72 ºC.

En el caso de la amplificación para el marcador 16S, ésta fue realizada mediante una desnaturalización inicial de 3 minutos a 94-95ºC, seguida de 39 ciclos de 39-45s a 94º C, 30- 50 s a 45- 51,5 ºC (T de anillamiento), 2 minutos a 72ºC y una extensión final de 5-10 minutos a 72 ºC.

Por último, para la amplificación del marcador H3 se realizó en primer lugar una desnaturalización inicial de 3 minutos a 95ºC, seguida de 40 ciclos de 45-60 segundos a

94-95 ºC, 45 segundos a 50 ºC (T de anillamiento), 2 minutos at 72 ºC , y una extensión final de 10 minutos at 72 ºC.

Una vez que el programa elegido había sido completado, que aproximadamente tardaba un tiempo medio de tres horas, los productos de PCR se almacenaron a 4 ºC para su posterior uso.

Para conocer si dichos productos de PCR eran válidos para ser secuenciados, se les añadió tinta excitable con luz ultravioleta, y se cargaron en geles realizados con una disolución tampón de TAE (Tris, Acetato y EDTA) x0,5 y Agarosa, con el fin de llevar a cabo la técnica de electroforesis, que aplicando una diferencia de potencial atrae las moléculas que se han cargado en el gel, con carga negativa al contener ADN, hacia el polo positivo.Tras la electroforesis, los geles resultantes se revisaron bajo luz ultravioleta (Figura 2). En el caso de que aparecieran reflejadas las bandas referentes al peso molecular de cada marcador molecular, la PCR se consideró satisfactoria, y por tanto dichos productos de PCR fueron purificados y se enviaron a secuenciar a una empresa externa de secuenciación, Macrogen Europe en Ámsterdam, Holanda, división de la empresa surcoreana Macrogen Inc.

A B

Figura 2. A; Revisión de un gel mediante luz ultravioleta. B; Imagen de un gel en el cual se pueden observar las bandas referentes pertenecientes a los marcadores moleculares.

4.3 Metodología de gabinete Los resultados de las secuenciaciones se recibieron en formato digital y fueron introducidos en el software Geneious version 6.1.8 (http://www.geneious.com, Kearse et al., 2012). Se ensamblaron las secuencias, y posteriormente se cotejaron con ayuda del software BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (Altschul et al., 1990) de Genbank, y así ver si efectivamente las secuencias eran de los organismos estudiados o

alguna de ellas se contaminó durante el proceso. Posteriormente, de nuevo en Geneious, se editaron las secuencias y se pudieron corregir errores, así como eliminar los segmentos pertenecientes a los “primers”, o convertirlos a su cadena complementaria, si ello fuese necesario.

Al mismo tiempo, se hizo también uso de Genbank con el fin de descargar e incorporar aquellas secuencias de interés para nuestro estudio que se encontraran en la base, esto es, las secuencias de los mismos marcadores utilizados en nuestro estudio pertenecientes a otros ejemplares de la misma especie, o también de especies del mismo género, familia o de otra categoría taxonómica superior. Aunque estas últimas no pertenecen al taxón estudiado, tienen fines comparativos en el posterior estudio de inferencia (de Haro, 1997).

Con todas las secuencias, tanto las obtenidas en laboratorio, como las provenientes de Genbank, se efectuó un alineamiento múltiple en Geneious (Figura. 3).

Con el fin de obtener el modelo evolutivo que mejor se ajustaba para el estudio, se usó el software MrModeltest 2.3 (Nylander, 2004) y el programa PAUP version 4 (Swofford, 2003). Para los tres marcadores moleculares, ambos programas seleccionaron el modelo GTR+I+G.

Se realizó un análisis de inferencia para los tres marcadores y el concatenado de los tres genes COI+H3+16s con el software MrBayes versión 3.1.2b (Ronquist y Huelsenbeck, 2003).

Complementariamente, a fin de saber el número de grupos en que estaban desglosados los individuos del estudio se utilizó el software ABGD (Puillande et al., 2012). Por último, para conocer los valores de las p-distancias no corregidas entre los individuos para el marcador molecular COI, se usó de nuevo el programa PAUP version 4 (Swofford, 2003). De esta forma, se interpretaron las distancias genéticas entre los morfotipos de la especie estudiada.

Para definir una especie, se usó el criterio de divergencia y monofília recíproca soportada por marcadores moleculares independientes (Malaquias y Reid, 2009; Reid et al., 2006; Avise, 2004; Knowlton 2000; Wheeler y Meier, 2000).

Debido a que los diferentes grupos de organismos tienen diferentes tasas evolutivas, el uso de un umbral genético es difícil de consensuar (Hebert et al., 2003; Williams et al., 2003). Sin embargo, para este estudio se han considerado como especies distintas todas aquellas que presentaran entre sí distancias para las “uncorrected p-distances” de COI dentro de los rangos que otros trabajos establecieron para considerar especies distintas en grupos cercanos al de este trabajo. Por ejemplo, para otros grupos se consideró un corte de un 10% para Bulla (Malaquias y Reid, 2008), un 7% entre dos especies de Glossodoris (Valdés et al., 2011), un 5,5-16% entre especies hermanas de Aeolidiidae (Carmona et al., 2013), un 5,01-21,58% entre especies de Felimida (Ortigosa et al., 2014), un 4% entre especies de Chromodorididae (Ortigosa, datos no publicados) y un 4-14% en el género Acanthodoris (Hallas et al., 2016, en prensa).

Para visualizar, editar y exportar en formato de imagen los árboles resultantes del estudio de inferencia, se usaron los editores de árboles filogenéticos Treegraph 2 (Stöver et al., 2010) y Figtree v 1.4.2 (2014, http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/). El primero fue usado para colapsar los nodos no soportados, mientras que el segundo fue usado para configurar con los valores deseados el árbol con el fin de guardarlos en formato de imagen. Con el fin de realizar algunas modificaciones a los archivos de imagen exportados se usó el programa de edición de imagen Paint.net v4.x.x (dotPDN LLC and Rick Brewster, 2014-2016).

5. RESULTADOS De todos los análisis realizados, el que contiene mayor número de secuencias de los tres marcadores y que, por tanto se tomará como referencia principal para los resultados, es el de inferencia bayesiana de la matriz de datos concatenada (COI+16S+H3). En este análisis se observa la existencia de dos grupos fuertemente soportados dentro del conjunto de los ejemplares identificados inicialmente como D. luteocincta. Uno de estos clados corresponde a un individuo que responde a la descripción morfológica de la “variedad” reticulata de esta especie, mientras que el otro clado está integrado por dos individuos que responden a la “variedad” morfológica alba (Figura 4). Los análisis de inferencia bayesiana para los marcador moleculares COI y 16S, también avalan la existencia de estos mismos dos grupos, fuertemente soportados (Figuras 5 y 6).

En las figuras en las que se muestran árboles filogenéticos se han colapsado aquellos nodos no soportados, es decir, que tuviesen un valor por debajo de 0,95 y por tanto no se apreciaran diferencias significativas.

La distancia genética mínima entre ambos grupos, atendiendo a los valores de las “uncorrected p-distances” para el marcador molecular COI es de un 5,78%. Por otro lado, el software ABGD divide el grupo de estudio en dos, resultando así incluidas 5 especies dentro del género Diaphorodoris.

Para el análisis del marcador H3 no se diferencian ambos grupos, encontrándose todos los individuos de ambas “variedades” en un mismo clado (Figura 7). Este último análisis no deja claras las relaciones entre especies del mismo género.

Tabla 2. Tabla de doble entrada con los intervalos de distancia genética basados en las “uncorrected p- distances” para el marcador molecular COI. En las dos primeras líneas se pueden observar tanto los valores para las distancias entre los dos grupos constituidos por las “variedades” como los valores de variación dentro de cada grupo. Se compara además con especies de la misma familia, superfamilia y una especie, Felimare tema, que actúa de grupo externo.

Uncorrected p-distances (COI) D. luteocincta morf. reticulata D. luteocincta morf. alba D. luteocincta morf. reticulata 0,15 - 1,23 % 5,78 - 8,47% D. luteocincta morf. alba 5,78 - 8,47% 0 - 2,20% Diaphorodoris papillata 11,94 - 12,32% 10,77 – 12,53 % Diaphorodoris lirulatocauda 14,89 - 15,83% 14,23 – 16,24 % Diaphorodoris cf. mitsuii 15,66 - 15,99% 14,31 – 16,17 % Calycidoris guenteri 15,00 15,20 % 13,98 – 15,25 % Armodoris anudeorum 17,33 – 17,76 % 17,48 – 19,12 % Ancula gibbosa 19,15 – 19,60 % 18,84 – 20,14 % Corambe obscura 16,56 – 17,33 % 17,02 – 19,58 % Acanthodoris planca 18,69 - 19,00 % 17,57 – 19,59 % Onchidoris bilamellata 16,07-16,26% 17,47 – 18,97 % Knoutsodonta jannae 18,69 – 19,11 % 18,17 – 19,89 % Triopha catalinae 18,66 - 19,15% 18,34 – 18,87 % Doriopsilla spaldingi 18,10 – 18,56 % 17,65 – 19,31 % Felimare tema 18,26 – 19,02 % 17,81 – 19,48 %

obtuvo 3 Figura exitosamente el marcador molecula marcador el exitosamente .

Ejemplo de alineamiento y obtención de la secuencia consenso en el programa Geneious 6.1.8 para todos los ejemplares incluido ejemplares los todos para 6.1.8 Geneious programa el en consenso secuencia la de obtención y alineamiento de Ejemplo r COI. Cada color representa representa color Cada COI. r una base nitrogenada una base

s en este estudio de los cuales se se cuales los de estudio este en s 22

2222 ( molecular discontinua, línea de 4 Figura MOL344 .

) Árbol filogenético colapsado resultante del concatenado de los tres marcadores moleculares moleculares marcadores tres los de concatenado del resultante colapsado filogenético Árbol COI. COI. . Fotografía de Marta Pola. Marta de Fotografía . A. E A. jemplar del del jemplar

mínimas distancias genéticas genéticas distancias mínimas Diap horodoris luteo horodoris

intraespecíficas cincta

morf. reticulata

y el número de secuencias usadas en el análisis el en usadas secuencias de número el y

( MOL528 )

. Fotografía de de Fotografía .

Enric Madrenas. Madrenas. Enric COI+H3+ 16S .

En azul, el grupo de estudio. de grupo el azul, En basado en las “uncorrected “uncorrected las en basado .B. Ejemplar .B. del del Diaphorodoris luteo Diaphorodoris

p A la derecha la A - distances” d distances” cincta , en columnas en , el

morf. marcador marcador alba alba 20

2322 morfotipo 5 Figura .

re Árbol filogenético colapsado colapsado filogenético Árbol t iculata . En amarillo, individuos pertenecientes al morfotipo al pertenecientes individuos En amarillo, . resultante del análisis del marcador molecular C molecular marcador del análisis del resultante alba .

OI. En OI.

cuadrado de azul, el grupo de estudio. En rojo En estudio. de grupo el azul, de cuadrado ,

individuos pertenecientes al al pertenecientes individuos 20

2422 morfotipo 6 Figura .

re Árbol Árbol t iculata filogenético colapsado resultante del análisis del marcador molecular 16S molecular marcador del análisis del resultante colapsado filogenético . En amarillo, individuos pertenecientes al morfotipo al pertenecientes individuos En amarillo, . alba.

. En . cuadrado de cuadrado

azul, el grupo de estudio. de grupo el azul,

En rojo En ,

individuos pertenecientes al pertenecientes individuos 20

2522 7 Figura .

Árbol filogenético colapsado resultante del análisis del marcador molecularH3. marcador del resultanteanálisis del colapsado filogenético Árbol

En cuadrado de cuadrado

azul, el grupo de estudio de grupo el azul, .

2622

6. ANÁLISIS DE RESULTADOS Y DISCUSIÓN En base a los resultados, dentro de la especie de estudio se han obtenido dos grupos soportados y separados con mucha claridad.

Dichos grupos, correspondiente a las “variedades” recogidas en la literatura, se encuentran claramente distanciados entre sí, como puede apreciarse en la Tabla 2, por un porcentaje de divergencia genética de COI de entre un 5,78 % a un 8,47%. Este rango de divergencia genética entre especies es de la misma magnitud que el encontrado por otros autores en varios grupos de heterobranquios marinos (Carmona et al., 2011, 2013; Ortigosa et al., 2014). Además, estos resultados también se encuentran dentro el rango que establecen Hallas et al. (2016, en prensa) en su reciente estudio acerca del género Acanthodoris, pertenenciente a Onchidoridoidae, la misma superfamilia a la que pertenece el género estudiado y por tanto, es genéticamente más próximo a éste.

Por ello, consideramos que dicho porcentaje es suficiente para afirmar que ambos grupos no están constituidos por individuos de una misma especie.

De esta forma, el morfotipo reticulata correspondería a Diaphorodoris luteocincta Sars 1870, al haber sido la descripción original de este animal realizada en base a un ejemplar rojo con protuberancias blancas en el dorso.

Por otro lado, el morfotipo descrito como “variedad” alba (Portman y Sandmeier, 1960) debería serconsiderada como Diaphorodoris sp. nov. Se pretende continuar con este estudio y realizar la descripción de esta nueva especie que contraposición a D. luteocincta, se caracterizaría por ser completamente blanca con una línea amarilla que bordea su manto y poseer un dorso completamente liso, sin protuberancias (Anexo).

Llama la atención que Diaphorodoris sp. nov., no fuera encontrada hasta 1960 en un litoral tan estudiado como las costas mediterráneas francesas (Vayssière, 1888, 1901, 1913; Pruvot-Fol, 1951, 1954; Wirz-Mangold y Wiss, 1958) y que a partir de su descripción, se comenzaran a registrar citas sobre ésta frecuentemente en el litoral del mediterráneo occidental (costas italianas, mediterráneas francesas e ibéricas). De igual forma, no es hasta mediados de los década de los 80 cuando Thompson y Brown (1984) hacen por primera vez referencia a la presencia del morfotipo alba en el sureste de las islas británicas.

Con el paso del tiempo así como el incremento de los muestreos y del desarrollo de la fotografía submarina, las citas de esta especie se incrementaron tanto en el mediterráneo occidental como en las regiones biogeográficas lusitánica y mauritánica (Cervera et al., 2006).

Mientras que la nueva especie no se encuentra tan al norte de Europa como Diaphorodoris luteocincta, cuyo rango de distribución iría desde las costas de Noruega hasta el sur de la Península Ibérica y la mitad occidental del Mediterráneo, Diaphorodoris sp. nov sin embargo presenta un rango de distribución mayor en el mar Mediterráneo, donde se han encontrado ejemplares desde el estrecho de Gibraltar hasta las costas de Turquía (Figura 8).

De esta forma cuando Diaphorodoris sp. nov. sea descrita formamente, representará un registro nuevo para la biodiversidad de las costas atlánticas europeas, para las macaronésicas y para las mediterráneas europeas y africanas, así como a nivel nacional y regional.

Diaphorodoris luteocincta

Diaphorodoris sp. nov.

Figura 8. Mapa de distribución basado en fuentes bibliográficas (Schmekel y Portman, 1982; Thompson y Brown, 1984; Schmekel y Portman, 1982; Picton y Morrow, 1994; Bedulli et al., 1995; Cachia et al., 2001; Cervera et al., 2006; Jaklin, 2006; Türkmen y Demirsoy, 2009; Tamsouri, 2014; Ballesteros et al., 2016) y actualizado con los resultados de este estudio, de la especies Diaphorodoris luteocinta y Diaphorodoris sp. nov.

7. CONCLUSIONES

- Entre los individuos de la especie Diaphorodoris luteocincta usados en este estudio existen dos grupos claramente diferenciados pertenecientes a las dos “variedades” descritas por Portman y Sandmeier (1960). - Las distancias genéticas entre estos dos grupos son lo suficientemente amplias para afirmar que se trata de dos especies distintas, conclusión también soportada por el análisis ABGD. De este modo, las variedades descritas en 1960 quedan invalidadas. - El morfotipo reticulata descrito por Portman y Sandmeier (1960) debe ser considerado como Diaphorodoris luteocincta sensu Sars 1870. - El morfotipo alba reportado en el trabajo de Portman y Sandmeier (1960) es una especie nueva, Diaphorodoris sp. nov. aún no descrita formalmente. - La descripción formal de la nueva especie representará un nuevo registro para la biodiversidad de las costas atlánticas europeas, macaronésicas, y para las mediterráneas europeas y africanas, así como a nivel nacional y regional.

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Anexo: Fotografías de ambos morfotipos de la especie Diaphorodoris luteoncincta Sars 1870 (Figuras 9-11). Se aporta una serie de fotografías de ambas “variedades” de la especie de estudio, en las cuales se pueden observar las diferencias morfológicas entre éstas.

 Morfotipo alba de la especie Diaphorodoris luteoncincta, tras los resultados de este estudio, Diaphorodoris sp. nov. Se observa un manto totalmente blanco, sin manchas, y liso, con ausencia de protuberancias en el dorso (Figura 9).

Figura 9. Fotografías in vivo del ejemplar de la “variedad” alba MOL 344, ahora Diaphorodoris sp. nov. colectado en 2014 en Banyuls-sur-mer (Francia), zona tipo de la variedad descrita por Portman y Sandmeier (1960). Fotografías de Marta Pola.

 Morfotiporeticulata de la especie Diaphorodoris luteoncincta, tras los resultados de este estudio, Diaphorodoris luteocincta. Se observa un manto con manchas roja, y las características protuberancias blancas en el dorso (Figura 10).

Figura 10. Fotografías in vivo del ejemplar de la “variedad” alba MOL 528, ahora Diaphorodoris luteocincta. colectado en 2016 en L’Estartit, Girona (España), la zona tipo de la variedad descrita por Portman y Sandmeier (1960). Fotografía de Enric Madrenas.

A B

Figura 11. Comparación entre Diaphorodoris luteocincta “variedad” reticulata (A) y Diaphorodoris “variedad” alba (B), de la Bahía de Peyrefitte (Francia). Obsérvense las protuberancias en el dorso en el caso de A. Fotografías de Heurtaux, P., 2001 (Mar 4) Fotografías de Diaphorodoris luteocincta. [Message in] Sea Slug Forum. Australian Museum, Sydney. Available from http://www.seaslugforum.net/find/3876.