Detección Y Limpieza De Virus En Orquídeas Cultivadas

CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -CONCYT- SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -SENACYT- FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYT- UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA – UVG -

INFORME FINAL

EVALUACIÓN DE MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN Y LIMPIEZA DE VIRUS EN ORQUÍDEAS CULTIVADAS

PROYECTO FODECYT No. 067-2007

MARGARITA PALMIERI Investigador Principal

GUATEMALA, JULIO DE 2012.

EQUIPO DE INVESTIGACIÓN:

Licda. Margarita Palmieri Santisteban – Investigadora Principal Licda. María Renée Álvarez – Investigadora Asociada

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AGRADECIMIENTOS:

La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por La Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología -SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología -CONCYT-.

OTROS AGRADECIMIENTOS

Este trabajo no habría sido posible sin la colaboración de los dueños de los cultivos comerciales y no comerciales de orquídeas que accedieron a colaborar con el proyecto prestando sus orquídeas para su análisis. También se agradece a la Asociación Guatemalteca de Orquideología (AGO) por permitirnos el acceso a sus reuniones y contactos para poder realizar el proyecto.

INDICE

CONTENIDO PÁGINA

RESUMEN xi

ABSTRACT xii PARTE I I.1. Introducción 1 I.2. Planteamiento del problema 2 I.2.1. Antecedentes en Guatemala 3 I.2.2. Justificación 3 I.3. Objetivos e hipótesis I.3.1. Objetivos 5 I.3.1.1. General 5 I.3.1.2. Específicos 5 I.3.2. Hipótesis 5 I.4. Metodología I.4.1. Localización 6 I.4.2. Las variables 6 I.4.2.1. Las variables dependientes 6 I.4.2.2. Las variables independientes 6 I.4.3. Indicadores 6 I.4.4. Estrategia metodológica 7 I.4.5. El método 7 I.4.6. La técnica estadística 9 PARTE II II.1 Marco teórico II.1.A) La familia Orchidaceae 10 II.1.B) Las Orchidaceae en Guatemala 13 II.1.C) Cultivo de orquídeas 14 II.1.D) Híbridos de orquídeas 14 II.1.E) Enfermedades y plagas de orquídeas 15 II.1.F) Enfermedades virales en orquídeas 16

II.1.G) Detección de virus en orquídeas 22 II.1.H) Terapias de tratamiento de virus 24 II.1.I) Limpieza de virus en orquídeas 26 PARTE III III.1. Resultados 27 III.1.A) Diagnóstico de enfermedades virales 27 III.1.B) Terapias de limpieza de virus 31 III.2. Discusión de resultados III.2.A) Diagnóstico de enfermedades virales 34 III.2.B) Terapias de limpieza de virus 36 PARTE IV IV.1. Conclusiones 40 IV.2. Recomendaciones 41 IV.3. Referencias bibliográficas 42 IV.4. Anexos IV.4.1. Metodología de ELISA directo 47 IV.4.2. Metodología de ELISA indirecto 49 IV.4.3. Resultados de presencia de 6 virus en la 180 Orquídeas Analizadas 51 IV.4.4. Fotografías de los síntomas más comunes presentados Por las orquídeas infectadas por virus 54

PARTE V V. 1. Informe Financiero 56

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LISTADO DE FIGURAS

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Figura 1. Esquema de una flor de orquídea 11

Figura 2. Flor de Cattleya vista frontal y sección lateral 11

Figura 3. Cápsulas de tres especies de orquídeas 12

Figura 4. Semilla de orquídea, compuesta por el embrión y la testa 17

Figura 5. Daño provocado en hojas por Cymbidium mosaic virus (CyMV) 17

Figura 6. Daño provocado por Odontoglossum ringspot Tobamovirus (ORSV) en a) una hoja de Cymbidium y b) una hoja de Phalaenopsis. 18

Figura 7. Daño provocado por a) Virus de la mancha anillada del Odontoglosum (ORSV o TMV-O) en una flor de Cymbidium b) la combinación de ORSV y el virus del mosaico del Cymbidium (CymMV) en una flor de Cymbidium y c) ORSV en una flor de Cattleya. 19

Figura 8. a) Cattleya percivaliana con síntomas de CMV, b) hoja de Coelogyne rochussenii con síntoma de CMV, c) hojas de Laelia lobata con ORSV y CMV, d) hojas de Epidendrum con síntomas de ORSV y CMV y e) CMV en Pescatoria wallisii 20

Figura 9. Hoja de Dactylorhiza foliosa con síntomas del virus del mosaico amarillo de la judía (BYMV) (Skelton et al. 2006) 20

Figura 10. Síntomas de infección con Tospovirus en una hoja de Phalaenopsis, b) síntomas de TSWV en una hoja de Phalaenopsis 21

Figura 11. a) síntomas de OFV en hojas, b) síntomas de OFV en bulbos, c) síntomas de OFV en hojas de Dendrobium, d) síntomas de OFV en hoja de Cymbidium y e) sintomatología de OFV en hojas de Laelia 22

Figura 12. Micrografía electrónica de viriones de OFV purificado. Un Aumento del virus se encuentra en el área dentro del rectángulo. 22

Figura 13. Pasos del procedimiento de ELISA directo. I = savia de planta infectada con virus y S = savia de planta sana 23

Figura 14. Brote lateral de Cattleya que puede ser utilizado como explante para el cultivo de meristemos 25

Figura 15. Frecuencia de los diferentes virus encontrados en las muestras de Orquídeas colectadas. 28

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Figura 16. Número de plantas de orquídeas con infecciones mixtas por 2 y 3 virus simultáneamente. 28

Figura 17. Gráfica de la distribución de la presencia de virus en Orquídeas infectadas. 29

Figura 18. Movimiento del virus del Mosaico del Cymbidium (CyMV) En híbridos de Dendrobium infectadas. 37

Figura 19. Efecto de la termoterapia para la eliminación de PVY 39

LISTADO DE CUADROS

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Cuadro 1: Número de plantas positivas para los virus analizados. 27

Cuadro 2. Orquídeas infectadas trasladadas al invernadero de la UVG 30

Cuadro 3. Orquídeas tratadas con hidroterapia, termoterapia y cultivo de meristemos 30

Cuadro 4. Resultados de la prueba de ELISA en las orquídeas tratadas con hidroterapia. 31

Cuadro 5. Resultados de la prueba de ELISA en las orquídeas tratadas con termoterapia. 32

Cuadro 6. Resultados de la prueba de ELISA en las orquídeas tratadas con cultivo de meristemos. 32

Cuadro 7. Resultados de la prueba de ELISA en las orquídeas tratadas con termoterapia a 42°C luego del cultivo de meristemos. 33

RESUMEN

La familia Orchidaceae es una de las más grandes del reino vegetal, en Guatemala representa aproximadamente el 10% de la flora. La belleza de sus flores ha hecho que sean muy apreciadas ornamentalmente, por lo cual su cultivo ha aumentado en los últimos años. Las condiciones ambientales en que se cultivan las hacen susceptibles a la infecciones por virus; siendo los más comunes: virus de la mancha anillada del Odontoglossum (ORSV), virus del mosaico del Cymbidium (CyMV), mosaico del pepino (CMV), virus del bronceado del tomate (TSWV), virus del mosaico del tabaco (TMV) y potyvirus. En este trabajo se realizó un diagnóstico de la presencia de los 6 virus por medio de pruebas ELISA en 6 cultivares. Además se implementaron terapias para la eliminación de virus en las orquídeas infectadas. Éstas fueron: hidroterapia a 45°C durante 1 hora, termoterapia a 42°C durante 24 horas, cultivo de meristemos y cultivo de meristemos seguido de termoterapia a 42°C y 8, 16, 24 y 48 horas. Se encontró que el 19.89% (36 plantas infectadas) de todas las plantas analizadas estaban infectadas con uno o más virus. Se observó la presencia de 3 virus: ORSV, CyMV y TMV. La sintomatología observada fue: líneas cloróticas en presencia de CyMV y manchas cloróticas en presencia del virus de ORSV. Ninguna de las terapias realizadas fue efectiva para la limpieza de virus en orquídeas. Únicamente una planta mostró eliminación de los virus por medio de hidroterapia.

Palabras clave: Orquídeas, virus, pruebas ELISA, terapias de eliminación, cultivo de meristemos

ABSTRACT

The Orchidaceae family is one of the largest in the plant kingdom, in Guatemala, representing approximately 10% of the flora. The beauty of their flowers has made them highly prized ornamentals, for which cultivation has increased in recent years. The environmental conditions in which they are grown make them susceptible to virus infections, the most common being: Odontoglossum ringspot virus (ORSV), Cymbidium mosaic virus (CyMV), cucumber mosaic virus (CMV), tomato spotted wilt virus (TSWV), tobacco mosaic virus (TMV) and potyvirus. In this work we carried out an assessment of the presence of the 6 viruses using ELISA in 6 cultivars. In addition, therapies were implemented to eliminate virus from infected orchids. Those were: hydrotherapy at 45 ° C for 1 hour, thermotherapy at 42 ° C for 24 hours, meristem culture and meristem culture followed by thermotherapy at 42 ° C for 8, 16, 24 and 48 hours. We found that 19.89% of all plants tested were infected with one or more viruses. We observed the presence of 3 viruses: ORSV, CyMV and TMV. The symptoms observed were: chlorotic lines in the presence of CyMV and chlorotic spots in the presence of ORSV. None of the therapies performed were effective in cleaning viruses in orchids. Only one plant was cleaned by hydrotherapy.

Keywords: Orchids, virus, ELISA, elimination therapies, meristem culture

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PARTE I

I.1. INTRODUCCIÓN

Las orquídeas son plantas monocotiledóneas que se caracterizan por la belleza de sus flores. Muchas de éstas han sido cultivadas e hibridizadas para su comercialización. Su cultivo ha ido creciendo en todas partes del mundo, incluyendo Guatemala. El cultivo de orquídeas es una producción intensiva en el que se posee un importante capital en muy poco espacio. Un vivero mediano cuenta con alrededor de quince mil plantas, las cuales necesitan muy buena calefacción y alto porcentaje de humedad. Estas condiciones son propicias para el desarrollo de diversas plagas y enfermedades. Es por ello que es necesario tener un exhaustivo control en las colecciones.

Las plagas y enfermedades en orquídeas son consecuencia de un riego incorrecto, mala ventilación, hábitos de fertilización incorrectos y otros errores de cultivo. En función de su origen hay cinco tipos de enfermedades: las provocadas por animales, hongos, bacterias o virus y las de origen fisiológico (Jezek 2005). Las enfermedades provocadas por hongos, animales y bacterias pueden ser controladas con productos químicos y las de origen fisiológico deben eliminarse con el control de las condiciones climáticas. Las enfermedades virales no tienen aún una cura, la única manera de combatirlas es realizando un examen para detectar la presencia de virus y evitar la extensión de la enfermedad. Se pueden tomar medidas preventivas como desinfectar los utensilios utilizados para el corte de flores y hojas.

En los últimos años los virus han tomado gran relevancia dentro del cultivo de orquídeas. La alta incidencia de estos patógenos puede ser atribuida a la facilidad de transmisión por herramientas usadas en las prácticas culturales. Más de veinticinco virus han sido reportados en orquídeas (Moreira et al. 1999, Cárdenas 2000). Frecuentemente las plantas infectadas por virus suelen florecer con menos eficiencia, pierden vigor y producen flores de menor calidad que las plantas sana, afectando el valor de exhibición o comercial de las plantas (Report on plant disease 1990; Hu et al. 1993). Además los virus causan una gran cantidad de anormalidades en la planta, como cambios en su forma, color y apariencia. Dos de los efectos más notables son el amarillamiento (clorosis) por inhibición de la formación de cloroplastos y muerte de los tejidos (necrosis). Estos síntomas pueden ocurrir separadamente o en combinación. También producen debilitamiento y reducción de la capacidad productiva, enanismo y, lo más importante en el caso de las orquídeas, manchas y/o deformación de la flor. En algunas especies, los virus manifiestan síntomas solo en los puntos de inoculación; sin embargo, sus efectos pueden ocurrir tiempo después en cualquier parte de la planta y causar mucho daño (Cárdenas 2000). Sin embargo, a veces, la infección por virus puede ser asintomática. En estos casos los síntomas pueden aparecer mucho después de la infección, manifestarse únicamente en las flores o no presentar nunca síntomas (Jezek 2005; Labrín et al. 2005). En éste último caso, el riesgo es de propagar la infección viral a otras plantas por medio de los utensilios de corte usados en invernaderos, por contacto entre plantas o por medio de vectores como áfidos o trips.

Los síntomas de virus en la familia Orchidaceae son tan diversos como la familia misma y pueden expresarse levemente o provocar severas distorsiones en flores y hojas. Sumado a esto, los síntomas virales pueden ser confundidos con síntomas provocados por otros patógenos o por deficiencias nutricionales (Wisler 1989; Report on plant disease 1990); por ejemplo, síntomas típicos de virus son manchas o líneas cloróticas o necróticas; sin embargo, enfermedades causadas por hongos y bacterias, así como deficiencias de luz o déficit hídrico pueden causar síntomas similares (Wisler 1989). Es por estas razones que se han desarrollado diversas técnicas de detección de virus en plantas. Entre éstas se encuentran el uso de plantas indicadoras, microscopía electrónica y de luz y técnicas serológicas como inmunodifusión y pruebas ELISA (Wisler 1989), así como técnicas moleculares. Los métodos serológicos que emplean enzimas como marcadores se conocen como ensayos inmunoenzimáticos. La prueba de ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) forma parte de estos ensayos (Batista et al. 2008).

El diagnóstico de plantas enfermas puede indicar la presencia de uno o más virus en una planta. Cuando no se cuenta con plantas madre libres de patógenos, o cuando se trata de especies o variedades difíciles de reproducir, es posible aplicar técnicas para la eliminación de los virus, obteniendo de esta manera material sano que pueda ser reproducido asexualmente. En la actualidad se cuenta con varios procedimientos para la eliminación de virus en plantas enfermas, entre estos se encuentran: la quimioterapia, el cultivo de meristemos, la termoterapia y la hidroterapia. Sin embargo, en orquídeas únicamente se ha probado la combinación de cultivo de meristemos con quimioterapia y ha resultado poco efectiva.

Debido a que a la fecha no se tiene aún ningún procedimiento de limpieza de virus en orquídeas, la única alternativa que los cultivadores poseen es la de aislar los individuos enfermos para evitar la propagación de la enfermedad viral. La eliminación de las plantas enfermas de la colección puede representar altos costos, tanto económicos (al tratarse de híbridos de alta producción), como genéticos, si la planta infectada pertenece a una especie con solo uno o dos ejemplares en colección. Es por esto que se hace importante encontrar una opción efectiva y de bajo costo para obtener plántulas libres de virus a partir de especímenes enfermos.

Pretendemos diagnosticar con pruebas ELISA enfermedades virales en orquídeas cultivadas e implementar procedimientos de terapia de eliminación de virus (principalmente termoterapia e hidroterapia) y extracción y cultivo de meristemos in vitro. Esperamos lograr la recuperación de plantas de orquídeas con infección viral que forman parte de colecciones tanto con fines comerciales como de conservación.

I.2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

I.2.1. Antecedentes en Guatemala

Estudios de virus en orquídeas en Guatemala han sido muy escasos pero sobre todo eventuales. No ha habido sistematización en los estudios. Solamente se ha hecho un poco de investigación según los problemas que van surgiendo. Solamente existe una publicación sobre este tema. El estudio titulado: “Determinación de enfermedades virales en orquídeas de invernaderos y silvestres de Guatemala” fue publicado por R. Calzia de Molina y M. Palmieri en 1997, en las Memorias del VIII Congreso Nacional de Manejo integrado de plagas. En ese estudio se comprobó la presencia de virus en orquídeas tanto cultivadas como en estado silvestre, pero siendo el porcentaje mayor en invernaderos. Los virus reportados son el virus del mosaico amarillo del frijol (BYMV), el virus del mosaico del Cymbidium (CymMV), virus de los puntos anillados del Odontoglossum (ORSV) y el virus del mosaico del pepino (CMV). Reporta también que el virus de mayor incidencia es el CymMV (21%), seguido por el ORSV (14%). También, hace mención de que el CMV fue el único virus en esa oportunidad, encontrado tanto en orquídeas de invernadero como en orquídeas de la naturaleza. Dicho estudio es el único publicado en nuestro país sobre enfermedades virales en orquídeas; sin embargo, el estudio no incluye métodos de limpieza de virus.

I.2.2. Justificación del trabajo de investigación

El cultivo y comercio de orquídeas nativas e introducidas, como plantas de colección, flores de corte o plantas ornamentales, ha tomado auge en los últimos años; sin embargo, en Guatemala aún no se han hecho estudios de la identificación y prevalencia de virus en colecciones y plantaciones comerciales, mucho menos de limpieza de virus en estos sitios. Según Wisler (1989) no hay colección en el mundo que se encuentre totalmente libre de infecciones virales. Esto, además de las pérdidas económicas que causa a comerciantes, puede reducir la variabilidad genética de las colecciones al infectar especies nativas raras o difíciles de reproducir.

A la fecha no se conoce ningún tratamiento efectivo para la eliminación de virus en orquídeas. A pesar de que se ha tomado al cultivo de meristemos como la técnica a elegir, esta tecnología por sí sola no es suficiente, sobre todo por las dificultades que representa el hacer cortes muy pequeños y el riesgo que se corre al hacerlos muy grandes (Wisler 1989; Vásquez 2000). También se han realizado estudios (Lim,Wong & Goh 1993; Toussaint et al. 1993) para la utilización de quimioterapia con este fin; sin embargo, sus altos costos y poca efectividad la hace inadecuada para ser utilizada en países en desarrollo, por lo que el único método recomendado para evitar que una infección viral se disperse en una colección o cultivo comercial es eliminar las plantas enfermas.

La eliminación de las plantas enfermas de la colección puede representar altos costos, tanto económicos (al tratarse de híbridos de alta producción), como genéticos, si la planta infectada es una especie endémica que se encuentra en una colección científica o con fines de rescate. Esta opción es especialmente dañina si el ejemplar infectado se trata de un híbrido (natural o producido) valioso con bajos niveles de reproducción o de

una especie nativa de la cual sólo se tiene uno o dos ejemplares en colección. Es por esto que se hace importante encontrar una opción efectiva y de bajo costo para obtener plántulas libres de virus a partir de especímenes enfermos.

En este estudio se pretende implementar procedimientos de terapia de eliminación de virus (principalmente termoterapia e hidroterapia), y la extracción y cultivo de meristemos in vitro para lograr la recuperación de plantas de orquídeas con infección viral que forman parte de colecciones tanto con fines comerciales como de conservación.

Es importante determinar si las plantas tratadas con las tecnologías propuestas estarán libres de virus, por lo que es necesario diagnosticar los virus presentes en las colecciones trabajadas. Esto puede hacerse mediante ELISA, las cuales son ampliamente utilizadas en estudios científicos debido a su confiabilidad, bajo costo y facilidad, ya que permiten correr un gran número de muestras simultáneamente.

El objetivo de este estudio es lograr una metodología que permita obtener plantas libres de virus a partir de plantas infectadas y de esta manera ayudar a disminuir las pérdidas provocadas por infecciones virales en colecciones y cultivos comerciales.

I.3. OBJETIVOS E HIPÓTESIS

I.3.1. Objetivos

I.3.1.1. General

 Implementar una metodología que permita la eliminación de infecciones virales en orquídeas.

I.3.1.2. Específicos

 Realizar el diagnóstico de enfermedades virales en orquídeas cultivadas por medio de pruebas ELISA  Determinar la terapia para limpieza de virus más efectiva para la eliminación de los mismos en orquídeas  Extracción de meristemos de orquídeas  Obtención de plántulas libres de virus por medio del cultivo in vitro.

I.3.2. Hipótesis

Ha1: La hidroterapia es el método más eficaz en la limpieza de virus en orquídeas cultivadas, comparado con el método de termoterapia.

Ha2: La termoterapia es el método más eficaz en la limpieza de virus en orquídeas cultivadas, comparado con el método de hidroterapia.

Ho: Ninguno de los dos métodos (hidroterapia o termoterapia) son eficaces en la limpieza de virus en orquídeas cultivadas.

I.4. METODOLOGÍA

I.4.1. Localización

Se realizaron los contactos con algunos cultivadores de orquídeas y se nos autorizó visitar y analizar sus cultivos. Se visitaron cultivos comerciales y colecciones de orquídeas en la Ciudad de Guatemala, Guatemala y sus cercanías.

Coordenadas: 14o 36’20” N; 90o 29’23” W Altitud: 1510 msnm Temperatura: máx. 24.5o C; min. 14o C; promedio: 14.3o C.

I.4.2. Las variables

I.4.2.1. Las variables dependientes

La presencia/ausencia de los virus: (el virus del mosaico del Cymbidium (CymMV), el virus de la mancha anillada de Odontoglossum (ORSV), el virus del bronceado del tomate (TSWV), el virus del mosaico del pepino (CMV) y el virus del mosaico del tabaco (TMV) y Potyvirus) después de los tratamientos de limpieza.

I.4.2.2. Las variables independientes

Las variables independientes son: la temperatura ambiental (termoterapia) y la temperatura del agua (hidroterapia).

I.4.3. Indicadores

 Obtención de porcentajes de contaminación viral en cultivares de orquídeas de Guatemala.

 Determinación de virus mayormente presentes en cultivares de orquídeas en Guatemala.

 Obtención de plantas libres de virus por medio de los métodos de hidroterapia, termoterapia y/o cultivo de meristemos.

I.4.4. Estrategia metodológica: Población y muestra

Se analizaron un total de 180 orquídeas provenientes de 6 cultivares. De éstas, se colectaron un total de 24 plantas infectadas con uno o más virus. Las plantas infectadas se sometieron a uno o más tratamientos dependiendo de la disponibilidad de réplicas. Se sometieron 10 plantas infectadas a hidroterapia, 8 a termoterapia y una a cultivo de meristemos. Por medio del cultivo de meristemos se obtuvieron 30 plantas in vitro a las que se les sometió a termoterapia. Las 30 plantas in vitro se dividieron en 5 grupos de 6 plantas que fueron sometidas a los siguientes tratamientos de termoterapia: control, 42°C por 8 horas, 42°C por 16 horas, 42°C por 24 horas y 42°C por 48 horas. En todos los casos el número de la muestra dependió de la disponibilidad de plantas.

I.4.5. El Método

A. Diagnóstico de enfermedades virales

Se buscaron plantas que presentaban síntomas indicativos de infección viral.

Los síntomas observados fueron: manchas anilladas, manchas cloróticas, manchas necróticas y deformaciones. Se tomó muestras de hoja de las plantas sospechosas y se trasladaron las muestras a las instalaciones de la Universidad del Valle de Guatemala, para ser diagnosticadas para virus. Se corrió pruebas ELISA (ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas) para 6 diferentes virus: el virus del mosaico del Cymbidium (CymMV), el virus de la mancha anillada de Odontoglossum (ORSV), el virus del bronceado del tomate (TSWV), el virus del mosaico del pepino (CMV) y el virus del mosaico del tabaco (TMV) y Potyvirus; cuya presencia ha sido reportada en orquídeas cultivadas alrededor del mundo. Se corrieron dos tipos o variantes de pruebas de ELISA: a- el ensayo de ELISA directo en forma de sándwich para los virus CymMV, ORSV, TSWV, CMV y TMV. En este tipo de inmuno ensayos se utiliza una placa de plástico tratada para aumentar la capacidad de adsorción de las proteínas que participan en la prueba. La placa posee 96 pozos y la prueba se hace en duplicado (dos pozos por muestra). En el ensayo, el anticuerpo contra el virus viene adsorbido en las placas o bien se coloca como primer paso, éste atrapa al antígeno que es inmovilizado para poder ser detectado y luego se añade otro anticuerpo, pero esta vez marcado con una enzima que, al agregarle su sustrato, cambia o produce un color que es visible y medible mediante un espectrofotómetro a determinada densidad óptica. En este caso la enzima utilizada fue la fosfatasa alcalina, el color producido fue amarillo y se leyó a una densidad óptica de 405.

El procedimiento llevado a cabo para el procesamiento y realización de esta prueba se encuentra en el Anexo 1. b) La otra modalidad fue la llamada indirecta que se utilizó en la detección de Potyvirus. En esta modalidad se utilizan placas similares sólo que no se adsorbe el anticuerpo primero. En este caso se agrega la muestra en primer lugar para que el antígeno se adsorba al plástico. Luego, se añade el primer anticuerpo que es contra el virus directamente y luego se añade un anti anticuerpo marcado con una enzima que reconocerá el anticuerpo añadido. Se añade el sustrato, se produce color y se detecta con espectrofotómetro. En este caso también se utilizó la enzima fosfatasa alcalina, se produjo color amarillo y se detectó a la misma densidad óptica de 405.

El procedimiento para la realización de la prueba se encuentra en el Anexo 2. Todos los virus se detectaron con anticuerpos y conjugados de la casa Agdia.

Se utilizaron dos modalidades de ELISA no sólo porque la casa así los vende sino porque el ELISA directo de sándwich tiene la característica de tener una gran especificidad y una alta sensibilidad debido a la amplificación de la señal que se logra mediante el segundo anticuerpo. En cambio, en el caso de Potyvirus, se utilizó la modalidad indirecta que tiene una mayor sensibilidad debido a la amplificación de la señal por la unión, en este caso, de dos anticuerpos secundarios, pero su especificidad es reducida. En este caso, detecta varios virus diferentes pero todos pertenecientes al género Potyvirus; no detecta uno específico como en el caso de ELISA directo de sándwich, como por ejemplo, el virus del mosaico del tabaco o TMV.

Luego de obtener los resultados de presencia de virus, se comunicó a cada cultivador el número e identificación de todas plantas infectadas con virus.

B. Terapias de limpieza de virus

Las plantas encontradas positivas en la etapa de diagnóstico de enfermedades virales se trasladaron a la Universidad del Valle para ser tratadas por medio de termoterapia, hidroterapia y cultivo de meristemos.

Se realizaron pruebas con el fin de establecer las condiciones de temperatura y luz adecuadas para el tratamiento por medio de termoterapia, ya que este tratamiento no se encuentra reportado en orquídeas. Se midió el tiempo en que las orquídeas empezaban a mostrar amarillamiento de las hojas por quemadura a diferentes temperaturas. a) Termoterapia  Se sometieron 10 plantas del lote de plantas infectadas a termoterapia.  Se introdujeron las plantas completas en una incubadora a una temperatura constante de 42°C durante 24 horas, y un fotoperiodo de 8 horas luz y 16 horas obscuridad.  Se monitoreó continuamente el estado de las plantas durante el lapso de tratamiento.  Al terminar el tratamiento, las plantas tratadas se colocaron en el invernadero de temperatura controlada alejadas de las plantas sin tratamiento. b) Hidroterapia:  Se sometieron 10 plantas del lote de plantas infectadas a hidroterapia.  Se sumergieron las plantas completas una a una en un baño de María a una temperatura constante de 45°C durante una hora.  Luego se extrajeron y se dejaron media hora en agua a temperatura ambiente.  Por último se resembraron y se colocaron en un invernadero de temperatura controlada alejadas de las plantas sin tratamiento.

c) Cultivo de meristemos  Se sometieron las plantas del género Epidendrum a cultivo de meristemos.  Se realizó la desinfección del material con el propósito de eliminar agentes contaminantes y luego se hizo la extracción de los meristemos de cada muestra.  La desinfección consistió en sumergir los tejidos durante una hora en una solución de Physan (1.25 ml/l de agua), seguido de 1 minuto en etanol 70%, luego 10 minutos en cloro comercial al 10% y tres lavados con agua estéril.  Los meristemos extraídos se colocaron en condiciones asépticas en medios de cultivo. El medio de cultivo utilizado fue ½ MS.  Los explantes establecidos en el medio nutritivo se colocaron en un cuarto de cultivo a una temperatura entre 22- 25º C con un fotoperiodo 16/8 (horas luz/oscuridad). d) Termoterapia luego de cultivo de meristemos  Las plántulas obtenidas por medio de cultivo in vitro de meristemos se propagaron y fueron luego sometidas a termoterapia.  Se dividieron las plantas en 5 lotes de 6 plantas cada uno.  El primer lote fue sometido a termoterapia de 8 horas a temperatura constante de 42°C.  El segundo grupo a termoterapia de 16 horas a temperatura constante de 42°C.  El tercero a termoterapia de 1 día a temperatura constante de 42°C.  El cuarto a termoterapia de 2 días a temperatura constante de 42°C.  Y el último sirvió de control. No fue sometido a terapia.

Al final de cada uno de los cuatro tratamientos (hidroterapia, termoterapia, cultivo de meristemos y cultivo de meristemos seguido de termoterapia), las plantas fueron diagnosticadas nuevamente, por medio de pruebas ELISA, para los virus diagnosticados como positivos en la prueba realizada antes de las terapias.

I.4.6 La técnica estadística

La estadística propuesta para este proyecto era un análisis no paramétrico de chi cuadrado. Sin embargo, debido a que no se lograron limpiar orquídeas con ninguno de los dos métodos, no se realizó ninguna prueba estadística.

PARTE II

II.1. MARCO TEÓRICO

A. La familia Orchidaceae

Las orquídeas han fascinado al mundo durante siglos y han sido consideradas como flores místicas; aunque algunos pueblos primitivos también la han utilizado con fines medicinales, por ejemplo, en la Grecia antigua se creía que eran un símbolo de virilidad. Actualmente, desde el punto de vista de la conservación, las orquídeas constituyen un grupo estratégico ya que su belleza despierta el interés de las personas, y por lo tanto éstas se interesan por conservarlas, aún aquellas cuyas flores no son tan atractivas. Sin embargo, es esta misma vistosidad la que ha puesto a varias especies de orquídeas en peligro, sobre todo debido a su extracción selectiva.

El nombre “orquídea” deriva del latín “orchis” que significa testículo, sugiriendo la similitud que existe entre estos órganos masculinos y los bulbos de algunas especies de orquídeas. Actualmente el término Orchis se utiliza para un género de orquídeas europeas y de éste se deriva el nombre de la familia, Orchidaceae (Jezek 2005).

La familia, una de las más diversas, con cerca de 1,000 géneros y 20,000 especies es probablemente la segunda familia con mayor número de especies, luego de Asteraceae. Su distribución es mundial pero con la mayor diversidad de especies en la región tropical entre los 1000 y 2000 m SNM. Pueden encontrarse en casi todos los hábitats, exceptuando aguas saladas y desiertos extremos (Ames y Correl 1985; Dix y Dix 2006; Infoagro 2003).

Las orquídeas son hierbas perennes, monocotiledóneas. Las especies de esta familia pueden ser terrestres, epífitas o rupícolas. No se conoce ninguna orquídea parásita o carnívora. Muchas de las especies encontradas en zonas templadas son terrestres, mientras que en zonas tropicales y subtropicales la mayoría son epífitas o rupícolas (Ames y Correl 1985; Romero 1991; Behar & Tinschert 1998). Las raíces de las orquídeas son generalmente carnosas y poseen un recubrimiento llamado velamen que les permite absorber agua. El tallo puede ser largo y delgado o corto y engrosado, hasta casi ausente. Muchas epífitas tienen tallos engrosados en la base que reciben el nombre de pseudobulbos y algunas terrestres poseen cormos subterráneos. Las hojas presentan nerviación paralela, y pueden ser delgadas o suculentas y hasta ausentes (Dix y Dix 2006).

Las inflorescencias son generalmente laterales y basales o terminales, pueden ser solitarias, racemosas, paniculadas o cimosas. Las flores tienen 3 sépalos y 3 pétalos, de los cuales uno de los pétalos se encuentra modificado formando un labio o labelo que distingue la familia de las orquídeas del resto de familias con flores (Dix y Dix 2006). El androceo y gineceo se encuentran fusionados formando una columna. La mayoría de orquídeas poseen un sólo estambre fértil y el estigma está localizado cerca del ápice de la columna, debajo de la antera, separada de ésta por un rostelo pegajoso. El polen se encuentra agrupado en masas pegajosas llamadas polinia o polinios. La forma de los polinios, del labio y de la columna son de gran importancia en la identificación taxonómica (Dix y Dix 2006; Seaton y Ramsay 2009). Un esquema de una flor de

orquídea y de la vista frontal y lateral de Cattleya se presenta en las figuras 1 y 2 para poder reconocer sus partes (Seaton y Ramsay 2009).

Figura 1. Esquema de una flor de orquídea.

Fuente: Tomado de: Seaton y Ramsay 2009.

Figura 2. Flor de Cattleya vista frontal y sección lateral.

Fuente: Seaton y Ramsay 2009

Los frutos son generalmente cápsulas secas, su forma es variable, comúnmente ovoide, elipsoide o cilíndrica; dehiscentes, se abren por suturas longitudinales. En la figura 3 se pueden apreciar.

Figura 3. Cápsulas de tres especies de orquídeas

Fuente: FODECYYT 067-2007.

Las semillas son diminutas, compuestas por células indiferenciadas; el embrión está cubierto por una capa denominada “testa” y no cuentan con material nutritivo de ninguna clase (Jezek 2005); son producidas en cantidades enormes (algunas especies producen más de un millón de semillas por cápsula) y se encuentran muy bien adaptadas a la dispersión por viento debido a su poco peso (Ames y Correl 1985; Seaton y Ramsay 2009). En la figura 4 se puede apreciar un ejemplo de una semilla de orquídea.

Figura 4. Semilla de orquídea, compuesta por el embrión y la testa.

Fuente: Seaton y Ramsay 2009

B. La familia Orchidaceae en Guatemala

La historia de las orquídeas en Guatemala se remonta al año 1834 cuando George Ure Skinner recibe una carta de Jhon Bateman pidiéndole le envíe orquídeas a Inglaterra. El resultado de esta asociación fue la descripción e ilustración de más de 100 nuevas especies de orquídeas, incluyendo la flor nacional de Guatemala, Lycaste skinneri. Luego de esto Skinner continuó colectando orquídeas por cerca de 33 años. Desde los años 1840 hasta ahora hubo además otros investigadores interesados en orquídeas que realizaron algunas colectas en lugares específicos. En 1937, Cyrus Lundell y su equipo realizaron estudios exhaustivos en Petén. En los años de 1940, Paul Standley y Julian Steyermark culminaron sus exploraciones con la publicación de “Flora of Guatemala”, en la cual se incluye “Orchids of Guatemala” de Oakes Ames y Donovan Correl (1952, 1953). En esta última se incluyen 542 taxa, seguido de un suplemento escrito por Correl, donde se incluye finalmente 567 taxa de la familia Orchidaceae (Dix y Dix 2000).

Sin embargo, aun cuando la publicación de Ames y Correl sigue siendo el referente principal para esta familia de la flora de Guatemala, las investigaciones han seguido en todo el territorio nacional, así como en los países vecinos. Las colectas de nacionales y extranjeros depositadas en los diferentes herbarios han permitido la ampliación del número de orquídeas presentes en el país. En base a las nuevas colectas en campo y especímenes depositados en herbarios, en 2000, Margaret A. Dix y Michael W. Dix presentan “Orchids of Guatemala: A Revised Annotated Checklist”. En este documento los autores incluyen 734 taxa, de las cuales 207 son reportes de especies nuevas o recientemente descritas. Y, según los autores, se calcula que la lista aumenta de 5 a 10 especies anualmente.

Esta familia presenta una gran variedad de formas, tamaños, colores de flor y hoja, fragancias y es desde el punto de vista evolutivo la que ofrece las características más avanzadas, por este motivo se dice que se encuentra en pleno proceso de diversificación, lo cual se refleja en su abundancia y diversidad de especies (Romero 1991; Infoagro 2003).

Como otros datos importantes de la familia en nuestro país, es la fundación de la Asociación Guatemalteca de Orquideología (AGO) en el año 1937, la Asociación de Orquideología de Alta Verapaz en 1981 y la Asociación de Orquideología de Baja Verapaz en 1982 (Dix y Dix 2000).

En Guatemala es considerada la familia de epífitas predominante ya que comprende entre el 25 y 63% de la riqueza de epífitas en bosques naturales (Dix & Dix 2006). La mayor parte de especies encontradas en zonas templadas son terrestres, mientras que en los trópicos y subtrópicos la mayoría son epífitas o litótfitas (Ames & Correl 1981; Romero 1991).

Otro dato importante de la familia Orchidaceae en Guatemala es que se encuentra en el Apéndice II de CITES para el país. Alrededor 28.000 especies de plantas están amparadas por la CITES contra la explotación excesiva. Las especies se agrupan en los Apéndices según su grado de amenaza debido al comercio internacional.

En el caso de las orquídeas la familia completa se encuentra bajo regulación de explotación (CONAP 2005). C. Cultivo de las orquídeas

Las orquídeas son un grupo en peligro de extinción. Esto se debe a diversos factores, entre ellos: su complicado proceso de germinación (necesidad de una simbiosis con un hongo) y a su alta sensibilidad a los cambios en el ambiente. Además, y probablemente más alarmante, es la tala incontrolada y el avance de la frontera agrícola en todo el mundo, principalmente en los trópicos donde se encuentra la mayor diversidad de orquídeas. Otra amenaza importante son los “cazadores” de orquídeas, que se dedican a extraer las orquídeas del bosque y venderlas a un precio menor que el de orquídeas cultivadas (Jezek 2005).

Debido a su belleza y al elevado costo que alcanzan las orquídeas actualmente, son motivo de cultivo por particulares e industriales como flor cortada y como planta ornamental; por ello esta familia posee una creciente importancia económica a nivel mundial. Sin embargo, en Guatemala aún son un recurso que no se maneja, explota y que se encuentra en desaparición (Dix & Dix 2006).

El cultivo de las orquídeas es posible en todas partes y está especialmente desarrollado desde la mitad del siglo pasado porque muchos híbridos interespecíficos e intergenéricos fueron creados y comercializados con éxito por sus obtentores. La explotación comercial para flor cortada y el cultivo en maceta afecta a unos cincuenta géneros cuyo cultivo se practica en muchos países (Infoagro 2003). Entre los géneros más cultivados se encuentran Cattleya, Cymbidium, y Phalaenopsis; esto se debe a la facilidad de su cultivo y a la gran cantidad de híbridos que presentan (Infoagro 2003, Guaragna et al. 2006).

Hay híbridos que brindan una buena oportunidad de rentabilidad anual. Por ejemplo, híbridos de Cattleya dan cinco o seis flores por planta al año; Cymbidium posee un promedio de tres varas por planta anualmente, cada vara produce entre siete y doce flores y Phalaenopsis, da una o dos varas por planta al año, con aproximadamente veinte flores. Normalmente, las orquídeas florecen una vez al año y la época está determinada por la genética de la planta. Cada híbrido florece una vez al año pero, en algunos géneros se han desarrollado híbridos que florecen en distintos momentos del año. Esto da la posibilidad de tener flores todo el año.

Entre los principales países productores de orquídeas cabe destacar: Brasil, China, Costa Rica, Estados Unidos, Filipinas, Indonesia, Países Bajos y Tailandia (Infoagro 2003). Sin embargo, el aumento de la demanda en los países industrializados ofrece una oportunidad para el impulso de mercados de exportación en otros países en desarrollo.

D. Híbridos de orquídeas

En la naturaleza existen híbridos naturales de orquídeas, los cuales son generalmente interespecíficos, es decir, plantas de diferente especie pero del mismo género. Se han encontrado híbridos en Guatemala de los géneros Lycaste, Maxillaria y Cattleya (Dix y Dix 2006). Sin embargo, en Guatemala la hibridación de especies ha

sido importante en la comercialización de orquídeas. Se han cultivado híbridos interespecíficos e intergenéricos con éxito. Por ejemplo, Lycaste skinneri (Bateman ex Lindl) Lindl., cuya variedad alba es la flor nacional del país, ha servido para producir más de 250 híbridos que se cultivan hoy en Europa, Asia, Australia y América (Dix y Dix 2006).

La historia de la hibridización es tan vieja como el cultivo de orquídeas. Los primeros híbridos en crecer en invernaderos europeos eran miembros del género Cattleya, en 1852. Sin embargo, era muy difícil producir plántulas por medio de las semillas de estos híbridos. Pero tras el descubrimiento de la siembra antiséptica por Knudson en 1922, la cantidad de hibridización artificial aumentó enormemente. Hasta la fecha, el número de híbridos de la familia Orchidaceae se estima en una cifra mayor a 25,000. Esto comprende híbridos naturales y artificiales, pero siendo muchísimo mayor el número de híbridos artificiales (Jezek 2005). Los cultivadores de orquídeas han ido perfeccionado la hibridación, mediante hibridaciones sucesivas, para obtener flores más grandes, más vistosas, con mayor número de flores o inflorescencias, más resistentes a plagas o enfermedades, con hojas más llamativas, etc, y han ayudado a que estas características positivas desde el punto de vista comercial, se mantengan por generaciones. Entre los híbridos más populares, debido a su gran valor ornamental, están los de los géneros Cymbidium, Paphiopedilum, Phalaenopsis, Cattleya, Laelia, Vanda, Odontoglossum y en menor grado Dendrobium y Oncidum (Jezek 2005). El cultivo de híbridos se ve también beneficiado ya que los híbridos reproducidos artificialmente de los géneros: Cymbidium, Dendrobium, Miltonia, Odontoglossum, Oncidium, Phalaenopsis y Vanda no están sujetos a la disposición del Apéndice II de CITES, por lo que pueden ser comercializados internacionalmente (CITES 2007).

E. Enfermedades y plagas en orquídeas

Las condiciones de cultivo de orquídeas en invernaderos son aptas para su propicio crecimiento; sin embargo, también es propicio que se den en él muchas enfermedades y plagas. Estas enfermedades y plagas son consecuencia de un riego incorrecto, mala ventilación, hábitos de fertilización incorrectos y otros errores de cultivo. En función de su origen hay cinco tipos de enfermedades: las provocadas por animales, hongos, bacterias o virus y las de origen fisiológico (Jezek 2005).

Las enfermedades causadas por insectos y hongos pueden ser controladas por medio de insecticidas y fungicidas que resultan en la mayoría de casos efectivas. Las infecciones por bacterias se ven provocadas por fríos húmedos de larga duración. Una solución puede ser intensificar la ventilación y limitar el riego temporalmente. Las enfermedades de origen fisiológico se deben a la falta de condiciones óptimas de nutrientes, luz, agua, ventilación, temperatura, etc. La solución a estas enfermedades es mantener las condiciones de crecimiento óptimas para la especie cultivada. Por último, las enfermedades virales no tienen aún una cura, la única manera de combatirlas es eliminando a las plantas infectadas o mediante la reproducción in vitro de células presumiblemente sanas de la planta para originar más plantas. Se puede saber si una planta está infectada realizando un examen para detectar la presencia de virus. Es importante saber qué virus es para poder determinar cómo se transmite y evitar su dispersión mediante el control o manejo de este transmisor. Además, hay que tomar medidas preventivas en el manejo de las plantas como desinfectar los utensilios

utilizados para el corte de flores y hojas (Jezek 2005), usar desinfección de manos, de vestimenta en algunos casos, etc. F. Enfermedades virales en orquídeas

La mayoría de los géneros de orquídeas pueden ser afectados por uno o más virus, lo cual es un grave problema sobre todo por el incremento en la importación y el rápido intercambio de plantas por comerciantes y entusiastas ya que esto favorece la introducción y dispersión de enfermedades provocadas por virus en plantas de invernaderos y colecciones (Report on plant disease 1990). En los últimos años los virus han tomado gran relevancia dentro del cultivo de orquídeas. La alta incidencia de estos patógenos puede ser atribuida a la facilidad de transmisión por herramientas usadas en las prácticas culturales, de plantas infectadas que no presentan síntomas y al desconocimiento popular de prácticas preventivas de estas enfermedades (Cárdenas 2000). Otro factor de mucha importancia es la gran popularidad y el aumento del cultivo de orquídeas, lo cual ha hecho surgir invernaderos con gran número de plantas colocadas en condiciones de alta humedad y temperatura, lo cual favorece el aparecimiento y dispersión de infecciones virales; a esto se le suma la continua adición de especímenes de diferentes orígenes sin previa cuarentena y que pueden estar contaminados.

Más de veinticinco virus han sido reportados en orquídeas (Moreira et al. 1999, Cárdenas 2000). Frecuentemente las plantas infectadas por virus suelen florecer con menos eficiencia, pierden vigor y producen flores de menor calidad que las plantas sana, afectando el valor de exhibición o comercial de las plantas (Report on plant disease 1990; Hu et al. 1993). Además los virus causan una gran cantidad de anormalidades en la planta, como cambios en la forma, color y apariencia de la misma. Dos de los efectos más notables son el amarillamiento (clorosis) por inhibición de la formación de cloroplastos y muerte de los tejidos (necrosis). Estos síntomas pueden ocurrir separadamente o en combinación. También producen debilitamiento y reducción de la capacidad productiva, enanismo y lo más importante en el caso de las orquídeas, manchas y/o deformación de la flor. En algunas especies, los virus manifiestan síntomas sólo en los puntos de inoculación; sin embargo, sus efectos pueden ocurrir tiempo después en cualquier parte de la planta y causar mucho daño (Cárdenas 2000). Sin embargo, a veces, la infección por virus puede ser asintomática. En estos casos los síntomas pueden aparecer mucho después de la infección, manifestarse únicamente en las flores o no presentar nunca síntomas (Jezek 2005; Labrín et al. 2005). En este último caso el riesgo es el de propagar la infección viral a otras plantas por medio de los utensilios de corte usados en invernaderos, por contacto entre plantas o por medio de vectores como áfidos, ácaros o trips.

Cymbidium mosaic potexvirus (CyMV) y Odontoglossum ringspot tobamovirus (ORSV, también llamado TMV-O) son considerados los virus más importantes desde el punto de vista económico y de prevalencia (Wisler 1989; Moreira et al. 1999; Cárdenas 2000; Labrín et al. 2005; Guaragna et al. 2006). Estos virus afectan una amplia gama de géneros de orquídeas y son transmitidos por contacto entre plantas o por medio de las herramientas utilizadas en el invernadero (Wisler 1989; Report on plant disease 1990; Cárdenas 2000).

Estos dos virus producen una serie de síntomas que incluyen estrías necróticas, manchas cloróticas y patrones necróticos lineares en hojas (Figura 5 y 6), así como

necrosis en flores en el caso de CyMV; y veteado de la flor en el caso de ORSV, ya que los síntomas foliares son frecuentemente desapercibidos o están ausentes. Las flores afectadas pueden sufrir deformación severa, el pigmento normal de los sépalos y pétalos es reemplazado por manchas irregulares de un color de mayor o menor intensidad al de la flor en estado normal (Fig. 7). No hay un patrón definido para este estriado. En otras plantas este virus puede presentar manchas, estrías y anillos cloróticos o necróticos (Wisler 1989; Cárdenas 2000; Labrín et al. 2005). Es común encontrar una combinación de estos virus en una misma planta, una infección mixta de CyMV y ORSV, ya que estos dos virus son biológicamente similares y con características epidemiológicas similares (transmisión mecánica) (Freitas-Astúa 2003). Los síntomas de la infección mixta son los mismos que para cada uno de ellos individualmente, éstos son: anillos cloróticos a necróticos y estriado color negruzco en la superficie foliar (Labrín et al. 2005).

Figura 5. Daño provocado en hojas por Cymbidium mosaic virus (CyMV)

Fuente: FODECYT 067-2007

Figura 6. Daño provocado en hojas por Odontoglossum ringspot Tobamovirus (ORSV) en a) una hoja de Cymbidium (American Orchid Society 2008) y b) una hoja de Phalaenopsis.

a. b.

Fuente: FODECYT 067-2007 Fuente: FODECYT 067-2007

Un ejemplo de los daños causados en flores se presenta en la figura 7. Cambios en la coloración como anillos o estriaciones de diferentes tonalidades se pueden observar, a veces hacen la apariencia de estas flores más interesantes pero lamentablemente esos rasgos rápidamente se vuelven necróticos haciendo que la flor pronto muera y no pueda ser comercializada. 17

a) b)

c) Fuente: American Orchid Society 2008.

Debido a su amplia distribución, estos dos virus han recibido mucha atención de los cultivadores y coleccionistas de orquídeas; sin embargo, se han encontrado al menos ocho géneros de virus en orquídeas en el mundo (Cucumovirus, Nepovirus, Potexvirus, Potyvirus, Rhabdovirus, Tobamovirus, Tombusvirus y Tospovirus). Entre los virus más conocidos de estos géneros se pueden encontrar:

Cucumber Mosaic Virus (CMV), reportado en Phalaenopsis (Wisler 1989). Capaz de infectar una amplia variedad de plantas de diferentes familias. Su distribución mundial no es conocida y produce síntomas que incluyen el aparecimiento de rayas blancas o jaspeados en las flores y mosaico o estriados en las hojas. Este virus puede ser transmitido principalmente por pulgones o áfidos (Freitas-Astúa 2003) de forma no persistente o semi persistente. Este virus infecta a más de 190 especies repartidas en más de 40 familias de plantas. Las especies más afectadas son las hortalizas como las cucurbitáceas (pepino, melón, sandía, güisquil, calabaza, chilacayote, etc.), tomate, chile y banano; y ornamentales como crisantemos, geranios y lirios. Los síntomas son muy variables de especie a especie; sin embargo, la mayoría presenta lesiones cloróticas o necróticas, amarillamiento y deformaciones en las hojas (Ferreira y Boley 1992). Algunos síntomas virales se pueden observar en la figura 8. El CMV es uno de los virus multirraciales, con mayor distribución a nivel mundial. Se puede diseminar mecánicamente, por injertos o por medio de semillas (Rivera 1998, Cárdenas 2003a).

a) b) c)

d) e) Fuente: American Orchid Society 2008.

Bean Yellow Mosaic Virus (BYMV), fue reportado en Alemania occidental, Estados Unidos, Japón (Wisler 1989) y más recientemente en Australia (Gibbs et al. 2000) y Costa Rica (Ortiz 2002). Fue reportado en los años 1930s en Gran Bretaña como “Pea Mosaic” y más recientemente se reporta en orquídeas de los géneros Calanthe, Masdevallia y en Dactylorhiza (Skelton et al. 2006; Hammond y Lawson 1988). Al igual que CMV, posee una gran cantidad de hospederos además de orquídeas y produce síntomas que incluyen la formación de manchas necróticas o cloróticas en la superficie de las hojas, así como mosaico y moteado en las mismas (Wisler 1989; Ortiz 2002; Skelton et al. 2006). La transmisión de este virus es mecánica o por áfidos de manera no persistente (Kennedy et al. 1962 en Ortiz 2002; Hammond y Lawson 1988) por al menos 20 especies. Este virus se puede transmitir por semilla y polen; sin embargo, en orquídeas no se ha informado su transmisión por semilla (Freitas-Astúa 2003). La figura 9 muestra algunos de los síntomas encontrados en plantas infectadas.

Figura 9. Hoja de Dactylorhiza foliosa con síntomas del virus del mosaico amarillo de la judía (BYMV).

Fuente: Skelton et al. 2006.

Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV), reportado para orquídeas en California, Florida y Hawaii (Hu et al. 1993; Sclar & Anisco 2001; Baker et al. 2007A), para los géneros Phalaenopsis y Oncidium. Este virus pertenece al grupo de los Tospovirus, es uno de los más cosmopolitas y posee uno de los más amplios rangos de hospederos, cerca de 800 especies (Baker et al. 2007B). Los síntomas encontrados en orquídeas incluyen manchas cloróticas con forma de anillo y lesiones necróticas de 1-2 cm de diámetro (Hu et al. 1993; Baker et al. 2007A). Este virus es transmitido por trips (Baker et al. 2007B), principalmente por Frankliniella occidentalis. La figura 10 muestra los síntomas que presentan las plantas con infección por TSWV.

Figura 10. Síntomas de infección con Tospovirus en una hoja de Phalaenopsis b) síntomas de TSWV en una hoja de Phalaenopsis

a) b) Fuente: Baker et al. 2007B

Otro Tospovirus importante en orquídeas es el llamado Virus de las manchas necróticas de la Impatiens (INSV). Este virus no se ha encontrado en orquídeas de Guatemala hasta el momento pero causa manchas anulares similares a las de TSWV, debilita la planta y finalmente la mata.

Otro virus importante en orquídeas es el Orchid fleck rhabdovirus (OFV). Fue descubierto en Japón en plantas del género Cymbidium que tenían manchas cloróticas y necróticas. Luego se reportó su presencia en Australia, Dinamarca, Alemania, Corea y Estados Unidos, causando manchas y anillos cloróticos y necróticos en varios géneros de orquídeas, especialmente en Dendrobium, Maxillaria, Cymbidium y Odontoglossum. El virus pertenece a la familia Rhabdoviridae y se encuentra ampliamente distribuido. Afecta a la familia Orchidaceae y a otras familias como Chenopodiaceae, Solanaceae y las leguminosas. El virus se transmite por un ácaro, Brevipalpus californicus, de manera persistente y puede también transmitirse por contacto entre plantas. La transmisión es más eficiente a través de adultos y ninfas (Kondo et al. 2003, Kitajima et al. 2005). El virus se aloja en la savia de la planta por lo que su transmisión puede ser mecánica (Kondo et al. 2006; Kubo et al. 2009; Freitas-Astúa 2002). Ejemplos de los síntomas que causa el OFV en orquídeas se presentan en la figura 11.

Figura 11. a) Síntomas de OFV en hojas, b) síntomas de OFV en bulbos, c) síntomas de OFV en hojas de Dendrobium , d) síntomas de OFV en hoja de Cymbidium y e) sintomatología de OFV en hojas de Laelia.

a) b) c)

d) e) Fotos de John Dooley 2011

Este virus, el Orchid fleck virus (OFV), tiene un genoma bipartite inusual de ARN en sentido negativo con una secuencia similar a la de los nucleorabdovirus. Este genoma consta de dos moléculas de ARN de una banda que tienen una longitud de 6413 y 6001 nucleótidos respectivamente, con un marco de lectura abierto (ORF) en sentido complementario. También se encontraron similitudes entre el OFV y los rhabdovirus en la complementariedad de las secuencias en las dos partes terminales de cada segmento de ARN (las secuencias terminales son 39-UGUGUC—GACACA-59) y en las secuencias intergénicas conservadas. Por esto se propuso un nuevo género Dichorhabdovirus dentro de la familia Rhabdoviridae del orden de los Mononegavirales

y con el OFV como el miembro prototipo y especie tipo (Kondo et al. 2006). La figura 12 muestra un ejemplo de la morfología del virus mediante una fotografía electrónica.

Figura 12. Micrografía electrónica de viriones de OFV purificado. Un aumento del virus se encuentra en el área dentro del rectángulo.

Tomado de: Kondo et al. 2006.

G. Detección de virus en orquídeas

El diagnóstico visual de virus en hojas y flores de orquídeas es sumamente difícil ya que los síntomas de las enfermedades virales son progresivos y varían dependiendo de la:

- Combinación virus (tipo y cepa de virus) - Planta hospedera (especie) - Condiciones ambientales (luz, temperatura). - Estado fisiológico y condiciones nutricionales del hospedero

Estos factores hacen variar la duración en tiempo entre la infección y la aparición de síntomas. Algunos virus, bajo ciertas condiciones no causan la aparición de síntomas, pero sí se manifiesta una reducción del vigor en la planta. Algunos factores genéticos son los responsables de la tolerancia de algunas especies a ciertos virus, mientras que en otras hay un alto nivel de susceptibilidad. Estos factores hacen imposible la determinación de la enfermedad si alguna planta, en especial presenta resistencia genética, ya que puede no manifestar síntomas aunque esté infectada (Report on Plant Disease 1990; Cárdenas 2000).

Además, es importante recalcar que en muchas ocasiones los síntomas observados en una planta no son causados únicamente por un solo virus. En muchos casos la planta puede presentar dos o más virus. Esto también dificulta determinar la enfermedad viral y los síntomas que corresponden a cada uno de los virus. Sumado a éstos, los síntomas de distintos virus pertenecientes a familias diferentes pueden

también ser similares. Por lo general, los síntomas como manchas necróticas o cloróticas son generales para muchos tipos de virus.

Los síntomas de virus en la familia Orchidaceae son tan diversos como la familia misma y pueden expresarse levemente o provocar severas distorsiones en flores y hojas. Además, los síntomas virales pueden ser confundidos con síntomas provocados por otros patógenos o por deficiencias nutricionales (Wisler 1989; Report on plant disease 1990); por ejemplo, síntomas típicos de virus son manchas o líneas cloróticas o necróticas; sin embargo, enfermedades causadas por hongos y bacterias, así como deficiencias de luz o déficit hídrico pueden causar síntomas similares (Wisler 1989). Es por estas razones que se han desarrollado diversas técnicas de detección de virus en plantas. Entre éstas se encuentran el uso de plantas indicadoras, microscopía electrónica y de luz y técnicas serológicas como inmuno difusión, pruebas ELISA (Wisler 1989). Estas pruebas son muy útiles cuando se quieren evaluar varias muestras y necesitan sensibilidad y especificidad. Son muy útiles cuando se cuenta con anticuerpos de calidad. Finalmente podemos encontrar técnicas moleculares como PCR que son útiles principalmente en trabajos en los que se necesita mucha sensibilidad y especificidad.

Los métodos serológicos que emplean enzimas como marcadores se conocen como ensayos inmunoenzimáticos. La prueba de ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) forma parte de estos ensayos (Batista et al. 2008). Fue descrita por primera vez por Clark y Adams en 1977 (Salazar 1990). Esta técnica consiste en la inmovilización en una fase sólida, del antígeno o el anticuerpo, sobre el cual se adicionan, de forma secuencial y previo lavado para eliminar los elementos deficientemente fijados o no fijados, los demás componentes de la reacción (ver Fig. 13). La presencia de la reacción antígeno-anticuerpo se revela mediante la adición del sustrato específico de la enzima y la consiguiente formación de productos coloreados, que permiten la evaluación de los resultados de forma visual, cualitativamente, o mediante la lectura de la absorbancia en un espectrofotómetro denominado lector de placas ELISA (Wisler 1989 ; Batista et al. 2008).

Existen numerosos tipos de ELISA, que pueden agruparse en dos categorías: ensayos directos o indirectos. En los ensayos directos se utilizan como conjugados los anticuerpos específicos, que reconocen al patógeno, marcados con la enzima, mientras que en los indirectos se emplean como conjugados anticuerpos que reaccionan con los anticuerpos de la especie animal en la que se produjeron los específicos del patógeno. Dentro de las numerosas variantes descritas, las denominadas sándwich de doble anticuerpo (ELISA-DAS) (ver Figura 13) y de doble anticuerpo indirecto (ELISA- DASI) son las más utilizadas para el diagnóstico rutinario de fitopatógenos (Batista et al. 2008; Salazar 1990).

Esta técnica es muy utilizada para la detección de virus tanto en cultivos agrícolas como ornamentales. Se ha utilizado ampliamente tanto para diagnosis como para investigación debido a su relativa facilidad, bajo costo y confiabilidad.

Figura 13. Pasos del procedimiento de ELISA directo. I = savia de planta infectada con virus y S = savia de planta sana.

Fuente: Salazar 1990.

H. Terapias para tratamiento de virus

Los virus son uno de los agentes patógenos que causan mayores pérdidas en un gran número de cultivos a nivel mundial (Over de Linden y Eliott 1971). Cuando las plantas infectadas por virus son propagadas de forma vegetativa, el patógeno pasa rápidamente de una generación a la próxima, por lo que toda una población de plantas puede verse infectada en poco tiempo (Dodds y Roberts 1990).

Quimioterapia. Existen reportes acerca de la curación de plantas infectadas con virus por medio de tratamientos químicos. Debido a que el metabolismo del virus está estrechamente relacionado con el hospedero, los químicos utilizados para interferir con la replicación viral son muchas veces fitotóxicos. Algunos de los químicos utilizados son: citovirina, virazol o virazole, ácido fosfoacético, derivados de purinas y pirimidinas (principalmente 2-tiouracilo y 8-aguanina) y amantadita (Anmirato et. al. 1990). En orquídeas se ha reportado el uso exitoso de Virazole a base de ribavirina en cultivo in vitro como tratamiento para infecciones virales (Albouy et al. 1988). Esto se ha

reportado para la eliminación exitosa de ORSV en orquídeas utilizando concentraciones de 35 mg/l (Toussaint et al. 1993). Sin embargo, el método es laborioso, caro y no asegura el 100% de desinfección (Freitas-Astúa 2003). Esta técnica se utiliza muchas veces complementada con la técnica de cultivo de meristemos en orquídeas (Freitas- Astúa 2003), en cítricos (Sanjeev et al. 2007), entre otros.

Cultivo de meristemos. Este procedimiento se basa en la utilización de pequeñas secciones de la yema apical de las plantas como explante, incluyendo el domo meristemático y el primordio foliar (Hartmann et. al. 2002); también pueden utilizarse meristemos de raíz (Dodds y Roberts 1990). Se utiliza principalmente para la eliminación de virus sistémicos, viroides, hongos y bacterias superficiales. Esta técnica es posible debido a que el meristemo, por ser un tejido de rápido crecimiento, está libre de patógenos, probablemente debido a la alta concentración de auxinas presentes que puede impedir su reproducción y a que la replicación en el caso de los virus es más lenta que la mitosis de las células de éste. Esto es posible aunque el resto de la planta este infectado, siendo así que mientras más pequeño el explante utilizado, más efectiva es la eliminación del patógeno. Se ha observado que meristemos de longitudes de 0.10 a 0.15 mm han provisto una eliminación del 100 % de virus, disminuyendo este rango a medida que se tienen porciones meristemáticas de mayor tamaño. Por otra parte, explantes más pequeños son más difíciles de establecer (Hartmann et al. 2002).

En el caso específico de las orquídeas se recomienda utilizar como explante, brotes jóvenes de 3 a 5 cm de longitud (ver figura 14), los cuales deben ser cortados y separados de la planta madre con bisturí previamente desinfectado. A este brote, luego de la desinfección, se le extraen las yemas laterales y el meristemo apical para su siembra in vitro (Alvarado 2000).

Figura 14. Brote lateral de Cattleya que puede ser utilizado como explante para el cultivo de meristemos.

Fuente: Alvarado 2000.

Termoterapia. La termoterapia es una técnica en la cual se emplean altas temperaturas para la erradicación de enfermedades en plantas. Está documentado el uso de esta técnica para el control de hongos en semillas, pre-tratamiento de porta-injertos

para eliminación de virus y principalmente eliminación de virus en plantas completas. La temperatura y tiempo de exposición al calor ya sea por medio de aire o agua caliente depende del cultivo y tipo de virus; generalmente se utilizan temperaturas entre 35 – 40º C y exposición de varias semanas para eliminación de virus en plantas y tratamientos con agua caliente (49 – 57 º C) para semillas (Hartmann et al. 2002).

Esta técnica es complementaria a la extracción de meristemos apicales (de raíz, terminal o de tallos) in vitro. La combinación de técnicas incluyen el crecimiento de plantas de 6-12 semanas a 30–40º C antes de la extracción de meristemos de las plantas, su introducción in vitro y luego su evaluación. Puede también incluir la extracción de meristemos pequeños previo al tratamiento de calor, evaluación de la presencia de virus, luego exponer esos explantes a temperaturas de 30-40º C por varias semanas y luego evaluar si se ha eliminado el virus. A esas temperaturas los virus son inactivados por el calor y los tejidos de las plantas pueden seguir creciendo (Dodds y Roberts 1990).

I. Limpieza de virus en orquídeas

En el caso de las orquídeas, sólo existen medidas preventivas para evitar enfermedades por virus, ya que por su naturaleza y velocidad de mutación hasta hoy no se tienen tratamientos efectivos para éstos. Plantas de mucho valor genético afectadas de virus sólo tienen la posibilidad de rescatarse mediante la limpieza con cultivo in vitro de tejido meristemático (Vázquez 2000). Esta técnica fue reportada por primera vez en 1950, para eliminar CyMV de plantas de Cymbidium infectadas; sin embargo, años más tarde Burnett (1984) descubrió que la infección no fue totalmente erradicada en las plantas obtenidas después del procedimiento (Wisler 1989). Esto se debe a que las técnicas utilizadas para el cultivo de meristemo fueron desarrolladas para la propagación en masa de las orquídeas, no para el control de virus en las mismas. Ya que únicamente el tejido meristemático se encuentra libre de virus, es necesario hacer cortes muy pequeños, lo cual hace sumamente difícil el crecimiento de los mismos aún en el medio adecuado. Al hacer cortes demasiado grandes se corre el riesgo de transmitir el virus que se desea eliminar a la nueva generación de plantas producidas. Se ha sugerido que la adición de reguladores de crecimiento al medio de cultivo puede suprimir los virus que se encuentren en el tejido cultivado (Cybularz-Urban & Hanus- Fajerska 2006); sin embargo, esta técnica tampoco logró erradicar completamente los virus en tejidos infectados.

En orquídeas se ha reportado la limpieza de algunos ejemplares por medio de la combinación de cultivo de meristemos, a veces combinado con otra técnica. Tal es el caso de la eliminación de ORSV por medio de cultivo de meristemos combinado con el uso de un antiviral ribavirin reportado por Freitas-Astúa (2003). Otro ejemplo es la eliminación de CMV y CymMV de Vanilla planifolia por medio de cultivo de meristemos reportado por Retheesh y Bhat (2010).

PARTE III

III.1 RESULTADOS

A. Diagnóstico de enfermedades virales

Se analizaron un total de 180 orquídeas provenientes de 6 cultivares. A cada planta se le realizó una prueba de ELISA para los virus siguientes: virus del mosaico del Cymbidium (CyMV), el virus de la mancha anillada de Odontoglossum (ORSV), el virus del bronceado del tomate (TSWV), el virus del mosaico del pepino (CMV), el virus del mosaico del tabaco (TMV) y Potyvirus (Poty). Se encontró un total de 36 orquídeas infectadas (20%). No se encontró orquídeas infectadas con TSWV, CMV, ni Potyvirus. Los resultados completos se presentan en el Anexo 3. En el cuadro 1 se presenta el número de plantas infectadas, el porcentaje de infección y sintomatología presente en las plantas. Los síntomas fueron observados en orquídeas cultivadas en invernaderos. Las imágenes de síntomas pueden observarse en el Anexo 4.

Cuadro 1: Número de plantas positivas para los virus analizados

Virus Número de Porcentaje de Porcentaje de infección Sintomatología plantas infección sobre el sobre el total de plantas en hojas infectadas total de plantas infectadas analizadas CymMV (únicamente) 22 12.15 % 61.11 % Líneas cloróticas ORSV (únicamente) 2 1.10 % 5.56 % Manchas cloróticas TMV (únicamente) 3 1.66 % 8.33 % Manchas y/o líneas cloróticas CMV 0 0 % 0 % --- TSWV 0 0 % 0 % --- Potyvirus 0 0 % 0 % --- CymMV/ORSV 4 2.21 % 11.11 % Manchas y líneas cloróticas ORSV/TMV 1 0.55 % 2.78 % Líneas cloróticas, manchas cloróticas y manchas necróticas. CymMV/ORSV/TMV 4 2.21 % 11.11 % Líneas cloróticas, manchas cloróticas y manchas necróticas. Total 36 19.89 % 100% FUENTE: FD 067-2012

Se encontró que el 20% de todas las plantas analizadas estaban infectadas con uno o más virus y que el 33% de las plantas infectadas presentaron infección mixta por dos o más virus. La figura 15 presenta la frecuencia de los diferentes virus que se encontraron en las plantas colectadas

Figura 15. Frecuencia de los diferentes virus encontrados en las muestras de orquídeas colectadas.

Fuente: FODECYT 067-2007.

Estas frecuencias corresponden a un 53% de veces que se encontró a CymMV, un 31% a ORSV y en un 16% de casos se encontró a TMV. La figura 16 presenta el número de plantas infectadas por 1, 2 ó 3 virus. El virus más comúnmente encontrado fue el virus del mosaico del Cymbidium (CyMV). Se puede observar que la presencia de infecciones mixtas por 2 o 3 virus simultáneamente no es muy diferente. Se encontraron infecciones mixtas con CymMV y ORSV en un 55.56% y con CymMV y TMV en un 44.44%.

Figura 16. Número de plantas de orquídeas con infecciones mixtas por 2 y 3 virus simultáneamente.

Fuente: FODECYT 067-2007.

La figura 17 muestra la distribución de la presencia de virus en las 36 plantas de orquídeas colectadas para el estudio.

Figura 17. Gráfica de la distribución de la presencia de virus en orquídeas infectadas.

70.00% 60.00% 50.00% 40.00% 30.00% 20.00% 10.00%

0.00% Porcentaje(%) CMV

TSWV

Potyvirus

ORSV/TMV

CymMV/ORSV

TMV (únicamente)

ORSV (únicamente) CymMV/ORSV/TMV

CymMV (únicamente)

Fuente: FODECYT 067-2007.

El virus encontrado más comúnmente fue el virus del mosaico del Cymbidium (CyMV) con un porcentaje de 61.11 %. También se pudo encontrar el virus de la mancha anillada del Odontoglossum (ORSV) y el virus del mosaico del tabaco (TMV).

Al ir a recoger las plantas infectadas a los diferentes invernaderos, únicamente nos dieron 24 plantas de las 36 infectadas. Las orquídeas que se trasladaron al invernadero de la UVG para ser sometidas a los diferentes tratamientos se presentan en el cuadro 2. Estas plantas fueron seleccionadas para someterlas a hidroterapia, termoterapia y a cultivo de meristemos. Se dividieron las plantas para someterlas al tratamiento de hidroterapia y termoterapia pero de algunas no se tuvo suficiente material y para cultivo de tejidos únicamente se pudo utilizar una planta ya que los meristemos estaban bastante dañados y secos. La selección de orquídeas para cada tratamiento se presenta en el cuadro 3.

Cuadro 2. Orquídeas infectadas trasladadas al invernadero de la UVG.

Número Género Especie ORSV CymMV TMV No. virus 43 Pleurothallis Inmersa Negativo Positivo Negativo 1 46 Phalenopsis Dontis Negativo Positivo Negativo 1 49 Paphio Insigne Negativo Positivo Negativo 1 50 Oncidium Sphacelatum Negativo Positivo Negativo 1 56 Sin ID Kisses Positivo Negativo Negativo 1 64 Lemboglossum Sp Negativo Negativo Positivo 1 70 Encyclia Cochleata Positivo Negativo Negativo 1 74 Cattleya Híbrido Negativo Positivo Negativo 1 77 Cattleya portia-cerula Negativo Positivo Negativo 1 83 Epidendrum X obrienianum Negativo Positivo Negativo 1 86 Epidendrum Híbrido Positivo Positivo Negativo 2 87 Epidendrum Amarillo Positivo Positivo Negativo 2 88 Epidendrum Morado Positivo Positivo Negativo 2 90 Ascocenda Judy Paige Negativo Positivo Negativo 1 91 Ascocenda Suksamram Beauty Negativo Positivo Negativo 1 92 Vascostilis Pine rivers Negativo Positivo Negativo 1 96 Vanda Tricolor Negativo Positivo Negativo 1 104 Osmoglossum Pulchellum Negativo Negativo Positivo 1 111 Phalenopsis Fulcra Positivo Positivo Positivo 3 116 Cattleya Híbrido Negativo Positivo Negativo 1 145 Cattleya híbrido 2 Positivo Negativo Positivo 2 149 Cattleya guatemalensis MS Palmieri Negativo Positivo Negativo 1 150 Oncidium Olorosa Negativo Positivo Negativo 1 158 Oncidium Sweet sugar Positivo Positivo Positivo 3 Total (24 plantas infectadas) 8 18 5 24 Fuente: FODECYT 067-2007.

Cuadro 3. Orquídeas tratadas con hidroterapia, termoterapia y cultivo de meristemos

No. Género Especie Hidroterapia Termoterapia Cultivo de meristemos 43 Pleurothallis inmersa X 70 Encyclia cochleata X X 74 Cattleya híbrido X X 83 Epidendrum x obrienianum X X 86 Epidendrum híbrido X X 87 Epidendrum amarillo X X 88 Epidendrum morado X X 116 Cattleya híbrido X X 145 Cattleya híbrido 2 X X 150 Oncidium olorosa X X 158 Oncidium Sweet sugar X X Total 10 8 1 Fuente: FODECYT 067-2007.

Las plantas infectadas se sometieron a uno o más tratamientos dependiendo de la disponibilidad de réplicas. Se sometieron 10 plantas infectadas a hidroterapia, 8 a termoterapia y una a cultivo de meristemos.

B. Terapias de limpieza de virus

Los resultados de los diferentes tratamientos a los que se sometieron las diferentes plantas se presentan en los cuadros 4, 5, 6 y 7.

Cuadro 4. Resultados de la prueba de ELISA en las orquídeas tratadas con hidroterapia.

Antes del tratamiento Después del tratamiento No. Cód. Género Especie ORSV CymMV TMV No. virus ORSV CymMV TMV No. virus Conclusiones 43 6LM Pleurothallis Inmersa Negativo Positivo Negativo 1 Negativo Negativo Negativo 0 Se eliminó CymMV 70 33LM Encyclia Cochleata Positivo Negativo Negativo 1 Positivo Positivo Positivo 3 Se detectó TMV y CymMV 74 37LM Cattleya Híbrido Negativo Positivo Negativo 1 Negativo Positivo Negativo 1 Permanece igual 83 6JM Epidendrum X obrienianum Negativo Positivo Negativo 1 Negativo Positivo Negativo 1 Permanece igual 86 9JM Epidendrum Híbrido Positivo Positivo Negativo 2 Positivo Positivo Negativo 2 Permanece igual 88 11JM Epidendrum Morado Positivo Positivo Negativo 2 Positivo Positivo Positivo 3 Se detectó TMV 111 34JM Phalenopsis Fulcra Positivo Positivo Positivo 3 Positivo Positivo Positivo 3 Permanece igual 116 39JM Cattleya Híbrido Negativo Positivo Negativo 1 Negativo Positivo Negativo 1 Permanece igual 145 39LM Cattleya híbrido 2 Positivo Negativo Positivo 2 Positivo Negativo Positivo 2 Permanece igual 158 16SM Oncidium Sweet sugar Positivo Positivo Positivo 3 Positivo Positivo Positivo 3 Permanece igual Fuente: FODECYT 067-2007

Se eliminó un solo virus de las 10 plantas tratadas con el tratamiento de hidroterapia. El virus de la planta que fue eliminado fue el virus del mosaico del Cymbidium (CyMV). Las nueve plantas restantes permanecieron con el mismo número de virus presentes y en dos de ellas se detectó la presencia de virus que no habían sido detectados anteriormente. El porcentaje de limpieza de este método fue del 10%.

Cuadro 5. Resultados de la prueba de ELISA en las orquídeas tratadas con termoterapia.

Antes del tratamiento Después del tratamiento No. Código Género Especie ORSV CymMV TMV No. virus ORSV CymMV TMV No. virus Conclusiones 70 33LM Encyclia cochleata Positivo Negativo Negativo 1 Positivo Positivo Positivo 3 Se detectó TMV y CymMV 74 37LM Cattleya híbrido Negativo Positivo Negativo 1 Negativo Positivo Negativo 1 Permanece igual 83 6JM Epidendrum X obrienianum Negativo Positivo Negativo 1 Negativo Positivo Negativo 1 Permanece igual 88 11JM Epidendrum morado Positivo Positivo Negativo 2 Positivo Positivo Positivo 3 Se detectó TMV 111 34JM Phalenopsis fulcra Positivo Positivo Positivo 3 Positivo Positivo Positivo 3 Permanece igual 116 39JM Cattleya híbrido Negativo Positivo Negativo 1 Negativo Positivo Negativo 1 Permanece igual 145 39LM Cattleya híbrido 2 Positivo Negativo Positivo 2 Positivo Negativo Positivo 2 Permanece igual 158 16SM Oncidium Sweet sugar Positivo Positivo Positivo 3 Positivo Positivo Positivo 3 Permanece igual Fuente: FODECYT 067-2007

No se eliminó ningún virus por medio de la termoterapia y se detectó virus que no habían podido ser detectados en el primer análisis.

Cuadro 6. Resultados de la prueba de ELISA en las orquídeas tratadas con cultivo de meristmemos.

Antes del tratamiento Después del tratamiento Número Código Género Especie ORSV CymMV TMV No. virus ORSV CymMV TMV No. virus Conclusiones 86 9JM Epidendrum híbrido Positivo Positivo Negativo 2 Positivo Positivo Negativo 2 Permanece igual Fuente: FODECYT 067-2007 La planta sometida a cultivo de meristemos, permaneció igual, es decir, no se eliminó ningún virus.

Cuadro 7. Resultados de la prueba de ELISA en las orquídeas tratadas con termoterapia a 42°C luego del cultivo de meristemos.

Antes del tratamiento Después del tratamiento No. No. De plantas No. No. Código Género Especie ORSV CymMV TMV virus Tratamiento tratadas ORSV CymMV TMV virus Conclusiones 8 horas 86 9JM Epidendrum Híbrido Positivo Positivo Positivo 3 42°C 6 Positivo Positivo Positivo 3 Permanece igual 16 horas 42°C 6 Positivo Positivo Positivo 3 Permanece igual 1 día a 42°C 6 Positivo Positivo Positivo 3 Permanece igual 2 días a 42°C 6 Positivo Positivo Positivo 3 Permanece igual Control 6 Positivo Positivo Positivo 3 Permanece igual Fuente: FODECYT 067-2007

Las plantas obtenidas por medio de cultivo de meristemos in vitro se trataron con termoterapia a 42°C por lapsos de tiempo diferentes. Las plantas originales (sin tratamiento) presentaban 3 virus: el virus del mosaico del Cymbidium (CyMV), el virus de la mancha anillada de Odontoglossum (ORSV) y el virus del mosaico del tabaco (TMV). Tanto el control como los cuatro tratamientos resultaron positivos para los tres virus después de los tratamientos.

III.2. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

A. Diagnóstico de enfermedades virales.

Se analizaron un total de 180 orquídeas provenientes de 6 cultivares, los resultados de las pruebas de ELISA se muestran en el cuadro No. 1. Los virus analizados fueron los siguientes: virus del mosaico del Cymbidium (CyMV), el virus de la mancha anillada de Odontoglossum (ORSV), el virus del bronceado del tomate (TSWV), el virus del mosaico del pepino (CMV), el virus del mosaico del tabaco (TMV) y Potyvirus (Poty).

La identidad de los cultivares se mantuvo secreta para no afectar a los cultivares en cuestión. De los 6 cultivares visitados, únicamente dos se encontraron libres de virus. Los otros 4 cultivares presentaron plantas infectadas con 2 o 3 de los siguientes virus: el virus del mosaico del Cymbidium (CyMV), el virus de la mancha anillada de Odontoglossum (ORSV) y el virus del mosaico del tabaco (TMV).

Este hallazgo es muy importante porque no se encontraron virus transmitidos por vectores. Todos los encontrados son transmitidos mecánicamente. Esto implica que probablemente lo que tienen que hacer los cultivares para mejorar la situación de sus plantas es incrementar el cuidado en sus medidas de higiene. Estos virus son transmitidos por el manejo de las plantas, por ejemplo, durante el corte de la flor puede haber contacto con las manos de la savia de la planta y si toca otra planta inmediatamente y también posee o se le hace una herida, la savia presente en las manos en este caso puede contaminar la segunda planta. Lo mismo ocurre con las herramientas y algunas veces con la vestimenta. Se recomienda que durante toda la manipulación de las plantas y con todo lo que se manipulen éstas se vigile que esté desinfectado. Esto se puede hacer con hipoclorito de sodio al 10% o hipoclorito de calcio al 3% o con cualquier otro desinfectante que inactive virus, hasta con agua y jabón pero se necesita lavar a conciencia la herramienta o las manos. No se deben tocar dos plantas seguidas sin lavarse o desinfectarse las manos.

En todos los cultivares se escogió plantas que presentaban algún tipo de sintomatología. Se observó, manchas anilladas en las hojas, manchas cloróticas, manchas necróticas o deformaciones. En base a la sintomatología presentada principalmente en las hojas se tomaron las muestras. No todas las orquídeas de los cultivares fueron analizadas, por lo tanto no puede establecerse un porcentaje de infección en cada cultivar. Sin embargo, sí pudo establecerse la presencia de virus en los cultivares, basándose en la sintomatología de las plantas.

Existió un 80.11% de plantas que también presentaban la sintomatología descrita anteriormente pero no presentaron presencia de ninguno de los virus analizados. Esto puede deberse a faltas nutricionales, lumínicas, quemaduras por fertilizantes foliares, pesticidas, presencia de alguna plaga como hongos o bacterias o presencia de algún otro virus que no se haya tomado en cuenta en este proyecto. Así mismo, es también probable que existan orquídeas que no presentaran sintomatología obvia pero que se encuentren infectadas. Para ello sería recomendable que se realizara un análisis completo de cada cultivar y así apartar todas las plantas con virus para no afectar a las plantas limpias. Se recomienda entonces apartar o aislar las plantas con virus para

minimizar el riesgo para las plantas limpias. Así mismo, se recomienda nunca utilizar las tijeras de podar y cualquier otro utensilio sin antes haberlo desinfectado con cloro o algún desinfectante anti-viral comercial como se dijo anteriormente; aun cuando no se observe ninguna sintomatología. Esta debe ser una práctica de rutina en cualquier situación (Wisler 1989). La práctica de tener un lugar para cuarentena es muy recomendable porque es allí en donde se pueden colocar las plantas sospechosas de enfermedades o bien las plantas enfermas mientras se les aplique la termoterapia o hidroterapia.

Debido a que más de la mitad de los cultivares tienen presencia de virus, es de gran importancia que los cultivadores estén al tanto de la sintomatología de los virus encontrados y de cómo pueden comprobar su presencia. La sintomatología observada (ver cuadro No. 1) es, en términos generales, líneas cloróticas en presencia del virus del mosaico del Cymbidium (CyMV) y manchas cloróticas en presencia del virus de la mancha anillada de Odontoglossum (ORSV). La sintomatología de las combinaciones de 2 o 3 virus y del virus del mosaico del tabaco (TMV) es la combinación de las sintomatologías anteriores, líneas cloróticas y manchas cloróticas. En el anexo 4 se encuentran las fotografías de los síntomas de las plantas que se analizaron.

El virus encontrado más comúnmente (ver figura 17) fue el virus del mosaico del Cymbidium (CyMV) con un porcentaje de 61.11 %. El estudio de este virus específicamente es importante para saber qué medidas utilizar para no seguir propagándolo. El virus del Cymbidium (CyMV) es un virus que no tiene un vector conocido y su transmisión es mecánica. Además, los otros dos virus encontrados en menor porcentaje son también transmitidos mecánicamente, el ORSV y el TMV. La presencia de TMV puede indicar que en el manejo de las plantas de orquídeas está involucrado o involucrada una persona fumadora. Este virus es un virus muy estable que puede transmitirse si un fumador toca una planta herida sin desinfectarse antes o si toca una herramienta y ésta corta la planta sin que se haya desinfectado antes. Es más, se ha encontrado que algunos periódicos con los que se tapan a las flores a veces para evitar el sol o para cualquier actividad que se realice en el invernadero, han sido encontrados infectados con TMV al hacerles una prueba. Esto da idea de lo estables que son estos virus.

Para evitar la infección por estos virus expusimos que es importante la higiene en la manipulación de las plantas. Un estudio llevado a cabo por Hu et al. (1994), establece que efectivamente la higiene es de extremada importancia para evitar la presencia de estos virus en el invernadero. En este estudio comprobaron que compuestos como leche descremada a una concentración mínima del 30% y etanol al 80% fueron efectivos en evitar la infección por CyMV y ORSV en invernaderos cuando se trataba de hospederos que manifestaban síntomas locales del virus. Sin embargo, con virus que presentan síntomas sistémicos no fueron efectivos. Por esto, se hicieron estudios con orquídeas que presentaron infecciones sistémicas por estos virus y llegaron a la conclusión que NaOH a una concentración del 1%y cloro inactivaban al virus y no permitían la transmisión de estos dos virus a las plantas. Además, se evidenció que NaOH a esa concentración no causa daño fitotóxicos en las plantas. La recomendación fue de usarlo en la desinfección de herramientas y en la higiene del invernadero. Physan no fue efectivo para hospederos con infección sistémica aunque para infecciones locales sí. Este estudio se hizo en Hawaii y demostró que la higiene y la elección del desinfectante adecuado son clave para invernaderos libres de estos virus.

B. Terapias de limpieza de virus

Luego del diagnóstico de presencia de virus, se procedió a colectar las plantas infectadas. Se recogió un total de 24 plantas infectadas pertenecientes a 3 cultivares. Estas plantas fueron trasladadas al invernadero de la Universidad del Valle de Guatemala. Las plantas grandes se separaron en dos o tres segmentos para propagarlas y tener más material para realizar las pruebas. Sin embargo, en el proceso de aclimatación se perdieron algunas plantas que no resistieron la separación. Las plantas que se sometieron a tratamiento fueron aquellas que se encontraban bien establecidas. Las plantas que se observaron débiles no se utilizaron ya que los tratamientos son bastante agresivos y podían matarla. Para el tratamiento de cultivo de meristemos se escogió una planta del género Epidendrum ya que este género presenta hojas alternas, no basales, y por lo tanto se pueden obtener varios meristemos de una planta. A diferencia del resto de géneros donde únicamente podemos obtener un meristemo basal de cada planta.

a) Hidroterapia

Se trató un total de 10 plantas infectadas con hidroterapia. Las plantas tratadas mostraron signos de quemadura luego del tratamiento, como el amarillamiento de las hojas y ablandamiento de los tejidos. Las plantas fueron llevadas nuevamente a invernadero para su aclimatación. Se tomó muestras para ELISA de los tejidos verdes, es decir tejidos vivos.

Con este método únicamente se logró limpiar una planta. Por lo tanto, el porcentaje de limpieza de este método es del 10%. Cabe mencionar que la planta que se limpió solamente tenía un virus - virus del mosaico del Cymbidium (CyMV).

La efectividad de este método es baja y los daños a las plantas son muy fuertes. Algunas de las plantas fueron dañadas a tal grado que murieron en el invernadero. Por lo tanto, el método no se recomienda como método de desinfección o limpieza de virus en orquídeas utilizando las mismas condiciones que en este estudio. Se cree que se debe probar con temperaturas más altas pero por tiempos más cortos porque así el efecto puede ser drástico pero por corto tiempo quizá no afecte tanto a la planta.

Finalmente, se comprobó la presencia de otros virus en dos plantas que no tenían reportado el virus en el diagnóstico. Lo más probable es que estas dos plantas hayan adquirido la concentración adecuada para la detección de este virus en el lapso de tiempo entre el primer diagnóstico y la extracción de las plantas de los cultivares o bien en el lapso de separación de las plantas para obtener réplicas. Otra posible razón puede ser que como el virus no se distribuye de manera igual por toda la planta, se haya muestreado tejido sin virus y que la segunda vez ya el tiempo que pasó entre estas dos evaluaciones haya permitido que toda la planta se infectara con virus y se haya podido detectar. Hu et al. (1994) reportan que se distribuye de acuerdo al diagrama que se presenta en la figura 18. En esta figura se puede observar que no todas las hojas presentan al virus al inicio de la infección y que hasta de por lo menos un mes o mes y medio la infección está en toda la planta.

Figura 18. Movimiento del virus del mosaico del Cymbidium (CyMV) en híbridos de Dendrobium infectados.

Fuente: Hu et al. 1994.

b) Termoterapia

Se trató un total de 10 plantas con este método; sin embargo, dos de éstas murieron en el tratamiento y es por ello que en el cuadro 6 únicamente se presentan 8. En este tratamiento no se logró limpiar ninguna planta, todas resultaron positivas después del tratamiento.

El porcentaje de decesos durante el tratamiento fue del 20%, siendo este tratamiento más agresivo que la hidroterapia. Sin embargo, la recuperación de las plantas que sobreviven a esta terapia es mejor que las que sobreviven a la hidroterapia.

De igual manera que la hidroterapia, en la termoterapia tampoco las temperaturas y tiempos utilizados en este estudio se recomiendan para la eliminación de virus, ya que éstos persisten, en todos los casos, luego de la terapia. Se recomienda hacer pruebas con temperaturas más altas pero con tiempos cortos para tratar de dañar menos a la planta.

Nuevamente se confirma la presencia de nuevos virus en las dos mismas plantas que en la hidroterapia. Esto confirma que el virus fue adquirido antes de la separación de la planta original pero no se había distribuido completamente en la planta.

c) Cultivo de meristemos

En este proyecto se utilizó como método de desinfección el cultivo de meristemos. Esto se hizo porque se ha reportado la limpieza de virus por medio de este método en otros cultivos y como se explicó con anterioridad, el virus se replica y se mueve más lentamente que la división celular.

Se utilizó plantas de Epidendrum debido a que éste presenta hojas a lo largo del tallo, no todas basales. De esta manera se extrajo el meristemo de cada nudo foliar. Los otros géneros disponibles de plantas infectadas eran Encyclia, Cattleya, Phalenopsis y Oncidium. Todos estos géneros tienen hojas basales por lo que la disponibilidad de meristemos es menor, por lo que la cantidad de plántulas que podríamos obtener de cada planta adulta es muy pequeña. Es por ello que se decidió trabajar con el género Epidendrum.

Se logró establecer plantas obtenidas de cultivo de meristemos. A estas plantas se les corrió la prueba ELISA y nuevamente resultaron positivas para los virus presentados antes de su cultivo, el virus del mosaico del Cymbidium (CyMV) y el virus de la mancha anillada de Odontoglossum (ORSV).

Por lo tanto, este método tampoco es efectivo para la limpieza de virus en orquídeas. Probablemente hay que tratar de hacer los meristemos más pequeños aún pero no se sabe si podrán aún reproducirse.

d) Termoterapia luego del cultivo de meristemos

Debido a que no se obtuvieron los resultados deseados en las plantas tratadas con cualquiera de las tres terapias anteriores, se decidió realizar la combinación de dos métodos, el cultivo de meristemos y la termoterapia. Las plantas introducidas a cultivo in vitro fueron meristemadas y reproducidas. De esta manera se obtuvo un lote de 30 plantas a las cuales se les realizó una prueba ELISA antes de realizar la termoterapia. De esta manera se comprobó la presencia de los tres virus encontrados a lo largo de este proyecto.

Se dividieron las plantas en cinco lotes o grupos para realizar cinco tratamientos de termoterapia y ver si alguno era eficaz para la limpieza de virus. El tratamiento más prolongado duraba 2 días (48 horas) a 42°C. No se realizó ningún tratamiento con tiempo mayor o temperatura mayor ya que las tasas de mortandad de las orquídeas son muy elevadas. La tasa de mortandad a 42°C y 48 horas fue del 33 % (2 de las 6 plantas tratadas murieron en la terapia y las cuatro que sobrevivieron a la terapia se vieron muy afectadas (la mayoría de hojas fenecieron).

Para todos los tratamientos de esta terapia, los resultados de la prueba ELISA muestran que todas las plantas (tratadas y control) permanecieron positivas (ver cuadro No. 8). Por lo tanto, al igual que las terapias individuales, el tratamiento de cultivo de tejidos seguido de termoterapia a 42°C no eliminó los virus en orquídeas y no es un método efectivo el la limpieza de virus.

Esta combinación de técnicas no fue muy eficiente pero últimamente se han reportado otras técnicas como quimioterapia con Ribavirin y electroterapia así como combinaciones de técnicas. Mahmoud et al. (2009) reportó para eliminación del virus PVY en papa, tratamientos de doble ciclo de termoterapia, quimioterapia, electroterapia y su combinación. Reportó que el primer ciclo que se proporcionó de termoterapia a plantas de papa fue realmente desalentador ya que como muestra la figura 19, únicamente se obtuvo un 2 % de plantas libres de virus. Pero, a estas plantas se les hizo cortes para sembrarlos, se sometieron a nueva termoterapia y se reprodujeron 35% de los cuales el 30% aproximadamente estaba libre de virus (PVY). Sin embargo, con el uso de técnicas como quimioterapia y electroterapia se obtuvieron mejores resultados. Esto sería muy interesante evaluarlo porque las orquídeas son bastante susceptibles a tratamientos fuertes.

Figura 19. Efecto de la termoterapia para la eliminación de PVY.

Fuente: Mahmoud et al. 2009. a) Dos plantas de 6 que sobrevivieron al tratamiento resultaron libres de virus y 4 se mantuvieron infectadas. b) Treinta y cinco plantas resultaron después de la segunda termoterapia a las plantas que se mantuvieron infectadas pero 30 se comprobó que estaban libres de virus.

PARTE IV

IV.1. CONCLUSIONES

 No se logró implementar una metodología que permitiera eliminar las infecciones virales en orquídeas, únicamente para plántulas infectadas por 1 virus y no para infecciones mixtas.

 Se encontró que, por el método de ELISA, se pudo determinar que el 20% (36 plantas infectadas de 180 plantas analizadas) de todas las plantas analizadas estaban infectadas con uno o más virus.

 Ninguna de las terapias realizadas (hidroterapia, termoterapia, cultivo de meristemos y combinación de cultivo de meristemos y termoterapia) fueron efectivas para la limpieza de virus en orquídeas.

 La extracción de meristemos se llevó a cabo con eficiencia ya que pudimos obtener varias plántulas de Epidendrum de los mismos.

 El cultivo in vitro de orquídeas no fue efectivo para limpiar las plantas de virus, todas resultaron tener los mismos virus al reproducirse de los meristemos.

 Únicamente una planta fue limpiada por medio de hidroterapia y ésta no presentaba infección mixta, solamente la presencia de 1 virus, CyMV.

 La sintomatología observada es: líneas cloróticas en presencia del virus del mosaico del Cymbidium (CyMV) y manchas cloróticas en presencia del virus de la mancha anillada de Odontoglossum (ORSV).

 La hipótesis sobre la eficiencia de la hidroterapia sobre la termoterapia no se pudo comprobar, por lo que no se rechaza la hipótesis alterna 1 aunque en un caso se logró obtener una planta libre de virus por esta técnica a diferencia de la termoterapia. Se acepta la hipótesis nula que establece que ninguno de los dos métodos (hidroterapia o termoterapia) son eficaces en la limpieza de virus de orquídeas cultivadas.

 La segunda hipótesis alterna se rechaza también, aceptando la hipótesis nula porque ninguno de los dos métodos fue efectivo para limpieza de virus en orquídeas.

IV.2. RECOMENDACIONES

 Realizar más pruebas de terapias, variando las temperaturas, los tiempos de duración y las combinaciones de las diferentes terapias, a fin de obtener un tratamiento efectivo en la eliminación de virus en orquídeas.

 Evaluar diferentes tamaños de meristemos para determinar el idóneo para la eliminación de virus de las diferentes variedades de orquídeas.

 Realizar un estudio en invernadero para determinar cuál es el efecto de estos tratamientos en orquídeas de diferentes especies infectadas por un virus o infectadas por combinaciones de los mismos.

 Combinar la técnica de termoterapia con quimioterapia o electroterapia o evaluar las otras dos técnicas y estimar su eficiencia.

 Tratar de monitorear las temperaturas tanto de la cámara de termoterapia como de la de hidroterapia para determinar la distribución real de las temperaturas en estas cámaras y estar seguros que la planta o el meristemo esté sometido a la temperatura que se quiere.

 Realizar en los cultivares un análisis de todas las orquídeas para determinar si los cultivares son libres de virus y así poder aislar las plantas infectadas y evitar contagios.

 Informar a todos los cultivadores sobre la incidencia de virus en orquídeas y dar a conocer los probables síntomas de los virus encontrados.

IV.3. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICA

Albouy, J.; Flouzat C.; Kusiak C. y Tronchet M.. (1988). Eradication of orchid viruses by chemotherapy from in-vitro cultures of Cymbidium. Acta hort. (ishs) 234:413- 420. http://www.actahort.org/books/234/234_49.htm

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ANEXOS

IV.4. ANEXOS

ANEXO No. 1: METODOLOGÍA DE ELISA DIRECTO FOSFATASA ALCALINA

Anticuerpo de cobertura (para 96 pozos) En un beaker colocar: 10 ml de buffer de cobertura 50 l de anticuerpo (Agdia) Agitar por aproximadamente 10 minutos Agregar 100 l a cada pozo, cubrir con tape Incubar en cámara húmeda por 4 horas o toda la noche a 4°C.

Preparación de muestras Todas las muestras se trabajan en duplicado. Se puede trabajar 46 muestras máximo, más los controles negativo y positivo. En un tubo: pesar 0.1 g de cada muestra agregar 1.0 ml de buffer de extracción directo macerar (entre cada muestra lavar el macerador con cloro al 10% y luego con agua destilada)

Lavado de la placa Se utiliza el lavador de placas automático BIORAD ImmunoWash modelo 1575. Se emplea PBST como solución de lavado.

Colocación de muestras Colocar en dos pozos buffer de extracción directo, lo cual servirá de blanco. Realizar el mapa en duplicado Colocar control positivo de Agdia (si no hay control positivo de Agdia puede colocar muestra de una hoja infectada) Colocar control negativo de Agdia (si no hay control negativo de Agdia puede colocar muestra de una hoja no infectada) Colocar 100 l de cada muestra en el pozo respectivo y en duplicado Cubrir con tape Incubar 2 horas en cámara húmeda a temperatura ambiente o toda la noche a 4°C

Lavado de placa Véase paso 3.

Anticuerpo conjugado En un beaker colocar (para los 96 pozos): 10 ml de buffer de conjugado 50 l de anticuerpo conjugado Agitar por 10 minutos Agregar 100 l a cada pozo, cubrir con tape Incubar en cámara húmeda por 2 horas a temperatura ambiente

Lavado de placa Véase paso 3

Sustrato En un beaker colocar: 10 ml de buffer de dietanolamina 1M, pH 9.8, MgCl2 0.5 mM Evitar que el beaker esté expuesto a la luz (cubrirlo con papel aluminio) 2 pastillas de sustrato (p-nitrofenilfosfato) Agregar 100 l a cada pozo Colocar en cámara oscura

Lectura de placa Se hacen dos lecturas (una hora y dos horas después de agregado el sustrato) a 405 nm

Fin de la reacción Agregue 50 l de NaOH 3M (opcional)

ANEXO No. 2: METODOLOGÍA DE ELISA INDIRECTO FOSFATASA ALCALINA

Preparación de muestras Todas las muestras se trabajan en duplicado. Se puede trabajar 46 muestras máximo, más los controles negativo y positivo. En un tubo: pesar 0.1 g de cada muestra agregar 1.0 ml de buffer de extracción indirecto macerar (entre cada muestra lavar el macerador con cloro al 10% y luego con agua destilada)

Lavado de la placa Remover el tape Vaciar la placa (sacudiéndola fuerte pero no bruscamente sobre el lavadero) Agregar PBST como solución de lavado Se deja 3 minutos entre cada lavado, esto se hace 2 veces Se sacude y se seca somatando sobre servilletas hasta que quede bien seca

Anticuerpo (para 96 pozos) En un beaker colocar: 10 ml de buffer de conjugado 50 l de anticuerpo (Agdia) Agitar por aproximadamente 10 minutos Agregar 100 l a cada pozo, cubrir con tape Incubar en cámara húmeda por 2 horas o toda la noche a 4°C.

Lavado de placa Véase paso 3.

Conjugado En un beaker colocar (para los 96 pozos): 10 ml de buffer de conjugado 50 l de anticuerpo conjugado Agitar por 10 minutos Agregar 100 l a cada pozo, cubrir con tape Incubar en cámara húmeda por 1 hora a temperatura ambiente

Lavado de placa Véase paso 3

Lectura de placa Se hacen dos lecturas (una hora y hora y media después de agregado el sustrato) a 405 nm

Fin de la reacción Agregue 50 l de NaOH 3M (opcional)

ANEXO 3. Resultados de presencia de 6 virus en las 180 orquídeas analizadas.

No. Género Especie ORSV TSWV TMV CMV CymMV Poty 1 Arpophyllum Giganteum Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 2 Trichopilia Tortilis Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 3 Epidendrum Verrucosum Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 4 Encyclia Tuerckheimii Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 5 Stanhopea Oculata Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 6 Coelia Suburbans Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 7 Brassia Verrucosa Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 8 Coelia macrostachya Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 9 Oncidium Sphacelatum Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 10 Trichopilia Tortilis Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 11 Oncidium ornithorhynchum Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 12 Lycaste Sp Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 13 Cattleya Skinneri Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 14 Cattleya Bowringiana Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 15 Cattleya Aurantiaca Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 16 Encyclia Cordigera Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 17 Encyclia Belizensis Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 18 Encyclia Ceratistes Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 19 Encyclia Alata Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 20 Encyclia Alata Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 21 Encyclia Cordigera Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 22 Encyclia Alata Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 23 Laelia Autumnalis Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 24 Oncidium cavendishianum Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 25 Phalenopsis Híbrido Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 26 Phalenopsis Híbrido Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 27 Phalenopsis Híbrido Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 28 Sin ID Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 29 Sin ID Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 30 Sin ID Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 31 Sin ID Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 32 Sin ID Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 33 Sin ID Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 34 Sin ID Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 35 Sin ID Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 36 Sin ID Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 37 Sin ID Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 38 Encyclia cordigera Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 39 Trigonidium Sp Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 40 Stanhopea Sp Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 41 Oncidium leucochilum Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 42 Pleurothallis sp1 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 43 Pleurothallis inmersa Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo 44 Rhynchostele sp1 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 45 Rhynchostele sp2 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 46 Phalenopsis dontis Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo 47 Phalenopsis dontis Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo 48 Phragmipedium Sp Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 49 Paphio insigne Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo 50 Oncidium sphacelatum Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo 51 Pleurothallis sp2 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 52 Sin ID miniatura Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 53 Pleurothallis sp3 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 54 Oncidium sp1 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 55 Dendrobium híbrido Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 56 Sin ID Kisses Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 57 Oncidium ornithorhynchum Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 58 Sobralia Sp Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 59 Oncidium sp2 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 60 Epidendrum arbuscula Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 61 Encyclia panthera Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 51

62 Lycaste cochleata Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo 63 Encyclia ochracea Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 64 Lemboglossum Sp Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo Negativo 65 Encyclia Sp Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo 66 Brassia maculata hibrido Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 67 Sin ID jardín Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 68 Rossioglossum williamsianum Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo 69 Vanda Sp Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 70 Encyclia cochleata Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 71 Epidendrum ciliare Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 72 Oncidium maculatum Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 73 Maxilaria anceps Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 74 Cattleya híbrido Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo 75 Encyclia phoenicia Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 76 Cattleya guatemalensis Positivo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo 77 Cattleya portia-cerula Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo 78 Cattleya loving Bankok Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 79 Oncidium leucochilum Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 80 Brassia maculata hibrido Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 81 Oncidium cherry baby Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 82 Brassia híbrido Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 83 Epidendrum X obrienianum Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo 84 Cymbidium sp1 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 85 Colmanara Wildcat Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 86 Epidendrum híbrido Positivo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo 87 Epidendrum amarillo Positivo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo 88 Epidendrum morado Positivo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo 89 Epidendrum radicans Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 90 Ascocenda Judy Paige Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo 91 Ascocenda Suksamram Beauty Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo 92 Vascostilis Pine rivers Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo 93 Mokara Rora Alsahof Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo 94 Cytopodium punctatum Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 95 Cymbidium sp2 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 96 Vanda tricolor Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo 97 Encyclia selligera Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 98 Encyclia cordigera Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 99 Brassia maculata Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 100 Stelis Sp Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 101 Elleanthus cynarocephalus Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 102 Dendrobium nobilis Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 103 Sobralia decora Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 104 Osmoglossum pulchellum Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo Negativo 105 Epidendrum cnemidophorum Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 106 Dendrobium Sp Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 107 Oncidium Grower Ramsey Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 108 Miltonia spectabilis Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 109 Encyclia papilosa Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 110 Cattleya sp. Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 111 Phalenopsis fulcra Positivo Negativo Positivo Negativo Positivo Negativo 112 Brassia verrucosa Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 113 VLC híbrido Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 114 Pleurothallis tuerckheimii Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 115 Cattleya ocracea x rex Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 116 Cattleya híbrido Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo 117 Huntleya burtii Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 118 Oncidium Jiuhboa-Gold Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 119 Lockhartia oerstedii Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 120 Stelis Sp Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 121 Coelia macrostachya Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 122 Ponera glomerata Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 123 Brassia verrucosa Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 124 Trichopilia tortilis Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 125 Arpophyllum giganteum Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

126 Oncidium ornithorhynchum Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 127 Sin ID Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 128 Epidendrum polyanthum Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 129 Epidendrum ciliare Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 130 Sin ID Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 131 Isochilus Sp Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 132 Oncidium ornithorhynchum Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 133 Maxilaria teniufolia Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 134 Maxilaria Sp Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 135 Encyclia Sp Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 136 Oncidium leucochilum Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 137 Cattleya aurantiaca Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 138 Oncidium leucochilum Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 139 Oncidium leucochilum Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 140 Sin ID Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 141 Sin ID Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 142 Sin ID Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 143 Sin ID Positivo Negativo Positivo Negativo Positivo Negativo 144 Sin ID Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 145 Cattleya híbrida Negativo Negativo Positivo Negativo Positivo Negativo 146 Trichopilia tortilis Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo chindavat x 147 Vanda coerulea Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 148 Vanda Azul Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 149 Cattleya guatemalensis Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 150 Oncidium olorosa Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 151 Ascocenda John De Biase Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Warszewiczianu 152 Phragmipedium m Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 153 Dendrobium Ekapole Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 154 Dendrobium Ekapole 2 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 155 Phalenopsis No. 1 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 156 Phalenopsis No. 2 Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 157 Cattleya White Diamond Positivo Negativo Positivo Negativo Positivo Negativo 158 Oncidium Sweet sugar Positivo Negativo Positivo Negativo Positivo Negativo 159 Sin ID Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 160 Sin ID Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 161 Sin ID Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 162 Sin ID Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 163 Sin ID Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 164 Sin ID Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 165 Sin ID Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 166 Sin ID Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 167 Sin ID Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 168 Sin ID Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 169 Sin ID Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 170 Sin ID Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 171 Sin ID Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo Negativo 172 Sin ID Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 173 Sin ID Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 174 Sin ID Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 175 Sin ID Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 176 Sin ID Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 177 Sin ID Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 178 Sin ID Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 179 Sin ID Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 180 Sin ID Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo

TOTAL 15 0 8 0 26 0 TOTAL DE PLANTAS INFECTADAS 36

ANEXO 4. Fotografías de los síntomas más comunes presentados por las orquídeas infectadas por virus (muestras positivas en los análisis).

CymMV CymMV CymMV Síntomas: líneas cloróticas Síntomas: líneas cloróticas y Síntomas: líneas cloróticas manchas necróticas

CymMV ORSV TMV Síntomas: líneas clorótricas, Síntomas: manchas cloróticas Síntomas: manchas y líneas cloróticas manchas cloróticas evidentes y manchas necróticas.

CymMV CymMV CymMV Síntomas: líneas cloróticas Síntomas: líneas cloróticas y Síntomas: líneas cloróticas manchas cloróticas

CymMV ORSV y CymMV ORSV y CymMV Síntomas: líneas cloróticas Síntomas: líneas y manchas Síntomas: líneas y manchas cloróticas cloróticas

ORSV y CymMV CymMV CymMV Síntomas: líneas y manchas Síntomas: manchas y líneas Síntomas: líneas cloróticas cloróticas cloróticas

CymMV CymMV TMV Síntomas: líneas cloróticas y Síntomas: líneas cloróticas Síntomas: líneas cloróticas manchas necróticas

ORSV, CymMV, TMV CymMV ORSV, TMV Síntomas: líneas clorótricas, Síntomas: líneas clorótricas, Síntomas: líneas clorótricas, manchas manchas cloróticas y manchas manchas cloróticas y manchas cloróticas y manchas necróticas. necróticas. necróticas.

CymMV CymMV ORSV, CymMV, TMV Síntomas: líneas cloróticas y Síntomas: líneas cloróticas Síntomas: líneas clorótricas, manchas manchas necróticas cloróticas y manchas necróticas. FODECYT 067-2007

PARTE V

VI. 1. INFORME FINANCIERO

AD-R-0013 QUINCEAVA CONVOCATORIA LINEA FODECYT

Nombre del Proyecto: EVALUACIÓN DE MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN Y LIMPIEZA DE VIRUS EN ORQUÍDEAS CULTIVADAS Numero del Proyecto: 067-2007 Investigador Principal: LICDA. SARA BARRIOS Monto Autorizado: Q73,969.50 Plazo en meses 12 MESES Fecha de Inicio y Finalización: 01/03/2008 al 28/02/2009 PRÓRROGA AL 31/12/2009 TRANSFERENCIA En Ejecuciòn Asignacion Grupo Renglon Nombre del Gasto Menos (-) Mas (+) Pendiente de Presupuestaria Ejecutado Ejecutar 1 Servicios No Personales 122 Impresión, encuadernación y reproducción Q 1,500.00 Q 1,500.00 133 Viáticos en el interior Q 600.00 Q 600.00 Estudios,investigacionesy proyectos de 181 factibilidad Q 30,000.00 Q 22,500.00 Q 7,500.00 Estudios,investigacionesy proyectos de 181 factibilidad (Evaluación Externa de Impacto) Q 8,000.00 Q 8,000.00 2 Materiales y Suministros 241 Papel de escritorio Q 140.00 Q 140.00 243 Productos de papel o cartón Q 100.00 Q 100.00 244 Otros productos de papel, cartón e impresos Q 100.00 Q 100.00 261 Elementos y compuestos químicos Q 100.00 Q 100.00 262 Combustibles y Lubricantes Q 750.00 Q 750.00 267 Tintes, pinturas y colorantes Q 560.00 Q 560.00 268 Productos plásticos nylon, vinil y pvc Q 100.00 Q 100.00 269 Otros productos químicos y conexos Q 25,000.00 Q 23,230.90 Q 1,769.10 291 Útiles de oficina Q 200.00 Q 200.00 299 Otros materiales y suministros Q 95.00 Q 95.00 3 Propiedad, planta y equipo 9 Asignaciones Globales (-) Gastos Administrativos (10%) Q 6,724.50 Q 6,724.50 Q -

TOTAL Q 73,969.50 Q 52,455.40 Q 21,514.10

Monto Autorizado Q 73,969.50 Disponibilidad: Q 21,514.10 ( -) Ejecutado Q 52,455.40 Sub-total Q 21,514.10 ( -) Apertura de Caja Chica Q - Total por Ejecutar Q 21,514.10