Molekulární a Buněčná Biologie, Genetika a Virologie 4XMGV
Total Page：16
File Type：pdf, Size：1020Kb
Univerzita Karlova Přírodovědecká fakulta Studijní program: Molekulární a buněčná biologie, genetika a virologie 4XMGVP Mgr. Kateřina Hoňková Využití „omics“ metod v molekulárně-epidemiologické studii novorozenců z různých lokalit České republiky The use of „omics“ methods in molecular-epidemiologic study in newborns from different localities of the Czech Republic Typ závěrečné práce: Disertační práce Školitel: RNDr. Pavel Rössner Jr, Ph.D. Ústav experimentální medicíny AV ČR, v.v.i. Praha, 2021 PROHLÁŠENÍ: Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci zpracovala samostatně a že jsem uvedla všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce, ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu. V Praze, dne ________________ ___________________ Mgr. Kateřina Hoňková PODĚKOVÁNÍ Na tomto místě bych chtěla poděkovat několika osobnostem, které stály u zrodu, průběhu i finále této práce. Mé nejdůležitější poděkování patří RNDr. Pavlu Rössnerovi, Jr., PhD., který v posledních letech vedl tuto práci. Děkuji především za jeho cenné připomínky, odborné rady v oboru genové exprese a konzultace, díky kterým práce postupně získávala směr a mohla být dokončena v této podobě. Musím rovněž poděkovat i za jeho trpělivost v období, kdy pro mě bylo psaní práce nejnáročnější. Má činnost a zaměření v oboru molekulární epidemiologie a genetické toxikologie započaly díky MUDr. Radimu J. Šrámovi, DrSc., kterému hluboce vděčím za laskavou možnost stát se součástí projektu „Vliv znečištění ovzduší na genom novorozenců (G-NEW)“ a později i projektu „Ovlivnění novorozenců prostředím“ (Strategie AV 21 – QUALITAS). Přijetím na pozici PhD. studenta na tehdejší Oddělení genetické ekotoxikologie ÚEM AV ČR, v.v.i. jsem mohla být o krok blíž k mému celoživotnímu snu: stát se vědcem. MUDr. Radimu J. Šrámovi, DrSc. vděčím zejména za vytvoření výborného pracovního zázemí, podporu při získávání dalšího vzdělávání a možnosti se účastnit významných zahraničních konferencí. V náročních laboratorních začátcích mě provázela Mgr. Andrea Rössnerová, PhD., která se mi trpělivě věnovala a které vděčím zejména za získání kritického myšlení. Děkuji jí za prohlubování motivace pro vědecké bádání v biologii, neboť vždy dokázala nalézt význam dosažených výsledků i tam, kde nebyl na první pohled patrný. Její nedocenitelné odborné rady byly pro mě pilíři, na kterých jsem stavěla postupy zpracování dat. Spolupráce s Mgr. Andreou Rössnerovou, PhD. si hluboce vážím i v současné době na řadě dalších projektů. Mé obrovské poděkování patří současnému vedoucímu Oddělení genetické toxikologie a epigenetiky ÚEM AV ČR, v.v.i. Ing. Janu Topinkovi, CSc., DSc., který se zasloužil o dokonalé zázemí pro mou navazující vědeckou práci a díky němuž jsem se mohla zapojit do mnoha zajímavých projektů, účastnit se prestižních konferencí a zahraničních kurzů, které mě naučily nezbytným základům náročné bioinformatické práce s velkoobjemovými daty. Mé hluboké poděkování patří také za jeho lidskou a vlídnou komunikaci při vedení oddělení, na kterou nikdy nezapomenu. Významné rady k disertační práci, její struktuře a obsahu jsem získala díky pečlivým připomínkám Ing. Hany Barošové, PhD. Z rad, za které jí velmi děkuji, jsem si odnesla mnoho cenných poznatků, které mi utkvěly v paměti i pro další publikační činnost. Srdečné poděkování patří také mým kolegyňkám z kanceláře, jmenovitě Mgr. Ing. Táni Závodné, PhD. a Mgr. Tereze Červené, které mě v nejnáročnějším období psychicky podporovaly, a jejichž přátelství si nesmírně vážím. Je pro mě velkou ctí, že mohu pracovat po lidské stránce s tak empatickými a po odborné stránce inspirativními osobnostmi. Mému kolegovi Mgr. Antonínu Ambrožovi, PhD. děkuji také za mnoho rad, kterými mi velmi ulehčil starost s náležitostmi k formalitám disertační práce. V poslední řadě mé poděkování patří mému partnerovi, který mi během sepisování disertační práce pravidelně připravoval obědy a večeře, abych během dlouhých hodin, kdy mi psaní zrovna nejlépe šlo, nemusela opouštět klávesnici u počítače. Děkuji mu také za projev trpělivosti a pochopení pro mou vědeckou práci, kterou mám velmi ráda, a proto jsem nebyla vždy ochotna nalézt dostatek času pro osobní život. Obsah Seznam zkratek ......................................................................................................................................... 7 Seznam genů ............................................................................................................................................. 9 Abstrakt .................................................................................................................................................. 10 Abstract .................................................................................................................................................. 12 Úvod ....................................................................................................................................................... 14 Znečištěné ovzduší .................................................................................................................................... 15 Studované lokality České republiky ...................................................................................................... 18 Vybrané „omics“ metody v molekulární epidemiologii ............................................................................. 25 Celogenomová genová exprese ............................................................................................................ 26 Metylace DNA ....................................................................................................................................... 27 Exprese miRNA ...................................................................................................................................... 29 Záměr disertační práce............................................................................................................................ 32 Cíle ............................................................................................................................................................. 34 Metodika ................................................................................................................................................ 35 Studované subjekty a rozdělení studií....................................................................................................... 35 Měření koncentrací látek ve vnějším ovzduší ........................................................................................... 37 Biologický materiál .................................................................................................................................... 37 Studie 1 - Zpracování RNA ..................................................................................................................... 37 Studie 2 - Zpracování DNA .................................................................................................................... 38 Studie 3 - Zpracování miRNA ................................................................................................................. 38 Statistická analýza ..................................................................................................................................... 39 Studie 1 - Analýza celogenomové genové exprese ............................................................................... 39 Studie 2 - Analýza genově-specifické metylace DNA ............................................................................ 40 Studie 3 - Analýza exprese miRNA ........................................................................................................ 41 Výsledky ................................................................................................................................................. 42 Charakteristika subjektů ............................................................................................................................ 42 Hodnocení znečištění ovzduší ................................................................................................................... 46 Studie 1 - Hodnocení diferenciálně exprimovaných genů ......................................................................... 50 Studie 2 - Hodnocení genově-specifické metylace DNA ........................................................................... 55 Studie 3 - Hodnocení diferenciální exprese miRNA................................................................................... 61 Diskuze ................................................................................................................................................... 65 Charakteristika prostředí a subjektů ......................................................................................................... 65 Studie 1 – Celogenomová genová exprese................................................................................................ 67 Studie 2 – Genově-specifická metylace DNA ............................................................................................. 71 Studie 3 – Diferenciální exprese miRNA .................................................................................................... 74 Závěr....................................................................................................................................................... 78 Literatura ...............................................................................................................................................