Universidade Vale Do Paraíba Instituto De Pesquisa E Desenvolvimento

UNIVERSIDADE VALE DO PARAÍBA INSTITUTO DE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO

Claudinéia Aparecida da Silva Araujo

TOLERÂNCIA DE FUNGOS FILAMENTOSOS AO ESTRESSE OSMÓTICO CAUSADO PELO CLORETO DE POTÁSSIO

Orientador: Prof. Dr Drauzio E.N Rangel

Co- Orientador: Prof. Dr Newton Soares da Silva

São José dos Campos 2016

UNIVERSIDADE VALE DO PARAÍBA INSTITUTO DE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO

Claudinéia Aparecida da Silva Araujo

TOLERÂNCIA DE FUNGOS FILAMENTOSOS AO ESTRESSE OSMÓTICO CAUSADO PELO CLORETO DE POTÁSSIO

Dissertação de mestrado apresentado ao Programa de Pós Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Vale do Paraiba como complementação dos créditos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Prof. Dr Drauzio E.N Rangel

Co- Orientador: Prof. Dr Newton Soares da Silva

São José dos Campos 2016

FICHA

Banca

DEDICATÓRIA

Eu dedico este trabalho a Deus que tornou possível esse grande sonho e ao meu pai que sempre deu o seu melhor para que eu chegasse até aqui, meu verdadeiro referencial de vida e a minha mãe que foi tantas vezes o acalanto quando tudo parecia perdido, ao meu amor pela sua compreensão e pela sua paciência.

AGRADECIMENTOS

A Deus, que se mostrou criador, que foi criativo. Seu fôlego de vida em mim me foi sustento e me deu coragem para questionar realidades e propor sempre um novo mundo de possibilidades. À minha família, por sua capacidade de acreditar em mim e investir em mim. Mãe, seu cuidado e dedicação foi que me deu, em alguns momentos, a esperança para seguir. Pai, sua presença significou segurança e certeza de que não estou sozinha nessa caminhada. Aos meus amigos, Luciana, Paulo Cesár, Breno, Flaviane quantas histórias escrevemos nos livro da vida, quantas conquistas, quanto aprendizado quantas lágrimas derramadas. E hoje estou, dividindo essa grande conquista em minha vida, e trilharemos daqui para frente a nossa nova história e assim vamos vivendo escrevendo cada página onde vocês serão sempre personagens essenciais nessa história da vida, e por vocês; Com vocês, as pausas entre um parágrafo e outro de produção melhora tudo o que tenho produzido na vida. Ao Prof.ª Drauzio pela sua delicadeza, paciência e inteligência, que soube orientar e acreditar na funcionalidade desse trabalho e, que soube passar o seu ensinamento, com leveza e alegria. Ao professor Newton, professora Flavia, a professora Nádia e todos os professores e servidores do programa de Pós Graduação que a mim repassaram seus conhecimentos, fazendo que meu desenvolvimento fosse o melhor possível. A coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), a Fundação de Amparo á Pesquisa do Estado de São Paulo pelo incentivo financeiro para a realização desse projeto. Ao meu amor, amigo, companheiro que sempre me apoiou e me deu força nos momentos de dificuldades e sempre acreditou em mim, muito mais do que eu mesma acreditava. A todos dos Luz do amanhecer que de alguma forma estiveram e estão próximos a mim, fazendo esta vida valer cada vez mais a pena

RESUMO

Os fungos enfrentam durante todo seu ciclo de vida, fatores de estresse, entre eles o estresse osmotico e a redução da disponibilidade de água no seu ambiente. O cloreto de potassio (KCl) é um estressor muito comum encontrado no habitat de fungos, tornando se ideal para experimentos laboratoriais. Fungos patógenos de insetos são conhecidos como importantes agentes de controle biológico. Os fungos fitopatogênicos são responsaveis por infectarem culturas de importãncia econômica. Os fungos antagonistas são uma opção de biocontrole, para combater os fungos fitopatogênicos.Os fungos pátogenos de insetos estão sujeitos ao estresse osmótico, quando estão crescendo na hemolinfa do inseto. Os fungos fitopatogênicos e antagonistas também são submetidos a esse tipo de estresse quando são expostos a ambientes com escassez hidrica. Este estudo avaliou a capacidade de germinação de várias espécies de fungos a diferentes concentrações de KCl. A germinação foi avaliada, em meio PDA (controle) ou PDA suplementado com KCl (concentrações de KCl 0,1 a 3,0 M para patógenos de insetos, concentrações de KCl 0,1 a 2,8 M para patógenos de plantas e concentrações de 0 a 2,0 para fungos antagonistas) a germinação foi avaliada após 24 horas de incubação a 26C. Entre fungos entomopatogênicos o Trichothecium roseum (ARSEF 1212) (LC90 = 3.350) foi o mais tolerante seguido por Lecanicillium aphanocladii, Simplicillium lanosoniveum, Quatro espécies de fungos mostraram osmotolerancia moderada, incluindo Mariannaea pruinosa, Torrubiella homopterorum, Isaria fumosorosea, Lecanicillium aphanocladii (LC90 de 1.9 á 2.1). Dos 18 isolados do gênero Metarhizium todos apresentaram uma moderada tolerância. Onze isolados foram mais sensiveis ao estresse osmotico, (LC90 de 1.0 á 1.6), entre eles, os fungos Tolypocladium extinguens e T. geodes foram os menos tolerantes. Entre os patogenos de plantas o Fusarium verticiloides (FGSC 7600) foi o mais tolerante e o menos tolerante foi Colletotrichum gleosporioides. Os isolados SF 134, SF 114, e SF 116 mutantes do isolado Fusarium fujikoroi (FMKC 1995) com alta produção de carotenoide, foram menos resistente que o isolado selvagem. Entre os fungos antagonistas os mais resistentes foram os isolados Clonastachys candelabrum (ARSEF 9499) LC90 = 2.677 e o isolado Clonastachys rosea (ARSEF 7200) LC90 = 2.530 frente à concentração de 1.9 M de KCl. O isolado Trichoderma lignorum (ARSEF 5176) apresentou tolerância moderada 1.6 M de KCl (LC90 = 1.653), e o menos tolerante foi o isolado Gliocladium roseum (ARSEF 3001) com 1.4 M (LC90 = 0.853)..Em geral os fungos patógenos de plantas foram mais resistentes ao cloreto de potássio que os fungos entomopatogênicos e os fungos antagonistas, entretanto os fungos entomopatogênicos Trichothecium roseum e Simplicillium lanosoniveum foram os mais tolerantes de todos os fungos testados.

Palavras-chave: Fungos filamentosos, Estresse osmótico, Cloreto de potássio.

TOLERANCE OF FILAMENTAL FUNGUS TO THE OSMOTIC STRESS CAUSED BY POTASSIUM CHLORIDE

ABSTRACT

Fungi face throughout their life cycle stress factors, including osmotic stress and reducing the availability of water in their environment. Potassium chloride (KCl) is a very common stressor found in fungi habitat, making it ideal for laboratory experiments. Pathogenic fungi of insects are known as important biological control agents. Phytopathogenic fungi are responsible for infecting crops of economic importance. The antagonistic fungi are a biocontrol option, to combat phytopathogenic fungi, through competition and myoparasitism. Pathogenic fungi of insects are subject to osmotic stress, when they are growing in the hemolymph of the insect. Phytopathogenic fungi and antagonists are also subjected to this type of stress when exposed to environments with water scarcity. This study evaluated the germination capacity of several fungal species at different concentrations of KCl. Germination was evaluated among PDA (control) or PDA supplemented with KCl (KCl concentrations of 0.1 to 3.0 M to insect pathogens, KCl concentrations from 0.1 to 2.8 M to plant pathogens and concentrations From 0 to 2.0 for antagonistic fungi) the germination was evaluated after 24 hours of incubation at 26 ° C. Among entomopathogenic the Trichothecium roseum (ARSEF 1212) (LC90 = 3.350) was the most tolerant followed by Lecanicillium aphanocladii, Simplicillium lanosoniveum, four species of fungi showed moderate osmotolerancia including Mariannaea pruinosa , homopterorum Torrubiella, Isaria fumosorosea, Lecanicillium aphanocladii (LC90 of 1.9 á 2.1) Of the 18 isolates of the genus Metarhizium all showed a moderate tolerance. Eleven isolates were more sensitive to osmotic stress (LC90 1.0 to 1.6), among them fungi extinguens Tolypocladium geodes . were less tolerant to osmotic stress. Among plant pathogens Fusarium verticiloides (FGSC 7600) was the most tolerant and the least tolerant was Colletotrichum gleosporioides. The isolates SF 134, SF 114, and SF 116 mutants of the isolated Fusarium fujikoroi (FMKC 1995) with high carotenoid production were less resistant than the wild isolate. Among the fungi toughest antagonists were isolated Clonastachys candelabrum (ARSEF 9499) LC90 = 2.677 and isolated Clonastachys rosea (ARSEF 7200) LC90 = 2.530 against the concentration of 1.9 M KCl. The isolated Trichoderma lignorum (ARSEF 5176) showed moderate tolerance 1.6 M KCl (LC90 = 1.653), and was less tolerant isolated Gliocladium roseum (ARSEF 3001) with 1.4 M (LC90 = 0.853) .. In general fungal pathogens plants were more resistant to potassium chloride entomopathogenic fungi and fungal antagonists, however entomopathogenic fungus Trichothecium roseum and Simplicillium lanosoniveum were more tolerant of all tested fungi.

Keywords: Fungi, Osmotic stress, Potassium chloride.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Tolerância de fungos patógenos de insetos ao cloreto de potássio com concentrações de 0 á 2.0 M ...... 24

Figura 2 - Tolerância de fungos patógenos de insetos ao cloreto de potássio com concentrações de 0 á 2.0 M ...... 25

Figura 3 - Tolerância de fungos patógenos de insetos ao cloreto de potássio com concentrações de 0 . 26

Figura 4 - Tolerância de fungos patógenos de insetos ao cloreto de potássio com concentrações de 0 á 2.4 M ...... 27

Figura 5 - Tolerância de fungos patógenos de insetos ao cloreto de potássio com concentrações de 0 á 3,0 M ...... 27

Figura 6 - Tolerância de fungos patógenos de plantas ao cloreto de potássio...... 30

Figura 7 - Tolerância de fungos patógenos de plantas ao cloreto de potássio. Os isolados SF 114, SF 115, SF 116 são mutantes que produzem constitutivamente alta concentração de carotenoides sem a presença de luz. Estes mutantes são linhagens provenientes do isolado FKMC 1995...... 31

Figura 8 - Tolerância de fungos antagonistas ao cloreto de potássio...... 33

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Isolados de fungos patógenos de insetos ...... 20

Tabela 2 - Isolados de fungos patógenos de plantas ...... 21

Tabela 3 - Isolados de fungos antagonistas ...... 21

Tabela 4 - Concentrações de inibição ao cloreto de potássio dos isolados de fungos entompatogênicos induzidos ao estresse osmótico ...... 28

Tabela 5 - Concentrações de inibição ao cloreto de potassio dos isolados de fungos fitopatogênicos induzidos ao estresse osmótico...... 32

Tabela 6 - Concentrações de inibição ao cloreto de potassio dos isolados de fungos antagonistas induzidos ao estresse osmótico...... 33

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ...... 11 1.1 Fungos entomopatogênicos ...... 11 1.2 Controle biológico ...... 12 1.3 Fungos Patógenos de Plantas ...... 14 1.4 Fungos Antagonistas...... 16 1.5 Estresse osmótico ...... 17 2 OBJETIVOS ...... 19 2.1 Objetivos Específicos ...... 19 3 MATERIAIS E MÉTODOS ...... 20 3.1 Isolados Estudados ...... 20 3.2 Produção do Meio de cultura PDA ...... 21 3.3. Condições de cultivo ...... 21 3.4 Produção de Conídios ...... 22 3.5 Desvio padrão ...... 22 4 RESULTADOS ...... 23 4.1Fungos Entomopatogênicos...... 23 ...... 28 4.3 Fungos Antagonistas ...... 32 5 DISCUSSÃO ...... 34 5.1 Fungos Entomopatogênicos ...... 34 5.3 Fungos Antagonistas ...... 37 6 CONCLUSÕES ...... 39 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 40

1 INTRODUÇÃO

1.1 Fungos entomopatogênicos

Fungos entomopatogênicos são importantes para a agricultura e podem ser encontrados mundialmente em diferentes regiões. Devido à sua diversidade genética podem parasitar diferentes hospedeiros (FERRON, 1977). A maioria dos representantes ocorrem no filo Entomophtoromycota e Ascomycota. Estudos mostram que pelo menos 90 gêneros e mais de 700 espécies de fungos são patógenos de insetos. Os organismos mais estudados pertencem aos gêneros Aschersonia, Beauveria, Entomophthora, Hirsutella, Metarhizium, Nomuraea, Paecilomyces, Tolypocladium, e Verticillium, (HUMBER; HANSEN, 2011). Os mais estudados e usados em programas de controle biológico são Metarhizium e Beauveria (LI et. al., 2011). Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana invadem seus hospedeiros por penetração direta da cutícula (BITTENCOURT; MASCARENHAS; FACCINI, 1999; ARRUDA et al, 2005; HARTELT et al., 2008). A adesão de conídios sobre a cutícula ocorre passivamente através de interações eletrostáticas e, em seguida, é iniciado o processo de germinação. Após a germinação dos conídios, os apressórios são formados, os quais secretam enzimas hidrolíticas que favorecem a penetração das hifas (HARTELT et al., 2008). Uma vez dentro do hospedeiro, o micélio se ramifica dando origem a blastósporos leveduriformes (HARTELT et al., 2008). De um modo geral, blastósporos de fungos entomopatogênicos são maiores do que conídios aéreos, crescendo preferencialmente na hemocele de hospedeiros infectados (JACKSON et al., 1997). A morte do hospedeiro infectado por fungos entomopatogênicos ocorre em até 10 dias pela combinação da ação de toxinas fúngicas, obstrução física da circulação, diminuição da nutrição e pela invasão dos órgãos (ZHANG et al., 2009). Após a morte do hospedeiro, o fungo cresce externamente ao cadáver e esporula (HARTELT et al., 2008). um fungo apenas emerge do cadáver de seu hospedeiro e esporula se houver condições apropriadas de temperatura e umidade para o seu desenvolvimento (FARIA; WRAIGHT, 2007). Diferente das bactérias e vírus que precisam ser ingeridos para causar doença em insetos, fungos entomopatogênicos, como por exemplo Metarhizium anisopliae, causam a

morte de insetos através da adesão e geminação de conídios na superfície do inseto, seguida de uma penetração física por apressório através da cutícula (HARRY; HYWELL-JONES, 1997). Além da penetração física, ocorre à ação de enzimas extracelulares tais como proteases, lipases e quitinases que facilitam a penetração das hifas por hidrolisar o exoesqueleto do inseto (LEGER et al., 1996). Em seguida as hifas desenvolvem-se na cavidade interna no corpo do hospedeiro, onde ocorre a liberação de micotoxinas que são metabólicos secundários. As micotoxinas atuam contra o sistema imunológico do hospedeiro, favorecendo assim o estabelecimento do patógeno (HOHL; FELDMESSER, 2007). O micélio surge externamente do corpo do inseto produzindo esporos que poderão ser dispersos no ambiente infectando assim outros insetos (HOHL; FELDMESSER, 2007). Os fungos filamentosos são aptos a habitarem diversos nichos ecológicos e os esporos podem percorrer longas distâncias através do ar o que faz com que repousem em ambientes diferentes de sua origem até que o fungo possa crescer. Portanto o fungo deve ser capaz de se adaptar rapidamente a qualquer ambiente, ajustando continuamente sua fisiologia, a fim de aumentar a sua sobrevida, mantendo assim sua viabilidade. (DOBERSKI, 1981; MAGAN 1988; FENG; POPROWSKI; KHACHATOURIANS, 1994).

1.2 Controle biológico

Controle biológico é uma atividade que envolve inimigos naturais vivos que visam reduzir ou suprimir uma população que represente uma praga. É um método dentro do manejo integrado de pragas que determina a seleção das táticas no controle de pragas, baseadas nas análises custo/benefício e impacto sobre produtores e meio ambiente (EILENBERG; HAJEK; LOMER, 2001). O uso incontrolável de agrotóxicos tem sido durante muitos anos o principal meio de controle de pragas em diversas culturas agrícolas no Brasil e em diversas partes do mundo (LI et al., 2011). Com isso, são causados vários desequilíbrios ambientais nesses ecossistemas, que vão desde a superpopulação de pragas, seleção de insetos resistentes, poluição dos solos e aquíferos e danos causados à saúde humana (PEDIGO, 2002). Os fungos patógenos de insetos são importantes agentes de controle biológico que podem ser usados como uma alternativa aos inseticidas químicos utilizados na agricultura

para o controle de pragas e doenças devido à segurança para os seres humanos e outros organismos não-alvo e a redução de resíduos de pesticidas nos alimentos (BARROS et al., 2010). No Brasil, os fungos foram os primeiros patógenos de insetos a serem relatados. Pestana em 1923 fez referência ao M. anisopliae para o controle de Tomaspi ssp. (Hemiptera: Cercopidae), conhecida popularmente como cigarrinha vermelha da cana de açúcar. Bittancourt em 1934 relatou a ocorrência de fungos entomopatogênicos em pragas de citrus. Em 1939, Reininger observou um ataque de Aschersonia aleyrodis em mosca branca. Porém o ataque mais significativo relatado foi feito por Viégas, em 1939, sobre a ocorrência de Verticillium lecanii em cochonilha. A ocorrência natural de M. anisopliae, a partir de 1964, começou a despertar a atenção dos pesquisadores. Em 1969 passou a ser estudada por diversos centros de pesquisa devido à doença das cigarrinhas da cana-de-açúcar (ALVES, 1992; LI et al., 2011). Na última década, tem havido um interesse renovado em fungos como agentes de controle biológico no Brasil. Várias novas empresas cooperativas, privadas, agricultores plantadores de seringueira, bem como usinas de açúcar e álcool começaram a produzir M. anisopliae, B. bassiana e Sporothrix insectorum. Não há dados oficiais sobre os montantes de produção ou área tratados com fungos entomopatogênicos no Brasil (LI et al., 2011). A partir dos dados mais recentes publicados disponíveis (principalmente com base em as maiores empresas), estima-se que a produção total de substratos colonizados por fungo foi de aproximadamente 2.500 toneladas, o suficiente para cobrir aproximadamente 500.000 ha (ALVES et al., 2008). Considerando as dificuldades na obtenção de informações precisas sobre a produção de fungos entomopatogênicos de todos os engenhos de cana e empresas públicas e privadas, presume-se que a área pulverizada com fungos entomopatogênicos é muito maior, provavelmente atingindo cerca de um milhão de hectares nos últimos anos. Isto é consistente com os dados mais recentes de uma pesquisa realizada em fevereiro de 2008, revelando que 1.882 toneladas de Metarhizium, 95 toneladas de Beauveria, e 12,5 toneladas de Sporothix insectorum foram produzidas por ano em apenas 10 usinas ou empresas privadas nos estados de Alagoas e São Paulo (Li et al. 2011)

1.3 Fungos Patógenos de Plantas

Nos ultimos anos, em todos os lugares do mundo onde se pratica uma agricultura econômica, a intervenção para o controle de doenças de plantas é largamente realizada através de pesticidas (KIMATI et al., 1997). O uso racional desses produtos pode ter, em curto prazo, um efeito satisfatório para o produtor. No entanto, em longo prazo, além do surgimento de isolados de fitopatógenos resistentes às substâncias químicas utilizadas, os resultados para a sociedade como um todo e para o meio ambiente podem se tornar negativos devido à poluição causada pelos resíduos. Nesse contexto, termos como “agricultura alternativa” ou “agricultura sustentável” estimulam a busca por novas medidas de proteção das plantas contra as doenças (ZADOKS, 1992). Um dos pontos fortes da agricultura alternativa é o controle de doenças de plantas, como por exemplo controle biológico e a indução de resistência em plantas (não são inclusos nesse conceito o controle químico e o melhoramento genético) (BETTIOL, 1991). Podemos definir o controle biológico como o controle de um microrganismo através da ação direta de um outro microrganismo antagônico, no qual pode atuar por meio de parasitismo,competição, predação, antibiose ou hipovirulência (COOK; BAKER, 1983). A indução de resistência (ou indução de proteção, imunidade adquirida, ou resistência sistêmica adquirida) envolve a ativação de mecanismos de defesa latentes, existentes nas plantas, em resposta ao tratamento com agentes bióticos ou abióticos (HAMMERSCHMIDT; DANN, 1997). Esses mecanismos de resistência induzidos podem ser estruturais, como papila, lignificação e tilose, ou bioquímicos, como o acúmulo de fitoalexinas e de proteínas relacionadas à patogênese (como β-1,3 glucanase e quitinase degradadoras da parede celular de fungos) (PASCHOLATI; LEITE, 1995). Essa ativação pode ser obtida pelo tratamento com agentes bióticos (como microrganismos viáveis ou inativados) ou abióticos, como ácido 2,6-dicloroisonicotínico (HIJWEGWN; VERHAAR; ZADOKS, 1996) e benzo (1, 2, 3) tiadiazol- 7 carbotióico (CIBA, 1995). A proteção conferida pelo tratamento é capaz de proteger a planta contra infecções subsequentes por diferentes patógenos (CIBA, 1995) . As fitoalexinas são metabólitos secundários, antimicrobianos, de baixo peso molecular e produzido pelas plantas em resposta a estresses físicos, químicos ou biológicos, sendo capazes de impedir ou reduzir a atividade de agentes patogênicos (LO et al., 1996). De forma geral, o modo de ação das fitoalexinas sobre fungos inclui granulação citoplasmática, desorganização dos conteúdos celulares, ruptura da membrana plasmática e inibição de enzimas fúngicas.

Esses efeitos refletem-se na inibição da germinação e elongação do tubo germinativo e redução ou inibição do crescimento micelial (LO et al., 1996). Os fungos constituem o maior grupo de patógenos radiculares, ocorrendo em todos os tipos de sistemas agrícolas e causando doenças nas principais espécies cultivadas, com uma variada gama de sintomas (HILLOCKS; WALLER, 1997). Muitos fungos habitantes do solo possuem elevada capacidade de competição saprofítica e podem sobreviver em resíduos de plantas introduzidos no solo, mantendo-se em elevadas densidades populacionais mesmo durante longos períodos de rotação de culturas (HILLOCKS; WALLER, 1997). Outros fungos que vivem nesse ambiente produzem estruturas como agregados miceliais, esclerócios, oósporos, clamidosporos ou outros tipos de esporos, que resistem às condições ambientais adversas e permanecem viáveis quando as plantas hospedeiras não estão presentes (WHEELER; RUSH, 2001). Essas estruturas podem estar associadas com resíduos de plantas, mas freqüentemente encontram-se livres no solo. Esse conjunto de características é uma das razões pela qual fungos fitopatogênicos habitantes do solo, uma vez introduzidos numa área de plantio, são praticamente impossíveis de serem eliminados (WHEELER; RUSH, 2001). Em 1917, foi apresentado claramente uma função ativa dos fungos na decomposição de resíduos de plantas, sugerindo a existência de dois grupos ecológicos gerais, habitantes do solo e invasores do solo. Espécies fúngicas que eram encontradas rotineiramente no solo foram designadas como habitantes do solo, enquanto aquelas com uma existência transitória nesse ambiente foram denominadas invasores do solo (WHEELER; RUSH, 2001). O gênero Fusarium foram estudados em solos da América Central. Algumas espécies desse fungo foram constatadas em todos os solos examinados e classificadas como habitantes do solo, enquanto outras foram verificadas somente em localidades específicas e classificadas como invasoras do solo, dentre as quais, Fusarium oxysporum f.sp. cubense, conhecida como agente do mal do Panamá (WHEELER; RUSH, 2001)Essa facilidade de adaptação e mudança de ambiente confere a esse gênero uma grande resistência, devido a sua capacidade de germinar em solos, com escassez hídrica, alta salinidade e alta temperatura. Avaliar a resistência dos fungos fitopatogênicos ao KCl, possibilita compreender a sua adaptação nomeio ambiente, e sua eficácia na patogenicidade em plantas de interesse econômico.

1.4 Fungos Antagonistas.

Os princípios do controle biológico baseiam-se na relação antagônica entre microrganismos, como: predação, competição, antibiose e parasitismo. Para que um antagonista seja bem sucedido é preciso que ele tenha capacidade de se multiplicar e colonizar a superfície da planta. O parasitismo parece ser o mecanismo mais eficiente de antagonismo do controle biológico natural, pois os hiperparasitas por viverem à custa do patógeno estão sujeitos as mesmas variações ambientes e dependem das mesmas condições do organismo parasitado. Dentre os fungos filamentosos, o Trichoderma é reconhecidamente o hiperparasita mais importante e um dos mais estudados. Os fungos do gênero Trichoderma sp. são de extrema importância econômica para a agricultura, uma vez que são capazes de atuarem como agentes de controle de doenças de várias plantas cultivadas, atuam como promotores de crescimento e indutores de resistência de plantas à doença (MOHAMED; HAGGAG, 2006). Algumas linhagens desses fungos vêm recebendo grande atenção da pesquisa, também, por sua versatilidade de ação. Estas são capazes de produzir enzimas que degradam paredes celulares de outros fungos e produzem também substâncias antifúngicas (antibióticos), apresentam diversidade de estratégias de sobrevivência que as tornam altamente competitivas no ambiente, e extraordinária capacidade de proliferação na rizosfera (MELO, 1996, RESENDE et al., 2005). Ademais, certos isolados se mostram resistentes aos fungicidas, característica que os fazem potenciais agentes biorremediadores (RESENDE et al., 2004). Fungos do gênero Trichoderma possuem amplas possibilidades para aplicação, tanto no biocontrole de patógenos foliares, quanto de patógenos habitantes do solo (MELO, 1996). No controle biológico de doenças causadas por patógenos de solo, os fungos são os principais agentes antagônicos. Micoparasitas como fungos do gênero Trichoderma, pertencentes à família Hypocreaceae, o qual forma estruturas de sobrevivência como os clamidósporos, têm sido considerados eficazes no biocontrole de fitopatógenos, principalmente de fitopatógenos que apresentam estruturas de resistência consideradas difíceis de serem atacadas, como esporos, escleródios, clamidósporos e microesclerócios. (MELO, 1996). Dentre outros agentes de biocontrole mais utilizados, destaca-se também Clonostachys rosea que ocorre naturalmente no solo, restos culturais, plantas daninhas e cultivadas, é

saprófita amplamente distribuído no mundo e antagonista a vários fungos fitopatogênicos (SUTTON et al., 1997; NOBRE et al., 2005). A aplicação do antagonista pode promover outros efeitos benéficos a plantas, como melhorar as condições fisiológicas e a eficiência fotossintética, reduzir estresses abióticos e aumentar a absorção de água e nutrientes, o que pode aumentar a produtividade (SHORESH et al., 2010). Clonostachys rosea é antagonista a Botrytis cinerea, conhecida como causadora do mofo cinzento nos vegetais, como o pepino. O ataque acontece principalmente por meio de hiperparasitismo e competição por nutrientes e colonização de tecidos mortos/senescentes (SUTTON et al., 1997; MORANDI; SUTTON; MAFFIA, 2000; COTA et al., 2008). O antagonista também pode promover o crescimento de plantas de pepino cultivadas em sistema hidropônico (LIU; SUTTON, 2002). No Brasil, não há relatos sobre o efeito de C. rosea em induzir resistência em plantas a fitopatógenos, apesar da eficiência de alguns isolados como antagonistas (NOBRE et al., 2005)Analisar a resistência de fungos antagonistas ao estresse osmótico possibilita nos compreendermos a sua resistência, quando em contato com regiões do solo, com baixa disponibilidade de água ou solos salinos, para combater fungos que causam danos às plantas e principalmente resistir a mecanismos de defesas encontrados nas regiões foliares que causam aumento da produção de açucares, ocasionando um estresse osmótico em suas células.

1.5 Estresse osmótico

Durante o curso da infecção por fungos, os fungos patogênicos encontram vários fatores adversos do inseto hospedeiro, tais como o estresse osmótico no interior do corpo do hospedeiro. Os fungos infectam insetos por penetração direta da cutícula, onde se adapta à elevada pressão osmótica da hemolinfa e se multiplica (WANG; DUAN; ST LEGER, 2008). Os fungos patogenos de plantas encontra no solo vários obstaculos para sua germinação, como alto teor salino, baixo pH e temperatura elevada, no entanto é necessário possuir estruturas resistentes para que possa germinar quando encontrar seu hospedeiro (BERGAMIN FILHO; KIMATI; AMORIN, 1995). Os fungos antagonistas, enfrentam as mesmas adversidades que os patógenos de plantas, e podem ser utilizados como controle biológico para combater outros fungos que causam doenças nas plantas, ou agir de forma simbiotica

com a planta, conhecidos como fungos micorrizicos, onde retiram do solo com alto teor salino, nutrientes necessários para a sobrevivencia da planta Muitos fungos são capazes de crescimento em meios com aumento de pressão osmótica, em que qualquer aumento da osmolaridade externa deve ser compensada por uma mudança comparável na osmolalidade intracelular. Este processo, frequentemente denominado "ajustamento osmótico" ou "osmoregulação", tem sido observada em micro-organismos (REED et al., 1987). O glicerol e eritritol são considerados os maiores compostos osmoregulatórios em Aspergilus nidulans, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae e Paecilomyces farinosus implicando que o conteúdo foi elevado após o crescimento em meio osmoticamente alterado com cloreto de potássio (BEEVER; LARACY, 1986; HALLSWORTH; MAGAN, 1994; HALLSWORTH; MAGAN, 1995).

2 OBJETIVOS

Os principais objetivos desta tese foram (1) acumular conhecimentos básicos sobre as respostas ao estresse de fungos filamentosos de diferentes nichos ecológicos como fungos patógenos de insetos, fungos patógenos de plantas e fungos antagonistas; (2) preencher em parte, a falta de conhecimento sobre a fisiologia as respostas ao estresse pelo cloreto de potássio em fungos filamentosos; e (3) enfatizar a importância da pesquisa usando-se fungos filamentosos menos conhecidos para suas possíveis aplicações biotecnológicas.

2.1 Objetivos Específicos

Avaliar a variabilidade intra-específica em relação à tolerância ao cloreto de potássio entre 33 isolados de fungos entomopatogênicos. Avaliar a variabilidade inter-específica entre 12 espécies de fungos fitopatógenos em relação à tolerância ao cloreto de potássio. Avaliar a a variabilidade inter-específica entre 5 espécies de fungos antagonistas em relação à tolerância ao cloreto de potássio

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Isolados Estudados

Foram obtidos trinta e três isolados de patógenos de insetos obtidos da USDA-ARS Collection of Entomopathogenic Fungal Cultures (ARSEF; Robert W.Holler Center for Agriculture & Health, Ithaca, NY, USA) (Tabela 1), doze isolados patógenos de plantas e cinco isolados de Fusarium que sofreram uma mutação, ao serem expostos na radiação ultravioleta, apresentando uma pigmentação mais forte que o isolado parental (1995) todos os isolados patógenos de plantas foram obtidos na Universidade de São Paulo e Universidad de Sevilla, Espanha (Tabela 2), quatro isolados de fungos antagonistas (Tabela 3) para o uso de espécies de fungos corretamente identificadas e certificadas obtidos da USDA-ARS Collection of Entomopathogenic Fungal Cultures

Tabela 1 - Isolados de fungos patógenos de insetos Espécie Isolado Substrato/Hospedeiro/Outras informações Origem Ano Aschersonia aleyrodis ARSEF 430 [Homoptera: Aleyrodidae] on citrus leaves Lake Alfred, Florida, USA 1980 Aschersonia aleyrodis ARSEF 10276 Scale insects in guava tree São José dos Campos, SP, Brazil 2011 Beauveria bassiana ARSEF 252 Leptinotarsa decemlineata [Coleoptera: Chrysomelidae] Orono, Maine, USA 1978 Isaria fumosorosea ARSEF 3889 Bemisia tabaci [Homoptera: Aleyrodidae] Hawaii, USA 1993 Lecanicillium aphanocladii ARSEF 6433 Triangulo Agroindustrial S.A. Pontes e Lacerda, Mato Grosso, Brazil 2001 Mariannaea pruinosa ARSEF 5413 Iragoides fasciata [Lepidoptera: Limacodidae] PR China, Guiyang City, Guizhou Province 1996 Metarhizium acridum ARSEF 324 Austracris guttulosa [Orthoptera: Acrididae] Queensland, Australia 1979 Metarhizium acridum ARSEF 3609 Patanga succincta [Orthoptera: Acrididae] Thailand 1992 Metarhizium acridum ARSEF 6421 Kraussaria angulifera [Orthoptera: Acrididae: Cyrtacanthacridinae]Senegal, Region of Kaolack 1999 Metarhizium acridum ARSEF 7486 [IMI 330189] Ornithacris cavroisi [Orthoptera: Acrididae] Niger 1992 Metarhizium anisopliae s.l. ARSEF 2341 Scotinophara coarctata [Hemiptera: Pentatomidae] Palawan, Philippines 1986 Metarhizium anisopliae s.l. ARSEF 4343 Soil Macquarie Island, Australia 1994 Metarhizium anisopliae s.l. ARSEF 4570 Soil Macquarie Island, Australia 1993 Metarhizium anisopliae s.l. ARSEF 5749 Schistocerca piceifrons [Orthoptera: Acrididae] Cerro de Ortega, Colima, Mexico 1992 Metarhizium brunneum ARSEF 1187 Oxycanus sp. [Lepidoptera: Hepialidae] Palmerston North, New Zealand 1966 Metarhizium brunneum ARSEF 5626 Tenebrio molitor [Coleoptera: Tenebrionidae] bait from soil Pälkäne, Hämeen Lääni, Finland 1986 Metarhizium brunneum ARSEF 7711 I Earth BioScience F52; IMI 385045 Austria 2005 Metarhizium pingshaense ARSEF 1545 Adult, Scotinophara coarctata [Hemiptera: Pentatomidae] on Philippines, Palawan 1984 Metarhizium robertsii ARSEF 23 Conoderus sp. [Coleoptera: Elateridae] North Carolina, USA 1961 Metarhizium robertsii ARSEF 2134 Phyllophaga ?anxia [Coleoptera: Scarabaeidae] Southern Quebec, Canada 1985 Metarhizium robertsii ARSEF 2547 Rhizotrogus majalis [Coleoptera: Scarabaeidae] Syracuse, New York, USA 1987 Metarhizium robertsii ARSEF 2560 Atta sexdens rubropilosa [Hymenoptera: Formicidae] Piracicaba, Sao Paulo, Brazil 1988 Metarhizium robertsii ARSEF 2575 Curculio caryae [Coleoptera: Curculionidae] South Carolina, USA 1988 Metarhizium robertsii ARSEF 6998 White mutant from ARSEF 6995 Mutation at Utah State University, USA 2001 Myrothecium verrucaria ARSEF 2741 Soil, using Tenebrio molitor [Coleoptera: Tenebrioidae] as a Philippines: La Trinidad, Benguet 1988 Simplicillium lanosoniveum ARSEF 6430 Leptopharsa heveae [Hemiptera: Tingidae] French Guiana 2000 Simplicillium lanosoniveum ARSEF 6432 Leptopharsa heveae [Hemiptera: Tingidae] French Guiana 2000 Simplicillium lanosoniveum ARSEF 6651 Leptopharsa heveae [Hemiptera: Tingidae] French Guiana 2000 Tolypocladium cylindrosporum ARSEF 3392 Soil Nepal 1991 Tolypocladium cylindrosporum ARSEF 5558 Delia floralis [Diptera: Anthomyiidae] as bait from soil. Valberg, Nordland, Norway 1996 Tolypocladium extinguens ARSEF 2921 CBS (345.77) Arachnocampa luminosa [Diptera: New Zealand. 1977 Tolypocladium geodes ARSEF 3275 Moorland soil Gisburn Forest, England 1991 Tolypocladium inflatum ARSEF 4772 Salmo salar (Cordata: Actinopterygii) Tasmania, Australia 1994 Tolypocladium inflatum ARSEF 4877 [Coleoptera: Scarabaeidae: Aphodiinae] Danby, New York, USA 1994 Torrubiella homopterorum ARSEF 2045 Nilaparvata lugens [Hemiptera: Delphacidae] Republic of Korea: Gun-Wandi 1985 Trichothecium roseum ARSEF 1212 Nymph, Adelphocoris sp. [Hemiptera: Miridae] Acquapendente, Lazio, Italy 1983 Fonte: Autor.

Tabela 2 - Isolados de fungos patógenos de plantas Espécie Isolado Substrato/Hospedeiro/Outras informações Origem Ano Colletotrichum acutatum FDC 52 Orange, from Fundecitrus (CA T-2) Taquarituba, SP, Brazil Colletotrichum acutatum FDC 82 Orange, from Fundecitrus Pedrápolis, SP, Brazil Colletotrichum fioriniae ARSEF 10220 Fiorinia externa [Hemiptera: Diaspididae]. Westchester County, New York, USA 2005 Colletotrichum gleosporioides CG 1 Avocado CBS > ESALQ Fusarium fujikuroi FKMC 1995 From rice (= C-01995) Taiwan (Kansas State University Collection) Fusarium fujikuroi SF 114 Carotenoid-overproducing strain. Mutation from FKMC1995 Mutation at Universidad de Sevilla, Spain Fusarium fujikuroi SF 115 Carotenoid-overproducing strain. Mutation from FKMC1995 Mutation at Universidad de Sevilla, Spain Fusarium fujikuroi SF 116 Carotenoid-overproducing strain. Mutation from FKMC1995 Mutation at Universidad de Sevilla, Spain Fusarium fujikuroi SF 134 Carotenoid-overproducing strain. Mutation from FKMC1995 Mutation at Universidad de Sevilla, Spain Fusarium oxysporum 4287 Tomato Plant. Fungal Genetics Stock Center (FGSC 9935) CBS 123668 / FGSC 9935 / NRRL 34936 Fusarium verticillioides FGSC 7600 Maize A-00149, M3125, MYA-4922 Visalia, CA, USA Fusarium verticillioides FGSC 7603 Corn stalk ATCC 201261 sensitive to benomyl benlate Knightstown, Henry Co. IN Fonte: Autor.

Tabela 3 - Isolados de fungos antagonistas Espécie Isolado Substrato/Hospedeiro/Outras informações Origem Ano Clonostachys candelabrum ARSEF 9499 Isolated from soil sample Moscow Region, Russian Federation 2004 Clonostachys rosea ARSEF 7200 Oncometopia tucumana [Hemiptera: Cicadellidae] Horco Molle, Tucuman, Argentina 2003 Gliocladium roseum ARSEF 3001 Soil Geneva, New York, USA 1990 Trichoderma atroviride IMI 206040 Associated organism Picea excelsa Sweden, Europe 1970 Trichoderma lignorum ARSEF 5176 Adelges tsugae [Hemiptera: Adelgidae] on Tsuga canadensis USA: Mt. Tom, Holyoke, Massachusetts. 1996 Fonte: Autor.

3.2 Produção do Meio de cultura PDA

O meio de cultura foi preparado em frascos Pyrex autoclaváveis de acordo com o fabricante (Difco Laboratories, Sparks, MD, USA), ajustado á quantidade necessária para cada experimento, em seguida o pH foi ajustado á 6.9 e misturada vigorosamente. Os frascos foram inseridos na autoclave, o termostato foi ajustado à temperatura máxima, até atingir 121 °C, em seguida o termostato foi reduzido á temperatura mínima, e contabilizado 15 min, logo após a autoclave foi desligada. Os meios de culturas foram colocados no fluxo laminar, e após 30 min foram vertidos 23 mL em placas de Petri de poliestireno (95  15 mm) e tampadas parcialmente até sua solidificação. As placas foram armazenadas na geladeira, em temperatura de 8 graus, por no máximo 48 horas até sua utilização.

3.3. Condições de cultivo

Culturas estoques foram mantidas a 4° C em tubos de ensaio com potato dextrose agar (Difco Laboratories, Sparks, MD, USA) (PDA), ajustados pH para 6.9. Conídios de cada isolado foram produzidos em 23 mL de meio PDA em placas de Petri de poliestireno (95  15

mm). De cada suspensão de conídios o inóculo de 100 l (107 conídios mL-¹),l foi inoculada e uniformente espalhada na superficie do meio de cultura. As culturas foram incubadas no escuro á 26 ± 1 °C durante 14 dias. O experimento foi repetido três vezes com um novo lote de conídios para cada repetição.

3.4 Produção de Conídios

Suspensões dos conídios dos fungos descritos acima foram utilizadas para avaliar a resistência à tolerância ao KCl. Para cada isolado foi realizado uma suspensão em 10 mL de Tween 80 (0.01%) (Sigma- Aldrich) na concentração de 105 conídios/ml em tubos de Pyrex com tampa de rosca. Cada suspensão foi vigorosamente agitada em um agitador de tubos. Foram inoculados 40 l no centro da placas de Petri (35 x 15 mm) contendo 6 mL meio PDA sem suplementação de KCl, controle) ou PDA suplementado com KCl (Sigma- Aldrich) nas seguintes concentrações, de 0 á 3,0 M utilizados para analisar a resistência dos fungos patógenos de insetos de 0 á 2.8 para analises dos fungos patógenos de plantas e 0 á 2.0 para fungos antagonistas. As placas foram mantidas a 26 C no escuro por um período de 24 horas. Após 24 horas, os conídios foram corados com azul de metileno e a germinação foi avaliada no microscópico a 400 . Para estimar a porcentagem de germinação, um total de 300 conídios foram examinados para cada tratamento.

3.5 Desvio padrão

A média da concentração inibitória (IC50) e seus intervalos de confiança foram calculados por análise Probit utilizando o programa AnalystSoft®, StatPlus® para Windows, Versão 2007, http://www.analystsoft.com/en/products/statplus/. A concentração inibitória 10 e 90% (IC10 e IC90) também foram calculadas pelo mesmo programa, mas não forneceu para estes cálculos os intervalos desconfiança.

4 RESULTADOS

4.1Fungos Entomopatogênicos.

O fungo Trichotecium roseum (ARSEF 1212) (IC90 = 3.3 M) apresentou maior tolerância ao estresse osmótico seguido pelos fungos Simplicillium lonosoniveum (ARSEF

6430) (IC90 = 2.3 M) (Fig. 3, Tabela 4), Torrubiella homopterorum (ARSEF 2045),

(IC90=2.25) (Fig. 3, Tabela 4), Simplicillium lanosoniveum (ARSEF 6651) (IC90= 2.21), (Fig.4, Tabela 4), Lecanicillium aphanocladii (ARSEF 6433) e Mariannaea pruinosa

(ARSEF 5413) (IC90 = 2.1 M) (Fig. 4, Tabela 4). A maioria das espécies de fungos entomopatogenicos apresentou tolerância moderada

(IC90 = 1,7 e 2,0 M), incluindo Fusarium coccophilum (ARSEF 821) (IC90 = 1.8 M), (Fig. 3,

Tabela 5) Isaria fumosorosea (ARSEF 3889) (IC90 =2.0) (Fig. 4, Tabela 4), Tolyplocadium cyllindrosporum (ARSEF 5558) (IC90 = 1.7 M), ( Fig 4, Tabela 4). Dentre os isolados de Metarhizium o mais resistente foi o isolado Metarhizium anisopliae (ARSEF 5749), (Fig. 1, Tabela 4) que também apresentou resistência moderada

(IC90 = 1.645 M), seguido do isolado Myrothecium verrucaia (ARSEF 2741) (IC90 = 1.603M). (Fig. 3, Tabela 4) Os isolados de Metarhizium robertsii (ARSEF 2560, 2575,2134 e 23) (Fig. 2, Tabela

4), (ARSEF 2547) (Fig. 1, Tabela 4) que apresentaram resistência semelhante IC90 de 1.497

M á 1.603 M , seguido do isolado Metarhizium anisopliae (ARSEF 2341 M), (IC90=1.556),

(Fig.1, Tabela 4) Metarhizium brunneum (ARSEF 1187) (IC90 = 1.4 M), (Fig.1, Tabela 4),

Metarhizium brunneum (ARSEF 7711) (IC90 = 1.411 M ) (Fig.2, Tabela 4), Metarhizium anisopliae (ARSEF 4343) (IC90=1.364 M), ( Fig. 1, Tabela 4), Metarhizium acridum

(ARSEF 3609),(IC90=1.347 M), (Fig. 1, Tabela,4), Metarhizium acridum (ARSEF 324)

(IC90= 1.293 M), ( Fig. 1, Tabela 4), Metarhizium brunneum (ARSEF 5626) (IC90 = 1.120 M), (Fig.2, Tabela 4). O isolado de Metarhizium anisopliae (ARSEF 4570) (Fig.1, Tabela 4) encontrado na Ilha Macquarie na Austrália, que fica no circulo polar antártico, apresentou menor nível de tolerância ao estresse osmótico entre os fungos do gênero Metharhizium (IC90 = 1,0 M) (Fig.1).

Os isolados do gênero Tolyplocadium (ARSEF 4772, e 3392) apresentaram resistência semelhante, IC90 = 1.639 M e 1.663 M respectivamente. Dentre os demais isolados que também apresentaram baixa resistência ao estresse osmótico estão Beauveria bassiana (ARSEF 252) (IC90 = 1.2 M),(Fig. 3), Aschersonia aleyrodis (ARSEF 430), (IC90 = 1.1), ( Fig. 2, Tabela 4) e (ARSEF 10276) (IC90 = 1.2 M) (Fig. 2, Tabela 4). O isolado Tolyplocadium geodes (ARSEF 3275) apresentou menor tolerância ao estresse osmótico (IC90 = 0.692 M).

Figura 1 - Tolerância de fungos patógenos de insetos ao cloreto de potássio com concentrações de 0 á 2.0 M

Fonte: Autor.

Figura 2 - Tolerância de fungos patógenos de insetos ao cloreto de potássio com concentrações de 0 á 2.0 M

Fonte: Autor.

Figura 3 - Tolerância de fungos patógenos de insetos ao cloreto de potássio com concentrações de 0

Fonte: Autor.

Figura 4 - Tolerância de fungos patógenos de insetos ao cloreto de potássio com concentrações de 0 á 2.4 M .

Fonte: Autor.

Figura 5 - Tolerância de fungos patógenos de insetos ao cloreto de potássio com concentrações de 0 á 3,0 M

Fonte: Autor.

Oitenta por cento dos conídios de Trichothecium roseum germinaram sob a concentracao de 2.0 M de KCl (equivalente a 0,928 atividade de água), com IC90 em 3.3 M (Tabela 3) e alguns germinaram em 3,0 M KCL (< 0,890 atividade de água). Isto sugere que o T. roseum é altamente xerotolerante.

Tabela 4 - Concentrações de inibição ao cloreto de potássio dos isolados de fungos entompatogênicos induzidos ao estresse osmótico IC IC ± SE IC Espécie Isolado 10 50 90 Concentração (M) Tolypocladium geodes ARSEF 3275 0.213 0.239 ± 0.011 0.692 Tolypocladium extinguens ARSEF 2921 0.394 0.394 ± 0.016 1.181 Metarhizium brunneum ARSEF 5626 0.211 0.616 ± 0.008 1.020 Metarhizium anisopliae s.l. ARSEF 4570 0.394 0.734 ± 0.008 1.075 Beauveria bassiana ARSEF 252 0.338 0.772 ± 0.009 1.206 Tolypocladium inflatum ARSEF 4772 0.118 0.879 ± 0.016 1.639 Metarhizium acridum ARSEF 324 0.609 0.905 ± 0.008 1.293 Metarhizium pingshaense ARSEF 1545 0.638 0.922 ± 0.007 1.206 Aschersonia aleyrodis ARSEF 430 0.556 0.931 ± 0.008 1.104 Aschersonia aleyrodis ARSEF 10276 0.664 0.950 ± 0.007 1.236 Metarhizium robertsii ARSEF 23 0.613 1.013 ± 0.009 1.413 Metarhizium acridum ARSEF 3609 0.87 1.109 ± 0.007 1.347 Metarhizium robertsii ARSEF 2134 0.851 1.125 ± 0.008 1.400 Metarhizium brunneum ARSEF 7711 0.884 1.146 ± 0.007 1.411 Metarhizium brunneum ARSEF 1187 0.885 1.157 ± 0.007 1.429 Tolypocladium cylindrosporum ARSEF 5558 0.541 1.158 ± 0.014 1.775 Metarhizium anisopliae s.l. ARSEF 4343 0.98 1.172 ± 0.007 1.364 Tolypocladium inflatum ARSEF 4877 0.744 1.180 ± 0.009 1.617 Trichoderma lignorum ARSEF 5176 0.743 1.191 ± 0.010 1.639 Metarhizium robertsii ARSEF 2575 1.041 1.269 ± 0.006 1.497 Metarhizium robertsii ARSEF 2560 0.966 1.285 ± 0.007 1.603 Metarhizium anisopliae s.l. ARSEF 2341 1.039 1.298 ± 0.008 1.556 Metarhizium robertsii ARSEF 2547 1.073 1.330 ± 0.007 1.587 Myrothecium verrucaria ARSEF 2741 1.068 1.342 ± 0.007 1.617 Tolypocladium cylindrosporum ARSEF 3392 1.062 1.363 ± 0.008 1.663 Metarhizium anisopliae s.l. ARSEF 5749 1.085 1.365 ± 0.007 1.645 Metarhizium robertsii ATCC MYA-3076 ND 1.430 ± ND 2.223 Mariannaea pruinosa ARSEF 5413 1.17 1.650 ± 0.011 2.130 Torrubiella homopterorum ARSEF 2045 1.309 1.780 ± 0.011 2.250 Lecanicillium aphanocladii ARSEF 6433 1.668 1.905 ± 0.007 2.143 Simplicillium lanosoniveum ARSEF 6651 1.668 1.939 ± 0.009 2.210 Simplicillium lanosoniveum ARSEF 6432 1.342 2.093 ± 0.027 2.845 Simplicillium lanosoniveum ARSEF 6430 1.406 2.428 ± 0.024 3.449 Fonte: Autor.

4.2 Fungos Patógenos de Planta.

Entre os fungos entompatogênicos de acordo com o cálculo da concentração inibitória, o isolado Colletotrichum fiorinae (ARSEF 10220) apresentou alta tolerância ao estresse osmótico ( IC90 3,278) ( Fig. 6, tabela 5), uma diferença significativa entre os isolados do mesmo gênero, Colletotrichum acutatum ( FDC 82) ( IC90 2.104) ( Fig. 6, Tabela 5) , Colletotrichum acutatum, ( FDC 52) ( IC90 1.919) ( Fig. 6, tabela 5) e Colletotrichum gleosporioises ( CG 1) (IC 90 1.857), ( Fig. 6, tabela 5) o que confere que as diferencias de nichos podem contribuir para as diferenças tolerâncias, o isolado mais tolerante, foi encontrado em um hemipetera o que confere que pode ser considerado um entomopatogenico. Entre os gêneros de Fusarium o isolado Fusarium verticilliodes ( FGSC 7600 e 7603) apresentaram maior tolerância, IC90 2.956 e IC90 2.927 respectivamente, seguido do isolado

Fusarium fujikuroi SF 115 (IC90 2.684) e Fusarium oxysporium ( SF 4287) (IC90 2.563)

O isolado selvagem Fusarium fujikuroi (FKMC 1995) (IC90 2.533) apresentou maior tolerância que os isolados que sofreram mutação através da exposição ao estresse de radiação, apresentando uma coloração diferente do isolado selvagem, dentre eles temos o isolado

Fusarium fujikuroi (SF 116), (IC90 2.113), Fusarium fujikuroi (SF 114), (IC90 1.800),

Fusarium fujikuroi (SF 134), que apresentou a menor tolerância (IC90 1.590), estudos indicam que a alta produção de carotenoide pode interferir na resistência dos fungos ao estresse osmótico, podendo ser uma alternativa para futuros estudos para o combate a esse fitopatogeno.

Figura 6 - Tolerância de fungos patógenos de plantas ao cloreto de potássio

Fonte: Autor.

Tabela 5 - Concentrações de inibição ao cloreto de potassio dos isolados de fungos fitopatogênicos induzidos ao estresse osmótico. IC IC ± SE IC Espécie Isolado 10 50 90 Concentração (M) Fusarium fujikuroi SF 134 0.027 0.808 ± 0.016 1.590 Fusarium fujikuroi SF 114 0.723 1.262 ± 0.013 1.800 Fusarium fujikuroi SF 116 0.891 1.502 ± 0.016 2.113 Colletotrichum acutatum FDC 82 0.921 1.513 ± 0.014 2.104 Fusarium coccophilum ARSEF 821 1.184 1.521 ± 0.011 1.857 Colletotrichum gleosporioides CG 1 1.334 1.596 ± 0.007 1.857 Colletotrichum acutatum FDC 52 1.352 1.636 ± 0.007 1.919 Fusarium fujikuroi FKMC 1995 0.907 1.720 ± 0.018 2.533 Fusarium fujikuroi SF 115 0.842 1.763 ± 0.024 2.684 Fusarium oxysporum 4287 1.256 1.910 ± 0.017 2.563 Fusarium verticillioides FGSC 7600 1.081 2.019 ± 0.02 2.956 Fusarium verticillioides FGSC 7603 1.553 2.240 ± 0.019 2.927 Colletotrichum fioriniae ARSEF 10220 1.383 2.330 ± 0.027 3.278 IC: Concentração Inibitória. Fonte: Autor.

4.3 Fungos Antagonistas

Entre os fungos antagonistas, Gliocladium roseum (ARSEF 3001) (IC 90 0,853) (Tabela 6, Figura 8) foi o menos tolerante, tendo uma tolerancia ao cloreto de potássio similar aos fungos entomopatogênicos menos tolerantes, Tolypocladium geodes e Tolypocladium extinguens. Por outro lado, os fungos Clonostachys rósea (ARSEF 7200) (IC 90 2.530) e

Clonostachys candelabrum ( ARSEF 9499) (IC 90 2.677) (Tabela 6, Figura 8) foram os mais tolerantes ao cloreto de potássio, com tolerância similar aos fungos patógenos de plantas. Os fungos Trichoderma lignorum (ARSEF 5176) ( IC 90 1.639) ( Tabela 6, Figura 8) e

Trichoderma atroviride (IMI 206040) ( IC 90 1.8) ( Tabela 5, Figura 8) tiveram uma tolerância ao cloreto de potássio similar com os fungos entomopatogênicos Metarhizium anisopliae s.l.

Figura 8 - Tolerância de fungos antagonistas ao cloreto de potássio.

Fonte: Autor.

Tabela 6 - Concentrações de inibição ao cloreto de potassio dos isolados de fungos antagonistas induzidos ao estresse osmótico. IC IC ± SE IC Espécie Isolado 10 50 90 Concentração (M) Gliocladium roseum ARSEF 3001 0.170 0.512 ± 0.008 0.853 Trichoderma lignorum ARSEF 5176 0.743 1.191 ± 0.010 1.639 Trichoderma atroviride IMI 206040 0.893 1.349 ± 0.01 1.805 Clonostachys rosea ARSEF 7200 0.875 1.703 ± 0.021 2.530 Clonostachys candelabrum ARSEF 9499 0.751 1.714 ± 0.022 2.677 Fonte: Autor.

5 DISCUSSÃO

5.1 Fungos Entomopatogênicos

A adaptação é essencial para fungos sobreviver em condições de estresse osmótico, causado por solutos como, por exemplo, o KCl e NaCl (ANGUS et al, 1983). Em alguns casos, as células sintetizam e ou acumulam solutos compatíveis Para manter a pressão osmótica. (ANGUS et al.,1983). Segundo Hallsworth e Magan (1994), o glicerol e cloreto de sódio um sal semelhante ao cloreto de potássio utilizado em nossos estudos, melhoraram a germinação de conídios de várias espécies de fungos sob a indução de estresse osmótico podemos perceber esse efeito sobre Trichotecium roseum que apresentou maior resistência. Alguns estudos mostraram que o controle de fungos de pragas de insetos tem sido inadequado devido a grande dificuldade de crescimento e germinação a baixa disponibilidade de água (HALLSWORTH, MAGAN, 1997). Dentre as espécies analisadas podemos verificar que Tolypocladium geodes não seria um agente tão eficiente para o combate a pragas, pois o mesmo apresentou a menor resistência ao estresse osmótico tendo sua germinação reduzida a partir de 0,692 M. Estudos indicam, por esta espécie ser encontrada muito em cursos de água contaminando mosquitos transmissores de doenças como Aedes e Anopheles, e portanto, este fungo tem uma ecologia aquática que evitaria o estresse osmótico (ROCHA et al, 2015). Estudo feito por Cao et al. (2011) demonstrou que o fungo Metarhizium acridum, apresentou aproximadamente 50% de germinação na concentração de 1,0 M, resultado semelhante foi observado no presente estudo, onde o isolado Metarhizium acridum (ARSEF 324) apresentou o inibição de 50% em 0.9 M, o que indica que o isolado apresenta um nível de tolerância moderada ao estresse osmótico. Estudos feito por Li e Holdon (1995) analisaram o crescimento dos fungos Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana em meio completo, e em meio suplementado com 0,52 g de KCl, observou-se uma diferença entre os dois meios de cultivo, a técnica de quantificar a é muita aplicada, pois, se trata de um método simples, de baixo custo e eficiente para avaliação de padrões de crescimento de microrganismos. De certa forma, observou-se certa exigência nutricional por parte do fungo Metarhizium anisopliae, que apresentou uma massa de 0,60 g quando exposto em meio completo e 0,29 g quando exposto em meio com KCl, enquanto Beauveria bassiana apresentou 0,64 g em meio completo e 0,36 g em meio com KCl em nossos estudos sobre a capacidade de germinação verificamos que o isolado de

Metarhizium anisopliae (ARSEF 4570), apresentou em sua concentração inibitória (IC50) de

0.734 M, em contrapartida Beauveria bassiana apresentou uma concentração inibitória (IC50) de 0.772 M que comprova segundo HALLSWORTH e MAGAN, 1997, da importância da disponibilidade de água para crescimento e germinação dos fungos . Conidios de Metarhizium robertsii produzidos em meios suplementado com NaCl ou KCl foram mais tolerantes ao calor e aos raios UV-B do que os do meio não suplementado. Estresses osmóticos e nutritivos resultou na produção de conídios com um fenótipo de estresse robusto, mas também foram associados com baixa produtividade de conídios. O que comprova os resultados obtidos em nosso experimento o isolado Metarhizium robertsii (ARSEF 2547) apresentou grande produção de micélio e baixa produção de conídios, e com germinação moderada, com 1.3 M apresentou 60% de germinação (IC50 de 1.3M). De acordo com estudos feitos por Lewis, Learmonth e Attfield (1997) em ensaios de resistência ao estresse causado por elevada concentração de sal no meio, S. cerevisiae de linhagens de panificação apresentaram resistência a até 1,5 M de KCl, o que é similar com os nossos estudos. Islam et al ( 2016) testou a virulência de dois isolados Metarhizium anisopliae em condições de estresse osmótico, com 0,5 M e 1,0 M de NaCl e 0,5 e 1,0 M de KCl ambos isolado apresentaram 97 % de germinação para 0,5 M de NaCl e 0,5 M de KCl e 86,7 % para

1 M de NaCl , para 1 M de KCl ambos diferiram nos resultados, o isolado (PR1) apresentou

83,9% de germinação e o isolado ( GT3) apresentou 83,8%. Em nossos estudos os isolados de Metarhizium anisopliae (ARSEF 2341, 4343, 4570 e 5749.) apresentaram resultados semelhantes com 0,5 de KCl, com 100% de germinação, com 1,0 de KCl a maioria dos isolados, excetos o ARSEF 1187 e 4570 foram mais resistentes que os isolados utilizados por Islam, mantendo 100% de germinação, o isolado ARSERF 1187 aproximou se do resultado encontrado por Islam, tendo aproximadamente 77% de conídios germinados. O isolado Metarhizium anisopliae (ARSEF 4570) da Ilha de Macquaire na Australia , apresentou menor tolerância em relação aos demais isolados de Metarhizium, com 1.0 M de KCl ocorreu apenas 15% de germinação dos conídios . De acordo com Gunde-Cimermman et al. (2003), o congelamento leva à desidratação celular enquanto que concentrações de sal elevada provoca os mesmos efeitos, devido a desequilíbrios osmóticos as células acumulam alguns solutos em resposta a certos estresses, como dessecação e alta salinidade, uma vez que a proteção contra danos de desidratação está correlacionada com o acumulo intracelular de solutos compatíveis, como por exemplo a trealose. Assim, pode haver uma relação entre a resistência à seca, salinidade elevada e frio em espécies de fungos. Tudo indica que o isolado

(ARSEF 4570) chegou até a ilha através de insetos migratórios, portanto não encontrou condições favoráveis para se desenvolver, apresentando assim baixa resistência ao estresse osmótico. De acordo com Doberski, (1981); Chandler, Heale e Gillespie (1994); Hassan, Dillon e Charnley (1989), a aceleração da germinação aumenta a virulência do fungo, onde os conídios que conseguem germinar em altas concentrações de soluto e baixa umidade relativa, no entanto isso pode ser muito relativo, porque o inseto apresenta diferentes fases de desenvolvimento a superfície de uma larva por exemplo deve possuir uma maior atividade de agua do que a de um inseto adulto o que contribui para que os conídios germinem mais rapidamente do que os conídios em condições normais, sendo assim, podem contribuir para melhorar a patogenicidade de agentes de controle biológico.

5.2 Fungos Patógenos de Plantas.

O milho é considerada uma cultura de grande importância econômica no Brasil e, devido ao aumento de produtividade, tem se observado maior interesse dos pesquisadores no controle de patógenos que são comumente encontrados na cultura, dentre esses, o Fusarium verticillioides (MACHADO; OLIVEIRA; VIEIRA, 2001). O uso da restrição hídrica ou condicionamento fisiológico em meio de cultura de Potato-Dextrose-Ágar (PDA) tem sido utilizado para inoculação de alguns fungos em sementes com a vantagem de permitir maior exposição dessas ao inóculo, desde que o potencial osmótico do meio restrinja a germinação das sementes e não prejudique o desenvolvimento das colônias do patógeno. Para cada microrganismo existe uma faixa adequada de potencial hídrico para o seu crescimento em meios de cultura osmoticamente modificados, pois estes diferem na habilidade de absorver água do ambiente (COUTINHO; GUIMARÂES,2001) Estudos feitos por Coutinho e Guimarães (2001) não apresentaram modificações na germinação de conídios com 0,6 M á 1,0 M de KCl , concordando com nossos resultados que apresentou 100% de germinação de todos os isolados de Fusarium nas mesmas concentrações, porém ele notou diferenças no crescimento micelial, em relação ao grupo controle, Utilizando as concentrações de 0,6 e -1,0 M de PDA+KCl o desenvolvimento da

colônia fúngica de F. verticillioides foi estimulada. Na concentração de 1,2 M o crescimento micelial foi de 4,14 cm, enquanto que o controle obteve 4,09 cm. Os resultados apresentados por Rey (2005) mostra uma grande resistência do isolado Colletotrichum lindemuthianum ao utilizar NaCl ou sacarose no meio de cultura. este comportamento diferenciado sugere-se a hipótese de que o isolado C. lindemuthianum com alta virulência apresentam maior facilidade de absorção sob-restrição hídrica, contribuindo assim para o seu crescimento vegetativo no interior dos tecidos do hospedeiro. Nestas raças, a sacarose mostrou-se de grande utilidade para o aumento do crescimento das colônias de C. lindemuthianum, quando comparados com o controle. O aumento do crescimento radial e micelial do patógeno, pode ser atribuído à adição da fonte de carbono (GAO; SHAIN, 1995), facilmente metabolizado por C. lindemuthianum. Os ajustes osmóticos de - 0,6 e - 0,8 M de sacarose proporcionaram uma ótima absorção do açúcar pelo fungo, consequentemente, fácil absorção de energia e também um melhor ajuste osmótico da célula fúngica propiciado pela absorção dos solutos, permitindo maior turgor para extensão celular (COUTINHO; GUIMARÃES, 2001). O uso de sacarose para restringir a quantidade de água do meio de cultura também proporcionou o aumento no diâmetro de colônia de Ascochyta paspali (MORLEY et al., 1993), concordando com os resultados deste trabalho onde os isolados do gênero Colletotrichum apresentaram rápido crescimento de suas colônias ( professor não me lembro quantos dias ao certo) e 100% de germinação nas mesmas concentrações utilizadas por Reys (2005) de 0.6 á 08M de KCl.

5.3 Fungos Antagonistas

O controle biológico tem sido demonstrado ser eficaz sob condições laboratoriais para muitas doenças fúngicas, mas apenas alguns produtos de biocontrole têm sido comercializados com sucesso. Uma razão para esta falta de sucesso comercial é que os agentes de biocontrole são organismos afetadas pelas condições ambientais variáveis. Pré- adaptação a uma condição de estresse particular também pode tornar as células resistentes a outros estresses, um fenômeno conhecido como proteção cruzada (SANDERS; VENEMA; KOK, 1999, RANGEL, 2011) Trichoderma atroveride apresentou em alguns estudos realizados, com 1 M de de KCl ou NaCl alta resistência ao estresse osmótico e um aumento no acumulo de glicerol em suas estruturas de fixação. Isso acontece devido a sua função de microparasita que ataca e penetra

fungos por meio do apressório, esse mecanismo evita a perda de água pela célula (INBAR; CHET, 1995), em nossos estudos espécies de Tricoderma lignorovum apresentou com 1 M de KCl 70% de germinação, tais resultados são similares com os resultados obtidos neste estudo (Fig. 5, Tabela 5). Os efeitos benéficos de Trichoderma sobre estresse abiótico têm sido bem documentadas (DONOSO et al., 2008; BAE et al, 2009 ), embora os mecanismos que controlam os fatores de estresse múltiplo de plantas ainda são desconhecidos. Recentemente, Mastouri et al. (2010) relatou que o tratamento de sementes de tomate com T. harzianum acelera a germinação das sementes, aumenta vigor de planta melhorando seu crescimento quando expostos a 150 mM de NaCl, e aumentando a sua proteção contra tensões refrigeração e aquecimento por indução de proteção fisiológica em plantas contra danos oxidativos e induz a resistência a doenças fúngicas e tolerância ao estresse salino (MASTOURI et al. , 2010 ).

6 CONCLUSÕES

O isolado que apresentou maior tolerância entre os fungos entompatogênico foi o fungo Trichotecium roseum (ARSEF 1212) (LC90 = 3.350), osmolaridade, permitindo o conhecimento sobre isolados com poucos estudos que podem ser utilizados como alternativa no combate a pragas de agricultura.

O fungo Tolypocladium geodes (ARSEF 3275) (LC90 = 0.692) foi o menos tolerante ao estresse osmótico, entre os fungos entomopatogencos. Entre os fungos fitopatogênicos, temos como o mais resistente o isolado Colletotrichum fiorinae (ARSEF 10220), o que nos confirma estudos feito com um dos grandes causadores de antracnose em uma ampla gama de plantas de importância econômica, mostrando sua facilidade em sobreviver em ambientes com restrição hídrica, até encontrar uma planta hospedeira, o isolado que apresentou menor tolerância foi mutante do Fusarium fujikuroi que apresentou alta produção de carotenoides, o que pode contribuir para sua baixa resistência ao estresse osmótico. Os estudos realizados mostraram a importância do conhecimento de novos isolados como o antagonista clonostrachys candelabrum uma espécies que não apresenta muitos estudos realizados como fungo antagonista para o combate de pragas de agricultura, e apresentou uma alta resistência ao estresse osmotico sendo assim uma alternativa que pode ser analisada e utilizada com sucesso como os isolados do genêro Trichoderma.

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