APROXIMACIÓ A LA DIVERSITAT DE MICROORGANISMES Estudi fenotípic i genotípic del microbioma de conills salvatges com a via per a introduir-se al món de la Microbiologia 16 DE GENER DE 2016 PSEUDÒNIM: CALAVERA DE FOC Institut ¿?¿?¿? Curs 2016/2017 Departament de Ciències Naturals TUTORA: ¿?¿?¿? Treball de Recerca de Batxillerat Institut ¿?¿?¿? Batxillerat científic APROXIMACIÓ A LA DIVERSITAT DE MICROORGANISMES Estudi fenotípic i genotípic del microbioma de conills salvatges com a via per a introduir-se al món de la Microbiologia Memòria presentada pel Sr. Calavera de Foc com a resultat del seu treball en el camp de la Microbiologia durant la seva estada en el CEAB (Centre d’Estudis Avançats de Blanes) Calavera de foc Centre d’Estudis Avançats de Blanes (CEAB) Blanes, estiu de 2016 “ El sentido de la vida es 5′-3′ ” Dra. Rosa Elena Sarmiento (Ciutat de Mèxic, Mèxic; 28 d’agost de 1966) SUMARI Resum general del treball presentat 1 1. Introducció 2 1.1 Brainstorming i Worrywillie per escollir la temàtica 2 1.2 Contacte amb el CEAB – CSIC 4 1.3 Objectius del treball 5 1.4 Hipòtesi de partida 6 DOCUMENTACIÓ 2. Obtenció d’informació sobre l’àmbit microbiològic 8 2.1 Història de la Microbiologia 9 2.1.1 Introducció 9 2.1.2 Nomenclatura de microorganismes 11 2.1.3 Tipus de microorganismes 11 2.1.4 Organització cel·lular dels organismes 14 2.1.5 Cronologia dels successos en Microbiologia 15 2.1.5.1 Etapa especulativa (des de l’antiguitat fins 1675) 15 2.1.5.2 Etapa de les observacions (de 1675 a mitjan segle XIX) 16 2.1.5.3 Etapa dels cultius (segle XIX – segle XX) 20 2.1.5.4 Etapa de les especialitzacions (des del s. XX fins als nostres dies) 25 2.2 L’estudi revolucionari de la Gut Microbiota i les seves aplicacions 29 2.2.1 Què és la Gut Microbiota i per què és important? 29 2.2.2 Què sabem a dia d’avui de la microbiota intestinal? 30 2.2.3 Microorganismes presents a la microbiota intestinal 31 2.2.3.1 Classificació segons la regió habitada 32 2.2.3.2 Classificació segons perillositat 33 2.2.3.3 Descripció dels gèneres microbians presentats 33 2.2.4 Modulació dietètica de la microbiota intestinal 35 2.2.5 La revolució de la Gut Microbiota en el desenvolupament de malalties 37 2.3 La microbiota dels conills de camp 39 2.3.1 Taxonomia, fisiologia, comportament i hàbitat dels conills 39 2.3.2 La microflora intestinal dels conills de camp 40 2.4 Aproximació a l’estudi del microbioma per mitjà de marcadors moleculars 42 2.4.1 El gen 16S rRNA 42 2.4.1.1 Un gen universal 42 2.4.1.2 rRNA 16S i els ribosomes 42 2.4.2 Característiques rellevants del gen 16S 44 PART PRÀCTICA DEL TREBALL 3. Estudi microbiològic de la flora bacteriana de conills 46 3.1 Introducció i temporització 46 3.1.1 Diagrama de Gantt sobre el projecte 46 3.2 Desenvolupament de la part pràctica al laboratori de Biologia Molecular 47 3.2.1 Normes de laboratori i gestió de residus 47 3.2.2 Mostres fecals i procés de sembra en plaques d’agar-agar 50 I. Selecció de l’objecte d’estudi 50 II. Preparació dels cultius bacterians: tipus de sembra i característiques 51 a) Material bàsic i dades de les solucions requerides 52 b) Sembres en medis sòlids 53 c) L’estria múltiple (o estria en T) 54 d) La sembra homogènia en superfície (spread-plate) i el banc de dilucions 55 3.2.3 Visualització de les morfologies colonials i cel·lulars. Estudi fenotípic de les seves característiques 58 I. Material bàsic 58 II. Funcionament del programari ImageFocus 4 Software Package i de la càmera microscòpica CMEX-5 Pro 59 III. Tractament fotogràfic de les plaques i de les morfologies colonials amb la lupa binocular 62 a) Imatges de les plaques a nivell macroscòpic 62 b) Imatges de les morfologies colonials 63 IV. Tractament fotogràfic de les morfologies cel·lulars amb el microscopi òptic i l’objectiu d’immersió. El frotis cel·lular 65 a) El frotis cel·lular i la tinció senzilla de blau de metilè 65 b) El microscopi òptic i el seu funcionament 69 V. Recull de les qualitats fenotípiques 72 a) Qualitats fenotípiques de les morfologies colonials 72 b) Qualitats fenotípiques de les morfologies cel·lulars 73 3.2.4 Amplificació de fragments del 16S rDNA mitjançant la reacció en cadena de la polimerasa (PCR) 75 I. Amplificació de material genètic i PCR template 75 Procediment de la PCR 75 Preparació del banc d’electroforesi 78 Visualització dels resultats amb el programari QuantityOne 80 II. Amplificacions de DNA amb èxit 82 A. 2a PCR template de les mostres que no havien amplificat i de les no analitzades 82 B. Nested-PCR 85 C. 2a Nested-PCR 87 III. Mostres amplificades 88 IV. Enviament a Macrogen Inc. per a seqüenciació 89 a) Carta de presentació 91 b) Document de patogenicitat 92 c) Factura comercial 92 3.2.5 Estudi bioinformàtic de les seqüències 93 I. Tasques preliminars: revisió de l’Excel de qualitats fenotípiques 94 II. Funcionament del programari R i RStudio 95 III. Script dels clústers de les morfologies cultivades 99 a) Script colonial 99 b) Script cel·lular 101 IV. Seqüències moleculars i creació de l’arbre filogenètic 103 a) Outline del treball bioinformàtic 103 RESULTATS I CONCLUSIONS 4. Resultats finals i discussió 108 4.1 Resultats de cultiu 108 I. Fotografies a nivell macroscòpic de les plaques cultivades 108 II. Taules de recomptes de Spread-Plate 115 III. Tractament fotogràfic de les morfologies colonials 117 IV. Taula Excel de les qualitats fenotípiques colonials 123 V. Clúster colonial 125 4.2 Resultats d’observacions 128 I. Tractament fotogràfic dels frotis cel·lulars 128 II. Taula Excel de les qualitats fenotípiques cel·lulars 152 III. Clúster cel·lular 154 4.3 Resultats genètics 156 I. Gels d’electroforesi i amplificació de les mostres mitjançant PCR 156 a) 1a anàlisi i PCR template 157 b) 2a PCR template de mostres no amplificades i de mostres sense analitzar 158 c) Amplificació mitjançant Nested-PCR 159 d) 2a Nested-PCR i últimes mostres amplificades 159 II. Seqüències genètiques de Macrogen Inc. 160 III. Taula d’identificacions taxonòmiques 163 IV. Arbre filogenètic 169 4.4 Discussió dels resultats 171 Comparativa d’agrupacions 171 Correspondència del cultiu bacterià amb la microbiota intestinal de conills 174 Ecologia bacteriana 175 5. Conclusions 178 6. Agraïments 181 7. Bibliografia 183 ANNEX I: La PCR. Funcionament i ús 189 ANNEX II: El “Pool”. Gel de comprovació genètica i quantificació de DNA per QUBITTM 190 ANNEX III: Altres metodologies emprades per a l’extracció i amplificació de material genètic 195 Aproximació a la diversitat de microorganismes Treball de Recerca Resum general del treball presentat El projecte a exposar en les properes pàgines té com a objectiu aproximar-se a l’àmbit de la Microbiologia, per a molts desconegut i inèdit. Per fer-ho, haurem de treballar amb mostres fecals de conill salvatge i analitzar la seva composició biològica. Això ens permetrà, d’alguna manera, concebre la microbiota intestinal d’aquests petits lepòrids. El TdR en qüestió contindrà una primera fase documentativa on es tractarà (1) la història d’aquesta branca científica, (2) la importància que té la flora intestinal, (3) el conill de camp i la seva microflora i (4) el gen universal amb què treballarem a la fase pràctica. Pel que fa a aquesta última, es farà un ampli recorregut que iniciarà amb les tècniques de cultiu tradicional (sembra en plaques Petri, observació a la lupa binocular i al microscopi, etc.) i que finalitzarà amb l’estudi molecular dels morfotips cultivats (amb la tècnica de la PCR), la seqüenciació del corresponent material genètic i l’obtenció d’agrupacions morfològiques (tant a nivell colonial com a nivell cel·lular i filogenètic). Els Resultats seran força contundents i ajudaran en l’argumentació de la hipòtesi plantejada. Per una banda, tindrem els resultats de cultiu (que inclouran fotografies de les plaques i de les colònies bacterianes, el recull de qualitats fenotípiques, taules de recomptes i un clúster colonial dut a terme amb eines bioinformàtiques); per altra banda, els resultats d’observació constituiran la segona etapa d’aquesta fase (fotografies dels frotis cel·lulars, un segon recull de qualitats fenotípiques i un altre clúster, ara a nivell cel·lular). Per acabar, les seqüències rebudes serviran per establir un arbre filogenètic així com per determinar la taxonomia dels gèneres obtinguts. Un cop finalitzat l’estudi, podrem concloure que l’anàlisi molecular ens permet una resolució molt més elevada del gèneres bacterians, ja que les metodologies tradicionals (cultiu i observació) esdevenen ineficaces per una manca de discriminació. Com és evident, també repassarem els objectius plantejats i comprovarem si aquests s’han acabat duent a terme. 1 Aproximació a la diversitat de microorganismes Treball de Recerca 1. Introducció El projecte d’enguany funciona com a incentiu per acabar de polir les meves tendències educatives, principalment universitàries, i guiar-me així en la difícil elecció que m’espera d’aquí a uns mesos. Com a conseqüència, el treball no pot ser extremadament difícil d’abastar, ja que aquest fet només comportaria més confusió, però sí que ha de plantejar-me una visió bastant àmplia de la branca científica que vulgui tractar. Per poder comprendre millor els meus interessos acadèmics, estructuraré un brainstorming (o pluja d’idees) que em mostrarà quina podria ser la temàtica ideal a treballar durant els mesos següents.