Relaciones Evolutivas de las Especies del Genéro Lucifuga (Ophidiiformes: Bythitidae) en Cuba

Item Type Theses and Dissertations

Authors Centro de Investigaciones Marinas Universidad de La Habana; Hernández Martínez, D.

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Centro de Investigaciones Marinas Universidad de la Habana

Relaciones Evolutivas de las Especies del Genéro Lucifuga (Ophidiiformes: Bythitidae) en Cuba

Trabajo presentado en opción al Título Académico de Maestro en Biología Marina y Acuicultura con mención en Ecología Marina

Autor: Lic. Damir Abel Hernández Martínez Tutor: Dr. Erik García Machado

La Habana 2005 Resumen

Resumen. En el presente trabajo se realizó un estudio de las relaciones evolutivas de las especies representativas de peces del género Lucifuga en Cuba mediante el análisis de sus variaciones genéticas y moleculares. Se estudiaron 11 sistemas proteicos y la secuencia parcial del gen mitocondrial citocromo b (cytb). Los animales fueron colectados en diferentes localidades de la zona occidental de Cuba. La filogenia reconstruida a partir de los caracteres moleculares indica la existencia de dos linajes evolutivos fundamentales cuya divergencia está sustentada por 11 loci proteicos, 73 sinapomorfías mitocondriales y un uso diferencial de los codones que codifican para el aminoácido valina. Uno de los linajes está constituido por las especies L. dentatus, L. dentatus var. holguinensis y L. simile y el otro por las especies L. subterraneus y L. teresinarum. La distribución de las especies en los linajes evolutivos se corresponde con la asignación de las mismas a los dos subgéneros definidos para este género. El análisis filogenético sostiene que las especies L. simile, L. dentatus y L. subterraneus constituyen linajes evolutivos independientes caracterizados por múltiples sinapomorfías, coincidiendo con clasificación taxonómica actual. L. teresinarum no se sustenta como clado monofilético y apunta a ser una sinonimia de L. subterraneus, aunque los resultados al respecto no son concluyentes. Los ejemplares de la denominada L. dentatus var. holguinensis capturados en dos localidades del norte de Matanzas constituyen un clado bien soportado definido por caracteres moleculares, bioquímicos y morfológicos. Esto sugiere la revisión de su estatus taxonómico. Índice

Introducción...... i 1 Revisión Bibliográfica...... 1 1.1 Clasificación taxonómica del género Lucifuga...... 1 1.2 Características generales del género Lucifuga...... 1 1.3 Consideraciones sobre las especies que conforman el género...... 3 1.3.1 Descripción de las especies...... 3 1.3.2 Distribución geográfica de las especies cubanas...... 5 1.4 Criterios sobre la evolución del género...... 6 1.5 Filogenia...... 7 1.6 Caracteres moleculares...... 8 1.6.1 Proteínas...... 9 1.6.1.1 Métodos electroforéticos...... 10 1.6.2 ADN mitocondrial...... 12 1.6.2.1 ADN mitocondrial como carácter molecular...... 13 2 Materiales y Métodos...... 15 2.1 Material biológico...... 15 2.2 Procesamiento de las muestras...... 16 2.2.1 Análisis Proteico...... 16 2.2.1.1 Preparación de los extractos...... 16 2.2.1.2 Electroforesis...... 17 2.2.1.3 Características y visualización de los sistemas proteicos estudiados...... 17 2.2.2 Análisis de la variación de la secuencia del gen mitocondrial citocromo b (cytb)..18 2.2.2.1 Obtención del ADN total...... 18 2.2.2.2 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y Secuenciación...... 19 2.3 Procesamiento Matemático...... 20 2.3.1 Proteínas...... 20 2.3.2 ADN mitocondrial...... 21 3 Resultados...... 23 3.1 Variación de loci proteicos en tres taxa...... 23 3.1.1 Análisis Filogenético...... 26 3.2 Análisis del gen mitocondrial cytb...... 27 3.2.1 Análisis de la variación...... 27 3.2.2 Saturación de las secuencias...... 32 3.2.3 Análisis Filogenético...... 33 3.2.3.1 Comparación de Topologías...... 34 4 Discusión...... 39 4.1 Relaciones evolutivas...... 39 4.2 Consideraciones taxonómicas...... 42 5 Conclusiones...... 51 6 Recomendaciones...... 52 Bibliografía...... 53 Índice

Anexos...... 60

Introducción

Introducción.

El género Lucifuga de la familia Bythitidae, subfamilia Brosmophycinae, está constituido por pequeños peces de cuerpo prolongado y comprimido lateralmente, que carecen de visión y que habitan en cuevas, cacimbas y grietas en aguas desde totalmente dulce hasta marinas (Nielsen et al., 1999). El género está conformado por 6 especies, de éstas, 4 son endémicas de Cuba. Estos peces constituyen los únicos vertebrados estrictamente troglobios que existen en el archipiélago cubano y juegan un papel importante en los ecosistemas donde habitan al ser, generalmente, el eslabón más alto de la cadena trófica (García-Debrás y Pérez, 1999). Al suponerse que el tamaño de las poblaciones es pequeño y producto de la fragilidad del hábitat que ocupan, todas las especies han sido consignadas como vulnerables en el libro rojo de especies amenazadas de la unión internacional para la protección de la naturaleza y los recursos naturales (IUCN Red List, 2000).

Aunque el descubrimiento de las primeras especies del género data de más de un siglo, el interés que estos peces han despertado en la comunidad científica ha sido esporádico. Una parte importante de los estudios (Poey, 1858; Gill, 1863; Cohen y Robins, 1970; Nalbant, 1980; Díaz et al., 1987a; Díaz, 1988; Cohen y McKoster, 1998) se han centrado en la discusión de los caracteres morfológicos que definen el género y las especies, y unos pocos trabajos han abordado las relaciones filogenéticas de las especies sobre la base de caracteres morfológicos (Vergara, 1980, 1981).

Los criterios más generalizados reconocen a la especie de la Bahamas, L. speleotes, como la más ancestral (Cohen y Robins, 1970; Vergara, 1980; Díaz, 1988) y a las especies cubanas más recientes siguiendo un gradiente de especiación desde la más plesiomórfica (L. dentatus), hasta las más apomórficas y recientes (L. subterraneus y L. teresinarum) (Vergara, 1980, 1981; Díaz, 1988).

Sin embargo, algunos de los caracteres morfológicos utilizados para la definición de las especies y la inferencia de sus relaciones se comportan variables entre las especies por lo que no constituyen caracteres diagnostico (ej.: las relaciones entre las aletas caudal, dorsal y anal; la estructura de la papila anal masculina; la ausencia/presencia de dientes en los huesos platinos; entre otros). En este sentido tampoco se conocen los patrones evolutivos de estos

i Introducción caracteres. Por estas razones algunas de las inferencias taxonómicas y evolutivas que se han establecido sobre la base de caracteres morfológicos se sustentan en criterios de poca solidez.

En casos como el que se da en Lucifuga donde los caracteres morfológicos en cierta medida son poco sólidos en el diagnóstico de entidades taxonómicas y de sus relaciones evolutivas, los estudios utilizando caracteres moleculares son de gran utilidad (Avise, 1994; Nei y Kumar, 2000; Graur y Li, 2000). En este sentido, el uso de varios tipos de datos moleculares y métodos de reconstrucción proporciona un alto grado de confiabilidad a la estimación filogenética (Chen et al., 2003). Teniendo en cuenta estos planteamientos sustentamos el presente trabajo sobre la base de la siguiente Hipótesis:

Si se utilizan caracteres moleculares y diferentes métodos de reconstrucción filogenética se podrán determinar las relaciones evolutivas del género Lucifuga, y contribuir al esclarecimiento de la clasificación taxonómica de las especies.

Para probar la hipótesis planteada se trazaron los siguientes objetivos:

♦ Estudiar la variación de loci proteicos y de la secuencia nucleotídica del gen mitocondrial citocromo b (cytb) entre las diferentes especies cubanas del género Lucifuga.

♦ Utilizar diferentes métodos de reconstrucción filogenética (distancias, parsimonia y probabilidad) para inferir las relaciones evolutivas entre las especies cubanas del género Lucifuga.

♦ Evaluar los criterios taxonómicos actuales sobre la base de la filogenia inferida.

ii Revisión Bibliográfica

1 Revisión Bibliográfica.

1.1 Clasificación taxonómica del género Lucifuga.

El orden Ophidiiformes agrupa peces que se caracterizan por presentar el cuerpo alargado y comprimido lateralmente. Presentan aletas pélvicas reducidas a un único radio y las aletas dorsal y anal largas, que se extienden hasta la base de la aleta caudal. Para el orden se reconocen dos subórdenes, cuya principal diferencia radica en la presencia o ausencia de un apéndice genital masculino llamado papila anal. El suborden Ophidioidei (que carece de papila anal) agrupa dos familias: Carapidae y Ophidiidae, esta última comprende cuatro subfamilias. El suborden Bythitoidei (que presenta papila anal) también agrupa dos familias: Aphyonidae y Bythitidae, esta última comprende dos subfamilias, en una de las cuales (Brosmophycinae) se incluye el género Lucifuga (Nielsen et al., 1999).

La clasificación taxonómica más aceptada para el género Lucifuga es la propuesta por Nielsen et al. (1999): Reino: Animalia Phylum: Chordata Subphylum: Vertebrata Clase: Osteicthyes Subclase: Actinopterigii Superorden: Teleostei Orden: Ophidiiformes (Mead et al, 1964) Suborden: Bythitoidei (Cohen y Nielsen, 1978) Familia: Bythitidae (Gill, 1861) Subfamilia: Brosmophycinae (Gill, 1862) Género: Lucifuga (Poey, 1858) Subgénero: Lucifuga (Cohen y Robins, 1970) Stygicola (Cohen y Robins, 1970) Especies: Lucifuga (Lucifuga) subterraneus (Poey, 1858) Lucifuga (Lucifuga) teresinarum (Díaz, 1988) Lucifuga (Stygicola) dentatus (Poey, 1858) Lucifuga (Stygicola) speleotes (Cohen y Robins, 1970) Lucifuga (Stygicola) simile (Nalbant, 1981) Lucifuga inopinata (Cohen y McCoster, 1998)

1.2 Características generales del género Lucifuga.

El género Lucifuga fue descrito por Poey en 1858 y está constituido por pequeños peces troglobios, que carecen de visión. El autor identificó el género con este nombre por la

1 Revisión Bibliográfica tendencia de estos peces de vivir a la sombra evadiendo la claridad. Etimológicamente la palabra Lucifuga proviene del Latín fugere lucem que significa huir de la luz.

Estos organismos habitan en cuevas, cacimbas y grietas en aguas desde totalmente dulce hasta marinas y a profundidades desde cero hasta aproximadamente 50 metros, excepto L. inopinata, capturado a 202 metros de profundidad (Nielsen et al., 1999).

Estos peces pueden ser clasificados como carnívoros generalistas que se alimentan de forma oportunista de anfípodos, micidáceos y algunas presas relativamente mayores (pequeños cangrejos y camarones), de esta manera juegan un importante papel en el equilibrio ecológico de las poblaciones de otros organismos acuáticos en las cuevas donde ellos habitan al ser, usualmente, el eslabón más alto de la cadena trófica (García-Debras y Pérez, 1999).

Los peces del género Lucifuga se caracterizan por presentar el cuerpo alargado y comprimido lateralmente, con la sección caudal poco prolongada. El mismo está cubierto de pequeñas escamas cicloideas imbricadas. La cabeza es deprimida, cubierta por una piel rugosa, parcialmente desprovista de escamas y con amplios canales cavernosos. La boca está bien hendida, no protráctil y provista de labios carnosos. La mandíbula inferior es algo más retraída que la superior. Presentan dientes villiformes formando series en el premaxilar, dentario, vómer y la faringe, en los palatinos pueden estar presentes o ausentes. La abertura nasal es doble, la abertura anterior es más pequeña y se ubica justo encima del labio superior. Los ojos se encuentran poco desarrollados o completamente ausentes. La abertura branquial está hendida aproximadamente hasta la sínfisis de la mandíbula inferior y las membranas branquiales están separadas. Poseen 7 radios branquiostegos y la espina del opérculo está cubierta por la piel de la cabeza. El preopérculo no es denticulado. Las aletas ventrales se encuentran en posición yugular y están compuestas por un solo radio no ramificado, las pectorales están constituidas por radios unidos que varían en número, con pedúnculo más ancho que largo. La aleta dorsal es única y continuada, lo mismo que la anal. La aleta caudal termina en punta y puede estar separada o fusionada, completa o parcialmente, a la dorsal y la anal. La línea lateral no es continua, presenta una sección anterior y superior que se extiende desde la cabeza hasta un punto medio entre los orígenes de las aletas dorsal y anal, la sección media inferior nace un poco antes del extremo posterior de la primera y se extiende hasta la base de la aleta caudal. Los machos presentan una papila anal que carece de partes osificadas

2 Revisión Bibliográfica

(Poey, 1858; Cohen y Robins, 1970; Nalbant, 1981, Díaz, 1988, Díaz et al., 1987, Nielsen et al, 1999).

1.3 Consideraciones sobre las especies que conforman el género.

El género está constituido por 6 especies reconocidas, 4 de ellas son endémicas de Cuba. Las primeras especies descritas fueron L. subterraneus y L. dentatus descubiertas en cavernas al sur de La Habana (Poey, 1858). Cohen y Robins en 1970 describieron una nueva especie en la Isla de Nueva Providencia en las Bahamas, nombrándola L. speleotes. Posteriormente se encontró una nueva especie al Norte de la provincia de Matanzas y se nombró L. simile (Nalvant, 1981). L. teresinarum, descrita por Díaz (1988), se descubrió en dos cuevas de la formación Ashton en Artemisa, provincia La Habana, esta especie es muy similar a L. subterraneus y comparte unos pocos caracteres con L. dentatus, viviendo en sintopía con estas dos especies. El último integrante del género fue descubierto en el Pacífico cerca de las Islas Galápagos y fue denominada L. inopinata (Cohen y McCoster, 1998). Sin embargo, la designación de esta especie dentro del género Lucifuga resulta controvertida (Cohen, comunicación personal), por lo que no se volverá a referir en el texto. También se ha descrito una variedad para L. dentatus, L. dentatus var. holguinensis (Díaz et al., 1987a), que carece de dientes en los huesos palatinos y fue descubierta en Gibara, Provincia Holguín.

Gill (1863), basándose en las características de la dentición, propone el género Stygicola donde ubicó a L. dentatus por presentar dientes en los huesos palatinos, L. subterraneus, que no los posee, quedó en el género Lucifuga. Sin embargo Cohen y Robins (1970) hacen una revisión de esta clasificación genérica y concluyeron que el carácter analizado presenta un valor subgenérico, por lo que propusieron los subgéneros homónimos.

1.3.1 Descripción de las especies.

Lucifuga subterraneus (Poey, 1858): Cuerpo alargado, comprimido, principalmente de la extremidad del abdomen a la punta caudal, disminuyendo de manera imperceptible. Cabeza poco elevada en la región occipital y muy deprimida en la parte anterior. Las escamas de la cabeza presentes en la región occipital, sobre el opérculo y sobre los músculos que revisten el preopérculo. Ojos ausentes, la cavidad ocular presenta una cubierta dérmica muy desarrollada. Carece de dientes en los huesos palatinos. Aletas dorsal, caudal y anal continuadas en una

3 Revisión Bibliográfica sola, difícil de distinguir la caudal de las otras dos. Número de radios dorsales: 80-87, anales: 60-72, pectorales: 11-14. Número de vértebras: 46-47.

Lucifuga teresinarum (Díaz, 1988): Cuerpo alargado, comprimido, principalmente de la extremidad del abdomen a la punta caudal, disminuyendo de manera imperceptible. Cabeza poco elevada en la región occipital y muy deprimida en la parte anterior. Las escamas de la cabeza presentes en la región occipital, sobre el opérculo y sobre los músculos que revisten el preopérculo. Ojos ausentes, la cavidad ocular presenta una cubierta dérmica muy desarrollada. Carece de dientes en los huesos palatinos. Aleta caudal totalmente separada de las aletas dorsal y anal. Número de radios dorsales: 78-80, anales: 61-64, pectorales: 10-11.

Lucifuga dentatus (Poey, 1858): Cabeza elevada en la región occipital. Mayor abultamiento en la región yugular. La forma general del cuerpo es robusta y presentan las tallas mayores dentro del género. Ojos ausentes, con vestigio de globo ocular evidente en algunos ejemplares, la cavidad ocular presenta una cubierta dérmica muy desarrollada. Presenta dientes fuerte y agudos en los huesos palatinos; los dientes mandibulares son más largos que en L. subterraneus. Aleta caudal totalmente separada de las aletas dorsal y anal. Número de radios dorsales: 83-95, anales: 66-78, pectorales: 15-17. Número de vértebras: 46-48.

Lucifuga dentatus var. holguinensis (Díaz et al.,1987a): Según los autores, estos individuos presentan una elevada correspondencia de sus caracteres con los de L. dentatus (altura del cráneo, forma del cuerpo robusta, gran talla, número de radios pectorales, forma de la cola entre otros), pero difiere de esta por la carencia de dientes en los huesos palatinos.

Lucifuga simile (Nalbant, 1981): Cabeza elevada en la región occipital. La forma general del cuerpo es robusta y alargada. Región occipital de la cabeza puede estar cubierta de escamas o desnuda. Ojos ausentes, vestigio de globo ocular evidente con cubierta dérmica muy desarrollada. Presenta dientes en los huesos palatinos, estos están menos desarrollados que los de L. dentatus. La aleta caudal se encuentra unida parcialmente con la dorsal y anal por finas membranas basales o fusionada totalmente con la anal y basalmente con la dorsal. Número de radios dorsales: 73-77, anales: 57-60, pectorales: 11-14. Número de vértebras: 46-48.

Lucifuga speleotes (Cohen y Robins, 1970): Cabeza elevada en la región occipital. Mayor abultamiento en la región yugular. La forma general del cuerpo es robusta. Región occipital de la cabeza desnuda. Los ojos relativamente evidentes, pequeños, no funcionales. Presenta

4 Revisión Bibliográfica dientes fuertes y agudos en los huesos palatinos. La aleta dorsal se encuentra bastante posterior y se continúa con la caudal y la anal, la caudal es alargada y fácilmente distinguible. Número de radios dorsales: 92-98, anales: 66-78, pectorales: 18-20. Número de vértebras: 52- 53.

Poey (1858), en su descripción de las especies L. dentatus y L. subterraneus, hace alusión a un apéndice genital externo masculino, conocido como papila anal, sin profundizar mucho en sus características. Cohen y Robins (1970) describiendo a L. speleotes hicieron un análisis detallado de este órgano y lo compararon con las otras dos especies del género conocidas hasta el momento, L. dentatus y L. subterraneus, y llegaron a la conclusión de que el mismo es muy similar en las tres especies. Otros autores tampoco han consignado diferencias en su estructura (Gill, 1862; Eigenman, 1903; Vergara, 1980; Nielsen et al, 1999). Sin embargo, algunos autores reconocen diferencias en la morfología del apéndice entre las diferentes especies, a las que le han conferido valor taxonómico. Díaz et al. (1987a), Díaz et al. (1987b) y Nalbant (1981), argumentaron la existencia de diferencias en la morfología de la papila anal entre las diferentes especies, dándole las características distintivas a las papilas de L. dentatus y L. subterraneus. L. simile, no obstante compartir rasgos mayoritariamente con L. dentatus, presenta la morfología de la papila similar a la de L. subterraneus. Según Díaz (1988) L. teresinarum comparte la mayoría de sus características con L. subterraneus, pero comparte con L. dentatus la aleta caudal totalmente separada y la estructura de la papila anal.

1.3.2 Distribución geográfica de las especies cubanas.

Las especies cubanas de este género habitan en terrenos relativamente bajos, desde el límite con la costa hasta tierra adentro, en cuevas de formación sedimentaria de tipo caliza. Este sistema de rocas es de alta permeabilidad y constituye el conjunto rocoso más joven de la isla con menos de 35 millones de años de formación (Iturralde, 2003).

Hasta hace relativamente poco tiempo el hábitat de las especies se circunscribía a la zona occidental de la Isla grande, pero se han encontrando evidencias de la existencia de una de estas más al Este. Algunas especies tienen una distribución más restringida como L. teresinarum que se encuentra confinada a dos cuevas de la formación Ashton en Artemisa, provincia La Habana: "Cueva Lechuza" y "Cueva Baño II", donde vive en sintopía con L. subterraneus y L. dentatus. De igual manera L. simile que se ha encontrado solo en tres

5 Revisión Bibliográfica cuevas, al Norte de la provincia de Matanzas: "Grieta Punta de Guana" y "Cueva la Pluma" y en provincia La Habana: "Cueva del Túnel" (esta última pudiera ser un error de identificación). L. subterraneus habita solo en la provincia La Habana, donde puede encontrarse de Norte a Sur y generalmente en simpatría con L. dentatus (García-Debrás et al., 1999). La especie de más amplia distribución es L. dentatus que puede encontrarse desde la porción más occidental de la provincia de Pinar del Río, hasta la provincia de Holguín (Díaz et al, 1987a), aunque, según el conocimiento actual, la mayor cantidad de informes fidedignos aparecen en la región occidental, desde Pinar del Río hasta Matanzas.

1.4 Criterios sobre la evolución del género.

Los procesos que llevaron a la evolución del género han sido poco estudiados. Vergara (1980 y 1981) realizó, lo que hasta la fecha constituye el único acercamiento a la filogenia y biogeografía de este grupo. En estos trabajos se compararon 25 caracteres morfológicos de las especies L. subterraneus, L. dentatus y L. speleotes con aquellos de dos de las especies marinas del género Calamopteryx (C. goslinei (Böhlke y Cohen, 1966) y C. robinsorum (Cohen, 1973)) considerado por Cohen y Robins (1970) como uno de los más relacionado filogenéticamente con Lucifuga.

Los resultados obtenidos llevaron a concluir que los géneros Calamopteryx y Lucifuga constituían dos grupos monofiléticos hermanos, derivados de un ancestro común y que Lucifuga evolucionó con un ritmo más rápido en las tasas de cambio evolutivo. Sin embargo, para probar esta afirmación no se utilizaron grupos externos u otros géneros de la subfamilia a la que pertenece Lucifuga.

El autor, con una visión gradualista acerca de la evolución del género, consideró que la especiación de Lucifuga dio lugar a la formación de dos grupos monofiléticos subordinados sucesivamente, el plesiomórfico con Lucifuga speleotes de las Bahamas, y el apomórfico con L. dentatus y L. subterraneus en Cuba. Las especies cubanas se formaron posterior a la de las Bahamas, a partir de un ancestro de igual edad absoluta que L. speleotes, y que L. dentatus y L. subterraneus son un par de especies hermanas, la primera plesiomórfica y ancestral, y la segunda comparativamente apomórfica, más reciente y más adaptada a la vida subterránea.

6 Revisión Bibliográfica

1.5 Filogenia.

La sistemática es una de las áreas más controversiales de la biología. La definición de las especies, los géneros, las familias entre otros, es frecuentemente subjetiva y con regularidad ocurre que los expertos estén en desacuerdo en cuanto a la asignación de determinados organismos a alguna categoría taxonómica. La filogenética es menos controversial puesto que su principal objetivo es establecer las relaciones evolutivas entre los organismos y estimar el tiempo de divergencia entre estos. En esta última, la asignación de los individuos a un rango taxonómico tiene una importancia secundaria. Sin embargo, las dos áreas de la biología están estrechamente relacionadas, ya que la clasificación de los organismos refleja sus historias evolutivas. En este sentido, la filogenética juega un papel importante para desarrollar las bases científicas de la sistemática (Mayr, 1968).

La teoría de la evolución parte del supuesto que entre las diferentes especies se deben encontrar huellas, ya sea en su morfología, fisiología, bioquímica, patrones de distribución entre otros, que permitan seguir su historia hasta la actualidad. Por tanto, la reconstrucción de la historia evolutiva de las especies es uno de los objetivos más importantes de los estudios actuales de la evolución. Si se reconstruyen filogenias confiables, éstas brindarán información sobre la secuencia de eventos evolutivos que generan la diversidad actual de las especies y ayuda a entender tanto los mecanismos de evolución como la historia de los organismos (Nei y Kumar, 2000, Skybreak, 2002).

Cuando una nueva especie evoluciona, solo puede hacerlo sobre la base de la variación heredable que existe en las poblaciones de sus ancestros inmediatos. Cuando se examina cualquier especie viviente o fósil, se encuentran algunas similitudes que son heredadas de sus ancestros (caracteres plesiomórficos), así como algunas diferencias que reflejan la emergencia de nuevos rasgos distintivos ausentes en la especie ancestral (caracteres apomórficos). Las similitudes permiten entender cuan relacionadas están las diferentes especies, mientras que las diferencias hacen a una especie única con respecto a las otras y permiten reconstruir la filogenia de las mismas (Skybreak, 2002).

Las filogenias básicas (secuencias de ancestro-descendiente) se establecen comparando los caracteres distintivos para reconstruir los árboles agrupando especies y linajes de acuerdo a

7 Revisión Bibliográfica los caracteres de forma y función que ellos tienen en común, y separándolos por caracteres claves que no son compartidos.

Los registros fósiles pueden utilizarse como una aproximación en la reconstrucción de filogenias, pero generalmente están incompletos o fragmentados. Por esta razón la mayoría de las investigaciones se volcaron, por un tiempo, a la utilización de métodos de morfología y fisiología comparada. Con el uso de estas metodologías se infirieron aspectos relevantes de la historia evolutiva de los organismos. Sin embargo los cambios evolutivos en los caracteres morfológicos y fisiológicos son tan complejos que las aproximaciones no producen un cuadro claro de la historia evolutiva, y los detalles de los árboles filogenéticos reconstruidos casi siempre son controversiales (Nei y Kumar, 2000).

El avance de la biología molecular cambió el panorama al permitir el estudio de las relaciones evolutivas de los organismos comparando sus ADNs. Esta aproximación tiene varias ventajas sobre las aproximaciones clásicas en las que se utilizan caracteres morfológicos y fisiológicos. El ADN es estrictamente heredable, lo que no es totalmente cierto para los caracteres morfológicos, generalmente influenciados por el ambiente. La molécula de ADN está compuesta de cuatro nucleótidos (A, T, G, C), que pueden ser usados para comparar cualquier grupo de organismos, lo cual es virtualmente imposible en las aproximaciones clásicas. Los cambios evolutivos en el ADN siguen un patrón más o menos regular, lo que permite el uso de modelos matemáticos para formular los cambios y comparar organismos poco relacionados, mientras que los cambios evolutivos de los caracteres morfológicos son extremadamente complicados incluso, en tiempos evolutivos cortos y los modelos descansan fundamentalmente en argumentos cualitativos. El genoma de todos los organismos está constituido por largas secuencias de nucleótidos que contienen una cantidad de información filogenética apreciablemente mayor que los caracteres morfológicos (Graur y Li, 2000; Nei y Kumar, 2000).

1.6 Caracteres moleculares.

El desarrollo de la biología molecular ha permitido utilizar la información genética contenida en las macromoléculas (Proteínas y ADN) para estudiar numerosos aspectos de la historia y relaciones evolutivas de los organismos. La integración de los datos moleculares con información sobre la etología, la ecología, la morfología comparada, la sistemática y la

8 Revisión Bibliográfica paleontología permite dilucidar aspectos importantes de la historia evolutiva de las especies (Avise, 1994).

El conocimiento de algunas propiedades de las macromoléculas, como son el modo de transmisión genética y la naturaleza de las diferencias mutacionales como base del polimorfismo, es crítico para la correcta interpretación de los caracteres moleculares en el contexto poblacional y específico. Los patrones de diferenciación de estos caracteres pueden ser altamente informativos acerca de las fuerzas que actúan en la evolución molecular (Avise, 1994; Hillis et al., 1996).

1.6.1 Proteínas.

El primer acercamiento empleado en la filogenética molecular fue la electroforesis de proteínas. Esta se fundamenta en el hecho de que las proteínas son el reflejo de las variaciones sufridas a nivel de los genes que las codifican, por tanto dichas variaciones son heredables y mantenidas en las poblaciones por determinadas fuerzas evolutivas. Su análisis permite conocer la composición genética de las poblaciones y especies, así como establecer relaciones entre las mismas. Otras características que las hace atractivas son la expresión codominante, y que los alelos alternativos de un locus son selectivamente equivalentes (neutrales) o cercanos a la neutralidad. Sin embargo, se conocen algunas excepciones, y en ausencia de evidencias de selección en un locus particular se asume la neutralidad para comenzar un estudio (Kimura, 1983; Ohta, 1992; Allendorf y Phelps, 1981).

Los caracteres proteicos, independientemente de sus limitaciones prácticas (complejidad en la conservación de las muestras, pérdida de actividad enzimática de las muestras en un tiempo relativamente corto después de conservadas, carácter destructivo de la toma de las muestras en la mayoría de los casos, entre otros), tienen otras limitaciones que restringen su uso en estudios filogenéticos. En este sentido las proteínas con frecuencia presentan bajos niveles de divergencia, con muy pocos caracteres filogenéticamente informativos no obstante evaluarse gran cantidad de loci (Murphy et al., 1983; Murphy et al., 1996). También son suceptibles a acumular homoplasias, por lo que se compartirán morfos proteicos que son convergentes (Derr et al., 1987; Dimmick, 1987). Sin embargo en varios grupos zoológicos los caracteres proteicos han probado ser útiles en inferir las relaciones filogenéticas a nivel intra e

9 Revisión Bibliográfica intergenérico (Gutierrez et al., 1983; Jonhson et al., 1988; Murphy, 1988; Daugherty et al., 1990).

1.6.1.1 Métodos electroforéticos.

La electroforesis de proteínas no es más que la migración de las moléculas en un medio inerte bajo la influencia de un campo eléctrico aplicado. Es uno de los métodos más populares y de menor costo de los utilizados en la genética a nivel molecular (Murphy et al., 1996).

Cinco aminoácidos son los responsables de la carga y por ende de la movilidad electroforética + de las proteínas, tres de ellos son básicos (lisina, arginina e histidina, con residuo NH3 ) y dos son ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico, con residuo COO-). La proporción de estos en la superficie de la molécula determina su carga neta.

La carga de las proteínas puede ser afectada por el pH. A pH bajos los grupos COO- son + neutralizados y predominan los grupos NH3 , los que le confieren una carga neta positiva a la molécula. Lo contrario ocurre si el pH es elevado (Richarson et al., 1986). La migración también se verá condicionada por la talla de la molécula y por su estructura secundaria.

La velocidad de migración es directamente proporcional a la carga de la molécula y depende también de la intensidad de la corriente y de la fuerza iónica del tampón de corrida, esta aumenta cuando es alta la intensidad y/o baja la fuerza iónica.

Otro aspecto que influye en la separación de las proteínas es el soporte que se utilice. Este puede ser acetato de celulosa, almidón, agarosa o acrilamida. El último de estos es uno de los más utilizados por su fácil preparación, manipulación y porque se puede almacenar por tiempos prolongados, además es el de mayor poder resolutivo pues se puede variar el tamaño de poro fácilmente.

Los métodos elestroforéticos de proteínas han sido muy utilizados en disímiles estudios. Sin embargo, presentan algunas desventajas (Nei, 1987; Berovides y Alfonso, 1995):

• Menos del 10% del ADN eucarionte comprende genes estructurales de proteínas, las variaciones ocurridas en intrones, ARNt, ARNr y regiones no codificadoras no serán detectadas.

10 Revisión Bibliográfica

• Aproximadamente el 20% de las sustituciones de aminoácidos no cambian la carga eléctrica de la molécula, por lo que no afectan la movilidad electroforética de la misma.

• Producto de la redundancia del código genético, cerca del 30% de los cambios de bases no modifican la secuencia de aminoácidos de las proteínas.

No obstante estas limitaciones la electroforesis de proteínas provee una información de alto valor en el estudio de las poblaciones intraespecíficas, las especies estrechamente relacionadas, la variación geográfica, las fronteras especificas y la filogenia de menos de 50 millones de años (Avise, 1994; Murphy et al., 1996).

Muchas investigaciones se han auxiliado de las aloenzimas para inferir las relaciones filogenéticas. Dowling y Brown (1989), analizaron el nivel de resolución filogenética entre cuatro especies de peces ciprinidos utilizando aloenzimas y el polimorfismo de fragmentos de restricción de ADN mitocondrial. Las aloenzimas apoyaron la monofilia de dos especies en relación con las otras dos. Sin embargo con el marcador mitocondrial utilizado no se logró esta resolución. Las causas de esta discrepancia pueden haberse debido a la convergencia evolutiva del ADN mitocondrial en las especies analizadas, lo que provoca la pérdida de resolución filogenética. Stepien et al. (1993), evaluaron las relaciones evolutivas de tres de las 6 familias de peces del suborden Blennoidei utilizando 40 loci aloenzimáticos y la secuencia del ADN ribosomal, encontrando concordancia en los resultados obtenidos a partir de los dos tipos de datos, los que sugirieron monofilia cuando fueron agrupadas las tres familias. Sin embargo, cuando se analizan las mismas por separado, los datos aloenzimáticos sugirieron la parafilia para una de ellas. Bermingham y Lessios (1993), estudiaron el grado de variación y evolución en tres pares de especies de erizos de mar (Eucidaris thouarsi-E. tribuloides, Echinometra vanbruni-E. viridis y Diadema mexicanum-D. antillanum) a ambos lados del Istmo de Panamá utilizando 34 loci aloenzimáticos y el polimorfismo de fragmentos de restricción del ADNmt. Estos autores encontraron una marcada diferenciación aloenzimática entre las especies de Eucidiaris y de Echinometra, con una gran cantidad de loci fijados a ambos lados del Istmo, sin embargo, Diadema mostró una baja diferenciación entre las especies Pacíficas y Atlánticas. Esta discrepancia indica que las especies Pacíficas y Atlánticas de Diadema se separaron más reciente que las otras. El análisis de ADNmt refuerza esta hipótesis.

11 Revisión Bibliográfica

1.6.2 ADN mitocondrial.

La mayoría de los eucariontes, con unas pocas excepciones, presentan en sus células gran cantidad de mitocondrias que funcionan como transductoras de energía. Estos organelos poseen un genoma propio y son sede de procesos de síntesis que garantizan su integridad y la de los complejos enzimáticos que participan en la fosforilación oxidativa y en la cadena de transporte electrónico. El hecho de que las mitocondrias tengan características semejantes a las células de ciertas especies de bacterias ha conllevado a la teoría del origen endosimbiótico de estas (Gray, 1989; Margulis, 1993).

El ADN mitocondrial (ADNmt) en la mayoría de los animales presenta una marcada conservación en el contenido de genes. En general está compuesto por genes que codifican para las subunidades 12S y16S del ARN ribosomal (ARNr), 22 para ARN de transferencia (ARNt) y 13 para proteínas involucradas en la cadena de transporte electrónico y en la síntesis de ATP (citocromo b, las subunidades I, II y III del complejo citocromo oxidasa, las subunidades 6 y 8 del complejo ATPasa y las subunidades 1-6 y 4L del complejo NADH deshidrogenasa). También presenta una región de control (no codificadora), que contiene secuencias involucradas en la iniciación de la replicación y la transcripción (Anderson et al, 1981; Harrison, 1989; Wolstenholme, 1992).

Los animales casi en su totalidad son homoplásmicos para el ADN mitocondrial (presentan un solo tipo de ADNmt), sin embargo, se han referido casos de heteroplasmia (ocurrencia de dos o más tipos de ADNmt en las células), relacionados fundamentalmente con polimorfismos de longitud (Rand, 1993).

El ADNmt, generalmente posee una tasa de evolución elevada con respecto al ADN nuclear determinada, en primer lugar, por la ineficiencia de la reparación. La velocidad efectiva de mutación es por tanto mayor para el ADNmt, siendo peculiar la alta incidencia de mutaciones transicionales respecto a las transversiones (Harrison, 1989).

Existen dos observaciones que apuntan a que el ADNmt no codifique para proteínas involucradas en su propia replicación, transcripción o traslación. Primero, su deriva en el código genético, lo que implica una tolerancia en el cambio de un código al otro. Segundo, los 2 ARNr y 22 ARNt codificados por el ADNmt evolucionan a velocidad 10 veces mayor que sus contrapartes nucleares (Wilson et al., 1985).

12 Revisión Bibliográfica

Otras características importantes del ADNmt son la ausencia de recombinación (que contribuye a su alta tasa de evolución mediante la facilitación de la fijación de mutaciones deletéreas), la haploidía y su herencia materna. Por tanto todos los descendientes de una hembra portarán el mismo tipo de ADNmt (Avise et al., 1979; Birky et al., 1982).

Estas propiedades del ADNmt lo hacen particularmente atractivo y propicio para el estudio de historias evolutivas en animales.

1.6.2.1 ADN mitocondrial como carácter molecular.

El genoma mitocondrial posee características y propiedades que lo hacen un sistema molecular muy sensible para el estudio de diferenciación entre poblaciones y especies, para establecer genealogías maternas y para definir afinidades genéticas entre especies cercanas (Harrison, 1989). También constituye una potente herramienta para realizar análisis filogenéticos (Avise, 1994).

Las diferencias en la tasa de mutación de diferentes regiones en el ADNmt permiten que estas sean empleadas, de acuerdo a su grado de conservación, para estudios filogenéticos, en el caso de los más conservados o para estudios poblacionales, en el caso de los más variables (Avise, 1994).

Las secuencias codificadoras se consideran bastante conservadas. Los genes más conservados pertenecen al complejo citocromo oxidasa, los de las subunidades de la ATPasa y los de las subunidades de la NADH deshidrogenasa (Brown, 1985; García-Machado, 1997). También se ha consignado poco variables los genes de los ARN ribosomales (García-Machado et al., 1993) y el gen que codifica para el citocromo b (Kitamura et al., 1996; McMillan y Palumbi, 1997). Por el contrario la región no codificadora ha sido reconocida por varios autores como la más variable (Brown et al., 1986; Kitamura et al., 1996; Maldonado et al., 1995; Bass et al., 1996; McMillan y Palumbi, 1997).

Particularmente el citocromo b (cytb) ha sido uno de los genes más utilizados para estudios filogenéticos en diferentes grupos taxonómicos. Song et al. (1998), estudiaron las relaciones entre 21 especies de peces de la familia Percidae analizando la secuencia total (1140 pb) de este gen. Ellos encontraron 3 grupos monofiléticos y obtuvieron evidencias de evolución independiente de algunas especies de hábitos bentónicos. Martin y Bermingham (1998),

13 Revisión Bibliográfica analizaron la secuencia del cytb en 21 especies de cíclidos y sugirieron la existencia de los mismos en el área centroamericana desde el Mioceno tardío, además encontraron evidencias de una radiación temprana en su historia. Estos autores consignan poca concordancia entre las relaciones filogenéticas obtenidas por este marcador y por los caracteres morfológicos, aduciendo este comportamiento a una posible evolución morfológica convergente, por lo que proponen una revisión de la clasificación y relaciones evolutivas en este grupo. Lavoué et al. (2000), analizaron las relaciones filogenéticas de un grupo de peces eléctricos africanos a partir de la secuencia parcial del cytb, encontrando polifilia en tres de los 15 géneros que componen el grupo, y concordancia entre los diferentes morfos del órgano eléctrico y las diferentes ramas del árbol filogenético obtenido con este marcador. Rocha-Olivares et al. (1999), utilizaron la secuencia parcial del cytb para corroborar el agrupamiento subgenérico, pobremente soportado por caracteres morfológicos en el género Sebastes de la familia Scorpaenidae, comprobando la monofilia subgenérica y encontrando bajos niveles de divergencia intragenérica. Strecker et al. (2003), evaluaron la diversidad genética, utilizando microsatélites, y establecieron las relaciones filogenéticas mediante secuencia parcial del cytb en 8 poblaciones, 4 de troglobias y 4 de superficie, de la especie de peces dulceacuicolas Astianax fasciatus. Estos autores encontraron, en general, una baja diversidad en las poblaciones subterráneas con pobres niveles de flujo genético entre estas y las poblaciones de superficie. El análisis filogenético mostró que dos de las poblaciones cavernícolas se agruparon con las de superficie, lo que sugiere que las primeras descienden de un ancestro de superficie. Ambos marcadores sugieren múltiples orígenes de las poblaciones troglobias y que estas se fundaron después de al menos dos invasiones independientes de las poblaciones superficiales a este hábitat.

14 Materiales y Métodos

2 Materiales y Métodos.

2.1 Material biológico.

Se colectaron ejemplares hembras y machos de las especies Lucifuga subterraneus, L. dentatus, L. dentatus var. holguinensis y L. teresinarum de diferentes formaciones cavernícolas del occidente del país (Fig. 1), también se contó con ejemplares (conservados en etanol) de las especies L. dentatus, L. subterraneus, L. simile y L. dentatus var. Holguinensis, donados por el Lic. Alfredo García Debrás.

Las especies fueron reconocidas siguiendo la clave de clasificación dada por Nielsen et al. (1999) para las especies y Díaz et al. (1987a) para la variedad.

Los individuos capturados fueron transportados vivos al laboratorio, donde se sacrificaron. Se tomó una porción de músculo para el análisis proteico, que se conservó a -20ºC hasta su procesamiento. Para el análisis de ADN se tomó una pequeña porción de músculo y de las aletas pectorales, de los ejemplares capturados y los donados, y se conservaron en etanol 90% hasta su procesamiento.

Grieta Punta de Guana Cueva la Chucha. Cueva Paredones Caimito Cueva el Estadio N

Sistema Ashton Artemisa

Cayuco y aledaños Manuel Lazo Península de Guanahacabibes

Figura 1. Sitios de muestreo de las diferentes especies cubanas del género Lucifuga.

En total se estudiaron 36 individuos de las especies L. dentatus, L. dentatus var. holguinensis y L. subterraneus utilizando como herramienta el análisis de proteínas y 55 ejemplares que

15 Materiales y Métodos

comprenden las cuatro especies y la variedad cubana reconocidas utilizando la secuencia parcial del gen mitocondrial citocromo b (Tabla 1).

Tabla 1. Sitios de muestreo y cantidad de ejemplares utilizados para los diferentes análisis. Sitios de Muestreo Proteínas ADN mt Provincia Localidad (Cueva) Especie (N. individuos) (N. individuos) Felipe (Fel) L. dentatus (Ld) 4 4 Península de El Patrón (Pat) L. dentatus (Ld) - 3 Guanahacabibes El Jagüey (Jag) L. dentatus (Ld) - 3 (Pinar del Río) De la Raja (Raj) L. dentatus (Ld) - 2 El Grillo (Gri) L. dentatus (Ld) - 1 Emilio (Emi) L. dentatus (Ld) 7 7 L. subterraneus (Ls) 3 3 Baño II (Ban) L. dentatus (Ld) 8 6 L. subterraneus (Ls) 5 5 L. teresinarum (Lt) - 2 Sur Lechuza (Lec) L. dentatus (Ld) 3 3 Provincia L. subterraneus (Ls 1 2 Habana Sitio (Sit) L. dentatus (Ld) 2 2 L. subterraneus (Ls) 2 2 Desconocida L. dentatus (Ld) - 1 L. subterraneus (Ls) - 1 Norte Paredones (Par) L. dentatus (Ld) - 4 L. subterraneus (Ls) - 1 La Chucha (Chu) L. dentatus var. 1 1 holguinensis (Ldvh) Matanzas El Estadio (Est) L. dentatus var. - 1 holguinensis (Ldvh) Grieta Punta L. simile (Lsim) - 1 de Guana (GPG)

2.2 Procesamiento de las muestras.

2.2.1 Análisis Proteico.

2.2.1.1 Preparación de los extractos.

Las muestras de músculo se homogeneizaron en tampón Tris-ácido fosfórico (Tris hidroximetil aminometano 0.06 mol/l, ácido fosfórico 0.03 mol/l, pH 7) en proporción 1:1 (p/v), en frío, se centrifugaron a 13200 g durante 5 min y se tomó el sobrenadante al que se le añadió una solución de sacarosa al 60% con azul de Bromofenol 1:2 (v/v), la cual le confiere densidad a las muestras y marca el frente de la corrida electroforética.

16 Materiales y Métodos

2.2.1.2 Electroforesis.

Los extractos fueron sometidos a electroforesis vertical discontinua, utilizando como soporte geles laminares de poliacrilamida siguiendo la técnica descrita por Davis (1964). Se utilizó una cámara electroforética Hoefer serie SE 600 (Amersham Pharmacia Biotech) con capacidad para procesar 30 muestras simultáneamente.

El gel concentrador se preparó mezclando 5 mL de tampón Tris-H3PO4 pH 6.9 (0.46-0.27 mol/L) con 0.23% de TEMED, 15 mL de una solución de Acrilamida-Bisacrilamida (10- 2,5%), 5 mL de Riboflavina al 0.006% y 15 mL de Sacarosa al 40%.

El gel separador se preparó mezclando 8 mL de tampón Tris-HCl pH 8.9 (3mol/L) con 0.23% TEMED, 360 µL de persulfato de amonio (PSA) al 10%, y 8 mL de una solución de

Acrilamida-Bisacrilamida (30-0.8%) completando a 64 mL con H2O para lograr una concentración final de 7.5%. Se utilizó como tampón de separación Tris-Glisina pH 8.3 (0.05- 0.042 mol/L).

Las corridas electroforéticas se llevaron a cabo a 4ºC, con una corriente de 80 mA y un voltaje que osciló entre 150-300 V y se terminaron cuando el BFB llegó al final del gel separador. Los sistemas enzimáticos ensayados se muestran en la tabla 2.

2.2.1.3 Características y visualización de los sistemas proteicos estudiados.

La visualización de los sistemas proteicos analizados se llevó a cabo mediante tinciones bioquímicas específicas siguiendo la metodología descrita por Murphy et al. (1996). Algunas características de los sistemas proteicos estudiados y las composiciones de las tinciones específicas para cada uno se presentan en el anexo 1.

17 Materiales y Métodos

Tabla 2. Sistemas proteicos estudiados. Numero de Clasificación Nombre Común Símbolo 1.1.1.27 Lactato deshidrogenasa Ldh 1.1.1.37 Malato deshidrogenasa Mdh 1.1.1.40 Enzima málica EM 1.1.1.44 6 fosfogluconato deshidrogenasa 6PGdh 1.1.1.49 Glucosa 6 fosfato deshidrogenasa G6Pdh 1.2.3.1 Aldehido oxidasa Aox 1.11.1.7 Peroxidasa Per 1.15.1.1 Superóxido dismutasa SOD 3.1.1.1 Carboxilesterasas Est 3.1.3.1 Fosfatasa Alcalina Akp - Proteinas totales GP

2.2.2 Análisis de la variación de la secuencia del gen mitocondrial citocromo b (cytb).

2.2.2.1 Obtención del ADN total.

El ADN total se obtuvo siguiendo el método descrito por García-Machado et al (1993) modificación del protocolo de Kocher et al (1989). Se parte de 20-30 mg de tejido de músculo o aleta fijados en etanol, se fragmenta, se lava con 500 μL de tampón de extracción (Tris-HCl 10 mM, EDTA 10 mM, NaCl 100 mM, SDS 0.1%, DTT 50 mM, pH 8) y se decanta la solución. Luego se añaden 300 μL del mismo tampón de extracción y 10 μL de Proteinasa K (10 mg/mL) (Boerhinger-Manhein), incubándose, con agitación, a 50oC durante 1-2 horas. Una vez que el tejido se ha digerido completamente, se trasvasa la solución a viales que contienen una resina permeable a las soluciones orgánicas e impermeable a las acuosas (Phase lock gel, Promega) que aumentan la eficiencia de la extracción. Se añaden 300 μL de fenol/cloroformo 1:1 (v/v), se agita en un rotador por 10 min, luego se centrifuga a 6000 g por 5min, paso que se repite otra vez, posteriormente, para eliminar los restos de fenol, la fase acuosa se incuba con 300 μL de cloroformo por 10 min con agitación en el rotador, se centrifuga a 6000 g por 5 min y se recupera la fase acuosa pasándola a un tubo eppendorf. A esta fase se le añaden 1/10 del volumen de NaAc 3 M, pH 5.2 y 2 volúmenes de etanol

18 Materiales y Métodos absoluto, se deja precipitar por 24 horas a -20ºC, se centrifuga a 13200 g por 15 min y se decanta el sobrenadante. El precipitado se lava con 200 μL de etanol 70% para eliminar las sales, se centrifuga a 13200 g por 10 min, se decanta el sobrenadante y se seca el precipitado a temperatura ambiente. Una vez seco, se resuspende en 50 μL de tampón TE 1X (Tris-HCl 10nM, EDTA 1mM, pH 7.5).

2.2.2.2 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y Secuenciación.

Se amplificaron dos fragmentos solapados de 450 y 460 pb del gen mitocondrial cytb, para obtener un fragmento alineado de 810pb. Los cebadores utilizados para amplificar los segmentos fueron: Glufish: 5' CCAATGACTTGAAGAACCACCGTTG modificado de Meyer et al (1990); H15150: 5' GTAGCCCCTCAGAAGGATATTTGTCCTC (Kocher et al, 1989); CBLu1: 5' TATGGCTCCTACCTTTACAAAGA creado para este estudio; CB3Luc: 5' TGCGAAGAGGAAGTACCATTC modificado de Palumbi et al. (1991). Las reacciones de amplificación se realizaron bajo las siguientes condiciones: Para 30 μL de volumen final de reacción, se tomaron 2 μL de una dilución 1/10 o 1/2 de la solución de ADN total (en dependencia de la calidad del ADN extraído), 1/10 volumen final de reacción de tampón de amplificación 10X (Promega) [10mM Tris-Hcl (pH 8.9), 50mM KCl, 1% Tritón X-100], 200 μM de dNTPs, 200 nM de cada uno de los cebadores, 1/100 volumen final de reacción de BSA (100mg/mL), 1.5 mM de MgCl2 y una unidad de Taq polimerasa (Promega). El programa utilizado fue el siguiente: Un paso inicial de desnaturalización a 93ºC durante 3 min, 35 ciclos de 45 seg de desnaturalización a 93ºC, 45 seg de alineamiento de los cebadores al molde a 54ºC y 2 min de extensión de las cadenas a 72ºC, y un paso de extensión final de 72ºC durante 5 min.

Los productos del PCR fueron purificados mediante el método de Rosenthal et al (1993), utilizando el Kit QIAquick para purificación de productos de PCR (QIAGEN). El protocolo se desarrolla colocando el producto de PCR en un filtro con frasco colector de 2 μL, a este se le añaden 5 volúmenes de tampón de precipitación PB, se centrifuga a 17900 g por un min y se desecha el líquido del frasco colector. Luego se adicionan 750 μL de tampón de lavado PE, se centrifuga a 17900 g por un min, se decanta el líquido y se vuelve a centrifugar otro min, se desecha el frasco colector y se coloca el filtro en un tubo eppendorf de 1.5 μL. Por último se añaden, al centro del filtro, 30 μL de tampón de elusión EB (10 mM Tris-HCl, pH 8.5), se

19 Materiales y Métodos espera un min y luego se centrifuga a 17900 g por un min, obteniéndose el producto de PCR purificado en el tubo eppendorf.

Las muestras purificadas se secuenciaron con los cebadores empleados para amplificar y el Kit de secuencia BigDye terminator sequencing ready reaction V.3 (Applied Biosystems), en un secuenciador automático ABI 370. El programa de amplificación de las secuencias fue el siguiente: 24 ciclos de amplificación a 96oC de desnaturalización por 30 seg, alineamiento a 48ºC por 60 seg y extensión de las cadenas a 60ºC por 4 min.

2.3 Procesamiento Matemático.

2.3.1 Proteínas.

Utilizando el paquete estadístico Fstat versión 2.9.3 (Goudet, 2001), se Calcularon las frecuencias génicas y genotípicas para cada locus analizado.

Mediante el programa Genetix versión 4.01 (Belkhir, 2000) se calculó una matriz de distancia utilizando la distancia genética insesgada de Nei (1978): ⎡ ⎤ ⎢ ⎥ n n ⎢ x y ⎥ ⎢ ∑∑ mi mi ⎥ D = − ln ⎢ m i ⎥ n n n n ⎢ ⎛ 2 ⎞ ⎛ 2 ⎞ ⎥ ⎢ ⎜ 2 n ∑∑x mi − 1⎟ ⎜ 2 n ∑∑y mi − 1⎟ ⎥ ⎝ m i ⎠ ⎝ m i ⎠ ⎢ ∗ ⎥ ⎣⎢ ()2 n x − 1 ()2 n y − 1 ⎦⎥ Donde: m es el número de loci i es el número de alelos emo xmi es la frecuencia del i alelo del locus m para el taxon X emo ymi es la frecuencia del i alelo del locus m para el taxon Y n es el tamaño d la muestra Con la matriz de distancia se construyó un árbol filogenético por el método Neighbor-Joining (Saitou y Nei, 1987) utilizando el programa MEGA versión 2.1 (Kumar et al., 2001), al no contar con organismos para utilizar como grupo externo y con el objetivo de darle polaridad al árbol obtenido, se creó el este grupo con valores extremos.

20 Materiales y Métodos

2.3.2 ADN mitocondrial.

Las secuencias fueron analizadas y alineadas utilizando los programas de análisis de secuencia y alineamiento, BioEdit 5.0.9 (Hall, 1999) y ClustalX versión 1.81 (Thompson et al., 1997).

Como medida de la diversidad de secuencias se calcularon, utilizando el paquete estadístico Arlequin (Schneider et al., 2000), la diversidad nucleotídica (Nei, 1987):

q Π = ∑ xi x j dij ij

ema ema Donde: xi y xj son las frecuencias de la i y j secuencia respectivamente. ema ema dij es el número de diferentes nucleotidos o sustituciones por sitio entre la i y j secuencia. q es el número total de secuencias. y la diversidad haplotípica (Nei, 1987):

k n ⎛ 2 ⎞ H = ⎜1− ∑ pi ⎟ n −1⎝ i=1 ⎠ Donde: n es el número de secuencias en la muestra. k es el número de haplotipos. emo pi es la frecuencia del i haplotipo en la muestra. Se utilizó el programa PAUP 4.1 (Swofford, 1998) para examinar la presencia o no de saturación en las secuencias por los patrones de variación en las mismas. Se graficó el número de diferencias nucleotídicas contra las distancias patrísticas (en parsimonia).

El análisis filogenético se realizó con el programa MEGA versión 2.1 (Kumar et al., 2001).

Se calculó la distancia evolutiva molecular de Kimura 2 parámetros (K2) (Kimura, 1980): K2: D = −1 2ln()1− 2P − Q −1 4ln(1− 2Q) Donde: P es la frecuencia total de pares de transiciones. Q es la frecuencia total de pares de transversiones.

Los errores estándares de las distancias fueron estimados mediante bootstrap con 10000 réplicas. Con el auxilio de los programas MEGA 2.1 (Kumar et al., 2001) y PHYML 4.1 (Guindon y Gascuel, 2003) se construyeron árboles filogenéticos empleando tres métodos de reconstrucción:

21 Materiales y Métodos

• Método de Distancia: Neighbor-Joining (Saitou y Nei, 1987) utilizando la distancia de Kimura 2 parámetros (Kimura, 1980). La consistencia de los nodos se estimó a partir de remuestreos (bootstrap) (Felsenstein, 1985) con 10000 replicas.

• Método de Parsimonia: Máxima parsimonia (Fitch, 1971) utilizando el algoritmo de búsqueda heurística de intercambio de vecinos cercanos (CNI) (Swofford y Begle, 1993). Se estimó la extensión de homoplasias en las secuencias mediante el cálculo de los índices de consistencia (IC)(Kluge y Farris, 1969) y de retención (IR)(Farris, 1989). La consistencia de los nodos se estimó a partir de remuestreos (bootstrap) con 500 replicas.

• Método Probabilístico: Máxima verosimilitud (Felsenstein, 1981). Utilizando el modelo de sustitución de Kimura dos parámetros (Kimura, 1980) con corrección gamma=1. Se partió de un árbol Neighbor-Joining inicial con las opciones de optimizar la topología y la longitud de las ramas. La consistencia de los nodos se estimó a partir de remuestreos (bootstrap) con 100 replicas.

Se realizó la prueba estadística de comparación de topologías alternativas de Shimodera- Hasegawa (Shimodaira y Hasegawa, 1999) para comparar las topologías obtenidas con las estimadas si L. teresinarum fuera un grupo monofilético. Se utilizaron como modelos de comparación los de Jukes y Cantor (Jukes y Cantor, 1969) con corrección gamma estimada de 0.216 y GTR (Rodríguez et al., 1990) con corrección gamma estimada de 0.216 y teniendo en cuenta los sitios invariantes.

Se utilizaron como grupos externos las secuencias, tomadas del Genebank, de las especies Cataetix rubrirostris (No. acceso AP004407) y Diplacanthopoma brachysoma (No. acceso AP004408), pertenecientes a la familia Bythithidae, subfamilia Bythitinae y Bassozetus zenkevitchi (No. acceso AP004405) de la familia Ophidiidae, subfamilia Neobythitinae, referidas por Miya et al. (2003).

22 Resultados

3 Resultados.

3.1 Variación de loci proteicos en tres taxa.

Se revelaron 10 sistemas enzimáticos y las proteínas totales en los que se detectaron 29 loci, de los mismos solo 3 presentaron polimorfismo intraespecífico: GP8 y GP10 donde se observaron dos alelos (a y b) en L. dentatus, con individuos heterocigotos y homocigotos para a y ausencia de los homocigotos para b. En L. subterraneus se presenta el locus GP8 en condición de homocigocidad para a y no se observó en GP10. El locus GP9 presentó dos movilidades (a y b) en L. subterraneus, con individuos heterocigotos y homocigotos para b, no encontrándose homocigotos para a. Este locus no se observó en L. dentatus. En L. dentatus var. holguinensis no se observaron estos loci.

Un total de 13 loci de 5 sistemas proteicos permitieron establecer diferencias entre las especies, los 3 descritos en el párrafo anterior y los loci Mdh2, Per1, Per2, Est3, Est6, Est7, SOD, GP4, GP5 y GP7 que fueron monomórficos, pero presentaron diferentes estados de los caracteres (diferentes alelos fijados) entre las especies o estuvieron presentes en una y ausente en la otra (Figura 2, Tabla 3).

Los loci Mdh2, Per1, Est6, SOD y GP4 fueron monomórficos en ambas especies con diferentes alelos fijados en cada una. Per1, Est6, SOD y GP4 presentaron el alelo de mayor movilidad en L. dentatus y en L. dentatus var. holguinensis, igual situación se observó en L. subterraneus para el locus Mdh2. Dos Loci esterasas (Est3 y Est7) mostraron actividad solo en L. dentatus y su variedad, mientras que los loci GP5 y GP7 se observaron únicamente en L. subterraneus. L. dentatus var. holguinensis presentó una movilidad exclusiva en el locus Per2, donde aparece el alelo retardado, encontrándose el alelo de mayor movilidad fijado en L. dentatus y L subterraneus.

23 Resultados

Mdh Per

______L. subterraneus L. dentatus ______L. subterraneus L. dentatus

Est GP

______L. subterraneus L. dentatus L. dentatus L. subterraneus

SOD

______L. subterraneus

______L. dentatus

Figura 2. Fotos de los sistemas proteicos que permitieron diferenciar las especies Lucifuga dentatus y Lucifuga subterraneus. Abreviaturas como en la Tabla 2.

24 Resultados

Tabla 3. Frecuencias génicas de los 13 loci que presentaron variación en las dos especies y la variedad analizadas del género Lucifuga. Loci L. dentatus L. dentatus var. holguinensis L. subterraneus Mdh2 a 0.00 0.00 1.00 b 1.00 1.00 0.00 Per1 a 1.00 1.00 0.00 b 0.00 0.00 1.00 Per2 a 1.00 0.00 1.00 b 0.00 1.00 0.00 Est3 a 1.00 1.00 0.00 Est6 a 1.00 1.00 0.00 b 0.00 0.00 1.00 Est7 a 0.05 0.00 0.00 b 0.95 1.00 0.00 GP4 a 1.00 1.00 0.00 b 0.00 0.00 1.00 GP5 a 0.00 0.00 1.00 GP7 a 0.00 0.00 1.00 GP8 a 0.8 0.00 1.00 b 0.2 0.00 0.00 GP9 a 0.00 0.00 0.19 b 0.00 0.00 0.81 GP10 a 0.6 0.00 0.00 b 0.4 0.00 0.00 SOD a 1.00 1.00 0.00 b 0.00 0.00 1.00

Los valores de distancia genética estimados según Nei (1978) se muestran muy bajos a nivel intraespecífico (entre 0 y 0.013 en L subterraneus y entre 0 y 0.008 en L. dentatus). Sin embargo entre las especies se observa una gran diferenciación (valores entre 1.770 y 2.398).

25 Resultados

El grado de divergencia existente entre L. dentatus y su variedad holguinensis fue estimado entre 0.095 y 0.098 (Tabla 4).

Tabla 4. Distancias genéticas (Nei, 1978) entre L. dentatus, L. dentatus var. holguinensis y L. subterraneus. LdEmi LdBan LdLecLdSit LdFel LdvhChuLsEmi LsBan LsLec LdBan 0.008 LdLec 0.001 0.000 LdSit 0.000 0.004 0.000 LdFel 0.001 0.000 0.000 0.000 LdvhChu 0.098 0.095 0.095 0.095 0.095 LsEmi 1.928 1.940 2.367 1.826 2.367 1.000 LsBan 1.954 1.967 2.398 1.852 2.398 1.000 0.013 LsLec 1.870 1.883 2.303 1.770 2.303 1.000 0.000 0.000 LsSit 1.935 1.947 2.375 1.833 2.375 1.000 0.007 0.000 0.000 Nota: Abreviaturas como en la Tabla 1. Las distancias de L. dentatus var. holguinensis con respecto a las especies se muestran sombreadas.

3.1.1 Análisis Filogenético.

En la Figura 3 se presenta el árbol filogenético que relaciona las especies y la variedad analizadas. Las poblaciones de una misma especie muestran una elevada identidad, incluso entre zonas geográficas distantes, como se evidencia en la distribución de los individuos de L. dentatus de Pinar del Río junto a los del sur de La Habana.

Se detectan dos clados bien definidos que corresponden a las especies reconocidas. La variedad holguinensis se enrama independiente constituyendo un taxon hermano de L. dentatus. A su vez el clado constituido por estos dos taxa se distingue marcadamente del conformado por L. subterraneus.

26 Resultados

LdLechuza LdFelipe

LdBañoII LdEmilio

LdSitio LdvhChucha LsLechuza LsEmilio

LsBañoII LsSitio

Grupo externo

0.2

Figura 3. Árbol obtenido por el método Neighbor-Joining, construido a partir de una matriz de distancia utilizando la distancia genética de Nei (1978) obtenida con datos de loci proteicos. Ld: Lucifuga dentatus. Ldvh: Lucifuga dentatus var. holguinensis. Ls: Lucifuga subterraneus. Emilio, BañoII, Lechuza, Sitio: Cuevas de la formación Ashton en Artemiza, La Habana. La Chucha: Cueva ubicada en Carbonera, al Norte de Matanzas Felipe: Cueva ubicada en el Manuel Lazo en la Península de Guanahacabibes, pinar del Río.

3.2 Análisis del gen mitocondrial cytb.

3.2.1 Análisis de la variación.

Los perfiles para cada secuencia (Anexo 2) fueron inspeccionados visualmente y corregidas las imprecisiones de lectura del secuenciador. Los dos fragmentos superpuestos de la secuencia parcial del gen cytb obtenidos para todos los individuos en estudio fueron concatenados y alineados obteniéndose un fragmento único de 810 pares de bases (pb). No se observaron ni deleciones ni adiciones entre las secuencias y la composición nucleotídica por posiciones en los codones y total en la secuencia para cada especie y para el conjunto de las

27 Resultados especies (Tabla 5) muestra cierta desviación con respecto a la expectativa aleatoria (según la cual debiera existir aproximadamente 25% de ocurrencia de cada nucleótido en la secuencia), las principales desviaciones se evidencian en la tercera posición con un alto porciento de C (51.1%) y muy bajo de G (4.1%) y en la segunda posición con un 38.8% de T y solo 12.6% de G. No existen diferencias significativas de las frecuencias nucleotídicas entre las diferentes especies (datos no mostrados).

Tabla 5. Composición nucletídica por especies y total de las secuencias parciales del cytb. Especies Posición en el Codón Nucleotidos % A T C G Primera 29.0 23.8 24.3 22.9 L. dentatus Segunda 21.6 38.7 27.3 12.4 Tercera 29.7 15.4 51.1 3.8 Todas la posiciones 26.8 26.0 34.2 13.0 Primera 28.1 23.3 25.6 23.0 L. dentatus var. Holguinensis Segunda 21.9 37.8 28.5 11.9 Tercera 27.6 17.4 49.6 5.4 Todas las posiciones 25.9 26.2 34.6 13.4 Primera 29.6 23.0 24.8 22.6 L. simile Segunda 21.9 37.8 28.5 11.9 Tercera 31.5 15.9 49.6 3.0 Todas las posiciones 27.7 25.6 34.3 12.5 Primera 26.6 24.5 23.4 25.5 L. subterraneus Segunda 21.7 39.3 25.5 13.4 Tercera 28.9 15.1 51.3 4.7 Todas las posiciones 25.8 26.3 33.4 14.5 Primera 27.6 23.3 24.4 24.6 L. teresinarum Segunda 21.9 38.9 26.7 12.6 Tercera 28.3 15.9 51.1 4.6 Todas las posiciones 25.9 26.0 34.1 14.0 Primera 28.3 23.9 24.2 23.6 Todas las especies Segunda 21.7 38.8 26.9 12.6 Tercera 29.4 15.4 51.1 4.1 Todas las posiciones 26.5 26.0 34.1 13.4

De los 810 pares de bases alineados del gen mitocondrial cytb, 653 posiciones fueron invariables. 157 sitios resultaron variables (Anexo 3), de ellos 134 fueron informativos para la parsimonia (compartidos por al menos dos secuencias). Las transiciones fueron más abundantes, 127 por 37 las tranversiones, con una proporción estimada transición/tranverción de 3.432 ± 0.809. Un total de 40 sitios muestran sustituciones no conservativas, 14 dados por

28 Resultados cambios tranversionales y 26 por cambios transicionales, aunque más de la mitad de los cambios totales (21) están dados por transiciones del par A-G en la primera posición del codón.

Un total de 515 posiciones constituyen sitios cero veces degenerados, 153 son sitios dos veces degenerados, y 142 sitios cuatro veces degenerados.

Se observó una diferenciación en el patrón de uso de los codones Valina entre dos grupos de taxa (Tabla 6). Las especies L. dentatus, L. dentatus var. holguinensis y L. simile utilizan los codones GUU, GUC y GUA con frecuencias similares, pero todas coinciden en el uso del codón GUU con las frecuencias relativas de uso de codones sinónimos (FRUCS) (Sharp et al., 1986) más elevadas. Sin embargo las especies L. subterraneus y L. teresinarum utilizan con frecuencia significativamente mayor el codón GUC (G = 9.675, p<0.05). El codón GUG, con poco o ningún uso, es el menos favorecido en todas las especies.

Tabla 6. Frecuencias de uso de los codones Valina en las especies y la variedad del género Lucifuga estudiados. L. dentatus L. dentatus var. L. simile L. subterraneus L. teresinarum holguinensis GUU(V) 4.0 (1.50) 4.0 (1.33) 4.0 (1.60) 2.8 (0.68) 2.0 (0.46) GUC(V) 2.7 (1.01) 4.0 (1.33) 2.0 (0.80) 9.3 (2.27) 10.5 (2.40) GUA(V) 3.0 (1.12) 3.0 (1.00) 4.0 (1.60) 4.3 (1.05) 5.0 (1.14) GUG(V) 1.0 (0.38) 1.0 (0.33) 0.0 (0.00) 0.0 (0.00) 0.0 (0.00) Nota: Entre paréntesis aparecen las frecuencias relativas de uso de codones sinónimos (FRUCS). Los codones de uso preferencial se muestran en negritas.

En la Tabla 7 se muestra el análisis de los sitios variables entre las especies. Al comparar los grupos de especies morfológicamente menos relacionados (L. subterraneus y L. teresinarum con L. dentatus, L. dentatus var. holguinensis y L. simile) se observa un número elevado de posiciones variables con una cantidad importante de tranversiones acumuladas. Entre las especies L. dentatus, L. dentatus var. holguinensis y L. simile el número de cambios es intermedio con predominio de las transiciones. El caso más notable lo constituye el bajo número de cambios detectados entre L. subterraneus y L. teresinarum.

29 Resultados

Las distancias moleculares entre especies (Tabla 8), estimadas por K2 (Kimura, 1980), fluctúan desde 1% hasta 17%. La menor diferenciación se da entre L. subterraneus y L. teresinarum (0.0101 ± 0.00311). Las distancias entre L. dentatus, la variedad holguinensis y L. simile son similares (entre 0.04265 ± 0.00723 y 0.08744 ± 0.01124), lo que da un grado de divergencia a L. dentatus var. holguinensis con respecto a L. dentatus tan elevado como el que se manifiesta a escala específica entre L. dentatus y L. simile. Las mayores divergencias se manifiestan ente los grupos morfológicamente más distantes: L. dentatus, la variedad holguinensis y L. simile vs. L. subterraneus y L. teresinarum (valores entre 0.13853 ± 0.01360 y 0.17114 ± 0.01472), las que son aproximadamente dos veces superiores a las encontradas dentro de los grupos más relacionados desde el punto de vista morfológico.

A nivel intraespecífico, se manifestó un polimorfismo bajo en L. subterraneus con solo dos haplotipos en 14 ejemplares estudiados, lo que se refleja en una baja diversidad haplotípica (0.3626). Por el contrario, L. dentatus presentó un polimorfismo elevado al encontrarse 20 haplotipos en 36 individuos evaluados, muchos de ellos definidos por cambios únicos. La diversidad haplotípica en esta especie fue de 0.9159. Sin embargo, las diversidades nucleotídicas para todas las especies fueron bajas (entre 0.002475 y 0.004075) (Tabla 9), lo que demuestra un número pequeño de cambios entre los haplotipos intraespecíficos (entre uno y 9 cambios).

30 Resultados

Tabla 7. Análisis de las variaciones en las secuencias parciales del gen Cytb (810 pb) entre las especies bajo estudio. L. dentatus L. dentatus var. L. simile L. subterraneus holguinensis L. dentatus var. Sitios Variables 26 holguinensis No. Transiciones 22 No. Tranversiones 4 Trans/Tranv 5.500 Cambios sinónimos 19 Cambios no sinónimos 7 L. simile Sitios Variables 46 Sitios Variables 64 No. Transiciones 39 No. Transiciones 57 No. Tranversiones 7 No. Tranversiones 7 Trans/Tranv 5.571 Trans/Tranv 8.143 Cambios sinónimos 41 Cambios sinónimos 54 Cambios no sinónimos 5 Cambios no sinónimos 10 L. subterraneus Sitios Variables 101 Sitios Variables 111 Sitios Variables 101 No. Transiciones 72 No. Transiciones 84 No. Transiciones 73 No. Tranversiones 29 No. Tranversiones 27 No. Tranversiones 28 Trans/Tranv 2.483 Trans/Tranv 3.111 Trans/Tranv 2.607 Cambios sinónimos 78 Cambios sinónimos 86 Cambios sinónimos 77 Cambios no sinónimos 21 Cambios no sinónimos 23 Cambios no sinónimos 21 L. teresinarum Sitios Variables 100 Sitios Variables 118 Sitios Variables 103 Sitios Variables 2 No. Transiciones 71 No. Transiciones 90 No. Transiciones 75 No. Transiciones 2 No. Tranversiones 29 No. Tranversiones 28 No. Tranversiones 28 No. Tranversiones 0 Trans/Tranv 2.448 Trans/Tranv 3.214 Trans/Tranv 2.678 Trans/Tranv - Cambios sinónimos 77 Cambios sinónimos 89 Cambios sinónimos 77 Cambios sinónimos 1 Cambios no sinónimos 21 Cambios no sinónimos 27 Cambios no sinónimos 23 Cambios no sinónimos 1

Tabla 8. Distancias evolutivas entre las especies cubanas del género Lucifuga, estimadas por Kimura 2 parámetros (Kimura, 1980). L. dentatus L. dentatus var. L. simile L. subterraneus L. teresinarum holguinensis L. dentatus 0.00723 0.00919 0.01461 0.01380 L. dentatus var. holguinensis 0.04265 0.01124 0.01469 0.01472 L. simile 0.06405 0.08744 0.01360 0.01324 L. subterraneus 0.15447 0.15665 0.13853 0.00311 L. teresinarum 0.14549 0.17114 0.14357 0.01011 Nota: Debajo de la diagonal aparecen las distancias K2 y encima los errores estándares de las mismas calculados por bootstrap con 10000 replicas.

31 Resultados

Tabla 9. Número de Haplotipos observados y Diversidades Haplotípicas (h) y Nucleotídicas (π) de las especies y la variedad cubanas del género Lucifuga bajo estudio. No. No. h π Individuos Haplotipos L. dentatus 36 20 0.9159 +/- 0.0283 0.003987 +/- 0.002387 L. dentatus var. holguinensis 2 2 1.0000 +/- 0.5000 0.003718 +/- 0.004291 L. simile 1 1 - - L. subterraneus 14 2 0.3626 +/- 0.1302 0.004075 +/- 0.002549 L. teresinarum 2 2 1.0000 +/- 0.5000 0.002475 +/- 0.003030 Total 55 27 0.9232 +/- 0.0198 0.069362 +/- 0.033810

3.2.2 Saturación de las secuencias.

El estudio de la saturación de secuencias se llevó a cabo comparando el número de diferencias entre pares de secuencias con las distancias patrísticas estimadas a partir de la topología de los árboles inferidos mediante parsimonia. No se evidencia saturación en las comparaciones dentro de especies ni entre las especies. En el extremo de la nube de puntos se distribuyen las distancias entre los taxa más divergentes, en las que se observa un ligero desvío de la linealidad sin llegar a manifestar saturación (Figura 4).

32 Resultados

N 140 ú m 120 e c r o 100

D 80 i f b 60 e r e 40 n a c 20 i a 0 s 0 20 40 60 80 100 120 140 Distancias patrísticas (en Parsimonia)

Figura 4. Análisis para detectar saturación en las secuencias. Se grafica el número de diferencias entre pares de secuencias contra las distancias patrísticas (en parsimonia). a: Distancias intraespecíficas y entre L. subterraneus y L. teresinarum, b: Distancias entre L. dentatus, L. dentatus var. holguinensis y L. simile, c: Distancias entre L. dentatus, L. dentatus var. holguinensis y L. simile vs. L. subterraneus y L. teresinarum.

3.2.3 Análisis Filogenético.

El árbol Neighbor Joining obtenido a partir de la distancia evolutiva de Kimura 2 parámetros (Kimura, 1980) revela la existencia de dos grandes linajes soportados por un valor de bootstrap (BP) de 99 (Figura 5). El primer conjunto comprende las especies L. dentatus con su variedad holguinensis y L. simile. Las especies L. dentatus (BP=96) y L. simile (BP=99) se distribuyen como grupos monofiléticos. L. dentatus var. holguinensis se erige como grupo monofilético bien sustentado (BP=99) y hermano del clado constituido por su especie. El segundo conjunto lo conforman las especies L. subterraneus y L. teresinarum, las que se agrupan en un solo linaje. En este clado se observan dos agrupamientos correspondientes a haplotipos de L. subterraneus.

33 Resultados

El análisis de parsimonia resultó en 79 árboles de igual longitud (536 pasos). Los índices de consistencia (IC= 0.753731) y retención (IR= 0.931994) fueron elevados, lo que sugiere una baja homoplasia. Los árboles obtenidos por el método de Máxima Parsimonia reconstruyen la misma topología que el Neighbor Joining (figura 6). Los dos agrupamientos más divergentes se soportan con igual valor de bootstrap (BP=99). El arreglo de los taxa en el clado L. dentatus/L. dentatus var. holguinensis/L. simile también está bien soportado: BP=100 para el agrupamiento de la variedad holguinensis como grupo monofilético, BP=97 para el clado de L. simile y BP=84 para L. dentatus.

El método de Máxima Verosimilitud resulta en un árbol que mantiene la misma topología que los obtenidos por los métodos anteriores (Figura 7). Los valores de robustez para soportar los clados también son similares.

El arreglo de los linajes en los árboles obtenido por los tres métodos de reconstrucción filogenética refleja que las especies morfológicamente más relacionadas también lo están desde el punto de vista molecular.

3.2.3.1 Comparación de Topologías.

La topología obtenida fue comparada con una topología alternativa, tomando a L. teresinarum como grupo monofilético, mediante la prueba de Shimodaira y Hasegawa (1999) utilizando como modelos de comparación los de Jukes y Cantor (1969) con corrección gamma y GTR (Rodríguez et al., 1990 ) con corrección gamma y sitios invariantes (Tabla 10). Ambos modelos arrojan resultados semejantes, en los cuales la prueba estadística no es significativa.

34 Resultados

77 Ld1Emi 60 Ld41Ashton 59 Ld20Sit Ld11Emi Ld22Ban Ld21Ban Ld2Lec Ld8Lec Ld13Emi Ld15Ban Ld9Ban 60 Ld16Ban Ld27Emi Ld7Ban Ld28Emi Ld26Emi Ld60par Ld58Par Ld57Par Ld61Par 87 Ld25Emi Ld3Lec Ld29Sit Ld35Fel 55 Ld32Fel Ld48Raj Ld50Gri 96 Ld34Fel Ld42Pat Ld45Jag 99 Ld44Pat Ld46Jag Ld43Pat Ld47Jag 99 Ld49Raj Ld33Fel 99 Ldvh53Est Ldvh36Chu 99 Lsim55GPG Lt39Ban 74 Ls37Lech 99 Lt38Ban Ls59Par Ls56 56 Ls12Emi Ls18Emi 99 Ls19Emi Ls23Ban Ls24Ban Ls30Sit Ls14Ban Ls10Ban Ls17Ban Ls4Lec Ls31Sit 65 Diplacanthopoma Cataetyx Bassozetus

0.02 Figura 5. Árbol obtenido por el método Neighbor Joining para las especies y la variedad cubanas del género Lucifuga, basado en la secuencia parcial del gen mitocondrial cytb. Se utilizó la distancia Kimura dos parámetros (Kimura, 1980). Los números sobre las ramas representan los valores de robustez de los nodos mayores del 50% estimados por bootstrap con 10000 replicas. Abreviaturas como en la Tabla 1.

35 Resultados

Ld1Emi Ld11Emi Ld41Ashton Ld22Ban Ld20Sit Ld13Emi Ld7Ban 52 Ld16Ban Ld15Ban Ld9Ban Ld27Emi Ld25Emi Ld26Emi Ld2Lec Ld21Ban 84 Ld8Lec Ld3Lec Ld29Sit Ld28Emi Ld57Par Ld58Par Ld60par Ld61Par 84 Ld32Fel Ld42Pat Ld43Pat Ld48Raj Ld45Jag Ld49Raj Ld44Pat 97 Ld47Jag Ld46Jag Ld35Fel 99 Ld34Fel Ld33Fel Ld50Gri100 Ldvh53Est Ldvh36Chu Lsim55GPG Ls12Emi Ls18Emi 100 Ls24Ban Ls10Ban 99 Ls31Sit Ls30Sit Ls4Lec Ls19Emi 100 Ls14Ban Ls23Ban Ls17Ban Ls37Lech Ls59Par 57 Lt38Ban Ls56 58 Lt39Ban Diplacanthopoma Cataetyx Bassozetus

20 Figura 6. Árbol obtenido por el método Máxima Parsimonia para las especies y la variedad cubanas del género Lucifuga, basado en la secuencia parcial del gen mitocondrial cytb. Se utilizó el algoritmo de búsqueda heurística de intercambio de vecinos cercanos (CNI). Los números sobre las ramas representan los valores de robustez de los nodos mayores del 50% estimados por bootstrap con 500 replicas. LA= 536, IC= 0.753731, IR= 0.931994. Abreviaturas como en la Tabla 1.

36 Resultados

Ld16Ban Ld9Ban Ld15Ban Ld13Emi 55 Ld7Ban Ld27Emi Ld8Lec Ld22Ban 57 Ld11Emi 56 Ld1Emi Ld41Ashton Ld20Sit Ld2Lec Ld21Ban Ld28Emi 90 Ld29Sit Ld3Lec Ld26Emi Ld25Emi Ld60par Ld61Par Ld58Par Ld57Par Ld35Fel Ld34Fel Ld32Fel 7252 Ld50Gri Ld48Raj Ld45Jag Ld44Pat Ld42Pat 100 Ld47Jag Ld43Pat Ld49Raj 99 Ld46Jag Ld33Fel 100 Ldvh36Chu 100 Ldvh53Est Lsim55GPG Lt39Ban Lt38Ban 100 Ls56 Ls59Par Ls37Lech 66 Ls4Lec Ls31Sit Ls23Ban Ls24Ban 99 Ls14Ban Ls17Ban Ls18Emi Ls12Emi Ls30Sit Ls10Ban 51 Ls19Emi Diplacanthopoma Cataetyx Bassozetus

Figura 7. Árbol obtenido por el método0.05 de Máxima Verosimilitud para las especies y la variedad cubanas del género Lucifuga, basado en la secuencia parcial del gen mitocondrial cytb. Se utilizó el modelo de sustitución de Kimura dos parámetros (Kimura, 1980) con corrección gamma=1. Los números sobre las ramas representan los valores de robustez de los nodos mayores del 50% estimados por bootstrap con 100 replicas. Abreviaturas como en la Tabla 1.

37 Resultados

Tabla 10. Comparación de Topologías alternativas por el método de Shimodaira-Hasegawa (1999). Modelo de Topología -Ln V Diferencia Shimodaira Hasegawa sustitución -Ln V (P) 1 4288.72632 JC+G 1.50585 0.235 2 4290.23217 1 4116.32431 GTR+G+I 1.09578 0.184 2 4115.22853 Nota: 1 (L. subterraneus; L. teresinarum); L. teresinarum) = Topología obtenida. 2 (L. subterraneus); (L. teresinarum) = Topología alternativa. JC+G: Modelo de Jukes y Cantor (Jukes y Cantor, 1969) con corrección gamma. GTR+G+I: Modelo GTR (Rodríguez et al., 1990) con corrección gamma y sitios invariantes. -Ln V: - Logaritmo de la verosimilitud

38 Discusión

4 Discusión.

4.1 Relaciones evolutivas.

Las relaciones evolutivas que ofrecen el análisis de las proteínas y el gen mitocondrial cytb, utilizando tres métodos de reconstrucción diferentes (Neighbor Joining, Máxima parsimonia y máxima verosimilitud), reconstruyen árboles filogenéticos con topologías muy similares (figuras 3, 5, 6 y 7)

El hecho de que los nodos que definen taxa específicos revelen altos valores de bootstrap (ver figuras 5, 6 y 7) nos indica que los árboles obtenidos son robustos. Sin embargo, que diferentes conjuntos de datos y métodos de reconstrucción muestren las mismas relaciones filogenéticas, constituyen criterios más sólidos referente a la confiabilidad de las topologías (Chen et al., 2003).

La reconstrucción filogenética indica la existencia de dos linajes evolutivos fundamentales, cuya divergencia está sustentada por 11 loci proteicos distintivos, 73 sinapomorfías mitocondriales y un uso diferencial de los codones que codifican para el aminoácido Valina.

Uno de los linajes incluye las especies L. dentatus, L. dentatus var. holguinensis y L. simile, mientras que en el otro se agrupan las especies L. subterraneus y L. teresinarum. El arreglo de las especies en cada linaje se corresponde con las similitudes que éstas presentan en cuanto a la forma del cuerpo y con su distribución en los dos subgéneros, Stygicola y Lucifuga, definidos para el género Lucifuga por Cohen y Robins (1970). De acuerdo a lo planteado por estos autores, la definición de los subgéneros se sustenta en la condición de la ausencia/presencia de dientes en los huesos bucales palatinos y en la cantidad de radios en las aletas pectorales. De esta manera al subgénero Stygicola pertenecerían las especies que presentaran dientes en los huesos palatinos y radios en las aletas pectorales en número de 15 a 20, mientras que el subgénero Lucifuga estaría compuesto por las especies que carecieran de dientes palatinos y presentaran radios en las aletas pectorales en número menor o igual a 14.

Es importante destacar que en este estudio se ha podido comprobar que, aunque la distribución de las especies en los subgéneros ha coincidido con las similitudes en la forma del cuerpo y con la señal filogenética contenida en los datos moleculares, la asignación de las especies a cada subgénero resulta discordante en algunos casos. Esta afirmación se realiza

39 Discusión sobre la base de las discrepancias que existen en cuanto al estado de los caracteres que se toman en cuenta para realizar la asignación de las especies. En este sentido, si nos guiamos estrictamente por el criterio de clasificación vigente, encontramos dos contradicciones: La primera consiste en que L. simile se asigna al subgénero Stygicola por presentar dientes en los huesos palatinos, si bien los radios de sus aletas pectorales se presentan en número menor de 15 (ver Nalbant, 1981), y la segunda en que L. dentatus var. holguinensis, al igual que L. dentatus se asigna al subgénero Stygicola porque presenta radios pectorales en número entre 15 y 17, aunque carece de dientes palatinos (ver Díaz et al., 1987a). De lo anteriormente planteado se deriva que los estadios de los caracteres tomados en cuenta para establecer los subgéneros no mantienen una relación estrecha. Esta evidencia invalida los criterios que se esgrimen actualmente para realizar la clasificación de los subgéneros.

Teniendo en cuenta que existen otros caracteres (ej.: forma del cuerpo, elevación de la región occipital, concavidad de la región anterior de la cabeza, entre otros) que pueden constituir mejores descriptores de las especies incluidas en cada subgénero, consideramos que la clasificación a nivel subgenérico debe ser revisada en el caso de que este nivel taxonómico se justifique.

Con respecto al análisis filogenético, el único estudio que, hasta el presente, ha realizado una aproximación acerca de las relaciones evolutivas y biogeográficas del género Lucifuga fue el realizado por Vergara (1980 y 1981). Este estudio tuvo relevancia cuando sólo se conocían tres especies (L. dentatus, L. subterraneus y L. speleotes). Para su análisis, el autor se apoyó en la variación de 25 caracteres morfológicos en las tres especies del género Lucifuga y dos especies del género Calamopterix, que ha sido considerado por Cohen y Robins (1970) como uno de los más relacionados filogenéticamente con Lucifuga sobre la base de sus similitudes morfológicas. Este autor propone desde un punto de vista gradualista que los eventos evolutivos se suceden linealmente desde un ancestro común a los dos géneros hasta un protolucifuga que da lugar a dos linajes evolutivos, el de L. speleotes, especie que habita en las Bahamas y que el autor considera más antigua por poseer los caracteres ancestrales en alta frecuencia; y el linaje que da origen a las especies cubanas, mediante eventos que conllevan la especiación de L. dentatus, considerada por el autor más plesiomórfica y ancestral, y la especiación de L. subterraneus, que resulta más apomórfica y reciente.

40 Discusión

Los resultados que se generan del análisis molecular sugieren que la evolución de las especies cubanas del género Lucifuga no ocurre mediante un proceso gradual de sucesión de eventos de especiación, sino que a partir de un ancestro común ocurrió la divergencia evolutiva de dos linajes. Uno de los linajes está representado actualmente por las especies L. subterraneus y L. teresinarum, que se reúnen en un clado monofilético y comparten un ancestro común con el resto de las especies cubanas del género. El otro linaje está formado por dos grupos hermanos: uno, que diverge primero e involucra a la especie L. simile y el otro formado por L. dentatus y L. dentatus var. Holguinensis que constituyen a su vez clados hermanos.

Es importante señalar que en este estudio se realizó el análisis de los 25 caracteres morfológicos utilizados por Vergara (1980 y 1981) como criterio filogenético y se pudo constatar que algunos resultan de poco valor debido a: su elevada variación, a que son caracteres que presentan evolución convergente o simplemente a que la condición del carácter que se analiza no se manifiesta como se había planteado (ej.: escamación de la cabeza, condición de los ojos, condición de la dentadura, razón del premaxilar en la longitud de la cabeza, condición del contorno superior cefálico, número total de radios en la aleta dorsal, número total de radios en la aleta pectoral, grado de pigmentación y naturaleza del hábitat). Por último Vergara (1980) considera los géneros Calamopterix y Lucifuga como grupos hermanos, a pesar de que, taxonómicamente, pertenecen a subfamilias diferentes (Bythitinae y Brosmophycinae respectivamente), y no obstante haber omitido en el análisis la presencia de un grupo externo u otros géneros de la subfamilia Brosmophycinae a la que pertenece Lucifuga. Cohen y Robins (1970) sugieren la existencia de otros géneros que pudieran tener una relación estrecha con Lucifuga. Tal es el caso de los géneros Cataetyx y Diplacantopoma pertenecientes a la misma subfamilia que Calamopterix. En el presente estudio se utilizaron especies de estos dos géneros, así como del género Bassozetus (familia Ophidiidae, subfamilia Neobythitinae) como grupos externos. Sin embargo ninguno de los análisis sugirió que existiese una relación estrecha entre alguna de estas especies y Lucifuga. Teniendo en cuanta que las relaciones filogenéticas en los Ophidiiformes no están totalmente claras, resulta comprometedor relacionar estrechamente a Lucifuga con uno u otro género sin antes haber realizado estudios más profundos en este sentido.

41 Discusión

4.2 Consideraciones taxonómicas.

A nivel específico los resultados del análisis de los caracteres nucleares y los mitocondriales sustentan la monofilia de los taxa reconocidos actualmente como especies L. simile, L. dentatus y L. subterraneus. Sin embargo, la ubicación de L. teresinarum difiere de la exhibida por los estudios morfológicos precedentes.

Ninguno de los métodos de reconstrucción evaluados utilizando caracteres moleculares (cytb) definen a L. teresinarum como un taxon monofilético y lo ubican compartiendo un ancestro común más reciente con L. subterraneus (Figuras 5, 6, 7). Por otro lado el análisis estadístico de comparación de las longitudes de los árboles no apoya la hipótesis de L. teresinarum como un taxon monofilético (tabla 10). El estudio de la variación nucleotídica del gen mitocondrial cytb (no se realizó el estudio con aloenzimas) muestra que L. teresinarum y L. subterraneus comparten uno de los haplotipos encontrados y solo se diferencian por dos sitios polimórficos (Tabla 7, Figura 8) y una distancia evolutiva neta de 0.002 (Anexo 4).

Con respecto al nivel de variación existen evidencias de que las divergencias evolutivas estimadas en varios grupos de vertebrados a partir del gen mitocondrial cytb muestran poca equivalencia con relación al rango taxonómico (Johns y Avise, 1998). Particularmente entre varias especies de peces las divergencias evolutivas varían en dependencia del género, los valores pueden fluctuar desde cercanos a cero en Scaphirynchus y Herichtys hasta más de 35% en Cynolebias (Johns y Avise, 1998). Se han referido también, valores pequeños de diferenciación interespecífica para peces cíclicos africanos, cuyas especies se distinguen por variaciones de entre uno y 4 cambios nucleotídicos (Meyer et al., 1990) y entre especies de atunes con uno o pocos loci enzimáticos y haplotipos de RFLP diferenciados (Ward et al. 1995).

42 Discusión

1 1 2 2 2 5 6 5 5 6 9 9 3 7 8 5 2 5 7 3 7 9 1 4 2 2 5 Ls12Emi GTGCGACTGA Ls18Emi ...... Ls19Emi ...... Ls10Ban ...... Ls14Ban ...... Ls17Ban ...... Ls23Ban ...... Ls24Ban ...... Ls4Lec ...... Ls30Sit ...... Ls31Sit ...... Ls37Lech ACATAGAC. . Ls59Par ACATAGAC. . Ls56 ACATAGAC. . Lt39Ban ACATAGACA G Lt38Ban ACATAGAC. . Figura 8. Sitios variables dentro y entre las especies L. subterraneus y L. teresinarum. En negrillas se muestra la variación en las secuencias de L. subterraneus que es compartida por L. teresinarum. Las sustituciones exclusivas de L. teresinarum se muestran sombreadas. Abreviaturas como en la tabla 1.

43 Discusión

En el género Lucifuga las divergencias evolutivas interespecíficas oscilan entre un 4% y un 17% (Tabla 8) con un número importante de cambios nucleotídicos entre las especies (Tabla 7), pero la divergencia entre L. teresinarum y L. subterraneus, determinada por el número de sitios variables (tabla 7) y las distancias evolutivas netas (Anexo 4), es varias veces inferior a la que se observa entre las otras especies de este género (Tablas 7 y 8), y se encuentra en el rango del polimorfismo intraespecífico observado en las especies congenéricas, el que fluctúa entre uno y nueve cambios nucleotídicos y entre valores de distancias de 0.001 y 0.01 (Anexos 4 y 5).

El nivel de divergencia evolutiva como criterio para definir límites entre especies congenéricas ha recibido una atención particular por parte de los investigadores y ha conducido a la revisión del estatus taxonómico de las especies de varios grupos zoológicos. Por ejemplo Murphy et al. (1995) analizaron la variación proteica y del gen mitocondrial cytb entre dos especies de serpientes de cascabel con morfologías muy similares, encontrando un solo sitio variable en el cytb y ningún locus diagnostico en las proteínas. Sobre la base de sus resultados estos autores proponen la sinonimia de estas especies. Por otra parte Karl y Bowen (1999), realizaron un análisis de la variación nucleotídica de algunos genes mitocondriales y nucleares en la especie de tortuga marina Chelonia agassizii con el objetivo de resolver las controversias acerca de si esta constituye una verdadera especie o es solo un morfo de C. mydas, y concluyeron que C. agassizii no constituye una unidad filogenética independiente por lo que no constituye una verdadera especie.

La ausencia de diferenciación detectada entre L. teresinarum y L. subterraneus en el análisis de la variación nucleotídica del gen mitocondrial cytb pudiera tener otros orígenes. Uno de éstos pudiera ser la divergencia reciente de estas especies y que por lo tanto todavía predominen polimorfismos compartidos indicativos de una retención de variabilidad ancestral. Según varios autores (Chouinard et al. 1996; Schluter, 1996; Taylor et al. 1997) en estos casos las especies incipientes pueden ser molecularmente indistinguibles o distinguibles solo en un nivel intraespecífico de variación.

La introgresión del genoma mitocondrial debido a la hibridación interespecífica ha sido referida también como una de las causas de que se manifiesten bajas tasas de diferenciación

44 Discusión entre especies estrechamente relacionadas ya que se comparten haplotipos mitocondriales muy relacionados o idénticos (McMillan y Palumbi, 1997; Shaw, 2002). El hecho de que L. teresinarum y L. subterraneus compartan un haplotipo mitocondrial y los otros sean muy similares convierte a la hibridación introgresiva de las especies L. dentatus y L. subterraneus (sintópicas con L. teresinarum) en una posible hipótesis para el origen de L. teresinarum.

Para corroborar esta hipótesis y con el objetivo de encontrar alguna señal del aporte de L. dentatus a la constitución genética de L. teresinarum, se analizaron las secuencias parciales (407 pares de bases) del gen nuclear de la rodopsina en las tres especies. Los resultados mostraron que el gen está muy conservado en este género, las especies L. dentatus y L. subterraneus solo difieren por tres cambios nucleotídicos (dos de ellos son no sinónimos) que definen a ambas especies. Por otra parte, la secuencia de L. teresinarum es igual a la de L. subterraneus (Figura 9), con lo cual se rechaza la hipótesis de hibridación para el origen de L. teresinarum.

2 2 4 2 5 6 8 Ld16Ban C CG Ld33Fel C CG Ls12Emi A TA Ls37Lech A TA Lt38Ban A TA Lt39Ban A TA Figura 9. Sitios variables en el gen de la Rodopsina entre las especies L. dentatus, L. subterraneus y L. teresinarum. En negrillas se presentan las especies L. subterraneus y L. teresinarum. Las variantes que implican cambios de aminoácido aparecen sombreadas. Abreviaturas como en la tabla 1.

45 Discusión

Otros aspectos importantes que pueden ayudar a determinar el estatus taxonómico de L. teresinarum son el análisis de su distribución geográfica y de su morfología.

El hábitat de L. teresinarum se restringe a dos cuevas de la formación Ashton en la región Suroeste de la provincia La Habana donde vive en sintopía con otras dos especies del género, L. dentatus y L. subterraneus. La frecuencia de aparición de esta especie es muy baja ya que de esas cuevas se cuenta con numerosos ejemplares en diferentes colecciones, todos identificados como L. subterraneus. No fue hasta 1984 y posteriormente hasta el año 2003 que se identifican morfos con las variantes morfológicas de L. teresinarum.

Desde el punto de vista morfológico L. teresinarum es muy similar a L. subterraneus y está definida como especie sobre la base de dos caracteres que comparte con L. dentatus, la aleta caudal libre y la estructura de la papila anal (Díaz, 1988). La independencia de la aleta caudal con respecto a las aletas dorsal y anal, fue utilizada por este autor como carácter taxonómico relevante en su propuesta de L. teresinarum como nueva especie. Sin embargo, Díaz et al. (1987b) en la descripción de ejemplares machos de L. simile, refieren dos relaciones diferentes entre las tres aletas que son tratadas como un polimorfismo de la especie

Por otra parte, algunos autores (Díaz et al., 1987a; Díaz et al., 1987b; Díaz, 1988 y Nalbant, 1981) le han conferido un elevado valor taxonómico a la estructura de la papila anal. No obstante, otros autores (Poey, 1858; Gill, 1862; Eigenmann, 1903; Cohen y Robins, 1970; Vergara, 1980; Nielsen et al, 1999) no han detectado grandes diferencias con respecto a la estructura de este órgano entre las especies. En este trabajo se realizó un análisis de las variaciones en la morfología de la papila anal en 40 individuos que comprenden las cuatro especies cubanas, y se observó que la estructura de este órgano es variable, pero la forma en que se manifiesta el polimorfismo no delimita características distintivas para una u otra especie

De acuerdo con lo planteado, las relaciones entre las aletas dorsal, anal y caudal, así como la estructura de la papila anal no deben considerarse por sí solos como caracteres en la definición taxonómica de las especies del género Lucifuga. Las especies de este género están constituidas por un mosaico de caracteres que en su conjunto las definen. La clasificación taxonómica tiene que realizarse sobre la base de la evaluación del conjunto de caracteres que relaciona y que distingue a las especies.

46 Discusión

Las evidencias morfológicas y moleculares sugieren que L. teresinarum sea una sinonimia de L. subterraneus. Sin embargo se necesitan estudios más profundos que involucren una mayor cantidad de datos moleculares (incluidos genes nucleares) que permitan establecer con certeza el estatus taxonómico de L. teresinarum.

Otro aspecto que resalta de los resultados obtenidos con los caracteres nucleares y los mitocondriales a nivel específico, es la elevada divergencia que existe entre L. dentatus y L. dentatus var. holguinensis (Tablas 7 y 8). En los árboles filogenéticos L. dentatus var. holguinensis se erige como clado monofilético bien sustentado por los valores de bootstrap (Figuras 3, 5, 6 y 7).

La categoría infraespecífica de variedad es utilizada para designar cualquier pequeña desviación con respecto a las características tipológicas de una especie y en la actualidad es poco utilizada en animales (Mayr y Ashlock, 1991). De acuerdo con esta clasificación las variedades constituyen poblaciones o razas geográficas que acumulan cierta variación que las distingue de otras poblaciones sin llegar a constituirse en especie.

En L. dentatus la variación geográfica es baja. Las zonas distantes como la Península de Guanahacabibes y La Habana se diferencian con el gen cytb entre un 0.1% y 0.7% y no se observa ninguna diferencia a nivel proteico. Sin embargo la divergencia de L. dentatus y L. dentatus var. holguinensis es muy superior, el valor de divergencia mitocondrial de 4% entre estos dos taxa es muy similar al que se observa entre L. simile (especie que diverge primero en este linaje evolutivo) y L. dentatus que es de 6%. Además L. dentatus var. holguinensis se distingue de L. dentatus en 3 de 29 loci proteicos con una divergencia genética de 9%.

Valores de divergencia entre especies congenéricas similares a los que se observan entre L. dentatus y L. dentatus var. holguinensis se han referido en erizos de mar, donde las divergencias proteicas y mitocondriales fluctúan entre 2.8% y 50% y entre 4% y 8% respectivamente (Bermingham y Lessios, 1993); En peces del género Galaxias donde las divergencias mitocondriales oscilan en valores desde 2.5% a 32% (Waters et al., 2000) y en peces del género Neochanna, con valores de divergencia evolutiva de 5% (Gleeson et al., 1999). Estos últimos autores sugirieron que dos poblaciones de la especie Neochanna diversus constituían especies crípticas sobre la base de divergencias mitocondriales aproximadamente iguales a las observadas entre las especies de éste género. Daugherty et al. (1990) refirieron

47 Discusión en Tuatara, divergencias proteicas interespecíficas similares a las observadas entre L. dentatus y L. dentatus var. holguinensis. Sobre la base de 3 loci distintivos y una divergencia proteica de 10%, estos autores propusieron que se restituyera el estatus específico de Sphenodon guntheri. Johns y Avise (1998) refieren que las divergencias interespecíficas en peces, evaluadas con cytb, se encuentran, con elevada frecuencia, en valores alrededor de 4%.

Es importante señalar que L. dentatus var. holguinensis se sustenta como linaje independiente por 11 sinapomorfías, un número mayor del que soporta a L. dentatus como clado (4 sinapomorfías). Además L. dentatus var. holguinensis es, como promedio, un 2% más divergente con respecto al resto de las especies del género que L. dentatus.

Desde el punto de vista morfológico L. dentatus var. holguinensis fue descrita como variedad por presentar las características taxonómicas de L. dentatus, pero carecer de dientes en los huesos bucales palatinos (Díaz et al., 1987a). El carácter ausencia/presencia de dientes palatinos fue considerado como importante por Poey (1858) para diferenciar a L. dentatus de L. subterraneus. Gill (1863) sobrevaloró este carácter asignándole valor genérico y creó el género Stygicola donde ubicó a L. dentatus. Más de un siglo después, Cohen y Robins (1970) hicieron una revisión de esta clasificación genérica y concluyeron que el carácter analizado presenta valor subgenérico, por lo que restablecieron el género Lucifuga y propusieron los subgéneros Stygicola y Lucifuga. El análisis anterior evidencia que la relevancia taxonómica de este carácter ha pasado por diferentes etapas, pero en ningún caso su valor ha sido considerado a nivel infraespecífico, razón por la que resulta controvertido designar una variedad sobre la base de la dentición palatina. Otra característica morfológica importante que se observó en este estudio y que no ha sido referida con anterioridad es la presencia en L. dentatus var. holguinensis de ojos relativamente evidentes, aunque pequeños e infuncionales. La presencia de ojos con cierto grado de desarrollo ha sido constatada en el género sólo en L. speleotes (Cohen y Robins, 1970). En el caso de la variedad holguinensis la manifestación de este carácter adquiere relevancia por el hecho de que no solo la distingue de L. dentatus sino de todas las especies cubanas del género.

L. dentatus var. holguinensis es, hasta el momento el taxon de distribución más oriental. De acuerdo al conocimiento actual, habita fundamentalmente en cuevas y casimbas de Matanzas y Holguín, aunque se ha referido su presencia en la Península de Guanahacabibes viviendo en

48 Discusión simpatría con L. dentatus. Las mayores densidades se han encontrado en la provincia de Matanzas donde también se ha referido la presencia de L. dentatus, aunque rara vez se encuentran compartiendo hábitats (ver Gacía-Debrás et al., 1999). La distribución de L. dentatus es más occidental y tiene asentamientos importantes en el extremo Oeste de Pinar del Río y prácticamente en toda La Habana. En Matanzas se ha señalado la presencia de L. dentatus, pero algunos de estos reportes deben ser revisados debido a que, por la elevada identidad morfológica entre ambos taxa, existe la posibilidad de errores de identificación. En la distribución geográfica de L. dentatus y L. dentatus var. holguinensis se observa que mayoritariamente existe un aislamiento físico entre ellas, lo que puede constituir un factor que ha favorecido la diferenciación genética alopátrica de ambos taxa.

Todas las evidencias morfológicas, bioquímicas y moleculares que se han referido en este estudio y que sustentan el clado L. dentatus var. holguinensis sugieren que el mismo puede ser redefinido al estatus taxonómico de especie.

Un aspecto en el que la reconstrucción filogenética utilizando los caracteres moleculares adquiere relevancia, es en la interpretación de los patrones evolutivos de algunos caracteres morfológicos conspicuos en el género.

En este sentido el carácter presencia/ausencia de dientes en los huesos palatinos, que se ha utilizado como carácter determinante en la clasificación subgenérica, ha evolucionado dos veces por vías evolutivas diferentes. La hipótesis más parsimoniosa que brinda la filogenia molecular es que el ancestro del género poseía dientes. De esta manera, el linaje L. subterraneus/L. teresinarum evolucionó hacia la perdida de los dientes, mientras que, en el linaje (L. simile+(L. dentatus+L. dentatus var. holguinensis) se conserva la condición plesiomórfica del carácter, excepto en L. dentatus var. holguinensis, que presenta la pérdida de los dientes (Anexo 6).

La relación de la aleta caudal con la dorsal y la anal es un carácter con alta variación en el género. El hecho de que el linaje L. subterraneus+L. teresinarum y que L. simile (la especie que diverge tempranamente en el linaje (L. simile+(L. dentatus+L. dentatus var. holguinensis)) sean polimórficos para las relaciones entre las tres aletas, sugiere que el ancestro común a todos los Lucifuga fuera polimórfico para dos condiciones del carácter (una con la aleta caudal libre y otra con la aleta caudal unida a la dorsal y la anal). Se debe señalar

49 Discusión que en el caso de L. simile, aunque existe polimorfismo, este se manifiesta de forma diferente (la aleta caudal libre, pero unida a la dorsal y anal por pequeñas membranas; y la aleta caudal libre de la dorsal y unida a la anal). En el caso del linaje L. dentatus+L. dentatus var. holguinensis el estado de aletas separadas se fija y constituye la condición más apomorfina. (Anexo 7).

En cuanto a los ojos, los ophidiiformes marinos en su mayoría presentan ojos desarrollados. Teniendo en cuenta que el ancestro del género Lucifuga es de origen marino y que la atrofia de los ojos es una consecuencia de la adaptación a la vida cavernícola. Se infiere que el ancestro del género poseía ojos. Las especies del género Lucifuga evolucionaron hacia la atrofia de este órgano. Sin embargo, el clado L. dentatus var. holguinensis revierte el carácter a la condición ancestral, aunque los ojos son pequeños e infuncionales (Anexo 8). Este carácter solo se presenta en esta condición en L. speleotes, la especie del género que habita en las Bahamas.

La interpretación de los patrones evolutivos de los caracteres morfológicos en el género requiere de la inclusión en el análisis filogenético de la especie de las Bahamas, L. speleotes, como un elemento importante, no sólo para tener un mejor estimado de estos patrones, sino también para una valoración más completa de las relaciones evolutivas de las especies del género Lucifuga.

50 Conclusiones

5 Conclusiones.

1- La reconstrucción filogenética indica la existencia de dos linajes evolutivos fundamentales que divergen en un 15%, uno está formado por las especies L. simile, L. dentatus y L. dentatus var. holguinensis, y el otro por L. subterraneus y L.teresinarum.

2- Las especies L. dentatus, L. simile y L. subterraneus constituyen clados monofiléticos, coincidiendo con la taxonomía actual.

3- El análisis de la secuencia del cytb no sustenta a L. teresinarum como entidad taxonómica.

4- L. dentatus var. holguinensis constituye un clado monofilético definido por autopomorfías morfológicas, bioquímicas y moleculares, por lo tanto su estatus taxonómico debe ser reconsiderado.

51 Recomendaciones

6 Recomendaciones.

1- Evaluar otros caracteres moleculares independientes (Ej.: genes nucleares) que permitan verificar los resultados obtenidos.

2- Incluir en el análisis filogenético la especie de las Bahamas, Lucifuga speleotes, como elemento importante para la interpretación de la evolución de los caracteres morfológicos, así como para estimar el tiempo de divergencia evolutiva entre las especies del género.

3- Realizar el análisis de la divergencia molecular a nivel intraespecífico para inferir, de manera comparativa, los patrones filogeográficos de las especies que tienen una distribución geográfica amplia.

52 Bibliografía

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Anexos

Anexo 1. Algunas características de los sistemas enzimáticos analizados y composición de las tinciones bioquímicas específicas. Malato Deshidrogenasa (Mdh). Esta enzima es un dímero, NAD dependiente, que se puede encontrar en mitocondrias y citosol (Harris y Hopkinson, 1976). La tinción se llevó a cabo mezclando 40 mg de dinucleotido de Adenina y Nicotinamida (NAD) y 0.15 mL de Metilsulfato de Fenasina (PMS) al 0.4% , que actúan como cofactores de la enzima, 6 mL de Acido Málico pH 7 (sustrato) y 3 mL de Azul de Nitrotetrazolio (NBT) al 4% (compuesto oxidado que al reducirse en la reacción toma una coloración azul que permite visualizar las bandas) disueltos en 50 mL de tampón Tris-HCl 0.5 mol/L pH 7 y 60 mL de H2O destilada.

Enzima Málica (EM). Esta enzima es un tetrámero, NADP dependiente, que se puede encontrar en mitocondrias y citosol (Harris y Hopkinson, 1976). La tinción se llevó a cabo mezclando 40 mg de fosfato de dinucleotido de Adenina y Nicotinamida (NADP) y 0.15 mL de Metilsulfato de Fenasina (PMS) al 0.4%, 6 mL de Acido Málico pH 7 (sustrato) y 3 mL de Azul de Nitrotetrazolio (NBT) al 4% disueltos en 50 mL de tampón Tris-HCl 0.5 mol/L pH 7.

Lactato Deshidrogenasa (Ldh). Esta enzima es un tetrámero. La tinción se ejecutó uniendo 5 mg NAD, 0.15 mL de PMS al 0.4%, 1.5 mL NBT al 4%, 2 mL de lactato de sodio 1mol/L (sustrato), 0.8 mL de NaCl al

1.3% y 1.5 mL de MgCl2 al 0.2% disueltos en 30 mL de Tris-HCl 0.5 mol/L pH 7.

Glucosa 6 Fosfato Deshidrogenasa (G6Pdh). Este sistema es un dímero NADP dependiente. Para la visualización se mezclan 10 mg de NADP y 0.15 mL de PMS al 0.4%, 100 mg de Glucosa 6 Fosfato (sustrato), 3 mL de Azul de

Nitrotetrazolio (NBT) al 4% y 1 mg de MgCl2, todos se disuelven en 25 mL de tampón Tris- HCl 0.5 mol/L pH 8.

6 Fosfogluconato Deshidrogenasa (6PGdh). Es un dímero NADP dependiente. La tinción se prepara mezclando 10 mg de NADP y 0.15 mL de PMS al 0.4%, 20 mg de Acido 6 Fosfoglucónico (sustrato), 3 mL de Azul de Nitrotetrazolio (NBT) al 4% y se disuelven en 25 mL de Tampón Tris-HCl 0.5 mol/L pH 7.

Aldehido Oxidasa (Aox). Para el revelado de este sistema se toman 20 mg de NAD y 0.5 mL de PMS al 0.4%, 1ml de Bensaldehido (sustrato) y 1 mL de NBT al 4% y se disuelven en 50 mL de Tampón Tris-HCl 0.5 mol/L pH 8.

Superóxido Dismutasa (SOD). Este sistema se encuentra en dos formas, tetramérica en mitocondrias y dimérica en citosol (Harris y Hopkinson, 1976; Healy y Mulcahy, 1979) y se visualiza mezclando 1 mL de PMS al 0.4% y 3 mL de NBT al 4% en 50 mL de Tampón Tris-HCl 0.5 mol/L pH 8.5.

Peroxidasa (Per). Esta enzima se revela con una solución compuesta por 2 g de Bencidina dihidroclórica, 14 mL de ácido acético glacial, 10 mL de H2O2 al 3% completada a 100 mL con H2O destilada. La Bencidina reducida (incolora) es utilizada por la encima como donador de electrones reduciendo el H2O2 a H2O + O2 y Bencidina oxidada (coloreada).

Carboxilesterasas (Est). Estas enzimas están constituidas por monómeros y dímeros de pequeño tamaño. El gel se incuba 20 min en ácido bórico para disminuir la alcalinidad, los restos del ácido son posteriormente eliminados con lavados de H2O y se le añade la solución de tinción compuesta por 10mg de α y β-naftil acetato (sustratos) disueltos en acetona y 100 mL de Tampón fosfato 0.02 mol/L pH7, por último se añade 60 mg de azul rápido que reacciona con el naftol resultante generando un compuesto coloreado.

Fosfatasa Alcalina (Akp). Esta enzima puede ser monomérica o dimérica. Para su revelado se prepara una solución que contiene 50 mg de β-naftil fosfato de sodio (sustrato) y 50 mg de azul rápido disueltos en 100 mL de Tampón Tris-HCl 0.5 mol/L pH8.5. Esta reacción da como productos ácido fosfórico y β-naftol, este último reacciona con el azul rápido dando lugar a un compuesto coloreado.

Proteínas Totales (GP). Estas se visualizan sumergiendo los geles en 100 mL de una solución de azul de coomasie al 0.1% disuelto en ácido tricloroacético al 12.5%.

Anexo2. Ejemplo de perfil de secuencia obtenido con el oligonucleótido Glufish en un individuo de L. dentatus.

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G C C T C G G G C A A T A T G T A T G T A G A T A C A G A T G A A N A A N A A G G AT G C G C C G T T T G C A T G T A T G T T G C G G A T T A N C C A T C C A T A G T T T A C A T C T C G G 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190

G A A A T G T G G G T G A T G G A T G A A A A G G C A G T G G T G A T A T C A G G G G T G T A G T G T A T T G C T A G G A A T A G T C C T G T G G C G A T T T G T G C G A T T A G G C A T 200 210 220 230 240 250 260 270 280

Anexo 3. Sitios variables observados entre los individuos en el análisis de las secuencias parciales del gen mitocondrial cytb. para las especies cubanas del género Lucifuga. Los números sobre las secuencias representan la posición de los nucleótidos respecto al primero del extremo 5’ del gen. Las abreviaturas como en la Tabla 1.

111111111111 1 1 1 1 1 11122222 1 2 2 2 4 5 5 5 5 66778011122234455 7 7 7 8 8 99901233 7 2 1 7 8 6 0 2 5 7 39584813513454706 4 7 8 3 9 78976514 Ld1Emi A A T C C A C T A C ACTCACTCCCAACAACA T C A T T TCATTTGA Ld25Emi ...... T ...... Ld11Emi ...... Ld13Emi ...... T ...... Ld26Emi ...... T ...... Ld27Emi ...... T ...... Ld28Emi ...... T ...... Ld7Ban ...... T ...... Ld9Ban ...... T ...... Ld15Ban ...... T ...... Ld16Ban ...... T ...... Ld21Ban ...... T ...... Ld22Ban ...... Ld2Lec ...... T ...... Ld3Lec ...... T ...... Ld8Lec ...... T ...... Ld20Sit ...... Ld29Sit ...... T ...... Ld41Ashton ...... Ld57Par ...... T ...... Ld58Par ...... T ...... Ld60par ...... T ...... Ld61Par ...... T ...... Ld32Fel ...... T ...... Ld33Fel ...... T ...... Ld34Fel ...... T ...... Ld35Fel ...... T ...... Ld42Pat ...... T ...... Ld43Pat ...... T ...... Ld44Pat ...... T ...... Ld45Jag ...... T ...... Ld46Jag ...... T . . . C ...... Ld47Jag ...... T ...... T ...... Ld48Raj ...... T ...... Ld49Raj C ...... T ...... Ld50Gri ...... T ...... Ldvh53Est . C . . . . . C G T G. C ...... G ...... T . . . C . G . . . A .

Ldvh36Chu . C . . . . . C G T G. C ...... G ...... T . . . C . G . . . A . Lsim55GPG . C C A A G . C . . . . . T . . . . T ...... C T . . . C T G C C . . . Ls12Emi . C C . A G T C G T GA . . C T C G . T . G T G C T T C . T C C C. G C . C A T Ls18Emi . C C . A G T C G T GA . . C T C G . T . G T G C T T C . T C C C. G C . C A T Ls19Emi . C C . A G T C G T GA . . C T C G . T . G T G C T T C . T C C C. G C . C A T Ls10Ban . C C . A G T C G T GA . . C T C G . T . G T G C T T C . T C C C. G C . C A T Ls14Ban . C C . A G T C G T GA . . C T C G . T . G T G C T T C . T C C C. G C . C A T Ls17Ban . C C . A G T C G T GA . . C T C G . T . G T G C T T C . T C C C. G C . C A T Ls23Ban . C C . A G T C G T GA . . C T C G . T . G T G C T T C . T C C C. G C . C A T Ls24Ban . C C . A G T C G T GA . . C T C G . T . G T G C T T C . T C C C. G C . C A T Ls4Lec . C C . A G T C G T GA . . C T C G . T . G T G C T T C . T C C C. G C . C A T Ls30Sit . C C . A G T C G T GA . . C T C G . T . G T G C T T C . T C C C. G C . C A T Ls31Sit . C C . A G T C G T GA . . C T C G . T . G T G C T T C . T C C C. G C . C A T Ls37Lech . C C . A G T C . . . A. . C T C G . T . G T G C T T C . T C C . . . C. C . T Ls59Par . C C . A G T C . . . A. . C T C G . T . G T G C T T C . T C C . . . C. C . T Ls56 . C C . A G T C . . . A. . C T C G . T . G T G C T T C . T C C . . . C. C . T Lt39Ban . C C . A G T C . . . A. . C T C G . T . G T G C T T C . T C C . . . C. C . T Lt38Ban . C C . A G T C . . . A. . C T C G . T . G T G C T T C . T C C . . . C. C . T

2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 33333333333333333 4 4 4 4 4 44444444 4 6 7 7 8 8 9 9 0 1 12244455566688999 0 1 2 2 2 34455567 6 4 4 6 2 5 1 7 0 2 84723515734647039 2 4 0 5 6 41737921 Ld1Emi A C A C C C T C A C G C C T G G T T A C T A C T C C A C A C C G T T C C A T C A Ld25Emi ...... T ...... Ld11Emi ...... Ld13Emi . . . A ...... G. T . . . . . Ld26Emi ...... T ...... Ld27Emi . . . A ...... Ld28Emi ...... T ...... Ld7Ban . . . A ...... Ld9Ban . . . A ...... Ld15Ban . . . A ...... Ld16Ban . . . A ...... Ld21Ban ...... T ...... Ld22Ban ...... T ...... Ld2Lec ...... T ...... Ld3Lec ...... G . . T ...... Ld8Lec . . . A ...... T...... Ld20Sit ...... Ld29Sit ...... G . . T ...... Ld41Ashton ...... Ld57Par ...... T ...... Ld58Par ...... T ...... Ld60par ...... T ...... Ld61Par ...... T ...... Ld32Fel ...... T ......

Ld33Fel ...... T ...... Ld34Fel ...... T ...... Ld35Fel ...... T ...... Ld42Pat ...... T ...... Ld43Pat ...... T ...... Ld44Pat ...... T ...... Ld45Jag ...... T ...... Ld46Jag ...... T ...... Ld47Jag ...... T ...... Ld48Raj ...... T ...... T ...... Ld49Raj ...... T ...... Ld50Gri ...... T ...... T ...... Ldvh53Est . T C . T ...... T . . . G T . . . C T A . . . G Ldvh36Chu . T C . T ...... T ...... T A . . . G Lsim55GPG G . . . . . C . . T AT T C . A . . . . C ...... T . . . C . A . C A . Ls12Emi . A C . T T . G C T CT. CACCCGTCGTC. TG T . . G A . AAAGCA. Ls18Emi . A C . T T . G C T CT. CACCCGTCGTC. TG T . . G A . AAAGCA. Ls19Emi . A C . T T . G C T CT. CACCCGTCGTC. TG T . . G A . AAAGCA. Ls10Ban . A C . T T . G C T CT. CACCCGTCGTC. TG T . . G A . AAAGCA. Ls14Ban . A C . T T . G C T CT. CACCCGTCGTC. TG T . . G A . AAAGCA. Ls17Ban . A C . T T . G C T CT. CACCCGTCGTC. TG T . . G A . AAAGCA. Ls23Ban . A C . T T . G C T CT. CACCCGTCGTC. TG T . . G A . AAAGCA. Ls24Ban . A C . T T . G C T CT. CACCCGTCGTC. TG T . . G A . AAAGCA. Ls4Lec . A C . T T . G C T CT. CACCCGTCGTC. TG T . . G A . AAAGCA. Ls30Sit . A C . T T . G C T CT. CACCCGTCGTC. TG T . . G A . AAAGCA. Ls31Sit . A C . T T . G C T CT. CACCCGTCGTC. TG T . . G A . AAAGCA. Ls37Lech . A . . . T . G C T CT. CACCCGTCGTC. TG T . . G A . AAAGCA. Ls59Par . A . . . T . G C T CT. CACCCGTCGTC. TG T . . G A . AAAGCA. Ls56 . A . . . T . G C T CT. CACCCGTCGTC. TG T . . G A . AAAGCA. Lt39Ban . A . . . T . G C T CT. CACCCGTCGTC. TG T . . G A . AAAGCA. Lt38Ban . A . . . T . G C T CT. CACCCGTCGTC. TG T . . G A . AAAGCA.

4 4 4 4 4 4 4 5 5 5 55555555555555555 5 6 6 6 6 66666666 7 7 7 8 8 9 9 0 0 1 12345566677888889 9 0 0 1 1 22344456 3 4 7 2 9 0 8 1 8 3 95692824849035897 8 3 6 0 2 45102866 Ld1Emi A C A T G A G G A C T C T C A C A C G T T A G T C A T C C A G C A G C G T T C A Ld25Emi ...... Ld11Emi ...... T ...... Ld13Emi . . . A ...... Ld26Emi ...... Ld27Emi ...... Ld28Emi ...... Ld7Ban ...... Ld9Ban ...... Ld15Ban ...... Ld16Ban ...... T .

Ld21Ban ...... Ld22Ban ...... Ld2Lec ...... Ld3Lec G . . . . . A ...... Ld8Lec ...... Ld20Sit ...... Ld29Sit G . . . . . A ...... Ld41Ashton ...... Ld57Par ...... Ld58Par ...... Ld60par ...... G . . Ld61Par ...... Ld32Fel ...... A ...... Ld33Fel ...... A ...... Ld34Fel ...... A ...... Ld35Fel ...... A ...... Ld42Pat ...... A ...... Ld43Pat ...... T ...... A ...... Ld44Pat ...... A ...... Ld45Jag ...... A ...... Ld46Jag ...... A ...... Ld47Jag ...... A ...... Ld48Raj ...... A ...... Ld49Raj ...... A ...... Ld50Gri ...... A ...... Ldvh53Est . . G ...... T ...... C T G C ...... AT A . . . . Ldvh36Chu . . G ...... T ...... C T G C ...... AT A . . . . Lsim55GPG . T . . A . . . . . CA ...... C C ...... T T . A . . A...... Ls12Emi . T . . A G A A G . C. A. GGGTACCGAC. . . T T G . A CAT. CC. C Ls18Emi . T . . A G A A G . C. A. GGGTACCGAC. . . T T G . A CAT. CC. C Ls19Emi . T . . A G A A G . C. A. GGGTACCGAC. . . T T G . A CAT. CC. C Ls10Ban . T . . A G A A G . C. A. GGGTACCGAC. . . T T G . A CAT. CC. C Ls14Ban . T . . A G A A G . C. A. GGGTACCGAC. . . T T G . A CAT. CC. C Ls17Ban . T . . A G A A G . C. A. GGGTACCGAC. . . T T G . A CAT. CC. C Ls23Ban . T . . A G A A G . C. A. GGGTACCGAC. . . T T G . A CAT. CC. C Ls24Ban . T . . A G A A G . C. A. GGGTACCGAC. . . T T G . A CAT. CC. C Ls4Lec . T . . A G A A G . C. A. GGGTACCGAC. . . T T G . A CAT. CC. C Ls30Sit . T . . A G A A G . C. A. GGGTACCGAC. . . T T G . A CAT. CC. C Ls31Sit . T . . A G A A G . C. A. GGGTACCGAC. . . T T G . A CAT. CC. C Ls37Lech . T . . A G A A G . C. A. GGGTACCGAC. . . T T G . A CAT. CC. C Ls59Par . T . . A G A A G . C. A. GGGTACCGAC. . . T T G . A CAT. CC. C Ls56 . T . . A G A A G . C. A. GGGTACCGAC. . . T T G . A CAT. CC. C Lt39Ban . T . . A G A A G . C. A . . G G T A C C G A C . . . T T G . A C. T . C C . C Lt38Ban . T . . A G A A G . C. A. GGGTACCGAC. . . T T G . A CAT. CC. C

6 6 6 6 6 6 6 7 7 7 77777777777777777 7 7 7 7 7 77888 7 7 8 8 9 9 9 0 0 1 11222333344445677 8 8 8 8 8 99000 4 5 7 8 3 7 9 3 5 7 89037256812483807 0 4 6 7 8 28147 Ld1Emi C C C C C A C C A T ACATGCTATCGCCGCAT C C C A C ACCCG Ld25Emi . . . . . G ...... ------Ld11Emi . . . . . ------Ld13Emi . . . . . G ...... ------Ld26Emi . . . . . G ...... ------Ld27Emi . . . . . G ...... Ld28Emi . . . . . G ...... ------Ld7Ban . . . . . G ...... Ld9Ban . . . . . G ...... ------Ld15Ban . . . . . G ...... ------Ld16Ban . . . . . G ...... ------Ld21Ban . . . . . G ...... Ld22Ban . . T ...... ------Ld2Lec . . . . . G ...... Ld3Lec T . . . . G ...... ------Ld8Lec . . . . . G ...... ------Ld20Sit ...... Ld29Sit . . T . . G ...... ------Ld41Ashton ...... Ld57Par . . . . . G ...... C...... Ld58Par . . . . . G ...... C...... Ld60par . . . . . G ...... C...... G . . . . . - - - Ld61Par . . . . . G ...... C...... Ld32Fel . . . . . G ...... ------Ld33Fel . . T . . G ...... ------Ld34Fel . . . . . G ...... ------Ld35Fel . . . . . G ...... ------Ld42Pat . . . . . G ...... T...... Ld43Pat . . . . . G ...... T...... Ld44Pat . . . . . G ...... T...... Ld45Jag . . . . . G ...... T...... Ld46Jag . . . . . G ...... T...... Ld47Jag . . . . . G ...... T...... Ld48Raj . . . . . G ...... T...... Ld49Raj . . . . . G ...... T...... Ld50Gri . . . . . G ...... Ldvh53Est . T T . . G ...... CT . . A . . . T ...... Ldvh36Chu . T T . . G ...... CT . . A . . . T ...... Lsim55GPG . T . . . G T . . . . . GC A . . . . A . . T A T . . T . . . . . T . . A Ls12Emi . . A T T G . A G C G T ------Ls18Emi . . A T T G . A G C G T ------Ls19Emi . . A T T G . A G C G T ------Ls10Ban . . A T T G . A G C G T ------

Ls14Ban . . A T T G . A G C G T ------Ls17Ban . . A T T G . A G C G T ------Ls23Ban . . A T T G . A G C G T ------Ls24Ban . . A T T G . A G C G T ------Ls4Lec . . A T T G . A G C GT . . . T . . C T A T . A T C C . . T G T C A T T . Ls30Sit . . A T T G . A G C G T ------Ls31Sit . . A T T G . A G C G T ------Ls37Lech . . A T T G . A G C GT . . . T . . C T A T . A T C C . . T G T C A T T . Ls59Par . . A T T G . A G C GT . . . T . . C T A T . A T C C . . T G T C A T T . Ls56 . . A T T G . A G C GT . . . T . . C T A T . A T C C . . T G T C A T T . Lt39Ban . . A T T G . A G C GT . . . T . . C T A T . A T C C . . T G T C A T T . Lt38Ban . . A T T G . A G C GT . . . T . . C T A T . A T C C . . T G T C A T T .

Anexo 4. Distancias evolutivas, calculadas por Kimura 2 parámetros (Kimura, 1980), entre pares de secuencia de las especies L. subterraneus y L. teresinarum.

Ls12Emi Ls18Emi Ls19Emi Ls10Ban Ls14Ban Ls17Ban Ls23Ban Ls24Ban Ls4Lec Ls30Sit Ls31Sit Ls37Lec Ls59Par Ls56 Lt38Ban Ls12Emi Ls18Emi 0.000 Ls19Emi 0.000 0.000 Ls10Ban 0.000 0.000 0.000 Ls14Ban 0.000 0.000 0.000 0.000 Ls17Ban 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 Ls23Ban 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 Ls24Ban 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 Ls4Lec 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 Ls30Sit 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 Ls31Sit 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 Ls37Lec 0.011 0.011 0.011 0.011 0.011 0.011 0.011 0.011 0.010 0.011 0.011 Ls59Par 0.011 0.011 0.011 0.011 0.011 0.011 0.011 0.011 0.010 0.011 0.011 0.000 Ls56 0.011 0.011 0.011 0.011 0.011 0.011 0.011 0.011 0.010 0.011 0.011 0.000 0.000 Lt38Ban 0.011 0.011 0.011 0.011 0.011 0.011 0.011 0.011 0.010 0.011 0.011 0.000 0.000 0.000 Lt39Ban 0.014 0.014 0.014 0.014 0.014 0.014 0.014 0.014 0.012 0.014 0.014 0.002 0.002 0.002 0.002 Nota: En negrilla se muestran las distancias entre especies

Anexo 5. Distancias evolutivas calculadas por Kimura 2 parámetros (Kimura, 1980) entre pares de secuencias de las especies L. dentatus, L. dentatus var. holguinensis y L. simile.

Ld1Emi Ld25Emi Ld11Emi Ld13Emi Ld26Emi Ld27Emi Ld28Emi Ld7Ban Ld9Ban Ld15Ban Ld16Ban Ld21Ban Ld22Ban Ld2Lec Ld3Lec Ld8Lec Ld20Sit Ld29Sit Ld41Asht Ld1Emi Ld25Emi 0.004 Ld11Emi 0.001 0.004 Ld13Emi 0.008 0.007 0.009 Ld26Emi 0.004 0.000 0.004 0.007 Ld27Emi 0.004 0.003 0.004 0.004 0.003 Ld28Emi 0.004 0.000 0.004 0.007 0.000 0.003 Ld7Ban 0.004 0.003 0.004 0.004 0.003 0.000 0.003 Ld9Ban 0.004 0.003 0.004 0.004 0.003 0.000 0.003 0.000 Ld15Ban 0.004 0.003 0.004 0.004 0.003 0.000 0.003 0.000 0.000 Ld16Ban 0.006 0.004 0.006 0.006 0.004 0.001 0.004 0.001 0.001 0.001 Ld21Ban 0.004 0.000 0.004 0.007 0.000 0.002 0.000 0.002 0.003 0.003 0.004 Ld22Ban 0.003 0.004 0.004 0.011 0.004 0.007 0.004 0.007 0.007 0.007 0.008 0.004 Ld2Lec 0.004 0.000 0.004 0.007 0.000 0.002 0.000 0.002 0.003 0.003 0.004 0.000 0.004 Ld3Lec 0.010 0.006 0.010 0.013 0.006 0.008 0.006 0.008 0.008 0.008 0.010 0.006 0.010 0.006 Ld8Lec 0.006 0.001 0.006 0.006 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.003 0.001 0.006 0.001 0.007 Ld20Sit 0.000 0.004 0.001 0.008 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.006 0.004 0.003 0.004 0.010 0.006 Ld29Sit 0.010 0.006 0.010 0.013 0.006 0.008 0.006 0.008 0.008 0.008 0.010 0.006 0.007 0.006 0.003 0.007 0.010 Ld41Asht 0.000 0.004 0.001 0.008 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.006 0.004 0.003 0.004 0.010 0.006 0.000 0.010 Ld57Par 0.005 0.000 0.004 0.007 0.000 0.004 0.000 0.004 0.003 0.003 0.004 0.001 0.004 0.001 0.006 0.001 0.005 0.006 0.005 Ld58Par 0.005 0.000 0.004 0.007 0.000 0.004 0.000 0.004 0.003 0.003 0.004 0.001 0.004 0.001 0.006 0.001 0.005 0.006 0.005 Ld60Par 0.008 0.001 0.006 0.008 0.001 0.006 0.001 0.006 0.004 0.004 0.006 0.004 0.006 0.004 0.007 0.003 0.008 0.007 0.008 Ld61Par 0.005 0.000 0.004 0.007 0.000 0.004 0.000 0.004 0.003 0.003 0.004 0.001 0.004 0.001 0.006 0.001 0.005 0.006 0.005 Ld32Fel 0.006 0.001 0.006 0.008 0.001 0.004 0.001 0.004 0.004 0.004 0.006 0.001 0.006 0.001 0.007 0.003 0.006 0.007 0.006 Ld33Fel 0.007 0.003 0.007 0.010 0.003 0.006 0.003 0.006 0.006 0.006 0.007 0.003 0.004 0.003 0.008 0.004 0.007 0.006 0.007 Ld34Fel 0.006 0.001 0.006 0.008 0.001 0.004 0.001 0.004 0.004 0.004 0.006 0.001 0.006 0.001 0.007 0.003 0.006 0.007 0.006 Ld35Fel 0.006 0.001 0.006 0.008 0.001 0.004 0.001 0.004 0.004 0.004 0.006 0.001 0.006 0.001 0.007 0.003 0.006 0.007 0.006 Ld42Pat 0.006 0.001 0.006 0.008 0.001 0.005 0.001 0.005 0.004 0.004 0.006 0.002 0.006 0.002 0.007 0.003 0.006 0.007 0.006 Ld43Pat 0.007 0.003 0.007 0.010 0.003 0.006 0.003 0.006 0.006 0.006 0.007 0.004 0.007 0.004 0.008 0.004 0.007 0.008 0.007 Ld44Pat 0.006 0.001 0.006 0.008 0.001 0.005 0.001 0.005 0.004 0.004 0.006 0.002 0.006 0.002 0.007 0.003 0.006 0.007 0.006 Ld45Jag 0.006 0.001 0.006 0.008 0.001 0.005 0.001 0.005 0.004 0.004 0.006 0.002 0.006 0.002 0.007 0.003 0.006 0.007 0.006 Ld46Jag 0.007 0.003 0.007 0.010 0.003 0.006 0.003 0.006 0.006 0.006 0.007 0.004 0.007 0.004 0.008 0.004 0.007 0.008 0.007 Ld47Jag 0.007 0.003 0.007 0.010 0.003 0.006 0.003 0.006 0.006 0.006 0.007 0.004 0.007 0.004 0.008 0.004 0.007 0.008 0.007 Ld48Raj 0.007 0.003 0.007 0.010 0.003 0.006 0.003 0.006 0.006 0.006 0.007 0.004 0.007 0.004 0.008 0.004 0.007 0.008 0.007 Ld49Raj 0.007 0.003 0.007 0.010 0.003 0.006 0.003 0.006 0.006 0.006 0.007 0.004 0.007 0.004 0.008 0.004 0.007 0.008 0.007 Ld50Gri 0.006 0.003 0.007 0.010 0.003 0.005 0.003 0.005 0.006 0.006 0.007 0.002 0.007 0.002 0.008 0.004 0.006 0.008 0.006 Ldvh53Est 0.048 0.043 0.050 0.048 0.043 0.046 0.043 0.046 0.046 0.046 0.048 0.044 0.045 0.044 0.049 0.045 0.048 0.046 0.048 Ldvh36Chu 0.044 0.039 0.045 0.043 0.039 0.042 0.039 0.042 0.042 0.042 0.043 0.040 0.040 0.040 0.045 0.040 0.044 0.042 0.044 Lsim55GPG 0.068 0.060 0.062 0.065 0.060 0.067 0.060 0.067 0.060 0.060 0.062 0.067 0.065 0.067 0.066 0.062 0.068 0.066 0.068

Ld57Par Ld58Par Ld60Par Ld61Par Ld32Fel Ld33Fel Ld34Fel Ld35Fel Ld42Pat Ld43Pat Ld44Pat Ld45Jag Ld46Jag Ld47Jag Ld48Raj Ld49Raj Ld50Gri Ldvh53Est Ldvh36Chu Ld57Par Ld58Par 0.000 Ld60Par 0.003 0.003 Ld61Par 0.000 0.000 0.003 Ld32Fel 0.001 0.001 0.003 0.001 Ld33Fel 0.003 0.003 0.004 0.003 0.001 Ld34Fel 0.001 0.001 0.003 0.001 0.000 0.001 Ld35Fel 0.001 0.001 0.003 0.001 0.000 0.001 0.000 Ld42Pat 0.004 0.004 0.006 0.004 0.000 0.001 0.000 0.000 Ld43Pat 0.005 0.005 0.008 0.005 0.001 0.003 0.001 0.001 0.001 Ld44Pat 0.004 0.004 0.006 0.004 0.000 0.001 0.000 0.000 0.000 0.001 Ld45Jag 0.004 0.004 0.006 0.004 0.000 0.001 0.000 0.000 0.000 0.001 0.000 Ld46Jag 0.005 0.005 0.008 0.005 0.001 0.003 0.001 0.001 0.001 0.002 0.001 0.001 Ld47Jag 0.005 0.005 0.008 0.005 0.001 0.003 0.001 0.001 0.001 0.002 0.001 0.001 0.002 Ld48Raj 0.005 0.005 0.008 0.005 0.001 0.003 0.001 0.001 0.001 0.002 0.001 0.001 0.002 0.002 Ld49Raj 0.005 0.005 0.008 0.005 0.001 0.003 0.001 0.001 0.001 0.002 0.001 0.001 0.002 0.002 0.002 Ld50Gri 0.004 0.004 0.006 0.004 0.001 0.003 0.001 0.001 0.002 0.004 0.002 0.002 0.004 0.004 0.001 0.004 Ldvh53Est 0.042 0.042 0.046 0.042 0.042 0.040 0.042 0.042 0.044 0.045 0.044 0.044 0.042 0.045 0.045 0.045 0.044 Ldvh36Chu 0.038 0.038 0.041 0.038 0.037 0.036 0.037 0.037 0.040 0.041 0.040 0.040 0.038 0.041 0.041 0.041 0.040 0.004 Lsim55GPG 0.068 0.068 0.070 0.068 0.059 0.060 0.059 0.059 0.064 0.065 0.064 0.064 0.063 0.065 0.063 0.065 0.064 0.087 0.088 Nota: En letra normal se muestran las distancias dentro de cada taxon y en negrillas las distancias entre taxa

Anexo 6. Hipótesis molecular acerca de la evolución del carácter dientes en los huesos palatinos en las especies cubanas del género Lucifuga. Si: Representa la condición de presencia de dientes. No: Representa la condición de ausencia de dientes. ?: Se desconoce la condición de carácter. /: Pasos en los que el carácter cambia a una nueva condición.

L. dentatus (Si) Si Si / L. dentatus var. holguinensis (No) Si L. simile (Si)

L. subterraneus (No)

/ L. teresinarum (No)

Cataetyx (Si)

Diplacanthopoma (Si)

Bassozetus (?)

Anexo 7. Hipótesis molecular acerca de la evolución de las relaciones entre las aletas dorsal, anal y caudal en las especies cubanas del género Lucifuga. S: Representa la condición de la aleta caudal separada de la dorsal y la anal. U: Representa la condición de la aleta caudal unida a la dorsal y la anal. P (U/S): Representa la condición polimórfica ancestral. P: Representa la condición polimórfica derivada. /: Pasos en los que el carácter cambia a una nueva condición.

L. dentatus (S) S

P (U/S) / L. dentatus var. holguinensis (S) P (U/S) / L. simile (P) L. subterraneus (U) P(U/S) L. teresinarum (S) }

Cataetyx (U)

Diplacanthopoma (U)

Bassozetus (S)

Anexo 8. Hipótesis molecular acerca de la evolución del carácter presencia/ausencia de ojos en las especies cubanas del género Lucifuga. Si: Representa la condición de presencia de ojos. No: Representa la condición de ausencia de ojos. /: Pasos en los que el carácter cambia a una nueva condición

L. dentatus (No) No / No / L. dentatus var. holguinensis (Si) Si L. simile (No)

L. subterraneus (No)

/ L. teresinarum (No)

Cataetyx (Si)

Diplacanthopoma (Si)

Bassozetus (Si)