Codium Tomentosum
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2014 Codium tomentosum: Avaliação do seu potencial de cultivo num sistema IMTA e do seu potencial biotecnológico A DEPARTAMENTODE CIÊNCIAS DA VIDA v alia ç IM Codiumtomentosum ão FACULDADE DE CIÊNCIAS TECNOLOGIAS DE E FACULDADE T A do e UNIVERSIDADE DE UNIVERSIDADE do seu po do seu po t en t c en ial Joana Raquel daCostaJoana Pereira c COIMBRA ial de bio cul t t e i v c o nológi num c : si o 2014 s t ema DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS DA VIDA FACULDADE DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIAS UNIVERSIDADE DE COIMBRA Codium tomentosum: Avaliação do seu potencial de cultivo num sistema IMTA e do seu potencial biotecnológico Dissertação apresentada à Universidade de Coimbra para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Biologia, realizada sob a orientação científica do Professor Doutor Leonel Pereira (Universidade de Coimbra) Joana Raquel da Costa Pereira 2014 “Mestre não é quem sempre ensina, mas quem de repente aprende” Guimarães Rosa Agradecimentos Tenho de agradecer a todas as pessoas que fizeram parte deste meu percurso de muita alegria, trabalho, esforço, desafios e, acima de tudo, aprendizagem. Ao Professor Doutor Leonel Pereira por me ter aceitado como sua mestranda, acreditando e guiando-me neste trabalho. Agradeço a sua disponibilidade sempre que precisei, pelos ensinamentos, conselhos e sobretudo pelas oportunidades que me disponibilizou. Agradeço também à Doutora Susana Cardoso e à Professora Doutora Teresa Batista pela disponibilidade, atenção e apoio prestado, que foi fundamental para a execução deste trabalho. Um agradecimento muito especial à Doutora Helena Abreu pela oportunidade de elaboração do estágio curricular na sua empresa (ALGAplus), pelo apoio, carinho, atenção prestada. Igualmente um obrigado a todas as pessoas que partilharam comigo essa etapa da minha vida. Ao Sr. José Brasão pela paciência e pelo auxílio laboratorial prestado, que foi imensamente importante para este trabalho. Um muito obrigado também pelo carinho e amizade demonstrado. Em geral, a todos os meus amigos que me acompanharam nesta etapa de estudante e que me ajudaram a vivê-lo na totalidade, e em particular à Raquel Silva pelo companheirismo, paciência para viver comigo e “aturar” as minhas manias. Sem esquecer, um muito obrigado à minha família, principalmente aos meus pais, por se esforçarem para me proporcionarem o melhor para mim, a entrada no mundo académico, a ida para Ílhavo, sem nunca me faltar nada. MUITO OBRIGADO. Como não poderia deixar de ser, queria agradecer ao meu namorado David Gomes pelo auxílio prestado sempre que necessitei, que foi mais do que importante para a concretização deste trabalho. Agradeço pelo amor, amizade, carinho, apoio, por tudo. Agradeço pela pessoa que é! v Índice Lista de Abreviaturas…………………………………………………………….…………..………………….……. xi Resumo.………………………………………………………………………………………………………..……....… xiii Abstract………………………………………………………………….………………………………….……………… xv 1 – INTRODUÇÃO ……………………………………………………………………………………………………. 3 1.1 – Algas………………………………………………………………………….…….…………………………………. 5 1.2 – Codium tomentosum……………………………………………………………………….…….…………. 10 1.2.1 – Propriedades Antioxidantes………………………………………………….….………… 18 1.2.2 – Propriedades Anti-inflamatórias.……………………………………….……………..… 21 1.2.3 – Aquacultura Multitrófica Integrada (IMTA).………………………………………… 24 1.3 – Contextualização do trabalho e objetivos…………….…………………………………….……… 28 2- MATERIAIS E MÉTODOS…………………………………………………………………………………….. 31 2.1 – Amostragem…………………………………………………………….…………………………………….… 31 2.1.1 – Local de Amostragem……………………………….………………………………………… 31 2.1.2 – Tratamento e Transporte da Amostra…………………………………….…………… 31 2.2 – Aquacultura de Codium tomentosum…………………………………………………….…………. 33 2.2.1 – Aquacultura Multitrófica Integrada (IMTA)………………………….……………… 33 2.2.2 – Aquacultura de Laboratório……….……………………………….………………………. 34 2.3 – Obtenção dos extratos algais………………….………………….……………………………………… 37 2.3.1 – Extração em hexano…………………………………………….…………………………….. 39 2.3.2 – Extração em metanol……………………………….………………………….……………… 39 2.3.3 – Extração aquosa e precipitação dos polissacarídeos…………….……….…….. 41 2.4 – Ensaios Antioxidantes…………………………….…………………………………………………………. 43 vii 2.4.1 – Quantidade Total de Compostos Fenólicos – Teste Folin………………..…… 43 2.4.2 – Avaliação da capacidade de redução do radical DPPH…………………..…….. 44 2.4.3 – Avaliação da capacidade de redução do radical NO (“NO Scavenging”)……………………………………………………………………..……………………………………… 45 2.5 – Ensaios Anti-inflamatórios……………………………………..………………………………….……… 46 2.5.1 – Cultura de células RAW 264.7 na presença dos extratos e do LPS……..… 47 2.5.2 – Determinação da produção de nitritos……………………………………………….. 49 2.5.3 – Determinação da viabilidade celular……………………………………..……………. 49 2.6 – Análise Estatística………………….…………………………………………………………………………. 50 3 – RESULTADOS…………………………………………..……………………………………………………….. 53 3.1 – Aquacultura de Codium tomentosum……………………………………….……………………….. 53 3.1.1 – Aquacultura Multitrófica Integrada (IMTA)………………………………..……….. 53 3.1.2 – Aquacultura de laboratório…………………………………………………………………. 58 3.2 – Extratos algais obtidos e usados………………………………………………………………………… 62 3.3 – Ensaios Antioxidantes…………………………………………….…………………………………………. 63 3.3.1 – Quantidade Total de Compostos Fenólicos – Teste Folin…………………..… 63 3.3.2 – Avaliação da capacidade de redução do radical DPPH………………….……… 65 3.3.3 – Avaliação da capacidade de redução do radical NO (“NO Scavenging”).................................................................................................................. 66 3.4 – Ensaios Anti-inflamatórios………………………………………………………………………………… 67 3.4.1 – Determinação da produção de nitritos…………………….…………………………. 67 3.4.2 – Determinação da viabilidade celular…………………………………………………… 70 4 – DISCUSSÃO DOS RESULTADOS………………………………..………………………………………… 75 4.1 – Amostragem…………………………………………………………………………………………………….. 75 viii 4.2 – Aquacultura de Codium tomentosum…………………………………………………..……………. 75 4.3 – Obtenção dos extratos algais…………………………………………………………………………….. 77 4.4 – Ensaios Antioxidantes…………………………………………………………………..………………….. 78 4.4.1 – Quantidade Total de Compostos Fenólicos – Teste Folin…………………….. 78 4.4.2 – Avaliação da capacidade de redução do radical DPPH………………….……… 78 4.4.3 – Avaliação da capacidade de redução do radical NO (“NO Scavenging”)………………………………………………………………………………………………….…………. 80 4.5 – Ensaios Anti-inflamatórios…….………………………………………………………………………….. 81 4.5.1 – Determinação da produção de nitritos……………………………………………….. 81 4.5.2 – Determinação da viabilidade celular…………….…………………………………….. 82 5 – CONCLUSÕES E PERSPETIVAS FUTURAS………….…………………………………………………. 87 6 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS………………………….…………………………………………….. 91 7 – ANEXOS…………………………………………………………………………………………………………. 103 Anexo I – Cortes Histológicos de Codium tomentosum……………………………….…..……….. 103 Anexo II – Meio de Cultura f/2…………………………………………………………………………………. 106 Anexo III – Meio de Cultura VSE…………………………………………………….…..……………..……… 109 Anexo IV – Curva padrão de calibração do ácido gálico…………………………..............…….. 110 Anexo V – Curva padrão de calibração do nitrito de sódio (NaNO2)……..…………………… 112 Anexo VI – Gráficos da Experiências A e B………………………………………………………………… 113 Anexo VII – Cálculo da percentagem de inibição do radical DPPH……………………….……. 131 Anexo VIII – Retas de percentagem de inibição do radical NO e cálculos do IC50……….. 135 Anexo IX – Cálculo da percentagem de inibição da produção de nitritos…………………… 147 Anexo X – Cálculo do IC50 para o padrão Ácido Ascórbico – DPPH…………………………… 150 Anexo XI – Cálculo do IC50 para o padrão Ácido Ascórbico – NO…………………………….…. 151 ix Lista de abreviaturas AINES – Anti-inflamatórios não esteroides ARA – Ácido araquidónico BHA – Butil hidroxianisol BHT – Butil hidroxitolueno BSE – Encefalopatia espongiforme bovina DC – Densidade de cultivo DHA – Ácido docosahexaenóico DMEM – Meio de Eagle modificado por Dulbecco (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) DMSO – Sulfóxido de dimetilo DPPH – 2,2-difenil-1-picrilhidrazil EPA – Ácido eicosapentaenóico FIM – Fundação para a Inovação em Medicina GSH-Px – Glutationa peroxidase IFN-γ – Interferon gama IL – Interleucina IMTA – Aquacultura Multitrófica Integrada LPS – Lipopolissacarídeo da membrana externa das bactérias gram-negativas MTT – Brometo de 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio NO – Óxido nítrico ORAC – Capacidade de absorção de radicais oxigénio PBS – Tampão Salino-Fosfato PUFA – Ácido gordo polinsaturado xi RGR – Taxa de crescimento ROS – Espécies reativas de oxigénio SBF – Soro bovino fetal SD – Desvio padrão SE – Erro padrão SNP – Nitroprussiato de Sódio SOD – Superóxido dismutase TBHQ – terc-butil hidroquinona TNF-α – Fator de necrose tumoral alfa VSE – Von Stosch’s Enrichment WHO – Organização Mundial da Saúde xii Resumo Em todo o mundo tem havido muito interesse no desenvolvimento e comercialização de produtos funcionais a partir de algas, sendo estas usadas para diversos fins: diretamente na alimentação, extração de ficocolóides, extração de compostos com atividade antiviral, antibacteriana ou antitumoral, como fertilizantes, em cosmética e também são usadas na purificação de águas residuais. Mais recentemente, com a descoberta dos alimentos funcionais e dos nutracêuticos, as algas começaram a captar a atenção como novas fontes de ingredientes funcionais, tendo sido alvo de vários estudos de investigação, como é o caso do Codium tomentosum (Chlorophyta). O C. tomentosum mostrou ter uma elevada atividade anticoagulante para o seu extrato aquoso frio. Também o seu extrato aquoso mostrou atividade antibacteriana moderada. Relativamente à cosmética,