Instructions to RFLP Blind Test Application
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO PROGRAMA DE PÓ S-GRADUAÇ ÃO EM BIODIVERSIDADE E BIOLOGIA EVOLUTIVA IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR E AUTENTICIDADE DO PESCADO COMERCIALIZADO COMO LINGUADO NO RIO DE JANEIRO DANIELA FERREIRA DOS SANTOS DE SOUZA PÓ S-GRADUAÇ ÃO EM BIODIVERSIDADE E BIOLOGIA EVOLUTIVA IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR E AUTENTICIDADE DO PESCADO COMERCIALIZADO COMO LINGUADO NO RIO DE JANEIRO Aluna: Daniela Ferreira dos Santos de Souza Orientador: Professor Antonio Mateo Solé-Cava FEVEREIRO DE 2020 3 Ficha Catalográfica Souza, Daniela Ferreira dos Santos Identificação molecular e autenticidade do pescado comercializado como linguado no Rio de Janeiro/ Daniela Ferreira dos Santos de Souza: Rio de Janeiro, 2020. 96 f.: il. Orientador: Antonio Mateo Solé-Cava. Dissertação (Mestrado em Biodiversidade e Biologia Evolutiva), Universidade Federal do Rio de Janeiro. Rio de Janeiro, 2020. 1. Biodiversidade 2. Genética marinha. I. Solé-Cava, Antonio Mateo. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro. 4 Agradecimentos Agradeço primeiramente a minha família, por me fazer quem sou e nunca desistir de me dar a chance de sonhar e realizar até mesmo os sonhos mais distantes, como esses. A minha mãe, por ser uma mulher forte, professora de escola pública que me ensinou e ensina todos os dias a fazer a mudança que queremos ser no mundo. Ao meu pai por me mostrar que nenhuma barreira é tão grande que não possa ser superada, e com jeito e muito trabalho muita coisa pode acontecer. Aos dois pelas noites não dormidas, as horas trabalhadas para sustentar meus estudos, aos conselhos nas horas difíceis, as rizadas nos melhores momentos e nos dias e noites na praia. A minha irmã por ser minha metade, me completando em absolutamente tudo, fiel escudeira, amiga, confidente, sempre me mostrando que sou mais capaz do que eu mesma possa pensar. Ao meu namorado, por ser tudo aquilo que eu preciso, mesmo quando eu não quero, me fazendo entender que meu limite esta muito além do que sempre espero. Por ser carinho e amor quando eu só sentia medo, por me mostrar que não preciso me sentir sozinha jamais. Ao meu avô, Maurício por me mostrar o amor a natureza, sua beleza e carácter fundamental em minha vida. Por ser meu porto seguro até mesmo agora que não está mais fisicamente entre nós. Por me ensinar a ser amor sempre e para todos independente do que o mundo possa me dar em troca. A minhas avós Dina e Tete por de maneiras diferentes a ser a mulher forte e independente que sou. Ao meu orientador Solé por todo o apoio incondicional, tanto profissional, emocional e amizade. Pelas horas não dormidas, e conselhos nos momentos mais importantes na minha vida, e pela oportunidade de aprender e conviver com uma pessoa incrível e um dos melhores pesquisadores do mundo. Obrigada por ser o melhor orientador e amigo que eu poderia sonhar professor. A todos os meus amigos em especial a Rafa, Jessica, Carine e a toda a Bandeja, por me apoiarem tanto na ciência quanto na vida, sem vocês eu não teria chegado até o final. A todos os meus professores, desde a escola municipal JK onde comecei minha vida escolar e aprendi muitos dos valores que carrego até hoje, ao Pedro II onde passei grande 5 parte da minha vida construindo meu ser consciente socialmente e politicamente sendo mais que uma escola, e por fim a UFRJ por toda a construção do ser pesquisadora uma das minhas maiores paixões. A todo o povo Brasileiro por apesar de tudo manter a garra e força e pelo trabalho possibilitar que eu e outros milhares de jovens alcançarem o sonho da faculdade pública de qualidade, que infelizmente não é para todos. A todos os jovens brasileiros em especial, que por não ter a oportunidade de ingressar no nível superior ou nem sequer a perspectiva, trabalham desde cedo e pagam com a própria força de trabalho para que nós estejamos aqui. Por fim, ao Mar, por seu encanto, beleza e força que me pegaram desde criança e pelo ímpeto que me da toda a vez que o vejo, sinto ou toco. 6 Resumo SOUZA, Daniela Ferreira dos Santos de. Identificação molecular e autenticidade do pescado comercializado como linguado no Rio de Janeiro. Rio de Janeiro, 2020. Dissertação (Mestrado em Biodiversidade e Biologia Evolutiva) – Instituto de Biologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2020. No Brasil, os peixes legalmente comercializados como “Linguado” correspondem a espécies dos gêneros Syacium e Paralichthys, o que foi definido apenas em 2015 pela Instrução Normativa número 29 (IN 29). Entretanto, espécies de menor valor comercial conhecidas como panga, alabotes e solha, são frequentemente rotuladas ilegalmente como linguado, configurando substituições. Essa rotulagem incorreta pode gerar diversas consequências para os consumidores, que vão desde perdas econômicas até danos à saúde pública, devido a algumas dessas espécies possuírem alergênicos ou contaminantes. A identificação de quais espécies são utilizadas nessas substituições, bem como a etapa na cadeia de produção de alimentos onde elas ocorrem é fundamental no processo de erradicação de tal atividade ilegal. Uma vez que a identificação morfológica de pescado é frequentemente impossibilitada após seu processamento, o uso de técnicas moleculares vem se mostrando uma alternativa eficaz. Dentre estas, se destaca o sequenciamento, que apesar de ser uma técnica amplamente utilizada, possui um custo extremamente elevado, inviabilizam sua aplicação em grande escala em fiscalizações. Como alternativa, apresentam-se técnicas como a RFLP-PCR e PCR Multiplex, igualmente capazes de obter as identificações, com uma redução de tempo e custos. Sendo assim, essa dissertação teve como objetivos: (i) Estimar a taxa de substituição de Linguados no Rio de Janeiro e sua prevalência, ao longo da cadeia de comercialização de linguados; (ii) Verificar a funcionalidade do controle normativo (IN 29) sobre a flutuação nos casos de substituição de Linguado; e (iii) estabelecer e comparar métodos de autenticação com base em multiplex PCR, RFLP-PCR e sequenciamento, quanto à viabilidade, custo e eficiência. Para isso, amostras de files de diferentes etapas da cadeia de comercialização (feiras, supermercados, peixarias e restaurantes) foram sequenciadas para dois genes mitocondriais (Citocromo b e Citocromo Oxidase I) e utilizadas para determinar sua identidade por interrogação de bancos de dados genéticos por BLAST e reconstrução filogenética. Essa metodologia possibilitou a determinação de quais espécies são utilizadas como substitutas, em qual etapa da cadeia de produção essa atividade mais ocorre e a comparação das taxas de substituição antes e depois da IN 29, verificando sua efetividade. Ao mesmo tempo, foram desenvolvidas metodologias baseadas em RFLP- PCR e multiplex abrangendo todo o espectro de espécies determinado na primeira etapa de identificação. Através da comparação das metodologias desenvolvidas com o sequenciamento é possível determinar qual o método apresenta melhor aplicabilidade no processo de identificação em larga escala. A análise através de reconstrução filogenética se mostrou mais consistente do que a com similaridade com BLAST, detectando uma taxa de 52% de substituições fraudulentas, nas quais as espécies Pangasianodon hypophthalmus, Xystreurys spp., Micropogonias furnieri, Merluccius hubbsi, Lophius gastrophysus, Oreochromis niloticus e Cynoscion xanthulus foram rotuladas como linguado. Dentro da cadeia de comercialização de linguado, o mais alto índice de substituição foi encontrado em restaurantes, enquanto que em supermercados tal ocorrência foi a mais baixa. A prevalência de substituições em restaurantes demostra um alvo claro para ações de fiscalização de pescado visando sua coibição. Quanto ao cenário atual de substituições em relação ao período anterior a IN 29, apesar de um pequeno aumento geral de X% ter sido detectado, em pontos específicos como supermercados, foi possível observar a oposta, e esperada, queda (r%). O fato de uma mudança significativa ainda não ter ocorrido em toda a cadeia de produção, revela que tanto a descontinuidade espacial de fiscalizações, quanto o carácter lento de mudanças sociais podem impactar simultaneamente o cenário de substituições. Fiscalizações constantes e ao longo de toda a cadeia se tornam, portanto, fundamentais, o que só pode ser desenvolvido através de uma metodologia de identificação eficiente, acurada, e de baixo custo. Comparando as metodologias de identificação implementadas, com um custo de T reais, um tempo de obtenção de Y horas e uma eficiência de H%, a RFLP-PCR se mostrou a alternativa mais eficiente e adaptável à situação atual do controle normativo pesqueiro brasileiro. As substituições de rótulo de Linguado no brasil são complexas e multifatoriais, sendo portanto, os dados e tecnologias 7 desenvolvidas, uma fonte única de norteamento para políticas públicas nacionais no controle de fraudes pesqueiras. Abstract SOUZA, Daniela Ferreira dos Santos de. Molecular identification and authenticity of fish sold as sole in Rio de Janeiro. Rio de Janeiro, 2020. Dissertation (Master in Biodiversity and Evolutionary Biology) - Institute of Biology, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2020. In Brazil, the fish legally labeled and sold as “Flounder” correspond to species of the genera Syacium and Paralichthys, as defined in 2015 by Normative Instruction number 29 (IN 29). However, species of lower commercial value, such as Panga, Halibut and Plaice, are often illegally labeled and sold as sole, constituting illegal substitutions. Incorrect labeling can have several consequences