UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA, BIODIVERSIDADE E CONSERVAÇÃO

ANÁLISES GENÉTICAS PARA RESOLUÇÃO DE INCERTEZAS TAXONÔMICAS E IDENTIFICAÇÃO DE UNIDADES EVOLUTIVAS EM PEIXES PLEURONECTIFORMES DE ESTUÁRIOS DO BRASIL

LEANDRO ARAUJO ARGÔLO

PPGGBC

Jequié-BA 2015 LEANDRO ARAUJO ARGÔLO

ANÁLISES GENÉTICAS PARA RESOLUÇÃO DE INCERTEZAS TAXONÔMICAS E IDENTIFICAÇÃO DE UNIDADES EVOLUTIVAS EM PEIXES PLEURONECTIFORMES DE ESTUÁRIOS DO BRASIL

Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Genética, Biodiversidade e Conservação da Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, para obtenção do Título de Mestre em Genética, Biodiversidade e Conservação.

Orientador: Prof. Dr. Paulo Roberto Antunes de Mello Affonso Co-orientadora: Profa. Dra. Iracilda Sampaio

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Jequié-BA 2015

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LEANDRO ARAUJO ARGÔLO

ANÁLISES GENÉTICAS PARA RESOLUÇÃO DE INCERTEZAS TAXONÔMICAS E IDENTIFICAÇÃO DE UNIDADES EVOLUTIVAS EM PEIXES PLEURONECTIFORMES DE ESTUÁRIOS DO BRASIL

Aprovada em ____/____/____

Banca Examinadora

Dr. Paulo Roberto Antunes de Mello Affonso (orientador) Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia - UESB

Dra. Jamille de Araújo Bitencourt Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia - UESB

PPGGBC Dr. Henrique Batalha Filho Universidade Federal da Bahia - UFBA

Programa de Pós-Graduação em Genética, Biodiversidade e Conservação Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia – Jequié, BA 4

PPGGBC Dedico à Silvia Britto, por todo o esforço e auxílio neste trabalho, e à minha família, pelo apoio e liberdade para fazer o que amo.

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AGRADECIMENTOS

Agradeço à Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia (UESB) e ao Programa de Pós- Graduação em Genética, Biodiversidade e Conservação (PPGGBC) pelo apoio e oportunidade de desenvolver este trabalho. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão da bolsa. Ao meu orientador Dr. Paulo Roberto Antunes de Mello Affonso, pela inestimável amizade e orientação sempre impecável. À Dra. Iracilda Sampaio pela disponibilização do laboratório para realização do sequenciamento e à Luciana Watanabe pelo grande auxílio no estágio. Agradeço também a todos os amigos em Bragança pela imensa hospitalidade e disposição, especialmente à Adriane Freitas e Priscila Santos. Ao Dr. Robson Tamar da Costa Ramos pela imprescindível contribuição ao trabalho. À Dra. Jamille de Araújo Bitencourt, pela amizade, por ser minha “segunda orientadora”, me ensinando grande parte do que sei na área de pesquisa hoje, e por toda a ajuda. Obrigado! À minha melhor amiga e namorada Silvia Britto Barreto por estar sempre ao meu lado, por me auxiliar tanto e por toda a contribuição aos trabalhos. Você foi a pessoa mais importante nesta jornada. Aos amigos de curso ou laboratório Lídia, Henrique, Leo Aragão, Lorena, Fabilene, Aline, Juliani, Renata, Alexandre Falcão, Josivanda, Fernando, Josi, Arlete, Zaline, Ana Paula, Nathanna, Márcia, Lands, Mirian e todos os outros que tornaram esta etapa sempre divertida e prazerosa. A todos os professores que contribuíram com minha formação e crescimento durante estes anos, MarceloPPGGBC Cervini, Caroline Garcia, Ana Maria, Eduardo Lazzarin, Luiza Soares, Christine Steiner, Paulo Carneiro, Juvenal Cordeiro, Sérgio Siqueira e Débora Diniz. A meus pais e meus irmãos, pela educação que me deram, pelas influências, amizade, e por me fazer quem sou hoje. Vocês são tudo pra mim!

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BIOGRAFIA

Leandro Araujo Argôlo, filho de Evandro Argôlo e Antônia Araujo Argôlo, nasceu em 06 de fevereiro de 1992, em Jequié, Bahia. Cursou o Bacharelado em Ciências Biológicas com ênfase em Genética pela Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia (UESB) entre os anos de 2009 e 2013. Durante a graduação, foi estagiário voluntário e, posteriormente, bolsista de iniciação científica pela FAPESB (2011-2012) no Laboratório de Citogenética Animal, sob orientação do Prof. Dr. Paulo Roberto Antunes de Mello Affonso. Ao fim da graduação, em abril de 2013, apresentou sua monografia intitulada: “Análise citogenética em Cichlasoma sanctifranciscense (Perciformes, Cichlidae)”. Imediatamente após a conclusão da sua graduação, ingressou no Programa de Pós-Graduação em Genética, Biodiversidade e Conservação (PPGGBC), da UESB, permanecendo sob orientação do Prof. Dr. Paulo Roberto Antunes de Mello Affonso e sendo bolsista CAPES. Ao longo do curso, desenvolveu pesquisas na área de Citogenética e Biologia Molecular em Pleuronectiformes da costa do Brasil.

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“A Ciência é mais do que um conjunto de conhecimentos, é uma forma de pensar” (Carl Sagan)

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RESUMO A ordem Pleuronectiformes constitui um grupo peculiar de peixes conhecidos como linguados ou solhas e caracterizados por sua anatomia diferenciada. Na fase adulta, o corpo destes organismos é altamente comprimido, bilateralmente assimétrico e com os dois olhos localizados no mesmo lado. Entretanto, a taxonomia dos representantes dessa ordem é bastante controversa em razão da sobreposição de caracteres morfológicos e variação intraespecífica, causando problemas de identificação pelos métodos tradicionais e subestimando a riqueza do grupo. Tais incertezas quanto à diversidade dos Pleuronectiformes são agravadas pela associação frequente destes animais com ecossistemas costeiros altamente impactados, como os estuários e pela exploração pesqueira. Mesmo diante desses fatores, poucos estudos que utilizem ferramentas variadas de análise da diversidade e variabilidade dos Pleuronectiformes estão disponíveis. Por outro lado, em conjunto com os dados morfológicos, a análise das espécies por ferramentas citogenéticas e moleculares representa uma abordagem informativa para resolução taxonômica em peixes, incluindo grupos historicamente controversos. Assim, este trabalho objetivou estabelecer as unidades taxonômicas e/ou evolutivas em representantes de diferentes famílias de Pleuronectiformes da costa brasileira, com ênfase em ecossistemas estuarinos por meio do uso do DNA barcoding, análises morfológicas e citogenéticas. Os resultados aqui apresentados sobre dados morfológicos e moleculares confirmam a eficiência do DNA barcoding em Pleuronectiformes e reforçam o poder da taxonomia integrativa na identificação de unidades evolutivas e resolução de inconsistências de dados com base em um único tipo de análise. No caso do gênero Bothus, os dados cromossômicos revelaram uma homogeneidade para cariótipos de Bothus ocellatus (2n=32) ao longo da costa brasileira, além de um padrão pouco usual em Bothus sp. (2n=44), ampliando a variação do número diplóide para o gênero. Da mesma forma, as análises morfológicas e moleculares indicam a presença de uma nova espécie desse o gênero com maior similaridade morfológica à B. lunatus e íntima relação genética com B. pantherinus proveninente dos oceanos Índico e Pacífico. Juntamente com cacterísticas larvais e biogeográficas, os dados genéticos em Bothus apoiam um cenário de especiação em anel com origem e dispersão do ancestral de Bothus sp. pela corrente de Benguela. Os resultados deste trabalho demonstram a necessidade de ampliação de estudos na ordem para o litoral brasileiro e reforçam a necessidade de revisões taxonômicas detalhadas para o grupo.

Palavras-chave: Barcoding, citotaxonomia, DNA, Pleuronectiformes, sistemática.

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ABSTRACT The order Pleuronectiformes encompasses a unique fish group, known as flounder or flatfish, with differentiated anatomical features. When adults, these fish present highly compressed and asymmetrical body with both eyes located on the same body side. Nonetheless, the taxonomy of species in this order is controversial because of overlapping of morphological traits and intraspecific variation thus hindering a proper identification by traditional methods and underestimating their actual richness. Such uncertainties about the diversity in Pleuronectiformes are critical since they inhabit highly threatened coastal environments, such as estuaries, besides being exploited in fisheries. Even though, few studies based on distinct tools to access the diversity and variability of Pleuronectiformes are available. On the other hand, morphological studies associated with cytogenetic and molecular analyses provide an informative approach to resolve taxonomic issues in fish, including controversial groups. Therefore, in the present work, we attempted to establish the taxonomic/evolutionary units in representatives of distinct families in Pleuronectiformes from Brazilian coast with emphasis on estuarine ecosystems by DNA barcoding, morphological and cytogenetic analyses. The results based on morphological and molecular data confirmed the efficacy of DNA barcoding in flatfish and reinforce the utility of integrative taxonomy in the identification of evolutionary units and resolution of inconsistent data based on a single dataset. In the case of Bothus, the chromosomal data revealed a karyotypic homogeneity in Bothus ocellatus (2n=32) throughout the Brazilian coast besides an unusual in Bothus sp. (2n=44), thus increasing the variation in diploid number within this genus. Likewise, both morphological and molecular analyses indicated the presence of a new species in this genus, being morphologically similar to B. lunatus but genetically related to B. pantherinus from Indian and Pacific oceans. Along with larval traits and biogeographic features, the genetic data in Bothus support the hypothesis of ring speciation with origin and dispersal of Bothus sp. ancestor via Benguela current. The present results show that studies in Pleuronectiformes should be intensified along Brazilian shore and stress out the necessity of a detailed taxonomic revision in this fish group.

Keywords: Barcoding, cytotaxonomy, DNA, Pleuronectiformes, systematics.

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LISTA DE FIGURAS

Capítulo 1

Figura 1. Pontos de coleta ao longo da costa Brasileira (verde). (A) Macapá – AP, (B) Soure – PA, (C) Bragança – PA, (D) São Luís – MA, (E) Baía de Traição – PB, (F) João Pessoa – PB, (G) São Félix – BA, (H) Salvador – BA, (I) Valença – BA, (J) Camamu – BA, (K) Itacaré – BA, (L) Ilhéus – BA, (M) Mucuri – BA, (N) Coqueiral – ES, (O) Niterói – RJ...... 63

Figura 2. Espécies coletadas e analisadas neste trabalho. a) Achirus lineatus; b) Trinectes paulistanus (Achiridae); c) Bothus ocellatus (Bothidae); d) Citharichthys spilopterus; e) Citharichthys arenaceus; f) Citharichthys macrops; g) Etropus crossotus; h) Paralichthys brasiliensis; i) Paralichthys patagonicus (imagem obtida no FishBase); j) Syacium micrurum; k) Syacium papillosum (Paralichthyidae); l) Symphurus oculellus; m) Symphurus diomedianus; n) Symphurus cf. tesselatus (Cynoglossidae); o) Citharichthys sp. 1 e p) Citharichthys sp. 2 64

Figura 3. Árvore de Neighbor-Joining baseada no método de substituição nucleotídica Kimura-2-parâmetros (K2P) para espécies de Pleuronectiformes. Árvore para as sequências do gene mitocondrial COI. Os valores de bootstrap são mostrados acima de cada ramo e os nomes seguidos de números de acesso foram obtidos do GenBank ...... 65

Figura 4. Árvore de Neighbor-Joining baseada no método de substituição nucleotídica Kimura-2-parâmetros (K2P) para espécies de Pleuronectiformes. Árvore para as sequências do genePPGGBC mitocondrial de DNAr 16S. Os valores de bootstrap são mostrados acima de cada ramo e os nomes seguidos de números de acesso foram obtidos do GenBank ...... 67

Figura 5. Rede haplotípica do gene COI entre espécies de Pleuronectiformes. A rede de haplótipos demonstra as relações entre os haplótipos das espécies de Pleuronectiformes amostrados e do BOLD de cada localidade. Cada cor representa uma localidade e o tamanho dos círculos é proporcional ao número de indivíduos (detalhado dentro de cada círculo) que 11

compartilham cada haplótipo. Os números nos ramos indicam o número de mutações entre os haplótipos ...... 68

Capítulo 2

Figura 1. Mapa global da distribuição das principais espécies de Bothus abordadas neste trabalho. O mapa mostra os locais de coleta de (a) Bothus sp. e (b) B. ocellatus (BTS - Baía de Todos os Santos, BA, Brasil; BCM - Baía de Camamu, Bahia, Brasil e NTR - Niterói, Rio de Janeiro, Brasil). A área de distribuição de B. ocellatus e (c) B. pantherinus está mostrada em verde e vermelho, respectivamente. As setas indicam as principais correntes oceânicas que podem servir como rotas de dispersão de B. pantherinus pra a costa do Atlântico ...... 91

Figura 2. Dados citogenéticos das espécies Bothus ocellatus e Bothus sp. Cariótipos (a,b) e metáfases somáticas após bandamento C (c,d) de Bothus ocellatus (a,c) e Bothus sp. (b,d). Em destaque, os pares portadores de RONs após impregnação por nitrato de prata (Ag-RON), coloração com fluorocromos mostrando marcações CMA3 positivas e FISH com sonda de DNAr 18S. Os asteriscos nas metáfases indicam os blocos heterocromáticos terminais nos pares portadores de RONs ...... 92

Figura 3. Árvores de Neighbor-Joining baseadas no método de substituição nucleotídica Kimura-2-Parâmetros (K2P) para espécies de Pleuronectiformes. Árvore para as sequências do gene mitocondrial Citocromo C Oxidase Subunidade I (COI) (a) e do DNAr 16S (b). Os valores de bootstrap são mostrados acima de cada ramo e os nomes em vermelho indicam as sequências retiradas do BOLDPPGGBC (Barcode of Life Data Systems) ...... 93

Figura 4. Árvores de Inferência Bayesiana e Máxima Verossimilhança para espécies de Pleuronectiformes. Árvores de Inferência Bayesiana (a,b) e Máxima Verossimilhança (c,d) para as sequências dos genes COI (a,c) e do DNAr 16S (b, d). Os valores de probabilidade a posteriori e de bootstrap são mostrados acima de cada ramo ...... 94

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Figura 5. Rede haplotípica do gene mitocondrial Citocromo C Oxidase Subunidade I (COI) entre espécies de Bothus. A rede de haplótipos demonstra as relações entre os haplótipos das espécies Bothus ocellatus (B. oc), Bothus sp. (B. sp) e Bothus pantherinus (B. pa) de cada localidade. Cada cor representa uma localidade e o tamanho dos círculos é proporcional ao número de indivíduos (detalhado dentro de cada círculo) que compartilham cada haplótipo. Os números nos ramos indicam o número de mutações entre os haplótipos ...... 95

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LISTA DE TABELAS

Capítulo 1

Tabela 1. Lista de espécimes coletados ao longo da costa do Brasil incluindo genes obtidos para cada espécime, local de coleta, identificações preliminares e confirmação pelo taxonomista ...... 53

Tabela 2. Distâncias intraespecíficas para o gene mitocondrial COI calculadas com base no modelo Kimura-2-Parâmetros (K2P) ...... 59

Tabela 3. Distâncias intraespecíficas para o gene mitocondrial DNAr 16S calculadas com base no modelo Kimura-2-Parâmetros (K2P)...... 60

Tabela 4. Matriz de distâncias interespecíficas para fragmentos do gene mitocondrial Citocromo C Oxidase Subunidade I (COI) com base no modelo evolutivo Kimura-2-Parâmetros (K2P) ...... 61

Tabela 5. Matriz de distâncias interespecíficas para fragmentos do DNAr 16S com base no modelo evolutivo Kimura-2-Parâmetros (K2P) ...... 62

Capítulo 2 PPGGBC Tabela 1. Distâncias intraespecíficas para fragmentos do gene mitocondrial Citocromo C Oxidase Subunidade I (COI) e do DNAr 16S calculadas com base no modelo Kimura-2- Parâmetros (K2P) ...... 89

Tabela 2. Matriz de distâncias interespecíficas para fragmentos do gene mitocondrial Citocromo C Oxidase Subunidade I (COI) com base no modelo Kimura-2-Parâmetros (K2P) ...... 89 14

Tabela 3. Matriz de distâncias interespecíficas para fragmentos do DNAr 16S com base no modelo evolutivo Kimura-2-Parâmetros (K2P) ...... 90

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ...... 17

2. REVISÃO DE LITERATURA ...... 18

2.1. BIODIVERSIDADE EM ECOSSISTEMAS ESTUARINOS ...... 18

2.2. A ORDEM PLEURONECTIFORMES ...... 21

2.3. EVOLUÇÃO E FILOGENIA DOS PLEURONECTIFORMES ...... 22

2.4. MARCADORES MOLECULARES NA IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES ...... 25

2.5. CITOGENÉTICA COMO FERRAMENTA TAXONÔMICA ...... 27

3. OBJETIVOS ...... 30

3.1. OBJETIVO GERAL ...... 30

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...... 30

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 31

4. CAPÍTULO 1: DNA BARCODING EM PLEURONECTIFORMES ...... 41

4.1. INTRODUÇÃO ...... 42

4.2. MÉTODOS ...... 43

4.2.1. OBTENÇÃO DAS SEQUÊNCIAS ...... 43

4.2.2. ANÁLISE MOLECULAR ...... 44

4.3. RESULTADOS ...... 45

4.4. DISCUSSÃO ...... 47

4.5. REFERÊNCIAS ...... 50

5. CAPÍTULO 2: DIVERGÊNCIA GENÉTICA EM ESPÉCIES SIMPÁTRICAS DE BOTHUS (PLEURONECTIFORMES:PPGGBC BOTHIDAE) DO ATLÂNTICO SUL SUGERE DISPERSÃO EM LARGA ESCALA E ESTREITA RELAÇÃO EVOLUTIVA COM ESPÉCIE DO INDO-PACÍFICO ...... 69

5.1. INTRODUÇÃO ...... 70

5.2. MATERIAL E MÉTODOS ...... 72

5.2.1. AMOSTRAGEM E IDENTIFICAÇÃO ...... 72

5.2.2. ANÁLISE CITOGENÉTICA ...... 72

5.2.3. EXTRAÇÃO DE DNA E SEQUENCIAMENTO ...... 73

5.2.3. ANÁLISE DAS SEQUÊNCIAS ...... 74 16

5.3. RESULTADOS ...... 75

5.3.1. DADOS MORFOLÓGICOS ...... 75

5.3.2. DADOS CITOGENÉTICOS ...... 76

5.3.3. DADOS MOLECULARES ...... 76

5.4. DISCUSSÃO ...... 77

5.4.1. TAXONOMIA INTEGRATIVA ...... 77

5.4.2. HIPÓTESE BIOGEOGRÁFICA DE DISPERSÃO ...... 80

5.5. REFERÊNCIAS ...... 83

6. CONCLUSÕES GERAIS ...... 96

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1. INTRODUÇÃO

A ordem Pleuronectiformes constitui um dos grupos mais derivados e morfologicamente peculiares dentre os teleósteos. Os linguados, como são conhecidos popularmente, em geral habitam regiões estuarinas e marinhas, tendo poucos representantes dulcícolas. Devido à sobreposição de caracteres morfológicos e variação intraespecífica, as relações taxonômicas neste grupo são extremamente controversas. Não obstante, a análise morfológica continua sendo a principal abordagem utilizada para a definição de grupos taxonômicos, o que em diversas situações pode levar a uma visão distorcida da riqueza e relações de um grupo. Atualmente, novas ferramentas vêm sendo desenvolvidas, em especial no campo da genética, para a resolução de incertezas taxonômicas. A utilização de técnicas citogenéticas (citotaxonomia) e moleculares a partir de sequenciamento gênico (por exemplo, DNA barcoding) como mecanismos auxiliares, ou mesmo fundamentais, na sistemática é uma tendência crescente e altamente informativa, se realizada corretamente. Para os Pleuronectiformes, os estudos citogenéticos e moleculares podem representar uma solução prática e eficiente aos seus problemas taxonômicos. Adicionalmente, o momento para o desenvolvimento de tais estudos é muito oportuno, tendo em vista o notório esforço científico para a concretização do “FISH-BOL” (Fish Barcode of Life) e a iniciativa brasileira da “Rede de DNA barcoding da ictiofauna do Brasil”. Aliado a estes fatos, poucos estudos sistemáticos em larga escala para a ordem Pleuronectiformes são disponíveis, tornando-a carente de dados mais amplos e robustos. Espera-se que com o estabelecimento de um maior conjunto de dados citogenéticos e moleculares para este grupo, seja possível uma afirmação ou reestruturação de sua taxonomia e a realização de inferências sobre as relações entre grupos atuais e processos evolutivos em Pleuronectiformes. Esses dadosPPGGBC ainda são úteis para inferir a intrincada história evolutiva e padrões de biodiversidade marinha na Província Brasileira, que durante muito tempo foi entendida como uma mera extensão da Província Caribenha. Contudo, trabalhos recentes com abordagens genéticas e sistemáticas mostram níveis de endemismo surpreendentes para a costa brasileira com desdobramentos relevantes sobre a origem e evolução de peixes marinhos nessa região.

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2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. Biodiversidade em ecossistemas estuarinos

Conceitualmente, a diversidade de espécies é a combinação entre a riqueza, isto é, o número de espécies, e a equidade, ou padrão de distribuição da abundância entre as espécies de uma comunidade (Begon et al., 2007). Em todos os níveis, a diversidade biológica é de suma importância para a manutenção da espécie humana e, principalmente, para a saúde do planeta e de seus ecossistemas. Entre os hotspots mundiais de biodiversidade destacam-se as zonas costeiras, cuja diversidade é comparável àquela das florestas tropicais (Ray, 1988). Assim como as florestas, essas regiões têm sido superexploradas de tal modo que os recursos marinhos vêm sendo destruídos mais rapidamente do que se pode conhecê-los e utilizá-los (Hayden et al., 1984). Por sua vez, os estuários constituem alguns dos ecossistemas costeiros de maior importância biológica, devido à elevada produtividade e ao aporte de matéria orgânica. Eles caracterizam-se por serem ambientes costeiros semifechados, com livre conexão com o mar aberto, onde a água salgada é diluída pela água doce proveniente dos rios (Pritchard, 1967). Além de funcionar como zonas de transição entre rios e mares para espécies migratórias, áreas vitais para a reprodução, alimentação ou habitat em pelo menos um estágio de vida de muitos peixes e invertebrados (Day et al., 1989), os estuários apresentam notável valor econômico e paisagístico. Em condições naturais, os sistemas estuarinos são biologicamente mais produtivos que os rios e oceanos adjacentes, uma vez que apresentam altas concentrações de nutrientes que estimulam a produção primária. Consequentemente, o crescimento da atividade econômica e das populações humanas sempre esteve intimamente relacionado aos estuários (Miranda et al., 2002). PPGGBC A rápida redução da biodiversidade como consequência direta ou indireta das atividades humanas constitui um grande problema para a conservação biológica (Frankham et al., 2008). Neste ponto, é preocupante a atuação humana sobre os estuários, uma vez que as zonas costeiras possuem um elevado crescimento demográfico, culminando na redução da qualidade ambiental destas áreas (Duarte et al., 2001). Somado a isto, estudos que busquem acessar a ictiofauna, avaliando a variabilidade dos habitats do sistema estuarino, são escassos. Além de compreender mais de 50% da riqueza dos vertebrados, totalizando mais de 32 mil espécies (Nelson, 2006; Froese & Pauly, 2015), os peixes constituem 99% das espécies 19

nectônicas em ambientes estuarinos (Araújo et al., 2004). Estes dados demonstram a importância e a representatividade dos peixes nesses ambientes. Entretanto, a exploração e degradação intensiva nos ecossistemas estuarinos e costeiros nos últimos séculos os têm distanciado de sua história como ecossistemas ricos, diversos e produtivos (Lotze et al., 2006). Desta forma, é evidente a necessidade de conhecer a riqueza nestes ambientes de forma acurada. Outro atributo importante da diversidade da ictiofauna estuarina está na genética populacional. Os peixes em estuários podem ser classificados como residentes, estuarino- dependentes ou estuarino-ocasionais (Lenanton & Potter, 1987). Para as duas primeiras classificações, o fluxo gênico segue um modelo unidirecional, uma vez que os estuários constituem barreiras ecofisiológicas e geográficas a estas espécies que possuem deslocamento mais restrito. Por conseguinte, a diferenciação genética de subpopulações e processos de especiação são favorecidos (Keenan, 1994), tornando o ecossistema estuarino uma importante fonte de variação genética para a ictiofauna e outros organismos aquáticos. A avaliação dos níveis de fluxo gênico entre as espécies estuarinas ainda é importante para avaliar a presença de estoques pesqueiros diferenciados (Rodrigues et al., 2013) e efeitos de alterações ambientais locais (McMillan et al., 2006), direcionando medidas de manejo para a exploração desses recursos. No caso do Atlântico Sul, a costa do Brasil merece especial atenção devido à extensa faixa litorânea e por reter a maior biodiversidade de ictiofauna marinha dessa região. De fato, a Província Brasileira abrange uma área de cerca de 8.000km, que inicia no delta do rio Orinoco (Venezuela) e termina ao Norte de Santa Catarina (Floeter et al., 2001). O fluxo principal de correntes nessa região é determinado pela Corrente Sul-Equatorial, a qual segue, com origem na costa da África, em direção ao continente Sul-americano. Essa é uma corrente constante e relativamente quente que, ao encontrar a costa Nordeste do Brasil (na altura do Cabo de São Roque), divide-se, formando a Corrente do Brasil em direção sul, e a Corrente Costeira do Norte do Brasil, em direçãoPPGGBC oposta à anterior (Vazzoler et al., 1999; Affonso & Galetti, 2007). O litoral nordestino em particular, incorporando áreas de estuários e recifes, é reconhecido por órgãos como National Oceanic and Atmospheric Administration (NOAA), World Wildlife Fund (WWF) e Conservation International (CI), como uma das 223 ecorregiões mundiais de alta diversidade e riqueza de habitats (Alexander, 1993; Olson & Dinerstein, 1998). Adicionalmente, uma porção significativa das 15 áreas reconhecidas como de importância biológica nas zonas costeiras do Brasil está localizada na região nordeste. Só a costa do estado da Bahia, com cerca de 1.000km de extensão, representa 12.5% da zona costeira da Província 20

Brasileira e contribui com cerca de 32% do total de pescado coletado anualmente na região nordeste (CEPENE, 2003). A costa norte do Brasil também apresenta áreas de alta diversidade e abundância com destaque para os estuários e mangues, áreas consideradas como berçários importantes para grande parte das espécies tipicamente marinhas (Whitfield, 1990). Apesar de tal importância, o conhecimento da ictiofauna estuarina e da ecologia larval no Brasil é limitado a poucos estudos na região sul (Brandini et al., 1997). A primeira descrição de ictioplâncton estuarino ao sul do Amazonas na costa norte foi realizado por Barletta-Bergan et al. (2002) revelando a existência de espécies raras e uma diversidade (63 taxa, 28 famílias) maior do que estuários do nordeste do Brasil. Esses resultados contradiziam a concepção prévia de que estuários de alta turbidez teriam baixa diversidade em relação a zonas estuarinas abertas ou maior variação de habitats. Similarmente, diversos levantamentos faunísticos na região costeira da Província Brasileira têm revelado um grande número de espécies, muitas endêmicas, determinando maior diferenciação da Província Caribenha que o pressuposto até então (Rocha et al., 2005; Luiz Jr. et al., 2009). Exemplificando, o último inventário da ictiofauna do litoral do Rio Grande do Norte (410 km de extensão), registrou 440 espécies, das quais 82 representaram novas ocorrências, e a distribuição geográfica de duas delas foi ampliada (Garcia, 2006). Mas, de modo geral, as informações sobre as espécies da plataforma continental nas costas norte e nordeste do Brasil ainda são restritas e pulverizadas. Essa situação ainda é agravada pela dificuldade, no ambiente marinho, em se avaliar a dispersão dos organismos, processos de fluxo gênico e padrões de especiação (Rocha & Bowen, 2008). No caso particular do Atlântico Sul, estudos recentes indicam que a biogeografia de peixes dessa região segue um padrão fragmentado de distribuição, resultante de eventos de especiação alopátrica, combinados com interação entre capacidade dispersiva e processos ecológicos (Ferreira et al., 2004; Rocha et al., 2005; Santos et al., 2006; Galetti et al., 2006). Toda essa complexidadePPGGBC estrutural das assembléias de peixes marinhos, com relações intra e interespecíficas intricadas, aliada à vasta e pouco conhecida diversidade de organismos justificam o emprego de análises mais detalhadas, como as genéticas, nessas espécies (Grosberg & Cunningham, 2001; Affonso & Galetti, 2007). Reiterando essa abordagem, a avaliação sobre a situação atual das águas marinhas no Brasil, realizada pelo Ministério do Meio Ambiente, atesta que: “A exploração e o uso sustentável dos recursos vivos do mar não devem ser enfocados exclusivamente com a finalidade de produção de alimentos, como recursos pesqueiros, mas também, em termos de sua biodiversidade, como patrimônio genético e como fonte potencial para utilização na biotecnologia.” (Ministério do Meio Ambiente, 2002). 21

2.2. A ordem Pleuronectiformes

Os Pleuronectiformes são um grupo de peixes que apresentam uma das especializações anatômicas mais extraordinárias dentre os vertebrados. Quando adultos, são bilateralmente assimétricos, com os dois olhos dispostos no mesmo lado. O corpo é altamente comprimido, sendo levemente arredondado do lado dos olhos e plano do lado cego (Nelson, 2006). Todos os Pleuronectiformes iniciam a vida como peixes pelágicos e bilateralmente simétricos, com um olho em cada lado da cabeça. No entanto, durante o desenvolvimento, as larvas sofrem uma metamorfose durante a qual um olho migra de um lado da cabeça para o outro, de modo que ambos os olhos passam a estar dispostos no mesmo plano corporal. Essa migração pode envolver o olho direito (destral) ou esquerdo (sinistral), padrão geneticamente fixado para a maioria das espécies (assimetria direcional), embora alguns representantes apresentem migração ocular assimétrica (Hutchins et al., 2003). Sob uma perspectiva ecológica, a retenção de um estágio larval bilateralmente simétrico promove a dispersão de larvas para longe dos adultos e em direção a futuros berçários (Schreiber, 2013; Gibson et al., 2014). Atualmente, a ordem Pleuronectiformes é dividida em duas subordens: Psettodoidei (com uma única família) e Pleuronectoidei (com 13 famílias), compreendendo cerca de 678 espécies distribuídas em aproximadamente 134 gêneros. A maioria é exclusivamente marinha, enquanto 10 espécies ocorrem somente em água doce (seis Achiridae, uma Soleidae e três Cynoglossidae). Outras espécies são primariamente dulcícolas, mas entram nos estuários ou mares, e 20 espécies marinhas, ocasionalmente, entram em água doce (Nelson, 2006). Esses peixes, popularmente conhecidos como linguados ou solhas, são bentônicos e de ampla distribuição geográfica, desde as regiões subantárticas até os trópicos (Pauly, 1994). Ocorrem nos mares tropicais, temperados e frios, em profundidades desde a zona entremarés até o talude continental, incluindo as fontes hidrotermais (Gibson et al., 2014). No Brasil, os linguados são encontradosPPGGBC ao longo de toda a costa, particularmente em ambientes estuarinos e sobre fundos arenosos (Figueiredo & Menezes, 2000). De fato, estudos recentes de dispersão de espécies em ecossistemas estuarinos demonstram que os Pleuronectiformes representam uma parcela significativa das espécies listadas nos estuários. Em geral, essas espécies utilizam esses ambientes como área de criação e desenvolvimento durante parte ou ao longo de todo o seu ciclo de vida (estuarino- dependentes) (Furey et al., 2013). Os linguados adultos variam em tamanho desde alguns centímetros até 2 m ou mais (Gibson et al., 2014). Adicionalmente, possuem uma incrível capacidade de camuflagem, 22

devido à resposta diferencial dos cromatóforos em sua pele. Com isso, eles são capazes de imitar cores e padrões de cores do ambiente, mimetizando até mesmo o tamanho das manchas (Ramachandran et al., 1996; Healey, 1999; Burton, 2010). O movimento dos olhos dos Pleuronectiformes é independente para cada olho e fornece uma visão de 360º, que maximiza a habilidade de detecção de presas e predadores. Além disso, quando os linguados se enterram no substrato para auxiliar na camuflagem, um saco muscular força a entrada de fluido na órbita, fazendo com que os olhos fiquem protraídos acima do chão (Gibson et al., 2014). Estas características, juntamente com a habilidade de mimetizar o ambiente por meio de uma rápida camuflagem, permitem uma alta eficiência no hábito predominantemente demersal e predação do tipo “senta-e-espera” (Ray, 1988; Schreiber, 2013). Muitas espécies desse grupo ainda apresentam notável importância econômica e representam um recurso pesqueiro altamente explorado em certas regiões. Porém, no caso das espécies do Brasil, o consumo de linguados ainda é dependente do extrativismo de populações naturais, especialmente da pesca artesanal (Mendonça & Araújo, 2002).

2.3. Evolução e filogenia dos Pleuronectiformes

As extraordinárias especializações mofológicas dos Pleuronectiformes suscitaram grandes discussões quanto à origem dos peixes desta ordem. Como apontado por Friedman (2008), as peculiaridades dos linguados e a ausência de formas intermediárias entre simetria e assimetria, em um primeiro momento, tornaram estes peixes uma parte central das críticas à seleção natural (Mivart, 1871), levando Darwin (1872) a sugerir um cenário de herança de características adquiridas. Muitos anos depois, Goldschmidt (1933, 1940) afirmou que os primeiros linguados deveriam ter surgido repentinamente, utilizando o grupo como um dos pontos principais de seus argumentos a favor da evolução saltatória. Contudo, as origens evolutivas dos PleuronectiformesPPGGBC são, atualmente, explicadas por aspectos vistos no peculiar gênero Psettodes e fósseis das formas extintas Heteronectes e Amphistium, que representam os linguados mais primitivos conhecidos, datados aproximadamente do Eoceno há cerca de 50 milhões de anos (Friedman, 2008, 2012). A chave para a compreensão do processo evolutivo nos linguados está, essencialmente, na assimetria cranial destes peixes. O primeiro estágio larval dos Pleuronectiformes é similar à maior parte dos teleósteos. Conforme comentado anteriormente, as larvas bilateralmente simétricas vão se tornando particularmente assimétricas ao longo do desenvolvimento ontogenético. Essa modificação entre formas imaturas e adultas envolve principalmente a 23

migração ocular, deslocando um dos olhos sobre a região dorsal, possivelmente, pela proliferação celular do tecido suborbital que o “empurra” até o lado oposto da cabeça (Bao et al., 2011). Como resultado, o lado ocular permanece voltado para a coluna d’água e o lado cego fica voltado ao substrato (McMenamin & Parichy, 2013). De acordo com Friedman (2008), a origem evolutiva da assimetria dos Pleuronectiformes se assemelha à ontogenia, com progressivos graus de migração da órbita, transformando um precursor simétrico em uma forma assimétrica. Os fósseis encontrados dos gêneros Heteronectes e Amphistium permitiram uma considerável compreensão dos estágios iniciais da evolução dos Pleuronectiformes. Ambos possuem um estágio incompleto de assimetria cranial, diferentemente das formas atuais. Também em contraste com as espécies contemporâneas, em sua maior parte monomórficas quanto ao lado ocular, existem indícios de que os ancestrais dos Pleuronectiformes possuíam formas destrais e sinistrais que ocorriam aproximadamente na mesma frequência dentro de cada espécie (Friedman, 2008, 2012). Além de Heteronectes e Amphistium, o gênero Psettodes é uma peça fundamental na compreensão da evolução deste grupo. Pela classificação atual, a subordem Pleuronectoidei compreende a vasta maioria das espécies de linguados, enquanto Psettoidei inclui uma única família com três espécies de Psettodes (Gibson et al., 2014). Essas espécies possuem profundas diferenças anatômicas e retêm um grande número de características plesiomórficas quando comparados aos outros Pleuronectiformes vivos (Regan, 1910; Norman, 1934). Chapleau (1993) descreveu uma série de características primitivas mantidas em Psettodes, enquanto Friedman (2012) demonstrou que a maior parte delas é compartilhada entre Psettodes, Heteronectes e Amphistium. Três sinapomorfias principais foram apontadas por Chapleau (1993) em suporte à monofilia dos Pleuronectiformes: a assimetria crianial como resultado da migração dos olhos, a inserção da nadadeira dorsal posicionada dorsalmente ao crânio, e a presença de um saco muscular na órbitaPPGGBC que se enche de fluido e faz o olho se protrair. Porém, em Psettodes, estas sinapomorfias, na verdade, diferem. Neste gênero, o olho não migra completamente para o outro lado, mas se posiciona na linha dorsal (Friedman, 2008), o que afeta a inserção da nadadeira dorsal que, diferentemente dos outros linguados, é posterior ao olho (Nelson, 2006). A terceira sinapomorfia, o saco muscular chamado de recessus orbitalis, pode não estar presente em Psettodes, uma vez que eles não podem estender os olhos e não possuem dobras de pele ao redor dos olhos, como outros membros da ordem (Chabanaud, 1937). Além disso, Psettodes possui uma série de características que não são comuns em outros linguados (Campbell, 2013). 24

De um modo geral, esse conjunto de dados indica que o primeiro grande passo para a evolução dos Pleuronectiformes foi o surgimento de um novo sistema de desenvolvimento que levou à assimetria craniana e ao posicionamento antissimétrico dos olhos. Inicialmente, a direção da migração ocular deveria ser um caráter não fixado, conforme verificado nos táxons ancestrais. Em seguida, é possível que tenha havido o estabelecimento da lateralização e assimetria direcional encontrada na vasta maioria de espécies em Pleuronectiformes (Gibson et al., 2014). Em relação às análises filogenéticas, as análises morfológicas tem sido substituídas por inferências a partir de sequências moleculares, uma vez que elas geram um número muito maior de caracteres informativos, independem do estágio do desenvolvimento e são tecnicamente padronizadas. Os dados das inferências moleculares ainda podem ser usados para confrontar outras fontes de dados na detecção de convergências, homoplasias e paralelismo (Ridley, 2006). Este cenário é um fato para Pleuronectiformes onde, atualmente, a maior parte das filogenias é baseada em dados moleculares. Estudos filogenéticos em Pleuronectiformes tem sido, em sua maioria, inconclusivos quanto à monofillia da ordem. Poucas filogenias apresentam os linguados como monofiléticos (Azevedo et al., 2008; Berendzen & Dimmick, 2002), entretanto, a amostragem de grupos exernos nestes estudos é fraca ou inexistente. Em contrapartida, análises moleculares que incluem uma ampla representatividade taxonômica (Smith & Wheeler, 2006; Li et al., 2009; Li et al., 2011) não apoiaram a monofilia deste grupo. Em um estudo recente incluindo mais de 200 táxons e 20 marcadores genéticos (um gene mitocondrial e 19 exons nucleares de cópia única), Betancurt et al. (2013) encontraram uma condição de monofilia para os Pleuronectiformes e estreita relação com grupos carangimorfos. Entretanto, esses autores ressaltam que uma minoria dos dados indica uma rejeição da monofilia da ordem. Em contrapartida, Campbel et al. (2013), analisando seis genes nucleares codificantes em 90PPGGBC táxons de linguados, rejeitaram a monofilia do grupo, defendendo a evolução paralela da forma dos Pleuronectiformes em duas linhagens com representantes atuais. Os dois estudos, porém, encontraram relações similares para as subordens de forma que Psettoidei e Pleuronectoidei de fato são agrupamentos monofiléticos. Desta forma, embora exista um reconhecido esforço para determinar o caráter monofilético ou parafilético dos Pleuronectiformes, as relações ainda são confusas e um consenso entre os autores ainda não foi alcançado. A interrelação entre os membros de Pleuronectiformes também permanece mal resolvida. Porém, os dados de filogenias morfológicas compilados por Gibson et al. (2014) apresentam 25

Psettodidae como a família mais basal, seguida, em ordem de derivação, pelos grupos: Citharidae, Tephrinectes, Scophthalmidae, “Paralichthyidae” (grupo parafilético), Bothidae, Pleuronectidae, Paralichthodidae, Poecilopsettidae, Rhombosoleidae, Achiropsettidae, Samaridae, Achiridae, Soleidae e Cynoglossidae. Assim como a filogenia da ordem, as relações entre os membros devem ser revistas para que se confirme a monofilia dentro das famílias, e que sejam resolvidas as relações em famílias particularmente problemáticas, como Paralichthyidae.

2.4. Marcadores moleculares na identificação de espécies

A taxonomia moderna ainda enfrenta desafios, principalmente no estabelecimento de um consenso científico sobre a categoria básica em torno da qual esta é construída – as espécies – e suas delimitações (Padial et al., 2010). Portanto, para haver uma real avaliação da riqueza da biodiversidade, é necessário resolver os impedimentos taxonômicos atuais para que sejam obtidos avanços na documentação, conservação e manejo de espécies. De fato, a diferenciação morfológica foi por muito tempo o único critério de escolha para os taxonomistas devido à facilidade relativa com que os caracteres são avaliados. Infelizmente, essas diferenças não são sempre causadas pela história evolutiva independente. Assim, grupos isolados reprodutivamente às vezes podem ser morfologicamente indistinguíveis. Contudo, muitos métodos de grande eficiência, principalmente no campo da genética, surgem como ferramentas auxiliares úteis à taxonomia e podem ajudar a resolver visões distorcidas da biodiversidade (April et al., 2011). Nesse contexto, os marcadores moleculares de DNA são muito utilizados em análises filogenéticas, filogeográficas e identificação de espécies. A utilização destes marcadores no estudo de populações naturais tem alcançado grande êxito no estabelecimento de relações evolutivas dentro PPGGBCde um grupo, além de contribuir com estudos que visem à conservação de espécies (Wolfe & Liston, 1998). O DNA mitocondrial (DNAmt) está entre as regiões genômicas mais utilizadas para estudos de sistemática molecular e é um marcador eficiente para análises intra e interespecíficas, podendo ser utilizado para estimativas do nível de variabilidade genética (Avise, 1986); análises de zona de contato (Szymura et al., 1986), fluxo gênico (Sanetra & Croizer, 2003); estudos de biogeografia histórica (Beheregaray & Sunnucks, 2001) e caracterização de estrutura populacional (Liu et al., 2006). Além dessas aplicações, as análises de DNAmt são utilizadas na sistemática molecular, com a identificação de espécies (por 26

exemplo, DNA barcoding) (Ward et al., 2009) e inferências de relações filogenéticas (Fraga et al., 2007), bem como em estudos de genética aplicada à conservação (Beheregaray et al., 2003). Dentre os genes mitocondriais mais utilizados em estudos de diversidade interespecífica destaca-se o da citocromo C oxidase I (COI), por apresentar regiões variáveis o suficiente para analisar grupos taxonomicamente relacionados (Sahls & Nyblom, 2000). Em função dessa característica, as sequências desse gene passaram a ser utilizadas em um sistema de taxonomia baseado em DNA ou DNA barcoding (Hebert et al., 2003). Esse sistema padrão rápido e preciso de identificação é utilizado como base de um sistema global de bioidentificação para os animais, recomendado para caracterização da biodiversidade (Hanner & Gregory, 2007). Em peixes, demonstrou-se que o DNA barcoding é uma poderosa ferramenta para ampliar a compreensão da história natural das espécies desse grupo, justificando a criação de uma rede de pesquisa internacional para estabelecer um banco de dados de DNA barcode de peixes, denominada FISH-BOL (Fish Barcode of Life). A campanha FISH-BOL (http://www.fishbol.org) foi concebida em 2004 e, até 2007, a identificação correta de 388 espécies de peixes de diferentes ordens foi alcançada. Em 2008, um total de 29.112 exemplares dentre 5.334 espécies de peixes foram analisadas por DNA barcoding, representando uma média de 5,46 indivíduos por espécie (Ward et al., 2009). Em um estudo realizado por Ribeiro et al. (2012) com peixes marinhos da região costeira do Estado de São Paulo (Brasil), 97% das espécies puderam ser discriminadas com base nas suas sequências COI. A maioria das espécies apresentou baixa distância genética intraespecífica, cerca de 43 vezes menor do que a distância entre espécies congenéricas. A utilidade do DNA barcoding também já foi demonstrada em peixes marinhos do litoral da Argentina por Mabragaña et al. (2011), em um estudo envolvendo 125 espécies. Dentre estas, espécies do gênero Paralichthys (Pleuronectiformes) apresentaram divergências genéticas acentuadas (até 16,2%), o que, para os autores, está acima dos valores típicos dentro de um gênero. Adicionalmente,PPGGBC em peixes marinhos, o DNA barcoding mostrou-se uma ferramenta capaz de identificar mais de 3.000 espécimes pertencentes a 521 espécies em um hotspot de biodiversidade, tal como os recifes de corais caribenhos (Weigt et al., 2012). Uma grande vantagem da técnica é a possibilidade de utilizar tanto peixes intactos quanto filés de peixe e fragmentos de nadadeiras. O DNA também pode ser extraído de ovos, larvas e juvenis (Pegg et al., 2006; Ward et al., 2009). No DNA barcoding, outros marcadores podem ser utilizados, de forma a suplementar os dados. Entre os diferentes tipos de sequências disponíveis, a região do gene ribossomal 16S do DNAmt constitui um marcador amplamente utilizado nos estudos em peixes (Farias et al., 2000; 27

Kochzius et al., 2010) e outros animais, tais como crustáceos (Harrison, 2004) e anfíbios (Vences et al., 2005). Diante desse cenário, ressalta-se que o DNA barcoding visa auxiliar na delimitação de espécies, indicando grupos geneticamente distintos. Assim, o “código de barras”, por si só, não é suficiente para descrever novas espécies (Hebert & Gregory, 2005), e, portanto, não deve ser visto como um substituto à taxonomia (Hajibabaei et al., 2007). Adicionalmente, o DNA barcoding baseado na análise da sequencia de COI pode não ser suficiente para identificar as unidades evolutivas e têm aplicabilidade restrita no estabelecimento de filogenias (Hickerson et al., 2006). Assim, o uso de outros genes mitocondriais, como o do RNAr 16S, também podem diferenciar espécies crípticas ou reforçar os dados obtidos com outros genes. Por exemplo, sequências do citocromo b e 16S foram informativas para revelar mais de uma unidade evolutiva de mero (Epinephelus itajara), peixe criticamente ameaçado, entre o Pacífico e Atlântico (Craig et al., 2009). Em função desses resultados, os autores sugerem a ressureição de E. quinquefasciatus para as populações do Pacífico e ressaltam a necessidade de manejo separado para essas espécies em programas de conservação. De modo similar, esses dois genes foram testados com sucesso na identificação de produtos pesqueiros comercializados no norte do Brasil, revelando a presença do peixe-serra (Pristis perotteti), umas das espécies de elasmobrânquios mais ameaçadas do mundo, entre os filés de cação (Palmeira et al., 2013). O DNAr 16S também foi usado em análises por SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism), revelando padrões espécie-específicos de amplificação para várias espécies de peixes marinhos a partir de amostras de ovos em plâncton (García-Vásquez et al., 2006). Em certos casos, como demonstrado em caranguejos, a sequência do DNAr 16S foi ainda mais informativa que o COI na identificação de espécies e estabelecimento das relações filogenéticas (Harrison, 2004), justificando o uso desse marcador em análises interespecíficas. PPGGBC 2.5. Citogenética como ferramenta taxonômica

A citogenética permite estabelecer marcadores em análises cariotípicas comparadas. Como responsáveis pela transmissão de informação genética entre as gerações e na compatibilidade gamética, as alterações nos cromossomos (rearranjos) devem desempenhar importante papel evolutivo. Assim, as diferenças cromossômicas entre populações e espécies podem determinar isolamento reprodutivo e especiação (Guerra, 1988; Allendorf & Luikart, 2007). 28

Com os avanços metodológicos na citogenética, é possível realizar uma caracterização fina da organização genômica das espécies e populações com potencial para revelar rearranjos microestruturais não identificados pelos métodos de rotina (Galetti & Martins, 2004; Martins, 2007). Esses resultados apresentam diversas aplicações em citotaxonomia, entendimento da estrutura cromossômica, mapeamento e diferenciação de genomas (Martins & Wasko, 2004; Martins et al., 2004). Outro aspecto relevante é que os marcadores moleculares não podem substituir a análise cromossômica (Allendorf & Luikart, 2007). Assim, os dados cariotípicos servem de excelente instrumento para inferir a história evolutiva dos organismos, contribuindo para análises filogenéticas (Nirchio & Oliveira, 2006) e o reconhecimento de linhagens ancestrais e derivadas (Azevedo et al., 2005). Contudo, é importante lembrar que a evolução cromossômica nem sempre reconstitui a história evolutiva das espécies com vários casos de rearranjos similares evoluindo de modo independente (Jacobina et al., 2013). Em peixes, as análises citogenéticas tornam-se especialmente interessantes porque eles constituem um grupo peculiar em função do número de espécies, diversidade de formas, comportamento e habitats e da posição central que ocupam na evolução dos vertebrados (Ohno, 1970). Em termos cariotípicos, uma série de particularidades é encontrada nesses animais que contribuem para a citogenética como um todo, justificando o crescente aumento no número de pesquisas cromossômicas em peixes (Affonso et al., 2007). No entanto, a carência de estudos citogenéticos ainda pode ser vista em muitos grupos. Mais especificamente sobre os Pleuronectiformes, apenas 58 das 822 espécies válidas apresentam alguma informação citogenética, o que representa menos de 10% das espécies conhecidas da ordem (Azevedo et al., 2007; Bitencourt et al., 2014). Até o momento, o número diplóide varia de 28 a 48, com cerca de 40% das espécies apresentando o cariótipo hipotético ancestral dos teleósteos (48 cromossomos acrocêntricos) proposto por Ohno (1970). A maior parte das espéciesPPGGBC com números diplóides plesiomórficos pertence às famílias Paralichthyidae e Pleuronectidae, como Hippoglossina macrops (Winkler et al., 2004), Kareius bicoloratus, Limanda yokohamae, Liopsetta putnami (Klinkhardt et al., 1995), entre outras. Igualmente, a maioria das espécies de Pleuronectiformes apresenta apenas um par de cromossomos portadores das regiões organizadoras de nucléolos (RONs). Azevedo et al. (2007) encontraram essas regiões localizadas principalmente na posição terminal em pares de cromossomos metacêntricos e submetacêntricos e na região pericentromérica de cromossomos subtelocêntricos e acrocêntricos. De acordo com esses autores, espécies do mesmo gênero ou família aparentemente exibem posições homólogas das Ag-RONs, apoiando as relações 29

filogenéticas baseadas propostas por informações morfológicas (Chapleau, 1993) e moleculares (Berendzen & Dimmick, 2002; Pardo et al., 2005). Ainda que os estudos citogenéticos sejam restritos nessa ordem, já foram documentados, por exemplo, mecanismo de determinação sexual XX/XY ou ZZ/ZW (Vitturi et al., 1993; Jiang et al., 2014), heteromorfismo de tamanho nos sítios de Ag-RON e de DNAr 45S e 5S entre cromossomos homólogos e entre indivíduos (Pardo et al., 2001; Cross et al., 2006), sintenia entre as sequências ribossomais 18S e 5S e evidência de fusão cromossômica pela presença de sequências internas dos telômeros (ITS) em um grande par metacêntrico (Bitencourt et al., 2014). O conjunto desses dados indica que os Pleuronectiformes apresentam um dinamismo surpreendente na evolução cromossômica quando comparados a outros grupos de teleósteos predominantemente marinhos como os Perciformes. Aparentemente, os principais rearranjos responsáveis pela diversificação cariotípica dos linguados são as inversões pericêntricas e as fusões cêntricas (Azevedo et al., 2007; Bitencourt et al., 2014). Em função da variabilidade cromossômica encontrada entre as espécies de Pleuronectiformes, a citogenética pode servir como excelente ferramenta em associação com dados de morfologia e genética molecular na resolução de incertezas taxonômicas (Bitencourt, 2015). De fato, essa abordagem, denominada citotaxonomia constitui uma das principais aplicações dos estudos cromossômicos em peixes Neotropicais, permitindo identificar tanto espécies crípticas como complexos de espécies (Oliveira et al., 2009).

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3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo geral

Gerar um sistema de referência confiável para auxiliar na taxonomia controversa das espécies de Pleuronectiformes de ecossistemas estuarinos da costa brasileira, integrando ferramentas citogenéticas e moleculares às análises morfológicas tradicionais.

3.2. Objetivos específicos

 Inventariar representantes de diferentes espécies e famílias de Pleuronectiformes de ambientes costeiros e estuarinos do litoral brasileiro, com especial atenção ao litoral nordestino;  Estabelecer número diplóide, fórmula cariotípica e padrão de distribuição da heterocromatina, regiões organizadoras de nucléolos (RONs) e sítios ricos em bases GC e AT de representantes amostrados;  Realizar um mapeamento físico usando técnicas de hibridação in situ (FISH) com sondas de DNAr 18S;  Utilizar o sequenciamento do gene do Citocromo C Oxidase subunidade I (COI) e do gene ribossomal 16S para auxiliar na identificação de espécies;  Com base nas análises moleculares e citogenéticas obtidas, verificar a utilidade desses marcadores na identificação de espécies ou estoques diferenciados de Pleuronectiformes e inferir as relações evolutivas e processos de diversificação do grupo.

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4. CAPÍTULO 1: DNA barcoding em Pleuronectiformes

Artigo a ser submetido à revista Mitochondrial DNA

Leandro A. Argôlo1, Robson T. C. Ramos2, Jamille A. Bitencourt3, Iracilda Sampaio3, Paulo R. A. M. Affonso1*

1Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, Jequié, BA, Brasil 2Departamento de Sistemática e Ecologia, Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, PB, Brasil 3Instituto de Estudos Costeiros, Universidade Federal do Pará, Bragança, PA, Brasil

*Autor para correspondência Endereço: Programa de Pós-Graduação em Genética, Biodiversidade e Conservação, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, Avenida José Moreira Sobrinho, s/n, Jequiezinho, CEP: 45206-190 Jequié, BA, Brasil. Tel.: +55 31 35289725. E-mail: [email protected]

Resumo O uso do DNA barcoding é, atualmente, uma das mais bem-sucedidas ferramentas moleculares com fins taxonômicos. O uso integrado de dados moleculares e morfológicos pode ser um passo decisivo em direção ao inventário da biodiversidade, especialmente em grupos morfologicamente controversos. Considerando esses aspectos, o objetivo do presente trabalho foi inventariar espécimes (n=370) de Pleuronectiformes (linguados) da costa do Brasil e testar a eficácia do DNAPPGGBC barcoding a partir da análise dos genes de Citocromo C Oxidase Subunidade I (COI) e RNAr 16S. Essa abordagem foi eficaz em identificar as espécies amostradas como grupos reciprocamente monofiléticos. Entretanto, a acentuada divergência genética intraespecífica em relação aos acessos dos bancos de dados online – BOLD e GenBank – sugere problemas na identificação desses peixes e/ou a presença de espécies crípticas. Esses dados reforçam a necessidade de revisões taxonômicas detalhadas para esse grupo de peixes.

Palavras-chave: Linguados, COI, 16S, Barcode Index Number, taxonomia.

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Introdução Em um curto espaço de tempo, o DNA barcoding (Hebert et al., 2003) tornou-se uma das ferramentas moleculares mais difundidas e bem-sucedidas de identificação taxonômica. Sua aplicação varia desde a composição de uma biblioteca mundial para fins taxonômicos – o Barcode of Life Data Systems (BOLD) – até análise forense (e.g. Barbuto, 2010). Embora ainda existam críticas pertinentes e algum ceticismo no meio acadêmico quanto a essa metodologia (Collins e Cruickshank, 2012), o DNA barcoding tem sido altamente eficiente em indicar unidades evolutivas únicas, muitas vezes passíveis de reavaliação taxonômica ou carentes de descrição formal (Hebert et al., 2004; Hendrich et al., 2014; Keer et al., 2007; Weight et al., 2012). Tal eficácia na discriminação de espécimes em unidades evolutivas pela comparação entre sequências desconhecidas e sequências publicadas é, sem dúvida, o ponto central do DNA barcoding e a porta para a interconexão de diferentes abordagens em busca da maior consistência possível para os grupos taxonômicos (Hajibabaei et al., 2007). Partindo deste pressuposto, grupos difíceis de identificar do ponto de vista morfológico e estudos larvais seriam os maiores beneficiados com esta ferramenta (Moritz e Cicero, 2004). Entre esses grupos, os peixes merecem destaque por constituírem o ramo mais morfologicamente diverso de vertebrados, com grandes mudanças fenotípicas durante o seu desenvolvimento. Neste contexto, a identificação precisa de todos os peixes é uma tarefa praticamente impossível quando baseada unicamente na morfologia (Becker et al., 2011). Um bom exemplo dessa diversificação é a ordem Pleuronectiformes (linguados ou solhas), a qual compreende cerca de 820 espécies amplamente distribuídas em regiões tropicais e temperadas, além de várias incertezas taxonômicas (Gibson et al., 2014). Com exceção das áreas que abrigam grandes espécies comerciais, como a região norte dos oceanos Pacífico e Atlântico e zonas temperadas do Hemisfério Sul, a taxonomia dos PleuronectiformesPPGGBC é pouco estudada. Com poucos taxonomistas interessados no grupo, a maior parte da diversidade de espécies na ordem, localizada na região tropical, permanece com caracterizações precárias (Gibson et al., 2014). Desta forma, mesmo entre taxonomistas, é comum verificar equívocos, como sinonímias e indivíduos mal identificados (Menezes e Figueiredo, 2000). Sob esta perspectiva, o objetivo do trabalho foi inventariar e analisar espécimes de Pleuronectiformes da costa brasileira a partir do sequenciamento dos genes mitocondriais Citocromo C Oxidase Subunidade I (COI) e de RNAr 16S, visando a verificação da eficácia do DNA barcoding na ordem e a determinação de unidades evolutivas. 43

Métodos Foram obtidos 370 espécimes de Pleuronectiformes (Tabela 1) em 15 localidades ao longo da costa do Brasil (Figura 1) por meio de coletas, doações ou aquisições com pescadores. A identificação dos espécimes foi feita em laboratório utilizando as chaves disponíveis e parte dos espécimes foi tombada na Universidade Federal da Paraíba (UFPB). Para a obtenção dos dados moleculares, foi utilizado um fragmento de tecido muscular ou fígado de cada espécime devidamente preservado em etanol absoluto. Em seguida, sequências de Pleuronectiformes disponíveis no BOLD (COI) e GenBank (16S) foram obtidas para análise comparativa. Para o primeiro gene, sempre que mais de um BIN (Barcode Index Number) foi verificado em uma espécie nominal, sequências representativas foram utilizadas. As sequências das bases de dados online utilizadas para construção das árvores e análises comparativas foram selecionadas de acordo com as identificações morfológicas, tamanho comparável e maior similaridade das sequências, verificada pela ferramenta de comparação do BOLD e a ferramenta BLAST do GenBank.

Obtenção das sequências A extração do DNA genômico foi feita com o kit Wizard Genomic DNA purification (Promega), segundo instruções do fabricante. O DNA, então, foi utilizado para a amplificação das regiões de interesse por meio das seguintes programações: COI: 95ºC por 4 min; 5 ciclos de 95ºC por 40s, 50ºC por 30s e 72ºC por 1 min e 30s; 35 ciclos de 95ºC por 40s, 53ºC por 40s e 72ºC por 1 min e 30s; e extensão final a 72ºC por 10 min. 16S: 95ºC por 5 min; 30 ciclos de 94ºC por 40s, 55ºC por 40s e 72ºC por 40s; e 72ºC por 7 min. Para a obtenção dos fragmentos do DNAr 16S, com cerca de 600 pares de bases (pb), foram utilizados primersPPGGBC universais (Palumbi, 1996). A amplificação para o COI (680pb), entretanto, foi padronizada com diferentes pares de primers para alguns grupos. Para amostras da família Paralichthyidae, foi utilizado o par de primers VF1_t1 (5’ - TGTAAAACGACGGCCAGTTCTCAACCAACCACAAAGACATTGG - 3’) e VR1_t1 (5’ – CAGGAAACAGCTATGACTAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA – 3’) (Ivanova et al., 2007). No caso dos representantes de Cynoglossidae, Bothidae e Achiridae, foi utilizado o par de primers Fish-F2 (5’ – TCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC – 3’) Fish-R1 (5’- TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA – 3’) (Kartavtsev et al., 2014). 44

As reações de PCR foram feitas em um volume final de 15 μL compostos por: 0.2 mM de dNTPs, tampão da Taq DNA polimerase 1x, 2 mM de MgCl2, 2 ng/μL de cada primer, 0.04 U/μL de Taq DNA polimerase (Invitrogen), 50 ng de DNA molde e 8.68 μL de água pura. Após a PCR, a amplificação dos fragmentos foi confirmada por meio da análise em gel de agarose 1%, de amostras coradas com azul de bromofenol e Gel Red® na proporção de 3:1. A purificação foi feita com polietilenoglicol (PEG) e lavagens em álcool hidratado 80%. O Kit BigDye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems) foi utilizado para as reações de sequenciamento. Em seguida, as amostras foram submetidas à precipitação com EDTA 125mM, etanol absoluto e etanol 70%. O sequenciamento foi realizado em um sequenciador automático ABI 3500XL (Applied Biosystems).

Análise molecular Todas as sequências foram submetidas às ferramentas de busca do BOLD e GenBank para verificação de similaridade e confirmação das regiões amplificadas. Posteriormente, a edição das sequências foi feita com o programa BioEdit Sequence Alignment Editor v.7.1.9 (Hall, 1999) e o alinhamento foi gerado pela ferramenta ClustalW Multiple alignment (Thompson et al., 1994) do mesmo programa. Logo após, as sequências consenso do COI foram obtidas com o DNA Baser Sequence Assembler v4.16.0.25 (Heracle BioSoft SRL, 2014). Os fragmentos finais tiveram comprimento de 634 pb para o COI e aproximadamente 540 pb para o 16S. Para o alinhamento do 16S, foi feita a remoção dos sítios hipervariáveis com o programa Gblocks v0.91 com as seguintes configurações: “Minimum Number of Sequences for a Flank Position” em 244, “Maximum Number of Contiguous Nonconserved Positions” em 8, “Minimum Length of a Block” em 2, e “Allowed Gap Positions” em “With Half”, resultando em um corte de 7%PPGGBC do total de bases. O alinhamento do DNAr 16S contou com 300 sequências dos espécimes coletados e 18 sequências do GenBank. Para o COI, foram analisadas 247 sequências, sendo 32 provenientes do BOLD e representando todos os BINs encontrados. Para alguns espécimes, foi obtida a sequência de apenas um dos genes. Para o cálculo das distâncias intraespecíficas e interespecíficas, bem como verificação do número de sítios variáveis e conteúdo de bases, foi utilizado o programa MEGA v.6 (Tamura et al., 2013). Com este mesmo programa, foram geradas as árvores de Neighbor-Joining (NJ) baseadas no método de substituição nucleotídica Kimura-2-Parâmetros (K2P) (Kimura, 1980) 45

com 10.000 réplicas de bootstrap. As árvores resultantes foram editadas nos programas FigTree v.1.4.2 e Adobe Photoshop CC v.14.0. A rede haplotípica foi gerada com o gene COI no Haplotype Viewer e editada com o Adobe Photoshop CC v.14.0 para inserção de dados adicionais. Em seguida, o software DNA Sequence Polymorphism, v5.10.01 (Rozas et al., 2010) foi utilizado para calcular as diversidades haplotípica (h) e nucleotídica (π).

Resultados As análises morfológicas confirmaram as espécies (Figura 2) Achirus lineatus e Trinectes paulistanus (Achiridae), Bothus ocellatus (Bothidae), Citharichthys spilopterus, Citharichthys arenaceus, Citharichthys macrops, Etropus crossotus, Paralichthys brasiliensis, Paralichthys patagonicus, Syacium micrurum e Syacium papillosum (Paralichthyidae) e Symphurus oculellus (Cynoglossidae) entre as amostrais. Algumas ainda carecem de confirmação embora apresentem características morfológicas indicativas de pertencerem às espécies Symphurus diomedianus e Symphurus cf. tesselatus. Além destes, dois grupos não-identificados do gênero Citharichthys foram denominados de Citharichthys sp. 1 e Citharichthys sp. 2 (Figura 2). Para o primeiro, não foi possível encontrar correspondência genética ou morfológica aparente. Entretanto, o segundo grupo apresentou 96% de similaridade com Citharichthys minutus disponível no BOLD e morfologia similar à mesma espécie de acordo com Saavedra-Díaz et al. (2000). O número de sítios variáveis encontrado foi de 284 para o gene COI e 243 para o 16S. O conteúdo médio de bases no COI foi de 27,9% de T, 29,2% de C, 23,5% de A e 19,4% de G, enquanto no 16S foi de 22.7% para T, 25,4% para C, 28,5% para A e 23,4% para G. As distâncias intraespecíficas variaram de 0% em alguns grupos até 0,8% em Bothus ocellatus BOLD:ACE2851 no gene COI (Tabela 2) e de 0% em vários grupos até 1,2% em Achirus lineatus para o 16SPPGGBC (Tabela 3). As árvores de NJ calculadas com o modelo de substituição K2P tanto para o COI quanto para o 16S foram concordantes na maior parte dos agrupamentos (Figuras 3 e 4). No caso do COI, a maioria das espécies analisadas formou ramos únicos com pelo menos um espécime da espécie correspondente no BOLD. Entretanto, diferentes BINs formaram ramos independentes. Isto foi visto para as espécies B. ocellatus (BOLD:ACE2851 e BOLD:AAC1841), A. lineatus (BOLD:AAB7245, BOLD:ABZ6110 e BOLD:ABY6026), S. papillosum (BOLD:AAD4398, BOLD:AAD4399, BOLD:AAD4397 e BOLD:AAD5377), S. micrurum (BOLD:AAF8657), e 46

S. tesselatus (BOLD:AAZ3850). Em contrapartida, S. ginsburgi BOLD:ABA2756 e S. oculellus apresentaram 100% de similaridade com as sequências do banco de dados do BOLD. Para o cálculo das distâncias, os diferentes BINs e grupos amostrados foram separados. Desta forma, as distâncias interespecíficas para o COI (Tabela 4) variaram de 1,9% entre A. lineatus BOLD:AAB7245 e A. lineatus + A. lineatus BOLD:ABZ6110 a 39,3% entre S. tesselatus BOLD:AAZ3850 e S. papillosum BOLD:AAD4398. Dentre os BINs e amostras de uma mesma espécie, foram encontradas as distâncias de 7,2%, 2,3% e 25,7% entre as amostras de S. micrurum, B. ocellatus e S. tesselatus do BOLD e as amostras do presente trabalho, respectivamente. O exemplo mais extremo de variação entre espécimes teoricamente coespecíficos foi encontrado em S. papillosum, que apresentou quatro BINs. A distância entre os BINs no banco de dados e os espécimes coletados de S. papillosum apresentou valores de 23.2% (BOLD:AAD4398), 21.1% (BOLD:AAD4397), 7.4% (BOLD:AAD5377) e 0.3% (BOLD:AAD4399). A árvore do 16S, da mesma forma, embora possua um menor número de táxons disponíveis no GenBank para comparação, também resultou em vários agrupamentos com altos valores de bootstrap. Entretanto, também foram encontrados grupos discordantes como Syacium micrurum, e Symphurus plagusia. Diferentemente do COI, Symphurus oculellus apresentou mais de 99% de similaridade com Symphurus plagusia AY998029.1, enquanto todos os Symphurus cf. tesselatus e S. tesselatus do GenBank formaram um agrupamento com 100% de bootstrap. Para o 16S, as distâncias interespecíficas (Tabela 5) encontradas variaram de 0% entre alguns indivíduos coespecíficos, a 30.1% entre Symphurus plagusia AY998029.1 e Bothus ocellatus. Desconsiderando a distância entre espécimes que possivelmente representam uma mesma espécie, a menor distância interespecífica foi de 2.9% entre Syacium micrurum e Syacium micrurumPPGGBC JQ939072.1. Um outro ponto de destaque foi a distância de 7.8% vista entre os dois espécimes de Symphurus plagusia do GenBank. A rede haplotípica com base em sequências do gene COI (Figura 5) foi concordante com os resultados vistos na árvore de NJ. O número total de haplótipos foi de 91 e a as diversidades haplotípica e nucleotídica foram de 0.955 e 0.198. Foi possível verificar um considerável número de mutações separando todos os BINs. Notavelmente, os haplótipos encontrados em São Paulo se mostraram próximos ou compartilharam haplótipos com os espécimes de outras regiões do Brasil. Por outro lado, haplótipos da região caribenha se distanciaram dos brasileiros. 47

Discussão As espécies amostradas de Pleuronectiformes da costa brasileira foram separadas pela análise do COI em grupos reciprocamente monofiléticos com altos valores de bootstrap (Figura 3). Do mesmo modo, o valor de 2% entre as sequências de COI como limiar de alta eficácia na diferenciação entre espécies de peixes (Ward, 2009) pôde ser aplicado à maior parte dos grupos de Pleuronectiformes aqui analisados (E. crossotus, C. spilopterus C. arenaceus, C. macrops, B. ocellatus, T. paulistanus, P. patagonicus, P. brasiliensis e P. orbignyanus). Contudo, a discordância ou concordância parcial de outros grupos pode indicar um problema na identificação morfológica de espécimes de Pleuronectiformes depositados no BOLD. Identificações morfológicas conflitantes podem ser feitas por dois ou mais laboratórios trabalhando com um mesmo táxon (Collins e Cruickshank, 2012) ou por atribuição do mesmo nome a espécies diferentes, o que provavelmente se aplica aos casos de S. papillosum, S. micrurum, A. lineatus e as espécies de Symphurus verificadas pelo COI. A inesperada distância (25.7%) entre os S. tesselatus amostrados e o S. tesselatus BOLD:AAZ3850 parece ser, quase indubitavelmente, um erro na identificação. O único espécime de S. tesselatus disponível no BOLD corresponde a um BIN no qual os outros seis (de um total de sete espécimes) são identificados como S. jenynsi. Portanto, as amostras deste estudo podem, de fato, ser S. tesselatus, como apontado pelo 16S e morfologia, preeliminarmente. Da mesma forma, os agrupamentos formados por S. oculellus e S. ginsburgi BOLD:ABA2756 no COI, e S. oculellus e S. plagusia no 16S, além da distância de 7.8% entre os S. plagusia do GenBank, certamente se deve à grande similaridade entre espécies deste grupo e à taxonomia confusa e pouco resolutiva de Symphurus, levando a erros de identificação frequentes (Menezes e Figueiredo, 2000). Como apontado por Ward et al. (2009), talvez o grande desafio para o DNA barcoding como uma ferramenta taxonômica está, especialmente, na necessidade da identificação correta dos espécimes quePPGGBC formam a “tabela de referência” da base de dados. Contudo, considerando a comprovada rigorosidade e eficácia de acordo com os possíveis padrões de associação entre BINs e espécies (Kekkonen e Hebert, 2014; Ratnasingham e Hebert, 2013), é extremamente improvável que os diferentes grupos encontrados com o mesmo nome de espécie, representem, de fato, uma única espécie. Erros de identificação morfológica em Pleuronectiformes podem, também, estar associados à identificação morfológica de larvas. Pelo menos em dois (BOLD:AAD4398 e BOLD:AAD4397) dos quatro BINs para S. papillosum, somente larvas foram utilizadas na identificação. Os dois BINs restantes incluem um sem informações sobre a fase do indivíduo 48

(BOLD:AAD5377) e outro identificado por indivíduos adultos (BOLD:AAD4399), o qual foi concordante com os espécimes amostrados. Embora exista uma literatura considerável para a identificação de larvas de Pleuronectiformes (e.g. Alshton 1964, Devi 2004), espécimes neste estágio são muito similares entre si e apresentam pouca semelhança aos adultos e são particularmente difíceis de identificar (Evseenko, 2008). Como exemplo, as identificações larvais dos S. papillosum BOLD:AAD4397 e BOLD:AAD5377 apresentaram uma distância de 23.6%, similar àquela vista entre famílias diferentes (Bothus ocellatus BOLD:ACE2851 - Bothidae e Etropus crossotus BOLD:AAB8735 - Paralichthyidae). Em Citharichthys sp. 2, ainda que sem a confirmação taxonômica por especialista, a análise morfológica revelou uma particular similaridade com C. minutus BOLD:ABA8468. Contudo, a distância de 4% encontrada no COI, em comparação com o valor comumente encontrado para discernir espécies, torna quase inviável a afirmação de que os dois grupos sejam coespecíficos. É possível que esse grupo apresente formas crípticas ainda não descritas, o que não é incomum para estudos da ictiofauna Neotropical (Pereira et al., 2013). Desta forma, em táxons morfologicamente difíceis de identificar, como os Pleuronectiformes (Gibson et al., 2014; Menezes e Figueiredo, 2000), as análises devem ser conduzidas de forma cautelosa e, sempre que possível, utilizar uma abordagem taxonômica integrativa, incluindo análises morfológicas detalhadas e maior conjunto de marcadores, dando maior robustez e confiabilidade aos dados (Dayrat, 2005). Sob essa perspectiva, as sequências do DNAr 16S também foram incluídas na análise de DNA barcoding em face do seu potencial para identificação de espécies em alguns grupos (García-Vásquez et al., 2006; Craig et al., 2009). Porém, devido à menor taxa de mutação do 16S em relação ao COI (Kochzius, 2010), o valor das distâncias no 16S foi menor. Ainda assim, a árvore de NJ apresentou uma tipologia similar à encontrada para o COI (Figura 4). Da mesma forma que no COI, a divergência de 2.9% entre os Syacium micrurum comprova a diferença genética e, possivelmentePPGGBC, morfológica entre os S. micrurum deste trabalho e os outros espécimes encontrados. A rede de haplótipos, além de confirmar a distância entre as espécies estudadas, indica uma clara distinção dos espécimes do Caribe em relação aos espécimes da América do Sul. Embora cerca de 75% das espécies sejam compartilhados entre estas regiões, na maior parte dos casos as populações de ambos os lados devem ser tratadas como unidades evolutivas diferentes, onde a barreira biogeográfica do Rio Amazonas pode desempenhar um papel central na conectividade destas populações (Rocha et al., 2007). Esse resultado reforça a indicação de que a Província Brasileira constitui uma região biogeográfica distinta da Caribenha (Moura et 49

al., 2001), o que apresenta implicações diretas sobre o manejo e gerenciamento dos recursos pesqueiros do Atlântico Sul, especialmente frente ao avançado estado de degradação dos habitats costeiros. Paralelamente, as novas descrições de espécies são frequentes em Pleuronectiformes e um número crescente de táxons aparentemente com ampla distribuição tem se revelado, na verdade, complexos de espécies (Gibson et al., 2014). Sendo assim, espécies como B. ocellatus e A. lineatus que apresentaram dois e três BINs, respectivamente, e distâncias genéticas consideráveis entre si, devem ser investigadas para esclarecer a causa destas divergências. Uma vez que identificações morfológicas se mostraram confusas, o sistema de BINs pode ser de extrema importância para guiar os esforços taxonômicos ainda escassos em Pleuronectiformes. Portanto, o DNA barcoding deve ser usado como auxílio à morfologia em futuras revisões. Neste sentido, este estudo contribuirá para compor a base de dados do BOLD, aumentando significativamente o número de espécimes depositados para algumas espécies e incluindo outras ainda não depositadas, como P. brasiliensis e, assim que propriamente identificados, Citharichthys sp. 1 e Citharichthys sp. 2. Contudo, os resultados em vários gêneros como Syacium, Symphurus e Achirus reforçam a necessidade de revisões taxonômicas na ordem e maior cautela nas identificações pelos pesquisadores, tendo em vista a grande similaridade entre espécies próximas.

PPGGBC

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Tabela I. Lista de espécimes coletados ao longo da costa do Brasil incluindo genes obtidos para cada espécime, local de coleta, identificações preliminares e confirmação pelo taxonomista. Registro Gene Localidade Identificação em campo Confirmação taxonômica 5926 16S Baía da Traição (PB) Etropus crossotus Etropus crossotus 4196 16S Bayeux (PB) Syacium micrurum Syacium micrurum 4057 COI Bragança (PA) Citharichthys sp. 1 - 4058 COI/16S Bragança (PA) Citharichthys sp. 1 - 4059 COI/16S Bragança (PA) Citharichthys sp. 1 - 4060 COI/16S Bragança (PA) Citharichthys sp. 1 - 4061 COI/16S Bragança (PA) Citharichthys sp. 1 - 5807 COI/16S Bragança (PA) Citharichthys sp. 1 - 5814 COI/16S Bragança (PA) Citharichthys sp. 1 - 5806 COI Bragança (PA) Citharichthys sp. 1 - 5829 COI/16S Bragança (PA) Citharichthys sp. 1 - 5830 COI/16S Bragança (PA) Citharichthys sp. 1 - 5831 COI Bragança (PA) Citharichthys sp. 1 - 5832 COI Bragança (PA) Citharichthys sp. 1 - 5834 COI Bragança (PA) Citharichthys sp. 1 - 5835 COI Bragança (PA) Citharichthys sp. 1 - 5815 16S Bragança (PA) Citharichthys sp. 1 - 5818 16S Bragança (PA) Citharichthys sp. 1 - 5808 16S Bragança (PA) Citharichthys sp. 1 - 5828 16S Bragança (PA) Citharichthys macrops Citharichthys macrops 5918 COI Camamu (BA) Bothus ocellatus Bothus ocellatus 5921 16S/COI Camamu (BA) Citharichthys arenaceus Citharichthys arenaceus 5940 16S/COI Camamu (BA) Citharichthys arenaceus Citharichthys arenaceus 1516 16S Camamu (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 1519 16S Camamu (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 1532 16S Camamu (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 1603 16S Camamu (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys pilopterus 2289 16S Camamu (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 2577 16S Camamu (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4398 16S Camamu (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4935 16S Camamu (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 5198 16S Camamu (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 5199 16S Camamu (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 5200 16S Camamu (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 5203 16S Camamu (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 5197 COI Camamu (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 1579 COI/16S Camamu (BA) Etropus crossotus Etropus crossotus 2286 COI/16S Camamu (BA) Etropus crossotus Etropus crossotus 2294 COI Camamu (BA) Etropus crossotus Etropus crossotus 4934 COI Camamu (BA) Etropus crossotus Etropus crossotus 5190 COI/16S Camamu (BA) Etropus crossotus Etropus crossotus 1951 16S Camamu (BA) Paralichthys cf. orbignyanus Paralichthys brasiliensis 5927 16S Camamu (BA) Paralichthys cf. orbignyanus Paralichthys brasiliensis 5914 COI/16S Camamu (BA) Paralichthys cf. orbignyanus Paralichthys brasiliensis 5917 COI/16S Camamu (BA) Paralichthys cf. orbignyanus Paralichthys brasiliensis 5919 COI/16S Camamu (BA) Paralichthys cf. orbignyanus Paralichthys brasiliensis 5925 COI/16S Camamu (BA) Paralichthys cf. orbignyanus Paralichthys brasiliensis 5941 COI Camamu (BA) Paralichthys cf. orbignyanus Paralichthys brasiliensis 5943 COI Camamu (BA) Paralichthys cf. orbignyanus Paralichthys brasiliensis 2571 16S PPGGBCCamamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 2572 16S Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 2573 16S Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 2574 16S Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 2575 16S Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 2576 16S Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 4410 16S Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 5193 16S Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 1506 16S Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 2284 16S Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 3507 COI/16S Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 5915 16S Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 1582 COI/16S Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 1610 COI Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 1611 COI Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 1612 COI/16S Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 2191 COI Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 2269 COI/16S Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 54

Tabela I (continuação). Lista de espécimes coletados ao longo da costa do Brasil incluindo genes obtidos para cada espécime, local de coleta, identificações preliminares e confirmação pelo taxonomista.

Registro Gene Localidade Identificação em campo Confirmação taxonômica 2270 COI/16S Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 2271 COI/16S Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 2272 COI/16S Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 2273 COI Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 2275 COI Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 2276 COI Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 2278 COI/16S Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 2279 COI/16S Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 2280 COI/16S Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 2281 COI/16S Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 2283 COI/16S Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 2287 COI Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 2290 COI Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 2291 COI Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 2293 COI Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 2295 COI/16S Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 2296 COI/16S Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 2297 COI/16S Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 2298 COI/16S Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 2299 COI/16S Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 3456 COI/16S Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 3500 COI/16S Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 4411 COI/16S Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 4412 COI/16S Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 5192 COI/16S Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 5194 COI/16S Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 5922 COI Camamu (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 1613 16S Camamu (BA) Syacium papillosum Syacium papillosum 2282 16S Camamu (BA) Syacium papillosum Syacium papillosum 2274 COI/16S Camamu (BA) Syacium papillosum Syacium papillosum 3457 COI/16S Camamu (BA) Syacium papillosum Syacium papillosum 5195 COI/16S Camamu (BA) Syacium papillosum Syacium papillosum 5196 COI Camamu (BA) Syacium papillosum Syacium papillosum 1581 COI/16S Camamu (BA) Symphurus cf. tesselatus - 1952 16S Camamu (BA) Symphurus cf. tesselatus - 1609 COI/16S Camamu (BA) Symphurus cf. tesselatus - 4155 COI Camamu (BA) Symphurus cf. tesselatus - 3439 16S Coqueiral (ES) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 5642 COI/16S Ilhéus (BA) Citharichthys sp. 2 - 5643 COI/16S Ilhéus (BA) Citharichthys sp. 2 - 5644 COI/16S Ilhéus (BA) Citharichthys sp. 2 - 5645 COI/16S Ilhéus (BA) Citharichthys sp. 2 - 5646 COI/16S Ilhéus (BA) Citharichthys sp. 2 - 3657 16S Ilhéus (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 3658 16S Ilhéus (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 3675 16S Ilhéus (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4673 16S Ilhéus (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4674 16S Ilhéus (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4757 16S Ilhéus (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 5648 COI/16SPPGGBC Ilhéus (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 5647 COI/16S Ilhéus (BA) Syacium papillosum Syacium papillosum 5649 COI/16S Ilhéus (BA) Syacium papillosum Syacium papillosum 5650 COI/16S Ilhéus (BA) Syacium papillosum Syacium papillosum 5651 COI/16S Ilhéus (BA) Syacium papillosum Syacium papillosum 5563 COI Ilhéus (BA) Syacium papillosum Syacium papillosum 5632 COI/16S Ilhéus (BA) Symphurus diomedianus Symphurus diomedianus 5622 16S Ilhéus (BA) Symphurus cf. plagusia Symphurus oculellus 5631 16S Ilhéus (BA) Symphurus cf. plagusia Symphurus oculellus 5636 16S Ilhéus (BA) Symphurus cf. plagusia Symphurus oculellus 5637 16S Ilhéus (BA) Symphurus cf. plagusia Symphurus oculellus 5638 16S Ilhéus (BA) Symphurus cf. plagusia Symphurus oculellus 5639 16S Ilhéus (BA) Symphurus cf. plagusia Symphurus oculellus 5640 16S Ilhéus (BA) Symphurus cf. plagusia Symphurus oculellus 5641 16S Ilhéus (BA) Symphurus cf. plagusia Symphurus oculellus 5939 16S Ilhéus (BA) Symphurus cf. plagusia Symphurus oculellus 3677 16S Ilhéus (BA) Symphurus cf. tesselatus - 3678 16S Ilhéus (BA) Symphurus cf. tesselatus - 55

Tabela I (continuação). Lista de espécimes coletados ao longo da costa do Brasil incluindo genes obtidos para cada espécime, local de coleta, identificações preliminares e confirmação pelo taxonomista.

Registro Gene Localidade Identificação em campo Confirmação taxonômica 3680 COI/16S Ilhéus (BA) Symphurus cf. tesselatus - 3681 COI/16S Ilhéus (BA) Symphurus cf. tesselatus - 3682 COI/16S Ilhéus (BA) Symphurus cf. tesselatus - 4668 COI Ilhéus (BA) Symphurus cf. tesselatus - 4669 COI Ilhéus (BA) Symphurus cf. tesselatus - 4670 COI/16S Ilhéus (BA) Symphurus cf. tesselatus - 4671 COI Ilhéus (BA) Symphurus cf. tesselatus - 4672 COI Ilhéus (BA) Symphurus cf. tesselatus - 4755 COI Ilhéus (BA) Symphurus cf. tesselatus - 4802 COI Ilhéus (BA) Symphurus cf. tesselatus - 4803 COI Ilhéus (BA) Symphurus cf. tesselatus - 4804 COI Ilhéus (BA) Symphurus cf. tesselatus - 4805 COI Ilhéus (BA) Symphurus cf. tesselatus - 4828 COI Ilhéus (BA) Symphurus cf. tesselatus - 4829 COI Ilhéus (BA) Symphurus cf. tesselatus - 4832 COI Ilhéus (BA) Symphurus cf. tesselatus - 5612 COI/16S Ilhéus (BA) Symphurus cf. tesselatus - 5615 COI Ilhéus (BA) Symphurus cf. tesselatus - 5617 COI Ilhéus (BA) Symphurus cf. tesselatus - 5618 COI Ilhéus (BA) Symphurus cf. tesselatus - 3447 16S Ilhéus (BA) Trinectes paulistanus Trinectes paulistanus 4675 16S Itacaré (BA) Citharichthys arenaceus Citharichthys arenaceus 4676 16S Itacaré (BA) Citharichthys arenaceus Citharichthys arenaceus 4678 16S Itacaré (BA) Citharichthys arenaceus Citharichthys arenaceus 4679 16S Itacaré (BA) Citharichthys arenaceus Citharichthys arenaceus 3083 COI/16S João Pessoa (PB) Achirus lineatus Achirus lineatus 3085 COI/16S João Pessoa (PB) Achirus lineatus Achirus lineatus 3091 COI/16S João Pessoa (PB) Achirus lineatus Achirus lineatus 3104 COI/16S João Pessoa (PB) Achirus lineatus Achirus lineatus 3109 COI/16S João Pessoa (PB) Achirus lineatus Achirus lineatus 4173 16S João Pessoa (PB) Citharichthys sp. 1 - 4175 16S João Pessoa (PB) Citharichthys sp. 1 - 3080 16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 3081 16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 3094 16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 3095 16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4156 16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4157 16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4158 16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4161 16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4162 16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4163 16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4164 16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4165 16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4168 16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4170 16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4171 16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4172 16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4174 16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4167 16S PPGGBCJoão Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4176 16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4178 16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4182 16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4183 16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4184 16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4185 16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4186 16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4187 16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4188 16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4189 16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4192 16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4193 16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4195 16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4199 16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 5813 16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4177 COI/16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4179 COI/16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 56

Tabela I (continuação). Lista de espécimes coletados ao longo da costa do Brasil incluindo genes obtidos para cada espécime, local de coleta, identificações preliminares e confirmação pelo taxonomista.

Registro Gene Localidade Identificação em campo Confirmação taxonômica 4180 COI/16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4181 COI/16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4190 COI/16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4191 COI/16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4194 COI/16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4197 COI/16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 5809 COI/16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 5810 COI/16S João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 5823 COI João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 5825 COI João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 5826 COI João Pessoa (PB) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 3065 COI/16S João Pessoa (PB) Etropus crossotus Etropus crossotus 3066 COI/16S João Pessoa (PB) Etropus crossotus Etropus crossotus 3067 COI/16S João Pessoa (PB) Etropus crossotus Etropus crossotus 3068 COI/16S João Pessoa (PB) Etropus crossotus Etropus crossotus 3069 COI/16S João Pessoa (PB) Etropus crossotus Etropus crossotus 3070 COI/16S João Pessoa (PB) Etropus crossotus Etropus crossotus 3125 COI/16S João Pessoa (PB) Etropus crossotus Etropus crossotus 3126 COI/16S João Pessoa (PB) Etropus crossotus Etropus crossotus 4198 COI/16S João Pessoa (PB) Etropus crossotus Etropus crossotus 4200 COI/16S João Pessoa (PB) Etropus crossotus Etropus crossotus 3123 16S João Pessoa (PB) Symphurus cf. plagusia Symphurus oculellus 3124 16S João Pessoa (PB) Symphurus cf. plagusia Symphurus oculellus 3071 16S João Pessoa (PB) Symphurus cf. plagusia Symphurus oculellus 3072 COI/16S João Pessoa (PB) Symphurus cf. plagusia Symphurus oculellus 3121 16S João Pessoa (PB) Symphurus cf. tesselatus - 3122 16S João Pessoa (PB) Symphurus cf. tesselatus - 5812 COI/16S Macapá (AP) Citharichthys sp. 1 - 5811 COI/16S Macapá (AP) Syacium papillosum Syacium papillosum 3407 16S Mucuri (BA) Citharichthys arenaceus Citharichthys arenaceus 5669 16S/COI Mucuri (BA) Citharichthys arenaceus Citharichthys arenaceus 5677 16S/COI Mucuri (BA) Citharichthys arenaceus Citharichthys arenaceus 5678 16S Mucuri (BA) Citharichthys arenaceus Citharichthys arenaceus 5679 16S/COI Mucuri (BA) Citharichthys arenaceus Citharichthys arenaceus 5734 COI Mucuri (BA) Citharichthys arenaceus Citharichthys arenaceus 5789 16S/COI Mucuri (BA) Citharichthys arenaceus Citharichthys arenaceus 3495 16S Mucuri (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 3931 16S Mucuri (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 3945 16S Mucuri (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 3970 16S Mucuri (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 5672 16S Mucuri (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 3494 COI/16S Mucuri (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 5670 COI/16S Mucuri (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 5673 COI/16S Mucuri (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 5675 COI/16S Mucuri (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 5676 COI/16S Mucuri (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 5681 COI/16S Mucuri (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 5692 COI/16S Mucuri (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 5725 COI Mucuri (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 5726 COI PPGGBCMucuri (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 3453 16S Mucuri (BA) Etropus crossotus Etropus crossotus 3452 COI Mucuri (BA) Etropus crossotus Etropus crossotus 5671 COI/16S Mucuri (BA) Etropus crossotus Etropus crossotus 5733 COI/16S Mucuri (BA) Etropus crossotus Etropus crossotus 5687 16S Mucuri (BA) Symphurus cf. tesselatus 5684 16S Mucuri (BA) Symphurus cf. tesselatus 5658 COI/16S Mucuri (BA) Symphurus cf. tesselatus - 5683 COI Mucuri (BA) Symphurus cf. tesselatus - 5685 COI/16S Mucuri (BA) Symphurus cf. tesselatus - 5686 COI/16S Mucuri (BA) Symphurus cf. tesselatus - 5688 COI/16S Mucuri (BA) Symphurus cf. tesselatus - 5689 COI/16S Mucuri (BA) Symphurus cf. tesselatus - 5691 COI/16S Mucuri (BA) Symphurus cf. tesselatus - 5697 COI Mucuri (BA) Symphurus cf. tesselatus - 5727 COI/16S Mucuri (BA) Symphurus cf. tesselatus - 3446 COI/16S Mucuri (BA) Trinectes paulistanus Trinectes paulistanus 3941 COI/16S Mucuri (BA) Trinectes paulistanus Trinectes paulistanus 57

Tabela I (continuação). Lista de espécimes coletados ao longo da costa do Brasil incluindo genes obtidos para cada espécime, local de coleta, identificações preliminares e confirmação pelo taxonomista.

Registro Gene Localidade Identificação em campo Confirmação taxonômica 3950 COI/16S Mucuri (BA) Trinectes paulistanus Trinectes paulistanus 3951 16S Mucuri (BA) Trinectes paulistanus Trinectes paulistanus 3952 COI Mucuri (BA) Trinectes paulistanus Trinectes paulistanus 2253 COI/16S Niterói (RJ) Bothus ocellatus Bothus ocellatus 5930 COI Niterói (RJ) Citharichthys macrops Citharichthys macrops 5929 COI Niterói (RJ) Citharichthys macrops Citharichthys macrops 2255 16S Niterói (RJ) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 2265 16S Niterói (RJ) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 3912 16S Niterói (RJ) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 3914 16S Niterói (RJ) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 3920 16S Niterói (RJ) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 5935 16S Niterói (RJ) Etropus crossotus Etropus crossotus 3854 COI/16S Niterói (RJ) Etropus crossotus Etropus crossotus 5934 COI/16S Niterói (RJ) Etropus crossotus Etropus crossotus 5936 COI/16S Niterói (RJ) Etropus crossotus Etropus crossotus 5937 16S Niterói (RJ) Paralichthys cf. patagonicus Paralichthys patagonicus 2230 COI/16S Niterói (RJ) Paralichthys cf. patagonicus Paralichthys patagonicus 2231 COI/16S Niterói (RJ) Paralichthys cf. patagonicus Paralichthys patagonicus 5932 COI/16S Niterói (RJ) Paralichthys cf. patagonicus Paralichthys patagonicus 5933 COI/16S Niterói (RJ) Paralichthys cf. patagonicus Paralichthys patagonicus 2247 16S Niterói (RJ) Syacium papillosum Syacium papillosum 2251 16S Niterói (RJ) Syacium papillosum Syacium papillosum 5931 COI/16S Niterói (RJ) Syacium papillosum Syacium papillosum 2249 COI/16S Niterói (RJ) Syacium papillosum Syacium papillosum 3916 COI/16S Niterói (RJ) Symphurus cf. tesselatus - 3918 COI Niterói (RJ) Symphurus cf. tesselatus - 3919 COI Niterói (RJ) Symphurus cf. tesselatus - 5218 COI/16S Salvador (BA) Bothus ocellatus Bothus ocellatus 5363 COI/16S Salvador (BA) Bothus ocellatus Bothus ocellatus 5558 COI/16S Salvador (BA) Bothus ocellatus Bothus ocellatus 5821 16S Salvador (BA) Citharichthys arenaceus Citharichthys arenaceus 5559 COI Salvador (BA) Citharichthys arenaceus Citharichthys arenaceus 3145 16S Salvador (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 3146 16S Salvador (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 3148 16S Salvador (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 3149 16S Salvador (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 5816 16S Salvador (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 5561 COI Salvador (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 5562 COI Salvador (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 5564 COI Salvador (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 5565 COI Salvador (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 5567 COI Salvador (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 5566 COI Salvador (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 4418 COI/16S Salvador (BA) Syacium papillosum Syacium papillosum 4790 16S São Felix (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4777 16S São Felix (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4781 16S São Felix (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4782 16S São Felix (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4783 16S São Felix (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4784 16S PPGGBCSão Felix (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4785 16S São Felix (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4786 16S São Felix (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4787 16S São Felix (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4788 16S São Felix (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4789 16S São Felix (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4791 16S São Felix (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4792 16S São Felix (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4793 16S São Felix (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4831 16S São Felix (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 5540 16S São Luís (MA) Symphurus cf. plagusia Symphurus oculellus 5541 16S São Luís (MA) Symphurus cf. plagusia Symphurus oculellus 5542 16S São Luís (MA) Symphurus cf. tesselatus - 5804 COI/16S Soure (PA) Citharichthys sp. 1 - 5817 COI/16S Soure (PA) Citharichthys sp. 1 - 5819 COI Soure (PA) Citharichthys sp. 1 - 5833 COI Soure (PA) Citharichthys sp. 1 - 5836 COI Soure (PA) Citharichthys sp. 1 - 58

Tabela I (continuação). Lista de espécimes coletados ao longo da costa do Brasil incluindo genes obtidos para cada espécime, local de coleta, identificações preliminares e confirmação pelo taxonomista.

Registro Gene Localidade Identificação em campo Confirmação taxonômica 3766 16S Valença (BA) Citharichthys arenaceus Citharichthys arenaceus 3767 COI Valença (BA) Citharichthys arenaceus Citharichthys arenaceus 3771 16S Valença (BA) Citharichthys arenaceus Citharichthys arenaceus 3809 COI/16S Valença (BA) Citharichthys macrops Citharichthys macrops 3822 COI Valença (BA) Citharichthys macrops Citharichthys macrops 4240 16S Valença (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 4241 16S Valença (BA) Citharichthys spilopterus Citharichthys spilopterus 3729 COI Valença (BA) Paralichthys cf. orbignyanus Paralichthys brasiliensis 3751 COI Valença (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 3778 COI/16S Valença (BA) Syacium micrurum Syacium micrurum 3701 COI Valença (BA) Syacium papillosum Syacium papillosum 3703 COI Valença (BA) Syacium papillosum Syacium papillosum 3815 16S Valença (BA) Symphurus cf. plagusia Symphurus oculellus 3816 16S Valença (BA) Symphurus cf. plagusia Symphurus oculellus 3817 16S Valença (BA) Symphurus cf. plagusia Symphurus oculellus 3819 16S Valença (BA) Symphurus cf. plagusia Symphurus oculellus 3821 16S Valença (BA) Symphurus cf. tesselatus - 3820 16S Valença (BA) Symphurus cf. tesselatus - 3697 16S Valença (BA) Symphurus cf. tesselatus - 3700 16S Valença (BA) Symphurus cf. tesselatus - 3810 16S Valença (BA) Symphurus cf. tesselatus - 3928 16S Valença (BA) Symphurus cf. tesselatus - 3818 COI Valença (BA) Symphurus cf. tesselatus - 3804 COI Valença (BA) Symphurus cf. tesselatus - 3811 COI/16S Valença (BA) Symphurus cf. tesselatus - 3812 COI/16S Valença (BA) Symphurus cf. tesselatus - 3813 COI Valença (BA) Symphurus cf. tesselatus - 3834 COI/16S Valença (BA) Symphurus cf. tesselatus - 3835 COI/16S Valença (BA) Symphurus cf. tesselatus - 3926 COI/16S Valença (BA) Symphurus cf. tesselatus - 3927 COI/16S Valença (BA) Symphurus cf. tesselatus - 3930 COI Valença (BA) Symphuruscf. tesselatus - 5805 COI/16S Soure (PA) Citharichthys sp. 1 - 5820 COI Soure (PA) Citharichthys sp. 1 - 5822 COI Soure (PA) Citharichthys sp. 1 - PPGGBC 59

Tabela II. Distâncias intraespecíficas para o gene mitocondrial COI calculadas com base no modelo Kimura-2-Parâmetros (K2P). Espécie Distância intraespecífica Citharichthys macrops 0,004896259 Citharichthys sp. 2 0,002279611 Citharichthys arenaceus 0,00126527 Citharichthys sp. 1 0,00181403 Citharichthys spilopterus 0,002050636 Etropus crossotus 0,000573053 Symphurus diomedianus - Symphurus oculellus - Symphurus cf. tesselatus 0,000423772 Paralichthys patagonicus 0,000812678 Paralichthys brasiliensis 0,000464576 Syacium micrurum 0,001932061 Syacium papillosum 0,002638015 Achirus lineatus 0,000650407 Trinectes paulistanus 0 Bothus ocellatus 0,001301345 Citharichthys arenaceus BOLD:AAO2157 0,004894003 Citharichthys macrops BOLD:AAJ1120 0 Citharichthys minutus BOLD:ABA8468 0 Citharichthys spilopterus BOLD:AAE2823 - Etropus crossotus BOLD:AAB8735 0,001626018 Paralichthys orbignyanus BOLD:AAC0146 0,001626018 Paralichthys patagonicus BOLD:AAE2996 0 Syacium micrurum BOLD:AAF8657 0 Syacium papillosum BOLD:AAD4398 - Syacium papillosum BOLD:AAD4399 - Syacium papillosum BOLD:AAD4397 - Symphurus ginsburgi BOLD:ABA2756 - Symphurus tesselatus BOLD:AAZ3850 - Achirus lineatus BOLD:AAB7245 0,001626018 Achirus lineatus BOLD:ABZ6110 0 Achirus lineatus BOLD:ABY6026 0,004894003 Bothus ocellatus BOLD:ACE2851 0,008172095 Bothus ocellatus PPGGBCBOLD:AAC1841 0,001625357 Syacium papillosum BOLD:AAD5377 - *(-) Dados não computados pela presença de um único espécime nas amostras.

60

Tabela III. Distâncias intraespecíficas para o gene mitocondrial DNAr 16S calculadas com base no modelo Kimura-2-Parâmetros (K2P). Espécie Distância intraespecífica Citharichthys spilopterus 0,000924542 Citharichthys minutus 0,000863932 Citharichthys sp. 0,001689137 Citharichthys macrops 0 Citharichthys arenaceus 0,000269979 Etropus crossotus 0,000392737 Paralichthys patagonicus 0,001295898 Paralichthys brasiliensis 0,000719944 Syacium papillosum 0,001194031 Syacium micrurum 0,000536403 Symphurus diomedianus - Symphurus oculellus 0,005441091 Symphurus tesselatus 0,000785717 Achirus lineatus 0,011780477 Trinectes paulistanus 0 Bothus ocellatus 0,00520618 Citharichthys macrops AY359656.1 - Etropus crossotus AY359654.1/AY998026.1 0 Paralichthys patagonicus AY359657.1/AY998028.1 0 Syacium micrurum JQ939072.1 - Syacium papillosum AY359655.1/AY998027.1 0 Symphurus plagusia AF488447.1 - Symphurus plagusia AY998029.1 - Symphurus tesselatus AY359668.1/AY998024.1 0 Bothus ocellatus AY359652.1/AY998025.1 0 Achirus lineatus AY359671.1/JQ939049.1 0,004329031 Trinectes paulistanus AY359672.1/AY998030.1 0 PPGGBC 61

Tabela IV. Matriz de distâncias interespecíficas (abaixo da diagonal) e desvio-padrão (acima da diagonal em azul) para fragmentos do gene mitocondrial COI com base no modelo evolutivo Kimura-2-Parâmetros (K2P).

Citharichthys macrops 0,021 0,020 0,022 0,019 0,018 0,025 0,025 0,026 0,022 0,024 0,024 0,023 0,023 0,023 0,021 0,020 0,002 0,021 0,019 0,018 0,023 0,022 0,024 0,026 0,023 0,023 0,025 0,028 0,024 0,023 0,025 0,021 0,021 0,023 Citharichthys sp.2 0,219 0,021 0,023 0,022 0,020 0,027 0,025 0,027 0,023 0,023 0,023 0,024 0,024 0,025 0,023 0,022 0,021 0,008 0,022 0,021 0,023 0,023 0,023 0,026 0,024 0,026 0,025 0,028 0,024 0,024 0,024 0,023 0,023 0,024 Citharichthys arenaceus 0,190 0,225 0,019 0,019 0,020 0,025 0,026 0,026 0,022 0,024 0,024 0,023 0,023 0,023 0,023 0,004 0,020 0,021 0,019 0,021 0,026 0,022 0,024 0,026 0,023 0,023 0,026 0,028 0,023 0,023 0,023 0,023 0,023 0,024 Citharichthys sp.1 0,223 0,251 0,191 0,021 0,022 0,028 0,027 0,025 0,025 0,026 0,024 0,024 0,025 0,023 0,023 0,018 0,022 0,023 0,021 0,022 0,026 0,025 0,024 0,028 0,024 0,025 0,027 0,028 0,027 0,025 0,027 0,022 0,023 0,023 Citharichthys spilopterus 0,189 0,238 0,195 0,205 0,022 0,028 0,026 0,025 0,023 0,024 0,025 0,024 0,024 0,023 0,024 0,020 0,019 0,021 0,002 0,022 0,025 0,023 0,023 0,025 0,024 0,023 0,026 0,027 0,024 0,024 0,025 0,024 0,024 0,025 Etropus crossotus 0,165 0,199 0,204 0,217 0,224 0,028 0,028 0,027 0,024 0,024 0,023 0,023 0,023 0,024 0,022 0,020 0,018 0,019 0,022 0,002 0,024 0,024 0,022 0,025 0,023 0,025 0,028 0,028 0,023 0,023 0,025 0,022 0,022 0,022 Symphurus diomedianus 0,303 0,334 0,300 0,324 0,323 0,345 0,025 0,024 0,025 0,030 0,026 0,026 0,026 0,026 0,024 0,025 0,025 0,027 0,028 0,028 0,028 0,025 0,028 0,028 0,026 0,027 0,025 0,025 0,027 0,026 0,026 0,025 0,024 0,026 Symphurus oculellus 0,293 0,297 0,293 0,295 0,301 0,330 0,265 0,016 0,027 0,026 0,026 0,026 0,025 0,026 0,024 0,026 0,025 0,025 0,026 0,027 0,025 0,027 0,028 0,028 0,026 0,028 0,000 0,026 0,026 0,025 0,025 0,024 0,024 0,026 Symphurus cf. tesselatus 0,300 0,320 0,310 0,290 0,280 0,329 0,255 0,143 0,026 0,026 0,025 0,025 0,026 0,025 0,024 0,025 0,026 0,027 0,024 0,027 0,027 0,026 0,026 0,028 0,025 0,028 0,016 0,024 0,026 0,026 0,027 0,025 0,025 0,024 Paralichthys patagonicus 0,233 0,238 0,237 0,278 0,256 0,253 0,303 0,310 0,289 0,018 0,022 0,020 0,023 0,021 0,024 0,022 0,022 0,024 0,023 0,024 0,015 0,000 0,024 0,022 0,020 0,024 0,027 0,028 0,023 0,023 0,023 0,025 0,024 0,022 Paralichthys brasiliensis 0,255 0,239 0,261 0,297 0,267 0,261 0,354 0,286 0,293 0,158 0,023 0,021 0,023 0,023 0,025 0,025 0,024 0,023 0,024 0,024 0,014 0,018 0,023 0,023 0,021 0,023 0,026 0,028 0,023 0,023 0,024 0,025 0,025 0,022 Syacium micrurum 0,275 0,258 0,277 0,268 0,270 0,268 0,325 0,305 0,288 0,245 0,258 0,017 0,025 0,025 0,024 0,023 0,024 0,023 0,024 0,023 0,024 0,022 0,011 0,022 0,017 0,024 0,026 0,029 0,025 0,025 0,026 0,025 0,024 0,016 Syacium papillosum 0,256 0,252 0,270 0,273 0,263 0,259 0,312 0,294 0,290 0,220 0,231 0,159 0,023 0,023 0,024 0,023 0,023 0,024 0,024 0,023 0,022 0,020 0,020 0,022 0,002 0,022 0,026 0,029 0,023 0,023 0,024 0,025 0,025 0,011 Achirus lineatus 0,259 0,264 0,249 0,291 0,270 0,248 0,307 0,311 0,313 0,244 0,255 0,292 0,251 0,018 0,023 0,023 0,023 0,024 0,024 0,023 0,024 0,023 0,024 0,026 0,023 0,029 0,025 0,026 0,006 0,000 0,006 0,023 0,024 0,024 Trinectes paulistanus 0,255 0,277 0,241 0,251 0,252 0,273 0,304 0,307 0,284 0,224 0,264 0,282 0,254 0,173 0,023 0,022 0,023 0,024 0,022 0,024 0,023 0,021 0,025 0,024 0,023 0,026 0,026 0,024 0,019 0,018 0,018 0,023 0,023 0,022 Bothus ocellatus 0,223 0,260 0,230 0,243 0,262 0,234 0,278 0,280 0,297 0,271 0,279 0,281 0,283 0,254 0,264 0,022 0,021 0,022 0,024 0,021 0,024 0,024 0,024 0,026 0,024 0,027 0,024 0,027 0,023 0,023 0,024 0,005 0,004 0,024 C. arenaceus BOLD:AAO2157 0,195 0,228 0,013 0,179 0,195 0,202 0,297 0,290 0,306 0,236 0,264 0,275 0,268 0,244 0,235 0,220 0,020 0,021 0,019 0,020 0,025 0,022 0,024 0,026 0,024 0,023 0,026 0,028 0,023 0,023 0,023 0,022 0,022 0,024 C. macrops BOLD:AAJ1120 0,003 0,220 0,190 0,224 0,189 0,168 0,297 0,293 0,298 0,231 0,255 0,274 0,258 0,259 0,256 0,225 0,195 0,021 0,019 0,018 0,023 0,022 0,024 0,026 0,023 0,024 0,025 0,028 0,024 0,023 0,025 0,021 0,021 0,023 C. minutus BOLD:ABA8468 0,208 0,040 0,210 0,244 0,214 0,188 0,323 0,286 0,315 0,251 0,243 0,255 0,252 0,260 0,272 0,245 0,212 0,209 0,021 0,020 0,024 0,024 0,022 0,025 0,024 0,025 0,025 0,030 0,024 0,024 0,024 0,022 0,021 0,025 C. spilopterus BOLD:AAE2823 0,191 0,238 0,193 0,205 0,008 0,225 0,320 0,300 0,276 0,252 0,271 0,266 0,264 0,271 0,251 0,259 0,190 0,191 0,216 0,022 0,024 0,023 0,023 0,024 0,024 0,022 0,026 0,027 0,024 0,024 0,025 0,024 0,024 0,024 E. crossotus BOLD:AAB8735 0,166 0,202 0,207 0,216 0,227 0,002 0,347 0,329 0,328 0,252 0,259 0,267 0,258 0,249 0,272 0,233 0,202 0,169 0,191 0,227 0,024 0,024 0,022 0,025 0,023 0,025 0,027 0,028 0,023 0,023 0,025 0,022 0,022 0,023 P. orbignyanus BOLD:AAC0146 0,237 0,242 0,269 0,285 0,266 0,247 0,321 0,299 0,305 0,125 0,100 0,260 0,233 0,244 0,243 0,259 0,262 0,237 0,256 0,264 0,246 0,015 0,024 0,022 0,021 0,022 0,025 0,029 0,024 0,024 0,025 0,025 0,025 0,023 P. patagonicus BOLD:AAE2996 0,233 0,238 0,237 0,277 0,256 0,253 0,302 0,310 0,289 0,000 0,158 0,244 0,220 0,243 0,224 0,271 0,236 0,230 0,250 0,251 0,252 0,125 0,024 0,022 0,020 0,024 0,027 0,028 0,023 0,023 0,023 0,025 0,024 0,022 S. micrurum BOLD:AAF8657 0,265 0,261 0,282 0,257 0,245 0,248 0,346 0,314 0,299 0,276 0,261 0,072 0,180 0,274 0,270 0,278 0,275 0,264 0,246 0,241 0,249 0,267 0,275 0,025 0,020 0,025 0,028 0,029 0,024 0,024 0,026 0,024 0,024 0,019 S. papillosum BOLD:AAD4398 0,274 0,276 0,277 0,306 0,277 0,265 0,328 0,333 0,332 0,225 0,241 0,238 0,232 0,292 0,260 0,301 0,277 0,276 0,274 0,273 0,266 0,229 0,224 0,255 0,023 0,017 0,028 0,033 0,025 0,026 0,024 0,027 0,027 0,022 S. papillosum BOLD:AAD4399 0,253 0,252 0,270 0,272 0,260 0,260 0,312 0,293 0,286 0,218 0,228 0,156 0,003 0,253 0,253 0,283 0,268 0,255 0,249 0,261 0,259 0,229 0,218 0,177 0,233 0,022 0,026 0,029 0,023 0,023 0,024 0,025 0,025 0,011 S. papillosum BOLD:AAD4397 0,245 0,274 0,248 0,264 0,238 0,253 0,315 0,314 0,328 0,247 0,235 0,260 0,211 0,332 0,291 0,302 0,239 0,246 0,273 0,238 0,254 0,236 0,248 0,261 0,144 0,208 0,028 0,030 0,028 0,029 0,028 0,028 0,027 0,023 S. ginsburgi BOLD:ABA2756 0,293 0,297 0,293 0,295 0,301 0,330 0,265 0,000 0,143 0,310 0,286 0,305 0,294 0,311 0,307 0,280 0,290 0,293 0,286 0,300 0,329 0,299 0,310 0,314 0,333 0,293 0,314 0,026 0,026 0,025 0,025 0,024 0,024 0,026 S. tesselatus BOLD:AAZ3850 0,334 0,325 0,314 0,329 0,308 0,333 0,265 0,268 0,257 0,312 0,318 0,353 0,349 0,318 0,292 0,323 0,316 0,333 0,351 0,310 0,332 0,321 0,312 0,358 0,393 0,348 0,356 0,268 0,026 0,026 0,026 0,027 0,028 0,029 A. lineatus BOLD:AAB7245 0,265 0,256 0,245 0,304 0,271 0,252 0,319 0,309 0,316 0,244 0,252 0,289 0,243 0,019 0,175 0,257 0,241 0,265 0,254 0,271 0,253 0,249 0,243 0,274 0,280 0,244 0,314 0,309 0,314 0,006 0,006 0,023 0,024 0,024 A. lineatus BOLD:ABZ6110 0,259 0,264 0,249 0,291 0,270 0,248 0,307 0,311 0,313 0,244 0,255 0,292 0,251 0,000 0,173 0,253 0,244 0,259 0,260 0,271 0,249 0,244 0,243 0,274 0,292 0,253 0,332 0,311 0,318 0,019 0,006 0,023 0,024 0,024 A. lineatus BOLD:ABY6026 0,274 0,269 0,255 0,305 0,290 0,270 0,308 0,305 0,322 0,249 0,263 0,305 0,256 0,026 0,173 0,262 0,250 0,274 0,265 0,289 0,271 0,259 0,249 0,292 0,278 0,257 0,322 0,305 0,314 0,023 0,026 0,023 0,024 0,025 B. ocellatus BOLD:ACE2851 0,217 0,259 0,228 0,239 0,266 0,237 0,285 0,275 0,300 0,274 0,280 0,282 0,286 0,251 0,260 0,020 0,218 0,219 0,250 0,265 0,235 0,264 0,273 0,272 0,303 0,285 0,307 0,275 0,321 0,254 0,250 0,259 0,006 0,024 B. ocellatus BOLD:AAC1841 0,220 0,253 0,233 0,243 0,265 0,239 0,279 0,276 0,296 0,268 0,278 0,279 0,283 0,260 0,268 0,013 0,223 0,222 0,238 0,262 0,238 0,264 0,268 0,277 0,298 0,283 0,299 0,276 0,323 0,264 0,260 0,264 0,023 0,025 S. papillosum BOLD:AAD5377 0,253 0,256 0,269 0,262 0,274 0,250 0,318 0,286 0,285 0,241 0,251 0,145 0,074 0,249 0,244 0,273 0,267 0,255 0,268 0,272 0,251 0,249 0,240 0,169 0,222 0,074 0,236 0,286 0,342 0,250 0,249 0,264 0,272 0,275

PPGGBC 62

Tabela V. Matriz de distâncias interespecíficas (abaixo da diagonal) e desvio-padrão (acima da diagonal em azul) para fragmentos do DNAr 16S com base no modelo evolutivo Kimura-2-Parâmetros (K2P).

Citharichthys spilopterus 0,013 0,012 0,012 0,011 0,012 0,020 0,020 0,019 0,019 0,023 0,025 0,024 0,022 0,021 0,023 0,012 0,012 0,020 0,019 0,019 0,023 0,025 0,024 0,022 0,022 0,021 Citharichthys sp.2 0,076 0,012 0,010 0,010 0,009 0,019 0,018 0,019 0,018 0,020 0,025 0,022 0,020 0,019 0,022 0,010 0,009 0,019 0,019 0,019 0,023 0,025 0,023 0,021 0,020 0,019 Citharichthys sp.1 0,064 0,067 0,013 0,013 0,013 0,020 0,020 0,020 0,018 0,022 0,022 0,022 0,021 0,019 0,022 0,013 0,013 0,020 0,018 0,020 0,022 0,023 0,022 0,022 0,021 0,019 Citharichthys macrops 0,063 0,054 0,069 0,011 0,009 0,019 0,018 0,018 0,018 0,023 0,024 0,023 0,021 0,019 0,022 0,000 0,009 0,019 0,018 0,018 0,023 0,024 0,023 0,021 0,021 0,019 Citharichthys arenaceus 0,059 0,050 0,072 0,059 0,011 0,019 0,019 0,019 0,019 0,023 0,024 0,023 0,021 0,021 0,022 0,011 0,011 0,019 0,019 0,020 0,023 0,025 0,023 0,022 0,021 0,021 Etropus crossotus 0,066 0,047 0,072 0,043 0,059 0,019 0,018 0,019 0,017 0,021 0,025 0,023 0,021 0,020 0,022 0,009 0,000 0,019 0,018 0,019 0,023 0,025 0,023 0,021 0,021 0,020 Paralichthys patagonicus 0,157 0,148 0,154 0,147 0,146 0,152 0,008 0,021 0,021 0,022 0,022 0,021 0,021 0,020 0,023 0,019 0,019 0,001 0,020 0,021 0,021 0,023 0,021 0,024 0,021 0,020 Paralichthys brasiliensis 0,154 0,143 0,151 0,135 0,146 0,138 0,033 0,020 0,020 0,023 0,023 0,021 0,021 0,020 0,023 0,018 0,018 0,009 0,020 0,020 0,021 0,023 0,021 0,023 0,021 0,020 Syacium papillosum 0,155 0,155 0,165 0,142 0,154 0,145 0,173 0,161 0,011 0,026 0,026 0,026 0,021 0,020 0,022 0,018 0,019 0,021 0,012 0,002 0,026 0,026 0,026 0,022 0,021 0,020 Syacium micrurum 0,143 0,141 0,146 0,135 0,143 0,125 0,173 0,164 0,055 0,025 0,026 0,026 0,021 0,020 0,021 0,018 0,017 0,021 0,008 0,011 0,026 0,027 0,026 0,021 0,021 0,020 Symphurus diomedianus 0,219 0,177 0,200 0,210 0,205 0,199 0,205 0,216 0,257 0,240 0,020 0,018 0,023 0,024 0,029 0,023 0,021 0,022 0,025 0,027 0,019 0,020 0,019 0,028 0,023 0,024 Symphurus oculellus 0,237 0,227 0,206 0,225 0,224 0,228 0,208 0,214 0,252 0,260 0,168 0,014 0,025 0,026 0,029 0,024 0,025 0,022 0,026 0,026 0,013 0,001 0,014 0,028 0,025 0,026 Symphurus cf. tesselatus 0,223 0,206 0,204 0,214 0,206 0,211 0,183 0,188 0,255 0,256 0,146 0,085 0,024 0,025 0,027 0,023 0,023 0,021 0,026 0,026 0,009 0,014 0,002 0,026 0,024 0,025 Achirus lineatus 0,203 0,180 0,185 0,188 0,174 0,182 0,183 0,184 0,192 0,202 0,222 0,238 0,223 0,013 0,023 0,021 0,021 0,021 0,022 0,021 0,024 0,025 0,024 0,023 0,002 0,013 Ttrinectes paulistanus 0,182 0,154 0,154 0,154 0,176 0,162 0,168 0,159 0,168 0,174 0,234 0,246 0,244 0,088 0,024 0,019 0,020 0,020 0,020 0,020 0,026 0,027 0,026 0,024 0,014 0,000 Bothus ocellatus 0,195 0,180 0,195 0,182 0,194 0,180 0,203 0,192 0,187 0,181 0,288 0,298 0,265 0,218 0,206 0,022 0,022 0,023 0,020 0,022 0,029 0,029 0,027 0,002 0,023 0,024 C. macrops AY359656.1 0,063 0,054 0,069 0,000 0,059 0,043 0,147 0,135 0,142 0,135 0,210 0,225 0,214 0,188 0,154 0,182 0,009 0,019 0,018 0,018 0,023 0,024 0,023 0,021 0,021 0,019 E. crossotus AY359654.1/AY998026.1 0,066 0,047 0,072 0,042 0,059 0,000 0,152 0,138 0,145 0,125 0,199 0,228 0,211 0,182 0,162 0,179 0,042 0,019 0,018 0,019 0,023 0,025 0,023 0,021 0,021 0,020 P. patagonicus AY359657.1/AY998028.1 0,156 0,148 0,154 0,146 0,146 0,151 0,001 0,034 0,174 0,172 0,205 0,208 0,183 0,183 0,170 0,201 0,146 0,151 0,020 0,021 0,021 0,023 0,021 0,023 0,021 0,020 S. micrurum JQ939072.1 0,146 0,157 0,144 0,136 0,149 0,130 0,168 0,156 0,062 0,029 0,243 0,258 0,259 0,196 0,167 0,178 0,136 0,130 0,167 0,012 0,025 0,026 0,026 0,020 0,021 0,020 S. papillosum AY359655.1/AY998027.1 0,157 0,157 0,166 0,144 0,157 0,147 0,177 0,158 0,003 0,057 0,259 0,254 0,259 0,194 0,170 0,189 0,144 0,146 0,178 0,064 0,026 0,026 0,026 0,022 0,021 0,020 S. plagusia AF488447.1 0,217 0,217 0,202 0,216 0,202 0,213 0,182 0,185 0,249 0,253 0,150 0,077 0,036 0,231 0,244 0,294 0,216 0,213 0,182 0,249 0,253 0,013 0,009 0,029 0,025 0,026 S, plagusia AY998029.1 0,241 0,230 0,209 0,228 0,226 0,232 0,210 0,216 0,255 0,264 0,170 0,003 0,085 0,241 0,250 0,301 0,228 0,232 0,210 0,260 0,257 0,078 0,014 0,029 0,025 0,027 S. tesselatus AY359668.1/AY998024.1 0,225 0,208 0,206 0,216 0,208 0,213 0,185 0,191 0,258 0,259 0,148 0,087 0,002 0,225 0,246 0,268 0,216 0,213 0,185 0,261 0,262 0,038 0,087 0,027 0,024 0,026 B. ocellatus AY359652.1/AY998025.1 0,191 0,176 0,191 0,178 0,190 0,176 0,203 0,190 0,183 0,178 0,286 0,294 0,263 0,215 0,202 0,004 0,178 0,175 0,201 0,176 0,185 0,291 0,297 0,266 0,023 0,024 A. lineatus AY359671.1/JQ939049.1 0,198 0,176 0,182 0,183 0,170 0,178 0,177 0,180 0,187 0,197 0,219 0,233 0,218 0,008 0,085 0,214 0,183 0,178 0,177 0,191 0,189 0,227 0,236 0,221 0,211 0,014 T. paulistanus AY359672.1/AY998030.1 0,182 0,154 0,154 0,154 0,176 0,162 0,168 0,159 0,168 0,174 0,234 0,246 0,244 0,088 0,000 0,206 0,154 0,162 0,170 0,167 0,170 0,244 0,250 0,246 0,202 0,085

PPGGBC 63

PPGGBC

Figura 1. Pontos de coleta ao longo da costa Brasileira (Verde). (A) Macapá – AP, (B) Soure – PA, (C) Bragança – PA, (D) São Luís – MA, (E) Baía de Traição – PB, (F) João Pessoa – PB, (G) São Félix – BA, (H) Salvador – BA, (I) Valença – BA, (J) Camamu – BA, (K) Itacaré – BA, (L) Ilhéus – BA, (M) Mucuri – BA, (N) Coqueiral – ES, (O) Niterói – RJ. 64

PPGGBC Figura 2. Espécies coletadas e analisadas neste trabalho. a) Achirus lineatus; b) Trinectes paulistanus (Achiridae); c) Bothus ocellatus (Bothidae); d) Citharichthys spilopterus; e) Citharichthys arenaceus; f) Citharichthys macrops; g) Etropus crossotus; h) Paralichthys brasiliensis; i) Paralichthys patagonicus (imagem obtida no FishBase); j) Syacium micrurum; k) Syacium papillosum (Paralichthyidae); l) Symphurus oculellus; m) Symphurus diomedianus; n) Symphurus cf. tesselatus (Cynoglossidae); o) Citharichthys sp. 1 e p) Citharichthys sp. 2. 65

PPGGBC

Figura 3. Árvore de Neighbor-Joining baseada no método de substituição nucleotídica Kimura-2-parâmetros (K2P) para espécies de Pleuronectiformes. Árvore para as sequências do gene mitocondrial de COI. Os valores de bootstrap são mostrados acima de cada ramo e os nomes seguidos de números de acesso foram obtidos do GenBank.

66

PPGGBC

Figura 3. Árvore de Neighbor-Joining baseada no método de substituição nucleotídica Kimura-2-parâmetros (K2P) para espécies de Pleuronectiformes (continuação). Árvore para as sequências do gene mitocondrial de COI. Os valores de bootstrap são mostrados acima de cada ramo e os nomes seguidos de números de acesso foram obtidos do GenBank. 67

PPGGBC

Figura 4. Árvore de Neighbor-Joining baseada no método de substituição nucleotídica Kimura-2-parâmetros (K2P) para espécies de Pleuronectiformes. Árvore para as sequências do gene mitocondrial de DNAr 16S. Os valores de bootstrap são mostrados acima de cada ramo e os nomes seguidos de números de acesso foram obtidos do GenBank. 68

Figura 5. Rede haplotípica do gene COI entre espécies de Pleuronectiformes. A rede de haplótipos demonstra as relações entre os haplótipos das espécies de Pleuronectiformes amostrados e do BOLD de cada localidade. Cada cor representa uma localidade e o tamanho dos círculos é proporcional ao número de indivíduos (detalhado dentro de cada círculo) que compartilham cada haplótipo. Os números nos ramos indicam o número de mutações entre os haplótipos. PPGGBC 69

5. CAPÍTULO 2: Divergência genética em espécies simpátricas de Bothus (Pleuronectiformes: Bothidae) do Atlântico Sul sugere dispersão em larga escala e estreita relação evolutiva com espécie do Indo-Pacífico

Título resumido: Divergência genética entre espécies simpátricas de Bothus

Artigo a ser submetido à revista PLOS ONE

Leandro A. Argôlo1, Robson T. C. Ramos2, Silvia B. Barreto1, Jamille A. Bitencourt3, Iracilda Sampaio3, Paulo R. A. M. Affonso1* 1Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, Jequié, BA, Brasil 2Departamento de Sistemática e Ecologia, Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, PB, Brasil 3Instituto de Estudos Costeiros, Universidade Federal do Pará, Bragança, PA, Brasil *Autor para correspondência E-mail: [email protected]

Resumo Objetivo: Em peixes da ordem Pleuronectiformes, problemas de identificação taxonômica são frequentes devido à sobreposição de caracteres e falta de uniformidade na literatura, de modo que estudos complementares de taxonomia integrativa são necessários. Assim, nós analisamos e comparamos espécies do gênero Bothus da costa oeste do Oceano Atlântico com outras espécies amplamente distribuídas do gênero, culminando em intrigantes padrões de diversidade e eventos biogeográficosPPGGBC no Atlântico Sul. Métodos: Nós analisamos espécimes de Bothus ocellatus e Bothus sp. por meio da comparação morfológica, análises citogenéticas e moleculares com os genes mitocondriais Citocromo C Oxidase subunidade I e de RNAr 16S. Os valores de distância genética, diversidade haplotípica e nucleotídica foram calculados e as informações das sequências de DNAmt foram usadas para construção de árvores de Neighbor-Joining, Máxima Verossimilhança e Inferência Bayesiana. Resultados: As análises morfológicas indicaram a presença de indivíduos (Bothus sp.) mais semelhantes à Bothus pantherinus (Indo-Pacífico) que das demais espécies simpátricas desse gênero no Atlântico Sul. Os dados citogenéticos em B. ocellatus foram coincidentes com os 70

previamente publicados (2n=32), diferindo marcadamente de Bothus sp. (2n=44). As análises moleculares mostraram uma grande diversidade genética em Bothus ocellatus e confirmaram a acentuada divergência de Bothus sp. em relação a outros representantes de Bothus do Atlântico Sul, colocando-a evolutivamente mais próxima da espécie do Indo-Pacífico. Principais conclusões: Os dados morfológicos e moleculares apontam uma clara diferenciação entre Bothus sp. e as demais espécies do Atlântico Sul. Contudo, dados genéticos indicam ainda, uma estreita relação entre Bothus pantherinus e Bothus sp. Assim, Bothus sp. parece representar uma unidade evolutiva distinta que ainda carece de status taxonômico formal. A hipótese mais provável da origem de Bothus sp. envolve especiação em anel com dispersão transoceânica de um ancestral similar à B. pantherinus pelas correntes do oeste do Oceano Índico e correntes subequatoriais do Atlântico Sul.

Introdução

Embora os recifes e ecossistemas costeiros ocupem uma área equivalente a cerca de 8% da Terra, cerca de um terço do total estimado das espécies de peixes marinhos está concentrado nestes ambientes [1,2]. Baseados em modelos de centros de origem, acumulação e sobreposição de espécies, alguns autores sugerem um modelo de feedback de biodiversidade entre hotspots e áreas periféricas para explicar os processos de especiação marinha atuantes em regiões de grande acúmulo de biodiversidade [3,4]. Em um cenário regido pelo feedback de biodiversidade, dispersões por longas distâncias são essenciais para sustentar o modelo. De fato, apesar do comportamento usualmente sedentário e bentônico das formas adultas, os estágios iniciais de desenvolvimento com ovos e/ou larvas planctônicas da maioria das espécies demersais oferecem um grande potencial dispersivo [5]. Adicionalmente, ao contrário do ambiente terrestre, existem poucas barreiras evidentes nos maresPPGGBC tropicais [6,7]. Portanto, direta ou indiretamente, estudos que incluam espécies de habitats periféricos e/ou hotspots podem reforçar ainda mais o modelo de feedback e gerar hipóteses que contribuam para conhecimentos biogeográficos, taxonômicos e evolutivos. Considerando a diversidade de espécies no ambiente marinho e a similaridade morfológica entre muitas espécies congenéricas, como no caso dos Pleuronectiformes [8], estudos que forneçam uma identificação confiável são essenciais para pesquisas em biodiversidade e auxiliam no reconhecimento de novas espécies [9]. Embora a morfologia seja 71

a base da taxonomia, a acurácia na delimitação de táxons é fortalecida a partir de diferentes fontes de dados (abordagem denominada de taxonomia integrativa) [10]. Nessa perspectiva, a técnica do DNA barcoding foi desenvolvida para auxiliar na identificação de espécies de forma rápida, precisa e automatizada a partir de pequenas regiões gênicas (usualmente, a subunidade I do gene Citocromo C Oxidase – COI) [11]. O uso desta técnica tem permitido uma série de descobertas e discussões taxonômicas importantes, tanto em pequena quanto em larga escala e em diferentes grupos de organismos [e.g 12-16]. Os Pleuronectiformes, popularmente conhecidos como linguados ou solhas, são peixes demersais e de ampla distribuição geográfica, ocorrendo desde as regiões subantárticas até os trópicos [17]. No Brasil, são encontrados ao longo de toda a costa, particularmente em ambientes estuarinos e sobre fundos arenosos [18], assim como em recifes de corais. Em relação especificamente ao gênero Bothus (família Bothidae) são atualmente reconhecidas quatro espécies para a costa Brasileira: B. robinsi, B. ocellatus, B. lunatus e B. maculiferus [8]. Apesar dos hábitos bentônicos e limitada capacidade natatória dos indivíduos adultos de Pleuronectiformes, várias famílias como Bothidae, Pleuronectidae e Cynoglossidae incluem gêneros que estão presentes em escala pantropical ou circumtropical. Essa ampla distribuição se deve essencialmente à dispersão por meio de larvas planctônicas, incluindo algumas com hábito pelágico [8], seguindo o modelo proposto para o feedback de biodiversidade do ambiente marinho tropical. Embora características larvais sejam pouco estudadas em grande parte desta ordem, o gênero Bothus, constituído majoritariamente por espécies associadas a recifes [19], possui uma considerável quantidade de características larvais descritas em diversas espécies [20-28]. Deve-se ressaltar ainda que alta capacidade dispersiva não necessariamente significa ampla distribuição. Por exemplo, Bothus ocellatus Agassiz, 1831 e Bothus podas Delaroche, 1809, que realizamPPGGBC deriva larval em escalas transcontinentais [29], possuem área de ocorrência mais restrita que outras espécies distribuídas em escala próxima à circumglobal, tais como B. pantherinus Rüppell, 1830, B. myriaster Temminck & Schlegel, 1846 e B. mancus Broussonet, 1782 [8]. Aparentemente, o grande tamanho das larvas atua sinergicamente com a duração do período pelágico em várias espécies de Bothidae na dispersão por grandes áreas geográficas [30]. Considerando a taxonomia inconclusiva e a escassez de estudos integrados para a caracterização da riqueza de espécies de Bothus no Atlântico Sul, nós analisamos espécimes do gênero Bothus da costa oeste do Oceano Atlântico por meio de ferramentas moleculares, 72

citogenéticas e morfológicas. A partir desse conjunto de dados foi possível identificar formas crípticas e simpátricas com alta divergência genética que indicam padrões de dispersão em larga escala e diferentes rotas de colonização e especiação no Atlântico Sul.

Material e Métodos

Amostragem e identificação Espécimes de Bothus foram coletados na costa oeste do Atlântico Sul nos Estados do Rio de Janeiro e da Bahia, nas regiões sudeste e nordeste do Brasil, respectivamente (Fig. 1). Foram identificados inicialmente dois grupos morfológicos para esse gênero, os quais foram enviados e depositados na coleção ictiológica da Universidade Federal da Paraíba para uma investigação taxonômica. Os dados morfológicos foram analisados e comparados com a descrição na literatura para representantes de Bothus encontrados na costa do Atlântico Ocidental (B. ocellatus, B. lunatus, B. robinsi e B. maculiferus), além da espécie geneticamente mais próxima de um dos morfotipos com base nos dados moleculares – B. pantherinus [18,31,32,33]. Alguns indivíduos de ambas as espécies foram mantidos vivos em aquários aerados para realização de estudos cromossômicos. Após a eutanásia, fragmentos de fígado ou tecido muscular foram obtidos de todos os espécimes e conservados em etanol absoluto para as análises moleculares. Para o processamento dos dados genéticos, sequências representativas de todos os BINs (Barcode Index Number) disponíveis para Bothus no Barcode of Life Data Systems (BOLD) e todas as sequências disponíveis para o gene DNAr 16S (n=12) no GenBank foram incluídas na análise. Além destes, outras espécies de linguados da família Achiridae (Achirus achirus) e Paralichthyidae (Citharichthys spilopterus e Syacium papillosum) foram coletados e utilizadosPPGGBC como grupo externo nas análises moleculares.

Análise citogenética A estimulação mitótica foi feita por meio de inoculação intramuscular de agentes imunoestimulantes [34]. Após um período de 24 a 48 horas, foi realizada a eutanásia pela imersão em água fria [35]. Os cromossomos foram obtidos a partir de células do rim anterior utilizando meio de cultura RPMI e colchicina 0,05%, segundo a técnica de air-drying [36]. As preparações cromossômicas foram analisadas quanto ao número diplóide (2n), morfologia e número fundamental (NF) com o uso do corante de Giemsa 10%. Os cromossomos 73

foram classificados como metacêntricos (m), submetacêntricos (sm) e subtelocêntricos/acrocêntricos (st/a) de acordo com a razão de braços [37]. Posteriormente, foram verificadas as regiões heterocromáticas por bandamento C [38] e sua composição de bases com coloração por fluorocromos base-específicos Cromomicina A3 (CMA3) e 4-6- diamino-2-fenilindole (DAPI) [39]. A análise das regiões organizadoras de nucléolo (RONs) foi feita por impregnação com nitrato de prata (Ag-RONs) [40], e a hibridação fluorescente in situ foi utilizada para visualização do sítio ribossomal 18S [41]. As imagens obtidas em microscópio de epifluorescência Olympus BX-51 utilizando o software Image Pro-Plus v. 6.2. (Media Cybernetics) foram processadas para a montagem dos cariótipos e as figuras foram preparadas com o auxílio do programa Adobe Photoshop CC v.14.0.

Extração de DNA e Sequenciamento O DNA total foi extraído utilizando o kit de extração Wizard (Promega), segundo instruções do fabricante. Fragmentos de cerca 680 pares de bases (pb) do COI e 600pb do 16S foram isolados com os primers Fish F1-R1 [42] e primers universais [43], respectivamente. Cada reação de PCR foi composta por um volume total de 15 μL contendo: 0,2 mM de dNTPs, tampão da Taq DNA polimerase 1x, 2 mM de MgCl2, 2 ng/μL de cada primer, 0,04 U/μL de Taq DNA polimerase (Invitrogen), 50 ng de DNA molde e 8,68 μL de água pura. Os ciclos de temperatura para o COI foram: 95ºC por 4 min; 5 ciclos de 95ºC por 40s, 50ºC por 30s e 72ºC por 1 min e 30s; 35 ciclos de 95ºC por 40s, 53ºC por 40s e 72ºC por 1 min e 30s; e extensão final a 72ºC por 10 min. A amplificação do 16S seguiu os seguintes ciclos: 95ºC por 5 min; 30 ciclos de 94ºC por 40s, 55ºC por 40s e 72ºC por 40s; e 72ºC por 7 min. Para a confirmação da amplificação, os produtos da PCR foram corados com azul de bromofenol e Gel Red® na proporçãoPPGGBC de 3:1 e analisados em gel de agarose 1%. A purificação por polietilenoglicol (PEG) foi seguida de duas lavagens com álcool 80% hidratado com solução de reidratação do kit Wizard® Genomic DNA Purification (Promega). A reação de sequenciamento foi feita pelo método de dideoxinucleotídeos terminais [44] usando o kit BigDye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems) e as amostras foram sequenciadas em um sequenciador automático ABI 3500XL (Applied Biosystems).

74

Análise das sequências Primeiramente, a qualidade das sequências foi verificada no programa BioEdit Sequence Alignment Editor v.7.1.9 [45]. Em seguida, todas as sequências foram submetidas ao BLAST (Basic Alignment Search Tool) no NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov) e à ferramenta de comparação do BOLD para confirmação do fragmento amplificado e identificação dos espécimes conforme similaridade de sequências. A sequência consenso do gene COI foi gerada utilizando o DNA Baser Sequence Assembler v4.16.0.25 [46]. Para o alinhamento, foi utilizada a ferramenta ClustalW Multiple alignment [47] no BioEdit v.7.1.9 [45]. Após a edição manual, as sequências do COI e 16S tiveram comprimento final de cerca de 650 e 570pb, respectivamente. As distâncias intraespecíficas e interespecíficas para os dois genes e as árvores de Neighbor-Joining (NJ) baseadas no método de substituição nucleotídica Kimura-2-parâmetros (K2P) [48], com 1000 réplicas de bootstrap [49], conforme preconizado pelo DNA barcoding, foram geradas com o auxílio do programa MEGA v. 6 [50]. O número de sítios variáveis e a porcentagem do conteúdo de bases foram estimados usando o mesmo programa. As árvores de NJ foram calculadas utilizando o alinhamento com as sequências dos indivíduos coletados, juntamente com as sequências obtidas no BOLD e GenBank. Entretanto, para tornar a leitura mais simples e eliminar resultados redundantes, parte das sequências das bases de dados online foi removida, de forma que no máximo 3 indivíduos de uma espécie por gene ocupando o mesmo ramo foi mantido. Desta forma, as árvores finais do COI e 16S contaram com 45 sequências. As árvores de Máxima Verossimilhança (MP) e Inferência Bayesiana (IB) foram feitas separadamente para cada gene. Com o programa MEGA v.6, os alinhamentos foram convertidos para as extensões .phy e .nex. Em seguida, para definir os melhores modelos evolutivos, o programaPPGGBC jModelTest [51,52] foi utilizado. Desta forma, o modelo utilizado na análise de sequências do COI foi o TIM1+I+G, enquanto para 16S foi o TVM+I+G. Os parâmetros de cada modelo foram inseridos no PhyML v.3.0 [53] e as análises foram feitas com 1000 réplicas de bootstrap. No programa MrBayes v.3.2 [54], o modelo mais próximo disponível (GTR+I+G) foi utilizado para o cálculo de dez milhões de cadeias de Markov Monte Carlo (MCMC), usando quatro cadeias em duas análises e burn-in de 20%. O grupo externo utilizado no 16S foi composto pelas espécies Achirus achirus, Citharichthys spilopterus e Syacium papillosum. Por fim, as árvores foram editadas com os programas FigTree v.1.4.2 e Adobe Photoshop CC v.14.0. 75

As diversidades haplotípica (h) e nucleotídica (π) foram calculadas para o gene COI dos indivíduos coletados e espécimes de B. pantherinus do BOLD usando o software DNA Sequence Polymorphism v5.10.01 [55]. A construção da rede haplotípica foi feita com o programa Haplotype Viewer. 111

Resultados

Dados morfológicos Embora a ausência de uniformidade das publicações sobre morfologia de Bothus dificulte a comparação entre caracteres anatômicos, a análise morfológica sugere que as amostras estudadas correspondem a dois grupos. No primeiro grupo, todos os caracteres morfológicos analisados confirmaram a identificação de Bothus ocellatus. Entretanto, os espécimes do segundo grupo apresentaram características intermediárias ou sobrepostas às espécies do Atlântico Sul. É possível afirmar que os espécimes de Bothus sp. examinados não correspondem a B. ocellatus, dado que eles possuem altura corporal inferior a 60% do comprimento padrão e entre 88 e 98 escamas na linha lateral. Em B. ocellatus, a altura é superior a 60% do comprimento padrão e o número de escamas da linha lateral varia entre 70 e 80. Do mesmo modo, essas amostras não se encaixam na descrição de B. robinsi pelo fato de que essa espécie possui duas manchas orientadas longitudinalmente na nadadeira caudal, uma próxima à base da nadadeira, outra próxima ao extremo distal dos raios medianos. Em contraste, Bothus sp. possui duas manchas principais orientadas verticalmente (dorsoventralmente), posicionadas próximo à base da nadadeira caudal, um caráter típico de B. lunatus e compartilhado por B. ocellatus. Da mesma forma, não se trata de B. maculiferus porque essa espécie possui espinhos na margem anterior dos olhos,PPGGBC um caráter ausente nos espécimes examinados nesse estudo. Adicionalmente, Bothus sp. apresenta o perfil dorsal da cabeça convexo e sem uma concavidade breve acima do focinho e à frente do olho não migratório (olho inferior). Ao contrário, a espécie B. lunatus possui o perfil dorsal entre retilíneo e levemente côncavo, com a breve concavidade acima do focinho e à frente dos olhos. Ainda, B. lunatus possui tentáculos orbitais pouco desenvolvidos, enquanto B. maculiferus os possui longos – os espécimes estudados de Bothus sp. possuem tentáculos orbitais variáveis (entre 0,5 e 1,5 vezes o diâmetro ocular). O número de raios das nadadeiras dorsal e anal não é informativo, coincidindo com as quatro espécies do gênero ocorrentes na região. Quanto à coloração, as manchas ocelares 76

registradas nos espécimes vivos são amarelas e envolvidas por uma margem preta, um padrão não referido para outras espécies do Atlântico Ocidental. Assim, pode-se afirmar que os espécimes examinados nesse estudo, embora com morfologia mais próxima daquela de B. lunatus, podem tratar-se de uma nova espécie.

Dados citogenéticos Bothus ocellatus apresentou um número diplóide de 2n=32 e fórmula cariotípica 14m+4sm+14st/a (NF=50) (Fig. 2a). Em contrapartida, o número diplóide de Bothus sp. foi de 2n=44 e o cariótipo composto por 8m+2sm+34st/a (NF=56) (Fig. 2b). Uma constrição secundária no par 7 com heteromorfismo de tamanho entre os homólogos foi usualmente identificado em Bothus sp. (Fig. 2b, em destaque). Após a impregnação por nitrato de prata (Ag-RONs) e FISH com sondas ribossomais + 18S, os sítios de DNAr foram visualizados em regiões GC-ricas (CMA3 ) nos braços curtos do par 8 (sm) em B. ocellatus (Fig. 2a, em destaque) e no par 7 (st/a) de Bothus sp., coincidentes com a constrição secundária (Fig. 2b, em destaque). A análise da heterocromatina por bandamento C revelou blocos pericentroméricos na maior parte dos cromossomos tanto em B. ocellatus quanto em Bothus sp. Segmentos de banda C terminais ainda foram visualizados no braço curto do par portador de RONs em ambas as espécies e em alguns pares st/a em B. ocellatus (Fig. 2c, d).

Dados moleculares Por meio da ferramenta de identificação do BOLD para o gene COI, as sequências de B. ocellatus apresentaram similaridade aproximada de 99% com as sequências depositadas desta mesma espécie.PPGGBC Por outro lado, as amostras de Bothus sp. tiveram a maior similaridade (98,17%) com sequências de B. pantherinus. É válido ressaltar que oito sequências privadas ou em early-release foram encontradas e apresentaram correspondência entre 99% e 100% com Bothus sp., embora estivessem identificadas como quatro espécies ou mesmo gêneros diferentes. Entretanto, sua condição privada, além de impedir sua utilização nas análises de dados, ainda permite que os autores alterem ou revisem a identificação antes da publicação definitiva. O alinhamento das sequências de COI e DNAr 16S apresentou um total de 247 e 205 sítios variáveis, respectivamente. A média do conteúdo de bases no COI foi 27,2% de T, 29,8% 77

de C, 21,9% de A e 21,9% de G. No 16S, a média foi de 21,7% T, 27,2% C, 28,3% A e 22,7% G. A distância intraespecífica calculada para o COI variou de 0,1% em Bothus sp. a 0,5% em B. ocellatus (Tab. 2). Por sua vez, a divergência interespecífica variou de 2,3% entre Bothus sp. e B. pantherinus a 31,6% entre A. achirus e B. mancus (Tab. 3). O gene 16S apresentou variação intraespecífica entre 0% em B. pantherinus e 0,4% em B. ocellatus (Tab. 2). A variação interespecífica aponta uma pequena divergência (0,4%) entre B. pantherinus e Bothus sp. (Tab. 4). Em contrapartida, o maior distância entre pares de espécies foi verificada para A. achirus x Bothus sp. (25,5%). A árvore de NJ para ambos os genes apresentou uma clara definição de ramos únicos e reciprocamente monofiléticos para cada espécie, com exceção dos dois espécimes de B. maculiferus que se agruparam no mesmo ramo que B. ocellatus (Fig. 3). O agrupamento entre Bothus sp. e B. pantherinus foi apoiado com altos níveis de confiabilidade (100%) (Fig. 3). As árvores baseadas em IB e MV (Fig. 4) recuperaram tipologias essencialmente similares às árvores de NJ para os dois genes mitocondriais analisados. Novamente, uma estreita relação filogenética foi verificada entre B. pantherinus e Bothus sp. em relação às demais espécies de Bothus, com valores de confiança dos ramos sempre superiores a 99%. As diversidades haplotípica (h) e nucleotídica (π) calculadas a partir do COI em B. ocellatus foram de h=0,565 e π=0,01474. Além disto, entre os espécimes coletados, B. ocellatus apresentou nove haplótipos e 11 sítios polimórficos. Em Bothus sp., por sua vez, foram encontrados apenas dois haplótipos e um sítio polimórfico (h=0,400 e π=0,00062). As diversidades haplotípica e nucleotídica em B. pantherinus foram de h=1,000 e π=0,00308, incluindo três haplótipos e três sítios polimórficos. A rede de haplótipos resultante (Fig. 5) demonstra claramente o maior número de mutações (125) separando B. ocellatus do grupo [B. pantherinus + BothusPPGGBC sp.]. A maior diversidade genética em B. ocellatus também é notória, embora tenha sido provavelmente influenciada pela maior amostragem dessa espécie no presente estudo.

Discussão Taxonomia integrativa A família Bothidae tem sido reconhecida como um grupo monofilético [56,57,58] situada em posição intermediária na filogenia de Pleuronectiformes [59]. Contudo, a 78

identificação morfológica de espécies e o estabelecimento de relações intra e intergenéricas em Pleuronectiformes é muitas vezes confusa e controversa [8]. No caso de Bothus, diferentes autores estabelecem parâmetros conflitantes para o reconhecimento das espécies [53,18,54]. Ainda assim, a análise morfológica demonstrou a separação das amostras em dois grupos, sendo um equivalente a B. ocellatus e outro denominado Bothus sp., com algumas características parcialmente similares a outras espécies do Atlântico Sul. Desse modo, o uso de outros marcadores como os citogenéticos e moleculares representa uma ferramenta valiosa para elucidar tanto a identidade desta possível espécie sem descrição formal quando sua relação com espécies congenéricas. Infelizmente, os dados citogenéticos em Bothus são particularmente escassos. Das 16 espécies válidas no gênero, apenas três, incluindo o presente estudo, possuem dados cromossômicos descritos [60,61]. Entretanto, os dados citogenéticos apontam para uma acentuada variação cromossômica em Bothus, cujo 2n pode variar de 2n=32 (B. ocellatus) a 2n=44 (Bothus sp.). Considerando que o cariótipo basal dos Pleuronectiformes deveria apresentar 2n=48 com a maioria dos cromossomos acrocêntricos [62,63], as espécies analisadas compartilham a tendência dos Bothidae e outras famílias como Achiridae [64] de redução no número de cromossomos. A presença de valores diplóides <48 ao lado de vários cromossomos m e sm, como particularmente notado em B. ocellatus [60, presente estudo] indica a ocorrência de fusões cêntricas e inversões pericêntricas como os principais mecanismos de diversificação cariotípica em Bothidae. Comparativamente, Bothus sp. parece ter passado por um número menor de rearranjos cromossômicos envolvendo dois eventos de fusão cêntrica que dariam origem aos dois primeiros pares metacêntricos (Fig. 2b) e poucas inversões pericêntricas. Enquanto a macroestrutura cariotípica mostrou-se bem diferenciada, a microestrutura cromossômica foi particularmente uniforme. Um sistema simples de RONs intercaladas com regiões ricas em GC,PPGGBC conforme descrito no presente estudo e confirmado com os dados de FISH, é comum para a maioria das espécies de Pleuronectiformes [60,64,65]. O fato de ambas as espécies compartilharem sítios de DNAr 18S no braço curto de um par de cromossomos pode ainda ser um caráter simplesiomórfico, uma vez que ele é também encontrado em outras famílias de Pleuronectiformes [e.g 60,64-67]. Do mesmo modo, a presença de bandas C envolvendo o centrômero em B. ocellatus e Bothus sp. é uma característica compartilhada pela maior parte dos teleósteos [68] enquanto os blocos heterocromáticos associados às RONs (Fig. 2c,d) também são comumente encontrados em Pleuronectiformes [60,69]. 79

Apesar dessas semelhanças na microestrutura, o fato do cariótipo de B. ocellatus ser invariável entre populações distantes, incluindo as analisadas previamente [60], e, ao mesmo tempo, tão diferenciado de Bothus sp. reforça o potencial dos dados cromossômicos na citotaxonomia. De fato, o padrão cariotípico de Bothus sp. com alto valor de 2n e grande número de cromossomos acrocêntricos parece ser particularmente divergente das demais espécies do Atlântico já estudadas (B. ocellatus e B. podas) [60,61]. Reforçando essas diferenças entre as duas espécies de Bothus do Atlântico Sul, os resultados das análises moleculares indicam uma forte relação entre Bothus sp. e Bothus pantherinus, sugerindo uma história evolutiva recente, apesar da aparente ausência de conexão em suas distribuições. Em contrapartida, as amostras de B. ocellatus do presente estudo formaram um grupo com um único espécime do BOLD na árvore de NJ para o COI. O outro espécime de B. ocellatus do BOLD, entretanto, formou um grupo com outros dois espécimes também do BOLD identificados como B. maculiferus (Fig. 3a). O arranjo inesperado entre espécimes do BOLD de B. maculiferus e B. ocellatus se deve a um problema na identificação de larvas previamente apontado por outros autores [13], gerando a ideia errônea de que o DNA barcoding não é apropriado para distinguir as espécies de Bothus. Estes mesmos autores sugerem que o nome nas sequências seja alterado na base de dados para o nível de gênero [13]. Embora a tabela de distâncias interespecíficas revele uma menor divergência entre Bothus sp. e B. pantherinus em relação às outras espécies congenéricas (Tab. 3), o valor de 2,3% entre ambas pode ser considerado representativo. Em geral, os trabalhos com DNA barcoding em peixes marinhos utilizam valores de divergência de 2% como limiar para separação de espécies [70]. Ainda que esse critério de 2% de distância seja arbitrário e deva ser interpretado com cautela, a variação intraespecífica máxima de 0,4% nesses dois grupos reforça o barcode gap, evidenciandoPPGGBC a eficácia da técnica na identificação de espécies do gênero. Adicionalmente, as árvores de IB e MV (Fig. 4) não apresentaram variação expressiva no arranjo dos grupos de interesse (B. ocellatus, Bothus sp. e B. pantherinus) quando comparadas às árvores de NJ (Fig. 3). As análises dos genes COI e 16S baseadas nos diferentes modelos evolutivos testados e métodos de reconstrução filogenética resultaram, invariavelmente, na estreita ligação entre Bothus sp. e B. pantherinus com altos valores de confiabilidade dos ramos. Vale ressaltar que os haplótipos de COI em B. ocellatus, Bothus sp. e B. pantherinus foram distinguíveis entre si, sendo que o número de mutações que explicam as diferenças entre a primeira e as duas últimas espécies é extremamente elevado (Fig. 5). 80

Mesmo com a alta diversidade genética encontrada em B. ocellatus, ainda que enviesada pela diferença na amostragem, a integridade das amostras como uma unidade evolutiva distinta foi mantida. Esses dados, associados à distribuição descontínua entre Bothus sp. e B. pantherinus, apoiam a distinção de Bothus sp. Porém, a inesperada relação entre uma espécie sem ocorrência descrita para o Oceano Atlântico - B. pantherinus - e espécimes de Bothus da costa brasileira suscitou inferências biogeográficas sobre o processo de especiação e diferenciação de Bothus no Atlântico Sul, discutidos a seguir.

Hipótese Biogeográfica de Dispersão As características larvais evidenciam a capacidade dos Pleuronectiformes em realizar processos dispersivos de longa distância. Até onde se sabe, a maior parte dos ovos e todas as larvas em espécies desse grupo são planctônicas. Consequentemente, a taxa e direção da dispersão após a desova são amplamente dependentes das características do movimento local das águas [8]. Em Bothidae, os ovos também são pelágicos [71] e, após a eclosão, as larvas podem atingir um tamanho relativamente grande antes da metamorfose [27]. As larvas de B. pantherinus chegam a 16 mm, enquanto juvenis pelágicos podem chegar a aproximadamente 35 mm de comprimento padrão [27]. Evseenko [23], analisando o gênero Bothus, menciona que uma grande reserva de alimento é encontrada no fígado antes da metamorfose; característica ainda documentada em B. pantherinus [27]. Por acumular esta reserva antes da transformação, , espera-se que as larvas sejam competentes com complexos estrutura-função bem adaptados para alimentação, fuga de predadores, ventilação, entre outros [72]. Esses fatores indicam que as larvas de espécies de Bothus apresentam grande potencial dispersivo antes do recrutamento para o ambiente demersal. PPGGBC Outro ponto importante para a grande capacidade dispersiva em Bothus reside no período larval de longa duração registrado em algumas espécies, podendo durar de meses até um ano [29]. Na fase pelágica de algumas espécies, tais como B. pantherinus [27], isso significa um maior período na coluna d’água e, portanto, maior possibilidade de dispersão. De fato, foi demonstrada a capacidade de deriva das larvas de Bothus em escala transcontinental no Atlântico Norte [29]. Neste mesmo estudo, é ressaltada a via de dispersão larval pelas correntes oceânicas e a provável influência da temperatura na duração da fase pelágica, reduzindo-a ou aumentando-a conforme as correntes se tornam mais quentes ou mais frias, respectivamente. 81

Considerando a similaridade genética entre Bothus sp. e B. pantherinus e características que favorecem a dispersão no gênero, é possível imaginar duas rotas possíveis para o estabelecimento de Bothus sp. na costa oeste do Atlântico Sul milhões de anos antes da separação das espécies. Estas rotas tomam como base tanto a distribuição atual de B. pantherinus quanto o centro de origem de biodiversidade marinha tropical no Triângulo de Corais do Indo-Pacífico [4,73]. A primeira rota a ser considerada envolve uma dispersão através do Oceano Pacífico conduzida, essencialmente, pelas correntes Norte Equatorial, Sul Equatorial ou a Contracorrente Pacífica. A segunda rota possível segue a Corrente das Agulhas com posterior dispersão de ovos ou larvas pela corrente fria de Benguela e, por fim, seguindo condução pelas correntes Sul Equatorial Atlântica e Corrente do Brasil até a costa brasileira (Fig. 1). Em um cenário de dispersão conduzido pelas correntes do Pacífico, as larvas de B. pantherinus, ou um ancestral comum às duas espécies atuais, teriam que percorrer uma grande distância até transpassar a região do Istmo do Panamá e se estabelecer ao sul, na costa brasileira. Esta hipótese, embora reforçada pela presença de numerosas ilhas no Pacífico com ambientes recifais que poderiam agir como stepping stones para a espécie, possui vários pontos negativos. Apesar da quantidade de ilhas e recifes, a distância percorrida no Pacífico dificulta a possibilidade deste cenário. Não obstante, as Correntes Equatoriais do Pacífico Sul e Norte incluem caminhos pouco práticos à dispersão pelo Istmo do Panamá devido à sua direção, distância e, no caso da Corrente Sul, resfriamento severo pela Corrente Circumpolar Antártica. Outro ponto negativo dessa hipótese é a ausência de registros de ocorrência de B. pantherinus no leste do Pacífico (costa oeste das Américas), sugerindo uma interrupção na distribuição da espécie pelo Oceano Pacífico (Fig. 1). Dificultando ainda mais esta hipótese, pelo menos duas grandes barreiras biogeográficas marinhas teriam que ser transpassadas por esta rota: a grande distância e profundidadePPGGBC no Oceano Pacífico e o grande aporte de água doce e sedimento da barreira amazônica. Além destes fatores, a depender da idade da dispersão, ainda deve ser considerado o soerguimento do Istmo do Panamá, como uma barreira intransponível [7]. De fato, a distância genética K2P do COI entre Bothus sp. e B. pantherinus (2,3%) é muito menor do que aquela verificada entre pares trans-istmianos de espécies recifais dos gêneros Haemulon, Chromis, Chaetodon, Priacanthus, Thalassoma e Ophioblennius (6,5 a 12,37%) [74]. Esses dados depõem contra a colonização da linhagem ancestral de ambas as espécies de Bothus na costa brasileira por meio da rota do Pacífico. Por outro lado, alguns estudos demonstram que espécies 82

com maior afinidade por áreas estuarinas rasas, como os Bothidae, parecem ter resistido por mais tempo ao isolamento provocado pelo Istmo do Panamá, resultando em valores de divergência genética inferiores [74-76]. A segunda rota considera um caminho partindo do centro de origem, no Indo-Pacífico, até a extremidade sul do Continente Africano pela Corrente das Agulhas. Ocasionalmente, larvas ou ovos planctônicos em deriva poderiam atingir a Corrente de Benguela, adjacente à costa atlântica da África. Seguindo este caminho, as correntes Sul Equatorial Atlântica e Corrente do Brasil seriam responsáveis por levar as larvas à costa do Atlântico oeste. Diferentemente da primeira hipótese, a dispersão por meio da Corrente de Benguela é apoiada por uma menor distância entre as costas sul-americana e africana, sentido leste-oeste das principais correntes oceânicas (Fig. 1) e baixa temperatura da Corrente de Benguela (favorecendo o maior tempo de duração das larvas na fase pelágica). O maior contraponto para essa via de dispersão pela corrente de Benguela seria a distância em mar aberto que separa a costa africana da sul-americana. A transposição desta barreira, embora seja uma área menor que a distância no Oceano Pacífico, só pode ser explicada por repetidas “tentativas” de colonização e o grande alcance e longo tempo de permanência na fase planctônica e pelágica das larvas de Bothus. De fato, a colonização de espécies de peixes demersais ou nectônicos do leste do Atlântico para a América do Sul que cruzaram a barreira do meio do Atlântico tem sido documentada em diferentes grupos taxonômicos, tais como Acanthurus monroviae, Aulostomus strigosus, Epinephelus marginatus e Parablennius pilicornis [77]. Um estudo filogeográfico em peixe-trombeta do gênero Aulostomus também reforça esse segundo cenário [78] ao demonstrar que as amostras da costa brasileira eram geneticamente idênticas a Aulostomus strigosus da África do Sul e distintas da espécie congenérica caribenhaPPGGBC A. maculatus. Nesse caso, os autores propuseram um modelo de especiação em anel para os peixes-trombeta em escala circumtropical que parece ser igualmente plausível para as espécies do gênero Bothus. De acordo com esse modelo, duas formas geneticamente distintas (como Bothus sp. e B. ocellatus) acabariam sobrepondo a área de ocorrência a partir de vias de colonização opostas. Como B. ocellatus também ocorre no Caribe e guarda maiores similaridades genéticas com outras espécies dessa região (Fig. 3 e 4) é possível que ela tenha se originado em função do soerguimento do istmo do Panamá e chegado à costa do Brasil enquanto Bothus sp. teria seguido a rota pelo Atlântico leste. Nesse caso, esforços de 83

amostragem de Bothus na costa Atlântica da África seriam importantes para validar ou refutar tal hipótese. Do mesmo modo, mais investigações incluindo outros genes mitocondriais e nucleares podem ser de grande valia para compreender melhor as relações entre as duas espécies. Porém, fica claro que Bothus sp. possui uma divergência recente com B. panterinus, onde a descontinuidade da colonização e possível papel de pressão seletiva diferencial entre estas espécies levaram à formação das unidades evolutivas. Esses dados ainda demonstram que a riqueza de Bothus na costa brasileira está subestimada com a presença de formas crípticas, as quais precisam ser validadas para mensuração dos níveis de endemismo regional frente ao acelerado processo de degradação ambiental dos habitats costeiros.

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Tabela 01. Distâncias intraespecíficas para fragmentos do gene mitocondrial Citocromo C Oxidase Subunidade I (COI) e do DNAr 16S calculadas com base no modelo Kimura-2- Parâmetros (K2P). Espécie COI 16S Bothus sp. 0,000633915 0,00200126 Bothus ocellatus 0,003618844 0,002221211 Bothus pantherinus 0,003173357 0,00166667 Bothus maculiferus 0,001584787 - Bothus mancus - - Bothus sp. BOLD - - Bothus podas - - Bothus leopardinus - - Bothus lunatus 0,003174614 0,002498443 Bothus myriaster - 0,002500005 Bothus robinsi - 0,002500005 Achirus achirus - - Citharichthys spilopterus - - Syacium papillosum - - *(-) Dados não computados pela presença de um único espécime nas amostras.

Tabela 02. Matriz de distâncias interespecíficas para fragmentos do gene mitocondrial Citocromo C Oxidase Subunidade I (COI) com base no modelo Kimura-2-Parâmetros (K2P).

Espécie 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1. Bothus sp. 0,006 0,023 0,022 0,019 0,021 0,021 0,020 0,019 0,024 0,024 0,024 2. Bothus pantherinus 0,023 0,022 0,021 0,019 0,021 0,020 0,020 0,018 0,024 0,024 0,024 3. Bothus ocellatus PPGGBC0,237 0,233 0,004 0,020 0,021 0,015 0,019 0,020 0,024 0,024 0,025 4. Bothus maculiferus 0,234 0,226 0,013 0,019 0,021 0,015 0,019 0,019 0,024 0,024 0,025 5. Bothus mancus 0,192 0,188 0,204 0,199 0,023 0,019 0,021 0,011 0,026 0,024 0,025 6. Bothus sp. BOLD 0,234 0,221 0,219 0,212 0,252 0,021 0,022 0,021 0,023 0,022 0,023 7. Bothus podas 0,213 0,204 0,131 0,129 0,203 0,234 0,019 0,019 0,022 0,022 0,023 8. Bothus leopardinus 0,215 0,217 0,174 0,172 0,211 0,224 0,175 0,021 0,024 0,023 0,024 9. Bothus lunatus 0,186 0,179 0,200 0,200 0,084 0,242 0,206 0,217 0,025 0,022 0,025 10. Achirus achirus 0,292 0,296 0,265 0,270 0,316 0,259 0,252 0,278 0,299 0,025 0,023 11. Citharichthys spilopterus 0,280 0,275 0,277 0,276 0,252 0,256 0,251 0,259 0,246 0,285 0,017 12. Syacium papillosum 0,261 0,269 0,282 0,280 0,279 0,249 0,256 0,246 0,278 0,254 0,155 90

Tabela 03. Matriz de distâncias interespecíficas para fragmentos do DNAr 16S com base no modelo evolutivo Kimura-2-Parâmetros (K2P).

Espécies 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1. Bothus sp. 0,016 0,002 0,012 0,016 0,014 0,025 0,018 0,017 2. Bothus ocellatus 0,114 0,016 0,016 0,010 0,012 0,023 0,018 0,019 3. Bothus pantherinus 0,004 0,112 0,012 0,016 0,014 0,025 0,018 0,017 4. Bothus lunatus 0,066 0,118 0,063 0,016 0,013 0,024 0,018 0,018 5. Bothus podas 0,116 0,046 0,115 0,121 0,014 0,024 0,019 0,019 6. Bothus robinsi 0,090 0,079 0,086 0,081 0,094 0,023 0,020 0,019 7. Achirus achirus 0,255 0,222 0,250 0,250 0,231 0,237 0,023 0,022 8. Citharichthys spilopterus 0,170 0,164 0,167 0,160 0,176 0,176 0,236 0,010 9. Syacium papillosum 0,161 0,177 0,157 0,170 0,180 0,174 0,214 0,055

PPGGBC 91

Figura 1. Mapa global da distribuição das principais espécies de Bothus abordadas neste trabalho. O mapa mostra os locais de coleta de (a) Bothus sp. e (b) B. ocellatus (BTS - Baía dePPGGBC Todos os Santos, BA, Brasil; BCM - Baía de Camamu, Bahia, Brasil e NTR - Niterói, Rio de Janeiro, Brasil). A área de distribuição de B. ocellatus e (c) B. pantherinus está mostrada em verde e vermelho, respectivamente. As setas indicam as principais correntes oceânicas que podem servir como rotas de dispersão de B. pantherinus pra a costa do Atlântico. 92

Figura 2. Dados citogenéticos das espécies Bothus ocellatus e Bothus sp. Cariótipos (a,b) e metáfases somáticas após bandamento C (c,d) de Bothus ocellatus (a,c) e Bothus sp. (b,d). Em destaque, os pares portadores de RONs após impregnação por nitrato de prata (Ag-RON), coloração com fluorocromos mostrando marcações CMA3 positivas e FISH com sonda de DNAr 18S. Os asteriscos nas metáfases indicam os blocos heterocromáticos terminais nos pares portadores de RONs. PPGGBC 93

Figura 3. Árvores de Neighbor-Joining baseadasPPGGBC no método de substituição nucleotídica Kimura-2-Parâmetros (K2P) para espécies de Pleuronectiformes. Árvore para as sequências do gene mitocondrial Citocromo C Oxidase Subunidade I (COI) (a) e do DNAr 16S (b). Os valores de bootstrap são mostrados acima de cada ramo e os nomes em vermelho indicam as sequências retiradas do BOLD (Barcode of Life Data Systems). 94

Figura 4. Árvores de Inferência Bayesiana e Máxima Verossimilhança para espécies de Pleuronectiformes. Árvores de Inferência Bayesiana (a,b) e Máxima Verossimilhança (c,d) para asPPGGBC sequências dos genes COI (a,c) e do DNAr 16S (b, d). Os valores de probabilidade a posteriori e de bootstrap são mostrados acima de cada ramo.

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Figura 5. Rede haplotípica do gene mitocondrial Citocromo C Oxidase Subunidade I (COI) entre espécies de Bothus. A rede de haplótipos demonstra as relações entre os haplótipos das espécies Bothus ocellatus (B. oc), Bothus sp. (B. sp) e Bothus pantherinus (B. pa) de cada localidade. Cada cor representa uma localidade e o tamanho dos círculos é proporcional ao número de indivíduos (detalhado dentro de cada círculo) que compartilham cada haplótipo. Os números nosPPGGBC ramos indicam o número de mutações entre os haplótipos. 96

6. CONCLUSÕES GERAIS

 O presente estudo representa uma importante contribuição à base de dados do DNA barcoding para Pleuronectiformes do Atlântico Sul, incluindo novas espécies e ampliando no número depositado de espécimes por espécie e localidade;  A utilização do DNA barcoding mostrou uma grande eficácia em um grupo taxonomicamente controverso como Pleuronectiformes. Dentre os marcadores utilizados, o COI foi o mais resolutivo na identificação de espécies;  A acentuada distância genética em algumas espécies de Pleuronectiformes, como alguns representantes dos gêneros Syacium e Symphurus, indica equívoco na identificação morfológica entre os autores;  A presença de diferentes BINs em algumas espécies (e.g. Achirus lineatus) e de unidades evolutivas distintas (e.g. Citharichthys) pode estar ligada ao isolamento biogeográfico e indica a possibilidade de espécies crípticas ou mesmo complexos de espécies, os quais precisam ser revisados sistematicamente;  A incongruência entre o sistema lineano e o sistema de BINs utilizado pelo DNA barcoding reforça a importância da associação de análises morfológicas e moleculares;  No gênero Bothus, uma provável espécie ainda não descrita foi amostrada para a costa nordeste do Brasil conforme apontado por dados morfológicos, citogenéticos e moleculares;  As análises citogenéticas em Bothus reitera o potencial da citotaxonomia em Pleuronectiformes uma vez que B. ocellatus apresentou um cariótipo concordante com outras populações previamente analisadas enquanto Bothus sp. demonstrou características cariotípicas claramente distintas;  A surpreendentePPGGBC similaridade genética entre Bothus sp. da costa brasileira e B. pantherinus do Indo-Pacífico versus a alta divergência da primeira em relação à B. ocellatus suscitou a hipótese de especiação em anel associada à colonização e posterior diferenciação do ancestral de Bothus sp. por meio de deriva larval pela corrente de Benguela no Atlântico Sul;  Esse conjunto de dados demonstra a riqueza ainda não descrita de espécies estuarinas e costeiras de Pleuronectiformes no Atlântico Sul com cenários alternativos de origem e diversificação da ictiofauna da Província Brasileira.