Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera,

Noctuidae) en especies de Meliaceae

Daniela Alejandra Álvarez Yepes

Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias, Escuela de Química Medellín, Colombia 2019

Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera,

Noctuidae) en especies de Meliaceae

Daniela Alejandra Álvarez Yepes

Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título de: Magister en Ciencias

Directora Tatiana Lobo Echeverri PhD. Codirector (a): Clara Inés Saldamando Benjumea PhD.

Línea de Investigación: Química de los Productos Naturales Grupo de Investigación: Química de los Productos Naturales y los Alimentos, Universidad Nacional de Colombia

Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias, Escuela de Química Medellín, Colombia 2019

Serendipität

Agradecimientos

Agradezco a la Universidad Nacional de Colombia y a la dirección de investigaciones, sede Medellín (DIME) por la financiación brindada para la ejecución de este proyecto y a Colciencias por la beca “Jóvenes Investigadores”

Agradezco a mi familia y a mis amigos por todo el apoyo, amor y comprensión durante estos años.

Agradezco especialmente a la profesora Tatiana Lobo por su valiosa instrucción y paciencia, a quien debo todos los instantes alegres de mi paso por el laboratorio 19A-210. Agradezco también a la profesora Clara Saldamando por su apoyo académico e investigativo.

Resumen y Abstract IX

Resumen

Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) es una plaga polífaga de gran importancia económica en Colombia, la cual causa pérdidas hasta del 35% en los cultivos de maíz y en porcentajes menores en los cultivos de arroz, caña de azúcar, sorgo y algodón. Se ha reportado la existencia de dos biotipos de este insecto, denominados de arroz y maíz, por ser estas las plantas de las que se alimentan principalmente. Estos biotipos difieren en su susceptibilidad a insecticidas como lambadacialotrina y metomil y a las endotoxinas del Bacillus thuringensis, generalmente usados en el control de esta plaga, siendo el biotipo de arroz más resistente a los insecticidas y el biotipo de maíz a las endotoxinas. Tal diferencia en susceptibilidad supone un problema si se tiene en cuenta que ambos biotipos han adquirido resistencia a insecticidas sintéticos y a plantas transgénicas y que actualmente los pesticidas sintéticos representan un problema creciente de contaminación y riesgo a la salud. Este panorama pone de relieve la importancia de la búsqueda de alternativas biosostenibles para el control de S. frugiperda, que consideren la existencia de los biotipos. Dado el amplio espectro de compuestos con potencial insecticida e insectistático de la familia Meliaceae, se evaluó la actividad insecticida y antialimentaria de extractos vegetales de Carapa guianensis, Swietenia mahagoni y Swietenia macrophylla, usando larvas de tercer instar. De estas plantas, las fracciones de diclorometano de los tallos de C. guianensis y de S. macrophylla tuvieron mayores efectos sobre S. frugiperda, tanto insecticidas como antialimentarios, siendo S. macrophylla la más exitosa. Para evaluar un posible mecanismo de acción de la fracción se realizó un ensayo de inhibición de tirosinasa, en el que se evidenció un efecto moderado. Dicha fracción de tallos de S. macrophylla está compuesta principalmente por fitoesteroles y ácidos grasos, en la que resalta el β-sitosterol 3-O-β-glucopiranósido por ser el compuesto mayoritario y para el que se ha reportado su potencial controlador de insectos.

Palabras clave: Spodoptera frugiperda, Swietenia macrophylla, Carapa guianensis, actividad insecticida, actividad antialimentaria, β-sitosterol 3-O-β-glucopiranósido.

X Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

Abstract

Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) is a polyphagous pest of great economic value in Colombia, which causes losses of up to 35% in corn crops, and to a lesser extent in rice, sugarcane, cotton and sorghum crops. It has been reported that there are two strains of this insect, namely Rice and Corn strain, because these are the main plants they feed from. These strains differ from their susceptibility to insecticides like lambdacyhalothrin and methomyl, and to the Bacillus thuringensis endotoxins, generally used in this pest control, being the Rice strain more resistant to insecticides and the corn one more resistant to the endotoxins. This difference in susceptibility is a problem if it is considered that both strains have become resistant to synthetic insecticides and transgenic crops, and that nowadays the synthetic insecticides are a growing threat to human health and the environment. This scenario highlights the need to find new and bio-sustainable alternatives for controlling S. frugiperda, which consider the strains existence. Because of the wide spectrum of compounds with insecticide and insectistatic potential in the Meliaceae family, we tested the insecticide and antifeedant activity of the Carapa guianensis, Swietenia mahagoni y Swietenia macrophylla ethanolic extracts on third instar larvae. From these plants, the Carapa guianensis and Swietenia macrophylla twigs dicloromethane fractions had the major effects on S. frugiperda, both insecticide and antifeedant, being S. macrophylla the most successful. In order to evaluate a possible mechanism that explains this fraction effect we tested the S. macrophylla tyrosinase inhibition, which resulted in a moderate effect. The dicloromethane fraction is basically composed of phytosterols and fatty acids. The β-sitosterol 3-O-β-glucopyranoside is the main compound of the fraction and a potential insect controller, based on what is reported in the literature and our results.

Keywords: Spodoptera frugiperda, Swietenia macrophylla, Carapa guianensis, insecticide activity, antifeedant activity, β-sitosterol 3-O-β-glucopyranoside.

Contenido XI

Tabla de Contenido

1. Objetivos ...... 5 1.1 Objetivo general ...... 5 1.2 Objetivos específicos ...... 5

2. Marco teórico y estado del arte ...... 7 2.1 Aspectos biológicos de Spodoptera frugiperda ...... 7 2.1.1 Ciclo de vida de S. frugiperda ...... 8 2.1.2 Hábitos alimenticios y daño a los cultivos...... 15 2.1.3 Biotipos de S. frugiperda ...... 18 2.1.4 Estrategias de control de S. frugiperda ...... 25 2.2 Potencial insecticida de compuestos de origen vegetal ...... 34 2.3 Familia Meliaceae ...... 42 2.3.1 Distribución geográfica y hábitat ...... 43 2.3.2 Morfología ...... 44 2.3.3 Importancia económica ...... 46 2.3.4 Fitoquímica ...... 47 2.3.5 Descripción de las especies evaluadas ...... 50

3. Metodología ...... 63 3.1 Extracción etanólica del material vegetal ...... 63 3.2 Fraccionamiento, purificación y elucidación estructural de compuestos ...... 63 3.3 Mantenimiento de insectos ...... 65 3.4 Bioensayos sobre las larvas de los biotipos de S. frugiperda ...... 66 3.4.1 Ensayo antialimentario ...... 66 3.4.2 Ensayo insecticida ...... 67 3.5 Ensayo de inhibición de tirosinasa con la fracción de tallos de S. macrophylla . 67 3.6 Análisis estadístico ...... 68

4. Resultados y discusión ...... 70 4.1 Fraccionamiento de las especies seleccionadas ...... 71 4.2 Ensayo insecticida ...... 74 4.2.1 Efectos sobre la fase larval ...... 75 4.2.2 Efectos sobre el ciclo completo ...... 94 4.3 Ensayo antialimentario ...... 110 4.4 Ensayo de inhibición de tirosinasa con fracción de tallos de S. macrophylla ... 117 4.5 Caracterización química...... 120 4.5.1 Caracterización química de la fracción de diclorometano del extracto de tallos de C. guianensis ...... 120

XII Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

4.5.2 Aislamiento y caracterización de estigmasterol de C. guianensis ...... 133 4.5.3 Caracterización química de la fracción de diclorometano del extracto de tallos de S. macrophylla ...... 136 4.5.4 Aislamiento y caracterización del β-sitosterol 3-O-β-glucopiranósido de S. macrophylla ...... 144

5. Conclusiones y recomendaciones ...... 149 5.1 Conclusiones ...... 149 5.2 Recomendaciones ...... 150

Contenido XIII

Lista de figuras

Figura 2-1: Características morfológicas de los huevos de S. frugiperda...... 9 Figura 2-2: Características morfológicas de las larvas de S. frugiperda ...... 11 Figura 2-3: Rasgos característicos de S. frugiperda que permiten su identificación...... 12 Figura 2-4: A. Pupa de S. frugiperda. B. Características sexuales de la pupa ...... 13 Figura 2-5: Características morfológicas de adultos de S. frugiperda ...... 15 Figura 2-6: Maíz afectado por S. frugiperda ...... 16 Figura 2-7: Daños de S. frugiperda a hospederos...... 17 Figura 2-8: Aislamiento reproductivo en los biotipos de S. frugiperda ...... 22 Figura 2-9: Piretrina y piretroides...... 36 Figura 2-10: Alcaloides insecticidas ...... 37 Figura 2-11: Estructura química de la gedunina y la limonina...... 38 Figura 2-12: Estructura química de algunos limonoides de A. indica ...... 39 Figura 2-13: Estructura química de algunos limonoides de M. azedarach ...... 40 Figura 2-14. Estructura química de algunos flavonoides con actividad insecticida ...... 41 Figura 2-15: Distribución geográfica de Meliaceae ...... 43 Figura 2-16: Flores y frutos de Meliaceae ...... 44 Figura 2-17: Estructura del tirucalano, el eufano y el limonoide prototípico ...... 48 Figura 2-18: Estructura química de algunos tipos de limonoides ...... 49 Figura 2-19: Características de S. macrophylla ...... 51 Figura 2-20: Características de S. mahagoni ...... 55 Figura 2-21: Características de C. guianensis ...... 59 Figura 4-1: Fraccionamiento biodirigido de las especies seleccionadas ...... 72 Figura 4-2: Fraccionamiento de la partición de diclorometano del extracto de tallos de C. guianensis ...... 72 Figura 4-3: Fraccionamiento de la partición de diclorometano de el extracto de tallos de S. macrophylla ...... 73 Figura 4-4: Supervivencia de larvas de ambos biotipos frente a las especies vegetales evaluadas...... 76 Figura 4-5: Supervivencia de las larvas de ambos biotipos discriminado por extractos y fracciones...... 79 Figura 4-6: Supervivencia de las larvas del biotipo de arroz ...... 83 Figura 4-7: Mortalidad corregida en larvas para el biotipo de arroz ...... 85 Figura 4-8: Supervivencia de las larvas del biotipo de maíz ...... 87 Figura 4-9: Mortalidad corregida en larvas para el biotipo de maíz ...... 89 Figura 4-10: Supervivencia de las larvas del biotipo de arroz frente a S. macrophylla .... 90

XIV Título de la tesis o trabajo de investigación

Figura 4-11: Supervivencia de las larvas del biotipo de maíz frente a S. macrophylla..... 92 Figura 4-12: Porcentaje de mortalidad comparada para ambos biotipos...... 93 Figura 4-13: Supervivencia para el ciclo completo y ambos biotipos ...... 95 Figura 4-14: Supervivencia en el ciclo completo para el biotipo de arroz ...... 97 Figura 4-15: Mortalidad corregida en pupas para el biotipo de arroz ...... 99 Figura 4-16: Porcentaje de insectos del biotipo de arroz que sobrevivieron al ciclo completo ...... 100 Figura 4-17: Efectos sobre larvas y pupas del biotipo de arroz ...... 102 Figura 4-18: Efectos sobre los adultos del biotipo de arroz ...... 102 Figura 4-19: Supervivencia en el ciclo completo para el biotipo de maíz ...... 103 Figura 4-20: Mortalidad corregida en pupas para el biotipo de maíz ...... 105 Figura 4-21: Porcentaje de insectos del biotipo de maíz que sobrevivieron al ciclo completo ...... 106 Figura 4-22: Porcentaje de supervivencia al ciclo completo para ambos biotipos...... 107 Figura 4-23: Efectos sobre larvas y adultos del biotipo de maíz ...... 108 Figura 4-24: Efectos sobre pupas del biotipo de maíz...... 109 Figura 4-25: Porcentaje de área consumida para ambos biotipos y cada tratamiento ... 111 Figura 4-26: Áreas consumidas por las larvas del biotipo de arroz...... 113 Figura 4-27: Áreas consumidas por las larvas del biotipo de maíz ...... 115 Figura 4-28: Inhibición de la tirosinasa por tallos de S. macrophylla a diferentes concentraciones...... 119 Figura 4-29: Estructura del estigmasterol ...... 134 Figura 4-30: Estructura del β-sitosterol 3-O-β-glucopiranósido ...... 145

Contenido XV

Lista de tablas

Tabla 4-1: Resultados del ensayo insecticida para el biotipo de arroz ...... 74 Tabla 4-2: Resultados del ensayo insecticida para el biotipo de maíz ...... 75 Tabla 4-3: Índices antialimentarios para ambos biotipos ...... 111 Tabla 4-4: Resultados para el ensayo de inhibición de la tirosinasa con la fracción de tallos de S. macrophylla ...... 117 Tabla 4-5: Compuestos propuestos para la fracción de diclorometano del extracto de tallos de C. guianensis detectados mediante CG-EM...... 121 Tabla 4-6: Compuestos propuestos para la fracción de diclorometano del extracto de tallos de S. macrophylla detectados mediante CG-EM...... 137

XVI Título de la tesis o trabajo de investigación

Lista de Símbolos y abreviaturas

RMN Resonancia Magnética Nuclear CG-EM Cromatografía de masas acoplada a espectrometría de masas 13C RMN Resonancia Magnética Nuclear de Carbono 13 1H RMN Resonancia Magnética Nuclear de Protón COSY Correlación Espectroscópica (Correlation Spectroscopy) Dept Mejora sin Distorsión por la Transferencia de Polarización (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer) δ Desplazamiento Químico en ppm en Resonancia Magnética Nuclear HSQC Coherencia Cuántica Simple Heteronuclear (Heteronuclear Simple Quantum Coherence) Hz Hertz J Constante de Acoplamiento en Resonancia Magnética Nuclear Uma Unidad de Masa Atómica

νmax Frecuencia Máxima M+ Ión Molecular en Espectrometría de Masas °C Grados Celsius CCF Cromatografía de Capa Fina h Hora min Minutos L Litros μL Microlitros M Concentración Molar ppm Partes Por Millón HR Humedad relativa %v/v Porcentaje volumen-volumen Oz Onza EI Ionización electrónica (Electronic ionization) eV Electronvoltio Kg Kilogramo g Gramo

Contenido XVII

PCR-RFLP Reacción en cadena de la polimerasa con polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (Restriction Fragment Length Polymorphism) mg EAG/g Miligramos equivalentes de ácido gálico por gramo

Introducción

Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) es una polilla que se encuentra en gran parte del hemisferio occidental (Ashley, 1986), siendo un insecto polífago que presenta preferencia por las gramíneas, con más de 80 especies de plantas como hospedantes de esta especie (Saldamando-Benjumea et al., 2014), entre las que se encuentran gran parte de los cultivos anuales (Ashley, 1986). Al ser un insecto que ataca los cultivos en las fases tardías, países de zonas subtropicales como Brasil y Argentina se han visto afectados gravemente por su presencia, reportándose S. frugiperda como la mayor plaga de sus cultivos de maíz (Casmuz et al., 2010). En el caso colombiano, este insecto se distribuye por todo el país y se considera una de las principales plagas del maíz (Zea mays L.), secundaria en sorgo (Sorghum spp.), algodón (Gossypium hirsutum), hierbas y pastos (García et al, 2002). En el cultivo de maíz, es determinante en la industria agrícola colombiana, y en éste la polilla produce pérdidas hasta del 60% de la producción total (Torres & Cotes, 2005; CAI, 2012).

Debido a que Colombia es un país tropical, por tanto, desprovisto de estaciones, S. frugiperda puede reproducirse rápidamente, teniéndose una gran cantidad de generaciones por año, lo que implica un uso reiterado e indebido de insecticidas o xenobióticos (por fuera de la naturaleza) que, sumado a las altas tasas evolutivas de un insecto que se multiplica tan rápido, suele desencadenar resistencias a los productos utilizados para su control (Santos-Amaya et al., 2015). Una muestra de esto es el reporte de resistencia de S. frugiperda a insecticidas sintéticos como lambadacialotrina y metomil (León-García et al., 2012) así como a insecticidas derivados de DDT, ciclodienos, organofosforados, carbamatos y piretroides (Pitre, 1986; Tomquelski & Martins, 2007). Asimismo, se ha reportado resistencia a los cultivos transgénicos de maíz con endotoxinas

2 Introducción de Bacillus thuringiensis, siendo este uno de los principales métodos de control de este insecto (Adamczyk et al., 1997; Malaquias et al., 2015).

Este panorama ha supuesto nuevos esfuerzos por encontrar métodos más acordes con el ecosistema y por lo tanto eficientes en el control de S. frugiperda con menores efectos nocivos al medio ambiente, que comprendan una visión holística de la agricultura, lejos de un modelo de explotación en donde los bienes naturales se conciben únicamente por su potencial de rendimiento (González-Maldonado, Gurrola-Reyes & Chaírez-Hernández, 2015; Valladares et al., 2003); esto implica que las nociones de agroecología tengan en cuenta los sistemas políticos y económicos del ser humano y sus implicaciones en la estructura de la naturaleza (Jones, 2011; Lanka, Khadaroo & Böhm, 2017). Sin embargo, la existencia de dos biotipos de S. frugiperda, cuya biología sugiere un proceso de especiación en cuanto a la evolución de aislamiento químico, ecológico y reproductivo precigotico y postcigotico (Dres & Mallet, 2002; Pashley-Prowell, Hammond & Hardy, 1992; Velásquez-Vélez, Saldamando & Ríos, 2011; Pashley-Prowell, McMichael & Silvain, 2004; Groot et al., 2010; Saldamando et al. 2014), no ha sido tenida en cuenta como un factor importante a la hora del manejo de la plaga. Los pocos estudios realizados sobre la respuesta de tolerancia a insecticidas y controladores biológicos han reportado que la susceptibilidad frente a los diferentes métodos de control de S. frugiperda varía entre los dos biotipos. Ambos han presentado diferencias en su tolerancia a la endotoxina Cry1 AC de B. thuringiensis en Estados Unidos (Adamczyk et al., 2001), siendo las larvas del biotipo de maíz más resistentes a insecticidas que las larvas del biotipo de arroz; además, este último biotipo es más resistente a cultivos transgénicos de algodón que contienen la endotoxina Cry1 AC (Adamczyk et al., 2001). En contraste, en Colombia se ha reportado que el biotipo de arroz desarrolla tolerancia de manera más rápida a lambda-cialotrina y al metomil (Ríos-Diez & Saldamando, 2011). La evidencia anterior demuestra que el manejo de S. frugiperda debe tener en cuenta las diferentes susceptibilidades de ambos biotipos si se quiere superar las barreras con las que el control se enfrenta en el momento. Por otro lado, en Colombia se encontró que el biotipo de maíz es más resistente al biotipo de arroz con respecto a las endotoxinas Cry 1AC y Cry 1ABm en condiciones de laboratorio (Ríos- Diez et al. 2012).

En cuanto a la producción y uso de insecticidas tradicionalmente se ha optado por compuestos de origen sintético que, aunque suelen tener altas tasas de efectividad, son

Introducción 3 poco selectivos y altamente riesgosos para el ecosistema por su baja biodegradabilidad (Schweitzer & Noblet, 2018); esto se ha dado principalmente por la concepción capitalista de los bienes naturales como recursos aprovechables únicamente para los poderosos, la cual no tiene en cuenta estudios de tipo ecológico y socioeconómico que den cuenta de los daños potenciales al ecosistema y a la sociedad humana, en general (Jones, 2011; Lanka, Khadaroo & Böhm, 2017). Estos insecticidas suelen ser halogenados, lo que implica, además, presuntos daños a la salud humana y acumulación en el medio ambiente (Weichenthal et al., 2012; Xavier et al., 2005). Si se tiene en cuenta que en las últimas décadas se ha presentado una creciente resistencia a este tipo de insecticidas por parte de diversas plagas, derivando en el uso de cantidades mayores de plaguicidas a frecuencias más altas, se hace necesario reformular las herramientas de control que se disponen actualmente. Una de las alternativas que ha surgido con más fuerza ha sido la utilización de productos naturales, derivados en gran medida de plantas (Petroski & Stanley, 2009). El uso de productos naturales resulta ventajoso debido principalmente a su alta biodegradibilidad y selectividad en la interacción con el insecto plaga. Esto se debe a la baja concentración de halógenos en sus estructuras y por los complejos procesos co- evolutivos entre plantas e insectos que han determinado intrincados mecanismos de defensa de ambos organismos (Dayan et al., 2009; Hollomon, 2012). Asimismo, los productos naturales han despertado gran interés por ser una fuente de estructuras orgánicas novedosas que superan en complejidad a los insecticidas sintéticos por la abundancia de centros quirales, anillos, carbonos de hibridación sp3, nitrógeno y oxígeno (Xu, Ye & Zhao, 2010; Rimando & Duke, 2006). Sin embargo, la búsqueda de estas moléculas no está restringida por el reemplazo de los insecticidas convencionales, sino que buscan insertarse en programas de manejo integrado de plagas que, desde un enfoque sistémico y holístico, con un trabajo mancomunado ciencias sociales y naturales, no provoquen grandes daños al ecosistema, como sucede en este momento por el inexistente enfoque agroecológico de la producción económica neoliberal.

En el caso de los insecticidas de origen vegetal, la familia Meliaceae ha sido reconocida por el potencial insecticida y antialimentario de algunas de sus especies, principalmente Azadirachta indica (Neem) de donde se ha extraído la azadiractina – limonoide actualmente comercializado como insecticida y acaricida biológico – (Tomar & Kaushik, 2011; Céspedes et al., 2000). Otras de sus especies menos estudiadas de los géneros Swietenia y Carapa se han reportado como potenciales controladores de diferentes

4 Introducción insectos, contando ambas especies con compuestos terpénicos, a los que suele atribuirse actividades insecticidas o antialimentarias (Sarria et al., 2011; Jiménez et al., 1997; Adhikari & Chandra, 2012). Además, se ha reportado la presencia de alcaloides, terpenoides de 10, 15, 20 y 30 carbonos, cumarinas, flavonoides, cromonas, lignanos y otros compuestos fenólicos, asociados con efectos antioxidantes, anticancerígenos, antiinflamatorios, astringentes y otros (Yadav et al., 2015; Yang & Yue, 2012), lo que hace de estas plantas importantes fuentes de productos naturales.

Debido a lo anterior, esta investigación buscó identificar el posible potencial insecticida o antialimentario de tres especies de Meliaceae, a saber, Carapa guianensis, Swietenia mahagoni y Swietenia macrophylla, sobre S. frugiperda, teniendo en cuenta la existencia de los dos biotipos y la probable respuesta diferenciada frente a los efectos de estas plantas. Para esto, ensayos insecticidas y antialimentarios fueron realizados con larvas de ambos biotipos usando extractos etanólicos y fracciones derivadas de los extractos tanto de hojas como de tallos de las especies vegetales en cuestión, las cuales fueron analizadas bajo una perspectiva química con la intención de caracterizar algunos de los compuestos posiblemente involucrados en las actividades insecticidas o antialimentarias.

1. Objetivos

1.1 Objetivo general

Evaluar la capacidad controladora y diferenciada de Swietenia macrophylla, S. mahagoni y Carapa guianensis sobre los biotipos de maíz y arroz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) de una colonia de laboratorio.

1.2 Objetivos específicos

• Evaluar comparativamente la actividad insecticida de los extractos etanólicos de hojas de las especies vegetales sobre larvas de los biotipos de maíz y arroz de S. frugiperda.

• Evaluar comparativamente el efecto antialimentario de los extractos etanólicos de hojas de las especies vegetales sobre las larvas de los biotipos de maíz y arroz de S. frugiperda.

• Seleccionar la especie más promisoria de los tres extractos evaluados para identificar los compuestos mayoritarios siguiendo un fraccionamiento biodirigido por la actividad insecticida y antialimentaria sobre las larvas de S. frugiperda.

2. Marco teórico y estado del arte

2.1 Aspectos biológicos de Spodoptera frugiperda

Spodoptera frugiperda hace parte del orden Lepidoptera, de la familia Noctuidae, el cual ha sido señalado como uno de los grupos de plagas de insectos más voraces en una gran cantidad de cultivos (Bohnenblust & Tooker, 2010). Comúnmente, este insecto es conocido en su estado larval como gusano cogollero, debido a que se alimenta del cogollo del maíz, planta a la que afecta significativamente. Además, suele asociársele con el nombre de oruga militar tardía (en inglés fall armyworm) porque cuando las polillas terminan de alimentarse de una planta hospedera se mueven en conjunto, como un bastión militar, hacia otra planta de la que puedan alimentarse.

La distribución de S. frugiperda se extiende desde el sur de Canadá, Estados Unidos, América central, el Caribe, pasando por Colombia, Brasil y Venezuela, hasta llegar al centro de Argentina (Murúa et al., 2008). Es un insecto móvil y polífago que presenta preferencia por las gramíneas, tanto cultivadas como silvestres, dentro de las cuales se han registrado alrededor de 186 especies de plantas de 42 familias como hospederas de este insecto, de las que Poaceae y Fabaceae son las más afectadas (Casmuz et al., 2010). En Suramérica, esta polilla es una de las principales plagas de maíz (Zea mays L.), arroz (Oryza spp.), sorgo (Sorghum spp.), frijol (Phaseolus vulgaris), soya (Glycine max), alfalfa (Medicago sativa) y algodón (Gossypium hirsutum) (Clark et al., 2007; Casmuz et al., 2010). En Colombia ha sido considerada una de las principales plagas del maíz y secundaria en sorgo, algodón, hierbas y pastos (García et al., 2002), siendo reportada por primera vez en 1914 en áreas maiceras del departamento de Antioquia. Actualmente esta plaga se encuentra en todos los departamentos con cultivos de maíz del país y, también, en el departamento del Tolima en plantaciones de algodón y arroz (Vélez-Arango et al.,

8 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

2008). Dada la gran variedad de hospederos que tiene esta plaga y su amplia distribución sus poblaciones suelen ser constantes (García et al., 2002; Torres & Cotes, 2005). Sobre todo, en países de la región tropical como Colombia, este insecto encuentra condiciones favorables, entre las que se destacan temperaturas cálidas y siembra reiterada de cultivos hospederos, que le permiten mantener altas poblaciones a lo largo del año (Alexandratos, 1995). En el caso de países como Argentina o Estados Unidos, S. frugiperda migra constantemente para encontrar condiciones óptimas de desarrollo, que suelen implicar cambios en hospederos y movimiento hacia regiones en Centroamérica y el Caribe, en el caso de los insectos que parten de Estados Unidos, y hacia el norte de Suramérica en el caso argentino. Esto hace del gusano cogollero un insecto de alta adaptabilidad que requiere de complejos sistemas de manejo para evitar pérdidas tan importantes en los cultivos como sucede en Colombia, en donde se han reportado pérdidas de al menos un 35% de la producción de maíz (Vélez-Arango et al., 2008) o en Brasil en donde las pérdidas anuales se acercan a los 400 millones de dólares, siendo responsable de hasta el 50% del daño causado al cultivo de maíz y del mayor uso de insecticidas sintéticos (Souza et al., 2013). Recientemente se ha reportado la presencia de S. frugiperda en diferentes regiones de África, poniendo en peligro los cultivos de maíz y de otros pastizales presentes en el continente (Goergen et al., 2016; Midega et al., 2018); también se reportó en 2018 la presencia de este insecto en India (Sharanabasappa et al., 2018), lo que significa, en últimas, que podría convertirse en una amenaza para la agricultura mundial.

2.1.1 Ciclo de vida de S. frugiperda

El ciclo biológico de S. frugiperda tiene una duración aproximada de 30 días, en verano, de 60 días en primavera y otoño, y de 90 días en invierno. En condiciones favorables este

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insecto puede producir cerca de 12 generaciones anuales. Sin embargo, el número de generaciones variará según las condiciones medioambientales de la región, encontrándose en el norte de Estados Unidos poco más de una generación al año, y en Carolina del Sur, Louisiana y Florida más de cuatro generaciones (Capinera, 2008). En el caso de países suramericanos tropicales y neotropicales, el número de generaciones dependerá de la disponibilidad de los cultivos hospederos de S. frugiperda y las condiciones de lluvias y sequía que se presenten.

El ciclo de vida comienza con la ovoposición de la polilla hembra que deposita en promedio 1.044 ± 391,8 huevos en masas de 100-200 huevos, los cuales eclosionan luego de 2 a 4 días, cuando las temperaturas son favorables (Capinera, 2008; Sharanabasappa, 2018). Las posturas están cubiertas por escamas e hilos de seda de una coloración grisácea que protegen a los huevos (Casmúz et al., 2010), lo que les da una apariencia peluda o mohosa (Capinera, 2008). Los huevos suelen ser planos en la base y redondos en la parte superior, en forma de cúpula. Son generalmente blanquecinos o grisáceos, aunque suelen cambiar de coloración conforme maduran y miden cerca de 0.5 mm de diámetro y 0.3 mm de altura (figura 2-1). Aunque las posturas ocurren generalmente sobre el envés de la hoja de la planta hospedera, esto no siempre sucede, por lo que implica un desplazamiento de las larvas recién nacidas hacia el alimento (Casmúz et al., 2010).

Figura 2-1: Características morfológicas de los huevos de S. frugiperda.

10 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

A, B: MacRae, T. C. (2012). Fall armyworm egg mass [Imagen digital]. Tomadas de https://bugguide.net/node/view/699638.

Al emerger las larvas se alimentan del corión de los huevos, mientras permanecen escondidas entre las hojas, para más tarde alimentarse del follaje hasta llegar al estadio de pupa (Camúz, 2010; Capinera, 2000). Bohnenblust y Tooker (2010) han reportado que, en el estado larval, S. frugiperda se alimenta de cerca de 140 cm2 de material vegetal para desarrollarse, pasando por seis estadios o instar de desarrollo.

Las larvas de S. frugiperda son de tipo eruciforme, es decir que tienen una cabeza bien formada y diferenciada del cuerpo, el cual está constituido por tres segmentos torácicos y diez segmentos abdominales, con el noveno y el décimo fusionados. Durante el primer instar las larvas poseen un cuerpo de color verde pálido y una cabeza negra. Al pasar al segundo instar, su cuerpo se torna más oscuro con la cabeza de color naranjado. A medida que la larva crece, el dorso se hace marrón con líneas laterales blancas o naranjas pálidas, que son características de la especie (figura 2-2 A, B). Entre el cuarto y el sexto instar la cabeza se torna marrón con tres líneas pálidas, en forma de Y invertida, debido a la sutura entre los dos epicráneos que la forman, las cuales sirven de guía para diferenciar a S. frugiperda de otras especies como el gusano elotero del maíz (Helicoverpa zea) o el

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gusano soldado (Mythimna unipuncta) (figura 2-3 B) (Costa, Ide & Simonka, 2006). Asimismo, las larvas maduras de S. frugiperda tienen en su parte dorsal puntos negros con espinas o sedas (pináculos) que sobresalen del cuerpo (Capinera, 2008; Sharanabasappa, 2018). En el último segmento se presentan cuatro pináculos formando un cuadrado (Degrande, 1998) (figura 2-3 A). La epidermis larval tiene apariencia granular o rugosa, aunque al tocarla no se sienta así por la ausencia de microespinas.

Las larvas de S. frugiperda son polípodas. Estas cuentan con tres pares de patas verdaderas o torácicas en los primeros segmentos del cuerpo, seguidos de dos segmentos sin apéndices, y luego cuatro pares de patas falsas o espuripedios contiguos a dos segmentos sin patas y un último par de espuripedios. Las piezas bucales de S. frugiperda son de tipo hipognata, dispuestas de forma perpendicular al cuerpo, con una sutura epicraneal larga (Costa, Ide & Simonka, 2006). Las longitudes del cuerpo de las larvas de S. frugiperda a lo largo de los seis estadios reportadas son 1,7; 3,5; 6,4; 10,0; 17,2 y 34,2 mm, respectivamente. Así como el ancho de la cabeza en cada estadio es: 0,35; 0,45; 0,75; 1,3; 2,0 y 2,6 mm. Además, se ha determinado la duración de cada instar, a una temperatura de 25°C, siendo 3,3; 1,7; 1,5; 1,5; 2,0 y 3,7 días, respectivamente (Capinera, 2008).

Figura 2-2: Características morfológicas de las larvas de S. frugiperda. A. Larva de primer instar. B. Larva madura.

12 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

A: Buss, L. J. Newly hatched larva of the fall armyworm, Spodoptera frugiperda (J. E. Smith). [Imagen digital] Tomada de http://entnemdept.ufl.edu/creatures/field/fall_armyworm.htm. B: Childs, K. [Imagen Digital]. Tomada de http://mothphotographersgroup.msstate.edu/species.php?hodges=9666

A diferencia de los primeros estadios, en donde las larvas se alimentan durante todo el día, las larvas maduras se alimentan solo en la noche (Sparks, 1979). Esto puede entenderse por la tendencia al canibalismo de S. frugiperda al principio del ciclo que asegura una vida solitaria de las larvas maduras, a veces encontrándose solo una larva por planta, eliminando la competencia. Si bien se han encontrado implicaciones negativas del canibalismo en los insectos como la transmisión de patógenos por el consumo de congéneres infectados, el riesgo atribuido a la defensa del ataque de otras larvas y la posible reducción del fitness, los beneficios parecen ser mayores al aumentarse la probabilidad de sobrevivir y la tasa de desarrollo. También se ha especulado que al reducirse la población por vía del canibalismo el riesgo de depredación y/o parasitismo disminuye (Chapman et al., 2000).

Figura 2-3: Rasgos característicos de S. frugiperda que permiten su identificación. A. Pináculos negros en el último segmento que forman un cuadrado. B. Y invertida que

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permite diferenciar a S. frugiperda (Fall armyworm, FAW) de Mythimna unipuncta (Armyworm, AWM) y Helicoverpa zea (Corn earworm, CEW).

A: Dress. [Imagen Digital]. Tomada de https://texasinsects.tamu.edu/fall-armyworm/. B: [Imagen Digital]. Tomada de https://www.pioneer.com/home/site/us/agronomy/crop-management/corn-insect-disease/fall- armyworm.

Durante el periodo de pre-pupa las larvas dejan de comer, se encogen y se tornan de color marrón brillante. La pupa tiene una longitud de 14 a 18 mm y alrededor de 4.5 mm de ancho. El estadio pupal normalmente sucede en el suelo, en donde las larvas se entierran a una profundidad de 2 a 8 cm. Cada larva construye un capullo suelto con seda y partículas de suelo; la duración de este periodo de metamorfosis completa dura entre 8 y 9 días en verano, pero puede alcanzar más de dos semanas en períodos más fríos (Capinera, 2008). A nivel de pupa es posible distinguir el sexo de los futuros adultos, determinando la distancia entre la apertura genital y la ranura anal, la cual es mayor para las hembras (Sharanabasappa, 2018).

Figura 2-4: A. Pupa de S. frugiperda. B. Características sexuales de la pupa.

14 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

A: Bertone, M. Pupae of fall armyworms are typical of many moths - reddish-brown, wiggly and buried in the soil. [Imagen digital] Tomada de http://ncsupdicblog.blogspot.com/2014/08/. B: Sharanabasappa, 2018 (Se tradujeron las etiquetas a español).

Una vez el insecto ha emergido y a medida que madura es fácil distinguir entre hembras y machos. Las hembras poseen alas anteriores de coloración café grisácea que puede ser uniforme o estar levemente moteada (figura 2-5 A). Las alas posteriores son iridiscentes de color blanco o plateado con un borde oscuro y delgado, identificables también en los machos. Por su parte, estos poseen alas anteriores de color gris o café con prominentes manchas blancas cercanas al borde superior del ala y al centro (figura 2-5 B). La envergadura del ala mide entre 32 a 40 mm (Capinera, 2008).

El periodo de preovoposición de las hembras dura de 3 a 4 días y luego ponen huevos incluso hasta después de dos semanas. La duración promedio de la vida de los adultos suele ser de 10 días, pero puede alargarse si las temperaturas son bajas. De esta forma el ciclo completo de S. frugiperda oscila entre 32 y 43 días para las hembras y 34 y 46 días para los machos (Sharanabasappa, 2018).

El apareamiento de los adultos se da generalmente en horas de la noche, con una duración promedio de 130 minutos. Simmons y Marti (1992) han reportado que los machos se aparean 6.7 veces durante su vida y las hembras 3.7 veces. También reportaron que los

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machos se aparean más durante las primeras tres noches después de la emergencia, aunque pueden hacerlo hasta su muerte. La temperatura juega un rol importante en el apareamiento, teniéndose mejores condiciones con temperaturas entre 25 y 30°C, con poca frecuencia de apareamiento a temperaturas menores de 15°C.

Tanto las larvas como los adultos de S. frugiperda son reconocidos por su capacidad migratoria. De los adultos se ha reportado que pueden atravesar distancias de hasta 100 km en una sola noche (Midega et al., 2018), lo que implica un obstáculo importante en el control de esta plaga polífaga.

Figura 2-5: Características morfológicas de adultos de S. frugiperda. A. Hembra. B. Macho.

A, B: Tomadas de Sharanabasappa, 2018.

2.1.2 Hábitos alimenticios y daño a los cultivos

Las larvas de S. frugiperda son normalmente defoliadoras. Recién nacidas consumen la hoja por un solo lado, dejando la otra capa epidérmica sin daños. A medida que pasan al tercer estadio, las larvas consumen de los bordes de la hoja hacia adentro, perforándola. Cuando las larvas son maduras causan defoliación extensiva, dejando solo los tallos y las

16 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

nervaduras de las plantas, lo que les da una apariencia desgarrada (Capinera, 2008). En el caso del maíz, las larvas prefieren plantas jóvenes, consumiéndolas desde el suelo. Cuando las larvas crecen se mueven hacia el cogollo, causando una fila de perforaciones (Casmuz, 2010), por lo que terminan con el sustento energético de la planta. También se ha encontrado a S. frugiperda dañando las mazorcas al consumir los granos (figura 2-6). Los efectos en la mazorca se asemejan a los realizados por el gusano elotero, Helicoverpa zea.

Figura 2-6: Maíz afectado por S. frugiperda. A. Larva de sexto estadio alimentándose de maíz. B. Planta de maíz con daños foliares a causa de S. frugiperda.

A: Goergen, G. [Imagen Digital]. Tomada de https://www.cimmyt.org/es/los-desastres-climaticos-estan-mas- cerca-por-que-nos-olvidamos-de-los-agricultores/. B: 2012. Field Crop Insects. Iowa State University of Science and Technology.

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En el cultivo de algodón S. frugiperda se alimenta de las plantas más pequeñas hasta provocarles la muerte (figura 2-7 A). Cuando la planta madura y el tallo se ensancha el gusano barrena hacia abajo, lo cual se hace evidente en el campo por el número de tallos marchitos. Las larvas también comen los pistilos y las flores, arruinando la capacidad reproductiva de la planta. Este comportamiento se da también en los cultivos de sorgo, soya y alfalfa.

En arroz, las larvas se alimentan de las plantas jóvenes, antes de la inundación del cultivo. Los daños van desde defoliación, corte de las plantas, consumo de las flores y panículas (Casmuz et al., 2010). Cuando el cultivo está inundado las larvas se alimentan de la parte de la planta que está sobre la superficie (Ver figura 2-7 B).

Figura 2-7: Daños de S. frugiperda a hospederos. A. Larva alimentándose del fruto del algodón. B. Infestación de larvas de S. frugiperda en arroz.

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A: Smith, R. [Imagen Digital]. Tomada de: https://www.ipmimages.org/browse/detail.cfm?imgnum=1858073. B: Hummel, N. [Imagen Digital]. Tomada de: https://www.lsuagcenter.com/topics/crops/rice/insects/presentations/10fall-armyworm.

2.1.3 Biotipos de S. frugiperda

Una de las teorías más prominentes de la biología evolutiva actual es la especiación simpátrica, la cual establece que la aparición de dos especies a partir de una puede darse sin una barrera geográfica (Mayr, 2001). Dentro de la teoría evolutiva se reconoce que el proceso de especiación es continuo, siendo posible identificar poblaciones de una misma especie con polimorfismos, poblaciones pertenecientes a diferentes especies, y otras que se encuentran en un intermedio. Es decir que existen individuos que se sitúan en un espectro taxonómico más que en una categoría discreta de especie, los cuales han sido denominados biotipos o razas. Dentro de estos, los biotipos asociados a un hospedero representan uno de los ejemplos más contundentes de la especiación simpátrica. Según Drés y Mallet (2002), los biotipos o razas de hospedero (host races en inglés) son “poblaciones simpátricas de parásitos, genéticamente diferenciados, que afectan diferentes hospederos y entre los que hay un flujo genético apreciable”. Por tanto, las poblaciones que caben dentro de esta definición deben ocurrir en áreas geográficas no aisladas, estar estrechamente ligadas a un hospedero, tener diferencias genéticas más allá de los polimorfismos, pero con cruces que den lugar a cierto porcentaje de híbridos en la naturaleza. Ese “estado” en el proceso de especiación se mantiene hasta que el flujo genético disminuye considerablemente y las poblaciones divergentes pueden considerarse especies distintas.

Uno de los ejemplos de especiación simpátrica es el caso de S. frugiperda, debido a que existen características genéticas, reproductivas y ecológicas que sustentan la hipótesis de que actualmente atraviesa un proceso de especiación, presentada en 1986 por Pashley-

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Prowell, quien identificó dos biotipos en una investigación con aloenzimas. En esta, observó que cada biotipo está asociado a un grupo de plantas hospederas. El que se alimentaba preferentemente de maíz fue denominado Biotipo de maíz, aunque se alimenta también de sorgo y algodón. Por otro lado, el Biotipo de arroz se alimenta de arroz y de otros pastos o gramíneas. En un ensayo electroforético para proteínas realizado por Pashley-Prowell (1986) se identificaron diferencias en la composición de esterasas en muestras de individuos de los dos biotipos, tomadas de distintas regiones de México. A partir de ello se determinó que el biotipo de maíz tenía las esterasas B, C y D y que el biotipo de arroz tenía las esterasas E y F, por lo que la hipótesis sobre la existencia de biotipos de S. frugiperda tomó relevancia.

Investigaciones moleculares adicionales han reportado otras diferencias a nivel genético entre ambos biotipos. Una de ellas se encuentra en la secuencia mitocondrial de los genes ND1 y citocromo oxidasa, que al someterse a una PCR-RFLP con la enzima MspI produce dos fragmentos digeridos de 497 y 72 pb en el biotipo de maíz y ninguna digestión en el biotipo de arroz. También se han encontrado diferencias en las longitudes de algunos polimorfismos y una secuencia de fragmentos homólogos de DNA nuclear que aparece extensivamente en el biotipo de arroz y está ausente en el biotipo de maíz (Groot et al., 2010). A la fecha estos marcadores moleculares son la herramienta más utilizada para la distinción entre biotipos ya que a nivel morfológico no existen diferencias apreciables cuando los insectos están en la fase larval.

En cuanto a la fisiología y desarrollo de S. frugiperda es posible distinguir un aislamiento ecológico, en tanto los biotipos del insecto se han especializado en un grupo de plantas. Esto se ha visto en numerosas investigaciones revisadas por Groot et al. (2010), en donde han reportado que es más probable encontrar larvas del biotipo de arroz alimentándose de maíz que larvas del biotipo de maíz en pastizales. Una investigación adelantada por Pashley-Prowell et al. (2004) con poblaciones de S. frugiperda colectadas en Florida,

20 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

Louisiana, Puerto Rico, Guadalupe y Guayana francesa arrojó que de los individuos encontrados en maíz 19% de ellos eran del biotipo de arroz, mientras que de los colectados en pastizales tan solo el 5% era del biotipo de maíz. Asimismo, un estudio realizado en Colombia por Vélez-Arango et al. (2008) con los marcadores COI y FRa mostró que los individuos del biotipo de maíz se encontraron alimentándose exclusivamente de maíz o algodón, mientras que los individuos del biotipo de arroz se encontraron principalmente en arroz, con baja incidencia en maíz.

Los efectos de alimentarse de un grupo exclusivo de plantas se ven en el plano de lo fisiológico, pues se han encontrado diferencias en los pesos de larvas del biotipo de arroz alimentadas con maíz y con arroz. En algunas investigaciones realizadas por Whitford et al. en 1988 y Pashley-Prowell et al. en 1992 las larvas del biotipo de arroz tuvieron una pérdida significativa de peso al ser alimentadas con maíz. Sin embargo, otros estudios más recientes de Meagher et al. (2004) mostraron que individuos del biotipo de arroz alimentados con maíz ganaron más peso y se desarrollaron más rápido. Para Groot et al. (2010) estas diferencias dan cuenta de la complejidad de la relación hospedero-biotipo que ha de tener en cuenta factores geográficos, co-evolutivos y genéticos. Por otro lado, se ha reportado que las hembras prefieren ovopositar en el hospedero asociado a su biotipo (Whitford et al., 1988).

En términos comportamentales, una de las principales diferencias se presenta en el aislamiento químico entre polillas. Las feromonas, que son los compuestos volátiles encargados de la comunicación de los insectos, no son las mismas para cada biotipo (Pitre, 1986). Un estudio realizado por Groot et al. (2008) en Estados Unidos reportó la composición de feromonas de S. frugiperda, siendo estas Z9-14: OAc, Z11-16: OAc, Z7- 12: OAc, Z9-12: OAc. En este se encontró que el biotipo de arroz tenía una mayor concentración de Z9-12: OAc y Z7-12: OAc. Otra investigación realizada en Louisiana

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determinó que las hembras del biotipo de maíz tenían una mayor concentración del componente Z9-14: OAc y una menor de Z11-16: OAc y Z7-12: OAc, comparadas con las hembras del biotipo de arroz (Groot et al., 2010). Según evidencias, dicha variación en las feromonas tiene efectos en la atracción de los machos. En otra investigación, realizada por Pashley-Prowell, Hammond y Hardy (1992), las hembras del biotipo de maíz atrajeron un 65% de los machos de dicho biotipo y las hembras del biotipo de arroz un 60% de machos de su mismo biotipo. Sin embargo, otros estudios realizados han mostrado que las diferencias en la composición de la glándula de las hembras de S. frugiperda varían según la regiones geográficas, teniendo un efecto en la atracción de los machos (Marr et al., 2009). Esto se ha visto recientemente corroborado por Unbehend et al. (2014) en una investigación realizada en Norte y Suramérica donde se encontró que las plantas hospederas podrían jugar un rol determinante en la atracción de machos, influenciando el mecanismo de las feromonas. En ese caso, los machos del biotipo de maíz fueron atraídos diferencialmente por uno de los componentes más importantes, Z7-12: OAc, dependiendo de la región geográfica; en el caso de los machos de biotipo de arroz tales diferencias no se encontraron.

Por otro lado, una investigación llevada a cabo en Colombia reportó que existen diferencias en cuanto al tiempo de emisión de las feromonas en cada biotipo, lo que podría reforzar el aislamiento químico. Según el trabajo de Cañas-Hoyos, Lobo-Echeverri y Saldamando- Benjumea (2017), existe un desfase temporal en la emisión de las feromonas en el que las hembras del biotipo de maíz emiten tres horas después de la escotofase y las del biotipo de arroz seis horas después. Asimismo, en un estudio realizado por Pashley-Prowell, Hammond y Hardy (1992) se reportó que los adultos del biotipo de maíz se aparearon más temprano, en los primeros dos tercios de la noche, mientras que los del biotipo de arroz se aparearon al final de la noche, en el último tercio, evidenciando un aislamiento reproductivo temporal.

22 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

Figura 2-8: Aislamiento reproductivo en los biotipos de S. frugiperda

Tomada de Groot et al., 2010 y traducida al español.

Además, los resultados de Cañas-Hoyos, Lobo-Echeverri y Saldamando-Benjumea (2017) mostraron que las hembras de los biotipos de S. frugiperda emiten 27 compuestos volátiles de los cuales 8 son exclusivos del biotipo de maíz y 11 del biotipo de arroz. Esto puede explicar el aislamiento comportamental encontrado por Saldamando et al. (2014), que consiste en que las hembras del biotipo de maíz se aparean más con machos del biotipo de maíz que de arroz y que las hembras del biotipo de arroz se aparean con ambos. Lo anterior supone un aislamiento químico precigótico en términos de la respuesta diferenciada a las feromonas entre los biotipos y del tiempo de apareamiento (ver figura 2- 8). Si bien las investigaciones realizadas muestran que rara vez las hembras del biotipo de maíz se aparean con los machos del biotipo de arroz, se han encontrado en campo

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individuos híbridos que responden a dos o más marcadores moleculares específicos para biotipo, arrojando un porcentaje de hibridación de al menos 16% (Groot et al., 2010). Esto significa que, aunque la especie no sea panmítica – pues los individuos eligen aparearse en la mayoría de los casos con los de su propia raza–, los biotipos son muestra de una especiación en proceso más que de una terminada.

Por otro lado, se ha reportado un aislamiento reproductivo poscigótico que da cuenta de la viabilidad de la progenie de los biotipos. Trabajos realizados en Colombia han encontrado que los biotipos de este insecto generan híbridos de las generaciones F1 y F2 con baja viabilidad, baja fertilidad y bajo fitness, comparado con las poblaciones de sus parentales en condiciones de laboratorio (Velásquez-Vélez, Saldamando-Benjumea Ríos-Díez, 2011). Estos resultados concuerdan con estudios realizados por Dumas et al. (2015) en los que encontraron una reducción significativa de apareamientos exitosos en F1 y un alto nivel de microsatélites que muestran una distorsión en su transmisión en F2.

Como se ha mencionado, los biotipos de S. frugiperda son irreconocibles morfológicamente a nivel de larva; sin embargo, se han llevado a cabo estudios morfométricos del ala de adultos que han revelado que las hembras de los biotipos difieren significativamente en la forma del ala y los machos difieren en el tamaño, al ser los machos del biotipo de maíz más grandes que los de arroz (Cañas, Márquez & Saldamando, 2014). Las autoras argumentan que las diferencias encontradas en las alas de los adultos podrían ser producto de las preferencias de hospedero de cada uno de los biotipos. Del mismo modo, los estudios morfométricos se presentan como una herramienta complementaria al análisis molecular en la identificación de los biotipos.

Además de las diferencias estructurales entre los biotipos se ha encontrado que estos responden separadamente a insecticidas y otros mecanismos de control. Si bien la mayoría

24 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

de los estudios alrededor de la resistencia de S. frugiperda a insecticidas o cultivos transgénicos no tienen en cuenta la existencia de los biotipos, algunos estudios arguyen la necesidad de considerarlos en la evaluación de mecanismos de control de esta plaga. Particularmente, la investigación realizada por Ríos-Díez et al. (2011, 2012) ha mostrado que los biotipos difieren en su susceptibilidad a insecticidas como lambdacialotrina y metomil y a las endotoxinas de Bacillus thuringiensis Cry 1 Ac y Cry 1 Ab. En un ensayo realizado en 2012, Ríos-Díez, Sigfried y Saldamando-Benjumea mostraron que el biotipo de arroz es más susceptible a las endotoxinas Cry 1 Ac y Cry 1 Ab, comparado con el biotipo de maíz. Al estudiar la heredabilidad de la susceptibilidad a dichas endotoxinas, encontraron que para que la tolerancia a Cry 1 Ac aumentase diez veces se necesitan de 15 a 20 generaciones, mientras que para que aumente la tolerancia a Cry 1 Ab se necesitarían de 47 a 560 generaciones. Estos resultados apoyan lo que Zenner de Polania et al. habían reportado en 2008 y Adamczyk et al. en 1997 con respecto a la susceptibilidad del biotipo de arroz frente a estas endotoxinas.

Por otro lado, Ríos-Díez y Saldamando-Benjumea (2011) publicaron un estudio en el que evaluaron la susceptibilidad de los biotipos de S. frugiperda a los insecticidas comerciales como metomil y lambdacialotrina. Siguiendo la metodología reportada por Morillo y Notz, los investigadores tomaron larvas de ambos biotipos, las dividieron en tres grupos: metomil, lambdacialotrina y el control y las sumergieron durante 30 segundos en soluciones de diferentes concentraciones de cada insecticida. Esto se realizó con diferentes concentraciones para cada insecticida, para calcular la concentración requerida para que el 50% de las larvas muriera (LC50). Todo el procedimiento se realizó con larvas de la línea parental (Po) y de tres generaciones (F1, F2, F3). Los resultados indican que no hay grandes diferencias en las susceptibilidad al metomil entre los biotipos, teniéndose un LC50 de 380.01 ppm para el biotipo de maíz y 445.14 ppm para el biotipo de arroz, en la generación parental, con un aumento en la resistencia al insecticida en las generaciones

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F1, F2 y F3, con una LC50 de 501.37 ppm para el biotipo de maíz y 811.41 ppm para el de arroz en la última generación evaluada. En el caso de la lambdacialotrina, el biotipo de arroz fue más susceptible que el de maíz, con LC50 para la línea parental de 31.36 ppm frente a 45.01 ppm. Sin embargo, se encontró que el biotipo de arroz desarrolló resistencia a este insecticida mucho más rápido que su contraparte, pues se obtuvo un LC50 de 117.52 en F3 frente a 75.33 ppm. Esto da cuenta de una heredabilidad de la resistencia a la lambdacialotrina más alta que al metomil, necesitándose para aumentar diez veces la LC50 6.5 generaciones para el primer insecticida y 11.5 generaciones para el segundo (Ríos- Díez & Saldamando-Benjumea, 2011). Dichos resultados contradicen lo publicado por Busato et al. (2006), quienes reportaron que el biotipo de maíz fue más resistente a la lambdacialotrina, lo cual puede explicarse, siguiendo lo planteado por Ríos-Díez y Saldamando-Benjumea en su artículo de 2011 y Groot et al. (2010) en la revisión de los dos biotipos de S. frugiperda, teniendo en cuenta las variaciones geográficas y de mecanismos de control del insecto y las implicaciones que tiene esto en las poblaciones colectadas en campo.

2.1.4 Estrategias de control de S. frugiperda

Insecticidas

El manejo de S. frugiperda se realiza generalmente con un programa integrado en el que los insecticidas sintéticos son ampliamente utilizados. Sin embargo, también se hace uso de herramientas mecánicas, ecológicas, transgénicas y de control biológico. Dentro de los insecticidas más utilizados se encuentran grupos de compuestos como carbamatos (metomil, carbaril), piretroides (beta-cipermetrina, etofenprox, lambdacialotrina) organofosforados (clorpirifós, diazinón, acefato), pirroles halogenados (clorfenapir) y el dicloro difenil tricloroetano (DDT) (Fernandes et al., 2018; Beley, Huckaba & Foster, 2012; Gist & Pless, 1985; Souza et al., 2013), los cuales son usados, en muchos casos, en

26 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

combinación con fungicidas y fertilizantes (Zandonadi et al., 2017). Cada familia de insecticidas afecta de diferente manera el desarrollo del insecto, ya sea porque inhibe su muda, tiene un efecto antialimentario, neurotóxico, entre otros.

Todas estas familias de insecticidas sintéticos tienen respuestas efectivas en el manejo de S. frugiperda, con porcentajes de mortalidad de más del 80% en los primeros días después de la primera aplicación (Beley, Huckaba & Foster, 2012; Burdet et al., 2017); sin embargo, se ha reportado tanto en el hemisferio sur como norte del continente americano el desarrollo de resistencia a insecticidas sintéticos por parte de diferentes lepidópteros plaga, entre esos S. frugiperda. Los primeros reportes de resistencia a insecticidas de este insecto se remontan a la década de los 70s cuando se publicó un estudio realizado por Young y McMillan (1979) mostrando los niveles de resistencia de S. frugiperda al carbamil. Después de ello, numerosos artículos han reportado la resistencia de S. frugiperda y su heredabilidad a insecticidas como lamdacialotrina, metomil (Adamczyk et al. 1997; Morillo & Notz, 2001; Ríos-Díez & Saldamando-Benjumea, 2011), permetrina, tetrametrina, fluvinato, clorpirifós, sulprofós, malatión, entre otros de tipo piretroide y organofosforado (Georghiou & Lagunes-Tejada, 1989; Yu, 1991). El desarrollo de la resistencia a este tipo de insecticidas ha supuesto aumentar su concentración, incluso, un 100% (Yu, 1991), lo que ha devenido en la readaptación del insecto a estas nuevas concentraciones, generando un círculo vicioso del uso de insecticidas.

Precisamente, algunos reportes sobre la adquisición de resistencia por parte de insectos plaga señalan como principal factor el uso desmedido de los insecticidas en el campo (Lagunes-Tejada, Rodríguez-Maciel & De Loera-Barocio, 2009). Desde el punto de vista bioquímico, se ha señalado que la resistencia a los insecticidas se da principalmente por medios enzimáticos de detoxificación y por cambios en la proteína objetivo de la molécula insecticida. En términos genéticos, se han reportado algunas mutaciones en los genes que

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codifican para las proteínas objetivo de los insecticidas y otras que llevan a la sobreexpresión de otro tipo de proteínas que desensibilizan el insecto ante el plaguicida (Ishaaya, 2000). En el caso de S. frugiperda, un estudio realizado por Carvalho et al. (2013) determinó algunos mecanismos genéticos y bioquímicos de resistencia a insecticidas organofosforados y piretroides. Para ello, colectaron dos grupos de S. frugiperda, uno resistente a organofosforados (OP), proveniente de Minas Gerais, y el otro resistente a piretroides (PYR), proveniente de Mato Grosso, en Brasil. Usando técnicas moleculares para amplificar la secuencia de DNA de los genes de interés, los investigadores encontraron una mutación del gen ace-1, que codifica para acetilcolinesterasa (blanco de los insecticidas organofosforados y carbamatos), en el grupo OP. La mutación dio lugar a tres sustituciones de aminoácidos en la proteína: A201S, G227A y F290V, conocidas por conferir resistencia a otros lepidópteros (Fournier, 2005). Por su parte, en los individuos del grupo PYR, se encontraron mutaciones en uno de los genes que codifica para canales de sodio, reflejadas en los cambios de aminoácidos T929I, L932F y L1014F. Estos cambios están relacionados con un tipo de resistencia llamado Knockdown, identificada por primera vez en Musca domestica y asociada al DDT, que confiere resistencia neurológica a los insectos al impedir que el piretroide se una a los canales de sodio (Davies et al., 2007; Zhu et al., 2010). Asimismo, Carvalho et al. (2013) encontraron en los grupos resistentes de S. frugiperda algunas familias de genes sobreexpresadas como glutathion s-transferasas, citocromo P450s y carboxilesterasas, anteriormente reportadas por su rol en el desarrollo de resistencia en otros insectos (Huang et al., 1998).

Los insecticidas sintéticos suponen, además, un problema de daño al ecosistema, al afectar sus interrelaciones en casi todos sus componentes, entre los que se incluye el medio ambiente y un riesgo a la salud humana, dado que las personas forman parte estos ecosistemas. Muchos de los pesticidas usados en la agricultura, y sus derivados, producto de procesos químicos, biológicos y físicos en el entorno, permanecen en el ecosistema

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debido a la dificultad de su biodegradación por su alto contenido de halógenos y metales (Lei et al., 2015; Martínez-Vidal et al., 2009). Estos compuestos generalmente representan un problema para los suelos, aguas y organismos en los que se acumulan. En el caso de los bienes naturales como el hídrico, los pesticidas representan uno de los factores más importantes de su contaminación, tanto para las aguas superficiales como para las subterráneas. Los insecticidas sintéticos suelen representar un riesgo ecotóxico debido a su baja selectividad, sobre todo cuando se trata de organofosforados y carbamatos (Stehle, Bub & Schulz, 2018). Los insecticidas ponen en riesgo tanto la salud humana, al contaminar agua potable, como los organismos acuáticos de aguas dulces y saladas, que luego son consumidos (Kikuchi, Sasaki & Wakayabashi, 2000).

La contaminación de los suelos, por su parte, puede desembocar en problemas a la salud humana, la biodiversidad, así como procesos de desertificación del planeta, en el peor de los casos. Esta contaminación puede tener efectos tanto funcionales como ecológicos, pues muchos de los microorganismos e insectos que lo habitan podrían desaparecer debido a las condiciones tóxicas de su ecosistema. Un ejemplo de ello es el daño a las lombrices de tierra con consecuencias como muerte, disminución en la tasa de reproducción, alteración de su desarrollo, daño en el DNA, entre otros (Shi, Tang & Wang, 2017). Las lombrices de tierra representan un factor importante de la salud del suelo al ser metabolizadoras de materia orgánica, por la que estudios recientes la han utilizado como biomarcador de contaminación. Otro ejemplo de los efectos de la contaminación por pesticidas es la disminución del crecimiento de bacterias fijadoras de nitrógeno por la acumulación de glifosato (herbicida) en el suelo y la inhibición de la transformación del amoniaco en nitritos debido a la presencia de triclophyr (herbicida y fungicida). Asimismo, se ha encontrado que el trifluralin (herbicida) inhibe el crecimiento de microrrizas (Aktar, Sengupta & Chowdhury, 2009).

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En el caso de la bioacumulación y toxicidad en organismos vivos se ha encontrado que los insecticidas no polares, como el DDT, constituyen el mayor grupo de contaminantes bioacumulables, debido a su alta solubilidad en lípidos. Dicha condición implica que, en el caso de ser tóxicos para el organismo, los efectos nocivos sobre el cuerpo permanezcan, incluso, durante años (Schweitzer & Noblet, 2018). La toxicidad de los insecticidas en los organismos vivos suele clasificarse según el mecanismo de exposición. Si la exposición al insecticida es directa, los efectos tienden a ser mayores, dándose generalmente en organismos que se encuentran en el sitio de aplicación del compuesto, como insectos benéficos, hongos e, incluso, la planta hospedera. Dentro de toda la literatura que reporta estos casos, el más conocido es el del DDT, publicado en el famoso libro Primavera Silenciosa de Rachel Carson. El DDT fue usado ampliamente en la década de los 60s y 70s en Estados Unidos como un insecticida de amplio espectro. Este se absorbe rápidamente en el suelo, con una vida media de 20 a 30 años. Rachel Carson encontró que el DDT se acumulaba en diferentes especies de aves, causando un adelgazamiento de la cáscara de sus huevos, lo que terminaba por interrumpir el crecimiento del pichón. Como el DDT, otros compuestos de tipo organofosforado y carbamato han causado daños devastadores a las aves norteamericanas, con pérdidas de al menos 60 millones anuales en las últimas décadas del siglo pasado (Devine & Furlong, 2007). Por otro lado, se han reportado efectos reproductivos en mamíferos expuestos a insecticidas de tipo neonicotoide con afectaciones en el nivel de testosterona y en la calidad de los espermatozoides de los machos. Además, indicadores de la actividad hepática han mostrado que los insecticidas afectaron la formación de los hepatocitos y aumentaron las enzimas hepáticas, características de daños en el hígado (Han, Tian & Shen, 2018).

En cuanto a la exposición humana a insecticidas y pesticidas, se han reportado problemas citogenéticos, carcinógenos, mutágenos y cambios en la bioquímica del cuerpo (Lei et al., 2015). Algunos estudios realizados con sembradores de soya en Brasil mostraron que su

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exposición a herbicidas, fungicidas e insecticidas impacta negativamente la estructura del DNA, cuyo efecto está asociado con la hipermetilación de este y produce una mayor frecuencia de muerte celular (Benedetti et al., 2017). Además, se ha reportado que los agricultores tienen un riesgo más alto de sufrir de mieloma y leucemia, con más de 56 pesticidas clasificados como cancerígenos (Bolognesi, 2003). Algunos marcadores bioquímicos como los niveles de colinesteresa, aspartato y alanina aminotransferasa y alcalino fosfatasa en la sangre han sido utilizados para medir los efectos nocivos de la sobreexposición de insecticidas en agricultores de Pakistán (Hayat et al., 2019).

Control biológico

La mayoría de las estrategias de control biológico de S. frugiperda se han concentrado en potenciar el ataque de sus enemigos naturales. Dentro de estos se encuentran géneros de insectos de las familias Braconidae, Scelionidae, Trichogrammatidae, Ichenumonidae, Vespidae y Coccinellidae que actúan como parásitos de las larvas (Álvarez & García, 1995; Gardner, Noblet & Schwehr, 1984). Uno de los ejemplos más importantes en Estados Unidos son las avispas Cotesia marginiventris y Chelonus texanus de la familia Braconidae y la mosca Archytas marmoratus de la familia Tachinidae (Capinera, 2008).

Los depredadores de S. frugiperda suelen atacar a un grupo amplio de larvas de diferentes familias. Dentro de estos se destacan la tijereta común Labidura riparia (Dermaptera: Labiduridae), el chinche Podisus maculiventris (Hemiptera: Pentatomidae), el chinche pirata Orius insidiosus (Hemiptera: Anthocoridae) y algunos coleópteros de la familia Caribidae (Capinera, 2008). Asimismo, se han reportado algunos nemátodos de la familia Mermithidae (Vélez, 1993) y los hongos Metarhizium rileyi y Entomophthora aulicae (Hamm, 1980; Lezama-Gutiérrez, 2001) como controladores de este insecto. En los últimos años se ha reportado la creación de un biopesticida que tiene como principio activo a

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Metarhizium rileyi; si bien los resultados son prometedores las condiciones ambientales a las que se desarrollan los controladores suponen un problema a resolver antes de su comercialización (Gibralba et al., 2018). Asimismo, la tendencia migratoria de S. frugiperda representa una dificultad importante para el control biológico pues muchos de los organismos utilizados no se desarrollan en las mismas condiciones en las diferentes geografías que habita, por lo que los enemigos naturales del insecto suelen variar.

Dentro de las estrategias de control biológico también se encuentra el uso de baculovirus, entre esos el SfGV (Spodoptera frugiperda Granulovirus) y el SfMNPV (Spodoptera frugiperda Multiple Nucleopolyhedrovirus). Las investigaciones alrededor de estos dos virus han mostrado que tienen alta virulencia y son seguros para vertebrados (Barrera et al. 2011). El SfMNPV es específico para S. frugiperda, causando una disminución en la alimentación, manchas en la piel de la larva y muerte. Aunque las larvas son muy susceptibles a este virus, la susceptibilidad aminora conforme esta crece. Otro factor importante en el uso de virus son las condiciones ambientales a las que estos pueden infectar el hospedero y replicarse (Cisneros et al., 2002). Un estudio realizado en Colombia, por Agrosavia (antes Corpoica), logró estandarizar una formulación de un biopesticida con SfMNPV, de gran capacidad insecticida (Santos et al., 2014).

Si bien el control biológico es una de las herramientas más promisorias en la agricultura, existen algunos factores que limitan su utilización. Uno de ellos es el riesgo que conlleva aumentar los números de una especie en un ecosistema, muchas veces ajeno al organismo controlador, que debe monitorearse por expertos en el tema. Asimismo, los costos y tiempos requeridos para ver los primeros efectos son aspectos en los que los insecticidas sintéticos aún llevan ventaja (Bale, Lenteren & Bigler, 2008). Por lo demás, el control biológico es una estrategia que cada vez gana más terreno en el manejo integrado de plagas a nivel mundial.

32 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

Biopesticidas

Según la FAO (Food Agriculture Organization, de la ONU), un biopesticida es un agente de control pasivo que, a diferencia del control biológico, no busca la plaga activamente. Entre estos agentes se encuentran productos naturales generalmente de origen vegetal o microbiano, estrategias de ecología química y cultivos transgénicos (Dimetry, 2014).

Entre los mecanismos transgénicos está el cultivo de plantas que sintetizan endotoxinas de B. thuringiensis, denominadas Cry. Estas son proteínas paraesporales que actúan como precursores de toxinas. Las investigaciones alrededor de este tipo de moléculas han encontrado que afectan a insectos coleópteros, lepidópteros y hemípteros (Bravo et al., 2015). Algunos estudios han establecido que el mecanismo de las proteínas Cry comienza una vez digeridas por el insecto: estas entran al lumen intestinal y son escindidas por proteasas del intestino para dar lugar a la toxina, formando poros en la pared intestinal al anclarse a la membrana (Pardo-López et al., 2013). Algunos de los genes que codifican para estas proteínas han sido introducidos al genoma de cultivos transgénicos, entre esos maíz, algodón, soya, berenjena y papa (James, 2010). Las células vegetales adquieren, entonces, la capacidad de producir las proteínas Cry y resistir al ataque de ciertos insectos plaga.

Si bien los cultivos de Bt han tenido un gran éxito en el mercado, con más de 50 millones de hectáreas de maíz y algodón Bt sembradas para el año 2010, algunos estudios han empezado a reportar resistencia de los insectos a las toxinas Cry. Entre estos se encuentra S. frugiperda con casos de resistencia en Brasil, Colombia, Estados Unidos, China y otros países (Burtet et al., 2017; Gassmann et al., 2011; Omoto et al., 2016; Ríos-Díez, Sigfried & Saldamando-Benjumea, 2012; Zhang et al., 2011). Se han realizado investigaciones

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moleculares que muestran que la resistencia a las proteínas Cry está vinculada con una mutación en los genes que codifican para las proteínas transportadoras de membrana dependientes de ATP, subfamilia C2, (ABCC2), la cual participa probablemente en la formación de los poros en el intestino del insecto (Banerjee et al., 2017).

Otro biopesticida consiste en el uso de trampas con feromonas u otros semioquímicos que atraen diferencialmente a los insectos (Fleischer et al., 2005). Sin embargo, estas no resultan muy eficientes cuando el número de insectos es grande, por lo que suelen ser usadas como un medio de detección de las especies asociadas a un cultivo en vez del principal método de control (Rajendran, 2005).

Recientemente se ha desarrollado otro sistema con volátiles para el control de S. frugiperda. Llamado push-pull, este método utiliza otras plantas, diferentes del cultivo, es decir, uso de alelopatía para crear un ambiente químico desfavorable para la plaga. Se tienen, entonces, dos grupos de plantas, uno que va entre las plantas del cultivo (Intercrop), con plantas que producen semioquímicos que repelen las polillas, y otro que rodea el cultivo (Bordercrop) con plantas cuyas alelomonas las atraen. Es decir que cada agricultor tendría un monocultivo y un cultivo push-pull. Por el momento este sistema solo se ha ensayado en algunos países africanos en cultivos de maíz (Midega et al., 2018), aunque otras aplicaciones de alelopatía son utilizadas en cultivos agroecológicos alrededor del mundo (Mallik, 2008).

Finalmente, dentro de la investigación en productos naturales se han determinado ciertas plantas con potencial insecticida en contra de S. frugiperda, siendo Azadirachta indica (Neem) la más reconocida (Koul et al., 2004). Esta planta contiene un limonoide llamado azaridachtina que interfiere con el proceso de muda del insecto y, al mismo tiempo, tiene un efecto antialimentario (Maredia, Segura & Mihm, 1992). Asimismo, se han reportado plantas de las familias Meliaceae, Arecaceae, Leguminosae, Cactaceae, Calceolariaceae,

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Labiatae y Verbenaceae con efectos antialimentarios o insecticidas contra S. frugiperda y otros lepidópteros (Céspedes et al., 2000; Céspedes et al., 2005; Guerrero et al., 2014; Muñoz et al., 2013; Viera-Dos Santos et al., 2016).

2.2 Potencial insecticida de compuestos de origen vegetal

El crecimiento de la producción agronómica, con 2.4 mil millones de toneladas al año previstas para 2025, supone el aumento de la aplicación de pesticidas para contrarrestar la amenaza de insectos, microorganismos y plantas que, con la agudización del cambio climático, representan un problema cada vez más grande (Biber-Freundenberger et al., 2016; Dimetry, 2014). Debido a los efectos nocivos de muchos de los pesticidas sintéticos se han expandido las búsquedas de otros métodos de control, una de estas representada por los biopesticidas. Se ha reportado que entre 1997 y 2010 el 20% de los pesticidas aprobados en USA fueron de origen natural (Duke et al., 2013), con tan solo 1% de insecticidas de origen vegetal en el mercado (Dimetry, 2014). En la academia, el aumento de este tipo de investigaciones es evidente. Para 1980 había menos de 100 artículos relacionados con insecticidas de origen vegetal, en contraste con los publicados en 2011, que fueron alrededor de 1100 (Isman, 2017). Si bien las revisiones de especies de plantas con propiedades insecticidas no son consistentes, pues algunas hablan de más de 2500 y otras de poco más de 1000, estas sí reconocen una larga tradición en el uso de la botánica para el control de plagas que ha resurgido luego del auge de los pesticidas sintéticos en el siglo XX (Dimetry, 2014; Gopalakrishnan et al, 2014; Isman, 2017; Velasques et al., 2017). Según Gopalakrishnan et al. (2014), de 1005 plantas con propiedades insecticidas revisadas, 384 son antialimentarias, 297 repelentes, 27 atrayentes y 31 inhibidoras del

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crecimiento. Por su lado, Dimetry (2014) menciona en su revisión que hay al menos 350 compuestos con propiedades insecticidas reportados. Esa baja cantidad de compuestos, frente al número de especies reportadas, da cuenta de lo que Isman y Grieneisen mostraron en un artículo de 2014, en el que después de revisar más de 20000 investigaciones sobre insecticidas botánicos – publicados entre 1980 y 2012 –, encontraron que solo un tercio de estos incluía análisis químicos o caracterización de las muestras probadas. Que la investigación en productos naturales prescinda del análisis químico representa una de las principales barreras en la industrialización y comercialización de este tipo de alternativas.

Cuando se habla de insecticidas botánicos o de origen vegetal, los investigadores concuerdan en que su actividad puede ser tanto insectistática como insecticida, pues se han encontrado nuevos compuestos que no inducen la muerte del insecto, sino que alteran su desarrollo o comportamiento (Isman, 2017). En cuanto a la alteración del desarrollo se reconoce, principalmente, la inhibición del crecimiento y muda; por otro lado, los cambios en el comportamiento agrupan actividades repelentes, deterrentes y antialimentarias (Rattan, 2010).

Dentro de los compuestos insecticidas más importantes de origen vegetal se encuentran las piretrinas, las cuales son terpenoides extraídos de especies del género Chrysanthemum (Dimetry, 2014). Las piretrinas tienen efectos neurotóxicos en los insectos, al interferir con el funcionamiento de los canales de sodio en los axones neuronales, causándoles convulsiones e hiperactividad hasta que mueren (Rattan, 2010). Los polvos de crisantemo han sido usados desde el año 400 D.C para combatir piojos y otros insectos. Actualmente, las piretrinas sirven de plantilla para sintetizar otros compuestos, denominados piretroides, que son menos lábiles en condiciones ambientales (Dimetry, 2014) (ver figura 2-9). Aunque se ha encontrado que las piretrinas y los

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piretroides pueden afectar el sistema nervioso de mamíferos y ser tóxicos para algunos peces, su limitada persistencia en el medio ambiente y biodegradabilidad les han procurado ser el remplazo de insecticidas sintéticos de tipo carbamato y organofosforados (Devine & Furlong, 2007).

Figura 2-9: Piretrina y piretroides.

Como las piretrinas, los compuestos insecticidas de origen vegetal suelen ser metabolitos secundarios, aunque también se han reportado proteínas (Velasques et al., 2017). Dentro de estos, los alcaloides representan una de las familias de compuestos más estudiadas por su potencial pesticida. Algunos de los alcaloides insecticidas más reportados provienen

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del tabaco (Nicotiana tabacum), siendo la nicotina, la nornicotina y la anabasina los más representativos (Dimetry, 2014) (ver figura 2-10). La nicotina, como muchos de los alcaloides, afecta a los insectos al remplazar la acetilcolina, interactuando sobre su receptor en el sistema nervioso (Rattan, 2010). Los efectos de dicho mecanismo antagonista son convulsiones, parálisis, excitación y muerte. Buscando ese efecto insecticida, se han sintetizado compuestos llamados neonicotoides, de los que sobresale el imidacloprid (Matsuda et al., 2001). Sin embargo, como los alcaloides, los neonicotoides suelen tener efecto sobre los neuroreceptores de mamíferos, desencadenando respuestas tóxicas en el organismo (Walia, Saha & Rana, 2014). Otros alcaloides con actividades insecticidas provienen de las familias Melianthaceae, Berberidaceae, Annonaceae,

Apocynaceae, Meliaceae y Piperaceae, entre otras (Barua, Gopalakrishnan & Veer, 2016).

Figura 2-10: Alcaloides insecticidas

Otra de las familias de compuestos más reconocidas por su potencial insecticida es la de los limonoides. Estos son terpenos altamente oxigenados de tipo tetranorterpenoide que se encuentran en las familias Meliaceae y Rutaceae. El primer limonoide aislado fue la limonina, en estudios sobre la acidez de algunos cítricos (Roy & Saraf, 2006). Sin embargo, estos compuestos se asocian principalmente a las especies de Meliaceae por los efectos que tienen sobre algunas familias de insectos (Walia, Saha & Rana, 2014). La gedunina

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fue el primer limonoide de Meliaceae aislado en 1960, la cual tiene un efecto tóxico sobre las larvas de Aedes aegypti y Culex quinquefasciatus, así como sobre algunos lepidópteros (figura 2-11) (Arnason et al., 1987; Gurulingappa et al., 2009).

Figura 2-11: Estructura química de la gedunina y la limonina.

Hasta el momento, se han aislado más de 1600 limonoides de Meliaceae, aunque no todos comparten la actividad insecticida de la gedunina (Fang, Di & Xao, 2011, Roy & Saraf, 2006). De estos, la mayoría de limonoides reportados corresponden a las especies Azadirachta indica y Melia azedarach, ya que ambas especies poseen una alta actividad insecticida y antialimentaria (Senthil-Nathan, 2015). Algunos de los compuestos activos de A. indica incluyen azaridactina, salanina, desacetil-salanina, nimbina y desacetil-nimbina (figura 2-12) (Gopalakrishnan et al., 2014). Se ha reportado que la azaridactina controla 413 especies de insectos de diferentes órdenes, entre esos lepidópteros, dípteros,

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hemípteros, himenópteros y optópteros (Walia, Saha y Rana, 2014). Entre las actividades de la azaridactina están antialimentaria, deterrente, disruptora del desarrollo del insecto, inhibidora de la fecundidad de los huevos, reductora del tiempo de vida de las polillas y esterilizante (Ascher, 1993).

Figura 2-12: Estructura química de algunos limonoides de A. indica

En el caso de M. azedarach se han aislado limonoides como 21-α-acetoxymelianol, meliantriol, melianona, melianol, meliacarpina, y meliartenina (figura 2-13) (Walia, Saha & Rana, 2014). Con efectos similares a los de A. indica, M. azedarach controla insectos de más de 23 especies, siendo los coleópteros los más afectados (Defagó et al., 2009). Asimismo, otras especies de los géneros Swietenia, Carapa, Cedrela, Aphanamixis, Lansium, Sandoricum, Naregamia y Trichillia han sido reportadas como posibles controladoras de insectos (Céspedes et al., 2000; Jiménez et al, 1997; MacKinnon, Durst & Arnason, 1997; Santos et al., 2015; Sarria et al., 2011; Wheeler et al., 2000; Yadav et al., 2015).

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Figura 2-13: Estructura química de algunos limonoides de M. azedarach

Contrario a los alcaloides, los limonoides suelen tener baja toxicidad en mamíferos, causando poca irritación en la piel y las mucosas. Tienen una vida corta en el ambiente y son altamente biodegradables (Dimetry, 2014). Otros metabolitos tipo cumarinas, flavonoides, cromonas, lignanos y terpenos se han reportado como biopesticidas (Xu, Ye & Zhao, 2010). Dentro de estos sobresale el caso de la rotenona, una isoflavona aislada de Deguelia utilis (Fabaceae) que inhibe la respiración celular (Dimetry, 2014). Si bien esta ha sido efectiva en el control de ortópteros, coleópteros, áfidos y lepidópteros, se ha encontrado que es altamente tóxica para mamíferos, incluso al compararla con insecticidas organofosforados y carbamatos (Sahayaraj, 2014). También se han reportado la hidroxinaftoquinona y su acetato contra insectos plaga de 29 especies de 11 órdenes diferentes (Walia, Saha & Rana, 2014). Asimismo, algunos flavonoides como quercetina, lupinifolina y kaempferol han sido estudiados por su control sobre mosquitos (figura 2-14)

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(Barua, Gopalakrishnan & Veer, 2016); también se reconocen los flavonoides rotenona y deguelina por su actividad pesticida, insecticida y anticancerígena (Hail & Lotan, 2004).

Por otro lado, los aceites esenciales han surgido como una estrategia biosostenible con un amplio rango de actividades. Entre esas sobresalen los efectos repelentes y antialimentarios, aunque es posible encontrar aceites altamente tóxicos. Los aceites esenciales están compuestos mayoritariamente por terpenoides tales como hemiterpenoides, monoterpenoides, diterpenoides, politerpenoides y sesquiterpenoides, así como alcoholes, fenoles, éteres, ésteres y aldehídos. Algunas de las plantas reconocidas por el potencial insecticida de sus aceites esenciales son el limoncillo (Cymbopogon winterianus), el eucalipto (Eucalyptus globules), el romero (Rosmarinus officinalis), el vetiver (Chrysopogon zizanioides), el clavo (Syzygium aromaticum) y el tomillo (Thymus vulgaris) e, incluso, el aceite de neem (Tangtrakulwanich & Reddy, 2014).

Figura 2-14. Estructura química de algunos flavonoides con actividad insecticida

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2.3 Familia Meliaceae

La familia Meliaceae está conformada mayormente por árboles y en menor medida por arbustos. Suele llamársele familia Mahogany debido a que algunos de sus miembros son utilizados para producir este tipo de madera. Perteneciente al orden Sapindales, esta familia cuenta con 575 especies en 51 géneros distintos y cuatro subfamilias (Bremer et al., 2009). Algunas de sus especies tienen una importancia significativa en el ámbito de la

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producción de madera, las cuales suelen pertenecer a los géneros Swietenia, Entandrophragma & Cedrela (Kubitski, 2011).

2.3.1 Distribución geográfica y hábitat

Las especies de Meliaceae habitan regiones tropicales y subtropicales en ambos hemisferios. Sin embargo, también se han reportado en ambientes secos en Australia (con especies de Xylocarpus), en los Andes (representadas por especies de Schmardaea) y en los bosques de várzea (con Sandoricum bornéense y Chisocheton amabilis) y regiones montanas en Asia (figura 2-15) (Bremer et al., 2009; Kubitski, 2011; Yadav et al., 2015). En Colombia se han descrito dos subfamilias (Melioideae y Swietenioideae), diez géneros y 79 especies, habitando las regiones amazónica, pacífica y andina (Morales-Puentes, 2009).

Figura 2-15: Distribución geográfica de Meliaceae

Tomada de Laboratorio de Sistemática de Plantas Vasculares de LA Universidad de la República de Uruguay, en www.thecompositaehut.com.

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2.3.2 Morfología

En general, las especies de Meliaceae se caracterizan por tener hojas pinnadas alternadas con ausencia de estípulas y foliolos oblicuos (Yadav et al., 2015). Las flores suelen encontrarse solas o agrupadas en inflorescencias en racimos o espigas; estas pueden ser globulares o tubulares y se asocian con una fuerte fragancia. Las flores son actinomorfas, de 4 a 5 sépalos y 3 a 7 pétalos, libres o parcialmente fusionados. Además, son hermafroditas o unisexuales, con órganos de sexo opuesto rudimentario. Las flores pueden medir entre 0.05 cm, en algunas especies de Aglaia, o más de 10 cm, cuando son tubulares, en algunas especies de Turraea; las flores masculinas siendo más grandes que las femeninas (figura 2-16) (Kubitski, 2011).

Figura 2-16: Flores y frutos de Meliaceae. A. Flor Aglaia odorata. B. Flor de Turraea nilotica. C. Fruto de S. macrophylla. D. Fruto de Disoxylum rufum.

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A, Sunrise, S. Aglaia odorata Lour. Meliaceae: Chinese rice flower. [Imagen Digital].

En: https://www.flickr.com/photos/eddingrid/5906189391.

B, Iseminger, M. The flower of Turraea nilotica. [Imagen Digital].

En: https://botanyphoto.botanicalgarden.ubc.ca/2017/03/turraea-nilotica/.

C, En: https://harneedi.wordpress.com/2018/03/27/sky-fruit-swietenia-macrophylla-that-helps-in-diabetes- mellitus/.

D, Breeden, S. Dehisced fruit. [Imagen Digital].

En: http://keys.trin.org.au/key-server/data/0e0f0504-0103-430d-8004- 060d07080d04/media/Html/taxon/Dysoxylum_rufum.htm.

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Los frutos pueden ser o no carnosos, con semillas no endospérmicas. Aunque los frutos varían considerablemente entre especies, estos suelen tener forma de cápsula, baya, nuez o drupa. Las cápsulas son septicidas (cuando los carpelos se abren a la vez) o loculicidas (cuando se abren los carpelos por separado). Las semillas tienen testa y pueden ser aladas, como en el género Swietenia, con los embriones bien definidos (Ver figura 2-16).

El tallo suele ser cilíndrico, sólido y ramificado, con cavidades de resina. La asociación del parénquima con fibras no septadas permite distinguir tribus dentro de la familia como Turraeeae, Melieae, Trichilieae y Sandoriceae; asimismo, hay ausencia de floema interno, haces corticales y medulares (Yadav et al., 2015). Contrario a los frutos, la madera de las especies suele ser indistinguible, siendo posible diferenciar, basado en esta característica, únicamente especies de los géneros Aphanamixis, Astrotrichilia, Azadirachta, Cipadessa, Ekebergia, Melia, Nymania, Owenia, Sandoricum, Turraeanthus y Vavaea (Kubitski, 2011).

2.3.3 Importancia económica

Las especies de la familia Meliaceae son usadas principalmente como fuentes de madera. Dentro de estas, las más relevantes en el mercado son aquellas pertenecientes al género Swietenia, conocidas como Mahogany (caoba en español). Este tipo de madera ha sido comerciado desde el siglo XVIII. Inicialmente, S. mahagoni era la principal fuente de este tipo de madera, pero el uso desmedido de esta ha terminado por casi extinguirla en el ámbito comercial. Actualmente, casi toda la madera proviene de S. macrophylla, con al menos 150000 ha sembradas y 70000 a 140000 m3 comercializados anualmente (Lugo & Fu, 2003). Sin embargo, S. macrophylla ha entrado recientemente en el Libro rojo de plantas de Colombia, que recopila la lista de especies vegetales amenazadas por su explotación (Cárdenas & Salinas, 2007). Otro tipo de madera de Meliaceae, comercializado

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desde India hasta Australia, es producido a partir de las especies Toona ciliata, Cedrela odorata, Entandrophragma sapele, E. utile y Lovoa (Kubitski, 2011).

Por otro lado, algunos aceites de meliáceas se utilizan en áreas de la medicina y de la industria del jabón. Las semillas de Melia azadirachta se utilizan para producir el aceite “margossa” que tiene importante demanda para tratar enfermedades como el reumatismo. Otros aceites como el de Carapa guianensis son usados como iluminantes, antiinflamatorios y bases de productos de belleza. Asimismo, algunas especies como A. indica y M. azedarach son utilizadas como plantas ornamentales y árboles de sombra (Kubitski, 2011). En el espectro medicinal se reconocen actividades antiparasitarias, astringentes, insecticidas, vomitivas, febrífugas, entre otras (Morales-Puentes, 2009).

2.3.4 Fitoquímica

Como ya se ha mencionado, la familia Meliaceae es reconocida por sintetizar tetranorterpenoides, denominados limonoides, con algunos reportados por su actividad insecticida. En términos químicos, los limonoides se derivan del esqueleto 4,4,8-trimetil- 17-furanilesteroide (Roy & Saraf, 2006). Los anillos fusionados se nombran A, B, C y D. Generalmente, en la familia Rutaceae los anillos A y B son los modificados, pero en Meliaceae la gran diversidad de limonoides da cuenta de modificaciones en toda la estructura. Según esto, se han clasificado los limonoides de Meliaceae en distintos grupos con al menos 15 tipos (figura 2-18) (Fang, Di & Hao, 2011; Taylor, 1984).

Si bien no se han realizado muchos estudios biosintéticos, se ha propuesto que la ruta de síntesis de los limonoides está emparentada con la ruta de los terpenoides, a partir de la ciclación del escualeno. Se ha especulado que el tirucalano y el eufano pueden ser los últimos precursores de la síntesis de limonoides, los cuales deberán oxidarse y perder la

48 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

cadena lateral del C-17 para que se forme el anillo de furano (figura 2-17) (Roy y Saraf, 2006).

Figura 2-17: Estructura del tirucalano, el eufano y el limonoide prototípico

Además de sus propiedades insecticidas, se ha reportado que los limonoides inhiben el crecimiento de las líneas celulares de cáncer de colon, de pulmón y de piel; entre esos están la limonina, nomilina y sus glucósidos (Roy y Saraf, 2006). Por otro lado, se han estudiado los efectos antimicrobianos de algunos limonoides contra especies de Aspergillus, Saccharomyces, Ustilago, Eschericia, Micrococcus y Bacillus sp. (Paritala et al., 2015). Entre esos se han reportado la gedunina, azaradictina, harrisonina, obacunona, nomilina y entandrofragmina (Champagne et al., 1991). También se han reportado la gedunina y azaradictina como inhibidoras de la α-amilasa, útiles en el tratamiento contra la diabetes (Ponnusamy et al., 2015).

Algunos limonoides de tipo mexicanolido y andirobina han sido estudiados por sus propiedades antidiarreicas, provenientes de especies de géneros como Khaya, Lansium y Carapa (Yadav et al., 2015). Se han reportado, también, efectos de interés farmacológico como antiinflamatorio, antidepresivo, antioxidante, anticonvulsivo, protector gástrico y

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hepático en especies del género Swietenia, Xylocarpus, Naregamia, Azadirachta, Carapa, Ekerbegia, entre otras, con limonoides aislados como swietenolida, swiemahoginas A y B, xylogranatinina, granatoina, cleomiscosina B, fotogedunina y azaridactina (Araújo- Marques, Martins & Agner-Ramos, 2016; Burlano & Cornara, 2017; Koriem, 2010; Yadav et al., 2015).

Además de los limonoides, las plantas de Meliaceae contienen altos porcentajes de ácidos grasos en sus frutos y semillas como el ácido oleico, el ácido palmítico, el ácido linoleico, el ácido palmitoleico, el ácido elaídico y el ácido cis-vaccénico, el cual se encuentra en semillas de Entandraphragma con uno de los porcentajes más altos reportados de una planta (35-50%) (Kleiman & Payne-Wahl, 1984; Novello et al., 2015). Se han encontrado en las semillas alcaloides, taninos, saponinas, antraquinonas, flavonoides y otras grasas como glicerina y escualeno; sin embargo, estos han sido poco caracterizados y su estudio se ha limitado a la evaluación de su presencia o ausencia a partir de marchas fitoquímicas (Naveen et al., 2014). En cuanto a la madera y a las hojas, se han reportado terpenos de 10, 15, 20 y 30 carbonos, así como los flavonoides quercetina, narigenina, myricetina y otras familias de compuestos como flavonas, furanocumarinas, piranocumarinas, con potencial herbicida, y los alcaloides evolitrina, graveolina y kokusagina, con efectos insecticidas sobre coleópteros (Nebo et al., 2014; Vieira et al., 2014).

Figura 2-18: Estructura química de algunos tipos de limonoides

50 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

2.3.5 Descripción de las especies evaluadas

Swietenia macrophylla King

De nombre común caoba, S. macrophylla es un árbol de al menos 30 m de altura y un tronco de 1.5 m de diámetro. Con la copa bien formada, este árbol de hoja perenne es de crecimiento rápido y larga vida. Las hojas son unipinadas o paripinadas, de color verde oscuro. Las flores son pequeñas, con pétalos de color blanco o verdoso, los sépalos son ovados y pequeños. Las flores pueden agruparse en panículas de 10 a 15 cm. Los frutos,

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por su lado, son carnosos en forma de cápsula con 12-16 cm de largo y 8 cm de diámetro; la semilla es grande, alada, de color marrón (figura 2-19) (Kumar et al., 2016).

Figura 2-19: Características de S. macrophylla. A. Flor. B. Fruto. C. Hojas. D. Árbol completo.

A, Mercadante, M. [Imagen Digital]. En https://www.flickr.com/photos/mercadanteweb/8009462254/sizes/l/

B, [Imagen Digital]. En https://www.alibaba.com/product-detail/Swietenia-macrophylla_50035376959.html

C, [Imagen Digital]. En http://hasbrouck.asu.edu/neotrop/plantae/imagelib/imgdetails.php?imgid=185299

D, Big-Leaf Mahogany. [Imagen Digital]. En https://bernheim.org/vanishing-acts-big-leaf-mahogany/

52 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

S. macrophylla es nativa de América, extendiéndose desde el sur de México hasta Brasil. También se ha introducido en algunos países asiáticos. Dentro de los usos que se le da a este árbol el más importante es, sin duda, el aprovechamiento de su madera. La madera de S. macrophylla es la más comercializada dentro de su género e, incluso, dentro de su familia. Sus usos van desde la producción de muebles hasta soporte en construcciones (Kumar et al., 2016). Otros de los usos de S. macrophylla son la comercialización de su resina, la implementación de los taninos como colorantes y su utilización como árbol ornamental (Orwa et al., 2009).

En cuanto a la composición química de S. macrophylla, diversos estudios se han concentrado en purificar y caracterizar limonoides provenientes de las semillas. Dentro de las familias de limonoides aislados resaltan las swietemacrophinas, swietenitinas (limonoides de tipo fragmalina), geduninas, sexomahagoninas (tipo andirobina), swietenolidas, khayasinas, fisinolidas, swieteninas, augustineolidas, swietelimonoides (tipo mexicanolido), entre otros (Cheng et al., 2014; Mootoo et al., 1999; Paritala et al., 2015; Sun et al., 2018; Tan et al., 2009). De las semillas también se ha analizado la composición de ácidos grasos, encontrándose el ácido oleico, el ácido palmítico, el ácido esteárico y el ácido linoleico como principales constituyentes de las fracciones de hexano y de dietiléter (Suliman et al., 2014).

El extracto de las semillas de S. macrophylla se ha asociado con distintas actividades biológicas, entre las que se reportan propiedades antiinflamatorias, efectos antioxidantes, antimutagénicos, antidiabéticos, antidiarreicos, antialimentarios, disuasivos y acaricidas (Cheng et al., 2014). La actividad antimicrobiana ha sido estudiada por Suliman et al. (2013), quienes reportaron la inhibición del crecimiento de las bacterias Staphylococcus aureus, Staphylococcus typhimurium, Pseudomonas aeruginosa, reconocidas por ser resistentes a un gran espectro de antibióticos. El aceite de las semillas inhibió el

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crecimiento a concentraciones entre 10 y 1000 ppm. Asimismo, se ha reportado la actividad de la swietenolida y la 2-hidroxy-3-O-tigloilswietenolida, aisladas de las semillas, sobre S. aureus, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhi, y Salmonella paratyphi, en el que en cada caso la 2- hidroxy-3-O-tigloilswietenolida inhibió más que el control positivo usado (Rahman et al., 2009).

Por otro lado, se ha estudiado el potencial inhibidor del extracto de las semillas de S. macrophylla sobre el virus del dengue (Cheng et al., 2014). En el estudio realizado el swielimonoide B, así como la swietenolida, el acetato de swietenina, la deacetoxi-7α- hidroxigedunina y el 3 metil angolensato, mostraron una inhibición importante de la actividad del virus, en la que se destaca particularmente la producida por el swielimonoide

B con una concentración EC50 de 7,2 ± 1,33 μM. Otro estudio determinó la citotoxicidad de varios limonoides extraídos del fruto de S. macrophylla, entre los que el swieteliacato B se destaca por la inhibición de las líneas celulares de cáncer SW480 (cáncer colorrectal) y

HL-60 (leucemia) con valores para IC50 de 30,6 y 32,9 μM, respectivamente (Sun et al., 2018).

Con respecto a la actividad insecticida de S. macrophylla, se ha reportado el efecto antialimentario de algunos limonoides extraídos de las semillas; de estos la swietenolida, la 6-O-acetylswietenolida, la 3,6-O, O-diacetilswietenolida y la swietemahonina F inhibieron al menos el 70% del consumo de las larvas de cuarto instar de S. frugiperda, al evaluarlas a una concentración de 1000 ppm (Mootoo et al., 1999). También en un estudio realizado por Fowles et al. (2010) evaluaron la inhibición del crecimiento y actividad antialimentaria de los limonoides swietenolida, swietenina, swietemahonina G, 2-hidroxiswietenina y algunos de sus derivados sobre los insectos S. frugiperda, H. zea, Heliothis virescens y Manduca sexta. Estos encontraron que los derivados 3-O-isovalerilswietenolida y 3-O-

54 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

isobutirilswietenolida tuvieron una alta actividad antialimentaria, con valores DC50 de 0.19 y 0.009 ppm en larvas de S. frugiperda. Los demás compuestos mostraron efectos leves a moderados en la inhibición de los insectos, excepto la sweitenolida que tuvo un DC50 de 80.6 ppm con larvas de S. frugiperda (Fowles et al., 2010).

Asimismo, una investigación realizada sobre la composición química del aceite floral de S. macrophylla y de su actividad biológica mostró que los compuestos α-cariofileno y germacreno D, reportados previamente por su efecto deterrente e insecticida sobre Aedes aegypti, Sitotroga cerealella y Sitophilus oryzae (Adjalian et al., 2015; Prieto et al., 2011; Da Silva et al., 2015), se encontraron mayoritariamente en el extracto de las flores (Guo et al., 2016). También, un estudio realizado por Pérez-Flores, Eigenbrode & Hilje-Quiroz (2012) determinó que una fracción rica en alcaloides del extracto de hojas de S. macrophylla causó una disminución en el peso de las larvas de Hypsipyla grandella, aminorando su supervivencia; sin embargo, la caracterización química de los alcaloides no se realizó. Dicho estudio está en consonancia con el realizado por Pamplona et al. (2018), quienes determinaron que la fracción de hexano de las hojas de S. macrophylla, rica en limonoides de tipo fragmalina, inhibió el crecimiento de H. grandella.

Finalmente, S. macrophylla ha mostrado un gran potencial inhibidor de las enzimas fosfolipasas PLA2 involucradas en los edemas y miotoxidad producto de las mordeduras de serpiente. Un trabajo realizado por Preciado et al. (2016) mostró que la catequina, compuesto fenólico extraído de las hojas de S. macrophylla, inhibió las PLA2 en un 89,8%, 81,1% y 74,3%, en ensayos con diferentes relaciones veneno-catequina.

Swietenia mahagoni Jacq

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Swietenia mahagoni, conocida en inglés como small-leaved mahogany, es un árbol perenne mediano, de hasta 30 m de altura y 1 m de diámetro del tronco. La copa del árbol es esférica y el tronco suele estar ampliamente ramificado. Las hojas son paripinadas, alternadas, con 10 a 18 cm de longitud. Los folíolos son de tono brillante y color verde oscuro, tienen forma de lanza y pueden medir hasta 5 cm de largo. Las flores son amarillas verdosas, suelen ser pequeñas, de tan solo 8 mm de ancho, y unisexuadas. Por su parte, el fruto tiene apariencia leñosa y ovalada, en forma de cápsula, mide hasta 10 cm de largo y tiende a ser de color marrón claro. Las semillas son aladas, marrones y de hasta 6 cm de longitud. La corteza es de color gris en los árboles jóvenes, con tendencia al rojo en los árboles maduros. S. mahagoni se diferencia de S. macrophylla porque sus folíolos, frutos y semillas son más pequeños (figura 2-19) (Loupe, Oteng-Amoako & Brink, 2008; Orwa et al., 2009).

Figura 2-20: Características de S. mahagoni. A. Flor. B. Fruto. C. Hojas. D. Árbol completo.

56 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

A, [Imagen Digital]. En http://huertodominicano.blogspot.com/2012/04/la-flor-nacional-de-republica.html

B, [Imagen Digital]. En https://benefitsplantforhealth.blogspot.com/2017/01/Mahogany-as-a-bitter-taste-anti- cancer-antiviral-anti-diabetic-antidepressant-diuretic..html

C, Heckscher, S. Closeup of pinnate leaf showing asymmetrical leaflets. [Imagen Digital] En http://www.phytoimages.siu.edu/imgs/paraman1/r/Meliaceae_Swietenia_mahagoni_23623.html

D, [Imagen Digital]. En http://www.floraofbangladesh.com/2016/06/mahogany-swietenia-mahagoni.html

S. mahagoni es nativa del sur de Florida, Estados Unidos. Como sucedió con S. macrophylla, esta fue introducida en India en el siglo XVIII y comercializada por el valor de

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su madera, la cual fue usada principalmente en la construcción de embarcaciones (Loupe, Oteng-Amoako & Brink, 2008). Su madera es reconocida por su estabilidad y fácil manejo. Sin embargo, su aplicación se ha reducido porque diferentes organizaciones han señalado la especie como amenazada o en peligro de extinción (Americas Regional Workshop, 1998). Otros usos comprenden su utilización como árbol ornamental y el consumo de la corteza en las regiones del Caribe por sus propiedades astringentes, antidiarreicas y como fuente de vitaminas y hierro (Orwa et al., 2009).

Con respecto de la actividad biológica, se ha reportado un alto potencial antialimentario sobre diferentes especies de insectos. En un estudio realizado con los extractos no polares de las hojas de S. mahagoni se comprobó una fuerte actividad repelente y larvicida sobre Culex quinquefasciatus, el vector de la filariasis linfática humana; en este estudio se obtuvo una mortalidad larval del 100% a una concentración de 50 ppm, a las 72 horas de exposición (Adhikari, Singha & Chandra, 2012). Por otra parte, el extracto metanólico presentó una repelencia del mosquito del 100% hasta por 2 horas y 15 minutos. Adicionalmente, se ha determinado que los extractos de diferentes polaridades de las hojas generan mortalidad en las larvas y repelencia en adultos de Culex vishnui, vector del virus causante de la encefalitis japonesa (Adhikari & Chandra, 2012). Además, se ha comparado su acción acaricida sobre Varroa destructor, el ectoparásito obligado de las especies de abejas Apis mellifera y Apis cerana. En la investigación se evidenció que 48 horas después del tratamiento con el extracto etanólico de hojas a una concentración de 500 ppm el 95% de los ácaros que estaban parasitando las colonias de abejas murió (El Zalabani et al., 2012). Asimismo, otro trabajo realizado por los autores indica que S. mahagoni tiene actividad contra el mosquito Anopheles stephensi, uno de los vectores de la malaria. Según estos, el extracto de acetato de etilo de las hojas de la planta causó la muerte del 97% de las larvas de A. stephensi, después de 72 horas de exposición (Adhikari & Chandra, 2014). Por otro lado, se ha reportado que los compuestos swietemahonina G, swietefragmina I y 2-hidroxi-6-deacetoxiswietenina, extraídos de las hojas de S. mahagoni, fueron activos

58 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

sobre larvas de S. littoralis, causando un efecto antialimentario a concentraciones de 300 y 500 ppm (Abdelgaleil, Doe & Nakatani, 2013).

También se ha reportado su potencial controlador de la proteasa del VIH, al usarse el extracto metanólico de la corteza, así como la formación de sincitios en las líneas celulares para leucemia MOLT-4 y MOLT-4/ HIV-1 (Otake et al., 1995). Adicionalmente, se han publicado diferentes estudios sobre características farmacológicas de interés de S. mahagoni como efectos de protección gastrointestinal, antidiabético y antiinflamatorio (Naveen et al., 2014). En cuanto al efecto antidiabético, se reportó que el extracto etanólico de las semillas inhibió la α-amilasa en un 70.33% a una concentración de 200 μg/mL (Li et al., 2005).

Finalmente, su capacidad antimicrobiana ha sido ampliamente reportada. En cuanto a ello, un estudio publicado por Ramanathan et al. (2009) determinó que el extracto metanólico de las semillas de S. mahagoni actúa como inhibidor del crecimiento de Candida albicans, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeroginosa, Streptococcus faecalis y Proteus mirabillase, los cuales son reconocidos como microorganismos de alto impacto en la salud humana. Además, los compuestos swietenolida y 2-hidroxi-3-O-tigloilswietenolida, extraídos de las semillas, han mostrado actividad antibacteriana frente a Haemophilus influenzae y Streptococcus pneumoniae (Rahman et al., 2009).

Carapa guianensis Aublet

Carapa guianensis es un árbol semiperenne, de tamaño mediano a grande, el cual puede alcanzar los 50 m de altura. Es conocido comúnmente como Andiroba y se extiende desde Centroamérica hasta la Amazonía. La copa del árbol es esférica y bien formada. Las hojas son alternadas, paripinadas con folíolos opuestos. Las flores son pequeñas, unisexuadas

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y de color blanco. El fruto tiene forma de cápsula, está conformado por cuatro lóbulos, con dos a cuatro semillas por lóbulo. El fruto es dehiscente, globular y de coloración marrón. La corteza suele ser de color gris, aunque puede tornarse marrón; la corteza inferior es fibrosa, de color rojizo (figura 2-21) (Orwa et al.2009).

Figura 2-21: Características de C. guianensis. A. Flor. B. Fruto. C. Hojas. D. Árbol completo.

A, [Imagen Digital]. En http://www.plantasyhongos.es/herbarium/c/Carapa_guianensis_06.jpg

B, Carapa guianensis. [Imagen Digital]. En http://www.parasperfumers.com/product/andiroba_oil

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C, Pérez, R. Carapa guianensis Fruit Leaf. [Imagen Digital]. En http://hasbrouck.asu.edu/neotrop/plantae/imagelib/imgdetails.php?imgid=185269 D, [Imagen Digital]. En http://www.plantasyhongos.es/herbarium/c/Carapa_guianensis_01.jpg

Como las especies de Swietenia, C. guianensis también es utilizada como planta maderable. Sin embargo, el uso más frecuente que se hace de esta es la extracción de su aceite, llamado comúnmente aceite de andiroba. Dicho aceite es utilizado por sus propiedades cosméticas, antiinflamatorias, analgésicas y repelentes (Henriques & Penido, 2014).

Un estudio realizado por Penido et al. (2005) concluyó que el aceite de C. guianensis, extraído de sus semillas, tiene un efecto antiedematogénico y antialérgico, al ser evaluado sobre ratones C57/Bl10, a quienes se les indujo un edema, y ratas Winstar, como modelo de alergias. Los autores adjudican la actividad del aceite de andiroba a los compuestos 6a- acetoxigedunina, 7-deacetoxi-7-oxogedunina, andirobina, metil-angolensato, gedunina y 6a-acetoxiepoxiazadiradiona, purificados del aceite. Asimismo, se ha estudiado el potencial antioxidante de C. guianensis, al evaluar la citotoxicidad, genotoxicidad y hematotoxicidad de nanoemulsiones del aceite sobre la línea celular de fibroblastos NIH/3T3 y ratones Swiss (Milhomem-Paixão et al., 2017). Según el estudio, no se observó in vivo ningún efecto tóxico, lo que sugiere una ventaja en su aplicación terapéutica y cosmética.

Por otro lado, se ha reportado que los limonoides 7-deacetoxi-7-oxogedunina y β- fotogedunina actúan como inhibidores del crecimiento de S. frugiperda a concentraciones de 50 ppm (Sarria et al., 2011). Esto se evidenció en una prolongación del ciclo larval de la plaga y una reducción en el peso de la pupa de hasta 31 mg, causando, en el caso de la β-fotogedunina, una tasa de mortalidad de 53,3% en la fase larval y 20% en la fase de pupa a la concentración mencionada. Además, el aceite de andiroba y un extracto rico en limonoides de las hojas de la planta fueron probados contra Plasmodium falciparum, la

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especie de protozoo que causa la malaria (Miranda et al., 2012). Con una concentración de 8.2 ppm del aceite y 3.2 ppm del extracto se obtuvo una inhibición del crecimiento de los clones W2 (resistente a cloroquina y susceptible a mefloquina) de P. falciparum. Además, cuando se probaron en los clones Dd2 (resistente a cloroquina, mefloquina y piremetamina) se obtuvo una inhibición de crecimiento del protozoo después de 72 h de 88% en el caso del aceite de andiroba y 82% en el de la fracción rica en limonoides, esto en comparación al 60% de cloroquina. La identificación de los compuestos del aceite de andiroba indicó que en este se encuentran los limonoides 6α-acetoxigedunina, 7- deacetoxi-7-oxogedunina, 7-deacetilgedunina, 1,2-dihidro-3β-hidroxi-7-deacetoxi-7- oxogedunin y andirobina, a los que los autores atribuyen el efecto antiplasmodial de la planta. Lo anterior concuerda con la actividad contra P. falciparum reportadas para las especies de Meliaceae: Azadirachta indica, Carapa odorata, Guarea multiflora, Khaya grandiflora y K. grandifoliola (Bicki et al., 2000; Khalid, Duddeck & Gonzalez-Sierra, 1989; Phillipson & Wright, 1991).

Por otro lado, el aceite de andiroba ha resultado efectivo en contra de las garrapatas de la especie Rhipicephalus sanguineus. Un estudio demostró el efecto neurotóxico del aceite contra esta especie de garrapatas pues al exponer las hembras hubo un cambio estructural en el singanglión (masa de nervios fusionados en las garrapatas implicada en su comportamiento) (Roma et al., 2015). Los autores argumentan que los daños estructurales debido al aceite pueden ser suficientes para impedir las funciones neuronales de estas garrapatas, presentándose como un acaricida biosostenible en el control de dichos ectoparásitos.

C. guianensis también tiene un potencial antialimentario sobre las larvas de la mariposa blanca de la col, Pieris brassicae, gracias al compuesto terpénico orodatona que a una concentración de 1000 ppm provoca tasas antialimentarias de hasta 75% y de mortalidad

62 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

del 50% (Qi et al., 2003). Asimismo, se ha probado su toxicidad contra el gorgojo del maíz, Sitophilus zeamais, al usar el aceite de andiroba a una concentración de 200 ppm y obtenerse un LC50 de 65,22%. Los autores del estudio atribuyen la acción mortífera del aceite a la presencia de triterpenos, flavonoides, cumarinas y los ácidos oleico, palmítico, esteárico y linoleico (Santos, Fernandes & Sousa, 2015).

Otras investigaciones han resaltado el carácter repelente y antialimentario de C. guianensis contra insectos de las familias Calliphoridae y Culicidae. Dentro de esos resulta particularmente importante el efecto del aceite de andiroba sobre Aedes aegypti, el mosquito portador de la fiebre amarilla y del dengue. Prophiro et al. (2012) mostraron que a una concentración de 500 ppm las larvas tuvieron una mortalidad del 100% al contacto directo, una mortalidad del 100% después de recibir durante doce días dosis de menor concentración y que las pupas y los adultos presentaron deformaciones, alterando el ciclo de vida del insecto por completo.

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3. Metodología

3.1 Extracción etanólica del material vegetal

Las tres especies seleccionadas debido a su potencial sobre insectos plaga reportado en la literatura, S. macrophylla, S. mahagoni y C. guianensis, se colectaron en el campus de la Universidad Nacional de Colombia, sede Medellín. Estas especies ya se encuentran identificadas en el catálogo del campus y una muestra testigo de cada una está depositada en el herbario de la Universidad (MEDEL). Para los ensayos se colectó 1 kg de hojas y 1 kg de tallos, los cuales fueron secados a temperatura ambiente y extraídos por percolación con etanol (1 L x 100 g). Cada extracto se concentró por rotaevaporación a presión reducida y a temperaturas no mayores de 50°C. Los extractos secos obtenidos fueron almacenados en la oscuridad y a temperatura de 4°C. En el caso del extracto de tallos se realizó una partición por extracción líquido-líquido con agua (70%) y diclorometano (30%). La partición de diclorometano se concentró por rotaevaporación a presión reducida y a temperaturas no mayores a 50°C.

3.2 Fraccionamiento, purificación y elucidación estructural de compuestos

El fraccionamiento de los extractos se llevó a cabo de forma biodirigida, es decir que la purificación de compuestos y caracterización se realizó solo en las fracciones más promisorias en los ensayos. Inicialmente, los extractos etanólicos de hojas de las especies vegetales se evaluaron en un ensayo insecticida y antialimentario contra S. frugiperda, detallados en el apartado 3.4. Debido al rendimiento de sus extractos, las especies S.

64 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

macrophylla y C. guianensis fueron escogidas para el fraccionamiento y se excluyó S. mahagoni. El fraccionamiento se realizó por cromatografía de columna usando Sílica gel- 60, eluída con solventes orgánicos a gradiente. Las fracciones de hexano y diclorometano de ambos extractos fueron utilizadas en los bioensayos. Adicionalmente, se evaluaron las fracciones de diclorometano de los tallos de ambas especies vegetales. A partir de ello se seleccionó la especie más promisoria en los bioensayos y se llevó a cabo el fraccionamiento y purificación de compuestos mayoritarios por medio de una serie sucesiva de análisis de cromatografía de columna usando Sílica gel-60 y Sephadex L-20 como fases estacionarias. Estas fueron eluídas por medio de solventes orgánicos a gradiente. Las fracciones obtenidas fueron monitoreadas por medio de cromatografía en capa fina (CCF). Para la purificación de los compuestos mayoritarios se usó columnas cromatográficas sucesivas y por último cromatografía preparativa en capa fina.

Las fracciones menos polares ya refinadas, con actividad biológica, se sometieron a cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-EM) para su caracterización. Las muestras se inyectaron en el cromatógrafo de gases Agilent 6890 acoplado a un detector selectivo de masas (5973) con ionización electrónica (EI) a 70 eV. Se utilizó una columna capilar Agilent DB-1MS (30.0m x 320.0µm x 0,25µm). Se inyectaron 3.0 µL de cada muestra usando helio como fase móvil a un flujo de 1.0 mL/min (velocidad lineal 37 cm/s). La inyección se hizo en modo splitless a una temperatura inicial de 70°C sostenida por 2 minutos, la cual se incrementó a razón de 8°C/min hasta 320°C y se mantuvo por 39.25 minutos. Para obtener los datos de masas se fijó la temperatura del detector a 320°C y se hizo el barrido en modo SCAN, con un intervalo de masas entre 30 y 800 umas. Los cromatogramas obtenidos fueron analizados con el software AMDIS y la base de datos espectral de masas NIST (2001).

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Los compuestos purificados fueron caracterizados por medio de espectrometría de resonancia magnética nuclear (RMN) a temperatura ambiente (20-25ºC) utilizando un espectrómetro Bruker Avance DPX-300 MHz. Se corrieron experimentos RMN 1H, 13C y DEPT135 utilizando el software del fabricante de acuerdo con la complejidad del compuesto. Los desplazamientos químicos en los espectros fueron registrados en partes por millón (ppm) sobre la escala δ, y las constantes de acoplamiento (J) se expresaron en Hz.

3.3 Mantenimiento de insectos

Los muestreos de S. frugiperda para obtener los individuos para los bioensayos se llevaron a cabo en el primer semestre de 2017. Las colectas, se realizaron en cultivos de maíz y arroz del departamento de Antioquia y del departamento del Tolima. Las larvas fueron mantenidas en condiciones controladas (24 ± 2°C y 70% HR) hasta la emergencia de los adultos. Estas larvas fueron genotipificados con un método de PCR-RFLP del gen COI y la enzima de restricción MSPI y con la amplificación del gen FR y una PCR-RFLP del gen COI una enzima de estricción SAC para la identificación de los biotipos de maíz y arroz de esta especie en otro proyecto simultáneo. El protocolo de genotipificación se encuentra reportado en Cano-Calle et al. (2015).

Para obtener la primera línea parental de cada biotipo, se ubicaron los individuos adultos vírgenes de cada cultivo en recipientes plásticos de 7.5 L, con una pieza de papel craft para la ovoposición y se alimentaron con una solución 1:1 de agua y miel. Las masas de huevos colectadas se dispusieron en recipientes similares hasta la emergencia de larvas. Las larvas se mantuvieron con una dieta sintética que consiste en una mezcla de 114 g de fríjol, 32 g de levadura, 3 g de ácido ascórbico, 1 g de ácido sórbico, 0.25 g de benzoato

66 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

de sodio y 5 g de agar, según la metodología propuesta por Shorey y Hale (1965). Una vez que las larvas alcanzaron el tercer estadio se ubicaron individualmente en copas plásticas de 1 onza para evitar el canibalismo. La dieta se reemplazó cada 3 días hasta alcanzar el estadio de pupa, para evitar contaminación y presencia de parásitos. Cada pupa fue separada hasta la emergencia de los adultos para iniciar una nueva generación.

3.4 Bioensayos sobre las larvas de los biotipos de S. frugiperda

3.4.1 Ensayo antialimentario

La actividad antialimentaria de las muestras se evaluó con base en la metodología reportada por Huang et al. en 2013, con un método de no-elección. Para ello, se recortaron áreas de cuatro centímetros cuadrados de hojas de lechuga (Lactuca sativa), las cuales fueron sumergidas en las soluciones a evaluar a una concentración de 4000 ppm. Como control positivo se utilizó el pesticida comercial Neemazal® (Azaridactina 0.12 v/v) y como controles negativos se utilizaron el etanol, pues las muestras se diluyeron en este solvente, y el blanco (agua). Después de que el solvente se evaporara de las porciones de hoja de lechuga, se dispuso en una copa de 1 onza una larva de tercer instar (8 días de nacida) y una porción de hoja. Por cada muestra se usaron 10 larvas y se realizaron tres repeticiones, en el caso del biotipo de arroz (n=30), y dos en el caso del biotipo de maíz (n=20). Después de 24 h se midió el área consumida usando el programa ImageJ. El índice 1−푇 antialimentario se calculó según la prueba de Abbott con la ecuación 퐼퐴% = ( ) × 100, 퐶 en donde T es el consumo promedio de la hoja tratada con la muestra y C es el equivalente

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en el control negativo (etanol) (Huang et al., 2013). El ensayo fue realizado en las mismas condiciones del cultivo de los insectos.

3.4.2 Ensayo insecticida

El ensayo insecticida se realizó basado en la metodología de Díaz-Napal y Palacios (2015). Las larvas fueron alimentadas continuamente con las secciones de hoja de lechuga (L. sativa) tratadas con cada una de las muestras a evaluar hasta su muerte o hasta que llegaran a pupa. La mortalidad fue reportada cada 24 h. El ensayo se llevó a cabo en las mismas condiciones del ensayo antialimentario, con control positivo Neemazal®, control negativo (etanol) y el blanco (agua). Cada muestra se evaluó en 10 larvas, con tres réplicas para el biotipo de arroz (n=30) y dos réplicas para el biotipo de maíz (n=20). Asimismo, se reportó el número de días que tardó cada larva en llegar a pupa, si lo hizo, y el número de días que tardó en emerger el adulto. Las muestras se evaluaron a una concentración de 4000 ppm. El porcentaje de mortalidad se calculó siguiendo la ecuación de la mortalidad 푀푇−푀퐶 corregida de Abbott: 푀표푟푡푎푙𝑖푑푎푑 푐표푟푟푒𝑔𝑖푑푎 = ( ) × 100, en donde MT es el 100−푀퐶 porcentaje de mortalidad en el tratamiento y MC es el porcentaje de mortalidad con el control negativo (etanol) (Abbott, 1925).

3.5 Ensayo de inhibición de tirosinasa con la fracción de tallos de S. macrophylla

Se seleccionó la fracción más activa de la especie más promisoria (S. macrophylla) para el ensayo de inhibición de la tirosinasa y así obtener información sobre el mecanismo o los mecanismos de acción involucrados en la actividad biológica. La inhibición sobre la enzima

68 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

tirosinasa se midió siguiendo el método reportado (Muñoz et al., 2007). El sustrato L- tirosina es oxidado a L-DOPA y L-dopaquina, y su producción es seguida espectrofotométricamente a 480 nm. La muestra preparada en buffer fosfato se incuba con la enzima y se inicia la reacción por la adición del sustrato. La absorbancia es seguida cada minuto durante 30 minutos. El incremento de la absorbancia es proporcional a la actividad proteolítica de la enzima. La disminución en la pendiente de la gráfica absorbancia vs. tiempo, comparado con la pendiente de la reacción control, se usó para determinar el porcentaje de inhibición aplicando la ecuación 퐼푛ℎ𝑖푏𝑖푐𝑖ó푛 (%) = 푀 −푀 푐표푛푡푟표푙 푚푢푒푠푡푟푎 × 100, donde Mcontrol y Mmuestra son las pendientes de la gráfica 푀푐표푛푡푟표푙 absorbancia vs tiempo, del control y de la muestra, respectivamente.

El ácido kójico (Lote: 1363411V, Sigma®) a 250 μM fue usado como inhibidor de referencia. Aproximadamente 10 mg de muestra fueron pesados y disueltos en 1 mL de DMSO. Las diferentes concentraciones del extracto evaluadas se prepararon con buffer fosfato. Los resultados son expresados en miligramos equivalentes de ácido gálico por gramo de muestra (mg EAG/g de muestra).

3.6 Análisis estadístico

Se utilizó un análisis de supervivencia para estimar los efectos de los tratamientos en el ciclo de vida de los insectos, en el ensayo insecticida. Los análisis de supervivencia se realizan a partir de curvas Kaplan-Meier, las cuales son un estimado de máxima verosimilitud no-paramétrico de la función de supervivencia que permite tener en cuenta la autocorrelación temporal de cada insecto. De esta forma, se estimó el tiempo en el que cierto evento ocurre para cada insecto (e.g., paso de larva a pupa, paso de pupa a adulto o muerte); así como si existían diferencias significativas en la probabilidad de supervivencia entre insectos sometidos a diferentes tratamientos dentro y entre biotipos. La comparación

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pareada para determinar diferencias significativas entre las curvas de supervivencia de más de dos grupos se realizó mediante el test Log-rank con correcciones para comparaciones múltiples (Benjamini & Hochberg, 1995). Los análisis de supervivencia fueron llevados a cabo en el software R version 3.5.3 (R Core Team, 2019), mediante el paquete survival (Therneau & Grambsch, 2000).

En el caso del ensayo antialimentario, se usó el análisis de varianza de una vía (ANOVA) para evaluar si existían diferencias significativas en la actividad de las plantas evaluadas con respecto a los controles y entre los dos biotipos. En todos los análisis de evaluó la significancia a una probabilidad del 95% (α ≤ 0,05). En los casos en que se presentaron diferencias significativas se usó la prueba de Tukey para definir e identificar los factores entre los que se daban dichas diferencias.

Para el ensayo de inhibición de tirosinasa también se aplicó un ANOVA. Cuando se presentaron diferencias significativas se usó la prueba de Tukey para definir e identificar los factores entre los que se daban dichas diferencias.

70 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

4. Resultados y discusión

Como ya se ha mencionado, el control de S. frugiperda enfrenta diferentes problemas en la actualidad. El primero de ellos – y más importante – es la aparición de la resistencia a diversos insecticidas ampliamente utilizados como lambdacialotrina, metomil, permetrina, tetrametrina, fluvinato, clorpirifós, sulprofós, malatión y otros (Ríos-Díez & Saldamando- Benjumea, 2011; Morillo & Notz, 2001; Adamczyk et al. 1997). Esto ha supuesto el aumento en la frecuencia de uso y concentración de dichos insecticidas, lo que ha terminado por crear un círculo vicioso entre la aparición de la resistencia y el uso reiterativo de pesticidas (Lagunes-Tejada, Rodríguez-Maciel & De Loera-Barocio, 2009; Yu, 1991). Asimismo, otro de los problemas a los que se enfrenta el control no solo de S. frugiperda, sino de otras plagas, son los efectos nocivos al medio ambiente y a la salud que se han reportado para pesticidas de origen sintético y semisintético (Martínez-Vidal et al., 2009; Lei et al., 2015; Stehle, Bub & Schulz, 2018). Por otro lado, la eficiencia de los cultivos transgénicos productores de endotoxinas Cry de B. thuringiensis ha menguado debido a la aparición de tolerancia a este tipo de proteínas en S. frugiperda y otros insectos (Adamczyk et al., 1997; Ríos-Díez, Sigfried & Saldamando-Benjumea, 2012; Zenner de Polania et al., 2008). Este panorama ha llevado a la búsqueda de nuevos controladores de S. frugiperda; sin embargo, dichas investigaciones no han tenido en cuenta la existencia de los biotipos de este insecto que, como han mostrado algunos trabajos realizados, difieren en su susceptibilidad a insecticidas sintéticos como metomil y lambdacialotrina y a las endotoxinas de B. thurigiensis (Busato et al., 2006; Ríos-Díez & Saldamando- Benjumea, 2011).

Teniendo eso en cuenta, esta investigación se propuso evaluar el potencial insecticida y antialimentario de tres especies de Meliaceae – familia reconocida por tener compuestos

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controladores de insectos – a partir de un fraccionamiento biodirigido con el fin de escoger la especie más promisoria y caracterizar algunos de los compuestos posiblemente involucrados en la actividad biológica.

4.1 Fraccionamiento de las especies seleccionadas

Los extractos etanólicos de hojas de las tres especies de Meliaceae escogidas para la investigación, C. guianensis, S. macrophylla y S. mahagoni, fueron evaluados inicialmente con el biotipo de arroz. A partir de dicho ensayo, se descartó a S. mahagoni por su bajo rendimiento, tanto en la prueba antialimentaria como insecticida, como se muestra en los apartados 4.2 y 4.3. Las fracciones de hexano y diclorometano de los extractos etanólicos de las hojas de C. guianensis y S. macrophylla, obtenidas a partir de cromatografía de columna con Sílica gel-60, se evaluaron con ambos biotipos. Esto se realizó porque la polaridad de algunos limonoides, terpenos y otros compuestos, reportados por su posible participación en actividades insecticidas e insectistáticas, se ajusta a la de estos dos solventes (Ayil-Gutiérrez et al., 2018; Céspedes et al., 2005; Mazoir et al., 2008). Asimismo, se eligieron las fracciones de diclorometano del extracto etanólico de tallos de ambas especies para su evaluación con ambos biotipos (figura 4-1).

Los resultados de los bioensayos mostraron que las fracciones de diclorometano de los extractos de tallos de C. guianensis y S. macrophylla fueron las más promisorias por lo que fueron seleccionadas para su fraccionamiento y posterior caracterización química (figuras 4-2 y 4-3).

72 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

Figura 4-1: Fraccionamiento biodirigido de las especies seleccionadas

%SA: porcentaje de supervivencia para el biotipo de arroz, %SM: porcentaje de supervivencia para el biotipo de maíz, %IAA: porcentaje de índice antialimentario para el biotipo de arroz, %IAM: porcentaje de índice antialimentario para el biotipo de maíz.

El fraccionamiento de la partición de diclorometano del extracto de tallos de C. guianensis se realizó por cromatografía de columna, eluída a gradiente. En la figura 4-2 se detallan las fracciones obtenidas. De la quinta fracción se purificó el estigmasterol por decantación con etanol. Las primeras seis fracciones fueron caracterizadas por CG-EM.

Figura 4-2: Fraccionamiento de la partición de diclorometano del extracto de tallos de C. guianensis

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Figura 4-3: Fraccionamiento de la partición de diclorometano del extracto de tallos de S. macrophylla

74 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

En el caso de la fracción de tallos de diclorometano de S. macrophylla, se fraccionó inicialmente por cromatografía de columna, eluída a gradiente, obteniéndose seis fracciones, MT1-6. De ellas, la primera fuera fraccionada mediante cromatografía con Sephadex, en donde la fracción menos polar fue luego fraccionada por cromatografía con Sílica-gel 60, obteniéndose 14 fracciones (MT1.1-MT1.14), las cuales fueron llevadas a CG-EM para su caracterización. De la primera columna pudo purificarse el ß-sitosterol- glucopiranósido por decantación (figura 4-3).

4.2 Ensayo insecticida

A continuación, se consignan los resultados del ensayo insecticida para cada biotipo en las tablas 4-1 y 4-2. Se designa con E. hojas el extracto etanólico de hojas, F. tallos la fracción de diclorometano de tallos y F1 y F2 las fracciones de hexano y diclorometano del extracto etanólico de hojas.

Tabla 4-1: Resultados del ensayo insecticida para el biotipo de arroz

Muestra Mortalidad Mortalidad Supervivencia Duración de Duración de Duración del Larvas (%) Pupas (%) ciclo la fase de la fase de ciclo completo completo (%) larva [días] (± pupa [días] (± [días] (± DE) DE) a DE)

E. hojas 17.24 8.33 75.86 15.33 ± 1.63 10.45 ± 1.01 25.36 ± 1.67 F1 17.24 8.33 75.86 17.25 ± 2.19 9.95 ± 0.90 27.31 ± 1.86 F2 17.24 8.33 75.86 16.29 ± 1.83 10.23 ± 0.69 26.18 ± 1.18

F. tallos 41.38 41.18 34.48 16.94 ± 2.28 10.50 ± 0.71 26.40 ± 1.43 C. guianensis C.

E. hojas 6.89 25.93 68.97 15.52 ± 1.01 10.50 ± 0.76 26.05 ± 1.34 F1 13.79 8.00 79.31 15.96 ± 1.10 10.55 ± 0.83 26.69 ± 1.62 F2 3.45 7.14 89.66 15.86 ± 1.08 10.35 ± 0.98 26.15 ± 1.22

F. tallos 58.62 16.67 34.48 16.67 ± 1.83 10.50 ± 0.85 26.70 ± 1.42 S.macrophylla

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E. hojas 13.79 12.00 75.86 15.88 ± 1.24 10.82 ± 0.85 26.81 ± 1.62 S.mahagoni C- 0 0 100 15.03 ± 0.73 10.14 ± 0.64 25.17 ± 0.85 Blanco 3.44 0 100 15.04 ± 0.88 9.71 ± 0.71 24.75 ± 0.97 C+ 100 - 0 - - - a La duración de la fase de larva contempla el tiempo que tarda una larva hasta llegar a pupa. Por tanto, no se tienen en cuenta las larvas que mueren en esta fase.

Tabla 4-2: Resultados del ensayo insecticida para el biotipo de maíz

Muestra Mortalidad Mortalidad Supervivencia Duración de la Duración de la Duración del Larvas (%) Pupas (%) ciclo completo fase de larva fase de pupa ciclo (%) [días] (± DE) [días] (± DE) completo [días] (± DE)

E. hojas 5.26 22.22 73.68 14.56 ± 1.76 10.13 ± 0.92 24.36 ± 2.17 F1 21.05 20.00 63.16 14.40 ± 1.45 9.83 ± 1.34 24.17 ± 1.89 F2 21.05 53.33 36.84 17.00 ± 1.81 11.14 ± 0.69 27.85 ± 1.95

F. tallos 15.79 37.50 52.63 14.69 ± 1.20 10.45 ± 1.37 24.90 ± 2.55 C. guianensis C.

E. hojas 21.05 53.33 36.84 18.33 ± 2.45 11.57 ± 0.98 30.71 ± 1.70 F1 15.79 25.00 63.16 16.06 ± 1.91 10.75 ± 1.54 26.67 ± 2.90 F2 15.79 37.50 52.63 18.28 ± 1.71 12.09 ± 1.04 30.70 ± 2.71 F. tallos

21.05 26.70 57.89 17.40 ± 2.69 11.42 ± 2.31 28.63 ± 3.58 S.macrophylla C- 0 0 100 13.95 ± 1.47 10.11 ± 1.15 24.05 ± 2.01 Blanco 5.26 0 100 13.94 ± 1.55 9.67 ± 0.94 23.61 ± 2.17 C+ 100 - 0 - -

4.2.1 Efectos sobre la fase larval

Los resultados del análisis de supervivencia realizado muestran que, de las tres especies de plantas evaluadas, tanto S. macrophylla como C. guianensis tuvieron efectos notorios

76 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

sobre el ciclo del insecto, a nivel de larva y de pupa; sin embargo, con importantes diferencias. En términos de la fase larval, se encontró que en ambos biotipos hubo una prolongación cuando se alimentaron con S. macrophylla (Ver figura 4-4). Por otro lado, los resultados del desempeño de las larvas del biotipo de arroz alimentadas con S. mahagoni y C. guianensis muestran que la última alargó el ciclo, mientras que la primera no tuvo efectos significativos. El bajo impacto de S. mahagoni en el ciclo de vida de las larvas de este biotipo concuerda con la baja tasa de mortalidad de larvas y pupas alimentadas con la planta, como se mostrará más adelante. Por esta razón, en el fraccionamiento biodirigido, se excluyó esta planta para el experimento con las larvas del biotipo de maíz, así como su fraccionamiento y posterior evaluación sobre las larvas del biotipo de arroz. Esto resulta interesante si se tiene en cuenta que S. mahagoni ha sido reportada por su efecto antialimentario e insecticida sobre otros lepidópteros como Spodoptera littura, con porcentajes larvicidas de 50% (Ayil-Gutiérrez, 2018), lo cual sugiere una actividad selectiva sobre dicho lepidóptero que podría explorarse en futuras investigaciones.

Figura 4-4: Supervivencia de larvas de ambos biotipos frente a las especies vegetales evaluadas.

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CG: C. guianensis, SM: S. macrophylla, SMh: S. mahagoni, Bl: blanco, C+: control positivo (Neemazal®), C-: control negativo (etanol).

Las curvas de Kaplan-Meier indican que la probabilidad de que una larva alimentada con S. macrophylla o C. guianensis permaneciera en ese estadio aumentaba en función del tiempo. De esta manera, mientras que después de trascurridos 20 días desde el inicio del experimento todas las larvas del control negativo, el blanco y S. mahagoni habían

78 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

empupado, algunas larvas alimentadas con C. guianensis y S. macrophylla se mantenían en la misma fase del ciclo. De estas, algunas pasaron a pupa y otras murieron.

Estos resultados concuerdan con los reportados por Sarria et al. (2011), con respecto a la evaluación de los limonoides ß-fotogedunina y 7-deacetoxy-7-oxogedunina extraídos de las semillas de C. guianensis y evaluados sobre larvas neonatas de S. frugiperda. En dicha investigación, ambos limonoides afectaron el desarrollo de las larvas, prolongando la duración de esta fase en hasta 1.5 días, con respecto al control positivo (gedunina). Si bien las investigaciones realizadas con S. macrophylla frente a S. frugiperda se centran más en el potencial antialimentario, se ha reportado que los limonoides swietenolida, swietenina, swietemahonina G, 2-hidroxiswietenina, extraídos de esta planta, y algunos de sus derivados afectaron el desarrollo de los lepidópteros Heliothis virescens y Manduca sexta, con índices de inhibición de crecimiento de 68% y 43%. Este índice se refiere a la razón a la que la larva aumenta de peso, que da cuenta de la velocidad a la que logra alcanzar el estadio de pupa, por lo que están en consonancia con el alargamiento del ciclo de las larvas de S. frugiperda de esta investigación.

Los efectos sobre el desarrollo del insecto, traducidos en menor peso y estadios larvales más largos, son típicos de los productos naturales que no logran insertarse del todo dentro de la categoría de insecticida, sino que tienen también impactos de tipo insectistático (Isman, 2017). La azadiractina y otros compuestos de especies de Meliaceae pueden ubicarse dentro de esta categoría, pues sus mecanismos de acción sobre insectos no causan efectos neurotóxicos inmediatos (parálisis, convulsiones y muerte) como los de los insecticidas convencionales, sino que afectan la metamorfosis del insecto (Aerts & Mordue, 1997). Además de los efectos hormonales y fisiológicos que derivan de una ingesta de alimento pobre, la prolongación del estadio de larva supone que el insecto sea susceptible por más tiempo a factores de tipo biótico y abiótico presentes en el ecosistema. En este sentido, entre mayor tiempo viva la larva mayor será la probabilidad de morir a manos de

79

depredadores, parásitos y patógenos (Díaz-Napal y Palacios, 2015). Asimismo, la prolongación del estadio larval termina por afectar el fitness del insecto, al desacelerar su ciclo, por lo que el número de generaciones de la plaga se ve claramente afectado (National Research Council, 2002); esto implica que los mecanismos de control como la aspersión de insecticidas sintéticos puedan disminuirse, afectando la velocidad a la que el insecto adquiere resistencia.

La figura 4-5 muestra, en un nivel detallado, lo que se resume en la figura 4-4, esta vez teniendo en cuenta tanto el biotipo como la muestra evaluada (extractos de hojas y fracciones). En este caso, se evidencia que, tanto para el biotipo de maíz como de arroz, la fracción de diclorometano de los tallos de S. macrophylla tuvo un efecto más prominente en la prolongación del estadio larval.

Figura 4-5: Supervivencia de las larvas de ambos biotipos discriminado por extractos y fracciones.

80 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

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CGhojas: extracto de hojas de C. guianensis, CGF1: fracción de hexano del extracto de hojas de C. guianensis, CGF2: fracción de diclorometano del extracto de hojas de C. guianensis, CGtallos: fracción de diclorometano del extracto de tallos de C. guianensis, SMhojas: extracto de hojas de S. macrophylla, SMF1: fracción de hexano del extracto de hojas de S. macrophylla, SMF2: fracción de diclorometano del extracto de hojas de S. macrophylla, SMhhojas: extracto de hojas de S. mahagoni, Bl: blanco, C+: control positivo (Neemazal®), C-: control negativo (etanol). La letra A o M que sucede a las abreviaturas anteriores designa que fue evaluado con el biotipo de arroz (A) o el de maíz (M), así CGhojasA denota el extracto de hojas de C. guianensis evaluado con el biotipo de arroz.

Efecto de las muestras vegetales sobre las larvas del biotipo de arroz

En cuanto al biotipo de arroz, la figura 4-6 muestra cómo respondieron las larvas a los diferentes tratamientos. En esta, las curvas de supervivencia indican que el efecto más prominente en el desarrollo larval es producido por la fracción de diclorometano de los tallos de S. macrophylla. Mientras que a los 20 días todas las larvas del control negativo y del blanco habían pasado a la fase de pupa, 9 de las 30 larvas que consumieron la fracción de los tallos de S. macrophylla continuaban en la fase larval, y de estas, pasados 25 días, 2 continuaron en dicha fase, y luego murieron. Llama la atención que, si bien la fracción del extracto de tallos de S. macrophylla tuvo el mayor efecto sobre el estadio larval, ninguna de las otras muestras provenientes de esta planta afectó notoriamente el desarrollo de las larvas, como sí sucedió con el biotipo de maíz (figura 4-8). Si bien la información reportada en la literatura sobre la fitoquímica de los tallos de S. macrophylla es escasa, se espera que esta sea diferente a la que se reporta para las demás partes de la planta, no solo en términos de los metabolitos sino de sus concentraciones.

Las hojas y los tallos tienen funciones diferentes en la planta y, por tanto, requerimientos diferentes. Factores abióticos como la humedad, la incidencia de rayos UV, la temperatura, la salinidad, así como la presencia de patógenos y depredadores determina la fitoquímica de las diferentes partes (del Valle et al., 2015). En el caso de S. macrophylla evaluaciones con marchas fitoquímicas mostraron que la composición química de los tallos difiere de la

82 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

de las hojas en el porcentaje de fenoles, esteroides y resinas, lo que determina los posibles usos de cada parte de la planta (Arumugasamy, Latha & Sathis-Kumar, 2004).

Por el contrario, todas las fracciones y extractos evaluados de C. guianensis afectaron el ciclo del insecto en su fase larval, al alargarlo (figura 4-6). Si se tiene en cuenta el promedio de días que necesitaron las larvas de cada tratamiento para pasar a pupa, es posible identificar que las larvas alimentadas con C. guianensis tuvieron una fase larval más larga, especialmente las alimentadas con la fracción de hexano del extracto de hojas (F1) con una duración de 17.25 ± 2.19 días, en contraste con 15.03 ± 0.73 y 15.04 ± 0.88 del control negativo y del blanco. Con este tratamiento la duración de la fase larval se alargó en al menos 2 días, comparable con los resultados obtenidos por Sarria et al. (2011) en los que los limonoides ß-fotogedunina y 7-deacetoxy-7-oxogedunina, aislados de C. guianensis, alargaron el ciclo de S. frugiperda en 1.5 días.

Sin embargo, aunque estas fracciones de las hojas de C. guianensis alargaron el ciclo, las larvas lograron pasar a pupa, lo cual es evidente en la baja tasa de mortalidad (17.24%). Lo contrario sucede con la fracción de tallos tanto de S. macrophylla como de C. guianensis, pues las larvas que más vivieron no lograron pasar a pupa, reflejándose en el promedio de días de duración de la fase larval (16.67 ± 1.83 para S. macrophylla y 16.94 ± 2.28 para C. guianensis) y en el porcentaje de mortalidad en la fase larval (58.62 % para S. macrophylla y 41.38 % para C. guianensis), comparados con el 100% de mortalidad del control positivo.

En este sentido, los efectos de los tallos de ambas especies sugieren mecanismos tanto insecticidas como insectistáticos. En el caso de C. guianensis, los resultados apoyan lo encontrado por Sarria et al. (2011), pues la ß-fotogedunina y la 7-deacetoxi-7oxogedunina causaron 40% y 53.3% de mortalidad en las larvas de S. frugiperda, aunque en el caso de la fracción de tallos el ciclo solo se haya alargado en 1 día. Asimismo, se ha reportado que

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el aceite de C. guianensis, rico en limonoides y aceites esenciales, provocó la muerte del 97.5% de las larvas de S. frugiperda cuando se evaluó por contacto (Vieira-Dos Santos et al., 2016). Este resultado se aleja del obtenido con la fracción de tallos de C. guianensis, posiblemente por la concentración del aceite de andiroba – el cual fue evaluado sin diluciones –, así como por la composición de este y por la vía de exposición.

Por otro lado, el porcentaje de mortalidad de la fracción de los tallos de S. macrophylla se ubica dentro de un efecto moderado (58.62%) que, sin embargo, no había sido reportado antes en una evaluación con S. frugiperda u otros lepidópteros, pues los resultados registrados en la bibliografía se restringen al antialimentario.

Figura 4-6: Supervivencia de las larvas del biotipo de arroz

84 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

CGhojas: extracto de hojas de C. guianensis, CGF1: fracción de hexano del extracto de hojas de C. guianensis, CGF2: fracción de diclorometano del extracto de hojas de C. guianensis, CGtallos: fracción de diclorometano

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del extracto de tallos de C. guianensis, SMhojas: extracto de hojas de S. macrophylla, SMF1: fracción de hexano del extracto de hojas de S. macrophylla, SMF2: fracción de diclorometano del extracto de hojas de S. macrophylla, SMhhojas: extracto de hojas de S. mahagoni, Bl: blanco, C+: control positivo (Neemazal®), C-: control negativo (etanol).

En la figura 4-7 pueden apreciarse las diferencias en la tasa de mortalidad de las larvas del biotipo de arroz con los diferentes tratamientos. Resaltan, como se ha mencionado, las fracciones de tallos de C. guianensis y S. macrophylla. Si bien ninguna de las dos fracciones tuvo un efecto comparable al del control positivo (Neemazal®), esto no implica una desventaja en su uso; en primer medida porque las fracciones pueden contener una concentración menor de los compuestos responsables de la actividad, comparada a la concentración de la azaridactina en el Neemazal®, y, en segunda medida, porque se ha reportado que la utilización de mezclas trae ventajas sobre el uso de compuestos puros. Una de ellas es la ampliación de mecanismos de control, ya que pueden confluir efectos neurológicos como fisiológicos, lo que termina por reducir la capacidad del insecto de adquirir resistencia o desarrollar mecanismos de detoxificación (Koul et al., 2004).

Figura 4-7: Mortalidad corregida en larvas para el biotipo de arroz

86 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

CGhojas: extracto de hojas de C. guianensis, CGF1: fracción de hexano del extracto de hojas de C. guianensis, CGF2: fracción de diclorometano del extracto de hojas de C. guianensis, CGtallos: fracción de diclorometano del extracto de tallos de C. guianensis, SMhojas: extracto de hojas de S. macrophylla, SMF1: fracción de hexano del extracto de hojas de S. macrophylla, SMF2: fracción de diclorometano del extracto de hojas de S. macrophylla, SMhhojas: extracto de hojas de S. mahagoni, Bl: blanco, C+: control positivo (Neemazal®), C-: control negativo (etanol).

Efecto de las muestras vegetales sobre las larvas del biotipo de maíz

En el caso del ensayo realizado sobre las larvas del biotipo de maíz, el análisis de supervivencia muestra que todas las fracciones evaluadas de S. macrophylla alargaron la fase larval, en contraste con las larvas sometidas a las fracciones de C. guianensis, de las que tan solo las alimentadas con la fracción de diclorometano del extracto de hojas (F2) sufrieron algún tipo de alteración en dicha fase del ciclo, alargándola 3 días (Ver figura 4- 8). Las demás muestras de esta planta no tuvieron diferencias significativas con el control negativo y el blanco (ver tabla 4-2).

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A diferencia de los resultados obtenidos con el biotipo de arroz, lo máximo que duró la fase larval de un individuo fue 21 días – con un solo caso de 24 días con la fracción de tallos de S. macrophylla –, después de los cuales pasaron mayoritariamente a pupa. Esto se ve de manera clara en los porcentajes de mortalidad que no superan el 21% (figura 4-9). No obstante, los promedios de duración de la fase larval con S. macrophylla fueron mayores a los reportados con el biotipo de arroz.

Mientras que las larvas del biotipo de arroz sometidas a S. macrophylla tardaron en alcanzar la fase de pupa al menos 15.52 ± 1.01 días, las larvas del biotipo de maíz expuestas a estos mismos tratamientos tardaron en empupar al menos 16.06 ± 1.91 días, siendo el promedio de F1 el menor. Por su parte, el extracto de hojas y la fracción de diclorometano (F2) alargaron en mayor medida esta fase en el biotipo de maíz, con 18.33 ± 2.45 y 18.28 ± 1.71 días, en contraste con el control negativo y el blanco, cuyos promedios fueron 13.95 ± 1.47 y 13.94 ± 1.55 días. Además, la fracción de tallos de S. macrophylla alargó la fase larval en tres días. En este sentido, S. macrophylla alargó la fase larval en un máximo de 5 días, siendo dos días lo mínimo con F1, lo que implica, como ya se ha dicho, una mayor susceptibilidad de las larvas a factores bióticos y abióticos del ecosistema que puede derivar en su muerte.

Figura 4-8: Supervivencia de las larvas del biotipo de maíz

88 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

CGhojas: extracto de hojas de C. guianensis, CGF1: fracción de hexano del extracto de hojas de C. guianensis, CGF2: fracción de diclorometano del extracto de hojas de C. guianensis, CGtallos: fracción de diclorometano

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del extracto de tallos de C. guianensis, SMhojas: extracto de hojas de S. macrophylla, SMF1: fracción de hexano del extracto de hojas de S. macrophylla, SMF2: fracción de diclorometano del extracto de hojas de S. macrophylla, Bl: blanco, C+: control positivo (Neemazal®), C-: control negativo (etanol).

Figura 4-9: Mortalidad corregida en larvas para el biotipo de maíz

CGhojas: extracto de hojas de C. guianensis, CGF1: fracción de hexano del extracto de hojas de C. guianensis, CGF2: fracción de diclorometano del extracto de hojas de C. guianensis, CGtallos: fracción de diclorometano del extracto de tallos de C. guianensis, SMhojas: extracto de hojas de S. macrophylla, SMF1: fracción de hexano del extracto de hojas de S. macrophylla, SMF2: fracción de diclorometano del extracto de hojas de S. macrophylla, Bl: blanco, C+: control positivo (Neemazal®), C-: control negativo (etanol).

Desde una perspectiva molecular, los efectos reguladores del crecimiento de los insectos se han relacionado con interferencias en su sistema neuroendocrino. Se ha señalado la irrupción del metabolismo asociado a las hormonas ecdisona y 20-hidroxi-ecdisona, responsables de la muda, como blanco de la inhibición del crecimiento (Muñoz et al., 2013). En el caso de la azaridactina se ha reportado que esta bloquea o retrasa la muda al reducir

90 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

los niveles de la ecdisona o al inhibir la conversión de esta a la 20-hidroxi-ecdisona. Otra alteración de la acción de la ecdisona se da por parte de compuestos que mimetizan su estructura y se unen a los receptores hormonales del insecto, acelerando o interrumpiendo la muda, los cuales se asemejan a los fitoecdisteriodes producidos por las plantas (Guerrero & Rosell, 2005). También se ha señalado la actividad irruptora del crecimiento de limonoides tipo salaninna que afectan la metamorfosis del insecto al alterar la tasa de consumo del alimento; es decir que el retraso en el crecimiento es producto de un efecto antialimentario o digestivo (Koul et al., 2004).

Las diferencias en los efectos sobre la fase larval de S. macrophylla pueden apreciarse mejor en las figuras 4-10 (biotipo de arroz) y 4-11 (biotipo de maíz). En el caso del biotipo de arroz, solo la fracción de tallos tuvo un efecto importante sobre el desarrollo de la fase larval, también con un alto porcentaje de mortalidad (58.62%). Por el contrario, el biotipo de maíz fue susceptible a todas las muestras de S. macrophylla evaluadas, con una prolongación del ciclo evidente que no significó, sin embargo, una alta tasa de mortalidad. Esto implica que sí hay diferencias notables entre la susceptibilidad de ambos biotipos a las muestras de S. macrophylla, tanto a nivel de la regulación del crecimiento de los insectos como en el porcentaje de mortalidad. Por tanto, esta planta tendría efectos diferentes sobre S. frugiperda, debidos a una posible conjunción de mecanismos de acción.

Figura 4-10: Supervivencia de las larvas del biotipo de arroz frente a S. macrophylla

91

SMhojas: extracto de hojas de S. macrophylla, SMF1: fracción de hexano del extracto de hojas de S. macrophylla, SMF2: fracción de diclorometano del extracto de hojas de S. macrophylla.

92 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

Figura 4-11: Supervivencia de las larvas del biotipo de maíz frente a S. macrophylla

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SMhojas: extracto de hojas de S. macrophylla, SMF1: fracción de hexano del extracto de hojas de S. macrophylla, SMF2: fracción de diclorometano del extracto de hojas de S. macrophylla.

En el caso de la mortalidad corregida para la fase larval, la figura 4-12 permite ver que el biotipo de arroz murió más que el biotipo de maíz, al ser sometido al tratamiento con la fracción de tallos de S. macrophylla (58.62%) y C. guianensis (41.38%). Las tasas de mortalidad para las larvas del biotipo de maíz se mantuvieron menores al 25%. Estos resultados son comparables con los reportados por Ríos-Díez, Sigfried y Saldamando- Benjumea, en donde el biotipo de arroz fue más susceptible a la lambdacialotrina y a las endotoxinas de B. thuringensis Cry 1 Ac y Cry 1 Ab, con respecto al biotipo de maíz (2011, 2012).

En el caso de los efectos en el desarrollo del insecto debido a productos naturales no se han encontrado reportes en la literatura que informen sobre dichas alteraciones en relación con los dos biotipos de S. frugiperda. Sin embargo, como se ha mostrado, las larvas del biotipo de maíz vivieron en promedio más días que las larvas del biotipo de arroz, aunque se haya encontrado en este último individuos que vivieron hasta 10 días más que los controles negativos, lo que derivó en su muerte.

Figura 4-12: Porcentaje de mortalidad comparada para ambos biotipos

94 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

CGhojas: extracto de hojas de C. guianensis, CGF1: fracción de hexano del extracto de hojas de C. guianensis, CGF2: fracción de diclorometano del extracto de hojas de C. guianensis, CGtallos: fracción de diclorometano del extracto de tallos de C. guianensis, SMhojas: extracto de hojas de S. macrophylla, SMF1: fracción de hexano del extracto de hojas de S. macrophylla, SMF2: fracción de diclorometano del extracto de hojas de S. macrophylla, SMhhojas: extracto de hojas de S. mahagoni. Bl: blanco, C+: control positivo (Neemazal®), C-: control negativo (etanol).

4.2.2 Efectos sobre el ciclo completo

Los efectos sobre el ciclo completo del insecto se calcularon teniendo en cuenta tanto la duración de la fase larval como de la fase de pupa y, a partir de ello, se construyeron las curvas de supervivencia. La figura 4-13 muestra que, en todos los casos, tanto para el biotipo de arroz como para el de maíz, la planta que más incidencia tuvo sobre el ciclo fue S. macrophylla, seguida de C. guianensis, como anticipan los resultados de la fase larval.

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Sin embargo, los efectos variaron según el biotipo, tanto a nivel de la duración del ciclo como en el porcentaje de mortalidad de los insectos.

Figura 4-13: Supervivencia para el ciclo completo y ambos biotipos

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CG: C. guianensis, SM: S. macrophylla, SMh: S. mahagoni, Bl: blanco, C+: control positivo (Neemazal®), C-: control negativo (etanol).

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Efecto de las muestras vegetales sobre el ciclo completo del biotipo de arroz

Los resultados para el biotipo de arroz se muestran en la figura 4-14. En este caso se ve cómo las larvas de este biotipo tuvieron un desarrollo más largo cuando se alimentaron de C. guianensis y de la fracción de tallos de S. macrophylla. No obstante, tal diferencia en la duración del ciclo se debe principalmente a la fase larval, pues la duración de la fase de pupa no tuvo diferencias significativas con respecto a los controles, como lo muestran los promedios de días que tardaron los adultos de cada tratamiento en emerger, consignados en la tabla 4-1.

Figura 4-14: Supervivencia en el ciclo completo para el biotipo de arroz

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CGhojas: extracto de hojas de C. guianensis, CGF1: fracción de hexano del extracto de hojas de C. guianensis, CGF2: fracción de diclorometano del extracto de hojas de C. guianensis, CGtallos: fracción de diclorometano

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del extracto de tallos de C. guianensis, SMhojas: extracto de hojas de S. macrophylla, SMF1: fracción de hexano del extracto de hojas de S. macrophylla, SMF2: fracción de diclorometano del extracto de hojas de S. macrophylla, SMhhojas: extracto de hojas de S. mahagoni, Bl: blanco, C+: control positivo (Neemazal®), C-: control negativo (etanol).

Si bien las larvas que consumieron la fracción menos polar (F1) del extracto etanólico de las hojas de C. guianensis fueron las que tardaron más en completar el ciclo (27.31 ± 1.86 días, en comparación con 25.17 ± 0.85 y 24.75 ± 0.97 del etanol y del blanco) (figura 4- 14), esto no afectó la tasa de adultos que emergieron, con una supervivencia de 75.86%. Por otro lado, la fracción de tallos de C. guianensis causó una tasa considerable de mortalidad de pupas, con 41.18%, frente a las otras muestras de esta planta que no superaron el 10%. Por su parte, los extractos de hojas y la fracción de tallos de S. macrophylla causaron una tasa de mortalidad de pupas de 25.93 y 16.67%, respectivamente (figura 4-15).

Lo anterior implica que el biotipo de arroz es susceptible a los extractos de tallos de ambas plantas, con efectos tanto a nivel de larva como de pupa, al verse tasas considerables de mortalidad en ambas fases del ciclo. Esto significa que, aun cuando las pupas no se sometieron directamente a los tratamientos, la afectación de las larvas puede no traducirse en muerte en ese estadio sino en la imposibilidad de llegar a adulto, viéndose reflejado en las tasas de supervivencia para estos dos tratamientos (34.38% para ambas). Las larvas sometidas a los demás tratamientos, tanto de C. guianensis como de S. macrophylla, superan el 67% de supervivencia, tal y como se muestra en la figura 4-16.

Figura 4-15: Mortalidad corregida en pupas para el biotipo de arroz

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CGhojas: extracto de hojas de C. guianensis, CGF1: fracción de hexano del extracto de hojas de C. guianensis, CGF2: fracción de diclorometano del extracto de hojas de C. guianensis, CGtallos: fracción de diclorometano del extracto de tallos de C. guianensis, SMhojas: extracto de hojas de S. macrophylla, SMF1: fracción de hexano del extracto de hojas de S. macrophylla, SMF2: fracción de diclorometano del extracto de hojas de S. macrophylla, SMhhojas: extracto de hojas de S. mahagoni.

Figura 4-16: Porcentaje de insectos del biotipo de arroz que sobrevivieron al ciclo completo

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CGhojas: extracto de hojas de C. guianensis, CGF1: fracción de hexano del extracto de hojas de C. guianensis, CGF2: fracción de diclorometano del extracto de hojas de C. guianensis, CGtallos: fracción de diclorometano del extracto de tallos de C. guianensis, SMhojas: extracto de hojas de S. macrophylla, SMF1: fracción de hexano del extracto de hojas de S. macrophylla, SMF2: fracción de diclorometano del extracto de hojas de S. macrophylla, Bl: blanco, C+: control positivo (Neemazal®), C-: control negativo (etanol).

Dentro de los efectos de los diferentes tratamientos que pudieron observarse cualitativamente en el desarrollo de los insectos se encuentran el ennegrecimiento y empequeñecimiento de pupas y larvas y malformaciones en adultos, en alas y torsos, aunque estas aparecieron en menor medida (figuras 4-17 y 4-18). Dichos efectos se han relacionado con interrupciones en el proceso de muda, en la fase de ecdisis y esclerotización causados por compuestos como la gedunina, el triterpeno chechepegenina (reportado en Myrtillocactus geometrizans) y los esteroles peniocerol y macdougalina (aislados de Peumus boldus Molina) sobre S. frugiperda y otros lepidópteros (Céspedes et al., 2005; Silva-Aguayo et al., 2010).

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Figura 4-17: Efectos sobre larvas y pupas del biotipo de arroz

Figura 4-18: Efectos sobre los adultos del biotipo de arroz

Efecto de las muestras vegetales sobre el ciclo completo del biotipo de maíz

Por su parte, en el biotipo de maíz los efectos sobre el ciclo fueron más evidentes. En primer lugar, con las muestras provenientes de S. macrophylla se alargó el ciclo de forma significativa frente a los controles (ver figura 4-19). De esta manera, los promedios más altos de duración del ciclo se dieron con el extracto etanólico de hojas y la fracción F2 (30.71 ± 1.70 y 30.70 ± 2.71 días) y en menor medida, pero igualmente significativo, con

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la fracción de tallos (28.63 ± 3.58 días), con respecto al solvente, 24.05 ± 2.01, y al blanco, 23.61 ± 2.17. Lo que supone una prolongación del ciclo en hasta 6 días. Por su parte, solo la fracción F2 de C. guianensis tuvo un efecto sobre la duración del ciclo de este biotipo, con 27.85 ± 1.95 días de duración, alargándolo casi 4 días.

Figura 4-19: Supervivencia en el ciclo completo para el biotipo de maíz

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CGhojas: extracto de hojas de C. guianensis, CGF1: fracción de hexano del extracto de hojas de C. guianensis, CGF2: fracción de diclorometano del extracto de hojas de C. guianensis, CGtallos: fracción de diclorometano

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del extracto de tallos de C. guianensis, SMhojas: extracto de hojas de S. macrophylla, SMF1: fracción de hexano del extracto de hojas de S. macrophylla, SMF2: fracción de diclorometano del extracto de hojas de S. macrophylla, Bl: blanco, C+: control positivo (Neemazal®), C-: control negativo (etanol).

A diferencia de lo que sucedió con el biotipo de arroz, con el biotipo de maíz las tasas de mortalidad de pupa aumentaron. Particularmente resaltan el extracto etanólico de hojas de S. macrophylla y la fracción F2 de C. guianensis, ambas con 53.33%. Las demás muestras provenientes de S. macrophylla causaron porcentajes de mortalidad de no menos del 25%, como se ilustra en la figura 4-20. Por tanto, no solo el biotipo de maíz se tardó más en completar el ciclo, sino que murió más en la fase de pupa, en relación con el biotipo de arroz. Esto se ve reflejado en la tasa de supervivencia de los insectos del biotipo de maíz que, en general, fue más baja que la de su contraparte (figuras 4-21 y 4-22).

Figura 4-20: Mortalidad corregida en pupas para el biotipo de maíz

CGhojas: extracto de hojas de C. guianensis, CGF1: fracción de hexano del extracto de hojas de C. guianensis, CGF2: fracción de diclorometano del extracto de hojas de C. guianensis, CGtallos: fracción de diclorometano

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del extracto de tallos de C. guianensis, SMhojas: extracto de hojas de S. macrophylla, SMF1: fracción de hexano del extracto de hojas de S. macrophylla, SMF2: fracción de diclorometano del extracto de hojas de S. macrophylla.

Lo anterior implica que los efectos disruptores del metabolismo de muda pueden determinar la emergencia de los adultos, aun cuando las pupas no están directamente expuestas a los diferentes tratamientos.

En cuanto a los porcentajes de supervivencia para el biotipo de maíz, las larvas alimentadas con el extracto de hojas de S. macrophylla y con la fracción de diclorometano de las hojas de C. guianensis tuvieron los porcentajes más bajos (Figura 4-21). Más del 50% de las larvas alimentadas con los demás tratamientos lograron llegar a pupa. Comparados con los resultados arrojados para el biotipo de arroz, las larvas del biotipo de maíz sobrevivieron en menor medida, como puede verse en la figura 4-22. En todos los casos, excepto en el de los tratamientos derivados de los tallos, las larvas de arroz sobrevivieron más que las de maíz. Esto implica que los efectos en ambos biotipos se diferencian al menos en la etapa de desarrollo del insecto que afectan; siendo que el biotipo de arroz murió más en la fase de larva y el biotipo de maíz murió más en la fase de pupa.

Figura 4-21: Porcentaje de insectos del biotipo de maíz que sobrevivieron al ciclo completo

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CGhojas: extracto de hojas de C. guianensis, CGF1: fracción de hexano del extracto de hojas de C. guianensis, CGF2: fracción de diclorometano del extracto de hojas de C. guianensis, CGtallos: fracción de diclorometano del extracto de tallos de C. guianensis, SMhojas: extracto de hojas de S. macrophylla, SMF1: fracción de hexano del extracto de hojas de S. macrophylla, SMF2: fracción de diclorometano del extracto de hojas de S. macrophylla.

Figura 4-22: Porcentaje de supervivencia al ciclo completo para ambos biotipos

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CGhojas: extracto de hojas de C. guianensis, CGF1: fracción de hexano del extracto de hojas de C. guianensis, CGF2: fracción de diclorometano del extracto de hojas de C. guianensis, CGtallos: fracción de diclorometano del extracto de tallos de C. guianensis, SMhojas: extracto de hojas de S. macrophylla, SMF1: fracción de hexano del extracto de hojas de S. macrophylla, SMF2: fracción de diclorometano del extracto de hojas de S. macrophylla.

Los efectos en el desarrollo de los insectos de este biotipo fueron parecidos a los observados con el biotipo de arroz. En ambos aparece un ennegrecimiento de la cutícula en pupas y larvas y malformaciones como empequeñecimiento, endurecimiento o morbidez de los cuerpos (figuras 4-23 y 4-24), característicos de la irrupción en el mecanismo de muda de los insectos.

Figura 4-23: Efectos sobre larvas y adultos del biotipo de maíz

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Figura 4-24: Efectos sobre pupas del biotipo de maíz

El ensayo insecticida ha arrojado resultados que permiten ver diferencias en la susceptibilidad de los dos biotipos de S. frugiperda a la S. macrophylla y C. guianensis. De allí, resalta que el biotipo de arroz murió considerablemente en la fase larval cuando se alimentó con las fracciones de tallos de S. macrophylla y C. guianensis y que el biotipo de maíz vivió casi una semana más cuando fue alimentado con S. macrophylla. Asimismo, las tasas de supervivencia del biotipo de maíz fueron en promedio más bajas pero superiores a las tasas de supervivencia del biotipo de arroz, cuando este se sometió a las fracciones de tallos de S. macrophylla y C. guianensis, que fueron las más bajas de todo el experimento.

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4.3 Ensayo antialimentario

El índice antialimentario calculado con base en el consumo promedio de hoja con el control negativo está consignado en la tabla 4-3. Los valores indican que para ambos biotipos los índices antialimentarios más altos se produjeron cuando las larvas se sometieron a los tratamientos de S. macrophylla.

Los análisis estadísticos post-hoc, con ANOVA y test de Tukey, se realizaron para identificar si había diferencias significativas dentro y entre los grupos de plantas y biotipos y con respecto a los controles. Los resultados de todas las muestras frente a ambos biotipos se consignan en la figura 4-25. En esta es posible identificar superficialmente las diferencias entre ambos biotipos y las dos plantas con efectos más prominentes, a saber C. guianensis y S. macrophylla. En la figura se muestra cómo en los dos biotipos la tendencia de las larvas alimentadas con las muestras de C. guianensis fue a consumir más del 50% de la hoja, en contraste con lo que sucede con S. macrophylla en la que el consumo de la hoja se mantuvo, en la mayoría de los casos, por debajo de 40%. Esto se refleja en el índice antialimentario, en donde las muestras de C. guianensis fueron menores al 40%, excepto en el caso del extracto etanólico de las hojas cuando se usó en las larvas del biotipo de maíz. Por su parte, S. mahagoni, la cual fue evaluada únicamente frente al biotipo de arroz, no mostró mayor efecto antialimentario, con un consumo promedio de la hoja cercano al 70%.

Esto concuerda con lo reportado por Sun et al. (2018) en donde los limonoides extraídos de S. macrophylla swietenolida, 6-acetilswietenolida, 3,3-O,O-diacetilswietenolida y swietemahonina F, evaluados a una concentración de 1000 ppm, causaron en S. frugiperda índices antialimentarios mayores al 70%. La diferencia en la magnitud del efecto antialimentario puede deberse a la concentración de los compuestos involucrados en la actividad en los diferentes tratamientos evaluados, pues esta es menor al tratarse de una

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mezcla. En el caso de C. guianensis, estos valores están en desacuerdo con el carácter repelente que se le atribuye a la planta en las investigaciones realizadas sobre insectos como Aedes aegypti pertenecientes a otras a de las familias Calliphoridae y Culicidae, cuyas larvas al someterse al aceite de andiroba a una concentración de 500 ppm murieron en su totalidad (Prophiro et al., 2012).

Tabla 4-3: Índices antialimentarios para ambos biotipos

Tratamiento % Índice antialimentario (%IA) Biotipo Arroz Biotipo Maíz

E. hojas 11.63 45.88 F1 22.25 18.76 F2 40.38 3.20

F. tallos 9.63 10.36 C. guianensis C.

E. hojas 32.37 39.82 F1 20.92 28.31 F2 4.27 49.57

macrophylla F. tallos 49.20 35.34

S.

E. hojas 11.07 - S.mahagoni C- 0.00 0.00 Blanco -2.99 -1.42 C+ 63.83 63.37

Figura 4-25: Porcentaje de área consumida para ambos biotipos y cada tratamiento

112 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

Efecto antialimentario de las muestras vegetales sobre el biotipo de arroz

En el caso del biotipo de arroz, el mayor índice antialimentario se obtuvo con la fracción de diclorometano del extracto de hojas de C. guianensis (40.38%) y el extracto de tallos de S. macrophylla (49.20%). Al realizar la prueba de Tukey se obtuvo que estos dos

113

tratamientos están cercanos, en términos estadísticos, al índice antialimentario del control positivo (63.83%), como puede verse en la figura 4-26.

Figura 4-26: Áreas consumidas por las larvas del biotipo de arroz

De esta manera, el control positivo se ubica en el grupo a y la fracción de diclorometano (F2) de C. guianensis y la fracción de diclorometano de tallos de S. macrophylla se ubican

114 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

en el grupo ab, con promedios de consumo menores a 20%. Los controles negativos, por su parte, se ubican en el grupo e, compartiéndolo con el extracto de hojas de S. mahagoni y el extracto de tallos de C. guianensis, con porcentajes de área consumida mayores al 60%. Por otro lado, se ubican el extracto de hojas de C. guianensis y su fracción de hexano (F1) (grupo cd) con porcentajes de consumo cercanos al 40% y la fracción de hexano de S. macrophylla entre el 20 y 40% de área consumida, en el grupo bc.

De los resultados se destaca que, como sucede en el ensayo insecticida, es la fracción de tallos el que causó un efecto más prominente en el ensayo antialimentario; sin embargo, un índice antialimentario de 49.20% no es suficientemente alto, sino que se ubica dentro de un rango moderado de actividad, según los valores establecidos en la literatura (Muñoz et al., 2013).

Efecto antialimentario de las muestras vegetales sobre el biotipo de maíz

En cuanto al biotipo de maíz llama la atención que en general fue más susceptible a los diferentes tratamientos, siendo los más efectivos el extracto de hojas de C. guianensis y la fracción de diclorometano (F2) de S. macrophylla, la cual pasó, además, de no surtir ningún efecto sobre el biotipo de arroz, a tener un índice antialimentario de 49.57% con el biotipo de maíz – el más alto de todas las muestras de S. macrophylla –. En el caso de esta planta, todos las muestras aumentaron su efecto con el biotipo de maíz, excepto el extracto de tallos, que se mantuvo en un rango cercano; no obstante, este tuvo un efecto moderado con un índice antialimentario de 35.34% y un porcentaje promedio de hoja consumida por debajo de 40%, como lo indica la figura 4-27.

Los resultados de la prueba de Tukey ubican al control positivo en el grupo c, cercano a la fracción de diclorometano (F2) de S. macrophylla y el extracto de hojas de C. guianensis, en el grupo cd. En los grupos ab y b se ubican los controles negativos y la fracción de diclorometano de las hojas de C. guianensis, con mayor área consumida. Contrario a lo

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que se obtuvo con el biotipo de arroz, todas las muestras de S. macrophylla previnieron que las larvas consumieran más del 50% de la hoja, en comparación con los valores de los controles negativos que superaron en promedio el 60% del consumo.

Figura 4-27: Áreas consumidas por las larvas del biotipo de maíz

Por su parte, mientras que la fracción de diclorometano de hojas de C. guianensis afectó moderadamente al biotipo de arroz (IA 40.38%), el efecto fue casi nulo con el biotipo de maíz (3.20%). Asimismo, el efecto del extracto de las hojas de la planta pasó de ser

116 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

despreciable con el biotipo de arroz (11.63%) a ser moderado con el biotipo de maíz (45.88%). En el caso de la fracción de hexano y de la fracción de diclorometano de tallos no hubo una variación importante en cuanto al efecto antialimentario, el cual fue mínimo con los dos biotipos.

En relación con el efecto antialimentario se han señalado diferentes mecanismos que pueden estar involucrados en su producción. Uno de ellos consiste en el bloqueo de las señales sinápticas de las células gustativas, a un nivel posdigestivo (Arora et al., 2015). También se ha reportado el efecto a nivel de los receptores químicos para glucosa e inositol en la boca de lepidópteros, por parte de sesquiterpenos de tipo drimano, aislados de Drimys winteri (Rattan, 2010; Zapata et al., 2009).

Dado que los insecticidas comerciales como lambdacialotrina y metomil no surten este tipo de efectos, no hay reportadas en la literatura investigaciones que relacionen el efecto antialimentario y la existencia de los dos biotipos de S. frugiperda. Llama la atención que el efecto del Neemazal® fue equivalente para ambos biotipos tanto en el ensayo antialimentario como insecticida. Frente a este panorama, las fracciones de tallos de S. macrophylla y C. guianensis se presentan como una alternativa con selectividad, a potenciar, en el control del biotipo de arroz, por la especificidad de sus efectos insecticidas e insectistáticos. Un controlador de insectos selectivo resulta importante al no afectar a insectos benéficos u otros organismos que estén en el ecosistema de la plaga, incluyendo a los agricultores. Por su parte, la fracción de diclorometano de hojas de C. guianensis (F2) y el extracto de hojas de S. macrophylla podrían llevarse a otras instancias investigativas para el diseño de controladores del biotipo de maíz de S. frugiperda. En cuanto al efecto antialimentario, los resultados lo ubican dentro de lo moderado, siendo S. macrophylla la planta más efectiva frente ambos biotipos.

117

4.4 Ensayo de inhibición de la tirosinasa con la fracción de tallos de S. macrophylla

En la tabla 4-4 se muestran los valores obtenidos con el ensayo de inhibición de la tirosinasa realizado con la fracción de diclorometano de los tallos de S. macrophylla a diferentes concentraciones.

Tabla 4-4: Resultados para el ensayo de inhibición de la tirosinasa con la fracción de tallos de S. macrophylla

Número de réplicas Concentración (ppm) Inhibición % (± DE) RSDa (%) 2 100 11.31 ± 1.676 14.812

3 500 26.25 ± 2.626 10.003

3 1000 30.17 ± 3.860 12.793

2 2500 31.28 ± 3.388 10.833 a RSD= Coeficiente de variación de preferencia. El valor debe ser menor al 20% para que el ensayo se considere significativa.

En la figura 4-28 se muestran los resultados de la inhibición de la tirosinasa con la fracción de tallos de S. macrophylla. Si bien los porcentajes de inhibición no son muy altos, aun cuando la concentración evaluada supera las 1000 ppm, es posible inferir un efecto moderado de la fracción sobre la actividad de esta enzima. Esto puede deberse a la concentración de los compuestos implicados en este mecanismo dentro de la fracción.

La tirosinasa o también llamada polifenoloxidasa (PPO en inglés) es una enzima cuprífera que cataliza las reacciones de síntesis de melanina a través de la hidroxilación de un monofenol y de la conversión del o-difenol correspondiente a la O-quinona (Muñoz et al., 2013). En los insectos, esta se ha relacionado con la metamorfosis, con relación al proceso de ecdisis y esclerotización. Cuando la tirosinasa es inhibida se interrumpe el endurecimiento de la cutícula del insecto, lo que termina por generarle malformaciones que

118 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

obstaculizan su crecimiento, lo que se pudo observar en la etapa de pupas de los experimentos realizados en este trabajo con los tallos de S. macrophylla y en menor medida de C. guianensis (figuras 4-18 y 4-24). Algunas plantas se han reportado por su potencial inhibitorio de la tirosinasa, mostrándose como un blanco promisorio para el control de insectos. Entre esas se encuentran especies con altos porcentajes de inhibición como Calceolaria integrifolia, Buddleia coriacea, Gnaphalium cheiranthifolium, Scheelea princeps y Heterotheca inuloides (Kubo 1997; Chang, 2009).

En términos moleculares se han señalado diferentes grupos de moléculas que participan en la inhibición de la enzima tirosinasa. Entre esos se han reportado flavonoides, polifenoles, estilbenos, cumarinas, lípidos, ésteres y terpenos (Chang, 2009; Muñoz et al., 2013). Los mecanismos de inhibición que involucran este tipo de productos naturales reportados hasta ahora se centran en su capacidad antagonista. El ácido kójico, el cual fue usado como control positivo en este experimento, es el inhibidor de tirosinasa más estudiado hasta ahora; este es un inhibidor competitivo de la actividad monofenolasa de la enzima, es decir de la primera reacción de síntesis de la melanina (Chang, 2009).

En cuanto a los insectos del género Spodoptera, un estudio realizado con la tirosinasa de la hemolinfa de S. littoralis fue inhibida por el ácido kójico (Kim & Uyama, 2005). Sin embargo, como mencionan Muñoz et al. (2013) en su artículo, la función de la tirosinasa en la formación de la cutícula no ha sido del todo elucidada, pues se desconoce en qué momento está activa la enzima en el insecto y si los inhibidores pueden alcanzar la cutícula con concentraciones suficientemente altas para evitar la metamorfosis, cuando estos se ingieren en la dieta.

Por otro lado, algunas especies de Meliaceae han sido evaluadas en la inhibición de tirosinasa. No obstante, no se conocen reportes de esta actividad en S. macrophylla. Una investigación llevada a cabo por Vaibhav y Lakshaman (2012) indicó que el extracto

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metanólico de las hojas de Azadiracta indica tuvo un porcentaje promedio de inhibición de tirosinasa de 10.10, al evaluarse a 1000 ppm. En el caso del extracto metanólico de la corteza de la planta el porcentaje promedio de inhibición fue de 43.59, lo que es comparable con el resultado obtenido para la fracción de tallos de S. macrophylla en esta investigación. Además, en un estudio realizado con el extracto de metanol de las hojas de S. macrophylla se encontró que posee una alta capacidad antioxidante, con un 90.61% de actividad. También, el extracto de hexano y el de diclorometano de S. macrophylla presentaron un porcentaje alto de actividad antioxidante con 84.17% y 89.46% (Tan et al., 2008). Esto resulta relevante si se tiene en cuenta que se ha señalado una posible correlación entre la capacidad antioxidante y el potencial de inhibición de tirosinasa (Chang, 2009).

Figura 4-28: Inhibición de la tirosinasa por tallos de S. macrophylla a diferentes concentraciones.

Las letras diferentes indican diferencia estadísticamente significativa (p<0.05) entre las concentraciones evaluadas según test de comparación múltiple de Tukey.

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4.5 Caracterización química

Debido a las tasas de supervivencia del ciclo completo, a los efectos sobre la duración del ciclo y a los efectos antialimentarios de S. frugiperda, se escogieron las fracciones de diclorometano de tallos de C. guianensis y S. macrophylla para la caracterización química.

Los espectros de masas obtenidos para la fracción de diclorometano del extracto de tallos de C. guianensis y S. macrophylla, a partir de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-EM), fueron comparados con la base de datos espectral NIST. Los compuestos con un porcentaje de similitud entre su espectro de masa y la base de datos superior al 90% se consignaron en las tablas 4-5 y 4-6.

4.5.1 Caracterización química de la fracción de diclorometano del extracto de tallos de C. guianensis

En cuanto a la caracterización química de la fracción escogida de C. guianensis, se obtuvo por medio de CG-EM un grupo de compuestos dentro de los que se encuentran ácidos grasos, terpenos y fenoles, consignados en la tabla 4-5, en la cual están consignados el nombre del compuesto, los fragmentos correspondientes a los picos más prominentes en el espectro y la abundancia relativa del compuesto. En la literatura revisada los reportes sobre la composición química de los tallos y la madera de C. guianensis son muy pocos en comparación con lo encontrado para semillas, flores y hojas de la planta. Se ha reportado para el extracto etanólico de tallos los compuestos: ácidos ursólico, triacontanoico y tetratriacontanoico, los flavonoides naringenina y sciadopitisina, la cumarina scopoletina y el derivado de cumarina cleomicosina, el 3,4-dihidroximeilbenzoato y 2,6-dihidroximetilbenzoato, la (-) catequina, la orodatona y ácido glicerido-1,3-di- benceno-2-octadecilico carbonamina, acido 2,3-dihidroxi-glycerido hexacosanoico (Qi et al., 2004; 2003).

121

Tabla 4-5: Compuestos propuestos para la fracción de diclorometano del extracto de tallos de C. guianensis detectados mediante CG-EM.

Fracción de diclorometano del extracto de tallos C. guianensis Compuesto Fragmento (m/z) Área

29 (129), 41(319), 43(323), 55(212), 57(156), 69(142), 1.3617 70(161), 73(176), 88(999), 101(462)

Miristato de etilo

29 (507), 41(803), 55(728), 67(999), 8(406), 69(422), 2.531 79(383), 81(849), 82(421), 95(589)

Linoleato de etilo

29(227), 41(268), 43(362), 55(233), 57 (217), 69(132), 37.7271 73(156), 88(999), 89(136), 101(559)

Palmitato de etilo 29 (180), 41(227), 43(328), 55(220), 57(213), 69(129), 3.0671 73(160), 88(999), 89(145), 101(596)

122 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

Margarato de etilo

29(146), 41(200), 43(339), 55(226), 57(213), 69(139), 16.1695 88(999), 89(200), 101(559), 312(203)

Estearato de etilo

41(488), 43(999), 55(398), 57(597), 60(705), 61(460), 0.9436 71(348), 73 (316), 102(777),

256(547)

Palmitato de isopropilo

41(694), 43(506), 55(999), 69(736), 83(654), 84(462), 10.5543 88(634), 96(465), 96(465), 97(531), 101(510)

123

Oleato de etilo

29(938), 41(999), 43(688), 55(995), 60(599), 83(624), 1.9404 88(943), 101(640), 155(542), 157(575)

9-oxononanoato de etilo

29(134), 41(166), 43(267), 55(177), 57(154), 70(132), 3.8049 73(147), 88(999), 89(139), 101(505)

Etil-éster del ácido pentadecanoico

29(159), 41(226), 43(376), 55(238), 57(275), 69(155), 0.2053 88(999), 89(183), 101(581), 157(134)

Etil-éster del ácido nonadecanoico 41(404), 55(463), 67(627),

79(999), 80(409), 81(444), 7.9177 91(305), 93(523), 95(600),

108(425)

124 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

Linolenato de etilo

51(51), 52(74), 108(54), 123(120), 151(999), 152(122), 0.2637 153(87), 168(183), 196(552), 197(62)

Etil-éster del ácido 4-hidroxi-3-metoxi-benzoico

125

41(141), 43(300), 55(133), 57(129), 69(76), 71(999), 72(57), 0.1026 81(69), 82(79), 83(52)

Isofitol

41(687), 43(999), 55(393), 69(594), 79(660), 81(342), 0.971 91(420), 93(632), 95(484), 109(449)

Óxido de cariofileno

39(96), 49(158), 65(95), 77(102), 91(83), 95(108), 177(156), 29.3833 207(239), 222(999), 223(137)

Apiol

126 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

41(402), 43(375), 55(701), 69(638), 81(444), 95(672), 6.3321 107(442), 109(399), 121(427), 438(999)

24-metilencicloartan-3-ona

41(440), 43(999), 79(277), 81(256), 93(233), 95(627), 1.93 105(231),121(468), 161(241), 204(285)

Alfa-cadinol 29(502), 41(945), 43(648), 55(746), 69(524), 81(547), 0.1254 95(518), 107(527), 111(999), 122(811)

127

Palustrol

67(108), 68(260), 152(83), 153(130), 155(58), 165(100), 1.1735 183(999), 184(151), 198(459), 199(74)

Cadaleno

28(44), 105(51), 128(70),

129(73), 131(63), 143(47), 0.4444 144(53), 159(999), 160(142),

202(106)

128 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

cis-calameneno

41(688), 43(999), 69(349), 79(316), 91(422), 93(397), 7.509 105(341), 119(421), 159(335), 205(332)

Spatulenol

Los siete ésteres etílicos derivados de ácidos grasos saturados detectados en las muestras de C. guianensis presentaron iones característicos de ésteres de cadena alifática en su espectro de masas, debido a que las moléculas se rompen por los mismos sitios, originando en muchos casos los mismos fragmentos. De tal forma, se evidencia el ion típico de esteres etílicos (m/z = 88 uma), como también los iones correspondientes a la pérdida del etilo [M-29]+ y pérdidas sucesivas de metileno. En el caso de los ácidos grasos de

129

cadena insaturada detectados en esta muestra, se presentaron fragmentaciones típicas de la serie CnH2n-3, lo cual se evidencia claramente para el linoleato de etilo con picos de los fragmentos más abundantes con relaciones m/z = 81, 67 y 95 presentes en cadenas con dos insaturaciones (Nieto & Cucaita, 2007). Para el palmitato de isopropilo, se evidencia el pico base a una relación m/z= 43, fragmento del isopropilo, además de otros picos característicos (m/z = 57 y 60). La identificación del pico base de cada uno de estos compuestos y su comparación con la base espectral NIST permitió confirmar la estructura de cada ácido graso.

Por parte del potencial insecticida de los ácidos grasos y sus derivados, se ha reportado que tienen propiedades antialimentarias, neurotóxicas y ovicidas (Don-Pedro, 1990). Esto implica que pudieron estar involucrados en la actividad presentada por C. guianensis, al ser componentes abundantes en la fracción de diclorometano de tallos. En fracciónes de tallos de C. guianensis, se ha reportado el ácido linolénico, el ácido linoleico y el ácido palmítico con actividades insecticidas e insectistáticas sobre S. frugiperda (Ramos-López et al., 2012). Según este estudio, a 400 ppm, los ácidos en cuestión redujeron la viabilidad de las larvas en un 40% y alargaron la fase larval en 4 días. Lo anterior está en concordancia con lo encontrado en el presente trabajo, donde se detectaron ésteres de ácido linolénico, linoleico y palmítico en la fracción con actividad promisoria. Adicionalmente, dentro de los estudios de actividad de los ácidos grasos se ha encontrado que la toxicidad aumenta de acuerdo con la longitud de la cadena, siendo mayor la del ácido undecanoico con respecto al ácido acético y aun mayor en los ácidos esterificados (Tripathi & Rathore, 2001). Evidencia adicional de la actividad de estos ácidos grasos sobre larvas de S. frugiperda se reportó en el extracto de acetona de Carica papaya L, rico en ácido oleico, el cual causó el 60% de mortalidad en los insectos después de 10 días de alimentarse con hojas impregnadas con el extracto (Figueroa et al., 2002).

130 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

La actividad biológica de los ácidos grasos se ha relacionado con irrupciones en los sistemas neurológicos y endocrinos de los insectos. Adicionalmente, algunos ácidos grasos como el ácido 10,11-metilenehexadec-10-enoico y al ácido 11,12-metilenehexadec- 11-enoico interfieren en la producción de (Z)-9-tetradecenil y (Z, E)-9,11-tetradecadienil acetato, dos de los componentes de las feromonas de S. littoralis (Gosalbo et al 1992). Debido a la similitud estructural de algunos ácidos grasos con componentes de feromonas, se ha propuesto que estos ejercen una actividad biológica directa sobre algunos lepidópteros en estadios adultos, por lo que es otra forma promisoria de control de este insecto plaga.

Por su parte, los componentes de aceites esenciales en plantas, tales como los sesquiterpenos, monoterpenos, ácidos grasos volátiles y fenilpropanoides han sido reportados por sus actividades farmacológicas tales como: antifúngica, antialimentaria, antibacteriana, antiinflamatoria, antiviral, entre otras. De los componentes de aceites esenciales en los tallos de C. guianensis, se caracterizaron seis sesquiterpenos, de los cuales el α-cadinol, palustrol, spatulenol y óxido de cariofileno presentaron fragmentos más abundantes a una relación de m/z = 41, 43 y 69. Para el α-cadinol, se encuentran los fragmentos característicos m/z 43(999), 95(627), 105(231), 121(468), 161(241), 204(285) (Borg-Karlson & Norin, 1981). Por otro lado, se detectaron dos sesquiterpenos con aromaticidad en sus anillos (cadaleno y cis-calameneno). Para el cadaleno se detecta el pico base a m/z = 183 (999) que corresponde a la pérdida de un metilo y en el espectro del cis-calameneno se observa un pico base a una relación m/z = 159, característico por la pérdida del isopropilo.

Se ha propuesto que, por su volatilidad, estos compuestos, interactúan con la sensilia de los insectos a partir de proteínas CSPs (Chemosensible proteins) y OBPs (Odorant biding proteins). Entre las respuestas posibles se encuentra la neurotóxica que supone la interacción de la molécula con el sistema neurológico del insecto. En ese caso, se han

131

reportado mono y sesquiterpenos que se unen a los receptores GABA del insecto, propiciando una reacción deterrente (Regnault-Roger, 2013). En el caso del óxido de cariofileno, detectado en los análisis de C. guiananesis en la fracción activa, se ha reportado su efecto repelente sobre Anopheles gambiae y antialimentario sobre S. littoralis (Rodilla et al., 2008). Además, en una evaluación de los aceites esenciales de Hyptis fruticosa (Lamiaceae) Salzm., H. pectinata (Lamiaceae) Poit., y Lippia gracilis sobre A. aegypti, se reportó al óxido de cariofileno y al carvacrol como responsables de la actividad insecticida (Silva et al., 2007). Asimismo, se publicó la presencia del spatulenol, cis- calameneno y alfa-cadinol en los aceites evaluados, los cuales están presentes en la fracción de tallos de C. guianensis caracterizada en este estudio. También se ha argumentado que el alfa-cadinol, el spatulenol, el isofitol y el óxido de cariofileno, constituyentes de la fracción de hexano de los extractos etanólicos de cuatro especies de Achillea, están involucrados en los efectos insecticidas sobre adultos de Leptinotarsa decemlineata (Çakir et al., 2016).

En otro estudio realizado para evaluar el potencial insecticida del aceite esencial del fruto de Illicium pachyphyllum sobre Sitophilus zeamais y Tribolium castaneum, se purificó al óxido de cariofileno por ser uno de los componentes principales del aceite y se evaluó sobre los dos insectos, encontrándose un efecto menor que el de la mezcla (Liu et al., 2012). Una explicación que se ha dado a ese tipo de situaciones se centra en los posibles efectos sinérgicos entre los componentes del aceite que no existen con el compuesto puro y que suponen un obstáculo a la hora de explicar los mecanismos de acción que producen el efecto de interés (González-Coloma et al., 2010).

Si bien en los tallos de C. guianensis se encontró el óxido de cariofileno, la fracción no tuvo una actividad antialimentaria sobre las larvas de S. frugiperda. Esto puede deberse a la concentración de los sesquiterpenos en la fracción, la cual puede ser menor a la requerida para conseguir tal efecto antialimentario, o puede tener su causa en S. frugiperda,

132 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

sugiriendo que los efectos reportados para dichos sesquiterpenos pueden ser selectivos para las especies sobre las que han tenido actividad antialimentaria, como es el caso de S. littoralis. Ese panorama podría explorarse en estudios posteriores pues la especificidad de los efectos de compuestos o mezclas de compuestos sobre ciertas especies aventaja a aquellos métodos de control que afectan tanto a la especie objetivo como a otras especies benéficas que habitan el mismo ecosistema.

Recientemente, se ha publicado información al respecto para los productos comerciales basados en A. indica. Una de esas investigaciones, realizada por Barbosa et al. (2013), mostró que la azaridactina tuvo un efecto repelente e insecticida sobre el abejorro común, Bombus terrestris, el cual es un importante polinizador, con concentraciones que variaron entre 3.2 y 320 ppm. En este sentido, han cobrado cada vez más relevancia los productos naturales con efectos más específicos, los cuales suelen agruparse dentro de la categoría de insectistáticos, pues los efectos letales, como los que causa A. indica, desencadenan mecanismos de adaptación y detoxificación por parte del insecto, requiriéndose mayores concentraciones del producto insecticida o la producción de derivados más tóxicos (de Freitas-Bueno et al., 2017). A partir de ello, la fracción de diclorometano de tallos de C. guianensis se presenta como una opción que puede explorarse para el control del biotipo de arroz de S. frugiperda, por sus efectos sobre la duración del ciclo y la mortalidad en larvas.

Finalmente, se encontró en la fracción de C. guianensis el apiol, siendo el compuesto más abundante caracterizado por CG-EM de la fracción activa (abundancia relativa de 29.38%). La estructura de este compuesto fue asignada por su patrón de fragmentación en el cual se encontró que el pico m/z = 207 corresponde a la pérdida del grupo metilo y el m/z = 191 corresponde a la pérdida del grupo metoxilo (Karim y Khalid, 2017). Este fenilpropeno ha sido ampliamente reportado por su vasto rango de actividades biológicas, entre las que sobresalen la antifúngica y la insecticida (Duke et al., 2010).

133

En un estudio realizado por Ben-Khalifa et al. (2018) se evaluó el potencial insecticida de seis aceites esenciales de Apiaceae, en donde el apiol es uno de los componentes principales, sobre S. littoralis. De estos, los aceites de C. cyminum y F. vulgare causaron luego de 24 h de exposición una mortalidad del 100% de las larvas. Asimismo, se ha reportado su carácter repelente e insecticida sobre Tribolium confusum, Drosophila melanogaster, Periplanata americana L., Musca domestica L., Tribolium castaneum, Callosobruchus maculates F., Ephestia kuehniella Zeller, Aedes albopictus y Plodia interpunctella (Babri et al., 2012; Khani, Rashid y Mirshekar, 2017; Lichtenstein et al., 1974; Maroufpoor et al., 2016; Seon-Mi et al., 2015).

En conclusión, los compuestos detectados en la fracción de tallos de C. guianensis, pertenecientes a los grupos de ácidos grasos, sesquiterpenos y el fenilpropanoide apiol, han sido reportados por su actividad sobre insectos, ya sea como insecticidas o antialimentarios. Esto apoya el efecto selectivo insecticida sobre el biotipo de arroz de esta muestra (figura 4-7) y genera un panorama promisorio para esta fracción, la cual podría estandarizarse para ser usada como una alternativa sobre S. frugiperda.

4.5.2 Aislamiento y caracterización de estigmasterol de C. guianensis

De la fracción CT5 (figura 4-2), resultado de la cromatografía de columna realizada a la fracción de tallos de C. guianensis, se aisló un sólido blanco, el cual se precipitó y fue purificado por decantación en repetidas ocasiones con etanol. La pureza del compuesto se verificó por CCF con los sistemas de solventes: hexano-acetona (7:3), Rf = 0.4 y cloroformo-metanol (9:1), Rf = 0.7.

134 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

1 El compuesto C1 exhibió las siguientes señales espectrales: H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 5.34 (1H, t, H-6), 5.18 (1H, m, H-21), 5.09 (1H, m, H-20), 3.51 (1H, m, H-3), 2.33 (1H, dd,

Ha-12), 2.27 (1H, d, Hb-12), 0.95 (3H, d, CH3-19), 0.88 (3H, t, CH3-24), 0.85 (3H, d, CH3-

13 26), 0.83 (3H, d, CH3-27), 0.71 (3H, s, CH3-29), 0.64 (3H, s, CH3-28); C RMN (300 MHz,

CDCl3) δ 140.78 (C-5), 138.44 (C-20), 129.28 (C-21), 121.78 (C-6), 71.85 (C-3), 56.79 (C- 14), 56.06 (C-17), 50.14 (C-9), 45.84 (C-22), 42.4 (C-13), 42.34 (C-4), 39.79 (C-12), 37.27 (C-1), 36.53 (C-10), 36.18 (C-18), 33.95 (C-2), 31.92 (C-7), 31.68 (C-8), 29.7 (C-25), 29.14 (C-16), 26.05 (C-23), 24.34 (C-15), 23.03 (C-19), 22.5 (C-11), 20.2 (C-26), 19.8 (C-27), 18.9 (C-28), 12.2 (C-29), 12.1 (C-24).

El compuesto C1 mostró la presencia de seis señales de metilos, de las cuales dos señales aparecieron como singuletes en δ 0.71 y 0.64; tres dobletes correspondiente a metilos en δ 0.83, 0.85 y 0.95 y un triplete de un metilo en δ 0.88. Las señales típicas para los protones olefínicos en δ 5.09 y 5.18 por el doble enlace de la cadena lateral y δ 5.34 del protón olefínico del C-6. Asimismo, el protón del núcleo esteroidal correspondiente al H-3 se visualizó como un multiplete en δ 3.51. En el espectro de 13C RMN se visualizaron 29 señales, con dos señales olefínicas en las regiones δ 140.78 y 121.78 y un metilo oxigenado en δ 71.85. Basados en la evidencia espectral y en comparación con la literatura, este compuesto fue identificado como estigmasterol (Figura 4-28) (Suttiarporn et al., 2015).

Figura 4-29: Estructura del estigmasterol

135

Para el estigmasterol se ha reportado la actividad insecticida y antialimentaria frente a S. littura, Spilosoma obliqua, Myzus persicae y Rhopalosiphum padi, con índices de preferencia para los dos últimos de máximo 0.30 ± 0.10, cuando se evaluó a una concentración de 50 μg. cm-2 (Díaz et al., 2015). Por otro lado, el extracto de raíces de Piper auritum, del que se aisló el estigmasterol, fue reportado por su actividad insecticida sobre el chinche Collaria oleosa, causando el 41.2% de mortalidad a una concentración de 100 ppm (Sáez et al., 1998). En el caso de S. littura, Huang et al. (2009) reportaron la actividad citotóxica del estigmasterol sobre dicho insecto, con valores de 23% de mortalidad a una concentración de 25 ppm. Este compuesto no fue evaluado de forma aislada en este trabajo, pero su presencia en la fracción promisoria de C. guianensis sugiere un aporte a la actividad biológica en sinergia con los otros compuestos detectados por CG-EM. Asimismo, este compuesto se ha asociado a nivel molecular con la inhibición de la acetilcolinesterasa, provocando efectos larvicidas en Aedes aegypti y Culex quinquefasciatus (Gade et al., 2017); esto implica que la acetilcolinesterasa podría ser un blanco de acción de la fracción de tallos de C. guianensis.

136 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

Los terpenos y esteroles han sido señalados como irruptores de los efectos estimulantes de la glucosa y el inositol en las células receptoras de la boca de los insectos, causando efectos antialimentarios y digestivos (Rattan, 2010). Además, se ha argumentado que, por su polaridad, estos compuestos pueden actuar como solventes de otras toxinas y facilitar su paso a través de las membranas celulares.

4.5.3 Caracterización química de la fracción de diclorometano del extracto de tallos de S. macrophylla

Como sucede con C. guianensis, la caracterización química de S. macrophylla encontrada en la literatura se ha concentrado en la purificación de limonoides de las semillas, flores y hojas. La información de los tallos es, entonces, escasa. Se han reportado los limonoides swietenina A-Z, 2-acetoxiswietenialida D, 2,11-diacetoxiswietenialida D, 11- deoxiswietenialida D y epoxifebrinina B y el lignano 3-hidroxicaruilignano C (Zorofchian- Moghadamtousi et al., 2013). Además, de la madera se han aislado la (+)-catequina, la (- )-epicatequina y el derivado de catequina, swietemacrophyllanina (Falah, Suzuki y Katayama, 2008).

La caracterización realizada en este trabajo por CG-EM de la fracción de tallos de S. macrophylla evidenció la presencia de ácidos grasos y de fitoesteroles (tabla 4-6). En el caso de los ácidos grasos encontrados, tal y como se mencionó con C. guianensis, se detectaron dos etil-ésteres de cadena saturada y dos de cadena insaturada, caracterizados por el ion típico de ésteres etílicos de m/z = 88 u.m.a. y pérdidas sucesivas de metileno. Igualmente, se encuentra el linoleato de etilo y otros ácidos grasos presentes también en la muestra de C. guianensis. Este tipo de derivados de ácidos grasos se han reportado por su participación en actividades insecticidas y antialimentarias frente a diferentes especies de Spodoptera (Figueroa et al., 2002).

137

Sin embargo, en la fracción de tallos de S. macrophylla los compuestos más abundantes fueron los esteroles. Más de 100 moléculas de este tipo han sido identificadas en plantas, de los cuales sobresalen el sitosterol, el estigmasterol y el espinasterol (González-Coloma et al., 2010). La mayoría de los fitoesteroles tienen un doble enlace en el carbono 5 o 7 y un grupo alquilo en la cadena lateral. Este grupo de esteroles encontrados en la fracción de tallos de S. macrophylla presentaron fragmentos m/z correspondientes a la pérdida del grupo hidroxilo y de la cadena lateral correspondiente a cada uno. Otros fragmentos particulares se encontraron en el estigmast-4-en-3-ona con un pico a una relación m/z = 229 [ruptura del anillo D]+ y su pico base en 55 (999). Para el estigmasterol se observó un

+ pico a una relación m/z = 255 [273 -H2O] . Para el cicloartenol el fragmento m/z = 300 localiza la instauración de la cadena lateral en el C-22, lo cual lo diferencia de los otros esteroles encontrados.

En cuanto a la interacción biológica de este grupo de compuestos con los insectos, aunque estos los ingieren por su incapacidad de producir colesterol, se han reportado actividades insectistáticas e insecticidas de fitoesteroles, tales como citotóxica, antialimentaria e inhibición de la proteína SCP (Sterol Carrier Protein). Asimismo, se ha reportado que los esteroles pueden interrumpir el metabolismo de ecdisteroides en el insecto, causando afectaciones al crecimiento y al desarrollo (Céspedes et al., 2005), como las observadas en este estudio (ver figuras 4-18 y 4-24).

Tabla 4-6: Compuestos propuestos para la fracción de diclorometano del extracto de tallos de S. macrophylla detectados mediante CG-EM.

Fracción de diclorometano del extracto de S. macrophylla Compuesto Fragmento (m/z) Área

29(227), 41(268), 43(362), 55(233), 57(217), 69(132), 11.1402 73(156), 88(999), 89(136), 101(559)

138 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

Palmitato de etilo

29(146), 41(200), 43(339), 55(226), 57(213), 69(139), 2.4153 88(999), 89(200), 101(559), 312(203)

Estearato de etilo

41(699), 43(515), 55(999), 69(714), 83(543), 84(495), 3.8442 88(618), 96(407), 97(496), 101(429)

Oleato de etilo

41(488), 43(999), 55(398), 57(597), 60(705), 61(460), 15.3548 71(348), 73(316), 102(777), 256(547)

Palmitato de isopropilo

139

41(319), 43(277), 55(402), 57(137), 59(999), 60(189), 18.6385 69(209), 72(936), 112(147) 126(182),

9-octadecenamida (Z)

41(518), 54(455), 55(669), 67(999), 68(476), 69(374), 0.9823 81(831), 82(459), 95(586), 96(362)

Linoleato de etilo 41(265), 43(999), 55(326), 57(461), 58(961), 59(423), 0.4507 69(261), 71(538), 85(261), 95(215)

140 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

6,10,14-trimetil-2-Pentadecanona

41(226), 43(481), 55(257), 56(148), 57(234), 69(162), 0.9194 71(148), 99(999), 114(151), 126(128)

4,8,12,16-tetrametilheptadecan-4-olido

29(414), 41(749), 43(999), 55(616), 57(634), 60(838), 0.9655 61(218), 69(310), 71(285),

73(905)

Ácido palmítico

41(470), 43(999), 55(617),

57(452), 71(312), 81(436), 3.94 95(414), 105(306), 107(403),

145(285)

141

Campesterol

41(455), 43(445), 55(999), 69(631), 81(737), 83(867), 13.09 95(447), 97(427), 133(395), 255(634)

Estigmasterol

41(366), 43(567), 55(506), 2.20 57(292), 69(283), 81(275),

142 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

95(308), 124(999), 229(344), 412(394)

Estigmast-4-en-3-ona

41(579), 55(549), 69(999), 81(440), 93(370), 95(430), 18.77 107(400), 109(440), 121(350), 135(320)

Cicloartenol

41(561), 43(999), 55(639), 0.86 57(447), 79(348), 81(427),

143

91(377), 95(387), 105(392), 107(378)

ß-sitosterol

Algunos esteroles encontrados en S. macrophylla como el ß-sitosterol, así como el (3b,7a)- estigmast-5-ene-3,7-diol y el (3b,7a)-7-metoxistigmast-5-en-3-ol, aislados de Echium wildpretii y Abutilon indicum, fueron reportados por su actividad antialimentaria, con un índice antialimentario mayor al 60%, frente a Leptinotarsa decemlineata y Culex quinquefasciatus y los áfidos Myzus persicae, Diuraphis noxia, Metopolophium dirhodum, Rhopalosiphum maidis y Rhopalosiphum padi (Rahuman et al., 2008; Santana et al., 2012). Además, Santana et al., (2012) sugieren en su trabajo que la actividad antialimentaria de los fitoesteroles sobre L. decemlineata se debe a la inhibición de la respuesta electrofisiológica fagoestimulante a la sacarosa en las células del sensilia del insecto, siendo un proceso predigestivo. En este sentido, los fitoesteroles tendrían diferentes blancos de inhibición e irrupción en el metabolismo de los insectos y al ser tan abundantes en la fracción activa de S. macrophylla, se sugiere que están involucrados en la actividad presentada.

Otros estudios han mostrado la actividad insecticida del ß-sitosterol sobre larvas de Aedes aegypti (LC50=11.5 mg/L), Culex quinquefasciatus (LC50=26.7 mg/L) y Anopheles stephensi (LC50=3.58 mg/L) (Ghosh, 2013). Para el autor, dicho efecto larvicida se debe

144 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

a la inhibición de la proteína SCP (Sterol Carrier Protein), al impedir la conversión a colesterol por parte de los insectos.

En cuanto a los otros esteroles encontrados en la fracción de tallos de S. macrophylla, se ha reportado, como se mencionó en el apartado anterior, que el estigmasterol tiene actividad insecticida y antialimentaria sobre las especies S. littura, Spilosoma obliqua, Collaria oleos y Myzus persicae (Díaz et al., 2015; Huang et al., 2009). Con respecto al campesterol y al cicloartenol no se han reportado actividades sobre insectos, sino de interés farmacológico como efectos anticancerígenos o antiangiogénicos (Choi et al., 2007; Suttiarporn et al., 2015). Asimismo, la estigmast-4-en-3-ona ha sido evaluada por su potencial hipoglicémico, a partir de un extracto de hexano de la corteza de Anacardium occidentale (Alexander-Lindo, Morrison y Nair, 2004).

4.5.4 Aislamiento y caracterización del β-sitosterol 3-O-β- glucopiranósido de S. macrophylla

En las fracciones MT2, MT3 y MT4 (figura 4-3), resultadas de la cromatografía de columna realizada a la fracción de tallos de S. macrophylla, se precipitó un sólido blanco, el cual fue purificado por decantación en repetidas ocasiones con etanol. La pureza del compuesto se verificó por CCF con los sistemas de solventes: cloroformo-metanol (9:1), Rf = 0.4 y acetona-metanol (9:1), Rf = 0.7.

El compuesto C2 exhibió las siguientes señales espectrales: 1H RMN (300 MHz, MeOH) δ 5.32 (1H, s, H-6), 4.77 (1H, d, H-1’), 4.36 (1H, dd, J = 9.4 y 2.6 Hz, H-6’), 4.34 (1H, dd, J = 11.9 y 5.3 Hz, H-3’), 3.85 (1H, m, H-4’), 3.80 (1H, m, H-2’), 3.76 (1H, m, H-5’), 2.32 (1H, dd, J = 13.4 y 2.3 Hz, Ha-12), 2.31 (1H, t, J = 11.3 Hz, Hb-12), 1.79 (3H, d, J = 6.4 Hz, CH3-

21), 1.44 (3H, s, CH3-19), 0.93-0.75 (9H, m, CH3-29, CH3-26, CH3-27), 0.63 (3H, s, CH3- 18); 13C RMN (300 MHz, MeOH) δ 140.3 (C-5), 122.3 (C-6), 101.3 (C-1’), 78.7 (C-3), 78.5 (C-3’), 77.8 (C-5’), 73.4 (C-4’), 69.7 (C-6’), 56.6 (C-14), 56.1 (C-17), 50.2 (C-9), 45.7 (C-

145

24), 42.1 (C-4), 39.8 (C-13), 39.3 (C-12), 37.2 (C-1), 36.6 (C-10), 36.06 (C-20), 34.1 (C- 22), 32.1 (C-8), 32.1 (C-7), 31.77 (C-2), 29.6 (C-23), 29.02 (C-16), 28.1 (C-25), 24.1 (C- 15), 23.2 (C-28), 20.9 (C-11), 19.6 (C-26), 19.3 (C-19), 19.1 (C-27), 18.8 (C-21), 12.2 (C- 29), 12.0 (C-18).

Los datos espectrales del compuesto C2 exhiben un singulete en δ 5.32 del protón olefínico en la posición H-6 y las señales características para seis grupos metilos de la región δ 1.44 a 0.75. La presencia de señales en la región entre δ 4.77 (H-1’), 4.36 (H-6’), 4.34 (1H, H- 3’), 3.85 (H-4’), 3.80 (H-2’), 3.76 (H-5’) y en el espectro de 13C RMN las señales entre 101.3 (C-1’), 78.5 (C-3’), 77.8 (C-5’), 73.4 (C-4’), 69.7 (C-6’) ppm fueron características para el núcleo de glucosa. Todos estos valores son similares a los reportados por (Ramaiah et al., 1984), lo cual permitió identificar este compuesto como β-sitosterol 3-O-β-glucopiranósido.

Figura 4-30: Estructura del β-sitosterol 3-O-β-glucopiranósido

La aglicona del ß-sitosterol se ha reportado ampliamente en la literatura por sus actividades anticancerígena, antibacteriana, fungicida y larvicida (Abdul-Rahuman et al., 2008). Este

146 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

compuesto detectado en la fracción de tallos de S. macrophylla por CG-EM podría sugerir una actividad sinérgica con los otros esteroles pues su actividad sobre insectos ha sido reportada, en términos de su potencial insecticida y regulador del crecimiento; sin embargo, la confirmación de dicho comportamiento requiere otro tipo de ensayos que no se realizaron en esta investigación. Particularmente, en un estudio realizado por Mhalla et al. (2018), se obtuvo que el ß-sitosterol, presente mayoritariamente en el extracto hexánico de Rumex tingitanus, inhibió en un 70% el crecimiento de las larvas de cuarto instar de S. littoralis y causó la muerte de las larvas neonatas con un LC50 de 2.56 mg/g Estos resultados concuerdan con los obtenidos con la fracción de S. macrophylla que contenía ß-sitosterol, al retardar el crecimiento de las larvas, prolongando su fase larval para ambos biotipos (ver figuras 4-10 y 4-11). Por otro lado, se ha reportado su actividad controladora sobre A. aegypti, A seteplensi y C. quinquefasciatus (Abdul-Rahuman et al., 2008).

En cuanto al β-sitosterol 3-O-β-glucopiranósido se ha reportado su actividad insecticida contra A. aegypti, al causar el 100% de la mortalidad de las larvas al ser evaluado a una concentración de 1.25 µg/mg (Amin et al., 2012). Como se ha mencionado, las actividades insecticidas e insectistáticas de los esteroles incluyen un amplio rango de mecanismos de acción, entre los que se encuentran la inhibición de proteínas como las SCP o la tirosinasa (Céspedes et al., 2005). La inhibición de esta última enzima se evidenció en la fracción de tallos de S. macrophylla al evaluar su actividad frente a la tirosinasa (figura 4-28). Al inhibir la enzima tirosinasa, el resultado es una metamorfosis incompleta, al impedirse el endurecimiento y oscurecimiento de la cutícula del insecto (Céspedes et al., 2015), lo cual se observó en este estudio (figuras 4-18 y 4-24). En el caso de la inhibición de las SCP el resultado es la imposibilidad de absorber el colesterol por parte del insecto, que deriva en una deficiencia de colesterol, la cual es mortal (Chang, 2009; Kim & Lan, 2010).

Por otro lado, se ha argumentado que los esteroles y sus derivados podrían estar involucrados en la inhibición de la ecdisona, por su cercanía estructural a los ecdisteroides,

147

con un mecanismo parecido al de los fitoecdisteroides que mimetizan la hormona juvenil de los insectos, interrumpiendo los procesos de muda (Muñoz et al., 2013).

Además, en el caso de los esteroles y terpenos glicosilados se ha propuesto que rompen la integridad de la membrana celular. Esto se debe a su estructura bipolar, pues la parte lipídica es fácilmente integrada a la fracción plasmática de la membrana, mientras que la porción del azúcar queda afuera, formando un poro. Los daños en la membrana celular resultan irreversibles, impidiendo el paso de nutrientes y la estabilidad celular (De-Geyter et al., 2007).

La conjunción de diversos mecanismos de acción en los que puede participar el β- sitosterol-3-O-β-glucopiranósido junto con los demás esteroles encontrados y los ácidos grasos resulta interesante en el control de S. frugiperda, pues la adquisición de resistencia ante controladores con varios blancos es mucho más difícil para el insecto en comparación con los insecticidas que tienen solo un objetivo. Asimismo, la especificidad de los efectos de la fracción de tallos de S. macrophylla sobre los dos biotipos de S. frugiperda, siendo el efecto sobre el biotipo de arroz principalmente larvicida y el que se da sobre el biotipo de maíz de control del crecimiento, le concede ventaja a esta fracción sobre otros insecticidas sintéticos o productos naturales como la azaridactina, al ser menos probable su daño a insectos y organismos benéficos.

Finalmente puede concluirse que la fracción de tallos de S. macrophylla es la más promisoria de todas las muestras evaluadas. Los compuestos del grupo de los esteroles tienen una incidencia en la actividad biológica presentada, al tener una abundancia relativa grande en esta fracción que, junto a los limonoides reportados para los tallos de esta planta, pueden explicar el efecto antialimentario visto en esta investigación sobre las larvas de S. macrophylla (figura 4-25) y el efecto selectivo en el ciclo de vida sobre el biotipo de maíz (figura 4-13). El uso del extracto estandarizado basados en la presencia de esteroles

148 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

encontrados puede contribuir al manejo integrado de esta plaga como una alternativa de menor impacto ambiental.

149

5. Conclusiones y recomendaciones

5.1 Conclusiones

En este trabajo se evaluó el potencial insecticida y antialimentario de tres especies de Meliaceae: Swietenia macrophylla, Swietenia mahagoni y Carapa guianensis, sobre los dos biotipos de S. frugiperda. De estas, tanto S. macrophylla como C. guianensis tuvieron efectos importantes y diferenciados sobre los biotipos. En el caso del biotipo de arroz, la mortalidad en la fase larval fue mayor con las fracciones de diclorometano de los tallos de ambas platas, con efectos sutiles sobre el ciclo del insecto. Por el contrario, el biotipo de maíz vivió hasta 6 días más que los controles negativos, cuando se alimentó de las diferentes muestras de S. macrophylla, tanto de hojas como de tallos. En cuanto a la actividad antialimentaria, ni C. guianensis ni S. mahagoni tuvieron efectos significativos, mientras que S. macrophylla tuvo un efecto moderado sobre ambas plantas. Estos resultados implican que hay una actividad diferenciada de S. macrophylla y de C. guianensis sobre los dos biotipos que podrían implementarse en el desarrollo de otras herramientas de control de este insecto que por ser selectivas pueden ser menos nocivas para insectos y otros organismos benéficos que cohabitan con S. frugiperda.

El ensayo de tirosinasa arrojó un resultado moderado por parte de la fracción de diclorometano de los tallos de S. macrophylla. Esto implica que, si bien la inhibición de tirosinasa no es el mecanismo principal que da cuenta de los efectos de la planta sobre el insecto, este sí tiene una participación al menos marginal. Se han sugerido otros mecanismos de acción que pueden explicar la actividad de S. macrophylla basados en la composición química de su fracción, la cual es rica en esteroles y ácidos grasos, tales como inhibición de las proteínas SCP, irrupción del metabolismo de muda, mímesis de las hormonas juveniles, daño en la membrana celular, entre otras. La purificación del β-

150 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

sitosterol 3-O-β-glucopiranósido como uno de los componentes principales de la fracción sugiere su participación en la actividad de S. macrophylla, lo que concuerda con lo reportado en la literatura, según lo cual este compuesto tiene efectos insecticidas sobre diferentes familias de insectos.

Los resultados obtenidos contribuyen al aumento de la información disponible tanto con respecto a los biotipos de S. frugiperda, pues no se conocen evaluaciones de productos naturales que tengan en cuenta su existencia, como en lo relacionado con la fitoquímica de la familia Meliaceae, en particular con la caracterización química de los tallos de S. macrophylla y C. guianensis. Finalmente, esta investigación da cuenta del potencial de los productos naturales en la creación de herramientas de control de plagas biosostenible y con menores efectos nocivos a la salud humana.

5.2 Recomendaciones

En cuanto a las recomendaciones, se considera importante evaluar las fracciones de los tallos de S. macrophylla y C. guianensis a diferentes concentraciones para así encontrar la dosificación óptima del uso de dichas mezclas. Asimismo, se recomienda evaluarlas sobre otras especies de insectos para determinar su selectividad.

Adicionalmente se podría complementar estos resultados con la evaluación de las muestras activas (fracciones y compuestos) sobre otras enzimas que tienen implicaciones en los cambios de fase de S. frugiperda, con el fin de elucidar mecanismos de acción que puedan contribuir a definir cómo debería suministrarse el producto para el control del insecto.

También se recomienda hacer pruebas citotóxicas para evaluar la seguridad en cuanto a la salud humana en el uso de estos productos naturales, así como pruebas en semicampo

151

que permitan comprobar la efectividad de los compuestos y extractos sobre los insectos en su ecosistema.

152 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

Anexos

1- Espectros de masas de esteroles de la fracción de tallos de S. macrophylla

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2- Espectros de masas de sesquiterpenos y ácidos grasos de la fracción de tallos de C. guianensis

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3- Espectro de 1H RMN de Estigmasterol

164 Controladores de los biotipos de arroz y maíz de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera, Noctuidae) en especies de Meliaceae

4- Espectro de 13C RMN de Estigmasterol

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5- Espectro de 1H RMN de β-Sitosterol β-D-glucopiranósido

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