Universidade Estadual De Campinas Instituto De

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

INSTITUTO DE QUÍMICA

FABIÁN GILBERTO VILLALTA ROMERO

AŃLISE ESTRUTURAL E FUNCIONAL DE METALO (SVMP) E SERINA PROTEASES (SVSP) DE VENENOS DE SERPENTES

CAMPINAS 2016

FABIÁN GILBERTO VILLALTA ROMERO

AŃLISE ESTRUTURAL E FUNCIONAL DE METALO (SVMP) E SERINA PROTEASES (SVSP) DE VENENOS DE SERPENTES

Tese de Doutorado apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutor(a) em Ciências

Orientador(a): Prof(a). Dr(a). Ljubica Tasic Coorientador(a): Prof(a). Dr(a). Goran Neshich

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO(A) ALUNO(A) FABIÁN GILBERTO VILLALTA ROMERO, E ORIENTADA PELO(A) PROF(A). DR(A). LJUBICA TASIC

CAMPINAS 2016

BANCA EXAMINADORA

Profa. Dra. Ljubica Tasic (Orientadora)

Profa. Dra. Mirian Akemi Furuie Hayashi (UNIFESP)

Profa. Dra. Giselle Zenker Justo (UNIFESP-Diadema)

Profa. Dra. Taicia Pacheco Fill (IQ-UNICAMP)

Profa. Dra. Cátia Cristina Capêlo Ornelas Megiatto (IQ-UNICAMP)

A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do(a) aluno(a).

Este exemplar corresponde à redação final da Tese de Doutorado defendida pelo aluno FABIÁN GILBERTO VILLALTA ROMERO, aprovada pela Comissão Julgadora em 25 de fevereiro de 2016.

Dedico este trabalho à minha família,

que foi a parte dele em todos momentos.

Agradecimentos

A Deus pela vida.

À minha família pelo apoio e por me motivar a continuar e não desistir.

À minha professora e orientadora, Ljubica Tasic (Buba), pela oportunidade de ser a parte do Laboratório de Química Biológica (LQB), realizar a pesquisa no Brasil e pela ajuda dada em todos os momentos.

Ao pessoal do Laboratório I-250, ao professor Nelson Durán e seus estudantes (Elias, Ana Paula, Jeanifer, Ana Maria, Dani Ridolfi, Camila, Amauri, Patricia, Paula e Carol). Ao nosso técnico do laboratório, Francisco Camargo, pela sua amizade e por ter me socorrido quando fui atropelado. A todos os colegas que passaram pelo LQB: Junko, Ana Paula, Almas, Dani Pott, Dani Cypriano, Banny, João, Stephanie, Flávia, Guillerme, William, Antônio, Raphael, Natália, Willian, Paula, Gilberto, Verônica, Caio, Mayra, Lucimara, Danijela e Boris. A Lillian por seus brigadeiros, a palha italiana e sua ajuda com meu português. Aos meus colegas de pesquisa Roney, Raniery e Marina por toda ajuda. E não posso esquecer a nossa “cafeteira”, que sempre tinha o café pronto na hora certa.

Aos meus treinadores Luiz, Giovanna, Marina, Guima, Bruno e aos meus colegas de triathlon Atila, Martina, Diego, Ricardo, André, Laura, Joana, Ruam, Matheus, Luciane, Jorge, Andrew, Lucia, Sofia, Jadisha, Marina e em especial ao Ricardo e a Monica por tantos momentos compartilhados. À Valeria pelos treinos de bike de madrugada. Ao Daijiro e à Patricia por todas suas dicas para melhorar neste belo esporte.

Aos colegas de minha antiga república Ricardo, Jadson, Guilherme, Neto, Stephanie, Lucas, Allan, Fernanda e Marina.

Aos meus amigos Janainna, Priscilla, Banny, Rafael, Jane, João Paulo e a Teka por me mostrar tanto do Brasil principalmente da gastronomia, música e novas palavras! Mas, principalmente por sua amizade e por compartilhar tantos jantares onde não poderia faltar uma berinjela!!

Ao pessoal da Embrapa, Luiz, Salim, Ignacio, Ivan, Jardine e principalmente ao professor Goran pela oportunidade de usar tanto recurso computacional e por todo o aprendizado.

Ao professor Arni, Rafael e a Mônika por toda sua ajuda na tentativa de cristalizar “minhas” proteínas.

Ao Paulino por sua ajuda na purificação das serina proteases.

Ao pessoal do Instituto de Química, professores e técnicos de laboratório, em especial a Claudia Martelli, Sonia Fanelli, Anderson Pedrosa, Gustavo Shimamoto e Paula Pilli. E ao pessoal da CPG.

Aos visitantes internacionais Raphael e Nixson do Chile, Ricardo e Renier de Cuba por sua amizade.

Ao professor Stephen Hyslop e suas estudantes Norma e Bia pela ajuda no ensaio de inibição de angiogênese em membrana corionalantóide de embrião de galinha (in ovo). À professora Giselle Zenker pela ajuda nos ensaios em células endoteliais de aorta de coelho.

Ao pessoal do Instituto Clodomiro Picado, senhor José María, Alexandra Rucavado, Teresa Escalante, Erika Camacho, e professor Bruno Lomonte pela ajuda e conselhos.

À María e ao Raúl por trazer minha bike, a Tercipelo, e alguns Tamalitos lembrando-me as cosas boas do Natal em Costa Rica! À Karina por sua visita e por trazer o famoso molho Salsa Lizano e café da Costa Rica.

Ao pessoal externo a Lab LQB Luiz, Leandro, Ana Carolina, Diego, Marcelo, Amanda.

Ao senhor João e a sua família em Cruzilia por me permitir conhecer a cultura mineira e em especial o angu, um prato simples, mas que bem acompanhado é uma delícia!

Enfim, a tantas pessoas que tornaram muito agradável minha estadia no Brasil, muito obrigado por tudo.

Resumo

As picadas por serpentes s̃o classificadas como doenças negligenciadas pela Organização Munidial de Saúde (OMS). Além de ser uma quest̃o de sáde ṕblica, a peconha ou veneno de serpentes (SV) é particularmente interessante por apresentar atividades bioqúmicas e farmacológicas ́nicas. Nossa pesquisa abrange os estudos acerca de seis proteases de SV das classes: metalo (SVMP) e serina proteases (SVSP), que foram isoladas de tres serpentes: Bothrops asper (SVMP, BaP1), Crotalus simus (SVMP, PIII; SVSP-I e SVSP-II) e Crotalus durissus cumanensis (SVSP, Cd SI e Cd SII). Na primeira parte deste trabalho foram utilizadas as técnicas de dicrósmo circular e fluorescencia para caracterizac̃o biof́sica das proténas alvo. Foi verificado o papel de ́ons de cálcio (II) na estabilizac̃o da estrutura e atividade das duas SVMP. Na segunda parte, utilizando as técnicas in silico de Screening virtual das bibliotecas Zinc, ChemBL e PubChem, foram propostos cinco compostos como potenciais inibidores da BaP1. Destes, três compostos foram testados em ensaios in vitro e dois inibiram a atividade proteoĺtica da BaP1. Usando metodologia similar, a hesperitina foi proposta como um inibidor potente para as SVSP, in silico e in vitro. Dessa forma, esses compostos poder̃o ser úteis no tratamento de envenenamentos. A terceira parte deste trabalho consistiu na análise comparativa de estruturas 3D de SVMP utilizando ferramentas de biologia computacional e na caracterizaç̃o das diferenças entre as proténas que provocam ou ño a hemorragia em acidentes ofídicos. Finalmente, na quarta e última parte, estudamos a atividade das SVMP, BaP1 e PIII, perante a inibic̃o da formac̃o de capilares sangúneos e verificamos que ambas mostram potencial farmacológico para terapia antiangiogenica.

Abstract

Snake bites are classified as neglected diseases according to the WHO. As well as a public health issue, the snake venom (SV) is particularly interesting because it presents unique biochemical and pharmacological activities. Our research covers the study of six SV proteases, metalloproteases (SVMP) and serine proteases (SVSP), isolated from three snakes: Bothrops asper (SVMP, BaP1), Crotalus simus (SVMP, PIII; SVSP-I and SVSP-II) and Crotalus durissus cumanensis (SVSP, Cd SI and Cd SII). The circular dichroism and fluorescence techniques were used for the biophysical characterization of the target proteins. The role of calcium (II) ions in stabilizing the structure and activity of the two SVMP was verified. In the second part of this work, using the Virtual Screening techniques, the libraries Zinc, ChemBL and PubChem were screened and five compounds have been proposed as good in silico inhibitors of BaP1. Among these, three were tested in vitro assays and two showed complete inhibition of the proteolytic activity of BaP1. Using similar methodology, the hesperetin has been proposed as a potent inhibitor for the SVSP, both in silico and in vitro. Thus, these compounds have the potential to aid in the anti-poisoning treatments. The third part of this work consisted of the comparative analysis of SVMP 3D structures by computational biology tools, and the differences between the proteins that provoke or not cause hemorrhagic effects were characterized. Finally, we investigated the activity of SVMP, BaP1 and PIII in the inhibition of the formation of blood capillaries and found that both tested proteins show pharmacological potential for antiangiogenic therapy.

Lista de figuras

Figura 1 Nomenclatura específica para o substrato da protease, em que os resíduos de aminoácidos no substrato são numerados para fora do local de clivagem como ··· -P4 -P3 -P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'- ···, e o local de clivagem é destacado pela seta preta, entre P1 eP1 '. ______30

Figura 2 Esquema de classificação das MEPs de acordo com a sua assinatura de ligação de zinco conhecidas, incluindo apenas as famílias de proteases para as quais as estruturas tridimensionais estão disponíveis. ______32

Figura 3 (A) A figura representa a coordenação do íon zinco (II) a três histidinas e a uma molécula de água (Lingott et al., 2009). (B) Estrutura da metaloprotease BaP1 (PDB: 1ND1) representada em cartoon onde, em azul são as -hélices, em amarelo as folhas-, e em verde voltas e estruturas randômicas. (C) Topologia do domínio catalítico da metzincina, da família adamalysins/ADAMs, onde o esquema mostra os elementos da estrutura secundária regular. Mostrando as -hélices como cilindros, as folhas-, como flechas, as ligações de hidrogênio e ligações metal-ligante como linhas tracejadas, ligações de dissulfeto como linhas sólidas laranja, segmentos desordenados ou pontos de inserção de domínios adicionais por linhas azuis e resíduos específicos da família estão representados em vermelho (Cerdà-Costa e Xavier Gomis-Rüth, 2014). ______33

Figura 4 Esquema de classificação das SVMP, onde o símbolo (?) refere-se ao produto do processamento não identificado no veneno (Fox e Serrano, 2008). ______34

Figura 5 (A) A figura representa a sequência completa de aminoácidos da metaloprotease BmooMPalpha-1 reportada na base de dados UniProt, código P85314. (B) Representação esquemática em cartoon da estrutura canônica com código PDB 3GBO, onde o íon Zn (II) está representado em cinza, o íon de Ca (II) em verde e as ligações de dissulfeto em vermelho. (C) Representação geométrica da coordenação do íon de Zn(II). ______36

Figura 6 (A) A figura representa a sequência completa de aminoácidos da metaloprotease Adamalisyn II reportada na base de dados UniProt, código P34179. (B) Representação esquemática em cartoon da estrutura canônica com código PDB 1IAG onde o íon Zn (II) é representado em cinza, o íon de Ca (II) em verde e as ligações de dissulfeto em vermelho. (C) Representação geométrica da coordenação do íon de Zn (II). ______37

Figura 7 (A) A figura representa a sequência completa de aminoácidos da metaloprotease Trimerelysin II reportada na base de dados UniProt, código P20165. (B) Representação esquemática em cartoon da estrutura canônica com código PDB 1WNI, onde o íon Zn (II) é representado em cinza, o íon de Ca (II) em verde e as ligações de dissulfeto em vermelho. (C) Representação geométrica da coordenação do íon de Zn (II). ______38

Figura 8 (A) A figura representa a sequência completa de aminoácidos da metaloproteasa BaP1 reportada na base de dados UniProt, código P83512. (B) Representação esquemática em cartoon da estrutura canônica com código PDB 1ND1, onde o íon Zn (II) é representado em cinza, o íon Ca (II) em verde e as ligações de dissulfeto em vermelho. (C) Representação geométrica da coordenação do íon de Zn (II). ______40

Figura 9 Representação da frequência de clivagem para as posiçoes P4-P4´ (1 = P4; 2 =P3; 3 = P2; 4 = P1; 5 = P1´; 6 = P2´; 7 = P3´; e 8 = P3´ geradas da hidrólise da biblioteca de peptídeos trípticos deficiente de albumina de proteínas de plasma pela metaloprotease BaP1. Fonte:(LEME et al., 2011) ______40

Figura 10 (A) A figura representa a sequência de aminoácidos da metaloprotease Acutolisyn A madura reportada na base de dados UniProt, código Q9PW35. (B) Representação esquemática em cartoon da estrutura canônica com código PDB 1BSW, onde o íon Zn (II) é representado em cinza, o íon de Ca (II) em verde e as ligações de dissulfeto em vermelho. (C) Representação geométrica da coordenação do íon de Zn (II). ______41

Figura 11 (A) A figura representa a sequência de aminoácidos da metaloprotease Acutolisyn C madura reportada na base de dados UniProt, sob o código P60244. (B) Representação esquemática em cartoon da estrutura canônica com código PDB 1QUA, em cinza íon Zn (II) e em vermelho ligações de dissulfeto. (C) Representação geométrica da coordenação do íon Zn (II). ______42

Figura 12 Representação do mecanismo da reação da atividade proteolítica das metaloproteases. Passos (A) adição; (B) intermediário; (C) remoção e (D) o mecanismo de reação de clivagem do substrato pela metaloprotease (extraído de Ramos & Selistre-de-Araujo, 2006). ______43

Figura 13 Resumo dos múltiplos efeitos promovidos pelas metaloproteases de veneno de serpente na patogênese e dano tecidual local. Alguns efeitos são devidos à ação direta de metaloproteases de veneno, enquanto outros são efeitos indiretos (extraído de Gutierréz e Rucavado, 2000). ______44

Figura 14 Mecanismo hipotético de 'duas-etapas' para explicar danos nos vasos capilares levando à hemorragia induzida pelas SVMPs. O primeiro passo está associado com a clivagem proteolítica de componentes da membrana basal (BM) e proteínas da membrana em células endoteliais (CE) envolvidas na adesão célula-BM. O enfraquecimento da BM e células endoteliais abre o caminho para a segunda etapa, na qual o gradiente de pressão transmural distende a parede do capilar, aumentando a tensão da parede, processo este que induz ao desgaste das células endoteliais e a uma redução no número de vesículas pinocitóticas. Eventualmente, as células endoteliais são rompidas e são formadas aberturas na parede do capilar. Além disso, a tensão de cisalhamento do sangue dependente do fluxo pode causar dano mecânico adicional para as células endoteliais enfraquecidas. O resultado líquido deste processo é a ruptura das paredes capilares, o extravasamento e a consequente hemorragia (extraído deGutiérrez, J. M. et al., 2005). ______46

Figura 15 Representação do mecanismo geral das serina proteases (extraído de Hedstrom, 2002). 49

Figura 16 Etapas do acoplamento proteína-proteína para simulação computacional. ______50

Figura 17 Estrutura do inibidor Batimastat. ______54

Figura 18 (A) Esquema de purificação da BaP1. (B) Eletroforese em gel de poliacrilamida 12% de amostras da BaP1 corado com Azul de Coomassie, onde a última coluna à direita corresponde ao padrão de peso molecular (Protein Mixture LMW, GE Healthcare). ______73

Figura 19 (A) Eletroforese em gel de poliacrilamida 15 % de amostras da BaP1 incubadas a temperatura ambiente por diferentes períodos de tempo; da direita para esquerda padrão de peso molecular (Protein Mixture LMW, GE Healthcare), BaP1 0 h, BaP1 1 h, BaP1 2 h, BaP1> 24 h. (B) Determinação do peso molecular da banda majoritária do gel de poliacrilamida 15 % correspontende a BaP1. ______74

Figura 20 A figura representa na sua parte (A) o espectro de fluorescência da BaP1 a uma -1 -1 concentração de 4 mol L em tampão Tris-HCl (25 mmol L , pH 8), em (B) e (C) os diagramas da estrutura 3D da metaloprotease BaP1 com um inibidor co-cristalizado e os resíduos de triptofano em laranja em (B) e de tirosina em rosa em (C). E na parte (D) estão representados os pockets preditos pelo servidor DoGSite (http://dogsite.zbh.uni-hamburg.de). Onde todas as estruturas foram geradas no programa Pymol.

______75

Figura 21 Espectro de dicroísmo circular (CD) da BaP1 (4 µmol L-1) em tampão Tris-HCl (25 mmol L- 1; pH 8) ______76

-1 - Figura 22 Espectro de dicroísmo circular (CD) da BaP1 (4 mol L ) em tampão Tris-HCl (20 mmol L 1Tris-HCl, 100 mmolL-1 NaCl e pH 8) com diferentes quantidades de cálcio e Apo BaP1.. ______77

-1 Figura 23 Dados de intensidade de dicroísmo circular BaP1 (4 mol L ) em tampão Tris-HCl (25 mmol L-1 e pH 8) em 222 nm quando amostra foi aquecida de 20-80 °C. ______77

Figura 24 Purificação da proteína PIII de C. simus apartir do veneno bruto. (A) Separação das proteinas não aderidas na coluna de troca aniônica DEAE-Sepharose, (B) Separação das proteínas aderidas na coluna eluídas com um gradiente de NaCl. (C) e (D) Gel de Eletroforese SDS-PAGE 12% das frações isoladas. ______79

Figura 25 (A) Eletroforese em gel de poliacrilamida 15% de amostras da metaloprotease PIII do veneno da C. simus corado com Azul de Coomassie onde a última coluna à direita corresponde ao padrão de peso molecular (Protein Mixture LMW, GE Healthcare). (B) Sequência de aminoácidos da metaloprotease PIII madura do veneno da C. simus. Em azul o domínio metaloprotease; em vermelho o domínio desintegrina e em preto o dominio rico em cisteínas. ______80

Figura 26 Espectro de fluorescência da metaloprotease PIII do veneno da C. simus 6 µmol em tampão Tris-HCl (25 mmol L-1, pH 8) e excitada a 280 nm. ______81

Figura 27 Representação em cartoon da estrutura 3D prevista de para a proteína P III do veneno da C. simus pela plataforma I-TASSER. Com melhor score (A) modelo 1, (B) modelo 2, (C) modelo 3, (D) sobreposição dos modelos. ______82

Figura 28 (A) Espectro de dicroísmo circular (CD) da proteína PIII do veneno da C. simus na concentração de 6 µmol L-1. (B) Estabilidade térmica da proteína PIII do veneno da C. simus. (C) Efeito do pH na proteína PIII do veneno da C. simus.(D) Efeito dos cátions Ca(II) e Zn(II) na estrutura secundária da proteína PIII do veneno da C. simus. ______83

Figura 29 (A) Esquema de purificação das serina proteases do veneno de Crotalus durissus cumanensis.(B) Eletroforese em gel (SDS-PAGE 12%) de amostras da serina protease do veneno de Crotalus durissus cumanensis. Serino I (Cdc-SI) e Serino II (Cdc-SII) onde a última coluna à direita corresponde ao padrão de peso molecular (Protein Mixture LMW, GE Healthcare). ______84

Figura 30 Espectro de dicroísmo circular (CD) (A) da proteína serino I 6,6 µmol L-1 (Cdc-SI); (B) da proteína serino II 5 µmol L-1(Cdc-SII) do veneno da Crotalus durissus cumanensis. ______84

Figura 31 (A) Esquema de purificação das serina proteases do veneno de Crotalus simus. (B) Cromatografia de filtração em gel analítica do veneno total da Crotalus simus em Sephadex G-75 e G- 200 onde foram obtidas sete frações (I-VII). (C) Ensaio enzimático com o substrato BApNA, resultando em atividades proteolíticas as amostras I-IV. (D) Separação RP-HPLC em coluna C5 das frações de X1-X14 a partir do passo de exclusão molecular das quais as frações X7 e X10 apresentaram atividades proteolíticas com o substrato BApNA. (E) RP-HPCL em C5 das frações X7 e X10 a partir da RP-HPLC. Todas as frações apresentaram atividade proteolítica com o substrato BApNA. ______85

Figura 32 Gel de SDS-PAGE 12% das amostras dos picos p1-p4 em que as amostras p2 (Cs-SI) e p4 (Cs-SII) apresentaram bandas correspondentes a serina proteases de peso molecular de 28,5 e 23,0 kDa respectivamente. Da direita para esquerda: Padrão molecular (P), Veneno total (VT), p1, p2, p3 e p4. ______86

Figura 33 Espectro de dicroísmo circular (CD) onde em (A) se tem a serina protease I isolada da C. simus coletada do pico 2 (Cs-SI) e em (B) a serina protease coletada no pico 4 (Cs-SII).______87

Figura 34 Ilustração do alinhamento das sequências das SVMPs hemorrágicas e não hemorrágicas, em cores diferentes os resíduos idênticos e similares, sendo azul escuro para resíduos idênticos e azul claro para similares. ______88

Figura 35 Alinhamento das estruturas 3D das SVMP 1. (A) Em amarelo estão representadas as regiões menos conservadas, em verde a esfera correspondente ao íon cálcio (II) e em cinza a esfera correspondente a íon zinco (II). (B) Proteínas hemorrágicas (vermelho) BaP1 (código PDB: 1ND1), Acutolisyn A (código PDB: 1BSW), Acutolyisin C (código PDB:1QUA) e proteínas não hemorrágicas (azul) BmooMPalpha-I (código PDB:3GBO), Adamalisyn II (código PDB: 1IAG) e Trimerlisyn II (códigoPDB: 1WNI). ______89

Figura 36 Alinhamento das estruturas da BaP1 (código PDB: 1ND1 em vermelho), BmooMPalpha-I (código PDB: 3GBO em azul) com o complexo de MMP-1 ligado a um peptídeo de colágeno (código PDB: 4AUO). Para uma melhor visualização a estrutura da MMP-1 foi apagada. ______90

Figura 37 Modelos das SVMPs com as poses de maior pontuação ao interagir com o colágeno. (A) BaP1 (código PDB: 1ND1), (B) Acutolisyn A (código PDB: 1BSW), (C) Acutolyisin C (código PDB:1QUA), (D) BmooMPalpha-I (código PDB:3GBO), (E) Adamalisyn II (código PDB: 1IAG) e (F) Trimerlisyn II (códigoPDB: 1WNI). ______91

Figura 38 Pockets das SVMP gerados pelo servidor Dog Site Scorer, onde (A) e (G) são referentes a SVMP com códico PDB 1ND1, (B) e (H) com código PDB 1BSW, (C) e (I) com código PDB 1QUA, (D) e (J) com códico PDB 3GBO, (E) e (K) com código PDB 1IAG e (F) e (L) com o código PDB 1WNI. 92

Figura 39 Volume, área superficial e área lipofílica dos pockets localizado no sítio de clivagem das SVMP 1. Em vermelho estão representadas as proteínas hemorrágicas e em azul, proteínas não hemorrágicas. ______93

Figura 40 Descritores geométricos de profundidade e encerramento dos pockets localizados no sítio de clivagem das SVMP-1, em vermelho estão representadas proteínas hemorrágicas e em azul, proteínas não hemorrágicas. ______94

Figura 41 Representação 2D das ligações dos íons cálcio nas metaloproteases de veneno de serpente: (A) Adamalysin II (código PDB: 1IAG); (B) Bmoompalfa-I (código PDB: 3GBO) e (C) Acutolysin-A (código PDB: 1BSW). ______95

Figura 42 Contatos internos (ITC) dos resíduos com possibilidade de ligação ao íon cálcio (II): (A) Glu9, (B) Asp93, (C) Cys197, (D) Asn200 e (E) Lys131 na estrutura da BaP1 (código PDB: 1ND1). 97

Figura 43 Estrutura da BaP1 (código PDB: 1ND1). Em roxo, resíduos com possibilidade de ligação ao cálcio; em vermelho, resíduos com contato interno com os resíduos de ligação ao cálcio e em amarelo, Lys131. A esfera em cinza corresponde ao zinco. ______98

Figura 44 Alinhamento das SVMP e comparação dos sítios de ligação ao cálcio. ______99

Figura 45 Descrição do nano-ambiente dos resíduos ligados ao cálcio (A) Adamalisyn II (código PDB: 1IAG), (B) BmooMPalpha-I (código PDB:3GBO) e (C) Acutolisyn A (código PDB: 1BSW). ______100

Figura 46 Descrição do nano-ambiente no sítio de ligação ao cálcio nas estruturas onde não foi determinado sua ligação (A) BaP1 (código PDB: 1ND1), (B) Trimerlisyn II (códigoPDB: 1WNI) e (C) Acutolyisin C (código PDB: 1QUA). ______101

Figura 47 Comparação de alguns parâmetros estruturais nos sítios de ligação ao cálcio (A) Fator de temperatura e (B) potencial eletrostático na superfície. Sendo em ambas as figuras em azul SVMPs sem cálcio e em laranja SVMPs com cálcio. ______102

Figura 48 Diagramas de topologia das metaloproteases de veneno de serpente hemorrágicas (A) BaP1 (código PDB: 1ND1), (B) Acutolisyn A (código PDB: 1BSW), (C) Acutolyisin C (código PDB:1QUA); e das não hemorrágicas (D) BmooMPalpha-I (código PDB:3GBO), (E) Adamalisyn II (código PDB: 1IAG) e (F) Trimerlisyn II (códigoPDB: 1WNI). ______104

Figura 49 Representação 2D das ligações dos íons zinco nas metaloproteases de veneno de serpente: (A) BaP1 (código PDB: 1ND1), (B) Acutolisyn A (código PDB: 1BSW), (C) Acutolyisin C (código PDB:1QUA); e das não hemorrágicas (D) BmooMPalpha-I (código PDB:3GBO), (E) Adamalisyn II (código PDB: 1IAG) e (F) Trimerlisyn II (códigoPDB: 1WNI).

______105

Figura 50 Nano-ambiente do sítio de ligação ao zinco nas metaloproteases de veneno de serpente. BmooMPalpha-I (código PDB:3GBO), Adamalisyn II (código PDB: 1IAG), Trimerlisyn II (códigoPDB: 1WNI), BaP1 (código PDB: 1ND1), Acutolisyn A (código PDB: 1BSW), Acutolyisin C (código PDB:1QUA). ______106

Figura 51 Identificação do sítio de ligação do ligante co-cristalizado na BaP1 (código PDB 2W14). (A) Representação do ligante co-cristalizado em verde. (B) Representação do modelo do farmacóforo onde em cinza se tem o volume de exclusão, em verde o doador de ligações de hidrogênio, em roxo o aceptor de ligações de hidrogênio e em azul os grupos hidrofóbicos; (C) Representação do nanoambiente dos resíduos que fazem contato com o ligante co-cristalizado. ______109

Figura 52 Diagrama de fluxo de trabalho a preparação dos ligantes das bibliotecas Zinc, PubChem e ChemBL com o programa Pipeline Pilot. ______109

Figura 53 Diagrama de fluxo de trabalho desenvolvido para o HTS com BaP1 com o programa Pipeline Pilot. ______110

Figura 54 Interações dos cinco compostos escolhidos com a BaP1 (A) ZINC08767570; (B) ZINC19201999; (C) ZINC36615464; (D) ZINC04429579 e (E) ZINC06812429. ______112

Figura 55 Histograma das interações das soluções do Docking com a proteína BaP1. ______113

Figura 56 Interações da conformação com melhor Score com a BaP1 resultado dos cálculos de Docking: (A) ZINC08767570; (B) ZINC19201999; (C) ZINC36615464; (D) ZINC04429579 e (E) ZINC06812429. ______114

Figura 57 Espectros de fluorescência de emissão da BaP1 e da BaP1 com os inibidores (A) composto ZINC06812429, A1 e (B) composto ZINC08767570, A2. ______116

Figura 58 Serina proteases homólogas as da serpente Crotalus durissus cumanensis e seus “pockets” na superfície enzimática, um potencial sítio de ligação com os pequenos compostos químicos (possíveis fármacos). As serina proteases homólogas encontradas por meio dos programas computacionais são trombolíticas e são das víboras A) Agkistrodos halys (código PDB: 4E7N) e B) Agkistrodos acutus (código PDB: 1OP0). ______117

Figura 59 Interação enzima-inibidor no pocket 1 da enzima de código PDB 4E7N. (A) e (F) Hesperitina; (B) e (G) Warfarina;(C) e (H) Nafamostat; (D) e (I) Camostat; (E) e (J) Sivelestat. ___ 117

Figura 60 Estrutura química das moléculas utilizadas para fazer o docking com as enzimas de códigos PDB 4E7N e1OP0. ______118

Figura 61 Interação enzima-inibidor no pocket 1 da enzima de código PDB 4E7N (A) e (C) e no pocket 6 da enzima de código PDB 1OP0 (B) e (D). ______118

Figura 62 Propriedades cinéticas e inibição das enzimas SVSP1 e SVSP2. Curva de Michaelis- Menten da (A) SVSP1 e (C) SVSP2. Curva de Lineweaver-Burk da (B) SVSP1 e (D) SVSP. _____ 119

Figura 63 Espectros de fluorescência de emissão referente as serina proteases isoladas do veneno de C. simus a uma concentração 4 µM com e sem o inibidor hesperitina (8 µM) a A) Cs-SI e B) Cs-SII. ______121

Figura 64 Gráfico de Stern-Volmer para a SVSP isoladas do veneno de Crotalus durissus cumanensis interagindo com hesperitina. ______122

Figura 65 Avaliação da viabilidade celular de células endoteliais de aorta de coelho (RAEC) na presença de BaP1 ou PIII (0-100 µg mL-1). ______123

Figura 66 Avaliação da formação de estruturas capilares pelas células RAEC em membrana basal reconstituída (Matrigel) na presença das SVMPs BaP1 e PIII. ______124

Figura 67 Imagens das estruturas capilares em membrana basal reconstituída obtidas por microscopia ótica. ______124

Figura 68 Teste de membrana corioalantóicas (CAM) em ovos de galinha de 11 dias de idade. (A) Controle positivo, (B) controle negativo, (C) 10 µL de BaP1 (0,5 µmol L-1), (D) 10 µL de PIII (0,5 µmol L-1). ______125

Figura 69 Espectro de dicroismo circular (CD) da Lisozima (4 µmolL-1) em tampão Tris-HCl (25 mmol L-1 e pH 8). ______143

Figura 70 Parâmetros do programa Sting ______144

Figura 71 Cluster dos modelos de farmacóforo ______162

Figura 72 Características dos aceptores de ligações de hidrogênio do farmacóforo gerado manualmente da metaloproteases BaP1,com código PDB: 2W14.______163

Figura 73 Biblioteca de inibidores de quinases e o ligante co-cristalizado Batimastat, utilizados no análise de ROC (Receiver Operating Characteristic) para avalidar o modelo de farmacóforo. ____ 168

Figura 74 Curva ROC do modelo de farmacóforo. ______171

Figura 75 Gráfico do mapa de calor para a interação dos ligantes com os modelos de farmacóforos. ______172

Figura 76 Cromatograma da fracionamento do veneno bruto da Bothrops asper com a coluna de CM- Sephadex ______173

Figura 77 Cromatograma da purificação da BaP1 com a coluna Affi Gel Blue. ______173

Figura 78 Purificação da fração da PIII pos DEAE 2P3 em uma coluna MonoQ acoplada em um FPLC, usando um tampão de Tris 20mM, pH7,0 e eluí-se com um gradiente de NaCl 0-1,0 mol L-1 174

Lista de Tabelas

Tabela 1 Contagem das proteases e de seus homólogos, e suas sequências, que estão incluídos na base de dados MEROPS ...... 29

Tabela 2 Sítios de clivagem da Trimerelysin II ...... 39

Tabela 3 Comparação da porcentagem de estrutura secundária estimada com as medições experimentais da BaP1, com o reportado pelo autor (PDB) e com o algoritmo para a atribuição da estrutura secundária STRIDE e DSSP

...... 76

Tabela 4 Sequência de peptídeos trípticos identificados por espectrometria de massas e o domínio correspondente...... 81

Tabela 5 Desvio da raiz quadrada média (RMSD) dos alinhamentos da cadeia principal RMSD (angstrom das estruturas das SVMP) abaixo da diagonal e Número de sobreposição de resíduos acima da diagonal ...... 89

Tabela 6 Distância do oxigênio da N200 ao cálcio nas SVMPs ...... 99

Tabela 7 Determinação de parâmetros para classificar metaloproteases hemorrágicas e não hemorrágicas ...... 107

Tabela 8 CDOCKER_ENERGY e porcentagem de inibição in vitro dos compostos selecionados com a proteína BaP1...... 115

Tabela 9 Melhores valores da interação enzima-inibidor (–CDOCKER ENERGY) para a enzima de código PDB 4E7N (pocket 1) e PDB 1OP0 (pocket 6)...... 118

Tabela 10 Parâmetros cinéticos para as enzimas Cs-SIe Cs-SII. Os valores de VMax, KM e kcat modificam com a presença da hesperitina em ambas as enzimas...... 120

Tabela 11 Clãs das metalopeptidases ...... 139

Lista de Abreviaturas

BaP1 Metaloprotease tipo P1 do veneno de Bothrops asper

BmooMPa-I Metaloprotease tipo P1 do veneno de Bothrops moojeni

CD do inglês Circular Dichroism

Cd SI Serina protease I do veneno de Crotalus durissus cumanensis

Cd SII Serina protease II do veneno de Crotalus durissus cumanensis

SVSP-I Serina protease I do veneno de Crotalus simus

SVSP-II Serina protease II do veneno de Crotalus simus

DLS do inglês Dynamic Light Scattering

MB Membrana basal

MMP Metalo Protease da matriz

PDB do ingl̂s Protein Data Bank

STRIDE algoritmo automático para a atribuição da estrutura secundária

SVMP do inglês Snake Venom Metalloprotease

SVSP do inglês Snake Venom Serine Protese

Sumário

1 INTRODUÇÃO ...... 24

1.1 PEÇONHA DE SERPENTES ...... 25

1.2 CLASSIFICAÇÃO DE PROTEASES ...... 28

1.3 SÍTIO DE CLIVAGEM DAS PROTEASES ...... 30

1.4 METALOPROTEASES ...... 31

1.4.1 CLASSIFICAÇÃO DE METALOPROTEASES DE VENENO DE SERPENTE ...... 33

1.4.1.1 BmooMPalpha-I ...... 35

1.4.1.2 Adamalisyn II...... 36

1.4.1.3 Trimerelysin II ...... 38

1.4.1.4 BaP1 ...... 39

1.4.1.5 Acutolisyn A ...... 41

1.4.1.6 Acutolyisin C ...... 42

1.4.2 MECANISMO DE CLIVAGEM DAS SVMP ...... 43

1.4.3 EFEITOS BIOLÓGICOS DAS METALOPROTEASES ...... 44

1.4.3.1 Efeito hemorrágico ...... 44

1.4.3.2 Classificação baseada na atividade hemorrágica ...... 46

1.5 SERINA PROTEASES ...... 46

1.5.1 MECANISMO DE CLIVAGEM DAS SVSP ...... 48

1.6 ABORDAGENS IN SILICO PARA A DESCOBERTA DE INIBIDORES E INTERAÇÃO PROTEÍNA-PROTEÍNA 49

1.6.1 DOCKING ...... 49

1.6.2 ACOPLAMENTO PROTEÍNA-PROTEÍNA ...... 50

1.6.3 NANO-AMBIENTE ...... 51

1.7 INIBIDORES ...... 52

1.7.1 NEUTRALIZAÇÃO DE TOXINAS DE VENENO DE SERPIENTE ...... 52

1.7.2 NEUTRALIZAÇÃO DE EFEITOS LOCAIS ...... 53

1.7.2.1 Inibidores de SVMP ...... 53

1.8 POTENCIAL FARMACOLÓGICO DAS TOXINAS ISOLADAS DE VENENO DE SERPENTE ...... 55

2 OBJETIVOS ...... 56

3 PARTE EXPERIMENTAL ...... 58

3.1 ISOLAMENTO DE PROTEÍNAS ...... 59

3.1.1 ISOLAMENTO DA BAP1 ...... 59

3.1.2 ISOLAMENTO DA SVMPP-III DE C. SIMUS ...... 59

3.1.3 ISOLAMENTO DA SERINA PROTEASE DE C. DURISSUS CUMANENSIS...... 59

3.1.4 ISOLAMENTO DE SERINA PROTEASE DE C. SIMUS ...... 60

3.2 CARACTERIZAÇÃO DE PROTEÍNAS ...... 61

3.2.1 DICROÍSMO CIRCULAR (CD) ...... 61

3.2.1.1 Efeito do cálcio na BaP1 ...... 62

3.2.1.2 Efeito do pH e dos íons cálcio e zinco na PIII de C. simus ...... 62

3.2.2 ESPECTRO DE FLUORESCÊNCIA ...... 62

3.2.3 IDENTIFICAÇÃO DE PEPTÍDEOS INTERNOS DA PIII DE C. SIMUS ...... 62

3.3 ANÁLISES POR BIOINFORMÁTICA ...... 63

3.3.1 ALINHAMENTO DAS PROTEÍNAS ...... 63

3.3.2 INTERAÇÃO PROTEÍNA-PROTEÍNA ...... 64

3.3.3 DETERMINAÇÃO DE POCKETS E PARÂMETROS ESTRUTURAIS ...... 64

3.3.3.1 Análise Estatística ...... 65

3.3.3.2 Determinação de parâmetros que permitam classificar metaloproteases hemorrágica e não hemorrágicas ...... 65

3.3.3.3 Representação 2D da coordenação dos íons Ca(II) e Zn(II) nas SVMP ...... 65

3.3.3.4 Diagramas de topologia ...... 66

3.4 INTERAÇÃO PROTEÍNA-INIBIDOR (DOCKING) ...... 66

3.4.1 PREPARAÇÃO DA PROTEÍNA BAP1 ...... 66

3.4.2 PREPARAÇÃO DOS LIGANTES PARA A SVMP BAP1 ...... 66

3.4.3 RECEPTOR E SÍTIO DE LIGAÇÃO ...... 67

3.4.4 DESENHO DE FARMACÓFORO ...... 67

3.4.5 PREPARAÇÃO DAS PROTEÍNAS HOMOLOGAS DAS SVSP ...... 68

3.4.6 PREPARAÇÃO DOS LIGANTES PARA AS SVSP ...... 68

3.4.7 DOCKING COM AS SVSP ...... 68

3.5 ENSAIO DE INIBIÇÃO DA ATIVIDADE PROTEOLÍTICA COM AZOCASEÍNA ...... 68

3.6 TESTE ATIVIDADE COAGULANTE ...... 69

3.7 ENSAIO DE ATIVIDADE E INIBIÇÃO DA ATIVIDADE PROTEOLÍTICA COM BAPNA...... 69

3.8 ENSAIOS DE ATIVIDADE BIOLÓGICA DAS PROTEÍNAS PURIFICADAS ...... 69

3.8.1 CULTURA DE CÉLULAS ENDOTELIAIS DE AORTA DE COELHO (RAEC)...... 69

3.8.2 AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE CELULAR PELO ENSAIO DE REDUÇÃO DO SAL REZASURIN SÓDICO EM

RESORUFIN 70

3.8.3 ENSAIO DE FORMAÇÃO DE ESTRUTURAS TIPO CAPILAR EM MEMBRANA BASAL RECONSTITUÍDA

(MATRIGEL) 70

3.8.4 ENSAIO DE INIBIÇÃO DE ANGIOGÊNESE EM MEMBRANA CORIONALANTÓIDE DE EMBRIÃO DE

GALINHA (IN OVO) ...... 71

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 72

4.1 CARATERIZAÇÃO DA PROTEÍNA ...... 73

4.1.1 CARATERIZAÇÃO DA PROTEÍNA BAP1 SVMP (P1A) ...... 73

4.1.2 CARACTERIZAÇÃO DA PROTEÍNA DA PIII DE C. SIMUS ...... 78

4.1.3 CARACTERIZAÇÃO DAS SERINA PROTEASES DE VENENO DE CROTALUS DURISSUS CUMANENSIS 83

4.1.4 CARACTERIZAÇÃO DAS SERINA PROTEASES DE VENENO DE CROTALUS SIMUS ...... 85

4.2 COMPARAÇÃO DE PROTEÍNAS SVMP-I HEMORRÁGICAS E NÃO HEMORRÁGICAS ...... 87

4.2.1 FUNÇÃO DO CÁLCIO NAS SVMP ...... 94

4.3 INTERAÇÕES PROTEÍNA-INIBIDOR ...... 108

4.3.1 INIBIDORES DE SVSP DO VENENO DE C. SIMUS E CROTALUS DURISSUS CUMANENSIS ...... 116

4.4 ENSAIOS DE ATIVIDADE BIOLÓGICA DAS PROTEÍNAS ...... 123

5 CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS ...... 126

6 BIBLIOGRAFIA ...... 129

7 APÊNDICE ...... 138

7.1 ALINHAMENTO DAS PROTEÍNAS ...... 145

7.2 DOCKING PROTEÍNA-PROTEÍNA: ZDOCK ...... 148

7.3 DETERMINAÇÃO DE PARÂMETROS PARA CLASSIFICAR METALOPROTEASES HEMORRÁGICA E NÃO

HEMORRÁGICAS ...... 155

7.4 DOCKING: PROTEÍNA-INIBIDOR ...... 160

Capítulo 1. Introdução

‘‘Dosis sola facit venenum’’

(Paracelsus)

1 INTRODUÇÃO

Os acidentes causados por picada de serpente ou ofidismo são um problema de saúde pública em muitos países tropicais e subtropicais, por esses serem ambientes propícios à vida desses animais, e integram o grupo de doenças negligenciadas. Tornando – se uma das muitas doenças negligenciadas que essas regiões enfrentam, doenças que ño só prevalecem em condiç̃es de pobreza, mas também contribuem para a manutenç̃o do quadro de desigualdade, já que representam um forte entrave ao desenvolvimento desses páses (Departamento de Ciência e Tecnologia do Ministério da Saúde, 2010; Gutiérrez, J. M., Theakston e Warrell, 2006a).

Esses acidentes acometem ao redor de 2,5 milhões de pessoas por ano, dos quais cerca de 125 mil têm um desfecho fatal (Chippaux, 2009; Williams et al., 2010), ocorrendo principalmente entre as pessoas que vivem em áreas rurais da Ásia, África e América Latina (Harrison et al., 2009; World Health Organization, 2007).Onde as vítimas sobreviventes podem apresentar sequelas físicas permanentes devido à necrose do tecido no local da picada e, por vezes, até sequelas psicológicas (Gutiérrez, J. M., Theakston e Warrell, 2006b).

Na América Latina, a maioria dos acidentes ofídicos são causados pelas serpentes da família Viperidae, em que os venenos contêm uma elevada porcentagem de metaloproteases zinco-dependentes, que desempenham um papel relevante na patogênese da hemorragia característica destes envenenamentos. Além de conter algumas serina proteases, que estão diretamente envolvidas a eventos proteolíticos, causando perturbações na hemostasia observada após o envenenamento (Gutiérrez, J. M. e Rucavado, 2000; Matsui, Fujimura e Titani, 2000).

1.1 Peçonha de serpentes

As serpentes se dividem em dois grupos principais. As scolecophidias, que são pequenas serpentes que se alimentam de formigas e térmitas, e as que pertencem ao grupo aletinofídio (Alethinophidia) que são ecologicamente diversas e que se alimentam principalmente de vertebrados. A infraordem Alethinophidiase 26

subdivide-se em quinze famílias listadas abaixo (Mackessy, 2009) (http://www.itis.gov):

 Acrochordidae  Aniliidae  Anomochilidae  Atractaspididae  Boidae  Bolyeriidae  Colubridae  Cylindrophiidae  Elapidae  Loxocemidae  Pythonidae  Tropidophiidae  Uropeltidae  Viperidae  Xenopeltidae Os vipéridos (Viperidae) são uma família de serpentes muito venenosas que compreendem as víboras do Velho Mundo e os crótalos, principalmente americanos que é subdividida em quatro subfamílias (http://www.itis.gov):

 Subfamília Azemiopinae  Subfamília Causinae  Subfamília Crotalinae  Subfamília Viperinae Os crotalinos ou crótalos (Crotalinae) são uma subfamília de serpentes formada por vários gêneros venenosos, representados a baixo, encontrados principalmente na América e também na Ásia (http://www.itis.gov).

 Agkistrodon  Atropoides  Bothriechis  Bothriopsis  Bothrops  Calloselasma  Cerrophidion  Crotalus  Deinagkistrodon  Gloydius  Hypnale  Lachesis  Ophryacus 27

 Ovophis  Porthidium  Sistrurus  Trimeresurus  Tropidolaemus As espécies do gênero Bothrops e Crotalus, da subfamília Crotalinae e da família Viperidae, são consideradas as espécies de maior perigo para o homem devido ao grande número de registro de picadas e aos efeitos altamente tóxicos dos seus venenos.

Em geral a composição dos venenos das serpentes apresenta uma mistura complexa entre proteínas (mais de 90% do peso seco) e moléculas orgânicas de baixo peso molecular como: citrato, aminoácidos, carboidratos, aminas biogênicas; e compostos inorgânicos (cálcio, cobalto, cobre, ferro, fósforo, potássio, magnésio, manganês, sódio e zinco) (Aragón-Ortiz e Bolaños-Herrera, 1977; Doery, 1956; Francis, Seebart e Kaiser, 1992; Friederich e Tu, 1971). Sendo este coquetel secretado por glândulas exócrinas especializadas onde a mistura complexa de toxinas contribui para subjugar, matar e digerir a presa.

No caso das Viperidae as toxinas podem ser agrupadas em famílias de proteínas que incluem enzimas, como as proteases (serina proteases e metaloproteases dependentes de zinco), L-amino oxidases, e fosfolipases II (PLA2) e proteínas sem atividade enzimática (desintegrinas, moléculas de lectina tipo C, peptídeos potenciadores de bradicinina, miotoxinas, fatores de crescimento endotelial e etc) (Calvete, Juárez e Sanz, 2007; Fry et al., 2005). Cada família de toxina é usualmente representada no mesmo veneno por múltiplas proteínas, que diferem na sua atividade farmacológica, mas que podem compartilhar notáveis semelhanças estruturais e antigênicas (Fry, 2004). No entanto as proteínas específicas encontradas nos venenos de espécies diferentes podem variar na sequência de aminoácidos e na abundância e, assim, contribuir para as diferenças na atividade biológica global de venenos individuais. A variabilidade na composição de proteínas entre os venenos de serpentes de indivíduos de diferentes origens geográficas, sexo ou idade é um fenômeno bem documentado (Alape-Girón et al., 2009; Barlow et al., 2009; Calvete et al., 2010; Chippaux, Williams, V. e White, 1991), e essa variabilidade tem implicações muito importantes para a produção e 28

utilização de antivenenos e no tratamento de envenenamentos por acidentes ofídicos.

1.2 Classificação de proteases

As proteases são enzimas que hidrolisam as ligações peptídicas e são classificadas como exoproteases ou endoproteases com base nos sítios de clivagem da ligação peptídica que podem ocorrer em posições terminais ou em regiões internas do peptídeo respectivamente (Barrett e McDonald, 1986).

Atualmente estão disponíveis dados de sequências de aminoácidos e de estrutura de mais de 500 mil proteases, porém apenas 747 foram identificadas e têm sua estrutura 3D depositada na base de dados “Protein Data Bank” (PDB) como apresentado na Tabela 1.

Neil Rawlings e Alan Barrett determinaram que existem linhas “evolutivas” distintas que podem ser utilizadas para classificar as proteases. Esta classificação assume a existência de famílias ou grupos de famílias relacionadas ("clãs"), das quais as propriedades das proteases têm sido consideradas a partir de dois pontos de vista principais, o primeiro sendo a divergência em atividade catalítica e o segundo a convergência das propriedades (Rawlings e Barrett, 1993).

O termo Tipo catalítico é usado para referir a um conjunto de proteases distinguíveis pelo grupo químico responsável pela catálise (Rawlings e Barrett, 1993), podendo ser divididas em:

 Serinaprotease  Cisteínaprotease  Aspárticoprotease  Metaloprotease  Glutâmicoprotease 29

Tabela 1. Contagem das proteases e de seus homólogos, e suas sequências, que estão incluídos na base de dados MEROPS1

Identificada Identificada com Tipo catalítico Sequência Identificador com entrada número EC PDB Aspártico 27737 315 32 53 Cisteína 113612 979 78 165 Glutâmico 396 7 2 3 Metalo 162597 1063 132 212 Asparagina 3530 24 3 19 Mistura 6960 52 0 7 Serina 183035 1689 119 252 Treonina 18300 97 6 32 Desconhecidas 7700 18 0 4 Não clasificadas 4 3 24 - Grande Total 523871 4247 396 747 Total Famílias 253 Total clãs 61

O termo Família é usado para descrever um grupo de proteases no qual os membros mostram uma relação ‘’evolutiva’’ ao menos uma com outra ao longo da sequência ou em parte da sequência responsável pela atividade catalítica (Rawlings e Barrett, 1993). Cada família é identificada por uma letra maiúscula, que representa o tipo do grupo catalítico (S para o tipo-serina, T para o tipo-treonina; C para o tipo- cisteína, A para o tipo aspártico, M para o tipo metalo, e U para o tipo desconhecido), seguido por um número único. Porém, não existe uma sequência completa dos números de cada família, pois, por vezes, alguns números deixam de ser usados, por diferentes razões, e tais números nunca são reutilizados. E uma família que contém grupos muito divergentes pode ser dividida em subfamílias identificadas por letras maiúsculas.

Já o termo clã é um grupo de famílias que se pensa ter ancestralidade comum. Os membros são mais frequentemente reconhecidos por semelhanças na estrutura terciária, mas evidências como a ordem de resíduos catalíticos na sequência podem ser úteis (Rawlings e Barrett, 1993). Os clãs de muitas famílias são ainda desconhecidos, sendo cada clã identificado por duas letras maiúsculas, a

1 http://merops.sanger.ac.uk 30

primeira especifica o tipo do catalisador (como para famílias), e a segunda é única para o clã. A base de dados MEROPS (http://merops.sanger.ac.uk/) é um repositório de proteases que segue esta classificação (Rawlings, Barrett e Bateman, 2009).

1.3 Sítio de clivagem das proteases

A especificidade das proteases por clivar substratos perto da posição N- ou C- terminal (exoproteases), ou no meio do substrato (endoproteases) acontece através da ligação do sítio ativo da protease com os resíduos de substrato vizinhos ao local de clivagem. Os resíduos do sítio ativo na protease são compostos de cavidades contínuas denominadas de subsítios. Cada cavidade do subsítio liga-se a um resíduo correspondente na sequência do substrato, aqui referida como a sequência de posição. De acordo com esta definição, os resíduos de aminoácidos na sequência de substrato são numerados consecutivamente para fora a partir dos locais de clivagem como ··· -P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'- ··· onde a ligação clivável está localizada entre as posições P1 e P1', enquanto os subsítios no sítio ativo são correspondentemente rotulado como S4-S3-S2-S1-S1'-S2'-S3'-S4' (Schechter e Berger, 2015; Songet al., 2011).

Figura 1. Nomenclatura específica para o substrato da protease, em que os resíduos de aminoácidos no substrato são numerados para fora do local de clivagem como ··· -P4 -P3 - P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'- ···, e o local de clivagem é destacado pela seta preta, entre P1 e P1'. 31

1.4 Metaloproteases

As metaloproteases estão entre as hidrolases em que o ataque nucleofílico sob uma ligação peptídica é mediado por uma molécula de água, que é ativada por um cátion metálico bivalente, geralmente zinco, mas também podendo ser cobalto e manganês, dependendo do número de íons metálicos necessários para a catálise, atuando como 'co-cataliticamente' (Rawlings e Barrett, 2012).

As metaloproteases tem sido clasificadas em 16 clãs (Apêndice; Tabela 11), onde as proteases dos clãs MA, MC, MD, ME, MJ, MM, MO, MP e MT têm só um íon metálico catalítico, que usualmente é o Zn (II). Por outro lado, as proteases dos clãs MF, MG, MH, MN e MQ têm íons metálicos co-catalíticos (Rawlings e Barrett, 2012; Rawlings, Barrett e Bateman, 2009).

As metaloendoproteases (MEP; subclasse E.C. 3.4.24) são ubíquas e amplamente envolvidas na regulação do metabolismo por ter capacidade de degradar inúmeras proteínas e também hidrolisar seletivamente ligações peptídicas específicas (Sternlicht e Werb, 2001). As enzimas zinco dependentes são encontradas em organismos de todos os Reinos e são responsáveis por catalisarem a digestão ou degradação de proteínas e pelo desenvolvimento, manutenção, e remodelação dos tecidos (Gomis-Rüth, 2003). Além disso, elas estão envolvidas em mecanismos de ativação através de clivagem específica e limitada às ligações peptídicas de outras enzimas, pró-enzimas, peptídeos bioativos, repressores de DNA, ou das mesmas podendo ser ativadas ou inativadas. Algumas MPE também são capazes de liberar formas solúveis de citocinas e de outros peptídeos bioativos a partir de precursores ancorados às membranas. Assim, elas estão envolvidas na redução das concentrações de proteína na superfície das células e no aumento dos níveis das formas circulantes (Neurath e Walsh, 1976) (Yong, 2005). 32

Figura 2. Esquema de classificação das MEPs de acordo com a sua assinatura de ligação de zinco conhecidas, incluindo apenas as famílias de proteases para as quais as estruturas tridimensionais estão disponíveis.

A maioria das enzimas zinco dependentes pertencem à classe nomeada dezincina, que possuem uma sequência de consenso curta, HEXXH, onde X representa qualquer resíduo de aminoácido, com as duas histidinas atuando como ligantes do zinco catalítico e o glutamato como uma base geral. Uma subclasse das zincinas é caracterizada por um motivo C-terminal alongado, HEXXHXXGXXH/D, com uma glicina adicional estritamente conservada e uma terceira histidina ou aspartato ligado ao zinco. Esta subclasse é conhecida como metzicinas, que contêm seis famílias de proteases diferentes, que apresentam estruturas tridimensionais típicas. Na Figura 2 se apresenta um esquema desta classificação, que apesar da baixa similaridade de sequência, apresentam topologia global comparável, incluindo uma fenda de ligação ao substrato, que subdivide a enzima em subdomínios, um na parte superior e outro na inferior. A presença de cinco cadeias de folhas-β e duas de -hélices são sempre encontradas no subdomínio superior, Figura 3(B). Além disso, estas proteínas contendo -hélices englobam a primeira metade da sequência de consenso alongada e, portanto, é denominada -hélice do sítio ativo. Outras características comuns são: uma metionina conservada contendo Met-turn sob o metal catalítico e mais uma -hélice C-terminal no subdomínio inferior. Todas estas características estruturais identificam o clã metzincina de metaloendoproteases (Gomis-Rüth, 2003). 33

1.4.1 Classificação de Metaloproteases de veneno de serpente

As metaloproteases presentes em veneno de serpente (SVMP) são um conjunto de enzimas zinco dependentes, da subclasse Metzicinas, que apresentam a sequência conservada HEXXHXXGXXH no domínio catalítico onde, também, se apresenta um íon de zinco(II), que está coordenado a três histidinas e a uma molécula de água (Figura 3) (Watanabe et al., 2003). A molécula de água do sítio catalítico forma ligações de hidrogênio com o ácido glutâmico que atua como base na reação de hidrólise dos substratos. Outro resíduo altamente conservado é a metionina (M) que faz parte do loop Met-turn formado pela sequência C(I/V)M, onde a metionina forma uma base hidrofóbica com os três resíduos de histidina no sítio catalítico (Bode, Gomis-Rüth e Stöckler, 1993)

B C

Figura 3. (A) A figura representa a coordenação do íon zinco (II) a três histidinas e a uma molécula de água (Lingott et al., 2009). (B) Estrutura da metaloprotease BaP1 (PDB: 1ND1) representada em cartoon onde, em azul são as -hélices, em amarelo as folhas-, e em verde voltas e estruturas randômicas. (C) Topologia do domínio catalítico da metzincina, da família adamalysins/ADAMs, onde o esquema mostra os elementos da estrutura secundária regular. Mostrando as -hélices como cilindros, as folhas-, como flechas, as ligações de hidrogênio e ligações metal-ligante como linhas tracejadas, ligações de dissulfeto como linhas sólidas laranja, segmentos desordenados ou pontos de inserção de domínios adicionais por linhas azuis e resíduos específicos da família estão representados em vermelho (Cerdà-Costa e Xavier Gomis-Rüth, 2014). 34

Figura 4. Esquema de classificação das SVMP, onde o símbolo (?) refere-se ao produto do processamento não identificado no veneno (Fox e Serrano, 2008).

As metaloproteases de baixo peso molecular (20–25 kDa) formadas apenas pelo domínio catalítico pertencem à classe P-Ia em que a sequência-sinal é clivada por uma peptidase-sinal no espaço da matriz, para formar a proteína madura e apresenta um número variado de cisteínas em suas sequências, de 4 a 7 resíduos (Bjarnason e Fox, 1994). Os precursores da classe P-II geram proteínas pós- tradução formadas somente pelo domínio catalítico ou somente o domínio tipo desintegrina (P-IIa) e, também, proteínas que conservam o domínio desintegrina, podendo ser monoméricas P-IIb ou diméricas P-IIc. Esta classe também abrange as desintegrinas verdadeiras (com a sequência RGD em sua estrutura) homo e heterodiméricas, P-IId e P-IIe, respectivamente.

As proteases da classe P-III são proteínas de peso molecular maior entre 50 e 110 kDa que apresentam uma maior atividade hemorrágica que a classe P-I. No formato pós-traducional apresentam o domínio catalítico e o domínio tipo desintegrina seguido de um domínio rico em resíduos de cisteína na região C- terminal; na forma monomérica elas pertencem as P-IIIa e na forma dimérica as P- IIIc. Proteínas pós-tradução compostas pelos domínios tipo desintegrina e rico em 35

cisteínas (Cys Rich) são as P-IIIb. As P-IIId, antigamente P-IV, são compostas pelos seguintes domínios: catalítico, tipo desintegrina, rico em resíduos de cisteínas e mais duas cadeias de lectinas ligadas ao domínio rico em cisteínas por ligações de dissulfeto (Fox e Serrano, 2008).

1.4.1.1 BmooMPalpha-I

A BmooMPalpha-1, também conhecida como Caiçaca, é uma metaloprotease do tipo PI isolada do veneno da Bothrops moojeni que tem peso molecular de de 22,6 kDa. Sua sequência de referência encontra-se depositada na base de dados UniProt com o código P85314 (Figura 5(A)) e dispõe de estrutura cristalina depositada na base de dados PDB (código PDB: 3GBO), como se apresenta na Figura 5(B). E na base de dados MEROP é classificada no clã MA, subclã MA(M), família M12, subfamília M12B, e corresponde à protease com código M12.338 (de Arruda Campos Brasil de Souza et al., 2012).

Um aspecto interessante desta proteína é o modo de coordenação do íon zinco, que apresenta uma coordenação pouco usual nas SVMP tipo P1. Sua coordenação é octaédrica e é formada pelos átomos N2 das três histidinas e pelas águas OW131, OW143 e OW144, Figura 5(C). Além disso, contém o íon cálcio estrutural situado na região de inteseção entre os extremos N e C-terminais (Akao et al., 2010).

Figura 5. (A) A figura representa a sequência completa de aminoácidos da metaloprotease BmooMPalpha-1 reportada na base de dados UniProt, código P85314. (B) Representação esquemática em cartoon da estrutura canônica com código PDB 3GBO, onde o íon Zn (II) está representado em cinza, o íon de Ca (II) em verde e as ligações de dissulfeto em vermelho. (C) Representação geométrica da coordenação do íon de Zn(II).

Esta proteína não tem atividade hemorrágica, mas é ativa na clivagem do fibrinógeno bovino, degradando rapidamente as cadeias em condições de 20 a 50 ºC e pH 4 a 10. Porém sua atividade é menos eficiente na clivagem de fibrina, hidrolisando preferencialmente a cadeia In vivo, a BmooMPalpha-1 causa a desfibrinogenação quando é administrada via intraperitoneal em camundongo, evitando a coagulação do plasma, sendo os níves de fibrinógeno reduzidos a zero depois de uma hora que a proteína foi injetada, e que são posteriormente restabelecidos a níveis normais depois de 24 horas (Bernardes et al., 2008).

1.4.1.2 Adamalisyn II

Adamalisyn II (EC: 3.4.24.46) provém das serpentes Crotalus adamanteus, conhecida como cascavel diamante oriental. É uma endoprotease que contém só uma cadeia de 24 kDa, contém duas ligações de dissulfeto e não tem grupos sulfídricos livres. Sua sequência foi depositada no banco de dados UniProt com o código P34179, Figura 6(A), no banco de dados MEROPS, com o código M12.141 e 37

dispõe de quatro estruturas cristalográficas depositadas no banco de dados PDB: 1IAG, 2IAG, 3IAG e 4IAG (Kress e Catanese, 2012), sendo esta primeira, PDB1IAG, representada na Figura 6(B).

Esta proteína não apresenta atividade hemorrágica significativa,mas tem a capacidade de clivar o inibidor da serina protease do plasma humano (serpins),

Ala350Met351, e a antitrombina III, Ala375Ser376 (Kress, 1986). Também, tem-se reportado a clivagem da cadeia  da insulina oxidada em diferentes sítios: Phe1Val2, His5Leu6, Ala14Leu15, Leu15Tyr16 e Tyr16Leu17 (Kurecki, Laskowski, M. e Kress, 1978).

Figura 6. (A) A figura representa a sequência completa de aminoácidos da metaloprotease Adamalisyn II reportada na base de dados UniProt, código P34179. (B) Representação esquemática em cartoon da estrutura canônica com código PDB 1IAG onde o íon Zn (II) é representado em cinza, o íon de Ca (II) em verde e as ligações de dissulfeto em vermelho. (C) Representação geométrica da coordenação do íon de Zn (II).

O íon Zn(II) apresenta uma coordenação tetraédrica com os N2 de três histidinas (His142, His146 e His 152) e uma molécula de água que apresenta interação com o Glu143, Figura 6(C) e também tem um íon de cálcio(II) localizado do lado oposto do sítio ativo ligado a sete átomos de oxigênio das cadeis laterais dos 38

resíduos Asp93, Asn200, Glu9, do grupo carboxila da Cys197 e de duas moléculas de água (Gomis-Rüth et al., 1994).

1.4.1.3 Trimerelysin II

A trimerelysin II ou H2-Protease (EC 3.4.24.53) é uma metaloprotease isolada do veneno da Trimeresurus flavoviridis não glicosidada e não hemorrágica composta por uma cadeia de 201 aminoácidos (22.991 kDa), onde o aminoácido amino- terminal é o ácido piroglutâmico (Takeya et al.,1989). Sua sequência foi depositada no banco de dados UniProt com o código de acesso P20165 e ainda, dispõe de uma estrutura cristalográfica depositada no banco de dados PDB com o código 1WNI.

QRFPQRYIELAIVVDHGMYKKYNQNSDKIKVRVHQMVNHINEMYRPLNIAISLNRLQIWSKKDLITVK SASNVTLESFGNWRETVLLKQQNNDCAHLLTATNLNDNTIGLAYKKGMCNPKLSVGLVQDYSPNVF MVAVTMTHELGHNLGMEHDDKDKCKCEACIMSDVISDKPSKLFSDCSKNDYQTFLTKYNPQCILNA P (A) O C HOH 1011(A)

N CA

CD2 ZN 999(A) ZN His 142(A) CB NE2

CG CE1 ND1 NE2

CD2 CE1 N CE1 NE2 CG ND1 ND1 CA CD2 O His 152(A) CB N C CG CB

(B) His 146(A) CA C (C) (B) O

Figura 7. (A) A figura representa a sequência completa de aminoácidos da metaloprotease Trimerelysin II reportada na base de dados UniProt, código P20165. (B) Representação esquemática em cartoon da estrutura canônica com código PDB 1WNI, onde o íon Zn (II) é representado em cinza, o íon de Ca (II) em verde e as ligações de dissulfeto em vermelho. (C) Representação geométrica da coordenação do íon de Zn (II).

Estudos de determinação de sítios de clivagem com substratos fluorogênicos e com a cadeia da insulina oxidada mostraram a preferência de clivagem pelos resíduos hidrofóbicos como Leu e Met na posição P1´, como se mostra na Tabela 2. 39

Tabela 2. Sítios de clivagem da Trimerelysin II

Substrato P4 P3 P2 P1 P1´ P2´ P3´ P4´ Abz-Gly-Phe-Arg-Leu-Leu-Dna Abz Gly Phe Arg Leu Leu Dna - Abz-Ser-Pro-Met-Leu-Dna - Abz Ser Pro Met Leu Dna - Abz-Thr-Glu-Lys-Leu-Val-Dna Abz Thr Glu Lys Leu Val Dna - Cadeira B insilina (oxidada) - Phe Val Asn Gln His Leu Cya Cadeira B insilina (oxidada) Cya Gly Ser His Leu Val Glu Ala Cadeira B insilina (oxidada) Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Z-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro - Z Gly Pro Leu Gly Pro -

Abz = Ácido orto-aminobenzóico; Dna = 2,4-dinitroanilinoetilamida; Z= grupo Benziloxicarbonil

1.4.1.4 BaP1

A BaP1 é uma metaloprotease dependente de zinco (EC: 3.4.24) isolada do veneno da serpente Bothrops asper (família Viperidae, subfamília Crotalinae; conhecida como Terciopelo). O seu peso molecular é de 22,7 kDa e possui um pI de 7,9; é constituída por uma única cadeia de 202 aminoácidos e não apresenta glicosilações. Sua sequência, Figura 8(A), está depositada no banco de dados UniProt com o código de acesso P83512 e no Swiss-ProtQ072L4. No banco de dados PDB se apresentam cinco estruturas cristalinas depositadas (PDB: 1ND1, 2W12, 2W13, 2W14 e 2W15), sendo representada na Figura 8(B) estrutura cristalográfica com o código PDB1ND1 e na base de dados MEROPS tem o código M12.311. Esta proteína apresenta atividade hemorrágica relativamente fraca, em comparação com outras metaloproteases hemorrágicas. No entanto, devido à sua elevada concentração ela é um componente hemorrágico importante no veneno da B. asper, onde esta corresponde a 10% (Alape-Girón et al., 2009). Além da sua atividade hemorrágica, a BaP1 tem efeitos miotóxico, dermanecrótico e pró- inflamatórios (Rucavado et al., 1998), onde tem-se mostrado que a sua atividade inflamatória acontece pela ativação do sistema complemento (Farsky, Gonçalves e

Gutiérrez, J. M., 2000) e também, promove o incremento de citocinas IL-1 e IL-6 e metaloprotease 9 da matriz (MMP-9) (Farsky, Gonçalves e Gutiérrez, J. M., 2000).

Além disso, media a liberação local de prostaglandina E2 e TNF- ocasionando a hipernocicepção articular (Teixeira et al., 2009).

Figura 8. (A) A figura representa a sequência completa de aminoácidos da metaloproteasa BaP1 reportada na base de dados UniProt, código P83512. (B) Representação esquemática em cartoon da estrutura canônica com código PDB 1ND1, onde o íon Zn (II) é representado em cinza, o íon Ca (II) em verde e as ligações de dissulfeto em vermelho. (C) Representação geométrica da coordenação do íon de Zn (II).

Tipicamente, a determinação da especificidade na clivagem da ligação peptídica das metaloproteases de veneno (SVMPs) tem sido realizada utilizando conjuntos limitados de peptídeos ou oligopeptídeos pequenos como substratos experimentais. Embora esta abordagem tenha proporcionado dados valiosos, esta estratégia é geralmente limitada no seu âmbito devido aos pequenos conjuntos de substratos utilizados para gerar as sequências de consenso de especificidade para estas proteases. Recentes estudos têm usado grandes bibliotecas de peptídeos digeridos de proteínas do plasma como substratos, juntamente com a espectrometria

Figura 5. Representação da frequência de clivagem para as posiçoes P4-P4´ (1 = P4; 2 =P3; 3 = P2; 4 = P1; 5 = P1´; 6 = P2´; 7 = P3´; e 8 = P3´ geradas da hidrólise da biblioteca de peptídeos trípticos deficiente de albumina de proteínas de plasma pela metaloprotease BaP1. Fonte:(LEME et al., 2011) 41

de massa para explorar a especificidade da ligação peptídica da BaP1 e de outras metaloproteases para determinar as respectivas sequências de consenso de clivagem. No caso da BaP1observou-se uma clara preferência pelo resíduo de leucina no sítio da P1', como é mostrado naFigura 9 (Leme et al., 2011).

1.4.1.5 Acutolisyn A

Acutolysin A (EC: 3.4.24), também conhecida como Ac-1-protease é uma metaloprotease hemorrágica isolada do veneno da serpente Deinagkistrodon acutus, composta por 202 aminoácidos em uma única cadeia de 22.994 kDa, e com um pI de 4,7. Sua sequência foi depositada no banco de dados Uniprot com o código de acesso Q9PW35 e no banco de dados PDB são encontradas duas estruturas cristalinas (PDB: 1BSW, 1BUD) que foram cristalizadas em diferentes condições (pH 7,5 e 5,0, respectivamente) e no banco de dados MEROPS sob o código M12.131 (Komori e Nikai, 2012).

STEFQRYMEIVIVVDHSMVKKYNGDSDKIKAWVYEMINTITESYSYLYIDIILSGLEIWSEKDLINV ETSAENTLKSFGEWRAKDLIHRISHDNAQLLTATDFDGPTIGLAYVASMCDPKRSVGVVQDHSS VNRLVAITLAHEMAHNLGVRHDEGSCSCGSGYTCIMSPVINSEVIKYFSDCSYIQCREYISKENP (A) PCILNKP N C O

His 142(A) CA CB CD2

NE2 CG HOH 443(A) ND1 ZN ZN 800(A) CE1 NE2 N CE1 CD2 NE2 CE1 His 152(A) ND1 CG CA CD2 C

ND1 CB O C CG O CB

CA His 146(A) N (C)

(B) (C)

Figura 10. (A) A figura representa a sequência de aminoácidos da metaloprotease Acutolisyn A madura reportada na base de dados UniProt, código Q9PW35. (B) Representação esquemática em cartoon da estrutura canônica com código PDB 1BSW, onde o íon Zn (II) é representado em cinza, o íon de Ca (II) em verde e as ligações de dissulfeto em vermelho. (C) Representação geométrica da coordenação do íon de Zn (II). 42

Ao observar a clivagem da cadeia  da insulina oxidada, esta protease também mostrou a preferência pelos resíduos de leucina na posição P1´:

FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKA (Nikai et al., 1991).

Quanto aos testes biológicos, a acutolysin apresenta uma dose hemorrágica mínima de 0,223µg e também induz necrose e aumento dos níveis da creatinina fosfoquinase (CPK) em até 209 U/mL no sangue de camondongo (Nikai et al., 1991)

1.4.1.6 Acutolyisin C

A acutolisyn C, é uma metaloprotease isolada do veneno da Deinagkistrodon acutus que apresenta fraca atividade hemorrágica e também é conhecida por outros nomes como aculysin-1, acutolysin-F, hemorragin III e metaloproteases precursor H5. É composta por 197 aminoácidos. Sua sequência está depositada no banco de dados UniProt com o código de acesso P60244, no banco de dados PDB apresenta uma estrutura cristalográfica com o código 1QUA e no banco de dados MEROPS apresenta o código M12.337.

PAPQTSIELFLIVDHSMYAKYNSNSSKITTTLKARVNIMNAIYSSLNLVITLSGIEMWSAADLITVQ SSSRNTLKLFASWRETDLLKRTSNDNAQLLTATNFNGNTVGLAYLKTMCNSKYSVGLIQDHSAI PLLMAVTMAHELGHNLGMNHDGAGCSCATCIMAPVLSSGPAKSFSDCSKHDYQSFLTIHKPQC (A) LLN O C O

C His 146(A) N CA

N CA CB ND1 His 152(A) CB CE1 CD2 CG CG

NE2 NE2 CD2 ND1

ZN O His 142(A) CE1 NE2 C CD2 ZN 999(A)

CE1

CG CA HOH 300(A)

N ND1 (B) CB (C)

Figura 11. (A) A figura representa a sequência de aminoácidos da metaloprotease Acutolisyn C madura reportada na base de dados UniProt, sob o código P60244. (B) Representação esquemática em cartoon da estrutura canônica com código PDB 1QUA, em cinza íon Zn (II) e em vermelho ligações de dissulfeto. (C) Representação geométrica da coordenação do íon Zn (II). 43

1.4.2 Mecanismo de clivagem das SVMP

A atividade catalítica é produzida por proteólise de acordo com o mecanismo proposto na Figura 12. Onde os resíduos de aminoácidos do substrato se ligam ao sítio ativo da enzima e a proteólise pode ser dividida em duas etapas, a etapa de adição e de remoção. No primeiro passo, a molécula de água é adicionada à ligação peptídica do substrato por ataque nucleofílico, e a ativação desta molécula de água ocorre através da aceitação de um próton pelo resíduo glutamato altamente conservado localizado próximo ao zinco (II) e o intermediário gerado que é estabilizado pelo íon zinco (II), que atua como um ácido de Lewis.

Uma vez que o passo de adição ocorreu, a clivagem do enlace peptídico é realizada, e o próton do resíduo de do glutamato é transferido para a amina do N- terminal do substrato (Ramos e Selistre-de-Araujo, 2006; Whittaker et al., 1999).

Figura 12. Representação do mecanismo da reação da atividade proteolítica das metaloproteases. Passos (A) adição; (B) intermediário; (C) remoção e (D) o mecanismo de reação de clivagem do substrato pela metaloprotease (extraído de Ramos & Selistre-de- Araujo, 2006). 44

1.4.3 Efeitos biológicos das metaloproteases

As metaloproteases do veneno de serpente são responsáveis pelo efeito hemorrágico local e sistêmico, característico dos acidentes ofídicos causados por espécies da subfamília Viperinae e Crotalinae. Estas toxinas também estão envolvidas na manifestação de efeitos patológicos como: mionecrose local, danos na pele, formação de edema, distúrbios na hemostase e dano tecidual, como é resumido na Figura 13 (Gutiérrez, J. M. e Rucavado, 2000).

Hemorragia Formação de Mionecroses bolhas

Liberação de Dermonecroses TNF-a

SVMP

Ativação de Edema MMPs

Inibição de Degradação agregação de de Matriz plaquetas Degradação de extracelular fatores de coagulação sanguinea

Figura 13. Resumo dos múltiplos efeitos promovidos pelas metaloproteases de veneno de serpente na patogênese e dano tecidual local. Alguns efeitos são devidos à ação direta de metaloproteases de veneno, enquanto outros são efeitos indiretos (extraído de Gutierréz e Rucavado, 2000).

1.4.3.1 Efeito hemorrágico

A hemorragia ou sangramento é um fenômeno comum em vítimas de envenamento por veneno de serpentes da família Viperidae (subfamílias Crotalinae e Viperinae), e esta pode ocorrer no local da picada e contribuir com a isquemia local (Gutiérrez, J. M., Romero, Núñez, et al., 1995), ou também pode afetar outros 45

órgãos produzindo complicações, como o choque cardiovascular (Otero et al., 2002) (Gutiérrez, J. M. et al., 2005). As metaloproteases têm como alvo principal a membrana basal dos capilares e vênulas, que possuem um papel fundamental no arranjo estrutural do endotélio, na adesão celular, na acumulação de fatores de crescimento e na formação do trombo plaquetário pela interação de alguns de seus componentes com receptores da membrana das plaquetas (Sajevic, Leonardi e Križaj, 2011). A hidrólise destes componentes é o passo fundamental na patogênese da hemorragia.

Além disso, as SVMP são capazes de hidrolisar proteínas da membrana das células endoteliais como as integrinas e caderinas, que estão envolvidas na adesão célula-matriz e célula-célula. Este processo pode acontecer pela ativação de MMP-2 e caspase-3 levando a modificações na forma das células endoteliais e a apoptose (Wu,2003; Wu, Peng e Huang, 2003). As SVMP tipo PIII, que contêm domínios tipo desintegrina e domínio rico em cisteínas interagem com as integrinas das células endoteliais interferindo na sua adesão à matriz extracelular (Moura-da-Silva e Marcinkiewicz, 2001).

O processo de hemorragia ocasionado pelas SVMP é extremadamente rápido e as alterações estruturais das células endoteliais in vivo acontecem em poucos minutos. Resultados in vitro sugerem que os danos à células endoteliais acontencem depois de algumas horas (Díaz et al., 2005). Esta diferença entre os resultados in vitro e in vivo pode ser explicada pelo papel da força biofísica que opera nas microvesículas in vivo (Ballermann et al., 1998).

Tem sido proposto que as SVMPs produzem a hemorragia in vivo por meio de um mecanismo de ‘’duas etapas’’. Inicialmente, as SVMP degradam as proténas da membrana basal e as proteínas de adesão, enfraquecendo as paredes do capilar e prejudicando as interações entre as células endoteliais e a membrana basal. Então, a pressão transmural atua na parede capilar enfraquecida ocasionado uma distensão, e como consequência, as células endoteliais tornam-se muito finas, até que a integridade da parede do capilar é perdida em alguns pontos, onde ocorre extravasão, como mostrado na Figura 14. Além disso, as células endoteliais tornam- se mais suscetíveis a tensão de corte (shear stress) devido ao fluxo sanguíneo, o 46

que contribui ainda mais para a ruptura da parede capilar (Gutiérrez, J. M. et al., 2005).

SVMP

Figura 7. Mecanismo hipotético de 'duas-etapas' para explicar danos nos vasos capilares levando à hemorragia induzida pelas SVMPs. O primeiro passo está associado com a clivagem proteolítica de componentes da membrana basal (BM) e proteínas da membrana em células endoteliais (CE) envolvidas na adesão célula-BM. O enfraquecimento da BM e células endoteliais abre o caminho para a segunda etapa, na qual o gradiente de pressão transmural distende a parede do capilar, aumentando a tensão da parede, processo este que induz ao desgaste das células endoteliais e a uma redução no número de vesículas pinocitóticas. Eventualmente, as células endoteliais são rompidas e são formadas aberturas na parede do capilar. Além disso, a tensão de cisalhamento do sangue dependente do fluxo pode causar dano mecânico adicional para as células endoteliais enfraquecidas. O resultado líquido deste processo é a ruptura das paredes capilares, o extravasamento e a consequente hemorragia (extraído deGutiérrez, J. M. et al., 2005).

1.4.3.2 Classificação baseada na atividade hemorrágica

Além da classificação pelo peso molecular e pela presença de domínios, as SVMP podem ser classificadas pela sua atividade biológica, e especificamente, pela sua atividade hemorrágica. A atividade hemorrágica pode apresentar uma ampla gama de efeito hemorrágico, desde não prodizir nenhuma hemorragia detectável cuja dose hemorrágica mínima (MHDs) é de 10 ng até uma SVMP altamente hemorrágica, que apresenta uma MHD inferior a 1 µg. A dose hemorrágica mínima é definida como a mínima quantidade de proteína (em massa) com a capacidade de produzir uma de hemorragia local de 10 mm de diâmetro depois de 2 horas, quando injetado em camundongos por via intradérmica. As SVMPs com MHD inferior a 1 µg são altamente hemorrágicas, as com MHD entre 1 e 10 µg são fracamente hemorágicas e as com MHD maiores que 10 µg são não-hemorrágicas. (Bjarnason e Fox, 1994; Kondo et al., 1960). Um grande desafio é encontrar as características moleculares responsáveis pela potência hemorrágica de SVMP. Até o momento 47

muitas tentativas foram feitas sem resultados consistentes. Estudos anteriores descreveram uma série de comparações entre os domínios catalíticos de SVMPs hemorrágicas e não-hemorrágicas feitas com a ajuda de bioinformática e dessa forma foi sugerido uma participação dos resíduos conservados Asp148 e Ser176 na estabilização do sítio ativo (Ramos e Selistre-de-Araujo, 2006). Outros estudos compararam a ação de SVMPs hemorrágicas e não-hemorrágicas em membrana basal (BM) in vitro mediante a degradação de Matrigel e in vivo pela avaliação imuno-histoquímica dos marcadores da BM em músculo gastrocnêmio de rato. E outros, estudaram as diferentes capacidades de hidrolisar in vivo proteínas chave da membrana basal, tais como, colágeno tipo IV e perlecan, bem como outras proteínas da matriz extracelular (ECM), tais como colágenos tipos VI e XV, que desempenham um papel crítico ligando os componentes da membrana basal (Escalante et al., 2011). E ainda, estudos de simulação computacional mostraram que SVMPs hemorrágica e não-hemorrágicas têm diferentes valores do fator de temperatura no loop localizado no sítio Met-turn, sugerindo que essa diferença pode estar relacionada com a habilidade de se ligar a substratos específicos (Wallnoefer et al., 2010).

Embora a atividade hemorrágica possa parecer complexa, envolvendo múltiplos fatores, é necessário ainda realizar estudos adicionais para encontrar as características moleculares que possam ajudar a entender melhor os efeitos tóxicos das proteínas presentes na peçonha das serpentes.

1.5 Serina proteases

Outra família de proteínas importante é o das serina proteases, que pertencem à família da quimotripsina (S1A), segundo a base de dados MEROPS. Elas desempenham papéis importantes em diversos processos biológicos, desde a digestão, regulação da coagulação do sangue, no sistema imunológico e processos inflamatórios, catalisando a clivagem das ligações peptídicas das proteínas.

Apesar do alto grau de identidade de sequência, as serina proteases de veneno de serpente (SVSP) são bastante específicas perante um substrato macromolecular (Serrano e Maroun, 2005). As serina proteases tipo trombina (TL- SVSPs) são definidas pela sua capacidade de clivar o fibrinogênio (Stocker, Fischer 48

e Meier, 1982), liberando fibrinopeptídeos via clivagem de ligações Arg-Lys nas cadeias α e β do fibrinogênio de modo a converterem o fibrinogênio em fibrina. Sendo assim os monômeros da fibrina polimerizam espontaneamente após o lançamento dos fibrinopeptídeos, formando um trombo. O trombo formado pelas TL- SVSPs é rapidamente dissolvido pela plasmina e a formação repetida e subsequente dissolução de trombos produz uma coagulopatia, levando à incapacidade para formar trombos estáveis. Muitas SVSP induzem degranulação (reação de liberação) e agregação de plaquetas e um grupo interessante de TL- SVSP parece produzir sintomas neurológicos, além de afetar a hemodinâmica. Estas enzimas produzem a síndrome giroxina em ratos, descrito como episódios temporários caracterizados por opistótono e rotações em torno do eixo longitudinal do animal. A giroxina isolada de Crotalus durissus terrificus foi a primeira destas enzimas a ser identificada como causadora da síndrome (Mackessy, 2009).

1.5.1 Mecanismo de clivagem das SVSP

A clivagem da ligação peptídica catalisada por SVSP édividida em duas etapas: acilação e desacilação (etapa limitante) (Hartley e Kilby, 1954), onde o primeiro passo envolve o ataque nucleofílico ao carbono carbonílico do substrato através do átomo de oxigênio da hidroxila da Ser195, sendo catalisado pelo átomo de nitrogênio do grupo imidazol da His57, agindo como o aceptor do próton da hidroxila da Ser195. O oxiânion transitório de Ser195 é estabilizado por ligações de hidrogênio com os grupos NH da cadeia peptídica de Ser195 e Gly193 (que não é conservada em todas as SVSP). O ataque nucleofílico subsequente forma o complexo enzima-substrato, um intermediário tetraédrico ao lado da His57 do íon imidazólio. A catálise ácida pelo íon imidazólio conduz a formação do complexo de acil-enzima e a liberação do produto de amina. A desacilação é realizada por ataque nucleofílico ao carbono acílico pela água. Assim, o próton do grupo hidroxila da Ser195 encontra-se no produto de amina durante cada ciclo catalítico e é substituído pelo próton da água (Hedstrom, 2002; Mackessy, 2009; Polgár, 1971). Um esquema do mecanismo geral das serina proteases se encontra na Figura 15. 49

Tetraédro Acilação Tetraédro intermediário intermediário

Figura 8. Representação do mecanismo geral das serina proteases (extraído de Hedstrom, 2002).

1.6 Abordagens in silico para a descoberta de inibidores e interação proteína-proteína

1.6.1 Docking

O Docking (modelagem molecular) proteína-ligante é uma ferramenta poderosa para estudar as interações das proteínas com as moléculas pequenas. Vários algoritmos de docking estão disponíveis para prever contatos entre proteína- ligante e classificá-las com base em várias funções de pontuação. As funções de pontuação são utilizadas para estimar as afinidades de ligação dos distintos contatos dos ligantes com as proteínas-alvo (Elokely e Doerksen, 2013).

Atualmente, muitos programas de docking molecular estão disponíveis incluindo DOCK, AutoDock, Gold, FlexX, Glide, ICM, Surflex (Onodera, Satou e Hirota, 2007) e Discovery Studio. Este último é um pacote interativo de química computacional e modelagem molecular com uma ampla variedade de recursos para a modelagem e simulação. Este programa contém vários protocolos para ajudar na modelagem, como os algorítmos CDOCKER, LibDock e LigandFit.

Além dos métodos de docking, para determinar as interações proteína- inibidor, devem ser consideradas algumas propriedades físico-químicas que ajudam na adsorção dos compostos ao nível fisiológico; uma abordagem dada usando a 50

regra de Lipinski. Esta regra estabelece que a maioria dos fármacos que apresentam biodisponibilidade por via oral obedece pelo menos três dos seguintes parâmetros (Lipinski et al., 1997):

 Peso molecular ≤ 500;  Ńmero de grupos aceptores de ligaç̃o de hidroĝnio ≤ 10;  Ńmero de grupos doadores de ligaç̃o de hidroĝnio ≤ 5;  logP≤5.

1.6.2 Acoplamento proteína-proteína

O acoplamento (Docking) proteína-proteína é a previsão da estrutura tridimensional (3D) de um complexo proteína-proteína a partir das coordenadas das estruturas dos componentes. É classificado como encaixe ligado onde um complexo de proteínas é separado ou encaixe não ligado, onde as estruturas cristalizadas dos componentes individualmente são usadas e acopladas in silico. As alterações conformacionais das proteínas afetam as ligações, especialmente nas cadeias laterais da superfície. Com o poder de computação atual, não é viável realizar pesquisas extensivas das conformações durante o acoplamento, a não ser se o local de ligação é conhecido (Smith e Sternberg, 2002).

Coordenadas da Coordenadas da Informação Molécula 1 Molécula 2 experimental

Realizar busca de complexos corpo rígido

Ranqueamento dos complexos em energia de associação

Introdução de Flexibilidade, refinamento, reranqueamento

Lista de complexos

Figura 16. Etapas do acoplamento proteína-proteína para simulação computacional 51

O papel das interações eletrostáticas em interações proteína-proteína foi revisada por vários pesquisadores (Norel et al., 2001; Tobias, 2001). Para tratar a dessolvatação de grupos carregados nas interfaces com precisão, é necessário resolver a equação de Poisson-Boltzmann completa para cada orientação diferente dos componentes a ser examinada. Este é um cálculo caro computacionalmente e assim várias aproximações são utilizadas, como a "semi-Coulomb" ou aproximação de 'teste de carga', ou o uso da lei de Coulomb com um dielétrico dependente da distância, por exemplo, proporcional a r. Então, para qualquer desses esquemas, também podem ser adicionados uma expressão para a energia hidrofóbica (Smith e Sternberg, 2002).

Assim, uma série de grupos têm adotado uma abordagem em duas fases. Na fase inicial, o receptor e ligante são tratados como corpos rígidos e as rotações e translações são amplamente exploradas no espaço 6D com funções de pontuação que são tolerantes a mudanças conformacionais. Na fase de refinamento, um número pequeno (10-1000) de estruturas obtidas na fase inicial são refinadas e novamente ranqueadas usando funções de energia que consideram mudanças conformacionais, Figura17 (Chen, Li e Weng, 2003).

O algoritmo Zdock é um algoritmo que foca na fase inicial de acoplamento de proteínas e faz uso de funções de complementariedade de forma (PSC: Pairwise Shape Complementarity), dessolvatação e eletrostática (Chen, Li e Weng, 2003).

Também, existem algumas ferramentas que fazem uso de descritores físico- químicos e estruturais para distinguir resíduos que formam interface (IFR) de resíduos livres da superfície (FSR) que podem ser usados para elucidar mecanismos de interação proteína-proteína (de Moraes et al., 2014).

1.6.3 Nano-ambiente

O nano-ambiente é definido como o ambiente estrutural local (sítios delimitados) de uma proteína que mantém a sua funcionalidade. Estes refletem não só na constituição/estrutura, mas também, têm contribuição para o fornecimento das características necessárias e exigidas para o seu objetivo funcional. Por exemplo, na comunicação proteína-proteína que acontece numa interface, os resíduos dos aminoácidos neste sítio têm características específicas, que não só os diferenciam 52

do resto de resíduos da superfície, mas que permite que proteínas específicas possam se encaixar, ligar e também podem realizar alguma função. No caso das enzimas, sua atividade está normalmente relacionada aos resíduos do sítio catalítico (CSRs: Catalytic site residues). Estes resíduos peculiares são incorporados em um nano-ambiente muito específico e, por conseguinte, a função da enzima pode ser descrita em termos de características dos CSR e seus arredores (de Moraes et al., 2014).

Uma ferramenta de muita utilidade que descreve o nano-ambiente das proteínas é o JAVAProtein Dossier (JPD). Ele é parte da plataforma STING e provê uma coleção de parâmetros físico-químicos que descrevem a sequência, estrutura, estabilidade, função e interação com outras macromoléculas (Neshich et al., 2004). Com ajuda da plataforma STING foram feitas as descrições de distintos nano- ambientes presentes nas SVMP tipo I hemorrágicas e não hemorrágicas.

1.7 Inibidores

1.7.1 Neutralização de toxinas de veneno de serpente

Os envenenamentos por picada de serpentes têm sido tratados, principalmente, com o princípio de neutralização das toxinas utilizando anticorpos (Lomonte et al., 2009). Esses estudos sobre a neutralização de venenos de serpente ou toxinas isoladas têm contribuído para o desenvolvimento de novos antivenenos ou para a melhoria dos atualmente disponíveis, e têm também fornecido uma compreensão mais detalhada de aspectos fundamentais dos envenenamentos e do seu tratamento (Alape-Girón et al., 2009).

Em contraste com os efeitos sistêmicos, que são bem neutralizados, os efeitos locais induzidos pelas toxinas da peçonha da serpente B. asper são apenas parcialmente prevenidos pelo uso dos antivenenos. Limitações na neutralização de alguns efeitos particulares do envenenamento foram revelados por estudos em modelos animais (Gutiérrez, J. M. et al., 1985; 1986). Isto tem motivado a pesquisa de agentes neutralizantes alternativos provenientes de uma variedade de fontes naturais e também de compostos sintéticos, com o objetivo de obter novas ferramentas terapêuticas para complementar e melhorar as ações de soroterapia 53

convencional (Lomonte et al., 2009). Além disso, a ação rápida das toxinas causa danos significativos até serem encontradas por seus anticorpos neutralizantes específicos (Lomonte et al., 1994).

1.7.2 Neutralização de efeitos locais

1.7.2.1 Inibidores de SVMP

Devido à dificuldade da neutralização dos efeitos locais produzidos pelas SVMPs, tem sido proposta a possibilidade de usar inibidores das metaloproteases do veneno que podem ser injetados diretamente no local da picada, podendo ser um meio de lidar com este problema (Gutiérrez, J., Rucavado e Ovadia, 1999). Algumas substâncias sintéticas como a o-fenantrolina, o EDTA e o CaNa2EDTA, devido a sua capacidade de quelar metais, mostram-se inibidores interessantes para a atividade hemorrágica induzida pelo veneno de Bothrops asper (Borkow, Gutiérrez, J. M. e Ovadia, 1997). O Batimastat (Figura17) tem mostrado ser eficaz na inibição das

SVMPs isoladas (IC50 = 80 nM) e da atividade hemorrágica dos venenos de viperídeo brutos em modelos animais na concentração de 5,7 µM (Escalante et al., 2000). Esse inibidor foi um dos inibidores de primeira geração de MMP desenvolvido, baseado no esqueleto de peptídeo mimético, contendo um ácido succínico e um ácido hidroxâmico como grupos de ligação ao zinco (ZBG). O ácido hidroxâmico é um quelante bidentado, mas também tem uma boa afinidade de ligação com outros íons (Cu (II), Fe (II) e Ni (II)). Embora os hidroxamatos sejam frequentemente inibidores de enzimas muito potentes, vários desafios precisam ser vencidos, em primeiro lugar, por apresentarem uma seletividade relativamente baixa (devido a uma contribuição significativa da afinidade ao íon Zn (II)) podem ocorrer vários efeitos adversos, por exemplo, levando a efeitos colaterais em músculos esqueléticos devido, principalmente, à presença do ácido hidroxâmico, o que pode ser resolvido pelo desenvolvimento de inibidores mais seletivos. E em segundo lugar, devido à farmacocinética e problemas toxicológicos, que não são facilmente resolvidos. Estes desafios têm forçado a busca por substitutos para este grupo de ligação de zinco altamente eficiente (Bourguet et al., 2012). Os ácidos hidroxâmicos podem ser hidrolisados aos ácidos carboxílicos correspondentes em condições fisiológicas. Alguns hidroxamatos são propensos a hidrólise no plasma e isto é prejudicial para a sua distribuição e eficiência, uma vez que o ácido carboxílico é 54

geralmente muito menos ativo. A hidrólise pode também contribuir para a toxicidade devido à mutagenicidade do subproduto de hidroxilamina (Flipo et al., 2009). A incapacidade de produzir compostos clinicamente viáveis a patir dos hidroxamatos foi atribuída principalmente aos efeitos colaterais e à baixa biodisponibilidade oral (Coussens, Fingleton e Matrisian, 2002).

Figura 17. Estrutura do inibidor Batimastat.

Em uma tentativa para encontrar alternativas ao grupo do ácido hidroxâmico, alguns compostos foram identificados como ligantes para uso como inibidores de metaloproteases. Govinda Rao tem mostrado diferentes grupos de ligação ao zinco como inibidores de MMPs, mostrando os prós e os contras de inibidores com grupos de ligação ao zinco não-hidroxamato em termos de especificidade, de toxicidade e de propriedades farmacocinéticas (Rao, 2004). Alguns grupos de ligação ao zinco, como pirimidina-trionas e barbitúricos, têm mostrado potência superior sob os seus análogos de hidroxamato (Foley et al., 2001; Puerta, Lewis e Cohen, 2004) e a abordagem Fragment-based lead design (FBLD) também tem mostrado novos grupos de ligação a metais como possíveis inibidores de metaloproteases (Jacobsen et al., 2011).

No entanto, o acesso do público aos inibidores de metaloproteases desenvolvidos pela indústria farmacêutica para tratamentos dos acidentes ofídicos é limitado devido ao reduzido potencial de retorno lucrativo para a ind́stria, uma vez que a populaç̃o atingida é de baixa renda e presente, em sua maioria, nos páses em desenvolvimento (de Ciência e Tecnologia Secretaria de, 2010). Por isto é necessário procurar e desenvolver novos inibidores para as SVMPs que sejam mais acessíveis. 55

1.8 Potencial farmacológico das toxinas isoladas de veneno de serpente

Dada a capacidade de hidrolisar componentes da matriz extracelular, nosso grupo tem proposto a utilização das SVMPs como inibidores de angiogênese, que é a formação de novos vasos sanguíneos, essencial em inúmeros processos fisiológicos, incluindo o desenvolvimento, a reparação de feridas e na reprodução. A angiogênese é altamente regulada e só é ativada durante um breve período de tempo. No entanto, uma desregulação da angiogênese é descrita durante o desenvolvimento de tumores sólidos (Weis e Cheresh, 2011).

Vários inibidores endógenos da angiogênese têm sido identificados, por exemplo a angiostatina, um fragmento de 38 kDa de plasminogênio, que inibe a proliferação de células endoteliais, causando assim, um aumento da apoptose (O'Reilly et al., 1996) e o tumstatin, um pequeno peptídeo liberado pela clivagem do colágeno IV, que parece funcionar de uma maneira semelhante (Maeshima, 2002). Outro fragmento identificado como agente antiangiogênese é a endostatina, um produto da clivagem do colágeno XVIII, de 20 kDa (O'Reilly et al., 1997).

Outros tipos de inibidores interessantes são as desintegrinas, peptídeos ricos em ligações de dissulfeto, muitos dos quais contêm uma sequência Arg-Gly-Asp (RGD), que se ligam a integrinas que estão na superfície de células normais e malignas impedindo a adesão a células tumorais dos componentes da matriz extracelular. Algumas desintegrinas tipo não-RGD também foram avaliadas pela sua capacidade de bloquear processos centrais da progressão tumoral e angiogênese (Kallech-Ziri,José e Daoud, 2005). 56

Capítulo 2. Objetivos 57

2 OBJETIVOS

Caracterizar biofísica e bioquimicamente proteases do veneno de serpentes isoladas dos veneno de Botros asper, Crotalus simus e Crotalus durissus cumanesis. Desenhar inibidores para duas proteínas alvo (SVMP e SVSP) e verificar interação proteína-ligante in vitro. Verificar potencial de aplicação de proteínas alvo.

Objetivos específicos

 Caracterizar as proteínas BaP1 de Bothrops asper e a PIII do veneno de Crotalus simus;

 Utilizar ferramentas de biologia computacional para entender a interação proteína-proteína, SVMP tipo 1 com substratos, e explicar as diferenças das atividades hemorrágicas;

 Isolar e caracterizar duas serina proteases do veneno de Crotalus simus e duas de Crotalus durissus cumanesis;

 Desenhar inibidores para SVMP e SVSP que possam ser utilizados para complementar a terapia de anti-envenenamento;

 Comparar o potencial na atividade antiangiogênica das metaloproteases BaP1 e PIII. 58

Capítulo 3. Materiais e Métodos 59

3 PARTE EXPERIMENTAL

Os venenos das serpentes Bothrops asper e Crotalus simus foram fornecidos pelo Instituto Clodomiro Picado, Costa Rica e as frações do veneno de Crotalus durissus cumanesis foram fornecidas pelo pesquisador Dr. Arley Camilo Patiño da Universidade de Antioquia, Medellín, Colômbia.

3.1 Isolamento de proteínas

3.1.1 Isolamento da BaP1

Utilizando o procedimento descrito por Gutiérrez e colaboradores (Gutiérrez, J. M., Romero, Díaz, et al., 1995). A BaP1 foi isolada por cromatografia em uma coluna de CM-Sephadex C-25 (2 cm x 25 cm) e Affi-gel Blue (Bio-Rad), filtrada com água bidestilada, liofilizada e congelada a -20°C para estocagem.

3.1.2 Isolamento da SVMPP-III de C. simus

Preparou-se uma coluna de DEAE-Sepharose que foi equilibrada com uma -1 -1 solução de 0,05 mol L de Tris-HCl e 2,0 mmol L de CaCl2 em pH 7,0 (tampão inicial). Dissolveu-se 300 mg do veneno de C. simus em 3 mL de tampão inicial e foi feito a centrifugação para a remoção das impurezas que poderiam obstruir a coluna. O sobrenadante foi aplicado na coluna e eluído com uma mistura de 45% de tampão -1 -1 inicial e tampão final (tampão final: 0,05 mol L Tris-HCl; 2,0 mmol L CaCl2; 0,35 mmol L-1 NaCl) até que os valores de absorbância de 0 e 0,05 a 280 nm fossem obtidos. Foi utilizado um gradiente 45-100% com um fluxo de 1 mL min-1 por 4 horas e as frações com atividade proteolítica e bandas de peso molecular de 55 kDa foram recolhidas.

Um segundo procedimento de purificação foi realizado com a variação na quantidade de NaCl do tampão final (tampão final: 0,05 mol L-1 Tris-HCl; 2,0 mmol L- 1 -1 CaCl2; 1,0 mmol L NaCl).

3.1.3 Isolamento da serina protease de C. durissus cumanensis.

Seguiu-se o procedimento de separação descrito por Patiño e colaboradores (Patiño et al., 2013), onde o veneno bruto da serpente C. durissus cumanensis (100 60

mg) foi dissolvido em 1 mL de 0,05 mol L-1 de tampão Tris-HCl pH 7,0, seguido por uma etapa de clarificação através de centrifugação (10.000 g, durante 5 min). O sobrenadante foi recuperado e aplicado numa coluna de cromatografia de exclusão molecular Sephacryl S-200 (2,5 x 70 cm, Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia) anteriormente equilibrada com o mesmo tampão usado para a dissolução do veneno. As frações foram separadas a um fluxo constante de 0,15 mL min-1 e o perfil de eluição foi monitorado a 280 nm. Dez miligramas da fração denominada de pico II foram submetidos a uma segunda etapa cromatográfica usando uma coluna semi- preparativa (Vydac C8, 5 µm, 10 x 250 mm) acoplada a um HPLC de fase reversa (RP-HPLC). A amostra foi dissolvida em 200 µL de solução aquosa de ácido trifluoroacético 0,1% (TFA; tampão A) até a dissolução completa, seguida por clarificação por centrifugação (10.000 g, durante 5 min) e o sobrenadante foi então aplicado na coluna e a eluição das frações principais foi realizada utilizando um gradiente não linear de tampão B (acetonitrila, contendo 0,1% de TFA) sob um fluxo constante de 2,5 mL min-1 utilizando um cromatógrafo Agilent 1200 (Agilent, Waldbronn, Alemanha). A absorbância foi monitorada a 215 nm, e as frações foram recolhidas manualmente.

3.1.4 Isolamento de serina protease de C. simus

Aproximadamente 500 mg de veneno liofilizado de C. simus foram dissolvidos -1 em 1000 L de tampão de bicarbonato de amônio (0,2 mol L ; pH 8,0) onde a amostra foi homogeneizada, e em seguida, clarificada por centrifugação (10.000 g durante 5 min). O sobrenadante foi aplicado em duas colunas analíticas de cromatografia de filtração em gel, Sephadex G-200 e Sephadex G-75 (2 x 25 mm, Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia), acopladas em sequência, e previamente equilibrada com o mesmo tampão usado para a dissolução do veneno. As frações foram então separadas sob um fluxo constante de 1 mL min-1, o perfil de eluição foi monitorado a 280 nm, e as frações coletadas foram imediatamente liofilizadas e estocadas a -20°C.

As frações que apresentaram atividade proteolítica contra o substrato BapNa foram submetidas a uma segunda etapa de separação cromatográfica usando uma ® coluna semi-preparativa (Discovery BIO C5, 10 m, 10 x 250 mm) acoplada a um HPLC. A amostra foi dissolvida completamente em 300 L de solução aquosa 0,1% 61

de ácido trifluoacético (TFA; tampão A) e, em seguida, foi clarificada por centrifugação a 10.000 g, por 5 min. O sobrenadante foi então injetado na coluna previamente equilibrada com o tampão A por 15 min, e a eluição das frações que apresentaram atividade proteolítica foi realizada utilizando um gradiente linear (0- 100%) de 0,1% (v/v) de TFA em acetonitrila (tampão B), a um fluxo de 2,0 mL min-1. A absorbância foi medida a 280 nm e as frações foram manualmente coletadas, liofilizadas e estocadas a -20°C.

3.2 Caracterização de proteínas

As proteínas purificadas foram analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE,12 ou 15%) para a avaliação da pureza das proteínas isoladas e determinação aproximada da massa molar das amostras obtidas. A eletroforese em gel de SDS-PAGE foi efetuada segundo o método de Laemmli (Laemmli, 1970), utilizando o aparato Mini VE Vertical Electrophoresis System (Amersham Biosciences, Uppsala, Suécia), aplicando-se uma voltagem de 180 V.

3.2.1 Dicroísmo circular (CD)

Os espectros de CD das metalo e serina proteases de veneno de serpentes foram adquiridos de 200 a 260 nm, com velocidade de 20 nm.min-1 e com 5 a 10 acumulações por amostra em um espectropolarímetro J-720 (JASCO, Tóquio, Japão), usando uma cubeta de quartzo de 1 mm de caminho ótico e proteínas em concentração de 2-10 µmol L-1.

Os ensaios de desenovelamento térmico foram conduzidos monitorando-se o sinal das proteínas investigadas em 222 nm e utilizando-se aquecimento no intervalo de 20-80°C com 50°C min-1, em banho térmico que utiliza um sistema Peltier para o controle da temperatura.

3.2.1.1 Efeito do cálcio na BaP1

Para estudar o efeito do Ca (II) foi feita uma titulação adicionando-se 2 µL de -1 -1 uma solução 250 µmol L de CaCl2 sobre uma solução 4,0 µmol L de BaP1 e a mistura foi incubada por 10 min e depois analisada, sendo esse processo repetido por 4 vezes. 62

Para obter a apo-BaP1 foram adicionados 100 µL de EDTA (20 mmol L-1 em água) em uma solução de 4 µmol L-1 de BaP1, e a mistura foi incubada por 30 min antes da diálise em tampão 20 mmol L-1 Tris-HCl e 100 mmol L-1 NaCl com várias trocas de tampão.

3.2.1.2 Efeito do pH e dos íons cálcio e zinco na PIII de C. simus

Para analisar o efeito do pH foram feitas soluções de PIII 1µmol L-1 em Tris- HCl 10 mmol L-1 a diferentes pH (6,0; 6,5; 7,0; 7,5 e 8,0), a partir de uma solução estoque de PIII em 10 mmol L-1 Tris-HCl, 10 mmol L-1 NaCl e pH 7,0, que foi dessalinizada passando a solução 5 vezes por filtros Amicon Ultra com membrana de corte para 3kDa (Millipore, Billerica, EUA), tendo ao final, a sua concentração determinada por leitura de absorbância a 280 nm.

Para a obtenção da proteína Apo-PIII, foram adicionados 100 µL de EDTA (20 mmol L-1) na solução de PIII, que foi então incubada por 30 min. Após este tempo, foi feita a diálise por 24 h na geladeira com tampão 10 mmol L-1 Tris-HCl pH 7,0, com várias trocas de tampão. A solução foi dividida em quatro alíquotas iguais, sendo que uma foi mantida como solução controle enquanto foram adicionados às outras alíquotas equivalentes de CaCl2, ZnCl2, CaCl2 + ZnCl2 separadamente e a concentração final de proteína foi de 1 µmol L-1.

3.2.2 Espectro de fluorescência

As medidas foram realizadas em uma cubeta de quartzo de caminho óptico de 10 mm em fluorímetro da Varian (Varian, Palo Alto, EUA) utilizando = 280 nm para a excitação da amostra, com fendas de excitação e emissão de 5 nm e a aquisição dos espectros de emissão se deu no intervalo de 300 a 450 nm.

3.2.3 Identificação de peptídeos internos da PIII de C. simus

A partir do gel de eletroforese SDS-PAGE em condições redutoras foi obtida a banda da proteína PIII do gel corado com azul de Coomassie coloidal. A banda recortada do gel foi submetida à redução com ditiotreitol e à alquilação com iodoacetamida, seguido pela digestão do gel com tripsina bovina com grau de pureza para sequenciamento utilizando um processador automatizado (ProGest, DigiLab, MA, EUA). A mistura de peptídeos resultantes desta digestão foi então 63

analisada por espectrometria de massas MALDI-TOF-TOF, em um equipamento Applied Biosystems 4800-Plus (Applied Biosystems, CA, EUA) e as sequências dos peptídeos resultantes foram submetidos à analise de similaridade por Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Este procedimento foi feito em colaboração com o professor Dr. Bruno Lomonte do Instituto Clodomiro Picado, Costa Rica.

3.3 Análises por bioinformática

3.3.1 Alinhamento das proteínas

O alinhamento das sequências de aminoácidos (estrutura primária) e das estruturas terciárias foi realizado seguindo o protocolo Align Sequence Profiles (Align123) do programa Discovery Studio. Para isso foram escolhidas seis metaloproteases de veneno de serpentes depositadas na base de dados PDB, que apresentassem só o domínio de melaloprotease, que fossem monomérica e não tivessem sido co-cristalizadas com algum ligante.

As proteínas selecionadas foram de dois tipos, as SVMP-I não hemorrágicas, BmooMPalpha-I (código PDB: 3GBO), Adamalysin II (código PDB: 1IAG), Trimerlysin II (código PDB: 1WNI) e as SVMP-I hemorrágicas BaP1 (código PDB: 1ND1), Acutolysin A (código PDB: 1BSW) e Acutolysin C (código PDB:1QUA). Sendo usados os seguintes valores:

Pairwise Alignment Fast Pairwise Alignment Scoring Matrix BLOSUM 30 Pairwise Alignment Gap Open Penalty 10.0 Pairwise Alignment Gap Extension Penalty 0.1 Pairwise Alignment K-Tuple 1 Pairwise Alignment Gap Penalty 5.0 Pairwise Alignment Top Diagonals 3 Pairwise Alignment Window Size 5 Multiple Alignment Multiple Alignment Scoring Matrix BLOSUM Multiple Alignment Gap Open Penalty 10.0 Multiple Alignment Gap Extension Penalty 0.05 Delay Divergent 40.0 Special Gap Penalties Residue Specific Penalties True Hydrophilic Penalties True Hydrophilic Residues GPSNDQEKR Gap Separation Distance 8 64

Turn off End Gap Separation False Remove Existing Gaps True

O alinhamento estrutural foi realizado utilizando o protocolo Align Structures, que foi usado também para o alinhamento das proteínas BaP1 (código PDB: 2W14) e a BmooMPalpha-I (código PDB: 3GBO) com o domínio catalítico do complexo de MMP-1 ligado a um peptídeo de colágeno (código PDB: 4AUO), usando os seguintes valores:

C-Alpha Distance Cutoff 2.5 Length Cutoff 50 Bin Size 20

3.3.2 Interação proteína-proteína

Foi utilizado o algoritmo de docking de proteínas ZDOCK disponível no programa Discovery Studio (Accelrys Software Inc; v4.0.0.13259) (Chen, Li e Weng, 2003), onde as cadeias B, C e D do complexo da MMP-1 ligado a um peptídeo helicoidal triplo (código PDB: 4AUO) foram utilizadas como proteínas substrato e as SVMP-I não hemorrágicas BmooMPalpha-I (código PDB: 3GBO), Adamalysin II (código PDB: 1IAG), Trimerlysin II (código PDB: 1WNI) e as SVMP-I hemorrágicas BaP1 (código PDB: 1ND1), Acutolysin A (código PDB: 1BSW) e Acutolysin C (código PDB:1QUA) como proteínas alvo.

Tanto as estruturas das proteínas alvo quanto da proteína substrato foram preparadas no programa Discovery Studio (Accelrys Software Inc; v4.0.0.13259) e o campo de força CHARMm foi aplicado nas proteínas para a minimização da energia.

3.3.3 Determinação de pockets e parâmetros estruturais

Foi utilizado o programa STING MILLENNIUM para analisar cada uma das estruturas cristalográficas das metaloproteases hemorrágicas e não-hemorrágicas do veneno de serpente. Também foi utilizado o servidor DoGSiteScorer para predição de pockets (http://dogsite.zbh.uni-hamburg.de). 65

3.3.3.1 Análise Estatística

Os valores dos parâmetros físico-químicos dos pockets previstos foram analisados com o teste estatístico t-Student, do programa online t test calculator2 (GraphPad Software, La Jolla, EUA), usando o teste Unpaired t-test visando detectar as diferenças estatisticamente significativas entre as SVMPs hemorrágicas e não hemorrágicas.

3.3.3.2 Determinação de parâmetros que permitam classificar metaloproteases hemorrágicas e não hemorrágicas

Foram analisadas seis estruturas depositadas no PDB, sendo que três dessas estruturas foram classificadas como hemorrágicas, e as demais como não- hemorrágicas. Para cada estrutura de SVMP, foi selecionada a região definida pelos resíduos 153-176, utilizando parâmetros físico-químicos, estruturais e de conservação provenientes da plataforma STING (Higa et al., 2004; Neshich et al., 2006) para caracterizar os respectivos resíduos de aminoácido.

As análises foram realizadas em colaboração com o grupo de pesquisa do professor Goran Neshich na Embrapa. Todas as análises realizadas foram executadas no ambiente R3, tendo sido utilizados os pacotes randomForest4 e FSelector5. No apêndice apresentamos uma descrição detalhada do procedimento empregado.

3.3.3.3 Representação 2D da coordenação dos íons Ca(II) e Zn(II) nas SVMP

Para a representação e análise da coordenação dos íons de Ca (II) e Zn (II) foi utilizada a ferramenta LigPlot (Laskowski, R. A. e Swindells, 2011) e a base de dados Protein Data Bank in Europe (https://www.ebi.ac.uk/PDBe/)

2 http://graphpad.com/quickcalcs/ttest1.cfm

3 https://www.r-project.org/

4 https://cran.r-project.org/web/packages/randomForest/randomForest.pdf

5 https://cran.r-project.org/web/packages/FSelector/FSelector.pdf 66

3.3.3.4 Diagramas de topologia

Os diagramas de topologia das proteínas foram obtidos da base de dados PDBsum6 (Laskowski, R. A., 2001; Laskowski, R. A. et al., 1997).

3.4 Interação proteína-inibidor (Docking)

3.4.1 Preparação da proteína BaP1

Utilizando o programa Discovery Studio (Accelrys Software Inc; v4.0.0.13259) foi aplicado o protocolo Prepare Protein na estrutura da BaP1 depositado sob código PDB2W14 e os seguintes passos foram realizados: a) retirada da cela unitária, b) limpeza da proteína (adicionados átomos ausentes, conectividade correta, entre outros), c) inserção de conexões perdidas, d) cálculo da ionização da proteína e resíduos, e) retirada das conformações alternativas, f) retirada das moléculas de água, f) remoção das moléculas de ligantes, g) adição de hidrogênios, h) modificação da protonação de cadeias laterais, terminais e ionizáveis e finalmente,aplicação do campo de força CHARMm.

3.4.2 Preparação dos Ligantes para a SVMP BaP1

Foi construída uma biblioteca de ligantes combinando três bases de dados: ZINC (http://zinc.docking.org/) (Irwin et al., 2012; Irwin e Shoichet, 2005), ChemBl (https://www.ebi.ac.uk/chembl/) (Gaulton et al., 2011) e PubChem (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound) (Kim et al., 2015) no programa Pipeline Pilot (Accelrys Software Inc.; v9.1.0.13). Onde o fluxo de trabalho desenvolvido no Pipeline Pilot permitiu a remoção das estruturas dos ligantes duplicados, remoção dos íons dos sais inorgânicos, das moléculas complexas que contêm um elemento diferente do H, C, N, O, P, S, F, Cl, Br ou I e dos compostos com peso molecular menor que 150 u.a. Os ligantes foram preparados alterando as cargas correspondentes para um âmbito de pH entre 6,5-8,5, foram gerados os tautômeros para os grupos NH das amidas em que o grupo está ligado a dois ou mais átomos de C sp2 (como em R(C=O), N(C=O)-R) e foram aplicadas as regras de Lipinski

6 www.ebi.ac.uk/PDBsum 67

como um filtro para remover alguns compostos que não mostram características farmacológicas adequadas.

3.4.3 Receptor e Sítio de ligação

Nesse procedimento foi definida a região da proteína que iria interagir com os ligantes. Para a proteína BaP1, que tem um íon de zinco (II) no sítio catalítico, que é muito importante no mecanismo de clivagem do substrato, foi definida uma esfera no receptor, que incluiu o átomo de zinco, com as seguintes coordenadas x = 10,191, y = 12,007, z = 22,382 com um raio de 9 Å.

O sítio de ligação também foi definido a partir do volume ocupado pelo ligante co-cristalizado no complexo proteína-inibidor da estrutura com código PDB: 2W14.

3.4.4 Desenho de farmacóforo

O farmacóforo foi desenhado baseado no ligante co-cristalizado e no receptor, seguindo o protocolo Receptor-Ligand Pharmacophore Generation do Discovery Studio, onde foram gerados 10 modelos de farmacóforo com pontuação (score) de seletividade entre 12,343 e 13,256. Também foi gerado um agrupamento (Cluster) dos modelos obtidos para observar a similaridade entre eles, utilizando o protocolo Interaction Generation, um protocolo que extrai os ‘’pharmacophore query’’ a partir do mapa de interação Ludi que é criado dentro da esfera do sítio ativo e só atribui três principais características nomeadas de HBA, HBD e HY.Sendo todos os parâmetros no âmbito deste protocolo deixados com seus valores padrão (default).

Também foi gerado um modelo de farmacóforo com o protocolo Feature Mapping. Este modelo foi usado para substituir as caracteŕsticas HBD, ‘’HBD feature’’, orientada ao ́on de zinco para as características que descrevem os grupos de ligação ao zinco (Zinc Binding Feature), seguindo o procedimento desenvolvido por Al-Balas e colaboradores (Al-Balas et al., 2012).

Para validar este modelo foi utilizado o protocolo Screen Library usando como ligantes os inibidores de quinase, o Batimastat (inibidor de metaloprotease) e o ligante co-cristalizado. Para comparar os diferentes modelos gerados, foi utilizado o protocolo Compare Pharmacophores/ Ligand Profile e foram utilizados como ligantes a biblioteca de quinases e o ligante co-cristalizado. Os dados foram representados 68

pelo gráfico Heat map e também foi utilizado o protocolo Calculate ROC Curve com o modelo de farmacóforo, e a biblioteca de quinase para validar o desempenho do modelo escolhido (ver Apêndice).

3.4.5 Preparação das proteínas homologas das SVSP

Foram utilizados os fragmentos do N-terminal e de peptídeos internos das duas serina proteases da serpente C. durissus cumanesis (Cdc-SPI e Cdc-SPII) identificados previamente para determinar algumas estruturas de serina proteasse de peçonha de serpente homólogas depositadas na base de dados PDB (Patiño et al., 2013), onde foram selecionadas as estruturas depositadas sob os códigos PDB4E7N e PDB1OP0 e foi aplicado o protocolo Prepare Protein para a preparação das estruturas.

3.4.6 Preparação dos Ligantes para as SVSP

Foram preparados cinco compostos: Hesperitina, Warfarina Nafamostat, Camostat e Silvelestat usando o protocolo Prepare Ligand do programa Discovery Studio.

3.4.7 Docking com as SVSP

Foi utilizado o protocolo pronto CDocker do programa Discovery Studio e os sítios de ligação foram determinados de forma automática. As estruturas preparadas anteriormente PDB4E7N e PDB1OP0 (item 3.4.5) e os 5 compostos preparados (item 3.4.6) foram utilizados como ligantes.

3.5 Ensaio de inibição da atividade proteolítica com azocaseína

A atividade proteolítica de BaP1 foi medida utilizando o ensaio de azocaseína, onde se utilizou 20 µL de uma solução 1 µM de BaP1 em tampão de reação (25 -1 -1 -1 mmol L Tris HCl, 0,15 mol L NaCl e 5 mmol L CaCl2) e 5 µL de uma solução de 30 mmol L-1 dos inibidores, que foram incubados por 30 min a 37 °C. Passado esse tempo, foram adicionados 100 µL de azocaseina 10 mg mL-1 e após 90 min, foram adicionados 100 µL de solução de ácido tricloroacético 5%. Em seguida, a mistura foi centrifugada durante 10 min, a 4000 rpm e o sobrenadante foi misturado com 100 -1 µL de NaOH 0,5 mol.L em H2O e a absorção foi medida a 450 nm. 69

3.6 Teste de atividade coagulante

Aos 200 µL de plasma de sanguíneo, foram adicionados 100 µL da fração de BaP1, seguido de incubação a 37°C. Esta mistura foi monitorada a cada 5 min até que a formação do coágulo fosse observada.

3.7 Ensaio de atividade e inibição da atividade proteolítica com BApNA

A atividade da serina protease foi avaliada utilizando como substrato o composto sintético N-benzoil-L-arginina-p-nitroanilina (BApNA) em uma placa de Elisa de 96 poços, segundo descrito por Valeriano-Zapana e colaboradores (Valeriano-Zapana et al., 2012). A mistura para o ensaio enzimático e para a determinação dos parâmetros cinéticos continha 50 L de tampão Tris-HCl (10 mmol -1 -1 -1 L de Tris-HCl, pH 8,0, 10 mmol L de CaCl2, 100 mmol L de NaCl), 200 L de substrato, 16 L de água e 4 L de serina protease (SVSP). Para o ensaio enzimático, a SVSP foi incubada a 37 °C, por 30 min e a leitura da absorbância do produto formado, p-nitroanilina (cromóforo de coloração amarela), foi feita no leitor de microplacas da BioTek (BioTek Instruments, ELx808, Winooski, EUA) no comprimento de onda de 410 nm, e em intervalos de 5 min. Para a determinação de parâmetros cinéticos, a SVSP foi incubada com diferentes concentrações de substrato por 45 min a 37°C, em duplicata. A velocidade inicial da reação (V0) foi calculada pela razão da concentração de p-nitroanilina pelo tempo de reação, 45 min. Foram calculadas, de acordo com as equações de Michaelis-Menten e

Lineweaver-Burk, a constante de Michaelis (KM), a velocidade máxima (VMax) da

SVSP e a constante catalítica (kcat).

3.8 Ensaios de atividade biológica das proteínas purificadas

Os ensaios de viabilidade celular, e formação de estruturas tipo capilar em Matrigel foram feitos em colaboração com o grupo de pesquisa da Profa. Dra. Giselle Zenker Justo da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), campus São Paulo.

3.8.1 Cultura de células endoteliais de aorta de coelho (RAEC)

As células endoteliais derivadas de aorta de coelho (RAEC) (Buonassisi, 1973), foram mantidas em meio F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino 70

(SFB) e penicilina/ estreptomicina. Para o subcultivo, as células próximas da confluência foram desprendidas com uma solução de pancreatina (2,5 %) diluída na proporção de 1:10 em Earle's balanced salt solution (EBSS). A seguir, as células foram ressuspendidas em meio F12 suplementado com 10 % de SFB e penicilina/ estreptomicina e 3 x 105 células foram transferidas para uma nova placa. As células foram mantidas em estufa a 37 ºC e atmosfera úmida contendo 2,5 % de CO2. O meio foi substituído após 24 h de cultivo e cada subcultivo foi realizado próximo da confluência (48 h).

3.8.2 Avaliação da viabilidade celular pelo ensaio de redução do sal rezasurin sódico em resorufin

Para avaliar os eventuais efeitos citotóxicos das proteínas BaP1 e PIII, 1 x 104 células RAEC por poço em meio F12 suplementado com 10 % de SFB e penicilina/ estreptomicina foram plaqueadas em microplacas de 96 poços e incubadas por 24 h, em estufa a 37 ºC e atmosfera úmida de CO2 2,5 %. A seguir, as células foram tratadas com diferentes concentrações de BaP1 e PIII (0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 8,0; 10,0; 15,0 e 20,0 µg mL-1) diluídas em 150 µL de meio F12 suplementado com 10 % de SFB e penicilina/ estreptomicina por 24 h em estufa a 37 ºC e atmosfera úmida de

CO2 2,5%. Após o tratamento, o meio foi aspirado e 200 µL de solução de resazurin sódico 0,1 mg.mL-1 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), preparada em meio de cultura sem soro, foram adicionados em cada poço. As células foram então o incubadas por 4 h, a 37 C em estufa úmida de CO2 2,5%. A seguir, 100 L do meio foram transferidos para microplacas pretas de 96 poços e a redução do sal de rezasurin em resorufin foi medida por análise da fluoresĉncia (Exc = 560 nm; Em = 590 nm) no leitor FlexStation 3 (Molecular Devices, CA, EUA). A viabilidade celular foi expressa em porcentagem do controle (100%) e representa a média e o erro padrão de 2 experimentos independentes realizados em sextuplicata.

3.8.3 Ensaio de formação de estruturas tipo capilar em membrana basal reconstituída (Matrigel)

Placas de 96 poços foram previamente incubadas com 50 µL de Matrigel

(BD354230) em estufa a 37 ºC e atmosfera úmida contendo 2,5% de CO2 por 16 h. Após este período, 4 x 104 células por poço foram plaqueadas em microplacas de 96 71

poços e tratadas com BaP1 e PIII nas concentrações de 10; 50 e 100 µg mL-1diluídas em 150 µL de meio F12 suplementado com 10% de SFB e penicilina/ estreptomicina. As placas foram incubadas por 12 h em estufa a 37 ºC e atmosfera

úmida contendo 2,5 % de CO2. A seguir, as células foram observadas e analisadas em microscópio óptico invertido de interferência de fase (Zeiss, Oberkochen, Alemanha) utilizando o programa AxioVision Release 4.8.2. Os resultados foram expressos com base na quantificação do número de vasos em relação ao controle (100%). Os dados representam a média e o erro padrão de 3 experimentos independentes realizados em triplicata.

3.8.4 Ensaio de inibição de angiogênese em membrana corionalantóide de embrião de galinha (in ovo)

Estes ensaios foram feitos em colaboração com o grupo de pesquisa do Prof. Dr. Stephen Hyslop do Departamento de Farmacologia da Faculdade de Ciências Médicas (FCM)/ UNICAMP) e os ovos galados da linhagem Ross foram fornecidos pela produtora comercial de aves “Globo Aves”, localizada em Mogi Mirim, (SP, Brasil), foram incubados em câmara úmida (33%) a 37,5 °C e abertos depois de 10 dias. Os testes foram realizados como descrito por Kusaka e colaboradores (Kusaka et al., 1991). Os ovos foram esterilizados com etanol 95% para minimizar a possibilidade de contaminação e ficaram na incubadora por 8 dias e a confirmação da presença do embrião foi feita com uma pequena lâmpada LED, na sala escura. O estudo foi feito in vivo, com o método que utiliza a membrana corionalantóide de embrião (Ribatti et al., 1996) . Foram aplicadas 10 µL de soluções 0,5 µmol L-1 de BaP1 e PIII a cada embrião. Sendo utilizados como controle positivo o fator de crescimento endotelial vascular (VGEF) e como controle negativo a condroitina. A partir de 24 h após a inoculação da substância a ser testada, foi possível avaliar os resultados em um microscópio Leica (Aotec Instrumentos Científicos Ltda, São Paulo, Brasil). 72

Capítulo 4. Resultados e Discussão

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Caraterização da proteína

4.1.1 Caraterização da proteína BaP1 SVMP (P1a)

A BaP1 foi purificada a partir do veneno da B. asper, em duas etapas, sendo primeiramente separada com uma coluna de troca catiônica, CM- Sephadex C-25, fazendo a eluição com um gradiente de KCl dos outros componentes da peçonha e depois a fração que apresentou atividade proteolítica sobre o substrato azocaseína foi submetida a uma coluna de afinidade, Affi-gel Blue, onde a BaP1 interage com o ligante Cibacron Blue F3GA e foi eluída com um gradiente de NaCl. Tendo sua pureza verificada por eletroforese em gel (SDS-PAGE, 12%), onde a banda da da BaP1 (22 kDa) foi identificada como a proteína maioritária (Figura 18). O teste de atividade coagulante excluiu a presença de quantidades vestigiais de enzima tipo trombina. Sendo obtido um rendimento de 10% m/m a partir do veneno seco.

Figura 18. (A) Esquema de purificação da BaP1. (B) Eletroforese em gel de poliacrilamida 12% de amostras da BaP1 corado com Azul de Coomassie, onde a última coluna à direita corresponde ao padrão de peso molecular (Protein Mixture LMW, GE Healthcare).

Ao se observar a estabilidade da BaP1 ao longo do tempo (0-24 horas), notou-se que em todos os casos, havia presença de produtos de degradação, como é mostrado na Figura 19 (A). O peso molecular para a BaP1 que não foi degradada era de 22 kDa, Figura 19 (B).

Figura 19. (A) Eletroforese em gel de poliacrilamida 15 % de amostras da BaP1 incubadas a temperatura ambiente por diferentes períodos de tempo; da direita para esquerda padrão de peso molecular (Protein Mixture LMW, GE Healthcare), BaP1 0 h, BaP1 1 h, BaP1 2 h, BaP1> 24 h. (B) Determinação do peso molecular da banda majoritária do gel de poliacrilamida 15 % correspontende a BaP1.

A análise de fluorescência foi realizada excitando-se a amostra a 280 nm. A BaP1 apresentou um máximo de emissão em 343 nm. Conforme apresentado na Figura 20 (A), a BaP1 apresenta 3 triptofanos, sendo que dois destes resíduos são expostos ao solvente e distantes do sítio catalítico (mais de 22 Å do sítio catalítico) e o terceiro triptofano está localizado mais próximo do sítio catalítico, 13 Å. A BaP1 apresenta ainda 7 tirosinas, onde a que apresenta menor distância ao ligante está a 11 Å, Figura 20 (C). Mediante a previsão dos sítios de ligação foram encontrados sítios adicionais ao sítio onde se localiza o ligante co-cristalizado, Figura20 (D).

Mediante o uso de dicroísmo circular foram obtidos espectros que permitiram estimar o conteúdo de estrutura secundária da BaP1. Na Figura 21, pode-se observar o espectro de dicroísmo onde se apresenta um mínimo em

210 nm característico de proteínas  + , similar ao espectro da lisozima (Figura64, Apêndice). Na Tabela 3, se apresentam as porcentagens de estrutura secundária da BaP1, que são comparáveis aos dados das atribuições da estrutura secundária dos algoritmos STRIDE, DSSP (Frishman e Argos, 1995; Kabsch e Sander, 1983), e com as reportadas na base de dados PDB (Berman et al., 2000).

Figura 20. A figura representa na sua parte (A) o espectro de fluorescência da BaP1 a uma concentração de 4 mol L-1 em tampão Tris-HCl (25 mmol L-1, pH 8), em (B) e (C) os diagramas da estrutura 3D da metaloprotease BaP1 com um inibidor co-cristalizado e os resíduos de triptofano em laranja em (B) e de tirosina em rosa em (C). E na parte (D) estão representados os pockets preditos pelo servidor DoGSite (http://dogsite.zbh.uni- hamburg.de). Onde todas as estruturas foram geradas no programa Pymol.

Tabela 3. Comparação da porcentagem de estrutura secundária estimada com as medições experimentais da BaP1, com o reportado pelo autor (PDB) e com o algoritmo para a atribuição da estrutura secundária STRIDE e DSSP‡‡

Estimativa da PDB STRIDE Estrutura DSSP médias de CD secundaria (%) (%) (%) (%)

α-hélice 37 43 38 40

Folha β 16 16 16 16

Volta-β 16 - - -

Randômica 31 - - -

Figura 21. Espectro de dicroísmo circular (CD) da BaP1 (4 µmol L-1) em tampão Tris- HCl (25 mmol L-1; pH 8)

Os efeitos dos íons de Ca (II) foram estudados, e não foram observadas mudanças na estrutura secundária da proteína ao se adicionar Ca (II), mas

‡‡ http://www.rcsb.org/PDB/explore/remediatedSequence.do?structureId=1ND1#DSSPRefAnchor

durante os ensaios de adição de EDTA e posterior diálise contra o tampão original (20 mmol L-1Tris-HCl, 100 mmol L-1NaCl e pH 8) foi observada a perda da estrutura secundária, mostrando a importância dos íons na estabilização da estrutura secundária, de acordo com aFigura 22.

Figura 22. Espectro de dicroísmo circular (CD) da BaP1 (4 mol L-1) em tampão Tris- HCl (20 mmol L-1Tris-HCl, 100 mmolL-1 NaCl e pH 8) com diferentes quantidades de cálcio e Apo BaP1.

Figura 23. Dados de intensidade de dicroísmo circular BaP1 (4 mol L-1) em tampão Tris-HCl (25 mmol L-1 e pH 8) em 222 nm quando amostra foi aquecida de 20-80 °C.

Além disso, os ensaios de CD foram utilizados para determinar a estabilidade térmica (Figura 23) onde foi observado que durante o desenovelamento térmico a proteína BaP1 teve uma perda de 50% da estrutura secundária (Tm) a 52 °C.

4.1.2 Caracterização da proteína da PIII de C. simus

A SVMP do tipo PIII do veneno de C. simus foi obtida através da purificação feita com uma coluna cromatográfica de troca aniônica, DEAE- Sepharose, onde a proteína não retida na coluna foi eluída com um gradiente de NaCl (Figura 24) e repurificada com uma coluna de troca aniônica de alta resolução MonoQ, (Figura 78 do Apêndice). Com rendimento de 1,2% a partir do veneno seco.

Figura 24. Purificação da proteína PIII de C. simus apartir do veneno bruto. (A) Separação das proteinas não aderidas na coluna de troca aniônica DEAE-Sepharose, (B) Separação das proteínas aderidas na coluna eluídas com um gradiente de NaCl. (C) e (D) Gel de Eletroforese SDS-PAGE 12% das frações isoladas.

Ao contrário da BaP1, a PIII da C. simus ainda não tem uma estrutura cristalográfica determinada, no entanto a sequência de mRNA das glândulas da serpente C. simus é conhecida, e é idêntica à sequência depositada no GenBank DQ164403 como metaloprotease PIII da outrora Crotalus durissus durissus (atualmente Crotalus simus) e a sequência Q2QA02 da base de dados

UniProt, exceto que na sequência de aminoácidos há uma substituição de E/D, na posição 40. Esta sequência foi identificada com ajuda do sequenciamento de peptídeos trípticos por espectrometria de massas. E a sequência identificada com o código Q2QA02 foi utilizada para determinar alguns modelos da estrutura da PIII (Figura 26). Sendo identificados peptídeos do domínio metaloprotease e do domínio desintegrina (Tabela 4).

Figura 25. (A) Eletroforese em gel de poliacrilamida 15% de amostras da metaloprotease PIII do veneno da C. simus corado com Azul de Coomassie onde a última coluna à direita corresponde ao padrão de peso molecular (Protein Mixture LMW, GE Healthcare). (B) Sequência de aminoácidos da metaloprotease PIII madura do veneno da C. simus. Em azul o domínio metaloprotease; em vermelho o domínio desintegrina e em preto o dominio rico em cisteínas.

Com o servidor I-TASSER, foram determinados três modelos para a PIII mostrada na Figura 26, que foram geradas usando as proteínas com código PDB: 3DSL (Bothropasin), 2DW0 (VAP2 da peçonha de Crotalus atrox), 2ERO (VAP1 da peçonha de Crotalus atroxI, 3K7L (SVMP da peçonha da Naja atra), 2E3X (metaloprotease da víbora Rusell).

Tabela 4. Sequência de peptídeos trípticos identificados por espectrometria de massas e o domínio correspondente.

m/z Peptídeo Score Domínio 2280.2 YMYIHVALVGLEIWSNEDK 22 MP 1772.9 KHDNAQLLTAIDLDR 10 MP 1851.0 KKHDNAQLLTAIDLDR 15 MP 1601.8 MYELANTVNDIYR 15 MP 2052.1 ITVKPEAGYTLNAFGEWR 17 MP 1160.7 FVELVLVVDK 14 MP 1052.4 GNYYGYCR 7 DS MP: metaloprotease. DS: desintegrina.

Após isolamento a pureza da PIII foi analisada por eletroforese em gel (SDS-PAGE, 15%), como apresentado na Figura 24. A estrutura secundária da

PIII foi avaliada por dicroísmo circular (CD), Figura 28, que apresenta 22% de - hélice, 17% de folha- e mostra uma elevada porcentagem de estrutura desenovelada (39%) que pode ser consequência da presença do domínio desintegrina (Figura 27). A análise de fluorescência foi realizada excitando a amostra em 280 nm e a proteína apresentou um máximo de emissão a 342 nm (Figura 26). A PIII apresenta 3 Trp que se localizam no domínio metaloprotease. Também, apresenta 22 resíduos de Tyr e 12 de Phe localizadas nos três domínios.

1 342 nm 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Intensidade Intensidade normalizada 300 350 400 450 500 Comprimento de onda/ nm

Figura 26. Espectro de fluorescência da metaloprotease PIII do veneno da C. simus 6 µmol em tampão Tris-HCl (25 mmol L-1, pH 8) e excitada a 280 nm.

Figura 27. Representação em cartoon da estrutura 3D prevista de para a proteína P III do veneno da C. simus pela plataforma I-TASSER. Com melhor score (A) modelo 1, (B) modelo 2, (C) modelo 3, (D) sobreposição dos modelos.

Os estudos de estabilidade térmica, Figura 28(B), mostraram que a PIII tem pouca perda de estrutura secundária quando é aquecida até 80 ºC, o que pode ser explicado pela presença do domínio rico em cisteínas.

Também foi analisado o efeito do pH na estabilidade da estrutura secundária, observando que em pH 7 se tem um maior sinal correspondente a

-hélice (210 e 222 nm), Figura 28(C).

O efeito do Ca(II) e do Zn(II) foi estudado, ao adicionar Ca (II), Zn(II) e Ca(II) + Zn(II) na solução de Apo-PIII,onde não foi recuperada a estrutura secundária, Figura 28(D).

Figura28.(A) Espectro de dicroísmo circular (CD) da proteína PIII do veneno da C. simus na concentração de 6 µmol L-1. (B) Estabilidade térmica da proteína PIII do veneno da C. simus. (C) Efeito do pH na proteína PIII do veneno da C. simus.(D) Efeito dos cátions Ca(II) e Zn(II) na estrutura secundária da proteína PIII do veneno da C. simus.

4.1.3 Caracterização das Serina proteases de veneno de Crotalus durissus cumanensis

Foram purificadas duas serina proteases a partir do veneno da Crotalus durissus cumanensis segundo o procedimento descrito por Patiño e colaboradores (Patiño et al., 2013,) em que a pureza das proteínas foi verificada por eletroforese em gel (Figura 29). Onde o peso molecular estimado da Serina I é de 33 kDa e da Serina II é de 34 kDa e o rendimento obtido foi de 0,23% e 0,97% para as Cdc-SI e Cdc-SII respectivamente.

Figura 29.(A) Esquema de purificação das serina proteases do veneno de Crotalus durissus cumanensis.(B) Eletroforese em gel (SDS-PAGE 12%) de amostras da serina protease do veneno de Crotalus durissus cumanensis. Serino I (Cdc-SI) e Serino II (Cdc-SII) onde a última coluna à direita corresponde ao padrão de peso molecular (Protein Mixture LMW, GE Healthcare).

Também foram feitas as análises por CD (Figura 30), e ambas apresentaram uma percentagem de estrutura secundária similar, com um conteúdo de -hélice de 25%, de folha- paralela 22%, antiparalela de 12% e randômica de 34%.

A B

Figura 21. Espectro de dicroísmo circular (CD) (A) da proteína serino I 6,6 µmol L-1 (Cdc- SI); (B) da proteína serino II 5 µmol L-1(Cdc-SII) do veneno da Crotalus durissus cumanensis.

4.1.4 Caracterização das Serina proteases de veneno de Crotalus simus

A purificação das serinaproteases foi feita em duas etapas, a primera usando filtração em gel, que gerou sete picos, onde a presença de serina proteases foi testada usando o substrato sintético N-benzoil-L-arginina-p- nitroanilina (BApNA), Figura 31(C) e as frações positivas, X7 e X10, foram injetadas no HPLC e separadas usando uma coluna de fase reversa.

Figura 31.(A) Esquema de purificação das serina proteases do veneno de Crotalus simus. (B) Cromatografia de filtração em gel analítica do veneno total da Crotalus simus em Sephadex G-75 e G-200 onde foram obtidas sete frações (I-VII). (C) Ensaio

enzimático com o substrato BApNA, resultando em atividades proteolíticas as amostras I-IV. (D) Separação RP-HPLC em coluna C5 das frações de X1-X14 a partir do passo de exclusão molecular das quais as frações X7 e X10 apresentaram atividades proteolíticas com o substrato BApNA. (E) RP-HPCL em C5 das frações X7 e X10 a partir da RP- HPLC. Todas as frações apresentaram atividade proteolítica com o substrato BApNA.

Em uma próxima etapa a pureza foi verificada por eletroforese em gel (SDS-PAGE 12%). Somente as amostras coletadas nos picos p2 e p4 (SVSP1 e SVSP2, respectivamente) apresentaram maior concentração da proteína de interesse.

Figura 32. Gel de SDS-PAGE 12% das amostras dos picos p1-p4 em que as amostras p2 (Cs-SI) e p4 (Cs-SII) apresentaram bandas correspondentes a serina proteases de peso molecular de 28,5 e 23,0 kDa respectivamente. Da direita para esquerda: Padrão molecular (P), Veneno total (VT), p1, p2, p3 e p4.

Figura 33. Espectro de dicroísmo circular (CD) onde em (A) se tem a serina protease I isolada da C. simus coletada do pico 2 (Cs-SI) e em (B) a serina protease coletada no pico 4 (Cs-SII).

Foram obtidos espectros de dicroísmo circular para quantificar o conteúdo de estruturas secundárias das SVSP. A Cs-SI apresenta 7,8 % -hélice, 30,6% de folha-antiparalela, 5,3% de folha-paralela, 21,9% volta-e 35,3% de estrutura randômica e a Cs-SII apresenta 21,7% -hélice, 18,9% de folha- antiparalela, 5,9% de folha-paralela, 5,7% de volta-e 18,0% de estrutura randômica. Assim foram observadas diferenças no conteúdo de estrutura secundária, principalmente em relação ao conteúdo de -hélice e folha-o que pode afetar a afinidade e seletividade pelo substrato destas enzimas.

4.2 Comparação de proteínas SVMP-I hemorrágicas e não hemorrágicas

Para entender a diferença na atividade biológica das SVMP-I entre as proteínas hemorrágicas e não-hemorrágicas, foi realizada a comparação entre suas sequências e estruturas. Foram analisadas as SVMP-1 não-hemorrágicas: BmooMPalpha-I (código PDB: 3GBO), Adamalisyn II (códigoPDB: 1IAG), Trimerlisyn II (códigoPDB: 1WNI) e as SVMP-1 hemorrágicas: BaP1 (código PDB: 1ND1), Acutolisyn A (código PDB: 1BSW) e Acutolyisin C (código PDB:

1QUA) como apresentado nas Figura 34 e 35.

Figura 25. Ilustração do alinhamento das sequências das SVMPs hemorrágicas e não hemorrágicas, em cores diferentes os resíduos idênticos e similares, sendo azul escuro para resíduos idênticos e azul claro para similares.

Foi realizada uma comparação da semelhança dos resíduos e da estrutura secundária, observando porções altamente conservadas e outras com menor conservação. Os valores de Identidade e Similaridade das sequências foram de 26,6% e 47,3%, respectivamente. As regiões menos conservadas podem ser divididas em três: uma região próxima ao sítio ativo, que é interrompida pelos três resíduos estruturalmente conservados do motivo Met- turn (Cys-Ile/Val-Met); uma segunda região composta pelos resíduos do N- terminal e uma terceira região composta pelos resíduos do C-terminal.

Também, foi feito um alinhamento das estruturas 3D das SVMP-1 (Figura 35) com os átomos do Cα, onde só foi possível perceber algumas diferenças no loop definido pelos resíduos 153-176 que corresponde a uma região flexível. Algumas pesquisas têm mostrado que esta região possui um papel importante na interação proteína-proteína (Akao et al., 2010; Wallnoefer et al., 2010).

Figura 35. Alinhamento das estruturas 3D das SVMP 1. (A) Em amarelo estão representadas as regiões menos conservadas, em verde a esfera correspondente ao íon cálcio (II) e em cinza a esfera correspondente a íon zinco (II). (B) Proteínas hemorrágicas (vermelho) BaP1 (código PDB: 1ND1), Acutolisyn A (código PDB: 1BSW), Acutolyisin C (código PDB:1QUA) e proteínas não hemorrágicas (azul) BmooMPalpha-I (código PDB:3GBO), Adamalisyn II (código PDB: 1IAG) e Trimerlisyn II (códigoPDB: 1WNI).

Ao calcular os desvios da raiz quadrada média (RMSD) das estruturas alinhadas nos átomos de Cα chega-se a valores menores que 1 Å, podendo-se afirmar que elas são estruturalmente similares (Tabela 5).

Tabela 5.Desvio da raiz quadrada média (RMSD) dos alinhamentos da cadeia principal RMSD (angstrom das estruturas das SVMP) abaixo da diagonal e Número de sobreposição de resíduos acima da diagonal

Proteína 1ND1 1BSW 1QUA 3GBO 1IAG 1WNI

1ND1 195 187 198 187 187

1BSW 1,0800 187 195 187 187

1QUA 0,8380 1,0080 187 189 195

3GBO 0,9420 1,0580 0,9910 187 187

1IAG 0,8210 1,0330 0,8270 0,8820 189

1WNI 0,7360 0,9820 0,6870 0,9570 0,7400

Para analisar o efeito das diferenças nas conformações apresentadas no loop definido pelos resíduos 153-176, a primeira abordagem foi alinhar a estrutura hemorrágica da BaP1 (código PDB: 2W14) e a não hemorrágica, BmooMPalpha-I (código PDB: 3GBO) com o domínio metaloprotease do complexo da MMP-1 ligado ao peptídeo do colágeno (código PDB: 4AUO). No alinhamento mostrado na Figura 36 pode-se observar que o loop definido pelos resíduos 153-176 tem possibilidade de interagir com o colágeno para ambas as proteínas, hemorrágicas e não hemorrágicas.

Figura 36. Alinhamento das estruturas da BaP1 (código PDB: 1ND1 em vermelho), BmooMPalpha-I (código PDB: 3GBO em azul) com o complexo de MMP-1 ligado a um peptídeo de colágeno (código PDB: 4AUO). Para uma melhor visualização a estrutura da MMP-1 foi apagada.

Para validar as possíveis interações que as SVMP-1 podem apresentar com o substrato, foram realizados cálculos de interação proteína-proteína com o programa ZDock. Com este programa, foram geradas 2000 diferentes estruturas para cada um dos pares proteína-substrato e as funções de pontuação usadas foram as de Shape-complementarity. Como molécula receptora foi utilizado o peptídeo em hélice tripla de colágeno (cocristalizado com a colagenase MMP-1 cataliticamente inativa (E200A) e depositada com o código PDB: 4AUO).

Analisando as estruturas geradas com os melhores scores foi possível perceber grandes mudanças entre os complexos de SVMPs hemorrágicas e não hemorrágicas. As SVMPs não-hemorrágicas apresentaram poses onde o loop definido pelos resíduos 153-176 e o íon zinco (II) se localiza do lado oposto ao sítio de contato proteína-substrato (Figura 37).

A B C

D E F

Figura 28. Modelos das SVMPs com as poses de maior pontuação ao interagir com o colágeno. (A) BaP1 (código PDB: 1ND1), (B) Acutolisyn A (código PDB: 1BSW), (C) Acutolyisin C (código PDB:1QUA), (D) BmooMPalpha-I (código PDB:3GBO), (E) Adamalisyn II (código PDB: 1IAG) e (F) Trimerlisyn II (códigoPDB: 1WNI).

A abordagem do Docking proteína-proteína, ZDock, com função de pontuação de Shape Complementarity, permitiu encontrar descritores para a interação proteína-proteína com os pockets (cavidade). Uma ferramenta que permite determinar a presença de pockets nas estruturas cristalográficas é o servidor DoGSiteScorer, onde também foi possível obter parâmetros como volume, tamanho, forma e características químicas dos pockets previstos. Este servidor foi usado para comparar os pockets das SVMP-1 hemorrágicas e não hemorrágicas. Foi observado que as proteínas não hemorrágicas apresentam

um maior número de pockets distribuídos em regiões distantes do sítio de clivagem onde se localiza o íon de zinco (II) (Figura 38). Além disso, os pockets que se localizam no sítio de clivagem nas SVMPs não hemorrágicas apresentam uma maior área lipofílica e um maior volume como apresentado na Figura 38. As diferenças nos parâmetros geométricos, tais como o encerramento (enclosure), como mostrado na Figura 40 apresentam significância estatística entre hemorrágica e não hemorrágica ( o valor p = 0,0194).

Figura 38. Pockets das SVMP gerados pelo servidor Dog Site Scorer, onde (A) e (G) são referentes a SVMP com códico PDB 1ND1, (B) e (H) com código PDB 1BSW, (C) e (I) com código PDB 1QUA, (D) e (J) com códico PDB 3GBO, (E) e (K) com código PDB 1IAG e (F) e (L) com o código PDB 1WNI.

Conforme ilustrado na Figura 38, pode-se observar a diversidade de estrutura dos pockets nas SVMP-I. Parâmetros como o tamanho e área de superfície são importantes na interação proteína-substrato e na seletividade das enzimas pelo substrato.

Figura 29. Volume, área superficial e área lipofílica dos pockets localizado no sítio de clivagem das SVMP 1. Em vermelho estão representadas as proteínas hemorrágicas e em azul, proteínas não hemorrágicas.

Figura 30. Descritores geométricos de profundidade e encerramento dos pockets localizados no sítio de clivagem das SVMP-1, em vermelho estão representadas proteínas hemorrágicas e em azul, proteínas não hemorrágicas.

Estudos recentes têm mostrado que parâmetros como as cavidades podem ter um papel importante na atividade hemorrágica das SVMPs (Dagda et al., 2014; Souza et al., 2016) mas nosso estudo é o primeiro a mostrar que estas cavidades podem ser sítios de interação com o substrato, embora possam ficar distantes do sítio de clivagem e serem responsáveis pela atividade hemorrágica. Alguns estudos têm mostrado que o domínio catalítico das MMP-12 se ligam às membranas intracelulares, utilizando duas orientações estruturais complementares encontrados em lados opostos da cavidade catalítica (Koppisetti et al., 2014). Por este motivo a exploração dessas regiões poderia ser de grande interesse para entender melhor as funções das metaloproteases.

4.2.1 Função do cálcio nas SVMP

Também foi considerado a função do cálcio nas metaloproteases de veneno de serpente tipo 1. Das estruturas selecionadas, algumas apresentam o íon cálcio (II) e outras não apresentam. O íon cálcio (II) está presente principalmente nas metaloproteases não hemorrágicas (3GBO e 1IAG), mas tem

uma proteína hemorrágica que apresenta o íon cálcio (II) (1BSW), e em ambos os casos a geometria apresentada foi octaédrica. Foram selecionados os resíduos de ligação ao cálcio: Glu9, Asp93, Asp200 e a Cys197 para as estruturas da Adamalysin II (código PDB: 1IAG) e Acutolysin-A (código PDB: 1BSW); na enzima Bmoompalfa-I (código PDB: 3GBO) o íon cálcio se encontra ligado com os resíduos Glu7, Asp91, Asp198 e com o grupo carboxila da Cys195. Em ambos os casos, o íon cálcio também tem ligação com moléculas de água, como se apresenta na Figura 41 obtida com ajuda do programa LigPlot. Em todos os casos se observou que os resíduos que apresentam ligação ao íon cálcio estão localizados nas regiões N e C-terminal.

A N B C Asn 200(A) N C N CB O Asn 198(A) CA N C C OE2 CB O CB CG Cys 197(A) CA CA SG C OD2 O C ND2 CB CA O CA CD CG OE2 O OE1 C CB CG N Asp 93(A) ND2 CA HOH 444(A) OD1 OD1 CB Asp 93(A) CG OD1 Glu 9(A) CB OD1 CD O CG CG O HOH 405(A) OD2 Glu 7(A) N OE1 CA OE2 CA 250(A) HOH 313(A) OD2 CA C Glu 9(A) CA CG CB O Cys 197(A) OE1 CD N OD1 C CA HOH 410(A) CA 900(A) CB O CA CG CA 301(A) OD1 ND2 CG SG C N HOH 319(A) SG CA N C CA O O CB N CB CB CA C C Asp 91(A) CA Asn 200(A) OXT O N Cys 195(A) N

Figura 31. Representação 2D das ligações dos íons cálcio nas metaloproteases de veneno de serpente: (A) Adamalysin II (código PDB: 1IAG); (B) Bmoompalfa-I (código PDB: 3GBO) e (C) Acutolysin-A (código PDB: 1BSW).

No caso das proteínas que não tinham cálcio na estrutura de raio-X, elas apresentam os resíduos com capacidade de ligação ao cálcio, mas alguns autores atribuem que o motivo de não apresentar cálcio na estrutura cristalina deve-se ao empacotamento. Watanabe e colaboradores justificam que o grupo

N da Lys131 é o responsável pela não ligação do cálcio, pois este resíduo pode formar uma ligação de hidrogênio via uma molécula de água com o grupo N2 da Asn200 (Watanabe et al., 2003). Com ajuda do programa JavaProtein Dossier, do

Sting, foram analisados os contatos internos (ITC) dos resíduos E9, D93 C197 e N200 da estrutura cristalográfica da BaP1 com código PDB 1ND1 como se apresenta na Figura 42.

97 × × × × × A B C D E

Figura 32. Contatos internos (ITC) dos resíduos com possibilidade de ligação ao íon cálcio (II): (A) Glu9, (B) Asp93, (C) Cys197, (D) Asn200 e (E) Lys131 na estrutura da BaP1 (código PDB: 1ND1).

Figura 43. Estrutura da BaP1 (código PDB: 1ND1). Em roxo, resíduos com possibilidade de ligação ao cálcio; em vermelho, resíduos com contato interno com os resíduos de ligação ao cálcio e em amarelo, Lys131. A esfera em cinza corresponde ao zinco.

Analisando os contatos internos dos resíduos com possibilidade de ligação ao cálcio, não foi observada a interação da Lys131 com estes resíduos, como se apresenta nas Figuras 42 e 43, ficando distante desses resíduos. Na Figura 42 (D), se observa a que a Asn200 apresenta interação com uma molécula de água, e esta interação é por ligações de hidrogênio (cadeia principal- H2O- cadeia secundária) entre o oxigênio da Leu199-H2O (3,082 Å) e da H2O-ND2 da Asn200 (2,896 Å).

Além disso, os autores reportaram que esta proteína apresenta uma estequiometria monomérica, o que deixa em dúvida o verdadeiro motivo da falta de cálcio nesta proteína, abrindo a possibilidade de que em solução o íon cálcio (II) possa interagir com estes resíduos.

Fazendo um alinhamento das estruturas, Figura 44, pode-se observar que as cadeias laterais do N200 são pouco sobrepostas em comparação aos

resíduos E9, D93 e a C197. Calculando a distância do oxigênio ao sítio onde pode-se localizar o cálcio, se observou que estas distâncias são maiores a 4 Å, como se mostra na Tabela 6, o que poderia explicar o motivo de que este íon não está presente na estrutura.

Figura 44. Alinhamento das SVMP e comparação dos sítios de ligação ao cálcio.

Tabela 6. Distância do oxigênio da N200 ao cálcio nas SVMPs

Distância do N200 ao Ca(II) Código PDB Nome da proteína Observações [Å] 1IAG Adamalysin II 2,4 Ca(II) 3GBO Bmoompalfa-I 2,4 Ca(II) 1BSW Acutolysin-A 2,4 Ca(II) 1WNI Trimerelysin II 4,4 Não Ca(II) 1QUA Acutolysin-C 8,2 Não Ca(II) 1ND1 Bap1 8,0 Não Ca(II) Com o programa JavaProtein Dossier foi caracterizado o nano-ambiente do sítio de ligação ao cálcio tanto nas proteínas que apresentaram ou não o íon Ca (II) na sua estrutura de raio-X encontradas na base de dados PDB. Algumas diferenças entre os grupos se apresentaram em parâmetros como o Fator de

100

Temperatura e potencial eletrostático, como é mostrado nas, Figuras 45, 46 e na Figura 47.

× × A B C

Figura 34. Descrição do nano-ambiente dos resíduos ligados ao cálcio (A) Adamalisyn II (código PDB: 1IAG), (B) BmooMPalpha-I (código PDB:3GBO) e (C) Acutolisyn A (código PDB: 1BSW).

101

× × × A B C

Figura 35. Descrição do nano-ambiente no sítio de ligação ao cálcio nas estruturas onde não foi determinado sua ligação (A) BaP1 (código PDB: 1ND1), (B) Trimerlisyn II (códigoPDB: 1WNI) e (C) Acutolyisin C (código PDB: 1QUA).

102

100 Temperature Factor LHA

0 EDCNEDCNEDCNEDCNEDCNEDCN 1WNI 1IAG 3GBO 1QUA 1ND1 1BSW

(A)

-30 EPsurface -20 -10 0

EDCNEDCNEDCNEDCNEDCNEDCN 1WNI 1IAG 3GBO 1QUA 1ND1 1BSW

(B)

Figura 47.Comparação de alguns parâmetros estruturais nos sítios de ligação ao cálcio (A) Fator de temperatura e (B) potencial eletrostático na superfície. Sendo em ambas as figuras em azul SVMPs sem cálcio e em laranja SVMPs com cálcio.

Outra forma de comparar as estruturas das proteínas, principalmente com elementos de estrutura secundária, é pelos diagramas de topologia que mostram como as cadeias , representadas pelas setas grandes, juntam-se, lado-a-lado, para formar folhas-e como as -hélices (os cilindros grandes) estão localizados em relação a estes. As setas pequenas indicam a direcionalidade da cadeia da proteína, a partir do N- para o C-terminal. Os números dentro dos elementos estruturais secundários correspondem à numeração dos resíduos dada no arquivo PDB e é possível observar na Figura 44 uma conservação das

103

estruturas de folhas- presentes (4 paralelas e uma antiparalela). A região N- terminal também é similar em quase todas as estruturas, mas no caso da BaP1 (código PDB: 1ND1) apresenta algumas mudanças. A região que apresenta mais mudanças nos elementos de estrutura secundária é na porção C-terminal, por isso, devemos prestar mais atenção nesta região, dado que esta região é importante na interação com o cálcio.

104

A B C

D E F

Figura 37. Diagramas de topologia das metaloproteases de veneno de serpente hemorrágicas (A) BaP1 (código PDB: 1ND1), (B) Acutolisyn A (código PDB: 1BSW), (C) Acutolyisin C (código PDB:1QUA); e das não hemorrágicas (D) BmooMPalpha-I (código PDB:3GBO), (E) Adamalisyn II (código PDB: 1IAG) e (F) Trimerlisyn II (códigoPDB: 1WNI).

Ambas as regiões, N- e C-terminal se localizam na superfície. A região do N-terminal encontra-se unida à região do C-terminal por ligações de hidrogênio na hélice C (Figura3 (C)) que contém o resíduo glutamato que atua como base na reação de hidrólise dos substratos (Cerdà-Costa e Xavier Gomis-Rüth, 2014; Gomis-Rüth, 2009).

105

Ao analisar o sítio de ligação ao zinco, Figura 49 e Figura 50, pode-se observar a conservação dos elementos de estrutura secundária onde predomina a hélice e comparando alguns descritores, foram observadas diferenças como o tamanho dos pockets. Um caso de grande interesse é a estrutura da Bmoompalfa-I, código PDB3GBO, que é umas das poucas metaloproteases que apresenta uma coordenação octaédrica incomum, onde três moléculas de água interagem com as histidinas do sítio catalítico, formando ligações de hidrogênio, mas não com o glutamato, Figura 49(D).

N N C O C O A O B C His 142(A) CA C His 142(A) CA CB His 146(A) N CA C CB CD2 N CA O CG O CB ND1 NE2 His 152(A) ND1 CD2 C CG HOH 443(A) ND1 CB CE1 CD2 CG CG His 146(A) ZN CE1 CE1 ND1 ZN 800(A) NE2 CA N CE1 NE2 NE2 NE2 ZN 400(A) CG CD2 ND1 ND1 NE2 N CE1 CD2 CE1 NE2 ZN CG CB CE1 His 152(A) CB ZN ND1 CA NE2 CD2 CG O His 142(A) CE1 CD2 C O NE2 CA C CD2 ZN 999(A) CD2 ND1 CB O N HOH 467(A) C CG CE1 C His 152(A) O CB CG CA HOH 300(A) CA His 146(A) N N ND1 CB

O C

ND1 O CB CA CE1 His 150(A) D E N F C C CA CG HOH 1011(A) CD2 NE2 CB N CA O HOH 544(A) N His 152(A) CD2 ZN 999(A) ZN CD2 CG ZN His 142(A) CB NE2 HOH 543(A) CE1 ND1 ND1 ND1 CG HOH 531(A) NE2 CE1 ND1 ZN 302(A) NE2 NE2 CE1 O CB CE1 NE2 CD2 CG CD2 CE1 CD2 N ND1 C CA CG CE1 CE1 CB CD2 NE2 NE2 ZN CG O ND1 ND1 CA N His 144(A) CG CD2 O C CA His 146(A) N His 140(A) CB CE1 NE2 His 152(A) ZN 999(A) CB N N C CG CB CA ND1 CD2 C HOH 300(A) CA O His 146(A) C CG His 142(A) O CB C

CA N

Figura 38. Representação 2D das ligações dos íons zinco nas metaloproteases de veneno de serpente: (A) BaP1 (código PDB: 1ND1), (B) Acutolisyn A (código PDB: 1BSW), (C) Acutolyisin C (código PDB:1QUA); e das não hemorrágicas (D) BmooMPalpha-I (código PDB:3GBO), (E) Adamalisyn II (código PDB: 1IAG) e (F) Trimerlisyn II (códigoPDB: 1WNI).

106 × × × × × ×

Figura 39. Nano-ambiente do sítio de ligação ao zinco nas metaloproteases de veneno de serpente. BmooMPalpha-I (código PDB:3GBO), Adamalisyn II (código PDB: 1IAG), Trimerlisyn II (códigoPDB: 1WNI), BaP1 (código PDB: 1ND1), Acutolisyn A (código PDB: 1BSW), Acutolyisin C (código PDB:1QUA).

Também foram analisadas as sequências com o módulo MSSP do programa STING de algumas regiões, como os pockets e o loop que apresentam maior

107

flexibilidade. Um parâmetro interessante é o Fator de Temperatura, que apresenta uma maior variação na região definida pelos resíduos 153-176. O Fator de temperatura indica o nível da mobilidade dos átomos no cristal e indica qual região poderia ser considerada como uma região muito flexível. Mas aplicando-se alguns métodos de classificação, pode-se determinar outros parâmetros que permitem classificar as metaloproteases em hemorrágicas e não hemorrágicas como se apresenta na Tabela 7.

Tabela 7. Determinação de parâmetros para classificar metaloproteases hemorrágicas e não hemorrágicas

CFS analysis Random Forest Chi Square 3D Entropy CA (Window=7.Radius=5) Density CA sw(9,3) Contacts Energy All sw (false,3) 3D Entropy CA (Window=9.Radius=6) Energy Density LHA sw(7,4) Contacts Energy All sw (true,3) 3D Entropy LHA sw(3,4) Diff Reliability Energy Density LHA sw(3,6) 3D Entropy LHA sw(3,5) EP lha Energy Density LHA sw(7,4) 3D Entropy LHA sw(5,5) Density CA sw(7,3) Density CA sw (9,3) Contacts Energy All sw(true,5) 3D Entropy LHA sw(3,3) Density CA sw (7,3) Contacts Energy All sw (false,5) 3D Entropy CA Density CA sw (9,4) (Window=7.Radius=4) Density CA sw (9,4) MyReliability Energy Density LHA sw(7,5) Density LHA sw(9,3) Density Ca sw(9,4) Diff Reliability. Distance C. 3D Entropy LHA sw(3,4) 3D Entropy LHA sw(7,4) Energy Density Intra(4) 3D Entropy LHA sw(5,4) Energy Density LHA sw(5,5) Energy Density CA sw(9,3) Energy Density LHA sw(7,5) 3D Entropy LHA sw(3,4) Temperature Factor Max Density LHA sw(7,6) 3D Entropy LHA sw(3,3)

Considerando-se a caracterização desses resíduos, foi empregado o método Random Forests (Breiman, 2001) para derivar um modelo preditivo capaz de estabelecer inferências sobre o efeito hemorrágico das SVMPs de interesse. Devido à sua natureza não-paramétrica, o método Random Forests é capaz contabilizar a dependência não-linear dos diversos parâmetros considerados. Por meio de uma análise estatística do modelo preditivo derivado, foi possível determinar o grau de

108

importância (Gini importance) de cada parâmetro na classificação das SVMPs como hemorrágicas ou não-hemorrágicas.

Além do Random Forests, mais dois métodos estatísticos foram empregados: CFS (Correlation Feature Selection) e Chi-quadrado. Em particular, o método CFS utiliza métricas de correlação e entropia para determinar um subconjunto de parâmetros não-correlacionados, que sejam amplamente capazes de estabelecer inferências preditivas sobre o problema estudado.

Os resultados obtidos indicam que os parâmetros mais importantes para determinar se uma SVMP é hemorrágica são os relacionados à conservação (3D Entropy), contatos (Contacts Energy, Energy Density), além dos geométricos (Distance to C-Terminal, Density) e físico-químicos (Electrostatic Potencial).

Nossa proposta sugere-se que a atividade biológica, hemorrágica, destas proteínas não depende de um único parâmetro estrutural como a flexibilidade, e que o processo de interação proteína-proteína pode acontecer em outras regiões além do sítio de clivagem, como foi discutido previamente.

4.3 Interações proteína-inibidor

Uma vez feita a caracterização das estruturas, iniciou-se a busca por moléculas pequenas com capacidade de interagir e inibir a atividade proteolítica da BaP1 que é uma SVMP hemorrágica. O primeiro passo foi definir um sítio de ligação na proteína BaP1. A estrutura cristalina de código PDB: 2W14 tem um ligante co- cristalizado, que se localiza próximo ao íon zinco como ilustrado na Figura 51.

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Figura 51. Identificação do sítio de ligação do ligante co-cristalizado na BaP1 (código PDB 2W14). (A) Representação do ligante co-cristalizado em verde. (B) Representação do modelo do farmacóforo onde em cinza se tem o volume de exclusão, em verde o doador de ligações de hidrogênio, em roxo o aceptor de ligações de hidrogênio e em azul os grupos hidrofóbicos; (C) Representação do nanoambiente dos resíduos que fazem contato com o ligante co-cristalizado.

Figura 52. Diagrama de fluxo de trabalho a preparação dos ligantes das bibliotecas Zinc, PubChem e ChemBL com o programa Pipeline Pilot.

Também foi necessário definir um modelo de farmacóforo para realizar um mapeamento dos ligantes e executar uma filtragem rápida da biblioteca dos compostos (Figura 51(B)). Foram criados 11 modelos de farmacóforos, 10 de forma

110

automática e 1 de forma manual, mas todos baseados na estrutura do ligante co- cristalizado com a proteína. Foi necessário comparar e determinar qual apresentava maior afinidade pelos inibidores conhecidos (inibidor cocristalizado, WR21204). Foram avaliados e usados como controles negativos uma pequena biblioteca de inibidores de quinases (que não inibem a BaP1) e como controle positivo o inibidor cocristalizado (WR21204), Figura 68 (Apêndice). Os resultados obtidos foram representados por meio de gráficos de mapas de calor (Figura 70, Apêndice). O modelo do farmacóforo que apresentou melhor resposta contém uma combinação de sub-estruturas, restrições 3D, características, formas e volumes de exclusão da proteína e do inibidor utilizado como modelo. Uma característica importante incluída no modelo de farmacóforo desenvolvido foi a presença de grupos com a capacidade de ligação ao íon Zn(II). Pela análise de ROC (Receiver Operating Characteristic) foi possível concluir que não há falsos positivos na filtragem com o farmacóforo (Figura 69, Apendice)

Figura 53. Diagrama de fluxo de trabalho desenvolvido para o HTS com BaP1 com o programa Pipeline Pilot.

Foram analisadas três bibliotecas virtuais (Zinc, PubChem e ChemBL) de compostos, sendo geradas 255 conformações para cada composto selecionado que foram testadas com o fluxo de trabalho de Docking que abrange uma serie de métodos de docking e filtros conectados em série, sendo estes: Farmacóforo, LibDock, LiganFit e CDOCKER, Figura 53.

No fluxo de trabalho de Docking o primeiro componente foi o Ligand Pharmacophore Map. Este componente compara e ajusta as conformações dos

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ligantes gerados com o modelo de farmacóforo escolhido. Esta primeira etapa permitiu avaliar a grande quantidade de conformações geradas de forma rápida (alguns dias) permitindo filtrar compostos com algumas caraterísticas desejadas como a presença de grupos de ligação ao zinco. Na segunda etapa foi utilizado o componente LibDock, que é um componente que realiza o cálculo de docking usando hotspots, onde os ligantes são alinhados no sítio de ligação por meio de interações polares e apolares. Este também é um método rápido desenvolvido para avaliar bibliotecas combinatórias (Diller e Merz, 2001). A terceira etapa foi a utilização do componente LigandFit, que utiliza um algoritmo de Docking baseado na forma do ligante e do sítio selecionado como receptor na proteína (Venkatachalam et al., 2003). A quarta etapa foi necessária para selecionar as conformações com maiores Scores nas funções de pontuação usadas previamente FitValue para a filtração com o farmacóforo, LibDockScore para o método LibDock e Dock Score para o LigandFit. Depois foi utilizado o componente RMSD Pose Filter para selecionar as conformações com um RMSD próximo, deixando as de maior Score (neste caso foi usado Dock Score). Este procedimento permitiu reduzir a quantidade de conformações em alguns casos redundante o que permitiu otimizar os outros cálculos seguintes que demandaram maior tempo computacional. Também foi usado um componente de Filtração (Filtration) onde foram selecionados os compostos que apresentaram interação com o íon zinco (II) e no subsítio S1´, para os quais foram tomados como positivo os valores FitValue maior que 1 para a característica (feature) que descreve o grupo de ligação ao Zinco (ZnBinder) e as interações hidrofóbicas no subsítio S1´ e com maior Dock Score.

O componente CHARMm Binding energy foi utilizado para calcular a energia de interação, mas não foi usado para filtrar. Finalmente foi utilizado o método de CDOCKER, que utiliza algoritmos baseados em dinâmica molecular (MD) com o campo de força CHARMm. Este cálculo consistiu na geração de conformações aleatórias dos ligantes a partir de uma temperatura elevada, transferindo o ligante ao local de ligação. As poses são revisadas utilizando rotações aleatórias de corpo rígido, seguido de reconhecimento simulado com um potencial grid e finalmente é feita uma minimização para refinar a pose do ligante.

Também, foi utilizado um componente para analisar os resultados obtidos,

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analisando as melhores interações com a proteína, Analize Ligand Poses, resultados mostrados na Figura 55.

Baseado no Score CDOCKER_ENERGY, cinco compostos foram selecionados e analisados como scaffolds de um possível inibidor, como é mostrado na Tabela 7. Desses 5 compostos, Figura 54, foi possível testar 3 compostos in vitro na concentração de 1 mmol L-1, com o ensaio de azocaseína mostrando inibição da atividade proteolítica da BaP1.

Figura 54. Interações dos cinco compostos escolhidos com a BaP1 (A) ZINC08767570; (B) ZINC19201999; (C) ZINC36615464; (D) ZINC04429579 e (E) ZINC06812429.

O histograma de interações mais favoráveis, Figura 55, mostra que uma das interações mais favoráveis foi com o íon zinco. Os ligantes com os melhores Scores apresentam os grupos de ligação ao zinco pirimidina-2,4,6-triona, fosfato e a purina- 6,8-diol. A pirimidina-2,4,6-triona foi relatada como um inibidor promissor, e é uma nova classe eficaz e seletiva de inibidores de metaloproteases de matriz MMP-2 e MMP-9 (Grams et al., 2001). Outros estudos mostram a eficácia de derivados de pirimidina-2,4,6-triona, especialmente o composto RO 28-2653 desenvolvido pelo grupo de pesquisa da Hoffman-La Roche para o tratamento antitumoral e como terapia antiangiogênica e anticancerígena (Bartsch et al., 2011; Cannarile, Ries e Ruettinger, 2013; Lein et al., 2002; Maquoi et al., 2004).

113

Figura55. Histograma das interações das soluções do Docking com a proteína BaP1.

Outra interação favorável é estabelecida com a Arg110 (Figura 56) que está envolvida na formação de subsítio S1. No caso da pirimidina-2,4,6-triona o grupo hidroxila forma interações de ligações de hidrogênio com o grupo guanidino da Arg110.

114

A B

C D

Figura 56. Interações da conformação com melhor Score com a BaP1 resultado dos cálculos de Docking: (A) ZINC08767570; (B) ZINC19201999; (C) ZINC36615464; (D) ZINC04429579 e (E) ZINC06812429.

As interações hidrofóbicas são outras interações favoráveis, que ocorrem principalmente no subsítio S1´, Figura 56. A Ile108 é parte da entrada do túnel do subsítio S1´, que é conhecido pela sua elevada hidrofobicidade em todos as SVMPs e é provável que seja a responsável pela especificidade do substrato.

115

Tabela 8. CDOCKER_ENERGY e porcentagem de inibição in vitro dos compostos selecionados com a proteína BaP1

Inibição -CDOCKER_ENERGY Nome in [kcal·mol−1] vitro(%)

A ZINC08767570 83,4334 95

B ZINC19201999 80,684 -

C ZINC36615464 78,1994 -

D ZINC04429579 69,4876 7

E ZINC06812429 69,4267 98

Comparando os compostos A (ZINC08767570) e o composto E (ZINC06812429) pode-se observar que os grupos na posição para- do grupo fenila, metila e isopropila respectivamente, apresentam interações com os resíduos da cavidade hidrofóbica como a Ile108. No caso do composto E (ZINC06812429), a presença do grupo isopropila permite preencher ainda mais a cavidade hidrofóbica estabelecendo interações com resíduos como a Leu170. O composto B (ZINC19201999) também apresenta um grupo fenila que interage com a Ile108 e Leu170. O composto C (ZINC36615464) tem uma pequena ocupação da cavidade hidrofóbica onde o grupo imidazol interage com a Ile108.

Foi realizado um ensaio de supressão de fluorescência (quenching) das soluções de BaP1 (2 µM) com diferentes concentrações dos compostos ZINC06812429 (nomeado composto A1) e o ZINC08767570 (nomeado composto A2, diluída em dimetilsulfóxido (DMSO)), como ilustrada na Figura 57. As técnicas de fluorescência podem ser utilizadas para investigar o sítio de ligação enzimático, permitindo a verificação de mudanças no ambiente dos triptofanos quando acontecem as interações proteína-inibidor.

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Figura 57. Espectros de fluorescência de emissão da BaP1 e da BaP1 com os inibidores (A) composto ZINC06812429, A1 e (B) composto ZINC08767570, A2.

4.3.1 Inibidores de SVSP do veneno de C. simus e Crotalus durissus cumanensis

Utilizando um protocolo pronto de Docking, que utiliza o método CDocker do programa Discovery Studio, foram testados cinco compostos: Hesperidina, Hesperitina, Nafamostat, Camostat e Silvelestat (Figura 72), onde serina proteases homólogas com as proteínas isoladas do veneno da Crotalus durissus cumanensis foram usadas para construção do modelo de proteína alvo. Sendo utilizados os fragmentos N-terminal das duas serina proteases da serpente C. durissus cumanensis (Cdc-SI e Cdc-SII) e o fragmento da sequência de aminoácidos da Cdc- SI inserido no programa foi: VIGGDEC(X)NIN obtendo a enzima de código PDB 4E7N que se trata de uma serina protease tipo trombina do veneno da serpente Agkistrodon halys. O segundo fragmento da sequência de aminoácidos da Cdc-SII foi: VIGGDICNINEHNFLVYE, obtendo a enzima de código PDB 1OP0 que se trata de uma serina protease tipo trombina do veneno da serpente Agkistrodon acutus.

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Figura 58. Serina proteases homólogas as da serpente Crotalus durissus cumanensis e seus “pockets” na superfície enzimática, um potencial sítio de ligação com os pequenos compostos químicos (possíveis fármacos). As serina proteases homólogas encontradas por meio dos programas computacionais são trombolíticas e são das víboras A) Agkistrodos halys (código PDB: 4E7N) e B) Agkistrodos acutus (código PDB: 1OP0).

Figura59.Interação enzima-inibidor no pocket 1 da enzima de código PDB 4E7N. (A) e (F) Hesperitina; (B) e (G) Warfarina;(C) e (H) Nafamostat; (D) e (I) Camostat; (E) e (J) Sivelestat.

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Figura 60. Estrutura química das moléculas utilizadas para fazer o docking com as enzimas de códigos PDB 4E7N e1OP0.

Foram encontrados sítios de ligação para os ligantes que foram utilizados para o cálculo de Docking. Apresentam-se somente os resultados da interação com o sítio de ligação 1 que foi o que mostrou melhores resultados, sendo esse com resíduos da tríade catalítica das serina proteases (His57, Asp189, Ser195).

Os melhores valores da interação enzima-inibidor para a enzima serina protease tipo trombina da serpente Agkistrodon halys depositado sob o código PDB 4E7N estão resumidos Figura 61 e na Tabela 9. O composto hesperitina apresentou melhor interação formando ligações de hidrogênio com a S195.

Tabela 9. Melhores valores da interação enzima-inibidor (–CDOCKER ENERGY) para a enzima de código PDB 4E7N (pocket 1) e PDB 1OP0 (pocket 6)

Composto 4E7N 1OP0 (pocket 1) (pocket 6)

kcal·mol−1 kcal·mol−1 Hesperidina N.I.* N.I.*

Hesperitina 68,3677 44,9082 Nafamostat 29,4374 6,42802 Camostat 35,552 -5,46012

Silvelestat -287,264 -195,629

N.I.*: não apresentou interação

Para a serina protease da A. halys, no pocket 1 a hesperitina teve a maior energia de interação com a enzima, assim como no pocket 6 da A acutus. A Figura

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61 mostra a hesperitina e as suas interações com os resíduos de aminoácidos e que participam das interações nas duas enzimas.

Figura 61. Interação enzima-inibidor no pocket 1 da enzima de código PDB 4E7N (A) e (C) e no pocket 6 da enzima de código PDB 1OP0 (B) e (D).

Foi feita a determinação de parâmetros cinéticos das duas SVSPs isoladas do veneno da C. simus, onde foram calculados VMax e KM e para saber a eficiência da catálise enzimática, calculou-se a constante catalítica (kcat), que é a razão da VMax pela concentração da enzima. Os valores de VMax, KM e kcat para as duas SVSP encontram-se na Tabela 10 e os gráficos de Michaelis-Menten e Lineweaver-Burk encontram-se na Figura 62.

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Figura 62. Propriedades cinéticas e inibição das enzimas SVSP1 e SVSP2. Curva de Michaelis-Menten da (A) SVSP1 e (C) SVSP2. Curva de Lineweaver-Burk da (B) SVSP1 e (D) SVSP.

Tabela 10. Parâmetros cinéticos para as enzimas Cs-SIe Cs-SII. Os valores de VMax, KM e kcat modificam com a presença da hesperitina em ambas as enzimas.

Parâmetros cinéticos Cs-SI Cs-SII Sem Inibidor Com Inibidor Sem Inibidor Com Inibidor -1 -1 -1 VMax / mol L min 1,96 6,29 x 10 2,61 2,03 -1 -1 -1 -1 KM / mmol L 1,29 4,82 x 10 2,70 x 10 2,97 x 10 -1 6 6 7 6 kcat / s 5,60 x 10 1,78 x 10 1,07 x 10 8,06 x 10

Dos resultados da determinação de parâmetros cinéticos das duas SVSP com e sem hesperitina pode-se definir que para a serina protease I (Cs-SI) a hesperitina atua como um inibidor não-competitivo observando mudanças no parâmetro VMax e

Kcat. A serina proteianse SII (Cs-SII) corresponde a um inibidor misto, observando-se mudanças de Kcat e pequenas mudanças de VMax.

Foi realizado ensaio de supressão de fluorescência (quenching), as soluções de SVSP foram tituladas até atingir 10 L de hesperitina, na concentração de 0,5 mg

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mL-1, diluída em dimetilsulfóxido (DMSO), como mostrado na Figura 63. Foram observados deslocamentos (max) de 20 nm para a Cs-SIe de 17 nm para Cs-SII, sendo que estes deslocamentos para o vermelho indicam alterações estruturais que levam à maior exposição dos resíduos de triptofano para o solvente.

Figura 63. Espectros de fluorescência de emissão referente as serina proteases isoladas do veneno de C. simus a uma concentração 4 µM com e sem o inibidor hesperitina (8 µM) a A) Cs-SI e B) Cs-SII.

Ensaios de supressão de fluorescência realizado para as serina SVSP isoladas do veneno da Crotalus durissus cumanensis permitiram o cálculo das constantes de dissociação. Utilizando um gráfico de Stern-Volmer para o cálculo destes valores. O gráfico de Stern-Volmer obtido corresponde a um desvio negativo devido a presença de múltiplos fluoróforos. Os dados foram ajustados a um comportamento hiperbólico. Os valores obtidos de Kd foram de 14±2 µM e 17±4 µM para a Cdc-SI e CdC-SII respectivamente.

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Figura 64. Gráfico de Stern-Volmer para a SVSP isoladas do veneno de Crotalus durissus cumanensis interagindo com hesperitina.

Foi demonstrado que a hesperitina pode inibir a atividade proteolítica das serina proteases de veneno de serpente. Isso pode estimular o trabalho futuro com base em novas buscas de alvos ou de modificações estruturais das moléculas a partir de resíduos agro-industiais, como resíduos de casca de laranja que são ricos em flavonóides.

4.4 Ensaios de atividade biológica das proteínas

As metaloproteases são proteases multiespecíficas com a capacidade de interagir com vários componentes da membrana basal até o ponto de promover a hemorragia hidrolisando as proteínas da matriz extracelular dos capilares. Dessa forma, testamos as duas proteínas, a BaP1 e a PIII como inibidores de angiogênese. Nossa hipótese prevê que a atividade proteolítica destas proteínas tenha a capacidade de reduzir a formação de novos capilares.

Foi necessário validar a viabilidade celular das células endoteliais de aorta de coelho para averiguar se as doses utilizadas não são letais. Na Figura 65, pode-se observar que as proteínas BaP1 e PIII não afetam a viabilidade das células RAEC em concentrações de ate 20 µg ml-1.

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Figura65. Avaliação da viabilidade celular de células endoteliais de aorta de coelho (RAEC) na presença de BaP1 ou PIII (0-100 µg mL-1).

No ensaio de formação de estruturas tipo capilar por células RAEC em membrana basal reconstituída (Matrigel), a BaP1 tem mostrado uma completa inibição em concentração menor que 10 µg mL-1 (Figuras 66 e 67). A PIII, além do domínio metaloprotease, apresenta um domínio de desintegrina e um domínio rico em cisteínas (Cys Rich domain). Embora seja uma SVMP altamente hemorrágica foi necessário usar concentrações maiores do que 100 µg mL-1 para a inibição completa da formação de estruturas capilares das células RAEC. Comparando-se a BaP1 com a PIII, é possível observar que a BaP1 tem mostrado melhores resultados de atividade. A dose utilizada para inibir de forma completa a formação de estruturas capilares foi menor que a dose hemorrágica mínima, 20µg (Gutiérrez, J. M., Romero, Díaz, et al., 1995).

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Figura66. Avaliação da formação de estruturas capilares pelas células RAEC em membrana basal reconstituída (Matrigel) na presença das SVMPs BaP1 e PIII.

Figura67. Imagens das estruturas capilares em membrana basal reconstituída obtidas por microscopia ótica.

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Figura 68. Teste de membrana corioalantóicas (CAM) em ovos de galinha de 11 dias de idade. (A) Controle positivo, (B) controle negativo, (C) 10 µL de BaP1 (0,5 µmol L-1), (D) 10 µL de PIII (0,5 µmol L-1)

Os ensaios in vitro (in ovo) também mostraram a capacidade da BaP1 e a PIII de inhibir a formação de capilares, Figura 63. Estes resultados sugerem o potencial destas proteínas para o tratamento de antiangiogênese.

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Capítulo 5. Conclusões e perspectivas

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5 CONCLUSÕES

 As metaloproteases BaP1 e PIII do veneno de C. simus foram caracterizadas com técnicas de dicroísmo circular mostrando a importância dos íons Ca(II) e Zn(II) na estabilização da estrutura secundária de ambas proteínas.

 As metaloproteases hemorrágicas e não hemorrágicas apresentam diferentes sítios de interação com o substrato, colágeno. As proteínas não hemorrágicas apresentam uma maior quantidade de cavidades, o que permite o estabelecimento de interações proteína-substrato em regiões distantes do sítio de clivagem.

 Entre os cinco inibidores obtidos via screening virtual selecionados por apresentar melhor interação com a metaloprotease BaP1, dois apresentaram atividade inibitória in vitro, o que permitiu considerá-los como promissores inibidores dessa enzima. Estes inibidores são os compostos ZINC08767570 e ZINC06812429.

 Para as proteínas SVSP isoladas, o bioflavonóide hesperitina foi identificado como potente inibidor in silico e in vitro.

 A metaloprotease BaP1 teve atividade de inibição de angiogênese superior quando comparada com a metaloproteinase PIII nos ensaios in ovo e in vitro.

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PERSPECTIVAS

• Os parâmetros como conservação (3D Entropy), contatos (Contacts Energy, Energy Density), geométricos (Distance to C-Terminal, Density), físico- químicos (Electrostatic Potencial) e pockets podem ser considerados em estudos de mutagênese que procurem modificar a atividade biológica das SVMP hemorrágicas.

• Buscar novos alvos ou realizar modificações estruturais nas moléculas presentes nos resíduos agro-industriais como resíduos de casca de laranja que são ricos em flavonóides para tratamento de doenças negligenciadas.

• Avaliar o potencial da BaP1 em tratamentos de antiangiogênese.

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Capítulo 6. Bibliografia

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138

76 APÊNDICE

139

TabelaTabela 11. 11Clãs das metalopeptidases8

Clãs Famili TIPO DE PEPTIDASE a MA M1 aminopeptidase N (Homo sapiens) M2 angiotensin-converting enzyme peptidase unit 1 (Homo sapiens) M3 thimet oligopeptidase (Rattus norvegicus) M4 thermolysin (Bacillus thermoproteolyticus) M5 mycolysin (Streptomyces cacaoi) M6 immune inhibitor A peptidase (Bacillus thuringiensis) M7 snapalysin (Streptomyces lividans) M8 leishmanolysin (Leishmania major) M9 bacterial collagenase V (Vibrio alginolyticus) M10 matrix metallopeptidase-1 (Homo sapiens) M11 gametolysin (Chlamydomonas reinhardtii) M12 astacin (Astacus astacus) M13 neprilysin (Homo sapiens) M26 IgA1-specific metallopeptidase (Streptococcus sanguinis) M27 tentoxilysin (Clostridium tetani) M30 hyicolysin (Staphylococcus hyicus) M32 carboxypeptidase Taq (Thermus aquaticus) M34 anthrax lethal factor (Bacillus anthracis) M35 deuterolysin (Aspergillus flavus) M36 fungalysin (Aspergillus fumigatus) M41 FtsH peptidase (Escherichia coli) M43 cytophagalysin (Cytophaga sp.) M48 Ste24 peptidase (Saccharomyces cerevisiae) M49 dipeptidyl-peptidase III (Rattus norvegicus) M54 archaelysin (Methanocaldococcus jannaschii) M56 BlaR1 peptidase (Staphylococcus aureus) M57 prtB g.p. (Myxococcus xanthus) M60 enhancin (Lymantria dispar nucleopolyhedrovirus) M61 glycyl aminopeptidase (Sphingomonas capsulata) M64 IgA peptidase (Clostridium ramosum) M66 StcE peptidase (Escherichia coli) M72 peptidyl-Asp metallopeptidase (Pseudomonas aeruginosa) M76 Atp23 peptidase (Homo sapiens) M78 ImmA peptidase (Bacillus subtilis) M80 Wss1 peptidase (Saccharomyces cerevisiae) M84 MpriBi peptidase (Bacillus intermedius) M85 NleC peptidase (Escherichia coli) M90 MtfA peptidase (Escherichia coli) M91 NleD peptidase (Escherichia coli) M93 BACCAC_01431 g.p. and similar (Bacteroides caccae) M97 EcxAB peptidase (Escherichia coli) M98 YghJ g.p. (Escherichia coli) MC M14 carboxypeptidase A1 (Homo sapiens)

8 Fonte: http://merops.sanger.ac.uk/

140

M86 PghP gamma-polyglutamate hydrolase (Bacillus phage phiNIT1) M99 Csd4 peptidase (Helicobacter pylori) MD M15 zinc D-Ala-D-Ala carboxypeptidase (Streptomyces albus) M74 murein endopeptidase (Escherichia coli) ME M16 pitrilysin (Escherichia coli) M44 pox virus metallopeptidase (Vaccinia virus) MF M17 leucine aminopeptidase 3 (Bos taurus) MG M24 methionyl aminopeptidase 1 (Escherichia coli) MH M18 aminopeptidase I (Saccharomyces cerevisiae) M20 glutamate carboxypeptidase (Pseudomonas sp.) M28 aminopeptidase S (Streptomyces griseus) M42 glutamyl aminopeptidase (Lactococcus lactis) MJ M19 membrane dipeptidase (Homo sapiens) M38 isoaspartyl dipeptidase (Escherichia coli) MM M50 site 2 peptidase (Homo sapiens) MN M55 D-aminopeptidase DppA (Bacillus subtilis) MO M23 beta-lytic metallopeptidase (Achromobacter lyticus) MP M67 RPN11 peptidase (Saccharomyces cerevisiae) MQ M29 aminopeptidase T (Thermus aquaticus) MS M75 imelysin (Pseudomonas aeruginosa) MT M81 microcystinase MlrC (Sphingomonas sp. ACM-3962) unassigned M73 camelysin (Bacillus cereus) M77 tryptophanyl aminopeptidase 7-DMATS-type peptidase (Aspergillus fumigatus) M79 RCE1 peptidase (Saccharomyces cerevisiae) M82 PrsW peptidase (Bacillus subtilis) M87 chloride channel accessory protein 1 (Homo sapiens) M88 IMPa peptidase (Pseudomonas aeruginosa) M96 Tiki1 peptidase (Homo sapiens)

141

Snake Venom/ADAMs Family MEROPS Enzyme PDB L1 X L2 Y L3 Z L4 L5 Number Bacteroides fragilis (entero)toxin-1 Profragilysin-3 3P24 Hisα 3 Hisα 5 His(C) – Asp M10.020 Crotalus adamanteus or Adamalysin II 1IAG Hisα 3 Hisα 5 His(C) – H2O M12.141 Crotalus atrox Atrolysin C (form-D) 1ATL Hisα 3 Hisα 5 His – H2O M12.144 Crotalus atrox vascular apoptosis-inducing protein 1 2ERO Hisα 3 Hisα 5 His – H2O M12.186 Crotalus atrox vascular apoptosis-inducing protein 2DWO Hisα 3 Hisα 5 His – H2O M12.332 2B Trimeresurus flavoviridis H2-proteinase 1WNI Hisα 3 Hisα 5 His – H2O M12.155 Trimeresurus mucrosquamatus TM-3 peptidase 1KUF Hisα 3 Hisα 5 His – H2O M12.242 Bothrops jararaca snake venom H2-proteinase 1C9G Hisα 3 Hisα 5 His – H2O M12.132 Bothrops jararaca snake venom endopeptidase 3DSL Hisα 3 Hisα 5 His – H2O M12.140 Agkistrodon acutus Acutolysin A (sim 1BSW Hisα 3 Hisα 5 His – H2O M12.131 ADAMTS-9) Agkistrodon acutus Acutolysin C 1QUA Hisα 3 Hisα 5 His – H2O Agkistrodon acutus Acutolysin F 1YP1 Hisα 3 Hisα 5 His – H2O M12.337 Bothrops asper pit viper (BaP1) 2W13 Hisα 3 Hisα 5 His – H2O M12.311 Bothrops moojeni pit viper 3GBO Hisα 3 Hisα 5 His – H2O M12.338 Russell's viper venom metalloproteinase (russellysin) 2E3X Hisα 3 Hisα 5 His – H2O M12.158 Human TNF-α-converting enzyme (ADAM 17) 1BKC Hisα 3 Hisα 5 His – H2O M12.217 Human ADAMTS4 peptidase 2RJP Hisα 3 Hisα 5 His – H2O M12.221 Human ADAMTS1 peptidase 2JIH Hisα 3 Hisα 5 His – H2O M12.222 Human ADAMTS5 peptidase (Aggrecanase-2) 3B8Z Hisα 3 Hisα 5 His – H2O M12.225 Mouse ADAM33 1R54 Hisα 3 Hisα 5 His – H2O M12.244

142

143

10 -1 -1 dmol

-2 5 deg cm

3 0 190 200 210 220 230 240 250 260 ]x10 ⊖ [ -5

-10 Comprimento de onda/ nm

Figura 69. Espectro de dicroismo circular (CD) da Lisozima (4 µmolL-1) em tampão Tris-HCl (25 mmol L-1 e pH 8).

144

Figura 70. Parâmetros do programa Sting.

145

76.1 Alinhamentoﬁ das proteínas

Align Sequence Profiles (Align123)

Information Name Align Sequence Profiles (Align123) Status Success User m151260 DS Version 4.0.0.13259 PP Version 9.1.0.13 DS Client Version 4.0.0.13259 Server Name lbcs011 (Linux64) Server Ports 9144 (9143) Start Time 11/11/14 14:38:25 Finish Time 11/11/14 14:38:37 Execution Time 00:00:12 Summary Sequence identity = 26.6% Sequence similarity = 47.3% Results Output Alignment View Results Parameters Protocol Settings Protocol.pr_xml Alignment Type Align Sequences to a Profile Input Sequence Cluster-1.bsml Alignment Input Sequence Set Cluster-1_2.bsml Use Secondary ss.Wht Structures Secondary Structure 1.0 Weight Advanced Pairwise Alignment Fast Pairwise Alignment BLOSUM 30 Scoring Matrix Pairwise Alignment Gap 10.0 Open Penalty Pairwise Alignment Gap 0.1 Extension Penalty Pairwise Alignment K- 1 Tuple Pairwise Alignment Gap 5.0 Penalty Pairwise Alignment Top 3 Diagonals Pairwise Alignment 5 Window Size Multiple Alignment Multiple Alignment BLOSUM Scoring Matrix Multiple Alignment Gap 10.0 Open Penalty Multiple Alignment Gap 0.05 Extension Penalty Delay Divergent 40.0 Special Gap Penalties Residue Specific True Penalties Hydrophilic Penalties True Hydrophilic Residues GPSNDQEKR Gap Separation Distance 8 Turn off End Gap False Separation Remove Existing Gaps True

ﬁl /M…ue oﬁl

146

Align Structures

Information Name Align Structures Status Success User m151260 DS Version 4.0.0.13259 PP Version 9.1.0.13 DS Client Version 4.0.0.13259 Server Name lbcs011 (Linux64) Server Ports 9144 (9143) Start Time 11/11/14 14:56:58 Finish Time 11/11/14 14:57:36 Execution Time 00:00:38 Summary Table showing Main-chain RMSD (angstrom) below the diagonal and Number of Overlapping Residues above the diagonal

Alignment Cluster 1 1ND1,1BSW,1QUA,3GBO,1IAG,1WNI Protein 1ND1 1BSW 1QUA 3GBO 1IAG 1WNI 1ND1 195 187 198 187 187 1BSW 1.0800 187 195 187 187 1QUA 0.83800 1.0080 187 189 195 3GBO 0.94200 1.0580 0.99100 187 187 1IAG 0.82100 1.0330 0.82700 0.88200 189 1WNI 0.73600 0.98200 0.68700 0.95700 0.74000

Results Sequence Alignment of cluster1 Superimposed Proteins of cluster 1 View Results Parameters Protocol Settings Protocol.pr_xml Input Protein Molecule.dsv Molecules C-Alpha Distance 2.5 Cutoff Length Cutoff 50 Bin Size 20 Fuzzy Bins False

ﬁl …sul

147

Align Structures

Information Name Align Structures Status Success User fabian DS Version 3.5.0.12158 PP Version 8.5.0.200 DS Client Version 3.5.0.12158 Server Name lbcs011 (Linux64) Server Ports 9944 (9943) Start Time 09/20/13 12:57:31 Finish Time 09/20/13 12:57:51 Execution Time 00:00:20 Summary Table showing Main-chain RMSD (angstrom) below the diagonal and Number of Overlapping Residues above the diagonal

Alignment Cluster 1 4AUO,3GBO Protein 4AUO 3GBO 4AUO 87 3GBO 1.9520

Results Sequence Alignment of cluster1 Superimposed Proteins of cluster 1 View Results Parameters Protocol Settings Protocol.pr_xml Input Protein 4AUO_solo_una_unidad.dsv Molecules RMSD Cutoff 2.5 Length Cutoff 50 Bin Size 20 Fuzzy Bins False

ﬁl …gi

148

Align Structures

Information Name Align Structures Status Success User fabian DS Version 3.5.0.12158 PP Version 8.5.0.200 DS Client Version 3.5.0.12158 Server Name lbcs011 (Linux64) Server Ports 9944 (9943) Start Time 09/20/13 12:54:12 Finish Time 09/20/13 12:54:35 Execution Time 00:00:23 Summary Table showing Main-chain RMSD (angstrom) below the diagonal and Number of Overlapping Residues above the diagonal

Alignment Cluster 1 4AUO,2W14 Protein 4AUO 2W14 4AUO 90 2W14 1.9720

6.27 Docking Proteína-proteína: ZDock

ﬁl /M…_Ba

149

Dock Proteins (ZDOCK)

Information Name Dock Proteins (ZDOCK) Status Success User fabian DS Version 4.0.0.13259 PP Version 9.1.0.13 DS Client Version 4.0.0.13259 Server Name lbcs011 (Linux64) Server Ports 9144 (9143) Start Time 11/13/13 15:49:40 Finish Time 11/14/13 08:54:00 Execution Time 17:04:20 Warnings ZDock Warning: there were 158 atoms of unknown type. Please check AtomTypeWarnings.txt for detailed list. ZRank Warning: there were 178 atoms/residues of unknown type. Please check AtomTypeWarnings.txt for detailed list. Summary Reporting 54000 docked poses in ZDockResults_all.dsv. Filtering : 54000 of 54000 poses passed filters. Clustering : Generated 100 Clusters. Largest Cluster contains 63 poses Reporting 2000 docked poses in ZDockResults.dsv. Results All Protein Poses All Protein Poses in Text (ZDock) Format Top Ranked Protein Poses Top Ranked Protein Poses in Text (ZDock) Format Unknown Atom/Residue Type Warnings View Results Parameters Protocol Settings Protocol.pr_xml Input Receptor 4AUO_solo_una_unidad.dsv Protein Input Ligand Protein 1ND1.dsv Angular Step Size 6 Receptor Blocked Residues Ligand Blocked Residues Filter Poses Receptor Binding Site Residues Ligand Binding Site Residues Distance Cutoff 10.0 ZRank True Top Poses 2000 Report Score False Components Clustering Top Poses 2000 RMSD Cutoff 10.0 Interface Cutoff 10.0 Maximum Number of 100 Clusters Parallel Processing False Advanced Use Electrostatic and False Desolvation Energy PreserveDisplayStyle True

ﬁl

150

Dock Proteins (ZDOCK)

Information Name Dock Proteins (ZDOCK) Status Success User fabian DS Version 4.0.0.13259 PP Version 9.1.0.13 DS Client Version 4.0.0.13259 Server Name lbcs011 (Linux64) Server Ports 9144 (9143) Start Time 11/11/13 14:00:21 Finish Time 11/12/13 05:51:07 Execution Time 15:50:46 Warnings ZDock Warning: there were 151 atoms of unknown type. Please check AtomTypeWarnings.txt for detailed list. ZRank Warning: there were 169 atoms/residues of unknown type. Please check AtomTypeWarnings.txt for detailed list. Summary Reporting 54000 docked poses in ZDockResults_all.dsv. Filtering : 54000 of 54000 poses passed filters. Clustering : Generated 100 Clusters. Largest Cluster contains 52 poses Reporting 2000 docked poses in ZDockResults.dsv. Results All Protein Poses All Protein Poses in Text (ZDock) Format Top Ranked Protein Poses Top Ranked Protein Poses in Text (ZDock) Format Unknown Atom/Residue Type Warnings View Results Parameters Protocol Settings Protocol.pr_xml Input Receptor 4AUO_solo_una_unidad.dsv Protein Input Ligand Protein 1BSW.dsv Angular Step Size 6 Receptor Blocked Residues Ligand Blocked Residues Filter Poses Receptor Binding Site Residues Ligand Binding Site Residues Distance Cutoff 10.0 ZRank True Top Poses 2000 Report Score False Components Clustering Top Poses 2000 RMSD Cutoff 10.0 Interface Cutoff 10.0 Maximum Number of 100 Clusters Parallel Processing False Advanced Use Electrostatic and False Desolvation Energy PreserveDisplayStyle True

ﬁl

151

Dock Proteins (ZDOCK)

Information Name Dock Proteins (ZDOCK) Status Success User fabian DS Version 4.0.0.13259 PP Version 9.1.0.13 DS Client Version 4.0.0.13259 Server Name lbcs011 (Linux64) Server Ports 9144 (9143) Start Time 11/14/13 16:50:27 Finish Time 11/15/13 10:24:21 Execution Time 17:33:54 Warnings ZDock Warning: there were 150 atoms of unknown type. Please check AtomTypeWarnings.txt for detailed list. ZRank Warning: there were 168 atoms/residues of unknown type. Please check AtomTypeWarnings.txt for detailed list. Summary Reporting 54000 docked poses in ZDockResults_all.dsv. Filtering : 54000 of 54000 poses passed filters. Clustering : Generated 100 Clusters. Largest Cluster contains 70 poses Reporting 2000 docked poses in ZDockResults.dsv. Results All Protein Poses All Protein Poses in Text (ZDock) Format Top Ranked Protein Poses Top Ranked Protein Poses in Text (ZDock) Format Unknown Atom/Residue Type Warnings View Results Parameters Protocol Settings Protocol.pr_xml Input Receptor 4AUO_solo_una_unidad.dsv Protein Input Ligand Protein 1QUA.dsv Angular Step Size 6 Receptor Blocked Residues Ligand Blocked Residues Filter Poses Receptor Binding Site Residues Ligand Binding Site Residues Distance Cutoff 10.0 ZRank True Top Poses 2000 Report Score False Components Clustering Top Poses 2000 RMSD Cutoff 10.0 Interface Cutoff 10.0 Maximum Number of 100 Clusters Parallel Processing False Advanced Use Electrostatic and False Desolvation Energy PreserveDisplayStyle True

ﬁl

152

Dock Proteins (ZDOCK)

Information Name Dock Proteins (ZDOCK) Status Success User fabian DS Version 4.0.0.13259 PP Version 9.1.0.13 DS Client Version 4.0.0.13259 Server Name lbcs011 (Linux64) Server Ports 9144 (9143) Start Time 11/14/13 16:50:12 Finish Time 11/15/13 10:54:31 Execution Time 18:04:19 Warnings ZDock Warning: there were 151 atoms of unknown type. Please check AtomTypeWarnings.txt for detailed list. ZRank Warning: there were 1319 atoms/residues of unknown type. Please check AtomTypeWarnings.txt for detailed list. Summary Reporting 54000 docked poses in ZDockResults_all.dsv. Filtering : 54000 of 54000 poses passed filters. Clustering : Generated 100 Clusters. Largest Cluster contains 54 poses Reporting 2000 docked poses in ZDockResults.dsv. Results All Protein Poses All Protein Poses in Text (ZDock) Format Top Ranked Protein Poses Top Ranked Protein Poses in Text (ZDock) Format Unknown Atom/Residue Type Warnings View Results Parameters Protocol Settings Protocol.pr_xml Input Receptor 4AUO_solo_una_unidad.dsv Protein Input Ligand Protein 3GBO.dsv Angular Step Size 6 Receptor Blocked Residues Ligand Blocked Residues Filter Poses Receptor Binding Site Residues Ligand Binding Site Residues Distance Cutoff 10.0 ZRank True Top Poses 2000 Report Score False Components Clustering Top Poses 2000 RMSD Cutoff 10.0 Interface Cutoff 10.0 Maximum Number of 100 Clusters Parallel Processing False Advanced Use Electrostatic and False Desolvation Energy PreserveDisplayStyle True

ﬁl

153

Dock Proteins (ZDOCK)

Information Name Dock Proteins (ZDOCK) Status Success User fabian DS Version 4.0.0.13259 PP Version 9.1.0.13 DS Client Version 4.0.0.13259 Server Name lbcs011 (Linux64) Server Ports 9144 (9143) Start Time 11/12/13 14:39:52 Finish Time 11/13/13 07:50:13 Execution Time 17:10:21 Warnings ZDock Warning: there were 150 atoms of unknown type. Please check AtomTypeWarnings.txt for detailed list. ZRank Warning: there were 168 atoms/residues of unknown type. Please check AtomTypeWarnings.txt for detailed list. Summary Reporting 54000 docked poses in ZDockResults_all.dsv. Filtering : 54000 of 54000 poses passed filters. Clustering : Generated 100 Clusters. Largest Cluster contains 57 poses Reporting 2000 docked poses in ZDockResults.dsv. Results All Protein Poses All Protein Poses in Text (ZDock) Format Top Ranked Protein Poses Top Ranked Protein Poses in Text (ZDock) Format Unknown Atom/Residue Type Warnings View Results Parameters Protocol Settings Protocol.pr_xml Input Receptor 4AUO_solo_una_unidad.dsv Protein Input Ligand Protein 1IAG.dsv Angular Step Size 6 Receptor Blocked Residues Ligand Blocked Residues Filter Poses Receptor Binding Site Residues Ligand Binding Site Residues Distance Cutoff 10.0 ZRank True Top Poses 2000 Report Score False Components Clustering Top Poses 2000 RMSD Cutoff 10.0 Interface Cutoff 10.0 Maximum Number of 100 Clusters Parallel Processing False Advanced Use Electrostatic and False Desolvation Energy PreserveDisplayStyle True

ﬁl

154

Dock Proteins (ZDOCK)

Information Name Dock Proteins (ZDOCK) Status Success User fabian DS Version 4.0.0.13259 PP Version 9.1.0.13 DS Client Version 4.0.0.13259 Server Name lbcs011 (Linux64) Server Ports 9144 (9143) Start Time 11/08/13 12:40:37 Finish Time 11/09/13 06:50:03 Execution Time 18:09:26 Warnings ZDock Warning: there were 150 atoms of unknown type. Please check AtomTypeWarnings.txt for detailed list. ZRank Warning: there were 168 atoms/residues of unknown type. Please check AtomTypeWarnings.txt for detailed list. Summary Reporting 54000 docked poses in ZDockResults_all.dsv. Filtering : 54000 of 54000 poses passed filters. Clustering : Generated 100 Clusters. Largest Cluster contains 58 poses Reporting 2000 docked poses in ZDockResults.dsv. Results All Protein Poses All Protein Poses in Text (ZDock) Format Top Ranked Protein Poses Top Ranked Protein Poses in Text (ZDock) Format Unknown Atom/Residue Type Warnings View Results Parameters Protocol Settings Protocol.pr_xml Input Receptor 4AUO_solo_una_unidad.dsv Protein Input Ligand Protein 1WNI.dsv Angular Step Size 6 Receptor Blocked Residues Ligand Blocked Residues Filter Poses Receptor Binding Site Residues Ligand Binding Site Residues Distance Cutoff 10.0 ZRank True Top Poses 2000 Report Score False Components Clustering Top Poses 2000 RMSD Cutoff 10.0 Interface Cutoff 10.0 Maximum Number of 100 Clusters Parallel Processing False Advanced Use Electrostatic and False Desolvation Energy PreserveDisplayStyle True

ﬁl

155

6.37 Determinação de parâmetros para classificar as metaloproteases hemorrágica e não hemorrágicas

Lê as planilhas contendo os descritores STING para os resíduos. Normalizam- se os dados, isto é, transformação para distribuição normal com media zero e variância 1. A normalização é necessária, pois os parâmetros possuem escalas muito diferentes, algo que pode influenciar negativamente na análise. require(gdata)

## Loading required package: gdata ## gdata: read.xls support for 'XLS' (Excel 97- 2004) files ENABLED. ## ## gdata: read.xls support for 'XLSX' (Excel 2007+) files ENABLED. ## ## Attaching package: 'gdata' ## ## The following object is masked from 'package:stats': ## ## nobs ## ## The following object is masked from 'package:utils': ## ## object.size require(FSelector)

## Loading required package: FSelector require(caret)

## Loading required package: caret ## Loading required package: lattice ## Loading required package: ggplot2 require(randomForest)

## Loading required package: randomForest ## randomForest 4.6-7 ## Type rfNews() to see new features/changes/bug fixes. ## ## Attaching package: 'randomForest' ## ## The following object is masked from 'package:gdata': ## ## combine require(pROC)

## Loading required package: pROC ## Type 'citation("pROC")' for a citation. ## ## Attaching package: 'pROC' ## ## The following objects are masked from 'package:stats': ## ## cov, smooth, var

Avaliação dos parâmetros por dois métodos para seleção de parâmetros: CFS (Correlation Feature Selection) e Chi Square. O primeiro determina um subconjunto de parâmetros que possuem alta correlação com a classe (neste caso, Hemorrágica e Não Hemorrágica), mas que não sejam correlacionados

156

entre si. Já o Chi Square determina a correlação de cada parâmetro com a classe.

Loop CFS loopData = preProcessData(read.xls("StingParametersLoop.xlsx")) pocketData = preProcessData(read.xls("StingParametersPocket.xlsx")) cfs(Type ~ ., loopData)

## [1]"X3DEntropyCA.Sliding.Window..Window.7.Radius.5." ## [2]"X3DEntropyCA.Sliding.Window..Window.9.Radius.6."## [3]"X3DEntropyLHAsw.3.4." ## [4]"X3DEntropyLHAsw.3.5."

## [5]"X3DEntropyLHAsw.5.5." ## [6]"ContactsEnergyAllsw.true.5."## [7]"ContactsEnergyAllsw.false.5."## [8]"DensityCAsw.9.4." ## [9]"DensityLHAsw.9.3." ## [10] "DistanceC.." ## [11] "EnergyDensityIntra.4." ## [12] "EnergyDensityLHAsw.5.5." ## [13] "EnergyDensityLHAsw.7.5." ## [14] "Temperature.Factor.Max"

Chi Square cs = chi.squared(Type ~ ., loopData) cs.order = order(cs$attr_importance, decreasing = T)[1:15] cs.data = cbind(colnames(loopData)[cs.order], cs$attr_importance[cs.order]) colnames(cs.data) = c("Parâmetro", "Correlação") cs.data preProcessData<- function(dataSet) { # Remove columns with constant values data <- dataSet[, sapply(dataSet, function(v) var(v, na.rm = TRUE)

!= 0)] # Remove non-numeric columns data$hotspots <- NULL data$htsp <- NULL data<- cbind(data[, 1], as.data.frame(scale(data[, -(1:6)]))) colnames(data)[1] = "Type" data

}

Correlação

Random Forest (http://en.wikipedia.org/wiki/Random_forest)

trainRadomForest<- function(dataSet) { fitControl <- trainControl(method =

157

"repeatedcv", number = 2, repeats = 5, classProbs = TRUE, summaryFunction = twoClassSummary) grid<- expand.grid(mtry = c(5, 10, 15, 20, 40, 60, 100)) train(Type ~ ., dataSet, method = "rf", tuneGrid = grid, trControl = fitControl,

} metric = "ROC")

Foram criados classificadores para tentar discriminar entre hemorrágicas e não hemorrágicas. Para avaliar os modelos foi utilizada a 5x2 cross-validation

## Parâmetro Correlação ## [1,]"ContactsEnergyAllsw.false.3.""0.561026790199928" ## [2,]"ContactsEnergyAllsw.true.3." "0.541537086987589"

## [3,] "EnergyDensityLHAsw.3.6." ## [4,] "EnergyDensityLHAsw.7.4." ## [5,] "DensityCAsw.9.3." ## [6,] "DensityCAsw.7.3."

## [7,] "DensityCAsw.9.4." ## [8,] "EnergyDensityLHAsw.7.5." ## [9,] "DiffReliability.." ## [10,] "X3DEntropyLHAsw.7.4." ## [11,] "X3DEntropyLHAsw.5.4." ## [12,] "EnergyDensityCAsw.9.3." ## [13,] "X3DEntropyLHAsw.3.4." ## [14,] "DensityLHAsw.7.6." ## [15,] "X3DEntropyLHAsw.3.3."

"0.531889503730476" "0.455355659210421" "0.42911587693227" "0.414704601729235" "0.403913115084691" "0.401802248094843" "0.392773041328356" "0.385385071461893" "0.377323311439848" "0.377323311439848" "0.371799943877197" "0.366440597484222" "0.362719862900801"

Loop

rf.modelLoop

## Random Forest ##

## 115 samples

## 188 predictors

## 2classes:'Hemorrhagic','NotHemorrhagic' ##

158

## No pre-processing

## Resampling: Cross-Validated (2 fold, repeated 5 times) ##

## Summary of sample sizes: 57, 58, 57, 58, 57, 58, ... ##

## Resampling results across tuning parameters: ##

## mtry ROC Sens Spec ROCSD SensSD SpecSD

## 5 0.8 0.8 0.7 0.04 0.1 0.09

## 10 0.9 0.8 0.8 0.03 0.09 0.09

## 20 0.9 0.8 0.8 0.03 0.1 0.07

## 20 0.9 0.8 0.8 0.03 0.1 0.08

## 40 0.9 0.8 0.8 0.03 0.08 0.06

## 60 0.9 0.8 0.8 0.03 0.1 0.09

## 100 0.9 0.8 0.8 0.03 0.08 0.07 ## ##ROCwasusedtoselecttheoptimalmodelusing thelargestvalue. ## The final value used for the model was mtry = 100.

Parâmetros mais importantes para o modelo de classificação: colnames(loopData)[order(rf.modelLoop$finalModel$importance, decreasing = T)[1:10]]

## [1]"DensityCAsw.9.3." ## [2]"EnergyDensityLHAsw.7.4." ## [3]"DiffReliability.." ## [4]"EPlha.." ## [5]"DensityCAsw.7.3." ## [6]"X3DEntropyLHAsw.3.3." ## [7]"X3DEntropyCA.Sliding.Window..Window.7.Radius.4."## [8]"MyReliability.." ## [9]"DensityCAsw.9.4." ## [10] "X3DEntropyLHAsw.3.4."

## Random Forest ##

## 84samples

## 188 predictors

## 2classes:'Hemorrhagic','NotHemorrhagic' ##

## No pre-processing

159

## Resampling: Cross-Validated (2 fold, repeated 5 times) ##

## Summary of sample sizes: 42, 42, 42, 42, 42, 42, ... ##

## Resampling results across tuning parameters: ##

## mtry ROC Sens Spec ROCSD SensSD SpecSD

## 5 0.5 0.2 0.8 0.04 0.07 0.1

## 10 0.5 0.2 0.8 0.02 0.08 0.1

## 20 0.5 0.2 0.8 0.03 0.07 0.1

## 20 0.5 0.2 0.8 0.03 0.09 0.09

## 40 0.5 0.2 0.8 0.04 0.1 0.1

## 60 0.6 0.3 0.8 0.05 0.1 0.09

## 100 0.6 0.3 0.8 0.07 0.1 0.09 ## ##ROCwasusedtoselecttheoptimalmodelusing thelargestvalue. ## The final value used for the model was mtry = 100.

160

6.47 Docking:Proteina-inibidor

Prepare Protein

Information Name Prepare Protein Status Success User fabian DS Version 3.5.0.12158 PP Version 8.5.0.200 DS Client Version 3.5.0.12158 Server Name lbcs011 (Linux64) Server Ports 9944 (9943) Start Time 10/29/13 14:55:06 Finish Time 10/29/13 14:55:59 Execution Time 00:00:53 Summary No missing segments found from SEQRES data. (Missing segments containing non-standard residues or more than 20 residues, and missing residues at N and C termini are ignored) Details Alternate Conformations No alternate conformations found in this structure. Standardize Names 2 name(s) standardized Standardized name of atom A:PRO202:OCT2 Standardized name of atom A:PRO202:OCT1 Complete Residues No incomplete residues found Bonding and bond orders Bonds and bond orders have been checked and corrected if necessary Terminus modification 2 terminal residue(s) adjusted Atom ordering Reordered atoms in 202 residue(s) A:PCA1 A:ARG2 A:PHE3 A:SER4 A:PRO5 A:ARG6 A:TYR7 A:ILE8 A:GLU9 A:LEU10 A:ALA11 A:VAL12 A:VAL13 A:ALA14 A:ASP15 A:HIS16 A:GLY17 A:ILE18 A:PHE19 A:THR20 A:LYS21 A:TYR22 A:ASN23 A:SER24 A:ASN25 A:LEU26 A:ASN27 A:THR28 A:ILE29 A:ARG30 A:THR31 A:ARG32 A:VAL33 A:HIS34 A:GLU35 A:MET36 A:LEU37 A:ASN38 A:THR39 A:VAL40 A:ASN41 A:GLY42 A:PHE43 A:TYR44 A:ARG45 A:SER46 A:VAL47 A:ASP48 A:VAL49 A:HIS50 A:ALA51 A:PRO52 A:LEU53 A:ALA54 A:ASN55 A:LEU56 A:GLU57 A:VAL58 A:TRP59 A:SER60 A:LYS61 A:GLN62 A:ASP63 A:LEU64 A:ILE65 A:LYS66 A:VAL67 A:GLN68 A:LYS69 A:ASP70 A:SER71 A:SER72 A:LYS73 A:THR74 A:LEU75 A:LYS76 A:SER77 A:PHE78 A:GLY79 A:GLU80 A:TRP81 A:ARG82 A:GLU83 A:ARG84 A:ASP85 A:LEU86 A:LEU87 A:PRO88 A:ARG89 A:ILE90 A:SER91 A:HIS92 A:ASP93 A:HIS94 A:ALA95 A:GLN96 A:LEU97 A:LEU98 A:THR99 A:ALA100 A:VAL101 A:VAL102 A:PHE103 A:ASP104 A:GLY105 A:ASN106 A:THR107 A:ILE108 A:GLY109 A:ARG110 A:ALA111 A:TYR112 A:THR113 A:GLY114 A:GLY115 A:MET116 A:CYS117 A:ASP118 A:PRO119 A:ARG120 A:HIS121 A:SER122 A:VAL123 A:GLY124 A:VAL125 A:VAL126 A:ARG127 A:ASP128 A:HIS129 A:SER130 A:LYS131 A:ASN132 A:ASN133 A:LEU134 A:TRP135 A:VAL136 A:ALA137 A:VAL138 A:THR139 A:MET140 A:ALA141 A:HIS142 A:GLU143 A:LEU144 A:GLY145 A:HIS146 A:ASN147 A:LEU148 A:GLY149 A:ILE150 A:HIS151 A:HIS152 A:ASP153 A:THR154 A:GLY155 A:SER156 A:CYS157 A:SER158 A:CYS159 A:GLY160 A:ALA161 A:LYS162 A:SER163 A:CYS164 A:ILE165 A:MET166 A:ALA167 A:SER168 A:VAL169 A:LEU170 A:SER171 A:LYS172 A:VAL173 A:LEU174 A:SER175 A:TYR176 A:GLU177 A:PHE178 A:SER179 A:ASP180 A:CYS181 A:SER182 A:GLN183 A:ASN184 A:GLN185 A:TYR186 A:GLU187 A:THR188 A:TYR189 A:LEU190 A:THR191 A:ASN192 A:HIS193 A:ASN194 A:PRO195 A:GLN196 A:CYS197 A:ILE198 A:LEU199 A:ASN200 A:LYS201 A:PRO202 Results CHARMM Log File Predicted pK Values Prepared Protein Structure Titration Curves View Results Parameters Protocol Settings Protocol.pr_xml Input Protein 2W14.dsv Build Loops True Loop Definition SEQRES Loop List Maximal Loop Length 20 Use Looper False Use Looper Maximal 12 Loop Length Use CHARMm True Minimization Flexible Stem Residues 0 Protonate True Protein Dielectric 10 Constant pH for Protonation 7.4 Ionic Strength 0.145 Energy Cutoff 0.9 Advanced Forcefield CHARMm Keep Ligands True Keep Water None Disulfide Bridges

ﬁl

161

Receptor-Ligand Pharmacophore Generation

Information Name Receptor-Ligand Pharmacophore Generation Status Success User fabian DS Version 3.5.0.12158 PP Version 8.5.0.200 DS Client Version 3.5.0.12158 Server Name lbcs011 (Linux64) Server Ports 9944 (9943) Start Time 08/28/13 11:56:51 Finish Time 08/28/13 11:57:43 Execution Time 00:00:52 Summary Found 26 features in ligand: WR21204 9 features match the receptor-ligand interactions: AADDDDHHH 10 pharmacophores generated.

Pharmacophore Summary Pharmacophore Number of Feature Set Selectivity Score Features Pharmacophore_01 6 ADDDDH 13.256 Pharmacophore_02 6 ADDDDH 13.256 Pharmacophore_03 6 ADDDDH 13.256 Pharmacophore_04 6 AADDDD 13.256 Pharmacophore_05 6 ADDDDH 13.256 Pharmacophore_06 6 DDDDHH 13.256 Pharmacophore_07 6 AADDDH 12.343 Pharmacophore_08 6 AADDDH 12.343 Pharmacophore_09 6 ADDDHH 12.343 Pharmacophore_10 6 AADDDH 12.343 Details Results All Matching Features Ligand Binding to the Receptor Pharmacophore_01 Pharmacophore_02 Pharmacophore_03 Pharmacophore_04 Pharmacophore_05 Pharmacophore_06 Pharmacophore_07 Pharmacophore_08 Pharmacophore_09 Pharmacophore_10 Selectivity Score View Results Parameters Protocol Settings Protocol.pr_xml Input Receptor 2W14.dsv Input Ligand WR21204.dsv Maximum 10 Pharmacophores Minimum Features 4 Maximum Features 6 Keep Water Molecules False Validation False Advanced Add Shape Constraint False Minimum Shape 0.5 Similarity

ﬁl nts…a

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Figura 71. Cluster dos modelos de farmacóforo

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Figura 72. Características dos aceptores de ligações de hidrogênio do farmacóforo gerado manualmente da metaloproteases BaP1,com código PDB: 2W14.

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Feature Mapping

Information Name Feature Mapping Status Success User fabian DS Version 3.5.0.12158 PP Version 8.5.0.200 DS Client Version 3.5.0.12158 Server Name lbcs011 (Linux64) Server Ports 9944 (9943) Start Time 08/28/13 12:16:16 Finish Time 08/28/13 12:16:25 Execution Time 00:00:09 Summary Found 26 features in ligand: Proteina_2W14 Details HB_ACCEPTOR: 14 HB_DONOR: 6 HYDROPHOBIC: 4 RING_AROMATIC: 2 Results Pharmacophore Features View Results Parameters Protocol Settings Protocol.pr_xml Input Ligands Proteina_2W14.sd Features HB_ACCEPTOR HB_DONOR HYDROPHOBIC POS_IONIZABLE NEG_IONIZABLE NEG_CHARGE RING_AROMATIC ZN_BINDER Advanced Map Each Conformation False Separately Catalyst Parameter File Tempfiles

ﬁl /M…e

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Screen Library 1/5/16, 21:59

Screen Library

Information Name Screen Library Status Success User fabian DS Version 4.0.0.13259 PP Version 9.1.0.13 DS Client Version 4.0.0.13259 Server Name lbcs011 (Linux64) Server Ports 9144 (9143) Start Time 11/07/13 13:19:56 Finish Time 11/07/13 13:20:48 Execution Time 00:00:52 Summary 6 out of 47 molecules mapped to pharmacophore 2w14_with_Zn_feature Details Mapping with 2w14_with_Zn_feature.chm WR21204 : Best Fit = 4.68005 Batimastat : Best Fit = 3.88276 1kim : Best Fit = 1.48969 1e2m : Best Fit = 1.16773 1ki7 : Best Fit = 0.954051 1ki6 : Best Fit = 0.852593 1e2k : No map found 1e2n : No map found 1ki2 : No map found 1ki3 : No map found 2ki5 : No map found Results 4 Feature All Hits 4 Feature Best Hits 5 Feature All Hits 5 Feature Best Hits All Fit Results Best Fit Results View All Results View Best Results Parameters Protocol Settings Protocol.pr_xml Input Pharmacophore 2w14_with_Zn_feature.chm Input Ligands kinasa_mmp-(1).sd Minimum Features 4 Maximum Features 5 Maximum Subset of 100 Pharmacophores Advanced Input Type Ligands Input Database Sample Input Database Limit Hits First N Input Database Maximum 300 Input Database Hitlist Fitting Method Rigid Minimum Interfeature 0.5 Distance Map Each Conformation False Separately Maximum Mappings 100 Total Number of Features 0 Number of Possible 0 Pharmacophores Specify Energy False Threshold Mapped Energy 20.0 Threshold Output Non-Fitting False Ligands Output Pharmacophore 0 Files Catalyst Parameter File Sort Fit Values True Parallel Processing False

ﬁle:///Users/fvillalta/Doc uments/Doctorado/Embrapa/EMBRAPA/Maquina% 2…0Client/Results/ScreenLibrary_2013_11_07_131544_038/Outp ut/Report.htm Page 1 of 1

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Figura 73.61. Biblioteca de inibidores de quinases e o ligante co-cristalizado Batimastat, utilizados no análise de ROC (Receiver Operating Characteristic) para avalidar o modelo de farmacóforo.

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oﬁler

Ligand Profiler

Information Name Ligand Profiler Status Success User fabian DS Version 3.5.0.12158 PP Version 8.5.0.200 DS Client Version 3.5.0.12158 Server Name lbcs011 (Linux64) Server Ports 9944 (9943) Start Time 09/23/13 12:46:31 Finish Time 09/23/13 12:56:20 Execution Time 00:09:49 Summary 11 pharmacophores mapped to one or more ligands. Details Profiled 19 uniquely named molecules with 12 pharmacophores. 2 molecules mapped to pharmacophore 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-Feature_mapping_ZBG 2 molecules mapped to pharmacophore 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-WR21204_01 2 molecules mapped to pharmacophore 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-WR21204_02 2 molecules mapped to pharmacophore 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-WR21204_03 5 molecules mapped to pharmacophore 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-WR21204_04 2 molecules mapped to pharmacophore 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-WR21204_05 2 molecules mapped to pharmacophore 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-WR21204_06 2 molecules mapped to pharmacophore 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-WR21204_07 3 molecules mapped to pharmacophore 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-WR21204_08 1 molecule mapped to pharmacophore 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-WR21204_09 4 molecules mapped to pharmacophore 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-WR21204_10 Results 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-Feature_mapping_ZBG.chm 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-Feature_mapping_ZBG.sd 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-Feature_mapping_ZBG_view.pl 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-WR21204_01.chm 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-WR21204_01.sd 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-WR21204_01_view.pl 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-WR21204_02.chm 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-WR21204_02.sd 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-WR21204_02_view.pl 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-WR21204_03.chm 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-WR21204_03.sd 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-WR21204_03_view.pl 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-WR21204_04.chm 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-WR21204_04.sd 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-WR21204_04_view.pl 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-WR21204_05.chm 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-WR21204_05.sd 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-WR21204_05_view.pl 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-WR21204_06.chm 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-WR21204_06.sd 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-WR21204_06_view.pl 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-WR21204_07.chm 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-WR21204_07.sd 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-WR21204_07_view.pl 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-WR21204_08.chm 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-WR21204_08.sd 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-WR21204_08_view.pl 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-WR21204_09.chm 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-WR21204_09.sd 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-WR21204_09_view.pl 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-WR21204_10.chm 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-WR21204_10.sd 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG-WR21204_10_view.pl Fits Organized by Molecule Fits Organized by Pharmacophore Generated Conformations Profiling Results View Results Parameters

ﬁl …e oﬁl

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oﬁler

Protocol Settings Protocol.pr_xml Input Ligands thrombin_ligands.sd Input File 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG- PharmacophoresWR21204_01.chm 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG- WR21204_02.chm 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG- WR21204_03.chm 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG- WR21204_04.chm 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG- WR21204_05.chm 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG- WR21204_06.chm 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG- WR21204_07.chm 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG- WR21204_08.chm 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG- WR21204_09.chm 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG- WR21204_10.chm 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG- Feature_mapping.chm 2w14_pharmacophore_automatically_10_solutions_feature_mapping_ZBG- Feature_mapping_ZBG.chm Input LigandProfilerDB Pharmacophores Input HypoDB Pharmacophores Input PharmaDB Pharmacophores Model Selection Most Selective Conformation BEST Generation Maximum Conformations 200 Discard Existing True Conformations Energy Threshold 10 Ring Fragments File Save Conformations True Advanced Input Type Ligands Input Database Sample Input Database Limit Hits First N Input Database Maximum 300 Input Database Hitlist Fitting Method Rigid Maximum Omitted 0 Features Minimum Interfeature 0.5 Distance Scale Fit Values False Prune Empty Fits True Prune Missed Molecules True Keep Input False Conformations Save Aligned Ligands True Activity Property Catalyst Parameter File Parallel Processing False

ﬁl …e oﬁl

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Figura 74. Curva ROC do modelo de farmacoforo.

Name Calculate ROC Curve Status Success User fabian DS Version 4.0.0.13259 PP Version 9.1.0.13 DS Client Version 4.0.0.13259 Server Name lbcs011 (Linux64) Server Ports 9144 (9143) Start Time 11/07/13 13:31:41 Finish Time 11/07/13 13:31:43

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Figura 75. Gráficodo mapa de calor para interação dos ligantes com os modelos de farmacóforos.

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Figura 76. Cromatograma da fracionamento do veneno bruto da Bothrops asper com a coluna de CM-Sephadex

Figura 77. Cromatograma da purificação da BaP1 com a coluna Affi Gel Blue.

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Figura 78. Purificação da fração da PIII pos DEAE 2P3 em uma coluna MonoQ acoplada em um FPLC, usando um tampão de Tris 20mM, pH7,0 e eluí-se com um gradiente de NaCl 0-1,0 mol L-1

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Universidad de Costa Rica - Instituto Clodomiro Picado División Académica / Laboratorio de Proteómica Servicios de Análisis Proteómicos - Informe de Resultados N°. solicitud: 359 Usuario: Fabian Villalta Fecha: 2015.07.03 Correo: serpientes Analista: Bruno Lomonte

Muestra Tipo ID Run m/zz N Péptidos Modificaciones Conf Sco %co Identificación por similitud con: Código

1 C.simus.Fx.2P3 gel 3663 p23:381,383 2280.2 1 1, 2 YMYIHVALVGLEIWSNEDK 99 22 14.9 (1) SVMP-CohPH-3 Crotalus o. helleri ~T1E6U1 1722.9 1 1, 2 KHDNAQLLTAIDLDR 99 10 11.7 (2) SVMP Crotalus d durissus ~Q2QA02 1851.0 1 1, 2 KKHDNAQLLTAIDLDR 99 15 1601.8 1 1 MYELANTVNDIYR 99 15 2052.1 1 2 ITVKPEAGYTLNAFGEWR 99 17 1160.7 1 1, 2 FVELVLVVDK 99 14 1052.4 1 1, 2 GNYYGYCR 82.4 7