UNIVERSITE D’ANTANANARIVO

FACULTE DES SCIENCES

DEPARTEMENT DE BIOLOGIE ET ECOLOGIE VEGETALES

MEMOIRE POUR L’OBTENTION DU DIPLOME D’ETUDES APPROFONDIES (D.E.A) BIOLOGIE ET ECOLOGIE VEGETALES Option : PHYSIOLOGIE VEGETALE

ETUDE DE LA MATURATION DES FRUITS DE «VOARAMONTSINA »

(Vaccinium emirnense -ERICACEAE): VARIATION S DES ACTIVITES

ANTIOXYDANTE ET HYPOGLYCEMIANTE

Présenté par: Mioralalaina Rovasoa RARINIRINA (Maître ès Sciences)

Soutenu publiquement le 27 Octobre 2010

Devant la commission d’examen composée de :

Président : Professeur Isabelle RATSIMIALA RAMONTA Rapporteur : Docteur Aro Vonjy RAMAROSANDRATANA Examinateurs : Docteur Eliane RALAMBOFETRA

: Docteur David RAMANITRAHASIMBOLA UNIVERSITE D’ANTANANARIVO

FACULTE DES SCIENCES

DEPARTEMENT DE BIOLOGIE ET ECOLOGIE VEGETALES

MEMOIRE POUR L’OBTENTION DU DIPLOME D’ETUDES APPROFONDIES (D.E.A) BIOLOGIE ET ECOLOGIE VEGETALES Option : PHYSIOLOGIE VEGETALE

ETUDE DE LA MATURATION DES FRUITS DE «VOARAMONTSINA» (Vaccinium emirnense-ERICACEAE): VARIATIONS DES ACTIVITES

ANTIOXYDANTE ET HYPOGLYCEMIANTE

Présenté par : Mioralalaina Rovasoa RARINIRINA (Maître ès Sciences)

Soutenu publiquement le 27 Octobre 2010 Devant la commission d’examen composée de :

Président : Professeur Isabelle RATSIMIALA RAMONTA Rapporteur : Docteur Aro Vonjy RAMAROSANDRATANA Examinateurs : Docteur Eliane RALAMBOFETRA : Docteur David RAMANITRAHASIMBOLA

Photo de couverture : Fruit de Vaccinium emirnense (Cliché de l’auteur) REMERCIEMENTS

Le présent travail est le fruit de la collaboration entre le Département de Biologie et Ecologie Végétales de l’Université d’Antananarivo et l’Institut Malgache de Recherches Appliquées (IMRA). Qu’il m’est permis d’exprimer ici mes reconnaissances et ma gratitude à tous ce qui ont rendu ce travail possible.

Mes remerciements les plus sincères s’adressent aux membres de Jury :

℘ Madame Isabelle RATSIMIALA RAMONTA, Professeur, Responsable de la formation du troisième cycle, option Physiologie Végétale, qui a bien voulu me faire l’insigne d’honneur de présider ce mémoire malgré ses multiples engagements. Qu’elle trouve ici l’expression de ma haute considération.

℘ Monsieur Aro Vonjy RAMAROSANDRATANA, Maître de Conférences à la Faculté des Sciences, mon encadreur, qui m’a proposé ce sujet et m’a guidé minutieusement tout au long de ce travail en dépit de ses énormes responsabilités. Ses critiques et ses précieux conseils, ont été fort utiles. Qu’il veuille recevoir mes plus vifs remerciements et ma profonde reconnaissance.

℘ Madame Eliane RALAMBOFETRA, Maître de Conférences à la Faculté des Sciences, qui a porté un grand intérêt à ce travail et a accepté de siéger parmi les membres du jury en tant qu’examinateur. Ses recommandations ont été très indispensables pour l’amélioration de ce travail. Qu’elle trouve ici le témoignage de ma gratitude.

℘ Monsieur David RAMANITRAHASIMBOLA, Maître de Conférences à la Faculté de Médecine, qui a accepté d’examiner ce travail afin d’optimiser sa qualité et sa valeur. Il m’a également transmis ses connaissances et m’a accordé des appuis techniques au cours de l’élaboration de ce travail. Sa présence parmi les membres de jury m’honore.

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Je tiens aussi à exprimer mes vifs remerciements à tous ceux qui m’ont aidé à l’accomplissement de ce travail :

℘ Au Professeur Suzanne URVERG-RATSIMAMANGA, Président de l’IMRA qui m’a permis d’effectuer mes travaux de recherche au sein de son institut et pour son soutien financier dans le cadre de cette œuvre.

℘ Au Docteur Voahangy RAMANANDRAIBE, Enseignant chercheur du Département de Chimie organique de la Faculté des Sciences, qui n’a ménagé ni son temps ni son expérience pour m’encadrer dans la partie chimie. Qu’elle veuille trouver ici l’expression de ma profonde gratitude.

℘ A l’équipe de l’Unité de Recherche sur la Récolte et les Traitements Post-Récoltes (RTPR) de l’IMRA qui a su prouver la solidarité et la collaboration. Un grand merci particulier à ANTSONANTENAINARIVONY Goum pour tous les services qu’il m’a rendu durant tous les travaux de terrain, qu’il soit assuré de mon énorme reconnaissance.

℘ Aux personnels des laboratoires de Chimie marine et de Phytochimie (IMRA), de Physiologie Végétale et de Biochimie de la Faculté des Sciences, qui m’ont aidée dans la réalisation de mes travaux.

℘ Tous les enseignants au sein de la Faculté des Sciences pour leurs supports pédagogiques durant mon cursus universitaire.

℘ Aux habitants d’Andandemy-Manjakandriana, particulièrement à la famille Jean- Pierre, qui nous ont toujours accueillis chaleureusement. Merci à notre guide, Mr. Théo, qui nous a constamment accompagnés avec enthousiasme sur terrain.

℘ A mes parents, pour leur grand amour et leurs appuis inconditionnels ; à mes frères et belles-sœurs qui m’ont tout donné sans rien en retour, à Karl pour son amour et son soutien malgré la distance, et à tous mes amis qui m’ont soutenu dans les moments difficiles.

« Merci à vous tous qui m’avez aidé inlassablement à la réalisation de ce travail, je vous remercie du fond du cœur. »

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LISTE DES ABREVIATIONS

AFSSA : Agence française de sécurité sanitaire des aliments DPPH : 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

CE 50 : Concentration efficace inhibant 50% des radicaux de DPPH FRAP : Ferric reducing ability of plasma

IC α=5% : Intervalle de confiance calculé avec un risque α=0,05 OMS : Organisation Mondiale de la Santé ORAC : Oxygen Radical Absorbance Capacity PAC A : Proanthocyanidine de type A PEP : Phosphoenolpyruvate PMF : Poids de la matière fraîche PMS : Poids de la matière sèche PTG : Produits terminaux de la glycation TEAC : Trolox equivalent antioxidant capacity TSS : Total de solides solubles UTI : Urinary tract infections

GLOSSAIRE

Acidocétose : Elévation excessive de l'acidité du sang due à une accumulation d'éléments appelés corps cétoniques Angiogenèse : Croissance de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants Brousse éricoïde : formation végétale à abondance d’espèces d’Ericacées. Cellules β langheransiennes : cellules pancréatiques productrices d’insuline Glycation : Réaction entre un sucre et une protéine générant des protéines glyquées (PTG) qui ne peuvent être ni détruites, ni libérées de la cellule. Ces protéines glyquées s'accumulent ainsi dans les cellules, les encrassant ou causant des mutations des gènes. Glycémie : Taux de glucose dans le sang Insuline : Hormone sécrétée par le pancréas régulant le métabolisme du glucose Sénescence : Etape du développement qui suit la maturité, durant laquelle le produit se dégrade progressivement. Véraison : Etape correspondant au démarrage de la maturation du fruit.

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SOMMAIRE

LISTE DES ABREVIATIONS ...... iii GLOSSAIRE ...... iii LISTE DES PHOTOS ...... vi LISTE DES FIGURES ...... vi LISTE DES CARTES ...... vii LISTE DES TABLEAUX ...... vii LISTE DES ANNEXES...... vii INTRODUCTION ...... 1 GENERALITES...... 3 I- LE GENRE Vaccinium A MADAGASCAR ...... 3 I.1- Descriptions de Vaccinium emirnense ...... 3 I.2- Caractéristiques écologiques des habitats de «voaramontsina» ...... 5 I.3- Connaissance ethnobotanique de «voaramontsina» à Madagascar ...... 5 II- LE GENRE Vaccinium DANS LE MONDE ...... 6 III-MATURATION DES FRUITS ...... 8 IV-LES ACTIVITES ANTIOXYDANTES ...... 12 IV.1- L’oxydation dans l’organisme ...... 12 IV.2- Quelques méthodes d’évaluation de la capacité antioxydante d’un produit ...... 12 IV.2.1- Test de réduction du radical stable, le DPPH ...... 13 IV.2.2- Test TEAC ...... 13 IV.2.3- Test FRAP ...... 13 IV.2.4- Test ORAC ...... 14 V- LE DIABETE SUCRE ...... 14 V.1- Différents types de diabète sucré ...... 14 V.2- Pathogenèse du diabète sucré ...... 15 V.3- Traitements du diabète sucré ...... 15 MATERIELS ET METHODES ...... 17 I. ZONE DE RECOLTE ...... 17 II. MATERIELS ...... 17 II.1 - Matériel végétal ...... 17 II.2 - Matériel biologique ...... 17 III. METHODES: ...... 19 III.1 - Caractérisation des différents stades de maturation des fruits de «voaramontsina» ...... 19

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III.1.1- Caractérisation morphométrique ...... 20 III.1.2- Caractérisation physico-chimique ...... 20 a- Acidité titrable ...... 20 b- Total des solides solubles ...... 20 c- Dosage des chlorophylles ...... 20 d- Dosage des anthocyanes ...... 21 III.2- Evaluation des activités biologiques ...... 22 III.2.1- Extraction méthanolique ...... 22 III.2.2- Test d’activités antioxydantes ...... 22 III.2.3- Test d’activité hypoglycémiante ...... 23 a- Préparation des souris avant le test ...... 23 b- Test de tolérance aux sucres : glucose et amidon ...... 23 RESULTATS ...... 25 I- Caractéristiques morphométriques des fruits de «voaramontsina» ...... 25 I.1- Poids...... 25 I.2- Diamètre ...... 25 II- Caractéristiques physico-chimiques du fruit de «voaramontsina» ...... 26 II.1- Teneur en eau ...... 26 II.2- Acidité titrable...... 26 II.3- Total de solides solubles ...... 27 II.4- Teneurs en chlorophylles et en anthocyanes totaux ...... 27 II.5- Rendement en extraits méthanoliques ...... 28 III- Activités biologiques ...... 29 III.1- Propriété antioxydante ...... 29 III.2- Activité hypoglycémiante des fruits de «voaramontsina» ...... 30 DISCUSSIONS ...... 25 CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES ...... 40 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ...... 42 ANNEXE ...... a RESUME ABSTRACT

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LISTE DES PHOTOS

Photo 1: Pied de «voaramontsina» dans son milieu naturel sur le mont Fanongoavana ...... 4 Photo 1a : Foliation apicale de «voaramontsina» ...... 4 Photo 1b : Tiges ramifiées avec des branches glabres ...... 4 Photo 2: Inflorescence de «voaramontsina»...... 4 Photo 3: Fruits en grappe de «voaramontsina» ...... 4 Photo 4: Vue du Mont Fanongoavana, district de Manjakandriana ...... 17 Photo 5: Brousse éricoïde, habitat typique de «voaramontsina» ...... 17 Photo 6: Pied de «voaramontsina» montrant l’hétérogénéité de la maturation des fruits ...... 19 Photo 7: Grappe à fruits de différentes couleurs ...... 19 Photo 8: Les quatre stades de développement définis au cours de la maturation des fruits de «voaramontsina» ...... 19

LISTE DES FIGURES

Figure 1: Voie métabolique des flavonoïdes au cours de la maturation de la baie de raisin ...... 11 Figure 2: Structure du radical stable DPPH ...... 13 Figure 3: Variation du poids frais des fruits de «voaramontsina» à différents stades de maturation ...... 25 Figure 4: Evolution du diamètre des fruits de «voaramontsina» à différents stades de maturation ...... 25 Figure 5: Variation de la teneur en eau (TE) des fruits de «voaramontsina» à différents stades de maturation ...... 26 Figure 6: Variation de l’acidité des fruits de «voaramontsina» à différents stades de maturation ...26 Figure 7: Variation du total de solides solubles (TSS) dans les fruits de «voaramontsina» à différents stades de maturation ...... 27 Figure 8: Variation des teneurs en chlorophylles et en anthocyanes totaux dans les fruits de «voaramontsina» à différents stades de maturation ...... 27 Figure 9: Activités antioxydantes des extraits méthanoliques des différents stades de fruits de «voaramontsina» au cours de la maturation comparés aux acides ascorbique et gallique ...... 29 Figure 10 : Effet des extraits méthanoliques (100 mg/kg) des différents stades de fruits de «voaramontsina» sur l’hyperglycémie provoquée par le glucose (2 g/kg) chez la souris non diabétique ...... 31 Figure 11 : Effet des extraits méthanoliques (500 mg/kg) des différents stades de fruits de «voaramontsina» sur l’hyperglycémie provoquée par l’amidon (5 g/kg) chez la souris non diabétique ...... 31

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LISTE DES CARTES

Carte 1 : Distribution de Vaccinium emirnense à Madagascar ...... 5 Carte 2 : Localisation de la zone de récolte située à Fanongoavana dans le district de Manjakandriana ...... 18

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 : Variation du rendement en extrait méthanolique des fruits de «voaramontsina» à différents stades de maturation ...... 28

Tableau 2 : Valeurs de CE 50 des extraits méthanoliques des différents stades de fruits de «voaramontsina» et des produits de référence ...... 30

LISTE DES ANNEXES

Annexe 1 : Test DPPH des fractions H2O:MeOH de quelques fruits comestibles ...... a

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INTRODUCTION

Introduction

INTRODUCTION

Le régime alimentaire doit répondre à une double demande chez l’homme: les besoins énergétiques et les besoins plastiques. Les premiers compensent les pertes occasionnées par le métabolisme de base, l’activité musculaire, la thermorégulation et la croissance. Les seconds concernent la défense, la construction et la réparation des tissus (Encarta ® 2009). Les fruits apportent plusieurs éléments essentiels à la nutrition. La plupart des espèces du genre Vaccinium consommées dans le monde présentent des valeurs nutritionnelles et pharmacologiques bien connues. Les fruits des espèces de Vaccinium contiennent en abondance des antioxydants, qui agissent en neutralisant les radicaux libres responsables de diverses maladies (maladies pulmonaires, diabète, cancer...) (Heimhuber et Herrmann, 1990). Ils sont d’excellentes sources de fibre, de calcium, de fer, de vitamine C et de composés phénoliques telles que les anthocyanes (Mainland et Tucker, 2002). En effet, les activités antioxydantes de Vaccinium myrtillus, V. angustifolium , et V. macrocarpon sont largement étudiées. Ces propriétés sont principalement dues à la présence de composés anthocyaniques et phénoliques contenus dans les fruits, particulièrement les acides phénoliques tels que l’acide chlorogénique (Matsunaga et al. , 2010 ; Zafra-Stone et al. , 2007 ; Sellappan, 2002). En outre, plusieurs espèces du genre Vaccinium sont utilisées par la médecine traditionnelle des pays occidentaux pour le traitement des symptômes diabétiques (Chambers et Camire, 2003 ; Jellin et al. , 2005). Comme l'incidence de ce désordre métabolique continue à augmenter dans le monde, la recherche de produits naturels pour son traitement et sa prévention devient un axe prioritaire pour les manufactures de phytomédicaments. Divers fruits sont ainsi connus pour leur propriété hypoglycémiante comme le jamblon, la christophine, la mangue (Sharma et al ., 2006). Le processus de maturation du fruit est déterminant pour sa qualité finale (qualité organoleptique et nutritionnelle). C’est au cours de la maturation que s’accumulent la plupart des composés actifs retrouvés dans le fruit. En effet, l’état de maturité du fruit à la récolte pourrait être un facteur susceptible d’influer sur la teneur en substances actives. Les Vaccinium de Madagascar, Vaccinium emirnense et Vaccinium secundiflorum , sont méconnus du régime alimentaire malagasy bien qu’ils soient répandus dans les forêts secondaires d’altitude des hauts-plateaux et de la partie orientale.

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Introduction

L’objectif de ce travail est de vérifier si les Vaccinium malagasy possèdent certaines des activités biologiques rencontrées chez les Vaccinium étrangers, notamment les activités antioxydante et hypoglycémiante liées à la maturation des fruits, afin de pouvoir vulgariser et développer leurs utilisations à de fins alimentaires et/ou pharmaceutiques. Dans le cas de notre étude, nous avons choisi de travailler avec les fruits de Vaccinium emirnense, plus abondants sur les hautes terres et en particulier autour d’Antananarivo. Les objectifs spécifiques du présent travail consiste à :
suivre l’évolution des caractéristiques morphologiques et biochimiques des fruits de Vaccinium emirnense au cours de leur maturation ;
vérifier et étudier la variation des capacités antioxydative et hypoglycémiante des fruits de Vaccinium emirnense au cours de leur maturation.

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GENERALITES

Généralités

GENERALITES

I- LE GENRE Vaccinium A MADAGASCAR A Madagascar, le genre Vaccinium est représenté par deux espèces endémiques, V. emirnense et V. secundiflorum (Perrier de la Bathie, 1934). Vaccinium emirnense a une morphologie très variée suivant l’altitude. Cette variation concerne surtout la taille des feuilles. En effet, les feuilles rencontrées à moyenne et à basse altitudes sont grandes et celles en haute altitude sont petites (Randrianarivony, 2007).

I.1- Descriptions de Vaccinium emirnense  Classification botanique La classification botanique du genre Vaccinium a été établie par Bremer et al. (2003). Règne : VEGETAL Sous - Règne : EUCARYOTES Embranchement : CORMOPHYTES Sous-Embranchement : SPERMATOPHYTES Super-Classe : ANGIOSPERMES Classe : DICOTYLEDONES Ordre : ERICALES Famille : ERICACEAE Genre et espèce : Vaccinium emirnense Nom vernaculaire : voaramontsina

 Appareil végétatif «Voaramontsina» est un arbuste de 2 à 5 m de hauteur, à tronc dichotomique (Photo 1). La tige est très ramifiée avec des branches glabres (Photo 1b). Les feuilles sont coriaces, mesurant environ 1,5 x 1 cm, à pétiole plus ou moins aplati, à bord denté, et à nervations bien distinctes (Photo 1a). (Randrianarivony, 2007)

 Appareil reproducteur Les inflorescences sont axillaires. Elles sont formées par des fleurs jaunes verdâtre disposées en racèmes de type grappe (Photo 2). Les fleurs sont hermaphrodites, actinomorphes, à pédoncule floral d’environ 3 mm de long. Elles sont formées par cinq sépales soudés, insérés au sommet de l’ovaire infère, cinq pétales à préfloraison imbriquée, et dix étamines médifixes. (Randrianarivony, 2007)

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Généralités

Photo 1a : Foliation apicale de «voaramontsina»

Photo 1b : Tiges ramifiées avec des branches glabres Photo 1 : Pieds de «voaramontsina» dans leur milieu naturel sur le mont Fanongoavana (Manjakandriana)

 Fruit Le fruit de «voaramontsina», une baie verte, puis rouge, voire pourpre à maturité, est comestible (Photo 3). Il contient plusieurs petites graines globuleuses et dures.

Photo 2 : Inflorescence de «voaramontsina». Photo 3 : Fruits en grappe de «voaramontsina». Barre = 1 cm

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Généralités

I.2- Caractéristiques écologiques des habitats de «voaramontsina» Les espèces de Vaccinium ont besoin d’un sol acide (pH= 3,5 - 4) bien drainé à matières organiques élevées (Krzewi ńska, 2004). «Voaramontsina» est une espèce héliophile car elle est rencontrée dans les endroits ensoleillés de la brousse éricoïde. Il est distribué dans le centre, l’Est et les hauts sommets de Madagascar (Randrianarivony, 2007).

Carte 1 : Distribution de Vaccinium emirnense à Madagascar (Randrianarivony, 2007)

I.3- Connaissance ethnobotanique de «voaramontsina» à Madagascar La consommation des fruits de «voaramontsina» n’est pas formellement connue à Madagascar. Les fruits sont voire méconnus surtout par la population urbaine. Les villageois en goûtent en passant leur chemin au bord duquel la plante pousse. L’espèce est utilisée comme bois de chauffe (d’après les enquêtes).

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Généralités

II- LE GENRE Vaccinium DANS LE MONDE Ce genre comprend une diversité d’espèces réparties dans le monde. Les fruits sont exploités industriellement dans beaucoup de pays. En Amérique, quelques espèces sauvages de Vaccinium (V. angustifolium , V. ashei , V. macrocarpon ) sont largement exploitées après améliorations de la gestion des champs de culture. En Pologne et en Europe de l'Est, l’exploitation des espèces sauvages indigènes telles que : V. myrtillus , V. vitis idaea , V. uliginosum , et V. oxycoccus , n’est pas encore développée, cependant le commerce de V. corymbosum est important depuis les années 70. La filière de V. macrocarpon est également en développement actuellement mais pas aussi large que celle de V. corymbosum (Krzewi ńska, 2004).

 Exemples d’utilisations des fruits de quelques espèces de Vaccinium

Vaccinium myrtillus (origine : Italie; nom vernaculaire : la myrtille, bilberry) : une étude récente a montré que les anthocyanes de l’extrait de fruits de cette espèce pourrait favoriser la synthèse de glycosaminoglycanes au niveau des cellules épithéliales cornéennes sur l’amélioration de la vision. Ce sont des facteurs importants pour le renouvellement et l’homéostasie physiologiques de ces cellules (Song et al. , 2010). L’extrait de fruits de Vaccinium myrtillus a également un effet inhibiteur sur l'angiogenèse dû à leurs principaux constituants, tels que la delphinidine, la cyanidine et la malvidine. Ces mêmes composants participent également aux propriétés antioxydantes de ces mêmes fruits (Matsunaga et al. , 2010).

Vaccinium angustifolium (origine : Canada; nom vernaculaire : airelle à feuilles étroites, blueberry): la consommation de ses fruits est fortement recommandée par les tradipraticiens québécois, pour le traitement des symptômes et des complications diabétiques (Haddad et al. , 2003; Leduc et al. , 2006). Le fruit aurait la propriété de stimuler la production d'insuline en favorisant la prolifération des cellules β du pancréas. Ce résultat revêt un intérêt particulier car aucun médicament disponible sur le marché ne produit cet effet (Martineau et al. , 2006). Au Canada, l'extrait de « blueberry » est déjà utilisé, sous forme de supplément alimentaire, comme traitement complémentaire du diabète de type 2 (http://fr.wikipedia.org). Le fruit de Vaccinium angustifolium est riche en acide chlorogénique et en quercétine et ses dérivés (quercetin-3-O-galactoside, quercetin-3-O-glucoside) à part leur forte teneur en anthocyanes (Harris et al. , 2007).

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Généralités

Vaccinium macrocarpon (nom vernaculaire : canneberge cultivé, cranberry) : le fruit contient un polyphénol, la proanthocyanidine de type A (PAC A), contribuant à diminuer la fixation, sur les parois des voies urinaires, de certaines bactéries coliformes ( Escherichia coli ) souvent responsables d'infections du tractus urinaire (UTI ou cystites) (Nowack et Schmitt, 2008). Ses effets ont été prouvés par de nombreuses études cliniques et validés dans le cadre de la diminution des infections urinaires par l'AFSSA pour une dose journalière de 36mg PAC (www.martineschnoering.com). Etant donné l’efficacité du jus de canneberge dans le traitement des infections de l'appareil urinaire, les fruits ou jus de fruit utilisés comme suppléments peuvent être un choix thérapeutique valable dans le traitement des cystites pendant la grossesse (Dugoua et al. , 2008). Le fruit de V. macrocarpon est également réputé pour sa propriété antioxydante grâce aux composés anthocyaniques (Zafra-Stone et al. , 2007).

Vaccinium corymbosum (origine : Amérique du nord ; nom vernaculaire : corymbelle) : la capacité antioxydante de ses fruits est due principalement à la contribution des composés phénoliques tels que les anthocyanes, la quercétine, le kaempferol, la myricétine, et l’acide chlorogénique (Sellappan, 2002).

Vaccinium floribundum (origine : Equateur et Pérou) : les baies sont largement consommées en Equateur comme fruit frais ou en tant que produits transformés. Les communautés locales utilisent également ces fruits pour traiter le diabète et l'inflammation (Schreckinger et al., 2010).

Vaccinium padifolium (origine : Portugal) : les baies sont prescrites par la pharmacopée locale pour le traitement de la toux, la bronchite, la dysenterie et sont exportées pour la production commerciale de spécialités ophtalmiques (Cabrita et al, 2000)

Vaccinium meridionale (origine : Colombie): les fruits sont riches en cyanidin-3-galactoside (anthocyane) et en acide chlorogénique. Selon Garzón et al. (2010), leur utilisation comme source d’antioxydants, de colorants naturels, et de suppléments alimentaires semble être prometteuse. Ainsi, les fruits de Vaccinium sont utilisés depuis longtemps par la pharmacopée traditionnelle de plusieurs pays, et constituent également l’objet de recherches actuelles dans les domaines médicinal et nutritionnel. Les recherches sont surtout focalisées sur leurs propriétés antioxydante, hypoglycémiante, antiangiogénique et antibactérienne.

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Généralités

En outre, diverses utilisations des autres parties, autres que fruits, de la plante du genre Vaccinium sont connues. En effet, les tiges, les feuilles et les racines de V. angustifolium sont reconnues pour leur propriété antidiabétique (Martineau et al ., 2006). Aux Etats-Unis, les tiges feuillées de V. ovatum tiennent une place importante sur le marché des fleurs, servant de feuillage pour l’arrangement floral. Les tiges de V. parvifolium sont aussi utilisées dans la fabrication de paniers (Kerns et al ., 2004).

III- MATURATION DES FRUITS

La maturation correspond à un ensemble de changements biochimiques et physiologiques conduisant à l’état de maturité et conférant au fruit ses caractéristiques organoleptiques (arômes, couleur, jus...) (Brady, 1987). Les fruits du genre Vaccinium sont des fruits de type non climactérique c’est-à-dire qu’ils ne présentent pas d'autonomie de maturation et doivent donc mûrir sur l'arbre. Parmi ces fruits non climactériques se trouvent les agrumes, la framboise, la fraise et le raisin.

 Evènements associés à la véraison et à la maturation des fruits (exemple chez le raisin) La véraison correspond au démarrage de la maturation du fruit. Chez le raisin, cette étape du développement transforme les fruits verts, acides et astringents en fruits mûrs, sucrés, colorés. Elle se manifeste par de multiples changements physiologiques dans les baies (Gaudillere, 2006). (1) Le ramollissement des parois est la manifestation la plus précoce de la véraison. Elle correspond à une modification des pectines des parois. (2) La synthèse des anthocyanes est une des premières manifestations suivant le déclenchement de la véraison. Les proanthocyanidines sont accumulées avant la véraison et cette accumulation ne se poursuit que 1 à 2 semaines après la véraison (3) Les sucres changent de destination: au stade vert ils sont métabolisés et assurent la croissance du fruit. A partir de la véraison, plus de 50% du saccharose importé par les baies sont accumulés dans les vacuoles de la pulpe. La chlorophylle est dégradée avec le métabolisme photosynthétique. L'expression, la quantité et l'activité d'enzymes du métabolisme des sucres sont modifiés à la véraison. Des acides aminés, principalement la proline et l’arginine, sont accumulés. (4) Le métabolisme des acides organiques est altéré par répression de l'activité de la PEP carboxylase

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Généralités

(5) Une abscission partielle des vaisseaux du xylème rompt les communications hydrauliques entre les baies et la plante. La baie n'est plus alimentée que par le transport phloémien qui doit assurer l'intégralité des besoins trophiques des fruits (eau et sucres) pour permettre le processus de maturation. Le fruit peut maintenir son statut hydrique en accumulant des solutés, en baissant la pression de turgescence et en baissant le potentiel osmotique. (6) L'accumulation des protéines commence à la véraison et se poursuit pendant toute la phase de maturation.

Parmi les changements biochimiques subis par le fruit, certains sont directement perçus par le consommateur. La période de croissance est une phase d’accumulation de matières premières (eau, sels, azote, glucide, acides organiques…), la période de maturation est marquée par un métabolisme extrêmement intense (respiration, synthèse protéique, formation de pectines, de saccharose, dégradation de chlorophylles…), et la sénescence enfin se signale par un catabolisme généralisé (hydrolyse du saccharose, des pectines, destruction des protéines…) (Lizada, 1993).

 Composés synthétisés dans les fruits Les baies constituent une des plus importantes sources de composés naturels nécessaires à la santé humaine. Elles sont riches en acide ascorbique, en composés phénoliques, en particulier les acides phénoliques, les anthocyanes, les proanthocyanidines et d’autres flavonoïdes (Fukumoto, 2000 ). Les composés phénoliques sont des métabolites secondaires, pouvant être classés en deux groupes : les flavonoïdes et les non-flavonoïdes.

1- Les flavonoïdes Les flavonoïdes sont synthétisés au niveau des fleurs, des fruits, des feuilles et des graines d’un grand nombre de végétaux. Leur accumulation confère des avantages écologiques et physiologiques majeurs pouvant être induite par divers agents biotiques ou abiotiques comme une blessure, une attaque de pathogène, une carence en minéraux et nutriments, un rayonnement d’ultraviolets et une lumière élevée associée à des températures froides. Les flavonoïdes apportent également des avantages adaptatifs pour les interactions plantes- insectes. Les flavonoïdes (anthocyanes et flavonols) participent activement à la coloration des fleurs et des fruits. La coloration des fleurs faciliterait leur attraction par les insectes pour la pollinisation (Gomez, 2009).

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Généralités

Les principales classes de flavonoïdes sont : les flavones, les flavonols, les flavan-3-ols, les flavanones et les anthocyanidins. Dans les baies, trois principaux types de flavonoïdes sont accumulés, les flavan-3-ols, les flavonols et les anthocyanes (Crozier et al. , 2006). - Les flavan-3-ols sont présents sous forme de monomères et de structures polymérisées, appelées proanthocyanidines ou tannins condensés. Les structures de base des proanthocyanidines, sont les flavan-3-ols monomères : (+) -catéchine et ( -)-épicatéchine La proanthocyanidine de type A (PAC A) est constituée d’une liaison entre deux molécules d’épicatéchines. - Les flavonols sont des pigments jaunes qui s’accumulent dans les baies à maturité, notamment en réponse à l’exposition au rayonnement UV (exemple: quercétine, myricétine, kaempférol, laricitine, isorhamnetine, syringétine). - Les anthocyanes ont une structure de base commune, le cation flavylium ou 2- phényl-1-benzopyrilium. Elles sont largement dispersées dans toutes les parties de la plante mais sont particulièrement évidentes au niveau des fruits et des fleurs, où elles sont responsables de la coloration rouge, bleue et pourpre. Les anthocyanidines constituent les aglycones des anthocyanes. Le pélargonidine, le cyanidine, le péonidine, le delphinidine, le pétunidine et le malvidine sont les six anthocyanidines les plus courants trouvés dans la nature (Jungmin et al., 2008)

Biosynthèse des flavonoïdes Partant de la phénylalanine comme substrat, la synthèse des flavonoïdes commence par 3 réactions catalysées par les enzymes phenylalanine ammonia-lyase (PAL), cinnamate 4- hydroxylase (C4H) et la 4-coumaroyl CoA ligase (4CL) pour aboutir au 4 -coumaroyl CoA. La structure en C6-C3-C6 caractéristique des flavonoïdes est obtenue par l’action d’une chalcone synthase (CHS) sur le 4-coumaroyl CoA, générant une chalcone qui est ensuite transformée en naringenine sous l'action d’une chalcone isomérase (CHI). Le noyau C de cette molécule est ensuite hydroxylé en position 3 par une flavanone 3-β hydroxylase (F3H) pour donner le dihydrokampférol. Cette molécule peut ensuite être hydroxylée générant la dihydroquercétine ou la dihydromyricétine. A partir des dihydroflavonols, la flavonol synthase (FLS) catalyse la formation des flavonols. La dihydroflavonol 4-réductase (DFR) catalyse la formation des précurseurs des anthocyanes et des flavan -3-ols : leucocyanidine, leucodelphinidine et leucopélargonidine. D’une part, l’oxydation des leucoanthocyanidines catalysée par la leucoanthocyanidine dioxygénase/anthocyanidine synthase (LDOX/ANS) aboutit à la formation des anthocyanidines, cyanidine, delphinidine et perlargonidine. D’autre

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Généralités part, à partir d’une réduction catalysée par une leucoanthocyanidine réductase (LAR), sont obtenus les isomères 2,3 trans des flavan 3-ols: (+) -catéchine, (+) -gallocatéchine et (+) - afzeléchine. Les isomères 2,3 cis, (-)-épicatéchine, (-)-épigallocatéchine et ( -)-épiafzeléchine sont pour leur part synthétisés à partir d’une réduction respectivement de la cyanidine, la delphidine et la pelargonidine par une anthocyanidine réductase (ANR). Concernant la voie spécifique des anthocyanes, l’enzyme UDP-glucose: flavonoide 3-O-glucosyltransférase (UFGT) catalysant la réaction de glucosylation des anthocyanidines. Cet enzyme est détecté à partir de la véraison et tout le long du stade de maturation dans la pellicule (Gomez, 2009).

Phénylalanine 4-Coumaroyl -CoA +Manolyl -CoA PAL C4H 4CL CHS Chalcone CHI Naringenine F3H FLS Dihydrokampférol FLS Flavonols Flavonols F3’H F3’ 5’H

FLS Dihydroquercétine Dihydromyricétine FLS DFR

(+) -catéchine Leucocyanidine LAR (+) -gallocatéchine Leucodelphinidine LDOX/ANS (-)-épicatéchine Cyanidine UFGT ANR Delphidine Anthocyanes (-)-épigallocatéchine Pellicule Flavonols Proanthocyanidines Flavonols Anthocyanes

Pépin Proanthocyanidines

VERAISON

Figure 1: Voie métabolique des flavonoïdes au cours de la maturation de la baie de raisin (Gomez, 2009).

2- Les non-flavonoïdes Les principaux non-flavonoïdes sont les acides phénoliques (exemple : acide chlorogénique, acide ca fféique, acide gallique, l’acide vanillique) qui sont les précurseurs des tanins hydrolysables, les hydroxycinammates et leurs dérivées conjuguées, et les stilbènes polyphénoliques.

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Généralités

IV- LES ACTIVITES ANTIOXYDANTES

IV.1- L’oxydation dans l’organisme Les radicaux libres, dérivés du métabolisme sont produits dans toutes les cellules, considérant que l’oxydation est essentielle à la vie de l’organisme pour la production d’énergie afin d’accomplir les processus biologiques. Les principaux radicaux libres présents dans les cellules humaines sont les ions superoxydes, les radicaux hydroxyles, le peroxyde d'hydrogène et les métaux de transition. Ils oxydent les molécules se trouvant à l'intérieur des cellules, en particulier les lipides membranaires, ce qui provoque la mort des cellules (Encarta ® 2009). Les cellules sont protégées des dommages des radicaux libres par les enzymes antioxydantes comme le superoxyde dismutase et la catalase ou par les composés chimiques tels que l' α- tocophérol, l’acide ascorbique, les composés phénoliques, le glutathion. Cependant, la protection assurée par ces enzymes et composés antioxydants est souvent insuffisante ayant pour résultats l’apparition de maladies et l’accélération du vieillissement (Soares et al. , 2009). L'ADN est particulièrement sensible à l'oxydation par les radicaux libres, et que ces substances pourraient être responsables des mutations précédant l'apparition d'un cancer. Cela expliquerait pourquoi certains métaux de transition tels que le nickel et le chrome sont cancérigènes dans certaines conditions. Les radicaux libres seraient également impliqués dans l'athérosclérose, les atteintes hépatiques, les maladies pulmonaires, les affections rénales et le diabète (Encarta ® 2009). Les produits naturels à activité antioxydante peuvent être utilisés pour aider le corps humain à réduire les dommages dus aux stress oxydatifs. En effet, beaucoup de fruits et légumes sont reconnus pour leurs activités antioxydantes.

IV.2- Quelques méthodes d’évaluation de la capacité antioxydante d’un produit Il existe différentes méthodes pour déterminer le potentiel antioxydant de produits alimentaires, ingrédients,… Les méthodes TEAC et DPPH sont couramment utilisées pour analyser les extraits de plantes et de fruits. La méthode ORAC est applicable sur quasiment toutes les matrices (extraits végétaux, aliments, plasma sanguin,…) aussi bien sur des composés hydrophiles que liposolubles. Il existe souvent des différences de valeurs entre les méthodes, du fait que les sources de radicaux libres sont différentes, et que les antioxydants répondent différemment aux méthodes de mesure (http://www.labo-nutrinov.com).

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Généralités

La mesure du potentiel antioxydant et le suivi des processus d’oxydation sont abordés globalement en déterminant des produits résultant de l’oxydation ou en évaluant l’aptitude à piéger des radicaux de modèles réactionnels.

IV.2.1- Test de réduction du radical stable, le DPPH Le 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) est un radical stable et coloré, qui est centré sur l’azote

Figure 2: Structure du radical stable DPPH (http://www.labo-nutrinov.com)

Le maximum de son absorption dans le visible se situe vers 515-517 nm dans le méthanol et l’éthanol. La réduction du radical par un donneur d’atome H (AH) conduit à la 2,2-diphényl- 1-picrylhydrazine incolore (DPPH-H) et au radical (A°).

DPPH ° AHDPPHHA°

Ce test, largement utilisé, est rapide et facile à réaliser; il permet donc de comparer un grand nombre de composés. Les résultats peuvent être exprimés en pourcentage de réduction de DPPH.

IV.2.2- Test TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity) Dans la méthode TEAC, l’activité antioxydante totale d’une molécule est déduite de sa capacité à inhiber le radical ABTS •+ , obtenu à partir de l’ABTS [sel d’ammonium de l’acide 2,2’-azinobis-(3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique)] comparé à un antioxydant de référence: le Trolox ® (acide 6-hydroxy-2,5,7,8-tétraméthylchroman-2-carboxylique). Le radical ABTS •+ , en contact avec un donneur de H • conduit à l’ABTS + et à la décoloration à λ=734 nm de la solution (http://www.labo-nutrinov.com).

IV.2.3- Test FRAP (Ferric reducing ability of plasma) Le pouvoir antioxydant d’une solution comme le plasma est déterminé grâce au test FRAP. A faible pH et à 37°C, le complexe tripyridyltriazine ferreux (TPTZ-Fe 3+ ) est ajouté à l’échantillon. Les antioxydants présents réduisent le complexe sous sa forme Fe 2+ et son absorbance est lue à 593 nm toutes les 15 s durant la période de mesure. Ce test est rapide et donne des résultats reproductibles pour des solutions biologiques ainsi que pour des solutions

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Généralités pures d’antioxydants où la réaction est indépendante de la concentration car la réponse est linéaire (http://www.labo-nutrinov.com).

IV.2.4- Test ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) La particularité du test ORAC est la possibilité de mesurer séparément à partir d’une même solution biologique la capacité antioxydante des composés hydrophiles et lipophiles qui la composent. Les composés sont évalués pour leur capacité à empêcher l’oxydation de la fluorescéine par les radicaux péroxyles. Ce test est applicable aux solutions biologiques comme le plasma sanguin et aux extraits de fruits et légumes (http://www.labo-nutrinov.com).

V- LE DIABETE SUCRE

Le diabète sucré est une maladie chronique provoquée par un trouble du métabolisme des glucides et caractérisée par un taux anormalement élevé de sucre dans le sang et les urines (Encarta ®2009). Le diabète est installé lorsque la glycémie à jeun est supérieure à 120 mg/dl chez l’homme, et supérieure à 250 mg/dl de sang chez la souris.

V.1- Différents types de diabète sucré

L’OMS (1999) a défini trois principaux types de diabètes : le diabète de type 1, le diabète de type 2 et le diabète néonatal. Ces formes se différencient par leurs causes et leurs distributions:

- le diabète de type 1 (ou diabète insulinodépendant) fait partie des maladies auto-immunes. Il est dû à la destruction des cellules β langheransiennes. Ce diabète également appelé diabète maigre portait autrefois le nom de diabète juvénile, représente 5 à 10% des cas de diabète et son évolution est très rapide; - le diabète de type 2 (ou diabète non insulinodépendant) se caractérise par une résistance à l'insuline de l'organisme et une hyperinsulinémie réactionnelle. Le pancréas fabrique de plus en plus d'insuline et lorsque la quantité d'insuline ne suffit plus à contrer les résistances, le taux de glucose devient anormalement élevé. Ce type de diabète est dit diabète gras ou diabète de la personne âgée et c’est la forme la plus fréquente du diabète sucré (70-90% des cas); - le diabète néonatal est semblable au diabète du type 2 parce qu'il implique la résistance à l'insuline. C’est une affection très rare caractérisée par une hyperglycémie survenant dans les six premières semaines de la vie et se guérit spontanément vers le 18 ème mois (http://fr.wikipedia.org).

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Généralités

V.2- Pathogenèse du diabète sucré (Encarta ®2009)

L'insuline, hormone sécrétée par le pancréas, permet de réguler le taux du glucose sanguin, qui fournit l'énergie nécessaire à de nombreux processus métaboliques. - Chez un sujet en bonne santé, lors de la digestion, la glycémie augmente. Le pancréas sécrète de l'insuline qui permet aux cellules insulinodépendantes, telles que les cellules des tissus adipeux et musculaire, d'assimiler le glucose. L'insuline contribue en outre à la transformation du glucose en glycogène, substance énergétique emmagasinée dans le foie et les muscles. Des hormones régulent l'insulinosécrétion en faisant chuter le taux de sucre dans le sang. En retour, le pancréas produit moins d'insuline. - Chez un sujet atteint de diabète sucré, le pancréas ne sécrète pas assez d'insuline ou l'organisme est incapable d'utiliser l'insuline produite. Si au terme de la digestion le pancréas ne peut sécréter suffisamment d'insuline, l'organisme est contraint de puiser son énergie dans les graisses et non plus dans le glucose. Bien que partiellement excrétées dans l'urine, des substances toxiques appelées cétones s'accumulent dans le sang, ce qui contribue à l'apparition de l'acidocétose, maladie grave pouvant entraîner le coma ou la mort. Si l'organisme s'avère incapable d'utiliser correctement l'insuline, le glucose ne peut pénétrer dans les cellules et circule librement dans l'organisme sans être assimilé. Un taux élevé de sucres dans le sang et dans l'urine altère les défenses de l'organisme contre l'infection et peut entraîner l'acidocétose.

V.3- Traitements du diabète sucré Un régime hyposucré et des exercices physiques constituent les premières étapes du traitement de diabète. Mais si ces mesures échouent pour régler la glycémie, la thérapie par des médicaments à voie orale est recommandée (Van de Laar et al. , 2005). Six classes de médicaments anti-hyperglycémiques oraux existent (Nathan 2007) :

- les biguanides (ex: metformine), un médicament antihyperglycémiant plutôt qu'hypoglycémiant (son utilisation évite la hausse du taux de glucose dans le sang mais n’entraîne pas l'hypoglycémie), - les sulfamides hypoglycémiants (ex: tolbutamide), augmentent de façon temporaire la sécrétion d’insuline, - les glinides (ex: repaglinide), agissent comme les sulfamides en forçant le pancréas à sécréter de l’insuline au moment des repas, - les thiazolidinediones (ex: pioglitazone),

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Généralités

- les dipeptidyles inhibiteurs de la peptidase IV (ex: sitagliptine), - les inhibiteurs d' α-glucosidase (ex: acarbose), diminuent l’absorption de sucres de l’intestin vers le sang.

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MATERIELS ET METHODES

Matériels et méthodes

MATERIELS ET METHODES

I. ZONE DE RECOLTE La récolte des fruits de «voaramontsina» a été effectuée autour du mont Fanongoavana (Altitude: 1627 m, Longitude: 19°03’535’’S, Latitude: 47°5’069’’E), dans le district de Manjakandriana (Carte 2). La zone de récolte est formée d’une brousse éricoïde et de reliquats de formation secondaire, dominées par les espèces d’Ericaceae et d’Eucalyptus. Elle présente un climat humide tempéré d’altitude, caractéristique de la région orientale.

Photo 4 : Vue du Mont Fanongoavana et de ses Photo 5 : Brousse éricoïde, habitat typique alentours, district de Manjakandriana. de «voaramontsina».

II. MATERIELS

II.1 - Matériel végétal Les fruits de «voaramontsina» ont été récoltés pendant la saison de fructification, durant les mois de Janvier et Février 2009. Les fruits récoltés sont immédiatement placés dans une glacière (autour de 5°C). Les fruits destinés à l’extraction méthanolique ont été étuvés pendant environ 5 jours à 50°C, tandis que ceux nécessaires aux caractérisations physico-chimiques ont été congelés à -15°C jusqu’à leur utilisation.

II.2 - Matériel biologique Les tests biologiques ont été effectués sur des souris swiss de l’espèce Mus musculus élevées dans une animalerie dans les conditions naturelles de lumière, de température d’humidité et d’aération. Les souris sont nourries quotidiennement avec de la provende standardisée sous forme de pellet (1340, Avitech - Antananarivo) et de l’eau de robinet.

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Matériels et méthodes

Carte 2 : Localisation de la zone de récolte située à Fanongoavana dans le district de Manjakandriana (source : Kew-map, 2010). Échelle : 1 /200 000.

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Matériels et méthodes

III. METHODES:

III.1 - Caractérisation des différents stades de maturation des fruits de «voaramontsina» La période de fructification de «voaramontsina» est assez étalée et la maturation des fruits est hétérogène d’un pied à l’autre mais aussi sur le même pied (Photo 6 et 7). En effet, Sur un même pied, il est possible d’observer des fruits à différents stades de maturation, voire même des fleurs épanouies.

Photo 6: Pied de «voaramontsina» montrant Photo 7: Grappe à fruits de différentes l’hétérogénéité de la maturation des fruits couleurs. Barre=0,5 cm

Quatre stades de développement (Photo 8) ont été définis suivant la maturation des fruits selon la classification établie par Çelik et al. (2008) chez Vaccinium macrocarpon :

- stade I : fruit vert en cours de développement (a) - stade II : fruit à moitié rouge ou fruit rose (b) - stade III : fruit rouge (c) - stade IV : fruit pourpre (d)

(a) (b) (c) (d)

Photo 8 : Les quatre stades de développement définis au cours de la maturation des fruits de

«voaramontsina» . Mémoire de DEA Miora RARINIRINA 19

Matériels et méthodes

III.1.1- Caractérisation morphométrique Les fruits sont préalablement triés en fonction de leur stade de développement avant de mesurer leur diamètre. Ensuite, les fruits sont pesés frais puis séchés à l’étuve jusqu’à l’obtention d’un poids sec constant. La teneur en eau est donnée par la formule : avec : TE : la teneur en eau (%) PMF – PMS TE 100 PMF : le poids de la matière fraîche PMF PMS : le poids de la matière sèche

III.1.2- Caractérisation physico-chimique Pour chacun des quatre stades de développement, 20 g de fruits fraîchement sortis du congélateur ont été broyés, mélangés avec 60 ml d’eau distillée, puis mise en agitation pendant 15mn. Le mélange est ensuite filtré avec un papier filtre (MN 616, Ø90 mm) et le jus obtenu est utilisé pour la détermination de l’acidité titrable et du taux de solides solubles.

a- Acidité titrable L’acidité titrable mesure la concentration de tous les ions d’hydrogène disponibles, ceux qui sont libres en solution sous forme d’ions H + et ceux liés à des acides non dissociés et aux anions. 25 ml de jus de fruits sont dilués dans 25 ml d’eau distillée. L’acidité du jus est mise en évidence par titration avec de la soude 0,1N après avoir ajouté 2 gouttes de phénolphtaléine. L’apparition d’une couleur rose violacée indique la neutralisation. Le volume de soude nécessaire à la neutralisation de tous les acides est proportionnel à l’acidité du jus. Cette acidité est exprimée en gramme d’acide malique par 100 g de fruits. La valeur obtenue est multipliée par le facteur de dilution qui est égale à 6.

b- Total des solides solubles (TSS) Le contenu des solides solubles représente le total de tous les solides dissous dans l'eau, incluant le sucre, les sels et les protéines. Il est mesuré à l’aide d’un réfractomètre. Ainsi, deux gouttes du jus sont étalées sur le prisme du réfractomètre. Le TSS est exprimé en pourcentage. La valeur lue est multipliée par le facteur de dilution qui est égal à 3.

c- Dosage des chlorophylles La détermination de la teneur en chlorophylles de chaque stade de développement est réalisée selon le principe de dosage défini par Arnon (1949). Pour cela, 0,1 g de fruits broyés est

Mémoire de DEA Miora RARINIRINA 20

Matériels et méthodes mélangé avec 20 ml d’éthanol 98° glacial. Le mélange obtenu est agité puis centrifugé à 1000 tr/mn pendant 15 mn. Ensuite, le surnageant est récupéré et l’absorbance est lue à 663 nm pour la chlorophylle a et 645 nm pour la chlorophylle b à l’aide d’un spectrophotomètre (Anthelie, Light- Secomam ®) en utilisant l’éthanol comme blanc. La teneur en chlorophylles totales, exprimée en mg/g de fruits, est déterminée selon la formule d’Arnon (1949):

Chlorophylletotale mg/ml = 0,0202 645 0,00802 663 avec, D.O : Densité optique (absorbance)

d- Dosage des anthocyanes La méthode utilisée dans la détermination de la concentration en anthocyanes totaux est basée sur celle décrite par Iland et al. (2000) puis modifiée par l’Australian Wine Research Institute en 2006. Cette méthode nécessite une extraction des composés à partir d’échantillons broyés, une expression de leur coloration à faible pH et une quantification basée sur leur absorbance à une longueur d’onde de la lumière visible. La malvidin-3-glucoside constitue l’un des anthocyanes majeurs du fruit du genre Vaccinium (Lohachoompol et al. , 2008) et le résultat est exprimé en équivalent en malvidine.

Brièvement, 50 g de fruits de «voaramontsina» sont broyés en purée à l’aide d’un mixeur. Ensuite, 2 g de l’homogénat sont mélangés avec 20 ml d’éthanol à 98°. Après 1 h d’agitation, le mélange est centrifugé à 1000 tr/mn pendant 15 mn ; 0,2 ml du surnageant est versé dans un tube puis additionné de 3,8 ml de 1M HCl. Le mélange obtenu est agité puis placé au réfrigérateur à 4°C pendant 3 à 24 h (étape critique pour permettre l’expression de la couleur). L’absorbance de l’extrait est lue à 520 nm.

La concentration est ensuite calculée selon la formule :

A520 x DF x V ml x 1000 / 500 x 100 x poids de l′homog énat g avec : a : absorbance de l’extrait lue à 520 nm. b : facteur de dilution (dilution de l’extrait dans 1M de HCl), égal à 6. c : volume final mesurée après ajout de 2 g d’homogénat dans 20 ml d’éthanol, égal à 21 ml. d : absorbance de 1% p/v (1 g/100 ml) de la solution de malvidin-3-glucoside. poids de l’homogénat : égal à 2 g.

Mémoire de DEA Miora RARINIRINA 21

Matériels et méthodes

III.2- Evaluation des activités biologiques

Dans le cadre de la recherche d’activités biologiques, des extraits méthanoliques ont été utilisés, sachant que le méthanol constitue un solvant efficace pour l’extraction des composés phénoliques (Kapasakalidis et al. , 2006).

III.2.1- Extraction méthanolique

Des fruits secs de chaque stade de maturation ont été moulus jusqu’à obtention de poudre fine. 100g pour chacun ont été macérés dans 500 ml de méthanol, en agitant le mélange pendant 24h. Le filtrat récupéré après filtration par le papier Whatman no.1 est séché au rotavapor à 40°C jusqu’à élimination totale du solvant, en durée de 30mn en moyenne. Les extraits obtenus ont été frigorifiés jusqu’à leur utilisation.

III.2.2- Test d’activités antioxydantes

La méthode est basée sur la dégradation du radical de DPPH (Aldrich ®Chemistry). Un antioxydant aura la capacité de donner un électron singulet au radical synthétique de DPPH de coloration violette pour le stabiliser en DPPH de coloration jaune-verte. La mesure de la décroissance de la coloration violette à différentes concentrations permet de déterminer l’EC 50 , concentration à laquelle 50% de coloration est perdue (correspondant à la quantité d’antioxydant nécessaire pour faire diminuer de 50% la quantité initiale de DPPH) Ainsi, l’évolution de l’activité antioxydante au cours de la maturation des fruits de «voaramontsina» a été testée par mesure de la capacité des différentes concentrations de l’extrait méthanolique à piéger les radicaux libres de la solution de DPPH à concentration identique. La quantification des radicaux piégés de DPPH a été faite par suivi spectrophotométrique selon la méthode décrite par Tepe et al. (2005). Des extraits de fruits ont été mélangés avec un volume fixe d’une solution de DPPH (25 µg.ml -1 dans du méthanol) de façon à obtenir différentes concentrations : 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, et 100 µg/ml (extrait/solution de DPPH). Chaque échantillon est agité vigoureusement et maintenu dans une chambre noire pendant 30 mn (critère d’incubation pour le déroulement de la réaction de piégeage des radicaux). La solution de DPPH (sans extrait) a été utilisée comme témoin. L’absorbance a été mesurée à 517 nm.

Mémoire de DEA Miora RARINIRINA 22

Matériels et méthodes

La capacité des extraits à piéger les radicaux de DPPH est calculée selon la formule :

A0 A1 I% 100 A0 avec : A0 : absorbance du témoin A1 : absorbance du mélange extrait + DPPH

La concentration de chaque extrait de fruits provoquant 50% d’inhibition (CE 50 ) a été déterminée sur chaque courbe correspondante tracée par GraphPad Prism ®. De l’acide ascorbique et de l’acide gallique ont été utilisés comme antioxydants de référence.

III.2.3- Test d’activité hypoglycémiante

Ce test permet de suivre les propriétés hypoglycémiantes des fruits de «voaramontsina» à différents stades de maturation.

a- Préparation des souris avant le test

Des jeunes souris âgées d’environ 3 mois ayant un poids corporel de 24 ± 2 g ont été sélectionnées pour le test. Celles-ci sont acclimatées dans un endroit calme 24h avant le début de l’expérimentation pour éviter toutes perturbations pouvant affecter le métabolisme des individus et fausser les résultats de l’expérience. Les sujets ont été mis à jeun pendant 12 heures, avant l’expérimentation.

b- Test de tolérance aux sucres : glucose et amidon

Ce test consiste à évaluer l’activité hypoglycémiante d’extraits de fruits de «voaramontsina» chez des souris normoglycémiques chez lesquelles l’hyperglycémie a été provoquée par administration de glucose ou d’amidon.

 Protocole expérimental Les souris sont réparties en cinq groupes dont quatre sont traités avec les extraits de fruits et le dernier correspond au témoin. Chaque groupe est constitué de quatre souris et l’expérience a été réalisée deux fois indépendamment. Chez les souris traitées, 100 ou 500 mg/kg (extraits/souris) d’extraits de fruits repris dans 0,25 ml d’eau distillée ont été administrés par voie orale selon que l’hyperglycémie ait été provoquée par du glucose ou par l’amidon.

Mémoire de DEA Miora RARINIRINA 23

Matériels et méthodes

Chez les souris témoins, aucune administration d’extraits de fruits n’a été effectuée. L’hyperglycémie est provoquée par gavage de glucose d’une dose de 2 g/kg ou d’amidon de 5 g/kg dissoute dans 0,25 ml d’eau distillée pour tous les groupes de souris. Le gavage de glucose ou d’amidon a été effectué 1 h après administration d’extraits de fruits pour les souris traitées.

 Mesure de la glycémie

La première mesure correspondant à la glycémie de base a été effectuée au temps t o, (temps avant administration de produits). Puis d’autres mesures ont été faites 15, 30, 60 et 120 mn après gavage de glucose ou d’amidon. Une goutte de sang est prise au niveau de la veine caudale de l’animal. La glycémie est mesurée à l’aide d’un glucomètre éléctronique Sensocard ® (77 Electronika Kft., Budapest, Hongrie) et est exprimée en mg de glucose par dl de sang.

 Fonctionnement du glucomètre Le taux de glucose sanguin est déterminé à l’aide d’une bandelette qui comprend une zone réactive sur laquelle une goutte de sang est déposée. Cette zone réactive contient une enzyme, le glucose oxydase-peroxydase, qui réagit avec le β-D-glucose en déclenchant son oxydation. L’intensité des électrons ainsi formés est mesurée par le lecteur. Le résultat assimilera les valeurs totales de glucose dans le capillaire sanguin. (Razafindrakoto, 2009)

 Baisse de la glycémie L’activité hypoglycémiante est évaluée à partir de la baisse de la glycémie obtenue chez les souris traitées par rapport à la glycémie des souris témoins suivant la formule :

G Témoin G Traité Baisse % 100 G Témoin avec G Témoin : Glycémie des souris témoins G Traité : Glycémie des souris traitées

La baisse de la glycémie par rapport au témoin est déterminée à 15, 30, 60 et 120 mn après administration de glucose ou d’amidon.

Mémoire de DEA Miora RARINIRINA 24

RESULTATS

Discussions

RESULTATS

I- Caractéristiques morphométriques des fruits de «voaramontsina»

I.1- Poids Au cours du développement des fruits de «voaramontsina», nous constatons une augmentation progressive de 0,25 à 0,52 g jusqu’à la fin de la maturation soit une hausse de 108% (Figure 3). Cette augmentation est forte entre le stade I (fruit vert) et II (fruit rose) et devient peu significative jusqu’au stade IV (fruit pourpre).

0,6 c c 0,5 b

0,4

0,3 a

0,2

0,1 PMF moyen moyen PMFdufruit (g)

0,0 I II III IV Stades Figure 3: Variation du poids frais (PMF) des fruits de «voaramontsina» à différents stades de

maturation. (n=30 ; Barre = IC α=5% ). Les poids moyens surmontés de la même lettre ne sont pas

significativement différentes au seuil de probabilité α=0,05. I.2- Diamètre Pendant leur maturation, le diamètre des fruits de «voaramontsina» augmente significativement de 0,56 (stade 1) à 0,82 cm (stade III) puis devient stable (Figure 4).

1,0 c c 0,8 b a 0,6

0,4

0,2 Diamètre Diamètre moyen (cm)

0,0 I II III IV Stades

Figure 4: Evolution du diamètre des fruits de «voaramontsina» à différents stades de maturation.

(n=30 ; Barre = IC α=5% ).Les diamètres moyens surmontés de la même lettre ne sont pas significativement différentes au seuil de probabilité α=0,05. Mémoire de DEA Miora RARINIRINA 25

Discussions

II- Caractéristiques physico-chimiques du fruit de «voaramontsina»

II.1- Teneur en eau (TE ) La teneur en eau croît significativement de 70 à 85% du stade I au stade III puis diminue légèrement (83%) pour le stade IV (Figure 5).

100 c d b 80 a

60

40

TE myenne myenne TE dufruit (%) 20

0 I II III IV Stades

Figure 5: Variation de la teneur en eau (TE) des fruits de «voaramontsina» à différents stades de

maturation. (n=30 ; Barre = IC α=5% ). Les teneurs en eau moyennes surmontées de la même lettre ne sont pas significativement différentes au seuil de probabilité α=0,05.

II.2- Acidité titrable L’acidité exprimée en équivalent gramme d’acide malique de fruits diminue progressivement de 0,3 à 0,13 g d’acide malique par 100 g de fruits frais, au cours de la maturation (Figure 6).

0,4

0,3

0,2

0,1 malique/100g de fruit)

Acidité Acidité moyenne (gramme d'acide 0,0 I II III IV Stades

Figure 6: Variation de l’acidité des fruits de «voaramontsina» à différents stades de maturation

(n=3; Barre=IC α=5% ).

Mémoire de DEA Miora RARINIRINA 26

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II.3- Total de solides solubles (TSS%) Le TSS des fruits augmente constamment au cours de la maturation allant du stade I (2,7%) au stade IV (11%) (Figure 7).

12

10

8

6

4 TSS moyen moyen TSS (%)

2

0

I II III IV Stades Figure 7: Variation du total de solides solubles (TSS) dans les fruits de «voaramontsina» à

différents stades de maturation (n=3; Barre=IC α=5% ).

II.4- Teneurs en chlorophylles et en anthocyanes totaux La teneur en chlorophylles diminue fortement de 0,41 à 0,21 mg/g entre les stades I et III puis continue progressivement sa chute vers le stade IV (Figure 8). Inversement, la teneur en anthocyanes s’élève brusquement de 0,19 à 0,53 mg/g entre les stades I et III puis reste stable jusqu’à la fin de la maturation (0,56 mg/g)

Chlorophylle totale Anthocyane (équivalent malvidine) 0,6

0,5

0,4

0,3

0,2 Teneur(mg/g)

0,1

0,0 I II III IV Stades Figure 8 : Variation des teneurs en chlorophylles et en anthocyanes totaux dans les fruits de «voaramontsina» à différents stades de maturation.

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II.5- Rendement en extraits méthanoliques Nous constatons que le rendement des extraits méthanoliques obtenus (g d’extraits/g de fruits secs) augmente au fur et à mesure de la maturation des fruits. Cette valeur varie de 16,52% pour les fruits de stade I à 30,55% pour les fruits de stade IV (Tableau 1).

Tableau 1: Variation du rendement en extrait méthanolique des fruits de «voaramontsina» à différents stades de maturation Types d'extrait Rendement (%) stade I 16,52 stade II 19,49 stade III 24,13 stade IV 30,55

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III- Activités biologiques

III.1- Propriété antioxydante La figure ci-dessous (Figure 9) montre la variation de l’activité antioxydante des différents extraits obtenus au cours de la maturation des fruits ; l’acide ascorbique et l’acide gallique ont été utilisés comme produits de référence. Les extraits de fruits de stade I et II présentent des activités antioxydantes très comparables qui sont supérieures à celles des fruits de stade III et IV (Figure 9). En effet, les valeurs CE 50 calculées indiquent que la capacité antioxydante des fruits diminue avec leur état de maturation : l’CE 50 est de 9,5 µg/ml pour les fruits de stade I mais de 72,9 µg/ml pour les fruits de stade IV (Tableau 2). Les CE 50 déterminées pour les antioxydants de référence, acide ascorbique et acide gallique, sont de 3,26 et 2,76 µg/ml, respectivement.

100

90

80

70 Acide ascorbique

60 Acide gallique

50 Stade I

40 Stade II

30 Stade III

20 Stade IV

10 Piégeage des radicaux de DPPH (%) 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Concentration ( µg/ml)

Figure 9 : Activités antioxydantes des extraits méthanoliques des différents stades de fruits de «voaramontsina» au cours de la maturation comparés aux acides ascorbique et gallique.

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Tableau 2 : Valeurs d’CE 50 des extraits méthanoliques des différents stades de fruits de «voaramontsina» et des produits de référence, obtenues à partir de leurs propriétés antioxydantes.

CE 50 (µg /ml) Acide ascorbique 3,26 Acide gallique 2,76 Stade I 9,52 Stade II 10,5 Stade III 67,9 Stade IV 72,9

III.2- Activité hypoglycémiante des fruits de «voaramontsina» L’efficacité des traitements avec les extraits de fruits est évaluée par rapport à la glycémie des souris témoins (non traitées).

Test de tolérance au glucose Aucun des extraits de fruits administrés ne présente une activité hypoglycémiante significative sur les souris dont l’hyperglycémie a été provoquée par du glucose.

Test de tolérance à l’amidon Le test de tolérance à l’hyperglycémie induite par l’amidon chez la souris montre une variation de l’activité hypoglycémiante des fruits en fonction de leur stade de maturation. Dans tous les traitements, le taux maximal de glycémie est observé 15 à 20 mn après administration d’amidon. A cet instant, les souris ayant reçu l’extrait de fruits de stade II présentent une baisse de glycémie significative de 37,2% (P=0,029) par rapport aux témoins (tableau 4). Au bout de 60 mn, les extraits de fruits de stade I, II et III présentent tous des activités hypoglycémiantes significatives (P=0,009) qui persistent encore au bout de 120 mn (P=0,004) alors que les souris témoins n’atteignent pas encore leur glycémie basale.

Mémoire de DEA Miora RARINIRINA 30

Discussions

350

300

250

200 témoin stade I 150 stade II

Glycémie Glycémie (mg/dl) stade III 100 stade IV

50

0 0 15 30 45 60 75 90 105 120 Temps (mn)

Figure 10 : Effet des extraits méthanoliques (100 mg/kg) des différents stades de fruits de «voaramontsina» sur l’hyperglycémie provoquée par le glucose (2 g/kg) chez la souris non diabétique. Les barres représentent l’écart-type réduit (n=8).

250

200 * 150 ** * témoin stade I 100 ** stade II

Glycémie( Glycémie( mg/dl) stade III stade IV 50

0 0 15 30 45 60 75 90 105 120 Temps (mn)

Figure 11 : Effet des extraits méthanoliques (500 mg/kg) des différents stades de fruits de «voaramontsina» sur l’hyperglycémie provoquée par l’amidon (5 g/kg) chez la souris non diabétique. Les barres représentent l’écart-type réduit (n=8). * indique P<0,05 ; ** indique P<0,01

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DISCUSSIONS

Discussions

DISCUSSIONS

 Physiologie de la maturation des fruits de «voaramontsina»

Le mûrissement des fruits de «voaramontsina» passent par quatre stades de développement allant du vert (stade I) au pourpre (stade IV) selon la classification retenue par Çelik et al. (2008) chez Vaccinium macrocarpon.

Au cours de leur maturation, une forte augmentation du poids frais et du diamètre des fruits de «voaramontsina» est constatée entre le passage des fruits verts aux fruits rouges atteignant la taille finale. Cette augmentation de la taille et du poids des fruits devient moins prononcée quand les fruits ont acquis une couleur rouge pourpre (stade IV). Çelik et al. (2008) ont observé la même tendance d’évolution du poids des fruits, allant de 67,3 pour les fruits verts à 141,8 g/100 baies pour les fruits pourpres, chez Vaccinium macrocarpon . La croissance des fruits est généralement caractérisée par une évolution du poids et du volume suivant une courbe à double sigmoïde qui s’effectue en trois phases. Ce modèle de croissance a été rapporté dans le cas d’autres fruits charnus tels que le raisin (Coombe, 1992), l’olive (Inglese et al. , 1996), le goyave (Mercado-Silva et al. , 1998), la myrte (Fadda et Mulas, 2010). Cette dissemblance relative à l’allure des courbes de croissance de «voaramontsina» par rapport aux autres fruits viendrait de l’omission des stades précoces de la maturation précédant le stade I et des stades intermédiaires entre les quatre stades préalablement définis.

Cette augmentation importante du poids frais du fruit de «voaramontsina» est accompagnée d’un accroissement progressif de la teneur en eau au cours de la maturation de «voaramontsina». Selon Conde et al. (2007), la croissance volumique du fruit est principalement le résultat de l'accumulation d'eau, et par conséquent l'entretien de la croissance du fruit exige la coordination entre le transport de l'eau et de corps dissous, par le tissu vasculaire et au niveau des cellules de la pulpe. L’eau agit comme dissolvant des composés chimiques volatils et fixes. Chez le raisin, l'augmentation rapide du poids de baie pendant le stade post-véraison est attribuée à l’agrandissement des cellules du péricarpe et aux flux de composés dissous, en particulier de sucres et de l’eau, vers la baie de raisin principalement par le phloème (Rogiers et al. , 2006).

La diminution de la teneur en eau chez les fruits pourpres serait probablement due à un faible flux ou à une augmentation de la transpiration du fruit.

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Discussions

Selon Giovannoni (2001), la maturation est un phénomène irréversible, coordonnée, génétiquement programmée et impliquant une série de changements biochimiques, physiologiques et organoleptiques. Ce processus est influencé par l’éthylène, le CO 2 atmosphérique, la température et l’oxygène. L’amidon, les pectines, la cellulose et les hémicellulose constituent les classes majeures de polysaccharides de la paroi cellulaire qui subissent des modifications lors de la maturation du fruit. Ces changements concernent essentiellement l’accumulation de pigments rouges d’anthocyanes, la production de composés volatils et l’accumulation de sucres (Aharoni et al., 2000).

L’acidité titrable du fruit de «voaramontsina» diminue jusqu'à l’achèvement de sa maturation contrairement au TSS (total de solides solubles) qui augmente progressivement. Cette augmentation est due à l’élévation de la teneur en sucres par dégradation de l'amidon sous l'action de l'amylase, et/ou par transformation des acides organiques en sucres par décarboxylation ; ce qui explique la relation inverse entre la teneur en sucres et celle en acides au cours de la maturation du fruit de «voaramontsina». L’acidité, exprimée en équivalent acide malique, varie de 0,3 à 0,13 g/100 g de fruit frais, soit 1300 mg/kg chez les fruits pourpres pour lesquels la maturation est la plus avancée. Cette valeur est faible par rapport aux autres fruits du genre Vaccinium rapportés dans la littérature. Au contraire, l’acidité totale augmente significativement au cours de la maturation grâce à une importante contribution de l’acide citrique chez Vaccinium macrocarpon , (Çelik et al. , 2008).

Allant du stade vert au pourpre, la TSS des différents stades de maturation des fruits de «voaramontsina» varie de 2,7 à 11%. La valeur de la TSS des fruits de stade IV (11%) est relativement élevée par rapport à celle décrite pour Vaccinium meridionale (7%) (Garzón et al. , 2010), comparable à celle de V. myrtillus (11,2%) tandis que légèrement plus faible par rapport à celle de V. corymbosum (12,4%) (Giovanelli et Buratti, 2009).

La couleur du fruit provient des pigments localisés dans le cytoplasme au niveau des vacuoles des cellules de l’épiderme et du parenchyme de la pulpe.

La teneur en anthocyanes dans les fruits de «voaramontsina» varie de 0,19 à 0,56 mg/g au cours de la maturation, soient 190 à 560 mg/kg. Cette valeur est assez élevée par rapport aux teneurs en anthocyanes rapportées chez le genre Vaccinium dans la littérature. Chez Vaccinium macrocarpon , cette teneur exprimée en équivalent cyanidin-3-galactoside varie de 0,8 à 111 mg/kg, au cours de la maturation, (Çelik et al. , 2008).

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Discussions

Généralement, le taux de matériels colorés pourrait dépendre de la variété, de la région source ou des conditions climatiques (www.crcv.com.au). Pendant la maturation, la coloration des fruits de «voaramontsina» change du vert au pourpre après avoir passé par différentes pigmentations intermédiaires. Cette variation de couleurs se déroule simultanément avec la diminution du taux de chlorophylles, et l’augmentation de la synthèse d’anthocyanes. En fait, ce changement implique la transformation des chloroplastes en chromoplastes mais aussi la dégradation des chlorophylles par la chlorophyllase sous le contrôle de l'éthylène (Guis et Botondi, 1997). La coloration rouge des fruits est due aux anthocyanes. La production d’anthocyanes dans les tissus des fruits est bien programmée pendant son développement. Chez Vaccinium myrtillus , Jaakola et al. (2002) ont démontré qu’il y a une corrélation entre l'accumulation d'anthocyanes et l'expression des gènes impliqués dans la synthèse de flavonoïdes pendant la maturation des baies. Durant les premières phases du développement de la baie, les procyanidines et la quercétine sont les principaux flavonoïdes, mais leurs taux diminuent jusqu’à une proportion indétectable avant la synthèse d’anthocyanes au cours du mûrissement. En effet, la teneur en anthocyanes est devenue très importante et elles constituent les flavonoïdes principaux de la baie mûre. Selon Vvedenskaya et Vorsa (2004), les concentrations très élevées des proanthocyanidines et des flavonols trouvés dans les ovaires des fleurs de Vaccinium macrocarpon et dans les premières phases du développement de ses fruits suggèrent que ces flavonoïdes pourraient servir de protection contre les champignons qui infectent les canneberges. D’après Jungmin et al. (2008), le pélargonidine, le cyanidine, le péonidine, le delphinidine, le pétunidine et le malvidine sont les six anthocyanidines les plus courants trouvés dans la nature. Pour le genre Vaccinium , delphinidine, pétunidine, cyanidine et malvidine sont les principaux pigments anthocyaniques responsables de la coloration des fruits, bien que leur taux varie d’une espèce à une autre (Lohachoompol et al. , 2008). Martineau et al. (2006), qui ont effectué une étude sur les différentes parties de la plante Vaccinium angustifolium , ont affirmé que seul le fruit contient des anthocyanes.

Les études sur les suivis de la variation de la teneur en anthocyanes au cours de la maturation des fruits du genre Vaccinium sont très rares. La majorité des recherches est souvent concentrée sur les fruits mûrs, directement consommés ou utilisés dans l’industrie alimentaire (jus de fruits, confiture ou autres produits dérivés).

Mémoire de DEA Miora RARINIRINA 34

Discussions

 Activité antioxydante des fruits au cours de la maturation

Dans la présente étude, le suivi de la propriété antioxydante des fruits de «voaramontsina» au cours de leur maturation a été effectué en évaluant la capacité des extraits de fruits à piéger les radicaux libres du DPPH. La valeur CE 50 est inversement proportionnelle à l’activité antioxydante c'est-à-dire qu’une faible CE 50 indique un pouvoir antioxydant élevé. L’activité antioxydante des fruits de «voaramontsina» diminue avec leur état de mûrissement. Les propriétés médicinales et les activités biologiques des plantes sont liées à leur profil chimique. Ainsi, cette diminution de la potentialité antioxydante des fruits au cours de la maturation serait liée aux modifications qualitative et quantitative des composés chimiques contenus dans les lots de fruits.

Chez Vaccinium macrocarpon également, l’activité antioxydante déterminée grâce aux méthodes FRAP et TEAC est significativement élevée chez les fruits verts par rapport aux fruits mûrs (Çelik et al. , 2008). Selon Sun et al. (2002), l’activité antioxydante des fruits de V. macrocarpon est due aux anthocyanes et à d’autres composés phénoliques.

Les anthocyanes sont les pigments les plus communs des fruits rouge-pourpre, et ont été intensivement étudiés pour leur potentialité antioxydante. Or, chez les fruits de «voaramontsina», le taux d’anthocyanes augmente au cours de la maturation, contrairement à la cinétique de leur activité antioxydante. Cela pourrait être dû à la différence de type d’anthocyanes contenus dans la baie. En effet, parmi les espèces de Vaccinium riches en anthocyanes et connues pour leurs activités antioxydantes figure Vaccinium myrtillus. Pour cette espèce, les fruits contiennent plus de 20 % d’anthocyanidines, dont la cyanidine, la delphinidine, la pétunidine, la péonidine et la malvidine. Celles-ci se lient à des sucres tels que le glucose, le galactose ou l’arabinose. Les fortes potentialités antioxydantes de ces fruits sont principalement dues à la delphinidine, la cyanidine et la malvidine (Matsunaga et al. , 2010). L’espèce Vaccinium angustifolium , consommée dans toutes les régions Nord-Est de l’Amérique, possède également une propriété antioxydante bien documentée (Wang et Jiao, 2000; Kay et Holub, 2002; Rimando et al. , 2004). Les fruits sont riches en anthocyanes principalement du glycoside de la malvidine (Harris et al. , 2007). Dans les fruits de Vaccinium myrtillus et de Vaccinium angustifolium , les anthocyanes sont plus abondants au niveau de la peau qu’au niveau de la pulpe. La quercétine constitue le flavonol prédominant des fruits entiers des deux espèces tandis que la myricétine est plus abondante au niveau de leur peau (Riihinen et al. , 2008). Chez Vaccinium vitis-idaea , les activités antioxydantes des

Mémoire de DEA Miora RARINIRINA 35

Discussions flavonoïdes sont plus efficaces que celles des acides phénoliques comme l’acide para - coumarique (Rosch et al. , 2003).

En outre, l’activité antioxydante pourrait être influencée par la teneur en composés phénoliques non-anthocyaniques. A titre d’exemple, une contribution des composés phénoliques autres que les anthocyanes à l'activité antioxydante est mise en évidence chez Vaccinium myrtillus (Connor et al., 2002) . Chez cette espèce, la myricétine ainsi que d’autres composés phénoliques, est synthétisée pendant les dernières étapes de murissement des fruits, conférant aux fruit mûrs une forte activité antioxydante (Jaakola et al. , 2004). Par ailleurs, il est rapporté qu’une corrélation positive significative existe entre l’activité antioxydante et le taux d’anthocyanes totaux ou de phénoliques totaux dans les différentes stades de maturation de fruits ou de différentes variétés de Vaccinium (Prior et al. , 1998). Simonetti et al. (1997) ont également montré que les activités antioxydantes des 13 vins italiens typiques sont fortement corrélées avec leurs teneurs en substances phénoliques et en flavanols. Enfin, chez Vaccinium corymbosum , les différences observées sur les teneurs en composés phénoliques totaux entre les cultivars et les différentes phases de mûrissement de fruits sont conformes aux différences enregistrées au niveau de leurs activités antioxydantes (Castrejón et al. , 2008).

La CE 50 des fruits vert de «voaramontsina» (stade I, CE 50 =9,52 µg/ml) montre une capacité antioxydante environ deux fois moins efficace que celle de la Cerise de la Cayenne (Eugenia uniflora ) (CE 50 =4 µg/ml) (Einbond et al. , 2004). Parmi les fruits de 12 espèces d’Amérique centrale étudiées par Einbond et al. (2004), cet Eugenia uniflora présentant la plus forte capacité antioxydante (CE 50 =4 µg/ml) est la seule espèce contenant la delphinidin-3-glucoside (Annexe 1). Kähkönen et Heinonen (2003) ont montré que les monoglucosides de la cyanidine et de la delphinidine ainsi que l'acide chlorogénique et la quercétine possèdent une activité antioxydante élevée et que cette activité est comparable à celle des produits antioxydants connus tels que l’ α-tocophérol et le Trolox.

Dans le jus de framboise (Rubus idaeus ), Deighton et al. (2000) ont trouvé une forte corrélation entre la capacité antioxydante et les phénoliques totaux, tandis que la teneur en anthocyanes a une faible influence sur cette activité et que l'acide ascorbique y contribue peu. D’après Fu et al., (2009), la (+)-catechine est le composé phénolique le plus abondant dans les fleurs de l'hémérocalle ( Hemerocallis sitrina ) constituant environ 74% de leurs composés phénoliques totaux. Une corrélation linéaire existe entre le taux de ce composé et les propriétés antioxydantes de ces fleurs, indiquant que (+)-catechine pourrait être le principal

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Discussions responsable de la propriété antioxydante des extraits de fleurs. En plus de celà, ces auteurs n’ont trouvé aucune corrélation entre les teneurs en rutine, quercétine, acide chlorogénique et l’activité antioxydante des extraits de fleurs.

 Activité hypoglycémiante des fruits au cours de la maturation

Lors du test de tolérance au glucose, les différents stades de fruits de «voaramontsina» n’ont présenté aucune activité hypoglycémiante significative. Ainsi, les composés extraits des fruits pourraient ne pas avoir la capacité de stimuler la sécrétion d’une quantité suffisante d’insuline permettant d’abaisser le taux de glycémie. Le glucose est rapidement absorbé ce que démontre le pic de glycémie 15 mn après son administration chez toutes les souris, témoins et traitées. En plus, l’inefficacité des extraits méthanoliques de fruits à abaisser la glycémie provoquée par administration du glucose pourrait provenir de la faible absorption des composés anthocyaniques. En effet, Grace et al. (2009) ont élaboré une recette pour permettre une meilleure absorption des anthocyanes de Vaccinium angustifolium . Ils ont trouvé que les extraits purs d’anthocyanes n’étaient pas hypoglycémiants si administrés sans Labrasol ® (émulsifiant), démontrant la propriété de ce produit dans l’amélioration de la disponibilité biologique de la préparation administrée. Les traitements par gavage (300 mg/kg) d’anthocyanes purs (delphinidin-3-O-glucoside et malvidin-3-O-glucoside) formulé avec du Labrasol ® sur des souris ont montré que, la malvidin-3-O-glucoside est significativement hypoglycémiante (baisse de 34%) alors que la delphinidin-3-O-glucoside ne l’est pas.

Toutefois, une baisse significative de la glycémie est produite 15 mn après absorption d’amidon chez les souris ayant reçu les extraits des trois premiers stades de fruits de «voaramontsina». La même tendance a été observée dans les propriétés antioxydantes des fruits. Les composés responsables des activités pourraient appartenir à la même famille de molécules, abondants au début puis se raréfient en fin de maturation.

Certains composés phénoliques, y compris les flavonoïdes, sont non seulement des antioxydants efficaces mais possèdent également des propriétés additionnelles sur la prévention de quelques complications diabétiques, y compris la capacité d'empêcher la formation des produits terminaux de glycation (PTG), (Wu et Yen, 2005). Chez les fruits de Vaccinium vitis-idaea , l’activité inhibitrice de la formation de PTG des produits phénoliques tels quel le glycoside de la quercétine (flavonol), la cyanidin-3-galactoside (anthocyane), coïncide avec la forte activité antioxydante de ces composés (Beaulieu et al. , 2010).

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Discussions

La baisse de glycémie observée chez les souris gavées à l’amidon pourrait provenir d’une activité inhibitrice de α-glucosidase des extraits de fruits. En effet, les glucides absorbés sont dégradés par les amylases salivaire et pancréatique en dissacharides (saccharose, lactose, maltose) puis par les α-glucosidases (maltase, lactase, saccharase ou invertase) en monosaccharides. Seuls les monosaccharides peuvent franchir la barrière intestinale. L’amidon est hydrolysé en monosaccharides par l’ α-glucosidase qui sont alors absorbés dans le sang pour augmenter la teneur en sucres sanguin. Les inhibiteurs de l’ α-glucosidase agissent au niveau du dernier stade de la digestion des sucres. Ceux-ci ne pouvant être absorbés, continuent leur périple dans l'intestin et subissent la fermentation bactérienne en acides gras volatiles ou sont éliminés dans les selles (www.about.com). Les inhibiteurs de l’ α- glucosidase pourraient rallonger la durée de l'absorption des sucres et maintenir stable la concentrations du glucose sanguin (Ye et al. , 2002).

Une activité prometteuse contre l’ α-amylase et l’ α-glucosidase est également observée chez les fruits verts du Capsicium annum . A ce stade, le fruit est caractérisé par une teneur élevée en phytols et en différents acides gras, tels que l’ester méthylée de l’acide 8,11- octadecadienoique, la linolénate de methyle, la palmitate de methyle, la palmitoleate de methyle, et l’acide palmitique. Par ailleurs, les fruits rouge matures, caractérisés par une faible teneur en composés polyphénoliques totaux, sont incapables d’inhiber l’ α-amylase (Loizzo et al. , 2008). Selon les auteurs, les fruits verts possèdent une forte teneur en lutéoline, un composé connu pour sa forte propriété inhibitrice de l’ α-amylase (IC 50 =0,17 mM) (Conforti et al. , 2007).

Chez le rotra ( Syzygium cumini ), l’activité optimale est constatée dans les graines complètement mûres. En effet, une forte activité hypoglycémiante est obtenue avec les poudres de graines des fruits mûrs récoltées au cours de la 12 ème semaine de leur maturation, préparées selon le procédé breveté du Madeglucyl ®. La baisse est de 44,9, 30,2 et 20% après, respectivement, 15, 30 et 60 mn d’administration de glucose. De même, un effet hypoglycémiant non significatif est constaté après traitement des souris avec des poudres de graines récoltées durant les semaines 6 et 9, (constituées de 50% de fruits mûrs et de 50% de fruits verts). L’administration de poudre de graines de fruits verts n’a aucun effet sur la glycémie (Razafindrakoto, 2009)

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Discussions

Chez Vaccinium angustifolium , l’extrait éthanolique de fruits riche en acide chlorogénique agit positivement sur la prolifération des cellules β du pancréas. Cet effet pourrait améliorer l’activité antidiabétique potentielle du fruit en retardant la détérioration des cellules β du pancréas chez les diabétiques de type 2 (Martineau et al. , 2006).

Il est intéressant de signaler que les classes de composés phénoliques identifiées chez le genre Vaccinium : acide chlorogénique, quercétine, les procyanidines et anthocyanines présentent toutes un potentiel antidiabétique démontré in vitro et in vivo (Jayaprakasam et al. , 2005).

Nos résultats montrent que l’activité hypoglycémiante des extraits de «voaramontsina» persiste 2h après administration d’amidon. Or, une approche thérapeutique intéressante pour le traitement du diabète de type 2 est l’abaissement de l’hyperglycémie postprandiale (c’est-à- dire augmentation immédiate du taux de glycémie après un repas). Ceci est réalisé en retardant l’absorption du glucose par l'inhibition des enzymes tels l’ α-glucosidase (Wachters- Hagedoorn et al. , 2007).

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CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES

Conclusions et Perspectives

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES

En conclusion, la couleur de la peau du fruit de «voaramontsina», à partir de laquelle quatre stades ont été définis, constitue un bon indicateur des différents stades de maturation. Nos résultats ont montré qu’il existe un lien entre la physiologie de la maturation des fruits et leurs qualités nutritionnelle et médicinale. En effet, ces propriétés varient au cours de la maturation accompagnant les nombreuses modifications biochimiques au niveau du fruit. Les taux en acides, en sucres, en anthocyanes, varient fortement au cours de la maturation des fruits de «voaramontsina». Ces paramètres pourraient être utilisés comme des indicateurs afin d’apprécier rapidement la qualité du fruit. Auparavant, la saveur, la forme et l'aspect étaient les attributs les plus importants des fruits et légumes frais, mais de nos jours les consommateurs sont préoccupés davantage par la sûreté et la valeur nutritive de la nourriture. Les caractéristiques principales liées à la qualité du «voaramontsina» sont la texture, la saveur (les sucres solubles et les acides organiques), les valeurs médicinales (activités antioxydante et hypoglycémiante), la couleur (contenu en anthocyanes) ainsi que le parfum dégagé par les composés volatiles.

Les propriétés antioxydante et hypoglycémiante des fruits non matures sont assez originales. En effet, les composés actifs sont généralement accumulés dans les fruits mûrs. L’accumulation différentielle ou la dégradation progressive de ces composés actifs dans le fruit pourrait faciliter grandement leur identification lorsque associée à l’apparition ou la disparition d’une activité biologique. Par conséquent, nous suggérons pour la suite de ce travail de :
confirmer l’activité anti-α-glucosidase des extraits ;
fractionner les extraits afin d’élucider la structure moléculaire de(s) composé(s) responsable(s) de ces activités biologiques ;
tester les effets toxiques potentiels, puisque quelques polyphénols peuvent être nocifs à l’organisme ;
sélectionner les meilleures provenances de «voaramontsina» et étudier la faisabilité d’une culture commerciale.

Les fruits de «voaramontsina» sont méconnus de la population urbaine de Madagascar et peu appréciés des populations rurales. Ce comportement assez indifférent viendrait du fait que «voaramontsina» n’est qu’un fruit accessoire dans son habitat naturel. L’absence de données ethnobotaniques sur son utilisation confirme l’ignorance de ses propriétés médicinales et

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Conclusions et Perspectives nutritionnelles. Pour cela, la sensibilisation de la communauté locale à la mise en culture de ces arbustes serait envisageable tout en vulgarisant les vertus apportées par les fruits afin de renforcer la consommation et/ou la mise sur le marché.

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REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

Références bibliographiques

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

Aharoni, A., Keizer, L.C.P., Bouwmeester, H.J., Sun, Z., et Alvarez, H.M., 2000. Identification of the SAAT gene involved in strawberry flavor biogenesis by use of DNA microarrays. Plant Cell. 12:647–61

Arnon, D.I., 1949 . Copper enzymes in isolated chloroplasts. Polyphenoloxidase in Beta vulgaris . Plant Physiol . 24: 1–15

Beaulieu, L., Harris, C.S., Saleem, A., Cuerrier, A., Haddad, P.S., Martineau, L.C., Bennett, S.A.L. et Arnason, J.T., 2010. Inhibitory effect of the Cree traditional medicine wiishichimanaanh ( Vaccinium vitis-idaea ) on advanced glycation endproduct formation: Identification of active principles. Phytother. Res. 24: 741–747

Brady, C.J., 1987 . Fruit ripening. Annu. Rev. Plant Physiol. 38: 155–178

Bremer, K., Bremer, B. et Thulin, M., 2003. Introduction to phylogeny and systematics of flowering plants. Symb. Bot. Ups . 33 (2). 100p

Cabrita, L., Frùystein, N. et Andersen, M., 2000. Anthocyanin trisaccharides in blue berries of Vaccinium padifolium . Food Chem . 69: 33–36

Castrejón, A.D.R., Eichholz, I., Rohn, S., Kroh, L. W. et Huyskens-Keil, S. 2008. Phenolic profile and antioxidant activity of highbush blueberry ( Vaccinium corymbosum L.) during fruit maturation and ripening. Food Chem . 109 : 564–572

Çelik, H., Özgen, M., Serçe, S. et Kaya, C., 2008. Phytochemical accumulation and antioxydant capacity at four maturity stages of cranberry fruit. Sci. Hort . 117: 345–348

Chambers, B. et Camire, M., 2003. Can cranberry supplementation benefit adults with type 2 diabetes? Diabetes Care . 26: 2695–2696

Conde, C., Silva, P., Fontes, N., Dias, A.C.P., Tavares, R.M., Sousa, M.J., Agasse, A., Delrot, S. et Gerós, H., 2007. Biochemical changes throughout grape berry development and fruit and wine quality. Global Sc. Books Food 1(1): 1–22

Conforti, F., Statti, G.A. et Menichini, F., 2007. Chemical and biological variability of hot pepper fruits ( Capsicum annuum var. acuminatum L.) in relation to maturity stage. Food Chem. 102: 1096–1104

Connor, A.M., Luby, J.J., Hancock, J.F., Berkheimer, S. et Hanson, E.J., 2002. Changes in fruit antioxidant activity among blueberry cultivars during cold-temperature storage. J. Agric. Food Chem. 50: 893–898

Coombe, B.G., 1992. Research on development and ripening of the grape berry. Am. J. Oenol. Vitic. 43:101–110

Mémoire de DEA Miora RARINIRINA 42

Références bibliographiques

Crozier, A. Clifford, M.N. et Ashihara, H., 2006. Plant secondary metabolites : Occurrence, structure and role in the human diet. Blackwell Publishing Ltd. (ISBN 1-4051-2509-8). 371p

Deighton, N., Brennan, R., Finn, C. et Davies, H. V., 2000. Antioxidant properties of domesticated and wild Rubus species. J. Sci. Food Agric . 80: 1307–1313

Dugoua, J., Seely, D., Perri, D., Mills, E. et Koren, G., 2008 . Safety and efficacy of cranberry ( Vaccinium macrocarpon ) during pregnancy and lactation . Can. J. Clin. Pharm. 15(1): e80–e86

Einbond, L.S., Reynertsona, K.A., Luo, X., Basile, M.J. et Kennelly, E.J., 2004. Anthocyanin antioxidants from edible fruits. Food Chem . 84: 23–28

Fadda, A. et Mulas, M., 2010. Chemical changes during myrtle ( Myrtus communis L .) fruit development and ripening. Sci. Hort. . 125(3): 477–485

Fu, M., He, Z., Zhao, Y., Yang, J. et Mao, L., 2009. Antioxidant properties and involved compounds of daylily flowers in relation to maturity. Food Chem . 114: 1192–1197

Fukumoto, L.R. et Mazza, G., 2000. Assessing antioxidant and prooxidant activities of phenolic compounds . J. Agric. Food Chem . 48: 3597–3604

Garzón, G.A., Narváez, C.E., Riedl, K.M. et Schwartz, S.J., 2010 . Chemical composition, anthocyanins, non-anthocyanin phenolics and antioxidant activity of wild bilberry ( Vaccinium meridionale Swartz ) from Colombia. Food Chem . 122: 980–986

Gaudillere, J.P., 2006 . Le déclenchement de la véraison. UMR Œnol. Ampélologie, INRA- Univ. Bordeaux2. 25p

Giovanelli, G. et Buratti, S., 2009 . Comparison of polyphenolic composition and antioxidant activity of wild Italian blueberries and some cultivated varieties. Food Chem . 112: 903–908

Giovannoni, J., 2001. Molecular biology of fruit maturation and ripening. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol . 52:725–749

Gomez, C., 2009 . Etude des mécanismes de stockage des anthocyanes dans la baie de raisin caractérisation fonctionnelle des gènes impliqués dans ces mécanismes. Thèse, Ecole Doctorale: Sciences des Procédés – Sciences des Aliments. Montpellier Supagro. 202p

Grace, M.H., Ribnicky, D.M., Kuhn, P., Poulev, A., Logendra, S., Yousef, G.G., Raskin, I. et Lila, M.A., 2009. Hypoglycemic activity of a novel anthocyanin-rich formulation from lowbush blueberry, Vaccinium angustifolium Aiton. Phytomedicine. 16: 406–415

Guis, M. et Botondi, R., 1997. Ripening-associated biochemical traits of Cantaloupe charentais melons expressing an antisense ACC oxidase transgene. J. Amer. Soc. Hort. Sci . 122: 748–751

Mémoire de DEA Miora RARINIRINA 43

Références bibliographiques

Haddad, P.S., Depot, M., Settaf, A., Chabli, A. et Cherrah, Y., 2003 . Comparative study on the medicinal plants most recommended by traditional practitioners in Morroco and Canada. J. Herbs Sp. Med. Plants 10: 25–45

Harris, C.S., Burt, A.J., Saleem, A., Le, P.M., Martineau, L.C., Haddad, P.S., Bennett, S.A.L. et Arnason, J.T., 2007 . A Single HPLC-PAD-APCI/MS method for the quantitative comparison of phenolic compounds found in leaf, stem, root and fruit extracts of Vaccinium angustifolium. Phytochem. Anal. 18: 161–169

Heimhuber, B., Herrmann, K., 1990. Benzoe-, Phenylessig-, 3-Phenylpropan- und Zimtsaure sowie Benzoylglucosen in einigen Obst- und Fruchtgemusearten. Deutsche lebensmittel rundschau . 86(7): 205–209

Iland, P.G., Ewart, A., Sitters, J., Markides, A. et Bruer, N., 2000. Technics for chemical analysis and quality monitoring during winemaking. (Patrick Iland, eds), Wine Promotions, Campbelltown, SA

Inglese, P., Barone, E. et Gullo, G., 1996. The effect of complementary irrigation on fruit growth, ripening pattern and oil characteristics of olive ( Olea europaea L. ) cv. Carolea. J. Hort. Sci . 72 (2): 257–263

Jaakola, L., Määttä, K., Pirttilä M.A., Törrönen, R., Kärenlampi, S. et Hohtola, A., 2002. Expression of genes involved in anthocyanin biosynthesis in relation to anthocyanin, proanthocyanidin, and flavonol levels during bilberry fruit development. Plant Physiol . 130: 729–739

Jaakola, L., Riihinen, M.K., Kärenlampi, S. et Hohtola, A., 2004 . Activation of flavonoid biosynthesis by solar radiation in bilberry ( Vaccinium myrtillus L .) leaves. Planta 218: 721– 728

Jayaprakasam, B., Vareed, S.K. et Olson, L.K., 2005 . Insulin secretion by bioactive anthocyanins and anthocyanidins present in fruits. J. Agric. Food Chem. 53: 28–31

Jellin, J.M., Gregory, P.J., Batz, F.et Hitchens, K., 2005. Natural medicines comprehensive database. In : Pharmacist’s Letter/Prescriber’s Letter. Therapeutic Research Faculty, Stockton, CA, p. 2239

Jungmin, L., Christopher, R. et Ronald, E.W., 2008. Correlation of two anthocyanin quantification methods: HPLC and spectrophotometric methods. Food Chem . 110: 782–786

Kähkönen, M. P. et Heinonen, M., 2003. Antioxidant activity of anthocyanins and their aglycons. J. Agric. Food Chem. 51: 628–633

Kapasakalidis, P.G., Rastall, R.A. et Gordon, M.H., 2006. Extraction of polyphenols from processed black currant ( Ribes nigrum L .) residues. J. Agric. Food Chem . 54(11): 4016–4021

Mémoire de DEA Miora RARINIRINA 44

Références bibliographiques

Kay, C.D. et Holub, B.J., 2002. The effect of wild blueberry ( Vaccinium angustifolium ) consumption on postprandial serum antioxidant status in human subjects. Braz. J. Nutr. 88: 389–398

Kerns, B.K., Alexander, S.J. et Bailey, J.D., 2004 . Huckleberry abundance, stand conditions, and use in western Oregon: evaluating the role of forest management. Econ. Bot . 58(4) : 668–678

Krzewi ńska, D., 2004. The benefits of Vaccinium species in ecological production. J. Fruit Ornam. Plant Res. Special ed . 12: 49–61

Leduc, C., Coonishish, J., Haddad, P. et Cuerrier, A., 2006. Plants used by the Cree Nation of Eeyou Istchee (Quebec, Canada) for the treatment of diabetes: A novel approach in quantitative ethnobotany. J. Ethnopharm . 105: 55–63

Lizada, C., 1993. Mango. In : Seymour, G.B., Taylor, J.E. et Tucker, G.A (eds). Biochemistry of fruit ripening: Chapman and Hall, London, UK, 255–271

Lohachoompol, V., Mulholland, M., Srzednicki, G. et Craske, J., 2008. Determination of anthocyanins in various cultivars of highbush and rabbiteye blueberries. Food Chem . 111: 249–254

Loizzo, M.R., Tundis, R., Menichini, F., Statti, G.A. et Menichini, F., 2008. Influence of ripening stage on health benefits properties of Capsicum annuum Var. acuminatum L.: In Vitro studies. J. Med. Food . 11(1):184–189

Mainland, C.M. et Tucker, J.W., 2002. Blueberry health information-Some new mostly review. Acta Hort. 574: 39–43

Martineau, L.C., Couture, A., Spoor, D., Benhaddou-Andaloussi, A., Harris, C., Meddaha, B., Leduc, C., Burt, A., Vuonga, T., Le, P.M., Prentki, M., Bennett, S.A., Arnason, J.T. et Haddad, P.S., 2006 . Anti-diabetic properties of the Canadian lowbush blueberry Vaccinium angustifolium Ait. Phytomedicine. 13: 612–623

Matsunaga, N., Tsuruma, K., Shimazawa, M. Yokota, S. et Hara, H., 2010. Inhibitory actions of bilberry anthocyanidins on angiogenesis. Phytother. Res. 24: S42–S47

Mercado-Silva, E., Bonito-Bautista, P. et Garcia-Velasco, M.L.A., 1998. Fruit development, harvest index and ripening changes of guavas produced in central Mexico. Postharvest Biol. Techn . 13: 143–150

Microsoft ® Encarta ® 2009. © 1993-2008 Microsoft Corporation.

Nathan, D.M., Davidson, M.B. et De Fronzo, R.A., 2007. Impaired fasting glucose and impaired glucose tolerance: implications for care. Diabetes Care . 30:753–759

Nowack, R. et Schmitt, W., 2008. Cranberry juice for prophylaxis of urinary tract infections- Conclusions from clinical experience and research. Phytomedicine. 15: 653–667

Mémoire de DEA Miora RARINIRINA 45

Références bibliographiques

Perrier de la Bathie, H., 1934 . Catalogue des plantes à Madagascar. Ericaceae et Vacciniaceae. Académie Malagasy. Tana, pilot et Cie. 21p

Perrier, C., Mingeau, M., Ameglio, T., Ferreira, M.I. et Jones, H.G., 2000. Effects of water stress on transpiration, radial growth and yield in highbush blueberry. Acta Hort . 537(2): 923–928

Prior, R. L., Cao, G., Martin, A., Sofic, E., McEwen, J. et Brien, C., 1998. Antioxidant capacity as influenced by total phenolic and anthocyanin content, maturity, and variety of Vaccinium species. J. Agric. Food Chem. 46: 2686–2693

Randrianarivony, T.N., 2007. Etude des formations végétales dans les hautes montagnes du nord de Madagascar, cas d’Ambohimirahavavy et de Beampoko, sud–est de Tsaratanana (régions sofia et Sava), autoécologie du genre Vaccinium dans ces massifs. Mém. DEA. Eco. Vég. Univ. Antananarivo. 128p

Razafindrakoto, M.N., 2009 . Variation du potentiel hypoglycemiant des graines de rotra (Syzygium cumini L.) au cours de leur maturation, germination et stockage. Mém. DEA. Physio. Vég. Univ. Antananarivo. 77p

Riihinen, K., Jaakola, L., Kärenlampi, S. et Hohtola, A., 2008. Organ-specific distribution of phenolic compounds in bilberry ( Vaccinium myrtillus ) and ‘northblue’ blueberry (Vaccinium corymbosum x V. angustifolium ). Food Chem .110: 156–160

Rimando, A.M., Kalt, W., Magee, J.B., Dewey, J. et Ballington, J.R., 2004 . Resveratrol, pterostilbene, and piceatannol in Vaccinium berries. J. Agric. Food Chem. 52: 13–19

Rogiers, S.Y., Greer, D.H., Hatfield, J.M., Orchard, B.A. et Keller, M., 2006. Solute transport into Shiraz berries during development and late-ripening shrinkage. Am. J. Enol. Vitic . 57: 73–80

Rosch, D., Bergmann, M., Knorr, D. et Kroh, L.W., 2003. Structure antioxidant efficiency relationships of phenolic compounds and their contribution to the antioxidant activity of sea buckthorn juice. J. Agric. Food Chem 51: 4233–4239

Schreckinger, M.E., Lotton, J., Lila M.A. et Gonzalez de Mejia, E., 2010. Berries from South America: A comprehensive review on chemistry, health potential, and commercialization. J. Med. Food. 13(2): 233–246

Sellappan, S., Akoh, C.C. et Krewer, G., 2002. Phenolic compounds and antioxidant capacity of Georgia-grown blueberries and black-berries. J. Agric. Food Chem . 50: 2432– 2438

Sharma, S.R., Nasir, A., Prabhu, K.M. et Murthy, P.S., 2006 . Antihyperglycemic effect of fruit pulp of Eugenia jambolana in experimental diabetes mellitus. J. Ethnopharm . 104: 367– 373

Mémoire de DEA Miora RARINIRINA 46

Références bibliographiques

Simonetti, P., Pietta, P. et Testolin, G., 1997. Polyphenol content and total antioxidant potential of selected italian wines. J. Agric. Food Chem. 45: 1152–1155

Soares, A.A., Marques de Souza, C.G., Daniel, F.M., Ferrari, G.P., Gomes da Costa, S.M. et Peralta, R. M., 2009. Antioxidant activity and total phenolic content of Agaricus brasiliensis (Agaricus blazei Murril ) in two stages of maturity. Food Chem . 112: 775–781

Song, J., Li, Y., Ge, J., Duan, Y., Sze, S., Tong, Y., Shaw, P., Ng, T., Tsui, K.C., Zhuo, Y., et Zhang, K. Y., 2010. Protective effect of Bilberry ( Vaccinium myrtillus L .) extracts on cultured Human Corneal Limbal Epithelial Cells (HCLEC). Phytother. Res . 24: 520–524

Sun, J., Chu, Y.F., Wu, X. et Liu, R.H., 2002. Antioxidant and antiproliferative activities of common fruits. J. Agric. Food Chem. 50: 7449–7454

Tepe, B., Sokmen, M., Akpulat, H. A. et Sokmen, A., 2005. In vitro antioxidant activities of the methanol extracts of four Helichrysum species from Turkey. Food Chem . 90: 685–689

Van de Laar, F. A., Lucassen, P. L., Akkermans, R. P., Van de Lisdonk, E. H., Rutten, G. E. et Van Weel, C., 2005. α-Glucosidase inhibitors for patients with type 2 diabetes: Results from a Cochrane systematic review and meta-analysis. Diabetes Care , 28(1): 154–163

Vvedenskaya, I.O. et Vorsa, N., 2004 . Flavonoid composition over fruit development and maturation in America cranberry, Vaccinium macrocarpon Ait. Plant Sci . 167: 1043–1054

Wachters-Hagedoorn, R.E., Priebe, M.G. et Heimweg, J.A., 2007. Low-dose acarbose does not delay digestion of starch but reduces its bioavailability. Diabete Med. 24:600–606

Wang, S.Y. et Jiao, H., 2000. Scavenging capacity of berry crops on superoxide radicals, hydrogen peroxide, hydroxyl radicals, and singlet oxygen. J. Agric. Food Chem . 48: 5677– 5684

WHO (World Health Organization Department of Non Communicable Disease Surveillance: Definition, Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus and Its Complications . Geneva: Document Production Services, 1999.)

Wu, C.H. et Yen, G.C., 2005. Inhibitory effect of naturally occurring flavonoids on the formation of advanced glycation endproducts. J. Agric. Food Chem . 53: 3167–3173

Ye, F., Shen, Z. et Xie, M., 2002. Alpha-glucosidase inhibition from a chinese medical herb (Ramulus mori ) in normal and diabetic rats and mice. Phytomedicine. 9: 161–166

Zafra-Stone, S., Yasmin, T., Bagchi, M., Chatterjee, A., Vinson, J.A. et Bagchi, D., 2007. Berry anthocyanins as novel antioxidants in human health and disease prevention. Mol. Nutr. Food Res . 51: 675–683

Mémoire de DEA Miora RARINIRINA 47

Références bibliographiques

Site Web : http://fr.wikipedia.org http://web.tn.refer.org/hedhili http://www.about.com http://www.crcv.com.au http://www.labo-nutrinov.com http://www.martineschnoering.com

Mémoire de DEA Miora RARINIRINA 48

ANNEXE

Annexes

ANNEXE

Annexe 1: Résultats du test DPPH des fractions H 2O:MeOH de quelques fruits comestibles

Nom scientifique Nom commun Famille CE 50 (µg/ml±SD)

Blighia sapida Aki SAPINDACEAE 6,6±1 ,1 Eugenia uniflora Cerise de la Cayenne MYRTACEAE 4,0±2 ,2 Gaultheria shallon Gaultherie (Salal) ERICACEAE 5,9±0 ,3 Malpighia glabra Cerise des Antilles MALPIGHIACEAE 13 ,9±1 ,3 Mammea americana Abricot des Antilles CLUSIACEAE 7,9±2 ,7 Mangifera indica Mangue ANACARDIACEAE 145±20 Manilkara zapota Sapotillier SAPOTACEAE 50 ,8±4 ,5 Muntingia calabura Cerise de la Jamaïque ELAEOCARPACEAE 6,5±0 ,6 Myrciaria cauliflora Prunier de Java MYRTACEAE 6,2±0 ,7 Sambucus caerulea Sureau CAPRIFOLIACEAE 16 ,9±0 ,6 Theobroma grandiflorum Cupuaçu STERCULIACEAE 177 ,0±12

D’après Einbond et al . (2004)

Mémoire de DEA Miora RARINIRINA a

Résumé

Mémoire de DEA en Biologie et Ecologie Végétales Option: Physiologie Végétale

Titre: ETUDE DE LA MATURATION DES FRUITS DE «VOARAMONTSINA» (Vaccinium emirnense-ERICACEAE) : VARIATIONS DES ACTIVITES ANTIOXYDANTE ET HYPOGLYCEMIANTE

Auteur: Mioralalaina R. RARINIRINA RESUME

Certaines des activités biologiques rencontrées chez les fruits des Vaccinium étrangers, notamment les propriétés antioxydante et hypoglycémiante, ont été vérifiées chez l’une des espèces de Vaccinium endémique malagasy, Vaccinium emirnense appelée aussi «voaramontsina». Les changements au niveau des caractéristiques morphologiques et biochimiques ainsi que les capacités antioxydante et hypoglycémiante ont été suivis au cours de la maturation des fruits. Quatre stades de fruit ont été établis selon leur coloration : stade I (vert), II (rose), III (rouge) et IV (pourpre). Les résultats montrent une augmentation du poids, de la taille, de la teneur en eau, des anthocyanes ainsi que du TSS (total de solides solubles) au cours de la maturation. Le poids des fruits présente une hausse de 108% en fin de maturation, due à l’accumulation d’eau et de composés dissous. Par contre, la teneur en chlorophylles et l’acidité titrable diminuent. Les activités biologiques des fruits de «voaramontsina» sont fortement exprimées dans les fruits non matures (stade I et II) et diminuent au cours du mûrissement. La concentration efficace (CE 50 ) augmente de 9,5 µg/ml (stade I) à 72,9 µg/ml (stade IV) durant la maturation, indiquant une réduction du potentiel antioxydant. Aucun des extraits de fruits administrés ne présente une activité hypoglycémiante quand l’hyperglycémie a été provoquée par du glucose. Cependant, une baisse significative de la glycémie est constatée 15 mn après absorption d’amidon chez les souris ayant reçu les extraits de fruits des stades I, II et III. Ce résultat suggère la présence d’une activité inhibitrice de l’ α-glucosidase chez les fruits de stade II qui provoquent la plus forte baisse de glycémie (37,2%, P=0,029). Les composés responsables des activités pourraient appartenir à la même famille de molécules, abondants en début puis se raréfient en fin de maturation.

Mots clés : activité antioxydante, activité hypoglycémiante, maturation des fruits, Vaccinium emirnense, voaramontsina.

Encadreur : Dr Aro Vonjy RAMAROSANDRATANA

Mémoire de DEA Miora RARINIRINA

Abstract

DEA thesis in Plant Biology and Ecology Option: Plant Physiology

Title: STUDY OF «VOARAMONTSINA» (Vaccinium emirnense - ERICACEAE) FRUITS RIPENING: CHANGES IN ANTIOXIDANT AND HYPOGLYCEMIC ACTIVITIES

Author: Mioralalaina R. RARINIRINA

ABSTRACT

Biological activities, found in the fruits of foreign Vaccinium species, including antioxidant and hypoglycemic properties were confirmed in one of the Malagasy endemic Vaccinium species, Vaccinium emirnense called, «voaramontsina». Changes in morphological and biochemical characteristics as well as in antioxidant and hypoglycemic capacities were monitored during fruit ripening. Four fruit ripening stages have been established based on their color namely stages I (totally green), II (pink), III (red), and IV (purple). During ripening, fruits displayed significant increase in weight, size, water, anthocyanins contents and soluble solids contents. The weight gain reached 108% of their initial weight by the end of the ripening period, due to accumulation of water and dissolved compounds. In contrast, chlorophyll level and titratable acidity decreased. The biological activities of «voaramontsina» fruits were mostly associated with the immature fruits (Stage I and II) and decreased gradually during maturation. The efficiency concentration (EC 50 ) values for the antioxidant capacity increased with the ripening stage from 9.5 µg/ml (stage I) to 72.9 mg/ml (stage IV) indicating a reduction in antioxidant potential. No fruit extracts administered had hypoglycemic activity when hyperglycemia was induced by glucose. However, significant decrease in blood glucose was obtained 15 min after intake of starch, when mice were treated with methanolic extracts from stage I, II, and III. This result indicates a possible α- glucosidase inhibitory activity of the fruit extracts with stage II fruit promoting the most significant lowering of blood glucose (37.2%, P = 0.029). Compounds responsible of these activities could belong to the same family of molecules, which are abundant within young berries then became scarce in ripe fruits.

Keywords: antidiabetic, antioxidant, fruit ripening, Vaccinium emirnense, voaramontsina.

Supervisor : Dr Aro Vonjy RAMAROSANDRATANA

Mémoire de DEA Miora RARINIRINA