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CONTENIDO

ARTÍCULOS DE INVESTIGACIÓN ORIGINAL

Ecología y Comportamiento Uzbekia González-Coronado, Gino Juárez-Noé y Claudia Ruíz-González. Coleópteros (Insecta: Coleoptera) del Campus de la Universidad Nacional de Piura, Perú. ( (Insecta: Coleoptera) of the campus the National University of Piura, Peru) …...…...... 95−105

Sistemática y Morfología Irene Lobato-Vila, Sara Fernández-Garzón, M. Catalina Reina-Rojas, Mailyn A. González and Juli Pujade-Villar. Synergus pedroi n. sp. from Colombia (Hymenoptera: Cynipidae: Synergini). (Synergus pedroi n. sp. de Colombia (Hymenoptera: Cynipidae: Synergini)) ...... 106−113

ARTÍCULOS DE REVISIÓN

Entomología Médica y Forense Raúl Noguez-Moreno, Ildefonso Fernández-Salas, Jorge Cime-Castillo, Enrique Merino-Pérez, Renaud Conde, Salome Cabrera-Romo y Humberto Lanz-Mendoza. Nuevas estrategias de control vectorial: mosquitos transgénicos. (New strategies of vector control: Genetically modified mosquitoes) ...... 114−138

Uzbekia González-Coronado Gino Juárez-Noé Claudia Ruíz-González

Escuela Profesional de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional de Piura, Perú.

[email protected]

Campus Universitario, Urb. Miraflores s/n, Castilla-Piura Apartado Postal 295. Región Piura, Perú.

Folia Entomológica Mexicana (nueva serie), 3(3): 95−105, 2017.

Recibido: 8 de agosto 2017 Aceptado: 16 de diciembre 2017 Publicado en línea: 31 de diciembre 2017

ISSN: 2448-4768

COLEÓPTEROS (INSECTA: COLEOPTERA) DEL CAMPUS DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA, PERÚ

Beetles (Insecta: Coleoptera) of the campus the National University of Piura, Peru

Uzbekia González-Coronado, Gino Juárez-Noé y Claudia Ruíz-González.

Escuela Profesional de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional de Piura, Región Piura, Perú.

*Autor de correspondencia: [email protected]

RESUMEN. El objetivo del siguiente trabajo fue el de determinar el número de especies de coleópteros presentes en el campus de la Universidad Nacional de Piura, en la región Piura, Perú, se realizaron recolectas entre agosto de 2016 y abril de 2017. Se registraron 136 especies, agrupadas en 117 géneros, 27 familias y dos subórdenes. Las familias , Tenebrionidae, Carabidae, , Chrysomelidae y Cerambycidae agruparon la mayor cantidad de especies. Photinus baeri (Oliver) y Merocnemus binotatus Boheman son citadas por primera vez para Perú, así como los géneros Cymatodera Gray y Phyllobaenus Dejean, ambos con especies aún no descritas. Además, se añade un nuevo dato distribucional regional para Mecopelidnota marxi Soula y Grammopsoides tenuicornis (Casey). Los resultados muestran que el campus contiene un alto número de especies de coleópteros y que la presencia de nuevos registros, ampliaciones de distribución y especies aún no descritas resaltan la importancia que tiene este sitio en los estudios de coleopterofauna en Perú.

Palabras clave: Bosques estacionalmente secos, distribución, nuevos registros, región Piura.

ABSTRACT. The objective of the following work was determining the number of coleopteran species present campus of the National University of Piura, Piura region, Peru, collections were made between August 2016 to April 2017. It registered 136 species, grouped in 117 genera, 27 families and two suborders. The families Coccinellidae, Tenebrionidae, Carabidae, Scarabaeidae, Chrysomelidae and Cerambycidae group the largest number of species. Photinus baeri Oliver and Merocnemus binotatus Boheman are cited first time from Peru, as well as genera Cymatodera Gray and Phyllobaenus Dejean, both with undescribed species. Also, a new regional distributional data is added for Mecopelidnota marxi Soula y Grammopsoides tenuicornis (Casey). The results show that campus of National University of Piura contains a great number of coleopteran species and that the presence of new records, range extensions and undescribed species highlight the importance of this site in coleopterofauna studies in Peru.

Key words: Seasonally dry forests, distribution, new records, Piura region.

INTRODUCCIÓN cercana a la línea ecuatorial, heterogeneidad del relieve e interacciones marino-atmosféricas, Dentro de la entomofauna mundial, además presenta dos cadenas montañosas: los Coleoptera constituye el más rico y variado Amotapes y los Andes, los cuales condicionan orden de la clase Insecta, con aproximadamente los diversos paisajes ecológicos que posee (More 400,000 especies dentro de cuatro subórdenes, et al., 2014). 211 familias y 1,663 tribus (Bouchard et al., Uno de estos paisajes son los bosques 2011; Grimmelikhuijzen y Huaser, 2012). En la estacionalmente secos que cubren aproximadamente región neotropical está constituido por el 73 % de la superficie territorial de la región y aproximadamente 72,500 especies, 6,700 géneros dentro de los cuales destacan los algarrobales, y 127 familias (Costa, 2000), mientras que en formaciones vegetales dominadas por Prosopis Perú está constituida por 99 familias y 10,000 pallida (Humb. & Bonpl. ex Willd.) Kunth especies (Chaboo, 2015). (Fabaceae), distribuidas desde las planicies Piura es una región singular por su geografía costeras hasta los 400 metros de altitud y biodiversidad, como resultado de la interacción aproximadamente (La Torre-Cuadros y Linares, de factores ambientales, geológicos, ubicación 2008).

95 González-Coronado et al.: Coleópteros del Campus de la Universidad Nacional de Piura, Perú.

Dentro de los estudios del orden Coleoptera en Además, constituye una de las principales áreas la región de Piura destacan los de Juárez (2014), boscosas dentro del casco urbano de la ciudad de Juárez et al. (2015, 2016), Juárez y González Piura, ya que alberga fauna característica de los (2015a, 2015b, 2016a, 2016b, 2016c, 2016d, bosques secos (Chávez-Villavicencio, 2013). 2016e, 2016f, 2017), González y Juárez (2016, Método de muestreo. Las recolectas se 2017), Mendoza y Juárez (2017) quienes realizaron mensualmente desde agosto de 2016 elaboraron listados de especies y citaron nuevos hasta abril de 2017 y se efectuaron las primeras registros para Perú. tres semanas de cada mes con una duración de El campus de la Universidad Nacional de Piura cinco días por semana (15 días efectivos de constituye una de las zonas verdes más extensas recolecta por mes) en horarios diurnos y e importantes dentro de la ciudad de Piura, el nocturnos empleando tres métodos de captura: 1) cual al estar compuesto por áreas de uso urbano recolecta manual, con el cual se capturaron con abundante vegetación y estar ubicado dentro directamente los coleópteros que fueron de la zona biogeográfica de bosque seco descubiertos en su hábitat (Morón, 2004), además ecuatorial (Chávez-Villavicencio, 2013) representa de capturas en suelo y recolectas directas sobre la un sitio interesante para estudiar la comunidad de vegetación, sobre y bajo hojarasca, dentro y insectos presentes. En este campus el conocimiento debajo de troncos, así como el uso de red aérea de su entomofauna es nulo, por lo tanto, este para la obtención de ejemplares en el estrato trabajo tuvo como objetivo determinar el número arbóreo e individuos en vuelo y red acuática en de especies de coleópteros presentes en el zona acuícola. campus de la Universidad Nacional de Piura. La recolecta manual se efectuó en horarios diurnos (08:00 h hasta 14:00 h) y nocturnos MATERIALES Y MÉTODO (18:00 h hasta 22:00 h) por día; 2) trampas pitfall, cebadas con carne de pescado en vasos Área de estudio. El campus de la Universidad plásticos transparentes de nueve cm de diámetro Nacional de Piura (UNP) se localiza en el distrito de abertura y 500 ml de capacidad, las que de Castilla, en la provincia de Piura y región fueron colocadas sobre cuatro transectos lineales Piura, al noroeste de Perú (Fig. 1), entre los 05° de 300 m cada uno separados 50 m entre sí y con 10´ 54 S - 80° 37´ 14 O, a una altitud de 30 10 pares de trampas cada 30 m por transecto msnm y con una superficie total de 110 ha. Está haciendo un total de 80 trampas instaladas en compuesto por áreas de edificaciones, jardines todo el campus. Las trampas estuvieron activas con plantas exóticas y nativas, pozas para la las tres semanas de cada mes y revisadas cada 24 crianza de peces y langostinos, establos de horas (Villareal et al., 2004); 3) trampas de luz ganado vacuno, porcino, ovino, avícola y una blanca, de dos focos de 100 watts cada uno extensa área de cultivos de Pennisetum adheridos a lámparas y colocadas frente y debajo purpureum Schum. (Poaceae), Zea mays L. de mantas blancas de dos m de ancho y dos m de (Poaceae), Gossypium barbadense L. (Malvaceae), largo (Solis, 2004), las cuales se colocaron dos Medicago sativa L. (Fabaceae), Manihot sculenta veces por mes (cada siete días) entre las 19:00 h Crantz (Euphorbiaceae), Musa sp. (Musaceae) y y 22:00 h. plantaciones de Spondias purpurea L. Para la identificación de los ejemplares se (Anacardiaceae). El campus con excepción de la consultaron los trabajos de Martínez (2005) y zona de cultivos está rodeado por bosque seco Naviaux (2007) para Carabidae; Libonatti et al. conformado en su mayoría de P. pallida y de (2011) para Dytiscidae e Hydrophilidae; acuerdo con la clasificación de More et al. Navarrete et al. (2002) para Staphylinidae; (2014) se encuentra dentro del paisaje ecológico Scholtz (1990) para Trogidae; Endrödi (1985), bosque estacionalmente seco de llanura. Morón et al. (1997), Sakai y Nagai (1998)

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Figura 1. Ubicación del campus de la Universidad Nacional de Piura (*). y Morón (2003) para Scarabaeidae; Cobos Tenebrionidae, Carabidae, Chrysomelidae con 13 (1979), Akiyama y Ohmomo (2000) y Moore y cada una, Scarabaeidae con 12 y Cerambycidae Diéguez (2008) para Buprestidae; Aguirre- con 10 fueron las que contaron con el mayor Tapiero (2009) para Elateridae; Háva (2004) y número de especies, mientras que para los Díaz et al. (2008) para Dermestidae; Binda y géneros lo fue Hyperaspis Chevrolat con tres Joly (1991) y Borowski y Węgrzynowicz (2007) (Cuadro 1). para Bostrichidae; Kolibác (2013) para Nuevos registros. Dentro de las especies Trogossitidae; González (2007) para determinadas es importante mencionar que Coccinellidae; Peña (1973,1994), Kaszab (1981) Photinus baeri (Oliver) (Lampyridae: Lampyrinae) y Silvestro et al. (2015) para Tenebrionidae; (Fig. 2a), Merocnemus binotatus Boheman Pinto y Bologna (1999) para Meloidae; Galileo y (: Cryptorhynchinae) (Fig. 2b) y Martins (1996, 2007), Martins (1970, 1999, los géneros Cymatodera Gray (Cleridae: 2002, 2003) y Noguera (2002) para Tillinae) y Phyllobaenus Dejean (Cleridae: Cerambycidae; Anderson (2004) y Marvaldi y Hydnocerinae) se citan por primera vez para Lanteri (2005) para Curculionidae y Perú. Además, se añade como nuevo registro de Dryophthoridae. Se siguió la clasificación localidad dentro de la región a la provincia de propuesta por Bouchard et al. (2011) para la Piura para Mecopelidnota marxi Soula clasificación taxonómica de las especies mientras (Scarabaeidae: ) (Fig. 2c) y que los ejemplares fueron depositados en la Grammopsoides tenuicornis (Casey) (Cerambycidae: Colección Gino Juárez N., Piura, Perú (CGJN). Lamiinae) (Fig. 2d) (Cuadro 2). Asimismo, se da a conocer el primer registro de una morfoespecie RESULTADOS de Phileurus Latreille para ecosistemas secos en Perú, esto debido a que la mayoría de sus Riqueza. Se registraron 136 especies de especies han sido registradas en localidades coleópteros distribuidos en 117 géneros, 27 ubicadas en zonas andinas, selva alta y selva baja familias y dos subórdenes. El suborden dentro del país (Coelho y Saltin, 2014; Ratcliffe Polyphaga fue el más numeroso con 121 especies et al., 2015). y 25 familias, mientras que el suborden Del mismo modo se registra un género y 10 Adephaga agrupó 15 especies y dos familias. Por especies endémicas para Perú: Prohylitus su parte, las familias Coccinellidae con 19, Kaszab, Psammetichus dissimilis Peña, Kocakia

97 González-Coronado et al.: Coleópteros del Campus de la Universidad Nacional de Piura, Perú.

Cuadro 1. Lista de especies de coleópteros registradas en el campus de la Universidad Nacional de Piura. Perú. Suborden Adephaga Familia Elateridae Familia Carabidae 41. Aeolus sp. 1. Cicindelidia trifasciata Fabricius, 1871. 42. Conoderus sp. 1 2. Tetracha chilensis (Laporte, 1834). 43. Conoderus sp. 2 3. Calosoma abbreviatum Chaudoir, 1869. 44. Heteroderes amplicollis (Gyllenhal, 1817). 4. Clivina sp. 45. Horistonotus sp. 5. Brachinus sp. Familia Lycidae 6. Blennidus peruvianus (Dejean, 1828). 46. Plateros sp. 7. Blennidus sp. Familia Lampyridae 8. Calleida migratoria Casale, 2002. 47. Photinus baeri (Oliver, 1907). 9. Calleida sp. Familia Dermestidae 10. Stenolophus sp. 48. Trogoderma sp. 11. Notiobia sp. 49. Attagenus fasciatus (Thunberg, 1795). 12. Selenophorus sp. Familia Bostrichidae 13. Tetragonoderus sp. 50. Sinoxylon anale Lesne, 1897. Familia Dytiscidae 51. Sinoxylon unidentatum Fabricius, 1801. 14. Megadytes sp. 52. Micrapate scabrata (Erichson, 1847). 15. Thermonectus sp. 53.Dolichobostrychus angustus Steinheil, 1872. Suborden Polyphaga 54. Amphicerus cornutus (Pallas, 1772). Familia Hydrophilidae Familia Ptinidae 16. Hydrophilus sp. 55. Ptinus sp. 17. Tropisternus collaris (Fabricius, 1775). Familia Trogossitidae 18. Tropisternus sp. 56. Tenebroides sp. Familia Staphylinidae Familia Cleridae 19. Bledius sp. 57. Phyllobaenus sp. 20. Medon sp. 58. Cymatodera sp. 21. Philonthus sp. 59. Necrobia rufipes (DeGeer, 1775). 22. Eupaederus cyanipennis (Guerin, 1830) 60. Neorthopleura guayasensis Opitz, 2013. Familia Trogidae Familia Nitidulidae 23. Omorgus persuberosus (Vaurie, 1962) 61. Carpophilus sp. Familia Scarabaeidae 62. Colopterus sp. 24. Aphodius pseudolividus Balthasar, 1941. 63. Cychramus sp. 25. Ataenius sp. 64. Lobiopa sp. 26. Canthon sp. 65. Stelidota sp. 27. Paranomala undulata Guérin, 1831. Familia Coccinellidae 28. Leucothyreus sp. 66. orbigera Gordon, 1980. 29. Mecopelidnota marxi Soula, 2008. 67. Scymnus rubicundus Erichson, 1847. 30. Cyclocephala sp. 68. Scymnus loewii Mulsant, 1850. 31. Phileurus valgus (Olivier, 1789). 69. Scymnobius galapagoensis (Waterhouse, 32. Tomarus maimon Erichson, 1847. 1845). 33. Tomarus sp. 70. Scymnobius triangularis Gordon, 2002. 34. Gymnetis stellata Latreille, 1833. 71. Stethorus tridents Gordon, 1982. 35. Gymnetis sp. 72. Hyperaspis onerata Mulsant, 1850. Familia Buprestidae 73. Hyperaspis esmeraldas Gordon, 2011. 36. Polycesta excavata Blanchard, 1846. 74. Hyperaspis arida Gordon y Canepari, 2008. 37. Agrilaxia acuminata (Cobos, 1972). 75. Brachiacantha darlene Gordon y Canepa, 38. Chrysobothris sp. 2014. 39. Agrilus sp. 76. Zagreus hexasticta (Crotch, 1874). 40. Agrilus piuraensis Juárez y González, 77. Psyllobora confluens Fabricius, 1801. 2017 78. Coleomegilla maculata Latreille, 1833.

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Cuadro 1. Continuación. 79. Cycloneda sanguinea (Linnaeus, 1763). 108. Heterachthes pallidipennis (Thomson, 80. Cheilomenes sexmaculata Fabricius, 1781. 1865). 81. Paraneda pallidula Mulsant, 1850. 109. Obrium circunflexum Martins y Galileo, 82. Paraneda sp. 2004. 83. Hippodamia convergens Guerin, 1836. 110. Smodicum sp. 84. Nephaspis sp. 111. Atrypanius sp. Familia Passandridae 112. Nesozineus peruanus Galileo y Martins, 85. Taphroscelidia sp. 2007. Familia Ripiphoridae 113. Nesozineus probolus Galileo y Martins, 86. Macrosiagon octomaculata Gerstaecker, 1996. 1855. 114. Grammopsoides tenuicornis (Casey, 1913). Familia Tenebrionidae Familia Chrysomelidae 87. Parepitragus sp. 115. Amblycerus piurae (Pierce, 1915). 88. Prohylitus sp. 116. Acanthoscelides obtectus (Say, 1831). 89. Psammetichus costatus (Guérin, 1830). 117. Callosobruchus maculatus (Fabricius, 90. Psammetichus dissimilis Peña, 1993. 1775). 91. Kocakia opaca (Kaszab, 1982). 118. Megacerus sp. 92. Ammophorus rubripes Solier, 1838. 119. Diabrotica speciosa Baly, 1886. 93. Blapstinus sp. 1 120. Diabrotica septemliturata Erichson, 1847. 94. Blapstinus sp. 2 121. Systena sp. 95. Zophobas opacus (Sahlberg, 1823). 122. Cryptocephalus sp. 96. Pumiliofossorum sechurae Giraldo y Flores, 123. Typophorus sp. 2015. 124. Myochrous sp. 97. Trichoton sp. 125. Phenrica sp. 98. Aryenis sp. 126. Epitrix sp. 99. Ulomiodes dermestoides (Chevrolat, 1878). 127. Lema sp. Familia Meloidae Familia Histeridae 100. Nemognatha sp. 128. Omalodes sp. 101. Zonitis cantharoides Kaszab, 1960. Familia Curculionidae Familia Anthicidae 129. Pantomorus sp. 102. Anthicus sp. 130. Pandeleteius sp. 103. Ischyropalpus sericans (Erichson,1834). 131. Merocnemus binotatus Boheman, 1844. 104. Plesionotoxus sp. 132. Platyomus sp. Familia Cerambycidae 133. Plectrophoroides sp. 105. Achryson lineolatum Erichson, 1847. Familia Dryophthoridae 106. Eburia pilosa (Erichson, 1834) 134. Metamasius hemipterus (Linnaeus, 1758). 107. Eburia rufobrunnea Perroud, 1855. 135. Sphenophorus sp. 136. Sitophilus zeamais Motschulsky, 1855. opaca (Kaszab), Pumiliofossorum sechurae acuminata (Gordon y Canepari, 2008; Giraldo y Giraldo y Flores, Nesozineus peruanus Galileo y Flores, 2016; Monné, 2016). Martins, Nesozineus probolus Galileo y Martins, Obrium circunflexum Martins y Galileo, DISCUSIÓN Heterachthes pallidipennis (Thomson), Hyperaspis arida Gordon y Canepari, Zagreus Los resultados muestran que el campus de la hexasticta (Crotch) y Agrilaxia acuminata UNP alberga una alta cantidad de especies de (Cobos) (González, 2015; Monné y Chaboo, coleópteros. Así, las 136 especies reportadas 2015; Smith et al., 2015, Giraldo y Flores, 2016), supera ampliamente a las 74 especies de de las cuales nueve especies son también coleópteros citada por Juárez y González (2016f) endémicas de ecosistemas secos: P. dissimilis, K. para el campus de la Universidad de Piura opaca, P. sechurae, N. peruanus, N. probolus, O. (UDEP), recinto universitario ubicado también circunflexum, H. arida, Z. hexasticta y A. en pleno casco urbano a solo dos km del campus

99 González-Coronado et al.: Coleópteros del Campus de la Universidad Nacional de Piura, Perú.

Figura 2. Nuevos registros. a. Photinus baeri. b. Merocnemus binotatus. c. Mecopelidnota marxi. d. Grammopsoides tenuicornis. (Fotos: Gino Juárez Noé).

Cuadro 2. Taxones considerados como nuevos registros para Perú y con ampliaciones de distribución regional. Se indica países y provincias donde fueron registrados previamente. Taxones Nuevos registros Ampliaciones distribución Photinus baeri Brasil (McDermott, 1966). (Oliver, 1907). Merocnemus binotatus Argentina, México Nicaragua (Maes y Boheman, 1844. O´Brien, 1990; Hernández y Cabrera, 2014). Género Cymatodera Canadá, Estados Unidos México, Costa Gray, 1832. Rica, Guatemala, Honduras, Panamá, Colombia Venezuela (Burke et al., 2015). Género Phyllobaenus Estados Unidos México, Guatemala, Dejean, 1833. Panamá, Nicaragua, Argentina, Venezuela, Paraguay (Leavengood, 2014; Leavengood y Garner 2014) Mecopelidnota marxi Provincias Sullana y Huancabamba Soula, 2008. (Soula, 2008; Moore et al., 2017) Grammopsoides tenuicornis Provincia Morropón (Santos-Silva y (Casey, 1913). Galileo, 2016 de la UNP y que solo presenta ambientes urbanos Se observó un incremento gradual en el número bosque seco tipo algarrobal (Viñas y More, de especies desde el inicio de las evaluaciones 2002). Asimismo, es importante mencionar que las con excepción del último mes en la cual se evaluaciones en el campus UDEP se efectuaron produjo una reducción. Además, el alto número durante 24 meses y con los mismos métodos de de especies entre enero y marzo estuvo colecta utilizados para este estudio. Por su parte, relacionado con la variable climática de las 27 familias registradas representan el 27 % de precipitación ya que durante estos meses se las familias reportadas a nivel nacional (Chaboo, presentaron altos niveles de lluvias (Fig. 3). 2015). Esto coincide generalmente con lo observado en

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Figura 3. Número de especies y niveles de precipitación durante los meses de evaluación en el campus de la Universidad Nacional de Piura. los bosques estacionalmente secos donde los tiene el campus de la UNP en los estudios de insectos son más abundantes, en términos de coleopterofauna a nivel nacional. número de especies e individuos, en la temporada Por último, la información aquí presentada se lluviosa que en la estación seca (Hanson, 2011). puede tomar como un punto de partida para Por otro lado, la gran cantidad de especies de futuras investigaciones y no representa un coleópteros registrada soporte la idea de que este inventario definitivo de las especies de grupo de insectos constituye un componente coleópteros en el campus de la UNP. ecológico importante dentro del campus de la UNP. Así, algunas especies quizás constituyan la CONCLUSIONES principal fuente de alimento de grupos de vertebrados, especialmente aves, ya que el Los resultados muestran que el campus de la 70 % de la avifauna registrada en el campus Universidad Nacional de Piura contiene una alta es insectívora (Chávez-Villavicencio, 2013), cantidad de especies de coleópteros representada mientras que otras pueden participar por 136 especies, 117 géneros, 27 familias y dos específicamente en el proceso de polinización tal subórdenes. P. baeri y M. binotatus son citadas como sucede con las especies de Meloidae, en la por primera vez para Perú, así como los géneros degradación de materia orgánica como Cymatodera y Phyllobaenus, ambos con especies Scarabaeidae, Dermestidae, Cleridae y aún no descritas, se añaden nuevos datos Tenebrionidae, como plagas para el caso de distribucionales regionales para M. marxi y G. Bostrichidae y Buprestidae y como controladores tenuicornis y se da a conocer el primer registro biológicos principalmente Coccinellidae y de una morfoespecie de Phileurus para Carabidae (González, 2007; Lawrence y Ślipiński, ecosistemas secos en Perú. La presencia de 2013; Chaboo y Clark, 2015; Erwin et al., 2015). nuevos registros para el país, ampliaciones de Este estudio ha permitido conocer la presencia distribución y especies aún no descritas resaltan de nuevos registros para el país y ampliaciones la importancia que tiene el campus de la UNP en de distribución. Además, es importante los estudios de coleopterofauna a nivel nacional. mencionar que los ejemplares colectados de Cymatodera y Phyllobaenus son aún especies no AGRADECIMIENTOS descritas, lo que sumado a otros nuevos registros citados previamente en este recinto universitario A Miguel Ángel Cortez, Rosario Montes y César (Juárez y González, 2015b; González y Juárez, Raúl Tuesta por sus recomendaciones en la 2016; Juárez y González, 2016d; Juárez y elaboración del manuscrito. A John Leavengood, González, 2017a, 2017b; González y Juárez, Alan Burke, Marcelo Guerrero, Carlos Aguilar, 2017) resaltan la importante contribución que Alfred Newton, Paul Johnson, Donald Chandler y

101 González-Coronado et al.: Coleópteros del Campus de la Universidad Nacional de Piura, Perú.

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1Universitat de Barcelona. Facultat de Biologia. Departament de Biologia Animal. [email protected] [email protected]

2Instituto de Investigación de Recursos Biológicos. Alexander Von Humboldt, Colombia. [email protected] [email protected]

[email protected]

1 Avda. Diagonal, 645. 08028-Barcelona. España. 2 Ak. 1 #16-20, Bogotá, Colombia.

Folia Entomológica Mexicana (nueva serie), 3(3): 106−113, 2017.

Recibido: 5 de julio 2017 Aceptado: 7 de noviembre 2017 Publicado en línea: 31 de diciembre 2017

ISSN: 2448-4768

Synergus pedroi n. sp. FROM COLOMBIA (HYMENOPTERA: CYNIPIDAE: SYNERGINI)

Synergus pedroi n. sp. de Colombia (Hymenoptera: Cynipidae: Synergini)

Irene Lobato-Vila1, Sara Fernández-Garzón1, M. Catalina Reina-Rojas2, Mailyn A. González2 and Juli Pujade-Villar1

1 Universitat de Barcelona. Facultat de Biologia. Departament de Biologia Animal. 2 Instituto de Investigación de Recursos Biológicos. Alexander Von Humboldt, Colombia.

*Autor de correspondencia: [email protected]

ABSTRACT. A new species of Synergus Hartig, 1840 is described from Colombia, being the second species of this genus known from this country. It is the first Synergus species with the radial cell open known from South America and the first inquiline related to galls induced by Zapatella Pujade-Villar & Melika (Hymenoptera: Cynipidae: Cynipini). The main morphological characters of this new species are described and illustrated. The few known Synergus species with the radial cell open are mentioned. The DNA barcode region COI of S. pedroi n. sp. is given.

Key words: Hymenoptera, Cynipidae, Synergini, Synergus, new species, Colombia.

RESUMEN. Se describe de Colombia una nueva especie de Synergus Hartig, 1840, siendo la segunda especie del género conocida en este país. Es la primera especie de Synergus con la celda radial abierta para Sur América y la primera especie inquilina obtenida a partir de agallas de Zapatella Pujade-Villar & Melika (Hymenoptera: Cynipidae: Cynipini). Se exponen e ilustran las principales características morfológicas de esta nueva especie. Se mencionan especies del género que presentan la celda radial abierta. Se proporciona el código de barras de ADN COI de S. pedroi n. sp.

Palabras clave: Hymenoptera, Cynipidae, Synergini, Synergus, nueva especie, Colombia.

INTRODUCTION form of cleptoparasitism, usually considered to represent a unilateral advantageous relationship The most part of oak gall wasps (Cynipidae) are that benefits only the inquilines (Askew, 1984; true gall makers (Ronquist, 1999); however, about Ronquist, 1994, 1999). 180 species, classified into ten genera, develop as Until recently, all inquilines were included in the inquilines inside galls of other cynipids (Pujade- Synergini tribe. However, Ronquist et al. (2015) Villar et al., 2003; Nieves-Aldrey and Medianero, internally restructured the Cynipidae family, 2010; Pénzes et al., 2012; Bozsó et al., 2014, separating the inquilines in three tribes: Synergini 2015; Schwéger et al., 2015a, b; Ronquist et al., s. str., Ceroptresini and Diastrophini. Currently, 2015). Unlike true gall wasps, which can induce the Synergini tribe only includes genera whose the formation of complex galls in different plants, first metasomal segment is ring-shaped and inquilines are not capable to induce galls by usually carinated, and it includes several genera themselves and develop as guests inside galls of related to galls that develop on Fagaceae (except other cynipids, except for one species described for Rhoophilus loewi Mayr, 1881), mainly on by Abe et al. (2011) from Japan, Synergus itoensis Quercus spp. Abe, Ide & Wachi, and for Saphonecrus The genus Synergus includes 117 species (Pénzes hupingshanensis Liu, Yang & Zhu, which was et al., 2012; Schwéger et al., 2015a; Pujade-Villar inferred to be a gall maker because no gall maker and Lobato-Vila, 2016a, b; Pujade-Villar et al., was reared from the galls it emerged from in 2016), but only 14 of them are present in the Castanopsis carlesii (Hemsl.) Hayata (Fagaceae), Neotropical region. Neotropical species have according to Liu et al. (2012). Inquilinism is a been studied by Ritchie and Shorthouse (1987),

106 Lobato-Vila et al.: Synergus pedroi n. sp. from Colombia.

Díaz and Gallardo (1998), Nieves-Aldrey (2005) Instituto Colombiano Agropecuario, Mosquera, and Nieves-Aldrey and Medianero (2011). In Colombia (Pedro A. Rodríguez). Colombia, just a single species of inquiline is mentioned: Synergus colombianus Nieves- DESCRIPTION Aldrey, 2005. The species described here is the first with the radial cell open known from South Synergus pedroi n. sp. America and the second in the Neotropical area Pujade-Villar, Lobato-Vila & Fernández-Garzón that shows this morphological trait (Pujade-Villar (Figs. 1-3). et al., 2015). urn:lsid:Zoobank.org:act:11623733-7FC6- 4142-9369-65EC459D0113 MATERIALS AND METHOD Diagnosis. Female. (length 1.7-2.8 mm; n = 8). Adults of the new species were obtained from This species is morphologically closely related different galls related to Zapatella Pujade-Villar to Synergus mexicanus Gillette, 1896, both having & Melika (Hymenoptera: Cynipidae: Cynipini) the radial cell open, but distinguishable by the developed on Quercus, Lobatae section. following morphological characters: tarsal claws For morphological descriptions, it has been used with a strong basal tooth (tarsal claws simple, the current terminology of morphological without a basal tooth in S. mexicanus); head in structures as given in the following studies: dorsal view 1.7 times wider than long (2.1 times Liljeblad and Ronquist (1998) and Melika (2006) in S. mexicanus); F1/F2 ratio in females sub-equal for adult morphological structures, Ronquist and (F1 1.6 times longer than F2 in females of S. Nordlander (1989) for forewing venation and mexicanus); mesosoma about as long as high in Harris (1979) for patterns of cuticular sculpture. lateral view (1.4 times as long as high in S. The following are measurements and mexicanus); metasoma strongly dorso-distally abbreviations used in this paper: F1-F12, the first incised (not incised and pointed in S. mexicanus). and the following flagellomeres; POL (post- Color. (Fig. 1). Head reddish yellow in dorsal ocellar distance), the distance between the inner view and light yellow bellow toruli; mandibles margins of the posterior ocelli; OOL (ocellar- apically black, frons and vertex medially with a ocular distance), the distance from the outer black band that doesn’t reach the eye margin, margin of the lateral ocellus to the inner margin of occiput black; antennae testaceous, sometimes the compound eye; LOL (lateral-ocular distance), darker in F9-F12; mesosoma laterally black, the distance between lateral and frontal ocellus; excepting the sides of pronotum and scutellum, transfacial line, distance between inner margins of and lateral margins of mesoscutum, which are compound eyes measured across toruli; width of reddish yellow to reddish brown; tegulae and radial cell, measured as the distance between the mesopleural triangle yellow; mesoscutum black upper margin of the forewing and the Rs vein. between notauli, with dark brown stripes between Electron microscope images of adults were notauli and mesoscutum lateral margins; taken using a Scanning Electron Microscope (FEI scutellum reddish yellow with a median dark spot Quanta 200 ESEM) at Universitat de Barcelona near the anterior margin; metasoma black (Catalonia). Finally, optical images were taken dorsally, antero-laterally reddish; legs yellow, with an Olympus SC30 digital microscope camera excepting all tarsi, which are slightly darker; coupled with an Olympus U-CMAD3 adapter to a forewings hyaline, yellow veins. binocular microscope Olympus SZX10. Head. (Figs. 2b-c), in frontal view quadrangular Type material of the species is deposited in the with genae convergent, 1.2 times wider than high, following institutions: IAvH. Instituto Alexander genae not expanded behind compound eyes. Face von Humboldt, Villa de Leyva, Colombia (Andrés slightly pubescent, lower face and genae with M. Cuervo). UB. Universitat de Barcelona, striae irradiating from clypeus and reaching basal Catalonia (col. Juli Pujade-Villar). ICA-Tibaitata margin of compound eye and basal margin of

107 Folia Entomol. Mex. (n. s.), 3(3): 106−113 (2017).

Figure 1. Female of Synergus pedroi n. sp.: (a) head in anterior view, (b) dorsal view of head and mesosoma, (c) habitus. antennal toruli; medial carina absent. Clypeus filiform, not broadened apically; pubescence indistinct, ventral margin straight. Malar space dense and short; placodeal sensilla visible only on about 0.4 times as long as height of compound eye flagellar segments F6-F12. Pedicel 1.8 times (4:10). Anterior tentorial pits visible at 1/4 of the longer than wide; F1 and F2 subequal (1.1), F2 as distance between clypeus and the basal margin of long as F3. Last flagellar segment two times antennal toruli; pleurostomal and epistomal sulcus longer than wide and about two times longer than absent. Transfacial line 0.9 times as long as height F11. of compound eye. Toruli situated mid-height of Mesosoma. (Figs. 3a-c), about as long as high in compound eye; distance between torulus and lateral view (including nucha), with short and not compound eye shorter than diameter of toruli; dense pubescence. Ratio of length of pronotum distance between toruli 0.6 times as long as the medially/laterally: 0.25. Pronotal plate absent or diameter of torulus. Frons coriaceous with a few reduced; ad-median pronotal depressions oval, and scattered punctures; frontal carinae visible, transverse, small, sallow, open laterally, widely branched and not reaching the lateral ocelli, or separated medially by a distance 2.3 times the very weak impressed near ocelli. Head in dorsal width of an adventitious depression. Lateral view 1.7 times wider than long. Vertex coriaceous pronotum sculpture regularly rugose, densely with piliferous punctures. POL:OOL:LOL = pubescent, its dorsal part with weak pubescence 5:3.4:3; POL 1.5 times as long as OOL; OOL 1.7 to glabrous; lateral margins of pronotum rounded, times longer than the diameter of lateral ocellus. without lateral carina. Mesoescutum 1.2 times Occiput coriaceous with scattered piliferous wider than long, with a few weak and sometimes punctures. interrupted transverse rugae; anterior grooves Antennae (Fig. 2b), 14-segmented (12: 8: 12: weakly impressed, occupying almost 1/3 of 11: 11.5: 10.5: 10: 9: 8: 7.5: 6.5: 6.5: 6: 13); mesoescutum length. Notauli complete, wider and

108 Lobato-Vila et al.: Synergus pedroi n. sp. from Colombia.

Figure 2. Synergus pedroi n. sp.: (a) male antennae, (b) female antennae, (c) female head in anterior view, (d) female head in dorsal view, (e) male head in dorsal view, (f) radial cell of forewing (with detail of the radial cell open). converging posteriorly. Median groove absents. smooth, more or less oval-triangular-shaped, posterior Parapsidial grooves inconspicuous. Scutellum margins almost indistinct and separated from each rounded, almost as long as wide, rugose, densely other by a narrow septum. Mesopleuron shiny, pubescent, circumscutellar carina weak but visible; transversely striated, speculum striated; interspaces scutellar foveae superficial, shallowly impressed, smooth, pubescent basally. Metapleural sulcus well 109 Folia Entomol. Mex. (n. s.), 3(3): 106−113 (2017).

Figure 3. Synergus pedroi n. sp.: (a) mesosoma in dorsal view, (b) mesosoma in lateral view, (c) propodeum, (d) metasoma in lateral view, (e) metasoma in dorsal view (with detail of the micropunctures), (f) tarsal claws. defined, reaching almost 2/3 parts of mesopleuron Wings. Forewings pubescent with marginal setae, height. Propodeum pubescent and weakly sculptured, longer than mesosoma plus metasoma. Radial cell alutaceous with some rugae; propodeal carinae open and 3.5 times longer than wide (Fig. 2f); straight and convergent, central area alutaceous and areolet indistinct. Rs+M vein not visible. Basal cell pubescent. Nucha sulcated dorsally and laterally. weakly pubescent. Legs. (Fig. 3f). Tarsal claws with a strong basal Metasoma. (Figs. 3d-e), slightly shorter than lobe or tooth. head plus mesosoma length, 1.2 times longer than 110 Lobato-Vila et al.: Synergus pedroi n. sp. from Colombia. high in lateral view. First metasomal segment 20.viii.2016: 1♀ (leg. M. A Gonzalez, E. A. sulcated dorsally and laterally. Syntergite smooth, Tenorio & H. Arenas) (deposited in IAvH). anterolateral pubescence composed of a group of Distribution. Colombia: Boyacá, Cundinamarca 6-7 setae; strongly dorso-distally incised, with a and Santander Departments. short postero-dorsal patch of micropunctures (Fig. Biology. Emerged from galls induced by species 3e); following segments micropunctured. of the genera Zapatella on Quercus humboldti: Z. Hypopygial spine 1.8 times longer than wide and inflata Pujade-Villar and Rodríguez, 2015; Z. with a few lateral setae; apical setae projected nievesaldreyi Melika and Pujade-Villar, 2012 and beyond the tip of the spine. Zapatella sp. (undescribed species). MALE. (length 1.8-2.6 mm; n=6). Similar to Etymology. Named in honor to our friend Pedro female, except for the following morphological Rodriguez, collector of most of the specimens. characters: antennae (Fig. 2a) 15-segmented (9: 6: Barcoding. The DNA barcode of the specimen 15: 10: 9: 9: 7: 6: 6: 6: 7: 7: 7: 6: 9); F1 curved, collected in Vereda Jabonera with Malaise trap medially excavated, more expanded distally than mentioned in ‘additional material’ and deposited basally; F1/F2 ratio about 1.5; head in dorsal view in IAvH is available at BOLD (http://www.boldsystems. more curved (Fig. 2e); radial cell about 4.2 times org.) under the sample ID code CBIHM001-17. longer that wide; metasoma 1.3 times longer than high in lateral view. DISCUSSION Type material. HOLOTYPE ♀ deposited in IAvH with the following labels: “COL, Sitio CAR The morphological limits between Synergus and (Guayabal de Siquina, Cundinamarca, Colombia), Saphonecus genera are imprecise. Very few 4º 50′ 36″ N, 74º 27′ 43″ W, 2083 m.” (white Synergus species present the radial cell open but label); “ex. Zapatella inflata on Quercus it occurs in all species of Saphonecrus. These humboldti, (04.i.2013) 20-29 i.2013” (leg. P. species are: Synergus plagiotrochi Nieves-Aldrey Rodriguez)” (white label); “Synergus pedroi and Pujade-Villar, 1985 with a Circum- Pujade-Villar, Lobato-Vila & Fernández-Garzón Mediterranean distribution in the Palearctic area; n. sp., desig. JP-V 2017” (red label). S. castaneus Pujade-Villar, Bernardo and PARATYPES (10♂ & 10♀): same data as the Viggiani, 2013 and Synergus kawakamii Tang and Holotype: 8♂ & 5♀ (6♂ & 4♀ deposited in UB; Melika, 2015 in the Eastern Palaearctic area; S. 2♂ & 1♀ deposited in IAvH); Finca Rafael mexicanus Gillette, 1896 [= S. dugesi Ashmead (Guabal de Siquina, Cundinamarca, Colombia), 4º 1899 = S. brevis (Weld, 1926) according to 50′ 36″ N, 74º 28′ 34″ W, 1919 m, Zapatella Pujade-Villar and Lobato-Vila, 2016a, b] in the nievesaldreyi on Quercus humboldti, Nearctic and the Neotropical area; and also, the (12.vii.2012) 22-27.vii.2012: 2♂ & 5♀ (leg. P. new species described here in the Neotropical Rodriguez) (1♂ & 1♀ deposited in ICA-Tibaitata; area. 3♀ deposited in UB; 1♂ & 1♀ deposited in In recent phylogenetic studies, Saphonecrus IAvH). appears as a polyphyletic genus (Pénzes et al., Additional material. Cruce de San Miguel 2012; Bozsó et al., 2014, 2015; Schwéger et al., (Chiquinquirá, Boyacá, Colombia), 5º 37′ 22″ N, 2015a). Until Saphonecrus is not restructured, the 73º 46′ 11″ W, 2578 m, ex. Zapatella sp. (agalla traits that separate Synergus and 'Saphonecrus C bellota) on Quercus humboldti, 09.i.2012 (15- complex', according to the key presented by 17.i.2012): 2♂ & 4♀ (leg. P. Rodriguez) (1♀ Schweger et al. (2015a), are: frontal carinae deposited in UB; 2♂ & 3♀ deposited in IAvH). present and radial cell closed; if radial cell is open, Vereda Jabonera, carretera vía Escuela El Gaitán, then pronotal carinae are present, or frontal Bosque del Acueducto, transición bosque- carinae are present, or female antennae have 14 rastrojo-carretera (El Peñón, Santander, segments. In accordance with this definition, there Colombia), 6º 2′ 64.4″ N, 73º 47′ 36.6″ W, 2838 is no doubt that Synergus pedroi n. sp. belongs to m, Trampa Malaise #Malaise2 (8 días), 13- the Synergus genus because, despite having no

111 Folia Entomol. Mex. (n. s.), 3(3): 106−113 (2017). pronotal carinae and the radial cell open, it has LILJEBLAD, J. AND F. RONQUIST. 1998. A phylogenetic frontal carinae and 14-segmented antennae in analysis of higher-level gall wasp relationships females. (Hymenoptera: Cynipidae). Systematic Entomology, 23: 229–252. LIU, Z., YANG, X. H., ZHU, D. H. AND Y. Y. HE. 2012. A CKNOWLEDGMENTS A new species of Saphonecrus (Hymenoptera, Cynipoidea) associated with plant galls on Castanopsis Convenio especial de coperación No. FP44842- (Fagaceae) in China. Annals of the Entomological 109-2016 (IAvH 16-062) Colombia BIO for Society of America, 105(4): 555–561. funding malaise trap sampling and DNA barcode. MELIKA, G. 2006. Gall wasps of Ukraine. Cynipidae. Eduardo Tovar and Paola Pulido-Santacruz Vestnik Zoologii, 21 (Supplement 1): 1–300. (Instituto de Investigación de Recursos NIEVES-ALDREY, J. L. 2005. Notes on the Neotropical Biológicos Alexander von Humboldt, Colombia) species of Synergus (Hymenoptera, Cynipidae), for arranging and sending the data to BOLD. And with description of a new species from Colombia. also to the entomology group of the Instituto de Canadian Entomologist, 137: 501–508. Investigación de Recursos Biológicos Alexander NIEVES-ALDREY, J. L. AND E. MEDIANERO. 2010. Agastoroxenia panamensis, a new genus and species von Humboldt, Colombia for your support. of inquiline Oak gall wasps (Hymenoptera: Cynipidae: Synergini) of the Neotropics. Annals of the LITERATURE CITED Entomological Society of America, 103(4): 492–499. NIEVES-ALDREY, J. L. AND E. MEDIANERO. 2011. ABE, Y., IDE, T. AND N. WACHI. 2011. Discovery of a of inquilines of oak gall wasps of new gall-Inducing species in the inquiline tribe Panama, with description of eight new species of Synergini (Hymenoptera: Cynipidae): inconsistent Synergus Hartig (Hymenoptera, Cynipidae, implications from biology and morphology. Annals Synergini). Zootaxa, 2774: 1–47. of the Entomological Society of America, 104: 115– PÉNZES, Z., TANG, C. T., BIHARI, P., BOZSÓ, M., 120. SCHWÉGER, S. AND G. MELIKA. 2012. Oak ASKEW, R. R. 1984. The biology of gall wasps. Pp. associated inquilines (Hymenoptera, Cynipidae, 223– 271 In: Ananthakrishnan, T. N. (Ed.). The Synergini). TISCIA monograph series, 11, Szeged, biology of gall . London: Edward Arnold. Hungary. 76 pp. BOZSÓ, M., PÉNZES, Z., BIHARI, P., SCHWÉGER, S., PUJADE-VILLAR, J. AND I. LOBATO-VILA. 2016a. TANG, C. T., YANG, M. M., PUJADE-VILLAR, J. Synergus dugesi Ashmead, 1899 una espècie AND G. MELIKA. 2014. Molecular phylogeny of the sinònima de S. mexicanus Gillette, 1896 (Hym., inquiline cynipid wasp genus Saphonecrus Dalla Cynipidae: Synergini). Butlletí de la Institució Torre and Kieffer, 1910 (Hymenoptera: Cynipidae: Catalana d’Història Natural, 80: 75–77. Synergini). Plant Protection Quarterly, 29(1): 26– PUJADE-VILLAR, J. AND I. LOBATO-VILA. 2016b. 31. Synergus brevis (Weld, 1926), una nova sinonímia BOZSÓ, M., TANG, C. T., PÉNZES, Z., YANG, M. M., de S. mexicanus Gillette, 1896 (Hym., Cynipidae: BIHARI, P., PUJADE-VILLAR, J., SCHWÉGER. S. Synergini). Orsis, 30: 63–65. AND G. MELIKA. 2015. A new genus of cynipid PUJADE-VILLAR, J., MELIKA, G., ROS-FARRE, P., ÁCS, inquiline, Lithosaphonecrus Tang, Melika and Z. AND G. CSOKA. 2003. Cynipid inquiline wasps Bozsó (Hymenoptera: Cynipidae: Synergini), with of Hungary, with taxonomic notes on the Western description of four new species from Taiwan and Palaearctic fauna (Hymenoptera: Cynipidae, China. Insect Systematics and Evolution, 46(1): Cynipinae, Synergini). Folia Entomololica 79–114. Hungarica, (64): 121–170. DÍAZ, N. B. AND F. GALLARDO. 1998. Synergus PUJADE-VILLAR, J., SERRANO-MUÑOZ, M. AND G. A. nicaraguensis una nueva especie de agastoparasitoide VILLECAS-GUZMÁN. 2015. Synergus mexicanus de la familia Cynipidae (Hymenoptera: Cynipoidea). Gillette, 1896: una especie que incrementa el Revista Nicaraguensis Entomologia, 43: 41–51. conflicto genérico (Hym., Cynipidae: Synergini). HARRIS, R. 1979. A glossary of surface sculpturing. Butlletí de la Institució Catalana d’Història State of California, Department of Food and Natural, (79): 145–148. Agriculture, Occasional Papers in Entomology, 28: 1– PUJADE-VILLAR, J., ROCA-CUSACHS, M. AND I. LOBATO- 31. VILA. 2016. Descripción de las primeras especies de

112 Lobato-Vila et al.: Synergus pedroi n. sp. from Colombia.

Synergus con hembras de 13 antenómeros para México PLoS ONE, 10(5): e0123301. doi: 10.1371/journal. (Hymenoptera: Cynipidae: Synergini). Dugesiana, pone.0123301. 23(2): 109–116. RONQUIST, F. AND G. NORDLANDER. 1989. Skeletal RITCHIE, A. J. AND J. D. SHORTHOUSE. 1987. A review of morphology of an archaic cynipoid, Ibalia rufipes the species of Synergus from Guatemala, with notes on (Hymenoptera: Ibaliidae). Entomologica Cynips guatemalensis Cameron (Hymenoptera: Scandinavica, Supplement (33): 1–60. Cynipidae). Proceedings of the Entomological Society SCHWÉGER, S., MELIKA, G., TANG, C. T., YANG, M. of Washington, 89(2): 230–241. M., STONE, G. S., NICHOLLS, J. A., SINCLAIR, F., RONQUIST, F. 1994. Evolution of parasitism among HEARN, J., BOZSÓ, M. AND Z. PÉNZES. 2015a. New closely related species: phylogenetic relationships species of cynipid inquilines of the genus and the origin of inquilinism in gall wasps Saphonecrus (Hymenoptera: Cynipidae: (Hymenoptera, Cynipidae). Evolution, 48: 241– Synergini) from the Eastern Palaearctic, with a re- 266. appraisal of known species world-wide. Zootaxa, RONQUIST, F. 1999. Phylogeny, classification and 4054(1): 1–84. evolution of the Cynipoidea. Zoologica Scripta, 28: SCHWÉGER, S., MELIKA, G., TANG, C. T., BIHARI, P., 139–164. BOZSÓ, M., STONE, G. S., NICHOLLS, J. A. AND Z. RONQUIST, F., NIEVES-ALDREY, J. L., BUFFINGTON, PÉNZES. 2015b. New species of cynipid inquilines M. L., LIU, Z., LILJEBLAD, J. AND J. A. A. of the genus Synergus (Hymenoptera: Cynipidae: NYLANDER. 2015. Phylogeny, Evolution and Synergini) from the Eastern Palaearctic. Zootaxa, Classification of Gall Wasps. The Plot Thickens. 3999(4): 451–497.

113 Raúl Noguez Moreno 1,4 Ildefonso Fernández Salas 2 Jorge Cime Castillo 1 Enrique Merino Pérez 3 Renaud Conde 1 Salome Cabrera Romo 1 Humberto Lanz Mendoza 1

1 Instituto Nacional de Salud Pública, Centro de Investigación Sobre Enfermedades Infecciosas.

2 Instituto Nacional de Salud Pública, Centro Regional de Investigación en Salud Pública.

3 Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México.

4 Instituto Tecnológico Superior de Ciudad Serdán.

[email protected]

1 Av. Universidad No. 655 Colonia Santa María Ahuacatitlán, Cerrada Los Pinos y Caminera C. P. 62100, Cuernavaca, Morelos. México. 2 4a. Norte y 19 Poniente s/n Col. Centro, C. P. 30700. Tapachula, Chiapas, México. 3 Av. Universidad No. 2001, Col. Chamilpa, C. P. 62210 Cuernavaca, Morelos. 4 Av. Instituto Tecnológico s/n, Col. La Gloria. CP: 75520, Ciudad Serdán, Puebla, México.

Folia Entomológica Mexicana (nueva serie), 3(3): 114−138, 2017.

Recibido: 3 de octubre 2016 Aceptado: 22 de noviembre 2017 Publicado en línea: 31 de diciembre 2017 ISSN: 2448-4768

NUEVAS ESTRATEGIAS DE CONTROL VECTORIAL: MOSQUITOS TRANSGÉNICOS

New strategies of vector control: Genetically modified mosquitoes

Raúl Noguez-Moreno1,5, Ildefonso Fernández-Salas2, Jorge Cime-Castillo1, Enrique Merino- Pérez3, Renaud Conde1, Salome Cabrera-Romo4 y Humberto Lanz-Mendoza1*.

1 Instituto Nacional de Salud Pública, Centro de Investigación Sobre Enfermedades Infecciosas. 2 Instituto Nacional de Salud Pública, Centro Regional de Investigación en Salud Pública. 3 Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México. 4 El Colegio de la Frontera Sur, Unidad Villahermosa. 5 Instituto Tecnológico Superior de Ciudad Serdán.

*Autor de correspondencia: [email protected]

RESUMEN. La idea del control genético de insectos no es nueva, ésta se desarrolló a mediados del siglo XX con el objeto de alterar el genoma de una especie, disminuyendo la viabilidad poblacional o la sustitución por un genotipo más benigno. Lo anterior impulsó un esfuerzo importante en la investigación en genética clásica con diferentes enfoques que incluye, principalmente, la generación de machos estériles y genes letales condicionales. Sin embargo, tanto el éxito aparentemente rotundo del uso de pesticidas químicos, como la investigación en el desarrollo de vacunas contra las enfermedades transmitidas por vector (ETV) y los problemas técnicos como económicos derivados de éste disminuyeron el interés en la investigación del control genético de insectos durante los últimos 20 años del siglo XX. No obstante, en el presente siglo el surgimiento de insectos resistentes a pesticidas y la falta de éxito de las vacunas para el control de ETV, han estimulado nuevamente el interés en el desarrollo de estrategias para el control genético de insectos, impulsadas también las nuevas herramientas de ingeniería genética y los avances de las ciencias genómicas de insectos, lo que permite transferir genes y expresarlos de forma regulada de una manera más rápida y eficiente. En este trabajo describiremos brevemente el control genético y abordaremos a mayor detalle los nuevos métodos de ingeniería genética de insectos para la generación de mosquitos transgénicos y el control de las ETV. También se discutirán las experiencias obtenidas, así como las ventajas y desventajas del uso de mosquitos transgénicos.

Palabras clave: Mosquitos Transgénicos, Enfermedades Transmitidas por Vector, Ingeniería Genética de Insectos, Control Genético de Insectos.

ABSTRACT. This paper will briefly describe the genetic control and address in greater detail the new methods of insect genetic engineering used to generate transgenic mosquitoes to control vector-borne (VBD) diseases. The idea of genetic control of insects is not new, it developed in the mid-twentieth century to alter the genome of a species, decreasing population viability or replacement by a more benign genotype. This led to an important effort in classical genetic research with different approaches that includes, mainly, the generation of sterile males and lethal conditional genes. However, both the seemingly resounding success of the use of chemical pesticides, and the research into the development of VBD vaccines, and the technical and economic problems derived from it, have diminished the interest in the investigation of the genetic control of insects during the last 20 years. However, in the present century the emergence of insect’s resistant to pesticides and the lack of success of vaccines for the control of VBD, have stimulated again the interest in the development of genetic control strategies of insects, also driven the new engineering tools genetic and advances in the genomic sciences of insects, allowing to transfer genes and express them in a regulated way in a faster and more efficient way. In this work we will briefly describe the genetic control and we will approach in greater detail the new methods of genetic engineering of insects for the generation of transgenic mosquitoes and the control of VBD.

Key words: Transgenic Mosquitoes, Vector-borne Diseases, Insect Genetic Engineering, Insect Genetic Control.

INTRODUCCIÓN vectores (ETV). Más de la mitad de la población a nivel mundial vive en áreas de riesgo donde las La Organización Mundial de la Salud estima que principales especies de insectos capaces de el 17 % de todas las enfermedades infecciosas transmitir enfermedades se encuentran presentes. humanas son enfermedades transmitidas por (www.oms.org).

114 Noguez-Moreno et al., Nuevas estrategias de control vectorial.

La ubicuidad de los insectos es una característica en los infantes y las pérdida de autonomía en que les ha permitido ser un grupo interesante para etapas posteriores de desarrollo. La infección su estudio; si bien la mayoría son probablemente durante el embarazo también se ha vinculado a inocuos o benéficos para las poblaciones resultados adversos que incluyen pérdida del humanas, existen otros que pueden ser un riesgo embarazo, defectos en los ojos, pérdida de en la transmisión de enfermedades. La audición y trastornos de crecimiento en los globalización y el cambio climático pueden neonatos (www.oms.org). Por otro lado, los incrementar el riesgo de dispersión de las ETV, ya efectos secundarios de esta enfermedad en adultos que los cambios en la variación climática tienen se asemejan al síndrome de Guilian-Barret que gran impacto en la población de artrópodos, provoca parálisis progresiva (ECDC, 2015). particularmente en mosquitos (Liu-Helmersson et A pesar de los esfuerzos para prevenir brotes al., 2016). epidémicos mediante el control de poblaciones de Las enfermedades transmitidas por vectores, mosquitos, se ha estimado que las ETV son tienen un gran impacto en la salud pública en todo responsables de más de un millón de muertes al el mundo; dentro de éstas se encuentran aquellas año. Si bien, la distribución de estas enfermedades que son transmitidas por garrapatas o mosquitos. está determinada por una compleja dinámica de Ambos artrópodos son capaces de transmitir factores medioambientales y sociales, existen patógenos tales como baterías, parásitos y virus. diferentes programas de prevención que han logrado En el caso de los parásitos, la malaria o paludismo atenuar la trasmisión de enfermedades mediante el ha sido una de las enfermedades más mortífera, control de las poblaciones de los distintos vectores tan sólo en el año 2015 causó 438,000 muertes. proporcionando una mejor calidad en la salud (www.oms.org). Por otro lado, en el caso de los pública a nivel mundial (Culshaw et al., 2017) virus, se encuentran los arbovirus, los cuales son Estrategias de control genético. Es importante virus que biológicamente necesitan replicarse señalar que recientemente no ha habido una dentro del vector artrópodo para llevar acabo la clasificación a las diferentes estrategias de control transmisión al huésped vertebrado, durante la genético, a pesar de una gran numero de reportes alimentación de artrópodos hematófagos (Weaver recientes al respecto. Sin embargo, en los diversos y Reisen, 2010). artículos reportados los autores destacan algunas Las enfermedades virales transmitidas por de sus propiedades que nos permite diferenciarlas vectores pueden circular entre poblaciones de unas de otras. En primer lugar, la genética clásica animales silvestres, domésticos y en poblaciones utiliza insectos irradiados para generar esterilidad humanas. Virus como el dengue (DENV), el o disminuir su capacidad reproductiva (Steril Chikungunya (CHIKV) y recientemente el virus Insect Thecnology, SIT; Gould y Schliekelman, de Zika, se han distribuido ampliamente en todo 2004; Kraaijeveld y Chapman, 2004; Helinski et el mundo, no obstante, la enfermedad viral con al., 2009). La segunda, mosquitos transgénicos mayor crecimiento es el dengue, cuya incidencia que se basan en la manipulación del material se ha multiplicado 30 veces en los últimos 50 años genético in vitro, a través de métodos de (http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs11 ingeniería genética o de biología sintética para el 7/es/). diseño y construcción de elementos genéticos los La reemergencia, mutación y dispersión de estos cuales llevan genes específicos de control de virus, ha planteado nuevos problemas desde el enfermedades o control poblacional (Stebbins et punto económico, sociales y de salud pública, al., 2001). Los mosquitos transgénicos se pueden recientemente el conjunto de efectos que causa el clasificar en varias subdivisiones, como moscos virus de Zika, lo que ha generado una gran refractarios, los cuales al expresar un efector, preocupación, debido a las alteraciones en disminuyen o evitan la capacidad de infectarse; neonatos durante la gestación como es la los moscos dominantes letales de uno y dos microcefalia, la cual genera un daño permanente componentes que inducen esterilidad y en el tamaño del cerebro al nacer y disminuyen la población de insectos (Gong-P et consecuentemente en las cualidades cognitivas y al., 2003); los mosquitos con fenotipo sin vuelo

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Cuadro 1. Control Clasificación de Diferentes Tipos de Control Genéticos de Mosquitos. Tipo de control Subtipo Definición Requerimientos Ventaja Desventaja genético I) Control Genético Tecnología del Insecto Estéril La genética clásica utiliza Instalaciones especiales para el uso Ha sido probada su efectividad 1) Es muy costosa respecto a otras clásico de insectos. (SIT Steril Insect Techology), mutaciones inducidas para de radioactividad. en diversos insectos. tecnologías genéticas (Kraaijeveld y Chapman, generar esterilidad o disminuir 2) Se generan desechos radioactivos. 2004). su capacidad reproductiva. 3) Se exponen a los seres humanos involucrados en el proceso. 4) Se deben de liberar constantemente mosquitos irradiados. 5) Se debe de optimizar la dosis de radiación para tener el óptimo de esterilidad/viabilidad y competitividad sexual. II) Mosquitos a) Mosquitos refractarios. Mosquitos que expresan un 1) Efecto antiparasitario y viral 1) Evita la diseminación del No presenta ventaja reproductiva. transgénicos. (Ghosh et al., 2001; Ito et al., péptido o proteína que evita la 2) Expresión órgano o tejido patógeno. 2002; Franz et al., 2006). infección del mosquito por el específico. 2) No extermina a una especie. virus o patógeno. b) Dominante Letal de Uno y Mosquito en el que se porta un 1) Requieren de un gen letal. 1) Disminuye la población del 1) Se debe de comprar o desarrollar Dos Componentes. (Phuc, gen que en el contexto 2) El gen letal debe ser fuerte y insecto. la tecnología propia. 2007). heterocigoto despliega el específicamente regulado para 2) Teniendo líneas transgénicas 2) Se deben de liberar mosquitos fenotipo letal. expresarse durante el desarrollo se pueden reproducir en el constantemente para disminuir la del mosquito y en el medio laboratorio a un costo más bajo población de insectos, porque la ambiente. y menos elaborado que la población transgénica tiende a estrategia SIT. desaparecer. c) Fenotipo Sin vuelo. (Fu et Insectos incapaces de volar por Expresión de una versión del gen 1) Evita la diseminación del 1) Se debe de comprar o desarrollar al., 2010). un defecto en la musculatura de de actina mutante órgano o tejido mosquito. la tecnología propia. las alas. específico. 2) Disminuye la población del 2) Se deben de liberar constantemente insecto. para disminuir la población de insectos, porque la población transgénica tiende a desaparecer. d) Gene Drive (Genéticamente Es la práctica de "estimular una 1) Se requiere de usar un gen 1) Favorece su permanencia y No han sido probados en campo y Dirigido; GD; Oye K. et al., herencia predispuesta o sesgada egoísta o el sistema de CRISPR- sustitución de poblaciones. muchos modelos de GD están en 2014). de genes particulares para alterar CAS9 para favorecer el sesgo 2) Requiere de menos insectos alguna etapa previa de desarrollo. poblaciones enteras”. genético. liberados para disminuir una 2) Requiere de un gen efector o población. blanco para el control del patógeno 3) Podría ser la mejor estrategia o favorecer incremento de su para disminuir una especie de frecuencia genética. mosquito peligrosa para la humanidad.

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Figura 1. Optimización de la exposición a radiación para la generación de insectos estériles. Consiste exponer a los huevos de insecto con partículas gama de fuentes de cobalto 60 o Cesio 137 (60Co o 137Cs), después los huevos son incubados para que se desarrollen a un estado adulto. La radiación produce daño cromosómico en las células del insecto, resultando en la esterilidad deseada pero también causa los efectos somáticos que reducen la competitividad de los machos. Desventajas se requieren grandes cantidades de machos por no todos son estériles, viables o competitivos desde el punto de vista sexual (Helinski et al., 2009).

ESTRATEGIAS DE INGENIERÍA GENÉTICA en trans en otro plásmido. En este último caso la DE INSECTOS introducción del DNA para la generación de moscos transgénicos se realiza microinyectando Transposones para la Introducción de Genes ambos plásmidos al huevo del insecto (Grossman en Insectos. Dos principales tecnologías de et al., 2001; Jasinskiene et al., 1998). transgénesis han sido desarrolladas; la primera se Edición de Genomas para Introducir Genes, basó en la capacidad de los transposones para Quitarlos o Editarlos. El desarrollo de las nuevas recombinar de manera casi al azar en el genoma tecnologías para insertar genes, escindirlos o del insecto y la segunda, está soportada por las editarlos, tuvo su origen en el descubrimiento de nucleasas de doble cadena, está fundamentada la que un corte en un ADN blanco de doble cadena, tecnología de edición de genomas, como se in vivo, estimula la edición del genoma a través describirá más adelante. de una recombinación homóloga (HR: del inglés: En el primer caso, los principales transposones Homologous Recombination) (Rudin et al., 1989; usados fueron el “piggyBack.” y “Hermes” Rouet et al., 1994; Choulika et al., 1995; Bibikova (Grossman et al., 2001; Jasinskiene et al., 1998). et al., 2002; Bibikova et al., 2003). Estudios Estos tienen un tamaño de alrededor de 3,000 posteriores realizados por Chandrasegara y pares de bases y contienen una unidad de Carroll (2016) demostraron la posibilidad de diseñar transcripción que codifica para la transposasa nucleasas basadas en el dominio de unión de (Fig. 2) flanqueada por dos terminales invertidas factores de transcripción del tipo “dedos de zinc” repetidas (TIR). La transposasa cataliza la (Bibikova et al., 2002, 2003). En el mismo grupo de recombinación no homóloga cortando y pegando investigación descubrieron que cuando las hebras de dentro de las TIR, fenómeno conocido como ADN blanco son cortadas y simultáneamente se transposición genética (Atkinson et al., 2001). introduce una secuencia que no presenta identidad Los transposones fueron utilizados manipulando con la secuencia blanco del genoma, éste se repara su estructura, particularmente la construcción por recombinación introduciendo la secuencia no genética de interés se incluye entre las secuencias homologa o bien, reuniendo la doble cadena de invertidas repetidas y la transposasa dentro del manera imprecisa, lo cual genera una inserción o mismo vector de clonación o bien, complementado pérdida de secuencia de ADN (Fig. 3).

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Figura 2. Los piggyBack son una familia de transposones de aproximadamente 3 kilobases con similitud en estructura y propiedades similares encontrados originalmente en una línea celular TN-368 de Anticarsia gemmatalis. Son útiles para la generación de moscos transgénicos, ya que los elementos invertidos pueden ser usados para flanquear una construcción genética de interés y la transposasa puede ser expresada fuera las secuencias invertidas repetidas en un mismo plásmido o proporcionadas en trans en otro plásmido. La transposasa actúa como enzima de corte y pegado para la introducción de las construcciones genéticas incluidas entre las dos secuencias invertidas IR-5’ e IR-3´ (Grossman et al., 2001).

Figura 3.- Ingeniería Genética usando Nucleasas Programables (NP): ZFNs, Talens y CRISPR-Cas9. Las nucleasas se pueden programar para realizar un corte doble en un sitio específico de la doble cadena del ADN; el doble corte en el ADN induce la reparación por el sistema de reparación homologa HDR o no homologa NHEJ, (del inglés: HDR Homology-Directed Repair y Non-Homologous End Joining NHEJ, respectivamente). Durante un evento de doble corte del ADN realizado por cualquiera de las endonucleasas la célula escoge alguno de las dos vías de reparación. La reparación por la vía de HDR es favorecida cuando se introducen secuencias que comparten identidad de al menos de 20 pares de bases al sitio de corte, mientras que al no encontrar una secuencia homologa de ADN alrededor del sitio de corte, la célula repara por unión directa los extremos de las cadenas de ADN. La inducción del sistema de reparación de ADN por las NP, se ha utilizado para desarrollar la ingeniería genética in vivo o también llamada ingeniería genómica (figura adaptada de Chandrasegara S y S. Carroll, 2016).

A este proceso le llamaron NHEJ (del inglés: (DSB, del inglés: Doble Strand Break): conocidas Non Homologous End-Joining (NHEJ) (Bibikova como ZFNs, TALENs y CRISP-CAS9 son et al., 2002). Los estudios antes mencionados utilizadas, para la edición de genomas y transgénesis fueron la base para el desarrollo de la poderosa (Fig. 3). Durante la inserción de genes por DSB, el tecnología de ingeniería genómica conocida en la requisito es que la construcción de interés lleve actualidad como Edición de Genomas. En la secuencias idénticas cortas (de 20 pares de bases) actualidad tres nucleasas de doble cadena de DNA del genoma donde se desea recombinar. Esta

119 Folia Entomol. Mex. (n. s.), 3(3): 114−138 (2017). tecnología, que se ha ensayado en insectos y en cadena de ADN, así que, para generar un doble muchos organismos, se ha demostrado que es más corte, se deben diseñarse dos ZFNs: una ZFN- eficiente que los transposones para insertar genes, Izquierda y otra ZFN-Derecha, para que ya que en un solo evento de transformación se reconozcan secuencias vecinas en una región con puede tener la inserción en los dos cromosomas, corte coincidente (Chandrasegara y Carroll., generando fácilmente líneas transgénicas 2016) (Fig. 4a). 2016) (Fig. 4a). homocigotas y además, se puede dirigir la Por otro lado, el sistema de nucleasa TALENs inserción en el lugar del genoma que sea más fue desarrollado gracias al descubrimiento de un conveniente, evitando así, la inserción al azar y los módulo de unión a ADN derivado de un factor de problemas de silenciamiento posicional del virulencia de Xantomonas (un patógeno de transgén, por estructura de cromatina (Reid y plantas). Este factor de virulencia se llama TALE, O´Brochta, 2016). mismo que presenta un dominio central repetido Sistemas de nucleasas ZFNs y TALENs. Las que consiste en 33 a 35 aminó ácidos (Christian et dos primeras herramientas antes mencionadas son al., 2010; Miller et al., 2011). Cada módulo el resultado del estudio de la estructura función de repetido es idéntico excepto en dos aminoácidos las nucleasas de restricción tipo II llamada FokI y en posiciones 12 y 13, conocidos como RVDS de los dominios de unión a ADN tipo dedos de (del inglés: Repeat Variable Di-Residues). zinc (Zinc Finger o ZF), el cual forma parte de un Mientras cada ZF reconoce de tres a cuatro bases; factor de transcripción IIIA de la rana Xenopus cada motivo TALE reconoce un solo nucleótido. laevis, que se une a unas secuencias consenso La especificidad del RVD opera de la siguiente ricas en GC (5’ GCGTGGGCG3’) (Miller et al., manera: los residuos NI reconocen A, HD 1985; Berg, 1990). La enzima Fok I, está formada reconoce C, NG o HG reconocen T and NN por dos dominios estructurales: un dominio de reconoce G o A (Fig. 4b) (Moscou y Bogdanove, unión a una secuencia/s específica ADN de doble 2009; Christian et al., 2010; Mussolino et al., cadena (5´GGATG-3´:5´CATCC3´) y un dominio 2011; Deng et al., 2012). Una diferencia de nucleasa de corte inespecífico entre 9-13 bases importante entre los dominios ZF y el módulo del sitio de reconocimiento. Esta propiedad TALE, es la independencia de los módulos permitió a través de ingeniería genética, fusionar vecinos, lo que lo hace conceptualmente sencillo la secuencia de ADN que codifica para el dominio para el diseño de módulos de reconocimiento a de nucleasa (ZFN) y unirla con la secuencia de secuencias de ADN específicas, pero no desde el ADN que codifica para el dominio de unión a punto de vista técnico, por lo que su costo es ADN ZF, del factor de transcripción (Fig. 4a) elevado (hasta US $5000 / blanco). Estos módulos (Kim Y-G, 1996). La reprogramación a diferentes de diseño se deben fusionar (a nivel de las sitios de pegado es posible gracias a los estudios secuencias codificantes correspondientes) con el de la estructura de la proteína ZF, permitió dominio de nucleasa de la enzima de restricción entender, que residuos de aminoácidos de la alfa hélice Fok I. Al igual que las ZFNs, las nucleasas del dominio ZF, interaccionan específicamente con TALENs deben ser diseñadas en pares (izquierda cada uno de los cuatro nucleótidos del ADN. y derecha) para lograr un doble corte en la cadena Además, el dominio ZF que esta repetido tres de ADN (Fig. 4b) (Chandrasegara y Carroll, veces en tándem, se le puede agregar uno dominio 2011). ZF y se pueden generar cambios específicos de Sistema de Nucleasa CRISPR-CAS9. La esos dominios para un nuevo reconocimiento de tercera nucleasa usada para editar genomas una secuencia de ADN contigua y especifica proviene del descubrimiento del sistema inmune (Chandrasegara y Carroll 2016). La desventaja adaptativo CRISPR-CAS9 de la bacteria más importante es que, para cada sitio seleccionado Streptococcus pyogenes, cuyo nombre deriva la con fines de edición de genoma, se deben diseñar organización del locus donde se encuentra la y ejecutar nuevos cambios del dominio ZN nucleasa CAS9 (del inglés CRISPR: Clustered múltiple. La nucleasa quimérica ZFN funciona Regular Interspaced Short Palindromic Repeats haciendo un corte sencillo en una hebra de la CRISPR-Associated Sequence 9).

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Figura 4. Esquema que representa las nucleasas programables. Se muestran las nucleasas unidas a su sitio blanco. En a) schematic nucleasas unidas a 4 dedos de zinc, en b) TALENs y en c) CRISPR-Cas9-RNAguía (adaptado de Chandrasegara S y S. Carroll. 2016).

En realidad, CRISPR-CAS9 es uno de los tres conocer a mayor detalle los eventos de interacción sistemas CRISPR-CAS encontrados en el 50 % de insecto-vector patógeno o virus, pero de hecho ya las diversas especies estudiadas y es del tipo II el se plantean una infinidad de estrategias para la cual el más sencillo desde el punto de vista supresión y sustitución poblacional de insectos a estructural, lo que facilita su manipulación para el través de genética dirigida, usando el sistema uso de la ingeniería genómica (Chandrasegara y CRISPR-CAS9 (Esvelt et al., 2014). Carroll, 2011; Jiang y Doudna, 2017) (Fig. 4). Sistema Sintético tTAV-OP7 para la Expresión No obstante que las nucleasas programables Regulada de Efectores en Insecto por ZFNs y TALENs se desarrollaron primero y han Tetraciclina. Los elementos de control del operón sido usadas con éxito por muchos autores para de resistencia a tetraciclina (Tc) del transposon generar ingeniería genómica, incluyendo la Tn10 de Escherichia coli, fueron utilizados por generación de moscos transgénicos, el sistema primera vez para desarrollar un sistema altamente CRIPR-CAS9 ha tenido un mayor éxito en el uso eficiente de control transcripcional negativo en y versatilidad en la ingeniería genómica debido a células de mamífero. Lo anterior se consiguió su sencillez, ya que la proteína CAS9 siempre es fusionando la secuencia de ADN que codifica el núcleo de reacción y la especificidad sobre las para el represor de tetraciclina (tet) con la secuencias de ADN blanco es mediado por la secuencia codificante ADN de los últimos 109 secuencias de ARN guía intercambiables que aminoácidos del dominio de transactivación de la varían sólo en los 20 nucleótidos de la secuencia de proteína V16 del virus herpes humano (V) y reconocimiento, manteniendo los otros elementos colando el elemento de ADN operador OP en siete de la estructura que forma plegamientos secundarios repeticiones (OP7), justo antes de un promotor que son importantes para ser reconocidas por la mínimo de citomegalovirus humano (PMC) y el proteína CAS9 (Chandrasegara y Carroll, 2016) gen de luciferasa, que se expresa de manera (Fig. 5). El sistema CRISPR-CAS9, no solo se constitutiva (Figs. 6 y 7). Con esta construcción se presenta como una herramienta prometedora para logró modular la transcripción de luciferasa en la generación de moscos transgénicos, ofrece una respuesta a la concentración de Tc, alcanzando un variedad de oportunidades, para desarrollar “nocaut apagado a concentraciones de 1 µg/ml con un genético”, silenciamiento transcripciónal, modificación máximo de transcripción de cinco veces en de elementos reguladores de la transcripción, y ausencia de Tc (Gossen y Bujard, 1992). sobre-expresión de genes, lo cual potenciará el Usando el sistema de regulación tTAV-OP7, conocimiento de la fisiología molecular de los pero en este caso bajo un promotor mínimo de seres vivos y, en particular, la oportunidad de heat shock 70 fue evaluado en insectos (en líneas

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Figura 5.- La edición genomas a través de ARNguia-CAS9. La nucleasa Cas9 y la guía de ARN, debe ser primero introducida en la célula diana. Esto se logra mediante la transfección de los plásmidos de expresión que contiene ambas secuencias codificantes, pero la introducción del ARNm de CAS9 y el ARN guía también es eficaz. El ARN guía dirige a Cas9 para unir secuencias de ADN diana. En el blanco se forma una burbuja que debe estar flanqueada por un adecuado motivo adyacente (PAM), (con secuencia NGG). Sí el ARN guía es idéntica con solo unos desajustes en el extremo 5´del espacio de hibridación, Cas9 cortará las dos cadenas del ADN generando extremos romos. Sí se suministra con una plantilla de reparación que contiene los cambios deseados y homología a las secuencias a ambos lados de la ruptura, la célula puede utilizar la recombinación homóloga para reparar la ruptura mediante la incorporación de la plantilla de la reparación en el cromosoma. De lo contrario, la ruptura será reparada uniendo los extremos, lo que resulta en la perdida de algunos nucleótidos y la interrupción del gen (Jinek et al., 2012 (modificada de Esvelt et al., 2016).

Figura 6. En a) se presenta la construcción genética para producir el transactivador quimérico tTAV, esto se logró fusionando la secuencia del gen regulador de tetraciclina TR con los últimos 327 nucleótidos del gen V16 del virus herpes generando una proteína de fusión. b) La secuencia primaria del transactivador quimérico tTAV tiene tres dominios estructurales que se pliegan para darle una integridad funcional. En b) y c) se presentan los tres dominios de tTA: el dominio de unión a ADN (DBD), el dominio de unión a tetraciclina (BTCD) y el dominio de transactivación que recluta a la ARNpol II para iniciar la transcripción en un promotor mínimo (PM). d) En ausencia de Tc el regulador tTAV se une al ADN reconociendo la secuencia OP, lo cual posiciona el dominio TD, para reclutar componentes del RNA polimerasa II en el PM (Gossen y Bujard, 1992). transgénicas de), donde se demostró por el fue un paso importante para el desarrollo del funcionamiento adecuado de este sistema para la control poblacional de insectos en A. aegypti, ya expresión del gen Ala5 que dispara la muerte que los elementos de control fueron utilizados celular en un sistema de dos componentes con para generar la cepa OX513A de moscos patrón de expresión durante el desarrollo transgénicos, la cual lleva un gen dominante letal embrionario y larval y encendido-apagado en que actúa a nivel larvario como un sistema de un ausencia o presencia de Tc en Drosophila solo componente (Figs. 8 y 9) (Phuc et al., 2007). melanogaster (Stebbins et al., 2001). Lo anterior

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Figura 7. La primera construcción genética para controlar la transcripción de manera negativa en presencia de tetraciclina fue desarrollada por Gossen y Bujard en 1992. Se muestra, en cuadros negros los siete sitios para el pegado (OP7) del transactivador quimérico (tTAV), que al unirse a estos sitios favorece la transcripción de un promotor mínimo, el cual incluye la caja TATAAA y el sitio de inicio de la transcripción de un promotor de citomegalovirus humano que controlan el gen reportero de luc (del gen de lucifersasa) (Gossen y Bujard H, 1992).

Figura 8. Sistema letal de retroalimentación positiva o también conocido como de sistema de un componente. Se muestra la construcción realizada por Luke Alpey y colaboradores para la generación de moscos transgénicos dominante letal de acción retardada (del inglés Late-Acting Dominant Lethal: LADL). En donde el transactivador químerico tTAV está bajo el control de su propio sitio de unión, tetO, el promotor mínimo de Drosophila Hsp70, y una secuencia 3 ' UTR de Drosophila fs 1-K10 que favorece la terminación y el pegado del poli A durante la transcripción (ver figura 6 y es similar a lo descrito en la figura 4). El elemento funciona de la siguiente manera: en ausencia de tetraciclina, tTAV se une a tetO y dirige la expresión de más tTAV, en un bucle de retroalimentación positiva. En presencia de tetraciclina, el factor de transcripción tTAV se une tetraciclina; lo que genera un cambio conformacional que afecta el dominio de unión a ADN y por lo tanto no se une tetO, lo que no conduce a la expresión de más tTAV. En consecuencia, esta construcción da niveles muy altos de expresión de tTAV en ausencia de tetraciclina, pero la expresión sólo llega a nivel basal en presencia de tetraciclina. La expresión de alto nivel de tTAV es tóxico, posiblemente debido a la interacción del dominio VP16 con factores de trascripción clave factores durante el desarrollo (Phuc et al., 2007; figura modificada de Gabrieli et al., 2014).

Genes Marcadores para Mosquitos Desde que el ADNc que codifica para la GFP fue Transgénicos. La proteína nativa verde clonado por Prasher y colaboradores (1992), se ha fluorescente (Green Fluorescent Protein: GFP), fue utilizado como un marcador de expresión genética, aislada originalmente de la medusa Aequoria en estudios de tráfico y localización de proteínas en victoria del pacifico norte (Shimomura et al., 1962). células y tejidos de diversos organismos. Lo anterior Se demostró que esta tenía propiedades especiales: se consigue fusionando la secuencia codificante de no necesita de sustrato para fluorescer, es muy la GFP con el promotor, o fase de lectura con la estable en tejidos fijados o vivos (Ward, 1979). secuencia de ADNc codificante de la proteína de

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Figura 9. Estructura del sistema letal de un componente (ver texto). La construcción genética está integrada dentro de las secuencias invertidas repetidas (IN-REP) del transposon piggyBac. En el extremo 5´, justo debajo del IN-REP 3´del piggyBac, se encuentra el promotor de Act5, que se expresa en la mayor parte del cuerpo del insecto. El promotor Ac5 activa la transcripción de la proteína roja fluorescente (Dsred2) al encontrarse rio arriba de éste; por lo que se usa como marcador genético para seguir a los moscos transgénicos. El sistema letal de retroalimentación positiva o de un componente, es construido con una región sintética de siete sitios de pegado (tetO7) para la proteína reguladora. La región tetO7, se encuentra justo antes del promotor mínimo de HSP70 y en conjunto activan la transcripción del regulador transicional quimérico tTAV, el cual tiene varios dominios funcionales, como son el dominio de unión a ADN, el dominio de regulación que se une a tetraciclina y el dominio de trans-activación de la proteína V16 del virus herpes de humano. Este regulador se une a su propio promotor como un sistema de retro-alimentación positiva, que se ha sugerido es letal por que posiblemente secuestra reguladores transcripcionales durante el desarrollo del insecto (Kim et al., 2007.) interés (Cubitt et al., 1995; Prasher, 1995; Ward, desarrollado por el grupo Alphey et al. (2010), 1979). Se ha logrado la generación de mutantes de basándose el sistema de regulación tTAV-OP7 GFP, que presentan diferentes rangos de excitación- (Figs. 4 a 7). En este caso el módulo sintético es emisión, resultando en la fluorescencia en diversos sencillo: el gen efector (que codifica para la colores como en rojo y azul, (red-shifted GFP: rsGFP proteína que se desea expresar), es el mismo y la Blue Fluorescent Protein: BFP), por lo que se regulador transcripcional que activa su propia pueden utilizar en diversos blancos de localización y transcripción, al llevar un promotor quimérico expresión simultánea en la misma célula o tejido OP7-PM, cuya expresión autóloga es tóxica en (Ormö et al., 1996). Otra proteína que se ha usado insectos (Fig. 7). El mecanismo por el cual la frecuentemente como marcador genético para sobre expresión del transactivador tTAV es tóxico insectos es DsRed la cual fue aislada del coral para insectos se desconoce, ya que trabajos Discosoma spp. (Matz et al., 1999). Algunas de sus previos se ha encontrado no ser letal en ratones, variantes mutagénicas como mCherry, han sido sin embargo, se ha propuesto que en insectos la usadas como marcadores genéticos para la selección sobreexpresión de tTA secuestra a reguladores de moscos transgénicos bajo el control de expresión clave del desarrollo embrionario en insectos o de promotores órgano o tejido específico, como es el interfiriendo con el sistema de proteólisis caso del promotor Act5 de actina muscular, que se dependiente de ubiquitina (Thomas et al., 2000). expresa en el cuerpo del insecto y el promotor 3xP3 En el caso del sistema de dos componentes el que se expresa específicamente en ojos. Esto permite transactivador quimérico tTAV regula la la simple selección visual del portador, sin destruir transcripción de un gen efector (HidAla5), el cual ningún órgano o tejido del mosquito transgénico es un gen que dispara la muerte celular (Dong et al., 2015). programada, logrando la expresión específica de tejido a través de poner el gen que codifica para el INGENIERÍA GENÉTICA PARA EL CONTROL transactivador tTAV bajo un promotor órgano o DE ENFERMEDADES TRASMITIDAS POR tejido específico, mientras que el efector se pone VECTOR bajo el promotor OP7-PM (Heinrich y Scott, 2000; Horn y Wimmer, 2003). La ventaja es que se Insectos que Trasmiten un Gen Dominante puede modular la expresión del gen de interés porque Letal de Uno y Dos componentes. El sistema de es posible apagarlo en presencia de Tc, (Figs. 9 y 10) dominante letal de un componente fue (Stebbins et al., 2001).

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Figura 10. El sistema de letalidad embrionaria de dos componentes fue desarrollado en Ceratitis capitata por Schetelig et al., en 2009. En a) se muestra el sistema de dos componentes que consiste en un promotor embrionario Sry-a que regula el transactivador quimérico tTAV, que a su vez controla la expresión del gen que codifica para la proteína HindAla5, la cual es un elemento en la cascada de transducción de señales que dispara la muerte celular programada. El sistema letal es regulado negativamente por Tc, lo que permite reproducir los insectos en el laboratorio y en ausencia de Tc el gen HindAla5 se expresa durante el desarrollo embrionario y es letal en la progenie (Schetelig et al., 2009).

Los primeros indicios de la funcionalidad de esta ha sido utilizado en la supresión de insectos para tecnología fuerón demostrado en un trabajo el control de las ETV. reportado en Drosophila. melanogaster Meigen, Mosquitos con Fenotipo sin vuelo. Los en donde se construyó un módulo que lleva el métodos modernos en el control de insectos transactivador tTA bajo un promotor (yolk 1) que requieren del conocimiento detallado del ciclo de se expresa en la yema de huevo e insertando el gen vida, fisiología y comportamiento del mosquito. Ala5 pro-apoptótico Hid bajo el promotor OP7, es En este sentido el vuelo es una función fundamental posible regular la transcripción en presencia de Tc durante el apareamiento sexual, así como en la (Heinrich y Scott, 2000). Tanto los machos como dispersión y escape de los depredadores en el estado en las hembras de una cepa que llevan ambos adulto. Con estas consideraciones se desarrollaron componentes son viables en medio suplementado líneas transgénicas de A. aegypti para tener un con Tc, pero sólo los machos sobreviven medio en fenotipo reprimible no volador específico ausencia de Tc. Heinrich y Scott (2000) proponen expresado solo en hembras. Lo anterior se logró que una cepa con tales propiedades sería ideal utilizando dos transgenes separados o un único para un programa de liberación para garantizar un transgén, y el uso del promotor de actina 4 (Act4) adecuado control de Insectos, ya que es más eficaz para la expresión específica de una versión que el método SIT. Un sistema de letalidad mutante de actina no funcional en las hembras de embrionaria de dos componentes fue desarrollado A. aegypti (Fu et al., 2010). También se han en Ceratitis capitata. El sistema consiste en un desarrollado líneas transgénicas de Aedes promotor embrionario Sry-α que regula el albopictus Skuse, con un fenotipo similar (Labbé transactivador quimérico tTAV, mismo que a su et al., 2012); sin embargo, no existen estudios que vez controla la expresión de gen que codifica para se hayan realizado en ambientes confinados ni la proteína HindAla5, la cual es un elemento en la tampoco en campo, para poder estimar o medir su cascada de transducción de señales que dispara la efectividad. muerte celular programada. El sistema letal es regulado negativamente por Tc, lo que permite MOSQUITOS TRANSGÉNICOS REFRACTARIOS reproducir los insectos en el laboratorio y, en A PATÓGENOS O VIRUS ausencia de Tc, el gen HidAla5 se expresa durante el desarrollo embrionario y resulta letal en la Mosquitos Refractarios a Malaria. La malaria progenie (Fig. 10) (Schetelig et al., 2009). No permanece como una de las enfermedades más obstante, el sistema letal de dos componentes no devastadoras, causando alrededor de un millón de

125 Folia Entomol. Mex. (n. s.), 3(3): 114−138 (2017). muertes de seres humanos por año en el mundo, Se ha demostrado en muchos trabajos que el debido a esto ha sido objeto de intenso estudio diseño y uso de ribozimas llamadas cabeza de durante varias décadas. El conocimiento del ciclo martillo (del inglés Hammerhead ribozymes: de vida de este parasito indica que el estadio más HRZ's) son una tecnología útil para apagar genes vulnerable del Plasmodium es el ooquiste o evitar la infección de virus de ARN (Scott et al., encontrado en el intestino medio (de sólo cinco 2013). En un trabajo reciente se diseñaron ooquistes por insecto), razón que lo convierte el ribozimas dirigidas contra genes proteínas primer blanco de ataque empleando mosquitos estructurales del virus CHIKV y se demostró que transgénicos que expresen moléculas efectoras son efectivas para suprimir la infección del virus antiplasmódicas o, en su caso, mediante para- tanto en células Vero como en líneas transgénicas transgénesis que involucra el uso de simbiontes de mosquitos. Este informe proporciona una transgénicos del mosquito, mismos que expresan prueba de que las HRZs, adecuadamente los efectores en presencia del ooquiste (Wang y manipuladas son poderosos efectores antivirales Jacobs-Lorena, 2013). En Anopheles stephensi para la generación de mosquitos transgénicos Liston, el péptido MS1, que se une a un posible resistentes a virus (Mishra et al., 2016). receptor del oocineto, se ha expresado en el intestino medio en MTs; dicho péptido inhibe ESTRATEGIAS DE REEMPLAZAMIENTO O fuertemente la invasión del oocinete y DISMINUCIÓN POBLACIONAL DE subsecuentemente éste es incapaz de trasmitir el INSECTOS POR GENÉTICA DIRIGIDA parasito (Ghosh et al., 2001; Ito et al., 2002). (GENE-DRIVE) Reportes posteriores de diferentes laboratorios han expresado diferentes péptidos con resultados La Genética Dirigida (GD), se define como la similares. Estos estudios demuestran que es práctica de estimular la herencia sesgada de genes posible reducir la trasmisión del Plasmodium vía particulares o módulos sintéticos, con el fin de modificación genética del mosquito vector. No disminuir o sustituir una población silvestre por obstante, estos logros, se debe de trabajar en la un organismo menos perjudicial. Aunque el ventaja genética (genética dirigida o Gene-Drive concepto se desarrolló a inicios de la década GD) para que los moscos transgénicos pasada, éste se ha reforzado gracias a la tecnología refractarios, portadores de los efectores antes de edición de genomas que proporciona un mencionados, pudiesen ser efectivos para su número vasto de estrategias en donde sólo la aplicación en algún programa de sustitución imaginación es el límite (Oye et al., 2014; Fig. poblacional. 11). El desarrollo de estrategias GD puede ser el Mosquitos Refractarios a Virus. Debido a que camino para hacer que una población de insectos el genoma del virus del dengue es de ARN, una de refractaria sea capaz de sustituir a una población estas estrategias para la generación de moscos previa, o bien que a través de GD sexual podría refractarios se basó en la tecnología del ARN permitir la supresión poblacional, (favoreciendo interferente (ARNi), la cual dirige la maquinaria que una población dada de insectos tienda a de degradación de ARN hacía el genoma viral, desaparecer de manera sustentable). Aquí generando moscos resistentes a la infección. Los describiremos algunos elementos genéticos resultados obtenidos fueron que la línea Carb77 naturales que tienen propiedades GD (elementos que expresa el ARNi, redujo la infección del Medea, genes de endonucleasa HEGs: Homing mosquito significativamente en comparación con Endonuclease Genes, y la bacteria intracelular el control, mostrando un alto nivel de resistencia Wolbachia), los cuales son interesantes para contra dengue 2 (DEN-2). Esto sugiere que esta manipulación y su posible aplicación en tecnología puede ser una poderosa herramienta programas de sustitución poblacional de insectos para el desarrollo de moscos refractarios a virus y para controlar las ETV. Posteriormente un posible uso en estrategias de reemplazo describiremos algunas de las nuevas estrategias de poblacional para controlar la transmisión del GD basadas en el sistema de edición de genomas DEN-2 (Franz et al., 2006). CRISPR-CAS9 (Esvelt et al., 2014).

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Figura 11. El concepto de genética dirigida (del inglés Gene Drive: GD) lo podemos ejemplificar en un caso hipotético de un transgen que bloquea la transmisión de la malaria (pero que no tiene valor selectivo en la población de insectos). Se podría impulsar el incremento en su frecuencia genética en la población, sustituyendo a los silvestres (sin color) a través de una construcción genética que incluya un gen que proporciona una ventaja selectiva (Gene Drive o GD) (en rojo) (figura modificada de Esvelt et al., 2014).

Elementos Medea. Los Medea son miembros individuos a nivel experimental (Gimble y de una clase de “elementos genéticos egoístas” Thorner, 1992). Debido a que este es un elemento que mejoran su transmisión genética al inducir la genético móvil que puede terminar invadiendo un muerte de aquellas crías que no logran heredar el genoma, teniendo algún valor negativo en algunos elemento (Burt y Trivers, 2006). Éste se identificó individuos de la población, por lo que desde el por primera vez en el escarabajo de la harina punto de vista GD para la sustitución poblacional (Tribolium castaneum Herbst), a través del lo hace interesante. Esto ha atraído la atención de análisis de los cruces entre cepas aisladas diversos investigadores hacia el estudio de los geográficamente. El elemento Medea se fija en mecanismos de recombinación destinados a una posición del genoma, y tiene la característica controlar de manera precisa y dirigida la de que la descendencia de las hembras expansión dentro de un locus en el genoma, para heterocigotas que se aparean con machos poder utilizarlo como un sistema de GD en algún silvestres, únicamente sobreviven aquellos que programa de sustitución poblacional, asociando tienen el elemento Medea. En contraste, los algún gen de interés para el control de las ETV machos Medea heterocigotos que se cruzan con (Deredec et al., 2008; Roy et al., 2016). hembras silvestres dan lugar al tipo silvestre de Bacterias del Genero Wolbachia. Existe una manera mendeliana (Beeman et al., 1992). No gran variedad de cepas de Wolbachia que se hace mucho tiempo, fue desarrollado un módulo comportan como si fuesen elementos de ADN sintético Medea que tiene los elementos para egoísta principalmente, y algunas veces, poder comportarse como el natural; no obstante, mostrando ciertos aspectos simbióticos de las presentó una baja frecuencia de invasión y un alto poblaciones de artrópodos y nemátodos, por lo costo reproductivo en estudios poblacionales en que se ha pensado utilizar esta información como D. melanogaster. Así que es necesario ajustar un recurso de GD para suprimir la transmisión del algunos parámetros para que, en el futuro, dicho virus del dengue (Hoffman et al., 2011). A pesar módulo resulte efectivo para su acoplamiento a un de que Wolbachia no tiene una gran capacidad gen de resistencia patógenos o virus para su infecciosa entre los insectos en la escala de aplicación en la generación de moscos tiempo; su mayor éxito de expansión en la transgénicos refractarios (Marshall et al., 2011b). naturaleza se debe a que estos elementos se Genes de endonucleasa. Los HEGs que tiene un transmiten por vía materna, al igual que las comportamiento de expansión en las frecuencias mitocondrias, pero generando una distorsión en la genéticas sobre todo cuando la nucleasa reside biología reproductiva de su anfitrión (Jansen et dentro de un intrón tipo I y puede esparcirse al., 2008). En este caso, los machos no propagan dentro de la población hasta llegar a un 95 % los al endosimbionte sólo es heredado de la madre; en

127 Folia Entomol. Mex. (n. s.), 3(3): 114−138 (2017). lugar de eso los machos producen espermas ecológico negativo por el uso de esta bacteria modificados que forman cigotos viables (Cuadro 2). solamente con los huevos de las hembras Genética Dirigida (GD) con CRSIPR-CAS9. infectadas, un fenómeno conocido como Aunque existen varios tipos de elementos incompatibilidad citoplásmica (CI), fusionando genéticos egoístas en la naturaleza, pocos han sido como un elemento esterilidad parcial de machos diseñados con éxito en el laboratorio hasta el perjudicando así la reproducción de hembras no momento. No obstante, con el descubrimiento del infectadas. sistema CRISPR-Cas9 se abren un sinnúmero de Debido a que Wolbachia es un simbionte oportunidades para ser utilizado el diseño, obligado, no es posible cultivarla y no se han optimización y mejoramiento de unidades de podido generar herramientas de ingeniería genes sintéticos egoístas GD para su uso en el genética para modificarla. Así que, para utilizar a control ETV. Aquí describen dos diferentes tipos esta bacteria en el control genético, se deben de de unidades de genes de ingeniería y sus liberar mosquitos infectados, los cuales son aplicaciones potenciales en la manipulación de las generados a través del aislamiento de Wolbachias poblaciones de mosquitos silvestres (Macias et simbiontes de otras especies de insectos como D. al., 2017) (Fig. 12). melanogaster que, a través de técnicas de Genética dirigida (GD) utilizando el sistema fragmentación celular, y mediante microinyección CAS9-ARN guía. En este sentido se ha estado de embriones de A. agypti se pudieron obtener trabajando en diferentes grupos de investigación líneas hiperinfectadas (Joubert 2016). La en el mundo; sin embargo, están sólo en etapa de posibilidad de infectar A. aegypti con Wolbachia desarrollo. Por ejemplo, se elige un gen esencial permitió encontrar que el fenómeno de imcompatilidad cuya pérdida genere la inviabilidad del organismo citoplasmica favorece la refractabilidad contra (Fig. 13). Las ventajas se incrementan introduciendo dengue y zika (Moreira et al., 2009). No obstante, varias unidades de ARN guía, con lo cual se existen reportes que en A. albopictus infectados aumenta la frecuencia de corte y se reduce la con Wolbachia no se tiene ningún efecto sobre la evolución de alelos resistentes a GD hasta niveles refractabilidad del virus dengue (Rainey et al., indetectables. Al elegir sitios diana dentro de un 2014); o incluso se incrementa la susceptibilidad gen esencial, éste debe ser modificado para hacer a la infección de Culex tarsalis Linnaus, contra el un alelo resistente, e incluirlo en la construcción, Virus del Nilo Occidental (Dodson et al., 2014; con el sistema CAS9-ARN guía, al que contenga Hughes et al., 2012). el gen marcador y gen de resistencia para el Las bases moleculares de la refractabilidad no se patógeno o virus que se trate. Cualquier conocen, pero se sabe que induce diversos acontecimiento que elimine los sitios blanco del componentes del sistema inmune del mosquito, sistema CAS9-ARN, producirán letalidad en las especies reactivas de oxígeno y la competencia lugar de crear una unidad de alelo resistente, lo de recursos limitantes como el colesterol que aumenta aún más la robustez de la (Kambris et al., 2009). La transferencia vertical construcción genética GD y favoreciendo la de Wolbachia es el principal mecanismo de sustitución poblacional de insectos (Esvelt et al., propagación; no obstante, se ha encontrado 2014) (Fig. 13). también evidencias de la transferencia horizontal Sistema de CRISPR-Cas9 de Distorsión de las utilizando, marcadores moleculares de cepas de Frecuencias Sexuales para el Control Genético Wolbachia (Ahmed et al., 2016). Por lo anterior de Insectos (Gene Drive Sex). Una estrategia se debe considerar conocer a mayor detalle el recientemente descrita por Galizi et al. (2016), se comportamiento de las diversas cepas de basa en las nucleasas CAS9 y una guía de ARN Wolbachia para hacer estudios en el laboratorio, que se dirige contra un gen que reside en el antes de proponer un programa de control ETV a cromosoma sexual. Para evaluar el sistema se fin de evitar errores de estrategias que pudieran desarrollaron líneas genéticas de Anopheles poner en riesgo la salud humana o un impacto gambiae sensu stricto CRISPRSD. Todas las líneas

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Cuadro 2. Tipo de Control de Mosquitos (ventajas y desventajas). Métodos de control de insectos Ventajas Desventajas Químico 1) Efectividad alta 1) Generación de resistencia 2) Baratos 2) No hay especificidad (dañan insectos benéficos). 3) Fácil aplicación 3) Contaminante en el ambiente, 4) Potencialmente teratógenos y carcinógenos. Wolbachia 3) Su uso podría ser relativamente más 1) Son obligadamente intracelulares, por lo que no se pueden cultivar fuera de barata que los mosquitos transgénicos. las células del huésped. 2) No hay herramientas genéticas para manipular este organismo. 3) Baja infectividad de insecto a insecto; pero se trasmiten a través de los procesos sexuales a la descendencia. Se requiere la liberación de mosquitos infectados. 4) No son específicos (pudiendo perjudicar especies importantes y generar un desequilibrio ecológico). 5) Poco estudiados. 6) La protección contra un tipo de virus o patógeno no protege contra otro, o puede dar mayor susceptibilidad. Genética clásica Programas de este tipo han funcionado 1) Requiere de infraestructura para la generación de mosquitos estériles. para el control de poblaciones de 2) Se requieren estudios de optimización del proceso de esterilización de insectos. mosquitos. 3) Genera residuos radioactivos contaminantes. 4) Se requiere de personal altamente especializado en la producción de mosquitos estériles. 5) Impacto negativo en la salud del personal expuesto a la radiación. 6) Altamente costoso. Mosquitos transgénicos 1) Puede evitar la diseminación del 1) Se debe de comprar o desarrollar tecnología propia. patógeno o disminuirlo del mosquito. 2) Se deben de liberar mosquitos constantemente para generar la refractabilidad 2) Podría ser la estrategia para a patógenos o para disminuir la población de insectos, porque la población exterminar una especie de mosquito transgénica tiende a desaparecer. peligrosa para la humanidad. 3) Muchos de los modelos transgénicos no han sido probados en campo y 3) Altamente especie específico. muchos de ellos están en alguna etapa previa de desarrollo. 4) Se podrían generar mutaciones con fenotipo silvestre.

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Figura 12. Genética dirigida (GD) utilizando el sistema CAS9-ARN guía. Las ventajas incrementan introduciendo varias unidades de ARN guía, lo que aumenta la frecuencia de corte y dificulta la evolución de alelos resistentes a GD a niveles indetectables. Al elegir sitios diana dentro de un gen esencial, debe ser modificados para hacer un alelo resistente e incluirlo en la construcción para unirlos a la construcción genética que lleva el sistema CAS9-ARN guía, y tanto al gen marcador, como al gen refractario (por ejemplo). Cualquier acontecimiento que elimine los sitios blanco del sistema CAS9-ARN, producirán letalidad en lugar de crear una unidad de alelo resistente, lo que aumenta aún más la robustez de la construcción genética GD y favoreciendo la sustitución poblacional de insectos (modificada de Esvelt et al., 2016).

Figura 13.- Sistema de CRISPR-Cas9 de Distorsión de las Frecuencias Sexuales para el Control Genético de Insectos (Gene Drive Sex). Esta se basa en las nucleasas CAS9 y una guía de ARN que se dirige contra un gen que reside en el cromosoma sexual. En este caso se genera una construcción genética dentro de las secuencias invertidas repetidas del transposon piggyBac. La construcción contiene del lado izquierdo al gen dsRed que codifica para la proteína roja fluorescente bajo el promotor P-3xP3 de expresión especifica de ojos (como marcador genético) y en la parte central tiene el gen que codifica para la enzima CAS9, el cual está bajo el promotor b2 de tubulina que se expresa en células de línea germinal y del lado derecho el gen que codifica para la guía de ARN bajo promotor P-U6 de ADN polimerasa III que se expresa en muchos tipos y tejidos celulares. La expresión de CAS9 y la guía de ARN en células de línea germinal durante la espermatogénesis, permite que rompan un gen esencial que se encuentra en el cromosoma sexual X, teniendo como resultado espermas que llevan el cromosoma masculino, lo que favorece la reproducción únicamente de machos (modificada de Galizi et al., 2016).

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CRISPRSD mostraron una fuerte distorsión de las selva Pahang en Malasia, donde se liberaron frecuencias sexual, con un sesgo masculino entre machos adultos de misma línea de mosquitos la progenie que van desde 86.1 % a 94.8% de los transgénicos anteriormente usadas en las Islas machos (Fig. 13). Estos resultados son muy Caimán (OX513A), para compararla con una prometedores para que esta tecnología pueda ser línea silvestre ambientada al laboratorio de A. usada en un futuro en algún programa de control aegypti. En ese estudio evaluaron parámetros de de ETV. sobrevivencia y dispersión, comparando el comportamiento de ambas líneas de insecto a LIBERACIÓN DE INSECTOS TRANSGÉNICOS través de experimentos de captura y recaptura. En este caso se encontró que había diferencia Para la liberación de moscos transgénicos se han significativa en la distancia de dispersión la cual considerado aspectos del comportamiento de fue de 52 metros de la línea transgénica contra 100 hembras y machos. Dentro de los cuales se sabe metros de la silvestre en promedio. Mientras que que solo la hembra tiene hábitos hematófagos, es la sobrevivencia promedio fue de dos días en la la que pica y trasmite las enfermedades. Por otro línea transgénica, mientras en la silvestre fue de lado, durante la reproducción sexual, la hembra 2.2. Estos datos son importantes para futuras copula con un macho una sola vez y almacena los pruebas de liberación de insectos o la espermatozoides en su espermoteca (Lang, 1956); implementación de estrategias de control genético por lo tanto, solo los machos deben ser liberados en el campo, para esta u otras líneas de insectos durante los programas de control, utilizando la transgénicos (Lacroix et al., 2012). tecnología del mosco estéril o dominante letal, Así que la primera liberación de un millón de con el propósito de que compitan sexualmente con moscos macho de la línea transgénica OX513A de los machos silvestres (Phuc, 2007). A. aegypti realizada en el 2010 en las Islas Caimán En el presente siglo el desarrollo científico y en un espacio de 14 hectáreas y durante un tecnológico adquirido por el grupo Luke Alpey de periodo de cuatro semanas. Provocaron la la Universidad de Oxford en Inglaterra permitió supresión de la población silvestre en un 80 %. fundar la compañía OXITEC el año 2002 (Alphey, Por lo que estos resultados sugieren que esta 2002). Entre varias tecnologías desarrolladas por tecnología puede ser utilizada para el control ellos cuentan con una línea transgénica llamada poblacional de insectos durante un brote OX513A de moscos transgénicos dominante letal epidémico (Harris et al., 2011). RICDL (del inglés: Release of Insects Carrying a Después de un brote de dengue en Key West, Dominant Letal) de A. aegypti, como se mencionó Florida, durante los años 2009 y 2010, anteriormente. Esta línea porta un gen dominante autoridades, consideraron realizar la primera letal que actúa a nivel larvario (Figs. 6 y 7). Los liberación en EU de los mosquitos machos de A. moscos pueden ser reproducidos en el laboratorio aegypti de la línea transgénica OX513A, para la ya que la expresión del gen letal se “apaga” en supresión poblacional. A pesar de la divulgación presencia de un antibiótico (tetraciclina); sin y atención de los medios, sólo la mitad de la embargo, una vez liberados los moscos adultos comunidad estaba al tanto de la propuesta y la transgénicos y homocigotos se cruzarán con las mitad de ellos apoyaron la idea, sin embargo, hembras silvestres y, en consecuencia, todos los nunca se llegó a realizar la liberación de descendientes morirán en el estado larvario en mosquitos transgénicos. De este estudio se tanto que la tetraciclina ya no está presente (Phuc concluye que para la implementación de las et al., 2007). nuevas estrategias de salud pública requiere una En el 2009, la Organización Mundial de la Salud participación muy importante de la comunidad (OMS) y el gobierno de Malasia, así como la (Ernst et al., 2015). Sociedad de Ciencias de Malasia consideraron Mientras tanto en Brasil, debido a la epidemia de utilizar esta tecnología para el control del dengue. zika que inicio durante el 2015, se abrió a un Esto impulsó un primer estudio de impacto debate público en aquel país, que involucró a ecológico de la tecnología RILDC en un área de responsables políticos y legisladores, así como el

131 Folia Entomol. Mex. (n. s.), 3(3): 114−138 (2017). público en general para el uso de la tecnología de en los ensayos que se realizaron en las islas RILDC y, particularmente el uso de la línea Caimán durante el 2010 (Harris, 2011). Lo cual transgénica OX513A, las cosas fueron distintas. indica que las diferencias ambientales y de las Aquí (en dónde también) se discutieron los características genéticas de la cepa OX513A de A. riesgos potenciales de esta tecnología y fueron aegypty liberada no tuvieron impacto negativo en sopesados con respecto al contexto de la epidemia el éxito de apareamiento de los machos. Por lo que de Zika. Esto elevó la importancia percibida de A. concluyen que la liberación sostenida de los aegypti como insecto vector. La Comisión elaboró machos OX513A puede ser un método eficaz y una lista completa de riesgos percibidos y fueron ampliamente útil para la supresión del vector del analizados sistemáticamente. Tales riesgos dengue A. aegypti. Los autores sugieren que con incluyen el potencial de supervivencia hasta la el nivel supresión observada, probablemente sería edad adulta de los estadios inmaduros del insecto suficiente para prevenir epidemias de dengue en que portan el transgen, es decir, como el riesgo de las localidades con característica similares a la ser comido por depredadores, o si el transgen deja comunidad estudiada (de Andrade et al., 2016). de ser expresado al apagarse por la exposición a suficiente tetraciclina del medio ambiente, etc. VENTAJAS Y DESVENTAJAS DEL USO DE Otros peligros percibidos en este foro, incluyen el MOSCOS TRANSGÉNICOS potencial alergénico o la toxicidad de las proteínas expresadas por el gen, la posibilidad de que el Derivado de la epidemia mundial de las ETV, la flujo de genes o aumento de la transmisión de generación de mosquitos transgénicos es una patógenos humanos y la ocupación de los lugares alternativa muy importante para el control de estas liberados de A. aegypti por otras especies de enfermedades y por lo que actualmente está insectos vectores; sin embargo en abril de 2014, pasando a una etapa de pruebas de campo y el la Comisión Técnica Nacional de Bioseguridad de costo beneficio nos dará respuestas en un plazo no Brasil completó una evaluación del riesgo de la muy largo sobre la verdadera efectividad de esta liberación de la línea transgénica OX513A de A. tecnología. Las principales desventajas actuales aegypti y concluyó que la cepa no presentó nuevos del mosco dominante letal (como la línea riesgos biológicos para los seres humanos o el OX513A de A. aegypti), requiere una producción medio ambiente y podría ser liberado en Brasil. masiva y continúa (Puch et al., 2011; de Andrade En ese momento, Brasil se convirtió en el primer et al., 2016). Lo cual involucra inversiones país en aprobar la liberación sin restricciones de importantes en infraestructura para los un mosquito modificado genéticamente para el laboratorios de biología molecular para la control de enfermedades (de Andrade et al., producción y monitoreo del uso de la tecnología, 2016). así como el pago de los derechos de uso de Lo anterior dio la pauta para la liberación en organismos patentado, lo cual podría ser muy campo de la línea transgénica dominante letal costoso para países como el nuestro. Por lo cual se Aedes aegypti (OX513A) durante el 2015 para requiere generar tecnología propia que nos una etapa de evaluación en campo en los permita abaratar alternativamente el uso de los suburbios de Juazeiro, Bahía, Brasil. Donde se moscos transgénicos a través de la búsqueda de liberaron machos de manera regular durante más nuevos métodos para inhibir la replicación de de un año, lo cual redujo la población local de A. viral o multiplicación del patógeno. Entre las aegypti en aproximadamente 95 %, de la original, ventajas más importantes de la tecnología de los estos resultados fueron sustentados por los datos moscos transgénicos, nos permite que la supresión de poblacional de adultos mediante trampas y en y/o sustitución poblacional son altamente el 81 % en base a los índices de ovoposición en específicos (especie-específica), a diferencia del ovitrampas, en comparación con el área control uso de insecticidas como control químico o adyacente donde no se liberaron insectos biológico usando microorganismos. (Catterucia et transgénicos. La competitividad de apareamiento al., 2009; Puch et al., 2011; Massonnet-Bruneel et de los machos liberados fue similar a la estimada l., 2013; de Andrade et al., 2016; Phuc et al., 2016).

132 Noguez-Moreno et al., Nuevas estrategias de control vectorial.

La nueva tecnología de moscos transgénicos LITERATURA CITADA también nos genera una ventaja sobre los moscos estériles generados por radiación (SIT; Steril Insect AHMED, M. Z., BREINHOLT, J. W. AND Y. A. Techology), ya que son altamente eficientes en la KAWAHARA. 2016. Evidence for common esterilidad reproductiva, los mosquitos transgénicos horizontal transmission of Wolbachia among es una tecnología segura (genéticamente específica y butterflies and moths. Ahmed et al. BMC no se exponen a radiación a seres humanos) y de Evolutionary Biology, 16: 118. manejo ecológicamente más amigable con el ALPHEY, L. 2002. Re-engineering the sterile insect ambiente, (no se producen desechos radioactivos), technique. Insect Biochemistry and Molecular (LaChanse et al., 1967; Lecis et al., 1975; Catterucia Biology, 32(10): 1243–1247. et al., 2009). Adicionalmente las estrategias ADELMAN, Z. N. AND Z. TU. 2016. Control of mosquito-borne infectious diseases: sex and gene contemporáneas de manipulación genética son ya Drive. Trends in Parasitology. M32(3): 219–229. rutinarias, lo que permitirá, a través de la genética doi: 10.1016/j.pt.2015.12.003. dirigida (GD), el control de las ETV de manera ATKINSON, P. W., PINKERTON, A. C. AND D. A. eficiente y sustentable (Cuadro 2). O’BROCHTA. 2001. Genetic transformation systems in insects. Annual Review of Entomology, PERSPECTIVAS EN NUESTRO GRUPO DE 46: 317–346. doi: 10.1146/annurev.ento.46.1.317. INVESTIGACIÓN BERG, J. M. 1990. Zinc fingers and other metal-binding domains. Elements for interactions between En nuestro grupo de investigación estamos macromolecules. The Journal of Biological trabajando para desarrollar mosquitos transgénicos Chemistry, 265: 6513–6516. de A. aegypti dominante letal y la generación de BEEMAN, R. W., FRIESEN, K. S. AND R. E. DENELL. 1992. Maternal-effect selfish genes in flour beetles. moscos refractarios a virus dengue. El sistema de Science, 256: 89–92. mosco transgénico dominante letal, está basado en BIBIKOVA, M., GOLIC, M., GOLIC, K. G. AND M. la caracterización de un gen bacteriano, aislado CARROLL. 2002. Targeted chromosomal cleavage previamente en nuestro laboratorio, el cual, al ser and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger expresado tanto en células bacterianas como en nucleases. Genetics, 161(3):1169–1175. [PubMed: células de insecto, resulta en la muerte de éstas 12136019]. (datos no publicados). Por otro lado, pretendemos BIBIKOVA, M., BEUMER, K., TRAUTMAN, J. K. AND D. tener moscos transgénicos resistentes a virus CARROLL. 2003. Enhancing gene targeting with dengue expresando un péptido antimicrobiano designed zinc finger nucleases. Science, 300: 764. llamado escorpina, tanto en glándulas salivales doi: 10.1126/science.1079512. como en intestino (hemos demostrado previamente BURT, A. AND R. TRIVERS. 2006. Genes in conflict. Cambridge, MA: Belknap Press. 632 pp. que este péptido tiene propiedades contra virus CARBALLAR-LEJARAZÚ, R., RODRIGUEZ, M. H., DE Dengue y Plasmodium) (Carballar-Lejarazu et al., LA CRUZ HERNÁNDEZ-HERNÁNDEZ, F., RAMOS- 2008). La efectividad de estas dos líneas de CASTAÑEDA, J., POSSANI, L. D., ZURITA-ORTEGA, moscos transgénicos se evaluará tanto en M., REYNAUD-GARZA, E., HERNÁNDEZ-RIVAS, R., condiciones de laboratorio como en sistema LOUKERIS, T., LYCETT, G. AND H. LANZ- confinado de jaulas en las instalaciones del MENDOZA. 2008. Recombinant scorpine: a Instituto Nacional de Salud Pública en Tapachula multifunctional antimicrobial peptide with activity Chiapas. Pretendemos en el futuro desarrollar against different pathogens. Cellular and líneas de moscos transgénicos con distorsión de Mollecular Life Sciences, 65: 3081–3092. doi: sexo (Gene Drive sexual) y GD para favorecer la 10.1007/s00018-008-8250-8. introducción de genes refractarios a patógenos y CATTERUCCIA, F., CRISANTI, A., WIMMER E. A. AND J. MALAR. 2009. Transgenic technologies to induce enfermedades, con el fin de incrementar las sterility. Malaria Journal, 16:8 Suppl. 2–Suppl. 7. frecuencias de los genes refractarios en doi: 10.1186/1475-2875-8-S2-S7. poblaciones de A. eaegypti, durante un posible CUBITT, A. B., HEIM, T., ADAMS, S. R., BOYD, A. E., programa de sustitución poblacional. GROSS, L. A. AND T. Y. TSIEN. 1995. Understanding, improving and using green fluorescent proteins.

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