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Physiologische Und Proteomische Untersuchungen Am Marinen Planktomyceten Rh Odopirellula Baltica

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Physiologische Und Proteomische Untersuchungen Am Marinen Planktomyceten Rh Odopirellula Baltica Physiologische und proteomische Untersuchungen am marinen Planktomyceten Rhodopirellula baltica Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften - Dr. rer. nat. - dem Fachbereich Biologie/Chemie der Universität Bremen vorgelegt von Dörte Gade Bremen 2004 Die Untersuchungen zur vorliegenden Doktorarbeit wurden in der Zeit von Juni 2001 bis Juni 2004 am Max-Planck-Institut für Marine Mikrobiologie in Bremen durchgeführt. 1. Gutachter: Prof. Dr. Friedrich Widdel 2. Gutachter: Priv.-Doz. Dr. Ralf Rabus Tag des Promotionskolloqiums: 2. Juli 2004 Inhaltsverzeichnis Abkürzungen Zusammenfassung S u mmary 4 Teil 1: Darstellung der Ergebnisse im Gesamtzusammenhang A Einleitung 7 1. Allgemeine Eigenschaften der Planktomyceten 8 1.1 Taxonomie 8 1.2 Morphologie 10 1.3 Ökologie und Physiologie 12 2. Rhodopirellula baltica 13 3. Funktionelle Genomanalyse 14 4. Proteomik 16 4.1 Zweidimensionale Gelektrophorese 18 4.2 Detektion von Proteinen in 2D Gelen 20 4.3 Bildanalyse 22 4.4 Identifizierung von Proteinen mittels Massenspektrometrie und Abgleich von Peptidmassen 22 5. Ziele der vorliegenden Arbeit 25 B Ergebnisse und Diskussion 26 1. Taxonomische Einordnung von Rhodopirellula baltica 26 2. Evaluierung von in der 2D Technik angewandten Färbemethoden 28 3. Physiologische Proteomanalysen bei Rhodopirellula baltica 33 3.1 Trennung und Darstellung der löslichen Proteine von k baltica 33 3.2 Rekonstruktion der zentralen Wege des Zuckerstoffwechsels in R. baliica 37 3.3 Untersuchungen zur Regulation des Zuckerstoffwechsels in K baltica 40 3.4 Untersuchungen der Wachstumsphasen und des Lebenszyklus in R. baltica 47 3.4.1 Differentielle Proteinbildung im Verlauf einer Wachstumskurve 47 3.4.2 Differentielle Proteinbildung bei Wachstum auf festem Medium 53 4. Ausblick 54 C Literaturverzeichnis 56 Teil II: Publikationen A Publikationsilste mit Erläuterungen 65 B Publikationen 1 Analysis ofiV-acetylglucosamine metabolism in the marine bacterium 67 Pirellula sp. strain 1 by a proteomic approach 2 Evaluation ofthe 2D DIGE method for protein profiling Soluble proteins ofthe marine bacterium Pirellula sp. strain 1 85 3 Taxonomic heterogeneity within the Planciomycelales as derived by DNA/DNA-hybridization, description of Rhodopirellula baltica gen. nov., sp. nov., transfer of Pirellula niarina to the genus Blastopirellula gen. nov., as Blastopirellula marina comb. nov., and an emended description ofthe genus Pirellula 107 4 Towards ofthe proteome of the marine bacterium Rhodopirellula ballica: mapping the soluble proteins 135 5 Proteomic reconstruction ofthe carbohydrate catabolism and regulation in the marine bacterium Rhodopirellula baltica 173 6 Growth phase/cycle dependent regulation ofprotein composition in Rhodopirellula baltica 199 C Weitere Publikationen 223 ABKÜRZUNGEN Abkürzungen 2DE Zweidimensionale Gelelektrophorese cDNA copy Desoxyribonukleinsäure DIGE Difference Gel Electrophoresis ESI Elektrospray-Ionisation 1CM Intracytoplasmatische Membran IEF Isoelektrische Fokussierung IEP Isoelektrischer Punkt MALDI Matrix-Assisted Laser Desorption/lonisation max. maximal Mb Megabasen MS Massenspektrometrie NAG N-Acetylglucosamin OD500 Optische Dichte gemessen bei 600 nm ORF Open Reading Frame (offener Leserahmen) PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PHX Predicted Highly Expressed (als hochexprimiert vorhergesagt) PMF Peptidmassen-Fingerabdruck PSD Post Source Decay RB Rhodopirellula baltica (Nomenklatur beim Genom) 5 Svedberg Einheit SDS Sodiumdodecylsulfat s(p)p. Spezies TCA Tricarbonsäure TOF Time ofFlight . 4. — ZUSAMMENFASSUNG Zusammenfassung Rhodopirellula baltica (ehemals Pirellula sp. Stamm 1) ist dem bislang wenig untersuchten bakteriellen Phylum Planciomycetes zugeordnet. Bekannte Mitglieder dieser Gruppe wurden vor allem aufgrund ihrer morphologischen Besonderheiten erkannt und isoliert. Hierzu zählen beispielsweise die intrazelluläre Kompartimentierung und die Knospenbildung zur Zellteilung. Diese für Bakterien seltene Art der Fortpflanzung fihrt zu einem Lebenszyklus, der sich durch den Wechsel zwischen sessilen Adultzellen (Rosetten) und mobilen Schwärmerzellen auszeichnet. Planktomyceten sind häufige Vertreter der mikrobiellen Lebensgemeinschaften in der marinen Wassersäule. Zudem sind sie auf die aerobe Verwertung von Kohlenhydraten spezialisiert. Es ist daher anzunehmen, dass sie eine wichtige Rolle bei der Remineralisierung von Kohlenhydraten im marinen Habitat spielen. Phylogenetisch signifikante Unterschiede der 16S rDNA-Sequenzen bekannter Pirellula spp. (P. staleyi, P. inarina und Pirel/ula sp. Stamm 1) erforderten die Beschreibung zweier neuer Gattungen (Rhodopirellula und Blastopirellula). Im Zuge dieser taxonomischen Neuordnung wurde Pirellula sp. Stamm 1 als Typusstamm der neuen Spezies Rhodopirellula baltica beschrieben und P. marina wurde als Blastopirellula marina in die zweite neue Gattung überführt. Klassische Wachstumsexperimente belegten die Spezialisierung von P. sta/eyi, B. marina und R. baltica auf die Verwertung von Kohlenhydraten als Energie- und Kohlenstoffquelle sowie ihr strikt aerobes Wachstumsverhalten. Den Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit bildeten proteomische Untersuchungen physiologischer Eigenschaften von R. baltica. Dabei diente die zweidimensionale Gelelektrophorese als zentrale Technik. Zunächst wurde (1) eine aktuelle Methode zur Bestimmung von Unterschieden in Proteinhäufigkeiten etabliert und evaluiert. Auf der Basis (2) eines Mastergels und (3) substratadaptierter Zellen wurden die zentralen Wege des Kohlenhydratabbaus rekonstruiert sowie Enzymkandidaten für die hinftihrenden substratspezifischen Wege identifiziert. (4) Schließlich wurde Wachstumsphasen- bzw. Lebenszyklus-spezifische Proteinbildung untersucht. Das Vorliegen der vollständigen Genomsequenz von R. baftica ermöglichte hierbei eine Proteinidentifizierung durch Abgleich der mithilfe der Massenspektrometrie erhalten Peptidmassen mit denen, die durch in silico Verdau der Proteinsequenz aus der Datenbank generiert wurden. ZUSAMMENFASSUNG 1 Physiologische Anpassungen spiegeln sich in Veränderungen der Proteinzusammensetzung wider, welche mit Hilfe der Differerice Gel Electrophoresis (DIGE)-Technologie quantitativ erfasst werden können. Präelektrophoretische, kovalente Markierung von Proteinen mit Fl uoreszenzfarbstoffen (CyDyesTM), Koseparierung und Verwendung eines internen Standards erlauben eine Quantifizierung mit hoher statistischer Sicherheit. Die hohe Sensitivität der dabei verwendeten Cy-Farbstoffe wurde durch den Vergleich mit konventionellen Farbstoffen (Coomassie und Silber) und dem Fluoreszenzfarbstoff SYPRO® Ruby nachgewiesen. Die DIGE-Technologie und das auf SYPRO® Ruby basierende System lieferten im gewählten Testansatz vergleichbare Abundanzunterschiede der untersuchten Proteinspots. 2 Es wurde ein Mastergel erstellt, auf dem 626 lösliche Proteine von R. baltica identifiziert und annotiert wurden, welche in einem pH-Bereich von 4 bis 7 separiert wurden. Ein Großteil dieser Proteine wurde mehrfach identifiziert. Dieses Mastergel wurde in Bezug auf die folgenden Punkte untersucht: a) Verteilung der Proteine über den pH-Gradienten im Vergleich zum theoretischen (wie bzw. woraus vorhergesagt) Mastergel; b) Nachweis der Expression vorhergesagter Proteine, insbesondere von hypothetischen Proteinen; c) Vorkommen von Signalpeptid-tragenden Proteinen; d) Vergleich von tatsächlichen Proteinabundanzen und theoretisch vorhergesagtem Expressionsniveau der codierenden Gene; e) Identifizierung bislang nicht vorhergesagter Gene. Darüber hinaus diente das Mastergel als Grundlage für die nachfolgenden funktionalen Untersuchungen. 3 Die Enzyme der Glykolyse, des oxidativen Pentosephosphat-Zyklus und des TCA Zyklus konnten bis auf wenige Ausnahmen auf dem Mastergel nachgewiesen werden. Es gab keinerlei Hinweise auf den Entner-Doudoroff-Weg. Die meisten Enzyme der rekonstruierten Abbauwege bilden die größten Spots auf dem 2D Gel und gehören somit zu den häufigsten Proteinen in der Zelle. Die Untersuchungen zu den peripheren Zuckerabbauwegen zeigten, dass die substratspezifisch induzierten Gene von K ba/tica in zwei Kategorien eingeteilt werden können: zum einen Gene, die clustern und deren genetische Nachbarschaft eine Funktion im Abbau des untersuchten Substrates nahe legt (z. B. bei Ribose und N-Acetyl glucosamin) und zum anderen Gene, welche scheinbar wahllos über das gesamte Genom 2 ZUSAMMENFASSUNG verteilt sind (z. B. bei Xylose) und deren Genkontext keinen Hinweis auf eine mögliche Funktion im Zuckerstoffwechsel gibt. Gene dieser zweiten Gruppe können jedoch auf regulatorischer Ebene miteinander verbunden sein. Im Falle von Raffinose und Melibiose konnten keine spezifischen Abbauenzyme bioinformatisch vorhergesagt werden. Beim Wachstum auf diesen beiden Zuckern wurden jedoch mehrere hypothetische Proteine gebildet. Möglicherweise handelt es sich dabei um Enzyme neuer peripherer Abbauwege für die genannten Kohlenhydrate. 4 In Wachstumskurven von R. baltica wurde eine lange stationäre Phase beobachtet. Sie deutet auf die Fähigkeit von R. baltica hin, Stress infolge von Substratbegrenzung oder hoher Zelldichte lange Zeit überdauern zu können. Entsprechend zeigten die proteomischen Analysen, dass Enzyme des Zentralstoffwechsels (z. B. Aconitase) in der späten stationären Phase herunterreguliert waren, während Enzyme der Stressantwort (z. B. Katalase) hochreguliert waren. Beim Übergang in die stationäre Phase der Flüssigkultur bzw. beim Wachstum auf Agarplatte wurden außerdem diverse hypothetische Proteine vermehrt
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