Put Microrna Drug Discovery

Research Collection Doctoral Thesis Gene circuit based screening assays for mirna drug discovery Author(s): Häfliger, Benjamin Publication Date: 2016 Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-010651992 Rights / License: In Copyright - Non-Commercial Use Permitted This page was generated automatically upon download from the ETH Zurich Research Collection. For more information please consult the Terms of use. ETH Library DISS. ETH NO. 23325 GENE CIRCUIT BASED SCREENING ASSAYS FOR MIRNA DRUG DISCOVERY A thesis submitted to attain the degree of DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH (Dr. sc. ETH Zurich) presented by BENJAMIN HÄFLIGER MSc ETH Biotech, ETH Zurich born on 25.02.1988 citizen of Fischbach, LU accepted on the recommendation of Prof. Dr. Yaakov Benenson Prof. Dr. Sven Panke Dr. Helge Grosshans 2016 ii Abstract Drug discovery is the process of identifying potential new medicines. A key step in this process is high throughput screening (HTS), whereby active compounds are identified from a large library of up to one million candidate molecules. Through minia- turization and automation, such libraries can nowadays be tested in a single week. Despite this impressive performance, about 50% of the screening campaigns fail to provide the desired hits, or the emerging lead compounds do not perform as expected in clinical settings, mostly due to toxicity from off-target interactions. To overcome this issue, novel HTS assays should provide more detailed information on the underlying biology and the relevant off-targets. Multiplexed assays based on liquid chromatog- raphy-mass spectroscopy or deep sequencing could deliver this information; yet, their throughput is comparably low. Therefore technologies that can probe a vast range of parameters in a high throughput fashion are highly desirable. One approach to addressing this challenge is the use of artificial regulatory networks. These can be implemented using synthetic gene circuits that are pro- grammed to perform specific functions inside living cells. To date, several complex mammalian gene circuits have been described that sense, integrate and compute multiple molecular inputs to conditionally produce a defined output. In the context of high throughput screening, such circuits could be designed to simultaneously report on the effects on the drug target as well as on multiple off-targets. Compared to standard approaches, where a single target is linked to a single reporter, the circuit-based approach compresses multiple inputs in a single output, increasing information density and throughput significantly. The concept can theoretically be applied to many different target families, such as kinases, GPCRs and miRNAs. However, small molecules tar- geting miRNAs are especially prone to off-target interactions, because of miRNAs’ similarities in nucleotide sequence and phosphoribose backbone, shared maturation pathway and common pri-miRNA precursors. This makes miRNAs the ideal candi- dates for a proof-of-concept of synthetic gene circuit-based drug discovery assays. In this thesis, I designed, optimized, tested and validated a family of gene circuit based assays for the discovery of specific small molecules that modulate miRNA activity. These assays consist of three genetic modules providing information on distinct drug effects including (i) global effects on gene expression, (ii) systemic effects on the RNAi pathway or off-target miRNAs and (iii) the desired effect on the intended miRNA drug target. Due to its involvement in hepatitis C virus replication and liver cancer ma- i lignity, I used miR-122 as the primary drug target miRNA and implemented the underlying gene circuit in the liver cancer cell line HuH-7. For the implementation of a pilot assay, the individual parts of each module were optimized alone and in concert. Due to the pilot circuit’s insufficient performance, three augmented circuit topologies were constructed. They were individually modeled in silico for best performance and subse- quently experimentally validated. Ultimately, the best performing one – the complete feed-forward (CFF) assay – was adapted for automatic screening. I performed a pilot small molecule screen and investigated the miR-122 hits and some of the excluded compounds by measuring dose-response of assay readouts. I confirmed the off-target effects for 14 of 18 tested compounds. Yet, the modest activity of miR-122 specific hits (<1.3 fold) turned out to be not significant in the follow-up experiments. Next, I ex- changed the drug and off-target miRNA binding sites, generating two new assay circuits. I validated these assays and found excellent screening properties, highlighting that the modular architecture of the circuit allows fast tailoring to new miRNA targets. Finally, I benchmarked the circuit assays against the current gold standard, i.e. dual reporter assays with fully complementary binding sites, and proved that they reliably identify unspecific compounds, while the traditional assays miss these effects. This thesis describes, to the best of my knowledge, the first multi-input, cus- tomizable screening assay that can be directly applied in high throughput screening. It outlines the engineering steps undertaken, identifies the bottlenecks and proves the fast adaptability of the system to other miRNA drug and off-targets. Eventually, I dis- cuss further directions to improve the assays and assess the potential of the technol- ogy for other target families. ii Zusammenfassung Die Wirkstoffsuche ist ein Prozess, bei dem neue Arzneimittel gefunden werden sollen. Ein zentraler Aspekt dieses Prozesses ist das Hochdurchsatz-Screening (HTS), bei welchem die aktiven Verbindungen einer grossen Substanzbibliothek iden- tifiziert werden. Durch die Miniaturisierung und Automatisierung dieses Prozesses können heutzutage Substanzbibliotheken mit bis zu einer Million Verbindungen in einer einzigen Woche getestet werden. Obwohl der Durchsatz dieser Screening-Kam- pagnen ausserordentlich hoch ist, scheitern 50% der Versuche. Dabei werden entwe- der nicht die gewünschten Treffer gefunden oder die identifizierten Leitwirkstoffe ver- halten sich in klinischen Test anders als erwartet – aufgrund von off-Target Effekten sind sie häufig toxisch. Um dieses Problem zu beseitigen, sollten neue HTS Testver- fahren so entworfen werden, dass diese auch Informationen über off-Target Effekte enthalten. Multiplex Testverfahren wie zum Beispiel Flüssigchromatographie mit Mas- senspektrometrie-Koppelung oder Deep Sequencing können diese Informationen be- reitstellen, doch der Durchsatz dieser Techniken ist vergleichsweise gering. Aus die- sem Grund sind Techniken, die sowohl multiplex Charakter als auch einen hohen Durchsatz haben sehr erstrebenswert. Ein Ansatz, um diese Herausforderung zu meistern, sind künstliche Regulati- onsnetzwerke, welche mit Hilfe von synthetischen Genschaltkreisen implementiert werden können. Dazu sind diese Schaltkreise so programmiert, dass sie in lebenden Zelle bestimme Funktionen ausführen. Bis heute wurden einige komplexe Säugerzell- genschaltkreise beschrieben, die mehrere molekulare Inputs messen, integrieren und verarbeiten können, um bedingt entsprechende Outputs zu produzieren. Im Kontext des Hochdurchsatz-Screenings könnten solche Schaltkreise verwendet werden, um gleichzeitig Interaktionen der Testsubstanzen mit dem Zielmolekül (on-Target) und mehreren off-Targets zu messen. Verglichen mit üblichen Ansätzen, bei denen jeweils ein einzelnes Target mit einem einzelnen Reporter verbunden wird, komprimiert der Genschaltkreis mehrere Inputs in einem einzigen Output, wodurch die Informations- dichte signifikant erhöht wird, der Durchsatz aber konstant bleibt. Dieses Konzept kann theoretisch auf viele verschiedene Target-Familie angewendet werden, aber nieder- molekulare Verbindungen die bei miRNAs ansetzen, interagieren speziell häufig mit off-Targets. Dies kann auf zwei Ursachen zurückgeführt werden. Erstens unterschei- den sich verschiedene miRNA nur durch die Abfolge ihrer Basen, ihre chemische Struktur ist aber die selbe und zweitens, teilen sich die misten miRNAs den selben Reifungsprozess. Deshalb sind miRNAs die idealen Kandidaten, um das Konzept von iii auf synthetischen Genschaltkreisen basierenden Testverfahren für die Wirkstoffsuche zu bestätigen. Für die vorliegende Arbeit habe ich verschiedene Varianten dieser Testverfah- ren entwickelt, optimiert, getestet und validiert. Sie bestehen jeweils aus drei Modulen, welche unterschiedliche Effekte, welche eine Testsubstanz ausüben könnte, anzei- gen. Nämlich (i) globale Effekte auf die Genexpression, (ii) systemische Effekte auf den RNAi Signalweg und (iii) die gewünschten Effekte auf die Ziel-miRNA. Da die miR- 122 sowohl in der Vervielfältigung von Hepatitis-C Viren als auch in der Malignität von Leberkarzinomen eine wichtige Rolle spielt, verwendete ich diese als Zielmolekül und implementierte das entsprechende Testverfahren in der Leberkrebszelllinie HuH-7. Für ein erstes Versuchsverfahren wurden die einzelnen Schaltkreisteile separat und gemeinsam optimiert und getestet. Da dieser Test nicht die gewünschte Leistung er- brachte, wurden drei verbesserte Verfahren entworfen und sowohl in silico als auch experimentell getestet und validiert. Schliesslich wurde das beste Verfahren ausge- wählt – der „complete feed-forward (CFF) assay“ – und für die Automation adaptiert. Daraufhin habe ich eine Substanzbibliothek getestet und bestätigte die Effekte von 14 von 18 ausgewählten Verbindungen in Nachfolgeuntersuchen.

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