Bronchopneumonies Infectieuses Des Jeunes Bovins: De La Complexité Du Microbiome Aux Particularités Évolutives Et Cliniques De Virus Respiratoires Encore Méconnus

En vue de l'obtention du DOCTORAT DE L'UNIVERSITÉ DE TOULOUSE Délivré par : Institut National Polytechnique de Toulouse (Toulouse INP) Discipline ou spécialité : Pathologie, Toxicologie, Génétique et Nutrition

Présentée et soutenue par : M. ELIAS SALEM le mercredi 24 octobre 2018 Titre : Bronchopneumonies infectieuses des jeunes bovins: de la complexité du microbiome aux particularités évolutives et cliniques de virus respiratoires encore méconnus.

Ecole doctorale : Sciences Ecologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingénieries (SEVAB) Unité de recherche : Interactions Hôtes - Agents Pathogènes (IHAP) Directeur(s) de Thèse : M. GILLES MEYER MME MARIETTE DUCATEZ

Rapporteurs : M. ETIENNE THIRY, UNIVERSITE DE LIEGE Mme CAROLINE LEROUX, INRA LYON Membre(s) du jury : Mme CAROLINE LEROUX, UNIVERSITE LYON 1, Président M. GILLES MEYER, ECOLE NATIONALE VETERINAIRE DE TOULOUSE, Membre Mme CECILE MALNOU, UNIVERSITE TOULOUSE 3, Membre Mme GAELLE SIMON, ANSES, Membre Mme MARIETTE DUCATEZ, ECOLE NATIONALE VETERINAIRE DE TOULOUSE, Membre

TABLE DES MATIERES

Table des matières ...... i

Liste des figures ...... iv

Liste des tableaux ...... iv

Liste des abréviations ...... v

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ...... 1

I. importanceLes bronchopneumonies infectieuses chez les bovins : définition et 2

1. Définition ...... 2

2. Importance des BPI ...... 4

II. Les agents pathogènes respiratoires bovins ...... 8

1. Fréquence des agents infectieux ...... 8

2. Pouvoir pathogène des principales bactéries ...... 13

3. Pouvoir pathogène des principaux virus ...... 17

4. Interactions entre agents pathogènes respiratoires ...... 23

III. Identification de nouveaux agents pathogènes respiratoires ...... 29

1. Notions sur les maladies émergentes chez l’homme ...... 29

2. Les nouvelles méthodes pour identifier de « nouveaux » agents pathogènes 33

IV. Les « nouveaux » virus respiratoires bovins : cas de l’influenzavirus de type D 38

1. Historique des infections à virus influenza A (IAV) chez les bovins ... 38

2. Découverte d’un nouveau virus influenza de type D chez les bovins 41

3. Propriétés générales des virus Influenza D ...... 42

4. Réservoir, spectre d’hôte et pouvoir pathogène ...... 46

V. Environnement microbien et pathologie respiratoire ...... 52 1. La notion de microbiote ...... 52

2. Le microbiote respiratoire de l’homme ...... 57

3. Interactions microbiome et agents pathogènes : le pathobiome ...... 64

4. Microbiome et pathobiome respiratoire bovin ...... 66

DESCRIPTION DES TRAVAUX DE RECHERCHE ...... 77

Chapitre I : Identification des virus respiratoires bovins ...... 78

I. Introduction et connaissances actuelles ...... 78

II. Détection des virus respiratoires par approche NGS chez des veaux affectés par la bronchopneumonie infectieuse ...... 81

1. Matériel et Méthodes ...... 81

2. Résultats ...... 86

III. Caractérisation génétique des coronavirus bovins : évolution et épidémiologie moléculaire ...... 96

Article : « Global transmission, spatial segregation and recombination determine the long-term evolution and epidemiology of Bovine Coronaviruses » . 97

Chapitre 2 : Identification et caractérisation du bactériote respiratoire bovin ...... 132

I. Introduction ...... 132

II. Article : « Microbial ecology of the upper and lower respiratory tract in calves: interactions and dysbiosis during acute bronchopneumonia » ...... 136

Chapitre 3 : l’influenzavirus de type D : répartition géographique et pouvoir pathogène ...... 176

I. Introduction ...... 176

II. Article : « Serologic evidence for influenza C and D virus among ruminants and Camelids, Africa, 1991-2015 » ...... 178

III. Article : « Pathogenesis, host innate immune response and aerosol transmission of influenza D virus in cattle » ...... 184

DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES ...... 229

BIBLIOGRAPHIE ...... 243 ANNEXES ...... 293

I. Résultats détaillés du virome respiratoire ...... 293 LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Arbre de décision sur l'émergence des maladies et agents pathogènes...... 32

Figure 2 : Représentation schématique d’un virus de type influenza D ...... 43

Figure 3 : Virus influenza D (C/OK) en microscopie électronique ...... 43

Figure 4 : Le génome du virus influenza D ...... 44

Figure 5 : Chronologie des études sur les communautés microbiennes ...... 58

Figure 6 : Evolution du nombre d’études sur le microbiome respiratoire ..... 59

Figure 7 : Résistance de colonisation ...... 66

Figure 8 : Représentation du processus de préparation des échantillons pour le séquençage NGS métagénomique du virome respiratoire...... 85

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 : Pouvoir pathogène des différents agents respiratoires bovins démontré lors d’infections expérimentales...... 13

Tableau 2 : Abondances relatives trouvées dans les poumons et les nœuds lymphatiques (NL) ...... 71

Tableau 3 : Résultats de détection des 7 agents pathogènes respiratoires dans les prélèvements respiratoires avec le LSI vetmax screening kit...... 88

Tableau 4 : Détection des principaux virus par NGS ...... 89

Tableau 5 : Correspondance entre la détection par RT-qPCR et le séquençage NGS...... 89

Tableau 6: Résultats détaillés du virome respiratoire ...... 293

LISTE DES ABREVIATIONS

ADN : acide désoxyribonucléique

ADNc : acide désoxyribonucléique complémentaire

ARN : acide ribonucléique

ARNr : acide ribonucléique ribosomique

ATT : aspiration trans-trachéale

BAAV : bovine associated adenovirus

BAD3 : bovine adenovirus type 3

BAT2 : bovine alveolar type 2 epithelial cells

BAV : bovine astrovirus

BRV : bovine rhinitis virus

BCOV : bovine coronavirus

BLAST : Basic Local Alignment Search Tool

BOHV1: bovine herpesvirus type 1

BoNV : bovine nidovirus

BPI : bronchopneumonie infectieuse

BPI3 : bovine parainfluenza virus type 3

BPV : bovine parvovirus

BRAV : bovine rhinitis virus type A

BRBV : bovine rhinitis virus type B

BRSV : bovine respiratory synctial virus

BVDV : bovine viral diarrhea virus

BWA : burrows-wheeler aligner

CAR : Cilia-associated respiratory bacterium

CFU : colony forming unit

CMH : complexe majeur d’histocompatibilité cp : cytopathogène

Cq : cycle de quantification

ECP : effet cytopathique

ENP : écouvillon nasal profond

FISH : fluorescence in situ hybridization

GAAS : genome relative abundance and average size

Gb : gigabase

H. s : Histphilus somni

HCoV : human coronavirus

HEF : hemagglutinine ésterase fusion

HRT 18G : human rectal tumor

IAV : influenza A virus

IbpA : immunoglobulin binding protein type A

IBR : infectious bovine rhinotracheatis

IBV : influenza B virus

ICV : influenza C virus

IDV : influenza D virus

IFHI1 : interferon induced with helicase C domain 1

IFNγ : interferon gamma

IGV : integrative genomics viewer

IHA : l’inhibition de l’hémagglutination

IL-10 : interleukine 10

IL-12 : interleukine 12

IL-1β : interleukine 1 beta

IL-4 : interleukine 4

ISG15 : Interferon-stimulated gene 15

LEfSe : Linear Discriminant Analysis using effect size LBA : lavage broncho-alvéolaire

LDA : laboratoire départemental d’analyse

LPS : lipopolysaccharide

M : protéine de matrice

M. b : Mycoplasma bovis

M. h : Mannheimia haemolytica

ME : microscopie électronique

MERS : middle-east respiratory syndrome mmp1 et mmp3 : métalloprotéases matricielles

NCBI : national center for biotechnology information ncp : non cythopathogènes

NGS : nouvelles générations de séquençage

NL : nœud lymphatique

NP : nucléoprotéine

Npro : non functional protein

NS1 : protéine non-structurale nt : nucléotide

ONT : Oxford nanopore technologies

P. m : pasteurella multocida

PA : protéine acide pb : paire de bases

PB1 : polymérase basique 1

PB2 : polymérase basique 2

PCR : polymerase chain reaction pH : potentiel hydrogène qPCR : quantitative PCR

RSAD2 : Radical S-Adenosyl Methionine Domain Containing 2 RT-qPCR : real-time quantitative PCR

SARM : Staphylococcus aureus résistant à la méticilline

SARS : severe acute respiratory syndrome

SBV : Shmallenberg virus

ST : swine testis

TCID : tissue culture infectious dose

TGS : third generation sequencing

TNFα : tumor necrosis factor alpha

VIP : virus identification pipeline

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

I. Les bronchopneumonies infectieuses chez les bovins : définition et importance

1. Définition

Le terme « bronchopneumonie infectieuse » (BPI) désigne une affection de l’appareil respiratoire profond des bovins, à caractère contagieux, qui survient essentiellement chez les jeunes bovins. Ces affections se traduisent cliniquement par l’apparition brutale de fièvre, d’une baisse de l’état général, d’une perte d’appétit plus ou moins marquée, d’un jetage séro-muqueux, d’une toux forte et sèche, de tachypnée et de dyspnée.

Les principales catégories d’animaux touchés sont d’une part les veaux durant les premiers mois de vie dans les élevages naisseurs, et d’autre part les jeunes bovins dans les ateliers d’engraissement suite à l’allotissement d’animaux provenant de différentes exploitations. Les génisses laitières peuvent également être touchées durant leurs premières années de vie.

L’étiologie des BPI est souvent multifactorielle, elle met en cause des agents infectieux comme des bactéries, virus ou parasites, et également des facteurs de risques liés à la conduite d’élevage et à l’environnement.

Des facteurs anatomiques, propres au bovin, le rendent plus sensible aux affections respiratoires (1). La faible surface des échanges gazeux et l’absence de ventilation collatérale, entraînent un coût énergétique élevé de leur respiration et une réserve ventilatoire restreinte. Ces phénomènes sont aggravés chez les races à viande du fait de leur masse musculaire plus importante.

A ceci s’ajoutent le plus souvent des facteurs de risque propres à chaque élevage. Souvent, les conditions d’ambiance lors de la mise en stabulation favorisent le développement des maladies respiratoires. En effet, une densité trop importante, une mauvaise ventilation, une mauvaise régulation de la température comme de l’hygrométrie, sont des facteurs prédisposant aux BPI (1). La conduite d’élevage peut également être un facteur déclenchant ou aggravant : le mélange des âges, les vêlages groupés, l’alimentation non adaptée, un statut immunitaire

défavorable, la circulation du virus immunomodulateur de la BVD (Bovine Viral Diarrhea), sont des exemples. Dans les systèmes d’engraissement les plus industrialisés (broutards et veaux de boucherie), les facteurs de stress et le rassemblement d’animaux de statuts et de provenances différents sont des éléments favorisants les BPI. Le sevrage, le transport, la transition alimentaire, ainsi que l’allotissement sont bien souvent en lien avec l’apparition de nombreuses pathologies dont les BPI (1–3).

A la naissance le veau naît agammaglobulinémique. Son système immunitaire est encore non totalement fonctionnel. Le complément est opérationnel à 20% le premier jour après le vêlage, l’activité des neutrophiles et des cellules NK (natural killer) est totalement fonctionnel entre 2 et 5 mois (4,5). Les lymphocytes B, quant à eux, sont très réduits à la naissance et augmentent en fraction pour atteindre les 20% de la composition des lymphocytes totaux à l’âge de 6 à 8 semaines. Les taux des immunoglobulines IgA, IgG1 et IgG2 n’atteignent des concentrations protectrices qu’entre 16 à 32 jours d’âge (4,5). Pendant les premières semaines de vie l’immunité du veau est donc essentiellement apportée par l’immunité maternelle colostrale. On comprend alors aisément l’importance du transfert colostral pour assurer une protection des jeunes veaux contre les infections respiratoires.

Dans un élevage les BPI peuvent évoluer sous différentes formes épidémiologiques : épizootique, enzootique ou sporadique. Le plus souvent, la maladie débute dans un cheptel par une phase épizootique avec une morbidité élevée et une mortalité allant de 5 à 10%. Cette phase peut être consécutive à un changement de la conduite d’élevage, à des conditions climatiques défavorables, ou à un rassemblement de bovins d’origines différentes au sein d’une exploitation. Suite à cette phase, la maladie peut prendre une allure enzootique avec une faible morbidité et une faible mortalité, d’autant plus que les conditions d’élevage ne sont pas maîtrisées. L’incidence progresse alors lorsque la densité d’animaux dans un atelier augmente. Si les conditions environnementales sont peu favorables au développement d’infections respiratoires (bâtiment et conduite d’élevage maîtrisées), la maladie, lorsqu’elle survient, peut ne revêtir qu’un caractère sporadique.

2. Importance des BPI

a. Importance Médicale

Les BPI, avec les entérites infectieuses, sont responsables de la grande majorité des mortalités observées chez le veau. Chez les jeunes bovins à l’engraissement elles représentent le principal handicap économique dans ces filières. L’importance médicale est avant tout liée à l’impact possible de la mortalité (jusqu’à 20% dans certains lots) mais aussi aux signes cliniques (dyspnée, inappétence, abattement) à l’origine de retards de croissance.

Dans le système naisseur des Pays de la Loire, le taux d’incidence des BPI a été estimé à 2,5 cas /veaux-jours à risque, soit environ 24 animaux traités pour 100 veaux (6). Les taux de létalité et de retard de croissance étaient respectivement de 6% et de 2,7% chez les animaux traités (6). Les BPI sont des pathologies majeures en engraissement de jeunes bovins. En 2008, dans les systèmes naisseur-engraisseur et engraisseur spécialisés du Pays de la Loire, le taux de morbidité pour les troubles respiratoires était de 18,1% sur les jeunes bovins mis en lot et 22% des lots avaient au moins 4 jeunes bovins atteints (7). Une autre étude a montré que 2,81% des jeunes bovins saisis à l’abattoir (saisie partielle ou totale) l’étaient pour motif de BPI (8). Enfin, chez les génisses laitières de renouvellement, les pathologies respiratoires représenteraient 20 à 30% des mortalités, le plus souvent vers l’âge de 6 semaines.

L’impact médical est en partie lié au fait que les bovins sont anatomiquement et physiologiquement mal équipés pour répondre à un processus pathologique respiratoire. Les bovins ont des poumons de faible volume (environ 12 litres/500 kg) comparé au volume d'un cheval (42 L). Leurs poumons sont en outre fortement compartimentés et leur surface d'échanges gazeux est faible par rapport à la masse musculaire de l'animal. Cette compartimentation pulmonaire prédispose à l’hypoxie voire à l’anoxie périphérique lorsque les conduits aérifères sont obstrués. Il en résulte dans la région lésée une accumulation et une multiplication d’éventuels agents infectieux.

La trachée des bovins est de faible diamètre (environ 3 cm pour un bovin de 400 kg) comparé à d’autres espèces du même gabarit. Cela impose une vitesse de l’air plus élevée qui contribue à l’imprégnation de l’épithélium trachéal par les éléments contaminants de l’air mais aussi une respiration plus profonde qui augmente la pénétration de particules.

En ce qui concerne l’appareil respiratoire profond, les bovins possèdent peu de macrophages dans la lumière alvéolaire. De plus, les lobes crâniaux étant moins bien irrigués, ils seraient également moins bien oxygénés, ce qui entraînerait une baisse de l’activité phagocytaire des macrophages alvéolaires et un ralentissement du pouvoir d’élimination des agents infectieux dans ces zones.

Les bovins présentent donc un certain nombre de particularités anatomiques qui les rendent particulièrement sensibles aux infections respiratoires, notamment les jeunes animaux de moins de 6 mois.

b. Importance Economique

Les BPI ont un impact économique considérable. La filière viande bovine est handicapée par les pertes économiques résultant des mortalités, des baisses de performance des animaux atteints, du coût des traitements et de la non-valeur économique de certains animaux. Une pathologie respiratoire durant la période néonatale entraîne un poids au sevrage inférieur de 16.5 kg comparé aux animaux sains (9). En France, les BPI sont la principale cause de mortalité des veaux après le premier mois de vie dans les élevages de bovins allaitants (10).

Dans les ateliers d’engraissement, les BPI constituent une préoccupation majeure pour l’état de santé et la performance économique globale du troupeau. En effet, le taux de létalité sur des animaux atteints de BPI peut aller jusqu’à 9,5% (11). Cette mortalité due aux BPI représente jusqu’à 60% de la mortalité en atelier d’engraissement. L’une des conséquences de la maladie est la diminution du gain moyen quotidien associé à une diminution du poids de carcasse et à un allongement de la durée de l’engraissement, ce qui entraîne des pertes économiques. Pour exemple dans les ateliers d’engraissement des Pays de Loire,

le coût des BPI varie entre 8 et 83 euros/animal selon les taux de mortalité et de morbidité (12).

En élevage laitier, l’impact négatif des BPI sur la croissance des génisses conduit à des baisses de performance de reproduction, des baisses de production laitière en première lactation et à une diminution de la longévité des animaux (13).

c. Impact Sanitaire

Les BPI ont une importance sanitaire car le traitement de ces affections fait appel à l’utilisation d’antibiotiques de façon plus ou moins systématique. En effet, lorsque des jeunes bovins sont atteints de troubles respiratoires, un antibiotique est le plus souvent utilisé pour lutter contre l’infection bactérienne ou pour la prévenir lors d’infections virales. De plus, en fonction de la gravité et du nombre d’animaux touchés, c’est souvent l’ensemble d’un lot qui est mis sous traitement et pas seulement les animaux qui présentent des signes cliniques. Cette pratique, appelée métaphylaxie, a pour objectif de traiter les malades et de prévenir la maladie chez les animaux encore non affectés, surtout quand la détection est difficile. Autrefois les antibiotiques pouvaient aussi être utilisés à titre préventif lors des périodes à risque telles que les rassemblements de jeunes bovins. Ce genre de pratiques, susceptible de favoriser l’émergence d’antibiorésistance (14,15), est aujourd’hui interdit.

Outre l’utilisation importante d’antibiotiques, le problème se posait aussi jusqu’il y a deux ans en terme de qualité, notamment de familles d’antibiotiques utilisés. Jusqu’en 2015 étaient en effet principalement utilisés des macrolides, des fluoroquinolones de 3e génération et des céphalosporines de 3e génération. Les deux dernières familles appartiennent à des familles d’antibiotiques dits « critiques », antibiotiques à utiliser préférentiellement chez l’homme. Ces molécules de dernière génération montrent une grande efficacité pour lutter contre les surinfections bactériennes, mais leur utilisation est depuis peu très règlementée en médecine vétérinaire pour limiter l’apparition de résistances. Elles ne sont maintenant autorisées qu’en seconde intention lorsque la bactérie responsable de BPI a été clairement identifiée et qu’elle présente des résistances aux autres antibiotiques. Selon l’Agence nationale de sécurité du médicament et 6

des produits de santé (ANSM), la définition des antibiotiques critiques repose sur la notion de pression de sélection et sur l’intérêt en dernier recours (16). Donc les antibiotiques « critiques » sont catégorisé soit 1- comme étant particulièrement générateurs de résistances : les associations amoxicilline-acide clavulanique, les céphalosporines, les fluoroquinolones, et la témocilline, soit 2- étant de dernier recours (la daptomycine, les glycopeptides, la linézolide, la tédizolide, la colistine injectable, les pénèmes, les phénicolés, la tigécycline, et la fosfomycine injectable). Ce contexte de réduction de l’utilisation des antibiotiques (plan Ecoantibio) et les législations récentes qui s’y réfèrent, ont incité les décideurs à développer des projets de recherche et des modalités nouvelles de gestion autour des agents infectieux responsables de BPI. L’objectif est d’une part de développer des mesures préventives (vaccination, augmentation de la robustesse des animaux, aménagement des bâtiments, changement des pratiques d’élevage…) et d’autre part de choisir le meilleur protocole thérapeutique en cas de maladie (choix de la molécule, de la dose, de la voie d’inoculation…).

II. Les agents pathogènes respiratoires bovins

Même si les BPI font intervenir des facteurs liés à l’élevage et l’hôte, il n’en reste pas moins que se sont les agents infectieux qui sont responsables du déclenchement et de la sévérité de la maladie. Là encore la situation est complexe car seulement dans un tiers des cas environ la maladie est due à un seul agent (bactérie, virus ou parasite) alors que dans 2/3 des cas, il s’agit d’une association virus/bactérie ou virus/virus, voir même bactérie/bactérie. De plus les techniques récentes d’identification de virus et bactéries permettent de découvrir de nouveaux agents potentiels. Dans ce paragraphe nous aborderons les principaux pathogènes connus puis nous traiterons des connaissances actuelles sur les co- infections lors de BPI et nous terminerons par les données actuelles sur les nouveaux agents infectieux potentiellement impliqués dans les BPI.

1. Fréquence des agents infectieux

Les principaux agents pathogènes impliqués dans BPI sont décrits dans le tableau 1. Leurs implications reposent sur les données d’études épidémiologiques et de reproduction expérimentale de la maladie.

Quatre bactéries sont plus communément impliquées dans les BPI, il s’agit de Mannheimia haemolytica, Pasteurella multocida, Histophilus somni et Mycoplasma bovis (Tableau 2). Les trois premières appartiennent à la famille des Pasteurellaceae. La prévalence de M. haemolytica et P. multocida en France est importante. La relation causale avec les BPI est plus complexe à établir car ces bactéries sont présentes dans le nasopharynx des jeunes bovins sains. La présence de M. haemolytica est probablement importante dans le système « jeunes bovins en lot » (17). En France, en 2011, un suivi régulier de 112 jeunes bovins charolais provenant de 43 fermes a permis d’étudier l’impact de M. haemolytica lors des épisodes de bronchopneumonie pendant la première phase d’engraissement. Au total, 75 jeunes bovins présentaient au moins une aspiration transtrachéale (ATT) positive pour M. haemolytica durant toute période d’étude. Quasiment tous les épisodes de pneumonie étaient associés à la présence de la

pasteurelle (14/16) avec toutefois une prévalence individuelle très variable (0- 89%) (18).

Les pasteurelloses sont également importantes chez les animaux non sevrés. Une étude réalisée sur 133 veaux provenant de plusieurs départements français met en évidence une prévalence de 28% pour M. haemolytica contre une prévalence de plus de 60% pour P. multocida (19). Si P. multocida est la plus fréquemment détectée, elle l’est en grande majorité en association avec d’autres pathogènes (74% des prélèvements possédant plusieurs agents pathogènes). En Europe ces deux bactéries sont ubiquistes. Dans une étude finlandaise, 34% des veaux laitiers mis en lot entre 5 jours et 1 mois d’âge, et affichant des signes cliniques respiratoires, étaient positifs à P. multocida sur des lavages trachéaux. La bactérie a été isolée dans environ 70 % des lots présentant un à plusieurs animaux malades (20). Son rôle dans les BPI reste discuté car elle n’est significativement associée à des signes cliniques que lorsque le prélèvement est poly-infecté.

En Ecosse, 17% des veaux (n= 616 veaux) possèdent M. haemolytica dans les cavités nasales avec une prévalence nettement plus élevée dans les cheptels laitiers, 26%, contre 9% dans les cheptels allaitants (21). Dans une étude danoise réalisée chez des veaux laitiers de moins de 4 mois pendant un épisode de BPI, P. multocida, H. somni et M. haemolytica ont été trouvées respectivement chez 48%, 20% et 23% des veaux sains alors que quasiment tous les veaux malades présentaient une culture ou une PCR positive pour deux agents pathogènes ou plus (97% avec 2 espèces bactériennes ou plus ; 3% avec une seule espèce bactérienne), avec une fréquence d’isolement de 82%, 41% et 29 % respectivement pour P. multocida, H. somni et M. haemolytica (22). Lorsqu’on s’intéresse au système « veaux de boucherie », l’étude réalisée par Pardon en 2010 recense 24 épisodes de pneumonie (240 veaux) avec des prévalences quasi-similaires pour les deux types de pasteurelles : 21,3% pour M. haemolytica et 22,1% pour P. multocida (23). L’ensemble de ces études suggère que la présence de P. multocida et M. haemolytica semble être un facteur de risque supplémentaire de BPI puisqu’elles sont fréquemment isolées lors d’épisodes cliniques, que ce soit seules ou en association (19,20,22).

En ce qui concerne H. somni, sa prévalence a surtout été étudiée en Amérique du Nord. En Ontario, Gagea (2006) a mis en évidence H. somni dans 16 % (14/86) des poumons de bovins présentant des lésions pulmonaires (86/99), avec une association avec P. multocida et/ou M. haemolytica dans plus de 50% des cas (24). En Europe H. somni a été détectée au Danemark par culture ou PCR sur ATT chez 20% des animaux sains et 41% des animaux malades (22) et en Finlande chez 0,5% des veaux (396 veaux laitiers) dans 5% des cheptels (20). En France, Tessier révèle une prévalence apparente globale de 30% par analyse PCR (133 veaux non sevrés). Entre 2006 et 2010, le laboratoire départemental d’analyse de Haute-Saône (LDA 71) a réalisé une large enquête et estime la prévalence d’H. somni dans les pathologies respiratoires (tous prélèvements confondus) à environ 2,5% par méthode classique de bactériologie et à 18% par PCR (25).

Pour les mycoplasmes, le réseau d’épidémio-surveillance (VIGIMYC) a montré que M. bovis est le mycoplasme le plus fréquemment isolé avec plus de 55% des isolats mycoplasmiques reçus (541/902) sur des prélèvements le plus souvent respiratoires (83%) (26). Une autre enquête sérologique réalisée à l’échelle nationale sur 824 cheptels choisis au hasard (32 197 animaux de plus d’un an) met en évidence pour M. bovis une prévalence cheptel de 28 à 30 % et une prévalence individuelle de 2 à 13% (27). Ces résultats sont conformes à ceux obtenus en Angleterre entre 1990 et 2000 avec une séroprévalence de 22%. M. bovis est fréquemment associé à d’autres mycoplasmes ou à d’autres agents bactériens lors d’épisodes de BPI : il est isolé dans 57% des poumons positifs pour P. multocida ou M. haemolytica contre 10% des poumons positifs au virus respiratoire syncytial bovin BRSV (pour Bovine Respiratory Syncytial virus) (28) ; il est associé à d’autres bactéries dans 81% des lavages broncho-alvéolaires (LBA) positifs à M. bovis (29). Enfin, les pneumonies à M. bovis se rencontrent majoritairement dans les élevages en lots (jeunes bovins et veaux de boucherie), où les animaux proviennent de cheptels différents. Des études montrent l’importance de ce mycoplasme lors de mise en lots de veaux non sevrés puisqu’il est le pathogène le plus fréquemment isolé avec plus de 70% des échantillons positifs (23,29).

Quant aux virus, les plus connus sont l’herpès virus bovin de type 1 (BoHV-1 pour Bovine Herpesvirus 1), le virus respiratoire syncytial bovin (BRSV), le virus parainfluenza 3 bovin (BPI3 pour Bovine Parainfluenza Virus type 3) mais depuis quelques années d’autres virus ont été incriminés tels que le coronavirus bovin (BCoV pour Bovine Coronavirus) et les adénovirus bovins (BAV pour Bovine Adenovirus). Globalement, les infections à virus respiratoires sont fréquentes chez les jeunes bovins, au moins pour le BRSV et le BPI3, comme en témoigne la forte séroprévalence des troupeaux en Europe. En 2010, la prévalence des infections à BRSV en Suède dans le cheptel bovin viande variait, selon la densité des animaux et les régions, entre 8 et 70%. La prévalence du BCoV était plus faible mais variait parallèlement à celle du BRSV (30). En élevage laitier, sur 59 élevages testés en Italie, au moins une vache séropositive au BRSV était présente dans tous les élevages (31). Dans 25% des élevages, tous les individus testés étaient séropositifs. En Norvège, la prévalence chez les veaux de plus de 5 mois dans les élevages laitiers a été estimée en 2009 à 50.2%, 39.3% et 31.2%, pour les virus BPI3, BCoV et BRSV, respectivement (32). En France toujours, les infections à BRSV et BPI3 sont considérées comme fréquentes, les séroprévalences étant estimées entre 60 et 70% avant 3 ans. En France la prévalence nationale moyenne d’ateliers infectés par la rhinotrachéite infectieuse bovine (IBR pour Infectious Bovine Rhinotracheitis) avoisine les 10-11% selon les années avec une prévalence plus importante en atelier allaitant qu’en atelier laitier. Toutefois des variations importantes existent entre les départements, la prévalence des ateliers infectés variant de 0,06 % à 85,2 %.

Les données de prévalence des virus lors d’affections respiratoires cliniques diffèrent selon les études, qui soulignent l’impact des techniques analytiques sur les résultats et une probable diversité attribuable, a minima, aux facteurs géographiques. Le BRSV est l’agent viral le plus fréquemment isolé à partir du poumon de veaux morts de troubles respiratoires. En élevage laitier, le BRSV serait associé aux troubles respiratoires dans 60 % à 70% des élevages au Danemark, aux Etats-Unis, en Suède et aux Pays Bas. En élevage allaitant ou en production de viande, le BRSV semble responsable de 16 à 71 % des troubles respiratoires selon les études. Plus le nombre de cheptels impliqués est élevé,

plus le risque relatif est important. En France, une étude menée à la fin des années 1990 a permis d’identifier une cause infectieuse dans 65,4% des cas de BPI chez des veaux (33). Un virus était présent, seul ou en association avec une bactérie dans 52,4 % des cas et parmi les virus, l’infection par le BRSV était dominante. En élevage de veaux de boucherie en lots, une enquête a été réalisée dans l’Est de la France en 2007 qui suggère que parmi les virus, l’infection par le PI3 était prédominante sans que les auteurs précisent le statut clinique des veaux infectés. La majorité des veaux testés avait reçu une injection de Rispoval RS BVD® lors de la mise en lots (environ 8 à 13 jours avant le prélèvement).

L’interprétation de ces résultats doit aussi tenir compte des limites liées aux prélèvements et aux techniques analytiques. Dans les études précédemment citées les techniques de détection utilisées étaient différentes selon l’agent infectieux recherché, avec chacune des caractéristiques propres de sensibilité et spécificité. Pour limiter, à défaut d’éliminer, les variabilités liées aux méthodes analytiques, des techniques d’amplification génique en temps réel (qPCR) ont été récemment mises au point, qui permettent de détecter rapidement le BRSV, le BPI3, le BCoV et les bactéries M. bovis, M. haemolytica, P. multocida et H. somni. Cette détection peut être couplée à la recherche du BVDV ou du BoHV-1, là aussi par PCR. Cet outil a été utilisé pour analyser 602 prélèvements respiratoires obtenus sur trois années consécutives par le LDA 71 dans le cadre du diagnostic vétérinaire (34). Les prélèvements respiratoires étaient un écouvillonnage nasal (EN), une ATT ou un prélèvement de poumon, principalement d’élevages naisseurs. Globalement les résultats montrent que dans 80% des cas il a été possible d’identifier un des sept agents respiratoires recherchés. Par comparaison avec des techniques conventionnelles, la technique PCR améliore la sensibilité de détection notamment des bactéries respiratoires, et plus particulièrement de P. multocida. Les fréquences de détection étaient respectivement de 22, 18, 7, 20, 51, 22 et 9% pour le BRSV, BCoV, BPI3, M. haemolytica, P. multocida, H. somni et M. bovis. La prévalence du BCoV en France sur des animaux cliniquement atteints est importante, de l’ordre de 20%. Par ailleurs les co-infections sont apparues très fréquentes dans plus de 40% des cas sans qu’il ne ressorte d’association préférentielle. Cette fréquence de co-

infections a aussi été observée dans une étude irlandaise où un virus était identifié dans 35% des troubles respiratoires et où 40% des veaux infectés avaient plus de 2 virus présents (35). Cette étude a aussi montré une grande fréquence de détection du BCoV, y compris dans les prélèvements de l’appareil respiratoire profond, et une fréquence relativement importante de H. somni, bactérie probablement sous-détectée auparavant dans la mesure où son isolement nécessite des conditions particulières de culture. L’ensemble des données de prévalence doit être interprété en tenant compte des limites liées aux modes opératoires (absence de critères stricts d’inclusion, systèmes d’élevage spécifiques, nombre d’échantillons...).

Tableau 1 : Pouvoir pathogène des différents agents respiratoires bovins démontré lors d’infections expérimentales.

2. Pouvoir pathogène des principales bactéries

Les principales bactéries impliquées dans les BPI bovines appartiennent à deux principaux groupes : les mycoplasmes (Mycoplasma bovis), associés le plus

souvent à des BPI de forme chronique, et les pasteurelles (Manheimia haemolytica, Pasteurella multocida, Histophilus somni) plutôt à l’origine d’affections aiguës. Plus rarement, on peut isoler les genres Salmonella et Coxiella, voire l’espèce Trueperella pyogenes.

a. Les Mycoplasmes

Les mycoplasmes appartiennent à la classe des Molliculites. Cette dernière comprend la famille des Mycoplasmataceae, se divisant elle-même en 4 genres : Mycoplasma, Ureaplasma, Eperythrozoon et Haemobartonella. Le genre Mycoplasma comporte environ 100 espèces dont 40 isolées chez les ruminants. Les espèces pathogènes majeures chez les bovins sont : M. mycoides subsp. mycoides responsable de la péripneumonie contagieuse bovine (PPCB), et

Mycoplasma bovis, agent de BPI.

Les pneumonies à M. bovis se rencontrent majoritairement dans les élevages en lots (jeunes bovins et veaux de boucherie), où les animaux proviennent de cheptels différents. Des études montrent l’importance de ce mycoplasme lors de mise en lot de veaux non sevrés puisqu’il est le pathogène le plus fréquemment isolé avec plus de 70% des échantillons positifs (23,29). La présence de M. bovis semble cependant corrélée à l’apparition de pneumonies puisque la bactérie est isolée uniquement dans des poumons d’animaux présentant des signes cliniques respiratoires chroniques et aigus (0% des animaux sains, 35,5% des animaux à pneumonie chronique et 50% des animaux à pneumonie aiguë) (28).

La contamination d’un élevage se fait souvent par l’introduction de porteurs sains ou malades. La transmission horizontale se fait par contact direct entre animaux via les aérosols, mais aussi via la contamination de l’alimentation et de l’eau de boisson par les sécrétions nasales d’animaux porteurs. Les animaux convalescents peuvent excréter pendant une longue période et les porteurs chroniques sont généralement responsables de la persistance de M. bovis au sein d'un troupeau. Un stress (conditions climatiques, ventilation insuffisante, surpopulation, allotissement) permet à la maladie de resurgir. En occasionnant des lésions inflammatoires chroniques, M. bovis fragilise le terrain pulmonaire, le 14

prédisposant ainsi à l’infection par d’autres agents pathogènes. Si les mycoplasmes sont généralement peu résistants dans le milieu extérieur, M. bovis peut persister plusieurs semaines sur du matériel humide ou dans l’eau, et jusqu'à 230 jours dans le fumier (36). L'environnement constitue donc la seconde source importante d'infection.

Mycoplasma bovis possède un double statut initiateur/ubiquiste puisqu’il est responsable à lui tout seul de lésions cellulaires importantes et d’une persistance de l’infection pendant plusieurs semaines. M. bovis possède 13 gènes codant pour des protéines de surface variables impliquées dans la variabilité antigénique, lui permettant d’échapper à la réponse immunitaire (37).

Plus rarement Mycoplasma dispar et Mycoplasma bovirhinis ont été cités pour leur rôle dans les BPI sans qu’il n’existe actuellement de preuves de leur pouvoir pathogène (38–40).

b. Les Pasteurelles

Les pasteurelles font partie de la flore commensale des muqueuses des vertébrés supérieurs et tout particulièrement des mammifères et des oiseaux domestiques. Chez les bovins, elles sont commensales dans le nasopharynx et le portage asymptomatique concerne plus de 30 % des sujets adultes. Il résulte d'un équilibre entre la réceptivité de l'animal hôte et la virulence des pasteurelles (41). Les pasteurelles prennent ainsi une grande importance dans le cadre de surinfections bactériennes consécutives à des infections respiratoires amorcées par des virus (BoHV1, BRSV, BVD) ou par des mycoplasmes.

Les trois principales pasteurelles pathogènes chez les bovins sont Mannheimia haemolytica, Pasteurella multocida et Histophilus somni.

M. haemolytica est la pasteurelle réputée la plus pathogène chez les bovins. Elle agit en tant que pathogène unique, notamment lors d’une diminution des défenses de l’hôte ou secondairement à une infection virale ou mycoplasmique (17). L’expression du pouvoir pathogène de M. haemolytica est conditionnée par une première multiplication locale dans le nasopharynx, concomitante à une altération des mécanismes de défense de l’appareil

respiratoire. La bactérie adhère alors à l’épithélium grâce à des facteurs d’attachement (pili, capsule), et ce d’autant plus facilement qu’un agent pathogène primaire a lésé préalablement la muqueuse. La contamination de l’appareil respiratoire profond se fait via l’inhalation d’exsudats virulents stagnants dans les régions postérieures des cavités nasales où la concentration en bactéries est très élevée en début de maladie (17). Une infection virale, classiquement par le virus BPI3 ou BoHV-1 facilite la colonisation en altérant la clairance muco-ciliaire des poumons et donc en altérant l’évacuation des bactéries envahissantes (17,42). Mannheimia haemolytica possède de nombreux facteurs de virulence : une adhésine, un polysaccharide capsulaire, un fimbriae, une sialoglycoprotéase, un lipopolysaccharide (LPS), une neuraminidase, une lipoprotéine OMPs, et une leucotoxine (Lkt). Les cinq premiers facteurs assurent l’adhésion à la cellule cible et la colonisation cellulaire. La neuraminidase participe au disfonctionnement de l’appareil muco-ciliaire et la sialoglycoprotéine clive les anticorps IgG1 bovins produits lors de la réponse humorale. Le LPS possède une action pro-coagulante et pro-inflammatoire entrainant un afflux de cellules inflammatoires ainsi que des lésions vasculaires (17). La leucotoxine Lkt est un facteur de virulence majeur de la bactérie. Cette protéine secrétée induit l’apoptose des neutrophiles et la libération consécutive de facteurs pro-inflammatoires et toxiques participant à la genèse des lésions typiques de bronchopneumonie alvéolaire (43).

Pasteurella multocida est, elle, la pasteurelle la plus fréquemment isolée ces dernières années en France à partir de prélèvements respiratoires. Il existe cinq sérogroupes parmi lesquels le sérogroupe A3 est le plus fréquemment isolé sur les bovins atteints de BPI (44,45). Plusieurs études tendent à montrer que P. multocida est une bactérie opportuniste des cavités respiratoires superficielles des bovins (46) dont la pathogénicité semble limitée (45). A contrario, d’autres études mettent en évidence une corrélation entre la présence de la bactérie et la présence de signes cliniques respiratoires (47) et une augmentation accrue des protéines inflammatoires (48). Elle possède globalement des facteurs de virulence identiques à M. haemolytica sauf la leucotoxine.

Enfin, H. somni a été identifiée pour la première fois chez les bovins en 1956. Pendant longtemps, sa seule manifestation clinique semblait être la

méningo-encéphalite thromboembolique mais H. somni provoque également d’autres affections, notamment respiratoires. Cette bactérie est responsable de plusieurs affections chez les bovins et les ovins : bronchopneumonie, infertilité, avortement, septicémie, myocardite, arthrite, méningoencéphalite (49). Six variants sont décrits à ce jour mais seules les souches 1, 2 et 3 sont isolées chez le bovin (50). H. somni provoque une pneumonie voire une pleurésie fibrineuse dans sa forme respiratoire. De plus, il semble que de nombreux facteurs de virulence soient exprimés uniquement chez des souches isolées sur des poumons présentant des lésions (51).

3. Pouvoir pathogène des principaux virus

Comme cité précédemment, les principaux virus respiratoires impliqués dans les BPI sont le BRSV (pour bovine respiratory syncytial virus), le BoHV-1 (pour bovine herpes virus 1), le coronavirus bovin BCoV (pour bovine coronavirus), le BPI3 (pour bovine parainfluenza virus 3), l’adénovirus bovin de type 3 (BAD3 pour bovine adenovirus type 3), et le BVDV (pour bovine viral diarrhea virus). L’importance relative de ces différents virus repose sur leur prévalence et leur pouvoir pathogène principalement étudié lors d’infections expérimentales (Tableau 1).

a. Le virus respiratoire syncytial bovin

Les enquêtes viro-épidémiologiques dans différents systèmes d’élevage bovin indiquent qu’actuellement le BRSV est l’agent pathogène responsable, seul ou en association, d’une grande partie des BPI (52). Il a été isolé pour la première fois en 1967 chez un bovin atteint de troubles respiratoires (53) et appartient à la famille des Paramyxoviridae, sous-famille des Pneumovirinae, et genre Pneumovirus. C’est un virus enveloppé à ARN simple brin de polarité négative contenant 10 gènes viraux qui codent pour 11 protéines dont 2 protéines de surface qui sont des déterminants antigéniques du virus (52). La glycoprotéine de fusion F permet la fusion de l’enveloppe virale avec la membrane cellulaire de la cellule cible, mais aussi la fusion des cellules infectées avec d’autres cellules non infectées, à l’origine de la formation de syncytia. Elle est la cible majeure des

anticorps neutralisants et est aussi impliquée dans l’induction de la réponse cellulaire spécifique. La glycoprotéine G permet, elle, l’attachement du virus à la cellule cible.

Le virus colonise l’épithélium des bronchioles puis les cellules des alvéoles pulmonaires (pneumocytes de type II) où il exerce son effet pathogène, conduisant à une bronchiolite obstructive fonctionnelle puis restrictive. Son pouvoir pathogène s’exerce à la fois par un effet cytopathique direct mais aussi par l’initiation d’une réponse immunitaire pathologique, notamment lors de forme clinique sévère. La nature de la réponse innée inflammatoire influencerait la nature de la réponse immunitaire spécifique des lymphocytes auxiliaires vers une voie dite de type Th1 ou Th2. La réponse Th1 est associée à la production d’anticorps neutralisants et l’induction d’une réponse cellulaire cytotoxique qui assure l’élimination du virus et la protection. La réponse de type Th2 serait associée à la libération de médiateurs pro-inflammatoires et au recrutement de polynucléaires neutrophiles et éosinophiles à l’origine d’une broncho-constriction sévère.

Sur le terrain, dans la majorité des cas le BRSV infecte un grand nombre de veaux (morbidité de 20 à 50%) et est responsable de signes cliniques respiratoires modérés avec une faible létalité (0,5 à 1%). Toutefois le BRSV peut aussi induire à lui tout seul des bronchopneumonies sévères avec un taux de mortalité non négligeable pouvant aller jusqu’à 20-30% (54).

b. Le virus de la rhinotrachéite infectieuse bovine

L’herpès virus bovin de type 1 (BoHV-1 pour bovine herpesvirus type 1) ou virus de l’IBR (Infectious Bovine Rhinotracheitis) appartient à la famille des Herpesviridae, sous famille des Alphaherpesvirinae. Il s’agit d’un virus de 150 à 200 nm de diamètre à ADN double brin d’environ 150 kbases. Le BoHV-1 a un tropisme pour les cellules épithéliales, les cellules mononucléées sanguines et les neurones (55). Il existe des différences nettes de pouvoir pathogène selon les souches virales. La latence virale et les périodes dites de réactivation-réexcrétion représentent la clé de voûte de l’épidémiologie de l’IBR (55). Le pouvoir pathogène du BoHV-1 est démontré depuis longtemps sur des bases 18

épidémiologiques et expérimentales. La rhinotrachéite infectieuse bovine est la forme respiratoire de l’infection par le BoHV-1. Suivant sa voie d’entrée dans l’organisme et le sous-type viral, le virus est également responsable d’encéphalite, de conjonctivite, d’avortement, d’une forme systémique mortelle en période néonatale et d’une forme génitale : la vulvo-vaginite pustuleuse infectieuse. Dans sa forme respiratoire le BoHV-1 n’est pas directement responsable de BPI, son tropisme étant limité au rhinopharynx et à la trachée. Par contre son rôle en tant qu’agent initiateur des BPI est étudié depuis longtemps, notamment dans le cadre de co-infections expérimentales avec Mannheimia haemolytica (55). De ces études, il ressort que le BoHV-1 favoriserait l’apparition de BPI par 3 actions, une cytolyse directe des cellules épithéliales respiratoires, la production de cytokines pro-inflammatoires et un effet suppresseur sur la réponse immune cellulaire.

Sur le terrain, la maladie atteint des animaux de tout âge mais les jeunes bovins sont les plus sensibles et la plupart des infections respiratoires sont asymptomatiques. Sinon la maladie se traduit par une rhinotrachéite (jetage séro- muqueux, hyperthermie, toux, épiphora), voire des troubles fonctionnels (râles, cornage) pour les souches pathogènes.

c. Le virus parainfluenza de type 3 (BPI3)

Le virus Parainfluenza de type 3 bovin (BPI3 pour bovine parainfluenza virus type 3) appartient à la famille des Paramyxoviridae, et au genre Respirovirus. Il s’agit d’un gros virus (150 à 300 nm) enveloppé à symétrie hélicoïdale dont le génome est constitué d’une molécule d’ARN simple brin linéaire de polarité négative. Principalement étudié dans les années 1990, le BPI3 fait actuellement l’objet de recherches peu nombreuses et essentiellement focalisées depuis 2000 sur la variabilité génétique et la possibilité de contamination croisée entre les différents virus parainfluenza. Le BPI3 est capable d’infecter un grand nombre de types cellulaires de l’appareil respiratoire car il reconnait comme premier récepteur l’acide sialique des cellules (56). Il induit une hyperplasie et une nécrose de la muqueuse, une perte des cellules ciliées et finalement une pneumonie interstitielle. Notamment, le BPi3, contrairement au BRSV, se multiplie dans les macrophages du poumon. Il en résulte une altération des fonctions

macrophagiques (baisse de la phagocytose, de la cytotoxicité des cellules infectées, secrétions de prostaglandines proinflammatoires…). Par ailleurs, et contrairement au BRSV, l’infection par le BPI3 entraîne chez le veau une perte de la ciliature des cellules ciliées trachéales, la présence d’inclusions cytoplasmiques et la desquamation et destruction des cellules épithéliales respiratoires. L’effet cytopathique observé, et potentiellement l’altération de la réponse immunitaire, expliquerait ainsi le rôle du BPi3 comme agent initiateur des BPI. Malgré ces observations, le pouvoir pathogène direct du virus n’est pas encore clairement établi. La plupart des infections expérimentales n’induisent pas à peu de signes cliniques et sur le terrain le virus est souvent détecté en présence d’autres pathogènes. Comme pour la plupart des autres virus respiratoires infectant les bovins, le virus BPI3 est fragile et ne se transmet que par contact direct « de mufle à mufle », ou bien via l’inhalation d’aérosols et de gouttelettes émises par un bovin infecté qui tousse ou éternue.

d. Le coronavirus bovin (BCoV)

Le BCoV (pour bovine coronavirus) appartient à la famille des Coronaviridae, elle-même subdivisée en quatre genres (Alphacoronavirus, Betacoronavirus, Gammacoronavirus et Deltacoronavirus) (57). Il fait partie du genre Betacoronavirus auquel appartient aussi le virus du Syndrome Respiratoire Aigu Sévère qui a sévi en Asie au printemps 2003 (SRAS-CoV), le coronavirus du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS-CoV) ainsi que le coronavirus respiratoire humain (HCoV OC43) (58). Il s’agit d’un virus sphérique enveloppé et pourvu de spicules, d’un diamètre de 120 à 160 nm, très fragile, sensible à la chaleur, aux détergents et aux solvants. Il est doté d’un ARN simple brin positif. A sa surface figurent deux protéines responsables de l’attachement du virus à la cellule hôte : l’hémagglutinine estérase (HE) et la protéine de la spicule (S), Leurs actions combinées permettent l’adhésion aux cellules cibles et l’entrée du virion dans le cytoplasme. De plus, les protéines HE et S provoquent une production d’anticorps neutralisants protecteurs (59). Toutes les souches de BCoV sont actuellement regroupées dans le même sérotype.

Le BCoV a un tropisme respiratoire et digestif. Il est bien connu en tant qu’agent de diarrhée chez les veaux mais son rôle dans les affections respiratoires est resté longtemps mal défini. Bien que détecté en 1986 dans deux cas de pneumonies à coronavirus chez les bovins, il a fallu attendre 2003 (pandémie de SRAS en Asie) pour que survienne un regain d’intérêt pour le coronavirus à tropisme respiratoire tant dans l’espèce humaine que chez les bovins. Dans les élevages, il pourrait jouer un rôle dans l’apparition de bronchopneumonie chez les jeunes animaux et chez les bovins engraissés en lot. Le BCoV peut ainsi être retrouvé tant dans les voies respiratoires inférieures que supérieures. Les veaux, les jeunes adultes ou les adultes infectés de manière subclinique ou clinique constituent le réservoir du virus. La reproduction expérimentale de la maladie est difficile mais permet d’induire un jetage nasal et de la toux, signe d’une infection du tractus respiratoire supérieur. Son implication en pathologie respiratoire repose alors principalement sur des études cas-témoins réalisées dans des feedlots nord-américains suggérant une association entre portage nasal de BCoV et BPI, une association entre présence de BCoV et lésions respiratoires à l’abattage, et une association inverse avec la présence d’anticorps neutralisant le BCoV et l’apparition de BPI (60–63). Les données en Europe sont moins nombreuses mais montrent aussi une corrélation avec la pathologie respiratoire (64–69).

Sur le terrain, Les affections à BCoV du jeune veau peuvent être cliniquement bénignes (toux, rhinite) ou se compliquer de pneumonie notamment lors de stress ou de surinfections bactériennes. Dans ce dernier cas le virus agirait comme agent initiateur. Lors de formes sévères les lésions traduisent une bronchopneumonie interstitielle (24,60,62,70–73).

e. L’Adénovirus bovin de type 3

Les adénovirus responsables de troubles respiratoires chez les bovins appartiennent à la famille des Adenoviridae, et au genre Mastadenovirus. L’Adénovirus bovin de type 3 (BAD3) a été isolé pour la première fois en 1965 chez une vache saine. Ce sont des virus nus qui mesurent 70 à 110 nm de diamètre, à ADN double brin et à géométrie icosaédrique. Ils sont très stables

dans le milieu extérieur (74). L’implication de ce virus dans la maladie respiratoire chez les bovins est très peu connue, quelques études évoquent sa détection dans les prélèvements respiratoires ou la détection des anticorps anti-BAD3 (20,23,48,74,75). L’infection semble causer des troubles pulmonaires et gastro- intestinaux mais il est aussi fréquent d’isoler le virus chez des animaux sains, la majorité des infections étant subcliniques. Récemment Ng et al (2015) ont montré que le BAD3 est significativement associé avec la BPI (P<0.0001) (76).

f. Le Virus de la diarrhée virale bovine (BVDV)

Le virus de la diarrhée virale bovine (BVDV pour bovine viral diarrhea virus) est un agent infectieux majeur des bovins qui appartient à la famille des Flaviviridae, et au genre Pestivirus. Il s’agit d’un petit virus enveloppé dont le matériel génétique se compose d’un ARN simple brin de polarité positive. Comme la plupart des virus à ARN, il fait preuve d’une grande variabilité génétique. Le virus BVD peut se présenter sous deux biotypes appelés cytopathogène (cp) qui induit une lyse en cultures cellulaires et non cytopathogène (ncp). Il semblerait que le biotype cytopathogène dérive du biotype non cytopathogène par mutation, chez les bovins infectés permanents immunotolérants (IPI) (77). Seules les souches ncp sont isolées à partir de poumons et ce sont les biotypes ncp qui circulent principalement sur le terrain (78). Les troubles respiratoires sont consécutifs à une infection transitoire avec une souche ncp. Toutefois les essais d’inoculation ayant pour but de produire une affection respiratoire due au seul virus BVD n’ont abouti qu’à des lésions mineures (78). Il semblerait que le virus BVD soit peu pneumopathogène par lui-même, même si une réplication dans la muqueuse respiratoire est possible (79) Son pouvoir pathogène dans les BPI s’expliquerait principalement par son effet immunosuppresseur. L’effet potentialisateur peut s’expliquer par l’action du virus sur les cellules lymphoïdes : altération fonctionnelle des granulocytes neutrophiles, des lymphocytes B et T, et quelquefois des thrombocytes ce qui induit une neutropénie et une lymphopénie, une trombocytopénie persistant 10 à 15 jours après l’infection. La durée et l’intensité de l’immunodépression dépendent de la souche virale. L’immunodépression induite par le BVDV (80) peut ainsi faciliter l’infection du

poumon par d’autres virus et par des bactéries (78,81–90). L’implication du BVDV dans les affections respiratoires bovines est donc complexe. Même s’il semble jouer un rôle plutôt indirect, il existe suffisamment de preuves pour le considérer comme un agent du complexe des affections respiratoires bovines.

4. Interactions entre agents pathogènes respiratoires

Les infections d’un même individu malade par plusieurs agents pathogènes impliqués dans le processus morbide ont été bien décrites chez l’homme dès les épidémies d’influenza de type A au XIXe et XXe siècle où les personnes atteintes décédaient de complications bactériennes respiratoires à staphylocoques, haemophilus et/ou streptocoques. Ces notions de co-infections sont très étudiées en Santé Humaine pour comprendre les processus morbides et trouver des moyens communs de prévention et de lutte. En pathologie respiratoire bovine, même si les recherches sur les co-infections respiratoires datent des années 1950 (91), il n’existe finalement que peu d’études dans ce domaine, qui reposent soit sur des données épidémiologiques visant à associer plusieurs pathogènes à un processus morbide soit sur des reproductions expérimentales. Pour ces dernières, l’objectif est de comparer la pathogénicité d’une co-infection à deux agents pathogènes le plus souvent par rapport à des mono-infections avec les mêmes agents étudiés. Cela contraste avec les études de prévalence qui suggèrent toutes une association fréquente entre pathogènes lors de BPI. Ainsi Tessier révèle que 74% de ses prélèvements sont poly-infectés alors que seulement 19,5% des prélèvements permettent d’isoler un seul agent (19). Dix- neuf pour cent des veaux sont poly-infectés dans l’étude de Valarcher (1). En Suède, une étude menée par Hagglund révèle que 35% des veaux sont infectés par une combinaison de 2 virus, 26% par une combinaison de 3 virus et 6% par une combinaison de 4 virus (92). Les combinaisons d’agents sont multiples et différentes selon les études et selon les types de prélèvements écouvillons nasaux profonds (ENP), ATT ou LBA. Dans l’étude de Valarcher, l’association la plus souvent rencontrée est BRSV/BCoV (1). Dans une autre étude française les couples de pathogènes les plus fréquents sont P. multocida/H.somni (28%), P. multocida/BRSV (19,6%), P. multocida/M. haemolytica (19,6%), H. somni/BRSV

(4,3%), et BRSV/BPi3 (4,3%) (25). En l’état et en l’absence de données exhaustives, il ne se dégage pas d’associations privilégiées entre certains agents pathogènes.

a. Interactions entre bactéries respiratoires

Les études sur les relations synergétiques et antagonistes entre bactéries dans les pneumonies sont diverses. Chez l’homme ces interactions sont décrites entre les bactéries commensales qui colonisent le tractus respiratoires et celles considérées comme pathogènes ou entre bactéries pathogènes (93,94). Les associations positives existent quand un micro-organisme favorise la présence et la survie d’un autre par des mécanismes de mutualisme, de commensalisme ou de symbiose ou par des moyens qui aident à échapper au système immunitaire de l’hôte. Les associations négatives sont dues aux interactions d’amensalisme (antagonisme) ou de prédation entre les espèces bactériennes en compétition dans le même habitat ou quand le système immunitaire favorise indirectement la présence d’une espèce. Ces mécanismes comprennent entre autres la production par certaines bactéries tolérantes du peroxyde d’hydrogène (H2O2) toxique pour les espèces compétitrices (95), les réactions biochimiques qui mènent à la destruction des protéines de surfaces nécessaires pour l’adhésion à l’épithélium des bactéries compétitrices (96), et la modulation du système immunitaire pour entraîner la clairance des espèces en compétition (97).

Les co-infections bactéries-bactéries sont très peu étudiées en pathologie respiratoire bovine. Corbeil et al. (1985) ont suggéré que la flore respiratoire résidente pouvait améliorer ou inhiber la croissance de M. haemolytica, P. multocida, et H. somni in vitro (98). La plupart des isolats de la flore respiratoire étaient bénéfiques à la croissance des pasteurelles, notamment les genres Micrococcus, Corynebacterium et Staphylococcus. A l’inverse tous les isolats du genre Bacillus, sauf un, ont montré un pouvoir inhibiteur sur les pasteurelles. En termes de diversité, il y avait 4 fois plus d’isolats améliorateurs de croissance que des bacilles inhibiteurs.

La bactérie Bibersteinia trehalosi précédemment connue comme Pasteurella haemolytica biovar T est considérée comme un agent pathogène 24

respiratoire chez les petits ruminants. En plus de B. trehalosi, M. haemolytica et P. multocida sont impliqués dans les BPI chez les mouflons canadiens. Curieusement, B. trehalosi et P. multocida sont souvent détectés simultanément dans les prélèvements de poumons des mouflons atteints, une association qui n’implique pas M. haemolytica. L’hypothèse que B. trehalosi et P. multocida peuvent inhiber la croissance de M. haemolytica a été vérifiée in vitro dans deux études. Dans la première étude, la charge en CFU (colony forming unit) de M. haemolytica était entre 6 et 9 log10 fois inférieure lors de co-culture avec B. trehalosi par rapport à la monoculture en l’absence de B. trehalosi (99). La deuxième étude (100) a montré, par des méthodes similaires, l’effet inhibiteur de P. multocida sur la croissance de M. haemolytica. Cultivées individuellement, les deux souches P. multocida et M. haemolytica ont montré des caractéristiques de croissance similaires, ce qui n’est pas le cas lorsque les deux pasteurelles sont misent en culture ensembles. Quantitativement, à 24h après mise en co-culture, la charge de M. haemolytica était inférieure de 4 ordres de grandeur comparée à celle de la monoculture. Dans les deux études, l’inhibition n’était pas observée quand les cultures du couple en question étaient séparées par une membrane de 8 µm empêchant le contact direct entre les deux cultures, ce qui suggère un mécanisme dépendant du contact et non pas par sécrétion de composés antimicrobiens. Les auteurs suggèrent que ce phénomène d’inhibition entre les pasteurelles est à l’origine des observations dans les données de diagnostic du terrain durant les épisodes de BPI chez les mouflons canadiens.

Une étude récente (101) a utilisé les résultats de Corbeil et al sur le potentiel des Bacilles respiratoires à inhiber la croissance et la colonisation des bactéries pathogènes comme les pasteurelles. Dans cette étude in vitro, les souches suivantes : Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Lactococcus lactis ainsi que Streptococcus thermophilus et Paenibacillus polymyxa ont été évaluées pour leur effet inhibiteur contre le serotype 1 de M. haemolytica, notamment sa capacité d’adhésion sur les cellules épithéliales bronchiques bovines (BBE). Les souches P. polymyxa, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus planterum, Lactobacillus casei et Lactobacillus acidophilus ont réussi à inhiber la croissance

de M. haemolytica sur le milieu de culture. Le mécanisme proposé serait la sécrétion de substances antimicrobiennes, car l’effet peut être reproduit en utilisant le surnageant de culture des souches à effet inhibiteur. Par la suite, les deux souches P. polymyxa et L. acidophilus ont montré le meilleur potentiel pour réduire la colonisation des cellules bronchiques bovines par M. haemolytica A1. Les souches bactériennes appartenant au genre Lactobacillus font partie du microbiote respiratoire normal des bovins (102) et une perturbation de leur abondance pourrait être à la base d’une dominance des bactéries pathogènes. Dans une application similaire en médecine humaine, la bactérie Streptococcus salivarius a montré un grand potentiel dans la protection contre la colonisation par des bactéries pathogènes dans les cavités respiratoires superficielles (103,104).

b. Interactions entre virus et bactéries

Les interactions virus-bactéries dans la pathogenèse des infections respiratoires chez l’homme font principalement intervenir deux mécanismes, la destruction de l’épithélium respiratoire par un virus qui expose la membrane basale aux infections bactériennes secondaires et le dysfonctionnement du système immunitaire favorisant ainsi la prolifération bactérienne (94). Tout atteinte de l’épithélium respiratoire, par exemple lors d’infection à BoHV-1, va entrainer une facilitation de la translocation bactérienne ce qui mène à une migration des bactéries résidentes dans les voies respiratoires superficielles vers les voies respiratoires profondes. Ce mécanisme est commun lors d’infection à pasteurelles (M. haemolytica, P. multocida et H. somni) qui peuvent être des germes commensaux du tractus respiratoire supérieur. Ces bactéries sont bien souvent isolées dans des prélèvements nasopharyngés de bovins ne présentant aucune pathologie respiratoire apparente. Par contre leur présence dans les poumons est un critère d’imputabilité pour les BPI.

Le mécanisme le plus souvent cité pour expliquer les co-infections virus- bactéries est la capacité des virus respiratoires à modifier/inhiber la réponse immunitaire, et notamment la réponse lymphocytaire, favorisant ainsi la prolifération bactérienne. Les principaux mécanismes connus sont le blocage de l’expression de certain récepteurs CMH (BoHV1) (55) , une diminution de la

phagocytose (BPI3) (56), et quelquefois un emballement sévère de la réponse immunitaire (BRSV) lymphocytaire vers une voie Th2, délétère pour l’animal (105).

L’exemple le plus cité dans la littérature est le virus BVD, connu comme cofacteur potentialisateur des maladies respiratoires lorsqu’il est associé à une pasteurelle ou un autre virus respiratoire. Le risque de BPI est ainsi significativement augmenté lorsque le lot est exposé au BVDV (12,106), et les traitements sont significativement plus longs (107). Le passage du virus de la BVD par les poumons aurait un impact sur les macrophages alvéolaires en diminuant leurs capacités de phagocytose et en diminuant la sécrétion des cytokines et chimiokines produites, notamment le TNFa et l’IL-1 (87). De même le BVDV diminuerait les capacités microbicides et de cytotoxicité dépendantes des anticorps associées aux neutrophiles (108). Par ailleurs, après infection par le BVDV on observe une lymphopénie et une thrombocytopénie transitoires (3 à 6 jours) sévères selon les souches. Toutes les classes de lymphocytes sont impactées (B, T, γd) et l’expression des molécules de CMHII est perturbée (109). Une étude a montré que lors de co-infections par le BVDV et M. haemolytica, les signes cliniques étaient plus sévères dans le groupe co-infecté. Les auteurs ont détecté dans le groupe co-infecté des concentrations élevées de protéines de la phase aiguë de l’inflammation (acute phase proteins APP) et une durée prolongée de l’infection virale. Par ailleurs la souche de M. haemolytica utilisée était faiblement pathogène (effet sur le groupe mono-infecté) suggérant la nécessité d’une co-infection par le BVDV pour induire une infection respiratoire sévère (90). Deux études ont aussi souligné l’importance du BVDV lors de co-infection avec M. bovis (86,110).

L’ordre de passage des pathogènes pourrait jouer un rôle. Pour exemple chez les bovins, la durée de l’infection était plus longue et les signes cliniques et les lésions pulmonaires plus sévères lors d’une infection par le BRSV suivie par une infection par H. somni, comparé à des infections uniques (111). Dans ce cas les IgE produites par l’infection virale seraient responsable d’une augmentation de la perméabilité vasculaire, des œdèmes et de l’inflammation observés (111). Ce synergisme entre le BRSV et H. somni a aussi été démontré in vitro, une pré- infection de cellules alvéolaires bovines par le BRSV induit une augmentation

significative de leur rétraction et est suivi par une augmentation de l’invasion par voie paracellulaire par H.somni. Cette rétraction cellulaire s’expliquerait par une production cellulaire accrue des métalloprotéases matricielles mmp1 et mmp3 qui vont dégrader plusieurs protéines de la matrice pulmonaire (112). Toutefois, dans une étude récente, la même équipe a suggéré une relation antagoniste entre H. somni et le BRSV lors d’infection primitive par la bactérie (113). Le pré-traitement des cellules BAT2 avec du surnageant de culture de H. somni a significativement réduit la réplication du BRSV lors de l’infection ultérieure. Par analyse microarray, ils ont montré que le surnageant de culture de H. somni sur les cellules BAT2 induit une surexpression de la transcription de différents gènes de protéines antivirales (IFIH1, ISG15, MX1, et RSAD2 en tant que viperin). Notamment la surexpression de la viperin serait due à l’endotoxine LPS. Par contre dans cette étude l’expression de l’antigène lbpA, responsable de la rétraction cellulaire et de la perméabilité des cellules alvéolaire, n’a pas été modifiée.

c. Interactions entre virus respiratoires

Les interactions entre virus sont moins bien connues en pathologie respiratoire bovine. Dans une étude expérimentale, les profils des cytokines IL-1β, TNFα, IFNγ, IL-12, IL-4 et IL-10 obtenus après co-infections par le BVDV et le BoHV1 ont été évalués et comparés à ceux produits lors d’une infection à BoHV-1 unique (114). Les veaux pré-infectés par le BVDV ont montré une augmentation de sécrétion de TNFα et une diminution de sécrétion de IL-10 après l’infection par le BoHV-1 entraînant une aggravation des signes cliniques et une exagération de la réponse inflammatoire comparée au groupe infecté par le BoHV-1 seul (114). L’effet coopératif du BVDV avec un autre virus serait lié à sa capacité à limiter la réponse innée et notamment la réponse en interférons de type I (INF-I). La protéine non-structurale virale Npro du BVDV réduit la production d’INF-I en agissant notamment sur la suppression du facteur de régulation IRF-3 (interferon regulatory factor 3) (85,115). Ainsi la réplication du BRSV in vitro était significativement supérieure en présence d’un virus BVD-2 sauvage par comparaison avec le même virus mais muté dans le gène Npro (protéine non fonctionnelle (BVDV2-E) (115). Les résultats de cette étude confirment les

premières observations de Brodersen et Kelling (1998) qui ont montré qu’une co- infection par le BVDV et le BRSV aggrave les signes respiratoires et les lésions pulmonaires. L’excrétion du BRSV dans le nasopharynx et les poumons était également plus longue lorsque le BVDV était présent (88).

III. Identification de nouveaux agents pathogènes respiratoires

Un autre domaine d’actualité en recherche sur les maladies respiratoires est l’identification d’agents pathogènes nouveaux permettant d’expliquer l’émergence de maladies, de nouvelles associations entre pathogènes, voir l’absence de résultats positifs lors de diagnostic étiologique d’une affection respiratoire.

1. Notions sur les maladies émergentes chez l’homme

Les maladies infectieuses ont continuellement accompagné l’homme et les évènements d’émergence et de réémergence des maladies virulentes comme par exemple la peste bubonique au XIVe siècle et l’introduction des maladies inconnues dans le nouveau monde durant le XVIe siècle ont sans doute marqué l’histoire de l’humanité. Les premières publications apparues avec l’expression « maladie émergente » datent des années 1950 et depuis, la définition de maladie émergente ainsi que les critères d’attribution de ce terme ont constamment varié.

En médecine humaine, Rosenthal et al. (2015) proposent des critères pour lesquels les maladies et les agents pathogènes sont considérés comme émergents. Ces critères distinguent la maladie émergente, l’agent pathogène émergent et le nouvel agent potentiellement pathogène (116). Une maladie est dite émergente si elle répond à l’un des critères suivants : 1- une augmentation nette de son incidence, 2- une exacerbation de la mortalité et de la morbidité, 3- une expansion géographique. Un agent pathogène est dit émergent dans les cas suivants : 4- un changement évolutif récent, 5- un changement de tropisme avec une première détection chez l’homme, 6- un changement significatif dans sa pathogenèse et sa manifestation clinique, 7- une première identification. 29

L’appellation « nouvel agent pathogène » est en fait discutable vu qu’il faut pouvoir distinguer entre un agent nouvellement émergent et un agent déjà existant mais nouvellement identifié. Pour répondre à cette question, la détermination de l’âge des micro-organismes est possible à partir de leurs séquences en faisant des alignements avec des souches homologues et par la suite en calculant le temps de divergence des ancêtres communs déterminés à partir d’une analyse phylogénique (117,118). Le terme nouvel agent potentiellement pathogène est lui réservé aux agents émergents qui n’ont pas encore montré une pathogénicité chez l’homme. La figure 1 montre l’arbre décisionnel pour distinguer une maladie émergente, un agent pathogène émergent, un agent potentiellement pathogène et une maladie ou agent pathogène en cours d’éradication.

Chez l’homme, les agents infectieux sont responsables d’environ 25% de la mortalité (119,120). Parmi ceux-ci ce sont les virus émergents qui ont été majoritairement responsables des épidémies durant les deux dernières décennies, dont la grande majorité possède un pouvoir pathogène respiratoire (121). Citons les coronavirus SARS-CoV , responsable du syndrome respiratoire aigu sévère, le MERS-CoV (122), le HCoV-NL63 (123), le métapneumovirus humain (124), l’hantavirus Sin Nombre (125), l’influenza H1N1 responsable de la pandémie de 2009 (126), le virus Ebola (127), et récemment le virus Zika (128). Les maladies émergentes d’origine bactérienne sont également significatives en termes d’impact sur la santé publique. Comme les virus émergents, les maladies émergentes bactériennes sont majoritairement zoonotiques et étroitement associées aux changements sociodémographiques et environnementaux. Cependant, les émergences s’expliquent d’avantage par une perturbation de la biodiversité très complexe des communautés bactériennes qui nous entourent que par l’apparition de nouvelles bactéries non décrites auparavant (129). En comparant aux virus, les génomes bactériens sont beaucoup plus stables et donc moins sensibles aux évènements évolutifs de nature aléatoire comme les mutations spontanées. Les évènements d’émergence les plus fréquents chez les bactéries sont l’apparition de souches résistantes aux antibiotiques (130) comme le Staphylococcus aureus résistant à la méticilline (SARM) (131) ou l’apparition de nouveaux sérovars très virulents appartenant à des familles bactériennes très

abondantes comme le cas de la souche O104:H4 de Escherichia coli qui a émergée en Allemagne en 2011 (132). Des bactéries pathogènes autrefois inconnues ont été récemment identifiées, comme l’espèce entéropathogène Vibrio fluvialis (133), et l’espèce vectorisée par les tiques Neoehrlichia mikurensis (134).

De nombreuses études montrent que la fréquence d’émergence des maladies infectieuses a significativement augmenté ces derniers décennies (120,135,136) et cette croissance est due au changement du dynamisme hôte- pathogène (116,129,135,137). Ces évènements d’émergence, majoritairement de nature zoonotique (129,135,137,138), sont non-aléatoires, et fortement corrélés aux facteurs socio-économiques, environnementaux et écologiques, surtout à l’exploitation intensive des terres, et aux activités agricoles et agro-alimentaires (135,137). Les études récentes sur les maladies infectieuses émergentes cherchent ainsi à comprendre comment les interactions entre le climat, l’environnement et les facteurs anthropologiques peuvent déclencher des épidémies. Elles combinent leur résultats avec les études plus classiques sur les modalités de transmission des agents pathogènes, l’existence de réservoirs, le spectre d’hôte et la pathogenèse (120,139,140).

Figure 1 : Arbre de décision sur l'émergence des maladies et agents pathogènes, d'après (116).

2. Les nouvelles méthodes pour identifier de « nouveaux » agents pathogènes

Un autre facteur expliquant l’augmentation des notifications d’émergence est l’arrivée d’outils plus performants pour les identifier, en particulier ceux de séquençage à haut débit et d’analyse bio-informatique. Ces nouveaux outils permettent une recherche sans a priori afin de récolter un maximum d’information dans les prélèvements. L’avantage est donc de pouvoir identifier le maximum d’agents, y compris ceux pour lesquels il n’existait aucune hypothèse de départ. La commercialisation des séquenceurs à haut débit a commencé au début des années 2000, permettant un séquençage parallèle et profond de plusieurs millions de molécules d’ADN de taille différentes en un temps réduit comparé au séquenceur Sanger de première génération (débit de 96 séquences par réaction ou « run »). La première plateforme NGS a été le 454 de Life science (acheté par Roche en 2007 et arrêté en 2013) qui utilisait la chimie de pyroséquençage. Actuellement, les plateformes NGS de deuxième génération les plus connues sont : Illumina (Miseq, Hiseq et Novaseq) et Ion Torrent de Life Technologies (PGM et Ion Proton). Ces plateformes possèdent des séquenceurs de plusieurs formats, y compris maintenant des séquenceurs de « paillasse » (benchtop sequencer). Bien que ces plateformes possèdent des méthodologies similaires, leurs performances ainsi que leur débit, taille des lectures produites et coûts sont différents (141). Actuellement, les technologies de deuxième génération sont les plus utilisées dans les projets de metagénomique et d’écologie microbienne (142). Les plateformes dites de troisième génération (third generation sequencing TGS) (141) comme Pacific biosciences (PacBio SMRT), Oxford Nanopore (MinION, GridION, PromethION, SmidgION) utilisent, elles, des technologies de « molécule unique » (single-molecule sequencing). Les caractéristiques de ces outils sont la génération des lectures de très grandes tailles en temps réel sans la nécessité d’amplifier préalablement le matériel génétique. Cela permet de générer rapidement des génomes complets « Whole genome sequencing » (141–143).

La metagénomique shotgun est définie par un séquençage haut débit de la totalité du matériel génétique dans un échantillon (144). Cette approche est irremplaçable pour l’identification des micro-organismes n’ayant pas des gènes

ubiquitaires comme les virus et les phages et pour l’annotation fonctionnelle des génomes microbiens. Quand la metagénomique est appliquée avec comme objectif l’identification d’un virome dans des échantillons bruts et non pas à partir de cultures de virus purs, une étape d’enrichissement du matériel génétique viral est nécessaire. En fait, la proportion d’acides nucléiques viraux par rapport à ceux de l’hôte ou des autres micro-organismes est infime, limitant ainsi la quantité de données propres au virome (145). Pour atténuer cette contrainte, différentes approches sont utilisées pour concentrer ou purifier les ADN ou ARN viraux (146– 150). Une amplification non-spécifique par PCR (122,151) ou des stratégies «multiple displacement » (152,153) sont souvent utilisées afin de générer une charge d’ADNc ou d’ADN viraux suffisante pour le séquençage haut débit. Selon les objectifs, les produits du séquençage sont traités suivant deux voies : un assemblage de novo ou un alignement et une affiliation par rapport à des génomes de références contenus dans les des bases de données (Binning). L’assemblage de novo consiste à assembler les séquences générées (« reads » ou lectures) afin de construire des génomes entiers ou partiels (contigs) sans avoir recours à des génomes de référence. Par contre, les stratégies utilisées durant le binning consistent à affilier chaque séquence générée à un groupe taxonomique en la comparant à une base de données afin de déterminer sa composition taxonomique. La séquence peut aussi être alignée contre un génome de référence (mapping) pour reconstruire des génomes partiels ou complets (144,145,154,155).

Un des avantages de la metagénomique est de récolter un maximum d’informations dans les échantillons par une approche non ciblée dite sans a priori. La puissance des séquenceurs de dernière génération a permis d’explorer les populations microbiennes surtout virales d’un grand nombre d’organismes et d’échantillons de l’environnement d’une manière exhaustive et large. L’autre avantage est la profondeur de séquençage permettant une détection des génomes minoritaires et d’identifier les quasi-espèces virales (156). Tant dans le monde vétérinaire qu’en médecine humaine, sur des patients sains ou des patients présentant des signes cliniques, les analyses metagénomiques permettent de répondre à des questions très variées. Les deux principales limites de ces méthodes sont d’une part la faisabilité et la difficulté technique à générer et

interpréter des millions de séquences et d’autre part l’imputabilité des agents identifiés par rapport à la maladie découverte. Les virus par exemple sont les entités biologiques les plus abondantes sur la planète (157), mais parmi tous les virus présents, une fraction seulement est reconnue comme étant pathogène.

La conception des virus obligatoirement pathogènes a en effet changé avec l’identification des virus commensaux comme les phages et les anellovirus chez l’homme (158,159). La causalité d’un virus dans l’étiologie d’une maladie n’est pas systématique même si le virus en question a été détecté dans une lésion ou un prélèvement d’un organisme atteint d’une maladie (160), d’où la nécessité d’établir des postulats comme celui de Koch et Rivers dans le but de définir la causalité d’un micro-organisme (161). De plus si ces dernières techniques permettent d’identifier le génome d’agents infectieux, l’isolement de ce dernier n’est pas toujours réalisable et le postulat de Koch pas toujours reproduit. Différentes analyses peuvent être réalisées in silico pour caractériser un nouveau virus identifié comme par exemple les analyses génomiques (phylogénie et évolution, marqueurs de virulence) ou des analyses in vitro comme l’étude du tropisme cellulaire, l’identification des récepteurs et la transcriptomique. De même, le rôle d’un nouvel agent potentiellement pathogène dans une maladie devrait être évalué en se basant sur les données épidémiologiques et expérimentales comme la séroprévalence et la prévalence de l’agent dans différentes populations, la charge de l’agent chez les malades par rapport aux individus sains, le tropisme dans l’organisme, la durée d’excrétion de l’agent pathogène, le profil de la réponse immunitaire et les facteurs de risque associés (160,162).

Globalement, le séquençage de masse a permis d’identifier un grand nombre d’agents pathogènes viraux émergents et ré-émergents chez l’homme ces dernières années, comme par exemple le virus Ebola associé à l’apparition des fièvres hémorragiques de 2007 en Ouganda (163), le nouveau phlebovirus nommé Heartland virus (HRTV) aux Etats Unis en 2009 (164), un nouveau genre viral nommé cosavirus appartenant à la famille des picornaviridae associé à une pandémie de paralysie chez des enfants au Pakistan (165), un nouveau rhinovirus (166), un nouveau bocavirus (167), un nouvel arenavirus en 2008 responsable du

décès de patients transplantés (168), ainsi que le MERS-Coronavirus responsable de maladie respiratoire aiguë (122) et de nombreux arbovirus (169).

L’identification de nouveaux agents pathogènes via des techniques de séquençage de nouvelle génération (NGS) est aussi de plus en plus utilisée chez les animaux avec des applications en Santé Humaine (zoonose) mais aussi en médecine vétérinaire. Pour exemple les chauves-souris ont fait l’objet de nombreuses études (170–174) particulièrement depuis que les chiroptères ont été identifiés comme hôtes réservoirs de plusieurs virus pathogènes responsables d’épidémies (virus Ebola, virus Marburg, coronavirus SRAS et MERS, différents lyssavirus dont le virus de la rage, virus Hendra et Nipah) (175) ainsi que de différentes bactéries zoonotiques et pathogènes (176,177). Pour les pathologies animales sensu stricto, le NGS est utilisé dans deux cas de figures, la recherche d’un agent pathogène inconnu mais principalement responsable d’une épizootie ou d’une émergence et la recherche exhaustive d’agents agissant en commun dans des pathologies multifactorielles pour lesquelles on fait l’hypothèse que tout n’est pas connu.

L’exemple le plus criant est l’identification en 2011 d’un bunyavirus, le virus Schmallenberg portant le nom de la ville dans laquelle la maladie a été détectée. Au cours de l’été 2011, de nombreux cas de diarrhées fébriles associées à une perte d’appétit et une chute importante de la production de lait étaient rapportés chez des bovins adultes en Allemagne (Rhénanie du Nord et Westphalie), avec parfois des signes cliniques évocateurs de la Fièvre Catarrhale Ovine, laissant craindre une résurgence de ce virus. Dans un premier temps la recherche de nombreux agents pathogènes dans des prélèvements provenant de bovins malades s’est révélée négative par des techniques classiques et même l’utilisation d’approches innovantes comme la bio-puce Epizone Biochip (> 2 000 amorces de virus). Ce n’est qu’avec une approche NGS à partir d’échantillons de sang de bovins malades que l’Institut Friedrich-Loëffler (FLI) a identifié en novembre 2011 des séquences nucléotidiques appartenant à un nouveau virus qui fut nommé Schmallenberg virus (SBV). L’analyse de la séquence du génome viral indiquait des similarités avec les virus Akabane, Aino et Shamonda, qui appartiennent au genre Orthobunyavirus au sein de la famille des Bunyaviridae.

L’implication du SBV dans les signes cliniques observés fut ensuite confirmée par détection par RT-qPCR du SBV dans les échantillons des bovins malades et quelques temps plus tard par une infection expérimentale sur des bovins âgés de 9 mois. Au cours du mois de décembre 2011, les Pays-Bas signalent pour la 1ère fois une action tératogène du SBV chez des ovins, dont les caractéristiques s’assimilent aux effets observés avec les virus Akabane et Aino.

IV. Les « nouveaux » virus respiratoires bovins : cas de l’influenzavirus de type D

Depuis quelques années de nouveaux projets de recherche ont vu le jour dont les objectifs sont de mieux caractériser les pathogènes respiratoires chez les ruminants et notamment d’identifier de nouveaux agents, principalement des virus. Trois explications majeures peuvent être avancées. La première est que finalement, avec des techniques très sensibles comme les PCR, il existe encore un pourcentage non négligeable de résultats négatifs (5% à 20% selon les études) même quand on cible l’ensemble des pathogènes respiratoires connus et que l’on se place dans les conditions optimales d’échantillonnage. La deuxième est que, si on connait le pouvoir pathogène individuel d’un agent, il reste encore beaucoup de questions sur les co-infections virales et leur importance. La troisième est, comme nous l’avons dit, liée au développement récent d’outils très performants de détection et de recherche de pathogènes. Deux approches peuvent être ainsi définies, une approche ciblée qui repose sur une hypothèse préalable et donc sur les connaissances existantes (données préliminaires, pathologie comparée…) et « l’intuition » scientifique, et une approche qui repose sur une recherche exhaustive de tous les virus et/ou bactéries présents et ensuite une analyse des résultats obtenus.

En l’état plusieurs études reposant sur une approche exhaustive ont été réalisées récemment, qui seront présentées dans la partie expérimentale de ce manuscrit (76,178–180). De même un nouveau virus, le virus Influenza D (IDV), fait partie des virus récemment détecté grâce aux méthodes NGS.

1. Historique des infections à virus influenza A (IAV) chez les bovins

La détection de virus influenza chez les bovins n’a été que très rarement décrite. Le virus influenza de type A a été isolé pour la première fois chez des bovins en 1962 en Hongrie (181). Par la suite, le virus aurait été isolé sur des bovins en Russie dans les années 1970, durant des épisodes de maladies respiratoires sur des bovins, coïncidant avec l’épidémie humaine de grippe à

H3N2 (182,183). En 1973, la souche A H3N2 calf/Duschabe/55/71 a été isolée grâce à une mise en culture sur œufs embryonnés de prélèvements issus d’un veau présentant des signes cliniques respiratoires (183). En 1998, Brown et al. (184) décrivent une séroconversion au virus influenza A chez des vaches laitières présentant des troubles respiratoires et des chutes de production laitière au Royaume uni. Les tests utilisés étaient l’inhibition de l’hémagglutination (IHA) et l’immunodiffusion. Les titres les plus élevés en anticorps étaient obtenus pour deux souches humaines d’influenza A : A/England/333/80(H1N1) et A/England/427/88(H3N2).

En 1984, dans une revue sur la microbiologie et l’épidémiologie de l’infection par l’influenza chez ruminants, Lopez et al. (185) indiquent que des résultats sérologiques (test de fixation du complément) positifs ont été obtenus aux USA contre les souches A2/Japan/305/57, Sw/15, Sw/Shope/58, A/Equi/Prague/57, et B/Johannesburg/59. Au moyen de l’IHA, des résultats positifs ont été trouvés contre les souches A/PR/8/34, A/equi/Prague, A/Equi2/Lexington, Sw/15, Sw/Shope/58, et B/Johannesburg/59 aux USA, et contre les souches A/PR/8/34, A/FM/1/47, B/Bonn, and B/Roma/1/59 en Italie et contre différentes souches de virus Influenza A en Roumanie, en ex URSS, au Népal, en Inde, et en Hongrie. Plusieurs souches ont alors pu être isolées.

En 2002 en Irlande, Graham et al. (186) analysent par IHA 84 paires d’échantillons (des phases aiguë et convalescente) de sérums issus de 17 élevages laitiers présentant des épidémies de maladies respiratoires, diarrhéique et de chute de production. Une séroconversion au virus A/England/333/80/H1N1 est ainsi mise en évidence chez 56,5% des animaux testés et la séroconversion au virus A/England/427/88/H3N2 est démontrée dans 58,8% des cas. Ces résultats suggèrent que le virus influenza A est capable d’infecter les bovins. Toutefois l’importance de l’infection et son rôle épidémiologique ne sont pas clairement connus. Ainsi une étude a été menée en 2007 au Royaume Uni par Crawshaw et al. (187) pour savoir si l’infection par les virus influenza A humains (A/England/333/80(H1N1) et A/England/427/88(H3N2)) pouvait être à l’origine d’une chute de production laitière chez les bovins. Deux troupeaux de 350 et 320 vaches ont été sélectionnés sur la base de l’apparition récente, soudaine et

transitoire (une à deux semaines) d’une chute de production lactée avec hyperthermie modérée, avec une incidence de 10 à 20% dans un troupeau et sans étiologie identifiée. Des sérologies couplées (à 21 jours d’intervalle) ont été réalisées sur les animaux présentant des chutes de production laitière de plus de 30% et sur 25 animaux témoins. Les tests sérologiques classiques ELISA étaient tous négatifs (absence de séroconversion) vis-à-vis des principaux pathogènes respiratoires (BRSV, BVDV, BoHV-1, BPI3, adénovirus, H. somni, M. bovis, Chlamidia psittaci, Coxiella sp, M. haemolytica, P. multocida, Treponemes spp.). Chez les vaches présentant une chute de lait, les résultats ont montré une séroconversion significative vis-à-vis des virus influenza A H1N1 et H3N2 (60% et 65% de séroconversion respectivement). Une corrélation significative a également été mise en évidence entre la séroconversion et une hyperthermie d’une part, et entre la séroconversion et la présence de bruits respiratoires surajoutés (craquements et sifflements) d’autre part. Cette étude suggère que le virus influenza A pourrait entraîner des troubles cliniques comme une chute de la production laitière ou des signes cliniques respiratoires peu marqués chez les bovins. Dans cette étude, la présence directe du virus n’a pas été recherchée.

Une étude d’infection expérimentale par vois intranasale sur quatre veaux inoculés par la souche influenza A hautement pathogène A/cat/Germany/R606/2006(H5N1) s’est révélée incapable d’induire de la symptomatologie, même si les veaux ont excrété le virus pendant 3 jours et ont séroconverti (188). Enfin une étude expérimentale (189) a montré que les virus influenza A humains (A/England/42/72, A/Michigan/1/72), le virus influenza A porcin (A/sw/IL/75(H1N1)) et le virus influenza A isolé chez un veau (A/calf/Duschanbe/55/71(H3N2)) étaient capables d’infecter des veaux, de se multiplier dans les muqueuses nasales (isolement viral pendant sept jours) et pour les souches isolées chez le veau et le porc, d’induire des signes cliniques respiratoires ainsi que des lésions pulmonaires modérées.

Compte tenu du faible nombre d’expériences réalisées, des études supplémentaires apparaissent nécessaires pour déterminer le rôle pathogène des virus influenza A chez les bovins et pour définir l’importance réelle des infections dans les conditions naturelles. L’adaptation du tropisme des virus influenza, en

particulier humains, aux bovins est probablement limitée, en raison du faible nombre de cas déclarés chez les bovins, pourtant en contact étroit avec les humains.

2. Découverte d’un nouveau virus influenza de type D chez les bovins

En Avril 2011, un virus est isolé aux U.S.A (190) à partir d’écouvillons nasaux réalisés sur des porcs âgés de 15 semaines présentant des signes cliniques grippaux. L’étude en microscopie électronique a montré des images caractéristiques d’un orthomyxovirus : virus sphérique enveloppé de 100nm de diamètre présentant des spicules, avec au niveau des cellules infectées des bourgeons filamenteux naissants à partir de la membrane plasmique. Bien que les RT-PCR soient négatives pour les virus influenza A (IAV), B (IBV) et C (ICV), et que l’activité neuraminidase soit négligeable, la présence d’une activité O- acétylesterase suggérait que le virus en cause était apparenté au genre influenza C.

Par la suite l’analyse du génome viral à l’aide d’outils de NGS a révélé 7 segments d’ARN contenant 1000 à 2000 paires de bases, et des régions non codantes en 3’ et 5’ similaires à celles trouvées chez l’ICV humain. De même, cette analyse a montré que le virus identifié était phylogénétiquement plus proche du type ICV (50% d’acide aminés identiques) que des types IAV et IBV. Le virus a donc été nommé provisoirement C/swine/Oklahoma/1334/2011 (C/OK).

Par la suite, différentes études ont montré que ce virus était suffisamment éloigné des ICV pour être classé dans un nouveau type : le virus influenza de type D (IDV) (191). Notamment, afin d’étudier les relations antigéniques entre les virus C/OK et influenza de type C humain, un typage sérologique par immunodiffusion sur gel d’agar (AGID) a été effectué. Cette méthode permet d’identifier les différences antigéniques des protéines NP et M1 et permet ainsi de classer les virus influenza en trois genres (A, B, C). Des anticorps polyclonaux spécifiques du virus C/OK ont réagi de façon significative avec le virus C/OK et un autre virus bovin D/660 mais n’ont pas réagi avec des ICV humains (C/JHB et C/TAYLOR). De même des anticorps polyclonaux spécifiques du virus humain C/TAYLOR n’ont 41

pas reconnu le virus C/OK ni le virus bovin D/660 mais ont réagi avec les souches humaines C/JHB et C/TAYLOR. Ces absences de réactions antigéniques croisées ont constitué une première preuve pour affirmer que le virus découvert appartenait à un nouveau genre d’influenzavirus. Par la suite une expérience a montré l’absence de réassortiment in vitro entre C/OK et des ICV humains sur cellules ST (swine testicle) lors de co-infections (191). Par contre et plus récemment, un réassortiment forcé a été réussi à l’aide d’un système de génétique inverse (192). Enfin des études phylogénétiques ont montré que les divergences entre les virus C/OK et les ICV humains étaient similaires à celles que l’on trouve entre les IAV et les IBV.

Au vu de tous ces arguments, il a été admis par la suite que ce virus C/OK représente un nouveau genre d’influenzavirus nommé influenza D. Dans la suite du manuscrit, le virus C/OK sera nommé D/OK.

3. Propriétés générales des virus Influenza D

a. Propriétés structurales

L’IDV fait partie de la famille des Orthomyxoviridae. C’est un virus enveloppé, doté d’un ARN simple brin segmenté de polarité négative. Les virions sont sphériques (Figure 2), d’un diamètre de 80 à 120 nm. En microscopie électronique ils apparaissent comme une sphère recouverte de spicules correspondant aux glycoprotéines de surface : l’hémagglutinine estérase fusion (HEF). L’enveloppe lipidique est dérivée de la membrane plasmique. Sous cette enveloppe se trouvent des protéines matricielles et au centre, une structure moléculaire hélicoïdale associant l’ARN à des complexes de nucléoprotéines et à des polymérases.

Figure 2 : Représentation schématique d’un virus de type influenza D (193)

Figure 3 : Virus influenza D (C/OK) en microscopie électronique l’hémagglutinine de l'enveloppe forme un halo caractéristique autour des particules virales en coloration négative (190).

Dans le cas des virus de type C et de type D, une unique glycoprotéine de surface est présente et assure à la fois le rôle de l’hémagglutinine et de la neuraminidase des IAV ou IBV. Cette glycoprotéine, appelé HEF, présente donc

trois fonctions : hémagglutination, activité d’estérase et de fusion. Elle est composée de deux sous-unités HEF1 et HEF2. La protéine HEF se lie au récepteur 9-0-acetyl-N-acetylneuraminic présent en surface des cellules cibles (194,195).

b. Génome viral et évolution virale

Le génome viral est lui composé d’un ARN simple brin de polarité négative réparti en 7 segments (Figure 4), chaque segment d’ARN code pour une ou plusieurs protéines virales (190). Les segments d’ARN sont entourés par la nucléoprotéine (NP) pour former des nucléocapsides de symétrie hélicoïdale.

Figure 4 : Le génome du virus influenza D (193)

Le gène de la protéine PB1 (polymérase basique 1) est le mieux conservé chez tous les virus influenza (196) et sa séquence nucléotidique est souvent utilisée pour évaluer les relations phylogénétiques entre différents virus influenza. Il existe plus de 69% d’identité entre les gènes PB1 de IDV et IDC alors que cette dernière est environ de 39% avec IAV et IBV. A titre de comparaison, les gènes de PB1 d’IAV et IBV présentent 61% d’identité, et les gènes PB1 des différents sous types d’IAV sont extrêmement conservés avec plus de 90% d’identité. De même, concernant les protéines PB2 et P3, les identités entre IDV et ICV sont respectivement de 53% et 50% (190). Concernant la protéine HEF, le pourcentage d’identité entre IDV et ICV est de 53%. Ce pourcentage est similaire au pourcentage d’identité des différentes hémagglutinines des sous-types d’IAV (49%) (190). Le pourcentage d’identité entre les NP du virus D/OK et celles d’ICV

est inférieur à 41%. De même, concernant les protéines de matrice, cette identité n’est que de 38% (190).

Les extrémités terminales 3’ et 5’ des segments d’ARN sont des régions non codantes habituellement très bien conservées. Ces régions non codantes jouent un rôle clé dans la réplication du génome et dans l’assemblage. De même, le phénomène de réassortiment entre deux virus n’est possible que si les régions non codantes de ces deux virus sont similaires (197). En ce qui concerne le virus D/OK, les régions situées en 3’ et 5’ sont identiques à celle du virus influenza C humain à l’exception d’un nucléotide.

Les virus influenza évoluent grâce à 2 mécanismes : les mutations ponctuelles («drift») et les réassortiments génétiques («shift»). Les mutations ponctuelles sont dues au faible taux de fidélité de l’ARN polymérase virale, avec un taux d’erreur de 10-4 substitutions/nucléotide/cycle pour l’influenza A, ce qui est assez important comparé au 10-9 substitutions/nucléotide/cycle de l’ADN polymérase. Ces erreurs aboutissent à des mutations ponctuelles au niveau des bases nucléotidiques des gènes viraux, et par conséquent à des modifications au niveau des protéines pour lesquels ils codent. Les conséquences peuvent être des pertes de fonction des protéines virales ou bien l’apport d’avantages sélectifs. C’est le phénomène de dérive génétique ou glissement antigénique. Ce dernier résulte également de la pression de sélection exercée par les anticorps neutralisants sur des sites antigéniques (198). Une étude d’évolution moléculaire sur 5 segments (PB1, PB2, P3, NP et M) du virus D/OK suggère que l’IDV a divergé d’un ancêtre commun aux ICV humains actuels, cet évènement datant d’il y a 300 à 1200 ans (117).

Les réassortiments sont dus à la segmentation du génome des virus influenza. Si une cellule est infectée simultanément par deux virions de sous-types différents, les segments peuvent se mélanger lors de l’assemblage de nouveaux virions. On obtient alors un nouveau virus dit « réassortant ». Une expérience de réassortiment in vitro a été effectuée avec des ICV humains, le virus D/OK et des virus D/bovin (190). Des cellules ST (swine testicle) ont été co-infectées avec différentes combinaisons des virus humains C/Taylor/1947, C/Johannesburg/66, le virus porcin D/OK et le virus bovin D/660. Des virus réassortants issus des deux

ICV humains ont été identifiés, ainsi que des virus réassortants issus du virus D/OK porcin et du virus D/bovin. La co-infection des cultures cellulaires avec de l’ICV humain et du virus D/OK porcin ou du virus D/bovin n’a en revanche pas permis de créer de virus réassortant viable. Cette incapacité de réassortiment naturel suggère que le groupe IDV est génétiquement éloigné de l’ICV humain et représente un nouveau genre d’influenzavirus dans la famille des Orthomyxoviridae. Par contre, un réassortiment forcé a été réussi à l’aide d’un système de génétique inverse (192) ; les différents gènes de D/OK ont pu remplacer les gènes correspondants appartenant à un virus ICV humain, et des virus réassortants viables ont été produits (192).

4. Réservoir, spectre d’hôte et pouvoir pathogène

Lors de la première détection de l’IDV chez le porc (Figure 3), des études se sont concentrées chez le porc et l’homme pour déterminer le spectre d’hôte et le réservoir viral. L’analyse de plusieurs cohortes a montré une séroprévalence limitée chez l’homme (1,3%) et le porc (9,5%), suggérant un rôle limité de ces deux espèces (190). Afin de vérifier la spécificité de la méthode sérologique employée, le virus influenza C humain C/Taylor/1233/47 a également été recherché chez les porcs. Des titres en anticorps allant de 10 à 20 ont alors été détectés chez 2,8% des sérums testés.

Chez le porc

Malgré une séroprévalence modérée, des études montrent que l’IDV circule chez le porc. En Italie en 2016, un écouvillon respiratoire sur 150 prélèvements testés est apparu positif à l’IDV (RT-qPCR) chez un porc malade (199). En 2017 et dans la même région italienne (plaine du Pô), 2,3% (n=845) des prélèvements respiratoires de porc malades prélevés entre les années 2015 et 2016 ont été positifs en RT-qPCR dont des prélèvements de poumons (200). Les sérologies réalisées en 2015 indiquaient un pourcentage de séropositivité de 11,7% alors qu’il était de 0,6% en 2009, suggérant une probable augmentation de la circulation d’IDV dans cette région.

En Chine, des taux de détection de 36,8% dans les écouvillons nasaux et de 28,9% dans les poumons des porcs atteint de maladie respiratoire ont été trouvés par RT-qPCR (201).

Dans une étude récente aux USA une séroprévalence globale de 19,1% a été trouvée chez les cochons sauvages (202). Dans cette même étude, 12 porcs sauvages capturés ont été inoculés par voie intranasale avec la souche D/46N, le virus a été détecté dans les sécrétions respiratoires jusqu’à 7 jours après inoculation avec des titres viraux maximaux de 2,37 log10 TCID50/ml. Les 7 porcs excréteurs de l’IDV ont séroconverti entre 5 et 8 jours post-inoculation. Le virus a été détecté dans les prélèvements respiratoires avec des titres maximaux dans la partie distale de la trachée (5,34 log10 TCID50/ml). Parmi les animaux de cette étude, 8 porcs ont été mis en contact direct avec les porcs infectés. La transmission par contact direct a été observée avec la détection d’IDV chez 3 animaux contacts. Finalement aucun signe clinique n’a pu être observé chez les porcs infectés.

En bilan, ces données montrent que l’IDV circule chez les populations de porcs domestiques et sauvages avec une distribution mondiale. Leur capacité à produire des troubles cliniques sur ces espèces semble être faible. En revanche, le risque d’adaptation chez cette espèce ou de réassortiment avec les autres genres de la famille des Orthomyxoviridae adaptés aux suidés reste probable.

Chez l’homme

L’IDV a la capacité d’infecter et de se transmettre par contact direct entre furets, un modèle de choix pour l’étude des virus influenza humains (190). Cela suggère que ce virus pourrait être transmissible à l’homme. De même, le tropisme cellulaire large et les bonnes capacités de réplication de l’IDV à 37°C sont des arguments supplémentaires concernant le potentiel zoonotique de l’IDV. Plusieurs enquêtes pour rechercher l’IDV chez l’homme ont donc été conduites avec des résultats très variés.

Une étude a été conduite en Floride en 2016 (203) pour évaluer la présence de l’IDV chez des personnes en contact avec le bétail. Un sondage sérologique a été réalisé chez 35 personnes qui travaillent au contact du bétail,

ainsi que chez 11 individus non exposés. Une séroprévalence de 91% a été détectée parmi les personnes travaillant au contact des bovins. Au sein des individus non exposés, une prévalence de 18% a été mise en évidence. Les résultats générés par cette étude pourraient être controversés ; les sérums humains analysés n’ont pas été pré-adsorbés avant avec des antigènes de l’ICV afin d’éviter une possible réaction croisée, sachant que la présence ou l’absence de réaction croisée entre les anticorps contre ces deux virus chez l’homme n’a pas été préalablement démontré. L’absence de cette étape pourrait constituer un biais méthodologique qui explique possiblement ce haut taux de positivité. Dans ses travaux de thèse, L. Eckard (192) a détecté une séropositivité de 1% contre IDV chez une cohorte d’individus en contact avec des bovins séropositifs. Une déplétion préalable des anticorps anti-ICV de ces échantillons a mené à une élimination complète des titres positifs anti-IDV, ce qui suggère une éventuelle réaction croisée entre les anticorps contre les deux virus.

Dans une autre étude, Smith et al. ont cherché IDV dans des prélèvements respiratoires humains ; 3300 échantillons écossais de 2006-2008 ont été analysés par PCR (204). Aucun échantillon n’a été trouvé positif pour IDV.

Le potentiel zoonotique a lui été investigué dans les travaux de L. Eckard. La capacité d’IDV à se répliquer dans les cellules normales bronchoépithéliales humaines différenciées (NHBE), qui représentent des cellules du système respiratoire superficiel humain, a été montrée. Si on considère l’infectivité d’IDV chez le furet et la possibilité de réassortiment forcé avec l’ICV, on peut estimer que le risque zoonotique d’IDV est possible et doit être étudié plus en profondeur.

Chez les bovins

Le rôle des bovins comme réservoir principal du virus a très vite été suspecté. Début 2013 une première étude a été réalisée sur 45 écouvillons nasaux de bovins atteints de BPI dans 6 états des USA pour recherche d’IDV par RT-qPCR (gène cible, PB1) suivie, pour les échantillons positifs, d’une mise en culture et d’un isolement viral sur la lignée cellulaire HRT-18G (human rectal tumor). Huit échantillons se sont révélés positifs (18%) à l’IDV avec des charges virales importantes (Ct compris entre 12 et 15). Par la suite, deux virus (D/bovine/Minnesota/628/2013 et D/bovine/Minnesota/729/2013) ont été choisis 48

au hasard et séquencés pour les comparer au virus D/OK. Tous les segments des virus isolés à partir de bovin étaient identiques à plus de 96% au virus D/OK.

Depuis, l’IDV a été identifié par des méthodes de détection directe (RT- qPCR) ou indirecte (sérologie), dans de nombreux pays (Mexique, Italie, Irlande, Luxembourg, Japon) sur plusieurs continents chez des bovins atteints ou non de signes cliniques respiratoires (199,202,205–212). Pour exemple, un sondage sérologique a été conduit en 2016 pour évaluer la présence de l’IDV au Japon (210) ; 1267 échantillons de sérums bovins collectés sur des animaux sains entre 2010 et 2016 dans différentes exploitations agricoles du pays ont été analysés. La méthode utilisée pour détecter les anticorps anti-IDV était l’IHA. Des sérums positifs ont été trouvés pour toutes les années de collecte et pour toutes les régions du pays. Les taux de séropositivité variaient entre 13,5% et 50% selon les régions. La séropositivité totale des échantillons testés était de l’ordre de 30%. Cette étude montre l’ubiquité de l’IDV au Japon depuis plusieurs années. La détection d’IDV en Asie avait en fait commencé plus tôt avec l’identification du virus en Chine en 2014 avec 3 positifs sur 453 prélèvements respiratoires testés (205). Dans l’étude chinoise de Zhai et al. (201), l’IDV a été détecté dans la province de Guangdong avec des taux de détection compris entre 7,3 et 16,3%. Les échantillons consistaient en des prélèvements respiratoires et des sérums, la détection du génome de l’IDV dans les composants du sang des bovins n’ayant pas été précédemment décrit.

C’est aux USA que les études sur les bovins sont les plus nombreuses. En 2015, une étude a montré un taux de positivité de l’IDV de 4,8% (n=208) et a surtout mis en évidence l’existence de deux rameaux phylogénétiques représentés par les souches D/swine/Oklahoma/1334/2011 (D/OK) et D/bovine/Oklahoma/660/2013 (D/660) (206). Un troisième groupe phylogénétique distinct s’est ensuite présenté avec l’identification des souches japonaises (213). La même année, Ferguson et al. ont montré que les deux souches D/OK et D/660 co-circulaient dans les élevages bovins atteints de BPI dans le Mississippi (207). Aux USA il semble que l’IDV circule depuis 2003, comme l’indiquent des résultats de séropositivité sur des cohortes de bovins dans le Nebraska (214).

En Europe, la détection de l’IDV a rapidement suivi son identification aux USA. L’équipe virologie (IHVV) de l’UMR 1225 à Toulouse a travaillé sur un total de 134 échantillons respiratoires (poumons, écouvillons nasaux et liquides d’aspiration trans-trachéale) de bovins atteints de BPI aimablement fournis par le laboratoire départemental de Saône et Loire (LDA71) et sur 140 échantillons (70 écouvillons nasaux et 70 lavages broncho-alvéolaires) obtenus par l’équipe en 2013 et 2014 sur des veaux atteints de BPI et provenant de 23 fermes du Sud- Ouest (Ducatez et al., 2015 et données non publiées). Respectivement deux écouvillons nasaux profonds (ENP, 2,8% des échantillons, provenance unité) et six prélèvements (4,5% des échantillons, provenance LDA71), se sont avérés positifs par RT-qPCR. Des co-infections ont été observées avec le BRSV, le BoHV-1, P. multocida, M. haemolytica et H. somni dans 4 prélèvements du LDA71 et les 2 prélèvements de l’UMR. Pour 2 prélèvements (5831 et 5920, collectés en 2014 par le LDA71), seul l’IDV a été détecté. Le virus présent dans l’échantillon présentant la charge virale la plus élevée a alors été séquencé et nommé D/bovine/France/2986/2012. L’analyse phylogénétique de ses segments a montré que D/2986 forme un groupe distinct qui se rapproche du groupe D/bovine/OK. Les études de surveillance européennes se sont enchaînées depuis. En Italie en 2016, Chiapponi et al. (199) ont décrit la détection et la caractérisation génétique de trois isolats d’IDV dont deux détectés dans des ENP de bovins atteint de BPI. Les trois prélèvements dataient des années 2014 et 2015 pour les ENP bovins et de 2011 pour l’ENP porcin. Les génomes analysés étaient très proches génétiquement et appartiennent au groupe D/swine/OK. En Irlande, 320 échantillons respiratoires de bovins atteints par la BPI entre 2014 et 2016 ont été analysés (211), l’IDV a été identifié dans 18 ENP. Le séquençage partiel et l’analyse phylogénétique ont montré que les virus détectés appartiennent au groupe D/swine/OK également. Enfin des études de sérologie menées en France indiquent une prévalence variant de 38 à 70% selon les régions testées (données non publiées).

L’ensemble de ces résultats suggère que les bovins sont l’hôte principal de l’IDV. S’est automatiquement posée la question du pouvoir pathogène de l’IDV dans cette espèce. Très rapidement après sa découverte deux études de

metagénomique sur des prélèvements respiratoires de bovins atteints de BPI aux USA et au Mexique ont montré une corrélation positive significative entre la détection du virus et la maladie respiratoire (76,180). Par la suite deux infections expérimentales ont été réalisées qui ont montré un pouvoir pathogène respiratoire principalement limité à l’appareil respiratoire supérieur (215,216). Ces études seront détaillées dans la partie expérimentale et leurs résultats discutés.

Autres espèces

En 2015, des échantillons de sérums ont été prélevés sur 648 petits ruminants (ovins et caprins) issus de 141 exploitations et dans 25 élevages avicoles (poulets et dindes) situés dans différentes régions des Etats-Unis et du Canada (217). Par IHA et séroneutralisation, des anticorps anti-IDV ont été détectés chez 5,2% des ovins testés (13.2% des exploitations ovines) et chez 8,8% des caprins testés (13,5% des exploitations caprines). Concernant les élevages avicoles, il n’a pas été détecté d’anticorps anti-IDV. Plus récemment le génome de l’IDV a été détecté par RT-qPCR dans 27 échantillons de sérums de chèvres (33,8%) et plus curieusement dans 12,5% des échantillons rectaux (201). En revanche, aucun écouvillon nasal n’était positif dans cette étude. Ces résultats montrent que l’IDV circule aussi chez les petits ruminants. Le pouvoir pathogène de l’IDV chez ces espèces n’est en revanche pas documenté à ce jour.

V. Environnement microbien et pathologie respiratoire

Si la notion d’agents infectieux respiratoires agissant sur un terrain prédisposé par des facteurs d’élevage et environnementaux est un concept bien établi en pathologie respiratoire, l’impact de l’environnement microbien a longtemps été ignoré, une des raisons étant la croyance que l’appareil respiratoire profond était stérile. Les données issues notamment de la biologie moléculaire ont radicalement changé ce concept ces dernières années.

1. La notion de microbiote

a. Introduction et définitions

L’avancement des techniques de biologie moléculaire centrées sur l’étude du matériel génétique a montré que les humains et les animaux sont les créatures minoritaires dans un énorme écosystème très complexe de microbes. Le corps humain loge 10 fois plus de cellules bactériennes que de cellules du soi et 100 fois plus de matériel génétique que son propre génome (218). Il est ainsi difficile d’imaginer que ce « deuxième » génome que nous hébergeons sur nos surfaces épithéliales est sans importance. Ces complexes poly-microbiens qui colonisent la majorité des surfaces sur terre, dont nos tissus, sont généralement symbiotiques et avantageux pour l’organisme hôte qui les héberge (219).

La description de ces communautés microbiennes complexes et de leur environnement a fait l’objet de nombreuses définitions quelquefois contradictoires. Les termes les plus utilisés dans ce domaine sont les suivants : - Le microbiote représente l’ensemble des communautés microbiennes présentes dans un environnement bien défini. Ces communautés microbiennes en question regroupent l’ensemble des bactéries (on parle de « bactériote » (220)), virus (on parle de « virome »), phages, archées, et micromycètes (220,221). Bien que le terme semble apparaître vers le début des années 50 (222), le terme microbiote est devenu commun vers les années 60 dans le lexique des laboratoires, à l’époque où les modèles animaux 52

gnotobiontes sont devenus populaires (223). Le terme de microflore a aussi été utilisé pour décrire ces communautés mais dans la mesure où le mot « flore » est plus spécifique des plantes, le terme microbiote apparait plus adéquat pour désigner les microorganismes (224). - Le microbiome est l’ensemble des communautés microbiennes en plus de leurs gènes et de l’environnement qui les entoure (221,223,225,226). En d’autres termes, un microbiome désigne un microbiote en prenant compte des données géniques ou génomiques et des interactions avec son habitat. Selon le dictionnaire Merriam-Webster (227), le terme microbiome est apparu pour la première fois en 1952 dans une étude sur les protozoaires comme indicateurs de la pollution de l’eau (222) mais son utilisation dans la littérature ne sera répandue que dans les années 2000. - Le metagénome est la collection des données géniques ou génomiques des membres d’un microbiote issue d’un séquençage haut débit (225,226). En d’autres termes c’est un dossier informatique contenant la totalité des informations issues d’un séquenceur à haut débit. Dans certaines références, les auteurs distinguent le terme metagénome du terme metataxonome, le premier désignant les données issues d’un séquençage haut débit non ciblé (shotgun sequencing) et le deuxième désignant les données issues d’un séquençage haut débit ciblé (par exemple le gène 16s rRNA) (225,226). Un metataxonome représente un métagénome contenant la collection des données d’un gène unique et pouvant être utilisé pour construire un arbre phylogénique.

b. Historique des études des communautés microbiennes

Les microorganismes associés au corps humain ont été étudiés depuis plusieurs siècles dans les conditions de santé ou de maladie. La première étude du microbiome humain a probablement commencé avec le scientifique néerlandais Antonie Van Leeuwenhoek qui sera le premier à décrire la présence des « animalcules » dans le grattage de la « substance granuleuse » accumulée entre ses dents et observée sous microscope (228). Ainsi, en 1693, il sera le premier à visualiser les bactéries nichées dans la plaque dentaire.

Ensuite, les microorganismes faisant partie d’une communauté microbienne ont été identifiés in situ par les méthodes de coloration comme par exemple la coloration de Gram (229). Ces méthodes, bien efficaces pour discerner de façon vague les familles microbiennes, manquaient de précision quant à la distinction taxonomique des espèces. De ce fait, la microbiologie est devenue quasiment dépendante de la culture ; il était nécessaire de cultiver un microorganisme au laboratoire afin de l’étudier. Différentes méthodes seront ainsi développées pour la détection et la discrimination des espèces microbiennes : l’utilisation des milieux de culture sélectifs, la discrimination selon la morphologie des colonies bactériennes, et les capacités métaboliques de production ou de consommation.

L’utilisation systématique des techniques de culture bactérienne a probablement privilégié l’étude des espèces dites cultivables. Pourtant la grande majorité (>99%) des espèces bactériennes n’est pas facilement cultivable (230). Le terme « numération erronée en plaque » (plate count anomaly) a été utilisé pour la première fois par Rasumov en 1932 (231) qui nota à partir d’échantillons divers une différence de plusieurs ordres de grandeur entre d’une part les bactéries identifiées par énumération microscopique et par culture en plaque. Longtemps les moyens pour étudier les espèces bactériennes non cultivables sont restés limités jusqu’au développement de méthodes indépendantes de la culture qui se basent sur l’étude moléculaire de l’ADN (232). Ainsi le développement de techniques analytiques à haut débit et la perception que les microorganismes sont en majorité non cultivables par les méthodes classiques et qu’ils sont responsables de la majorité des cycles environnementaux et des maladies humaines et animales a changé notre conception des microorganismes et de la façon de les aborder.

Les techniques moléculaires analysent le matériel génétique bactérien extrait directement de l’échantillon et non pas d’une culture pure. Elles prennent en compte la diversité taxonomique présente et permettent de décrire les fonctions de chacun des membres de la communauté bactérienne (génomique fonctionnelle). En résumé ces méthodes permettent d’avoir une vision plus réelle

et diversifiée des communautés microbiennes dans les différentes niches biologiques étudiées.

Les premières tentatives d’étude de diversité d’une communauté microbienne non cultivée étaient celles de David Stahl en 1984 et 1985 (233,234). Dans leurs études, les ARN 5S ribosomiques des échantillons de l’environnement étaient extraits, séparés par électrophorèse, séquencés, et leur phylogénie analysée. Par la suite, Olsen et al proposa l’utilisation des molécules d’ARN ribosomique (ARNr) plus grandes dans les études de l’écologie microbienne comme les ARNr 16S (235). Cette application qui ressemble de loin aux approches actuelles, a été utilisée pour la première fois en 1990 (236) et 1991 (237) pour caractériser des échantillons de plancton marin de l’océan Atlantique. La méthodologie utilisée dans ces 2 études a consisté à extraire et fragmenter l’ADN total et à le cloner dans un bactériophage. Les clones contenant les inserts du gène d’ARNr 16S étaient ensuite sélectionnés, amplifiés en PCR avant d’être séquencés. Les méthodes utilisées (PCR, clonage, synthèse d’amorces et de sondes d’hybridation,…) ont été considérées à l’époque comme une évolution très avantageuse dans la découverte des nouvelles espèces microbiennes (236–238).

L’hybridation in situ en fluorescence (FISH) a été parmi les premiers outils dits « culture-indépendants » utilisés dans les études de diversité microbienne in situ. Cette méthode se base sur l’hybridation ciblée des acides nucléiques sans extraction préalable (239).

Ces premiers outils ciblaient des gènes bactériens spécifiques ou des fonctions biochimiques et reposaient sur le clonage et le séquençage individuel des clones (236,237,240–242). Elles ont été capables de décrire la diversité microbienne dans des échantillons de l’environnement et du contenu intestinal particulièrement. Toutefois l’information fournie restait limitée.

c. Approches actuelles des analyses de la diversité microbienne

Trois approches différentes de séquençage à haut débit peuvent être utilisées dans les études de microbiome en fonction des objectifs : le séquençage

ciblé des amplicons, la metagénomique, et la metatranscriptomique. Le séquençage ciblé des amplicons consiste à amplifier d’une façon spécifique un fragment ou la totalité d’un gène et à le séquencer, les gènes en question sont souvent très conservés comme le gène ADN ribosomique 16S et peuvent servir pour déterminer la composition et la diversité microbienne d’un environnement. La metagénomique consiste à séquencer tous les ADN présents dans un échantillon dans le but d’identifier tous les gènes présents, cette méthode est utilisée dans la recherche fonctionnelle (par exemple sur les gènes de virulence ou les voies métaboliques) d’un microbiome ou dans le cas où les micro-organismes d’intérêt ne possèdent pas de gène conservé (comme les virus et les phages) (155). La metatranscriptomique ou « RNA-seq » consiste à séquencer l’ensemble des ARN (le transcriptome) présents dans l’échantillon ; l’analyse des résultats générés vise à identifier les transcrits présents et l’expression des gènes dans l’environnement étudié. En d’autres termes, le choix de l’approche peut se baser sur les questions suivantes : séquençage ciblé des amplicons ou « Qui est là ? », la metagénomique ou « qu’est-ce qu’ils peuvent faire ? », et la metatranscriptomique ou « qu’est-ce qu’ils font ? » (243).

Toutes ces approches reposent sur le séquençage à haut débit, le choix repose essentiellement sur les objectifs fixés et les questions posées. Par ailleurs la préparation des échantillons, les analyses bio-informatique et l’interprétation des données différentes selon les méthodes choisies.

Le séquençage du gène ADN ribosomique 16S est parmi les premières méthodes utilisées dans les études des communautés bactériennes (224). Il fournit une description quantitative (224) des espèces bactériennes présentes dans des échantillons de nature diverses permettant ainsi l’identification et les analyses de diversité des communautés complexes. Le gène ADNr 16S code pour l’ARN ribosomique (ARNr) 16S qui constitue la petite sous-unité des ribosomes des procaryotes. Il est constitué d’une alternance de régions conservées et variables, ce sont ces dernières qui permettent la discrimination entre les différentes espèces bactériennes (244). Le séquençage à haut débit d’une ou plusieurs régions variables du gène ADNr 16S est généralement précédé par une amplification de cette séquence cible à l’aide d’une réaction de PCR. Ce sont les

amplicons produits qui sont alors utilisés pour la préparation des librairies de séquençage (224). L’analyse bio-informatique des lectures générées par le séquençage ADNr 16S passe par plusieurs étapes durant lesquelles les séquences similaires sont groupées pour former des unités taxonomiques (operational taxonomic units, OTU) et affiliées en les comparant à des bases de données (par exemple : RDP, silva128 16S, greengenes). Les OTU identifiées ainsi que le dénombrement de ces taxons pour chaque échantillon sont classées dans une table d’abondance qui sera utilisée ultérieurement pour les analyses de biodiversité.

2. Le microbiote respiratoire de l’homme

a. Historique

Longtemps les poumons ont été considérés comme un organe stérile chez l’homme en bonne santé (245). Cette croyance et le fait que les méthodes d’investigation de l’appareil pulmonaire étaient considérées comme invasives et à risque expliquent en partie que cet organe n’était pas dans la liste des tissus du projet « Human microbiome project » (HMP) (Figure 5). Le HMP lancé en 2008 est l’étude de la diversité microbienne la plus importante en terme de budget (150 millions de dollars ) et de débit de donnés générées (246). Il avait comme objectifs à partir de prélèvements réalisés sur 250 volontaires qualifiés comme « sains », de caractériser le microbiome lié aux différents sites du corps humain en utilisant les outils biologiques à haut débit, de déterminer les associations entre les perturbations du microbiome et l’état de santé ou de maladie et finalement de fournir des ressources et des approches techniques standardisés afin de les diffuser dans la communauté scientifique (247)

Figure 5 : Chronologie des études sur les communautés microbiennes. Les cercles représentent les projets basés sur le séquençage profond du gène 16s ou metagénomique (shotgun) trouvés sur NCBI jusqu’à Mai 2012. La 58

grandeur de chaque cercle reflète la quantité de séquences générées par le bio projet. D’après (230)

La première étude décrivant un microbiome respiratoire bas (248) chez l’homme a été fortement critiquée et sa méthodologie remise en question. Depuis d’autres études sont venues confirmer la présence d’un microbiome respiratoire bas, la notion d’un microbiome « normal » colonisant l’arbre respiratoire de l’homme et sa relation avec certaines maladies respiratoires étant maintenant acceptée. En outre, les études se basant sur les séquences du gène ribosomique 16S révèlent une sorte de consensus sur les phylums bactériens présents dans l’appareil pulmonaire sain, que sont les phylums Firmicutes, Bacteriodetes, Proteobacteria, Fusobacteria, et Actinobacteria (249–251).

Le nombre d’études portant sur le microbiome respiratoire chez l’homme est en augmentation remarquable depuis quelques années, ces études se basant entièrement sur les outils de séquençage à haut débit. Le résultat d’une recherche simple sur Pubmed comprenant les termes suivants : « respiratory » OR « lungs » AND « microbiome » OR « microbiota » est suffisant pour illustrer cette croissance annuelle (Figure 6). Ces études traitent majoritairement des maladies respiratoires à caractère inflammatoire aigu et/ou chronique, et génétique chez l’homme comme par exemple la bronchopneumopathie chronique obstructive (252–254), l’asthme (248,255), l’allergie (256) et la mucoviscidose (257–259).

nombre d'études 40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 année

1846 1885 1892 1898 1905 1912 1918 1924 1930 1936 1942 1948 1954 1960 1966 1972 1978 1984 1990 1996 2002 2008 2014

Figure 6 : Evolution du nombre d’études sur le microbiome respiratoire 59

b. Ecologie du microbiome respiratoire en homéostasie et dysbiose : description chez l’homme

Le système respiratoire se constitue majoritairement d’un réseau d’épithéliums en contact direct avec l’environnement extérieur. Chez l’homme et les mammifères, la complexité anatomique et histologique de l’arbre respiratoire est à l’origine d’une écologie microbienne diversifiée créant ainsi différentes niches microbiennes reparties sur les différents niveaux du tractus respiratoire. Ces différences sont majoritairement dues à des variations de l’humidité, de l’oxygénation, de l’acidité du tractus luminal aérien et de la nature des cellules épithéliales (260). Dans les minutes qui suivent la naissance on peut détecter des communautés bactériennes présentes dans la cavité orale et dans le nasopharynx, indiquant d’abord une colonisation précoce de l’arbre respiratoire superficiel puis de l’arbre respiratoire profond (261,262).

Plusieurs hypothèses ont été proposées (254,263) pour expliquer la formation des microbiotes dans leurs habitats, la plus souvent admise est celle de l’écologie de la communauté décrite par Mark Vellend (260). Dans ce modèle, l’écosystème formé par le microbiote n’est pas soumis juste à la pression de sélection de son environnement mais aussi à une combinaison d’évènements sélectifs et aléatoires (264) que sont la dispersion, la sélection, la spéciation, et la dérive écologique. Le phénomène de dispersion, qui représente le mouvement des microorganismes dans les habitats, est responsable de la première colonisation du système respiratoire superficiel dans les instants après la naissance (265). L’exposition d’un être naïf à l’environnement extérieur va induire une colonisation non différenciée sur la totalité de son organisme, d’où la nature aléatoire de ce phénomène. La sélection, par contre, repose sur les capacités adaptatives et évolutives de différentes populations microbiennes. La sélection influence la prolifération et les taux de réplication de certaines espèces bactériennes et est à l’origine de la mise en forme de la structure du microbiome en termes d’abondance et de composition. La pression qu’exerce l’environnement, ainsi que les conditions physico-chimiques sont à l’origine de la structure des différents microbiomes dans chaque partie de l’arbre respiratoire. La spéciation représente-elle un isolement génétique dans un habitat spécifique dans lequel des

espèces s’adaptent et s’individualisent grâce à des évènements de mutations et de recombinaison ? Similaire à la spéciation, la dérive écologique est par contre liée au hasard. Ces évènements écologiques semblent gérer les interactions entres les bactéries aboutissant à une écologie très dynamique des microbiomes respiratoires (260).

Un microbiome colonisant un habitat biologique constitue une entité génomique et écologique très dynamique, et souvent dépassant en nombre de microorganismes et de gènes celles de l’organisme hôte (247,266). La composition des microbiomes colonisant une niche biologique d’une même espèce hôte est variable avec l’âge (267), la population, l’environnement, les conditions de vie (268), l’exposition à des substances pharmaceutiques ou chimiques (269), et diverses autres conditions (270).

La perturbation du microbiote, aussi appelée dysbiose correspond à un état dans lequel le microbiote subit des changement en terme de composition et de diversité suite à un évènement perturbateur et aboutissant à une maladie (256) : d’où le rôle fondamental des microbiomes dans la physiologie des organismes hôtes qui les hébergent et leur considération dans les approches de diagnostic et thérapeutique actuelles. Les interactions qui ont lieu entre l’hôte et les communautés microbiennes qui colonisent les muqueuses sont fondamentales pour le développement et la régulation du système immunitaire inné et acquis ; la nature de l’exposition du microbiote intestinal nouvellement installé chez les nouveau-nés est démontrée cruciale pour le développement et la modulation d’un système immunitaire sain, ce microbiote contenant l’ensemble des premiers antigènes se présentant à l’organisme (251,256,263,271–275). Il est aussi important pour la maintenance de l’homéostasie métabolique, pour exemple la surproduction des acides gras volatils suite à une perturbation du microbiote intestinale et à l’obésité (276,277) et des fonctions neurologiques, comme par exemple la capacité de certains micro-organismes du microbiote intestinal d’influencer le comportement de l’hôte par la production des composés neuromédiateurs analogues à ceux produits dans le système nerveux central (278). L’augmentation du risque de l’athérosclérose chez la souris ferait aussi

suite à la production exagérée par certaines bactéries intestinales de triméthylamine-N-oxide (279).

Pour le système respiratoire, les données sont bien moins nombreuses. Cette différence est due principalement à la difficulté d’échantillonner les cavités respiratoires basses, au manque de modèles, et à la faible charge bactérienne dans le tractus respiratoire aboutissant à un ratio positif en faveur des cellules de l’hôte (280,281). Le système respiratoire est considéré comme pauvre en ressources nutritionnelles nécessaires pour une prolifération microbienne abondante comparé au système gastro-intestinal.

c. Microbiome et pathologie respiratoire

Si on considère que le microbiome interagit avec l’homéostasie de l’hôte, toute perturbation majeure de ce microbiome pourrait avoir des conséquences sur l’état de santé. De nombreux facteurs régulent la prolifération bactérienne dans les cavités respiratoires tels que la pression en oxygène dans le tissu, la nature de l’irrigation sanguine du tissu, le pH de l’épithélium, la température locale, et la nature des cellules inflammatoires présentes (251).

A chaque inspiration des microorganismes vont se trouver en contact avec la muqueuse respiratoire des cavités nasales (282). En plus de l’extension directe, la micro-aspiration est un phénomène normal permettant la migration des microorganismes du système digestif superficiel vers le système respiratoire superficiel. L’élimination des particules et des microbes colonisant est assurée dans un premier temps par le tapis « muco-ciliaire » présent au niveau des bronches, par la toux, ainsi que par la phagocytose par les cellules immunitaires résidantes dans la muqueuse (251,260,283,284). Ainsi, ces trois facteurs contrôlent le dynamisme du microbiote de l’arbre respiratoire et maintiennent un état d’équilibre à l’état normal. Toute altération de la composition ou de la charge du microbiome respiratoire peut être attribuée à un dysfonctionnement d’un ou plusieurs de ces facteurs (282).

Dickson et al (263) a proposé différents modèles pour expliquer la pathogenèse respiratoire et le changement que subit l’écosystème pulmonaire

durant une pneumonie. Le premier modèle, adapté des données de l’écologie des espèces terrestres, considère les cavités respiratoires superficielles et profondes comme deux entités séparées. Ce modèle se base sur la migration et le taux d’extinction des espèces. La migration est dépendante de la différence de richesse ; les microorganismes tendent à coloniser les tissus ayant une richesse en micro-organismes inferieure. Le taux d’extinction dépend lui des capacités d’élimination des microorganismes par l’appareil respiratoire (toux, activité muco- ciliaire, immunité innée et acquise).

Le deuxième modèle écologique adopte la notion du gradient environnemental qui représente la variation des facteurs physico-chimiques le long du tractus respiratoire (température, pression d’oxygène, circulation sanguine, salinité, pH…). L’abondance et la diversité ainsi que le mouvement des espèces qui colonisent le système respiratoire sont directement liés à ce gradient.

Le troisième modèle considère l’écosystème microbien dans les poumons comme un système complexe adaptif. Dans ce modèle, tous les facteurs déjà cités sont pris en compte : les facteurs environnementaux, les facteurs de virulence, les conditions physico-chimiques, le système immunitaire, les structures anatomiques et physiologiques ainsi que les interactions des bactéries entre elles et avec les virus, tous ces facteurs interagissent ensemble d’une façon complexe. Par définition, un système complexe adaptif est non linéaire et très dynamique, il possède des capacités à changer rapidement et à s’adapter à de nouvelles conditions. Dans ce modèle l’écosystème respiratoire sain est considéré en état d’homéostasie, et la pneumonie, donc la maladie, est un phénomène foudroyant dans lequel le microbiote a une diversité microbienne basse (richesse en espèces) et une biomasse (charge microbienne) abondante ainsi qu’une réaction inflammatoire agressive.

Ces modèles montrent la nécessité d’étudier la relation microbiome- maladie dans une perspective écologique et non pas microbiologique classique (285).

3. Interactions microbiome et agents pathogènes : le pathobiome

Si on considère que l’appareil respiratoire profond héberge une communauté microbienne résidente, quelles peuvent être les relations entre cette communauté et des agents pathogènes respiratoires connus ?

Autrefois le postulat de Koch « un microbe, une maladie » se résumait comme suit : le microorganisme est présent dans tous les cas de la maladie, il doit être absent dans tous les autre cas, et finalement, le microorganisme doit pouvoir déclencher la maladie après avoir été isolé et cultivé dans un milieu pur (161). Ce dogme datant de 1890 a été fragilisé depuis que l’on considère le caractère multifactoriel et multimicrobien des maladies respiratoires (286). Les limitations au postulat de Koch ont en effet rapidement émergé avec la découverte du portage sain pour plusieurs agents pathogènes (exemple Vibrio cholera) ou avec l’identification de virus répondant rarement au postulat (287). Mais c’est durant la dernière décennie et avec le développement d’outils de séquençage que les postulats de Koch ont été soit remis en question soit adaptés en intégrant les données moléculaires obtenues sur des communautés microbiennes entières.

Grace aux données générées par les approches de biologie moléculaire récentes, est apparu la définition d’un « microbiote infectieux complexe » ou « pathobiome » pour désigner les interactions entre un microbiome et des agents pathogènes durant une maladie au sein d’un organe ou d’un tissu donné (288). Une telle approche semble être en discordance avec les modèles traditionnels d’infection surtout des organes et tissus stériles comme le sepsis ou la méningite où l’agent étiologique est unique et l’évolution préalablement connue. Comme déjà démontré dans plusieurs études, le microbiome normal peu se transformer en microbiome virulent sous certaines conditions (288) et inversement, un microbiome normal peut héberger des microorganismes connus comme étant pathogènes sans qu’il n’y ait nécessairement de maladie (260).

Etudier un pathobiome repose alors sur la compréhension des interactions de tous les membres du microbiote avec l’environnement qui les entourent. Ce travail complexe demande (i) une bonne connaissance des différents microorganismes qui constituent cette communauté et surtout de ses agents 64

connus comme étant pathogènes, (ii) des preuves qui lient les membres de cette communauté à la pathogenèse, (iii) une connaissance sur le rôle de la communauté microbienne ainsi que sur la persistance, transmission et évolution des agents pathogènes présents, et (iv) une connaissance sur les facteurs biotiques et abiotiques qui peuvent modifier la composition du microbiome et amener à une pathogenèse (288).

Au final les interactions peuvent être de nature agoniste ou antagoniste au sein des écosystèmes microbiens. Une étude sur la pathogenèse du poliovirus dans un modèle souris a montré que les souris ayant un microbiote intestinal déplété étaient moins susceptibles à l’infection par le virus (289). A l’inverse des effets antagonistes ont été mis en évidence, comme par exemple la présence de certaines entérobactéries dans l’intestin des moustiques (vecteurs de la malaria) qui rendait le microbiote intestinal du moustique résistant à la colonisation par le parasite Plasmodium falciparum, agent responsable de la malaria chez les humains (290). Ce phénomène de protection des organismes commensaux contre des agents pathogènes est désigné « résistance de colonisation » (Figure 7). Ces microorganismes commensaux protègent leur hôte en inhibant directement l’agent pathogène ou en renforçant le système immunitaire (291). Ce même phénomène a été validé dans une étude dans laquelle des intestins de souris pré-colonisés par Clostridium scindens, une bactérie commensale, ont montré une amélioration des signes cliniques suite à une infection par Clostridium difficile, une bactérie très pathogène responsable d’une entérite aigue (292). Dans une autre étude, une souche particulière d’E. coli (O21:H+) dans l’intestin de souris s’est montrée protectrice (absence de cachexie) dans un modèle d’infection du tractus gastrointestinal. Dans cette même étude, le transfert du microbiote résistant des souris protégées à des souris sensibles a permis de les protéger (293). Le mécanisme envisagé de protection par le microbiome et particulièrement E. coli O21:H+ ferait intervenir une stimulation du système immunitaire inné.

Figure 7 : Résistance de colonisation. (A) selon le postulat de Koch, un agent pathogène peut déclencher une maladie. (B) Cette théorie est remise en question quand un autre microorganisme peut induire une protection contre l'agent pathogène. (C) Dans d’autres cas, un microbiote peut avoir un effet protecteur encore plus important. D’après (291)

4. Microbiome et pathobiome respiratoire bovin

Les études sur le bactériote respiratoire des jeunes bovins sont récentes et en plein essor. La volonté d’explorer ces communautés bactériennes très complexes et inconnues et la facilité qu’offrent les outils de séquençages à haut débit expliquent ce progrès très rapide. Dans cette partie, nous désignons par « bactériote » la communauté bactérienne analysée puisque dans l’ensemble des études, les autres composantes du microbiote (virus, champignons et archées) n’ont pas été abordées. La grande majorité des études publiées concerne les élevages de type feedlot aux USA et au Canada où les BPI apparaissent quelques jours après la mise en lot de centaines de veau provenant de nombreux élevages.

Un premier objectif était d’étudier de manière dynamique la biodiversité du microbiote respiratoire nasopharyngien des veaux à l’allotissement puis 40 ou 60 jours après, aux dates correspondant à l’apparition des BPI. Ces travaux ont principalement été menés à l’Université de Calgary où l’équipe de Holman a montré dans une première étude (294), qu’au jour de l’allotissement, la grande majorité des séquences obtenues par NGS appartenaient au phylum Proteobacteria (93% des séquences générées), le phylum Firmicutes étant le seul autre à contenir plus d’1% des séquences totales. Par contre au jour 60 après allotissement, de nouveaux phylums avec plus d’1% d’abondance relative apparaissaient, tels que les phylums Actinobacteria, Tenericutes, et Bacteroidetes. En étudiant les genres bactériens, les plus abondants à l’allotissement étaient Pseudomonas, Shewanella, Acinetobacter, et Carnobacterium alors qu’au jour 60, les genres Staphylococcus, Mycoplasma, Mannheimia, et Moraxella prédominaient. Dans une 2e étude les même auteurs ont identifié le bactériote nasopharyngé selon la même cinétique mais en comparant deux groupes de 5 veaux traités ou non aux antibiotiques pour cause de BPI (102). Ils ont utilisé une puce à ADN (du genre Phylochip), capable d’identifier 8741 taxons bactériens différents par hybridation spécifique de 297 851 sondes ciblées sur le gène 16S ribosomique. Plus de 75% des OTU identifiées appartenaient aux phylums Proteobacteria et Firmicutes sans différence entre veaux malades et sains. La famille Acidobacteriaceae, qui regroupe des bactéries de l’environnement, était le taxon omniprésent dans tous les échantillons. Les veaux cliniquement sains présentaient des abondances relatives supérieures aux veaux malades pour les familles bactériennes Micrococcaceae, Lactobcillaceae et Bacillaceae à l’entrée au feedlot et Micrococcaceae et Lachnospiraceae 60 jours plus tard. Concernant les pasteurelles responsables de BPI, aucune différence n’a été observée entre les deux groupes au jour de l’entrée en feedlot. Par contre, tous les veaux atteints à l’entrée possédaient au moins un taxon appartenant à M. haemolytica ou à P. multocida, ces taxons n’étaient plus détectables au jour 60. La détection des Mycoplasmes n’était pas abordée dans cette étude. Indépendamment des groupes, c’est le phylum Actinobacteria qui a subi une diminution forte de l’abondance relative au cours du temps. De même les familles Enterobacteriaceae, Oxalobacteraceae, et Pasteurellaceae ont vu leur abondance

baisser au cours du temps à l’inverse des familles Micrococcaceae et Pseudomonadaceae. Les auteurs considèrent ainsi que le microbiote subit des modifications entre l’allotissement et la période d’apparition des BPI, sans pouvoir établir de lien direct entre modification du microbiote et pathologie respiratoire. Une étude similaire a alors été menée, mais en utilisant cette fois le séquençage NGS de Illumina Miseq, dans le but de caractériser l’évolution du bactériote nasopharyngien chez 30 veaux entre les jours 0 et 40 après l’entrée dans le feedlot (295). Les animaux inclus étaient préalablement vaccinés contre les pathogènes suivants, BoHV-1, BVDV1-2, BPi3, BRSV, Clostridium chauvoei, C. haemolyticum, C. novyi Type B, C. perfringens Types B, C et D, C. septicum et C. tetani. De même les veaux atteints de BPI étaient traités aux antibiotiques (florfenicol). Les phylums les plus abondants dans tous les prélèvements étaient les Tenericutes (53.2% dont 99.8% Mycoplasma pp), Proteobacteria (34.7%), Firmicutes (4.2%), Bacteroidetes (3.7%), et Actinobacteria (3.4%). Des différences majeures ont été observées dans la composition des classes de bactérie par rapport à leurs précédents résultats, notamment pour les espèces Mycoplasma dispar et Mycoplasma bovirhinis qui étaient les plus abondantes. Entre l’entrée et 40 jours plus tard, 92 OTU ont subi un changement d’abondance relative (augmentation ou diminution) chez les veaux. Une augmentation a été observée pour les genres Acinetobacter, Aerococcus, Amycolatosis, Anaerofilum, et Bifidobacterium et une diminution pour Aneurinibacillus, Bavillus, Brevibacillus, Enterococcus, et Pasteurella. Le bactériote a ainsi subi un changement de composition mais sans corrélation avec les signes cliniques ; parmi les 30 veaux, seuls 3 veaux ont en effet développé des signes de BPI.

Le 2e groupe d’études porte sur la composition du bactériote respiratoire en fonction de la nature et du lieu de prélèvement. Seules quelques études récentes se sont intéressées au bactériote respiratoire profond (296–299). La première a exploré la composition et la structure des bactériotes respiratoires superficiels et profonds de 8 veaux charolais cliniquement sains, âgés de 6 à 8 mois (298). Les veaux n’avaient pas reçu de traitement antibiotique mais avaient été vaccinés contre le BoHV-1, le BVDV, le BPi3 et le BRSV. Dans un premier temps les biodiversités alpha (intra échantillon) et beta (inter échantillon) des

taxons bactériens ont été comparées entre les deux types de prélèvements. Aucune différence n’a été trouvée pour la diversité alpha, par contre une distinction significative de la diversité beta a été observée, suggérant une disparité écologique importante entre les deux niveaux de l’appareil respiratoire. Les auteurs se sont ensuite intéressés aux différents taxons composant le bactériote. Ils ont montré une prédominance dans les ENP des phylums Actinobacteria (43,9% versus 4,9% dans les LBA), Tenericutes (12,1% versus 8,8% dans les LBA). En revanche dans les LBA on trouvait préférentiellement les phylums Proteobacteria (33,3% versus 15,9% dans les EN), Bacteroidetes (18,2% versus 8,8% dans les EN), et Fusobacteria (3,4% versus 0,1% dans les EN). Une différence significative en terme d’abondance relative entre les EN et les LBA a été notée pour les phylums Proteobacteria et Actinobacteria. En affinant la taxonomie au genre, les genres bactériens Rathayibacter, Flavisolibacter, Micrococcus, Agrococcus, et Cellulomonas sont apparus significativement plus abondants dans les cavités nasales alors que Bibersteinia, Streptococcus et Bacteroides étaient plus abondants dans les poumons. Aucune différence significative n’a été mise en évidence pour les genres bactériens associés aux BPI tels que Mycoplasma, Mannheimia, et Pasteurella. A l’aide d’une analyse de régression linéaire multiple les auteurs ont ensuite montré une association spécifique entre certains taxons des deux cavités, Mycoplasma, Sneathia, Moraxella, Mannheimia, Succinivibrio, Ruminococcus et Flavisolibacter. De plus certains taxons du nasopharynx étaient prédictifs de la présence d’autres taxons dans les LBA. Ainsi la présence de Streptococcus dans les EN était fortement prédictive de la présence de Moraxella et Mycoplasma dans les LBA. De même, la présence de Bacteroides, Promicromonospora et Mycoplasma dans les EN étaient fortement associés à Mannheimia, Bibersteinia et Mycoplasma dans les LBA. La même équipe s’est ensuite intéressée dans une 2e étude à ce qui se passe chez les veaux malades (M. Zeineldin et al 2017). Soixante-six veaux ont été sélectionnés en début d’allotissement, dont 22 veaux ont présenté une BPI diagnostiquée. Dix veaux ont été inclus comme contrôles négatifs et prélevés au même moment, à l’entrée en feedlot et un mois après. Ainsi, 4 groupes de bovins ont été inclus : BPI-E (malades juste après entrée), BPI-D (diagnostiqués un mois après l’arrivée), sains-E (sains après l’entrée), et sains-D (sains contrôles

au même moment que les BPI-D). Au niveau des phylums, des différences significatives (test Wilcoxon/ Kruskal-Wallis) ont été observées entre les 4 groupes de veaux pour Proteobacteria, Actinobacteria, et Fusobacteria. Les phylums Proteobacteria étaient plus fréquemment identifiés chez les veaux malades et les phylums Actinobacteria et Fusobacteria chez les veaux sains. Au niveau genre, les différences statistiques ont été détectées pour Acinetobacter, Rathayibacter, Corynebacterium, Solibacillus, et Turicibacter. Par analyse à l’aide de l’algorithme LEfSe, les OTU spécifiques du groupe veaux sains étaient Rathayibacter, Cellulomonadaceae et Bacteroidales alors que ceux du groupe malade BPI-D étaient Arcanobacterium, Actinomycetaceae, Microbacterium, Lysinibacillus, Solibacillus, Bacillus, Comamonas, Burkholderiales, Neisseriales, Acinetobacter, Moraxellaceae, Pseudomonadales, Stenotrophomonadaceae, Xanthomonadaceae et Xanthomonadales. In fine, aucune différence significative en terme de biodiversité (richesse en espèces) n’a été trouvée entre les groupes.

En 2017 Johnston et al. a étudié le bactériote des poumons et des nœuds lymphatiques respiratoires prélevés sur des échantillons provenant d’animaux atteints de BPI. Au total 38 échantillons de lobe crâniaux pulmonaires et 32 nœuds lymphatiques médiastinaux provenant de 32 veaux de boucherie et 6 veaux laitiers atteins de BPI ont été testés. Vingt prélèvements de poumons et 20 prélèvements de nœuds lymphatiques provenant de veaux sains ont servi de contrôles négatifs. Si la biodiversité des taxons bactériens n’a pas été abordée, les auteurs se sont focalisés sur plusieurs variables telles que le type de tissu (lobe crânial du poumon ou nœud lymphatique médiastinal), le type de production (bœuf de boucherie ou veau laitier), l’état de santé du veau (présence de signes respiratoires et lésions pulmonaires, absence de signes respiratoires mais présence de lésions pulmonaires, absence de signes respiratoires et présence de lésions pulmonaires). Des tests statistiques ont été utilisés pour révéler les différences qui existent en termes de détection et d’abondances taxonomiques, dans les différents types de prélèvements entre les deux types de productions en question. Le tableau 2 résume les principaux résultats d’abondances taxonomiques :

Tableau 2 : Abondances relatives des familles bactériennes trouvées dans les poumons et les nœuds lymphatiques (NL) de veaux cliniquement sains ou atteints de BPI, ayant ou pas des lésions pulmonaires, dans les productions laitières ou de boucherie, d'après (299).

Les taxons suivants : Leptotrichiaceae, Fusobacterium, Pasteurella, Trueperella, Helcococcus, et Ureaplasma étaient abondants dans les poumons et nœuds lymphatiques des veaux de boucherie et laitiers atteints de BPI. Par contre, les taxons : Leptotrichiaceae, Fusobacterium, Mycoplasma, Trueperella et Bacteroidetes étaient plus abondants dans les poumons des veaux laitiers atteints de BPI comparés aux poumons des veaux sains et sans lésions.

Dans leurs études de comparaison des bactériotes superficiels et profonds des veaux atteints de la BPI, Nicola et al. (296) et Timsit et al. (297) ont, eux, utilisé la méthode de l’aspiration trans-trachéale (ATT) comme méthode d’échantillonnage du tractus respiratoire profond. Bien que l’ATT soit une technique aseptique et peu invasive, elle permet de récupérer le lavage drainant la trachée et les grosses bronches mais pas le tissu pulmonaire profond (bronchioles et alvéoles). Ainsi Timsit et al. (2018) ont récemment analysé la composition et la diversité du bactériote respiratoire nasopharyngien et trachéal chez 60 veaux atteints de la BPI et 60 veaux cliniquement sains des mêmes feedlots. Ils ont montré que la richesse microbienne chez les veaux atteint de BPI était inférieure à celle de leurs camarades cliniquement sains que ce soit dans les EN ou dans les ATT. Parmi tous les phylums détectés, les plus abondants étaient les Tenericutes (47,4%), Proteobacteria (26,0%) et Firmicutes (20.7%). Les genres bactériens les plus abondants étaient Mycoplasma (46,8%), Lactococcus (18,02%), et Histophilus (10,1%). Plus précisément, les taxons ont été regroupés dans des metacommunautés (élément où la contribution était la plus élevée selon la méthode de Dirichlet). La métacommunauté 1, comprenant les pathogènes classiques des BPI comme M. bovis, M. haemolytica et P. multocida, était fortement représentée chez les veaux atteints de BPI. La métacommunauté 2, constituée de H. somni, Moraxella et des variants de L. lactis, était également présente chez des veaux sains et atteints de BPI, majoritairement dans un feedlot testé. La métacommunauté 3, constituée de M. dispar, L. lactis et L. casei, était majoritairement présente dans les trachées des veaux sains et la métacommunauté 4 (Corynebacterium, Jeotgalicoccus, Psychrobacter et

Planomicrobium) uniquement présente dans le nasopharynx des veaux indépendamment de l’état de santé.

La comparaison veaux atteints de BPI et veaux sains a aussi été investigué par Gaeta et al. (300) en utilisant cette fois une approche de métagénomique (WGS) ciblée sur l’ensemble des gènes. Six jeunes génisses atteintes de BPI ont été prélevées par ENP en deux jours différents (14 et 28 jours d’âge) après l’apparition des signes cliniques. Dix veaux sains choisis aléatoirement ont aussi été prélevés les mêmes jours pour finalement aboutir à 4 groupes finaux : BPI-J14, BPI-J28, sains-J14 et sains-J28. Les phylums Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria, Bacteroidetes, et Tenericutes ont regroupé 80-96% des séquences dans tous les groupes. Seul le phylum Bacteroidetes était différent entre les 4 groupes en termes d’abondance. Concernant les pathogènes respiratoires connus, il n’a pas été observé de différences significatives statistiques entre les groupes pour Mannheimia, Pasteurella et Mycoplasma. Curieusement, Mannheimia haemolytica a été détecté chez 78% des veaux de l’étude et a été l’espèce la plus abondante au jour 28 dans les groupes BPI et sains. En considérant les biotypes, l’abondance relative de M. haemolytica A1 était significativement augmentée chez les veaux des groupes BPI-J14 et 28 par rapport aux veaux sains du J14. Une augmentation des autres biotypes de M. haemolytica a été observée mais sans différence significative. Quant à Mycoplasma bovis, cette espèce était présente chez 16.7% des veaux des deux groupes BPI, chez 40% des veaux sains le jour 28 et était absente chez les veaux sains au J14. Cela infirme le portage sain de M. bovis à l’opposé des autres bactéries comme les pasteurelles. Enfin l’utilisation de la métagénomique, par rapport au séquençage 16S, a permis aux auteurs d’explorer la fonctionnalité des gènes. Ils ont notamment remarqué une abondance des gènes de résistance aux cobalt-zinc-cadmium chez un groupe de veaux, une observation très intéressante dans l’étude de l’évolution des métagénomes respiratoires après l’allotissement et le dynamisme de l’apparition des gènes de résistances aux antibiotiques dans ce type d’élevage.

En bilan, ces études ont permis de faire ressortir un consensus pour le bactériote considéré « normal » (animaux sains) si on étudie les phylums

bactériens. Dans les cavités nasopharyngiennes des veaux non malades, les taxons les plus abondants sont les Firmicutes, Proteobacteria, Tenericutes, Actinobacteria, et Bacteroidetes. Dans le tractus profond pulmonaire il s’agit alors de Bacteroidetes, Proteobacteria, Fusobacteria, et des Firmicutes. Par contre établir un consensus aux niveaux taxonomiques plus en aval (familles, genres, ou espèces) apparait difficile vu les résultats divergents observés. La même observation peut être faite si on cherche un consensus de bactériote dysbiotique ou « malade » prédominant lors de BPI. Enfin parmi toutes les études existantes, aucune n’a pris en considération les effets des co-infections virales sur la structure microbienne. Johnston et al. (2017) a été le seul à montrer des résultats d’examens virologiques et bactériens mais sans aucune relation d’association avec la structure des microbiotes. Par ailleurs, la majorité des veaux de ces études ont été vaccinés contre les pathogènes respiratoires et traités aux antibiotiques avant le prélèvement. Même si cela reflète la réalité du terrain, ces éléments doivent être pris en compte comme potentiellement interférant avec les structures des microbiotes et leurs dynamismes durant la maladie.

OBJECTIFS

Depuis 40 ans, les concepts ont progressivement évolué quant aux causes et aux mécanismes physiopathologiques des BPI. Si autrefois on ne considérait que l’agent pathogène, très vite sont apparues des notions de sensibilité de l’hôte et de facteurs de risque qui modulent la sévérité des affections respiratoires. Les BPI ont ainsi été définies comme des « affections inflammatoires de l’appareil respiratoire profond, d’allure contagieuse et d’étiologie plurifactorielle incluant des agents infectieux relayés par des facteurs liés à la conduite d’élevage et à l’environnement ». Les notions d’agent infectieux elles-mêmes ont aussi progressé, notamment avec l’avènement des techniques de biologie moléculaire puis les techniques dites à haut débit ou « omiques ». Nous sommes ainsi passés des monoinfections à agents pathogènes majeurs (BRSV ou M. haemolytica) aux co-infections virus-bactéries (virus dits initiateurs et bactéries de surinfection) puis plus récemment à la notion d’ensembles d’agents infectieux plus ou moins pathogènes agissant sur un terrain plus ou moins prédisposé. La notion de terrain a elle-même évolué avec l’identification d’un microbiote respiratoire de l’appareil superficiel mais aussi profond.

Ces notions soulèvent plusieurs questions scientifiques. Si les techniques modernes permettent de détecter un grand nombre de virus présents dans l’appareil respiratoire, quels sont-ils et quel est leur rôle réel dans la genèse et l’impact des BPI ? Par ailleurs l’identification du microbiote respiratoire pose aussi la question de son impact possible sur les BPI, ou vice-versa.

Il est probable que le nombre de virus respiratoires impliqués dans les BPI augmente à l’avenir, comme cela a été le cas avec l’apparition des metapneumovirus et bocavirus en Santé Humaine. L’équipe IHVV a ainsi récemment identifié (208) un nouveau virus influenza D en France, potentiellement impliqué dans les BPI.

Dans ce travail nous sommes partis de prélèvements de l’appareil respiratoire superficiel et profond réalisés en système naisseur chez des veaux récemment atteints de BPI non vaccinés et non traités aux antibiotiques. Nos objectifs étaient les suivants :

- D’une part caractériser le virome respiratoire et potentiellement identifier de nouvelles cibles virales ;

- D’autre part caractériser le microbiote respiratoire et décrire les interactions possibles avec les pathogènes connus.

Ces deux objectifs descriptifs vont permettre une mise à jour des agents pathogènes respiratoires circulants dans les élevages bovins en France, le dernier état des lieux datant des années 1990. Ils vont également permettre d’affiner nos connaissances sur les co-infections et d’émettre des hypothèses sur les combinaisons d’agents pathogènes plus ou moins fréquentes, qui suggèreront des synergies ou des antagonismes.

Enfin dans la mesure où nous avions déjà identifié un nouveau virus respiratoire, nous avons souhaité mieux comprendre sa prévalence et son pouvoir pathogène chez les bovins : étudier IDV en tant que seul agent étiologique potentiellement pathogène dans le modèle veau.

DESCRIPTION DES TRAVAUX DE RECHERCHE

CHAPITRE I : IDENTIFICATION DES VIRUS RESPIRATOIRES BOVINS

I. Introduction et connaissances actuelles

Les données concernant le virome respiratoire bovin sont récentes. Une première étude a permis d’identifier en 2013 un nouveau virus à partir de prélèvements respiratoires post-mortem lors d’une épizootie sévère de BPI apparue dans un feedlot du sud-Ouest des Etats-Unis (178). La technique NGS a été utilisée en raison d’une absence de détection d’agents pathogènes via les techniques classiques d’isolement. Sur 6 prélèvements (poumon, trachée et nœud lymphatique trachéo-bronchique) provenant de 4 bovins, 3 se sont avérés contenir des séquences d’un nouveau nidovirus bovin (BoNV) appartenant à un nouveau genre de Torovirinae, une sous-famille de Coronaviridae. Une étude sérologique sur 127 sérums de bovins américains présentant des signes cliniques respiratoires a montré une prévalence de 9% pour le BoNV. L’imputabilité clinique de ce virus n’a cependant pas été démontrée. D’autres virus ont en effet été détectés par cette technique, tels que le BCoV (1 prélèvement sur 6) et un herpèsvirus bovin (2 prélèvements sur 6). Par ailleurs aucun prélèvement de veaux sains du même feedlot n’a été réalisé à titre comparatif.

Une deuxième étude a recherché de manière exhaustive (métagénomique) des séquences virales à partir d’écouvillonnages nasaux profonds réalisés chez des veaux laitiers américains âgés d’un à deux mois et présentant des signes cliniques respiratoires (76). Cinquante veaux malades ont ainsi été prélevés. Par ailleurs, pour chaque veau malade, un veau physiquement proche mais ne présentant pas de signes cliniques a aussi été prélevé. L’analyse métagénomique a été réalisée sur les veaux malades par mélange de 5 veaux, soit 10 mélanges au total. L’analyse a permis d’obtenir 23,7 millions de séquences dont 11,5 millions ont été exploités, après élimination des séquences du génome bovin, des séquences de bactéries, des séquences doublons et des séquences illisibles. Dans 32% des échantillons il n’a pas été possible d’identifier de

séquences virales. Différentes raisons peuvent être avancées, qu’elles soient d’ordre méthodologique (élimination/dégradation des ARN lors de leurs traitements, absence de séquence homologue dans les banques, niveau de présence en dessous du seuil de détection, échantillonnage trop tardif,...) ou d’ordre biologique (présence de virus respiratoires mais uniquement dans l’appareil respiratoire profond, infections uniquement bactériennes). Dans les autres échantillons et par comparaison avec les banques génomiques (243 virus connus), les séquences obtenues présentaient, par ordre de fréquence décroissant, des homologies avec le rhinovirus bovin de type A (BRAV pour Bovine Rhinitis A Virus), l’adenovirus bovin de type 3 (BAD3 pour Bovine Adenovirus type 3), l’adénovirus-associé (BAAV pour Bovine Adeno-Associated Virus, dependoparvovirus B), le rhinovirus bovin de type B (BRBV pour Bovine Rhinitis B virus), l’astrovirus-BSRI1 (BAV-BSRI1 pour Bovine Astrovirus- BSRI1), le virus influenza D bovin (IDV pour Influenza D Virus), les picobirnaviruses, le parvovirus bovin de type 2 et l’herpès virus bovin de type 6. Par ailleurs un nombre élevé de co-infections était observé avec au moins 2 virus dans 38% des échantillons provenant de veaux maladies contre 8% pour les veaux contrôles. Toutefois il est impossible de savoir dans cette étude si les co-infections avaient un rôle majeur dans l’apparition des signes cliniques respiratoires. Pour associer la détection de ces virus avec un quelconque pouvoir pathogène (présence de signes cliniques respiratoires), des tests PCR, spécifiques des principaux virus identifiés, ont été élaborés et utilisés parallèlement sur les 50 veaux malades et les 50 veaux apparemment sains (76). Une association statistique entre maladie et présence du virus a pu être observée pour le BAD3, le BRAV et l’IDV. Le BAD3 est un adénovirus très prévalent dans les feedlots américains (50% de séroconversion) dans lesquels il a été associé à un syndrome fébrile sans perte de poids (74). Son inoculation par voie intratrachéale à des veaux de 4 mois et privés de colostrum a en effet provoqué un syndrome fébrile (301). Le BRAV est quant à lui, le plus souvent considéré comme non pathogène ou de pathogénicité mineure, bien qu’il n’existe aucune donnée expérimentale permettant de le confirmer ou de l’infirmer. Pour l’IDV ces résultats confirment la prévalence non négligeable (14%) de ce virus uniquement chez les veaux malades. Dans 85% des situations l’IDV était détecté en présence du BAD3 et du BPV2 (180).

L’approche métagénomique en NGS a aussi permis d’obtenir des génomes complets de virus. En 2015 un écouvillonnage nasal a été testé par NGS (179). Les séquences issues de cet échantillon (4 millions dont 3,6 millions appartenant à l’hôte) ont révélé la présence des séquences appartenant à BCoV, BAD4, BRAV2 (rhinite bovine A de type 2) et BRBV (rhinite bovine B). Un génome quasi-complet a été directement obtenu pour le BCoV, assemblé à partir de 15500 lectures. Les auteurs se sont ensuite intéressés au BRV (BRAV et BRBV), ils ont élaboré une RT-PCR qui cible les BRVA 1, BRVA 2 et BRBV. Sur 204 écouvillons nasaux de veaux souffrant de BPI, 13 échantillons se sont révélés positifs pour les BRV. Neuf de ces écouvillons étaient aussi infectés avec au moins un autre virus respiratoire connu (BRSV, BPi3, BCoV…) et 4 étaient aussi positifs pour le virus de la rhinite bovine. Par analyse NGS sur 6 échantillons BRV positifs, quatre étaient co-infectés par deux BRV différents (BRAV1, BRAV2, et BRBV), un était infecté uniquement par le BRV1 et le dernier contenait des séquences des 3 BRV. La présence de virus pathogènes dans la grande majorité des échantillons BRV positifs questionne sur le pouvoir pathogène de ces derniers. Le rôle des différents virus de la rhinite bovine reste en effet discuté, avec généralement des résultats qui suggèrent une pathogénicité respiratoire très faible (302,303). En contrepartie, la méthode métagénomique utilisée s’est avérée très puissante pour générer des génomes complets ou quasi-complets des deux espèces de BRAV et BRBV. Notons aussi que cette méthode a permis de détecter les génomes de BCoV et du BRSV non détectés par la PCR.

En 2016 Mitra et al. (180) ont analysé le virome respiratoire superficiel dans 93 écouvillons nasaux provenant de 93 jeunes bovins dont la moitié environ étaient atteints de BPI. Ces animaux étaient regroupés dans des feedlots dans le Kansas aux USA et au Mexique. Dans chaque feedlot atteint de BPI, cinq animaux malades et cinq autres cliniquement sains étaient prélevés. Les différentes réactions de séquençage ont engendré 40,5 millions de séquences (reads) pour la totalité des animaux malades et 36,9 millions pour les animaux cliniquement sains. Après un travail d’assemblage et de comparaison des séquences, un total de 21 virus a été obtenu. Pour chaque virus détecté, une caractérisation génomique et phylogénétique a été faite ainsi qu’une analyse statistique qui visait à établir une

corrélation entre l’état clinique et la présence du génome viral. Les virus identifiés étaient des virus respiratoires pathogènes classiques (BRSV, BCoV, BoHV-1, BPI3, BVDV1 et BVDV2, BAD3) ainsi que des virus moins étudiés tels que l’adénovirus-associé (BAAV), les virus BRAV, BRBV, IDV, le parvovirus bovin de type 3 (BPV3) et les entérovirus E et F bovin (EEV et EFV). Les auteurs pensent avoir identifié un nouveau virus qu’ils ont nommé bocaparvovirus des ongulés de type 6 (UBPV6). Le nidovirus bovin récemment caractérisé aux USA par une équipe qui collaboratrice avec Mitra et al. a aussi été détecté.

Les auteurs (76,180) se sont ensuite intéressés aux associations statistiques entre détection d’un virus et présence ou non de signes cliniques respiratoires. L’association la plus importante a été obtenue pour IDV avec un odd-ratio (OR) de 2,94 mais un intervalle de confiance très large (95% CI = 0,71- 12,13) et une probabilité non significative (p= 0,134).

Dans ce travail, nous avons cherché à identifier le virome respiratoire présent dans les élevages français de veaux atteints de BPI.

II. Détection des virus respiratoires par approche NGS chez des veaux affectés par la bronchopneumonie infectieuse

1. Matériel et Méthodes

a. Schéma expérimental et prélèvements

Les prélèvements respiratoires ont été obtenus dans des fermes d’élevages naisseurs du sud-Ouest de la France. Les animaux à prélever étaient des veaux âgés de 2 semaines à 4 mois et présentant des signes cliniques de bronchopneumonie. Une vingtaine de cabinets vétérinaires de 7 départements ont été contactés au cours de l’automne 2013 pour nous prévenir en cas d’apparition de BPI dans leurs élevages, les départements concernés étaient la Haute-

Garonne, le Gers, l’Ariège, les Hautes-Pyrénées, le Tarn, le Tarn-et-Garonne et l’Aveyron. Les critères d’inclusion pour les cas sélectionnés étaient les suivants :

Veaux âgés de 0 à 4 mois, présentant des signes cliniques d’atteinte de l’appareil respiratoire profond (broncho-pneumonie sur un lot ou plusieurs animaux) : hyperthermie > 39.5° – 40°C avec de la toux, une tachypnée et une dyspnée (modification des mouvements respiratoires, bruits respiratoires renforcés et si possible surajoutés (type râle) à l’auscultation).

Évolution aiguë (depuis 3 à 4 jours maximum) avec un nombre minimal de 3 veaux atteints.

Les critères d’exclusion étaient les suivants :

Ancienneté des signes cliniques (les troubles respiratoires étaient présents depuis plus de 5 jours). De même, au sein d’un élevage, n’étaient prélevés que les animaux malades depuis moins de 3-4 jours ou en phase d’hyperthermie, les autres étant exclus.

Présence de traitements antibiotiques préalables et/ou vaccination préalable contre les virus respiratoires.

En bilan 93 veaux atteints de BPI de 23 élevages ont été prélevés, soit entre 3 et 5 veaux par élevage. Deux types de prélèvements ont été réalisés pour chaque veau : un écouvillonnage nasal profond (ENP, appareil respiratoire superficiel) et un lavage bronchoalvéolaire (LBA, appareil respiratoire profond).

L’ENP a été effectué au moyen d’un écouvillon stérile de 20 cm avec embout en coton et manche en plastique pour éviter qu’il se casse en cas de mouvements de l’animal. Pour des veaux âgés de moins de 4 mois, la contention physique de l’animal suffisait à la réalisation des ENP. L’écouvillon était introduit dans la narine de l’animal le plus loin possible vers le méat dorsal puis vigoureusement frotté contre la muqueuse nasale jusqu’à la rosée sanguine par un mouvement de va-et-vient pendant une dizaine de secondes. Il était ensuite élué dans un mL de soluté salé physiologique puis conservé au froid positif durant le transport avant d’être congelé à -80°C, dans l’attente d’être analysé.

Les LBA ont été réalisés sous anesthésie générale par endoscopie (gastroscope pour petits veaux et colonoscope pour veaux de taille moyenne et jeunes bovins). Brièvement les veaux en hyperthermie et ne présentant pas de troubles respiratoires trop sévères étaient anesthésiés au moyen d’un mélange ketamine-diazepam (4 ml d’Imalgène 1000 (100 mg/ml) et 2 ml de Valium Roche (5 mg/mL)). Cette technique permet une anesthésie rapide, elle protège le veau, les opérateurs et le matériel. Par ailleurs, ce protocole permet une anesthésie de courte durée, ce qui est préférable pour des veaux présentant des troubles respiratoires, mais aussi une bonne myorelaxation (diazépam) qui facilite la mise en place de l’endoscope (passage du larynx et progression jusqu’aux bronches). L’endoscope est introduit par voie buccale en étant préalablement protégé par la mise en place d’un tube de plastique rigide dans la bouche de l’animal pour avoir un accès direct au larynx sans risque de contamination par la flore buccale. Une fois l’endoscope bloqué dans une bronche intermédiaire du lobe crânial droit, 100 mL de liquide physiologique stérile étaient injectés puis ré-aspirés, à l’aide d’une seringue d’au moins 50 ml. La quantité de liquide récupérée variait entre 35 et 70 mL. Le prélèvement était ensuite placé dans un tube stérile puis conservé au froid positif durant le transport avant d’être traité au laboratoire. Entre chaque prélèvement, l’endoscope était nettoyé à l’aide d’une solution physiologique. Entre chaque élevage, une désinfection complète à base d’ammoniums quaternaires (Amnios) était réalisée, selon les normes et le protocole du fabricant.

b. Traitement des échantillons

Pour les EN, 250 µL de solution d’ENP a été mélangée à 750 µL de Trizol LS (réactif permettant d’isoler l’ARN). Le reste de la solution a été aliquoté dans deux tubes eppendorf. Le tout a été conservé à -80°C. Les échantillons issus de LBA, une fois arrivés au laboratoire, ont tout d’abord été filtrés sur gaze, pour éliminer les gros débris fibrino-cellulaires. Le liquide de LBA a ensuite été divisé en deux parties. Une première partie du liquide, de 20 à 25 mL, a été centrifugé pendant 20 minutes à 1200-1500 tours/minute. Cette centrifugation permet d’obtenir deux phases : le surnageant et le culot cellulaire. Le surnageant a été récolté et aliquoté dans deux tubes eppendorf de 2 mL et dans des tubes de 5 mL.

Quant au culot cellulaire, il a été repris dans 1.5 mL d’une solution tampon PBS (Phosphate Buffered Saline) puis stocké dans deux tubes eppendorf à -80°C. L’autre partie du liquide filtré a été traitée directement sans être centrifugée. Deux tubes contenant 250 µL de ce liquide et 750 µL de Trizol LS ont été conservés à - 80°C ainsi que deux tubes contenant 140 µL de ce liquide associé à 140 µL de tampon de lyse du kit d’extraction d’ARN (RNeasy, Qiagen®). Le reste a été directement conservé à -80°C.

c. Détection des pathogènes respiratoires majeurs par RT- qPCR

Les prélèvements d’un même élevage ont été mélangés avant l’analyse. Pour chaque mélange, une recherche des virus BRSV, BCoV, BPI3 et des bactéries M. haemolytica, P. multocida, H. somni et M. bovis a été réalisée en utilisant un kit commercial RT-qPCR One step, basé sur la méthodologie Taqman (LSI Vetmax screening Pack- Ruminant Respiratory Pathogens – Life technologies).

d. Caractérisation du virome respiratoire superficiel et profond des veaux par séquençage métagénomique avec la méthode Illumina

Pour le séquençage à haut débit, 300µL de chaque prélèvement d’ENP et 3 mL de LBA ont été filtré à travers un filtre de 0,45µm à l’aide d’une seringue stérile. Ensuite le filtrat contenant les particules virales a été concentrées par ultracentrifugation (100000 g, 2h, 4°C). Les culots obtenus après l’ultracentrifugation des ENP et LBA ont subi un traitement nucléase (Exonuclease I (20U, Thermo Fischer, USA), Benzonase (25U, Merck chemical, Germany), Turbo DNAse (2U, Thermo Fisher Scientific, USA), RNase I (10U, Thermo Fischer, USA)). Le traitement des échantillons aux nucléases sert à éliminer les acides nucléiques libres donc non encapsidés, une étape qui va favoriser l’enrichissement en acides nucléiques viraux.

Après une incubation d’une heure à 37°C, les acides nucléiques ont été extraits à l’aide du kit Qiamp minElute virus spin kit de Qiagen et amplifiés par transcriptase inverse et PCR aléatoire. Brièvement, des amorces aléatoires (octomères) portant une étiquette ont été utilisées pour la rétrotranscription et la PCR. Les étiquettes utilisées étaient les suivantes : Tag-D CGTAGATAAGCGGTCGGCTC et Tag-E CATCACATAGGCGTCCGCTG. Les étiquettes servent à l’identification de chaque échantillon après l’étape de séquençage. Une étape de Klenow est nécessaire pour la création d’un ADN double brin à partir d’une molécule d’ADN simple brin. Les librairies ont été créées en suivant les indications du kit Illumina TrueSeq pour le séquençage sur la plateforme Illumina. Cette méthodologie d’amplification aléatoire est connue sous le nom de SISPA (sequence-independant, single-primer amplification) (Figure 8).

Figure 8 : Représentation du processus de préparation des échantillons pour le séquençage NGS métagénomique du virome respiratoire.

e. Séquençage et analyse bio-informatique

Deux séries de séquençage ont été réalisées : le séquenceur Illumina Miseq pour un premier run puis le séquenceur Illumina Hiseq pour une deuxième série (3 runs). Le changement méthodologique a été opéré car le nombre de séquences virales obtenues lors du premier run (Miseq) était faible (4,5 millions de séquences/run, équivalent à 260 000 séquences par échantillon). Les mêmes séries ont donc été analysées par la technique Illumina Hiseq. La différence majeure entre les deux séquenceurs Illumina se résume par le débit de données générées (15 Gb (millions de paires de bases) pour le Miseq contre 650 Gb pour le Hiseq). Parmi les résultats générés par le run Miseq, des génomes complets et partiels de BCoV ont été obtenus, ces données ont été exploitées dans le but de caractériser ces virus. Les informations concernant la caractérisation de BCoV seront détaillées dans la section « Caractérisation génétique des coronavirus bovins – Evolution et épidémiologie moléculaire » de ce manuscrit et dans l’article soumis « Global transmission, spatial segregation and recombination determine the long-term evolution and epidemiology of Bovine Coronaviruses ».

Le circuit bio-informatique utilisé a été le VIP (304). Ce circuit nouvellement créé pour l’identification et la découverte des virus a été installé sur la plateforme bio-informatique Galaxy du centre INRA Occitanie. Le pipeline VIP se caractérise par les étapes suivantes : 1. Contrôle qualité des séquences ; 2. Suppression des séquences hôtes éventuelles (appartenant à Bos Taurus) ; 3. Assemblage des lectures en contigs ; 4. Alignement nucléotidique contre des bases de données virales spécifiques (ViPR/IRD), ou contre les bases de données virales du NCBI ; 5. Assemblage de novo : reconstruction du génome des virus détectés.

2. Résultats

a. Caractérisation du virome respiratoire bovin

Dans un premier temps les agents pathogènes bovins connus ont été identifiés par RT-qPCR dans les prélèvements et ils sont décrits dans le tableau 3.

En bilan 23 exploitations ont été testées sur trois séries de séquençage. Les mélanges d’ENP et de LBA provenant des mêmes animaux ont été séquencés par une approche métagénomique à l’aide de la technologie Illumina Hiseq. Les 3 run de Hiseq ont permis de générer respectivement 140, 93 et 219 millions de séquences totales.

Des séquences correspondant potentiellement à de nombreuses familles virales ont été identifiées. Les résultats générés par le logiciel VIP appartenant à chaque échantillon sont présentés sous forme d’un tableau de synthèse (tableau 4), les données complètes présentées en Annexe détaillent, pour chaque famille de virus détecté, l’espèce virale la plus proche à la séquence assemblée, le genre viral, le pourcentage de couverture de l’ensemble des séquences assemblées par rapport à la séquence de référence, le nombre de reads (séquences issues du séquenceur et de l’analyse bio-informatique), la moyenne de profondeur (nombre moyen de hits (détections) par base du génome de référence).

Tableau 3 : Résultats de détection des 7 agents pathogènes respiratoires dans les prélèvements respiratoires avec le LSI vetmax screening kit. BRSV : virus respiratoire syncytial bovin, BPI-3 : virus parainfluenza-3 bovin, BCOV : coronavirus bovin, p. m ; Pasteurella multocida, m. h ; Mannheimia haemolytica, m.b ; Mycoplasma bovis, h. s ; Histophilus somni, LBA : lavage bronchoalvéolaire, EN ; écouvillon nasal, et p : présent.

Dans ce travail nous avons fixé un seuil de 10 reads pour considérer que le résultat (le virus identifié) est crédible (ou acceptable). Par ailleurs, même si les séquences d’origine bovine étaient éliminées par le pipe-line VIP, un travail supplémentaire a consisté à re-analyser les séquences attribuées aux virus ADN et aux rétrovirus, pour éliminer les reads affiliés correspondant à des gènes cellulaires (similarité de séquences avec certains gènes de virus à ADN, gènes de rétrovirus intégrés). En bilan, les principaux virus détectés par ordre décroissant de fréquence sont le BCoV, le BRSV, le BPI3, L’astrovirus bovin (BAV), les virus de la rhinite bovine BRAV et BRBV, le parvovirus bovin de type 2 (BPV2) et l’entérovirus bovin (EVB) (Tableau 4).

Tableau 4 : Détection des principaux virus par NGS ; nombre d’élevages positifs et nombre de prélèvements positifs dans l’appareil respiratoire superficiel (ENP) et profond (LBA).

Pour 4 prélèvements (un ENP et 3 LBA) venant de 4 élevages, il n’a été possible de détecter qu’un seul virus, le BCoV pour 3 échantillons (1 ENP, 2 LBA) et le BRSV pour le 4e LBA. A chaque prélèvement d’ENP ou LBA avec un seul virus identifié, son équivalent contrôle en LBA ou ENP contenait plusieurs familles virales. Ainsi il n’a pas été possible d’identifier deux prélèvements d’un même élevage ne contenant qu’un seul virus BCoV ou BRSV.

Des génomes complets et partiels ont été reconstruits pour les 8 virus détectés en alignant les métagénomes contre des génomes de référence.

Parmi les séquences générées, une grande proportion est apparentée à des virus des plantes, d’insectes et à des bactériophages. Ces séquences de bactériophages pourraient avoir un intérêt dans l’étude du bactériote respiratoire et les interactions au sein du microbiote et pourront faire l’objet d’une analyse spécifique ultérieurement.

Pour les virus pathogènes connus un tableau de correspondance a été établi entre la détection par RT-qPCR et le séquençage NGS (tableau 5).

Tableau 5 : Correspondance entre la détection par RT-qPCR et le séquençage NGS des virus BRSV, BPI-3, et BCOV. N : détection uniquement

par séquençage NGS, P : détection uniquement par RT-qPCR, et NP : détection par les deux méthodes.

b. Discussion

Dans cette étude nous avons fait le choix de travailler sur la présence des virus par mélange de veaux considérant l’élevage comme une unité ici, qui reflète la pression infectieuse locale et les différentes conditions individuelles possibles. Théoriquement, un nombre plus important de veaux par élevage aurait pu être échantillonné, toutefois cela aurait été difficile pour des raisons pratiques compte tenu de la faible taille des élevages concernés. Par ailleurs un effet dilution aurait pu être obtenu, occultant les virus pour lesquels le nombre de séquences était faible. En cas d’identification de virus d’intérêt, des PCR

spécifiques seront élaborées pour investiguer sa présence au niveau de l’élevage et au niveau individuel sur des veaux malades et sains. Contrairement aux études déjà réalisées dans des conditions épidémiologiques d’élevage différentes, nous n’avons pas prélevé de veaux apparemment sains dans les élevages sélectionnés. La présence de lots avec un faible nombre d’animaux et en contact étroit nous a laissé supposer que la plupart des animaux étaient potentiellement infectés, en incubation ou avec des signes cliniques minimes. Nous avons toutefois prélevé des échantillons dans des élevages sans troubles respiratoires, de même structure et dans la même région, pour des analyses comparatives ultérieures.

Des principaux virus identifiés par NGS, on retrouve les trois pathogènes connus que sont le BRSV, le BCoV et le BPI3. Le BoHV-1 n’a pas été identifié car les prélèvements provenaient tous d’élevages indemnes d’IBR. Les deux méthodes de détection (NGS et qPCR) étaient en accord faible (pour la détection de BCoV dans les LBA, κ=0.24, test de Cohen avec 95% d’intervalle de confiance) ou très faible (0.05<κ<0.19) pour toutes les autres comparaisons (Tableau 5). Des différences dans la préparation des acides nucléiques viraux et dans la sensibilité des deux techniques expliquent sans doute ces différences. En règle générale nos résultats ont montré que le NGS est plus sensible que la qPCR (lors de détections par une seule des deux méthodes, beaucoup plus de détections d’acides nucléiques viraux ont été observées par NGS que par qPCR ; la qPCR n’ayant permis la détection que de BCoV et de BRSV dans 2 échantillons, Tableau 5).

Le BRSV est agent pneumo-pathogène majeur, les virus BCoV et BPI3 sont plutôt considérés comme des virus initiateurs favorisant les infections secondaires bactériennes. Une autre possibilité est la présence de plusieurs virus respiratoires interagissant pour déclencher la maladie. Comme précisé dans la partie bibliographique, il existe peu de données sur les co-infections virales dans la mesure où la pathogenèse de chacun de ces virus a essentiellement été étudiée lors de mono-infections expérimentales. Dans le cas des études épidémiologiques, des outils de détection spécifiques aux agents pneumo- pathogènes bien connus sont utilisés individuellement, donc avec des informations sur les co-infections très limités.

Notre étude de séquençage par une approche exhaustive confirme l’importance des co-infections virales lors de BPI des jeunes veaux à l’unité de l’élevage. L’ensemble des ENP et des LBA étaient co-infectés avec en moyenne 3,3 et 3 virus respectivement. Toutefois nos prélèvements représentent un mélange de 3 à 5 veaux et ces observations doivent être validées au niveau individuel avant de pouvoir affirmer l’existence de co-infections chez un animal. L’analyse de mélanges d’échantillons plutôt que de prélèvements individuels a été utilisée lors des études précédentes de Ng et al et Mitra et al (pour les échantillons du Mexique), ce qui facilite les comparaisons. Cette méthode d’analyse par mélange de prélèvements issus d’animaux qui partagent physiquement le même environnement bien que loin d’être idéale, reste inévitable tant que les coûts du séquençage NGS sont élevés.

Concernant les co-infections virales, des combinaisons préférentielles entre les huit virus principaux détectés (BCoV, BRSV, BPI3, BAV, BRAV, BRBV, BPV2, et EVB) ne peuvent pas être parfaitement établies d’un point de vue statistique. Ceci est dû au nombre limité d’échantillons inclus dans l’étude (limite inhérente au choix de l’outil NGS). Cependant, hormis le BCoV qui est ubiquiste dans tous les prélèvements, une forme d’accordance peut être notée entre BRSV et BPI3 dans l’appareil respiratoire superficiel et profond, ainsi qu’entre astrovirus bovin (BAV) et BRSV et BPI3 dans les poumons (tableau 5). En contrepartie, une discordance est claire entre le BRAV et le BRBV : les deux virus de tropisme majoritairement nasopharyngé, ne coexistent dans aucun cas, ce qui suggère une compétition. La très haute prévalence du BCoV, BRSV, et BPI3 parmi les échantillons nasopharyngiens et bronchoavéolaires complique la recherche de co- infections préférentielles distinctes. Le développement d’un modèle mathématique qui prend en compte le tableau d’abondance de virus exhaustif pourra être envisagé afin de déterminer de potentielles relations de synergies ou d’antagonismes.

Les résultats obtenus devront-ils nous inviter à reconsidérer la désignation de « virus majeur ou initiateurs de BPI » ? Vont-ils nous amener à étudier la pathogenèse de ces virus d’une manière collective et non plus individuelle vu les interactions très probables entre eux ?

Concernant les pathogènes connus, notre étude diffère de celle de Ng et al. (2015) réalisée aussi chez des veaux malades mais en systèmes laitiers aux USA. Les auteurs identifient de nombreuses familles virales mais ni BRSV, ni BCoV, ni BPI3, ni BoHV-1 n’ont été détectés. Compte tenu de l’exhaustivité de la méthode utilisée, Ng et al. ont considéré que la non–détection des 3 pathogènes reflète probablement leur absence dans les EN testés ou leur présence à des quantités inférieures au seuil de détection. D’un autre côté, le statut vaccinal des animaux n’était pas documenté. Cette étude souffre aussi d’une description imprécise des critères d’inclusion des veaux, notamment en ce qui concerne les signes cliniques respiratoires. Par ailleurs les séquences virales ont été obtenues à partir d’EN. Des échantillons issus de l’appareil respiratoire profond, type LBA ou ATT, auraient été probablement plus représentatifs des troubles respiratoires observés. Dans notre étude les fréquences de détection sont quasi identiques entre ENP et LBA pour ces 3 virus (Tableau 5).

In fine, la question de la participation de ces virus connus comme non- pneumo-pathogènes dans la maladie respiratoire reste posée : est-ce que leur innocuité évaluée individuellement reste valide lors d’une infection multiple ? Peuvent-ils interagir avec d’autres virus ou bactéries ? Et si oui, comment ?

Concernant les virus respiratoires moins étudiés nous avons retrouvé la présence des BRAV et BRBV, du BPV2 et de l’EVB, comme dans les études de Ng et al. (2015) et Mitra et al. (2016). Par contre nous n’avons pas détecté de nidovirus bovin ni de BAD3, ni d’IDV.

L’absence de séquences appartenant à l’adénovirus de type 3 (BAD3) parmi nos résultats est ambiguë même si sa présence a été confirmée sur le continent européen dans des études précédentes (20,23,48). Même si peu probable, une raison technique (faible abondance relative ou absence de correspondance dans les bases de données par exemples) qui expliquerait cette absence ne peut être écartée.

L’implication des BRAV et BRBV dans les BPI est encore mal connue. Notre étude a confirmé pour la première fois sa présence chez les veaux en systèmes naisseurs, avec une fréquence non négligeable. Il semble que les BRAV et BRBV puissent jouer un rôle de virus initiateurs, avec une fréquence de 93

détection bien plus importante dans les ENP que dans les LBA au moins pour BRAV. Il n’existe cependant pour l’instant aucune donnée expérimentale permettant de le confirmer ou de l’infirmer. Un génome partiel d’EVB a été détecté dans un seul ENP. Le génome le plus proche aux séquences assemblées est celui d’un entérovirus bovin de type E. Le tropisme des entérovirus est digestif avec une implication suspectée dans les diarrhées néonatales et sa présence avérée dans le système respiratoire des veaux (305). Son implication dans la maladie respiratoire chez les veaux n’est pas vérifiée. De même, le BPV2 a été détecté dans un seul ENP. Ce virus n’est pas connu comme étant pneumo- pathogène. La détection des BPV2 et EVB dans les ENP des veaux pourrait être accidentelle vu le contact direct des muqueuses nasales avec l’air ambiant. Une autre possibilité est leur implication dans la flore nasale de l’appareil respiratoire superficiel. Pour exemple Mitra et al. (2016) ont estimé avoir identifié un nouveau virus qu’ils ont nommé bocaparvovirus des ongulés de type 6 (UBPV6). Cette observation a été faite après l’identification d’une séquence de 5 224 paires de bases issue de l’assemblage de novo, cette séquence partageant 69% d’identité nucléique avec le bocaparvovirus bovin de type 1 (anciennement parvovirus bovin de type 1). En utilisant ce nouveau génome comme référence, des séquences appartenant à UBPV6 ont été détectées dans six veaux symptomatiques et six autres cliniquement sains.

L’identification d’un astrovirus bovin dans nos prélèvements respiratoires semble fréquente, ce qui n’avait encore jamais été décrit. La réalité de sa présence est validée par le nombre d’échantillons positifs provenant de fermes différentes et par la profondeur ou le nombre de séquences (ou reads) obtenues dans chaque prélèvement. Plusieurs génomes complets et partiels appartenant à ce virus ont été ainsi obtenus à partir de 11 LBA et 2 ENP dans 13 élevages différents (entre 43 et 200 000 reads/échantillon). Une contamination par des particules fécales par voie aérosol ne peut être écartée ; toutefois la fréquence de détection dans plusieurs élevages et surtout sa présence principalement dans les LBA nous incite à penser que ce virus est bien présent dans l’arbre respiratoire des veaux. L’astrovirus bovin est connu pour son tropisme et son pouvoir pathogène digestif (306–309) et plus récemment nerveux (310). Dans les études

métagénomiques de Mitra et al et Ng et al, l’astrovirus a été détecté dans les écouvillons nasaux des veaux dans des élevages atteints de BPI (76,180). Plus récemment, des astrovirus ont été détectés dans des prélèvements respiratoires chez des patients humains et des porcs en phase aiguë d’atteinte respiratoire (311,312), mais aussi chez des camélidés cliniquement sains (313,314). Compte tenu des résultats obtenus, l’implication potentielle de l’astrovirus bovin dans les BPI mérite d’être investiguée, en commençant par une analyse comparative fine des séquences obtenues, la mise au point d’un test de détection PCR pour des études épidémiologiques, voire la réalisation d’infections expérimentales chez le veau.

En bilan, l’approche métagénomique peut être conçue comme une première étape d’identification de virus d’intérêt. La puissance de l’outil permet en effet une détection sans a priori de l’ensemble des virus présents chez l’animal, sous réserve que l’analyse bio-informatique des métadonnées soit réalisée avec un maximum de contrôles. Comme pour les PCR, les conditions de prélèvement (races, types de production, saisonnalité, localisation, ...) peuvent modifier les résultats. De même le coût des analyses ne permet actuellement que de tester un nombre limité d’animaux. Enfin, si un virus d’intérêt est identifié, il ne pourra être considéré comme d’importance réelle que lorsque son pouvoir pathogène aura été démontré par des études d’infection expérimentale ou par des études épidémiologiques.

La démonstration du pouvoir pathogène lors d’inoculation d’épreuve est alors plus difficile pour les virus qui agissent par co-infection avec d’autres virus ou comme agents initiateurs des infections bactériennes comme c’est le cas pour les BPI.

III. Caractérisation génétique des coronavirus bovins : évolution et épidémiologie moléculaire

Le coronavirus bovin est très répandu dans toutes les régions du monde affectant les élevages bovins et les ruminants sauvages (30,35,315–321). Fréquemment détecté, le BCoV est impliqué dans le développement de maladie respiratoire, dans les diarrhées chez les veaux et dans la dysenterie hivernale chez les bovins adultes, des maladies pouvant être à l’origine de perte économiques importantes (59,72,73,322,323). La famille des Coronaviridae regroupe les genres Alphacoronavirus, Betacoronavirus, Gammacoronavirus et Deltacoronavirus, virus sont connus pour infecter de nombreuses espèces aviaires et mammifères (324). BCoV appartient au genre Betacoronavirus, qui regroupe aussi les coronavirus humain OC43, HKU1, SRAS, et MERS ainsi que le coronavirus équin EqCoV (58), le coronavirus respiratoire canin CRCoV (66), le virus hémagglutinant de l'encéphalomyélite porcine HEV (325), le coronavirus murin (326), et les coronavirus de chauves-souris (BatCoV) HKU4, HKU5 et HKU9 (327–329). Le BCoV est parenté avec plusieurs de ces espèces virales (330). Les coronavirus constituent une menace constante pour la santé publique, en raison de leur faible fidélité de réplication et de leur forte variabilité génétique, ce qui les rend sujets à des changements constants conduisant souvent à des maladies émergentes (331). L'enquête intensive qui a suivi l'émergence du SRAS-CoV et du MERS-CoV a confirmé l'origine zoonotique de ces Betacoronavirus, leur bonne capacité d'adaptation et leur capacité à changer d'espèce hôte. Ainsi, sur la base de la similarité antigénique, on pense que l'OC43 humain et les coronavirus respiratoires canins ont émergé de BCoV (332,333).

Le but de cette étude était de caractériser les BCoV des voies respiratoires supérieures et inférieures d’animaux symptomatiques dans le sud- ouest de la France. Les virus étant détectés à l’aide de la RT-qPCR et leurs génomes partiels et complets obtenus par séquençage NGS, nous avons cherché à isoler les virus, et analysé les données génétiques obtenues en utilisant des modèles de phylogénie et d'évolution temporelle pour mieux comprendre l'évolution du BCoV. Alors que notre point de départ était les BCoV d’origine

française, notre étude vise à mieux comprendre l'évolution génétique du BCoV à l'échelle mondiale, en examinant à la fois les caractéristiques génétiques des virus et les temps de collecte afin de formuler des hypothèses sur l'origine BCoV et la propagation mondiale sur une échelle spatio-temporelle.

Article : « Global transmission, spatial segregation and recombination determine the long-term evolution and epidemiology of Bovine Coronaviruses »

Global transmission, spatial segregation and recombination determine the long-term evolution and epidemiology of Bovine Coronaviruses

E. Salem1, D. Vijaykrishna2,3, H. Cassard1, B. Hause4, S. Maman5, G. Meyer1, M.F. Ducatez1#

1 IHAP, Université de Toulouse, INRA, ENVT, Toulouse, France

2 Biomedicine Discovery Institute and Department of Microbiology, Monash University, Melbourne,

Victoria 3800, Australia

3 Program in Emerging Infectious Diseases, Duke-NUS Medical School, Singapore

4 Diagnostic Medicine/Pathobiology, College of Veterinary Medicine, Kansas State University,

Manhattan Kansas KS 66506-5802, USA

5 SIGENAE, GenPhySE, Université de Toulouse, INRA, INPT, ENVT, Castanet Tolosan, France.

# To whom correspondence should be addressed.

Mailing address: UMR Interactions Hôtes-Agents Pathogènes 1225, Service maladies contagieuses,

ENVT, 23 Chemin des Capelles, 31076 Toulouse cedex, France. Phone: (+33)561193249. E-mail: [email protected]

Running title: Genetic evolution of BCoV

Abstract

Bovine coronavirus (BCoV) is widespread in cattle and wild ruminant populations throughout the world. The virus causes neonatal calf diarrhea and winter dysentery in adult cattle as well as respiratory tract infection in young cattle. In the present study BCoV from both upper and lower respiratory tracts of symptomatic calves in the Southwest of France were characterized. Through virus isolation, deep sequencing, and genome analysis we estimated the most common ancestor of BCoV during 1940’s, and identified the global circulation of two geographically distinct BCoV lineages that diverged during 1960-1970. European BCoV formed a distinct lineage to those circulating globally with a predominant number of strains collected in Asia and North America. We found little evidence of genetic mixing between the lineages, highlighting potential routes of BCoV transmission. A recombination event in the spike gene (breakpoint at nt 1100) may be at the origin of the genetic divergence sixty years ago. Gap in BCoV surveillance, leading to limited sequence data, is a bias to

BCoV evolution analyses. Further studies are warranted to understand the mechanisms behind BCoV tissue tropism, to precise evolution rates and TMRCA, and to understand the reasons for the different evolution rates of European and non-European BCoV.

Keywords: bovine coronavirus, France, recombination, geographic clustering, molecular clock

1 Introduction

2 Bovine coronavirus (BCoV) is widespread in cattle and wild ruminant populations, resulting in

3 neonatal calf diarrhea and winter dysentery in adult cattle as well as upper and lower respiratory tract

4 infection. BCoV is associated with the bovine respiratory disease complex (BRD), a leading cause of

5 morbidity of young cattle worldwide with large economic costs due to mortality, treatment and

6 impeded growth performances and pose a threat to public health as a result of antibiotic use. Having a

7 multifactorial etiology, BRD is a complex disease triggered by the presence of one or several viruses

8 and/or bacteria (1) favored by an altered state of the host immune system (2) and usually disturbed

9 environmental factors (3) and several physical and biological stressors (2,4,5). Viruses associated with

10 BRD are capable of initiating a cascade of events such as immune suppression (2,6), respiratory

11 epithelium damage (7) and alter commensal flora and local biofilm (8–10) thus leading to complex

12 secondary bacterial infections (8,10,11).

13 BCoV is a pneumoenteric virus frequently isolated from the fecal samples of diarrheic calves (12–15)

14 and from upper and lower respiratory tract samples during BRD episodes worldwide (16–19). While

15 both forms of BCoV infection are widespread with high prevalence among cattle (12,13,15,20,21) and

16 wild ruminants (22), the putative differences between strains isolated from enteric and respiratory

17 tracts are still not clear and it is unknown whether these differences are related to tissue tropism or

18 simply to distinct times and locations of isolation. Some reports suggest that the all BCoV are similar

19 at genomic and antigenic levels (18,23) while others suggest that enteric and respiratory strains are

20 genetically and antigenically different (24,25).

21 Studies on BCoV diversity have been carried out in different parts of the world, but they have been

22 sporadic with most sequences representing a few countries in Europe, Asia, and North America and

23 restricted to a one to few years. Antigenic and genetic differences in north American strains were for

24 example shown by phylogenetic analysis and virus neutralization test (17). The genetic diversity of

25 BCoV strains was also assessed in Japan where a genetic shift was observed in the 1990’s (from

100

26 American-like viruses pre-1996 to more specific Japanese strains post-1996) (26). Genetic partition

27 between European and non-European BCoV strains has recently been identified (27,28).

28 Coronaviruses are enveloped particles with a large non-segmented, linear, polyadenylated, single-

29 stranded positive sense RNA genome (29). They belong to the family Coronaviridae in the order

30 Nidovirales within the Coronavirinae subfamily (30). Coronaviruses are classified into 4 genera (31):

31 Alphacoronavirus, Betacoronavirus, Gammacoronavirus and Deltacoronavirus, and are known to

32 infect birds and many mammals including humans (32). BCoV are members of the Betacoronavirus

33 genus within the Coronaviridae family, which includes several important human pathogens of

34 zoonotic origin, such as the Human Coronavirus (HCoV) OC43, HKU1, MERS, and SARS, and

35 mammalian viruses including equine coronaviruses (EqCoV) (33), canine respiratory coronaviruses

36 (CRCoV) (34), swine hemagglutinating encephalomyelitis virus (HEV) (35), murine coronaviruses

37 (30), and bat coronaviruses (BatCoV) HKU4, HKU5 and HKU9 (36–39). BCoV are most closely

38 related to members of the Betacoronavirus1 species PHEV, OC43 and EqCoV and share similarity in

39 genome organization (40).

40 Coronaviruses pose a constant public health threat, due to their low replication fidelity and high

41 genetic variability making them prone to a constant changing pattern often leading to emerging

42 diseases (41). The intensive investigation that followed the emergence of SARS-CoV (42) and MERS-

43 CoV (43) confirmed the zoonotic origins of those betacoronaviruses (38,44–46), their efficient

44 adaptability (47), and their potency to switch species (48). Based on antigenic similarity it is thought

45 that the human OC43 and canine respiratory coronaviruses emerged from BCoV (49,50).

46 The aim of the present study was to characterize BCoV from both upper and lower respiratory tracts of

47 symptomatic animals in the Southwest of France. We aimed at isolating the viruses, sequencing their

48 full genomes by deep sequencing, and analyzing the obtained genetic data using phylogeny and time

49 scale evolution models to better understand the virus evolution. While our starting point was French

50 field BCoV, our study aims at a better understanding of BCoV genetic evolution at a global scale,

101

51 looking both at the genetic characteristics of viruses and at the collection times in order to draw

52 hypotheses on BCoV origin (in time and space) and global spread.

53 Material and methods

54 All methods were carried out in accordance with relevant guidelines and regulations. All experimental

55 protocols were approved by the Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse and/or the Genotoul

56 bioinformatics platform Toulouse Midi-Pyrenées.

57 Sample collection and processing

58 Deep nasal swabs (NS) and bronchoalveolar lavage (BAL) were collected from herds affected with

59 respiratory disease in the south west of France during 2014. The calves included in this study

60 presented acute signs of pneumonia during BRD episodes and were not vaccinated nor treated prior to

61 sampling. Four calves were sampled from each of the affected herds and samples were pooled

62 separately by tissue type (NS or BAL). Swabs were inserted deep in the calf nostril (approximatively

63 20 cm deep) and rotated for 30 seconds against the nasal mucosae. Swabs were placed in PBS,

64 vortexed and kept on ice for no more than 2 hours until being stored at -80°C. Bronchoalveolar

65 lavages (BALs) by bronchoscopy were performed under deep anesthesia: 10mg/kg Diazepam and

66 10mg/kg ketamine were injected intravenously and a sterile flexible bronchoscope (Olympus) was

67 passed through the pharynx and visually guided to the first bronchial division corresponding to the

68 caudal segment of the right apical lung lobe. The lung lobe was then lavaged with 100 ml of sterile

69 isotonic saline solution and the liquid was immediately aspirated after the infusion and refrigerated

70 until further processing.

71 Sample preparation and NGS sequencing

72 Pools of both sample types were filtered by a syringe driven 0.45µm filter, and the BALs were

73 concentrated by centrifugation (100 000 g, 2h, 4°C). 300µl of PBS were added to the pellet and left at

74 4°C overnight before suspension. All samples were then treated with a cocktail of nucleases for 1 hour

102

75 at 37°C to eliminate the host nucleic acids (Exonuclease I (20U, Thermo Fischer, USA), Benzonase

76 (25U, Merck chemical, Germany), Turbo DNAse (2U, Thermo Fisher Scientific, USA), RNase I (10U,

77 Thermo Fischer, USA)). Viral nucleic acids were purified using the QIAamp MinElute virus spin kit

78 (Qiagen, USA). Sequence-independent, single primer amplification was carried out as described by

79 Liais et al (51). Briefly, reverse transcription was performed using tagged random hexamers, first and

80 second strands were then randomly amplified by PCR. PCR products were purified and libraries

81 processed using the Truseq nano kit (Illumina, USA) for next-generation sequencing with Illumina

82 Miseq v2 platform (San Diego, USA) generating paired 250 bp reads.

83 Bioinformatics analysis was carried out using an in-house bioinformatics pipeline. Briefly, sequences

84 reads from each library were filtered, demultiplexed, sorted and pair-end reads merged. Viral

85 composition and relative abundance were determined using GAAS (52), the metagenomes were

86 compared to NCBI RefSeq virus database using Blastx. BCoV reads were also mapped against the

87 Mebus BCoV genome (accession U00735.2) using Burrows-Wheeler Alignment Tool. Reads of

88 BCoV were as well assembled using CLC Genomics Workbench (Qiagen, USA). Specific primers

89 were designed based on the extracted reads for RT PCR to fill sequence gaps between the contigs and

90 the produced amplicons were sequenced on a 3130XL Applied Biosystems capillary sequencer

91 (Applied Biosystems, USA).

92 Screening for bovine respiratory pathogens

93 Samples were screened using the LSI VetMAX Screening pack – Ruminant Respiratory Pathogens

94 real-time PCR kit (Life technologies, USA) according to the manufacturer instructions for the

95 detection of Mycoplasma bovis, Histophilus somni, Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica,

96 Bovine coronavirus, Bovine respiratory syncytial virus (BRSV) and Bovine parainfluenza-3 virus

97 (BPI-3).

98 BCoV isolation

103

99 Virus isolation was attempted in Human Rectal Tumor-18G (HRT-18G) cells as follows: samples

100 filtered by a syringe driven 0.22µM filter were propagated on HRT-18G (ATCC CRL-11663) cells in

101 the presence of TPCK trypsin (1µg/ml, Thermo Fisher Scientific, USA) in optiMEM Reduced Serum

102 Media (Thermo Fisher Scientific, USA) supplemented with Penicillin (500 µg/ml), Streptomycin (500

103 Units/ml) (Life technologies, USA), Ciprofloxacin (10 µg/ml, Sigma-Aldrich, USA), Amphotericin B

104 (2.5 µg/ml, Sigma-Aldrich, USA) and BM-cyclin (15 µg/ml, Sigma-Aldrich, USA). The cells were

105 incubated for 4 days at 37°C before pooling and filtration of the supernatant.

106 Virus sequence datasets and phylogenetic analysis

107 Viruses sequenced in this study (Table 1) were combined with BCoV nucleotide sequence data

108 available in GenBank, along with their sampling dates, host and sample type (respiratory or fecal)

109 (Table 2). We focused on the spike (S) and nucleocapsid (N) genes as the large majority of the

110 available BCoV sequence data was on S and N genes. Multiple sequence alignments were generated

111 with Clustal Omega (53,54) and manually optimised with BioEdit v7.1 (55). Maximum likelihood

112 (ML) trees were constructed in MEGA v6 (56) using the best-fit nucleotide substitution models:

113 Tamura-Nei model with gamma-distributed rate variation (TN93+G) for N gene and the general time

114 reversible model with gamma-distributed rate variation and a proportion of invariant sites (GTR+G+I)

115 for the S gene. The quality of nucleotide sequences along with their temporal signal were assessed

116 using a regression of the root-to-tip distances of the ML tree and virus sampling dates in TempEst v1.5

117 (57). Samples that deviated from the regression were assumed to either be erroneous or incorrectly

118 labelled and were removed from subsequent analysis.

119 Recombination detection

120 Recombination detection was conducted for the N and S gene datasets using the Genetic Algorithm of

121 Recombination Detection (GARD) method (58) in the Datamonkey server of HyPhy v2 (58,59).

122 Datasets of recombination-free sequences were constructed by dividing the original alignments at the

123 detected breakpoints and were used in all subsequent analyses.

104

124 Molecular dating

125 Nucleotide substitution rates and the evolutionary time scale of divergence of BCoV lineages were

126 estimated using the year of virus sampling used as tip-calibrations in a relaxed molecular clock

127 method under the Bayesian Markov chain Monte Carlo (MCMC) framework in BEAST v1.7.1 (60),

128 implemented on a Galaxy workbench (http://galaxy-workbench.toulouse.inra.fr/). Molecular clock

129 branch rates were derived from a log-normal distribution (61). The Hasegawa-Kishino-Yano (HKY)

130 nucleotide substitution model was specified separately for codon positions 1 + 2 and 3, and used a

131 constant population size coalescent model. Analysis were run for 2x108 generations, sampling every

132 10,000 generations. Defaults were used for all priors expect for the clock rate for which a uniform

133 prior distribution was specified with an initial value of 10-4 substitutions/nucleotide/year.

134 Convergence of each of the parameters with a minimum effective sample size of 500, following a

135 burning of 10%, was assessed using Tracer (60). Maximum clade credible trees with the mean time of

136 the most recent common ancestor (tMRCA) and their 95% highest posterior density (HPDs) were

137 generated using the TreeAnnotator program included in the BEAST package and visualized in FigTree

138 v1.4.3.

139 Selective pressure analysis

140 Selection pressure acting on the S gene were investigated by estimating the ratio between the mean

141 number of non-synonymous (dN) and synonymous (dS) nucleotide substitution site (dN/dS) using the

142 Single Likelihood Ancestor Counting (SLAC), Fixed Effects likelihood (FEL) (62,63) and the Mixed

143 Effects Model of Evolution (MEME) method implemented in the datamonkey server of HyPhy v2

144 (59).

145 Results

146 BCoV genomes and isolation

105

147 Upper (NS) and lower (BAL) respiratory tract samples were collected from 31 calves exhibiting acute

148 respiratory disease during 2014 in the southwest of France. Nucleic acids extracted from purified

149 samples were subjected to NGS sequencing, focusing on BCoV genetic material arising separately

150 from the upper and lower respiratory samples of infected cattle. In total, five complete and two partial

151 BCoV genomes were generated (accession numbers MG757138-44), from which the nucleocapsid (N)

152 gene and spike (S) gene sequences were extracted and utilized for subsequent evolutionary analysis

153 (Supplementary Tables 1 and 2). Attempts of virus isolation in HRT-18G cells resulted in the

154 successful isolation of one strain, BCoV/France/ICSA17_LBA/2014, collected from the BAL sample

155 of infected calf in 2014.

156 BCoV and co-infecting pathogens

157 A greater proportion of BCoV were detected in NS samples (with lower Ct values) compared to BAL

158 in 3 out of 4 pools studied, whereas one sample (ICSA21) exhibited about ten times more BCoV in

159 BAL than in NS. Screening for other respiratory pathogens using real-time PCR resulted in the

160 identification of co-infecting agents (Table 1), including P. multocida, M. haemolytica, M. bovis and

161 H. somni. All samples had at least one co-infecting pathogen, with P. multocida in 3/4 calves,

162 followed by M. haemolytica, BRSV, M. bovis, BPI-3, and H. somni (Table 1).

163 Recombination of BCoV

164 Since coronavirus genomes are known to undergo recombination we inferred the occurrence of

165 recombinant breakpoints along the N and S gene alignments of BCoV collected since the 1960’s, and

166 found one recombination breakpoint in the S gene at nucleotide 1101 with significant differences in

167 evolutionary histories (KH test) between the two loci at nucleotide positions 1–1100 and 1101–4089,

168 whereas no breakpoints were detected in the N gene. These results suggest that a single phylogenetic

169 tree may not accurately describe the evolutionary history of S gene and data were therefore partitioned

170 for subsequent phylogenetic analysis.

106

171 Phylogenetic relationships and spatio-temporal evolution of recent BCoV

172 Phylogenetic analysis was conducted using 95 BCoV S gene sequences including seven from the

173 present study, and 54 BCoV N gene sequences including five newly generated sequences. Our

174 sequence dataset was predominantly restricted to sequences originating from North America, Asia and

175 Europe highlighting the paucity of BCoV surveillance and the lack of well curated sequence datasets

176 from around the globe. S gene alignments were partitioned at the detected recombination breakpoint to

177 create S gene datasets ranging from nucleotide positions 1–1100 and 1101–4089. In both data

178 partitions, BCoV circulating since the 1990s formed two broad spatially segregated phylogenetic

179 groups in Asia and Europe, respectively, derived from Mebus/1972-like strain collected in North

180 America. However, there were several topological differences between the S gene data partitions that

181 occurred both during the emergence of lineages in Europe and Asia, but we also identified topological

182 differences within the Asian and European clade suggesting continued recombination among co-

183 circulating lineages following spatial segregation (Fig. 1 and 2).

184 The Asian lineage of BCoV was predominated by strains collected in South Korea during 2002–2010

185 and both S gene partition phylogenies suggest that these strains were derived from strains similar to

186 those reported from North America during 1994–1998. Estimation of tMRCA of the South Korean

187 lineages showed that the mean tMRCA of S gene loci 1 was significantly more recent during 1995

188 (mean tMRCA 1995, Highest posterior density [HPD] 1992.5–1998.7) than in data partition-2 which

189 constituted two distinct lineages that diverged during 1986 (mean tMRCA 1986, HPD, 1980–1991),

190 however the tMRCAs of the two co-circulating lineages overlapped with the tMRCA of partition-1

191 highlighting the co-circulation of multiple lineages in South Korea. In addition, two strains collected

192 recently from cattle in China exhibited differences in origin between the S data partitions: their first

193 1000 nucleotides appear to be derived independently from strains similar to those collected in North

194 America during 1994–1998, whereas the second but longer partition were derived directly from South

195 Korean specimens collected during 2002–2010. These results suggest historical movement of BCoV

196 between the North America and Eurasia landmasses as well as between Asian countries.

107

197 The European lineage (EU-lineage) was represented by BCoV collected from several countries in

198 Europe since the 1990s, including France, Denmark, Germany, Italy and Sweden, however excluding

199 France most BCoV sequence data in Europe derives from 2002–2010. There is also evidence that the

200 EU-lineage evolved through recombination as the ancestral relationship of these lineages to

201 M80844/Geissen-Germany/1989 differed between the two loci (Fig. 1 and 2), indicating that the

202 recombination event (breakpoint at nt position 1100) may be at the origin of the distinct Asian and

203 European lineages.

204 BCoV sequences collected from calves in France between 2013–2014 revealed a greater genetic

205 heterogeneity in S gene loci-1 (1–1000 nts) with evidence of co-circulation of two lineages that

206 diverged as early as 2000 (mean tMRCA, Aug 2000 (95% Highest posterior density [HPD], 1998.5–

207 2009.8)) (Fig. 1), whereas loci 2 exhibited fewer differences between contemporary viruses and

208 revealed a mean divergence of approximately 4 years (mean tMRCA, Mar 2009 (95% HPD, 2007.5–

209 2010.8)). When looking specifically at the Southwestern French BCoV sequences,

210 BCoV/France/ICSA21L3/2014 differed from its counterparts on locus 1 (being closely related to a

211 recent Northwestern French sequence, BCoV/France/EPI-Caen/2013) but clustered with its

212 Southwestern counterparts for the locus 2 (Fig. 2). These results highlight a complex evolutionary

213 history that is determined by migration and pervasive recombination.

214 Our N gene dataset comprised lower sampling outside of France. All N gene sequences of BCoV

215 strains from France, isolated since 2003, formed a monophyletic group, with the mean tMRCA of the

216 contemporary BCoV (2013–2014) isolates estimated during 2004 (95% HPD, 1999.2–2009.2),

217 indicating a result that overlaps with the tMRCA of both S gene partitions.

218 Evolutionary rate and TMRCA of BCoV

219 We estimated the evolutionary rate for the S and N gene datasets using the relaxed clock model, and

220 found a relatively lower rates of nucleotide substitution rates in BCoV datasets, ranging from a mean

221 rate of 0.81 x 10-3 (95% HPD, 0.5–0.8 x 10-3) for S gene data partition-1, 1.0 x 10-3 (HPD, 0.7–1.3 x

108

222 10-3) for S gene data partition-2 and a lower but with wide-confidence intervals were observed for the

223 N gene dataset (mean rate, 0.2 x 10-3 (95% HPD, 0.1–0.4 x 10-3)). These estimates were similar to

224 those estimated for other Coronaviruses, for example the mean nucleotide substitution rate of MERS

225 was estimated at 1.1 (95% CI, 0.8–1.4 x 10-3) (64). Estimates of the coefficient of variance of the

226 relaxed clock model ranges from a mean of 0.61 for the S gene partition-1, to 0.7 for S partition-2 and

227 the N gene datasets, and HPD intervals of all datasets were lower than 1, indicating that there was

228 significant variation in nucleotide substitution rates along the BCoV branches and also suggests that

229 the relaxed clock model was more appropriate than using a strict clock model.

230 The tMRCA of globally sampled BCoV for the N and S genes was estimated during 1940 and 1964,

231 suggesting the common ancestor for known BCoV was about 51 to 75 years prior to the last included

232 sequence date (2015). Whereas the most common recent ancestor of the EU lineage was 1978–1981

233 (Fig. 1 and 2). The recombination event that likely led to the 2 main lineages with clear geographic

234 distinction (US/Asia and European lineages) co-circulating today may thus have occurred in the

235 1960’s–70’s.

236 Selective pressure

237 The selection analysis for the S gene was conducted using 2 partitions. The average dN/dS rate ratio

238 was estimated to be 0.310 for the S gene, with 28 positively selected amino acids (from SLAC, FEL

239 and MEME – see Methods) (Table 2). Amino acids 35, 113, 115, 447, 499, 501, 525, 716, 893, and

240 1239 were detected as positively selected in at least 2 of the 3 used models (Table 2).

241 Discussion

242 Prevalence of BCoV in Europe

243 Bovine coronavirus is considered widespread in Europe and worldwide in both its enteric and

244 respiratory forms. Furthermore, BCoV is considered a main pathogen associated with pneumonia in

245 feedlots in North America (15,16,65,66). Although BCoV is no less a very common pathogen in

109

246 Europe, limited data is available on its epidemiology. Norwegian studies have revealed a high

247 seroprevalence in cattle with 39.3% and 80.7% in calves and herds, respectively, in 2009 and 72.2% in

248 herds tested in 2016 (21,67). In Italy, four respiratory disease outbreaks during 2006 were associated

249 with BCoV without concurrent detection of other known respiratory pathogen but with the detection of

250 BCoV in the intestines in two of the four outbreaks (19). In Belgium, seroconversion for BCoV was

251 detected in 30% of veal calves herds (68). In a retrospective study in Ireland (2008-2012), BCoV was

252 the most frequently detected virus in cattle nasal swabs from respiratory disease outbreaks (69). In

253 France, BCoV was detected in 17 to 63% of respiratory samples collected in 2 independent studies

254 (70). Taken together, literature on BCoV in Europe is limited but highlights the high circulation of the

255 pathogen at the continental scale.

256 No obvious link between virus tropism and genetic markers

257 It is so far unknown whether a unique or distinct BCoV are responsible for respiratory and enteric

258 infections (18,23,25,71). As recently observed in Austria and Slovakia (23), we did not succeed in

259 identifying genetic determinants of tissue tropism, nor between enteric and respiratory BCoV strains,

260 nor between strains present in the upper and lower respiratory tracts. In the absence of viral genetic

261 determinants of tissue tropism, the immune status of the animals at the time of the BCoV infection,

262 infectious dose, and route of inoculation (oro-fecal versus aerosol) may play a role in determining site

263 of infection (72). Further studies are clearly warranted to understand the mechanisms behind the

264 differential tissue tropism of BCoV.

265 Little exchanges of BCoV viruses between Europe and the other continent

266 Among available BCoV complete genomes, a minority are from European origins. In this study we

267 therefore characterized respiratory strains of BCoV, from both upper and lower respiratory tracts, at

268 the genetic level. Despite recent efforts, there are notable gaps in our understanding of bovine

269 coronavirus dynamics and diversity. Our results show that the French strains described here cluster

270 with all other Europeans strains, thus indicating a homogeneous evolution of BCoV in Europe,

110

271 whereas a greater mixing was observed between isolates collected in North America and Asia. This

272 pattern of geographical and temporal distinction between strains was previously described for BRSV,

273 for which distinct phylogenic groups with continent-specific strains were identified (73–75). Similarly,

274 BVDV also harbors a geographic clustering (76). This peculiar evolutionary process could be

275 explained by the relative isolation of Europe as far as cattle traffic is concerned. According to FAOstat

276 (77), cattle traffic involving Europe is mainly unidirectional with export of live animals from France

277 (for the most part) to other continents with a negligible importation activity. On the other hand, the

278 import/export activity between North America and East Asia is much more fluid. In addition, Kin et al

279 recently highlighted this important trade constraint on BCoV spread at a global scale (28). It is

280 however unclear why/how BCoV, BRSV, or BVDV, would spread differently than other bovine RNA

281 viruses. Influenza D viruses (IDV), which primarily infects Bovine hosts, seem for example to have

282 emerged recently but genetically and antigenetically similar viruses circulate in Europe and North

283 America (78–81). One may thus hypothesize that different routes of transmission may be used for the

284 different pathogens. In addition, human coronaviruses were shown to induce short term immunity

285 (82). If BCoV led to similar responses in cattle, herds with animals of multiple ages as seen more often

286 in France than in North America, might face re-infections with BCoV, and might maintain virus over

287 long periods of time, which would impact the virus evolution.

288 Recombination likely drove the different evolutionary process taken by the Asian and North American

289 strains and the Europeans strains; in the first partition of the S gene dataset, the strains M80844

290 Giessen/1989 clustered along with French strain D00731/1979, US strain AF058942 LY138

291 Utah/1965, South Koreans EU401988 SUN5/1994 and EU401987 A3/1994 and North Americans

292 AF220295 Quebec/1972 and U00735 Mebus/1972 suggesting a common ancestor of this cluster.

293 Whereas, in the partition 2 of the S dataset, we noticed a change in the phylogenic scheme: the

294 M80844 Giessen/1989 there clustered with all Europeans strains while the more recent North Korean

295 (year 2002) and recent Chinese KM985631 HLJ/T4/2014 and KU886219 AKS/01/2015 clustered with

296 the US strains of the 1990’s, suggesting a common origin. The old BCoV strains (< year 1994) seemed

111

297 to have the same origin irrespective of their geographic origin until an event of recombination led the

298 European strains to evolve separately.

299 Evolution of BCOV

300 Using the different models (constant population under strict and relaxed clock for all the strains and

301 the constant population and BSP under relaxed clock for the European strains), the mean substitution

302 rates calculated for the spike genes ranged between 3.9 and 9.8 x 10-4 nucleotide substitution per site

303 per year, very similar range as previously published: 2.1-10.5 x 10-4 (83,84). The slower evolution of

304 N than of S gene is also in line to previous reports from the literature (84). Substitution rates were in

305 the same range for other Betacoronaviruses with 0.6 x 10-3, 0.7 ± 2 × 10-3 for HCoV-OC43 and

306 TGEV, respectively (85,86). We observed a slightly faster evolution for European BCoV than for the

307 whole dataset (Table 2). An important bias in our analyses comes from the lack of sequence data and a

308 timing difference between European and American BCoV: most North American specimens were at

309 least ten years older than European strains. In addition, the production systems (different numbers of

310 animals per farms, feedlots in North America but not in Europe), the virus prevalence, and the vaccine

311 coverages are likely different: the selection pressures must be different. Our selection pressure

312 calculations did unfortunately not allow for highlighting any difference in selection pressure between

313 the continents. The 10 positively selected amino acids detected here (Table 3) were spread out over the

314 whole spike protein and could not be linked to a biological function due to the limited research so far

315 carried out on BCoV: no spike structure has so far been resolved (comparison is only possible with the

316 SARS spike), and no clear antigenic sites have been detected to the best of our knowledge. Further

317 studies are thus warranted to understand the role of these positions in BCoV evolution.

318 As far as the TMRCA is concerned, our analysis with the new sequence data confirmed the values

319 previously estimated: 1978 (95% CI: 1910-1963) or 1944 (95% CI: 1910-1963) (83,84). Here again,

320 more sequences available throughout the last few decades would allow for an increased precision in

321 the TMRCA. We showed here for the first time that a recombination event may be at the origin of the

112

322 viruses that evolved separately in Europe on the one hand side and in America/Asia on the other hand

323 side. This event likely occurred in the 1960’s-1970’s, when cattle exchanges between Europe and the

324 other continents was already very limited.

325 Conclusions

326 Taken together, our results showed that while no genetic determinant of tissue tropism could be

327 identified in BCoV sequences, the BCoV ancestor emerged in the 1940’s, and that two geographically

328 distinct lineages diverged from the 1960’s-1970’s with no genetic mixing detected thus far. Further

329 studies are warranted to understand the mechanisms behind BCoV tissue tropism, and improved

330 surveillance and sequencing to precisely estimate the evolutionary and epidemiological parameters, of

331 circulation BcoV and identify the recombinations in genomic evolution.

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Acknowledgments

We are grateful to the Genotoul bioinformatics platform Toulouse Midi-Pyrenées and Sigenae group for providing help and/or computing and/or storage resources on the Galaxy interface http://sigenae- workbench.toulouse.inra.fr. This work was supported by the ‘RESPICARE’ grant of the Institut

Carnot Santé Animale (ICSA), and by the French Ministry of Agriculture. Elias Salem is supported by a PhD scholarship of the Lebanese University.

118

Contributions

E. Salem, H. Cassard, G. Meyer, M. Ducatez initiated the research, performed the field and laboratory work. E. Salem, D. Vijaykrishna, B. Hause, S. Maman and M. Ducatez run the bioinformatics and molecular evolution analyses. E. Salem, D. Vijaykrishna and M. Ducatez drafted the manuscript. All authors reviewed the final manuscript.

Competing Interests

The authors declare no competing interests.

Figures legends

Figure 1. Dated phylogeny of BCoV S gene partition 1 (nt 1-1100). Tree generated using the relaxed clock model and a constant coalescent tree prior. Nodes correspond to mean tMRCAs. 95% HPD are indicated on nodes with grey boxes. French sequences (including those generated in the present study),

European, Asian, and North American sequences are in red, orange, blue and green fonts, respectively.

Figure 2. Dated phylogeny of BCoV S gene partition 2 (nt 1101-4089). Tree generated using the relaxed clock model and a constant coalescent tree prior. Nodes correspond to mean tMRCAs. 95%

HPD are indicated on nodes with grey boxes. French sequences (including those generated in the present study), European, Asian, and North American sequences are in red, orange, blue and green fonts, respectively.

119

Figure 1 :

120

Figure 2 :

121

Table 1. Presence of co-infecting pathogens as determined by real time using the LSI vetmax screening kit.

Sample Ct value2

Id Type1 P. multocida M. haemolytica M. bovis H. somni BCoV BRSV BPI-3

ICSA-4 BAL 26,75 30,17 22,74

ICSA-16 BAL 39,01 24,19

ICSA-17 BAL 27,04 38,9

ICSA 21 BAL 29,32 27,31 29,27 38,61

ICSA-4 NS 32,1 27,9 29,4 32,61

ICSA-16 NS 18,67

ICSA-17 NS 28,9

ICSA 21 NS 24,4 26,7 34,93

1BAL, bronchoalveolar lavage and NS, nasal swabs. 2Ct values >40 are not shown. P. : Pasteurella ;

M.: Mycoplasma; H.: Histophilus; BCoV: Bovine coronavirus; BRSV: Bovine respiratory syncytial virus; BPI-3: Bovine parainfluenza-3 virus.

Table 2. Amino acid sites detected to be under positive selection (with p-values <0.1) through either of the selection methods (SLAC, FEL, and MEME).

Codon SLAC p-value FEL p-value MEME p-value

35 0.0600 0.0700 0.0130

113 0.0340 0.0220 0.0700

115 0.0670 0.0210 #N/A

155 #N/A #N/A 0.0500

179 #N/A #N/A 0.0680

257 #N/A 0.0820 #N/A

122

304 #N/A #N/A 0.0160332

447 0.0260 0.0260 0.0660 333 484 #N/A #N/A 0.0980

499 0.0230 0.0090 #N/A334

501 0.0010 0.0040 0.0060 335 509 #N/A 0.0410 #N/A

525 0.0220 0.0280 0.0910336 543 #N/A #N/A 0.0760 337 689 #N/A #N/A 0.0380

716 0.0590 0.0490 #N/A 338 744 #N/A #N/A 0.0060

767 #N/A #N/A 0.0000339

769 #N/A #N/A 0.0940 340 892 #N/A #N/A 0.0710

893 #N/A 0.0410 0.0010341

1085 #N/A #N/A 0.0030 342 1188 #N/A #N/A 0.0040

1206 #N/A 0.0450 #N/A343

1237 #N/A #N/A 0.0380 344 1239 #N/A 0.0110 0.0960

1269 #N/A #N/A 0.0000345 1362 #N/A 0.0150 #N/A 346

Sites with p-values <0.05 are shown in bold. Codons positively selected as shown by at least 2 of the 3 selection methods are underlined. #N/A: no positive selection detected.

123

Supplementary Table 1. Details of the strains used for S gene sequences analyses

Accession Type of Strain/isolate Host species Country Sampling year number sample

KU886219 AKS 1 bovine - China 2015

DQ389658 KWD17 bovine enteric South Korea 2002

DQ389656 KWD15 bovine enteric South Korea 2002

DQ389655 KWD14 bovine enteric South Korea 2002

DQ389653 KWD12 bovine enteric South Korea 2002

HM573330 Nyala 10.01 Nyala enteric South Korea 2010

HM573326 Wisent 10.01 Wisent enteric South Korea 2010

DQ389633 KCD2 bovine enteric South Korea 2004

DQ389654 KWD13 bovine enteric South Korea 2002

DQ389634 KCD3 bovine enteric South Korea 2004

DQ389635 KCD4 bovine enteric South Korea 2004

DQ389632 KCD1 bovine enteric South Korea 2004

DQ389636 KCD5 bovine enteric South Korea 2004

DQ389639 KCD8 bovine enteric South Korea 2004

DQ389641 KCD10 bovine enteric South Korea 2004

DQ389637 KCD6 bovine enteric South Korea 2004

DQ389638 KCD7 bovine enteric South Korea 2004

DQ389640 KCD9 bovine enteric South Korea 2004

DQ389659 KWD18 bovine enteric South Korea 2002

AY935643 KWD7 bovine enteric South Korea 2002

DQ389652 KWD11 bovine enteric South Korea 2002

DQ389657 KWD16 bovine enteric South Korea 2002

DQ389660 KWD19 bovine enteric South Korea 2002

KM985631 HLJ-14/CHN bovine enteric China 2014

AY935641 KWD5 bovine enteric South Korea 2002

AY935646 KWD10 bovine enteric South Korea 2002

AY935637 KWD1 bovine enteric South Korea 2002

AY935642 KWD6 bovine enteric South Korea 2002

124

AY935638 KWD2 bovine enteric South Korea 2002

AY935644 KWD8 bovine enteric South Korea 2002

AY935639 KWD3 bovine enteric South Korea 2002

AB354579 kakegawa bovine enteric Japan 1976

EU401988.1 SUN5 bovine enteric South Korea 1994

EU401987.1 A3 bovine enteric South Korea 1994

MG757144 BCoV/France/13-ICSA17-LBA/2014 bovine respiratory France 2014

MG757140 BCoV/France/11-ICSA16-LBA/2014 bovine respiratory France 2014

MG757139 BCoV/France/12-ICSA16-EN/2014 bovine respiratory France 2014

MG757138 BCoV/France/ICSA21L3/LBA/2014 bovine respiratory France 2014

MG757143 BCoV/France/2-ICSA4-EN/2014 bovine respiratory France 2014

KF169922 SWE/AC/06-1 bovine enteric Sweden 2006

KF169924 SWE/M/06-4 bovine enteric Sweden 2006

KF169940 SWE/P/10-4 bovine enteric Sweden 2010

KF169939 SWE/Y/10-3 bovine enteric Sweden 2010

KF169938 SWE/M/10-2 bovine enteric Sweden 2010

KF169937 SWE/M/10-1 bovine enteric Sweden 2010

KT318119 BCoV/FRA/EPI/Caen/2013/09 bovine enteric France 2013

KT318123 BCoV/FRA/EPI/Caen/2014/13 bovine enteric France 2014

KT318121 BCoV/FRA/EPI/Caen/2013/11 bovine enteric France 2013

KT318122 BCoV/FRA/EPI/Caen/2014/12 bovine enteric France 2014

KT318118 BCoV/FRA/EPI/Caen/2013/08 bovine enteric France 2013

KT318117 BCoV/FRA/EPI/Caen/2012/07 bovine enteric France 2012

KF169914 DEN/03-2 bovine enteric Denmark 2003

EU019216 Buffalo Buffalo enteric Italy 2007

KT318112 BCoV/FRA/EPI/Caen/2005/02 bovine enteric France 2005

KT318124 BCoV/FRA/EPI/Caen/2004/14 bovine enteric France 2004

KT318113 BCoV/FRA/EPI/Caen/2007/03 bovine enteric France 2007

KF169933 SWE/I/08-3 bovine enteric Sweden 2008

EU814647 438/06-TN bovine respiratory Italy 2006

KT318114 BCoV/FRA/EPI/Caen/2008/04 bovine enteric France 2008

KT318116 BCoV/FRA/EPI/Caen/2010/06 bovine enteric France 2010

125

KF169909 SWE/02-1 bovine respiratory Sweden 2002

KF169910 SWE/02-2 bovine respiratory Sweden 2002

KF169912 SWE/02-4 bovine respiratory Sweden 2002

KF169935 SWE/C/09-2 bovine respiratory Sweden 2009

KF169929 SWE/I/07-5 bovine enteric Sweden 2007

KF169934 SWE/P/09-1 bovine enteric Sweden 2009

KF169921 SWE/N/05-2 bovine enteric Sweden 2005

KF169920 SWE/N/05-1 bovine enteric Sweden 2005

KF169923 SWE/M/06-3 bovine enteric Sweden 2006

KF169936 SWE/U/09-3 bovine respiratory Sweden 2009

KF169930 SWE/C/07-6 bovine enteric Sweden 2007

KF169925 SWE/Z/07-1 bovine enteric Sweden 2007

KF169932 SWE/C/08-2 bovine enteric Sweden 2008

KF169931 SWE/AC/08-1 bovine enteric Sweden 2008

KF169926 SWE/C/07-2 bovine enteric Sweden 2007

EF445634 339/06 bovine enteric Italy 2006

KF169917 DEN/05-2 bovine enteric Denmark 2005

KF169919 DEN/05-4 bovine enteric Denmark 2005

KF169918 DEN/05-3 bovine respiratory Denmark 2005

KT318111 BCoV/FRA/EPI/Caen/2005/01 bovine respiratory France 2005

KT318115 BCoV/FRA/EPI/Caen/2003/05 bovine enteric France 2003

KF169915 DEN/03-3 bovine enteric Denmark 2003

KF169913 DEN/03-1 bovine enteric Denmark 2003

KF169908 SWE/C/92 bovine enteric Sweden 1992

M80844 Giessen bovine respiratory Germany 1989

D00731.1 Bovine bovine enteric France 1979

AF391541 BCoV-ENT bovine enteric USA Texas 1998

DQ915164 Alpaca bovine enteric USA Oregon 1998

AF391542 BCoV-LUN bovine respiratory USA Texas 1998

AF058943 LSU-94LSS-051-2 bovine respiratory USA Louisiana 1994

AF058944 OK-0514-3 bovine respiratory USA 1996

AF058942 LY138 bovine enteric USA Utah 1965

126

AF220295 Quebec bovine _ Quebec 1972

U00735 Mebus bovine enteric USA 1972

KF272919.1 RVLC7 bovine enteric Ireland 2011

127

Supplementary Table 2. Details of the strains used for N gene sequences analyses

Accession Type of Sampling

number Strain/ isolate Host species sample Country year

KU886219.1 BCV-AKS-01 Bovine - China 2015

M36656.1 F15 Bovine enteric France 1979

EU019216.1 Bubalus/Italy/179/07-11 Bubalus enteric Italy 2006

KM985634.1 HLJ-14/CHN Bovine enteric China 2014

EU401983.1 A3 Bovine enteric South Korea 1994

EU401984.1 SUN5 Bovine enteric South Korea 1994

AB354579.1 Kakegawa Bovine enteric Japan 1976

U00735.2 Mebus Bovine enteric USA 1972

KT318083.1 BCoV/FRA/EPI/Caen/2005/02 Bovine enteric France 2005

KT318087.1 BCoV/FRA/EPI/Caen/2003/05 Bovine enteric France 2003

KT318084.1 BCoV/FRA/EPI/Caen/2005/01 Bovine respiratory France 2005

KT318085.1 BCoV/FRA/EPI/Caen/2007/03 Bovine enteric France 2007

KT318096.1 BCoV/FRA/EPI/Caen/2004/14 Bovine enteric France 2004

KT318088.1 BCoV/FRA/EPI/Caen/2010/06 Bovine enteric France 2010

KT318086.1 BCoV/FRA/EPI/Caen/2008/04 Bovine enteric France 2008

MG757140 BCoV/France/11-ICSA16-LBA/2014 Bovine respiratory France 2014

MG757141 BCoV/France/ICSA17_LBA/2014 Bovine respiratory France 2014

MG757142 BCoV/France/19-pool-LBA/2014 Bovine respiratory France 2014

MG757139 BCoV/France/12-ICSA16-EN/2014 Bovine respiratory France 2014

MG757138 BCoV/France/ICSA21L3LBA/2014 Bovine respiratory France 2014

KT318092.1 BCoV/FRA/EPI/Caen/2013/10 Bovine enteric France 2013

KT318089.1 BCoV/FRA/EPI/Caen/2012/07 Bovine enteric France 2012

KT318095.1 BCoV/FRA/EPI/Caen/2014/13 Bovine enteric France 2014

KX982264.1 BCoV Bovine enteric France 2014

KT318093.1 BCoV/FRA/EPI/Caen/2013/11 Bovine enteric France 2013

KT318094.1 BCoV/FRA/EPI/Caen/2014/12 Bovine enteric France 2014

KT318090.1 BCoV/FRA/EPI/Caen/2013/08 Bovine enteric France 2013

KT318091.1 BCoV/FRA/EPI/Caen/2013/09 Bovine enteric France 2013

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EU401980.1 0501 Bovine enteric South Korea 2005

EU401981.1 0502 Bovine enteric South Korea 2005

AF058943.1 LSU-94LSS-051-2 Bovine respiratory USA 1994

AF058944.1 OK-0514-3 Bovine respiratory USA 1996

FJ425186.1 US/OH-WD358/1994 Waterbuck enteric USA 1994

FJ425185.1 US/OH-WD358-GnC/1994 Waterbuck enteric USA 1994

DQ811784.2 DB2 Bovine - Maryland USA 1984

FJ425189.1 US/OH-WD388/1994 Sambar deer enteric USA 1994

EF424621.1 US/OH1/2003 Sable antelope enteric USA 2003

EF424623.1 US/OH3/2003 Giraffe enteric USA 2003

AF391542.1 BCoV-LUN Bovine respiratory Texas USA 1998

AF391541.1 BCoV-ENT Bovine enteric Texas USA 1998

EF424617.1 R-AH65 Bovine respiratory Ohio USA 2001

DQ915164.2 Alpaca Alpaca enteric USA 1998

EF424620.1 R-AH187 Bovine respiratory Ohio USA 2000

White-tailed

FJ425187.1 US/OH-WD470/1994 deer enteric Ohio USA 1994

AF058942.1 LY 138 Bovine enteric Utah USA 1965

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Résultats et discussion

Le coronavirus bovin est répandu en Europe et dans le monde sous ses deux formes entérique et respiratoire. De plus, le BCoV est considéré comme un pathogène principal associé à la pneumonie dans les parcs d'engraissement en Amérique du Nord. Même si BCoV est très commun en Europe, les données disponibles sur son épidémiologie sont limitées. En France, le BCoV a été détecté dans 17 à 63% des échantillons respiratoires collectés dans 2 études indépendantes par des méthodes de criblage conventionnelles. La littérature sur BCoV en Europe est limitée mais met en évidence la circulation importante de l'agent pathogène à l'échelle continentale.

Dans cette étude, nous n'avons pas réussi à identifier de déterminants génétiques du tropisme tissulaire entre les souches BCoV entériques et respiratoires, ou entre les souches présentes dans les voies respiratoires supérieures et inférieures. D'autres études seront nécessaires pour comprendre les mécanismes à l'origine du tropisme tissulaire du BCoV.

Parmi les génomes complets de BCoV disponibles, une minorité est d'origine européenne. Dans cette étude, nous avons donc caractérisé au niveau génétique des souches respiratoires de BCoV, à la fois des voies respiratoires superficielles et inférieures.

Malgré les efforts récents, il existe des lacunes notables dans notre compréhension de la dynamique et de la diversité des coronavirus bovins. Nos résultats montrent que les souches françaises décrites ici se regroupent avec toutes les autres souches européennes, indiquant ainsi une évolution homogène du BCoV en Europe, alors qu'une plus grande diversité a été observée entre les isolats collectés en Amérique du Nord et en Asie. Ce modèle de distinction géographique et temporelle entre les souches a été précédemment décrit pour le BRSV, pour lequel des groupes phylogéniques distincts avec des souches spécifiques au continent ont été identifiés. Ce processus évolutif particulier pourrait s'expliquer par l'isolement relatif de l'Europe en ce qui concerne le commerce du bétail. Ces échanges sont principalement unidirectionnels avec

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l'exportation d'animaux vivants majoritairement de la France vers d'autres continents et avec une activité d'importation négligeable.

Un évènement de recombinaison a été détecté dans le gène de la spicule (S) qui a probablement conduit le processus évolutif vers une divergence entre souches asiatiques et nord-américaines d’une part et souches européennes d’autre part. Deux regroupements phylogénétiques distincts, séparés par la recombinaison, ont été observés. Les anciennes souches de BCoV (pré-1994) semblaient avoir un ancêtre commun quelle que soit leur origine géographique. L’événement de recombinaison a probablement eu lieu dans les années 1960- 1970, alors que les échanges de bétail entre l'Europe et les autres continents étaient déjà très limités.

Les taux de substitution moyens calculés pour les gènes S variaient entre 3,9 et 9,8 x 10-4 substitutions nucléotidiques par site et par an et une évolution plus lente du gène codant pour la nucléocapside (N). En outre, nous avons observé une évolution légèrement plus rapide pour les souches BCoV européennes comparées aux autres souches. Nos calculs sur la pression de sélection ont permis d’identifier 10 acides aminés sélectionnés positivement mais n'ont pas permis de mettre en évidence une différence de pression de sélection entre les continents. D'autres études sont donc nécessaires pour comprendre le rôle de ces positions dans l'évolution de BCoV.

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CHAPITRE 2 : IDENTIFICATION ET

CARACTERISATION DU BACTERIOTE

RESPIRATOIRE BOVIN

I. Introduction

Les approches NGS à l’heure actuelle sont considérées comme les plus performantes pour la caractérisation des communautés microbiennes de l’appareil respiratoire. Mais ces outils ne sont pas parfaits. Quelquefois ils ne permettent pas d’identifier des microbes qui pourtant sont détectés positifs par d’autres techniques réputées moins sensibles. Ainsi dans la première étude de Holman et al (294) qui compare culture bactérienne et NGS (plateforme Roche 454), le genre Bacillus avait poussé sur trois milieux différents et dans la grande majorité des prélèvements à tous les temps, alors qu’il n’était identifié par NGS qu’au jour 60 et avec une abondance relative de 0,1%. La même observation a été faite pour le genre Pasteurella où 2 échantillons étaient positifs par NGS au jour 60 (0,05% d’abondance relative) alors que 17,1% des prélèvements étaient positifs par culture bactérienne. De même, les genres Aerococcus, Dietzia, Proteus, Rothia, et Microccoccus/Macrococcus identifiés en culture classique étaient absents parmi les taxons du NGS. Les raisons possibles de ces divergences peuvent être liées à la sensibilité et/ou la spécificité des méthodes utilisées. Concernant la méthode NGS, les étapes de conditionnement, de purification, d’amplification moléculaire et de séquençage peuvent apporter des biais d’interprétation en favorisant certains taxons. Des raisons techniques en rapport avec l’affinité des amorces utilisées ou l’absence de séquences représentant ces genres dans les bases de données utilisées lors de l’affiliation peuvent aussi expliquer l’absence d’identification de certains microbes. Après tout, le « profiling » d’un microbiote est basé sur les abondances relatives donc les taxons les plus minoritaires sont écrasés par les plus majoritaires et risquent de ne pas ressortir lors des tests statistiques. Enfin, les résultats NGS reposent sur des

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algorithmes et tests statistiques qui se révèlent quelquefois peu cohérents entre eux. Par exemple l’utilisation de LEfSE, (algorithme qui sert à l’identification des biomarqueurs et des fonctionnalités génomiques marquant une différence entre deux ou plusieurs conditions biologiques) lors de l’étude de Zeineldin (2017) a abouti à l’identification de groupes d’OTU caractéristiques de l’appareil respiratoire supérieur et d’autres caractéristiques de l’appareil respiratoire profond. Ces identifications ont été incohérentes avec celles obtenues par le test de Wilcoxon/ Kruskal-Wallis utilisé dans le même objectif.

Si on s’intéresse aux bactéries respiratoires pathogènes connues, souvent la présence de Mannheimia haemolytica n’est pas un indicateur de BPI dans les études NGS. Son abondance diminue même avec l’apparition des signes cliniques respiratoires dans l’étude de Holman (102). De même, l’abondance du genre Pasteurella subit une diminution entre le début de l’allotissement et 40 jours plus tard à une période où les BPI sont présentes (295). Les résultats obtenus peuvent s’expliquer par le lieu de prélèvement. Le portage nasopharyngé de M. haemolytica chez des animaux sains est bien connu et son imputabilité dans les BPI repose théoriquement sur sa présence dans l’appareil respiratoire profond. Si les études NGS portent majoritairement sur le microbiote nasopharyngé, une étude semble cependant indiquer que M. haemolytica puisse être identifiée parmi les composants du bactériote pulmonaire des bovins cliniquement sains (300). Les mêmes auteurs confirment aussi que l’apparition des signes cliniques est associée à un changement vers une dominance du biotype A1 de M. haemolytica (300). Le genre Mycoplasma est le genre majoritaire trouvé dans l’appareil respiratoire superficiel et profond comme confirmé dans la majorité des études identifiant les communautés microbiennes respiratoires chez les veaux (296,298,334,335). Pour le moment seul M. bovis est considéré comme un pathogène respiratoire majeur dans les BPI. Le rôle de M. dispar reste discuté. Dans l’ensemble des études, y compris la nôtre, la présence de M. bovis est toujours associée à la maladie respiratoire. Par contre M. dispar a été trouvé dans tous les sites du tractus respiratoire, surtout profond, chez des veaux sains ou atteints de BPI. Timsit (Timsit et al., 2018) observe une tendance à la disparition de l’espèce M. bovis dans les prélèvements riches en M. dispar, suggérant une compétition entre les

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deux espèces et un caractère protecteur de M. dispar vis-à-vis d’une infection à M. bovis.

Récemment, il a été suggéré que certains organismes commensaux peuvent protéger l'hôte contre les « ennemis » pathogènes, un processus appelé «résistance à la colonisation». Ces protecteurs commensaux défendent l'hôte soit en inhibant directement l'agent pathogène, soit en renforçant l'immunité de l'hôte. Des données récentes sur les deux variétés de résistance à la colonisation montrent comment la présence de bactéries communes spécifiques peut modifier la pathologie induite par les bactéries infectieuses. Ces études démontrent comment le séquençage de la communauté microbienne peut être utilisé pour savoir si un agent infectieux induit une maladie chez certains hôtes, mais pas chez tous.

La résistance à la colonisation a déjà été montrée pour plusieurs microbiotes complexes. Pour exemple Buffie et al. (292) sont partis du fait que les souris traitées avec des antibiotiques présentaient une susceptibilité plus importante à l'infection par Clostridium difficile, causant une diarrhée induite par les antibiotiques. Par séquençage NGS et modélisation des interactions microbiennes, les auteurs ont identifié Clostridium scindens comme un agent commensal associé à la résistance à la colonisation par C. difficile. Son élimination par antibiothérapie permet ainsi une prolifération de C. difficile.

Pour la pathologie respiratoire, les données suggèrent que les familles Lactobacillaceae et Bacillaceae sont positivement associées à l’état de santé (102,294,297) chez les veaux. Leur effet inhibiteur sur les pasteurelles pathogènes a aussi été montré (98,101). Toutefois certaines études apparaissent contradictoires. Si le genre Acinetobacter est associé à la présence de BPI pour M. Zeineldine (334) et E. Timsit (295), l’inverse est montré dans l’étude de Holman (294).

In fine la démonstration de la présence de bactéries commensales des tissus respiratoires des bovins qui participent à la résistance contre les pathogènes respiratoires dépendra, non seulement des études de caractérisation à haut débit des communautés microbiennes mais aussi d’études d’interactions

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précises et fonctionnelles qui mettront en évidence des mécanismes d’interactions.

La perturbation de l'équilibre des communautés bactériennes peut conduire à une résistance affaiblie, une prolifération bactérienne, et un désengagement des pathogènes résidents et opportunistes. Cet état dysbiotique peut conduire à un microbiote virulent et nommé «pathobiome». Dans les maladies respiratoires bovines, de nombreuses perturbations environnementales, comme une forte densité, le transport et des changements de température, peuvent entraîner une dysbiose, cependant la raison majeure est considérée comme infectieuse.

Les principaux objectifs de cette étude étaient d'explorer la structure du microbiote des voies respiratoires supérieures et inférieures de deux populations de veaux ; cliniquement sains et cliniquement atteints par la BPI et pour étudier l'effet de la présence d’un pathogène respiratoire sur la structure. Les veaux inclus dans l'étude provenaient de 29 élevages différents de veaux engraisseurs de la région Occitanie dans le sud-ouest de la France au cours de la période 2014- 2016. Afin de ne pas interférer dans la composition microbienne, les veaux n'ont pas été traités avec des antibiotiques ni vaccinés avant l'échantillonnage. Les veaux en bonne santé provenant d'établissements similaires ne présentaient aucun symptôme respiratoire. L'effet du temps n'a pas été exploré dans cette étude et donc la modification de la structure du microbiote des mêmes animaux non plus.

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II. Article : « Microbial ecology of the upper and lower respiratory tract in calves: interactions and dysbiosis during acute bronchopneumonia »

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Microbial ecology of the upper and lower respiratory tract in calves:

interactions and dysbiosis during acute bronchopneumonia

E. Salem1, H. Cassard 1, N. Herman1, SM. De La Giclais 3, G. Stratan 3, M. Bernard 4, N. Villa-Vialaneix 5, and G. Meyer, 1,*

1 IHAP, UMR1225, Université de Toulouse, INRA, ENVT, Toulouse, France; 2 MIA-T, UR875, INRA, Toulouse, France ; 3 Université de Toulouse, INSA, Toulouse, France ; 4GABI, INRA, AgroParisTech, Université Paris-Saclay, Jouy-en-Josas, France ; 5MIAT, Université de Toulouse, INRA, F-31326 Castanet-Tolosan, France.

* [email protected]

ABSTRACT

Bovine respiratory disease (BRD) complex is a major economic and public health burden that affects young bovines worldwide, with a multifactorial etiology involving the presence of one or several viruses and/or bacteria. These respiratory pathogens act in the presence of a very complex network of resident bacterial species called the “microbiota”. Recent evidence suggests that the upper respiratory tract (URT) microbiota plays an important role in respiratory health and disease susceptibility in cattle (1–3) .Whereas only few data are available for the LRT. The objectives were to describe the mosaic structures of the URT and LRT microbiota and their interactions in healthy calves and calves with bronchopneumonia (BP) and to determine if well- known respiratory viruses or bacteria have an impact on the URT and LRT microbiota. Deep nasal swabs (NS) and bronchoalveolar lavages (BAL) were performed in 3 to 5 calves of 23 herds suffering from acute BP and not vaccinated nor treated with antibiotics. Similar samples were taken in healthy calves of 6 similar herds. DNA of calves from the same herd were extracted and pooled for sequencing. The V1-V3 hypervariable region of the bacterial 16S ribosomal RNA gene was

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amplified from the pools and sequenced using the Illumina Hiseq platform. Comparisons and diversity analysis of the bacterial communities based on measures of taxonomic richness (Alpha diversity metrics) and distances between samples (Beta diversity metrics) were done. At the phylum level, the LRT is associated with high relative abundance of Tenericutes, Proteobacteria, and Actinobacteria in clinically healthy calves and Tenericutes, Proteobacteria, and Fusobacteria in BRD affected calves. The URT of the clinically healthy calves was mostly associated with Tenericutes, Proteobacteria, and Actinobacteria and Tenericutes, Bacteroidetes, and Firmicutes in BRD affected calves. At the genus level, Mycosplasma were found to be the most abundant in both URT and LRT across all groups and in both health status. Alpha and beta diversity analyses as well as linear discriminant analysis (LDA) effect size algorithm (LEfSe) and sPLS-regression mode method with PLS-DA projections show significant differences of bacterial communities in terms of taxonomy, richness and diversity between the URT and the LRT. Finally sPLS- regression method was done separately for BAL and NS pools to describe relationships between microbiota of URT and LRT and the presence of bovine respiratory pathogens (BRSV, BPI3, BCoV, M. Haemolytica, P. multocida; h.somni, M. bovis). In the URT the presence of P. multocida and H.somni is associated with an important number of resident bacteria. A negative association was found between the presence of BRSV and BPI3 (association with a small number of bacteria) and the presence of H. somni. In the LRT M. haemolytica is associated with a large number of bacteria, while its absence is associated with the presence of P. multocida and H. somni. The impact of the presence of any of BRSV, BPI3 and or BCOV on the moicrobiota was also investigated.

INTRODUCTION

Bovine respiratory disease (BRD) complex or infectious bronchopneumonia (BP) is a major economic and public health burden (4) that affects young bovines worldwide, with a multifactorial etiology; BP is a complex disease triggered by the presence of one or several viruses and/or bacteria (5) favored by an altered state of the host immune system (6) and usually disturbed environmental factors (7). The severity of BP consequently depends on the causative agents, the host immune response,

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environment factors such as temperatures and biosecurity, and several other physical and biological stressors (6,8,9).

BP pathogens act by initiating a cascade of subsequent events of immune suppression (6,10), damaging the respiratory epithelium (11) and/or altering the local biofilms (12–14) and normal commensal flora thus leading to complex secondary bacterial invasion (12,14,15). The main viruses associated with BP are bovine respiratory syncytial virus (BRSV), bovine parainfluenza type-3 virus (BPI3), bovine coronavirus (BCOV) bovine herpesvirus-1 (BOHV-1), and bovine adenovirus 3. Most of them are able to induce immune suppression leading the way for secondary bacterial infections (16–20). The main bacteria are Pasteurella multocida, Histophilus somni, Mannheimia haemolytica and Mycoplasma bovis. Furthermore

A more recent consideration is the presence in the upper (URT) but also the lower (LRT) respiratory tracts of a very complex network of bacterial species called the “microbiota”, and its potential interaction with BP pathogens. This is particularly true for P. multocida, H. somni, and M. haemolytica which are considered as components of the normal flora of the upper respiratory tract and which may become opportunistic colonizers following several events such as a primary viral infection (21,22). This raises the question of their real role and the way they became virulent.

Determining the structure of the respiratory tract microbiome in health and in pneumonia carries the great potential to advance pulmonary infectious diseases prevention and management. Recent technologies in the field of next generation sequencing (NGS) are allowing us to explore these microbiomes in health and disease conditions and their relationship with the outer environment disturbances and different conditions. NGS studies on the bovine virome and microbiome were recently led in American feedlot young cattle describing the dynamics of the upper respiratory tract bacterial communities (1–3,23–27) and new viral species discoveries (19,20,28,29).

The aim of this study is first to understand the mosaic structures of the upper and also the lower respiratory microbiomes and their associations with pathogens in

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cases of BP of newborn calves and finally to evaluate the impact of a viral infection to the structures of these microbiomes.

MATERIAL AND METHODS

Experimental design

Seventy calves, between 2 to 8 weeks old, from 23 breeding farms of South of France were included in this study, all the calves presented acute signs of bronchopneumonia (BP) and where not vaccinated nor treated with antibiotics prior to sampling. Criteria for BP were the presence of respiratory clinical signs in more than 10% of calves, including hyperthermia (>40°C), tachypnea (respiratory rate >45), dyspnea and abnormal lung sounds (wheezing...) at auscultation, starting from less than two days. In addition to the clinically affected animals, 6 breeding farms free of BP from more than one year and without BP at the time of sampling were selected as control group. The clinically healthy calves originated from similar breeding facilities and the calves were clinically examined before sampling. Equally, the clinically healthy calves were neither treated for antibiotic nor vaccinated. In each farm 3 to 5 calves were sampled by nasal swabs (NS) and bronchoalveolar lavages (BAL) to determine pathogens and microbiota of both upper and lower respiratory tracts (URT and LRT) respectively.

NS was inserted deep in the calf nostril to a depth of 20 cm approximatively and rotated during 30 seconds against the nasal mucosae. Swabs were directly aliquoted in 1 ml PBS and kept on ice for no more than 2 hours until being stocked at -80°C. BALs were performed by bronchoscopy under deep anesthesia (10mg/kg Diazepam and 10mg/kg ketamine, intravenous route). Briefly a plastic rigid and sterile tube was inserted in the buccal cavity up to the larynx and the sterile flexible bronchoscope (Olympus, CF-EL, 1.3 meters long, 7.5 mm internal diameter, Shinjuku, Tokyo, Japan) was introduced in the plastic tube and visually inserted in the trachea via the epiglottis then guided to the first bronchial division corresponding to the caudal segment of the right apical lung lobe. The lung lobe was then lavaged with 100 ml of sterile isotonic saline solution and the liquid was immediately aspirated and refrigerated until treatment. Typically, the BAL procedure took 5 to 10 minutes and

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lung abnormalities (inflammation, fibrinous content) were recorded. BALs were kept on ice for no more than 2 hours until being treated. BALs were processed as follows: 20 mL of BALs were centrifuged at 2000 rpm for 20 minutes to collect supernatant and cells. The rest was directly stored at -80°C. Tube and endoscope were washed and fully disinfected between each farm according the manufacturers recommendations. The sampling was performed in accordance with accepted human standards of animal care (European Community council 2010/63/EU).

Finally individual NS and BAL samples were pooled in an average of 4 samples per pool, where each pool of NS or BAL represents a farm.

Microbial DNA extraction

Microbial DNA extraction was performed from each NS and BAL pool sample using the Qiamp UCP minikit (Qiagen, USA), with the pretreatment protocol of Microbial DNA from Biological Fluids or Cultures followed by a mechanical pre-lysis, according to the manufacturer instructions. Briefly, 400µl of NS liquid and 1500µl of BAL were concentrated by maximum speed centrifugation (13 000 rpm) then mechanically disrupted by vortexing using the Pathogen Lysis Tube (Qiagen, USA) in the presence of beads before being chemically lysed with proteinase K (Qiagen, USA) and 70°C in order to denature the Gram-positive bacterial cell walls. The samples are then transferred onto the QIAamp UCP Mini column (Qiagen, USA) and serially washed before eluting the DNA in 50µl of AVE Buffer. Total DNA concentration was quantified the QubitTM fluorometer (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) and the quality checked with the ratio 260/280nm wavelengths using the ClariostarTM Plate Reader (BMG LABTECH, Germany).

Amplification and Illumina sequencing of the V1-V3 hypervariable region of the 16S rRNA

Microbial DNA was subject to polymerase chain reaction PCR amplification of the V1- V3 hypervariable region of the 16SrRNA gene using the following primers: 27-F (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) and 534-R (ATTACCGCGGCTGCTGG). The generated amplicons were then purified. Adaptors were tagged individually through

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fusion primer PCR according to Illumina instructions. We used the HiseqTM 2500 platform (Illumina, USA). Dual indices and Illumina sequencing adapters were used according to the manufacturer instructions. The sequencing run was conducted using the 2x300bp v2 reagent kit generating 300bp long reads in a paired-end reaction. Our analysis involved two sequencing runs that included the BP and clinically healthy groups separately.

RNA extraction and Real Time qPCR

Specific pathogens detection was done by RTqPCR using the LSI VetMAX Screening pack – Ruminant Respiratory Pathogens real time PCR kit (Life technologies, Grand Island, NY, USA). The following pathogens: M. bovis, H. somni, P. multocida, M. haemolytica, BCOV, BRSV and BPI3 were screened in all our respiratory (NS and BAL) pool samples of clinically healthy and BP affected groups.

Bioinformatics processing, composition and statistical analysis

All sequencing reads generated by the Hiseq were analyzed using the Galaxy workbench implemented workflow FROGS (30). First, raw sequences were pre- processed by merging the paired-end reads with Flash (31), trimming the primers sequences with Cutadapt (32) and deleting the reads with the wrong length, containing ambiguous bases, and not containing the right primers (33). Swarm (34), a clustering algorithm was used to generate OTUs and define the seed sequence for every OTU defined. Chimeras, defined as anomalous sequences formed by different sequences joined together during the PCR were also detected and removed. The resulted OTUs were filtered using a minimum BLAST identity of 98% and sorted according to their sizes. The resulting abundance table formed is affiliated against the Silva123 16S reference database where every OTU seed sequence was taxonomically assigned up to the species level. Finally, the reads were normalized to the level of the poorest library. Bacterial community composition, alpha diversity (Observed, Chao1, and Shannon) and beta diversity (UniFrac and Bray-Curtis) were further calculated using the phyloseq package wrapped into the Galaxy workbench.

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In order to identify taxa displaying significant differences between the upper and lower respiratory tracts in BP group, the abundances values were analyzed using the linear discriminant analysis (LDA) effect size algorithm (LEfSe) (35) implemented in Galaxy workbench (http://galaxy-workbench.toulouse.inra.fr/). The LEfSE algorithm first use the non-parametric factorial Kruskal-Wallis (KW) sum-rank test to detect features with significant differential abundance with respect to the class of interest; biological significance is subsequently investigated using a set of pairwise tests among subclasses using the (unpaired) Wilcoxon rank-sum test. As a last step, LEfSe uses Linear Discriminant Analysis to estimate the effect size of each differentially abundant feature and, if desired by the investigator, to perform dimension reduction.

To further explore the dynamics of the respiratory microbiota in both URT and LRT and to better understand the interactions between the microbiota and the presence of respiratory pathogens, an exploratory analysis was also performed using sPLS- regression mode method. Analyses were done with logarithmic transformations of count tables. To compare NS and BAL samples, sparse PLS-DA (Partial least squares regression (PLS), discriminant version) was performed using paired or unpaired analysis after the individual contribution has been removed with a multilevel approach as implemented in the R package mixOmics. Student test was performed to assess whether the selected variables are differentially abundant between the two conditions tested. Boxplots were performed to display the abundance differences of these bacteria between NS and BAL samples. We also looked at the ajusted p- values using the Benjamini-Hochberg method which controls the False Discovery Rate (FDR, proportion of False Positives in bacteria declared differentially expressed).

To investigate associations between the presence of respiratory pathogens (BRSV, BPI3, BCOV, M. Haemolytica, P. multocida; H.somni, M. bovis) and microbiota in the URT and LRT, an exploratory analysis was performed using PLS-DA and sPLS-DA regression mode method with abundance data as explanatory variables and the presence of pathogens as variables to predict. For each condition NS and BAL samples were analyzed separately. Student tests were performed to assess whether

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the selected variables were differentially abundant between the two conditions tested. All results were considered significant at p < 0.05.

Finally relations between the presence of respiratory virus (BRSV and/or BCOV and/or BPI3) and the microbiota structure was analyzed using the same method (sPLS-regression method with abundance data as explanatory variables and the presence of any of the following viruses-BRSV, BCoV, and/or BPI3- as variables to predict). The analysis was done separately for BAL and NS pools. Student tests were performed to assess whether the selected variables were differentially abundant between the two conditions tested. All results were considered significant at p < 0.05.

RESULTS

RTqPCR detection of respiratory pathogens

The results for the presence of bovine major respiratory pathogens using real-time RT-PCR are summarized in Table 1. The screening included BRSV, BPI3, BCOV, P. multocida, M. haemolytica, and M. bovis. Among the 6 healthy pools, one was lightly positive with P. multocida in the NS, another was also lightly positive with P. multocida in the BAL, a third had the NS positive with P. multocida and the BAL with M. haemolytica. The Cq values in this group ranged between 31 and 35.

Hiseq sequencing data

Pools (N=23) of both NSs and BALs from calves showing signs of acute BP were sequenced using the Illumina Hiseq platform. The run generated around 77 million raw reads from which 61.8 million were kept after the pre-processing and chimeras removal steps. The number of reads per pool ranged between 547.4k and 858,200 reads. 406 bacterial OTUs were identified at the species level after filtering on the 98% identity cutoff, having a size ranging from 224 to 880,500 sequences per OUT (Supplementary data1).

Pools (N=6) of both NSs and BALs from healthy calves were also sequenced using the Illumina Hiseq platform. The run generated around 8.4 million raw reads from which, 4 million were kept after the pre-processing and chimera removal steps. The

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number of reads per sample ranged between 174,000 and 539,000 reads. 308 bacterial OTUs were identified at the species level after filtering on the 98% identity cutoff, having a size ranging from 204 sequences to 393,000 sequences per OUT (Supplementary data 2).

At the genus level, the taxa from the BP sequencing run were clustered in 151 OTU and the taxa from the healthy sequencing run in 144 OTU. In terms of common taxa between the two groups, 101 genera were found to be common (Fig. 1C).

Dominant taxa in the different group of samples in term of relative abundances

The microbial composition in the upper and the lower respiratory tract of the calves exhibiting or not signs of BP are illustrated in Figure 1 (Fig. 1, A & B).

In BP calves, regardless of the sample nature, the most abundant OTUs identified were: Mycoplasma bovirhinis (22.24%), Mycoplasma dispar (18.09%), Cilia- associated respiratory bacterium 246-57 (7.77%), Stenotrophomonas maltophilia (4.42%), an unknown genus of the family Leptotrichiaceae (3.64%), Alcaligenes faecalis (2.84%), an unknown species of the genus Pseudobachtrum (2.64%), Streptococcus pluranimalium (1.97%), Stenotrophomonas sp. (1.42%) and Pseudomonas sp. (1.38%).

In the upper respiratory tract

At the phylum level, differences were observed in relative abundance between BP and healthy farms. The top 5 most abundant OTUs in NS of BP farms were Tenericutes (48.76%), Bacteroidetes (16.48%), Firmicutes (13.62%), Proteobacteria (9.82%), and Actinobacteria (9.24%) while Tenericutes (28.72%), Proteobacteria (20.06%), Actinobacteria (16.88%), Firmicutes (28.07%), and Bacteroidetes (5.16%) were mainly found in control group

At the genus level, the top 10 most abundant OTUs in NS of BP group were Mycoplasma (47.66%), Cilia-associated respiratory bacterium (13.97%), Corynebacterium (5.53%), Streptococcus (4.94%), Moraxella (4.32%),

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Staphylococcus (2.82%), Pasteurella (1.99%), an unknown genus of Leptotrichiaceae family (1.43%), Mannheimia (1.16%), and Ureaplasma (1.07%).

Similar results were found in the healthy group but in a different order of magnitude: Mycoplasma (28.09%), Corynebacterium (12.24%), Streptococcus (10.46%), Neisseria (9.95%), and Enterococcus (5.49%).

At the species level, the top 5 most dominant OTUs in NSs were: Mycoplasma dispar (23.64%), Streptococcus plurianimalium (10.11%), Neisseria dentiae (7.82%), Enterococcus hirae (5.38%), and Mycoplasma bovoculi M165/69 (2.56%). The top 5 most dominant OTUs in the control group were: Mycoplasma bovirhinis (35.5%), Cilia-associated respiratory bacterium (14%), Mycoplasma dispar (10.2%), Streptococcus pluranimalium (4.6%), and an unspecified species of the Corynebacterium genus (2.9%).

In the lower respiratory tract

At the phylum level, by comparison with NS, the composition of the BAL microbiota was characterized by a very low abundance of Firmicutes and a relative high abundance of Proteobacteria. The top 5 most abundant OTUs were Tenericutes (38.45%), Proteobacteria (38.17%), Fusobacteria (7.85%), Bacteroidetes (7.18%), and Actinobacteria (4.91%) in the in BP group and Tenericutes (41.94%), Proteobacteria (38.01%), Actinobacteria (14.65%), Firmicutes (2.78%), and Bacteroidetes (2.19%) in the control group. At the genus level, the 10 most abundant OTUs in BALs of the BP group were Mycoplasma (37.35%), Stenotrophomonas (14.64%), Alcaligenes (7.37%), an unknown genus of Leptotrichiaceae family (5.75%), Pseudochrobactrum (5.16%), Pseudomonas (3.15%), Delftia (2.53%), Achromobacter (2.32%), Fusobacterium (1.84%), and Cilia-associated respiratory bacterium (1.84%). The top 5 most abundant taxa in control group were Mycoplasma (41.97%), Pseudochrobactrum (17.13%), Stenotrophomonas (10.08%), Glutamicibacter (4.36%), and Paeniglutamicibacter (4.27%).

The top 5 most dominant species in BALs of BP were Mycoplasma dispar (25.6%), Mycoplasma bovirhinis (10.4%), Stenotrophomonas maltophilia (8.6%), an

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unspecified species of the Leptotrichiaceae family (6%), and Alcaligenes faecalis (5.6%). The top 5 most dominant OTUs in BAL of control group were Mycoplasma dispar (41.91%), Pseudobactrum sp. (17.11%), Streptococcus plurianimalium (7.94%), Stenotrophomonas maltophilia (4.26%), and Neisseria dentiae (2.89%).

Microbial alpha and beta diversities in the URT and LRT

We then evaluated the variability within and between samples for each condition in NS and BALs. The metrics of alpha diversity were computed using the observed richness index, the Chao1 richness index (ANOVA) and the Shannon diversity index (ANOVA). Results indicated that the microbial richness in NS was significantly (p< 0.01) higher in both groups of calves (BP and clinically healthy) compared to the microbia richness of BALs.

The beta diversity metrics performed on the BP group also showed a clear dissimilarity in taxa diversity between the URT and LRT. First the UniFrac distances wich is a phylogenetic beta diversity metric clearly indicates a taxonomic dissimilarity (MANOVA P=0.0004) between both NS and BAL samples (Fig. 3A). In the clinically healthy group, this dissimilarity was also visible though less prominent (only in Jaccard P=0.0025 and UniFrac P=0.0024 metrics). When Principal Coordinates Analysis (PCoA) was performed on the UniFrac matrix of distances, a clear separation of the NSs and BALs group was obtained in addition to a wide variation between the NSs samples.

Differences in microbial taxa between the URT and LRT of calves with BP

The dissimilarities between the upper and lower respiratory microbiota were first discerned using the Linear Discriminant Analysis (LDA) Effect Size (LEfSe) (Fig. 4). By applying the LEfSe algorithm on relative abundances values, we have identified taxa at the family level that are statistically different among the NS and BAL in both BP and clinically healthy calf groups. In calves with BP, 51 and 11 families were preferentially and statistically associated with the URT and LRT respectively while differences were lower in the healthy calves with respectively 20 and 2 family associated with the URT and LRT. Most families (17/20) found in NS of healthy

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calves were also found preferentially in NS of BP calves. The Flavobacteriacae was statistically associated with NS for healthy calves and BAL for BP calves. The Pasteurellacae family containing major pathogens of BP was preferentially associated with NS only in BP calves.

In BP calves the main bacterial families characterizing the lower respiratory tract included Alcaligenaceae, Brucellaceae, Pseudomonaceae, Comamonadaceae, Bacteroidaceae, Porphyromonadaceae, Flavobacteriaceae, Enterobacteriaceae, Thermoactinomycetaceae, and Caulobacteraceae. Bacterial families characterizing the nasopharyngeal cavity included: Chitinophagaceae, Corynebacteriaceae, Streptococcaceae, Moraxellaceae, Pasteurellaceae, Staphylococcaceae, Sphingomonadaceae, Carnobacteriaceae, Acholeplasmataceae, and Bacteroidales S24_7 group. Other NS specific families included: Actinomycetaceae, Nocardiodaceae, Bacillaceae, Micrococcaceae, Prevotellaceae, Neisseriaceae, Clostridiaceae, Lactobacillacea, and Enterobacillacea.

To further explore the difference between the URT and LRT we used a different biostatistical approach using a sPLS-regression mode method. Analysis with logarithmic transformations of count tables at the genus level and expressed as PLS- DA projection shows a strong separation between NS and BAL samples mainly on the first axis (Fig 5A). When statistical analyses were performed only 6 genus were associated with the NS of BP calves, including Moraxella, Aquamicrobium, Peptocostridium, Caryphanon and Intestinibacter (Fig 5B and 5C).

The microbiota structure dynamics and correlation with major infectious respiratory pathogens

We first identify possible relation between the presences of one of the known infectious respiratory pathogens and the microbiota structure in both URT and LRT of calves with BP using a multivariate analysis on the microbiota abundance values (mixMC framework) (36) and shown as projections using sparse Partial Least Square Discriminant Analysis (sPLS-DA). The abundance data were used as explanatory variables and the results of the RTPCR assay for the respiratory pathogens (Table 1) were used as variables to predict.

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In the URT (Fig. 6A), the first axis is mostly driven by the absence of P. multocida that is associated to a small group of bacteria, while its presence is associated to a larger group of bacteria. The second axis is mostly driven by the opposition between the presence of BPI3 and BRSV that is opposed to the presence of H. somni. The first two viruses are mainly associated to one farm (probably) and to the presence of a small group of bacteria, while H. somni is associated to the presence of another group of bacteria.

In the LRT (Fig. 6B) the first axis is mostly driven by the presence of M. haemolytica (in two samples mainly) that is associated to a large group of bacteria, while its absence is associated to the presence of P. multocida and H. somni and a small group of two bacteria. The second axis is mostly driven by the presence of M. bovis (present in two samples) that is associated to a large group of bacteria while its absence is associated to the presence of BCOV and only one bacterium.

We then further evaluate if the presence of one of the three BCOV, BRSV and BPI3 viruses has an impact on the URT and LRT microbiota structure by using the sPLS- regression method, with abundance data as explanatory variables and the presence of any of the three viruses as variables to predict. In sPLS-DA projection plot, the clusters that represent the projection of the individuals on the first two components and that characterize the presence/absence of the group of viruses are well separated for the URT (Fig. 7A) while separation was less evident in the LRT (Fig. 7B). The contribution plots (Fig. 7C and 7D) display the abundance of taxa and in which status (presence/absence) they are the most abundant in the URT and LRT. For example, it seems that Leucobacter, Gelidibacter, Faecalicoccus, Vagococcus, and Mycoplasma are abundant when a viral infection is present in NS and the opposite for Pseudochrobactrum, Mannheimia, Ochrobactrum, Trueperella, Chryseobacterium, and Helcococcus. To evaluate the significance of the selected bacteria in the process of appearance or absence of these three viruses, Student tests were performed for each of them. The p-values obtained lead to the conclusion that none of the bacteria are found differentially abundant between infected and non- infected samples with this group of viruses in both the URT and LRT.

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A comparison of the relative abundance was then performed for the selected species (Fig 7C and 7D) that are also found in the control samples data. Results (Fig. 8, for 4 taxa) showed that the difference between BP samples with or without the presence of viruses and control samples in terms of relative abundance of common bacteria seems to be insignificant. It appears that the absence or presence of the group of viruses does not affect the quantity of bacteria studied.

DISCUSSION

The respiratory microbiota at equilibrium is considered to be beneficial to the host by modeling the immune system in early life and providing colonization resistance. Perturbation of the equilibrium of the bacterial communities can lead to a weakened resistance, bacterial overgrowth, and unshackling of resident pathogens. This dysbiotic state may lead to a virulent and unbalanced microbiota or “pathobiome”. In bovine respiratory disease, many environmental disturbances can lead to dysbiosis like high density, transportation, and temperature changes. However, the major reason is thought to be infectious. The main objectives of this study were to explore the structure of the microbiota in URT and LRT in clinically healthy calves and calves suffering from BP and to study the effect of a respiratory pathogen on the microbiota structure. The calves sampled in the study originated from 23 different veal breeding farms of the south west of France during the period 2014-2016. In order to not interfere in the microbial composition, the calves were not treated with antibiotics before sampling nor vaccinated. The healthy calves originated from similar facilities were no respiratory symptoms were observed. By comparision with previous US studies, the effect of time wasn’t explored in this study and so the microbiota structure modification. The farm system tested here (moderate density herds with small effectives and extensive environments) with no modifications of management differs from American feedlot breeding system in which the BP occurs after few weeks of the calves’ allotment.

The nasopharyngeal and pulmonary microbial structures were relatively consistent across all the individual samples belonging to the same group (clinically healthy or BP). In the clinically healthy group, the dominant nasopharyngeal phyla were:

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Tenericutes, Proteobacteria, Actinobacteria, Firmicutes, and Bacteroidetes, and dominant genera: Mycoplasma, Corynebacterium, Streptococcus, Neisseria, and Enterococcus. Whereas the dominant bronchoalveolar phyla were Tenericutes, Proteobacteria, Actinobacteria, Firmicutes, and Bacteroidetes, and dominant genera: Mycoplasma, Pseudochrobactrum, Stenotrophomonas, Glutamicibacter, and Paeniglutamicibacter.

In the BP group, the dominant nasopharyngeal phyla were: Tenericutes, Bacteroidetes, Firmicutes, Proteobacteria, and Actinobacteria, and dominant genera: Mycoplasma, Cilia-associated respiratory bacterium, Corynebacterium, Streptococcus, and Moraxella. Whereas the dominant bronchoalveolar phyla were Tenericutes, Proteobacteria, Fusobacteria, Bacteroidetes, and Actinobacteria and dominant genera: Mycoplasma, Stenotrophomonas, Alcaligenes, an unknown genus of Leptotrichiaceae family, and Pseudochrobactrum.

Compared to other studies (1–3,24–27), our finding seems to be comparable at the phylum level suggesting the presence of a consensus “normal” URT microbiota composed of the phyla: Firmicutes, Proteobacteria, Tenericutes, Actinobacteria, and Bacteroidetes and that of the LRT: Bacteroidetes, Proteobacteria, Fusobacteria, and Firmicutes. However, this is not the case at the genus level in both URT and LRT. In fact, except from Mycoplasma which is the ubiquitous genus across all studies in the nasopharyngeal cavities during health and disease, no consensus microbiota could be established. The explication of this variation seems to be linked with the different environments and rearing conditions of the animals in every study. Actually, the microbial ecosystem is thought to be shaped by a combination of selective and random events, where the pressure exerted by the environment, as well as the physico-chemical conditions are at the origin of the structure of the different microbiomes in each part of the respiratory tree (de Steenhuijsen Piters et al., 2015).

A particular observation in our samples was the high abundances of Mycoplasma bovirhinis and Mycoplasma dispar. Mycoplasmas belong to the Mycoplasmataceae family of the Mollicutes phylum. The genus Mycoplasma comprises about 100 species, 40 of which are isolated from ruminants. The major pathogenic species in

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cattle are M. mycoides subsp. mycoides responsible for contagious bovine pleuropneumonia (CBPP) but not present in EU and Mycoplasma bovis, an agent of BP. In France, M. bovis pneumonia is mainly found in beef and veal cattle farms (37) and its presence appears to correlate with the occurrence of pneumonia since the bacterium is isolated only from the lungs of animals with chronic and acute respiratory clinical signs (38). On the other hand, Mycoplasma dispar and Mycoplasma bovirhinis (39) are established commensal residents of the upper respiratory cavities of cattle. The loads of M. dispar in the respiratory system increases significantly during BP, but this relationship is considered associative and not causative (40). In addition, M. dispar was not revealed as a pathogenic agent as demonstrated during an experimental infection (41).

Diversity was compared between the two sites in every group, at the phylum level. The most abundant taxa in clinically healthy URT and LRT were composed of Tenericutes, Proteobacteria, and Actinobacteria. In BP group, the dominant phyla were Tenericutes, Bacteroidetes, and Firmicutes in the URT while in the LRT the dominant phyla were Tenericutes, Proteobacteria, and Fusobacteria. While the structure in healthy calves seems to be identical in both sites at the phylum level, a divergence starts to appear while descending the taxonomical level. For a better clarity, biodiversity metrics (alpha and beta) were calculated; the microbiota of the nasopharyngeal cavity was clearly ecologically richer than those of the lungs in both health and diseased animals. When compared together (beta diversity metrics), both sites (URT and LRT) in a same group showed very distinctive ecosystems. When UniFrac metric was used to compare the ecosystems in the NS and BAL samples in the same groups, the matrix of values showed a very significant dissimilarity between the URT and LRT mostly noticed in BP group. This disparity in healthy conditions was also demonstrated by Zeineldine et al. (26). Being explored by two different runs of NGS sequencing, the abundances results of both BP and health groups couldn’t be compared together, so being not the same, differences in microbial diversities between healthy and affected calves weren’t computed.

Studies on the synergistic and antagonistic relationships between bacteria in bovine pneumonia are scarce. In humans, these interactions are described between

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commensal bacteria that colonize the respiratory tract and those considered pathogenic or between the pathogenic bacteria themselves (42,43). Positive associations exist when one microorganism promotes the presence and survival of another through mechanisms of mutualism, commensalism or symbiosis, or by means that help to evade the host's immune system. Negative associations are due to interactions of amensalism (antagonism) or predation between competing bacterial species in the same habitat or when the immune system indirectly favors the presence of a species. These mechanisms include: the production of hydrogen peroxide (H2O2) by resistant bacteria for the elimination of competing species (44), biochemical reactions leading to the destruction of surface proteins needed for adhesion to the epithelium of competing bacteria (45), and modulation of the immune system to cause clearance of competing species (46).

In bovine respiratory pathology, several studies suggest a beneficial effect of the Lactobacillaceae and Bacillaceae families, where the abundance of members of these families was correlated with an inhibitory effect or a decline in the abundance of established pathogenic bacteria (2,47,48). In the present study, Lactobacillaceae and Bacillaceae families were almost exclusively present in the nasopharyngeal cavities, and no specific correlation patterns or significant shifts in abundances were noticed. The relative abundances of Lactobacillaceae taxa in the nasopharyngeal samples of clinically healthy group and the BP group were 0.22% and 0.14% respectively and 0.04% and 0.03% for the Bacillaceae family.

In the present study, we’ve first used the LEfSE algorithm in order to identify statistically different OTUs between the NS and BAL samples in each group. Chitinophagaceae, Corynebacteriaceae, Streptococcacea, Moraxellaceae, and Pasteurellaceae were the families statistically related to the URT in the BP group. Very little is known about the Cilia-associated respiratory bacillus (CAR) from the Chitinophagaceae family (now reclassified as Filobacteriaceae). However, the few available studies suggest their presence in the respiratory tract of cattle (49,50) as well as in wild red deer, roe deer and chamois in northern Italy (51). Besides, a correlation with inflammatory lesions in the tracheal epithelium in veal calves and adult cattle has been suspected (52). In the present study, CAR was shown to be

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one of the most abundant taxa in the nasopharyngeal cavities in the BP affected calves and the Chitinophagaceae family as the most related to the URT in the same group. These findings should drive us to investigate more closely the role of CAR in the respiratory disease in cattle.

Stenotrophomonas maltophilia is a non-fermenting ubiquitous Gram-negative bacilli found in a wide range of environmental habitats (53). With an increasing reputation as a lower respiratory tract pathogen in human, the infection with S. matophilia is associated with high morbidity and mortality in severely immunocompromised and debilitated individuals. On the other hand, S. matophilia infection is considered as nosocomial due to it is ability to colonize and to forming biofilms in all kinds of surfaces especially in medical equipment, (53–55). Moreover, several studies designate S. matophilia as a contaminant of bronchoscopes (56,57), so whether its presence in the lower respiratory tract is real or due to the presence of biofilms in the used material is subject to further investigations.

Principal Component Analysis (PCA) is a multidimensional descriptive method that allows exploring the links between variables and the similarities between individuals. The objective of the PCA is to identify the largest sources of variation and to project the data into a space of reduce dimension by maximizing the variability of the projection. In other words, PCA reduces the number of variables, in this way the information becomes less redundant. To better understand the similarities between samples in both respiratory tract sites, the sparse PLS-DA was further performed. As seen in the circle plot of the NS samples, several associations were noticed; M. bovis was associated with P. multocida and less tightly with a group of taxa formed by the genera Streptomyces, Rhodococcus, Variovorax, Sphingomonas, and Agreia. As for M. haemolytica, it was associated with Murdochiella, and H. somni was associated with Plonomicrobium sp., the genera Histophilus, Pasteurella and Mannheimia. The latter three genera are members of the Pasteurellaceae family and are established commensals of the nasopharynx mucosa and asymptomatic carriage in cattle. This family is quite known in the context of bacterial superinfections following respiratory infections primed by viruses or by mycoplasmas. This exact phenomenon was noticed in vitro by Corbeil et al. (1985) (47). In this study, resident respiratory flora

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was shown to enhance or inhibit the growth of M. haemolytica, P. multocida, and H. somni isolates. Also in the same study of Corbeil et al., most isolates of the respiratory flora were beneficial to Pasteurella growth, including the genera Micrococcus, Corynebacterium and Staphylococcus.

Similarly, the statistical interpretation in our study shows an opposition (inverse correlation) between the presence of BPI3 and BRSV on one hand and that of Histophilus somni on the other hand. It has been shown that H. somni stimulates the expression of antiviral proteins and inhibits the replication of BRSV in vitro in epithelial cells (Lin, 2016). In this same study, the supernatant of H. somni culture induced an overexpression of the transcription of different antiviral protein genes (IFIH1, ISG15, MX1, and RSAD2) once added to the culture of BAT2 cells.

The BRSV and BPI3, on the other hand, are tightly associated together and with several bacteria in addition to BCoV. The same analysis was however less conclusive in the bronchoalveolar samples.

Similarly, the virus-bacteria interactions in the pathogenesis of bovine respiratory infections are not fully understood. The most known mechanism during a virus- bacteria co-infection is the ability of respiratory viruses to impede the immune response of the host thereby promoting bacterial proliferation. Examples of this mechanism are the blocking of the expression of certain MHC receptors by the BoHV1 (58), the decrease in phagocytosis following BPI3 infection (59), and sometimes a complete evasion from the immune response, a very well-known mechanism of the BRSV (60, 61). In the present study, we tried to determine the potential relationships between the presence of a virus on the structure of the microbiota in the URT and LRT using the principal component analysis. Many of the bacterial genera revealed by the analysis are not known in bovine respiratory pathology and their possible interactions with one of the defined viruses, in any way, must be further investigated. Despite not statistically significant, the genus Mannheimia interestingly showed an increased abundance in the absence of a virus in the nasopharyngeal cavities, same for the genus Trueperella. In contrast, the genus Mycoplasma was revealed more abundant during a virus infection, M. bovis

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showed also the same pattern when the analysis was done on the species level (data not shown). The same analysis was less conclusive in the lower respiratory tract.

CONCLUSION

As a conclusion, the microbial ecology of the calves in health and during BP seems to be diverse with a clear distinct structure of the microbiota observed between the upper and lower respiratory tracts. The genus Mycoplasma was omnipresent in both clinically healthy and affected groups in both respiratory sites. Some patterned relationships were observed, notably between the presence of a known respiratory pathogen (bacteria or virus) and the respiratory structure of either the URT or the LRT microbiomes, raising the question of how these pathogens interact between themselves and with the resident microbiota.

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163

FIGURE LEGENDS

Figure 1: Relative abundance of bacterial 16S rRNA gene sequences at the phylum in BAL and NS of calves with (A) or without (B) BP. (C) Venn diagram of unique and common taxa at the genus level between BP and clinically healthy calves with no regard of sample nature (NS or BAL), 101 bacterial genera were found to be common in the two groups.

Figure 2: The alpha diversity metrics (Observed richness, Chao1, and Shannon) distribution in function of the sample nature: NS or BAL in calves with (A) or without (B) BP. The observed richness index is a qualitative metric of OTU present in each habitat, it is considered as a computation of the OTUs regardless of the relative abundance. Chao1 richness index (ANOVA) is a nonparametric estimator of the minimum richness and is based on the number of rare OTUs (singletons and doublets) within a sample. The Shannon diversity index (ANOVA) accounts for both richness and abundance in a single value of evenness, reflectes our ability to identify all present OTUs in the samples.

Figure 3: A) Distances matrix computed using the UniFrac distances according to the sample type (NS and BAL pairs of samples), Dissimilarity is clear (P = 0.0001) between the NS and the BAL pools. B) Principal Coordinates Analysis (PCoA) performed on the UniFrac matrix of distances, each point on the graph represents the entire microbiome of a single sample and each axis reflects the percent of variation between the samples, samples that cluster together have similar microbial community profiles. The UniFrac distance between a pair of samples (e.g. NS1 and BAL1) is defined as: unique branch length/observed branch length, where the unique branch length only leads to OTU(s) observed in sample NS1 or sample BAL1 and the observed branch length represents the total branch length observed in either sample NS1 or sample BAL1. C

Figure 4: LEfSe plots displaying bacterial families with significantly different abundance between the nasal (NS) and bronchoalveolar lavage (BAL) samples (LDA score log10 ≥ 2.0) in clinically healthy (A) and BP (B) pools. Differences are

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represented in the color of the most abundant class (red indicating BAL, Green indicating NS).

Figure 5: Differences of bacteria genus between the URT and LRT of BP calves using a sPLS-regression mode method. A) PLS-DA projection shows a strong separation between NS and BAL samples. B) Taxa (genus level) that were statistically associated with the URT. C) example of a box plot for the Moraxella genus in BP and clinically healthy calves

Figure 6: the projection of the variables selected by sPLS onto correlation circles. A) Represents the detected associations between respiratory pathogens and the microbiota in NS, while B) represents the detected associations between respiratory pathogens and the microbiota in BAL.

Figure 7: Contribution of BRSV, BPI3, and BCoV viruses on the URT and LRT microbiota. The virus group was defined and used as a target for prediction. Differences of bacteria genus taxa between the presence (1)/absence (0) of the group of viruses in the URT (A) and LRT (B) using a sPLS-regression mode method (PLS-DA projection). The contribution plots displaying the abundance of each bacterial genus and in which status (presence/absence) they are the most abundant in respiratory samples B) Nasal swabs and C) Bronchoalveolar lavages. The outcome 0 (in blue) indicates a contribution of the absence of a virus on the abundance of the bacterial genus. The outcome 1 (in orange) indicates a contribution of the presence of a virus on the abundance of the bacterial genus.

Figure 8: Boxplots of selected bacteria distributions for Leucobacter, Pseudochrobatum, Corynebacterium confusum and Gelidibacter in control and BP calves with or without presence of the group of viruses.

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Figure 1:

166

Figure 2:

A) Calves with BP B) Healthy calves

Figure 3:

A) B) B )

167

Figure 4 B) Calves with BRD

A) Clinically healthy calves

168

Figure 5: A)

B) C)

Figure6: B A) B) )

169

Figure 7:

A) B)

C) D)

170

Figure 8:

171

Table 1: Presence of respiratory major pathogens in the BP group as determined by real time using the LSI Vetmax screening kit.

bRSV1 bPI-32 BCoV3 P.m4 M.h5 M.b6 H.s7

Id BAL8 NS9 BAL NS BAL NS BAL NS BAL NS BAL NS BAL NS

ICSA-1 P10 p p p p p

ICSA-3 p p p

ICSA-4 p p p p p p p

ICSA-6 p

ICSA-7 p p p p p

ICSA-9 p p p

ICSA-10 p p p p

ICSA-11 p p p p p

ICSA-15 p p p p p p p

ICSA-16 p p p

ICSA-17 p p p

ICSA-18 p p p p

ICSA-19 p p p p p

ICSA-20 p p p p p p

ICSA-21 p p p p p p p

ICSA-23 p p p p p

ICSA-24 p p p p

172

ICSA-25 p p p p p p p

ICSA-26 p p p

ICSA-28 p p p

ICSA-29 p

ICSA-30 p p p p

ICSA-31 p p p p

1BRSV: Bovine respiratory syncytial virus, 2BPI-3: Bovine parainfluenza-3 virus, 3BCoV: Bovine coronavirus, 4P.m:

Pasteurella multocida, 5M.h: Mannheimia haemolytica, 6M.b: Mycoplasma bovis, 7H.s: Histophilus somni, 8BAL: bronchoalveolar lavage and 9NS: nasal swabs, 10p : present.

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Résultats et discussion

La structure microbienne nasopharyngée et pulmonaire était relativement constante dans tous les échantillons individuels appartenant au même groupe (cliniquement sain ou BP). Dans le groupe cliniquement sain, les phylums (embranchement) nasopharyngés dominants étaient : Tenericutes, Proteobacteries, Actinobacteries, Firmicutes et Bacteroidetes. Et les genres dominants étaient : Mycoplasma, Corynebacterium, Streptococcus, Neisseria et Enterococcus. Alors que les phylums broncho-alvéolaires dominants étaient : Tenericutes, Proteobacteria, Actinobactaria, Firmicutes et Bacteroidetes. Et les genres dominants étaient cette fois : Mycoplasma, Pseudochrobactrum, Stenotrophomonas, Glutamicibacter et Paeniglutamicibacter.

Dans le groupe de veaux atteints par la BPI, les phylums nasopharyngés dominants étaient : Tenericutes, Bacteroidetes, Firmicutes, Proteobacteria et Actinobacteria ; les genres dominants : Mycoplasma, Cilia-associated respiratory bacterium, Corynebacterium, Streptococcus et Moraxella. En parallèle, les phylums broncho-alvéolaires dominants étaient : Tenericutes, Proteobacteria, Fusobacteria, Bacteroidetes et Actinobacteria ; et les genres dominants : Mycoplasma, Stenotrophomonas, Alcaligenes, ainsi qu’un genre non déterminé de la famille Leptotrichiaceae et Pseudochrobactrum. Une observation particulière dans cette étude a été la forte abondance de Mycoplasma bovirhinis et de Mycoplasma dispar.

Alors que la structure chez les veaux en bonne santé semble être identique dans les deux sites au niveau de l'embranchement, une divergence apparaît aux niveaux taxonomiques les plus précis. Pour une meilleure clarté, des mesures de la biodiversité (alpha et beta) ont été calculées ; le microbiote de la cavité nasopharyngienne était clairement écologiquement plus riche que celui des poumons indépendamment de l’état de santé. Comparés ensemble, les indices de beta diversité des deux sites (ENP et BAL) dans un même groupe présentaient des écosystèmes très distincts, cette différence était bien prononcée lors de la BPI.

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Dans cette étude, nous avons utilisé l'algorithme LEfSe afin d'identifier des OTU statistiquement différentes entre les échantillons nasopharyngiens et broncho-alvéolaires dans chaque groupe. Les familles Chitinophagaceae, Corynebacteriaceae, Streptococcacea, Moraxellaceae et Pasteurellaceae étaient statistiquement corrélées à la cavité nasopharyngée chez les animaux du groupe BPI. Le Cilia-associated respiratory bacterium (CAR) était l'un des taxons les plus abondants dans les cavités nasopharyngiennes des veaux BPI, ainsi, la famille des Chitinophagaceae était la plus apparentée aux cavités nasopharyngiennes dans le même groupe. Ces résultats devraient nous inciter à examiner de plus près le rôle de cette bactérie dans la maladie respiratoire chez les bovins.

Plusieurs associations ont été observées à l’aide de PLS-DA ; M. bovis était associé à P. multocida et moins étroitement à un groupe de taxons formés par les genres Streptomyces, Rhodococcus, Variovorax, Sphingomonas et Agreia. Quant à M. haemolytica, il était associé à Murdochiella, et H. somni était associé à Plonomicrobium sp., aux genres Histophilus, Pasteurella et Mannheimia. D'autre part, le BRSV et le BPI3 sont étroitement associés entre eux et avec plusieurs bactéries en plus du BCoV, une observation déjà formulée dans les résultats du chapitre « identification des virus respiratoires bovins ».

Des associations potentielles entre la présence d'un virus sur la structure du microbiote dans les voies respiratoires supérieures et inférieures ont été recherchées. Curieusement, le genre Mannheimia a montré une augmentation de l'abondance en l'absence de virus dans les cavités du nasopharynx, de même pour le genre Trueperella. En revanche, le genre Mycoplasma s'est révélé plus abondant lors d'une infection virale.

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CHAPITRE 3 : L’INFLUENZAVIRUS DE TYPE D : REPARTITION GEOGRAPHIQUE ET POUVOIR PATHOGENE

I. Introduction

Suite à la découverte du virus de l’IDV aux USA, l’équipe virologie (IHVV) de l’Unité Mixte de Recherche Interactions Hôtes – Agents pathogènes 1225 (Toulouse France) a décidé de rechercher si le virus était présent dans la population bovine en France. En bilan, des prélèvements respiratoires (n=134) ont été analysés pour recherche d’IDV, 6 échantillons soit 4,5% des prélèvements, se sont avérés positifs par RT-qPCR (208).

Cette première description de l’IDV en Europe a très vite été suivie par son identification en Asie et dans différents pays d’Amérique du Nord et Centrale. Dans la mesure où aucune donnée n’existait pour le continent Africain, nous nous sommes très vite concentrés sur sa présence dans ce continent, qui présente une diversité animale très riche et une niche de maladie infectieuses de nature variée. Dans le cadre de cette étude, 2083 échantillons de sérums collectés entre 1991 et 2015 sur des bovins, des porcs, des petits ruminants et des dromadaires au Maroc (n=200), au Bénin (n= 308), au Togo (n=540), au Kenya (n=1231), et en Côte d’Ivoire (n=203) ont été testés pour détecter la présence d’anticorps anti IDV, par technique IHA ainsi que par séroneutralisation. Les antigènes utilisés pour ces tests étaient les souches D/bovine/Nebraska/9-5/2012 et la souche française récente D/bovine/France/5920/2014. Cette dernière a été isolée sur un fragment de poumons d’un veau mort suite à une atteinte de BPI en Bourgogne en 2014. Cet échantillon faisait partie des échantillons positifs en RT-qPCR de l’étude de Ducatez et al. 2015 (208).

Par ailleurs, lors des premières détections d’IDV en France nous avons observé des co-infections avec le BRSV, le BoHV-1, P. multocida, M. haemolytica

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et H. somni dans 4 prélèvements alors que pour 2 prélèvements collectés en 2014 seul l’IDV était détecté. Ces prélèvements provenant d’animaux morts ou gravement atteints de BPI, nous nous sommes alors posé la question du pouvoir pathogène d’IDV. L’hypothèse d’un pouvoir pathogène respiratoire de l’IDV était confortée par les études réalisées aux USA notamment. Si le virus était historiquement isolé chez le porc, les études épidémiologiques montraient clairement que l’hôte principal de l’IDV est le bovin (Hause et al., 2014). Par ailleurs les analyses statistiques effectuées dans les études de métagénomique de Mitra (180) et de Ng (76) montraient une corrélation entre la présence du génome de l’IDV et la présence de BPI chez les veaux prélevés. De même la fréquence de détection de l’IDV était statiquement plus importante chez les veaux atteints de BPI.

Si l’IDV était étroitement associé aux BPI, l’importance de son pouvoir pathogène n’était pas connue. Comme nous l’avons vu dans la partie bibliographique les BPI sont des maladies multifactorielles mettant en cause des facteurs de risques liés à la conduite d’élevage et à l’environnement et essentiellement des agents infectieux comme des bactéries, virus ou parasites. Les virus impliqués dans les BPI sont nombreux et leurs mécanismes d’action variés. Leur pouvoir pathogène est quelquefois considéré comme modéré, on parle alors souvent d’agents initiateurs qui favorisent les infections bactériennes. Même si cette assertion est réductrice, la dysbiose du microbiote représente l’étape inévitable qui aggrave la situation. Il est aussi possible que les virus respiratoires exercent leurs pouvoirs pathogènes lorsqu’ils sont associés, comme cela est le cas dans 4 de nos 6 premiers prélèvements positifs à l’IDV.

Afin de mieux comprendre le rôle de l’IDV dans le syndrome respiratoire chez les bovins, une infection expérimentale a été faite dans les limites des consignes de l’éthique et le bien-être animal.

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II. Article : « Serologic evidence for influenza C and D virus among ruminants and Camelids, Africa, 1991-2015 »

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Résultats et discussion

Les résultats des sérologies étaient similaires quel que soit la souche utilisée. Les résultats montrent que le virus IDV circule dans le Nord et l’Ouest de l’Afrique depuis au moins 2012. En effet, des anticorps ont été détectés chez des bovins au Maroc entre 2012 et 2015, chez des bovins au Togo et au Bénin depuis 2014, ainsi que chez des petits ruminants au Togo depuis 2013. Il semblerait de plus que l’infection progresse puisque les taux de prévalence chez les bovins augmentent au fil des années (23%, 41%, et 42% de séroprévalence au Maroc en 2013, 2014, et 2015 respectivement ; 0% et 21% de séroprévalence au Togo en 2009 et 2015 respectivement). Aucun des échantillons prélevés au Bénin sur des porcs et des petits ruminants ne s’est révélé séropositif vis-à-vis de l’IDV. Seuls 2% des bovins béninois (n=207) étaient séropositifs pour IDV. Concernant le Kenya, les échantillons de bovins testés se sont tous avérés séronégatifs. Par contre, les résultats sur des échantillons de dromadaires montrent que presque tous les animaux avaient des anticorps anti-IDV ou anti-ICV, qu'il y avait une réactivité croisée chez les dromadaires entre les deux virus et que 9% des échantillons avaient des anticorps anti-ICV. Les dromadaires pourraient donc être un hôte nouvellement découvert pour ICV, et éventuellement pour IDV.

L’ensemble des résultats suggère qu’IDV est un virus répandu dans le monde. La détection d'anticorps contre l'IDV chez les ruminants en Afrique soulève la question de l'origine et de la voie de transmission du virus, de son pouvoir pathogène et de son tropisme d’hôte. De même ces données permettront de mieux comprendre la dynamique d’évolution dans l’espace de ce virus.

Lors de la découverte de l’IDV en France, les questions portaient sur l’origine de l’IDV en France par rapport aux souches américaines. Les bovins français ont-ils été contaminés par leurs congénères Nord-américains ou vice versa ? Y a-t-il eu une co-évolution ? Les différentes souches proviennent-elles de sites distincts ou bien d’hôtes différents ? Compte tenu des données récentes d’identification, des restrictions aux échanges de bovins entre les différents pays identifiés, on peut supposer une co-évolution de ce virus sur les différents continents.

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III. Article : « Pathogenesis, host innate immune response and aerosol transmission of influenza D virus in cattle »

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Pathogenesis, host innate immune response and aerosol transmission of Influenza D virus in cattle

Elias Salem,a Sara Hägglund,b Hervé Cassard,c Tifène Corre,a Katarina Näslund,d Charlotte Foret,a David Gauthier,e, Anne Pinard,e Maxence Delverdier,a,c Siamak Zohari,b,d Jean-François Valarcher,b Mariette Ducatez,a and Gilles Meyer,a,c *

a IHAP, UMR1225, Université de Toulouse, INRA, ENVT, Toulouse, France ; b Swedish University of Agricultural Sciences, Host Pathogen Interaction Group, Department of Clinical Sciences, Uppsala, Sweden; c Université de Toulouse, Ecole Vétérinaire de Toulouse (ENVT), 31076 Toulouse cedex 03 ; d Department of Virology, Immunobiology and Parasitology, National Veterinary Institute, Uppsala, Sweden; e INRA, UE 1277, Experimental Infectiology Platform (PFIE), INRA-Val de Loire research Centre, Nouzilly, France

* [email protected]

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ABSTRACT

The recently discovered influenza D virus (IDV) of the Orthomyxoviridae family has so far been detected in swine and ruminants on four continents, confirming a worldwide distribution. Cattle are considered to be the primary host and reservoir and previous studies suggested a tropism of IDV for the upper respiratory tract and a putative role in the Bovine Respiratory Disease complex. This study aimed to characterize host pathogen interactions and the pathogenicity of IDV in naive calves, as well as the ability of this virus to transmit by air. Eight naive calves were infected by aerosol with a recent French strain (D/bovine/France/5920/2014) and were housed in one pen. Three non-infected contact animals were housed in the same unit but 3 meters apart from this pen, and five non-infected calves were housed in a separate unit. The level of viral replication, pathology and innate and adaptive immune responses were studied, and air samples were analyzed for IDV-RNA. The virus replicated in the epithelial cells of the bronchioles and caused moderate lesions of interstitial pneumonia and moderate dyspnea. Analyses of bronchoalveolar lavages indicated the induction of overexpression of pathogen recognition receptors and the chemokines CCL2, CCL3 and CCL4 in the lower respiratory tract, but without overexpression of genes involved in the interferon type I pathway. It was demonstrated that IDV can be airborne transmitted and infect naïve contact calves on short distances. These results suggest that IDV is a respiratory virus with moderate pathogenicity and probably a high level of transmission.

IMPORTANCE

Influenza D virus (IDV), a new Genus of the Orthomyxoviridae family, has a broad

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geographical distribution and can infect several animal species. Cattle are so far considered as the primary host for IDV, but the pathogenicity and the prevalence of this virus is still unclear. We demonstrated that under experimental conditions (in a controlled environment and in the absence of co-infecting pathogens), IDV is able to cause mild to moderate disease and targets both the upper and lower respiratory tract. The virus can transmit by direct as well as aerosol contacts. While this study evidenced overexpression of pathogen recognition receptors and chemokines in the lower respiratory tract, IDV-specific IgG1 production as early as 10 days post challenge, and likely both Th1 and Th2 responses, further studies are warranted to better understand the immune responses triggered by IDV and the role of the virus as part of the Bovine Respiratory Disease complex.

KEYWORDS: influenzavirus D, cattle, BRD, respiratory, pathogenicity

INTRODUCTION

The bovine respiratory disease (BRD) complex is a significant economic and public health burden (1) that affects young bovines worldwide. BRD is triggered by the presence of one or several viruses and/or bacteria (2) that are favored by a set of predisposing factors such as altered state of the host immune system (3) and environmental factors (4). Respiratory viruses may induce the disease alone, such as

Bovine Respiratory Syncytial Virus (BRSV), or cause disease by initiating a cascade of subsequent events of immune suppression (3,5), damaging the respiratory epithelium (6), the airway clearance mechanisms (7) and altering the local biofilms

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(8–10) and normal commensal flora thus leading to complex secondary bacterial invasion (8,10,11). Several viruses are thought to initiate and contribute to BRD, including BRSV, bovine parainfluenza type-3 virus (BPI3), bovine coronavirus

(BCoV), bovine herpesvirus-1 (BoHV-1) and bovine viral diarrhea virus (BVDV).

Recently a new virus, now called influenza D virus (IDV) was identified in the USA in

2011, first in swine (12) and then in cattle (13) with respiratory disease. IDV is an enveloped single-stranded negative-sense RNA virus of the Orthomyxoviridae family.

Like influenza C virus (ICV), the IDV genome is divided into seven segments whereas influenza A and B genomes are divided into eight segments (12,13). The genetic identity on the whole genome between ICV and IDV only reaches 52% and the two viruses are not able to reassort together (14). In addition, IDV was unable to cross-react with ICV positive sera. These three points lead to classification of the novel IDV in a new genus then in the Deltainfluenzavirus genus of Orthomyxoviridae family (13).

Since its discovery, both IDV and anti-IDV antibodies were successively detected in

North and Central America, Europe, Asia and Africa (12,14–21). While IDV is thought to be circulating among several mammalian species (14), cattle are considered to be the primary host and reservoir. First, IDV was isolated in many occasions from bovine respiratory samples, and high seroprevalence and virus prevalence within bovine herds were recorded globally (12,17,21–23). Furthermore, detection of IDV in the respiratory tract of cattle during BRD suggest that it could be a virus contributing to this major complex (24,25). However, since IDV was isolated from calves without

BRD, its pathogenicity in cattle remains unclear. Two recent studies of IDV pathogenesis suggested that calves experimentally infected with strains isolated in

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the USA (25,26) showed mild clinical signs of respiratory disease along with virus replication and lesions mainly restricted to the upper respiratory tract (URT). One study also clearly demonstrated that IDV is transmitted by direct close contact between calves (26).

The French IDV D/bovine/France/5920/2014 (IDV 5920) strain was recently isolated from the lower respiratory tract (LRT) of a calf suffering from BRD. Other classic respiratory viruses or bacteria were not detected (16) and this suggests that IDV

5920 may replicate in the LRT and induce clinical respiratory signs. Based on this virus, we developed a new calf model to i) attempt to reproduce clinical signs in the

LRT, ii) study the viral replication, the viral tropism and the pathology, iii) characterize local and systemic immune responses, and v) investigate if this virus could be transmitted by airborne route at a short distance.

RESULTS

IDV induces moderate clinical signs and pathology in both URT and LRT

After challenge and throughout the entire experiment (Fig. 1), no clinical signs

(Clinical score (CS) < 1, clinical cutoff) were observed in calves in the control and contact groups, except in one control calf at D12 and D13. This calf showed signs of apathy, loss of appetite and difficulties to walk due to arthritis in one stifle, but no respiratory signs were observed. This animal recovered after antibiotic treatment. For the five calves infected with IDV 5920 and euthanized at the end of experimentation,

clinical scores (CS)

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accumulated CS of 13.5 and 16) to moderate (Calves no. 7142, 7165 and 7180, accumulated CS of 33, 33.5 and 63) respiratory clinical signs. The average CS at D7,

D8 and D9 were significantly higher in infected animals compared to in the controls

(P<0.0001 at D7 and D8, P>0.05 at D9) (Fig. 2A). Moreover, the mean accumulated

CS were higher for the 5 infected animals compared to controls (Fig. 2B), although no statistical significance could be demonstrated. Mild clinical signs of respiratory disease included some spontaneous coughing and slight tachypnea (35-40 breaths/minute). Moderate respiratory signs, observed between D5 and D8, were characterized by repeated spontaneous coughing, abdominal dyspnea with increased respiratory rates (between 35 and 65 breaths/minute) and abnormal lung sounds (wheezing) but without consequences on appetite or general state. No hyperthermia was detected in any of the infected animals and all calves recovered by

D12.

Similarly, three inoculated calves were euthanized at D8. At this date calf 6533 showed major respiratory clinical signs (Clinical score of 6.5, starting at D4) while calves 6531 and 7144 were only mildly affected (CS of 2 starting at D6). These animals had macroscopic lung lesions characterized by patchy areas of atelectasis with deep red texture. The lesions were restricted to the cranial right lobe and covered about 5-10% of the entire lung surface for two calves (no. 6531 and 6533) and less than 5% for the last one (calf n°. 7144). No gross lesions were found in nasal cavities, larynx and trachea. At D22 and D23 (end of the experiment), no macroscopic lesions were observed in any animal, except in one infected calf (no.

7165) which showed fibrinous and necrotic pleuro-pneumonia with several abscesses in the cranial lobes. Bacteriology indicated the presence of Trueperella pyogenes, a

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bacterium typically involved in secondary respiratory infection of calves.

Histological examination was performed for all calves on olfactory bulb, nasal mucosa, trachea, mediastinal and tracheal lymph nodes and lung tissue sections with gross lesions when present, collected from the right and left cranial, the intermediate and the right and left caudal lobes. Microscopic lesions with light distribution ((3 or less lesion foci for a sample) were observed in the nasal mucosa and the right cranial lobe of 2 infected calves euthanized at D8 (no. 6531 and 6533), and in the right cranial and accessory lobes of the lung of two infected calves euthanized at D22 (no.

7147 and 7165). No microscopic lesions were observed in the lung paremchym from other lobes. At D8 of euthanasia calf 6533 showed major respiratory clinical signs

(Clinical score of 6.5, starting at D4) while calf 6531 was only mildly affected (CS of

2). The lesions characterized those of a subacute rhinitis (infiltration of the lamina propria by mononuclear cells in nasal epithelium) and a subacute bronchointerstitial pneumonia (neutrophils in bronchial lumens, neutrophilic and macrophagic alveolitis, peribronchial and septal lymphoplasmocytic infiltration in the lung, respectively).

IDV replicates in both URT and LRT

To assess the shedding of IDV in both URT and LRT, the presence of IDV RNA was monitored by RT-qPCR in deep nasal swabs (NS) between D0 and D22 and bronchoalveolar lavages (BALs) on D-1, D2, D7, D14 and D22. No virus was detected in control calves. In inoculated calves IDV detection in NS started at D1 in four calves and D2 for the other four. A peak of replication was observed at D4 with a mean titer of 5.6 x 108 (± 3.9 sd) IDV RNA copies/mL (Fig. 3A). The duration of

-12 days interval]. In addition, the IDV genome was

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detected in BALs of infected calves with titers ranging between 5.1 x 103 and 1.4 x

105 RNA copies/mL in 3, 2 and 1 out of the five tested calves at D2, D7 and D14 respectively (Fig. 3B). The presence of IDV in the lower respiratory tract was confirmed by analyses of IDV RNA in respiratory tissue samples collected on the three infected calves euthanized at D8 and on infected and contact calves at D22

(Table1). Viral RNA was easily detected, between 6.3 x 103 and 4 x 105 RNA copies/30mg of tissue, in NS, trachea, cranial and caudal lobes of the lungs and also the mediastinal and tracheal lymph nodes. Similarly, contact calves harbored viral

RNA in such tissues at D22, but additionally in tonsils and the olfactory bulb (Table1).

No virus could be detected in infected calves euthanized at the end of the experiment on D23. Finally, to localize where IDV replicates, immunohistochemistry (IHC) was performed on lung tissue sections from two infected calves euthanized at D8 (the cranial and intermediate lung lobes, which were positive by RT-qPCR) and on similar sections from control calves. Results showed IDV antigen deposition in the epithelium of the bronchioles (Fig. 4) with a nuclear and cytoplasmic localization. All tissues from the control animals were IDV negative.

IDV transmission may occur by direct or aerosol transmission

IDV was detected in nasal secretions from the three calves in the contact group

(separated by fence 3 meters apart from the infected group and without effluent contact), with shedding starting at least 10 days after the infected calves, at D11, D17 and D21 respectively (Fig. 3A). For the calf starting shedding at D11 (no. 7155), IDV was detected in NS until D19. For the other two calves, IDV was still present in NS at the end of the experiment (D22). To investigate aerosol transmission, we performed

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virus detection in 24 air samples collected over the course of the experiment in the contact calves’ area, the separating space and finally the infected calves’ area. The

IDV genome was detected in air samples in the three locations at D3, D5, D7, D9 and

D13 in a range of 5.2 to 6.1 Log10 RNA copies/m3 of air (Fig. 3C) with a maximum between D 5 and 7 although not significant. IDV detection started at D3 in the infected group area and D5 in the separating space and group contact area. After D9

IDV was only detected in aerosols of the group contact area.

IDV infection induces innate immune responses in BALs characterized by mRNA overexpression of pathogen recognition receptors and proinflammatory cytokines

Since IDV was able to replicate in the LRT and no data was available on IDV innate local immunity in the natural host we first analyzed BAL, collected from infected calves and controls at D0, D2, D7 and D14, for the transcriptomic response of 46 molecules. These included pathogen recognition receptors (PRRs), cytokines, chemokines and antiviral molecules involved in the interferon type I (IFN-I) response

(Table 2). The D0 was considered as a reference before challenge; D2 corresponded to the initiation of IDV replication and innate immunity, D7 to the peak of clinical signs and D14 to the recovery of infected calves.

Four genes coding for IL4, IL5, IL10 and MYD88 failed to pass the Fluidigm PCR quality check. Significant statistical differences between the two groups and the way of the expression (over or under expressed) for infected calves compared to controls are shown in Table 2 for each molecule and each day. CNRQ data of Fluidigm qPCR are available as supplementary data 1.

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IDV infection induced an active and significant overexpression of PRRs mRNA in calves, mainly TLR3, TLR7, TLR9, NOD2 and RIG-1 at D2 (Table 2). However, no significant differences between CNRQ values were found for INFα gene, genes involved in the interferon pathway (IRF1, IRF3, IRF7, STAT2) or interferon antiviral induced molecule ISG15. In contrast, CNRQ values of SOCS1 and SOCS3 were significantly (P<0.001 at D2) increased at D2. Concerning proinflammatory cytokine mRNAs, significant differences were mainly observed for CCL3, CCL4 and CX3CL1 at D2 and D14, CCL2 at D7 and D14, ITGAL (also named LFA-1A or CD11a) at D14 and CX3CR1 at all days. All the genes were overexpressed in infected calves except for ITGAL which was significantly under-expressed (P<0.01 at D14). In addition, IL6 was significantly overexpressed at D2 (P<0.01) and D14 (P<0.01) for infected calves while no differences were observed between IDV and control groups for IL1β, TNFα,

TNFβ and NF-ĸB. The cellular adaptive immune response was also characterized by an overexpression in the IDV group of INFγ at D2 and D14, IL2 at D6 and IL13 at D2,

D6 and D14.

We then further analyzed protein expression of 15 bovine chemokines in BAL cells using a multiplex Luminex assay. When statistically analyzed using the same method as for mRNA expression, results of adjusted protein concentrations indicated significant overexpression of TNFα at D2 and D7, CXCL10, IL1-R and IL10 at D7 and

IL2 at D2 and D14 (Table 3). Values for CCL3, INFγ, IL8 at D2 and D7 and CCL4 at

D2 were also upregulated for IDV infected calves but without significant differences, probably due to individual variability between calves. Protein concentrations were similar between the two groups for IL4, IL6, CCL2, IL1α, IL1β, and IL17a. Identical results were obtained using median fluorescence intensity (MFI) or Log transformed

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MFI as outputs (data not shown).

IDV induces both humoral and cell mediated systemic immune responses

The three colostrum-deprived controls remained seronegative for IDV hemagglutination-inhibiting (HI) antibodies throughout the experiment, and no increase of HI antibody titers was detected in the serum of the two control calves fed with IDV-positive colostrum (Fig. 5A). Two infected calves had already seroconverted by D7 (Calf no. 6131 and 7144) with HI titers of 1:10 (limit of detection, LOD, 1:10), and all five infected calves were seropositive at D15 (titers between 1:40 and 1:160,

Fig. 5A). In addition, the calf N° 7155 from the contact group who started shedding

IDV at D11 also developed a humoral response by D22, with a HI titer of 1:40. Sera from infected calves were additionally analyzed by IDV-specific IgG1 and IgG2

ELISAs (Fig. 5B). In agreement with the HI data, IDV-specific IgG1 seroconversions were detected in all infected animals. Whereas one calf had already seroconverted by D10 (no. 7165), a slight response was observed below the LOD in sera of the remaining four calves by D10, and these had all seroconverted by D22. No IDV- specific IgG2 antibodies were detected throughout the study; however, a weak response below the LOD was observed in two calves (no. 7142 and 7180) by D22, suggesting a low starting production of IgG2 in sera.

In the search for IDV-specific cellular memory responses in peripheral blood, 22 days after challenge, we analysed the proliferation and the cytokine production of IDV- restimulated PBMC. To eliminate unspecific responses against the cells in which IDV was propagated, responses induced by uninfected cell lysate were deduced from those induced by IDV-infected cell lysate. Overall, the IDV-specific proliferation was

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significantly stronger at D22 compared to at D-1 (Fig. 6), both after restimulation with live and inactivated virus (p=0.045 and p=0.031, respectively, two-sided paired T- test). The strongest proliferation was detected in calves no. 7142 and 7165 at D22, likewise after using both live and inactivated virus (Figure 5).

Live virus induced a weaker proliferation or more cell death than inactivated virus but was nevertheless used for cytokine analyses, to mimic the natural situation. Out of 15 analyzed cytokines, only the IDV-specific CCL-4 responses were significantly different in PBMC collected from D22, compared to in those collected on D-1 (greater on D22, p=0.025). On the other hand, regardless if cells derived from calves that had previously been challenged or not, IDV infection of lymphocytes consequently induced IL-1α and IL-8, at statistically significantly greater levels than control antigen

(p=0.043 and p=0.0003 for IL-1α; p=0.005 and p=0.0014 for IL-8, in cells from D-1 and D22, respectively).

DISCUSSION

Following its first detection in 2011, IDV is intriguing the scientific community: its pathogenesis, tropism, natural reservoir, route of transmission and role in respiratory affections are still not well-known. Studies using next-generation sequencing on the samples collected from young cattle with sign of respiratory disease suggested a positive relation between BRD and the presence of IDV in the URT (24,27). On the other hand, when IDV was intranasally inoculated in calves, the virus and the microscopic lesions were mainly detected in the nasal cavities and trachea and only exceptionally in lungs (25,26). In this study we confirm a higher level of IDV RNA loads in the URT than in BALs, suggesting a preferential tropism of IDV for the URT

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of cattle as also suggested in ferret, swine (12,18), and guinea pig (28). In contrast to data ported above (and by using the same mode method of infection), we found minimal lesion in the nose and trachea, suggesting that differences may exist due to factors link to the host or the virus strain. In addition, our data on IDV pathogenicity did not completely agree with previous results since we found a widespread infection of LRT which potentially makes this virus a stronger cause of bronchopneumonia. By using a French IDV strain isolated from cattle with lower respiratory clinical signs (16) and infection by aerosol, we were indeed able to detect IDV in LRT of infected calves from D2 to D14 in BALs and several lobes of the lungs at D8. This was confirmed by detection of IDV antigen in epithelial cells of bronchioles which is also in agreement with our previous field observations (16). Infection of the LRT is also suggested by the clinical signs typical of the LRT infection (dyspnea with surrounding wheezes) in two calves, which was not the case in the two previous experimental infections performed with different viral strains (25,26). Differences may be related to the IDV strain, the method of inoculation and/or the host. Here we used colostrum deprived calves of dairy production, while Ferguson et al. (2016) waited for the disappearance of maternal antibodies before inoculation. Consequently, infected calves were older and probably more mature immunologically. We can also not exclude that IDV colostrum may have stimulated the priming of the cellular immune response in the study of Ferguson et al. (2016). The French IDV strain used here and the

D/bovine/Mississippi/C00046N/2014 virus used by Ferguson et al are part of the

D/swine/Oklahoma/2011 lineage (whole genome sequences). No sequence data of the whole genome is to date available for the challenge strain,

D/bovine/Kansas/162655/2012 used by Hause et al. (25). Therefore, no proper

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genetic comparison could be performed between the 3 inoculum stains of IDV but we can hypothesize that this might have played a role on disease outcome and tissue tropism.

Despite the infection of the LRT, the clinical impact of IDV was moderate in this study, as infected calves quickly recovered from the infection. The quick recovery of the calves correlates with the limited extension of gross and histopathologic lesions of interstitial bronchopneumonia observed in the three animals euthanized at D8, indicating milder pathogenicity of IDV in the LRT compared to that of other respiratory viruses, such as BRSV. Beside the biological characteristics of IDV, this could also be due to experimental conditions including the virus, the dose and the route of inoculation. However in our study we used a high quantity of virus to infect animals

(107 TCID50 per calf) and a nebulization method which was previously shown to be very efficacious for BRSV experimental infection in calves (29). On the other hand, our IDV inoculum was produced on cells from human (HRT18G) and swine (ST) origins with 8 passages that might have attenuated the virus. An inoculum produced by several passages in calves might be better suited since the virus by this way may increase its fitness to the host and thereby raise its potential to replicate and induce clinical signs. Nevertheless, the moderate pathogenicity is in agreement with the previous experimental infections (25,26) but also with epidemiological findings.

Seroprevalence of IDV in cattle is under investigation in France and preliminary data indicate that over 50% of adult cattle may be seropositive (data not shown) suggesting that the virus may spread a lot without inducing clinical signs in large part of the cattle population. In addition, IDV was detected only with low frequency in the

LRT of calves suffering from severe BRD and frequently in association with other

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pathogens (16). Therefore, IDV might have a role of a predisposing factor to BRD. It is indeed well known that BRD involves several interacting microorganisms which may collaborate to induce clinical signs and lung lesions (30). In our study, the presence of co-infecting microorganisms was prevented by performing the experiment in isolation units in which co-infections are not occurring suggesting that the observed clinical signs are solely those of the IDV. This was confirmed by the absence of respiratory pathogen microbial qPCR detection in BALs before and after challenge. All these points suggest that at the current stage IDV can be considered as a respiratory virus that can replicate in the URT and LRT. Its limited pathogenicity is associated with mild clinical respiratory signs and can probably be considered as predisposing or cofactor of respiratory disease such as other viruses like BCoV and

BPI3.

The local innate immune response induced by IDV in the LRT was also investigated.

Our data suggest a high capacity of IDV to stimulate transcription of the membrane or cytosolic PRRs, such as TLR3, TLR7, TLR9 and RIG-1. In contrast, IFN-I and IFN-I pathway molecules such as IRF3, IRF7 or IFN-I stimulated genes (ISG15) were not overexpressed in infected calves by comparison with control animals.

Phosphorylation and translocation of IRF3 and IRF7 were tough not tested here.

Furthermore, transcription of SOCS1 and SOCS3, which are cytokine-inducible negative regulators of cytokines and members of the STAT-induced STAT inhibitor

(SSI) family, were overexpressed at the same time. These data allow us to explore further the ability of IDV to interfere with the IFN-I response at both the transcriptomic and protein levels as shown for IAV NS1 protein (31,32). This also suggests that IDV is rather well adapted to cattle and it would be interesting to compare if the similar

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response would be observed in pigs or other species. We also found overexpression of mRNAs of several chemokines along the course of infection, mainly observed for

CCL2 (also named MCP-1), CCL3 (MIP-1α), CCL4 (MIP-1β) and the tandem

CX3CL1/CX3CR1. In agreement with this, CCL4 production were induced by IDV in

PBMC in vitro, and in higher amounts by PBMC collected after IDV challenge. The soluble form CX3CL1 is chemotactic for T-cells and monocytes but not for neutrophils while the membrane-bound form promotes adhesion of those leukocytes to endothelial cells. Both CCL3 and CCL4 act as a chemoattractant for monocytes, but also, in a lesser extent, neutrophils and natural killer cells (NK), as well as antigen- specific T and B cells for CCL3 (33). Neutrophils might additionally have been stimulated by IL-8 production, as demonstrated in vitro and in vivo at D2 in BALs.

These results may explain our histopathological observations in IDV calves showing a peribronchial and septal lymphoplasmocytic infiltration in the lung, a moderate infiltration of neutrophils in the bronchial lumens and a light neutrophilic and macrophagic alveolitis. The moderate infiltration of inflammatory cells is also correlated with a down regulation in IDV calves of ITGAL mRNA expression, which is involved in leukocyte adhesion and transmigration of leukocytes including T-cells and neutrophils (34). On overall this also confirms well the interaction and replication of

IDV in the lower respiratory tract. We do not know if overexpression of chemokines may contribute to limit the severity of the disease in our study. For IAV both CCL3 and CCL4 contribute to promote recovery by inducing inﬂammatory responses (35), probably by inducing the synthesis and release of other pro-inflammatory cytokines such as interleukin 1 (IL-1), IL-6 and TNF-α from fibroblasts and macrophages

(36,37) and/or by skewing a Th1 protective response (38) when associated with its

200

receptor CCR5. We did not find IL-1 overexpression at either the mRNA or protein levels in the lung suggesting a moderate proinflammatory response and/or limited pathogenicity of IDV in the LRT, but IL-1α and IL-1β were induced by IDV in vitro. We also observed an IL6 overexpression at the transcription but not at the protein level,

the protein level. These differences may be due to technical sensitivity or timing of sample collection but overall it suggests that an inflammatory response occur which might also contribute to limit the Th1 response. In addition, our results suggest a mixed

the two calves which showed a proliferative lymphocytic response. Unfortunately, we were not technically able to detect IL4, IL5 or IL-12 mRNA transcripts in the BALs to more precisely define the cell specific response. The systemic and the local cell response has to be investigated more precisely to define clearly.

Finally, the aerosol transmission of IDV was also examined in this study. The airborne transmission of IAV was extensively studied and it is now acknowledged that in certain conditions of temperature, humidity, and strains, particles of IAV could be transmitted by respiratory droplets at least over short distances (39). Our study demonstrated that the efficient transmission of IDV infection via aerosol to a seronegative calf can occur under experimental conditions and that IDV is an airborne transmitted pathogen. The first contact calf began to shed the virus at D11 actively. Considering an incubation period of 2 to 4 days, this calf may have been infected between D7 and D9, when IDV excretion in the infected group remained high. For the two other contact calves we can estimate the infection period between

201

D15 and D19, at the period of highest excretion of the first contact calf. We can consequently hypothesize that the first contact calf was infected by airborne transmission from the infected group and that this calf contaminated the two other ones by close contact. The aerosol transmission also correlates with progressive detection of the virus in air samples from D3 to D13 firstly in the infected zone then in the intermediate and contact areas. The relative quantities of IDV RNA in aerosols are relatively low (5 logs by m3) but well in the range of the observed IAV RNA copies detected in swine barns (1.2 x106 RNA copies/m3 ((40); 3 x105 copies/m3

(41)). To date we do not know the minimum infectious dose for IDV in cattle. Since

IDV RNA was found in the LRT of all the three contact calves at D22, we can hypothesize an effective and probably high rate of IDV transmission between calves by natural transmission as also suggested by our epidemiological data. The capacity of IDV to be airborne transmitted, at least over short distances, and the high efficacy of transmission must also be considered in regards to the very high thermal and acid stability of the virus by comparison with IAV, IBV or ICV (42) and potential high resistance of the virus outdoors. Further studies will be useful in order to explain the physical and chemical conditions and the strain related differences on the aerosolization and transmission of IDV infection.

Taken together this study suggests that IDV is a respiratory virus with moderate pathogenicity but probably a high level of transmission. The role of IDV in BRD as a predisposing or cofactor with other virus and/or bacteria of cattle still need to be fully assessed in experimental conditions.

202

MATERIALS AND METHODS

Cells and virus

The influenza D strain D/bovine/France/5920/2014 was isolated from a lung fragment of a calf dead from BRD in 2014 in France (16). Lung extract was propagated on

Human Rectal Tumor-18G (ATCC CRL-11663) cells for five days in presence of

TPCK trypsin (1µg/ml, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA) in opti-MEM

Reduced Serum Media (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA) supplemented with penicillin (500 µg/ml) streptomycin (500 Units/ml) (Life technologies, Carlsbad, California, USA) , ciprofloxacin (10 µg/ml, Sigma-Aldrich,

USA), amphotericin B (2.5 µg/ml, Sigma-Aldrich, Missouri, USA) and BM-cyclin (15

µg/ml, Sigma-Aldrich, Missouri, USA). For the second, third and fourth passages, the supernatant was propagated on swine testis (ST) cells for five days in presence of

OPTIMEM medium supplemented with the same products and the progeny supernatant was filtered. The virus solution was verified free from other major respiratory pathogens by qPCR using the LSI VetMAX Screening pack – Ruminant

Respiratory Pathogens real time PCR kit (Life technologies, Carlsbad, California,

USA), and titrated using tissue culture infectious dose (TCID50) as previously described (26), using the Spearman-Kärber titration method.

Ethics statement

Animal experiment was performed in biosafety level 3 facilities at the Research

Platform for Infectious Disease (PFIE, National Institute for Agronomic Research

(INRA), Nouzilly, France) in accordance with accepted human standards of animal

203

care (European Community council 2010/63/EU) and under national ethical agreement number APAFIS#6204-20 1 60725 14353285 v5 (French Ministry of

Agriculture, Ethics Committee N°019).

Calves and experimental design

Fourteen Normand and Holstein calves, born in a bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) and bovine viral diarrhea virus (BVDV) free experimental station of INRA, were colostrum deprived (43) and transferred to PFIE between 3 to 7 days of age. The calves were then fed with commercial milk and reared for 2-6 weeks of age before the inoculation.

To reach the number of animals necessary for the statistical significance of some of the tests, two additional calves with maternal antibodies against IDV were added in the control group. Before challenge all calves tested negative for IDV, BRSV, BCoV,

BPI3, M.bovis, H.somni, P.multocida, and M. haemolytica pathogens (LSI VetMAX

Screening pack qPCR – Ruminant Respiratory Pathogens, Life technologies,

Carlsbad, California, USA). Absence of BVDV was confirmed by negative detection of the NS3 antigen (Serelisa BVDV-BD, Synbiotics, Lyon, France). In addition, the 14 colostrum-deprived calves also tested negative for anti-IDV antibodies using HI assay.

Two separated pens were used: five mock infected calves (control group, 3 deprived and 2 IDV antibodies calves) were placed in the first whereas eleven colostrum- deprived calves, eight of which to be inoculated, were placed in the second pen. In the latter pen, calves were divided into two groups separated by steel panels, 3 meters apart. Eight calves were inoculated (inoculated group) while the three others

(contact group) were not, in order to evaluate the aerosol transmission of IDV. The

204

two groups did not share any equipment, food, water, space, or fomite. The rule consisted in manipulating the three indirect-contact calves first, and then personal protective equipment was completely changed before manipulating infected calves.

The five calves were infected at day 0 (D0) with 107 TCID50 (10ml in Opti-MEM™) of

D/bovine/France/5920/2014 by aerosol inhalation using a compressor connected to a mask covering the nostrils and mouth as previously described (29). Calves of the control group received ST cells supernatant (10 ml in Opti-MEM™). The contact calves were not inoculated.

Clinical examination

Calves were examined by the same investigator twice a day from 3 days before infection (D-3) to D22 for body temperature, nasal discharge, coughing, decreased appetite, general state, abnormal breathing, respiratory rate and abnormal lung sounds. Clinical scores were assessed for each calf as already described (43). Briefly scores were assessed as follows: scores for rectal temperatures (T) were 0 (T <

39°C), 1 (39,1°C < T < 40°C), 2 (40,1°C< T < 41°C) or 3 (T > 41°C); scores for respiratory rates (RR/min) were 0 (RR < 30), 1 (31 < RR < 40), 2 (41 < RR < 60), 3

(61 < RR < 80) or 4 (RR > 80); a score between 0 (normal), 1 (mild) and 2 (severe) was attributed for nasal discharge, coughing, and the general state respectively while dyspnea (absent, weak, moderate, high) and appetite (drop in milk consumption of

0%, <30%, 30-60%, or > 60%) were scored from 0 to 3. Daily individual accumulated scores were calculated for each calf by adding the score of every parameter. In addition, mean accumulated clinical scores (ACS) were calculated for each group as the mean of the individual area under daily clinical scores using the trapezoid

205

method.

Gross lesions, histopathology and immunohistochemistry

Euthanasia and necropsy were carried out at D8 for 3 infected calves and at D22 for the remaining 13 calves. Euthanasia was achieved by intravenous injection of 25 mL of pentobarbital sodium injection (Dolethal, Vetoquinol, France; 182.2 mg of pentobarbital per kg) before complete exsanguination. Extracted lungs were photographed and examined for gross lesions then lavaged with saline isotonic fluid.

Tissue samples were then collected for histopathology and virology, including cranial right and left, intermediate, caudal right and left lobes of the lungs, the nasal and tracheal mucosa, tonsils, lymph nodes (mediastinal, tracheobronchial and mesenteric), kidney, spleen, liver and intestine (duodenum, jejunum and colon).

Every tissue and organ was divided in three parts, one in 10% buffered formalin for histology and immunohistology, one stored at -80°C for RNA isolation and subsequent RTqPCR and a third part in RNA Later (Qiagen, Hilden, Germany) for eventual later use.

For histopathology, fixed tissue samples were paraffin wax-embedded, sectioned at

3-5 µm and stained with hemalun and eosin. A pathologist described and scored the severity of microscopic lesions in slides of the lungs and respiratory lymph nodes as either light (3 or less small lesion foci in one section), moderate (> 3 small lesion foci per section), or marked (diffuse lesions in the section).

To confirm the presence of the IDV in the respiratory tract tissues, immunohistochemical staining was performed on paraffin-embedded sections of

206

lungs with a polyclonal rabbit anti influenza D virus antibody obtained by multiple immunizations of rabbits. Slides were retrieved in Pronase Antigen Retrieval Solution

(Dako, USA) at 0.05% and left 10 minutes at 37°C. They were then incubated with the rabbit antiserum at 1/100 dilution overnight at 4°C. The staining was revealed with a polymer conjugated with horseradish peroxidase HRP (polymer-HRP dual envision, Dako, USA) and the diaminobenzidine chromagen of the HRP (Diagomics,

France). A rabbit normal serum was used as negative control.

Samples collection

Nasal swabs (both nostrils) were taken daily from D0 to D22, collected in 1mL of PBS and directly stored at -80°C. Bronchoalveolar lavages (BALs) were performed for 5 control calves and 5 inoculated calves at D-1, D2, D7, D14, and D22 by endoscopy

(Olympus, CF-EL, Shinjuku, Tokyo, Japan) under general anesthesia (10 mg/kg ketamine and 10 mg/kg diazepam) as already described (43). During the process, airways abnormalities (inflammation, fibrinous content) were recorded. For each BAL, a same volume of 100 mL of a sterile isotonic sodium chloride solution was injected into the same location of the right lobe. BALs after euthanasia (D22 and D8 for the 3 other inoculated calves) were performed by direct extraction and lavages of the lungs with 250 ml of sterile isotonic saline solution as previously described (44). In one hour after collection, crude BAL, BAL supernatant and cells (obtained after centrifugation of 15 mL of BAL, 2500 rpm, 15 minutes) were aliquoted and stored at -80°C.

Air sampling was carried out at D1, D2, D4, D6, D8, D10, D12, D14, D16 and D18 post-infection in the same locations every time; starting in the center of the contact calf area, then the center of the separating space and finally the center of the

207

infected calf area. Air samples were collected using the Coriolis MICRO (Bertin

Instruments, Montigny-le-Bretonneux, France) air sampler according to the manufacturers’ procedures. The collector was placed at 1m above ground, and after every collection, the collector was thoroughly rinsed and disinfected. Briefly, 10 ml of

PBS supplemented with 0.01% of Tween 20 (Sigma-Aldrich, Missouri, USA) were added to the collector reservoir, the Coriolis collector was run for 15 minutes during which 4.5m3 of ambient air was captured and mixed in the PBS-Tween solution.

Immediately after collection, aliquots of 140µL were stored at -80°C for further RNA extraction and IDV genome detection by RT-qPCR.

208

Virus quantification

IDV detection and quantification was performed by RT-qPCR in nasal swabs, BALs and air samples. Viral RNA was extracted from 200µl of liquid samples using the extraction kit QIAamp cador Pathogen (Qiagen, Hilden, Germany) on the Qiagen

Qiacube automated (Qiagen, Hilden, Germany) platform. Tissues where extracted manually using Qiagen QiaAmp (Qiagen, Hilden, Germany) and Macherey Nagel

RNA blood (Macherey Nagel, Dϋren, Germany) respectively.

IDV genome was analyzed by an RTqPCR targeting a 135 bp fragment of

Polymerase Basic 1 (PB1) segment gene as previously published (12) in the

LightCycler 96 Real-Time PCR System (Roche, Basel, Switzerland) using the

QuantiNova Probe PCR kit (Qiagen, Hilden, Germany). In order to quantify the IDV genome in samples, blunt-ended PCR product of D/bovine/5920/2014 was inserted in the plasmid pSC-amp/kan of the StrataClone blunt PCR cloning kit (Agilent, Santa

Clara, California, USA). Amplified plasmids were linearized with EcoRV restriction enzyme before in vitro transcription according to the instructions of the MEGAscript kit (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA). Purified RNA was then quantitated by UV light absorbance (A260) using CLARIOstar reader (BMG Labtech,

Ortenberg, Germany) stored at -80°C and used to make a standard curve for PB1 gene quantification. IDV loads in NS and BALS were expressed as the daily mean. In addition, individual accumulated viral sheddings (AVS) in nasal secretions were calculated for each calf as the area under IDV titres using the trapezoid method.

Host humoral response

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Antibody response was first tested by HI at D0, D3, D6, D10, D15 and D22 as described previously (45), the sera were all treated with Receptor Destroying Enzyme

(RDE) (Denka Seiken, Japan) and hemadsorbed on packed horse red blood cells

(RBC). Four hemagglutination units of D/bovine/France/5920/2014 and 1% horse

RBC were used for HI assays. The IDV antibody response was also assessed by two

ELISAs for detection of IDV IgG1 and IgG2 at D0, D10 and D22. For antigen preparation, the IDV strain D/bovine/France/5920/2014 was propagated on swine testis fibroblasts (ATCC® CRL-1746™). Infected and uninfected cells were frozen on day 4 post inoculation, then thawed and pelleted by centrifugation at 1000 g and

21°C for 10 min. The cell pellets were re-suspended in H2O containing 0.5% Triton-X

(Sigma), and centrifuged as above and the supernatants were used as ELISA antigen and control antigen, respectively. For analysis of IDV-specific IgG1 and IgG2 antibodies, 96-well ELISA plates (PolySorp®, Nunc™, Denmark) were coated during

18 hours at 4°C with IDV-antigen or control antigen in 0,05M sodiumcarbonate- bicarbonate buffer, pH 9.6. The wells were thereafter blocked for 1h at 25°C with

0.05% PBS-Tween, prior to addition of i) 1:50 diluted serain 0.05% PBS-Tween, ii) monoclonal mouse anti-bovine IgG1 antibodies (MCA627 BioRaD, clone K37 2G6) or mouse anti-bovine IgG2 antibodies (MCA626 BioRaD, clone K192 4F10), iii) monoclonal rat anti-mouse IgG1 antibodies conjugated with HRP (MCA336P

BioRaD, clone LO-MG1-2), iv) TMB substrate and v) H2O2. Samples and antibodies were incubated for 1 h at 37°C prior to three washes with 0.05% PBS-tween solution.

Corrected OD (COD) values were calculated by subtracting absorbance values at

450 nm of wells containing control antigen from wells containing IDV antigen. Data were expressed as percentage of the COD of positive control sera.

210

Host cell-mediated immune response

The cell mediated immune response was tested by IDV-specific lymphocyte proliferation assays. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were obtained through centrifugation of heparinized blood diluted 1:1 in PBS, at 1100 x g and 21°C for 45 min, over Ficoll-Paque PLUS (density 1.077 g/mL, GE Healthcare). The cells were washed three times with PBS and by centrifugation (once at 500 x g and 21°C for 10 min, and twice at 200 x g and 21°C for 10 min) and were frozen at -80°C until analysis. Cells from five IDV-infected calves, collected on the day before challenge

(D-1) and D22, were thawed and immediately stimulated ex vivo, in triplicate, as previously described [1], with either a) heat-inactivated IDV-infected or uninfected cell lysate, or b) unheated IDV-infected or uninfected cell lysate. The strain

D/bovine/France/5920/2014 propagated in swine testis fibroblasts were used for this purpose. After six days of incubation at 37°C, Alamar Blue® reagent (Invitrogen,

Sweden) was added according to the manufacturers’ instructions. Absorbance was measured by spectrophotometry at 570 nm and 595 nm after another 24 hours of incubation at 37°C. Corrected OD values were calculated between IDV- and control antigen-stimulated PBMCs, as described previously (29).

Transcriptomic analyses in BALs

BALs at D-1, D2, D7 and D10 were analyzed for calf transcriptomic response of 46 bovine genes involved in the inflammatory response and innate immune response using the high-throughput microfluidic qPCR platform BioMark (Fluidigm, California,

United States) technology. Briefly cDNAs were generated from 300 ng of clean total

RNA using random hexamer primers and the Revertaid reverse transcriptase

211

(ThermoFisher). Primer pairs were designed using Primer3 software based on the relevant bovine mRNA sequences and synthesized commercially (Eurogentec). They were previously validated for RT-qPCR (Roche, LightCycler480) system using negative and positive samples. Two genes encoding IL4, IL5 do not pass the validation and were ruled off. Genes and primers are listed in Supplementary data 3.

Pre amplification of cDNA was carried out with a pool of forward and reverse primers

(0.2µM) on an ABI thermocycler with an initial step of activation (95°C for 10 min) followed by 14 cycles of two steps (95°C for 15 s and 60°C for 4 min).

Preamplification products were then treated with Exonuclease I (40 UI) and diluted 5 times in low EDTA TE. Standards were prepared by sequential two-fold dilutions of a pool of all samples (2µl from each). qPCR of preamplification products were then run on the BioMark qPCR with a cycling program as follows: 50°C for 2 min for amplification phase and 10 min at 95°C for activation of the hot-start enzyme, followed by 35 cycles of denaturation at 95°C for 15 s, annealing at 60°C for 1 min, and elongation at 72°C for 20 s. Melting curve analysis was performed after completion of the qPCR collecting fluorescence intensities between 60 and 95°C.

Once the quality test passed, the data of the run were exported to the Biogazelle qBase+ software (refernces). Relative expressions at each day were done by ΔΔCT analysis after normalization (GeNorm analysis) on the two most stable bovine housekeeping genes (hprt and ywha7) on a list of 6 genes previously mentioned in the literature (gapdh, hprt, rpl19, rpl26, sdha and ywha7 genes).

Protein quantification in BALs and PBMC supernatant using bioluminoassay

Protein extraction on cell extracts of BALs was done after washing twice with ice-cold

212

PBS. Just before use, cell pellet was resuspended for 15 min on ice in NP40 Cell

Lysis Buffer (ThermoFisher Cat. No. FNN0021) containing 1 mM PMSF (stock 0.3 M in DMSO) and protease inhibitor cocktail (Sigma, Cat. No. P-2714). The lysate was centrifuged at 14,000 rpm for 10 min at 2–8°C, and stored at -20°C after total protein concentration determination. Protein extraction on (24 hours) stimulated lymphocyte supernatants was done after cell centrifugation at 14,000 rpm for 10 min at 4°C to remove any cells or cellular debris. Clarified medium was aliquoted and stored at –

80°C for analysis. Just before analysis, thawed samples were clarified by centrifuging at 14,000 rpm for 10 min at 4°C in a refrigerated microcentrifuge to prevent clogging of the Luminex™ probe and/or filter plate. Protein quantification was done by

Luminex technology using the Millipex® MAX Magnetic Bead Panel coupled with

Luminex xMAP® platform (SPRCUS706, EMD Millipore, Burlington, Massachusetts) according to the manufacturer’s instructions. Fifteen bovine proteins were quantified :

IL-1α, IL1β, IL-1RA, IL-6, IL-4, IL-17a, IL-2, IFNγ, IL-8, IP-10, IL-10, CCL2, CCL3,

CCL4 and TNFα. Mean fluorescence or protein concentration (according to a reference range for each target) were analyzed as described in statistics section.

Statistical analysis

Statistical analyses for clinical and virological examinations were performed using

GraphPad (La Jolla, USA). Logarithmic transformation was applied to fulfill the conditions of variances in homogeneity and normality when necessary (qPCR data).

Data were expressed as arithmetic mean ± standard error of the mean (SEM). A two- way ANOVA with repeated measures (three-factor splitplot anova) was used to analyze the clinical and qPCR results. When effects of the “day” and “treatment”

213

factors were significant among interactions, a Bonferroni test between contrasts was used to compare the treatments on each day post challenge. P values were indicated in the text, levels of significance are indicated on the graphs with stars: * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001. A one-way ANOVA was used to compare the AVS and ACS.

When the effect of the “treatment” factor was significant, a Newman-Keuls test was used to compare the treatment effects at each time point. A T-test (Mann-Whitney test) was also run for these parameters.

Statistical analysis of Fluidigm transcriptomic results was carried out on the log transformed calibrated normalized relative quantities (CNRQ) values of mRNA expression by comparing the slopes from D0 to Dx between infected and control calves. We used a linear mixed model with random effect for group, considering interactions between time and status (infected or control) and fit by maximum likelihood t-tests use Satterthwaite approximations to degrees of freedom (Formula: Y

~ Status * Time + (1 | Calves)). This model takes into account the heterogeneity of cytokine RNA data at D0, when calves were not infected, and the different predictions of evolution between infected and control groups when interaction (ANOVA type III) is significant. The cytokine and proliferation data from in vitro PBMC stimulations were analysed by using two-sided paired T tests in Minitab 18 statistical software.

ACKNOWLEDGMENTS

The authors would like to thank Gilles Foucras and Didier Raboisson for their valuable scientific support, Angelique Teillaud and Cecile Caubet for precious

214

technical assistance, Olivier Boulesteix and Edouard Guitton for their work in the animal facility. This work was funded by the French National Agency for Research

(ANR), project ‘FLUD’. E. Salem is supported by a PhD scholarship from the

Lebanese University.

SLU authors would like to thank the Cells for Life Platform, partly funded by the

Infrastructure Committee at SLU, Sweden, for providing facilities and equipment, and the staff at the Clinical Science laboratory at SLU for their technical support.

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220

FIG 1 A) Experiment Timeline and sampling. B) Fourteen naive calves were allocated in two separated pens, one with five mock infected calves (control group) and the second with eleven calves. In the latter pen, calves were divided into two groups separated by steel panels, 3 meters apart. Eight calves (infected group) were 7 inoculated at day 0 (D0) with 10 TCID50 of IDV 5920 while the three others (contact group) were not, in order to evaluate the aerosol transmission of IDV..

FIG 2 Mean clinical scores (A) and mean accumulated clinical scores (B) between calves infected by IDV (in blue) or not infected without (in orange) or with contact (green) with infected calves. * = p<0.05;**= p<0.01, *** = p<0.001.

FIG 3 IDV RNA loads in nasal secretions (A) and BALs (B) in infected calves (blue), control (orange) and contact (green) calves. IDV was also detected in air samples (C) collected over the course of the experiment. -: negative

FIG 4 Immunostaining of left cranial lobe (A) of calf N°7165 infected with IDV showing cytoplasmic and nuclear labelling of the bronchiolar epithelium by the anti- IDV polyclonal antibody. (B) Negative control of the same slide with the substitution of the IDV polyclonal serum by a rabbit normal serum; magnification x200.

FIG 5 (A) Antibody response in calves infected (blue) or not (orange) with IDV assessed by IHA and B) Specific ELISAs for IDV IgG1 (blue) or IgG2 (green) responses in infected calves. The line in B) represent the positive threshold.

FIG 6 IDV-specific lymphocyte proliferative response on PBMC of infected calves, at D0 and D22 and stimulated ex-vivo with either A) heat-inactivated influenza D-infected or uninfected cell lysate, or B) untreated influenza D-infected or uninfected cell lysate. After six days of incubation, proliferative response was determined by corrected optical density (COD) of Alamar Blue® (Invitrogen, Sweden). Results are expressed as the mean COD of triplicate samples, with standard deviations indicated by upward deflecting lines.

221

FIG.1

FIG. 2

222

FIG 3

FIG 4 Immunostaining of left cranial lobe of calf N°7165 infected with IDV showing cytoplasmic and nuclear labelling of the bronchiolar epithelium by the anti-IDV polyclonal antibody (on the left). Negative control of the same slide with the substitution of the IDV polyclonal serum by a rabbit normal serum (on the right); magnification x200.

223

FIG 5

FIG 6

* 7142 0.3 7147

7161 0.2 7165 COD 7180 0.1 *

0.0

-1 22 -1 22 -1 22 -1 22 -1 22 A)

0.3

0.2 *

0.1 COD

0.0

-0.1

-1 22 -1 22 -1 22 -1 22 -1 22 B) Days post challenge

224

Table 1: IDV detection (Log10 RNA loads/30 mg of tissue) in post-mortem samples of the three infected calves euthanized at D8 and three contact calves euthanized at D22 as determined by RT-qPCR; Lca: left cranial lobe; Rca: right cranial lobe; Lcaud: left caudal lobe; Rcaud: right caudal lobe; Access: accessory lobe; NS: nasal mucosa; LNme: mediastinal lymph node; LNtrach: tracheal lymph node. -: negative

RESPIRATORY OTHER RNA copies (Log10) LN Olfactory in 30mg of tissue Lca Rca Lcaud Rcaud Access NS Trachea LN medi Tonsils trach bulb 6531 4.2 4.5 - 3.9 4.2 - 3.8 4.6 4.2 - - INFECTED 6533 4.7 5.6 - 5 - 4.2 - - 4.1 - - D7 7144 4 5.4 5 4.4 3.8 3.9 4.7 5 - - CONTACT 7164 5.7 5.4 6.2 4.6 4.9 9.1 4.5 4.6 4.6 6 6 D22 7163 ------3.8 7155 - - - - - 4.8 - - - - 3.8

225

Table 2: Chemokine- and cytokine mRNA expression (using RT-qPCR Fluidigm assay) in BALs between infected and control calves. Statistics were done by comparing the slopes of the curves for each day on day zero between infected and control calves using a linear mixed model with random effect for group and considering interactions between time and status. Statistical differences were indicated as follows *: p<0.05, ** p<0.01, *** p< 0.0005. The arrow represents the way of modification for infected calves compared to controls: ↑increase of mRNA expression; ↓ decrease of mRNA expression

mRNA in infected/ mRNA in infected/ D2 D7 D14 D2 D7 D14 BALS control BALS control

CCL2 ** * ↑ STAT2 CCL3 *** * ↑ SOCS1 *** * ↑ CCL4 * * ↑ SOCS3 *** * ↑ CCL8 IL1b CCR5 IL6 ** ** ↑ CSF2 TNFa CSF3 * * ↑ TNFb CX3CL1 * * ↑ NFkB CX3CR1 ** ** *** ↑ INFg * * ↑ CXCL1 IL12a CCL11 * ↑ IL13 *** ** * ↑ ITGAL ** ↓ IL1a RIG-1 *** *** ↑ IL2 ** ↑ TLR2 * ↑ IL8 TLR4 SPA TLR3 ** ↑ PTGS1 TLR7 ** ↑ PTGS2 TLR9 ** ** ↑ TGFB1 * ↑ NOD2 ** RPL19 INFa RPL26 IRF1 GAPDH house keeping genes IRF3 SDH IRF7 YWAH7 ISG15 HPRT

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Table 3: Chemokine- and cytokine concentrations in BAL cells between infected calves and controls as determined by Luminex assay. A linear mixed model was used with random effect for group and considering interactions between time and status. Statistical differences were indicated as follows *: p<0.05, ** p<0.01, *** p< 0.0005. The arrow represents the way of modification for infected calves compared to controls: ↑increase of mRNA expression; ↓ decrease of mRNA expression

Proteins in infected/ D2 D7 D14 BALS control

CCL2 CCL3 CCL4 CXCL10 * ↑ INFg TNFa * * ↑ IL10 * ↑ IL4 IL2 * * ↑ IL17 IL1A IL1B IL6 IL8 * ↑ IL1-R * ↑

SUPPLEMENTARY DATA

S1 : CNRQ results of transcriptomic assays

S2: Concentrations of chemokines/cytokines in BAL

S3: List of primers used for the transcriptomic assays

227

Résultats et discussion

On peut supposer que dans certaines conditions, liées aux facteurs d’ambiance ou à l’hôte, l’IDV est capable d’induire une maladie avérée chez le veau. Pour évaluer la pathogénicité de l’IDV, Ferguson et al. 2016 (215) ont inoculé 3 veaux laitiers par voie intranasale. Un jour après l’inoculation, un veau naïf a été mis en contact avec chaque veau inoculé. Les animaux inoculés et ceux à leur contact ont tous séroconverti et le virus a été détecté dans leur tractus respiratoire haut. Les animaux ont présenté des symptômes respiratoires frustes, sans augmentation du rythme cardiaque et du rythme respiratoire et sans élévation de la température rectale. L’IDV seul semble donc avoir un pouvoir pathogène limité et se transmet entre animaux par contact rapproché.

La contamination horizontale rapide a aussi été montrée sur le terrain au Japon sur un troupeau de bovin présentant des troubles respiratoires (210). 28 échantillons de sérum ont été alors prélevés et analysés et huit échantillons se sont alors révélés positifs, avec des titres assez faibles en anticorps. Du fait que certains bovins présentaient des symptômes respiratoires légers, les auteurs ont prélevé à nouveau les 28 mêmes bovins un mois plus tard. Sur les 20 bovins qui avaient des sérums négatifs lors des premiers sondages sérologiques, 19 se sont révélés positifs lors de ce second test. Ces résultats montrent que l’IDV peut se propager rapidement au sein d’un troupeau. Dans ce cas précis, il semble que la plupart des animaux aient été infectés de façon subclinique par l’IDV.

228

DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES

229

Les bronchopneumonies infectieuses sont des affections économiquement importantes des jeunes bovins avec des coûts financiers considérables dus entre autres à la mortalité, aux traitements et aux retards de croissance. Les facteurs déclenchant les BPI sont nombreux et comprennent les agents infectieux, l’âge et la race des bovins atteints et l’ensemble des facteurs d’élevage qui agissent en facilitant la transmission des agents pathogènes et en augmentant la réceptivité et la sensibilité des animaux. Cette complexité se retrouve au niveau des agents infectieux incriminés qui sont nombreux (virus et bactéries), possèdent un pouvoir pathogène direct plus ou moins important et qui peuvent agir seuls ou en association. Quoiqu’encore peu nombreuses, plusieurs études ont été publiées pour comprendre les interactions entre pathogènes respiratoires (100,112,113,115,336). Dans ce travail nous nous sommes intéressés à deux autres questions scientifiques.

La première question portait sur l’existence de virus respiratoires nouveaux et leurs rôles dans les BPI. Les méthodes nouvelles pour la détection des virus ont en effet permis de mettre en évidence des virus respiratoires préalablement inconnus comme l’influenza D (190) et le nidovirus bovin (178) ou des virus connus dont le rôle dans la pathologie respiratoire reste mal compris comme les virus de la rhinite bovine A et B. En partant du fait que les données diagnostiques suggèrent l’existence de pathogènes encore non identifiés, nous avons poursuivi ce type d’étude dans des élevages naisseurs français soit par une approche NGS sans à priori en identifiant le virome respiratoire des veaux atteints de BPI, soit par une approche classique plus ciblée quand le virus émergent était déjà identifié, comme ce fut le cas de l’IDV.

La deuxième question portait sur le fait que nous savons maintenant qu'il existe un écosystème abondant et diversifié dans les voies respiratoires superficielles et profondes. Cette connaissance a fait l’objet de plusieurs études et revues, principalement chez les enfants et les patients immunodéprimés, sur les interactions possibles entre agents pathogènes et microbiome respiratoire (93,94,251,337–340). Plus récemment des données ont été publiées sur la dynamique du microbiome respiratoire bovin dans les systèmes d’engraissement américains et canadiens (102,294,295,297–300,334,341,342). Dans ce travail notre 230

second objectif était de caractériser le bactériote résident dans les voies respiratoires des veaux atteints ou pas de BPI et d’identifier les interactions potentielles entre communautés bactériennes résidentes et agents pathogènes respiratoires.

Identification et caractérisation de nouveaux virus respiratoires

Concernant le premier point, l’approche virome respiratoire nous a permis de détecter un nombre conséquent de genres viraux dans les prélèvements de LBA et d’EN (Annexe 1). Par rapport aux études déjà publiées par Ng et al. (2015) et Mitra et al. (2016) aux USA sur des veaux en feedlots, nos prélèvements sont cependant moins riches en termes de diversités de familles et genres viraux identifiés. Ces différences peuvent être liées à l’origine des prélèvements. Les nôtres étaient réalisés dans des élevages naisseurs sans échange particulier d’animaux et sur une zone géographique restreinte et différente, contrairement aux études américaines où les élevages étaient repartis entre le Kansas, le Mexique et la Californie. Par ailleurs, le feedlot peut présenter un modèle très dynamique pour les maladies infectieuses vu le grand nombre de bovins confinés dans un espace relativement petit et d’animaux provenant d’origines très différentes. Ce « dynamisme » n’existe pas dans les élevages naisseurs que nous avons testé. Des raisons techniques peuvent aussi être envisagées. Bien que la même stratégie ait été utilisée dans les trois études, les modes opératoires étaient différents ainsi que le choix des réactifs, des amorces, des kits d’isolements et les plateformes NGS (Illumina Miseq dans l’étude de Mitra et al. (180) versus Illumina Hiseq dans l’étude de Ng et al. (76) et la nôtre).

Les études NGS ont comme inconvénient de n’explorer qu’une situation à un temps donné sur un nombre limité d’échantillons. Nos résultats reflètent la situation dans les élevages naisseurs du Sud-Ouest mais n’est en rien représentative de ce qui se passe dans l’ensemble des cheptels français. Ainsi, afin d’avoir une vision plus exhaustive des virus circulants en France, un nombre supérieur d’élevages devrait être envisagé dans les études futures. De plus, comme toute étude NGS, notre travail a des limites. La première est de ne pas avoir testé des veaux sains en parallèle, notamment si on veut corréler présence d’un virus et pouvoir pathogène 231

respiratoire. Nous avons fait le choix d’identifier dans un premier temps le virome chez des animaux malades pour identifier des cibles principales en investiguant l’appareil respiratoire profond, contrairement aux études américaines. Il est clair que pour chaque cible identifiée, il faudra par la suite préciser son implication en pathologie respiratoire, notamment en caractérisant sa fréquence chez des animaux atteints ou pas de BPI. C’est le cas pour les BRAV et BRBV identifiés dans les études américaines ou l’astrovirus bovin identifié dans notre étude. De même dans l’étude de Mitra et al (180), trois espèces différentes de parvovirus ont été détectées dont un (UBPV6) considéré comme potentiellement nouveau. Nous n’avons pas trouvé d’UBPV6 dans nos prélèvements. Cette découverte particulièrement intéressante doit inviter les auteurs à explorer méticuleusement ces virus en termes de présence réelle et d’intégrité. Ainsi Naccache et al. (343) a révélé que le virus « hybride » entre un parvovirus et un circovirus détecté dans le liquide céphalorachidien d’un patient humain hospitalisé n’était qu’une simple contamination provenant des colonnes à silice utilisées durant l’extraction. Cette découverte de génome « contaminant » impose de confirmer par d’autres moyens la découverte d’un nouveau virus. Cette prudence concernant l’interprétation des résultats issus des analyses NGS est particulièrement requise durant les analyses bio-informatiques en utilisant des outils d’assemblage de novo durant lesquelles des génomes sont construits à partir des reads de petites tailles sans vérifier l’authenticité de ces génomes par d’autres outils et approches à stratégies différentes. Cela est notamment vrai pour la détection de l’astrovirus, du parvovirus de type 2, et de l’entérovirus dans notre étude.

Une deuxième limite de notre étude était l’analyse NGS sur des mélanges de prélèvements. Le choix était double, le premier était de se placer au niveau de l’élevage comme unité épidémiologique ce qui nous parait plus correct avec la réalité, le deuxième était de pouvoir tester plus d’unités compte tenu des coûts très élevés du séquençage NGS. Si cette approche est acceptable pour le virome, elle est plus discutable pour l’étude du bactériote considéré comme le deuxième génome d’un organisme et ce, malgré les données montrant une homogénéité entre les structures des bactériotes des veaux d’un même environnement (102,295,297,298,334,341).

232

Comme démontré dans ce travail, les co-infections se sont avérées très fréquentes avec notamment une grande fréquence d’agents infectieux non compris dans les valences vaccinales actuelles, qui ciblent le VRSB, le BPI3, le BVDV, le BoHV-1 et M. haemolytica. En France, il n’existe pas de données exhaustives récentes sur la prévalence des virus et bactéries respiratoires. Durant ce travail, une mise à jour des connaissances sur la circulation des agents infectieux respiratoires a donc été faite. Le VRSB, considéré comme un des virus les plus prévalents en France, s’est révélé comme étant toujours très présent. Plus intéressant nos résultats sur le virome respiratoire ont montré que le BCoV, un virus dont le pouvoir pathogène est discuté, s’est avéré être le plus prévalent, y compris dans les prélèvements de l’appareil respiratoire profond. Le BCoV appartient au genre Betacoronavirus de la famille des Coronaviridae qui regroupe des virus responsables de maladies très sévères comme le MERS et le SARS. Les Betacoronavirus ont montré une capacité élevée d’adaptation et de saut d’espèce ; les MERS-CoV et SARS-CoV proviennent de coronavirus propres aux chiroptères, tout comme le coronavirus humain (OC43) et le CR-CoV des chiens dérivent du BCoV. Ce dynamisme élevé du coronavirus a été évalué dans ce travail. Grâce aux outils de séquençage NGS et de bio-informatique, des souches de BCoV respiratoires isolées de poumons de veaux ont été analysées et comparées à la totalité des souches présentes sur les bases de données de NCBI. Dans cette étude, la ségrégation entre souches de BCoV européennes d’une part et souches Asiatiques et Nord- Américaines d’autre part a été démontrée. Par ailleurs nous avons identifié un phénomène de recombinaison au niveau de la position 1100 du gène de la spicule (S). La recombinaison est un processus connu chez les coronavirus, qui crée de nouvelles opportunités pour surmonter les pressions sélectives et s'adapter aux nouveaux environnements et hôtes. La recombinaison a ainsi été associée dans la littérature à l'expansion des hôtes, à l'émergence de nouveaux variants, à l'augmentation de la virulence et de la pathogenèse, à la modification des tropismes tissulaires et à l'évolution de la résistance aux antiviraux. Le phénomène de recombinaison détecté dans notre étude semble être responsable de l’évolution génétique séparée des souches BCoV entre les continents. Cette disparité évolutive semble logique en considérant les données du commerce mondial des bovins. Selon

233

les données de la FAO, la France n’importe quasiment pas de bovins mais elle en exporte beaucoup. Ces échanges sont cependant beaucoup moins importants que ceux existant entre les pays asiatiques et l’Amérique du Nord. Si l’idée de l’isolement de l’Europe et particulièrement de la France face au « spillover » d‘agents infectieux bovins peut ainsi être suggérée par notre étude pour le coronavirus, la situation est cependant bien différente pour l’IDV puisque nous avons montré que des souches génétiquement apparentées appartenant au même groupe phylogénétique circulent en même temps en Europe et aux Etats-Unis. Cette question intrigante sur l’origine et la transmission des virus bovins sur de longues distances mérite d’être mieux étudiée dans des travaux futurs.

Dans le même esprit, nous avons pu identifier la présence d’un astrovirus jamais décrit jusqu’à présent dans les prélèvements respiratoires. L’astrovirus bovin est connu pour posséder un tropisme entérique et nerveux (306,307,309,310,314,344) mais les études qui caractérisent les différentes propriétés de ce virus sont rares. Dans cette thèse, nous décrivons la détection d’un astrovirus, principalement dans l’appareil respiratoire profond, 13 mélanges de LBA et 2 mélanges d’EN étant positifs, respectivement. Dans la mesure où ce virus possède un tropisme digestif, une contamination des prélèvements par la flore buccale et/ou fécale a été envisagée. La méthodologie utilisée (protection du passage de l’endoscope), la présence plus fréquente de l’astrovirus dans le LRT et l’absence d’autres virus à tropisme digestif dans nos résultats infirment cette hypothèse. Par ailleurs la profondeur du séquençage (nombre de reads ou séquences) obtenu pour la grande majorité des prélèvements suggère que l’astrovirus est présent en quantités importantes. En l’état, il serait intéressant de poursuivre cette piste en élaborant des travaux complémentaires sur ce virus et son rôle dans les BPI. Un premier travail consistera à développer une RT-qPCR spécifique de ce virus pour confirmer les résultats observés et effectuer des études comparatives sur veaux malades/veaux sains à partir des banques d’échantillons disponibles mais aussi de nouveaux prélèvements de terrain. Une autre possibilité sera d’isoler le virus et d’explorer la capacité du virus à infecter le tissu respiratoire sur des explants pulmonaires bovins.

234

In fine, le nombre de nouveaux virus décrits dans la littérature augmente chaque année, avec des études exhaustives qui rapportent la découverte de nouveaux génomes ou la description d’un métagénome. Cependant, trop souvent, l'importance accordée à la quantité de nouveaux virus ou génomes est préjudiciable à la signification d'une découverte. De nombreuses analyses complémentaires sont en effet nécessaires pour caractériser définitivement un virus et son pouvoir pathogène. Pour exemple, les caractéristiques moléculaires d'un nouveau virus devraient être déterminées par des analyses in silico, comme des analyses phylogénétiques et d’horloge moléculaire ; la recherche de marqueurs moléculaires de pathogénicité, transmission, etc. ; ou par des tests de culture in vitro comme les études du tropisme cellulaire et du profil transcriptionnel. De même, lorsque les données sont difficiles à obtenir, comme dans le cas de génomes entièrement nouveaux ou de virus non cultivables, des données sur le pouvoir pathogène d'un nouveau candidat peuvent être récoltées par des études épidémiologiques sur des cohortes d'individus ou des bibliothèques de prélèvements (prévalence virale et séroprévalence dans différentes populations, études cas-témoins, charge virale chez les patients/animaux sains versus malades, tropismes tissulaires et excrétion virale). La reproduction expérimentale de la pathologie respiratoire chez l’hôte naturel reste finalement un élément majeur pour comprendre la pathogénicité d’un virus nouvellement détecté. C’est ce que nous avons réalisé pour l’IDV.

Pendant la première phase de ce travail, notamment lors des étapes de validation du séquençage à haut débit, la circulation de l’IDV chez les veaux en France a été démontrée par les encadrants de ce travail (208). Nous nous attendions donc à retrouver l’IDV parmi les résultats du virome respiratoire, mais cela n’a pas été le cas lors du séquençage profond. Si on tient compte d’une prévalence virologique de 4,5% chez les veaux atteints de BPI (208), le nombre de fermes testées peut expliquer ce résultat. L’isolement d’une souche D/5920 française sur un poumon de veau issu de l’étude de Ducatez et al (208) nous a permis de tester le pouvoir pathogène de l’IDV. Le fait de détecter dans nos prélèvements respiratoires l’IDV seul mais aussi en association avec d’autres pathogènes nous a en effet interrogé sur son rôle dans les BPI en tant que pathogène majeur ou modéré. A la même période des études ont été publiées qui reposaient soit sur des données de

235

séquençage soit sur des données d’infections expérimentales. Les auteurs Ng et al. (76) et Mitra et al. (180) ont évalué chez des veaux en feedlots américains, le rôle d’IDV en calculant de manière basique, à l’aide de tests statistiques (Fisher et odd ratio), l’association entre la présence du génome viral et les signes cliniques respiratoires. Bien que ces tests aient indiqué une association entre IDV et pathologie respiratoire, ces résultats ne sont qu’une indication sur le pouvoir pathogène du virus. En contrepartie, les études d’infections expérimentales chez le veau de Ferguson et al. (215) et de Hause et al. (216) ont suggéré un pouvoir pathogène modéré d’IDV, plutôt limité à l’appareil respiratoire supérieur, mais n’ont pas mis en évidence de mécanisme d’action particulier.

Nos résultats de PCR quantitative suggèrent que le tropisme d’IDV porte avant tout sur l’URT. Nous avons pu cependant démontrer qu’IDV se réplique aussi dans l’appareil respiratoire profond en induisant, pour une partie des veaux, des signes cliniques (dyspnée avec râles sifflants) certes modérés mais spécifiques d’une atteinte pulmonaire. Aucun autre agent pathogène respiratoire connu n’a été détecté chez ces veaux. Les différences avec l’étude de Ferguson et al. (215) peuvent s’expliquer par le nombre de veaux infectés (3 versus 8 dans notre étude), la souche d’inoculation (D/OK versus D/5920) et le schéma expérimental. Notamment nous avons utilisé des jeunes veaux dépourvus d’anticorps colostraux alors que Ferguson et al. (215) ont attendu la disparition des anticorps colostraux avant d’infecter des veaux, par conséquent plus âgés et probablement plus matures d’un point de vue immunitaire. Par ailleurs la présence du colostrum peut aussi avoir favorisé l’initiation d’une réponse immunitaire cellulaire contre IDV. Compte tenu de la forte prévalence sérologique d’IDV dans les troupeaux français (entre 38 et 70%, données personnelles), l’infection de veaux sous couvert d’une immunité maternelle est probablement fréquente sur le terrain et pourrait alors être cliniquement plus modérée.

Si l’on considère l’ensemble des données obtenues, on remarque que IDV possède un pouvoir pathogène modéré lors d’infection expérimentale, comme c’est le cas pour les BCoV et BPI3. Cette hypothèse est compatible avec le fait que la prévalence d’IDV est élevée dans les élevages français (entre 38 et 70%, données personnelles) alors que sa fréquence de détection lors de BPI sévère avoisine les 236

4,5% (208). Son rôle en tant que co-contaminant mérite d’être mieux exploré, par exemple par des études de co-infections sur explants de tissus pulmonaires avec d’autres virus ou bactéries respiratoires. Dans ce contexte, l’étude de la réponse immunitaire innée respiratoire induite par IDV nous est apparue importante à investiguer chez l’hôte naturel. En tant que première ligne de défense, elle peut expliquer les modulations de l’infection et de la maladie. Elle pourrait être indirectement impliquée en favorisant ou pas les co-infections ou surinfections bactériennes, comme cela a été démontré pour l’infection avec le BRSV, le BPI3, le BVDV chez les bovins et avec les virus influenza A chez l’homme et la volaille. L’inflammation aiguë associée pourrait aussi induire une dysbiose microbienne participant à la maladie. Enfin, la caractérisation de la réponse innée chez le veau servira de standard comparatif sur des études ultérieures in vitro et ex vivo. Curieusement nos résultats indiquent que IDV est capable d’activer la transcription des PRR membranaires et cytosoliques dans le LRT sans que l’on ne détecte une augmentation de transcription de l’INF-I ou des molécules impliquées dans les voies de signalisation de l’INF-I. Des études ultérieures seront nécessaires pour infirmer ou confirmer ces résultats et évaluer si IDV est capable d’inhiber la réponse INF-I, comme cela est montré pour IAV (345). On pourra par exemple allonger la liste des ARN cibles à tester, étudier la réponse transciptomique par une approche NGS sans à priori et/ou aller évaluer la réponse INF-I à l’échelle protéique par des approches en cultures cellulaires ou explants pulmonaires.

Par rapport aux études précédentes nous avons finalement montré la capacité d’IDV à se transmettre entre veaux par voie aéroportée sur de courtes distances. Ce mode de transmission est courant pour les IAV chez l’Homme mais également en élevages de volailles et de porcs (346,347). Des données récentes (195) indiquent que IDV est plus résistant que les autres influenzavirus par rapport à des modifications de température et de pH et probablement dans les conditions extérieures. La voie aéroportée pourrait ainsi faciliter la contamination intra-troupeau, voir inter-troupeau s’il s’avérait que le virus puisse rester infectieux sur de plus longues distances. La contamination facilitée de ce virus explique aussi sa forte prévalence sérologique.

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Pour finir sur cette première partie, l’identification d’un astrovirus respiratoire, et dans une moindre mesure la très forte prévalence du BCoV dans l’appareil respiratoire profond et la caractérisation du pouvoir pathogène de l’IDV nous interrogent ainsi sur leurs contributions aux BPI. Comme décrits dans la partie bibliographique les virus sont souvent caractérisés comme pathogènes majeurs et/ou agents initiateurs, ces critères reposant sur des données épidémiologiques et d’infections expérimentales. L’adjectif « initiateur » a été longtemps utilisé pour désigner un virus qui, à lui seul, ne provoque pas de signes cliniques sévères chez un veau après inoculation. Pourtant ces virus sont très fréquemment détectés durant les épisodes de BPI aiguës et sans forcément être associés à des pathogènes majeurs. Les questions qui se posent alors sont les suivantes : quand on a détecté un pathogène majeur n’y a-t-il pas d’autres agents qui pourraient faciliter son action ? L’association de virus dits initiateurs peut-elle engendrer de la clinique et si oui, par quels mécanismes ? Ces agents dits initiateurs ne participeraient-ils pas à une dysbiose du microbiote et consécutivement à une sensibilité accrue des veaux aux BPI ? Par ailleurs la notion de pathogènes majeurs versus initiateurs n’est-elle pas modulable en fonction des caractéristiques de l’hôte, que ce soit la race, les éléments facilitateurs et la qualité de la réponse immunitaire ? On comprend ici toute la complexité de ces affections multifactorielles.

Caractérisation du microbiote respiratoire bovin et relations avec les agents pathogènes respiratoires

En s’inspirant des études d’analyse du microbiote respiratoire chez l’homme nous avons décidé d’explorer le microbiote respiratoire bovin à l’aide des outils NGS les plus performants. Il faut toutefois garder en mémoire que ces outils ne sont pas parfaits. Quelquefois ils ne permettent pas d’identifier des microbes qui pourtant sont détectés positifs par d’autres techniques réputées moins sensibles. Les étapes de conditionnement, de purification, d’amplification moléculaire et de séquençage peuvent apporter des biais d’interprétation en favorisant certains taxons sur d’autres. Des raisons techniques en rapport avec l’affinité des amorces utilisées ou l’absence de séquences représentant ces genres dans les bases de données utilisées lors de

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l’affiliation peuvent aussi expliquer l’absence d’identification de certains microorganismes. Après tout, le « profiling » d’un microbiote est basé sur les abondances relatives donc les taxons les plus minoritaires sont parfois écrasés par les plus majoritaires et risquent de ne pas ressortir lors des tests statistiques. En plus, les résultats NGS reposent sur des algorithmes et tests statistiques qui se révèlent quelquefois peu cohérent entre eux. Nous avons par exemple mis en évidence les contradictions entre les résultats obtenus avec l’algorithme LEfSE et avec le test de Wilcoxon/ Kruskal-Wallis.

Nous avons choisi une approche NGS par séquençage 16S car elle correspondait mieux à nos objectifs de caractérisation de la composition microbienne et d’étude des liens et interactions entre les différents composants du microbiome. Cette méthode est celle retenue dans la majorité des études qui portent sur les communautés bactériennes dans les différents habitats. En conséquence les résultats produits enrichissent continuellement les banques (RDP, Silva, Greengenes,…) et offrent ainsi une assurance vis-à-vis de l’identité des séquences identifiées durant l’étape d’affiliation. De plus, les circuits de traitement des données de séquençage sont beaucoup plus normalisés, révisés et mis à jour régulièrement que ceux utilisés pour la métagénomique bactérienne. Dans notre étude le pipeline FROGS a été utilisé pour l’analyse bio-informatique et écologique. Ce circuit bio- informatique a été développé par une équipe de l’INRA de Toulouse, il est simple d’utilisation et couramment utilisé. Toutefois, bien que l’affiliation des taxons dans l’approche 16S soit assurée pour la totalité des séquences générées, le niveau taxonomique le plus bas atteint reste le genre. Cela limite forcement les hypothèses biologiques. L’autre approche non ciblée de métagénomique (shotgun sequencing) aurait pu également être utilisée, elle permet d’éviter l’introduction de biais méthodologique lié à l’amplification d’un gène. Toutefois des biais propres à cette méthode existent, notamment lors des étapes de purification, d’enrichissement et selon la chimie de séquençage choisie. Plus important, le séquençage métagénomique risquait de ne pas être assez profond pour détecter les séquences appartenant à des genres bactériens peu représentés, surtout lorsque les résultats sont « contaminés » par un nombre majoritaire de séquences liées à l’hôte.

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Qualitativement, nous avons comparé la structure du bactériote chez le veau avec ou sans BPI ainsi que la composition en abondance relative de chaque composant. Un consensus taxonomique de bactériote normal au niveau des embranchements (phylum) en comparant nos résultats et ceux des études déjà réalisées sur les bovins (296–298,334,341). Ce consensus est composé par l’abondance, dans le tractus respiratoire superficiel, de bactéries des phylums Firmicutes, Proteobacteria, Tenericutes, Actinobacteria, et Bacteroidetes, et, dans le tractus profond, des phylums Bacteroidetes, Proteobacteria, Fusobacteria, et Firmicutes. Un tel consensus n’a pas pu être établi à un niveau taxonomique plus fin (familles, genres, ou espèces), vu les résultats divergents entre les différentes études. Les différences observées peuvent être liées à de nombreux paramètres présents tels que l’environnement, le type d’exploitation, la race, l’âge, le statut vaccinal, l’alimentation…(297,334). Comme déjà expliqué dans la partie bibliographique de cette thèse, la différenciation du microbiote respiratoire est aussi modélisée par les structures anatomiques et histologiques complexes de l’arbre respiratoire ainsi que les conditions physico-chimiques qui règnent à chaque niveau (humidité, oxygénation, acidité, et nature des cellules épithéliales) (260). Ainsi, cette disparité taxonomique visualisée par les différents outils utilisés dans notre étude (diversité Beta et LEfSe) peut être expliquée.

Quel que soient les conditions de prélèvements nous avons détecté une abondance importante des espèces Mycoplasma dispar, Mycoplasma bovirhinis et Cilia-associated respiratory bacterium. Leur rôle en tant que pathogène majeur direct est probablement nul mais leurs abondances pourraient suggérer un rôle indirect, comme cela a été proposé pour M. dispar (39). Toutefois leur présence à la fois chez les veaux malades et sains ne va pas dans le sens de cette hypothèse.

De même en utilisant des outils d’écologie moléculaire nous avons comparé les diversités des bactériotes nasopharyngés et pulmonaires des veaux et montré une différence qualitative et quantitative des genres bactériens, comme déjà suggéré dans d’autres études (296–298,334,341). Le bactériote des cavités nasales des veaux atteints de BPI est clairement plus riche comparé à celui des poumons, en termes d’abondances et de diversité taxonomique. Cette divergence est considérablement moins importante quand on étudie le microbiote des veaux sains. 240

Une hypothèse serait alors de dire que l’apparition de BPI sélectionne des genres bactériens différents entre tractus respiratoires superficiels et profonds et/ou que la présence de genres spécifiques dans les tractus respiratoires profonds et superficiels favorise l’apparition de BPI. Pour confirmer cette hypothèse, il serait nécessaire de suivre l’évolution du microbiote chez les mêmes animaux avant et pendant les BPI. La dynamique et l’évolution du bactériote respiratoire bovin ont été évaluées dans différentes études canadiennes dans lesquelles un échantillonnage était réalisé sur les mêmes individus avant et après transport des veaux (341) ou avant et après allotissement (294). Dans la première étude, bien que tous les animaux soient restés cliniquement sains, les résultats ont montré un changement brusque de la structure du bactériote des veaux après leur transport vers un parc d'engraissement (enrichissement des genres Pasteurella, Bacillus et Proteus au jour J0 du transport, des genresStreptococcus et Acinetobacter au jour 2, Bifidobacterium au jour 7 et Mycoplasma au jour 14). Dans l’évaluation du bactériote après allotissement dans la deuxième étude, les genres Pseudomonas, Shewanella, Acinetobacter, et Carnobacterium étaient les plus dominants à l’entrée, tandis qu’après 60 jours de l’arrivée dans les parcs d’engraissement, Staphylococcus, Mycoplasma, Mannheimia et Moraxella dominaient. Il apparait ainsi évident que le microbiote évolue en fonction de différents contextes d’élevage mais jusqu’à présent il n’existe pas de données sur l’impact d’une maladie en système respiratoire bovin.

Dans notre étude nous avons aussi décrit les interactions entre agents pathogènes connus et communautés bactériennes et le possible impact de la présence de virus respiratoires sur le microbiote. Plusieurs associations ont été observées, M. bovis était associé à P. multocida et moins étroitement à un groupe de taxons formé par les genres Streptomyces, Rhodococcus, Variovorax, Sphingomonas et Agreia. Quant à M. haemolytica, il était associé à Murdochiella et H. somni était associé à Plonomicrobium sp., aux genres Histophilus, Pasteurella et Mannheimia. Des relations de corrélations très similaires ont été observées in vitro par Corbeil et al. (1985) (348). Dans cette étude, il a été démontré que la flore respiratoire résidente a la capacité de favoriser ou inhiber la croissance des isolats de M. haemolytica, P. multocida et H. somni. La plupart des isolats de la flore respiratoire étaient bénéfiques pour la croissance des pasteurelles, notamment les

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genres Micrococcus, Corynebacterium et Staphylococcus. De même l’interprétation statistique montre dans notre étude une opposition (corrélation inverse) entre la présence de BPI3 et BRSV d’une part et celle d’Histophilus somni d’autre part. Il a été montré qu’H. somni stimule in vitro en cellules BAT2 l’expression de protéines antivirales (IFIH1, ISG15, MX1, et RSAD2) et inhibe la réplication du BRSV (113).

Concernant les interactions entre bactériote respiratoire et présence d’au moins un des virus BRSV, BPI3, BCoV, il n’a pas été possible de montrer un impact significatif même si des différences entre communautés bactériennes ont été identifiées selon la présence ou non des virus. Les explications sont multiples. La première est le faible nombre de prélèvements disponibles pour les études statistiques qui nous ont amenés à fusionner les différents virus dans un même groupe. Si cela a un sens statistique c’est moins défendable sur le plan biologique où on peut supposer que les modes d’interaction avec la flore résidente sont multiples et virus-dépendants. La deuxième pourrait être l’absence d’interactions directes entre flore résidente et virus respiratoires.

En conclusion, nos travaux descriptifs sur la détection de nouveaux virus et leur présence au sein d’un microbiote résident pose la problématique des interactions entre microbes sensu lato dans un environnement dynamique qui dépend aussi des conditions de vie et donc d’élevage des animaux. Le challenge reste toutefois immense pour identifier et comprendre l’ensemble des interactions microbiennes. Nous considérons cette thématique comme extrêmement enrichissante et prometteuse pour peu que l’on puisse aller vers des aspects mécanistiques. La détection de l’IDV en est un exemple. Probablement faut-il le prendre comme un virus dont le pouvoir pathogène se module en fonction de l’hôte, de sa flore résidente et de la présence ou non d’autres agents infectieux respiratoires.

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292

ANNEXES

Tableau 6: Résultats détaillés du virome respiratoire

I. Résultats détaillés du virome respiratoire

Sample Species virus Genus %Coverage Reads_hit Average RTPCR ID <10 reads depth of detection coverage

>NC_001989.1 Bovine respiratory LBA 1 syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 99.2800 7724 117.9978 BCoV >HQ530153.1 Bovine parainfluenza virus LBA 1 3 strain SD0835, complete genome BPI3 Respirovirus 93.4100 617 7.6107 >LC047787.1 Bovine astrovirus genomic RNA, nearly complete genome, strain: LBA 1 BoAstV/JPN/Ishikawa24-6/2013 BAV Mamastrovirus 88.5700 168 3.7400 >KF906249.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, LBA 1 complete genome BCoV Betacoronavirus 88.3000 1313 8.0699

293

>KF906249.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, EN 1 complete genome BCoV Betacoronavirus 76.9700 1580 11.7251 BCoV >NC_001989.1 Bovine respiratory EN 1 syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 10.8600 17 .1474

>KF906249.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, LBA 3 complete genome BCoV Betacoronavirus 94.4300 2258 14.1945 pas de détection >LC047787.1 Bovine astrovirus genomic RNA, nearly complete genome, strain: LBA 3 BoAstV/JPN/Ishikawa24-6/2013 BAV Mamastrovirus 93.7800 291 6.5143 >HQ530153.1 Bovine parainfluenza virus LBA 3 3 strain SD0835, complete genome BPI3 Respirovirus 92.7700 841 9.3033 >AF295543.1 Bovine respiratory syncytial LBA 3 virus ATCC51908, complete genome BRSV Pneumovirus 29.7900 65 .5455

>AY864805.1 SARS coronavirus BJ162, EN 3 complete genome BCoV Betacoronavirus 1.7700 18 .0177 BCoV

>LC047787.1 Bovine astrovirus genomic RNA, nearly complete genome, strain: LBA 4 BoAstV/JPN/Ishikawa24-6/2013 BAV Mamastrovirus 100.0000 200095 7534.3771 BRSV, BCoV >HQ530153.1 Bovine parainfluenza virus LBA 4 3 strain SD0835, complete genome BPI3 Respirovirus 99.8400 6288 97.2592 LBA 4 >KF906250.1 Dromedary camel BCoV Betacoronavirus 71.2900 573 3.1557

294

coronavirus HKU23 strain HKU23-362F, complete genome >KU168861.1 Bovine rhinitis B virus isolate TCH5 polyprotein gene, complete LBA 4 cds BRBV Aphthovirus 64.8500 91 2.2789 >NC_001989.1 Bovine respiratory LBA 4 syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 23.2800 52 .3749

>KF906249.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, BRSV, BCoV, EN 4 complete genome BCoV Betacoronavirus 99.9300 85928 673.9432 BPI3 >AF295543.1 Bovine respiratory syncytial EN 4 virus ATCC51908, complete genome BRSV Pneumovirus 99.8000 53505 828.8784 >KT148961.1 Bovine parvovirus - 2, EN 4 complete genome BPV2 Copiparvovirus 40.9300 221 7.9089 >KJ647285.1 Bovine parainfluenza virus 3 EN 4 isolate TVMDL16, complete genome BPI3 Respirovirus 19.6900 77 1.1684

>HQ530153.1 Bovine parainfluenza virus LBA 6 3 strain SD0835, complete genome BPI3 Respirovirus 99.9800 875801 14590.6435 pas de détection >LC047787.1 Bovine astrovirus genomic RNA, nearly complete genome, strain: LBA 6 BoAstV/JPN/Ishikawa24-6/2013 BAV Mamastrovirus 98.7900 373 11.2907 >KF906250.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-362F, LBA 6 complete genome BCoV Betacoronavirus 90.3700 1660 9.2731

295

>AF295543.1 Bovine respiratory syncytial LBA 6 virus ATCC51908, complete genome BRSV Pneumovirus 27.3000 60 .4425

>JF749843.1 Foot-and-mouth disease virus - type A isolate Egypt/2006, complete EN 6 genome BRAV Aphthovirus 63.0000 4771 49.5214 pas de détection >NC_001989.1 Bovine respiratory

EN 6 syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 3.5000 5 (<10 reads) .0428

> HQ530153.1 Bovine parainfluenza virus LBA 7 3 strain SD0835, complete genome BPI3 Respirovirus 93.5300 917 11.3383 BRSV >KF906249.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, LBA 7 complete genome BCoV Betacoronavirus 89.3300 1653 9.8624 >NC_023631.1 Bovine astrovirus B18/HK, LBA 7 complete genome BAV Mamastrovirus 75.2500 213 4.6909 >NC_001989.1 Bovine respiratory LBA 7 syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 25.9900 63 .4525

>NC_001989.1 Bovine respiratory EN 7 syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 76.4800 1210 17.8321 pas de détection >KP887098.1 UNVERIFIED: Murine EN 7 coronavirus strain AM2, complete genome BCoV Betacoronavirus 4.0400 16 .0404

> KF906249.1 Dromedary camel LBA 9 coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, BCoV Betacoronavirus 99.9600 950109 8020.8525 BCoV 296

complete genome >HQ530153.1 Bovine parainfluenza virus LBA 9 3 strain SD0835, complete genome BPI3 Respirovirus 86.7000 381 4.8600 >LC047787.1 Bovine astrovirus genomic RNA, nearly complete genome, strain: LBA 9 BoAstV/JPN/Ishikawa24-6/2013 BAV Mamastrovirus 73.6100 88 2.1289 >NC_010354.1 Bovine rhinitis B virus, LBA 9 complete genome BRBV Aphthovirus 29.5700 25 .6351 >AF295543.1 Bovine respiratory syncytial LBA 9 virus ATCC51908, complete genome BRSV Pneumovirus 16.3400 31 .2274

>KF906249.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, EN 9 complete genome BCoV Betacoronavirus 99.8900 13885 104.3452 BCoV >KU168861.1 Bovine rhinitis B virus isolate TCH5 polyprotein gene, complete EN 9 cds BRBV Aphthovirus 97.2100 2586 70.0357 >NC_001989.1 Bovine respiratory

EN 9 syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 6.6600 8 (<10 reads) .0693

>HQ530153.1 Bovine parainfluenza virus LBA 10 3 strain SD0835, complete genome BPI3 Respirovirus 84.4000 341 4.1382 BCoV >KF906251.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-368F, LBA 10 complete genome BCoV Betacoronavirus 77.5600 605 3.5406 LBA 10 >NC_001989.1 Bovine respiratory BRSV Pneumovirus 69.4000 401 5.9045

297

syncytial virus, complete genome >NC_023631.1 Bovine astrovirus B18/HK, LBA 10 complete genome BAV Mamastrovirus 66.1200 92 2.2133 >KJ755666.1 Porcine bocavirus isolate GD18 NS1, NP1, and VP1/VP2 genes,

LBA 10 complete cds Bocaparvovirus 3.8500 9 (<10 reads) .0435

>KU168861.1 Bovine rhinitis B virus isolate TCH5 polyprotein gene, complete EN 10 cds BRBV Aphthovirus 99.9100 44798 1201.3592 BCoV >KF906251.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-368F, EN 10 complete genome BCoV Betacoronavirus 11.4400 38 .1749

>LC047787.1 Bovine astrovirus genomic RNA, nearly complete genome, strain: LBA 11 BoAstV/JPN/Ishikawa24-6/2013 BAV Mamastrovirus 97.2800 318 7.4668 BPI3 >HQ530153.1 Bovine parainfluenza virus LBA 11 3 strain SD0835, complete genome BPI3 Respirovirus 93.7300 795 9.3280 >KF906249.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, LBA 11 complete genome BCoV Betacoronavirus 91.9500 1695 9.6416

>HQ530153.1 Bovine parainfluenza virus EN 11 3 strain SD0835, complete genome BPI3 Respirovirus 99.8700 16601 260.7001 BPI3, BCoV EN 11 >KF906249.1 Dromedary camel BCoV Betacoronavirus 98.6600 5640 33.4133

298

coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, complete genome >NC_010354.1 Bovine rhinitis B virus, EN 11 complete genome BRBV Aphthovirus 47.2200 61 1.4322

>KF906249.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, LBA 15 complete genome BCoV Betacoronavirus 99.9600 379033 3149.2247 pas de détection >HQ530153.1 Bovine parainfluenza virus LBA 15 3 strain SD0835, complete genome BPI3 Respirovirus 52.9200 131 1.1090 >NC_023631.1 Bovine astrovirus B18/HK, LBA 15 complete genome BAV Mamastrovirus 39.6800 43 .6863 >NC_001989.1 Bovine respiratory LBA 15 syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 32.8400 66 .6986

EN 15 NA NA NA NA NA BCoV

>KF906249.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, LBA 16 complete genome BCoV Betacoronavirus 93.1400 2245 15.5663 BCoV >LC047787.1 Bovine astrovirus genomic RNA, nearly complete genome, strain: LBA 16 BoAstV/JPN/Ishikawa24-6/2013 BAV Mamastrovirus 65.5700 71 1.1787 >HQ530153.1 Bovine parainfluenza virus LBA 16 3 strain SD0835, complete genome BPI3 Respirovirus 56.4900 187 1.5595 LBA 16 >NC_001989.1 Bovine respiratory BRSV Pneumovirus 34.1100 67 .6206 299

syncytial virus, complete genome

>NC_010354.1 Bovine rhinitis B virus, EN 16 complete genome BRBV Aphthovirus 99.4500 15837 533.3836 BCoV >KF906249.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, EN 16 complete genome BCoV Betacoronavirus 99.9700 3909265 33254.6893 >KU198929.1 Bovine parainfluenza virus 3 EN 16 isolate XJA13, complete genome BPI3 Respirovirus 14.3100 19 .1792 >NC_001989.1 Bovine respiratory

EN 16 syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 1.4700 7 (<10 reads) .0182

>KF906251.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-368F, LBA 17 complete genome BCoV Betacoronavirus 71.2200 541 2.8059 BCoV >NC_023631.1 Bovine astrovirus B18/HK, LBA 17 complete genome BAV Mamastrovirus 70.8000 154 4.1496 >HQ530153.1 Bovine parainfluenza virus LBA 17 3 strain SD0835, complete genome BPI3 Respirovirus 55.5900 128 1.1757 >NC_001989.1 Bovine respiratory LBA 17 syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 20.9500 49 .4031

>KF906249.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, EN 17 complete genome BCoV Betacoronavirus 98.6900 3701 22.6787 pas de détection EN 17 >HQ832578.1 Foot-and-mouth disease BRAV Aphthovirus 23.5900 137 1.8136 300

virus - type A isolate IND 161/2003, complete genome >LC000638.1 Bovine parainfluenza virus 3 viral cRNA, complete genome, isolate: EN 17 HS9 BPI3 Respirovirus 8.3700 33 .1194 >KJ755666.1 Porcine bocavirus isolate GD18 NS1, NP1, and VP1/VP2 genes, EN 17 complete cds Bocaparvovirus 5.7200 15 .0720 >NC_001989.1 Bovine respiratory EN 17 syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 3.8200 15 .0420

>HQ530153.1 Bovine parainfluenza virus LBA 18 3 strain SD0835, complete genome BPI3 Respirovirus 86.9000 399 6.0948 >KF906250.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-362F, LBA 18 complete genome BCoV Betacoronavirus 33.3700 95 .6539

>KF906249.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, EN 18 complete genome BCoV Betacoronavirus 99.2800 5315 32.6700 pas de détection >LC047787.1 Bovine astrovirus genomic RNA, nearly complete genome, strain: EN 18 BoAstV/JPN/Ishikawa24-6/2013 BAV Mamastrovirus 42.7700 134 3.1477 >NC_010354.1 Bovine rhinitis B virus, EN 18 complete genome BRBV Aphthovirus 34.5600 33 .5528 EN 18 >KU198929.1 Bovine parainfluenza virus 3 BPI3 Respirovirus 17.1400 32 .2349

301

isolate XJA13, complete genome

>KF906249.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, LBA 19 complete genome BCoV Betacoronavirus 75.2900 528 3.3365 BRSV, BCoV >HQ530153.1 Bovine parainfluenza virus

LBA 19 3 strain SD0835, complete genome BPI3 Respirovirus 5.0200 4 (<10 reads) .0522

>KF906249.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, EN 19 complete genome BCoV Betacoronavirus 99.9500 939150 7909.5940 BCoV >AJ633821.1 Foot-and-mouth disease virus polyprotein gene, genomic RNA, serotype O, isolate FRA/1/2001, complete

EN 19 genome BRAV Aphthovirus 5.8100 8 (<10 reads) .0581

>KF906250.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-362F, LBA 20 complete genome BCoV Betacoronavirus 73.2100 468 3.6550 BCoV

>KF906249.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, EN 20 complete genome BCoV Betacoronavirus 99.9600 426867 3540.0340 BCoV >AF295543.1 Bovine respiratory syncytial EN 20 virus ATCC51908, complete genome BRSV Pneumovirus 8.8400 20 .1878 EN 20 >LC000638.1 Bovine parainfluenza virus 3 BPI3 Respirovirus 5.6000 12 .0560

302

viral cRNA, complete genome, isolate: HS9 >AY593769.1 Foot-and-mouth disease virus A isolate a25 argentina iso38,

EN 20 complete genome BRAV Aphthovirus 4.9700 5 (<10 reads) .0497

>KU558922.1 Betacoronavirus 1 isolate Buffalo coronavirus B1-24F, complete LBA 21 genome BCoV Betacoronavirus 38.6800 112 .7326 BCoV >NC_001989.1 Bovine respiratory LBA 21 syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 38.3800 116 1.7587

>KF906249.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, EN 21 complete genome BCoV Betacoronavirus 99.0700 5501 32.5346 >KU198929.1 Bovine parainfluenza virus 3 EN 21 isolate XJA13, complete genome BPI3 Respirovirus 16.8800 47 .2299 >AJ633821.1 Foot-and-mouth disease virus polyprotein gene, genomic RNA, serotype O, isolate FRA/1/2001, complete EN 21 genome BRAV Aphthovirus 8.8600 24 .2461

>AF295543.1 Bovine respiratory syncytial LBA 23 virus ATCC51908, complete genome BRSV Pneumovirus 34.2800 107 1.4534 BRSV

>NC_001859.1 Bovine enterovirus, EN 23 complete genome EVb Enterovirus 92.8900 2233 52.2601 BCoV 303

>KF906250.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-362F, EN 23 complete genome BCoV Betacoronavirus 70.0800 606 2.4989 >HQ530153.1 Bovine parainfluenza virus EN 23 3 strain SD0835, complete genome BPI3 Respirovirus 26.3800 51 .4570 >AJ633821.1 Foot-and-mouth disease virus polyprotein gene, genomic RNA, serotype O, isolate FRA/1/2001, complete EN 23 genome BRAV Aphthovirus 13.4500 35 .4740 >NC_001989.1 Bovine respiratory EN 23 syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 11.1300 143 1.9650

absence de virus respiratoire - traces de LBA 24 coronaviridae (pas beta) pas de détection >KC462884.1 Foot-and-mouth disease virus - type Asia 1 isolate Asial/HN/2006,

LBA 24 complete sequence BRAV Aphthovirus .4600 2 (<10 reads) .0046 >KU316100.1 Human respiratory syncytial virus strain RSVB/Homo sapiens/USA/94E-140-01/1994, complete

LBA 24 genome BRSV Pneumovirus .3200 2 (<10 reads) .0032

>KF906250.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-362F, EN 24 complete genome BCoV Betacoronavirus 78.6900 848 3.8269 pas de détection >AJ633821.1 Foot-and-mouth disease EN 24 virus polyprotein gene, genomic RNA, BRAV Aphthovirus 15.6400 60 .7662 304

serotype O, isolate FRA/1/2001, complete genome

>NC_001989.1 Bovine respiratory EN 24 syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 7.3400 15 .1270

>KF906249.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, LBA 25 complete genome BCoV Betacoronavirus 10.6500 31 .1464 pas de détection >NC_001989.1 Bovine respiratory LBA 25 syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 5.5900 11 .1421

>KF906250.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-362F, EN 25 complete genome BCoV Betacoronavirus 97.7300 3874 28.0127 pas de détection >AJ633821.1 Foot-and-mouth disease virus polyprotein gene, genomic RNA, serotype O, isolate FRA/1/2001, complete EN 25 genome BRAV Aphthovirus 11.1100 40 .5403 >NC_001989.1 Bovine respiratory EN 25 syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 5.5300 15 .1007 >KT071671.1 Bovine parainfluenza virus 3 EN 25 strain NX49, complete genome BPI3 Respirovirus 5.1300 25 .0529

>AY593769.1 Foot-and-mouth disease virus A isolate a25 argentina iso38,

LBA 26 complete genome BRAV Aphthovirus 1.5700 1 (<10 reads) .0157 pas de détection

305

>KP887098.1 UNVERIFIED: Murine LBA 26 coronavirus strain AM2, complete genome BCoV Betacoronavirus .7800 9 (<10 reads) .0081

>HQ832578.1 Foot-and-mouth disease virus - type A isolate IND 161/2003, EN 26 complete genome BRAV Aphthovirus 92.9100 142199 1954.0993 pas de détection >KF906251.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-368F, EN 26 complete genome BCoV Betacoronavirus 63.5800 431 1.7285 >KJ647288.1 Bovine parainfluenza virus 3

EN 26 isolate TVMDL24, complete genome BPI3 Respirovirus .4900 3 (<10 reads) .0049 >NC_001989.1 Bovine respiratory EN 26 syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 2.5100 11 .0375

>KP856967.1 Human respiratory syncytial virus strain RSVA/Homo sapiens/USA/81E-025-01/1981, complete

LBA 28 genome BRSV Pneumovirus .7500 4 (<10 reads) .0075 pas de détection >AY864805.1 SARS coronavirus BJ162, LBA 28 complete genome BCoV Betacoronavirus 1.7700 18 .0177

>KF906249.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, EN 28 complete genome BCoV Betacoronavirus 73.9300 675 2.9974 pas de détection >AJ633821.1 Foot-and-mouth disease EN 28 virus polyprotein gene, genomic RNA, BRAV Aphthovirus 13.0700 41 .5659

306

serotype O, isolate FRA/1/2001, complete genome

>KM402138.1 Porcine bocavirus isolate EN 28 GD10, complete genome Bocaparvovirus 7.3500 17 .0982 >NC_001989.1 Bovine respiratory EN 28 syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 6.1600 15 .1023 >KT071671.1 Bovine parainfluenza virus 3 EN 28 strain NX49, complete genome BPI3 Respirovirus 5.4400 17 .0584

>KP887098.1 UNVERIFIED: Murine LBA 29 coronavirus strain AM2, complete genome BCoV Betacoronavirus 2.3300 17 .0261 pas de détection >AJ633821.1 Foot-and-mouth disease virus polyprotein gene, genomic RNA, serotype O, isolate FRA/1/2001, complete

LBA 29 genome BRAV Aphthovirus 1.1700 2 (<10 reads) .0117 >KJ755666.1 Porcine bocavirus isolate GD18 NS1, NP1, and VP1/VP2 genes,

LBA 29 complete cds Bocaparvovirus 1.0900 2 (<10 reads) .0109

>KF906251.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-368F, EN 29 complete genome BCoV Betacoronavirus 87.8700 1133 7.4964 pas de détection >KM822593.1 Yak astrovirus isolate S8, EN 29 complete genome BAV Mamastrovirus 25.3800 133 3.6370 >AJ633821.1 Foot-and-mouth disease EN 29 virus polyprotein gene, genomic RNA, BRAV Aphthovirus 8.8400 19 .2953

307

serotype O, isolate FRA/1/2001, complete genome

>AF295543.1 Bovine respiratory syncytial LBA 30 virus ATCC51908, complete genome BRSV Pneumovirus 75.8200 1400 19.5045 BRSV >KC412634.1 Foot-and-mouth disease virus - type Asia 1 isolate Asia1/HN/2006,

LBA 30 complete genome BRAV Aphthovirus 1.8300 3 (<10 reads) .0183

>NC_001989.1 Bovine respiratory EN 30 syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 91.2100 12165 176.5679 pas de détection >KF906249.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-265F, EN 30 complete genome BCoV Betacoronavirus 86.7300 860 5.1425 >KC412634.1 Foot-and-mouth disease virus - type Asia 1 isolate Asia1/HN/2006,

EN 30 complete genome BRAV Aphthovirus 1.8300 3 (<10 reads) .0183 >NC_002526.1 Bovine ephemeral fever EN 30 virus, complete genome Ephemerovirus 4.7600 28 .0514

>NC_001989.1 Bovine respiratory

LBA 31 syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 2.4700 8 (<10 reads) .0247 BRSV >KP887098.1 UNVERIFIED: Murine LBA 31 coronavirus strain AM2, complete genome BCoV Betacoronavirus 2.0500 21 .0211 >KP764763.1 Bovine parainfluenza virus 3

LBA 31 strain TtPIV-1, complete genome BPI3 Respirovirus 1.1700 6 (<10 reads) .0117

308

>KF906250.1 Dromedary camel coronavirus HKU23 strain HKU23-362F, EN 31 complete genome BCoV Betacoronavirus 72.5200 634 2.7901 BCoV >AJ633821.1 Foot-and-mouth disease virus polyprotein gene, genomic RNA, serotype O, isolate FRA/1/2001, complete EN 31 genome BRAV Aphthovirus 10.6200 42 .5648 >NC_001989.1 Bovine respiratory EN 31 syncytial virus, complete genome BRSV Pneumovirus 9.2800 25 .1695 >KJ647287.1 Bovine parainfluenza virus 3 EN 31 isolate TVMDL20, complete genome BPI3 Respirovirus 4.3700 22 .0496

309

actualités en perspective vers une identification Gilles Meyer1,2 Claire Pelletier3 Nicolas Herman1 de nouveaux virus Mariette Ducatez2 Hervé Cassard1,2 respiratoires bovins Elias Salem2 1Université de Toulouse, Institut National Polytechnique (INP), École Vétérinaire de Toulouse (ENVT), 31076 Toulouse cedex 03 L’identification et la caractérisation 2Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), des pathogènes respiratoires bovins Unité mixte de recherche UMR1225, Interactions hôtes - agents pathogènes (IHAP) est en plein essor. 31076 Toulouse cedex 3 De nouveaux virus ont été identifiés 3Laboratoire départemental d’analyses de Saône et Loire, LDA71, dans l’appareil respiratoire 71009 Mâcon des animaux malades. Objectifs pédagogiques T Connaître les dernières e virus respiratoire syncytial bovin données sur la prévalence (VRSB) reste actuellement l’agent patho- des agents pathogènes Lgène viral majeur le plus fréquemment respiratoires connus. isolé parmi les virus respiratoires bovins. Les coronavirus bovins (bCoV) et, dans une T Présenter les connaissances moindre mesure, les virus parainfuenza En France, il n’existe pas de données exhaustives récentes sur l’identification récentes sur la séroprévalence des virus respiratoires (bPI3) sont eux aussi très présents. De nou- de nouveaux virus (photo G Meyer). veaux virus ont cependant été récemment respiratoires bovins. identifiés pour lesquels le pouvoir pathogè- l’appareil respiratoire profond lors de ne est à démontrer. bronchopneumonie infectieuse (BPI) est er Cet article propose des données actualisées théoriquement un indicateur plus précis et 1 Prix éditorial sur la prévalence des agents pathogènes 20 plus efficace de leur prévalence et de leur 14 respiratoires connus, puis présente les imputabilité clinique. connaissances sur l’identification de nou- G Les études anciennes de prévalence des veaux virus respiratoires bovins. pathogènes respiratoires ont montré des LA PRÉVALENCE ACTUELLE différences qui soulignent l’impact des Essentiel DES PATHOGÈNES RESPIRATOIRES techniques analytiques sur les résultats, et CONNUS EN FRANCE une probable diversité, attribuable a minima T En France, il n’existe pas aux facteurs géographiques. Par exemple, de données exhaustives Les données disponibles en France dans ces études, les techniques de détection récentes sur la séroprévalence G En France, il n’existe pas de données utilisées étaient différentes selon l’agent des virus respiratoires. exhaustives récentes sur la séroprévalence infectieux recherché, avec chacune des T La technique PCR améliore des virus respiratoires. On considère qu’elle caractéristiques propres de sensibilité et la sensibilité de détection est importante, au moins pour le virus spécificité. des pathogènes respiratoires, respiratoire syncytial bovin (VRSB) et le virus G Ainsi, en élevages naisseurs, l’infection par notamment des parainfluenza de type 3 (bPI3) (photo). le virus respiratoire syncytial bovin (VRSB) seul Pasteurellacae. G La détection directe des virus et des et / ou en association était dominante (33 p. bactéries à partir des prélèvements de cent des veaux) et le coronavirus bovin (BoCV)

ACTUALITÉS Encadré - La prévalence des virus respiratoires : synthèse de quelques études

G En Suède, selon une étude de 2010, la préva- G En Norvège, la prévalence des veaux de plus lence des infections à virus respiratoire syncy- de 5 mois dans les élevages laitiers est estimée NÉVA tial bovin (VRSB) dans le cheptel bovin viande en 2009 à 50 p. cent, 39 p. cent et 31 p. cent, EUROPARC 15, rue E. Le Corbusier varie entre 8 et 70 p. cent, selon la densité des respectivement pour les virus bPI3, bCoV et 94035 CRÉTEIL CEDEX animaux et les régions. La prévalence du corona- VRSB [5]. Tél : (33) 1-41-94-51-51 Courriel : [email protected] virus bovin (BCoV) est plus faible mais varie En 2013, la prévalence nationale moyenne d’ate- parallèlement à celle du VRSB [2]. liers infectés par la rhinotrachéite infectieuse G En Italie, en élevage laitier, sur 59 élevages tes- bovine (IBR) est de 10 p. cent, avec une préva- tés, au moins une vache séropositive au VRSB lence plus importante en atelier allaitant qu’en est présente dans ces élevages testés [4]. Dans atelier laitier et une très importante variabilité T Crédit Formation Continue : 25 p. cent des élevages, tous les individus testés entre départements (prévalence troupeau de 0,05 CFC par article sont séropositifs. 0,05 p. cent à 90 p. cent). Reproduction interdite LE NOUVEAU PRATICIEN VÉTÉRINAIRE Toute reproduction ou représentation, intégrale ou partielle, par quelque procédé que ce soit, de la présen- élevages et santé vol 8 / n°31 te publication sans autorisation est illicite et constitue une contrefaçon. L’autorisation de reproduire un article 80 - MAI / AOÛT 2015 8 dans une autre publication doit être obtenue auprès de l’éditeur, NÉVA. L’autorisation d’effectuer des reproductions par reprographie doit être obtenue auprès du Centre français d’exploitation du droit de la copie (C.F.C.). actualités en perspective - vers l’identification de nouveaux virus respiratoires bovins

était en 1999 le 2e virus détecté dans l’ordre Tableau 1 - Fréquence de détection des agents pathogènes de fréquence décroissante [17]. respiratoires obtenus par le LDA71 dans le cadre du diagnostic vétérinaire (602 prélèvements, [12, 13]) G En élevage de veaux de boucherie, dans ou par l’INP-ENVT (19 élevages naisseurs, projet Respicare) l’Est de la France en 2008, l’infection par le Étude 2 (ENVT) virus parainfluenza de type 3 (bPI3) était pré- Fréquence Étude 1 (LDA71) dominante parmi les virus, sans que les de détection Écouvillons Liquide auteurs précisent le statut clinique des lots nasaux broncho-alvéolaire de veaux étudiés [1]. G VRSB 22 - 23 % 5,3 % 26,3 % G bCoV 17 - 19 % 63,2 % 42,1 % Les nouvelles méthodes analytiques G bPI3V 6 - 8 % 10,5 % 5,3 %

G Pour limiter, à défaut d’éliminer, les varia- G M. haemolytica 20 - 21 % 26,3 % 15,8 % bilités liées aux méthodes analytiques, des G P. multocida 50 - 52 % 74,2 % 74,2 % techniques d’amplification génique en G H. somni 22 - 23 % 47,4 % 36,8 % temps réel (qPCR) ont été récemment mises au point, qui permettent de détecter G M. bovis 9 - 10 % 5,3 % 10,5 % rapidement le Virus respiratoire syncytial Figure 1 - Répartition (%) bovin (VRSB), le virus parainfluenza de type 3 des écouvillons nasaux (bPI3), le Coronavirus bovin (bCoV) et les et lavages broncho-alvéolaires bactéries M. bovis, M. haemolytica, P. multo- en fonction du nombre de pathogènes détectés cida et H. somni. Cette détection peut être lors de l’étude 2 (INP-ENVT) couplée à la recherche du virus de la diar- Écouvillons nasaux rhée bovine (BVDV) ou de l’herpèsvirus % Lavages bronchoalvéolaires bovin de type 1 (BoHV-1), là aussi par PCR. 50 G Cet outil a récemment été utilisé dans 45 deux études de prévalence des pathogènes 40 respiratoires. 35 1. La première étude (étude 1) est une analy- 30 se de 602 prélèvements respiratoires obtenus 25 sur trois années consécutives par le LDA71 20 15 Nouveau ! dans le cadre du diagnostic vétérinaire [12, 13]. 10 Les prélèvements respiratoires sont : T Des techniques 5 d’amplification génique - un écouvillonnage nasal (EN) ; 0 en temps réel (qPCR) - une aspiration transtrachéale (ATT) ; 0 1234 Nombre d'agents pathogènes ont été récemment mises - un prélèvement de poumon. au point, qui permettent 2. La deuxième étude (étude 2), réalisée par de détecter rapidement l’École Vétérinaire de Toulouse (INP-ENVT), techniques conventionnelles (étude 1) la le virus respiratoire est un peu différente car elle entre dans le technique PCR améliore la sensibilité de syncytial bovin (VRSB), cadre d’un projet de recherche ICSA (Institut détection notamment des bactéries respira- le virus Parainfluenza Carnot pour la Santé Animale) Respicare. toires, et plus particulièrement P. multocida. de type 3 (bPI3), Les critères d’inclusion des prélèvements 2. Les co-infections sont apparues très fré- le Coronavirus bovin sont des écouvillons nasaux (EN) et des lava- quentes dans plus de 40 p. cent des cas ère (bCoV) et les bactéries ges broncho-alvéolaires (endoscopie sous pour la 1 étude et plus de 63,2 p. cent e M. bovis, M. haemolytica, anesthésie, LBA) simultanés chez trois à cinq des cas pour la 2 (figure 1). Il n’est pas res- P. multocida et H. somni. veaux par élevage, non traités aux antibio- sorti d’association préférentielle entre les tiques, non vaccinés et en début d’infection agents infectieux au moins pour l’étude 2. respiratoire (stade hyperthermie). Quatre- G Cette fréquence de co-infections a aussi vingt-deux veaux, issus de 19 élevages nais- été récemment observée dans une étude seurs ont ainsi été testés. irlandaise dans laquelle un virus a été identi- fié dans 35 p. cent des troubles respiratoires Les résultats de deux études récentes et où 40 p. cent des veaux infectés avaient ACTUALITÉS § Globalement ces études font ressortir les plus de deux virus présents [11]. points suivants (tableau 1) : 3. Les différences entre les études 1 et 2 1. Dans respectivement 80 p. cent et 94 p. s’expliqueraient par une possible suresti- cent des cas (études 1 et 2), il a été possible mation de la fréquence (très importante) de d’identifier un des sept agents respiratoires P. multocida dans la deuxième étude. recherchés. Les différences peuvent être Dans cette étude, un nombre non négligea- expliquées par les critères d’inclusion de ble de prélèvement ont des valeurs P. multo- chaque étude. Par comparaison avec des cida très proches de la valeur seuil négative.

LE NOUVEAU PRATICIEN VÉTÉRINAIRE élevages et santé vol 8 / n°31 9 MAI / AOÛT 2015 - 81 actualités en perspective - vers l’identification de nouveaux virus respiratoires bovins

4. Il existe une grande fréquence de détec- limité de prélèvements pour l’étude 2). tion du coronavirus bovin (bCoV), variable Par ailleurs, elles concernent principalement selon les études entre 17 et 53 p. cent des les élevages naisseurs. prélèvements, et cela y compris dans les pré- G Les résultats seraient probablement diffé- lèvements de l’appareil respiratoire profond. rents pour les autres types de production. Pour l’étude 2 menée à l’ENVT, dans 30 p. cent des LBA positifs en bCoV, ce virus est le VERS UNE CARACTÉRISATION DE NOUVEAUX VIRUS RESPIRATOIRES seul agent pathogène identifié. Pour les 70 BOVINS ? p. cent restant, les associations les plus fré- quentes sont observées avec H. somni (66 p. G Depuis quelques années, de nouveaux cent), puis le VRSB (33 p. cent). Compte tenu projets de recherche ont pour but de mieux de cette forte prévalence, il serait intéres- caractériser les pathogènes respiratoires, sant de pouvoir mieux caractériser à l’avenir et notamment d’identifier de nouveaux le pouvoir pathogène de ce virus, considéré agents, principalement des virus. comme modéré jusqu’à présent. G Trois explications majeures peuvent être 5. La fréquence actuelle de détection de M. avancées. Nouveau ! bovis est autour de 10 p. cent, avec des 1. Même avec des techniques très sensibles T Dans deux études récentes résultats similaires entre les deux études. comme les PCR, il existe encore un pour- réalisées par la technique PCR, 6. La fréquence de H. somni est relative- centage non négligeable de résultats néga- un des sept agents ment importante (entre 17 et 43 p. cent). tifs (5 p. cent et 20 p. cent pour les études 1 respiratoires recherchés Cette bactérie était probablement sous- et 2, respectivement), même lorsque l’on a été identifié. détectée auparavant, dans la mesure où son cible l’ensemble des pathogènes respiratoi- T Les co-infections isolement nécessite des conditions particu- res connus et que l’on se place dans les sont apparues très fréquentes lières de culture. conditions optimales d’échantillonnage. dans plus de 40 p. cent G Des différences dans les fréquences de Se pose alors la question de l’existence de e des cas pour la 1ère étude détection ont été observées lors de la 2 virus respiratoires bovins encore non identifiés. et plus de 63,2 p. cent étude selon que la PCR a été réalisée sur G En santé humaine, par exemple, au moins des cas pour la 2e. écouvillons nasaux (EN) ou liquide broncho- deux virus respiratoires pathogènes, le alvéolaire (LBA). Ces différences sont parti- Métapneumovirus humain et le Bocavirus T Il existe une grande culièrement notoires pour le VRSB qui est (parvovirus), ont été isolés ces 10 dernières fréquence de détection détecté quatre fois plus dans le LBA par rap- années chez l’enfant. du Coronavirus bovin port aux EN. De même, M. bovis est plus fré- 2. Si le pouvoir pathogène individuel d’un (bCoV), variable quemment détectée dans le LBA. selon les études entre 17 agent est bien connu, ne le sont, en revan- Ces résultats vont dans le sens de la premiè- che, pas les co-infections et leur importance. et 53 p. cent re étude bien que les différences observées des prélèvements. 3. La troisième explication est d’ordre (analyses par type de prélèvement, ATT ou méthodologique et liée au développement T La fréquence actuelle EN versus poumon) soient nettement moins récent d’outils très performants de détection de détection de M. bovis importantes pour le VRSB. En revanche, les et de recherche de pathogènes (figure 2). est autour de 10 p. cent. fréquences de détection du bPI3 sont simi- Parmi ceux-ci le séquençage à haut débit T Les intérêts des séquençages laires quelle que soit la nature du prélève- (NGS, pour next generation sequencing) à haut débit reposent ment. Les explications seraient liées au tro- permet maintenant d’analyser des millions sur leur puissance pisme tissulaire des agents incriminés ou à de séquences, à des coûts acceptables pour leur pouvoir pathogène, en supposant que de détection et le caractère la recherche, en quelques heures à partir les prélèvements pulmonaires et les LBA non ciblé de la recherche. d’un même prélèvement [14]. Il permet donc soient plus représentatifs d’une forme cli- T Leurs limites portent une recherche exhaustive de nouveaux virus nique sévère. Pour les pasteurelles, la fré- sur l’analyse bioinformatique ou bactéries présents dans l’échantillon quence de détection est plus grande dans de ces mégadonnées testé (figure 3). les EN par rapport aux LBA ou ATT, et ce, de et leur interprétation. G Les intérêts de ces techniques reposent manière plus marquée pour P. multocida, au sur leur puissance de détection et le carac- moins dans la première étude. tère non ciblé de la recherche. Les limites de ces études G Leurs limites portent sur l’analyse bioin- G Ces deux études, si elles apportent des formatique de ces megadonnées et leur indications récentes sur la prévalence des interprétation, notamment en termes d’im- agents pathogènes respiratoires, doivent putabilité clinique sur le terrain. toutefois être considérées par rapport à leurs G Ainsi deux approches peuvent être défi- limites liées aux modes opératoires (absence nies : de critères stricts d’inclusion dans l’étude 1, - une approche ciblée qui repose sur une élevages uniquement naisseurs et nombre hypothèse préalable, donc sur les connais-

LE NOUVEAU PRATICIEN VÉTÉRINAIRE élevages et santé vol 8 / n°31 82 - MAI / AOÛT 2015 10 sances existantes (données préliminaires, Figure 2 - Démarche méthodologique de la technique NGS pathologie comparée, ...) et “l’intuition” appliquée aux prélèvements respiratoires bovins (ENVT, UMR INRA IHAP 1225) scientifique ; - une approche qui repose sur une recher- Traitement nucléase che exhaustive de tous les virus et / ou bac- téries présents, puis une analyse des résul- tats obtenus. Une approche ciblée : un cas d’identification Lavage Extraction de l’Influenza virus D (IDV) bronchoalvéolaire de ARN/ADN Ultracentrifugation et (RT-)PCR G La détection récente d’un Influenza virus Séquençage aléatoire bovin est typique de l’approche ciblée. Analyse bioinformatiques Aux États-Unis

G En 2011, des porcs présentant un syndrome fébrile ont été échantillonnés aux USA, pour recherche de virus. Un nouveau virus a alors été identifié, puis classifié comme un Influenza du genre C (C/OK) [6]. Des études phylogénétiques et sérologiques ultérieures (inhibition de l’hémagglutination) ont mon- tré que ce virus était finalement différent des En France Influenza C, et que ces différences étaient G En France, l’INP-ENVT, en collaboration même plus importantes que celles existant avec le LDA 71, a recherché l’IDV par entre les genres A et B du virus Influenza. Il a RTqPCR sur des prélèvements (EN, aspira- En médecine humaine, par conséquent été proposé comme un tion transtrachéale ATT, poumons) utilisés T Au moins deux virus nouveau genre Influenza D (virus IDV) dans pour le diagnostic des virus respiratoires respiratoires pathogènes, la famille des Orthomyxoviridae [7]. bovins (Bronchopneumonies infectieuses), le Métapneumovirus humain G Dans la mesure où la prévalence du virus et récoltés entre 2010 et 2013 (à raison de 25 et le Bocavirus (parvovirus), Influenza de type D (IDV) était faible chez les échantillons par an) et début 2014 (34 échan- ont été isolés porcs, ce virus a été recherché dans d’autres tillons) [3]. ces 10 dernières années espèces, notamment dans l’espèce bovine, - Six échantillons, soit 4,5 p. cent, sont IDV chez l’enfant. en tenant compte des données épidémiolo- positifs : quatre de la campagne de collecte giques existantes. Il a été détecté pour la de 2014 et deux échantillons antérieurement première fois en 2012 - 2013 chez des bovins récoltés en 2011 et 2012 et conservés au américains présentant des troubles respira- laboratoire (tableau 2). toires. - Deux échantillons de 2014 sont négatifs A : Varic...virus G En 2014, toujours aux USA, la détection par pour tous les autres pathogènes recherchés B : Sim...virus RT-qPCR à partir de 206 écouvillons nasaux (bCoV, bPI3, VRSB, BVDV, Pasteurella multo- C : Mar...virus D : Percavirus (EN) de veaux malades a montré que 5 p. cida, Mannheimia haemolytica, Histophilus E : Betabaculovirus cent d’entre eux étaient positifs à l’IDV [7]. somni et M. bovis). F : Alphabaculovirus G : Coccolithovirus Figure 3 - Résultat d’un NGS sur un lavage broncho-alvéolaire avec identification 1 : Bovine herpesvirus 1 2% de l’ensemble des séquences virales, notamment celles du VRSB, responsable 2 : Suid herpesvirus 1 1% du trouble respiratoire observé (ENVT, UMR INRA IHAP 1225) 3 : Human herpesvirus 3 0,9% 4 : 4 genres viraux de plus 4 56 7 1 2 3 8 9 5 : Bovineherpesvirus 2 2% 10 6 : 5 genres viraux de plus Séquences Classification Alphaherpesviridae A B C D 11 7 : Gallid herpesvirus 3 2% reconnues Herpesviridae Gamma- herpesvirinae 8 : Lymphocryptovirus 1% 12% Herpesvirales 9 : Equid herpesvirus 2 1% Mononegavirales Pestivirus 10: Betaherpesvirinae 0,8% 6% Baculoviridae 11 : Bovine viral diarrhea virus 1 12% VRSB Racine 12 94% 6% E 12 : Choristoneura occidentalis Caudovirales F 13 82% Respiratory syncytial Virus granulovirus 5% G virus 43% Phycodnaviridae 14 13 : 7 genres viraux de plus Paramyxoviridae 15 14 : Siphoviridae 2% 16 Séquences ciblées Archéobactéries Pneumovirus 15 : 3 genres viraux de plus 17 Séquences cellulaires 16 : Emiliania huxleyi virus 86 2% Virus Bactérie ou non assignées 17 : 19 genres viraux de plus

LE NOUVEAU PRATICIEN VÉTÉRINAIRE élevages et santé vol 8 / n°31 11 MAI / AOÛT 2015 - 83 actualités en perspective - vers l’identification de nouveaux virus respiratoires bovins

Tableau 2 - Caractérisation des six prélèvements français positifs pour l’influenza virus D Date Traitement d’échantillon Age Vaccination VRSB bPI3 P. multocida M. haemolytica M. bovis H. somni bCoV BoHV-1 antibiotique Type 25/01/2014 Adulte Oui nd N N fP fP N P nf P Poumon 05/02/2014 12 mois Oui N N N N N N nf nf Poumon 18/02/2014 1 mois Oui Oui N N N N N N N nf Poumon 14/03/2014 1 mois Non Oui N N fP N N fP N nf Poumon 30/03/2011 nd nd nd N N P N N N nf nf Poumon 17/01/2012 écouvillon nd nd nd P N fP fP N N nf nf nasal Les prélèvements ont fait en contre les principaux - nd : non disponible - N : négatif- P : positif parallèle l’objet d’une recherche pathogènes respiratoires connus. - nf : non fait - fP : faiblement positif

- Des co-infections ont été observées pour modèle animal qui permette l’étude de la les quatre autres échantillons avec le VRSB, pathogénicité des Influenza virus chez l’hom- Pasteurella multocida, Mannheimia haemo- me. Il n’existe cependant pas de données Essentiel lytica et Histophilus somni. exhaustives sur le caractère zoonotique de T Même avec des techniques - Le génome d’un des six isolats français ce virus, une seule étude a montré une séro- très sensibles (D/bovine/France/2986/2012) a été séquen- prévalence de 1,3 p. cent en 2009 dans une comme les PCR, cé. Il est très proche des deux souches cohorte de 306 personnes âgées [6]. il existe encore américaines connues d’IDV, mais forme Une approche exhaustive par NGS un pourcentage cependant un rameau génétique différent. (next generation sequencing) : non négligeable Dans les autres pays la caractérisation du “virome” de résultats négatifs, G Depuis, l’IDV a été récemment identifié en respiratoire des bovins même lorsque l’on cible Chine [15], en Italie, au Royaume-Uni et au l’ensemble des pathogènes Chili (communication personnelle) mais il est G Cette approche exhaustive par NGS (next generation sequencing) consiste à respiratoires connus fort probable que sa distribution soit beau- séquencer en masse les prélèvements et que l’on se place coup plus étendue. dans les conditions optimales respiratoires obtenus chez des animaux § d’échantillonnage. Pour le moment, il existe peu de don- malades et / ou sains. Les millions de nées sur la séroprévalence de l’infection séquences obtenues sont ensuite analysées par l’IDV chez les bovins. pour identifier l’ensemble des virus (virome) G Aux USA, elle pourrait être élevée et / ou bactéries présentes. puisque, sur huit élevages testés, sept se Nouveau ! G Compte tenu du caractère novateur de ces sont révélés séropositifs avec une séropréva- approches, seules deux études ont récem- T Un nouveau virus Influenza lence intra-troupeau importante [7]. ment été publiées en 2015 sur la recherche D (virus IDV) dans la famille G En France, la séroprévalence individuelle du virome respiratoire des bovins. des Orthomyxoviridae a été pourrait aussi être importante (données personnelles en cours de validation). Il a Première étude sur le virome respiratoire détecté chez les porcs, des bovins puis, en 2012-2013, ainsi été suggéré que les bovins sont le chez des bovins américains. réservoir de l’IDV, sans que l’on dispose de 1. Un nouveau virus sur la recherche preuves scientifiques. du virome respiratoire des bovins ... T En France, le génome Il existe encore moins d’information sur le G La première étude du virome respiratoire d’un des six isolats, pouvoir pathogène de ce virus chez les des bovins est relativement limitée. Elle a a été séquencé. bovins, même si l’IDV a été majoritairement permis d’identifier un nouveau virus à partir Il est très proche des deux isolé de veaux présentant des signes cli- de prélèvements respiratoires post-mortem souches américaines niques respiratoires. lors d’une épizootie sévère de bronchop- connues d’IDV, mais forme Des essais en station expérimentale sont en neumonies infectieuses (BPI) apparue en cependant un rameau cours de programmation aux USA et en 2013 dans un feedlot du sud-Ouest des génétique différent. France, à l’INP-ENVT. États-Unis [16]. G Chez le porc, l’IDV se multiplie sans indui- G La technique NGS a été utilisée en raison re de signes cliniques [6]. Ce virus se d’une absence de détection d’agents patho- réplique aussi chez le furet, le principal gènes via les techniques classiques d’isole-

LE NOUVEAU PRATICIEN VÉTÉRINAIRE élevages et santé vol 8 / n°31 84 - MAI / AOÛT 2015 12 actualités en perspective - vers l’identification de nouveaux virus respiratoires bovins ment. Un nouveau nidovirus bovin (BoNV) Tableau 3 - Fréquence des agents infectieux détectés appartenant à un nouveau genre de par PCR spécifiques chez 50 veaux atteints d’affections respiratoires Torovirinae, une sous-famille de Coronavirus et 50 veaux sains provenant des mêmes élevages (d’après [10]) a été identifié. Sur six prélèvements (poumon, Fréquence de trachée et nœud lymphatique trachéo-bron- détection des virus Différences chique) provenant de quatre bovins, trois se identifiés par NGS Veaux malades Veaux sains (test Fisher) sont avérés contenir des séquences de ce (next generation nouveau virus. Une étude sérologique sur 127 sequencing) sérums de bovins américains présentant des G Adénovirus bovin 3 48 % 10 % p < 0.0001 signes cliniques respiratoires a montré une G Rhinovirus bovin A 24 % 8 % p = 0.009 prévalence de 9 p. cent pour le BoVN. G Rhinovirus bovin B 10 % 2 % p > 0.2

2. ... dont l’imputabilité clinique G Influenzavirus D 14 % 0 % P = 0.012 n’est pas démontrée G Parvovirus bovin 2 8 % 2 % P = 0.36 G L’imputabilité clinique de ce virus n’a G Astrovirus bovin 8 % 0 % P = 0.117 cependant pas été démontrée. G Picobirnavirus bovin 2 % 0 % P = 1 G D’autres virus ont en effet été détectés par cette technique, tels que le bCoV (un prélè- Les différences vement sur six) et un herpèsvirus bovin (deux connus), les séquences obtenues présen- statistiquement significatives sont en rouge. prélèvements sur six). Par ailleurs, aucun tent, par ordre de fréquence décroissant, prélèvement de veaux sains du même feed- des homologies avec le rhinovirus bovin de lot n’a été réalisé à titre comparatif. type A (BRAV), l’adénovirus bovin de type 3 (bAd3), l’adénovirus-associé (BAAV, depen- La deuxième étude sur des veaux doparvovirus B), le rhinovirus bovin de type Définition 1. De nouveaux virus identifiés dans B (BRBV), l’astrovirus-BSRI1 (BoAstV-BSRI1), T La caractérisation du virome les sécrétions nasales des veaux laitiers ... le virus Influenza D bovin (IDV), les picobirna- respiratoire est réalisée e virus, le parvovirus bovin de type 2 et l’her- G La 2 étude par NGS (next generation par le séquençage de masse sequencing) a consisté à rechercher de pèsvirus bovin de type 6. (NGS pour next generation manière exhaustive des séquences virales à - Par ailleurs, un nombre élevé de co-infec- sequencing) partir d’écouvillonnages nasaux profonds tions est, là aussi, observé avec au moins des prélèvements respiratoires réalisés chez des veaux laitiers américains deux virus dans 38 p. cent des échantillons obtenus chez des animaux âgés de 1 à 2 mois et présentant des signes provenant de veaux malades, versus 8 p. malades et / ou sains. cliniques respiratoires [10]. Cinquante veaux cent pour les veaux contrôles. malades ont ainsi été prélevés. Par ailleurs, G Toutefois, il est impossible de savoir dans pour chaque veau malade, un veau physi- cette étude si les co-infections ont un rôle quement proche mais ne présentant pas de majeur dans l’apparition des signes cli- signes cliniques a aussi été prélevé. niques respiratoires. L’analyse métagénomique a été réalisée sur 2. ... dont le pouvoir pathogène les veaux malades par mélange de cinq n’est pas connu Nouveau ! veaux, soit 10 mélanges au total. L’analyse a G Pour associer la détection de ces virus avec T Un nouveau virus permis d’obtenir 23,7 millions de séquences un quelconque pouvoir pathogène (présen- a été identifié : le nidovirus dont 11,5 millions ont été exploités, après éli- ce de signes cliniques respiratoires), des bovin (BoNV) appartenant mination des séquences du génome bovin, tests PCR, spécifiques des principaux virus à un nouveau genre des séquences de bactéries, des séquences identifiés, ont été élaborés et utilisés paral- de Torovirinae, doublons et des séquences illisibles. lèlement sur les 50 veaux malades et les 50 une sous famille - Dans 32 p. cent des échantillons, il n’a pas veaux apparemment sains [10] (tableau 3). de coronavirus. été possible d’identifier de séquences vira- Une association statistique entre maladie et les. Différentes raisons peuvent être avan- présence du virus a pu être observée pour T Cette technique NGS cées, d’ordre méthodologique (élimination l’adénovirus bovin de type 3 (bAd3), le rhi- est actuellement utilisée / dégradation des ARN lors de leurs traite- novirus bovin de type A (BRAV) et le virus à l’INP-ENVT pour caractériser ments, absence de séquence homologue Influenza D bovin (IDV). de manière exhaustive dans les banques, niveau de présence en G Le bAd3 (Adénovirus bovin de type 3) est l’ensemble des virus présents dessous du seuil de détection, échantillon- un adénovirus très prévalent dans les feed- dans l’appareil respiratoire nage trop tardif, ...) ou d’ordre biologique lots américains (50 p. cent de séroconver- profond, lors de bronchop- (présence de virus respiratoires, mais uni- sion), où il a été associé à un syndrome fébri- neumonie infectieuse. quement dans l’appareil respiratoire pro- le sans perte de poids [9]. Son inoculation fond, infections uniquement bactériennes). par voie intratrachéale à des veaux de 4 - Dans les autres échantillons, par comparai- mois et privés de colostum a provoqué un son avec les banques génomiques (243 virus syndrome fébrile [8].

LE NOUVEAU PRATICIEN VÉTÉRINAIRE élevages et santé vol 8 / n°31 13 MAI / AOÛT 2015 - 85 actualités en perspective - vers l’identification de nouveaux virus respiratoires bovins

Références G Le BRAV (Rhinovirus bovin de type A) est le des études épidémiologiques. La démons- 1. Arcangioli MA, Duet A, Meyer G, coll. The role plus souvent considéré comme non patho- tration du pouvoir pathogène lors d’inocula- of Mycoplasma bovis in bovine respiratory disease gène ou de pathogénicité mineure, bien tion d’épreuve est alors plus difficile pour les outbreaks in veal calf feedlots. Vet J 2008;177(1):89-93. qu’il n’existe aucune donnée expérimentale virus qui agissent par co-infection avec d’au- 2. Beaudeau F, Björkman C, Alenius S, coll. Spatial permettant de le confirmer ou de l’infirmer. tres virus ou comme agents initiateurs des patterns of bovine corona virus and bovine respi- G Pour l’IDV (virus Influenza D bovin), ces infections bactériennes. ratory syncytial virus in the Swedish beef cattle population. Acta Vet Scand 2010;21; 52:33. résultats confirment la prévalence non 3. Ducatez MF, Pelletier C, Meyer G. Influenza D négligeable (14 p. cent) de ce virus unique- CONCLUSION virus in cattle, France, 2011-2014. Emerg Infect Dis. ment chez les veaux malades. Dans 85 p. 2015;21(2):368-71. G Ces dernières années, l’identification et la 4. Luzzago C, Bronzo V, Salvetti S, coll. Bovine cent des situations, l’IDV a été détecté en caractérisation des pathogènes respiratoi- respiratory syncytial virus seroprevalence and risk présence du bAD3 et du BPV2. res bovins est en plein essor. De nouveaux factors in endemic dairy cattle herds. Vet Res Commun 2010;34(1):19-24. 3. L’absence des virus respiratoires virus apparaissent, dont la présence dans 5. Gulliksen SM, Jor E, Lie KI, coll. Respiratory pathogène connus ? l’appareil respiratoire des animaux malades infections in Norwegian dairy calves. J Dairy Sci. a été clairement établie. Toutefois, il faut 2009;92(10):5139-46. G En revanche, cette étude n’a pas permis 6. Hause BM, coll. Isolation of a novel swine d’identifier les virus respiratoires connus tels bien distinguer les pistes qui relèvent de la influenza virus from Oklahoma in 2011 which is dis- que le BoHV-1, le bPI3, le BVDV, le bCoV et recherche des réalités du terrain. tantly related to human influenza C viruses. 2013 Le virus respiratoire syncytial bovin (VRSB) PLoS pathogens 9(2):e1003176. le VRSB. Selon les auteurs [10], compte tenu 7. Hause BM, coll. Characterization of a novel de l’exhaustivité de la méthode utilisée, leur reste actuellement l’agent pathogène viral influenza virus in cattle and Swine: proposal for a non détection reflète probablement leur majeur le plus fréquemment isolé. Les coro- new genus in the Orthomyxoviridae family. 2014 navirus bovins (bCoV) et les virus parainfuen- mBio 5(2):e00031-0001. absence dans les écouvillons nasaux testés 8. Lehmkuhl HD, Smith MH, Dierks RE. A bovine ou leur présence à des quantités inférieures za (bPI3) sont eux aussi très présents mais adenovirus type 3 : isolation, characterization, and au seuil de détection. leur rôle pathogène demande à être mieux experimental infection in calves. Arch Virol précisé. 1975;48:39-46. G Mais, le statut vaccinal des animaux n’était 9. Mattson DE, Norman BB, Dunbar JR. Bovine pas documenté. Cette étude souffre aussi G Pour les nouveaux virus, leur importance adenovirus type-3 infection in feedlot calves. Am J d’une description imprécise des critères d’in- ne pourra être établie qu’après une Vet Res 1988;49:67-9. démonstration claire de leur pouvoir patho- 10. Ng TFF, Kondov NO, Deng X, coll. A metage- clusion des veaux, notamment pour les signes nomics and case-control study to identify viruses cliniques respiratoires. Par ailleurs, les séquen- gène. Là réside toute la difficulté à étudier et associated with bovine respiratory disease. J. Virol, ces virales ont été obtenues à partir d’écou- comprendre l’action d’un virus au pouvoir 2015;89(10):5340-9. doi:10.1128/JVI.00064-15 pathogène modéré mais capable d’agir en 11. O'Neill R, Mooney J, Connaghan E, coll. Pat- villons nasaux et des échantillons de l’appareil terns of detection of respiratory viruses in nasal respiratoire profond, type lavage broncho- synergie avec d’autres virus et / ou bactéries. swabs from calves in Ireland: a retrospective study. alvéolaire (LBA) ou aspiration transtrachéale, Les approches, type NGS, devraient nous Vet Rec. 2014;175:351. aider à mieux comprendre l’importance des 12. Pelletier C. In-house multiplex real time PCR (ATT) auraient été probablement plus repré- for simultaneous diagnosis of six major respiratory sentatifs des troubles respiratoires observés. co-infections en pathologie bovine.  pathogens in young cattle : three years of expe- Cette technique NGS est actuellement utili- rience in Burgundy. 16th Intern Symposium of the WAVLD, Berlin 2013. sée à l’INP-ENVT pour caractériser de formation continue 13. Pelletier C. Use of in-house multiplex real time manière exhaustive l’ensemble des virus PCR for simultaneous diagnosis of six major respi- présents dans l’appareil respiratoire profond 1. En élevage naisseurs, lors de broncho- ratory pathogens in young cattle : two years of lors de BPI (LBA de l’étude 2). pneumonies, le coronavirus bovin est-il experience in Burgundy. European Buiatric Forum, très fréquemment détecté dans les cavi- Marseille, 2013:37. § L’approche NGS est une première étape tés nasales et/ou l’appareil respiratoire 14. Pelletier C, Pez F, Francilette M, coll. Séquen- d’identification de virus d’intérêt. La puis- çage NGS : applications pratiques en médecine profond ? a. oui b. non vétérinaire. Le Point Vét, 2015;356:54-7. sance de l’outil permet en effet une détec- 15. Sheng Z, Ran Z, Wang D, coll. Genomic and tion sans à priori de l’ensemble des virus 2. Dans les études récentes de prévalence evolutionary characterization of a novel influenza- présents chez l’animal, sous réserve que l’a- des pathogènes respiratoires, C-like virus from swine. Archives of virology les co-infections représentent-elles 2014;159(2):249-55. nalyse bio-informatique des métadonnées 16. Tokarz R, Sameroff S, Hesse RA, coll. Discovery soit réalisée avec un maximum de contrôles. moins de 30 p. cent des cas ? a. oui b. non of a novel nidovirus in cattle with respiratory dis- G Comme pour les PCR, les conditions de ease. J Gen. Virol, 2015. doi:10.1099/vir.0.000166. 3. Un Influenzavirus du genre D a été 17. Valarcher JF. In vivo persistence and genetic prélèvement (races, types de production, evolution of bovine respiratory syncytial virus. PhD saisonnalité, localisation, ...) peuvent modi- identifié récemment chez des veaux Thesis Univ C. Bernard Lyon 1, 1999:265. fier les résultats. présentant des affections respiratoires. De même, le coût des analyses ne permet A-t-il été démontré que ce virus est NÉVA responsable des troubles observés ? EUROPARC 15, rue E. Le Corbusier actuellement que de tester un nombre limi- 94035 CRÉTEIL CEDEX té d’animaux. a. oui b. non Tél : (33) 1-41-94-51-51 G 4. Le séquençage de masse (NGS) est-il Courriel : [email protected] Si un virus d’intérêt est identifié, il ne pourra être considéré comme d’importance réel- une méthode qui permet une recherche exhaustive de l’ensemble des séquences Les auteurs déclarent le que lorsque son pouvoir pathogène aura ne pas être en situation été démontré par des études d’inoculation virales présentes dans un échantillon ? de conflit d’intérêt. d’épreuve en station expérimentale ou par a. oui b. non Reproduction interdite LE NOUVEAU PRATICIEN VÉTÉRINAIRE Toute reproduction ou représentation, intégrale ou partielle, par quelque procédé que ce soit, de la présen- élevages et santé vol 8 / n°31 te publication sans autorisation est illicite et constitue une contrefaçon. L’autorisation de reproduire un article 86 - MAI / AOÛT 2015 14 dans une autre publication doit être obtenue auprès de l’éditeur, NÉVA. 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