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XVIII Jornada de Iniciação Científica PIBIC CNPq/FAPEAM/INPA Manaus - 2009 IDENTIFICAÇÃO DE INIBIDORES PROTEOLÍTICOS EM EXTRATOS FOLIARES DE ESPÉCIES DE LEGUMINOSAS ARBÓREAS DA FLORA AMAZÔNICA Cristiane Santos do Carmo Ribeiro de SOUZA1; Larissa Ramos CHEVREUIL2; Andréia Fernandes VARMES3 'Bolsista PIBIC/FAPEAM/INPA; 2Co-orientadora INPA/CPST; 30rientadora INPA/CPST 1. Introdução A diversidade vegetal da Amazônia exibe grande potencial econormco, Dentre as famílias botânicas, destaca-se a Fabaceae que além de ser fonte de alimento para a dieta humana e animal pode também fornecer biomoléculas e/ou princípios ativos utilizados pelas indústrias de fármacos e de cosméticos (Souza e Silva, 2001). No que diz respeito às biomoléculas, encontram-se os inibidores proteolíticos, os quais são proteínas que interagem específica e reversivelmente com diferentes classes de enzimas proteolíticas (Bode e Huber, 2000). Nas plantas, esses inibidores podem estar presentes em sementes, raízes, folhas, flores e frutos, e exercem importantes funções, podendo atuar na regulação das proteinases endógenas, como proteínas de reserva e na resistência de plantas contra o ataque de insetos e patógenos (Marra et ai., 2009). Considerando a importância desses inibidores proteolíticos para aplicações biotecnológicas e sua elevada concentração na família Fabaceae, o objetivo deste estudo foi detectar a presença de inibidores de serinoproteinases em tecidos foliares de Parkia pendula, Parkia platycephala, Enterolobium schomburgkii, Enterolobium contortisiliquum e Enterolobium maximum. 2. Material e Metõdos Folhas maduras e em bom estado fitossanitário das especies P. pendula, P platycephala, E. schomburgkii, E. contortisiliquum e E. maximum foram secas, moídas e homogeneizadas em solução de NaCI 0,15 M (10% pjv), posteriormente centrifugadas e o sobrenadante submetido à diálise para retirada do sal, resultando no extrato total. A concentração das proteínas dos extratos totais foi estimada pelo método de Bradford (1976). O ensaio para determinação da atividade inibitória da tripsina e quimotripsina bovina consistiu na pré-incubação do tampão Tris-HCI 0,05 M pH 8,0, água deionizada, amostra e enzima (tripsina ou quimotripsina bovina), durante 10 minutos a 37°(, Em seguida, foram adicionados os substratos específicos para a tripsina e quimotripsina, BAPNA e BTPNA, respectivamente, prosseguindo-se à incubação durante 30 minutos a 37°C. Essa reação foi paralisada pela adição de ácido acético a 30% (vjv) e a hidrólise dos substratos foi monitorada por meio da absorbância a 410 nm (Espectrofotômetro UV/ Visível Ultrospec 2100 pro, Armesham Biosciences). 3. Resultados e discussão Determinação de proteínas totais Os teores de proteínas totais estimados nas espécies estudadas variam de 0,7 a 7,5 mg/g MF, sendo os menores valores encontrados para E. schomburgkii e E. contortisiliquum, enquanto os maiores teores foram para as espécies P. pendula, P. platycephala e E. maximum (Figura 1). No que diz respeito ao conteúdo protéico em extratos foliares de outras leguminosas arbóreas da flora Amazônica, as espécies Caesalpinia multijuga, Caesalpinia echinata e Leucaena leucocephala apresentaram concentração protéica de 2,7; 3,1 e 1,3 rnq/q MF, respectivamente (dados não apresentados). 10 IL ::E 9 ..•.... .e"" 8 .,.. 7 c: ~ I) e a. 5 ,ti "O•• I I ...o 4 3 ~'" I ! c: 2 u••• c: o 1 u o I P. pendu/a P. p/atyrepha/a E. schomburgkü E. rontortisiliquum E. maximum Figura 1 - Concentração de proteínas em extratos foliares de leguminosas arbóreas da Amazônia. 126 XVIII Jornada de Iniciação Científica PIBIC CNPq/FAPEAM/lNPA Manaus - 2009 Em sementes de E. schomburgkii a concentração de proteínas foi 0,9 mgjg MF, enquanto que sementes de P. pendula o teor foi 4,5 mgjg MF (Chevreuil, 2009). Estes resultados demonstram que tanto sementes como folhas da espécie E. schomburgkii apresentam baixos teores de proteínas. Contudo, tais resultados podem estar sendo influenciado pelo tipo de extrator (solução de NaCI), visto que existem diversos métodos de extração de proteínas, os quais são baseados em sua solubilidade, podendo, desta forma, também serem extraídas em soluções ácidas ou básicas, em água, em soluções alcoólicas, bem como por meio de solventes orgânicos (Osborne, 1924). Inibição da tripsina Os extratos foliares das espécies estudadas apresentaram inibição diferenciada contra a tripsina, variando de 35 a 81% (Figura 2). 100 ~ 90 ~ 80 ..<:: :; 70 .<>o 60 ••c ViD. SO E 40 11 ...., I o 30 n ••u- I :f! 20 I ~ 10 ' n j o IJ I P. pendu/a P. p/atyr:epha/a E schomburgldi E c:ontottisiliquum E maximum Figura 2 - Inibição da atividade da tripsina bovina sobre o substrato BAPNA pelos extratos foliares de leguminosas arbóreas da flora Amazônica. No que diz respeito à atividade inibitória da tripsina entre as espécies em estudo, observa-se que apenas P. pendula, P. platycephala e E. maximum apresentaram inibição acima de 50%. Neste sentido, tais espécies apresentam potencial para futuros estudos envolvendo o efeito biológico dos inibidores sobre proteinases de insetos e microorganismos, uma vez que, para tais ensaios, considera-se a concentração de inibidor capaz de promover a redução em 50% da atividade enzimática (lCso). Poucos estudos, envolvendo a detecção de inibidores tripsina em leguminosas, têm sido conduzidos em extratos foliares. Contudo, já se tem relatos da presença de inibidores de tripsina em folhas de Entada africana, Cassia obtusifolia, Parkia biglobusa e Sesbania pachycarpa (Vanderjagt et ai., 2000). Inibição da quimotripsina- A atividade inibitória da quimotripsina também se mostrou diferenciada nos extratos foliares das espécies estudadas, variando de 9 a 64% (Figura 3). No entanto, apenas a espécie P. platycephala apresentou percentagem maior que 50%, sendo a atividade inibitória da quimotripsina 17% menor, comparada à da tripsina. 100 z.. 90 :;<:: 80 o .<>.. 70 c iÍl 60 ViD. ;: Õ so I I ~ 40 ' I ::J I <T I ..,.. 30 o 20 •• 11I :f!'" ~ 10 I o n I r-l n P. pendu/a P. pIatycepha/a E. schomburgldi E c:ontortisiJiquum Emaximum Figura 3 - Inibição da atividade da quimotripsina bovina sobre o substrato BTPNA pelos extratos foliares de leguminosas arbóreas da flora Amazônica. ·127 XVIII Jornada de Iniciação Científica PlBIC CNPq/FAPEAM/lNPA Manaus - 2009 Os inibidores proteolíticos vegetais apresentam variação quanto à especificidade inibitória, onde os inibidores tipo Kunitz são potentes inibidores de tripsina e pouco específicos para quimotripsina (Garcia et ai., 2004; Macedo et ai., 2007). Essa diferença de especificidade de inibição enzimática é explicada mediante a formação de um complexo estável entre enzima e inibidor, o qual é dependente da interação de aminoácidos presentes no sítio reativo do inibidor com os aminoácidos do sítio ativo da enzima, determinando uma interação altamente específica com suas enzimas proteolíticas alvo (Haq et ai., 2004; 2005). Desse modo, quando a posição Pl do sítio reativo for ocupada por um aminoácido lisina ou arginina, o inibidor será reconhecido pela tripsina, porém se o sítio reativo apresentar triptofano, fenilalanina, tirosina ou leucina, o inibidor será reconhecido pela quimotripsina. Assim, dependendo do tipo de resíduo de aminoácido no sítio reativo do inibidor, existe uma enzima específica que atua sobre este inibidor (Bode e Huber, 2000; Scarafoni et ai., 2008; Legowska et ai., 2009). A espécie Parkia speciosa, representante do mesmo gênero das espécies estudadas P. pendula e P. pia tycephala , também não apresentou valores consideráveis de inibição para quimotripsina em sementes (Norioka et ai, 1988). 4. Conclusão Inibidores de tripsina e quimotripsina estão presentes em extratos foliares das espécies estudadas, onde as espécies P. pendula, P. platycephala e E. maximum apresentaram as maiores percentagens de inibição contra a tripsina, enquanto para a quimotripsina, apenas a espécie P. platycephala apresentou inibição acima de 50%. A partir disto, sugere-se que diferentes órgãos vegetais, além de folhas das espécies P. pendula, P. platycephala e E. maximum por exibirem potencial para aplicação em futuros ensaios envolvendo a atividade biológica de inibidores de tripsina devam ser relacionados entre as espécies alvo nas pesquisas sobre inibidores proteolíticos. 5. Referências Bode, W.; Huber, R. 2000. Structural basis of the endoproteinase-protein inhibitor interaction. Biochimica et Biophysica Acta, 1477:241-252. Bradford, M. M. 1976. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principie of dye binding. Anal Biochemistry, 72: 248-254. Chevreuil, L.R. 2009. Extração e purificação de inibidores proteolíticos em sementes de leguminosas arbóreas da Amazônia. Dissertação de Mestrado, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia/ Fundação Universidade do Amazonas, Manaus, Amazonas, 80 p. Garcia, V.A.; Freire, M.G.M.; Novello, J.c.; Marangoni, S.; Macedo, M.L.R. 2004. Trypsin inhibitor from Poecilanthe parviflora seeds: Purification, characterization, and activity against pest proteases. The Protein Journal, 23(5): 343-350. Haq, S.K.; Atif, S.M.; Khan, R.H. 2004. Protein proteinase inhibitor genes in combat against insects, pests, and pathogens: natural and engineered phytoprotection. Archives of Biochemistry and Biophysics, 431: 145-159. Haq, S.K.; Atif, S.M.; Khan, R.H. 2005. Biochemical characterization, stability studies and N- terminal sequence of a bi-functional inhibitor from Phaseolus aureus Roxb. (Mung bean). Biochimie, 87: 1127 - 1136. Legowska, A.; Debowski, D.; Lesner, A.;