Julio Sergio dos Santos

A ULTRAESTRUTURA DOS ESPERMATOZOIDES DE ALGUMAS ESPÉCIES DA FAMÍLIA (AMPHIBIA: ANURA)

Campinas, 2015

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RESUMO Os anuros da família Leptodactylidae estão alocados em três subfamílias: , e Paratelmatobiinae. Com o auxílio da microscopia eletrônica, foram observados os espermatozoides de 23 espécies de leptodactilídeos buscando-se contribuir com elementos para o entendimento de incertezas filogenéticas. Em , gênero alocado em Leiuperinae, foram comparados os espermatozoides de representantes do grupo P. pusillae de espécies dos quatro clados recuperados na filogenia molecular, os quais correspondem aos grupos cromossômicos 2n=22, 20, 18 e 16. A análise das espécies de Pseudopaludicola mostrou que as cabeças dos espermatozoides são semelhantes e contém a vesícula acrossomal cobrindo o cone subacrossomal. Já as caudas dos espermatozoides de Pseudopaludicola apresentam diferenças marcantes. Nas espécies com número cromossômico 2n=22, Pseudopaludicola sp. 1 (grupo P. pusilla), P. saltica, P. falcipes e P. mineira, as caudas exibem fibras acessórias (justa-axonemal, membrana ondulante e a fibra axial). Essas fibras também são observadas em P. ternetzi e P. ameghini, ambas do clado com 2n=20, mas a sua fibra axial é mais desenvolvida. Nos indivíduos do clado com número cromossômico 2n=18, P. canga, P. facureae, P. giarettai, P. atragula e Pseudopaludicolasp. 2 e com 2n=16, P. mystacalis, a cauda apresenta a membrana ondulante espessa, caracterizando um bastão para-axonemal, o qual é mais curto do que a membrana ondulante da cauda dos Pseudopaludicola com número cromossômico 2n=22 e 20. As diferenças morfológicas ultraestruturais observadas nas caudas dos espermatozoides indicam que esses caracteres podem ser filogeneticamente informativos, quando mapeados na filogenia molecular, pois os perfis ultraestruturais da cauda coincidem parcialmente com a formação dos quatro clados filogenéticos e possibilitam levantar a hipótese de uma progressiva simplificação do espermatozoide durante a evolução do gênero Pseudopaludicola. A análise comparativa de espécies entre os gêneros de leiuperíneos mostra que as caudas dos espermatozoides de (P. albifrons, P. centralis, P. cicadae P. cuvieri), também exibem fibras acessórias, como a fibra justa-axonemal e a membrana ondulante, contudo, a membrana ondulante nesse gênero é mais longa que aquela encontrada em Pseudopaludicola. Além disso, as caudas dos espermatozoides de Physalaemus não mostram fibra axial. Do gênero , grupo irmão de

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Physalaemus, foram analisadas E. petersi, E. freibergi e E. puyango, cujas caudas apresentam fibra justa-axonemal, membrana ondulante e fibra axial. Esses gêneros diferem ainda pela membrana ondulante mais curta em Engystomops, corroborando a revalidação do gênero Engystomops.A cauda de Engystomops puyango difere de E. petersi e E. freibergi, clado Duovox, e é igual a E. pustulosus, do clado Edentulus, indicando a necessidade de ampliar os estudos desse gênero. A espécie diplolister, do gênero próximo a Physalaemus e Engystomops, apresenta na cauda do espermatozoide a fibra justa-axonemal e a membrana ondulante, as quais são semelhantes àquelas observadas nas espécies de Physalaemus, entretanto, a membrana ondulante de P. diplolister é menor que a observada em Physalaemus. A comparação dos espermatozoides de representantes das outras subfamílias de Leptodactylidae mostrou que Paratelmatobiinae, representada por P.poecilogaster, apresenta estruturas iguais àquelas observadas nos Pseudopaludicola do clado com número cromossômico 2n=22. Por outro lado, a espécie analisada, natalensis, Leptodactylinae, apresenta fibra axial bem desenvolvida, diferente daquela exibida nos espermatozoides de Engystomops, Pseudopaludicola e P. poecilogaster. A outra espécie de Leptoctylinae, Adenomeramarmorata, a qual era alocada em Leptodactylus, apresenta apenas o axonema na cauda do espermatozoide. Essa diferença ultraestrutural das caudas de A. marmorata e L. natalensis, corrobora a re-alocação de A. marmorata como espécie válida e diferente de Leptodactylus. As descrições ultraestruturais dos gametas masculinos dos leptodactilídeos mostram caracteres filogenéticos informativos, principalmente aqueles das caudas, contribuindo para o entendimento dos relacionamentos intra e intergenérico.

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ABSTRACT The anurans of the family Leptodactylidae are distributed in three subfamilies – Leiuperinae, Leptodactylinae and Paratelmatobiinae. The spermatozoa of 23 leptodactylid species were analyzed under an electron microscope in order to provide evidence for the better understanding of a number of phylogenetic uncertainties. In the case of the leiuperine genus Pseudopaludicola, the sperm of the representative of the P. pusilla group and those of four clades identified in the molecular phylogeny, which correspond to well-defined chromosomal groups with 2n=22, 20, 18, and 16, were compared. The analysis of the different Pseudopaludicola species found spermatozoa with heads of similar shape, which contain an acrosomal vesicle covering the subacrosomal cone. However, the tails present marked differences. In the species with 2n=22, that is, Pseudopaludicola sp. 1 (P. pusilla group), P. saltica, P. falcipes and P. mineira the tails present accessory fibers (juxtaxonemal fiber, undulating membrane and axial fiber). Fibers of this type are also observed in P. ternetz and P. ameghini (representatives of the 2n=20 clade), although the axial fiber is more developed. In the specimens of the 2n = 18 clade (P. canga, P. facureae, P. giarettai, P. atragula and Pseudopaludicola sp. 2) and the 2n=16 clade (P. mystacalis), the tail has a thick undulating membrane, characterized by a paraxonemal rod, which is shorter than the undulating membrane of the tail of Pseudopaludicola (2n=22 and 20). The ultrastructural morphological differences observed in the tails of the spermatozoa indicates that these traits are phylogenetically informative, given their partial correspondence to the four clades identified in the molecular studies, and provide evidence of a progressive simplification of the spermatozoa during the evolution of the genus Pseudopaludicola. The comparative analysis of the leiuperine genera indicates that in Physalaemus (P. albifrons, P. centralis, P. cicada and P. cuvieri), the tail of the spermatozoon also shows accessory fibers, such as the juxtaxonemal and the undulating membrane, although in this genus, the membrane is longer than that observed in Pseudopaludicola. In addition, there is no axial fiber on the tail of the spermatozoon in Physalaemus. In the case of Engystomops, sister group of Physalaemus, the species E. petersi, E. freibergi, and E. puyango the sperm tail presents all three types of fiber (juxtaxonemal, undulating membrane and axial fiber).The tail of these two genera also differ each other for the shorter undulating membrane in Engystomops,

ix corroborating the revalidation of the genus Engystomops. Additionaly, the tail of E.puyango differs from E. petersi and E. freibergi, Duovox clade, and it is similar to E. pustulosus, Edentulus clade, indicating the need of more studies in this genus.In Pleurodema diplolister, representing the genus closest to Physalaemus and Engystomops, the sperm tail has a juxtaxonemalfiber and undulating membrane, which are similar to those found in Physalaemus, although the membrane observed in Pleurodema diplolister is shorter than that observed in Physalaemus. Comparisons with other leptodactylid subfamilies indicated that the Paratelmatobiinae, represented by P. poecilogaster, has the same structures as those observed in the 2n = 22 clade of Pseudopaludicola. On the other hand, the leptodactyline species analyzed, Leptodactylusnatalensis, has a well-developed axial fiber, distinct from that found in the sperm of Engystomops, Pseudopaludicola and P. poecilogaster. However, in the other leptodactyline species analyzed, marmorata, previously allocated to Leptodactylus, the sperm tail has only an axoneme. This ultrastructural difference in the tails of A. marmorata and L. natalensis supports the status of A. marmorata as a valid taxon distinct from Leptodactylus.Overall, then, the ultrastructural description of the male gametes of a selection of leptodactylid species provided informative phylogenetic characters, especially with regard to the morphology of the sperm tails, contributing for the understanding of intra and intergeneric relationships.

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Sumário I INTRODUÇÃO ...... 01 1. Os anuros ...... 01 2. A família Leptodactylidae ...... 02 3. Espermatozoides nos anuros ...... 05 4. Justificativa do trabalho ...... 11 5. Objetivos...... 14 5.1. Objetivo geral ...... 14 5.2. Objetivos específicos ...... 14 6. Referências ...... 15

II ARTIGO I Diferências ultraestruturais nos espermatozoides de espécies de Pseudopaludicola (Amphibia, Anura, Leptodactylidae) com comentários filogenéticos…...... 23 1. Introdução...... 25 2. Material e Métodos ...... 27 3. Resultados ...... 28 4. Discussão ...... 29 5. Referências ...... 33 Tabela 1 ...... 41 Legendas da Figuras ...... 42 Figuras...... 44

III. ARTIGO II Características ultraestruturais dos espermatozoides de dez espécies de leptodactilídeos (Amphibia, Anura)...... 49 1. Introdução...... 51 2. Material e Métodos ...... 53 3. Resultados ...... 53 4. Discussão ...... 56 5. Referências ...... 59 Tabela 1 ...... 67 Legendas da Figuras ...... 68 Figuras ...... 70

IV. CONDISERAÇÕES FINAIS...... 75 Referências...... 77 Legendas das figuras ...... 80 Figuras ...... 81

V. APÊNDICE...... 84 Resultados de Pleurodema diplolister...... 84

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Agradecimentos À minha orientadora, Profa Dra. Shirlei M. Recco-Pimentel, por abrir as portas do seu laboratório e compartilhar suas experiências de ensino e teoria científica. À minha co-orientadora, professora Dra. Gisele Orlandi Introíni, pela confiança, dedicação, carinho e ensino da teoria e prática, as quais contribuíram para minha formação. Aos professores Dr. Daniel Pacheco Bruschi, Dra. Mary Anne Heidi Dolder e Dra.Lenita de Freitas Tallarico, pela leitura prévia desse trabalho. À professora Dra. Ana Cristina Prado Veiga-Menoncello, pelas críticas e sugestões ao trabalho e por auxiliar em diversos momentos, na parte experimental e teórica. Aos Professores Doutores Maurício Papa de Arruda, Stênio Vittorazzi e Andrea Aparecida Aro, pela agradável convivência e carinho. Também à professora Dra. Luciana Bolsoni Lourenço pelos ensinamentos de teoria científica. À Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo apoio financeiro. Aos docentes do Departamento de Biologia Estrutural e Funcional, pela contribuição a minha formação profissional. Em especial, a Profa. Dra. Mary Anne Heidi Dolder, por disponibilizar o seu laboratório para o trabalho experimental. Ao programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural, em especial à secretária Liliam Alves Senne. Às servidoras do Laboratório de Microscopia Eletrônica: Adriana, Ana e Stella. Aos professores e alunos do Departamento de Biologia Estrutural e Funcional, especialmente a Bruna. À colega de laboratório Maria Rodrigues, pela amizade, compaixão e parceria nos momentos inesquecíveis que tornaram esse trabalho prazeroso, audacioso, criativo e extremamente importante para a minha formação. Aos colegas de laboratório, em especial Ariane, Amanda, Karin, Kaleb, William, Débora, Dra. Cíntia, Livia e aos demais que passaram pelo laboratório nesse período. Tenho certeza que todos ajudaram no meu crescimento pessoal e profissional. Aos amigos da UNICAMP, em especial GDU, Yaoska e Natalia. Aos familiares, em especial Mãe Josefa, irmãos Regina, Ana, Paulo, Luiz e Maria, sobrinhos (os cinco), Zenaide e Graciele. Ao meu amor Bruno pela compreensão, incentivo e carinho que foram fundamentais no crescimento espiritual, pessoal e de luta contra qualquer preconceito.

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I. INTRODUÇÃO

1. Os anuros A classe Amphibia inclui as ordens: Gymnophiona, Caudata e Anura. A maioria dos anfíbios se concentra nas áreas tropicais, onde apresentaram relevante radiação adaptativa (Duellman e Trueb, 1986). Os anfíbios foram os primeiros representantes vertebrados a ocuparem o ambiente terrestre (Purves et al., 2005) e sua denominação amphi: dual + bios: vida mostra que a maioria dessas espécies vivem parcialmente na água e na terra. Atualmente essa classe é compreendida por 7347 espécies (Frost, 2015). A ordem Anura (anura: sem cauda) contém a maioria dos anfíbios, 6455 espécies (Frost, 2015). As relações filogenéticas existentes nessa ordem ainda apresentam controvérias e vêm sendo discutidas com auxílio de ferramentas moleculares, citogenéticas, morfológicas e ultraestruturais dos espermatozoides. Nos anuros existe grande diversidade dos modos reprodutivos (Duellman e Trueb, 1986), nos quais a deposição dos ovos pode ocorrer em ambientes aquáticos, terrestres e arborícolas (Haddad e Prado, 2005). As estratégias reprodutivas nos anuros combinam uma série de atributos morfológicos, fisiológicos e comportamentais, adaptados a certas condições ambientais (Pombal-Júnior e Haddad, 2005). A chuva é um fator externo importante na reprodução de anuros e a desova reprodutiva aquática é considerada primitiva em relação ao modo de reprodução terrestre (Duellman e Trueb, 1986; Scheltinga e Jamieson, 2003). O modo de reprodução terrestre, juntamente com a fertilização interna, ocorre, por exemplo, em E.coqui, Eleutherodactylidae (Kasinsky et al., 2005). A fertilização interna foi adquirida independentemente nas ordens Anura, Caudata e Gymnophiona (Lee e Jamieson, 1993). Essa fertilização, retida originalmente em Caeciliidae, na maioria das espécies da ordem Caudata e, também presente nos anuros Ascaphus truei é considerada plesiomórfica em relação à fertilização externa em meio aquático (Lee e Jamieson, 1993). Esses autores sugerem que houve uma divergência evolutiva que fez com que a maioria dos anuros tivesse a fertilização externa e, em grupos mais basais, existisse a fertilização interna.

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2. A família Leptodactylidae A família Leptodactylidae, nominalmente, foi proposta em 1896 por Werner. Atualmente é formada por 199 espécies encontradas em diferentes regiões das Américas Norte, Central e Sul (Frost, 2015). É um grupo diversificado e que vem sofrendo constante revisão taxonômica (Frost et al., 2006; Grant et al., 2006; Fouquet et al., 2013),exibindo variação cariotípica de 2n=16 a 2n=26 (De Lucca et al., 1974). Lynch (1971) propôs a criação de quatro subfamílias para agrupar os leptodactilídeos, correspondendo a Ceratophryinae, Hylodinae, Leptodactylinae e Telmatobiinae. Ford (1989) afirmou que os leptodactilídeos apresentam ausência de sinapomorofia. Em 1996, Ruvinsky e Maxson sugeriram que essa família era polifilética, o que foi constatado também por Darst e Cannatella (2004) e posteriormente, por dados moleculares, uma vez que seus representantes formaram dois agrupamentos distintos, Leptodactylinae I: Pleurodema, Edalorhyna, Physalaemus e Pseudopaludicola, e Leptodactylinae II: Adenomera, , Leptodactylus e Vanzolinius, mostraram ser parafiléticos com relação à Cycloramphinae I: Paratelmatobius e Scythrophrys (Frost et al., 2006). De acordo com esses autores, estes agrupamentos somados ao gênero Somuncuria passaram então a ser reconhecidos como leptodactilídeos. Para um melhor entendimento das relações de parentesco entre os leptodactilídeos, Grant et al. (2006) ampliaram os estudos moleculares e propuseram uma nova estruturação para a família Leptodactylidae que passou a ser composta somente por quatro gêneros: Hidrolaetere, Leptodactylus, Paratelmatobius e Scythrophrys. Pseudopaludicola, Physalaemus (incluindo Engystomops e Eupemphix sensu Nascimento et al., 2005), Edalorhyna, Pleurodema e Somuncuria foram alocados na família Leiuperidae. Pyron e Wiens (2011), por meio de dados de filogenia molecular, verificaram que a família Leptodactylidae é parafilética em relação à Leiuperidae. Esses autores propuseram então a expansão da família Leptodactylidae, incluindo os gêneros Edalorhyna, Engystomops, Eupemphix, Physalaemus, Pleurodema, Pseudopaludicola e Somuncuria na subfamília Leiuperinae. Os autores também incluíram na subfamília Paratelmatobiinaeos gêneros Paratelmatobius e Scythrophrys. Na subfamília Leptodactylinae, ficaram alocados os gêneros Leptodactylus, Adenomera, Lithodytes e (Figura 1)

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Figura 1: Parte do cladograma de Pyron e Wiens (2011)

Ohler e Dubois (2012) validaram a subfamília Paratelmatobiinae. Fouquet et al. (2013), com base em dados moleculares, afirmaram que Rupirana é táxon irmão de Scythrophrys+ Crossodactylodes+ Paratelmatobius. Assim, Paratelmatobiinae foi confirmada com os gêneros Paratelmatobius, Scythrophrys, Rupirana e Crossodactylodes. Fouquet et al. (2013) consideraram que o ninho de espuma pode ter evoluído de forma independente nas subfamílias Leptodactylinae e Leiuperinae. A presença do ninho de

3 espuma nos leiuperíneos pode ter contribuído para a diversificação de espécies, principalmente em relação ao gênero Physalaemus (Fouquet et al., 2013). Historicamente, os estudos sobre as relações intra e intergenéricas entre os leptodactilídeos são antigos. No relacionamento intergenérico dos leiuperíneos foram levantados diversos questionamentos referentes às relações envolvendo o gênero Pseudopaludicola e outros leiuperíneos. Heyer (1974), em concordância com o estudo de Lynch (1971), sugeriu que Pseudopaludicola estaria relacionado ao gênero Physalaemus e que Pleurodema, por sua vez, seria o grupoirmão de Physalaemus e Pseudopaludicola. Heyer (1975), utilizando caracteres morfológicos, cromossômicos e reprodutivos, indicou Pseudopaludicola como mais relacionado à Physalaemus e Pleurodema. Cannatella e Duellman (1984), em estudos também baseados em caracteres morfológicos sugeriram a origem de Pseudopaludicola a partir de um grupo de Physalaemus (P. cuvieri, P. fernandezae e P. henselii). Porém, essa hipótese relacionada ao surgimento do gênero Pseudopaludicola foi questionada por Lynch (1989), pois dois dos caracteres (dados larvais e osteológicos) apresentam variações em ambos os gêneros. As relações entre Engystomops e Physalaemus também sempre foram motivo de controvérsia. Engystomops foi descrito por Jimenéz-de-la-Spada (1872), porém, foi sinonimizado a Physalaemus por Lynch (1970). Nascimento et al. (2005) com base na morfologia externa e osteologia dos Physalaemus, obtiveram sete grupos fenéticos: P. cuvieri, P. signifer, P. albifrons, P. deimaticus, P. gracilis, P. henselii e P. olfersii. Ademais, esses autores revalidaram os gêneros Engystomops e Eupemphix. A revalidação para o gênero Engystomops também foi confirmada por Ron et al. (2006, 2010). Sobre a espécie Eupemphix nattereri, Faivovich et al. (2012), com base em dados moleculares e reprodutivos de Pleurodema, consideraram E. nattereri sinônimo junior de Physalaemus. Lourenço et al. (2008) analisaram dados moleculares e cariotípicos dos gêneros Scythrophrys e Paratelmatobius. Nessa análise incluíram Pseudopaludicola falcipes, a qual foi recuperada como grupo irmão do gênero Leptodactylus. Entretanto, Lourenço et al.

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(2008) consideraram que a relação exata entre os ramos não está resolvida, devido ao baixo suporte de valores de bootstrap. Fouquet et al. (2013) afirmaram que o gênero Pseudopaludicola é grupo irmão de todos os outros representantes da subfamília Leiuperinae, contrariando dados de autores, como Grant et al. (2006) e Faivovich et al. (2012). Entre os representantes de Leptodactylinae, diversos questionamentos foram levantados. Por exemplo, Heyer (1969) subdividiu o gênero Leptodactylus em cinco grupos fenéticos: L. fuscus, L. melanonotus, L. ocellatus, L. pentadactylus e L. marmoratus. Heyer (1974) alocou as espécies do grupo L. marmoratus no gênero Adenomera. De La Riva (1996), com base em dados morfológicos de girinos, questionou esse arranjo entre Leptodactylus e Adenomera. Em 1998, Heyer, usando dados de bioacústica e morfologia, apontaram o parafiletismo de Leptodactylus em relação à Adenomera, Vanzolinius e Lithodytes. Frost et al. (2006), com base em dados moleculares, concluíram que Adenomera é sinônimo de Lithodytes e subgênero de Leptodactylus. Contudo, em diversas análises, Ponssa e Heyer (2007), Zaracho e Hernando (2011), Pyron e Wiens (2011) e Fouquet et al. (2013) afirmaram que Adenomera é distinto do gênero Leptodactylus.

3. Espermatozoides nos anuros As células germinativas migram para as gônadas onde se estabelecem e se proliferam por mitose, produzindo as oogônias nas fêmeas e as espermatogônias nos machos. Nos anuros, essas células germinativas estão arranjadas em cistos (Prado et al., 2004). Na diferenciação dessas células reprodutivas, a oogônia dará origem ao ovócito e a espermatogônia dará origem ao espermatozoide. Uma vez formados os espermatozoides, esses se concentram livres no lúmen dos túbulos seminíferos, juntamente com outras espermátides em diferenciação (Prado et al., 2004). Nos anfíbios existe a condição primitiva dos sistemas de ductos, a qual retém o espermatozoide nos testículos até a liberação deles para o ambiente de fertilização. Os ductos testiculares agem apenas na condução do espermatozoide. Além disso, Duellman e Trueb (1986) descreveram uma característica importante em todos os anfíbios, a existência

5 de corpos adiposos de coloração amarelada, os quais servem de reserva nutricional para as gônadas (Fitzpatrick, 1976). Em torno das células de Sertoli, agrupam-se as células germinativas, formando os cistos de espermatócitos, os quais contêm células no mesmo estágio de diferenciação (Báo et al.,1991; Oliveira et al.,2002). Os espermatozoides se encontram próximos à luz e as espermatogônias são localizadas na base do epitélio no tecido germinativo. Os estágios para formação do espermatozoide são: espermatogônia primária, espermatogônia secundária, espermatócito primário, espermatócito secundário e espermátide, conforme estudos realizados em Bufo arenarum (Burgos e Fawcett, 1956) e em Hyla ranki (Taboga e Dolder, 1991), entre outros. O tamanho do gameta masculino dos anuros pode ser variável. O comprimento do espermatozoide varia normalmente entre 25 e 180 μm, mas pode chegar a 2330 μm, como é o caso de Discoglossus pictus, Alytidae (Furieri, 1975). Já Leiopelma hochstetteri, Leiopelmatidae, alcança 250 μm (Scheltingaet al., 2001). Nos anuros, o espermatozoide pode conter diversas estruturas, como a vesícula acrossomal que recobre um espaço epinuclear, um cone subacrossomal, um perforatório endonuclear e o núcleo (Garda, 2002). Na cabeça, estruturas associadas (perforatório e/ou cone subacrossomal, estruturas homólogas em Garda et al., 2002), assumem formas variadas: cilíndrica, fusiforme e “saca-rolhas” (Scheltinga e Jamieson, 2003). A vesícula acrossomal, nos anuros, pode apresentar duas formas: (1) intimamente associada com a parte apical do núcleo ou (2) pode estar separada da parte apical do núcleo pelo cone subacrossomal (Scheltinga e Jamieson, 2003). Na família Ranidae, a vesícula acrossomal está localizada na parte apical do núcleo na forma de disco ou “saca-rolha”. Nos espermatozoides de P. falcipes, Leptodactylidae, o complexo acrossomal é composto por uma vesícula acrossomal e abaixo dessa pode ser encontrado o perforatório cônico, também chamado de cone subacrossomal, o qual cobre a porção anterior do núcleo (Amaral et al., 2000). Diferentemente, o espermatozoide dos leptodactilídeos P. thaul (Pugin-Rios, 1980) e L. wagneri (Scheltinga, 2002) não exibiram o cone subacrossomal. Os espermatozoides de diversos representantes da família Ranidae não apresentaram o cone (Qin et al., 2007).

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As inferências filogenéticas associadas à presença e ausência do cone nos espermatozoides de diversos anuros, permanecem incertas. Scheltinga (2002) sugeriu que a ausência dessa estrutura seria uma modificação derivada em Leiopelmaltidae, Pipidae, Ascaphidae e Myobatrachidae. O cone subacrossomal possuía aspecto de um anel contínuo e homogêneo de feixes na espécie Ameerega flavopicta, Dendrobatidae (referida como E. flavopictus em Garda et al., 2002) e em A. femoralis, Aromobatidae (referida como E. femoralis, Aguiar-Junior et al., 2003). Já nos espermatozoides de P. gracilis, P. biligonigerus (Amaral et al., 1999), P. marmoratus (referida como P. fuscomaculatus em Amaral et al., 1999) e P. falcipes (Amaral et al., 2000), Leptodactylidae, o cone (referido aqui como estrutura de denominação igual a perforatório) era formado por numerosos corpos densos de aspecto não contínuo e não homogêneo no plano transversal. A peça intermediária do espermatozoide dos anuros, geralmente, apresenta a fossa nuclear, o centríolo proximal, o distal, o início do flagelo e o colar de mitocôndrias (Scheltinga e Jamieson, 2003). O espermatozoide de Pleurodema thaul foi o primeiro descrito na literatura para um leptodactilídeo (Pugin-Rios, 1980). Uma característica peculiar do espermatozoide desse leptodactilídeo é a ausência de um colar de mitocôndrias e em alguns representantes da família Myobatrachidae as mitocôndrias foram observadas aderidas ao redor da fibra axial da cauda (Lee e Jamieson, 1992). Apesar do gameta masculino de Leptodactylus wagneri também não apresentar um colar de mitocôndrias, as mesmas foram vistas na região posterior do núcleo e início da cauda (Scheltinga, 2002). Em Ameerega hahneli e A. trivittata, Dendrobatidae (referidas como E. hahneli e E. trivittata em Aguiar-Junior et al., 2004) o espermatozoide apresenta um colar de mitocôndrias bem desenvolvido, o qual se situa na porção posterior do núcleo até a porção anterior da cauda. Em Anomaloglossus stepheni, Aromobatidae (anteriormente Colostethus stepheni, Dendrobatidae) foi verificado um colar de mitocôndrias em torno da porção anterior do

7 flagelo e, além disso, algumas mitocôndrias foram encontradas na membrana ondulante da cauda (Veiga-Menoncello et al., 2006). Physalaemus nattereri (anteriormente Eupemphix nattereri sensu Nascimento et al., 2005) apresenta bainha citoplasmática envolvendo o colar mitocondrial e lamelas aneladas, as quais são visualizadas em espermátides tardias. No corte transversal, conforme ocorre mais próximo da região da cauda e distante da peça intermediária, essa bainha diminui em espessura (Zieri et al., 2008). As caudas dos espermatozoides dos anuros podem exibir diferentes estruturas, como a membrana ondulante e a fibra axial. Essas estruturas podem fornecer informações filogenéticas relevantes (Scheltinga, 2002). O número de axonemapode variar como é o caso incomum descrito para Telmatobufo australis, Calyptocephalellidae (anteriormente Leptodactylidae, em Scheltinga, 2002), que possui dois axonemas (Pugin-Rios, 1980). Incomum também é apresença de duas caudas verificada no espermatozoide de Allobates femoralis (referida como E. femoralis), por Aguiar-Junior et al. (2003) e em Allobates sp. aff. trilineatus, A. brunneus e A. nidicola (referidas como Colostethus em Veiga-Menoncello et al., 2006). Diferentemente, em Anomaloglossus stepheni (referida como C. stepheni em Veiga- Menoncello et al., 2006), foi encontrada uma única cauda. Esses dados foram importantes para refutar a proposta de Morales (2000), de que a espécie A. stepheni pertencia ao mesmo grupo de A. brunneus (Veiga-Menoncello et al., 2006). Outro estudorealizado com Hylodes phyllodes, Megaelosia massarti e Crossodactylus sp. (Hylodidae) mostrou espermatozoides com uma única cauda, entretanto, exibiram caudas com dimensões variadas das fibras acessórias, constituídas de fibra justa- axonemal, membrana ondulante e fibra axial (Aguiar-Junior et al., 2006). Em diversos grupos de anuros, as fibras acessórias das caudas dos espermatozoides variaram na constituição, por exemplo, as caudas dos espermatozoides de Rhinella arenarum (Bufonidae) (referida como Bufo arenarum em Burgos e Fawcett, 1956), de alguns bufonídeos (Lee e Jamieson, 1993), de A. truei (Ascaphidae) (Jamieson et al., 1993), de P. falcipes (Leptodactylidae) (Amaral et al., 2000), de O. cultripes (Odontophrynidae) (Báo et al., 2001), de L. hochstetteri (Leiopelmatidae) (Scheltinga et al., 2001) e de L.

8 lineatus (Leptodactylidae) (Salles, 2014), a região da membrana ondulante alojou uma lâmina axial, chamada de fibra axial, constituída de material com forte elétron densidade. Por sua vez, nas caudas dos espermatozoides de algumas espécies do gênero Physalaemus, P. gracilis, P. biligonigerus (Amaral et al., 1999), P. marmoratus (referida como P. fuscomaculatus em Amaral et al., 1999) e P. nattereri (Leptodactylidae) (referida como E. nattereri em Zieri et al., 2008) não foi observada a fibra axial. Fibra axial bastante dilatada e com aspecto fortemente elétron-denso foi observada em Leptodactylus wagneri (Scheltinga, 2002) e L. podicipinus (Salles et al., 2013). Ausência de fibras acessórias foi detectada em P. paradoxa, P. tocantins, P. bolbodactyla (Hylidae) (Garda et al., 2004) e em alguns ranídeos do gênero Rana (Kwon e Lee, 1995). Apesar da diversidade já observada nos espermatozoides de anuros, ainda são necessárias mais descrições dessas células que retratem fielmente a diversidade morfológica gamética entre as espécies presentes nessa ordem (Frost, 2015). Um resumo das principais estruturas presentes nos espermatozoides de alguns representantes da família Leptodactylidae é apresentado no quadro 1.

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Quadro 1: Estruturas dos espermatozoides testiculares de alguns representantes da família Leptodactylidae.

Leiuperinae Leptodactylinae

Espécies Pleurodema Physalaemus Physalaemus Physalaemus Pseudopaludicola Engystomops Physalaemus Leptodactylus Leptodactylus Lithodytes 1 2 2 3 4 5 7 Estruturas thaul biligonigerus gracilis marmoratus2 falcipes pustulosus nattereri wagneri4 podicipinus6 lineatus

X X X X X X X X X X Vesícula acrossomal Cone X X X X X X subacrossomal/ Perforatório Forma cônica X X X X X X X X X X vesícula Espaço X X X X X X X X subacrossomal Núcleo X X X X X X X X X X

Fossa nuclear X X X X X X X X X X posterior Colar de X X X X X X X X mitocôndrias X X X X X X Canal citoplasmático X X X X X Anel citoplásmico X Lamelas aneladas Material X X X X pericentriolar Estriações X X X X X X transversais X X X X X X X X Fibra justa-axonemal X X X X X X Fibra axial X X X X X X X X X X Membrana ondulante X X X X X X X X X X Axonema único Dados: 1Pugin-Rios (1980), 2Amaral et al. (1999), 3Amaral et al. (2000), 4Scheltinga (2002), 5Zieri et al.(2008), 6Salles et al. (2013), 7Salles (2014). X: indica presença.

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4. Justificativa do Trabalho Entre os anuros, os do gênero Pseudopaludicola, alocados na família Leptodactylidae sensu Pyron e Wiens (2011) são interessantes para estudos científicos que usam a morfologia, a análise molecular - sequências de DNA, citogenética e a ultraestrutura de espermatozoide, por conta das controvérsias sobre suas relações intra- e intergenéricas. O gênero Pseudopaludicola (Miranda-Ribeiro, 1926) é composto por sapos de pequeno porte (Cardozo e Lobo, 2009). Um dos estudos mais importantes para o grupo Pseudopaludicola foi produzido por Lynch (1989) que fez uma revisão do gênero, confirmando o seu monofiletismo e separando as espécies em dois grupos, um deles, o de P. pusilla, caracterizado pela presença de uma falange terminal em forma de “T”, composto por P. pusilla, P. ceratophyes, P. boliviana e P. llanera, e o outro grupo, que não apresenta esse tipo de falange constituído por P. falcipes, P. mystacalis e P. ternetzi. Mais recentemente, algumas espécies novas como P. giarettai, P. parnaiba e P. hyleaustralis, foram descritas e ainda não foram alocadas em nenhum grupo (Veiga-Menoncello et al., 2014) Veiga-Menoncello et al. (2014), com base em dados moleculares, mostraram que o grupo de espécies de Pseudopaludicola que não apresenta a falange terminal em forma de T é parafilético ao grupo P. pusilla. Além disso, esses autores mostraram as espécies de Pseudopaludicolaalocadas em quatro clados, correspondentes aos grupos cromossômicos 2n=22, 2n=20, 2n=18 e 2n=16, e que o cariótipo 2n=22 representa uma condição plesiomórfica (Fig. 2).

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Figura 2: Parte do Cladograma de Veiga-Menoncello et al. (2014) para Pseudopaludicola. Lobo (1996), com base em caracteres morfológicos, propôs P. ameghini como sinônimo de P. mystacalis. Entretanto, essa sinonimização foi contestada por Favero et al. (2011), com base em diferenças marcantes observadas nos cariótipos, sendo P. mystacalis 2n=16 e P. ameghini 2n=20, claramente distintas citogeneticamente. Posteriormente, Pansonato et al (2013) propuseram P. ameghini como espécie válida e essa proposta foi

12 corroborada também pelos estudos de filogenia molecular de Veiga-Menoncello et al. (2014). Duarte et al. (2010) e Fávero et al. (2011) investigaram citogeneticamente diversas espécies e populações do gênero Pseudopaludicola. Esses estudos confirmaram a ocorrência de uma ampla variação cromossômica numérica intragenérica (2n=16 a 22), a qual havia sido anteriormente relatada para P. falcipes e P. ameghini (Cope, 1887) e atribuída, equivocadamente, a um polimorfismo intraespecífico presente em P. falcipes (Beçak, 1968; Batistic, 1970). Conforme detalhado anteriormente, ampliar o conhecimento sobre os quatro grupos de Pseudopaludicola pode favorecer o entendimento das relações nesse gênero. Além disso, essa melhor compreensão do relacionamento intragenérico pode ajudar no entendimento da relação intergenérica de Pseudopaludicola com os demais gêneros de leptodactilídeos que sempre foi motivo de discordâncias (Frost et al., 2006; Grant et al., 2006; Pyron e Wiens 2011; Faivovich et al., 2012; Fouquet et al., 2013). Somado a isso, outros gêneros leptodactilídeos também sofreram revisões taxonômicas. Entre essas revisões, destacamos aqui os leiuperíneos Physalaemus e Engystomops, os quais foram sinonimizados por Lynch (1970) e revalidados como distintos por Nascimento et al. (2005). Autores como Funk et al. (2007, 2008, 2009) não concordaram com essa revalidação. Atualmente, esses gêneros são considerados grupos irmãos nas filogenias de Pyron e Wiens (2011) e Fouquet etal. (2013). As relações filogenéticas dos anuros da subfamília Leptodactylinae (sensu Pyron e Wiens, 2011) também têm sido discutidas na literatura, como aquelas debatidas para o grupo L. marmoratus (=Adenomera marmoratus) em relação às demais espécies de Leptodactylus e de Lithodytes. Frost et al. (2006) afirmaram que Adenomera é sinônimo de Leptodactylus. Entretanto, outros autores, Ponssa et al. (2010), Pyron e Wiens (2011), Fouquet et al. (2013), De Sá et al.(2014) afirmaram que Adenomera é válido e distinto de Leptodactylus. Lithodytes lineatus foi alocada dentro de Leptodactylus e sinônimo de Adenomera por Frost et al. (2006), entretanto, Pyron e Wiens (2011), Fouquet et al. (2013) e De Sá et al. (2014) propuseram como diferente de Leptodactylus e grupo irmão de Adenomera.

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Nos útimos anos, foi crescente a obtenção de novos dados ultraestuturais de espermatozoides em diversos anuros (Scheltinga e Jamieson, 2003; Aguiar-Junior et al., 2003, 2006; Veiga-Menoncello et al. 2006; Muto e Kubota, 2011; Salles 2014). Esses dados, aliados às ferramentas (molecular, morfologia e canto) revelaram novas possibilidades de inferências de relacionamento e conhecimento sobre a evolução das diferentes famílias de anuros. Assim, a descrição de espermatozoides de representantes das três subfamílias de Leptodactylidae pode contribuir para o entendimento das relações intragenéricas, principalmente entre os Pseudopaludicola, e intergenéricas, de Pseudopaludicola, Physalaemus, Pleurodema, Engystomops, Adenomera, Leptodactylus e Paratelmatobius.

5. Objetivos

5.1. Objetivo geral

Analisar a ultraestrutura dos espermatozoides de representantes da família Leptodactylidae e comparar as caraterísticas ultraestruturais entre as espécies.

5.2. Objetivos específicos

 Comparar os caracteres ultraestruturais dos espermatozoides de espécies de Pseudopaludicola, alocadas no grupo P. pusilla (falange em forma “T”) e nos quatro clados, os quais correspondem aos quatro grupos cromossômicos, 2n=16 a 22.  Confrontar as características ultraestruturais dos gametas masculinos de espécies da subfamília Leiuperinae, principalmente aquelas removidas de Physalaemus e realocadas em Engystomops.  Comparar os caracteres ultraestruturais dos espermatozoides de representantes das subfamílias Leptodactylinae, Leiuperinae e Paratelmatobiinae, especialmente os gêneros Leptodactylus e Adenomera.

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II. Diferenças ultraestruturais nos espermatozóides de espécies de Pseudopaludicola (Amphibia, Anura, Leptodactylidae), com comentários filogenéticos

Ultrastructural sperm differences in Pseudopaludicola species (Amphibia, Anura, Leptodactylidae), with phylogenetic comments

1Julio Sergio dos Santos, 2Gisele Orlandi Introini, 1Ana Cristina Prado Veiga- Menoncello e 1Shirlei Maria Recco-Pimentel

1Departamento de Biologia Estrutural e Funcional, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Rua Charles Darwin, CEP 13083-863, Campinas, São Paulo,Brasil. E-mail do autor correspondente: [email protected] 2Departamento de Ciências Básicas da Saúde, Fundação Universidade Federal deCiências da Saúde de Porto Alegre (UFCSPA), Rua Sarmento Leite, 245, CEP: 90050-170, PortoAlegre, Rio Grande do Sul, Brasil.

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Resumo O gênero Pseudopaludicola é composto por pequenos anuros sul-americanos, cujas relações taxonômicas tem sido historicamente alvo de questionamentos. Inferências filogenéticas utilizando dados moleculares recuperaram quatro clados dentro de Pseudopaludicula, os quais demonstram correlação com as variações do número de cromossomos previamente detectado, 2n=22, 20, 18 e 16. No presente trabalho foi analisada a ultraestrutura dos espermatozoides de 12 espécies, com o objetivo de descrever sua morfologia e levantar caracteres ultraestruturais que possam contribuir para o melhor entendimento das relações em Pseudopaludicola. Os espermatozoides mostramdistinções nas estruturas que compõem a cauda. As caudas dos espermatozoides das espécies com número cromossômico 2n=22, Pseudopaludicola sp.1 (grupo P. pusilla), P. falcipes, P. mineirae P. saltica, assim como P. ameghini e P. ternetzi com 2n=20, exibem fibras justa- axonemal, membrana ondulante e fibra axial. Já as caudas das espécies com cariótipo 2n=18, P. facureae, P. giarettai, P. canga, P. atragula e Pseudopaludicola sp. 2, e também P. mystacalis com 2n=16, não apresentam fibras justa-axonemal e axial distinguível, caracterizando um bastão para-axonemal, com uma membrana ondulante espessa que é mais curta em relação à exibida nos outros Pseudopaludicola. As diferenças morfológicas ultraestruturais observadas nas caudas desses espermatozoides podem ser filogeneticamente informativas, pois essas caudas coincidem com alocação das espécies nos ramos da árvore filogenética e possibilitam levantar a hipótese de uma progressiva simplificação do espermatozoide durante a evolução desse gênero. Palavras-chave: Espermatozoide, Ultraestrutura, Pseudopaludicola, Anura.

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1. Introdução O gênero Pseudopaludicola Miranda-Ribeiro (1926) pertencente à família Leptodactylidae, subfamília Leiuperinae (Pyron e Wiens, 2011) é atualmente composto por 18 espécies (Frost, 2015) de pequeno porte, não ultrapassando 2,5 cm de comprimento. Essas espécies são amplamente distribuídas pela América do Sul, desde a Colômbia à Argentina, incluindo as Guianas e Suriname. Uma relevante revisão do gênero Pseudopaludicola foi realizada por Lynch (1989) na qual as espécies até então descritas foram alocadas em dois grupos fenéticos: Grupo “pusilla”, caracterizado pela presença de uma falange terminal em forma de “T” e composto pelas espécies P. boliviana Parker 1927, P. ceratophyes Rivero e Serna 1985, P. llanera Lynch 1989 e P. pusilla Ruthven 1916, e o grupo “falcipes”, composto pelas espécies P. falcipes Hensel 1867, P. ameghini Cope 1887, P. mystacalis Cope 1887, P. saltica Cope 1887 e P. ternetzi Miranda-Ribeiro, 1937 e que possuem falange terminal simples. Esse grupo foi considerado por Lynch, em sua revisão, parafilético em relação ao grupo “pusilla”. Espécies descritas posteriormente e que também apresentam falanges simples não foram alocadas em nenhum grupo, sendo elas, P. mineira Lobo 1994, P. murundu Toledo et al. 2010, P. giarettai Carvalho 2012, P. hyleaustralis Pansonato et al. 2012, P. facureae Andrade e Carvalho 2013, P. parnaiba Roberto et al. 2013 e P. atragula Pansonato et al. 2014. Pseudopaludicola canga Giaretta e Kokubum 2003, inicialmentefoialocada no grupo “pusilla”, mas posteriormente removida, devido a não comprovação da existência de falange terminal em T (Cardozo e Suárez 2012). A grande semelhança morfológica entre as espécies do gênero Pseudopaludicola contribui para as diversas mudanças taxonômicas, envolvendo sinonimizações e revalidações de espécies, por exemplo, Haddad e Cardoso (1987) usaram dados morfológicos e sinonimizaram P. ameghinicom P. mystacalis, entretanto, Strüssmann (2003), com base em dados bioacústicos e morfométricos, sugeriu a revalidação de P. ameghini. Fávero et al. (2011) encontraram uma diferença cariotípica marcante entre P. ameghini(2n=20) e P. mystacalis(2n=16) e corroboraram a hipótese de retirada de P. ameghini da sinonímia de P. mystacalis, realizada recentemente por Pansonato et al. (2013).Em outro exemplo conflitante de taxonomia, P. riopiedadenses foi diagnosticada

25 como distinta de outros Pseudopaludicola (Mercadal de Barrio e Barrio, 1994), mas, recentemente essa espécie foi sinonimizada com P. ternetzipor Cardozo e Toledo (2013). Pseudopaludicola serrana, descrita por Toledo (2010), foi considerada próxima de P. saltica e sinonimizada a P. murudu por Pansonato et al. (2014). Diversas espécies e populações de Pseudopaludicola foram citogeneticamente analisadas por Duarte et al. (2010) e Fávero et al. (2011). Esses autores confirmaram a ocorrência de variação no número diploide de cromossomos, observado anteriormente por Beçak (1968) e Batistic (1970), com a existência de quatro grupos distintos: 2n=16, 2n=18, 2n=20 e 2n=22. Veiga-Menoncello et al. (2014), com base em análise filogenética molecular, recuperaram quatro clados, concordantes com os quatro grupos cromossômicos. Esse estudo confirmou também o monofiletismo do gênero Pseudopaludicola e o parafiletismo das espécies que não possuem a falange em forma de “T” em relação ao grupo “pusilla”. A relação intergenérica de Pseudopaludicola com os demais representantes da subfamília Leiuperinae tem sido motivo de controvérsias (Lynch, 1971; Heyer, 1974; Heyer, 1975; Lobo, 1995; Frost et al., 2006; Grant et al., 2006; Pyron e Wiens, 2011; Faivovich et al., 2012; Fouquet et al., 2013). Com relação às características ultraestruturais dos espermatozoides de anuros, (ver Scheltinga e Jamieson, 2003) podemos destacar a importante contribuição na elucidação de alguns questionamentos relacionados à sistemáticaenvolvendo, por exemplo, em algumas espécies do gênero Litoria, família Hylidae (Meyer et al., 1997), do gênero Ameerega, família Dendrobatidae (anteriormente referido como Epipedobates, ver Aguiar-Junior et al., 2004) e dos gêneros Anomologlosuse Allobates, família Aromobatidae (referidos anteriormente como Colosthetus,ver Veiga-Menoncello et al., 2006). A ultraestrutura do espermatozoide também tem auxiliado no conhecimento das áreas de taxonomia e sistemática de outros grupos de vertebrados, por exemplo, em lagartos da família Teiidae (Callopistes flavipunctatus, Crocodilurus amazonicus, Dicrodon guttulatum, Dracaena guianensis e Teius oculatus) e Cercosaura ocellata, Gymnophthalmidae (Colli et al., 2007), em peixes Ostariophysi (Quagio-Grassioto e Oliveira, 2008), e em invertebrados, como nos insetos da família Eulophidae (Brito et al.,

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2009) e nos moluscos Isognomon bicolor e I. alatus (Introíni et al., 2009).Considerando o gênero Pseudopaludicola, a ultraestrutura do espermatozóide foi descrita apenas para uma espécie P. falcipes (Amaral et al., 2000). Diante da carência de informações ultraestruturais de espermatozoides em Pseudopaludicola, no presente trabalho foi realizada uma análise comparativa entre as espécies de Pseudopaludicolaque possuem falange simples e em forma de “T”, buscando correlacionar as características ultraestruturais dos espermatozoides com os quatro clados/grupos cromossômicos 2n=16, 2n =18, 2n=20 e 2n=22 recuperados na filogenia molecular (Veiga-Menconcello et al., 2014).

2. Material e Métodos 2.1. Espécies analisadas e locais de coleta Foram analisados os espermatozoides de 12 espécies de Pseudopaludicola coletadas em 15 localidades diferentes do Brasil (Tabela 1, Figura 1), com permissão do Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA - processos 02001.002003/2005-16 e 02001.002/2005/16). 2.2. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) Suspensões de célulasforam obtidas a partir de testículos retirados de animais previamente anestesiados por lidocaína e fixadas em glutaraldeído 2% + paraformaldeído 2% e gotejadas em lamínulas e pós-fixadas em solução de tetróxido de ósmio 1%. Posteriormente, essas lamínulas foram desidratadas em uma série crescente de álcool (30- 100%), levadas ao ponto crítico (CPD-030) e cobertas com partículas de ouro no Sputter Coater (SCD-050). As preparações foram observadas no Microscópio Eletrônico de Varredura Jeol - JSM 5800 LV. 2.3. Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) Os testículos foram fixados em glutaraldeído a 2% e paraformaldeído 2%, 24 horas, à 4ºC. Após lavagem em tampão cacodilato (0,1M), foram pós-fixados em solução de tetróxido de ósmio 1%, desidratados em uma série crescente de acetona (30-100%) e incluídos em resina Epoxi Epon 812.Cortes ultrafinos, obtidos em Ultramicrótomo Ultracult (UCT), foram transferidos para telas de cobre 200 mesh, submetidos ao acetato de

27 uranila 2% por 25 minutos, e citrato de chumbo de Reynolds por 8 minutos e observados no Microscópio Eletrônico de Transmissão Zeiss, Leo 906. 2.4. Apresentação dos resultados Foram selecionadas as micrografias eletrônicas que apresentavam estruturas bem definidas e ausência de material citoplasmático residual decorrente doprocesso de cito diferenciação. Devido a grande semelhança morfológica entre os espermatozoides, os resultados de MEV são apresentados apenas para as espécies Pseudopaludicola sp. 1, P. falcipes (idêntico a P. saltica e P. mineira), P. ameghini (idêntico a P. ternetzi), P. canga (idêntico a P. facureae), P. giarettai e P. mystacalis. Os dados obtidos por MET estão organizados por uma ou mais espécies, representando os diferentes grupos cromossômicos e mostrando as porções da cabeça, peça intermediária e cauda.

3. Resultados 3.1. MEV Os espermatozoides de todas as espécies de Pseudopaludicolasão alongados e apresentam cabeça no formato cônico (Figs. 2A-F). A cauda dos espermatozoides de Pseudopaludicola sp. 1 - Poconé (grupo P. pusilla), P. falcipes e P. ameghini (Figs. 2A-C) exibe membrana ondulante mais longa que aquela observada em P. canga, P. giarettai e P. mystacalis (Figs. 2D-F). O tamanho dos espermatozoides varia entre 50 a 80 µm. 3.2. MET 3.2.1. Cabeça e Peça Intermediária Todas as espécies analisadas, Pseudopaludicola sp. 1 - Poconé (grupo P. pusilla), P. saltica, P. ameghini, P. canga e P. mystacalis, apresentam vesícula acrossomal cobrindo completamente o cone subacrossomal, os quais revestem a porção anterior do núcleo (Figs 3A-J). Entre o cone e a porção anterior do núcleo observa-se o espaço subacrossomal, mostrado nas espécies P. saltica e P. ameghini (Fig. 3B, H). O núcleo do espermatozoide apresenta formato cônico e a cromatina exibe aspecto granuloso efortemente elétron-denso (Figs. 3A-O).

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O centríolo proximal e centríolo distal, em arranjo perpendicular, são encontrados na fossa nuclear (Figs. 3K-O). Um colar de mitocôndrias envolve a fossa nuclear e a região anterior da cauda. Estriações transversais são observadas entre o início da cauda e o centríolo distal (Figs. 3L-N). 3.2.2. Caudas As espécies Pseudopaludicola sp. 1 – Poconé (grupo P. pusilla) (Fig. 4A), P. saltica (Fig. 4B),P. mineira (Fig. 4C), P. ameghini (Fig. 5A) e P. ternetzi (Fig. 5B) apresentam um flagelo com axonema (9+2 microtúbulos). Ao lado desse axonema uma lâmina densa, dentro da membrana ondulante, conecta a fibra justa-axonemal e a fibra axial, as quais são altamente elétron-densas. No espermatozoide de P. canga (Fig. 6A), P. giarettai (Fig. 6B) e P. mystacalis (Fig. 6C) é observado apenas o axonema conectado a uma membrana ondulante espessa, caracterizando um bastão para-axonemal, no qual não é distinguível a fibra justa-axonemal e fibra axial. Uma representação esquemática correlacionando os tamanhos das caudas dos espermatozoides das espécies analisadas com os clados/grupos cromossômicos é mostrada na figura 7. Membranas ondulantes maiores são observadas para as espécies que possuem número cromossômico 2n=22 e 2n=20, enquanto que as demais com menor número cromossômico (2n=18 e 2n=16) exibem membrana ondulante espessa (bastão para- axonemal).

4. Discussão Nos últimos anos as descrições da ultraestrutura dos espermatozoides de alguns grupos de anuros contribuíram para um melhor entendimento do relacionamento intrafamiliar (Scheltinga, 2002; Scheltinga e Jamieson, 2003), assim como para os relacionamentos intra- e intergenérico em Pseudis (Garda et al., 2004), em Crossodactylus, Megaelosia e Hylodes (Aguiar-Junior et al., 2006),em Colostethus (Veiga-Menoncello et al., 2007), em Dendrobates (Lipke et al., 2009), em Leptodactyluse Lithodytes (Salles, 2014).

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Scheltinga e Jamieson (2003) propuseram que os estabelecimentos de relações filogenéticas baseadas apenas em caracteres ultraestruturais dos espermatozoides podem resultar em muitas homoplasias. Porém, o mapeamento de tais caracteresem filogenias menos abrangentes e bem suportadas, pode fornecer evidencias de sinal filogenético, como demonstrado no presente estudo. De acordo com a proposta atual de relacionamento intragenérico em Pseudopaludicola (Veiga-Menoncello et al.,2014) as espécies foram alocadas em quatro clados, para os quais houve uma correspondência com os diferentes números cromossomos, indicando uma progressiva redução cromossômica numérica. De maneira semelhante, o mapeamento dos dados ultraestruturais dos espermatozoide, especialmente a cauda,também corresponderam ao padrão de relacionamento recuperado para as espécies de Pseudopaludicola. Apesar da grande uniformidade das estruturas presentes na cabeça dos espermatozoides das espécies analisadas, encontramos variações na cauda que sugerem uma correspondência com os clados/números cromossômicos recuperados na filogenia. As espécies P. falcipes, P. saltica, P. mineira, Pseudopaludicola sp.1 (grupo pusilla) com 2n=22 e em P. ameghini e P. ternetzi, apresentam uma evidente fibra justa-axonemal, membrana ondulante delgada e fibra axial, sendo a membrana ondulante menos extensa nas duas últimas espécies portadoras de 2n=20. Enquanto que as espécies P. canga, P.atragula, P. facureae, Pseudopaludicola sp. 2 e P. mystacalis apresentam uma espessa membrana ondulante, sem fibra justa-axonemal distinta, caracterizando um bastão para-axonemal (denominação sugerida por Scheltinga, 2002; Scheltinga e Jamieson, 2003). Desse modo, a análise da ultraestrutura da cauda dos espermatozoides à luz da filogenia permite indicar uma possível simplificação dos espermatozoides dentro do gênero Pseudopaludicola. Kwon e Lee (1995) sugeriram que a cauda do espermatozoide com apenas axonema, sem membrana ondulante, seria uma característica derivada dos gêneros Rana, Rhacophorus e Xenopus. A simplificação da cauda dos espermatozoides também foi sugerida para o gênero Litoria (Meyer et al., 1997) e para alguns microhilídeos dos gêneros Cophixalus, Calluella, Ctenophryne e Sphenophryne (Scheltinga et al., 2002). Aguiar- Junior et al. (2004) também indicaram a expansão da membrana ondulante e a ausência da

30 fibra justa-axonemal como apomorfia em Ameerega trivittatus e A. hahneli (referidas como Epipedobates trivittatus e E. hahneli). A membrana ondulante delgada observada nos espermatozoides de P. falcipes (Amaral et al., 2000), já foi relatada em Rhinella marina e Litoria fallax (Lee e Jamieson, 1993), em Litoria cryptotis (Meyer et al., 1997) e em Atelopus spumarius (Siqueira et al., 2013), enquanto a membrana ondulante espessa, semelhante a observada no presente trabalho, foi encontrada no espermatozoide de Litoria brevipes (Meyer et al., 1997). A tentativa de atribuição de significados evolutivos para esses dados em níveis taxonômicos mais abrangentes é pouco informativa em função de homoplasias (Scheltinga e Jamieson, 2003). No entanto, quando a interpretação dos dados oriundos da ultraestrutura do espermatozoide é restrita a grupos taxonômicos menores e bem estabelecidos, pode trazer evidências de um significado filogenético, como sugerido no presente estudo. Por outro lado, a ultraestrutura do espermatozoide pôde em algumas situações contribuir para o esclarecimento de questões de classificação taxonômica tanto inter como intragenérica. Aguiar-Junior et al. (2004) apresentaram dados que não suportaram a alocação de Ameerega trivittata em um novo gênero, como proposto por Zimmermann e Zimmermann (1988). De maneira semelhante, Veiga-Menoncello et al. (2006) refutaram a proposta de fusão dos grupos “brunneus” e “alagoanus” (sensu Rivero, 1990), sugerida por Morales (2000), devido a ausência de espermatozoides biflagelados em Allobates stepheni (C. stepheni).Para as espécies de Pseudopaludicola, analisadas no presente trabalho, dois tipos morfológicos básicos, com diferenças na membrana ondulante foram evidenciados, permitindodistinguir os grupos cromossômicos de 2n=22 e 2n=20 dos grupos de 2n=18 e 2n=16. O cone subacrossomal, observado nas espécies de Pseudopaludicola, também já foi relatado para os espermatozoides de espécies de outros gêneros da subfamília Leiuperinae como Physalaemus biligonigerus, P. gracilis (Amaral et al., 1999), P. marmoratus (= P. fuscomaculatus em Amaral et al., 1999) e P. Nattereri (= E. nattereriem Zieri et al., 2008). Contudo, o cone subacrossomal é ausente em outro leiuperíneo, Pleurodema thaul (Pugin- Rios, 1980), nos leptodactilíneos Leptodactylus wagneri (Scheltinga, 2002) e Leptodactylus (Salles, 2014). A despeito de o cone subacrossomal ser considerado uma

31 característicaplesiomórfica nos espermatozoides de anuros (Jamieson et al., 1993; Scheltinga e Jamieson, 2003), até o momento, não traz informação que possa contribuir para um melhor entendimento das relações de parentesco entre os leptodactilídeos, a quais vem sendo exploradas por diversos estudos moleculares (Frost et al., 2006; Grant et al., 2006; Pyron e Wiens, 2011, Faivovich et al., 2012; Fouquet et al., 2013). As estriações transversais encontradas na porção inicial da cauda dos espermatozoides são estruturas semelhantes àquelas já descritas para os espermatozoides dastrês espécies de Physalaemus analisadas por Amaral et al. (1999), assim como para P. falcipes (Amaral et al., 2000) e P. nattereri (=E.nattereri em Zieri et al., 2008). As estriações transversais também foram observadas nos gametas masculinos de outras famílias de anuros, como por exemplo, Odontophrynus cultripes (Báo et al., 1991) e de algumas espécies de roedores (Fawcett e Phillips, 1969). Embora a função dessa estrutura ainda seja incerta, sugere-se que as estriações podem estabilizar a ancoragem do flagelo na peça intermediária (Fawcett e Phillips, 1969; Báo et al., 1991). Apesar da ultraestrutura do espermatozoide em Pseudopaludicola apresentar pouca resolução taxonômica, dois conflitos de classificação, recentemente elucidados, a remoção de P. canga do grupo “pusilla” (Cardozo e Suarez, 2012) e a retirada de P. ameghini da sinonímia de P. mystacalis (Pansonato et al., 2013) teriam um reforço baseado nas características ultraestruturais da cauda do espermatozoide, pois P. canga e P. mystacalis exibiram uma cauda com membrana ondulante dilatada, diferenciando-as do padrão, membrana ondulante delgada com fibras acessórias distintas, encontrado em Pseudopaludicola sp. 1 - (grupo “pusilla”) e P. ameghini. As diferenças morfológicas ultraestruturais observadas nas caudas dos espermatozoides de Pseudopaludicola parecem ser filogeneticamente informativas, pois cada tipo de cauda é congruente com a filogenia molecular de Veiga-Menoncello et al., (2014), possibilitando sugerir uma progressiva simplificação das estruturas da cauda relacionada à evolução desse gênero. Agradecimentos: Esta pesquisa recebeu suporte financeiro de agências brasileiras: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES/PROAP), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Processo nº

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140391/2012-6) e Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, Processo nº 2013/04076-1). Agradecemos a Dra. Luciana Bolsoni Lourenço e Dr. Daniel Pacheco Bruschi pelas sugestões e críticas durante o desenvolvimento do trabalho. Agradecemos ainda ao Dr. André Pansonato por fornecer e identificar algumas espécies.

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Tabela 1: Espécies utilizadas para a análise ultraestrutural dos espermatozoides, indicando os respectivos números cromossômicos, locais de coleta e números de registro nas coleções dos Museus. Espécies Número diplóide (fonte) Localidades (Estado) Número de Registro no Identificação na figura 1 Museu Pseudopaludicola 2n=18 Xambioá (TO) ZUEC 21132, 21134, 21138 canga(3) (ACP Veiga-Menoncello, não A publicado) Pseudopaludicola 2n=16 Uruaçu (GO) UFMT 18405, 18406, 18408 mystacalis(2) (ACP Veiga-Menoncello, não B publicado) Pseudopaludicola 2n=20 (Favero et al., 2011) Uruaçu (GO) UFMT 15752, 16170, 18061 ternetzi(2) B Pseudopaludicola 2n=22 (Favero et al., 2011 – Poconé (MT) UFMT 15716 sp. 1(1) referida como Pseudopaludicola sp. C 1) Pseudopaludicola 2n=22 (Favero et al., 2011 – Cuiabá (MT) UFMT 15891 sp. 1(1) referida como Pseudopaludicola sp. D 1) Pseudopaludicola 2n=22 (Duarte et al., 2010) Nova Lacerda (MT) ZUEC 14278, 14279 saltica(2) E Pseudopaludicola 2n=20 (Favero et al., 2011) Chapada dos Guimarães(MT) UFMT 8543 ameghini(2) F Pseudopaludicola 2n=20 (Favero et al., 2011) Vila Bela S. Trindade (MT) ZUEC 13925 ameghini(2) G Pseudopaludicola 2n=18 Serra do Cipó (MG) ZUEC 18042 sp. 2(3) ACP Veiga-Menoncello, não H publicado) Pseudopaludicola 2n=22 (Duarte et al., 2010) Serra do Cipó (MG) ZUEC 14317, 14321, 14326 mineira(3) H Pseudopaludicola 2n=18(Duarte et al., 2010) Uberlândia (MG) ZUEC 14186, 14187 facureae(2) referida como I Pseudopaludicola sp. aff. canga) Pseudopaludicola 2n=22 (Duarte et al., 2010) Uberlândia (MG) ZUEC 14309 saltica(2) I Pseudopaludicola 2n=18 Curvelo (MG) UFMT 17764, 17766 giarettai(3) (ACP Veiga-Menoncello não J publicado) Pseudopaludicola 2n=16 Três Lagoas (MS) ZUEC 19974, 19975 mystacalis(2) (ACP Veiga-Menoncello, não K publicado) Pseudopaludicola 2n=18(Duarte et al., 2010 – referida Nova aliança (SP) UFMT 17754, 17755 atragula(3) como L Pseudopaludicola sp.aff. canga) Pseudopaludicola 2n=18(Duarte et al., 2010 – referida Icém (SP) UFMT 17762, 17763 atragula(3) como M Pseudopaludicola sp.aff. canga) Pseudopaludicola 2n=16 (Favero et al., 2011) Cedral (SP) DZSJRP 8678, 8679 mystacalis(2) N Pseudopaludicola 2n=22 (Favero et al., 2011) Torres (RS) ZUEC 20980 falcipes(2) ⃰ O (1) Espécie do grupo P. pusilla(C. Strüsmann e Pansonato, A. - informação pessoal. Método de diafanização); (2)grupo P. falcipes(sensu Lynch, 1989); (3)não alocado em nenhum grupo. P. falcipes⃰: Coleta para dados de Microscopia Eletrônica de Varredura. Dados de Transmissão obtidos de Amaral et al. ( 2000). Estados Brasileiros: GO, Goiás; MG, Minas Gerais; MS, Mato Grosso do Sul; MT, Mato Grosso; RS, Rio Grande do Sul; SP, São Paulo; TO, Tocantins. ZUEC - Museu de Zoologia Prof. Adão J. Cardoso, do Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, São Paulo, Brasil. UFMT - Museu de Zoologia da Universidade Federal do Mato Grosso, Cuiabá, Brasil. DZSJRP - Museu do Departamento de Zoologia da Universidade Estadual Paulista, São José do Rio Preto, São Paulo, Brasil.

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Legendas das figuras

Figura 1 – Mapa da América do Sul com destaque para o Brasil, mostrando os sítios de coleta (letras) dos exemplares de Pseudopaludicola.

Figura 2 – Espermatozoides de Pseudopaludicolaobtidos por Microscopia Eletrônica de Varredura. A: Pseudopaludicola sp. 1 - Poconé (grupo P. pusilla), B: P. falcipes, C: P. ameghini, D: P.canga, E: P. giarettai, F: P. mystacalis. Barra de Escala: 1µm. n: vesícula acrossomal + núcleo, c: cauda.

Figura 3 – Micrografias Eletrônicas de Transmissão da cabeça e peça intermediária. A, F, K, P: Pseudopaludicola sp. 1 - Poconé (grupo P. pusilla). B, G, L, Q: P.saltica; C, H, M,R: P. ameghini; D, I, N, S: P. canga;E, J, O, T: P. mystacalis. A-E: Cortes longitudinais das cabeças dos espermatozóides. F-J: Secções transversais das cabeças. Observe o núcleo cilíndrico e a vesícula acrossomal (va) circundando o cone subacrossomal (cs) e o núcleo (n). K-O: Cortes longitudinais da região posterior do núcleo, peça intermediária e início da cauda. M: Espermátide tardia; observe o centríolo proximal e distal; P-T: Cortes transversais do início das caudas; observe o colar de mitocôndrias circundando o início da cauda. Escala: 0,2 µm. Axonema (ax), bastão para-axonemal (bp), centríolo proximal (cp), centríolo distal (cd), colar de mitocôndrias (cm), cone subacrossomal (cs), espaço subacrossomal (es),estriações transversais (et), fossa nuclear (fn), mitocôndria (m), núcleo (n) evesícula acrossomal (va).

Figura 4 – Micrografias Eletrônicas de Transmissão da cauda. A: Pseudopaludicola sp. 1 - Poconé (grupo P. pusilla), B: P. saltica e C: P. mineira. A-C: Cortes transversais das regiões intermediárias da cauda. Axonema (ax), fibra axial (fa), fibra justa-axonemal (fj) e membrana ondulante (mo). Escala: 0,2 µm.

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Figura 5 – Micrografias Eletrônicas de Transmissão da cauda. A: P. ameghinie B: P. ternetzi. Cortes transversais das regiões intermediárias da cauda. Axonema (ax), fibra axial (fa), fibra justa-axonemal (fj) e membrana ondulante (mo). Escala: 0,2µm.

Figura 6 – Micrografias Eletrônicas de Transmissão da cauda. A: P. canga, B: P. giarettai e C: P. mystacalis. Secções transversais das regiões intermediárias das caudas. Axonema (ax) e bastão para- axonemal (bp). Escala: 0,2µm.

Figura 7 - Ilustrações das caudas dos espermatozoides das espécies analisadas e seu posicionamento nos clados/grupos cromossômicos de Pseudopaludicola adaptado de Veiga- Menoncello et al. (2014). (1) –Os dados dos espermatozoides de P. falcipes foram obtidos de Amaral et al. (2000).(2) - Pseudopaludicola sp. 2 (Serra do Cipó) e P. giarettai não estão incluídas no cladograma de Veiga-Menoncello et al. (2014), entretanto, foram incluídas nessa ilustração por terem 2n=18 cromossomos e apresentarem a cauda do espermatozoide igual àquelas observadas nas espécies desse clado.

Abreviações: Axonema (ax), bastão para-axonemal (bp), fibra axial (fa), fibra justa- axonemal (fj) e membrana ondulante (mo).

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Figuras Figura 1:

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Figura 2:

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Figura 3:

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Figura 4:

Figura 5:

Figura 6:

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Figura 7:

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III. Características ultraestruturais dos espermatozoides de dez espécies de leptodactilídeos (Amphibia, Anura)

Ultrastructural features of the spermatozoa of tenspecies ofleptodactylids (Amphibia, Anura)

Julio S. Santos1, Gisele O. Introini2, Ana C. P. Veiga-Menoncello1 and Shirlei M. Recco- Pimentel1

1Departamento de Biologia Estrutural e Funcional, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP,13083-863 Campinas, São Paulo, Brasil. E-mail dos autores: [email protected]; [email protected] 2Departamento de Ciências Básicas da Saúde, Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre - UFCSPA, 90050-170 Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil

Resumo Os anuros da família Leptodactylidae estão alocados em três subfamílias: Leiuperinae, Leptodactylinae e Paratelmatobiinae. As relações de parentesco intrafamiliares desses anfíbios tem sido historicamente alvo de discussões e ainda hoje são pouco esclarecidas. Nesse estudo, com o auxílio da microscopia eletrônica, foram observados os espermatozoides de 10 espécies representantes das três subfamílias com o intuito de fornecer caracteres que sejam informativos e possam auxiliar na sistemática dos leptodactilídeos. Entre os leiuperíneos analisados verificou-se que o espermatozoide de Physalaemus albifrons e P. cicada apresenta a vesícula acrossomal cobrindo o cone subacrossomal e a região anterior do núcleo, no entanto, esse cone não é exibido no espermatozoide de Physalaemus centralis e P. cuvieri. A cauda do espermatozoide de P.

49 albifrons, P. centralis, P. cicada e P. cuvieri exibe uma membrana ondulante longa, ao passo que em Engystomops puyango, E. petersi e E. freibergi, os quais formam um clado irmão de Physalaemus, a membrana ondulante é mais curta e difere ainda pela presença de fibra axial, ausente nos Physalaemus. Essas diferenças entre as caudas dos gametas masculinos parecem concordar com a revalidação de Engystomops, o qual é distinto de Physalaemus. A cauda do espermatozoide de E. petersi e E. freibergi é semelhante à encontrada em Paratelmatobius poecilogaster(Paratelmatobiinae). O espermatozoide de Leptodactylus natalenis(Leptodactylinae) também exibe membrana ondulante e fibra axial, contudo, essa fibra é bem mais desenvolvida do que aquela encontrada em P. poecilogaster e em espécies de Engystomops. A cauda do espermatozoide de Adenomera marmorata (Leptodactylinae), espécie anteriormente pertencente ao grupo Leptodactylus marmoratus, não exibe membrana ondulante e fibra axial. Essa diferença ultraestrutural das caudas de A. marmorata e L. natalensis, parece corroborar a realocação de Adenomera marmorata, como espécie diferente das espécies do gênero Leptodactylus.

Palavras-chave: Microscopia eletrônica; Ultraestrutura; Espermatozoide; Leptodactylidae; Anura.

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1. Introdução A família Leptodactylidae é atualmente constituída por 199 espécies (Frost, 2015), alocadas em três subfamílias, Leiuperinae Bonaparte, 1850 (90 sp.), Leptodactylinae Werner, 1896 (1838) (96 sp.) e Paratelmatobiinae Ohler e Dubois, 2012 (13 sp.). Os leptodactilídeos estão distribuídos em diversas localidades das Américas, desde o sul dos Estados Unidos (EUA) até as regiões da Argentina e do Chile (Frost, 2015). Quanto a sistemática e organização dessa família, Frost et al. (2006), com base em dados de genes mitocondriais e nucleares, recuperaram dois grupos: Leptodactylinae I (PleurodemaTschudi, 1826, Edalorhyna Jimenez-de-la-Espada 1870, Physalaemus Fitzinger 1826 e Pseudopaludicola Miranda-Ribeiro 1926) e Leptodactylinae II (Adenomera, Lithodytes Fitzinger 1843, Leptodactylus Fitzinger 1826 e Vanzolinius Heyer 1974), que mostraram ser parafiléticos (Frost et al., 2006)com relação à Cycloramphinae I (Paratelmatobius Lutz e Carvalho 1958 e Scythrophrys Lynch 1971). Grant et al. (2006) retiraram os gêneros , Engystomops, Eupemphix Steindachner, 1863, Physalaemus Fitzinger, 1826, Pleurodema, Pseudopaludicola e Somuncuria Lynch, 1978 da família Leptodactylidae e os alocaram na família Leiuperidae. Entretanto, Pyron e Wiens (2011) reconheceram o parafiletismo entre Leiuperidae e Leptodactylidae e alocaram os gêneros Edalorhina, Engystomops, Physalaemus, Pleurodema e Pseudopaludicola na subfamília Leiuperinae. Em Leptodactylinae ficaram alocados Adenomera, Leptodactylus e Lithodytes e em Paratelmabiinae (Ohler e Dubois, 2012), Scythrophrys e Paratelmatobius. Fouquet et al. (2013) na análise molecular de espécies da família Leptodactylidae incluíram Rupirana e Crossodactylodes e afirmaram que o monofiletismo é bem suportado. Além disso, Fouquet et al. 2013 consideraram que Pseudopaludicola é grupo irmão dos leiuperíneos, discordando das filogenias moleculares de Frost et al. (2006), Grant etal. (2006), Pyron e Wiens (2011) e Faivovich et al. (2012) Sobre os relacionamentos intergenéricos entre leptodactilídeos, Nascimento et al. (2005), com base na morfologia externa e osteologia, organizaram os Physalaemus em sete grupos fenéticos, P. cuvieri Fitzinger 1826, P. signifer Frost 1985, P. albifrons Parker 1927, P. gracilis Parker 1927, P. deimaticus Sazima e Caramaschi 1988, P. henselii Parker 1927 e

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P. olfersii Parker 1927. Contudo, a alocação de P. albifrons em um grupo fenético distinto das espécies do grupo P. cuvieri foi questionada por Vittorazzi et al. (2014). Nascimento et al. (2005) revalidaram os gêneros Engystomops e Eupemphix, discordando de Lynch (1970) que sinonimizou as espécies de Engystomops à Physalaemus. Já Eupemphix nattereri, recentemente foi considerada sinônimo júnior de Physalaemus (Faivovich et al., 2012), o qual não corrobora os dados de Nascimento et al. (2005). Sobre o gênero Leptodactylus, alocado em Leptodactylinae, contém o maior número de espécies: 74 sp. entre os leptodactilídeos (Frost, 2015) e foi dividido por Heyer (1969) em 5 grupos fenéticos: L. fuscus Heyer 1968, L. melanonotus Brocchi 1881, L. ocellatus Girard 1853, L. pentadactylus Boulenger 1882 e L. marmoratus Parker 1935. Heyer (1974) distinguiu as espécies do grupo L. marmoratus dos demais Leptodactylus, alocando as espécies desse grupo no gênero Adenomera. Frost et al. (2006), com base em dados moleculares, afirmaram que as espécies do gênero Adenomera pertenciam à Leptodactylus. Contudo, Ponssa e Heyer (2007), Kwet et al. (2009), Zaracho e Hernando (2011), Pyron e Wiens (2011) e De Sá et al. (2014) discordaram de Frost et al. (2006) e propuseram que Adenomera (= L. marmoratus) era válido e distinto de Leptodactylus. Em Paratelmatobiinae, Frost et al. (2006) mostraram que Paratelmatobius e Scythrophrys são próximos, o que foi corroborado por Lourenço et al. (2008). Pyron e Wiens (2011) mostraram que o clado Paratematobius + Scythrophrys é irmão de Leiuperinae. Fouquet et al. (2013), com base em dados moleculares, incluíram os gêneros Crossodactylodes e Rupirana nessa subfamíllia. Assim, sabendo que as características estruturais dos espermatozoides de anuros vêm sendo usadas para complementar os parâmetros tradicionais morfológicos e moleculares da sistemática (ver Scheltinga, 2002; Aguiar-Junior et al., 2006; Veiga- Menoncello et al., 2006, 2007; Lipke et al., 2009; Siqueira et al., 2013; Salles, 2014), esse trabalho tem como objetivo contribuir com novos caracteres referentes à ultraestrutura dos espermatozoides de leptodactilídeos, auxiliando no entendimento do relacionamento inter e intragenérico dos representantes da família Leptodactylidae.

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2. Material e Métodos 2.1. Espécies analisadas e locais de coleta Foram analisados os espermatozoides de 10 espécies de leptodactilídeos coletados em 17 localidades da América do Sul, sendo 15 no Brasil e 2 no Equador (ver Figura 1 Tabela 1). As coletas foram realizadas com permissão do Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA – processos 10678-2, 02001.002003/2005-16 e 02001.002/2005/16) 2.2. Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) Os testículos foram retirados e fixados em glutaraldeído a 2% e paraformaldeído 2%, 24 horas, à 4ºC. Após lavagem em tampão cacodilato (0,1M) e pós-fixação em solução tetróxido de ósmio (OsO4) 1%, os testículos foram submetidos à desidratação em série crescente de acetona (30%, 50%, 70%, 90% e 100%), incluídos em resina Epoxy Epon 812, a qual foi polimerizada a 60ºC. Foram realizados cortes ultrafinos dos blocos de resina com auxílio do Ultramicrótomo Ultracut (UCT). Os cortes foram transferidos para telas de cobre 200 mesh e submetidos ao citrato de chumbo Reynolds e acetato de uranila 2%. A observação dos cortes foi feita com auxílio do Microscópio Eletrônico de Transmissão Zeiss, Leo 906. Foram selecionadas as micrografias eletrônicas que apresentavam estruturas bem definidas mostrando a cabeça cônica e alongada, a cauda com ou sem fibras acessórias e ausência de material citoplasmático residual do processo de cito diferenciação.

3. Resultados 3.1 Estrutura Geral Todos os espermatozoides das espécies analisadas exibem forma alongada e vesícula acrossomal na cabeça. Também apresentam centríolos (proximal e distal) organizados perpendicularmente. As mitocôndrias foram localizadas próximas da peça intermediária e da região inicial da cauda. Os flagelos de todos os espermatozoides exibem axonema com a organização 9+2 microtúbulos.

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3.2. Cabeça e Peça intermediária 3.2.1. Physalaemus cuvieri, P. centralis, P. cicada, P. albifrons, Engystomops freibergi A vesícula acrossomal cobre a porção anterior do núcleo (Figs. 2A, B) em Physalaemus cuvieri e P. centralis. A cromatina exibe espaços elétron-lúcidos, denominados lacunas em Physalemus cuvieri e P. centralis (Fig. 2A, B). O cone subacrossomal é observado entre a vesícula acrossomal e a porção anterior do núcleo em Physalaemus cicada, P. albifrons e Engystomops freibergi (Figs. 2C-E). A porção do núcleo é envolvida pela vesícula acrossomal em Physalaemuscuvieri e P. centralis (Figs. 2F, G). A vesícula acrosoomal circunda o cone subacrossomal e este, por sua vez, contorna a porção anterior do núcleo em Physalaemus cicada, P. albifrons e Engystomops freibergi (Figs. 2H-J). Na base do núcleo de todos os espermatozoides foi observado uma fossa nuclear (Figs. 2K-O). Nessa fossa aloja-se o centríolo proximal e o centríolo distal. Algumas mitocôndrias são observadas próximo da fossa nuclear e da região inicial da cauda (Figs. K-T). No início da cauda dos espermatozoides de Physalaemus (Figs. P-S) não foi possível distinguir a fibra justa-axonemal e a membrana ondulante, caracterizano um bastão para- axonemal. 3.2.2. , E. puyango, Paratelmatobius poecilogaster, Adenomera marmorata e Leptodactylus natalensis A vesícula acrossomal cobre o cone subacrossomal. Esse cone é localizado entre a vesícula e a região anterior do núcleo em Engystomops petersi, E. puyango, Paratelmatobius poecilogaster e Adenomera marmorata (Figs. 3A-D). A vesícula acrossomal do espermatozoide de Engystomops puyango não cobre totalmente o cone subacrossomal (Fig. 3B). O material nuclear de Adenomera marmorata mostra espaços elétron-lúcidos, denominados lacunas (Fig. 3D). O espermatozoide de Leptodactylus natalensis exibe uma espessa vesícula acrossomal (Fig. 3E). O espermatozoide de Engystomops petersi, E. puyango, Paratelmatobius poecilogaster e Adenomera marmorata circunda o cone subacrossomal e este, por sua vez, contorna a região anterior do núcleo (Figs. 3F-I). A vesícula acrossomal de Leptodactylus

54 natalensis apresenta material homogêneo e menos elétron-denso que o material nuclear (Fig. 3J). Na base do núcleo foi observada uma fossa nuclear nos espermatozoides de Engystomops petersi, E. puyango, Paratelmatobius poecilogaster, Adenomera marmorata e Leptodactylus natalensis (Figs. 3K-O). No espermatozoide de Adenomera marmorata é encontrado um material pericentriolar próximo da região dos centríolos proximal e distal (Fig. 3N). Algumas mitocôndrias são observadas próximas da fossa nuclear e da região inicial da cauda (Fig. 3K-S), exceto o espermatozoide de Leptodactylus natalensis, no qual não foi possível observar mitocôndrias nos cortes da região inicial da cauda (Fig. 3T). 3.3. Caudas 3.3.1. Physalameus cuvieri, P. centralis, P. cicada, P. albifrons, Engystomops freibergi, E. petersi, E. puyango, Paratelmatobius poecilogaster, Adenomera marmorata e Leptodactylus natalensis As caudas dos espermatozoides de Physalaemus cuvieri, P. centralis, P. cicada e P. albifrons exibem fibra juxta-axonemal localizada entre o axonema e a membrana ondulante (Figs. 4A-D). No espermatozoide de Engystomopsfreibergi e E. petersi a membrana ondulante é encontrada entre a fibra justa-axonemal e fibra axial (Figs. 4E, F). Já em E. puyango, essa fibra axial é observada entre a membrana ondulante espessa (bastão para-axonemal) e a membrana ondulante (Fig. 4G). A cauda do espermatozoide de Paratelmatobius poecilogaster exibe uma lâmina densa, dentro da membrana ondulante, que liga a fibra justa-axonemal e a fibra axial (Fig. 4H). O espermatozoide de Adenomera marmorata não apresenta fibras acessórias associadas ao axonema (Fig. 4I). A cauda do espermatozoide de Leptodacylus natalensis exibe a fibra justa-axonemal, a membrana ondulante e a fibra axial bem desenvolvida (Fig. 4J). Uma representação esquemática dos tipos de caudas dos espermatozoides das espécies analisadas no presente trabalho e de outros leptodactilídeos descritos na literatura é mostrada na figura 5.

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4. Discussão Os espermatozoides de Physalaemus cuvieri e P. centralis, espécies pertencentes ao grupo P. cuvieri (Nascimento et al., 2005), não apresentam o cone subacrossomal. Diferentemente, os espermatozoides de P. cicada (grupo P. cuvieri), P. albifrons (grupo P. biligonigerus) e P. gracilis (Amaral et al., 1999) (grupo P. gracilis) apresentam o cone subacrossomal. Com excessão de Pleurodema thaul (Pugin-Rios, 1980), Lithodytes lineatus, Leptodactylus (Salles, 2014) e L. natalensis, outros leptodactilídeos como Pseudopaludicola (Santos JS em preparação), Engystomops petersi, E. freibergi, Paratelmatobius poecilogaster, Adenomera marmorata e Physalaemus nattereri (Zieri et al., 2008) também exibem o cone subacrossomal. Scheltinga e Jamieson (2003) consideraram que a presença do cone subacrossomal poderia ser uma plesiomorfia nos anuros, entretanto, os mesmos autores ressaltaram que essas inferências filogenéticas recuperadas de caracteres ultraestruturais de espermatozoides, envolvendo grupos bem abrangentes de anuros, podem resultar em muitas homoplasias, o que dificulta estabelecer qualquer significado para a presença dessa estrutura. Apesar das características ultraestruturais dos espermatozoides não fornecerem fortes evidencias de sinal filogenético, diversas filogenias moleculares abordando os leptodactilídeos parecem não resolver completamente as relações taxonômicas, principalmente às relações intergenéricas (Frost et al., 2006; Grant et al., 2006; Pyron e Wiens, 2011; Faivovich et al., 2012; Fouquet et al., 2013). Assim, as descrições ultraestruturais de espermatozoides desse trabalho poderão contribuir no entendimento de algumas relações entre os leptodactilídeos, as quais são discutidas nesse trabalho. A compactação mais frouxa do material nuclear, sugerida pela presença de espaços ou regiões elétron-lúcidas em A. marmorata, P. centralis e P. cuvieri pode ser devida a uma compactação tardia, ou seja, as regiões elétron-lúcidas podem desaparecer com a cromatina mais compacta nos ductos extratesticulares desses anuros. A diferença ultraestutural entre os espermatozoides de Engystomops puyango e dos espermatozoides de E. petersi e E. freibergisão congruentes com a alocação dessas espécies de Engystomops em dois clados, sendo queo clado Edentulus agrupa as espécies

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Engystomops petersi, E. freibergi e E. pustulosus, já o clado Duovox aloca as espécies Engystomops coloradorum, E. guayaco, E. randi, E. montubio, E. pustulatus e E. puyango (Ron et al., 2006, 2010). Essas diferenças ultraestruturais dos espermatozóides também coincidem com a variação cariotípica entre os clados, nos quais as espécies do clado Edentulus possuem 2n=22 e as do clado Duovox possuem 2n=20 (Targueta et al., 2011). Vale ressaltar que as características ultraestruturais da cabeça e da cauda do espermatozoide de Engystomops puyango (clado Duovox) são idênticas às observadas em Engystomops pustulosus (referida como Physalaemus pustulosus em Scheltinga, 2002) (clado Edentulus), mas diferente de E. petersi e E. freibergi. Nas filogenias de Ron et al. (2010) e Fouquet et al. (2013) as espécies E. petersi e E. freibergi aparecem como irmãs de E. pustulosus. Uma hipótese para explicar essa divergência é que a estrutura do espermatozóide de E. petersi e E. freibergi tenha se modificado em relação ao gameta masculino de E. pustulosus, entretanto, foi mantida em E. puyango. Não descartamos, também, a possibilidade de que tenha havido falha na identificação de E. pustulosus, uma vez que Scheltinga (2002) informa em seu trabalho que a localidade de origem do exemplar E. pustulosus analisado é desconhecida. Faz-se necessário, portanto, confirmar a descrição do espermatozoide de E. pustulosus, pois até o momento é a única espécie do clado Edentulus que difere na estrutura do espermatozóide, se assemelhando às espécies do clado Duovox. Assim também, seria importante analisar as demais espécies de Engystomops que fazem parte do clado Duovox (Ron et al., 2006) para averiguar se a ultraestrutura dessas células são conservadas no clado. O colar de mitocôndrias observado na peça intermediária e região anterior da cauda dos espermatozoides descritos nesse trabalho, com excessão de L. natalensis, parece ser semelhante ao encontrado nos espermatozoides de leptodactilídeos (ver Amaral et al., 1999; Amaral et al., 2000; Zieri et al., 2008; Salles, 2014) e não leptodactilídeos, por exemplo em bufonídeos (Lee e Jamieson, 1993), em centrolenídeos (Scheltinga, 2002), em hilídeos (Garda et al., 2004), em aromobatídeos (Veiga-menoncello et al., 2006), em hilodídeos (Aguiar-Junior et al., 2006) e em bufonídeos (Siqueira et al., 2013). Apesar das incertezas sobre o significado filogenético desse colar de mitocôndrias (Scheltinga et al., 2001; Scheltinga e Jamieson, 2003; Aguiar Junior et al., 2006; Salles, 2014), nós afirmamos que

57 esse colar, localizado próximo da fossa nuclear e início da cauda dos espermatozoides leptodactilídeos, pode ser uma estrutura transitória, que pode ser perdida ou reduzida nos ductos extratesticulares desses anuros (Pugin-Rios, 1980; Garrido et al.,1989). Com relação a ultraestrutura da cauda do espermatozoide, nenhuma das espécies de Physalaemus exibe a fibra axial, que está presente nas caudas dos espermatozoides das espécies de Engystomops (E. petersi, E. freibergi e E. puyango), as quais são do gênero grupo irmão de Physalaemus (Pyron e Wiens, 2011; Fouquet et al., 2013). Apesar da histórica controvérsa sobre a remoção de Engystomops da sinonímia de Physalaemus (Lynch, 1970) e de ainda haver questionamentos sobre a proximidade entre esses dois gêneros (Boul et al., 2007; Funk et al., 2009), a estrutura do espermatozoide mostrou diferenças marcantes, congruentes com a existência dos dois gêneros conforme proposto por Nascimento et al. (2005), com base em dados morfológicos, e por Pyron e Wiens (2011) e Fouquet et al. (2013) com base em análises filogenéticas moleculares. A despeito das homoplasias ultraestuturais das caudas dos espermatozoides entre as espécies de Physalaemus analisadas aqui e Pleurodema diploslister (Cruz JC et al., em preparação), o que dificulta o claro entendimento sobre as relações taxonômicas entre os leiuperíneos (Scheltinga e Jamieson, 2003), nós encontramos características ultraestruturais que podem ser utilizadas como sinal filogenético em grupos menores, por exemplo, entre as espécies de Leptodactylus, leptodactilíneo. Nesse caso, Leptodactylus natalensis exibe uma membrana ondulante e uma fibra axial bem desenvolvida, similar a que foi encontrada em L. wagneri (Scheltinga, 2002) e L. podicipinus (Salles, 2014). Essa semelhança ultraestrutural parece corroborar a alocação dessas espécies no mesmo grupo de Leptodactylus melanonotus, recuperado na filogenia molecular de De Sá et al. (2014). Adenomera marmorata, anteriormente Leptodactylus marmoratus (Heyer, 1969; Frost et al., 2006), apresenta a cauda do espermatozoide diferente de Leptodactylusnatalensis, L. wagneri (Scheltinga, 2002) e L. podicipinus (Salles, 2014). Futuras análises dos espermatozoides de Adenomera e Leptodactylus podem avaliar se essa característica ultraestrutural da cauda pode contribuir para a distinção dos gêneros Adenomera e Leptodactylus que sempre foram alvo de questionamentos sobre o

58 relacionamento taxonômico intergenérico (Frost et al., 2006; Kwet et al., 2009; Zaracho e Hernando, 2011; Pyron e Wiens, 2011). A cauda do espermatozoide de Adenomera marmorata é também diferente do leptodactilíneo Lithodytes lineatus (Salles, 2014), espécie do gênero irmão de Adenomera (Pyron e Wiens, 2011, Fouquet et al., 2013; De Sá et al., 2014). Uma similar cauda à encontrada no espermatozóide de L. lineatus (Figura 5) foi sugerida como plesiomórfica em Ascaphus truei (Jamieson et al., 1993), em bufonídeos (Lee e Jamieson, 1993) e no hilídeo do gênero Litoria (Meyer et al., 1997; Scheltinga e Jamieson, 2003). Possivelmente esse tipo plesiomórfico de cauda, encontrada no espermatozoide de Lithodtytes lineatus, foi modificado ou perdido em Adenomera marmorata, porém, são necessárias novas descrições de gametas masculinos das espécies de Adenomera, associadas a filogenias moleculares, para compreensão dessas modificações nas caudas dos espermatozoides de leptodactilíneos como sinal filogenético. Os dados ultraestruturais das caudas de espermatozoides dos leiuperíneos Pseudopaludicola (Santos JS et al., em preparação) e o paratelmatobíneo Paratelmatobius poecilogasterparecem mostrar congruencia às relações taxonômicas recuperadas em filogenias moleculares. Quando comparamos esses dados ultraestruturais das caudas com as filogenias moleculares de Pyron e Wiens (2011) e Veiga-Menoncello et al. (2014), na qual Paratelmatobius poecilogaster é alocada na Paratelmatobiinae e Pseudopaludicola falcipes na Leiuperinae, parece que os Pseudopaludicola atragula, P. canga, P. giarettai, Pseudopaludicola sp. 2 e P. mystacalis apresentam cauda apomórfica em relação a cauda de Paratelmatobius poecilogaster e de Pseudopaludicola falcipes, Pseudopaludicola sp. 1 (grupo P. pusilla), P. saltica, P. ameghini, P. ternetzi e P. Mineira (ver Figura 5), as quais apresentam a cauda tipo plesiomórfica (plesiomorfia sugerida por Scheltinga e Jamieson, 2003). Isso confirma a hipótese de simplificação ultraestrutural do espermatozoide de Pseudopaludicola (Santos JS et al., em preparação) em acordo à filogenia molecular de Veiga-Menoncello et al. (2014). Apesar da descrição da ultraestrutura dos espermatozoides de diversos leptodactilídeos nesse trabalho contribuir com dados relevantes para o conhecimento biológico e sistemática desses anuros, ainda são necessárias descrições de um número

59 maior de espécies associadas às filogenias moleculares para o entendimento mais completo da evolução e do relacionamento intra- e intergenérico dos anuros dessa família.

Agradecimentos Essa pesquisa foi financiada pela Fundação de Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, processo nº 2013/04076-1), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, processo 140391/2012-6) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES/PROAP). Nós agradecemos a Dra. Luciana B. Lourenço e Dr. Stenio E. Vittorazzi pelas críticas e discussões durante o desenvolvimento do trabalho

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Tabela 1: Espécies utilizadas para análise ultraestrutural dos espermatozoides, com indicação da subfamília, locais de coleta /número no mapa e números de registro dos espécimes nas coleções dos Museus.

Espécies Subfamília Localidades / Número no número na figura 1 Museu

Engystomops Leiuperinae Yasuni, Parque Nacional QACZ30824, petersi Yasuni, Equador / 1 30825, 30826 e 30827 Engystomops Leiuperinae Puyango, Puyango, Equador / puyango 2 QACZ27698 e 27699 Engystomops Leiuperinae Rio Branco (AC), Brasil / 3 freibergi ZUEC14474 e 14475

Phyasalaemus Leiuperinae São Paulo Potengi (RN), ZUEC 17982 albifrons Brasil / 5

Physalaemus Leiuperinae Limoeiro (PE) e Poço ZUEC 17914, cicada Redondo (SE), Brasil 6 e 8, 20410 e 20415 respectivamente

Leptodactylus Leptodactylinae Bom Conselho (PE), Brasil / 7 ZUEC 17917 natalensis

Physalaemus Leiuperinae João Pinheiro (MG) e Três ZUEC 20402 e centralis Marias (MG), Brasil / 12 e 13, 20404 respectivamente.

Physalaemus Leiuperinae Macaíba (RN), Porto Nacional ZUEC 13371, cuvieri (TO), Paranã (TO), Uberlândia 13376, 17912, (MG), Serra do Cipó (MG) e 20382, 20384, Três Marias (SP), Brasil / 4, 9, 20390 e 20394 10, 11, 13, 14 e 15, respectivamente. Paratelmatobius poecilogaster Paratelmatobiinae São Luis do Paraitinga (SP), ZUEC20540 Brasil /16

Adenomera Leptodactylinae Bertioga (SP), Brasil / 17 marmorata ZUEC 13581 QACZ: Museu de Zoología de la Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Quito, Ecuador. ZUEC: Museu de História Natural “Prof. Adão José Cardoso” do Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp), São Paulo, Brasil.

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Legendas Figura 1: Mapa da América do Sul mostrando as localidades de coleta das espécies de leptodactilídeos estudadas. Destaque para Brasil e Equador. Abreviações: Arg: Argentina, Bol: Bolívia, Bra: Brasil, Chi: Chile, Col: Colômbia, Ecu: Ecuador, Gui: Guianas, Pan: Panamá, Par: Paraguai, Per: Peru, Sur: Suriname, Ven: Venezuela. AC: Acre, AL: Alagoas, AP: Amapá, AM: Amazonas, BA: Bahia, CE: Ceará, ES: Espírito Santo, GO: Goiás, MA: Maranhão, MT: Mato Grosso, MS: Mato Grosso do Sul, MG: Minas Gerais, PA: Pará, PB: Paraíba, PR: Paraná, PE: Pernambuco, PI: Piauí, RJ: Rio de Janeiro, RN: Rio Grande do Norte, RS: Rio Grande do Sul, RO: Rondônia, RR: Roraima, SC: Santa Catarina, SP: São Paulo, SE: Sergipe, TO: Tocantins.

Figura 2: Micrografias eletrônicas de transmissão da cabeça, peça intermediária e início da cauda. Espermatozoides de Physalaemus cuvieri (A, F, K e P), Physalaemus centralis(B, G, L e Q), Physalaemus cicada (C, H, M e R), Physalaemus albifrons (D, I, N e S) e Engystomops freibergi (E, J, O e T). Note o material nuclear de aspecto granular e bem elétron denso em todos os espermatozoides. Observe as mitocôndrias na região inicial da cauda e próximas da fossa nuclear. Barra de escala = 0,2 µm. Abreviações - ax: axonema,bp: bastão para-axonemal, cd: centríolo distal, cp: centríolo proximal, cm: colar de mitocôndrias, cs: cone subacrossomal, fa: fibra axial, fn: fossa nuclear, l: lacunas, mo: membrana ondulante, m: mitocôndria, n: núcleo, va: vesícula acrossomal.

Figura 3: Micrografias eletrônicas de transmissão da cabeça, peça intermediária e início da cauda.Espermatozoide de Engystomops petersi (A, F, K e P), Engystomops puyango (B, G, L e Q), Paratelmatobius poecilogaster (C, H, M e R), Adenomera marmorata (D, I, N e S) e Leptodactylus natalensis (E, J, O e T). Observe o bastão para-axonemal, no qual não é

68 possível distinguir a membrana ondulante e a fibra justa-axonemal em E. petersi. Note o material periocentriolar em A. marmorata. Barra de escala = 0,2 µm. Abreviações - ax: axonema,bp: bastão para-axonemal, cd: centríolo distal, cp: centríolo proximal, cm: colar de mitocôndrias, cs: cone subacrossomal, fa: fibra axial, fn: fossa nuclear, l: lacunas, mp: material periocentriolar, mo: membrana ondulante, m: mitocôndria, n: núcleo, va: vesícula acrossomal.

Figura 4:Micrografias eletrônicas de transmissão mostrando cortes transversais da cauda dos espermatozoides de P. cuvieri (A), Physalaemus centralis (B), Physaalemus cicada (C), Physalaemus albifrons (D), Engystomops freibergi (E), Engystomops petersi (F), Engystomops puyango(G), Paratelmatobius poecilogaster (H), Adenomera marmorata (I), e Leptodactylus natalensis(J). Note a longa membrana ondulante nos espermatozoies de Physalaemus (A-D). Observe um corte longitudinal da cauda de A. marmorata (I) e, também, a fibra axial bem desenvolvia em L. natalensis (J). Barra de escala = 0,2 µm. Abreviações - ax: axonema,bp: bastão para-axonemal, fa: fibra axial, fj: fibra justa- axonemal, mo: membrana ondulante.

Figura 5: Esquema ilustrativo das caudas dos espermatozoides de algumas espécies de leptodactilídeos.

Abreviações - ax: axonema,bp: bastão para-axonemal, fa: fibra axial, fj: fibra justa- axonemal, mo: membrana ondulante.

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Figura1:

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Figura 2:

71

Figura 3:

72

Figura 4:

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Figura 5:

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IV. CONSIDERAÇÕES FINAIS

As características ultraestruturais dos espermatozoides dos leptodactilídeos descritos no presente trabalho (inclusive P. diplolister, Apêndice - Figuras1 e 2), referentes à cabeça cônica, colar de mitocôndrias e núcleo alongado (Fig. 1), são semelhantes ao observado nos gametas masculinos de diversas espécies de anuros, como por exemplo,nos espermatozoides de Odontophrynus cultripes, Odontophrynidae (Báo et al., 1991), de Limnodynates peronii, Myobatrachidae (Lee e Jamieson, 1992), de Rhinela marina, Bufonidae (referida como B. marinus em Lee e Jamieson, 1993), de algumas espécies do gênero Litoria, Hylidae (Meyer et al., 1997), de Ameerega trivittata e A. hahneli, Dendrobatidae (referidas como E. trivittatus e E. hahneli em Aguiar-Junior et al., 2004), de Anomologlosus stepheni, Aromobatidae (referida como Colostethus stepheni em Veiga- Menoncello et al., 2006), de Dendrobates auratus, Dendrobatidae (Lipke et al., 2009), de A. spumarius, Bufonidae (Siqueira et al., 2013) e de algumas espécies do gênero Leptodactylus (Salles, 2014). Os dados ultraestruturais das caudas dos espermatozoides dos leptodactilídeos podem fornecer informações filogenéticas relevantes no nível intra- e intergenérico. Por exemplo, as diferenças morfológicas das caudas dos espermatozoides de Pseudopaludicola foram congruentes com a topologia recuperada de dados moleculares de Veiga-Menoncello et al. (2014). Assim, novas descrições de espermatozoides de outros gêneros leptodactilídeos, associadas com cladogramas de filogenias moleculares que mostram as relações intra e intergenéricas, poderão ampliar a compreensão sobre a evolução desse grupo de anuros. Em alguns leptodactilídeos, as caudas dos espermatozoides foram semelhantes entre todas as espécies de um mesmo gênero, por exemplo, Physalaemus, sugerindo que as espécies desse gênero conservaram a ultraestrutura da cauda durante a evolução desse grupo de anuros. Por outro lado, diferenças intragenéricas foram verificadas em Engystomops, o qual mostrou caudas diferentes entre E. petersi / E. freibergi (Clado Edentulus, Ron et al., 2006) e E. puyango (Clado Duovox, Ron et al., 2006), coerente com acom a divisão dos dois grupos de espécies e com a variação cariotípica já que as espécies

75 do grupo Edentulus possuem 2n=22 e as do grupo Duovox possuem 2n=20. Entretanto, o espermatozoide de E. puyango é idêntico ao observado em E.pustulosus (Scheltinga, 2002), alocada no grupo Edentulus (Ron et al., 2010; Fouquet et al., 2013), a qual é espécie irmã de E. petersi e E. freibergi. Tal incoerência suscita a hipótese de que possa ter havido identificação equivocada dos espécimes atribuídos a E. pustulosus e essa problemática merece uma investigação mais aprofundada e ampliada do gênero Engystomops. Em nível intergenérico, as diferenças ultraestruturais da cauda, por exemplo, entre Physalaemus e Engystomops contribui para a distinção desses gêneros e corrobora a proposta de revalidação do gênero Engystomops (Nascimento et al., 2005). O espermatozoide de Adenomera marmorata, espécie anteriormente pertencente ao grupo L. marmoratus, não exibe membrana ondulante e fibra axial, as quais foram vistas em L. natalensis. Essas diferenças ultraestruturais de A. marmoratae L. natalensis parece corroborar com a realocação da espécie Adenomera marmorata em um gênero válido e diferente de Leptodactylus, conforme proposto por Heyer (1974), Pyron e Wiens (2011) e Fouquet et al. (2013). Entre as subfamílias de Leptodactylidae (Pyron e Wiens, 2011; Fouquet et al., 2013), apesar da diversidade de caudas e cabeças dos espermatozoides ainda não é claro relacionar uma determinada característica ultraestrutural para distinguir as subfamílias, devido as diversas homoplasias ultraestruturais. Além disso, nesse trabalho de tese, foi plotado os dados ultraestruturais dos espermatozoides dos leptodactilídeos com os cladogramas obtidos de dados moleculares de Pyron e Wiens (2011) e Fouquet et al. (2013), respectivamente representados nas figuras 2 e 3. Nessa associação de dados parece incerto propor que a simplificação ultraestrutural do espermatozoide de anuros (proposta por Jamieson et al., 1993; Lee e Jamieson, 1993) seja totalmente congruente com as relações de leptodactilídeos com base nas topologias recuperadas da filogenia molecular. Devido às essas incertezas, por enquanto, são relevantes as descrições de espermatozoides de outros leptodactilídeos associadas à filogenia moleculares, com o intuito de entender o relacionamento entre as espécies, principalmente a nível intragenérico.

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Descrições detalhadas dos espermatozoides de leptodactilídeos são de suma importância para complementar dados moleculares, citogenéticos e morfológicos para análises filogenéticas, auxiliando na compreensão dos fatores envolvidos na evolução desses gametas.

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Legendas

Figura 1. Esquema ilustrativo das cabeças dos espermatozoides de algumas espécies de leptodactilídeos. Abreviações: cs: cone subacrossomal, n: núcleo, va: vesícula acrossomal

Figura 2. Caudas dos espermatozoides de alguns leptodactilídeos relacionadas à topologia recuperada dos dados moleculares ou parte do cladograma de Pyron e Wiens (2011). Pleurodema diplolister foi alocada no mesmo clado de Pleurodema brachyops (Ver filogenia molecular de Faivovich et al., 2012). Engystomops puyango é irmã de Engystomops pustulatus, as quais foram alocadas no clado Duovox (Ver Ron et al., 2006, 2010). Adenomera marmorata (anteriormente referida como Leptodactylus marmoratus) e Adenomeraandreae (anteriormente referida como Leptodactylus andreae) foram alocadas no mesmo grupo fenético de Leptodactylus marmoratus (Heyer, 1969, 1974). Abreviações: ax: axonema, bp: bastão para-axonemal, fa: fibra axial, fj: fibra justa- axonemal, mo: membrana ondulante.

Figura 3. Caudas dos espermatozoides de alguns leptodactilídeos relacionadas à topologia recuperada dos dados moleculares ou parte do cladograma de Fouquet et al. (2013). Adenomera marmorata (anteriormente referida como Leptodactylus marmoratus) e Adenomeraandreae (referida como Leptodactylus andreae) foram alocadas no mesmo grupo fenético de Leptodactylus marmoratus (Heyer, 1969, 1974). Abreviações: ax: axonema, bp: bastão para-axonemal, fa: fibra axial, fj: fibra justa- axonemal, mo: membrana ondulante.

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Figura 1:

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Figura 2:

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Figura 3:

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V. APÊNDICE O espermatozoide de Pleurodema diplolister também foi analisado durante o desenvolvimento da presente tese, porém esses dados foram incluídos em uma análise conjunta (*Cruz, J. et al., artigo em preparação) da ultraestrutura dos espermatozoides das espécies do gênero Pleurodema, que vem sendo conduzida pelos pesquisadores Dra. Gladys N. Hermida e Dr. Julian Faivovich, na Argentina. Apenas os dados obtidos para P. diplolister serão apresentados nesse apêndice, uma vez que são importantes para discussão da tese e foram mencionados no artigo 2. *Julio C. Cruz, Daiana P. Ferraro, Alejandro Farías, Julio S. Santos, Shirlei M. Recco- Pimentel, Julián Faivovich, and Gladys N. Hermida. A comparative ultrastructural analysis of spermatozoa among Pleurodema species (Anura, Leptodactylidae), with philogenetic considerations. 1. Material e Métodos 1.1. Os espécimes Dois indivíduos de Pleurodema diplolistris, coletados em Vassouras (MA), foram utilizados para análise. Os espécimes foram depositados no Museu de Zoologia Prof. Adão J. Cardoso (ZUEC), do Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, São Paulo, Brasil, com números de registro 12367 e 12368. As coletas foram realizadas com autorização do Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA - processos 02001.002003/2005-16 e 02001.002/2005/16).

1.2. MET A metodologia é a mesma já detalhadanos artigos da tese.

2. Resultados 2.1. MET A cabeçado espermatozoide de Pleurodema diplolister apresentou forma cônica e a vesícula acrossomal com aspecto elétron-denso e homogêneo cobrindo o cone subacrossomal, o espaço subacrossomal e a porção anterior do núcleo (Figs. 1A-E). O cone exibiu material menos elétron-denso que o encontrado no núcleo (Figs. 1C e D). No plano

84 transversal, verificou-se o núcleo com formato cilíndrico e a cromatina com aspecto granular e compactada (Figs. 1D e E). Na base do núcleo encontra-se a fossa nuclear, que contém o centríolo proximal e centríolo distal. Um colar de mitocôndrias foi detectado circundando a fossa nuclear e a região inicial da cauda (Figs. 2A e B). A caudaconstituída pelo axonema (9+2 microtúbulos), membrana ondulante e fibra justa-axonemal (Fig. 2C). Na porção final da cauda nota-se a membrana ondulantereduzida, restando apenas o axonema (Figs. 2D e E).

2.2. Legendas Figura 1. Micrografias eletrônicas de transmissão da cabeça do espermatozoide de P.diplolister. A: Corte longitudinal. Note a vesícula (va) cobrindo o cone subacrossomal (cs), e o núcleo (n). B-E: Cortes transversais. Observe a vesícula (va) circundando o cone subacrossomal (cs) e o núcleo (n). Barra = 200nm. Figura 2. Micrografias eletrônicas de transmissão da peça intermediária e cauda do espermatozoide de P. diplolister. A: Corte longitudinal da peça intermediária. Note a fossa nuclear (fn), o centríolo proximal (cp) e o centríolo distal (cd). Mitocôndria (m) próxima do axonema (ax). B: Note o triplex do centríolo proximal (cp) na fossa nuclear. C: Corte transversal da cauda. Note o axonema (ax), fibra justaxonemal (fj) e membrana ondulante (mo). D: Corte transversal próximo do final da cauda. Note o desaparecimento da membrana ondulante. E: Axonema. Barra = 200nm

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Figura 1:

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Figura 2:

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