Charakterisierung plasmamembrangebundener Proteasen von Nicotiana tabacum und Hordeum vulgare
Inauguraldissertation
zur
Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)
an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der
Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
vorgelegt von
Manuela Eick
geboren am 05. August 1979
in Königs Wusterhausen
Greifswald, 21. August 2012
Dekan: Prof. Dr. Klaus Fesser
1. Gutachter: Prof. Dr. Christine Stöhr
2. Gutachter: Prof. Dr. Doris Rentsch
Tag der Promotion: 23. November 2012 Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ______1 1.1 Proteasen ______1 1.1.1 Allgemeine Funktionen proteolytischer Enzyme in Pflanzen ______1 1.1.2 Klassifizierung von Proteasen ______2 1.1.3 Regulationsmechanismen der pflanzlichen Proteaseaktivität ______6 1.2 Membrangebundene Proteasen in Pflanzen ______8 1.3 Die pflanzliche Plasmamembran ______9 1.4 Fragestellungen der Arbeit ______11 2. Material und Methoden ______13 2.1 Material ______13 2.1.1 Pflanzen ______13 2.1.2 Sand ______13 2.1.3 Feinchemikalien ______13 2.1.4 Geräte ______14 2.1.5 Software ______15 2.1.6 Wasseraufbereitung ______15 2.2 Methoden ______16 2.2.1 Pflanzenanzucht und Kultivierung von Tabak ______16 2.2.2 Pflanzenanzucht und Kultivierung von Gerste ______17 a) Pflanzenanzucht ______17 b) Optimierung der Pflanzenanzucht von Gerste ______18 2.2.3 Pigmentbestimmung der Gerste ______19 2.2.4 Exsudatgewinnung und chromatographische Aufarbeitung ______20 2.2.5 Präparation der Membranvesikeln ______20 a) Präparation von mikrosomalen Membranfraktionen (mF) ______20 b) Präparation isolierter Plasmamembranvesikel ______21 2.2.6 Proteinbestimmung ______23 2.2.7 Proteaseaktivitätsbestimmung ______24 a) mit Fluoresceinthiocarbamoyl-Casein ______24 b) mit Exopeptidasesubstraten ______26 2.2.8 Endogene Proteolyse an PM-Vesikeln ______27 2.2.9 Proteinfällung ______28 a) Fällung löslicher Proteine mit Trichloressigsäure ______28 b) Chloroform/Methanol-Fällung solubilisierter PM-Proteine ______29 2.2.10 Solubilisierung PM-gebundener Proteine ______29 2.2.11 Probenwaschung und Volumeneinengung mittels Membranfiltration ______30 2.2.12 Chromatographische Reinigung der Protease ______30 a) Grössenausschlusschromatographie ______30 b) Anionenaustauschchromatographie ______31 c) Kationenaustauschchromatographie ______32 d) Hydrophobe Interaktionschromatographie ______32 e) Metallchelat-Affinitätschromatographie ______33 2.2.13 Behandlung mit Peptid-N-glykosidase F (PNGase F) ______34 2.2.14 Gelelektrophorese ______35 a) Native PAGE ______35 b) SDS-PAGE ______35 c) Zymogramm ______36 2.2.15 Silberfärbung ______37 2.2.16 Massenspektrometrie ______38 a) Bearbeitung und Messung solubilisierter PM-Proteine ______38 b) Einfluss der verwendeten Detergenzien ______39 II.b c) Bearbeitung und Messung der angereinigten PM-Protease Hv-Prot 5mM ______40 d) Messung der über endogene Proteolyse abgespaltenen Polypeptide ______42 e) Informationen zu detektierten Proteinen ______42 3. Ergebnisse ______43 3.1 Charakterisierung membranassoziierter Proteasen ______43 a) anhand ihrer Substratspezifitiät ______43 b) in Abhängigkeit von der Stickstoffernährung ______45 3.2 Eine Vielzahl unterschiedlicher Proteasen ist an die Plasmamembran von Wurzeln gebunden ______46 3.2.1 Untersuchungen zur Bindung der Proteasen an die Plasmamembran in Abhängigkeit von der Nitraternährung ______46 3.2.2 Fraktionierung der PM-Proteasen mittels chromatographischer Verfahren ______48 a) molekulare Grössenunterschiede innerhalb solubilisierter PM-Proteasen ______48 b) Trennung solubilisierter PM-Proteasen aufgrund der Nettooberflächenladung ______49 c) Fraktionierung der Prot I und Prot II anhand der Hydrophobizität ______50 d) Fraktionierung der Prot I und Prot II mittels Affinitätschromatographie ______51 3.2.3 Fraktionierung der PM-Proteasen mittels Gelelektrophorese ______52 a) Native PAGE solubilisierter PM-Proteasen ______52 II.b b) Untersuchung der angereinigter Hv-Prot 5mM mittels SDS-PAGE ______55 c) Untersuchung der verschiedenen Proteaseformen mittels Zymographie ______57 I 3.2.4 Deglykosylierung verändert das Proteasespektrum der Hv-Prot 5mM ______60 3.3 Verschiedene Proteasetypen sind an die PM von Wurzeln gebunden______61 3.3.1 Einfluss spezifischer Proteaseinhibitoren ______61 3.3.2 Einfluss zweiwertiger Kationen ______66 3.3.3 Massenspektrometrische Analyse verschiedener Proteaseformen von Gerste ______69 a) Analyse solubilisierter PM-Proteine von Gerstewurzeln ______69 II b) Analyse der fraktionierten Hv-Prot 5mM ______72 3.4 Natürliche Substrate PM-gebundener Proteasen ______80 3.4.1 Untersuchungen zur Substratspezifität der PM-gebundenen Proteasen ______80 3.4.2 Proteolytisch aktive Proteine werden endogen von den PM-Vesikeln abgespalten ______88 4. Diskussion ______91 4.1 Vielfalt der Proteaseformen an der pflanzlichen Plasmamembran ______91 a) Metalloproteasen ______93 b) Serinproteinasen ______100 c) Cysteinproteinasen ______101 d) Aspartatproteinasen ______104 e) Hinweise auf weitere, nicht klassifizierbare PM-gebundene Proteasen ______106 4.2 Kritische Betrachtung der verwendeten Methoden und Resultate ______108 a) Herausforderungen bei der Anreinigung bisher unbekannter Proteasen ______108 b) Massenspektrometrie nicht-abundanter PM-gebundener Proteasen ______113 4.3 Wie sind die PM-Proteasen an die Membran gebunden? ______120 4.4 Physiologische Bedeutung PM-gebundener Proteasen bei Pflanzen ______126 a) Hinweise zur Regulation der PM-Proteaseaktivität ______126 b) Einfluss physiologischer Faktoren auf die PM-Proteaseaktivitäten ______127 c) Funktionen PM-gebundener Proteasen in Wurzeln ______130 d) PM-Proteasen: ein erstes Modell ______137 5. Zusammenfassung ______138 6. Literatur ______139 7. Anhang ______153 7.1 Daten ______153 7.2 Abkürzungsverzeichnis ______163 7.3 Abbildungsverzeichnis ______164 7.4 Tabellenverzeichnis ______165 Abkürzungsverzeichnis der Proteaseformen ______167
Eidesstattliche Erklärung ______i
Danksagung ______ii
EINLEITUNG
1. Einleitung
Proteine sind die vielfältigsten Makromoleküle innerhalb eines Organismus. Ihre Funktionen erstrecken sich von der Katalyse, der Signaltransduktion, dem Transport und der Speicherung anderer Moleküle bis hin zur mechanischen Unterstützung einer Zelle. Deshalb ist die Regulation eines Proteins, angefangen von seiner Synthese bis hin zum Abbau, entscheidend für die Entwicklung eines Organismus (Berg et al. , 2003). Proteasen spielen dabei eine wichtige Rolle, denn die synonym als Peptidasen bezeichneten Hydrolasen katalysieren die Hydrolyse von Peptidbindungen. Um einen unkontrollierten Proteinabbau zu verhindern, werden alle bekannten Proteasen neben weiterer Kontrollmechanismen durch ihre jeweilige Substratspezifität eingeschränkt. Das bedeutet, es existiert keine Form, die in der Lage ist, ein Protein vollständig in einzelne Aminosäuren zu spalten (Barrett und Rawlings, 2007).
1.1 Proteasen
1.1.1 Allgemeine Funktionen proteolytischer Enzyme in Pflanzen
Die proteolytische Spaltung der Peptidbindungen stellt eine der grundlegendsten Reaktionen dar, die bei der Regulation der Stoffwechselprozesse stattfindet. Spezifische limitierte Proteolyse sowie komplette Proteolyse regulieren neben anderen posttrans lationalen Modifikationen die Halbwertszeit, den zellulären Transport und die Aktivität eines Proteins (Beers et al. , 2004). Durch unbegrenzte Proteolyse können Aminosäuren für neue Biosynthesen bereitgestellt, der Stoffwechsel durch Inaktivierung und Abbau von Proteinen reguliert und fehlerhafte Proteine aus der Zelle entfernt werden. Limitierte Proteolyse reguliert zudem die Funktion von Enzymen und Strukturproteinen. Dieser hochspezifisch und irreversibel angelegte Vorgang wandelt Vorstufenproteine in biologisch aktive Formen um (Schaller, 2004).
Das Genom von Arabidopsis kodiert über 800 Proteasen, die allen bekannten Familien zugeordnet werden können und deren biologische Funktionen noch weitestgehend unbekannt sind. Die bisher charakterisierten Formen zeigen aber bereits auch für die pflanzlichen Proteasen eine Beteiligung an einer Vielzahl sehr unterschiedlicher Prozesse (van der Hoorn, 2008). So spielt eine Protease eine wichtige Rolle bei der Chromosomen paarung und Rekombination während der Prophase I der Meiose (MPA1, Sánchez Morán et al. , 2004) und eine andere Form ist an der Aufrechterhaltung epidermaler Zellidentität beteiligt (DEK1, Johnson et al. , 2008). Proteolyse findet aber auch bei der
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Keimung statt, wodurch Speicherproteine im Endosperm der Monokotylen zu Aminosäuren abgebaut werden und für die Proteinbiosynthese wachsender Organe zur Verfügung stehen können (Mitsuhashi und Oaks, 1996). Proteasen spielen weiterhin eine wichtige Rolle bei der Seneszenz. Sie leiten die Proteinhydrolyse und Remobilisierung von Nährstoffen ein und ermöglichen dadurch besonders die Umverteilung organischen Stickstoffs innerhalb der Pflanze (Brouquisse et al. , 2001).
Pflanzliche Proteasen zählen aber nicht, wie früher gedacht, zu den Haushalts enzymen, sondern stellen vielmehr Schlüsselenzyme der pflanzlichen Zellhomöostase, des Wachstums und der Entwicklung sowie der Stressantwort dar (Walling, 2006). Sie sind bei Reaktionen in der Pathogenabwehr (Antão und Malcata, 2005) oder nach Verwundung (Fowler et al. , 2009) bis hin zum programmierten Zelltod (Beers et al. , 2000) involviert. Genexpressionsstudien implizieren zudem eine Beteiligung verschiedener Proteasen bei der Etablierung einer arbuskulären Mykorrhiza (Liu et al. , 2003; Hohnjec et al. , 2005) oder der Rhizobiensymbiose (Takeda et al. , 2007). Proteasen stellen folglich wichtige Regulatoren innerhalb aller Entwicklungsstadien einer Pflanze dar (Schaller, 2004). Mutationen können sogar für die Pflanze lethal sein (van der Hoorn, 2008).
1.1.2 Klassifizierung von Proteasen
Proteasen (EC 3.4) werden nach drei verschiedenen Kriterien klassifiziert. Ausgehend von der Lage der gespaltenen Peptidbindung innerhalb des Substrates unterscheidet man zwischen Exo und Endopeptidasen (Beynon und Bond, 2001). Exo peptidasen spalten eine Aminosäure, ein Di oder ein Tripeptid vom nicht blockierten Endterminus ab und werden deshalb in Amino (N Terminus) und Carboxypeptidasen (C Terminus) unterteilt. Endopeptidasen, auch Proteinasen genannt, spalten spezifisch innerhalb einer Polypeptidsequenz (McDonald, 1985; siehe Abbildung 1 1).
Abbildung 1-1: Einteilung der Proteasen anhand der von ihnen gespaltenen Peptidbindung innerhalb einer Polypeptidkette. Exopeptidasen spalten nur Peptidbindungen, die in der Nähe oder am Ende einer Peptidkette liegen und benötigen eine unsubstituierte α Amino oder α Carboxylgruppe. Endopeptidasen spalten innerhalb einer Polypeptidkette. (Schema nach McDonald, 1985)
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Vor mehr als 40 Jahren erkannten Schechter und Berger (1967) den Zusammenhang zwischen der Substratspezifität einer Protease und der Struktur ihres aktiven Zentrums. Das von ihnen erarbeitete Schema zeigt, wie die Interaktion des Substrats mit dem katalytischen Zentrum der Protease bestimmt, zwischen welchen Aminosäuren die Hydrolyse der Peptidbindung stattfindet (siehe Abbildung 1 2, a). Das aktive Zentrum einer Exopeptidase unterscheidet sich deshalb von dem einer Endopeptidase (siehe Abbildung 1 2).
a)
b)
Abbildung 1-2: Schema spezifischer Substratbindestellen, die die Substratspezifität einer Protease diktieren. Nomenklatur der Beschriftung geht auf Schechter und Berger (1967) zurück. Aminosäurereste des Substrates werden mit P („peptide“) und die entsprechenden Bindestellen innerhalb des katalytischen Zentrums des Enzyms werden mit S („subsites“) bezeichnet. Zusätzlich wird noch unterschieden, wo die Reste im Bezug zur Peptidbindung, die gespalten werden soll, innerhalb der Proteinsequenz liegen (z.B. P1’=Richtung C Terminus). a) Schema für eine Endopeptidase nach Barrett und Rawlings (2007). b) Schema für eine Carboxypeptidase nach McDonald (1985).
Die Aminosäuren, die das katalytische Zentrum einer Protease bilden, sind innerhalb der Proteinsequenz jedoch nicht zwingend nebeneinander angeordnet. Die entscheidenden Aminosäuren von Papain (EC 3.4.22.2), eine der am besten untersuchten pflanzlichen Cysteinproteinasen (Correa et al. , 2001), befinden sich an Stelle 158 (Cys), 292 (His) und 308 (Gln) innerhalb der Sequenz des Präproproteins (nach MEROPS Eintrag 1, siehe Abbildung 1 5). Erst durch die tertiäre Struktur wird das katalytische Zentrum in einer Spalte an der Proteinoberfläche zwischen zwei angrenzenden Strukturdomänen gebildet. Diese Lokalisierung des katalytischen Zentrums wurde anhand von kristallographischen Strukturanalysen auch für viele andere Proteasen bestätigt (Beynon und Bond, 2001). Es
1 http://merops.sanger.ac.uk/cgi bin/structure?mid=C01.001
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gibt aber auch andere Enzymstrukturen, wie die der Aminopeptidase N (Ito et al. , 2006) und der Rhomboidprotease von E. coli (Wang et al. , 2006) . Deren aktives Zentrum ist in einem Hohlraum innerhalb des Proteins lokalisiert, wodurch die Substratzugänglichkeit reguliert wird.
Abbildung 1-3: Hydrolysereaktion – Addition eines Wassermoleküls an eine Peptidbindung (Berg et al. , 2003)
Eine zweite Unterscheidungsmöglichkeit der verschiedenen Proteasen ergibt sich aufgrund der chemischen Natur des katalytischen Zentrums und dem Mechanismus der katalysierten Hydrolysereaktion – Addition eines Wassermoleküls an eine Peptidbindung (siehe Abbildung 1 3; Sterchi und Stöcker, 1999). Grundsätzlich besitzt jeder Proteasetyp eine nukleophile Gruppe, welche die Carbonylgruppe des Peptids angreift. Das ist möglich aufgrund der spezifischen Substratbindung innerhalb des aktiven Zentrums, wodurch sich die Carbonylgruppe an der zu spaltenden Peptidbindung des Substrats in einem Oxyanionenbereich der Protease befindet (van der Hoorn, 2008). Hier wird die Carbonyl gruppe des Substrats polarisiert, indem das Sauerstoffatom der Carbonylgruppe partiell negativ geladen wird, während das Kohlenstoffatom eine positive Partialladung erhält. Der so ermöglichte nukleophile Angriff seitens der Protease wird je nach Proteasetyp durch andere katalytische Gruppen katalysiert. Die nukleophile Gruppe stammt von einer Aminosäureseitenkette oder die Carbonylgruppe des Substrats wird von einem aktivierten Wassermolekül direkt angegriffen (siehe Abbildung 1-4 bzw. Tabelle 1 1; Berg et al. , 2003).
Die fachbezogene Literatur unterscheidet zwischen Serin , Cystein , Aspartat und Metalloproteasen (Beynon und Bond, 2001), wobei mittlerweile zwei weitere Gruppen beschrieben wurden (Barrett und Rawlings, 2007). Es handelt sich dabei um Threonin proteasen, zu denen das Proteasom und verwandte Komplexe gezählt werden (Schaller, 2004) und um Glutamatproteasen, die bisher nur in filamentösen Pilzen nachgewiesen wurden (Sims et al. , 2004; siehe Tabelle 1 1).
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Abbildung 1-4: Aktivierungsmechanismen der vier Hauptklassen von Proteasen . Bei den Serinproteasen (A) greift ein histidinaktiviertes Serin, bei den Cysteinproteasen (B) ein histidinaktiviertes Cystein, bei den Aspartatproteasen (C) ein aspartataktiviertes Wassermolekül und bei den Metalloproteasen (D) ein Metallionen aktiviertes Wassermolekül die Peptidbindung an. Bei den Metalloproteasen steht der Buchstabe B für eine Base (häufig ein Glutamatrest), welche die Deprotonierung des metallgebundenen Wassermoleküls unterstützt. rot – Substrat, blau – nukleophile Gruppe (aus Berg et al. , 2003).
Tabelle 1-1: Katalytische Typen von Proteasen.
katalytischer primäre katalytische sekundäre katalytische Beispiele a,b spezifische Typ Gruppe a Gruppe a Inhibitoren b
Serin Hydroxylgruppe von Imidazol von Histidin Subtilase, Trypsin, Elastase PMSF, AEBSF Serin (manchmal ε Amino gruppe von Lysin)
Threonin Hydroxylgruppe von Proteasom Lactacystin Threonin Cystein Thiolgruppe von Cystein Imidazol von Histidin Papain, Calpain, Cathepsin B E64, Iodoacetamid
Aspartat Carboxylgruppe von Pepsin, Phytepsin Pepstatin A zwei Aspartatresten und gebundenes Wasser
Glutamat Carboxylgruppe von Amidgruppe von Scytalidoglutamatpeptidase Glutamat Glutamin
Metallo Zinkatom (manchmal Carboxylgruppe von FtsH (ATP abhängig), 1,10 Phenanthrolin, auch ein anderes Metall) Glutamat Carboxypeptidase A EDTA und gebundenes Wasser a) Angaben nach Barrett und Rawlings, 2007 b) Angaben nach Beynon und Bond, 2001
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Das 1993 eingeführte MEROPS System ordnet die Proteasen zusätzlich nach Verwandtschaftsbeziehungen (Rawlings und Barrett, 1993). Ausgehend vom katalytischen Typen werden Proteasen mit einem gemeinsamen Vorfahren zu einem Clan zusammen gefasst. Innerhalb eines solchen Clans werden Proteasen mit größtmöglichen Sequenz homologien weiter in Familien gegliedert (Beynon und Bond, 2001). Deshalb wird die Endopeptidase Papain innerhalb der Cysteinproteasen (C) dem Clan CA, der Familie C1 und der Unterfamilie C1A zugeordnet (Beers et al. , 2004).
Neben kristallographischen Strukturanalysen können Proteasen bereits anhand der Sequenzvergleiche mit bekannten Proteaseformen einem katalytischen Typ zugeordnet werden. So besitzen viele Metalloproteasen das sogenannte HEXXH Motiv (X entspricht einer variablen Aminosäure). Es handelt sich dabei um die Zinkbindungsstelle, die aus zwei Histidinresten (H) und je nach Metalloproteasefamilie einem weiteren Histidin oder Glutamatrest (E) besteht (Jiang und Bond, 1992). Bei der Peptidasefamilie M1 liegt dieser Rest 18 Aminosäuren entfernt vom HEXXH Motiv in Richtung C Terminus (HEXXH[18X]E; Peer, 2011b). Daneben ist es möglich, durch die biochemische Charakterisierung und Verwendung spezifischer Inhibitoren eine Protease einer dieser katalytischen Gruppen zuzuordnen. So werden Metalloproteasen durch EDTA oder 1,10 Phenanthrolin gehemmt, weil diese das essentielle Metallion, in den meisten Fällen Zink, aus dem aktiven Zentrum entfernen und im Komplex binden. Inhibitoren der anderen Proteasegruppen (PMSF, E64, etc.) sind jedoch nicht in der Lage, Metalloproteasen zu hemmen (Beynon und Bond, 2001).
1.1.3 Regulationsmechanismen der pflanzlichen Proteaseaktivität
Jede Protease wird hinsichtlich ihrer Aktivität sowohl räumlich als auch zeitlich streng reguliert. Das trifft sowohl auf die Threoninproteasen des Proteasomkomplexes zu, der für den kontrollierten Proteinabbau im Cytosol und Nukleus verantwortlich ist (Barrett und Rawlings, 2007) als auch für eine Aspartatproteinase (CDR1), die bei Pathogenbefall in den Apoplasten sekretiert wird (van der Hoorn, 2008). Um unkontrollierte Proteolyse in der Zelle zu verhindern, werden Proteasen als inaktive Vorstufen synthetisiert. Die sogenannten Zymogene besitzen eine Prodomäne, die das aktive Zentrum sterisch blockiert und das Binden des Substrates verhindert. Das Propeptid wird enzymatisch durch Autoproteolyse oder durch andere Proteasen entfernt. Nichtenzymatische Prozesse wie eine pH Änderung können aber auch durch die stattfindende Konformationsänderung des Enzyms zum Entfernen der sterischen Blockade führen (Khan und James, 1998). Proteasen werden außerdem durch ihre Substratspezifität reguliert. Diese wird durch strukturelle
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Eigenschaften des katalytischen Zentrums bestimmt und manchmal sogar durch sogenannte Adaptorproteine beeinflusst, die das Substrat zur Protease bringen (Gottesman, 2003).
Zusätzlich besitzen viele Proteasen eine N terminale Signalsequenz, die für den Transport in ein bestimmtes Zellkompartiment sorgt, wodurch das Substratspektrum auf die jeweils kolokalisierten Proteine eingeschränkt wird (Barrett und Rawlings, 2007). Die lösliche Cysteinproteinase Papain aus dem Latex der Papaya (Carica papaya ) wird als sogenanntes Präpropapain am rauen Endoplasmatischen Retikulum (ER) synthetisiert. Der Name verweist auf die Bildung dieser Protease als inaktive Vorstufe (Pro) mit einer N terminalen Signalsequenz (Prä) (Beers et al. , 2004; siehe Abbildung 1 5). Das Signalpeptid bestehend aus 18 Aminosäuren (nach UniProt Eintrag 2) wird beim Transport ins ER abgespalten. Das Proprotein wird dann über Golgivesikel an die Plasmamembran (PM) transportiert und in den Apoplasten sekretiert (Emanuelsson et al. , 2000). Wie genau das Propeptid (114 Aminosäuren) in vivo entfernt wird, ist noch nicht genau bekannt. In vitro konnte diese Proregion bei pH 4 durch autokatalytische Spaltung entfernt werden (Moutim et al. , 1999).
Abbildung 1-5: Sequenzstruktur der inaktiven Vorstufe von Papain (Zymogen). Das Signalpeptid, der als inaktiven Vorstufe synthetisierten Cysteinproteinase Papain, dient als Transportsignal und wird im ER abgespalten. Die noch inaktive Form wird über Golgivesikel an die PM transportiert und in den Apoplasten sekretiert. Das Propeptid blockiert das aktive Zentrum, das durch die hervorgehobenen Aminosäuren Cystein (C158), Histidin (H292) und Asparagin (N308) gebildet wird. Die Aktivierung erfolgt durch das Abspalten des Propeptids. (Schema nach Einträgen zu Papain bei UniProt und MEROPS).
Neben den sequenzbedingten Mechanismen wird die Proteaseaktivität zusätzlich durch die Interaktion des Enzyms mit anderen Substanzen reguliert. Dazu zählen hauptsächlich Proteine, die als Proteaseinhibitoren von den Pflanzen auch gegen organismusfremde Proteasen oder bei Insektenfraß abgegeben werden. Die Regulation der Proteaseaktivität erfolgt dabei direkt durch das Binden eines Inhibitors im aktiven Zentrum oder indirekt durch Konformationsänderungen, die durch das Binden des Inhibitors ausgelöst werden (Habib und Fazili, 2007).
2 http://www.uniprot.org/uniprot/P00784
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1.2 Membrangebundene Proteasen in Pflanzen
Proteasen wurden innerhalb der pflanzlichen Zelle in allen Kompartimenten sowie als lösliche oder membrangebundene Formen nachgewiesen (van der Hoorn, 2008). Dabei sind alle bisher beschriebenen membrangebundenen Proteasen an den inneren Membranstrukturen der Plastiden oder Mitochondrien lokalisiert. So sind an der Thylakoidmembran ATP abhängige FtsH Proteasen des Metallotyps gebunden und ihre Proteasedomäne ist zum Stroma hin ausgerichtet (Sakamoto, 2006). Daneben wurden Serinproteasen beschrieben (SppA, DegP), die auf der luminalen Seite oder der Stromaseite der Thylakoidmembran assoziiert vorliegen (Sakamoto, 2006). In den Mitochondrien wurden ebenfalls ATP abhängige Metalloproteasen nachgewiesen, deren Proteasedomäne entweder zum Intermembranraum (i AAA FtsH Protease) oder zur Matrix (m AAA FtsH Protease) hin ausgerichtet ist. Die Monomere sind entweder über eine transmembrane Domäne (i AAA) oder zwei Domänen (m AAA) in der inneren Mitochondrienmembran verankert (Janska, 2005).
PM gebundene Proteasen wurden bisher nicht in Pflanzen beschrieben. Einzig eine PM assoziierte Metalloaminopeptidase aus Arabidopsis konnte als peripheres PM Protein nachgewiesen werden (Murphy et al. , 2002). In der Literatur finden sich aber, gestützt auf Sequenzanalysen von Arabidopsis thaliana und Reis ( Oryza sativa ), Hinweise auf PM gebundene Proteasen. Mit Hilfe eines entwickelten Algorithmus haben Eisenhaber und Kollegen (2003) Glykosyl Phosphatidylinositol verankerte (GPI verankerte) Proteasen in beiden Pflanzenarten vorhergesagt. Vergleichbare Ergebnisse wurden von Borner und Kollegen (2003) über massenspektrometrische Analysen der nach einer Behandlung mit der Phosphatidylinositol spezifischen Phospholipase C von der PM abgespaltenen Proteine ermittelt.
GPI verankerte Proteine werden nach der Übertragung des GPI Ankers auf das Protein vom ER über Vesikel zur PM transportiert und sind dort auf der apoplastischen Seite der PM lokalisiert (Maeda und Kinoshita, 2011). Proteasen mit einem solchen GPI Anker wurden bereits in Hefezellen (Aspartatproteinase Yps1p, Sievi et al. , 2001) und beim Menschen (Serintyp, Antalis et al. , 2010; Metallotyp, Antczak et al. , 2001) charakterisiert. Daneben wurden auch andere PM gebundene Proteasen bei Säugetieren beschrieben, die über eine N oder C terminale transmembrane Domäne (TMD) an der apoplastischen Seite der PM gebunden sind (Antczak et al. , 2001).
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1.3 Die pflanzliche Plasmamembran
Die pflanzliche Zelle besteht aus verschiedenen Organellen und Membransystemen, die von der PM eingeschlossen werden. Dabei stellt die PM nicht nur eine äußere Hülle dar, sondern sie kontrolliert den Austausch von Informationen und Stoffen mit dem extra zellulären Milieu (Tjellström et al. , 2010). Sie besteht aus Lipiden und Proteinen, deren physikalische Eigenschaften eine selektiv permeable Barriere für Makromoleküle und gelöste Substanzen bilden (Furt et al. , 2011). Neben der Aufnahme von Wasser und essentiellen Mineralstoffen finden Gasaustausch, Transport von Metaboliten aber auch Wahrnehmung von Signalmolekülen und erste Reaktionen auf externe Reize an dieser Membran statt (Murphy et al. , 2011).
Abbildung 1-6: Membranproteintypen. Integrale Membranproteine stehen in intensiver Wechsel wirkung mit den Kohlenwasserstoffketten der Membranlipide. Periphere Membranproteine sind über elektrostatische Kräfte und Wasserstoffbrücken mit den Kopfgruppen der Lipide an der Membran gebunden. Viele periphere Membranproteine sind an die Oberfläche integraler Membranproteine gekoppelt. Andere sind über eine kovalent gebundene hydrophobe Seitenkette, wie eine Fettsäure, in der Lipiddoppelschicht verankert (GPI Anker: Glykosyl Phosphatidylinositol Anker). (modifiziert nach Taiz und Zeiger, 2003)
Proteine sind in der Lipiddoppelschicht unterschiedlich angeordnet. Peripher assoziierte Membranproteine sind durch elektrostatische Wechselwirkungen und Wasser stoffbrücken mit integralen Membranproteinen oder den Kopfgruppen von Membranlipiden verknüpft. Ihre nicht kovalente Bindung an die Membran kann durch die Behandlung mit NaCl gestört werden (Munk, 2008). Integrale Membranproteine werden im Vergleich dazu durch Detergenzien oder organische Lösungsmittel solubilisiert (Berg et al. , 2003). Sie
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besitzen entweder einen lipophilen Membrananker oder durchspannen selbst mit hydro phoben Domänen die Membran. Ein Protein kann über mehrere dieser TMD verfügen, die eine α Helix oder eine ß Faltblattstruktur aufweisen. Es kann aber auch mit seinen hydrophoben Bereichen in einer Lipidschicht der PM eingebettet sein (integrale mono topische Proteine; siehe Abbildung 1 6). Die Verankerung über einen lipophilen Membran anker ist eine posttranslationale Modifikation. Dabei wird das Protein entweder auf eine Fettsäurekette, wie Myristin oder Palmitinsäure, auf eine Polyprenylseitenkette, wie Farnesyl oder Geranylgeranyl, oder auf einen GPI Anker übertragen (Munk, 2008). GPI verankerte Proteine wurden bisher ausschließlich an der apoplastischen PM Seite nachgewiesen (Maeda und Kinoshita, 2011).
Die hochkomplexe Struktur der PM zeigt sich auch in der asymmetrisch transversalen Verteilung der Phospholipide, Sphingolipide und Sterole innerhalb der Lipidschichten (Hill et al. , 1999). Zudem sind zusätzlich unterschiedliche Kohlenhydratmoleküle kovalent mit den Lipiden und Proteinen verknüpft, wobei diese Glykolipide und die Kohlenhydratreste der Glykoproteine an der äußeren Seite der PM lokalisiert sind (Lodish et al. , 2000). Diese asymmetrische Lipid und Proteinzusammensetzung wird durch einen ständigen Membran fluss reguliert (Peer, 2011a). Dieser beinhaltet i) den Transport von Proteinen an die PM und die Sekretion in den Apoplasten, ii) den Transport von PM Proteinen und aufgenommenen Proteinen in die Zelle sowie iii) den Proteintransport innerhalb der PM (Peer, 2011a). Wobei diese laterale Diffusion von Proteinen aber auch Lipiden innerhalb der PM gleichzeitig durch Lipid Lipid , Lipid Protein und Protein Protein Interaktionen zeitlich und räumlich begrenzt wird. Dadurch entstehen Mikrodomänen innerhalb der Membran, sogenannte „lipid rafts“, deren Funktionen der Membranfluss / transport, Signaltransduktion und Zellpolarisierung sind (Simons und Gerl, 2010).
Der strukturelle Unterschied zwischen der PM und allen anderen Endomembranen einer Zelle spielt bei der Isolierung der PM eine Rolle. So werden mit Hilfe des sogenannten wässrigen Polymer Zweiphasensystems Membranvesikel einer Zelle nicht aufgrund ihrer Größe oder Dichte voneinander getrennt sondern aufgrund ihrer Oberflächeneigenschaften, zu denen elektrochemische, hydrophobe und biospezifische Eigenschaften gehören (Larsson et al. , 1994). Dabei wird die Asymmetrie der PM für die Isolierung der „right side out“ PM Vesikel von allen anderen Endomembranen und „inside out“ PM Vesikeln ausgenutzt.
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1.4 Fragestellungen der Arbeit
Die massenspektrometrische Analyse von Membranproteinen benötigt eine andere Herangehensweise als die Analyse löslicher Proteine. PM Proteine sind amphiphil und dementsprechend sind Detergenzien nötig, um diese Proteine aus der Membran heraus zulösen. Dabei unterscheiden sich Detergenzien in ihren Solubilisierungseigenschaften und können mit den verwendeten chromatographischen Techniken sowie mit der massenspektrometrischen Analyse interferieren (Swiderek et al. , 1997). Dementsprechend ist es unbedingt erforderlich, ein geeignetes Detergenz für die Anreinigung auszuwählen. Gleichzeitig muss das gesuchte Membranprotein so weit wie möglich angereinigt werden, damit es neben den abundanten Aquaporinen überhaupt massenspektrometrisch detektiert wird (Wittmann Liebold et al. , 2006).
In der vorangegangenen Vorarbeit wurde bereits PM gebundene Proteaseaktivität in den Wurzeln von Tabak ( Nicotiana tabacum ) nachgewiesen und die ersten Anreinigungs experimente hatten auf verschiedene PM gebundene Proteasen hingewiesen. Die Aufgabe lag nun darin, diese PM Proteasen voneinander zu trennen und anzureinigen, um die Amino säuresequenzen über massenspektrometrische Analyseverfahren ermitteln zu können.
Dazu wurde neben Tabak auch Gerste ( Hordeum vulgare ), eine weitere wichtige teilsequenzierte Kulturpflanze, verwendet. Vortests hatten caseinolytische Proteaseaktivität an der Gerste PM bestätigt und die Pflanze garantierte genauso wie Tabak eine ausreichende Wurzelmenge für die PM Präparation. Die massenspektrometrische Analyse der angereinigten PM Protease(n) aus Gerstewurzeln wurde in Zusammenarbeit mit dem Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung in Gatersleben (IPK) geplant, wo bereits EST Datenbanken für Gerste erstellt worden sind. Dazu wurden verschiedene Reinigungsverfahren (Detergenzien, Chromatographie, Gelelektrophorese) getestet, um geeignete Methoden für die Anreinigung der proteolytischen Membranproteine auszuwählen. Besonderes Interesse galt dabei der Optimierung der Probenaufarbeitung für die Massenspektrometrie und der anschließenden Datenauswertung, die im Hinblick auf ihre Eignung beurteilt werden sollen.
Sequenzinformationen reichen nicht aus, um auf Funktion und Regulation eines Proteins schließen zu können. Deshalb wurde die proteolytische Aktivität an den PM Vesikeln beider Pflanzenarten hinsichtlich der Substratspezifität, Verteilung innerhalb der Pflanzenorgane Blatt und Wurzel sowie weiterer Enzymmerkmale (pH Optimum, Aktivatoren, Inhibitoren) charakterisiert. Von besonderem Interesse war dabei der Einfluss der Stickstoffernährung auf die PM assoziierte Proteaseaktivität beider Pflanzenarten, der bereits für andere wurzelspezifische PM gebundene Enzyme nachgewiesen wurde
11 EINLEITUNG
(Stöhr, 1999; Stöhr und Stremlau, 2006). Außerdem wurden gezielte Untersuchungen hinsichtlich potentieller Substrate der PM gebundenen Proteasen durchgeführt. Dabei wurde auch geprüft, ob die PM Proteasen einen Anteil an der Exsudation von Proteasen oder anderen Peptiden in die Rhizosphäre haben.
Die Existenz PM gebundener Proteasen in Tabak und Gerste – einer Dikotylen und einer Monokotylen – deutet auf einen bisher unbekannten grundlegenden Regulations mechanismus an der PM in Pflanzenwurzeln hin. Die vorliegende Arbeit soll zur Klärung der Identität, Funktion, Lokalisierung und Regulation dieser PM gebundenen Proteasen beitragen.
12 MATERIAL UND METHODEN
2. Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Pflanzen Nicotiana tabacum cv . Samsun (Tabak SNN; Genbank Gatersleben) Hordeum vulgare cv . Christina (Sommergerste, Versuchssaatgut 2007 SW Seed GmbH, Hanstedt)
2.1.2 Sand
Der Quarzsand (Sandkultur) wurde von den Quarzwerken Werferlingen bezogen: Korngröße 0,1 0,5 mm (fein, Typ WF 33); Korngröße S 0,7 1,2 mm (grob, Typ TV 25).
2.1.3 Feinchemikalien
1,10 Phenanthrolin Sigma AEBSF (4 (2 Aminoethyl)benzensulfonylfluorid HCl) Sigma Bestatin (N [(2S,3R) 3 Amino 2 hydroxy 4 phenyl butyryl] L leucin – HCl) Sigma Chymotrypsin; Sequenzierungsreinheitsgrad, aus dem Rinderpankreas Roche Dextran T500; von Leuconostoc mesenteroides Fluka DTT (1,4 Dithio DL threitol) AppliChem / Roth E64 (N (trans Epoxysuccinyl) L leucin 4 guanidinobutylamid) Sigma EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalz Dihydrat) Roth Elastase; für Zellkultur geeignet, aus dem Schweinepankreas Sigma Exopeptidasesubstrate (Ala pNA, Leu pNA, Arg pNA, Gly Pro pNA, siehe Tabelle 2 8 MCA AlaProLys Dnp) FTC Casein (Fluoresceinthiocarbamoyl Casein); Substrat aus dem Pierce QuantiCleaveTM Fluorescent Protease Assay Kit HEPES (2 (4 (2 Hydroxyethyl) 1 piperazinyl) ethansulfonsäure) AppliChem Imidazol Fluka Leupeptin Fluka Lubrol 17A17 MP Biomedicals, Inc. MES (2 (N Morpholino)ethansulfonsäure) AppliChem Octylglucosid (n Octyl ß D glucopyranosid) AppliChem PEG (Polyethylenglykol 4000) AppliChem / Roth Pepstatin A Sigma PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) Fluka PNGase F (Peptid N glykosidase F); von Elizabethkingia meningosepticum Sigma Proteaseinhibitorcocktail für pflanzlichen Zellextrakt Sigma PVP (Polyvinylpyrrolidon (K30)) AppliChem / Roth PVPP (Polyvinylpolypyrrolidon, Polyvinylpyrrolidon vernetzt) Sigma / AppliChem RB3014 (2 {3[(1 Aminoethyl ) hydroxyphosphinoyl] 2 benzyl propionyl Dr. B.R. Roques amino }3 phenylpropionsäure) SDS (Natriumdodecylsulfat) AppliChem TCA (Trichloressigsäure) Roth Ticarcillin Disodium Mixture 15:1 & Potassium Clavulanate Duchefa Tris (Tris (hydroxymethyl) aminomethan) AppliChem / Roth Triton X 100 AppliChem Triton X 114 Fluka Trypsin (gelöst in BupH Borate Puffer, pH 8,5; oder lyophilisiert) Pierce oder Serva Trypsin; Sequenzierungsreinheitsgrad Promega
13 MATERIAL UND METHODEN
Alle weiteren, nicht gesondert aufgeführten Grundchemikalien wurden von den folgenden Firmen bezogen: AppliChem Darmstadt GE Healthcare (ehemals Amersham Pharmacia Biotech) München Merck (inklusive Calbiochem) Darmstadt Roche Mannheim Roth Karlsruhe Serva Heidelberg Sigma (inklusive Fluka) München
2.1.4 Geräte Cellulose Acetat Filter (0,45 m] Sartorius Membran Vakuumpumpe VEB Reglerwerk Dresden DTX880 (Multiwell Reader) Beckman Coulter Eismaschine AF 20 Scotsman Feinwaage HG 2000 (0,01 2000 g) VIBRA Shinko Denski Feinwaage BP 210S (10 mg – 210 g) Sartorius AG Fluoreszenzmessung: Degaser Knauer Pumpe Spectra Series P 100 Thermo Separation Products Autosampler Spectra System AS 100 und AS3000 Thermo Scientific Fluoreszenzdetektor FP 1520 Jasco FPLC System I Äkta FPLC Amersham Biosciences Chromatographiesäulen: Econo Pac High Q (Anion Exchange), 5 ml BioRad HiTrap TM SP HP, 1 ml GE Healthcare Econo Pac t Butyl HIC, 5 ml BioRad HiTrap TM Chelating HP, 1 ml Amersham Pharmacia Biotech FPLC System II Econo System (Gradient Monitor, Econo Pump, etc.) BioRad Econo Pump (für Variperm) BioRad Gelfiltrationssäule: Superdex®200 Unbekannt Gelelektrophorese (Maxi Gele) Gelkammer TV400 VWR Gradientenmischer IPS 16 Ismatec Sa Electrophoresis Power Supply EPS 3501 XL Amersham pharmacia biotech Heizblock LS1 VLM GmbH Horizontalschüttler KL 2 und SM 30 B E. Bühler Labortechnik Materialtechnik J. O. GmbH Hydroponische Kultur: Pumpe Aco 9620 und Aco 9630 Hailea Belüftungsschläuche und Sprudelsteine ELITE (Hagen) Küchenmixer MX 32 Braun Kühlbrutschrank KB 240 Binder GmbH Magnetrührer RCT basic und RH basic KT/C IKA® Werke GmbH & Co.KG Magnetrührer MR 3001 K Heidolph Microcon® Membranfilter (YM10, NMWL 10000) Amicon
14 MATERIAL UND METHODEN
pH Meter: WTW pH 320 (Elektrode: SenTix® 41) WTW GmbH WTW inoLab Terminal Level 3 (Elektrode: SenTix® Mic) WTW GmbH Photometer: Cary 100 BIO UV VIS Spektrophotometer Varian Inc. Photometer Libra S5 Biochrom Ltd Photometer Genesys 10vis Thermo Scientific Photometer Helios Omega UV VIS Thermo Scientific Scanner Epson 1680 Pro Transparency Unit Epson Schüttelwasserbad GFL® 1083 Gesellschaft für Labortechnik Speedvac VR 1 (Centrivac) Heraeus instruments Membran Vakuumpumpe Vacuubrand Kühlteil CT100 Meto Lab equipment Tiefkühlschrank Vip series 86 °C Sanyo Trockenschrank TS100 MLW Ultraschallbad Sonorex Suer 10 P Digital Bandelin Variperm M (Dialyse) Kronlab Vortexer MS2 Minishaker IKA® Werke GmbH & Co.KG Vortexer Vortex Genie 2 Scientific Industries Zentrifugen: Tischzentrifuge 5417 R (Rotor: FA45 24 11) Eppendorf Zentrifuge 5804 R (Rotor: F34 6 38; F45 30 11; A 4 44) Eppendorf Zentrifuge 6K 15 (Festwinkelrotor 12256) Sigma Laboratori Centrifuges Ultrazentrifuge Optima LE 80K (Rotor: Ti45) Beckman Coulter Heraeus: Biofuge stratos (Rotor: 007303; 007770) Thermo
2.1.5 Software
Datenerhebung: CaryWinUV (Varian) ChromQuest 3.0 bzw. 5.0 (ThermoQuest Cooperation) Multimode System Software Version 3.3 (Beckman Coulter) Datenaufbereitung: Adobe Photoshop CS BioEdit Version 7.0.5.2 Office 2003 Origin Pro7G Scaffold3 Version 3.0.9.1 SigmaPlot 10 Literaturverwaltung: Endnote 10
2.1.6 Wasseraufbereitung
Das Leitungswasser wurde mit der Umkehrosmose (RIOS 30) aufbereitet. Für die Nährlösungen und für den Laufpuffer der HPLC wurde dieses RIOS Wasser verwendet
(H 2ORein ). Alle anderen Lösungen wurden mit zweifach gereinigtem Wasser hergestellt ® (H 2OReinst ). Dazu wurde H 2ORein mit Hilfe des MILLI Q Synthesis Systems von Millipore weiter aufbereitet.
15 MATERIAL UND METHODEN
2.2 Methoden
2.2.1 Pflanzenanzucht und Kultivierung von Tabak
Die Tabaksamen keimten nach Stöhr und Ullrich (1997) in einer Petrischale auf
einem mit 0,5 mM CaSO 4 getränkten Filterpapier bei schwacher Lichtintensität. Nach elf Tagen wurden die Keimlinge in eine Sandkultur überführt und täglich mit Nährlösung (siehe Tabelle 2 1) versorgt. Nach drei Wochen Wachstum in kleinen Töpfen (ø 8 cm) wurden die Tabakpflanzen anschließend für weitere vier Wochen in große Töpfe (ø 16 cm) umgesetzt. Der für die Sandkultur verwendete Grob und Feinquarzsand wurde im Verhältnis 2:1 miteinander vermischt.
Tabelle 2-1: Nährlösung für die Anzucht der Tabak- und Gerstepflanzen (verändert nach Hoagland und Arnon, 1939). Die Fe EDTA Lösung wurde separat angesetzt und bis zur vollständigen Lösung gekocht. Die Spurenelemente wurden als separate Lösung angesetzt. Für alle Lösungen wurde H 2ORein verwendet und der pH Wert wurde mit NaOH auf 5,5 eingestellt. Für die Tabakpflanzen (b) entspricht die jeweils verwendete Nitratkonzentration einer i) Mangelversorgung; ii) Normalversorgung oder iii) Überversorgung.
Substanz Endkonzentration
Ca(NO 3)2 a) kleine Töpfe 2,5 mM b) große Töpfe 1,0 mM i) 5,0 mM ii) 12,5 mM iii)
KH 2PO 4 3,0 mM
MgSO 4 1,0 mM
CaSO 4 * 2 H 2O 1,0 mM Fe EDTA Komplex 25,0 M
MnSO 4 * H 2O 14,7 M
CuSO 4 (entwässert) 1,5 M
ZnSO 4 * 7 H 2O 1,0 M
H3BO 3 (entwässert) 30,0 M
Na 2MoO 4 * 2 H 2O 0,285 M
CoSO 4 * 7 H 2O 0,1 M
NiSO 4 * 6 H 2O 0,1 M
Die Tabakpflanzen wurden im Gewächshaus des Botanischen Instituts unter kontrollierten Bedingungen angezogen (Lichtphase: 14 h, 28 °C, 75 % RLF; Dunkelphase: 10 h, 22 °C, 85 % RLF). Es bestand zusätzlicher Einfluss von Tageslicht. Nach vier Wochen Wachstum in den großen Töpfen wurden die mikrosomalen Membranfraktionen (mF) sowie die Plasmamembranvesikel (PM Vesikel) und übrigen Membranen aus Blatt und Wurzel
16 MATERIAL UND METHODEN
material gewonnen. Um den Einfluss der Stickstoffversorgung auf die PM assoziierte Proteaseaktivität zu prüfen, wurden Nährlösungen mit unterschiedlichen Nitratkonzentra tionen für die in große Töpfe umgesetzten Tabakpflanzen verwendet. Es wurden keine Parameter bezüglich des Pflanzenwachstums und des Pigmentgehaltes erhoben. Der Einfluss der Stickstoffversorgung auf das Wachstum von Tabakpflanzen wurde bereits von Stöhr (1999) beschrieben.
2.2.2 Pflanzenanzucht und Kultivierung von Gerste a) Pflanzenanzucht
Die Gerste wurde als hydroponische Kultur angezogen. Dazu wurden die
Gerstensamen zunächst 2 h in H2ORein bei Raumtemperatur (RT) im Dunkeln vorgequollen und anschließend mit 0,5 % NaClO für 15 min inkubiert. Nach gründlichem Spülen mit
H2ORein wurden die Samen auf Gaze (Lochgröße 0,4 x 0,4 cm) ausgelegt, die über Anzuchtsschalen (57 x 38 x 8 cm) gespannt war. Jede Anzuchtsschale enthielt zwei
Belüftungsschläuche (45 cm lang) und wurde mit 0,5 mM CaSO 4 Lösung gefüllt (13 l). Während der Samenkeimung wurden die Anzuchtsschalen mit weiteren Schalen abgedeckt. Ab Tag 4 wurden die Keimlinge belichtet und wenn nötig vereinzelt. Am 5. und 7. Tag wurde die CaSO 4 Lösung gewechselt. Am 9. Tag wurde die Lösung gegen 5 mM Nitratnährlösung für kleine Töpfe (siehe Tabelle 2 1) ersetzt. Ab dem 11. Tag wurde die Nährlösung täglich gewechselt und zusätzlich eine Nitritbestimmung der Lösung durchgeführt. Die Anzucht der Gerste fand im Gewächshaus des Botanischen Instituts unter kontrollierten Bedingungen statt (Lichtphase: 14 h, 22 °C; Dunkelphase: 10 h, 18 °C). Die Luftfeuchtigkeit wurde nicht reguliert und es bestand zusätzlicher Einfluss von Tageslicht. Zwei Wochen nach der Quellung der Samen wurden mF sowie PM aus Blatt und Wurzelmaterial gewonnen.
Für die Anzucht der Stickstoffmangelpflanzen wurde ab dem 9. Tag die Nährlösung für kleine Töpfe ohne Stickstoffquelle in Form von Ca(NO 3)2 verwendet (siehe Tabelle 2 1). Die Gerstepflanzen dieser Stickstoffmangelanzucht zeigten nach zwei Wochen im Vergleich zur 5 mM Nitraternährung deutliche Mangelerscheinungen, wie geringere Spross und Wurzelmasse und einen niedrigeren Pigmentgehalt (siehe Tabelle 2 2).
17 MATERIAL UND METHODEN
Tabelle 2-2: Vergleich des Entwicklungsstands der Gerstepflanzen bei der Ernte in Abhängigkeit von der Stickstoffernährung. Neben Mittelwert und Standardabweichung wurde ein unabhängiger t Test durchgeführt. Die geschätzte Pflanzenanzahl pro Anzuchtsschale betrug 759 ± 117 (5 mM Nitrat) und 717 ± 114 (ohne Zugabe) und war nicht signifikant verschieden (p=0,44). (5 mM Nitratanzucht: n=14, für Pigmentgehalte n=15; Anzucht ohne Stickstoffzugabe: n=7; für Pigmentgehalte n=15) Asterisk zeigt an, dass sich der Mittelwert der Stickstoffmangelernährung signifikant von dem Mittelwert der 5 mM Nitraternährung unterscheidet (p<0,05). Wachstumsparameter Einheit Stickstoffernährung 5 mM Nitrat ohne Zugabe Wurzelfrischgewicht [g Anzuchtsschale 1] 128 ± 20 95 ± 12* Sprossfrischgewicht [g Anzuchtsschale 1] 220 ± 30 151 ± 28* Sprossfrischgewicht einer Pflanze [g Pflanze 1] 0,29 ± 0,01 0,21 ± 0,01* Pigmentgehalte: 1 Chlorophyll a [mg Chl a g TG ] 11,2 ± 1,5 7,4 ± 1,8* 1 Chlorophyll b [mg Chl b g TG ] 4,7 ± 0,7 3,3 ± 0,8* Carotinoide [mg Carotinoide g TG 1] 1,6 ± 0,3 0,9 ± 0,2* Pigmentverhältnisse: Chlorophyll a zu Chlorophyll b 2,4 ± 0,1 2,3 ± 0,1* Gesamtchlorophyll zu Carotinoide 6,1 ± 0,5 7,5 ± 1,8*
b) Optimierung der Pflanzenanzucht von Gerste
Die im Laufe von drei Jahren erhobenen Anzuchtsparameter zeigten einen Zusammenhang zwischen der Pflanzenanzahl und dem Biomassezuwachs. Je mehr Pflanzen pro Anzuchtsschale (0,2 m² Fläche) kultiviert wurden, desto weniger Sprossfrisch gewicht wurde im Durchschnitt von einer einzelnen Pflanze gebildet (siehe Anhang Abbildung 7 1, A). Eine unterschiedliche Pflanzenanzahl je Schale sollte durch das Vorwiegen der Samen (je Schale ca. 50 g Samen) vermieden werden. Die Pflanzenanzahl veränderte sich durch das Absammeln von nicht gekeimten Samen und von Samen mit Schimmelbefall. Desweiteren hatte die Pflanzenanzahl einen Einfluss auf das Gesamtwurzel frischgewicht einer Anzuchtsschale. Mit steigender Pflanzenanzahl wurde auch mehr Wurzelmasse gebildet, wobei die Zunahme einer Sättigungskurve entsprach. Bereits mit 900 Pflanzen pro Anzuchtsschale konnte eine geringfügige Abnahme der gebildeten Wurzel masse festgestellt werden (siehe Anhang Abbildung 7 1, B).
Die Gersteanzucht wurde nicht unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Die Belüftungskapazität des Kulturmediums wurde deshalb nicht nur durch die mit dem Wurzelwachstum einhergehenden steigenden Respiration der Pflanzen beeinflusst sondern auch durch bakterielle Stoffwechselprozesse (Binnerup und Sørensen, 1992). Um anaerobe Bedingungen zu vermeiden, wurde deshalb neben dem Einsatz von Belüftungsschläuchen ein täglicher Nährlösungswechsel durchgeführt. Als Indikator für die Belüftungskapazität
18 MATERIAL UND METHODEN
wurde Nitrit, ein Zwischenprodukt der Denitrifikation (Betlach und Tiedje, 1981), gewählt. Wenn die Nitritkonzentration einen Wert von 5 nmol ml Anzuchtsmedium 1 überstieg, wurde die Nährlösung erneut gewechselt. Eine Erhöhung der Nitritkonzentration im Kulturmedium korrelierte dabei mit einer Erhöhung der Gerstepflanzen pro Anzuchtsschale (siehe Anhang Abbildung 7 1, C). Gleichzeitig stand eine hohe Nitritkonzentration im Kulturmedium im Zusammenhang mit einer geringen spezifischen Proteaseaktivität an den PM Vesikeln (siehe Anhang Abbildung 7 1, D). In den Monaten April bis Juni kam es trotz der Vorkehrungen zu einer Erhöhung der Nitritkonzentration im Medium (siehe Anhang Abbildung 7 1, E). Möglicherweise haben die höheren täglichen Sonnenstunden zu einem erhöhten Stoff wechsel und zu stärkerem Bakterienwachstum im Kulturmedium geführt und es kam deshalb zu einem höheren Sauerstoffverbrauch (siehe Anhang Abbildung 7 1, E).
Zusammenfassend wurde die Gersteanzucht optimiert, indem die Pflanzenanzahl pro Anzuchtsschale auf 700 bis 800 Pflanzen beschränkt wurde. Während der gesamten Anzucht wurden schimmelnde Samen sofort entfernt und bei einer Nitritkonzentration über 2 nmol ml 1 wurde das Medium zweimal täglich gewechselt. Wie bereits in der vorangegangenen Diplomarbeit (Eick, 2006) an PM Vesikeln von Tabakwurzeln gezeigt wurde, konnte auch bei der Gerste keine jahreszeitliche Abhängigkeit der spezifischen Proteaseaktivität an PM Vesikeln nachgewiesen werden (siehe Anhang Abbildung 7 1, F).
2.2.3 Pigmentbestimmung der Gerste
Am Tag der Ernte wurden vom ersten gebildeten Gerstenblatt die oberen 8 cm abgenommen, das Material von zwei Pflanzen vereinigt und bis zur Pigmentbestimmung bei 20 °C aufbewahrt. Die Pigmentextraktion wurde mit Methanol bei 62 °C nach Sartory und
Grobbelaar (1984) durchgeführt. Dazu wurde das Blattmaterial mit Methanol und Mg(HCO 3)2 15 min bei 62 °C gekocht und zentrifugiert (3000 x g, RT, 15 min). Der Überstand wurde abgenommen, dunkel gestellt und die Prozedur wiederholt, bis das Pellet weiß war. Die Extinktion wurde bei 750, 666, 653 und 470 nm gemessen, wobei 750 nm als Refferenz wellenlänge diente. Die Berechnung der Pigmentgehalte erfolgte mit Hilfe der für reines Methanol geltenden Gleichungen (Wellburn, 1994). Für die Berechnung der Stoffmengen und molaren Verhältnisse wurden die entsprechenden Molmassen verwendet (Schopfer, 1989). Für die Trockengewichtsbestimmung wurde vergleichbares Pflanzenmaterial separat abgenommen und im Trockenschrank bei ca. 80 °C 24 h getrocknet.
19 MATERIAL UND METHODEN
2.2.4 Exsudatgewinnung und chromatographische Aufarbeitung
Für die Exsudatgewinnung wurden Tabakpflanzen hydroponisch in Gegenwart des Antibiotikums Ticarcillin/Clavulanate (150 mg ml 1, Duchefa) kultiviert. Diese Behandlung sollte das Bakterienwachstum in der Nährlösung und an den Wurzeln reduzieren oder verhindern. Die Nährlösung (siehe Tabelle 2 1, 5 mM Nitrat) wurde jeden zweiten Tag gewechselt. Nach einer Woche Antibiotikabehandlung wurden die Pflanzen für 4 h auf
Gefäße mit H 2OReinst überführt. Das gewonnene Exsudat einer Pflanze wurde filtriert (Cellulose Acetatfilter, 0,45 m Porengröße) und die Polypeptide über eine kombinierte Anionen Kationenaustauschchromatographie angereichert. Dazu wurde eine FPLC Säule mit dem Material einer UNOsphere Q AC Säule (oben) und dem Säulenmaterial einer
UNOsphere S KC Säule (unten) (BioRAD) hergestellt. Die Säule wurde mit H 2OReinst äquilibriert und die gebundenen Polypeptide wurden anschließend mit 0,1 M NaOH bei einer Flussrate von 1 ml min 1 eluiert. Ausgewählte Fraktionen wurden dann mit 16 % Trichlor essigsäure (TCA) versetzt und 5 h bei 20 °C inkubiert. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation (10 4 g, 30 min) vom löslichen Überstand getrennt und das Pellet zweimal mit Ethanol gewaschen. Das über Nacht (RT) getrocknete Pellet wurde mit 0,1 M NaOH resuspendiert und über Gelelektrophorese (siehe Kap. 2.2.14b) fraktioniert.
2.2.5 Präparation der Membranvesikel
a) Präparation von mikrosomalen Membranfraktionen (mF)
Die Präparation der Blätter und Wurzeln wurde sowohl für Tabak als auch für Gerste nach Stöhr und Ullrich (1997) durchgeführt. Die Ernte erfolgte 2 h nach Beginn der Licht
phase. Je Probe wurden 80 100 g Material geerntet, dreimal in kaltem H 2ORein gewaschen und in der Kühlzelle mit 200 ml Aufbruchpuffer (siehe Tabelle 2 3) im Mixer zerkleinert. Das Homogenat wurde durch Nylongaze (Porengröße 200 m) gepresst und dieses Filtrat zur Abtrennung von PVPP und daran gebundenen Phenolen sowie größeren Zellpartikeln zentrifugiert (4 °C, 10 000 x g, 20 min). Die mF wurde durch Zentrifugation des erhaltenen Überstandes (20 000 x g, 4 °C, 80 min) gewonnen. Das mikrosomale Membranpellet wurde in Resuspensionspuffer (siehe Tabelle 2 4) aufgenommen und homogenisiert.
20 MATERIAL UND METHODEN
b) Präparation isolierter Plasmamembranvesikel
Die Isolierung der PM Vesikel aus der mF wurde in Anlehnung an die Methode von Larsson und Kollegen (1994) mit Hilfe des wässrigen Polymer Zweiphasensystems durch geführt. Die Zusammensetzung der Phasensysteme wurde nach Stöhr und Ullrich (1997) für Tabak und nach Körner et al. (1985) sowie Ward et al. (1988) für Gerste optimiert (siehe Tabelle 2 5). Je Probe wurden drei 24 g Phasensysteme vorbereitet und die Zentrifugations schritte (1620 x g, 4 °C, 15 min) fanden in einem Ausschwingrotor statt.
Tabelle 2-3: Zusammensetzung des Aufbruchpuffers (nach Stöhr und Ullrich, 1997). Der pH Wert wurde mit NaOH auf 7,5 eingestellt. Na Ascorbat, DTT, PVPP und PVP wurden frisch dazuge geben. Es wurden 1 mM EDTA (statt 10 mM) sowie kein PMSF und Leupeptin verwendet, um die Proteaseaktivität zu erhalten. Substanz Endkonzentration bzw. –gehalt HEPES (pH 7,5) 100 mM EDTA Dinatriumsalz Dihydrat 1 mM Saccharose 330 mM Casein (enzymatisches Hydrolysat) 1 g / l Glycerin 10 % (v/v) Cystein * HCl 10 mM Natriummolybdat 1 M Riboflavin 10 M Na Ascorbat 100 mM DTT 5 mM PVPP 1,5 % (w/v) PVP 5,5 % (w/v)
Tabelle 2-4: Zusammensetzung des Resuspensionspuffers (nach Stöhr und Ullrich, 1997). DTT wurde frisch dazugegeben. Substanz Endkonzentration Tris HCl (pH 7,8) 5 mM Saccharose 330 mM DTT 1 mM
Polyethylenglycol 4000 (PEG) und Dextran T500, die in den verwendeten Konzentrationen nicht mischbar sind, bilden nach Zentrifugation eine obere (PEG) sowie eine untere (Dextran) Phase aus. Aufgrund von Oberflächenbeschaffenheit, elektro chemischen, hydrophoben und biospezifischen Eigenschaften werden in der oberen Phase (PEG) zu 96 % selektiv die „right side out“ PM Vesikel angereichert und in der unteren Phase (Dextran) alle anderen Membranvesikel („inside out“ PM Vesikel und alle Endomembranen) (Larsson, 1985). Die entsprechenden Phasen wurden mit Resuspensions
21 MATERIAL UND METHODEN
puffer versetzt und zentrifugiert (100 000 x g, 4 °C, 1 h). Die so erhaltenen Pellets wurden jeweils in 600 l Resuspensionspuffer aufgenommen, aliquotiert und bis zur weiteren Verwendung bei 85 °C eingefroren.
Tabelle 2-5: Zusammensetzung der 24 g-Phasensysteme. A) Tabak (nach Stöhr und Ullrich, 1997) B) Gerste (verändert nach Körner et al., 1985 und Ward et al., 1988), KPP=Kaliumphosphatpuffer.
A Tabakwurzeln Tabakblätter Substanz Einwaage Endkonzentration Einwaage Endkonzentration 20 % Dextran T500 7,20 g 6,0 % (w/w) 7,32 G 6,1 % (w/w) 40 % PEG 4000 3,60 g 6,0 % (w/w) 3,66 G 6,1 % (w/w) 200 mM KPP (pH 7,8) 450 l 5 mM 450 l 5 mM
H2OReinst 4,72 g 4,54 G Saccharose 2,03 g 330 mM 2,03 G 330 mM
B Gerstewurzeln Gersteblätter Substanz Einwaage Endkonzentration Einwaage Endkonzentration 20 % Dextran T500 7,44 g 6,2 % /w/w) 7,80 G 6,5 % (w/w) 40 % PEG 4000 3,73 g 6,2 % (w/w) 3,90 G 6,5 % (w/w) 200 mM KPP (pH 7,8) 450 l 5 mM 450 l 5 mM 2 M KCl 24 l 2 mM 24 l 2 mM
H2OReinst 4,34 g 3,80 G Saccharose 2,03 g 330 mM 2,03 G 330 mM
Eine Korrelation der eingesetzten Wurzelfrischmasse mit der dazugehörigen spezifischen Proteaseaktivität an PM Vesikeln wies darauf hin, dass der Einsatz von mehr als 80 g Wurzelmaterial unter den gewählten experimentellen Bedingungen (Puffervolumen, Phasensysteme) einen negativen Effekt auf die spezifische Proteaseaktivität an den PM Vesikeln hatte (Daten werden nicht gezeigt). Es wurden daher in dieser Arbeit zwischen 60 und 80 g Wurzelmasse pro 200 ml Aufbruchpuffer eingesetzt, um die Reduktionskapazität des Puffers und die Trennleistung der 24 g Phasensysteme zu gewährleisten.
Die spezifischen Proteaseaktivitäten an den PM Vesikeln der Gerstewurzeln zeigten hohe Schwankungen (siehe Anhang Abbildung 7 1, F), die auf Artefaktreaktionen während der PM Präparation zurückgeführt werden konnten. Das Abschneiden der Wurzeln während der Ernte der Gerstepflanzen stellte einen Verletzungsstress dar und könnte zu oxidativen „cross linking“ (Bradley et al. , 1992; Konno et al. , 1999) oder zur Abgabe gasförmiger Substanzen, den sogenannten „biogenic volatile organic compounds“ (Laothawornkitkul et al., 2009) geführt haben, die wiederum die benachbarten Pflanzen beeinflusst haben könnten. Zudem könnten Wundreaktionen, die während der PM Präparation stattgefunden
22 MATERIAL UND METHODEN
haben, mit ein Grund für die unterschiedlichen Bandenmuster der zymographisch fraktionierten angereinigten Proteaseformen sein (siehe Kap. 3.2.3c). Aus diesem Grund wurden neben der beschriebenen Erntemethode zusätzliche Gersteanzuchten durchgeführt, die jedoch nicht für die Charakterisierung und Anreinigung der Proteaseformen verwendet wurden. Um Stressreaktionen der Pflanzen zu reduzieren oder ganz zu verhindern, wurden die Anzuchtsschalen vor der Ernte 15 min bei 4 °C akklimatisiert. Auf diese Weise sollten stattfindende Wundreaktionen verlangsamt werden. Es wurde eine im Mittel geringere spezifische Proteaseaktivität an PM Vesikeln durch die 4 °C Ernte (siehe Tabelle 2 6) ermittelt. Die Abnahme von 62,8 auf 55,5 g FTC Casein h 1 mg PM Protein 1 ist jedoch statistisch nicht abgesichert (p=0,466).
Tabelle 2-6: Einfluss der Erntebedingungen auf die spezifische Proteaseaktivität an PM-Vesikeln von Gerstewurzeln. Die Gerstepflanzen (5 mM Nitratanzucht) wurden sowohl im Gewächshaus bei RT (Standardmethode, n=92) als auch nach 15 minütiger Akklimatisierung bei 4 °C in der Kühlzelle (n=11) geerntet. Zusätzlich wurde das bei 4 °C geerntete Wurzelmaterial einer Anzuchtsschale sofort ohne weitere Wartezeit bearbeitet und zentrifugiert (10.000 x g, 4 °C) (n=3). Gepaarter t Test mit Irrtumswahrscheinlichkeit p≤0,05 % zeigte keine signifikanten Unterschiede. Erntebedingung Vorbehandlung Bearbeitungszeit zwischen Spezifische Proteaseaktivität Ernte und erstem [ g FTC Casein Zentrifugationsschritt h 1 mg PM Protein 1] RT (Gewächshaus) 1 h 50 min bis 2 h 20 min 62,8 ± 25,3 4 °C (Kühlzelle) 15 min 4 °C ca. 2 h 55,5 ± 15,4 4 °C (Kühlzelle) 15 min 4 °C ca. 30 min 47,4 ± 10,5
2.2.6 Proteinbestimmung
Die Proteinbestimmung, basierend auf der Bindung des organischen Farbstoffs Coomassie Brilliant Blue G 250 an Proteine, wurde nach Bradford (1976) durchgeführt. Dazu wurde das Reagenz Roti® Nanoquant (Roth) verwendet, das für die Messung frisch 1:5 mit
H2OReinst verdünnt wurde. Für die Proteinbestimmung der Membranfraktionen wurden 1 l der mF und der Dextranphase oder 2,5 l der PM Fraktion zunächst 15 min mit 0,1 % Octylglucosid in Reagenzgläsern bei RT vorinkubiert und anschließend nach Zugabe von 1 ml Reagenz 10 min bei RT unter Lichtabschluss inkubiert. Für die Berechnung wurde der Quotient aus der Extinktion von 590 nm und 450 nm bestimmt (Zor und Selinger, 1996). Die Standardkurve wurde mit BSA (Rinderserum Albumin) erstellt.
23 MATERIAL UND METHODEN
2.2.7 Proteaseaktivitätsbestimmung
Endo und Exopeptidasen unterscheiden sich durch die Position der von ihnen gespaltenen Peptidbindungen innerhalb einer Polypeptidkette. Mit Hilfe spezifischer Substrate können diese proteolytischen Aktivitäten voneinander unterschieden werden. Da es sich um bisher uncharakterisierte Proteasen handelte, wurde zunächst Casein, eines der gebräuchlichsten Proteasesubstrate, gewählt. Viele proteolytische Enzyme sind in der Lage dieses Proteingemisch zu spalten (Beynon und Bond, 2001). Eine Unterscheidung in Endo und Exopeptidasen ist mit diesem Substrat jedoch nicht möglich, denn die hydrolytische Spaltung des Caseins führt zur Bildung zweier neuer Substratmoleküle mit neuen Endtermini (Beynon und Bond, 2001).
a) mit Fluoresceinthiocarbamoyl-Casein
Die Fluoreszenz der kovalent ans Casein gebundenen Fluoresceinmoleküle wird aufgrund der räumlichen Nähe negativ beeinflusst. Durch die hydrolytische Spaltung von Casein sinkt das intramolekulare „self quenching“ und die damit verbundene ansteigende Fluoreszenz ist proportional zur Proteaseaktivität (Pierce, 2001, Produktdatenblatt). Als Grundlage für die Testdurchführung diente die Anleitung von Calbiochem (2004, Produkt datenblatt) und Twining (1984). Fluoresceinthiocarbamoyl Casein (FTC Casein) wurde in 1 H2OReinst gelöst (50 ng l ), aliquotiert und bei 20 °C gelagert.
Für den Testansatz wurden in ein Mikroreaktionsgefäß 1,25 g FTC Casein, sowie 25 l Inkubationspuffer (siehe Tabelle 2 7) und 10 g (Tabak) oder 5 g PM Protein (Gerste)
pipettiert. Das Endvolumen von 100 l wurde gegebenenfalls mit H 2OReinst eingestellt. Beim Leerwert wurde die Probe erst nach dem Abstoppen mit TCA hinzugegeben. Als Positiv
kontrolle wurden 50 g Trypsin (gelöst in H 2OReinst , Serva) verwendet. Nach 30 min Inkubation im Wasserbad bei 37 °C wurde die Reaktion durch Zugabe von 3,5 % TCA gestoppt. Nicht gespaltenes Substrat wurde durch eine weitere Inkubation auf Eis (30 min) gefällt und durch Zentrifugation (5 min, RT, 12 000 x g) von den löslichen Peptiden abge trennt. 200 l des Überstandes wurden abgenommen und in ein neues Mikroreaktionsgefäß gegeben. Da Fluorescein keine Fluoreszenz bei einem pH Wert kleiner 6,0 zeigt (Pierce, 2001, Produktdatenblatt), wurde die Probe durch Zugabe von 300 l Testpuffer auf einen pH von 8,5 umgepuffert. Bei einer Flussrate des Laufpuffers von 1,1 ml min 1 wurden jeweils 20 l der Probe automatisiert injiziert und die Fluoreszenz in einer Durchflussküvette gemessen. Für die Messung der Fluoreszenzintensität wurde mit einer Excitation von 490 nm und einer Emission von 525 nm gearbeitet. Die Auswertung der Fluoreszenz messung erfolgte mit der Software ChromQuest, mit deren Hilfe die Peakfläche ermittelt wurde. Die mit Trypsin gemessene Fluoreszenz wurde mit dem vollständigen Umsatz des
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Substrates (1,25 g) gleichgesetzt. Die beschriebene Testdurchführung bezieht sich auf die Messung der PM Vesikel (PEG Phase), mF und Dextranphase. Für angereinigte Proben wurde die Probenmenge auf 50 l erhöht und die Inkubationszeit wurde entweder auf 1 2 h (solubilisierte Probe) oder auf 15 h (FPLC Fraktionen oder Gelstücke) verlängert.
Zusätzlich wurde die Fluoreszenz mittels Plattenreader (DTX 880, Beckman Coulter) gemessen. Dazu wurden 100 l Probe in eine schwarze 96Well Platte (Fischer Scientific) gegeben und im Modus „Fluorescence Intensity Top“ bei 1000 mS gemessen. Als Excitation wurden 485 nm und als Emission 535 nm verwendet.
Tabelle 2-7: Zusammensetzung der Puffer für den Proteaseaktivitätstest mit FTC-Casein. Der Laufpuffer wurde mit H2ORein angesetzt. Puffer Substanz Endkonzentration
Inkubationspuffer Tris HCl (pH 7,8) 200 mM CaCl 2 8 mM
Testpuffer Tris HCl (pH 8,8) 500 mM
Laufpuffer Tris HCl (pH 8,5) 50 mM
Damit die Proteaseaktivität unter optimalen Bedingungen gemessen werden konnte, wurde für die PM Vesikel von Tabak und Gerstewurzeln das pH Aktivitätsoptimum bestimmt. Dazu wurde im sauren Bereich statt einem 200 mM Tris HCl Puffers ein 200 mM MES Puffer verwendet, der mit Hilfe des Trispuffers auf den entsprechenden pH eingestellt wurde. Die Ansätze enthielten kein CaCl 2. Für PM Vesikel von Tabakwurzeln wurde ein breites pH Optimum im Bereich von 6,0 bis 7,8 (siehe Abbildung 2 1) ermittelt. Die PM Vesikel von Gerstewurzeln zeigten dazu im Vergleich ein leicht in den alkalischen Bereich verschobenes pH Optimum von 7,8. Um die Aktivitäten beider Pflanzenarten miteinander vergleichen zu können, wurden Proteaseaktivitäten mit FTC Casein bei pH 7,8 gemessen.
Abbildung 2-1: pH-Abhängigkeit der Proteaseaktivität an PM-Vesikeln von Tabak- und PM Gerstewurzeln mit FTC-Casein als Substrat. Die Proteaseaktivität wurde mit Nt Prot 10mM (●, n=3) PM und Hv Prot 5mM (□, n=3) ohne CaCl 2 Zugabe gemessen.
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b) mit Exopeptidasesubstraten
Die Proteaseaktivitätsbestimmung mit den verschiedenen Exopeptidasesubstraten wurde unter der Leitung von Dr. C. Wolke in der Arbeitsgruppe von Prof. U. Lendeckel (Institut für Medizinische Biochemie und Molekularbiologie, Universität Greifswald) durchgeführt. Die verwendeten synthetischen Substrate (siehe Tabelle 2 8) bestehen aus einer einzelnen Aminosäure (Ala, Leu oder Arg) oder dem Dipeptid Glycin Prolin, die über ihr α COOH mit einem chromogenen Amin (4 Nitroanilin) verknüpft sind. Dadurch wird der C Terminus des Substrates blockiert und die Hydrolyse der vorhandenen Peptidbindung kann ausschließlich durch Aminopeptidasen katalysiert werden (Beynon und Bond, 2001). Das Substrat MCA AlaProLys Dnp wurde in dieser Arbeit für den Nachweis von Carboxypeptidasen verwendet. Der N Terminus ist durch den Substituenten (7 Methoxycoumarin 4 yl)acetyl (MCA) blockiert und die Fluoreszenz von MCA wird durch die an den C Terminus gebundene 2,4 Dinitrophenyl Gruppe (Dnp) gequenched (Enzo, 2010, Produktinformationsblatt). Im humanmedizinischen Bereich wird dieses Substrat für den Nachweis der ACE2 verwendet. Diese tierische Carboxypeptidase katalysiert die Spaltung zwischen Alanin und Prolin, wodurch ein Dipeptid vom C Terminus abgespalten wird (Vickers et al., 2002).
Tabelle 2-8: Spezifikationen der verwendeten Exopeptidasesubstrate. pNA = p Nitroanilid, MCA = (7 Methoxycoumarin 4 yl)acetyl, Dnp = 2,4 Dinitrophenyl. Substrat gespalten von Endkonzentration im Test Hersteller Ala pNA* Aminopeptidase 2,5 mM Bachem Leu pNA* Aminopeptidase 5,0 mM Sigma Gly Pro pNA Aminopeptidase, Dipeptidase 3,3 mM Bachem Arg pNA Aminopeptidase 2,5 mM Bachem MCA AlaProLys Dnp Carboxypeptidase 50 M Enzo * Je nach Fragestellung wurde die Aktivität zusätzlich in Gegenwart des Inhibitors RB3014 (1 M Endkonzentration) gemessen.
Der Proteaseinhibitor RB3014 (Substanzbezeichnung siehe Chemikalienliste nach Chen et al., 1999 (entspricht Substanz 7B) oder nach Patent WO 2009/024348 A1) wurde von Dr. B. R. Roques (Universität Paris, Frankreich) bezogen. Die Substanz ist ein sehr wirksamer und selektiver Inhibitor der tierischen Aminopeptidase N (EC 3.4.11.2), einer membrangebundenen Metallo Aminopeptidase (Fournie Zaluski et al., 1992). Für die Exo peptidaseaktivitätsmessung mit Ala pNA oder Leu pNA in Gegenwart des Inhibitors RB3014 wurde die Probe 15 min mit RB3014 (1 M Endkonzentration) bei 37 °C vorinkubiert. Der Testansatz betrug 100 l Gesamtvolumen und wurde direkt in 96Well Platten angesetzt.
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40 l Testpuffer (siehe Tabelle 2 9), 10 g Probe und Substrat wurden pipettiert und im Brutschrank bei 37 °C 30 min oder bis zu 2 h inkubiert. Sowohl zum Zeitpunkt 0 als auch am Ende der Inkubation wurde die Extinktion für freigesetztes p Nitroanilin (pNA) bei 390 nm und einer Referenzwellenlänge von 620 nm bestimmt. Die Fluoreszenz von MCA wurde mit einer Excitation von 320 nm und einer Emission von 405 nm (Modus: TopReader) gemessen. Dabei wurde eine Verstärkung von 30 oder 50 für die Messung der relativen Fluoreszenz (RFU) gewählt, um einen Wert von über 1000 zu erreichen. So sollte die Messgenauigkeit verbessert werden. Die Proteaseaktivität wurde in RFU min 1 mg Protein 1 angegeben. Eine Eichung wurde nicht durchgeführt.
Tabelle 2-9: Zusammensetzung des Testpuffer für die Messung der Exopeptidaseaktivitäten. Substanz Endkonzentration
HEPES NaOH (pH 6,8) 50 mM NaCl 200 mM ZnCl 2 10 M Dimethylsulfoxid 1 % (v/v)
2.2.8 Endogene Proteolyse an PM-Vesikeln
PM Vesikel (500 g) wurden zunächst auf Eis unter hypotonischen Bedingungen (20 mM Tris HCl (pH 7,8), 1 mM DTT) 5 min inkubiert und nach Zugabe von 150 mM NaCl weitere 5 min inkubiert. Dabei sollten peripher assoziierte sowie in den Vesikeln eingeschlossene lösliche Proteine abgetrennt werden. Nach Ultrazentrifugation (10 5 x g, 4 °C, 1 h) wurden die pelletierten PM Vesikel resuspendiert und der Waschvorgang wieder holt. Das Pellet wurde schließlich mit Resuspensionspuffer aufgenommen (siehe Tabelle 2 4) und die Probe enthielt sowohl „right side out“ als auch „inside out“ PM Vesikel.
Tabelle 2-10: Zusammensetzung des Proteaseinhibitorcocktails für pflanzliches Gewebe (Sigma, 2001). Die jeweiligen Endkonzentrationen der einzelnen Inhibitoren sind nicht bekannt. Hemmstoff Inhibition von
AEBSF Serinproteasen 1,10 Phenanthrolin Metalloproteasen Pepstatin A Aspartatproteasen Leupeptin Serin und Cysteinproteasen Bestatin Aminopeptidasen E 64 Cysteinproteasen
Die so vorbehandelten PM Vesikel (40 l) wurden zusammen mit 20 l
Resuspensionspuffer und 4 mM CaCl 2 2 h im Wasserbad bei 37 °C inkubiert. Als Kontrolle wurde ein Ansatz mitgeführt, bei dem die Proteaseaktivität durch die Zugabe von 20 l eines
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pflanzenspezifischen Proteaseinhibitorcocktails (Sigma, siehe Tabelle 2 10) gehemmt wurde. Die durch endogene Proteolyse abgespaltenen Polypeptide wurden anschließend durch Zentrifugation (50.000 x g, 1 h, 4 °C) von den PM Vesikeln abgetrennt und gelelektrophoretisch fraktioniert. Das PM Pellet wurde wieder in Resuspensionspuffer aufgenommen und bis zur weiteren Verwendung bei 85 °C eingefroren.
Für die gezielte Untersuchung der von der apoplastisch orientierten Seite der PM abgetrennten Proteine wurden die mit NaCl gewaschenen PM Vesikel zunächst über 6 g Phasensysteme (siehe Tabelle 2 5; Angaben verhältnismäßig für 6 g Systeme berech net) in „right side out“ und „inside out“ orientierte PM Vesikel getrennt. Nach Zentrifugation (1620 x g; 4 °C; 15 min) wurde die obere Phase in ein Zentrifugenröhrchen und eine frische obere Phase auf die untere Phase gegeben. Nach 40 s Schütteln und Zentrifugation (1620 x g; 4 °C; 15 min) wurden die oberen Phasen vereinigt und zentrifugiert (10 5 x g, 4 °C, 1 h). Das PM Pellet wurde in 200 l Resuspensionspuffer (siehe Tabelle 2 4) aufgenommen. 90 l der „right side out“ PM Vesikel wurden zusammen mit 20 l Resuspensionspuffer ohne
CaCl 2 2 h im Wasserbad bei 37 °C inkubiert. Als Kontrolle wurde ein Ansatz mitgeführt, bei dem die Proteaseaktivität durch die Zugabe des pflanzenspezifischen Proteaseinhibitor cocktails (20 l, siehe Tabelle 2 10) gehemmt wurde. Nach Zentrifugation (10 5 x g, 4 °C, 1 h) wurde der Überstand in ein 15 ml Falkon überführt und bis zur weiteren Bearbeitung bei 85 °C eingefroren.
2.2.9 Proteinfällung
a) Fällung löslicher Proteine mit Trichloressigsäure
Proben, die die durch Proteolyse von den PM Vesikeln abgetrennten Proteine enthielten (siehe Kap. 2.2.8), wurden zunächst in der Speedvac (ungekühlt, 3 h) auf ein Volumen von ca. 800 l reduziert. Anschließend wurden die Polypeptide in Gegenwart von 10 % TCA über Nacht bei 4 °C gefällt. Nach einer Zentrifugation (15.000 x g, 4 °C, 1 h) wurde das Pellet fünfmal mit unvergälltem Ethanol gewaschen. Dazu wurde die Probe mit Ethanol 10 min auf Eis inkubiert und zentrifugiert (15.000 x g, 4 °C, 2 min). Anschließend wurde das Pellet in der Speedvac (ungekühlt, 25 min) getrocknet und bis zur massen spektrometrischen Analyse bei 85 °C eingefroren.
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b) Chloroform/Methanol-Fällung solubilisierter PM-Proteine
Ausgewählte Fraktionen der IMAC (siehe Kap. 2.2.12e) wurden in einem 15 ml
Falkon vereinigt und das Volumen mit H 2OReinst auf 2,5 ml aufgefüllt. Die Proben stammten aus der Proteinaufreinigung in Gegenwart von 30 mM Octylglucosid als Detergenz. Die Chloroform/Methanol Fällung wurde in Anlehnung an die Methode von Wessel und Flügge
(1984) durchgeführt. Dazu wurde die Probe mit Methanol, Chloroform und H 2OReinst im Verhältnis 1:1,8:1:1,4 nacheinander versetzt, gemischt und 5 min auf Eis inkubiert. Nach einer Zentrifugation (9.000 x g, 4 °C, 5 min) wurde die obere Phase abgenommen und verworfen. Auf die untere Phase wurden erneut 3,5 ml Methanol gegeben, die Probe gemischt und weitere 5 min auf Eis inkubiert. Nach einer weiteren Zentrifugation (9.000 x g, 4 °C, 15 min) wurde der Überstand vollständig abgenommen und verworfen. Das Pellet wurde bei 60 °C im Heizblock 30 min getrocknet und bis zur massenspektrometrischen Analyse bei 85 °C eingefroren.
2.2.10 Solubilisierung PM-gebundener Proteine
Um membrangebundene Proteine in Lösung zu bekommen, ist aufgrund ihrer hydrophoben Eigenschaften die Verwendung von Detergenzien notwendig. Die amphiphilen Detergenzmoleküle können die Lipide, die die hydrophoben Bereiche der Proteine abschirmen, verdrängen oder ersetzen und die Proteine solubilisieren (Pryde, 1986). Nicht ionische Detergenzien, wie Triton X 100 und Triton X 114, Octylglucosid oder Lubrol, erhalten die biologische Aktivität des solubilisierten Proteins (Janson und Rydén, 1998).
Triton X 114 wurde zunächst nach Bordier (1981) durch dreimaliges Waschen präkondensiert, um Peroxidasen und andere hydrophile Moleküle aus der Lösung zu entfernen. Für die Solubilisierung wurden in ein Mikroreaktionsgefäß PM Probe (entsprechend 500 1000 g Protein), 2 % Triton X 114 (präkondensiert) und Puffer (20 mM Tris HCl, pH 7,8) pipettiert. Nach 30 min Inkubation im Eisbad wurde 1 h bei 10 5 x g und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Mikroreaktionsgefäß überführt und als Triton X 114 Phase bezeichnet. Diese Probe enthielt neben löslichen und peripher assoziierten Proteinen die mit Triton X 114 solubilisierten PM Proteine. Das Pellet, bestehend aus detergenz resistenten PM Bestandteilen, wurde in Puffer resuspendiert und in einem Glashomogenisator mit 75 mM Octylglucosid 1 h bei 30 °C im Heizblock inkubiert. Bei Tabak wurden zusätzlich noch 50 mM NaCl hinzugefügt.
Die solubilisierten Proteine wurden durch eine Zentrifugation (10 5 x g, 4 °C, 1 h) vom nicht solubilisierten Material getrennt und in ein neues Mikroreaktionsgefäß überführt
29 MATERIAL UND METHODEN
(entspricht den mit Octylglucosid(/NaCl) solubilisierten Proteinen #1). Die Behandlung mit Octylglucosid (und NaCl) wurde mit dem mit Puffer resuspendierten Pellet wiederholt. Nach der Zentrifugation (10 5 x g, 4 °C, 1 h) wurde der Überstand (entspricht den mit Octylglucosid(/NaCl) solubilisierten Proteinen #2) in ein neues Mikroreaktionsgefäß abge nommen und das Pellet (entspricht den nicht solubilisierten Proteinen) in Puffer resuspendiert. Von den solubilisierten Überständen wurden 200 l für den Proteasetest abgenommen und alle Proben wurden bis zur weiteren Verwendung bei 85 °C aufbewahrt.
2.2.11 Probenwaschung und Volumeneinengung mittels Membranfiltration
Zwischen den einzelnen Aufreinigungsschritten war es nötig, das Probenvolumen zu reduzieren und Substanzen wie NaCl aus den Proben zu entfernen. Dazu wurden Microcon® Filtrationseinheiten (Millipore) verwendet, deren Ausschlussgrenze (MWCO) bei 10 kDa lag. Der Filtrationsvorgang wurde nach Anleitung des Herstellers durch eine Zentrifugation (13.000 x g, 4 °C) durchgeführt. Nach Einengung des Volumens wurde die Probe mit 20 mM Tris HCl (pH 7,8) gewaschen und anschließend der Filterrückstand durch Zentrifugation (3.000 x g, 4 °C) in ein Mikroreaktionsgefäß eluiert.
2.2.12 Chromatographische Reinigung der Protease
Die FPLC („Fast Performance Liquid Chromatography“) wurde, wenn nicht anders angegeben, bei 15 °C durchgeführt. Zur Entsalzung der Fraktionen wurde die Variperm M (KRONLAB) verwendet. Dazu wurde der Außenmantel der Variperm mit dem Laufpuffer der Anionenaustauschchromatographie (siehe Tabelle 2 11) bei einer Flussrate von 5 ml min 1 gespült. Die entsprechenden Puffer wurden vor Verwendung filtriert (Cellulose Acetatfilter mit 0,45 m Porengröße) und entgast.
a) Größenausschlusschromatographie
Die Größenausschlusschromatographie trennt lösliche Proteine nach ihrer Größe und basiert auf der unterschiedlichen Permeation der Analyten in ein poröses Trägermaterial mit kontrollierter Porengröße. Die Proteine binden dabei nicht an das Säulenmaterial. Je nach gewähltem Trägermaterial können Moleküle ab einer bestimmten Größe nicht in die Poren des Trenngels eindringen und eluieren zusammen mit der Lösungsmittelfront im
30 MATERIAL UND METHODEN
Ausschlussvolumen. Die mobile Phase dient nur als Lösungsmittel und hat keinen unmittelbaren Einfluss auf die Trennung (Lottspeich und Engels, 2009).
Als Säulenmaterial wurde Superdex®200 verwendet (Trennleistung globulärer Proteine: 10.000 – 600.000 Da). Der Lauf wurde bei RT mit einer Flussrate von 1 ml min 1 durchgeführt und das Proteinelutionsprofil wurde mit einem analogen Schreiber (Empfind lichkeit 5 mV, Papiervorschub 1 mm min 1) aufgezeichnet. Der Laufpuffer enthielt 50 mM Tris HCl (pH 7,8) und 150 mM NaCl. Die Kalibrierung erfolgte anhand eines Standards (Pharmacia), gelöst in 50 mM Na Phosphatpuffer pH 8,0.
b) Anionenaustauschchromatographie
Mit der Anionenaustauschchromatographie (AC) werden Proteine aufgrund ihrer Nettooberflächenladung aufgetrennt, die durch den pH Wert des Mediums bestimmt wird. Liegt der pH Wert des verwendeten Laufpuffers über dem isoelektrischen Punkt (pI), so ist die Nettooberflächenladung des Proteins negativ. Die negativ geladenen Gruppen des + Proteins interagieren mit den positiv geladenen immobilisierten Gruppen ( N (CH 3)3) an der AC Säule und das Protein wird gebunden. Die Eluierung der gebundenen Proteine erfolgt durch einen zunehmenden Salzgradienten, wodurch die negativ geladenen Gruppen der Proteine durch die Chloridionen von der Säule verdrängt werden. Liegt der pH Wert des Laufpuffers unter dem pI, so ist die Nettooberflächenladung des Proteins positiv und es bindet nicht an die AC Säule (Coligan et al. , 2003).
Triton X 114 unlösliche und mit Octylglucosid (oder Octylglucosid/NaCl) solubilisierte PM Proteine sowohl von Tabak als auch von Gerstewurzeln wurden auf eine mit Laufpuffer (siehe Tabelle 2 11) äquilibrierte Econo Pac High Q Säule geladen. Die Flussrate betrug 0,5 ml min 1 und die gebundenen Proteine wurden mit einem Elutionspuffer über einen steigenden Stufengradienten eluiert. Die Proteaseaktivität der Fraktionen wurde mit FTC Casein bestimmt (15 h, 37 °C).
Tabelle 2-11: Zusammensetzung der Puffer für die Anionenaustauschchromatographie. Puffer Substanz Endkonzentration
Laufpuffer Tris HCl (pH 7,8) 50 mM Lubrol 17A17 0,02 % (w/v)
Elutionspuffer Tris HCl (pH 7,8) 50 mM Lubrol 17A17 0,02 % (w/v) NaCl 2 M
31 MATERIAL UND METHODEN
c) Kationenaustauschchromatographie
Die Kationenaustauschchromatographie (KC) basiert genau wie die AC auf der Trennung von Proteinen anhand ihrer Oberflächenladung. Im Unterschied zur AC binden Proteine mit einer positiven Nettooberflächenladung an das KC Säulenmaterial (Gruppe:
CH 2CH 2CH 2SO 3). Die Eluierung der gebundenen Proteine erfolgt ebenfalls durch einen zunehmenden Salzgradienten, wobei die positiv geladenen Gruppen der Proteine durch Natriumionen von der Säule verdrängt werden (GE, 2009, Produktinformation). Ausgewählte Fraktionen der AC wurden zunächst über Membranfiltration eingeengt, auf einen pH von 6,0 umgepuffert und auf eine mit Laufpuffer (siehe Tabelle 2 12) äquilibrierte KC Säule (HiTrap TM SP HP) geladen. Die Flussrate betrug 0,5 ml min 1 und die gebundenen Proteine wurden mit einem Elutionspuffer über einen linearen Gradienten eluiert. Die Proteaseaktivität der Fraktionen wurde mit FTC Casein (15 h, 37 °C) bestimmt.
Tabelle 2-12: Zusammensetzung der Puffer für die Kationenaustauschchromatographie. Puffer Substanz Endkonzentration
Laufpuffer MES NaOH (pH 6,0) 50 mM Lubrol 17A17 0,02 % (w/v)
Elutionspuffer MES NaOH (pH 6,0) 50 mM Lubrol 17A17 0,02 % (w/v) NaCl 1 M
d) Hydrophobe Interaktionschromatographie
Die Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) trennt Proteine aufgrund der unterschiedlichen Stärke der hydrophoben Interaktion zwischen Protein und den hydrophoben immobilisierten Gruppen (t Butyl) der Säulenmatrix. Alle Proteine sind in einem bestimmten Maß hydrophob, denn einige der Aminosäuren besitzen unpolare Reste (Alanin, Phenylalanin, Valin, Tryptophan, Leucin, Isoleucin und Methionin). In Gegenwart von Salzen wird die Proteinhydrathülle verkleinert, die Anzahl hydrophober, dem Außenmedium zugewandter Gruppen steigt und die Proteine binden an die Säulenmatrix. Durch einen abnehmenden Salzgradienten und einer damit einhergehenden Anzahl freier Wassermoleküle werden die gebundenen Proteine eluiert (Coligan et al. , 2003).
Das Volumen der ausgewählten AC Fraktionen von Tabakproben wurde mittels Speedvac eingeengt oder durch Membranfiltration (MWCO 10 kDa) reduziert. Die Probe wurde langsam mit einer Ammoniumsulfatstammlösung auf eine Endkonzentration von 1,5 M eingestellt, 10 min bei 15 °C inkubiert und zentrifugiert (16 000 x g, 15 °C, 10 min). Der Überstand wurde auf eine mit HIC Laufpuffer (siehe Tabelle 2 13) gespülte
32 MATERIAL UND METHODEN
Econo Pac t Butyl Säule (BioRad) geladen. Die Flussrate betrug 0,5 ml min 1. Die gebundenen Proteine wurden mit dem Laufpuffer der AC (siehe Tabelle 2 11) über einen linear abnehmenden Gradienten eluiert. Anschließend wurden immer noch gebundene Proteine mit einer 0,02 % Lubrollösung eluiert. Die Proteaseaktivität der Fraktionen wurde mit FTC Casein bestimmt (15 h, 37 °C).
Tabelle 2-13: Laufpufferzusammensetzung der Hydrophoben Interaktionschromatographie. Substanz Endkonzentration
Tris HCl (pH 7,8) 50 mM Lubrol 17A17 0,02 % (w/v) Ammoniumsulfat 1,5 M
e) Metallchelat-Affinitätschromatographie
Die Metallchelat Affinitätschromatographie (IMAC) nutzt die Komplexbildung von Proteinen mit bivalenten Metallionen aus. Dazu wird eine metallchelatierende Gruppe am Säulenmaterial immobilisiert und ein multivalentes Übergangsmetall Ion wird daran gebunden (Lottspeich und Engels, 2009). Das gebundene Metallion steht für die Inter aktionen mit basischen Gruppen von Proteinen zur Verfügung, wobei besonders Proteine mit den exponierten Aminosäuren Histidin, Cystein, Tryptophan (Amersham, 2001, Produkt information) oder Methionin als Liganden fungieren und mit den freien Elektronenpaaren an N und S Atomen koordinative Bindungen ausbilden. Die verwendete HiTrapTM Chelating HP Säule (1 ml, Amersham) enthielt Sepharose gekoppelt mit Iminoessigsäure zur Bindung der Metallionen.
Für die Fraktionierung der PM gebundenen Proteasen wurde Cu 2+ als Metallion ausgewählt, das in Form einer 0,1 M CuSO 4 Lösung injiziert wurde. Um das nicht gebundene Cu 2+ zu entfernen wurde die Säule mit Laufpuffer und Elutionspuffer 1 gespült (siehe Tabelle 2 14) und anschließend mit Laufpuffer äquilibriert. Die IMAC wurde bei 10 °C durchgeführt und als Probe wurden ausgewählte Fraktionen der AC verwendet. Das Probenvolumen wurde dazu über Membranfiltration (MWCO 10 kDa) eingeengt und anschließend auf 0,5 M NaCl eingestellt. Die durch das Salz ausgefallenen Proteine wurden nach einer Inkubation (10 °C, 10 min) durch Zentrifugation (16.000 x g, 10 °C, 5 min) entfernt und der Überstand wurde injiziert. Die Flussrate betrug 0,5 ml min 1 und die gebundenen Proteine wurden zunächst mit dem Elutionspuffer 1 über einen linearen Gradienten eluiert. Anschließend wurden immer noch gebundene Proteine sowie die Kupferionen mit dem Elutionspuffer 2 eluiert. Die Proteaseaktivität der Fraktionen wurde mit FTC Casein bestimmt (15 h, 37 °C).
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Tabelle 2-14: Zusammensetzung der Puffer für die Metallchelat-Affinitätschromatographie. Puffer Substanz Endkonzentration
Laufpuffer HEPES NaOH (pH 7,8) 50 mM Lubrol 17A17 0,02 % (w/v) NaCl 500 mM
Elutionspuffer 1 HEPES NaOH (pH 7,8) 50 mM Lubrol 17A17 0,02 % (w/v) NaCl 500 mM Imidazol 500 mM
Elutionspuffer 2 HEPES NaOH (pH 7,8) 50 mM Lubrol 17A17 0,02 % (w/v) EDTA 50 mM
2.2.13 Behandlung mit Peptid-N-Glykosidase F (PNGase F)
Das Enzym PNGase F von Elizabethkingia meningosepticum (Sigma, EC 3.5.1.52) spaltet spezifisch über Asparagin verknüpfte Oligosaccharide von Glykoproteinen ab (siehe Abbildung 2 2). Die PNGase F wurde nach Tarentino und Plummer (1994) in 5 mM KPP (pH 7,5) angesetzt und zusammen mit der Probe 15 h im Wasserbad bei 37 °C inkubiert. Als Kontrolle wurde die Probe mit dem KPP inkubiert. Die Reaktion wurde nicht durch Kochen abgestoppt, sondern die behandelten Proben wurden bis zur weiteren Bearbeitung auf Eis aufbewahrt.
Abbildung 2-2: Spaltungsort der PNGase F innerhalb eines Glykoproteins (Sigma, 2010, Produktinformationsblatt).
34 MATERIAL UND METHODEN
2.2.14 Gelelektrophorese
Elektrophorese ist die Wanderung geladener Teilchen in einem elektrischen Feld, wobei unterschiedliche Teilchenladungen und größen eine unterschiedliche elektro phoretische Beweglichkeit bewirken (Lottspeich und Engels, 2009). In dieser Arbeit wurden ausschließlich Polyacrylamidgele verwendet, deren Verhältnis von Acrylamid und N,N’Methylenbisacrylamid 37,5:1 betrug (Rotiphorese® Gel 30, Roth). Je nach Fragestellung wurden verschiedene Acrylamidkonzentrationen gewählt, wodurch die Porengröße und folglich die Trennleistung der Gele verändert wurde. Für alle Gelelektrophoresen wurde das diskontinuierliche Puffersystem nach Laemmli (1970) verwendet. Die Proben wurde immer 1:1 mit dem Probenauftragspuffer versetzt und 1 h bei RT inkubiert. Die Proteintrennung fand in einer vertikalen Anlage bei 10 °C statt. Zunächst wurde 1 h eine Spannung von 50 V angelegt und dann auf 100 V erhöht.
a) Native PAGE
Bei der nicht reduzierenden oder nativen Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) bleiben die physiologischen Eigenschaften der Proteine erhalten. Ohne Detergenzien und reduzierende Bedingungen hängt die Wanderungsgeschwindigkeit eines Proteins nicht nur von seiner Größe sondern auch von seiner Konformation und spezifischen Ladung ab. Bei dem verwendeten diskontinuierlichen Puffersystem werden ausschließlich negativ geladene Proteine bei neutralem pH aufgetrennt (Coligan et al., 2003).
Es wurden 10 %ige homogene Polyacrylamidgele mit 5 %igem Sammelgel verwendet. Die Gellösungen entsprachen dem Laemmli System und enthielten weder Natriumdodecylsulfat (SDS) noch andere Detergenzien (siehe Tabelle 2 15). Nach der Gelelektrophorese wurden die Gele gefärbt (siehe Kap. 2.2.15) bzw. ein Teil der Gele wurde mit dem Gelschneidemesser in 20 x 2,5 x 1 mm große Streifen geschnitten und für die Bestimmung der Proteaseaktivität verwendet.
b) SDS-PAGE
Im Vergleich zur nativen PAGE ermöglicht eine Vorbehandlung mit SDS eine Auftrennung der Proteine einzig nach ihrer Masse (Shapiro et al., 1967). SDS löst fast alle nicht kovalenten Wechselwirkungen im Protein auf. Zusätzlich werden mit DTT inter und intramolekulare Disulfidgruppen gespalten. Durch Anlagerung von SDS wird die ursprüng liche Ladung des Proteins vernachlässigbar (Lottspeich und Zorbas, 1998; Laemmli, 1970).
35 MATERIAL UND METHODEN
Tabelle 2-15: Zusammensetzung der Puffer zur Herstellung der SDS-Polyacrylamidgele. (Modifiziert nach Laemmli, 1970) Puffer Substanz Endkonzentration
Trenngelpuffer „Light“ Tris HCl, pH 8,8 1,5 M SDS 0,4 % (w/v)
Trenngelpuffer „Heavy“ Tris HCl, pH 8,8 1,5 M SDS 0,4 % (w/v) Glycerin 26,0 % (w/v)
Sammelgelpuffer Tris HCl, pH 6,8 0,5 M SDS 0,4 % (w/v)
Probenauftragspuffer Tris HCl, pH 6,8 0,5 M SDS 4,0 % (w/v) Glycerin 20,0 % (w/v) Bromphenolblau 0,1 % (w/v) DTT 1,7 % (w/v)
Laufpuffer Tris, pH 8,3 8,5 25,0 mM SDS 0,1 % (w/v) Glycin 190,0 mM
Es wurden sowohl 10 %ige homogene Polyacrylamidgele als auch Gradientengele mit 5 20 % oder 8 – 20 %iger Acrylamidkonzentration verwendet. Die Sammelgele wurden immer als homogene 5 %ige Polyacrylamidgele gegossen (siehe Tabelle 2 15). Nach der Elektrophorese wurden die Gele gefärbt (siehe Kap. 2.2.15) oder ein Teil der Gele wurde renaturiert (2,5 % Triton X 100 oder 30 mM Octylglucosid), mit dem Gelschneidemesser in 20x2,5x1mm große Streifen geschnitten und für die Bestimmung der Proteaseaktivität oder für die massenspektrometrische Analyse verwendet.
c) Zymogramm
Das Zymogramm ist eine gelelektrophoretische Methode, die die direkte Messung enzymatischer Aktivitäten im Gel ermöglicht. Dazu wird das Substrat bereits beim Gießen der Gele dazugegeben. In dieser Arbeit wurden das diskontinuierliche Puffersystem nach Laemmli (1970) und als Proteasesubstrat Gelatine (RUF) verwendet (modifiziert nach Troeberg und Nagase, 2003). Dazu wurden die Gellösungen der SDS PAGE (siehe Tabelle 2 15) verwendet und sowohl das 5 %ige Sammelgel als auch das 10 %ige Trenngel
mit 0,1 % Gelatine versetzt. Die Gelatine wurde vorher 10 min bei RT in H 2OReinst vorgequollen und 20 min bei 100 °C erhitzt.
Die Gelelektrophorese fand unter denaturierenden Bedingungen statt, deshalb wurde anschließend das Detergenz SDS gegen Triton X 100 ausgetauscht (siehe Tabelle 2 16). Die im Gel aufgetrennten und mit Triton X 100 renaturierten Proteine konnten dann das im Gel befindliche Substrat (Gelatine) spalten. Um optimale Bedingungen für die Proteolyse zu
36 MATERIAL UND METHODEN
gewährleisten, wurden die Gele mit einem Entwickler überschichtet (siehe Tabelle 2 16) und im Wasserbad bei 37 °C über Nacht (20 h) inkubiert. Anschließend wurden die Gele 1 h mit Färbelösung inkubiert (siehe Tabelle 2 16). Die im Gel fixierte Gelatine wurde dadurch blau angefärbt und nur dort, wo Proteasen im Gel das Substrat abgebaut hatten, erschienen weiße Banden. Je nach Proteaseaktivität und Hintergrundfärbung wurde der Entfärber solange gewechselt bis alles gut sichtbar war. Die Zymogramme wurden nach dem Dokumentieren invertiert und in Grautöne umgewandelt, um einen besseren Kontrast zwischen Hintergrund und Proteasebanden (schwarz) zu schaffen.
Tabelle 2-16: Zusammensetzung der verwendeten Lösungen für die Zymographie. Lösung Substanz Endkonzentration
Renaturierer Triton X 100 2,5 % (v/v)
Entwickler Tris HCl, pH 7,8 50 mM
Zusätze: CaCl 2 5 mM EDTA 10 mM
Färbelösung Coomassie Brilliant Blue R 250 0,1 % (w/v) Methanol 50 % (v/v) Essigsäure 7 % (v/v)
Entfärber Methanol 25 % (v/v) Essigsäure 7 % (v/v)
2.2.15 Silberfärbung
Die Silberfärbung basiert auf einer Komplexbildung zwischen dem Silberion und Aminosäureresten wie Glutamin, Asparagin und Cystein. Die von den Proteinen gebundenen Silberionen werden dann durch alkalisches Formaldehyd zu elementarem Silber reduziert. Daher färben sich die Proteinbanden schwarz (Lottspeich und Engels, 2009). In dieser Arbeit wurde die Färbemethode nach Rabilloud et al. (1988) verwendet. Nur der Entwickler (3 %
(w/v) Na 2CO 3; 0,025 % (v/v) Formaldehyd; 0,001 % (w/v) NaS 2O3) und die Stopplösung (5% (w/v) Tris; 2,5 % (v/v) Essigsäure) wurden verändert.
37 MATERIAL UND METHODEN
2.2.16 Massenspektrometrie
In der Massenspektrometrie wird im Hochvakuum die Molekülmasse und Ladung freier Ionen bestimmt. Dazu wurden in dieser Arbeit die zu analysierenden Proteine enzymatisch in Peptide gespalten und zunächst über eine „reversed phase“ FPLC chromatographisch getrennt und konzentriert. Durch die Kopplung mit einem Quadrupol massenspektrometer (Q TOF) wurden die Peptide über das Elektrosprayverfahren ionisiert und so in die Gasphase überführt (Lottspeich und Engels, 2009).
a) Bearbeitung und Messung solubilisierter PM-Proteine
Die Messung solubilisierter PM Proteine und andere Vortests fanden in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Dr. H.P. Mock im Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK, Gatersleben) statt. Die Experimente wurden von Dr. A. Matros durchgeführt oder betreut.
Probenvorbereitung und -verdau
400 l (ca. 28 g) der mit Octylglucosid solubilisierten PM Proteine von Gerstewurzeln (siehe Kap. 2.2.10) wurden mit einer Chloroform/Methanol Behandlung (siehe Kap. 2.2.9b) gefällt. Für den Verdau wurden sowohl Trypsin (Promega) als auch Elastase (Sigma) verwendet. Dazu wurde das getrocknete Pellet zunächst zur besseren Lösung mit
30 l 0,1 % RapiGest (Waters, gelöst in 50 mM (NH 4)2CO 3) 10 min bei 80 °C inkubiert. Dann wurden 2,5 mM DTT dazugegeben und 10 min bei 60 °C inkubiert, um die Disulfidbrücken der Cysteine zu spalten. Nachdem die Probe auf RT abgekühlt war, wurde kurz zentrifugiert. Nach der Zugabe von 7,5 mM Iodacetamid wurde 30 min bei RT im Dunkeln inkubiert. Mit diesem Schritt wurde verhindert, dass sich die Disulfidbrücken wieder ausbilden konnten (Aitken und Learmonth, 2002). Für den Verdau wurde ein Enzym:Proben Verhältnis von 1:50
verwendet und beide Enzyme wurden in 50 mM (NH 4)2CO 3 angesetzt. Der Verdau fand über Nacht bei 37 °C statt. Durch die schrittweise Zugabe von 1 N HCl wurde das Detergenz RapiGest gespalten und nach 10 min Inkubation (5 °C) durch Zentrifugation (18.000 rpm, 60 min, 4 °C) pelletiert. Der Überstand wurde bis zur weiteren Bearbeitung bei 5 °C gelagert.
LC-Messung am Q-TOF Premier
Für die UPLC (Waters) wurde eine Symmetry C18 (5 m 180 m x 20mm) als Vorsäule und eine Atlantis BEHC18 (1,7 m 100 m x 100mm) als Hauptsäule verwendet. Der
Laufpuffer A enthielt 0,1 % Ameisensäure gelöst in H 2OReinst und die Probe (3 l) wurde mit
38 MATERIAL UND METHODEN
einer Flussrate von 5.000 l min 1 aufgetragen. Eluiert wurde mit 0,1 % Ameisensäure gelöst in Acetonitril bei einer Flussrate von 0,6 l min 1 (siehe Tabelle 2 17; Gradient I).
Sol Tabelle 2-17: Verwendete Gradienten der UPLC. I: Gradient für die Analyse der Hv Prot 5mM (IPK, Gatersleben). II: Gradient für die Analyse aller anderen Proben (AG Hecker, Uni Greifswald). Gradient I Gradient II
Zeit [min] A [%] B [%] Zeit [min] A [%] B [%]
0,0 97 3 0,0 99 1 1,0 97 3 1,0 95 5 111,0 55 45 50,0 75 25 112,0 5 95 80,0 50 50 113,0 5 95 81,0 1 99 113,1 97 3 85,0 1 99 86,0 99 1
Datenanalyse
Die Ergebnisse der Massenspektrometrie wurden mit Hilfe der Software ProteinLynx Browser (Waters, Version 2.3) mit den Datenbanken SwissProt_viridiplantae (Stand 12.12.2008), UniRef90_viridiplantae (Stand n.b.) und einer umgeschriebenen EST Datenbank von Gerste (HarvEST_35, Stand n.b.) verglichen. Dabei wurden Modifikationen wie die Carbamidomethyl Gruppe am C Terminus (aufgrund der Behandlung mit Iodacetamid) oder eine Acetyl Gruppe am N Terminus und andere Modifikationen (Deamidation N, Oxidation M, Propionamide C) berücksichtigt. Es wurde entweder ein tryptischer oder ein unspezifischer Verdau (Elastase) ausgewählt, wobei teilweise keine Ergebnisse für die mit Elastase verdauten Proben gewonnen werden konnten aufgrund der für den Rechner nicht zu bewältigenden Datenmenge. Als Kriterium für Proteintreffer mussten mindestens zwei Peptide gefunden werden.
b) Einfluss der verwendeten Detergenzien
Neben solubilisierter PM Proteasen sollten auch weiter angereinigte Proben II.b massenspektrometrisch analysiert werden. Hv Prot 5mM wurde dazu über Gelelektrophorese fraktioniert. Für den Proteaseaktivitätstest wurde das Gel mit Triton X 100 renaturiert und in gleich große Stücke geschnitten (siehe Kap. 3.2.3b, Abbildung 3 10). Ein Gelstück (ca. 25 mm³) mit proteolytischer Aktivität wurde klein geschnitten und zweimal mit 10 mM
(NH 4)2CO 3 und 50 % Acetonitril gewaschen. Das getrocknete Gelstück wurde mit Trypsin verdaut und massenspektrometrisch analysiert (siehe Tabelle 2 17, Gradient I).
39 MATERIAL UND METHODEN
Die Probe konnte aufgrund störender Substanzen nicht massenspektrometrisch analysiert werden. Das Elutionsprofil deutete auf das Vorhandensein von Polymeren hin, zu denen auch die verwendeten Detergenzien zählen (siehe Abbildung 2 3; A). Im Prozess der Probenaufarbeitung wurden Octylglucosid (Solubilisierung), Lubrol (FPLC), SDS (Gelelektrophorese) sowie Triton X 100 (Renaturierung) verwendet. Eine Peptidanreinigung mit ZipTip (C18; P10; Millipore) sowie eine Probenreinigung mit „Pierce®Detergent Removal Spin Columns“ (Pierce) konnte die störenden Substanzen nicht entfernen (Daten werden II.b nicht gezeigt). FPLC Fraktionen der Hv Prot 5mM , die mit Chloroform/Methanol gefällt worden waren, konnten ebenfalls nicht analysiert werden (siehe Abbildung 2 3, B). Nur das Detergenz Octylglucosid, das für die Solubilisierung der PM Proteine verwendet wurde, zeigte keine störenden Effekte bei der Massenspektrometrie (siehe Abbildung 2 3, C).
A B C
Abbildung 2-3: Einflüsse der bei der Proteaseanreinigung verwendeten Detergenzien auf die massenspektrometrische Analyse. Dargestellt sind Ausschnitte der Elutionsprofile der UPLC. Bei A und B konnten die Proben aufgrund der störenden Einflüsse durch die Detergenzien nicht über die Massenspektrometrie analysiert werden. A) Ein Gelstück der gelelektrophoretisch fraktionierten II.b Hv Prot 5mM wurde mit Trypsin verdaut. In der Probe könnten bedingt durch Probenvorbereitung die Detergenzien Octylglucosid, Lubrol, SDS und Triton X 100 enthalten gewesen sein. B) Eine Fraktion II.b der chromatographisch angereinigten Hv Prot 5mM wurde mittels Chloroform/Methanol Behandlung gefällt und mit Trypsin verdaut. Die Probe könnte Octylglucosid und Lubrol enthalten haben. C) Die Sol Hv Prot 5mM wurde mit Chloroform/Methanol Behandlung gefällt und mit Trypsin verdaut. Die Probe enthielt nur Octylglucosid und konnte massenspektrometrisch gemessen werden.
II.b c) Bearbeitung und Messung der angereinigten PM-Protease Hv-Prot 5mM
Ausgehend von den Vortests wurde die Proteaseanreinigung nur in Gegenwart von Octylglucosid durchgeführt. Die so gelelektrophoretisch fraktionierte Proteaseform II.b Hv Prot 5mM wurde in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. M. Hecker im Institut für mikrobielle Physiologie und Molekularbiologie (Universität Greifswald) massenspektrometrisch analysiert. Die Experimente wurden von Dr. D. Becher betreut und von M. Moche nach Hempel et al. (2011) durchgeführt.
40 MATERIAL UND METHODEN
Probenvorbereitung und -verdau
Gelstücke mit proteolytischer Aktivität (siehe Kap. 3.3.3b, Abbildung 3 17) wurden klein geschnitten und zunächst fixiert (10 % Essigsäure, 40 % Ethanol). Dann wurde die
Probe zweimal gewaschen (30 % Acetonitril, 200 mM (NH 4)HCO 3) und anschließend 30 min in einer Speedvac getrocknet. Der Verdau wurde entweder mit Trypsin (Promega), Elastase (Sigma) oder mit Chymotrypsin (Roche) durchgeführt. Für den Trypsinverdau wurde das 1 Gelstück mit einer Trypsinlösung überschichtet (2 g ml in H 2OReinst ). Nach der Rehydrati sierung des Gels (1 h Inkubation) wurde die überschüssige Lösung abgenommen und die
Probe 16 h bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden die Gelstücke mit 100 l H2OReinst überschichtet und die durch den Verdau entstandenen Peptide durch 15 min Inkubation in einem Ultraschallbad extrahiert. Nach einer kurzen Zentrifugation (1 min, 13.000 x g) wurde der Überstand abgenommen und in ein neues Mikroreaktionsgefäß überführt. Nach einer Volumeneinengung in der Speedvac (auf ca. 10 l) wurde die komplette Probe bei der UPLC injiziert.
Probenmessung und Datenanalyse
Die LC MS/MS Analyse wurde nach Hempel et al. (2011) durchgeführt. Der für die Elution von der Hauptsäule verwendete Gradient ist in Tabelle 2 17 (Gradient II) aufgeführt. Die Protein Datenbanken wurden hauptsächlich von UniProt (http://www.uniprot.org/) bezogen und mit den erhaltenen Spektren mittels der Software Sorcerer TM SEQUEST® (Sage N) verglichen. Als Suchparameter wurden für den Trypsinverdau zwei „missed cleavage sites“ (Spaltung zwischen Lysin und Arginin) eingeräumt. Die Peptidspektren wurden mit 10 ppm Toleranz und die Fragmentspektren mit 1 Da Toleranz gesucht. Es wurden nur b und y Ionenserien berücksichtigt. Zudem wurde eine Methioninoxidation mit maximal vier Modifikationen pro Peptid einkalkuliert und die Ergebnisse der Datenbanksuche (Sorcerer) wurden in einer Scaffolddatei zusammengefasst. Die Sequest /Filterwerte wurden auf DeltaCn = 0,1; XCorr (+2) = 2,2; XCorr (+3) = 3,3 und XCorr (+4) = 3,7 gesetzt. Ein Protein galt als identifiziert, wenn mindestens zwei einzelne Peptide gefunden wurden. Als Kriterium für Proteintreffer mussten mindestens zwei Peptide mit mindestens 95 % Sequenz übereinstimmung gefunden werden.
41 MATERIAL UND METHODEN
d) Messung der über endogene Proteolyse abgespaltenen Polypeptide
Die mit TCA gefällte und mit Ethanol gewaschene Probe (siehe Kap. 2.2.9a) wurde mit einer 50 mM Triethylammoniumbicarbonat Lösung resuspendiert, die zusätzlich das Detergenz RapiGest (0,1 %, Waters) enthielt. Der Verdau wurde durch Mischen von einem Teil aktiviertem Trypsin (Promega) mit 250 Teilen Probe durchgeführt. Nach 6 h Inkubation bei 37 °C wurde die Reaktion durch Zugabe von 0,2 % Trifluoracetat gestoppt. Das durch die Säure hydrolysierte RapiGest wurde durch Zentrifugation (10.800 x g, 30 min) aus der Probe entfernt. Die massenspektrometrische Analyse wurde wie in Kap. 2.2.16c beschrieben durchgeführt. Zusätzlich wurden auch einfach geladene Ionen detektiert. Damit sollte berücksichtigt werden, dass in der Probe enthaltene Proteasen neben Trypsin ebenfalls proteolytisch aktiv gewesen sein könnten.
e) Informationen zu detektierten Proteinen
Informationen zu den detektierten Proteinen wurden direkt bei UniProt (http://www.uniprot.org/) eingesehen. Zur Vereinheitlichung wurden die über verschiedene Datenbanken erhaltenen IDs der Proteine in UniProtKB/Swiss Prot IDs überführt. Angaben der SwissProt Datenbank (gi) wurden bei NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/) und die der Arabidopsis Datenbank (AT) bei TAIR (http://www.arabidopsis.org/index.jsp) abgeglichen. Angaben der Tomaten Datenbank (SGN) wurden bei Solgenomic (http://solgenomics.net/search/ transcripts/unigene) eingegeben. Über die manuelle Annotation wurde ein Treffer für Arabidopsis gesucht und entsprechend bei TAIR nachgeprüft.
Zusätzlich wurde für jedes Protein der Hydrophobizitätsindex (GRAVY) bei ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/) ermittelt sowie eine Sequenzanalyse hinsichtlich transmembraner Domänen (TMD) nach Tusnády und Simon (1998, HMMTOP: http://www.tcdb.org/progs/TMS.php) sowie nach Sonnhammer et al. (1998, TMHMM: http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM 2.0/) durchgeführt. Die Auswahl dieser zwei Algorithmen fand aufgrund der Evaluierung verschiedener Methoden statt (Möller et al., 2001). Angaben zur Lokalisierung eines Proteins wurden bei UniProt und BRENDA (http://www.brenda enzymes.org) anhand der EC Nummer bezogen. Für die spezifische Proteindatenbanksuche wurde die Suchmaschine von NCBI verwendet (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome) und für den direkten Sequenzvergleich wurde die Software BioEdit benutzt (Hall, 1999).
42 ERGEBNISSE
3. Ergebnisse
Über die Existenz von PM gebundenen Proteasen (ProtPM ) ist noch wenig bekannt. Aufbauend auf den Ergebnissen der Vorarbeit wird die Vielfalt dieser Proteasen sowohl für Tabak als auch für Gerste dargestellt. Zudem wird gezeigt, dass diese Proteaseformen durch externe Faktoren und Cofaktoren unterschiedlich reguliert werden. Der Übersichtlichkeit wegen wird an dieser Stelle eine Nomenklatur eingeführt (siehe Anhang Seite 167, ausklappbar). Die Kürzel Nt und Hv stehen für die Pflanzenart, aus der die Plasmamembranvesikel (PM Vesikel) gewonnen wurden und werden an den Anfang gestellt. Hochgestellte Buch staben zeigen den Reinigungsgrad an und tiefgestellte Angaben stehen PM für die Nitratversorgung der Pflanzen. Nt Prot 10mM steht also für Proteaseaktivität an PM PM Vesikeln ( ) von Tabakpflanzen (Nt) mit einer 10 mM Nitraternährung (10mM ). Wenn nicht anders erwähnt, beziehen sich die Angaben immer auf PM Vesikel der Wurzeln.
3.1 Charakterisierung membranassoziierter Proteasen a) anhand ihrer Substratspezifität
Mit spezifischen Substraten können Endo und Exopeptidasen unterschieden werden. Casein wird hauptsächlich endoproteolytisch gespalten. Exopeptidasen können dieses Substrat auch spalten, deshalb geht ein geringer Anteil der gemessenen Aktivität mit FTC Casein auf Exopeptidaseaktivität zurück. Alle anderen verwendeten synthetischen Substrate werden ausschließlich durch Exopeptidasen prozessiert, denn viele Endoproteasen tolerieren kein freies α Amin innerhalb der Bindungstaschen ihres aktiven Zentrums (Beynon und Bond, 2001).
FTC Casein wurde sowohl von der mikrosomalen Fraktion (mF) des Blattes als auch mF mF der Wurzelzellen der Nt Prot 10mM und der Hv Prot 5mM gespalten. Diese Gesamtaktivität bezieht sich auf alle Zellmembranen und wurde als Ausgangswert für die Berechnung der Proteaseaktivitätsverteilung in den verschiedenen Membranfraktionen verwendet (siehe Tabelle 3 1). Sowohl im Blatt als auch in der Wurzel beider Pflanzenarten konnte nach Auftrennung der mF im Zweiphasensystem keine Anreicherung der Proteaseaktivität an den „right side out“ PM Vesikeln (PEG Phase) oder den restlichen Membranvesikeln (Dextran phase) gemessen werden. Der Aktivitätsverlust von 67 (Blatt) bzw. 55 % (Wurzel) der mF mF Nt Prot 10mM als auch 13 (Blatt) bzw. 40 % (Wurzel) der Hv Prot 5mM ging entweder auf mitgeführte lösliche Proteasen zurück oder deutete auf eine Inhibition der proteolytischen Enzyme durch die verwendeten Chemikalien (Polyethylenglycol (PEG) oder Dextran) hin.
43 ERGEBNISSE
Die Aktivität der nach der Phasentrennung und Zentrifugation entstandenen Überstände wurde in diesem Zusammenhang nicht bestimmt.
Tabelle 3-1: Membranassoziierte Proteaseaktivität von Blättern und Wurzeln mit FTC-Casein als Substrat. Die mikrosomale Fraktion enthält alle Zellmembranen und wurde als 100 % gesetzt. Die Verteilung der Proteaseaktivität wurde für die PEG Phase („right side out“ PM Vesikel) und für die Dextranphase („inside out“ PM Vesikel und Endomembranen) nach Zentrifugation und Resuspension aus der Gesamtaktivität pro Volumen berechnet. Blatt und Wurzelproben stammten von Nt Prot 10mM und Hv Prot 5mM . (Tabak: Blatt n=3; Wurzel n=8; Gerste: Blatt n=3; Wurzel n=10) mikrosomale Fraktion PEG Phase Dextranphase (pelletiert, resuspendiert) (pelletiert, resuspendiert) Versuchs Spezifische Spezifische Spezifische pflanze Proteaseaktivität Verteilung Proteaseaktivität Verteilung Proteaseaktivität Verteilung [ g FTC Casein [%] [ g FTC Casein [%] [ g FTC Casein [%] h 1 mg Protein 1] h 1 mg Protein 1] h 1 mg Protein 1] Tabak Blatt 1,6 ± 1,1 100 0,8 ± 0,6 14 ± 13 1,5 ± 1,3 19 ± 18 Wurzel 14,9 ± 8,0 100 11,4 ± 7,4 17 ± 2 14,3 ± 11,4 28 ± 4
Gerste Blatt 2,4 ± 0,4 100 0,8 ± 0,6 1 ± 1 0,9 ± 0,5 12 ± 8 Wurzel 60,4 ± 20,0 100 67,1 ± 27,3 23 ± 9 66,1 ± 21,5 37 ± 5
A B
Abbildung 3-1: PM-assoziierte Exopeptidaseaktivitäten der Blätter und Wurzeln. PM PM Exopeptidaseaktivität wurde von Nt Prot 10mM und Hv Prot 5mM bestimmt. A: Aminopeptidaseaktivität wurde mit den Substraten Ala pNA, Leu pNA und Gly Pro pNA getestet. Gly Pro pNA wird auch durch Dipeptidasen gespalten. B: Carboxypeptidaseaktivität wurde mit dem Substrat MCA AlaProLys Dnp nachgewiesen. Die Aktivität wird in RFU (relative Fluoreszenzeinheit) angegeben. (Tabak: Blatt n=3, Wurzel n=3; Gerste: Blatt n=3, Wurzeln n=8) Asterisk zeigt an, dass sich der Mittelwert des Blattes signifikant von dem der Wurzel unterscheidet (p<0,05).
Die spezifischen Proteaseaktivitäten mit FTC Casein waren bei beiden Pflanzenarten im Blatt 10 (Tabak) bzw. 30fach (Gerste) geringer als in der Wurzel. Im Vergleich dazu
44 ERGEBNISSE
zeigten die PM Vesikel aus Blättern beider Pflanzenarten gut messbare Exopeptidase aktivitäten. Mit dem Substrat Ala pNA wurde jeweils die höchste Aminopeptidaseaktivität gemessen (siehe Abbildung 3 1, A). MCA AlaProLys Dnp wird spezifisch von Carboxypepti dasen umgesetzt und sowohl Blatt als auch Wurzel PM vom Tabak zeigten deutliche PM Aktivitäten. Einzig die Carboxypeptidaseaktivität der Hv Prot 5mM im Blatt lag an der unteren Nachweisgrenze des Tests (siehe Abbildung 3 1, B). Die hohen Standardabweichungen für die Exopeptidaseaktivitäten der Gersteproben resultierten aus der Messung von acht PM Proben, von denen drei sehr aktiv waren.
Diese Ergebnisse beider Pflanzenarten wiesen auf endoproteolytische Aktivitäten hin, die unter den hier gewählten Bedingungen wurzelspezifisch sind. Alle weiteren Untersuchungen fanden deshalb ausschließlich an PM Vesikeln von Wurzeln statt.
b) in Abhängigkeit von der Stickstoffernährung
Um den Einfluss der Stickstoffernährung auf die wurzelspezifische PM assoziierte Proteaseaktivität zu charakterisieren, wurden die Tabakpflanzen neben einer optimalen Stickstoffversorgung (10 mM Nitrat) auch mit einer Mangel (2 mM Nitrat) und einer Überversorgung (25 mM Nitrat) kultiviert. Bei der Gerstehydrokultur wurden neben optimaler Versorgung (5 mM Nitrat) zusätzlich Pflanzen ohne eine Stickstoffquelle im Medium kultiviert.
A B C
Abbildung 3-2: PM-assoziierte Proteaseaktivitäten von Wurzeln in Abhängigkeit von der Nitrat- ernährung. Aktivitäten wurden von Nt Prot PM und Hv Prot PM bestimmt. A: Aminopeptidaseaktivität wurde mit den Substraten Ala pNA, Leu pNA, Arg pNA und Gly Pro pNA getestet. B: Carboxypepti daseaktivität wurde mit dem Substrat MCA AlaProLys Dnp nachgewiesen. (Tabak: 2 mM Nitrat n=3, 10 mM Nitrat n=3, 25 mM Nitrat n=3; Gerste: 0 mM Nitrat n=3, 5 mM Nitrat n=8) C: Proteaseaktivität wurde mit FTC Casein in Gegenwart von 5 mM (Tabak) bzw. 2 mM CaCl 2 (Gerste) bestimmt. (Tabak: 2 mM n=6, 10 mM n=33, 25 mM n=26; Gerste: 0 mM n=7, 5 mM n=92) Asterisk zeigt an, dass sich der Mittelwert der Stickstoffunter und überversorgung signifikant von dem PM PM Mittelwert der Kontrolle (Nt Prot 10mM und Hv Prot 5mM ) unterscheidet (p<0,05).
45 ERGEBNISSE
Die vorwiegend endoproteolytische Umsetzung von FTC Casein durch die PM assoziierten Proteasen beider Pflanzenarten wurde durch die unterschiedlichen Nitratgaben kaum beeinflusst (siehe Abbildung 3 2, C). Im Vergleich dazu erhöhten sich die Exopeptidaseaktivitäten für Nt Prot PM mit zunehmender Nitratkonzentration, was statistisch für Ala pNA, Leu pNA und Arg pNA abgesichert wurde (siehe Abbildung 3 2, A). Hv Prot PM zeigte dagegen für jedes getestete Exopeptidasesubstrat eine Aktivitätsverringerung mit erhöhter Nitratversorgung. Dieser Nitrateffekt wurde für die proteolytische Spaltung von Gly Pro pNA (p=0,0029) und MCA AlaProLys Dnp (p=0,0381) statistisch abgesichert.
3.2 Eine Vielzahl unterschiedlicher Proteasen ist an die Plasmamembran von Wurzeln gebunden
Verschiedene PM gebundene Proteasen konnten sowohl mit Hilfe verschiedener Detergenzien als auch chromatographischer und gelelektrophoretischer Methoden nachgewiesen werden.
3.2.1 Untersuchungen zur Bindung der Proteasen an die Plasmamembran in Abhängigkeit von der Nitraternährung
Die Triton X 114 Fraktionierung hatte bereits für Tabak gezeigt, dass die Haupt aktivität der PM gebundenen Proteasen nicht mit dem Detergenz Triton X 114 aus der Membran gelöst werden konnte (Vorarbeit). Das deutete auf eine integrale Membranver ankerung der PM Proteasen und zusätzlich auf eine Lokalisierung in sogenannten „lipid rafts“ (Pike, 2004) hin. Die PM Vesikel wurden deshalb zuerst mit Triton X 114 behandelt, um neben der Solubilisierung von Membranproteinen auch lösliche und peripher assoziierte Proteine zu entfernen. Bei beiden Pflanzenarten konnte ein Teil der Proteasen mit Triton X 114 solubilisiert werden. Für die Berechnungen wurden die Proteaseaktivitäten der jeweils verwendeten PM Vesikel als 100 % gesetzt. Beim Tabak lag die Proteaseaktivität mit FTC Casein für diese mit Triton X 114 solubilisierten Proteine zwischen 10 (2 mM Nitrat) und 24 % (25 mM Nitrat, siehe Tabelle 3 2). Bei der Gerste wurden 42 % (0 mM Nitrat) bzw. 12 % (5 mM Nitrat) der eingesetzten Aktivität in dieser Fraktion gemessen.
46 ERGEBNISSE
Tabelle 3-2: Proteaseaktivität solubilisierter PM-Proteine aus Wurzeln in Abhängigkeit von der Nitraternährung. PM Vesikel wurden mit Triton X 114 inkubiert und zentrifugiert (10 5 g). Das resus pendierte Pellet wurde mit Octylglucosid/NaCl (Tabak) oder ohne NaCl Zusatz (Gerste) solubilisiert. Nach einer Inkubation (30 °C, 1 h) wurden die solubilisierten PM Proteine vom nicht solubilisierten Material durch Ultrazentrifugation (10 5 g) getrennt. Die Solubilisierung mit Octylglucosid/NaCl wurde wiederholt (Tabak). Das Pellet mit den nicht solubilisierten Proteinen wurde in Puffer resuspendiert. Alle Fraktionen wurden mit FTC Casein ohne Zusatz von CaCl 2 auf Proteaseaktivität getestet. Für die Berechnung der prozentualen Verteilung wurde die Aktivität der eingesetzten PM Probe auf 100 % gesetzt. (Tabak: 2 mM Nitrat n=3; 10 mM Nitrat n=16; 25 mM Nitrat n=10; Gerste: 0 mM Nitrat n=4; 5 mM Nitrat n=84) Proteaseaktivität Prozentuale 1 1 Versuchs Fraktion [ g FTC Casein h Gesamtvolumen ] Proteaseaktivitätsverteilung [%] pflanze 2 mM 10 mM 25 mM 2 mM 10 mM 25 mM
Tabak mit Triton X 114 0,9 ± 0,4 3,6 ± 2,8 4,2 ± 2,9 10 ± 5 19 ± 8 24 ± 5 solubilisierte Proteine
mit Octylglucosid und 18,6 ± 19,0 18,1 ± 16,0 22,2 ± 15,5 204 ± 155 96 ± 54 124± 26 NaCl solubilisierte PM Proteine #1
mit Octylglucosid und 2,3 ± 3,0 3,0 ± 2,8 2,5 ± 1,9 12 ± 9 12 ± 6 14 ± 6 NaCl solubilisierte PM Proteine #2
nicht solubilisierte 1,0 ± 1,5 0,4 ± 0,5 0,2 ± 0,2 9 ± 12 2 ± 1 1 ± 1 PM Proteine (pelletiert)
0 mM 5 mM 0 mM 5 mM
Gerste mit Triton X 114 14,9 ± 4,7 9,5 ± 7,8 42 ± 21 12 ± 12 solubilisierte Proteine
mit Octylglucosid 77,7 ± 29,6 41,2 ± 20,1 219 ± 122 49 ± 31 solubilisierte PM Proteine #1
nicht solubilisierte 1,3 ± 0,9 1,2 ± 0,5 4 ± 3 2 ± 1 PM Proteine (pelletiert)
Die pelletierten Triton X 114 unlöslichen PM Proteine wurden resuspendiert, mit Octylglucosid/NaCl (Tabak) oder nur mit Octylglucosid (Gerste) solubilisiert und anschließend durch Ultrazentrifugation vom nicht solubilisierten Material getrennt. Bei beiden Pflanzenarten und allen getesteten Nitraternährungen war in dieser mit Octylglucosid solubilisierten Fraktion immer der Hauptanteil der PM gebundenen Proteaseaktivität enthalten. Die Ergebnisse deuteten dabei auf eine Beeinflussung der Solubilisierbarkeit dieser Proteinfraktion durch die Nitraternährung hin. Die höchste Aktivität wurde jeweils nach Stickstoffmangelernährung gemessen (siehe Tabelle 3 2). Eine wiederholte Octylglucosid/ NaCl Behandlung der nicht solubilisierten pelletierten PM Proteine vom Tabak führte zu einer weiteren Solubilisierung von etwa 12 % der eingesetzten Proteaseaktivität bei allen drei untersuchten Nitraternährungen. Das resuspendierte Pellet mit den nicht solubilisierten PM Proteinen zeigte nach der Triton X 114 und zweimaligen Octylglucosid/NaCl bzw. Octylglucosid Behandlung bei beiden Pflanzenarten und allen Nitraternährungen immer noch geringe proteolytische Aktivitäten zwischen 1 und 9 %.
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Durch die Vorbehandlung der PM Vesikel mit Triton X 114 wurden die verschiedenen Proteasetypen bei beiden Pflanzenarten nicht voneinander getrennt. Sowohl Endo als auch Exopeptidaseaktivitäten (siehe Anhang Abbildung 7 2) wurden in der mit Octylglucosid (+/ NaCl) solubilisierten Fraktion nachgewiesen. Die Aktivitäten der anderen Solubilisierungs fraktionen wurden jedoch nicht mit den Exopeptidasesubstraten bestimmt, deshalb kann keine Aussage über die Verteilung der Exopeptidasen gemacht werden.
3.2.2 Fraktionierung der PM-Proteasen mittels chromatographischer Verfahren
Aktivitätstests der mit Triton X 100 unlöslichen und mit Octylglucosid solubilisierten Proteasen beider Pflanzenarten hatten gezeigt, dass sowohl Exo als auch Endopeptidase aktivtäten auf membranintegrale Proteasen zurückgehen. Mit verschiedenen Chromato graphieverfahren sollten diese verschiedenen Proteaseformen voneinander getrennt und angereinigt werden.
a) molekulare Größenunterschiede innerhalb solubilisierter PM-Proteasen
Sol Mit Hilfe der Größenausschlusschromatographie wurden sowohl bei Nt Prot 10mM als Sol auch bei Hv Prot 5mM drei Proteasen fraktioniert (siehe Abbildung 3 3). Eine Proteaseform (Prot A) interagierte nicht mit dem Säulenmaterial und eluierte im Bereich des nativen Markerproteins Thyroglobulin (669 kDa). Zwei weitere Proteaseformen wurden bei beiden Pflanzenarten mit dieser Methode nicht vollständig voneinander getrennt. Für Prot B wurde ein apparentes Molekulargewicht (app. MW) von 107 kDa und für Prot C von 77 kDa bestimmt.
Abbildung 3-3: Elutionsprofil der Größenausschlusschromatographie solubilisierter Sol Sol PM-Proteasen aus Tabak- und Gerstewurzeln. Sowohl Nt Prot 10mM (○) als auch Hv Prot 5mM (■) wurden über eine Superdex®200 Säule in Gegenwart von 150 mM NaCl aufgetrennt (n=1). Die Fraktionen wurden mit FTC Casein auf Proteaseaktivität getestet. Aufgetragen ist zusätzlich der Standard (Pharmacia, ∆, y= 18,71*x+1899,66).
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b) Trennung solubilisierter PM-Proteasen aufgrund der Nettooberflächenladung
Die Proteasen der solubilisierten PM Fraktion wurden anhand der Nettooberflächen ladung bei pH 7,8 mittels Anionenaustauschchromatographie (AC) in Gegenwart von 0,02 % Lubrol aufgetrennt. Unter den gewählten Laufbedingungen wurden bei beiden Pflanzenarten zwei Proteaseformen nachgewiesen (siehe Abbildung 3 4). Eine Form konnte nicht an die AC Säule binden (Prot I) und eine zweite Protease eluierte bei 180 mM NaCl (Prot II ). Auch hier zeigte sich kein Einfluss der verschiedenen Nitraternährungen (siehe im Anhang Abbildung 7 3) und auch die Entsalzung hatte keinen Effekt auf die Proteaseaktivitäten.
A B
Abbildung 3-4: Elutionsprofile der Anionenaustauschchromatographie solubilisierter Sol Sol PM-Proteasen in Gegenwart von 0,02 % Lubrol. Sowohl Nt Prot 10mM (A) als auch Hv Prot 5mM (B) wurden über AC aufgetrennt. Die Proteaseaktivität der Fraktionen wurde mit FTC Casein gemessen. (A: ohne Dialyse, n=6; B: mit Dialyse, n=40). Die Standardabweichungen sind als graue Flächen dargestellt.
I Abbildung 3-5: Elutionsprofil der Kationenaustauschchromatographie der Hv-Prot 5mM . I AC Fraktionen mit proteolytischer Aktivität der Hv Prot 5mM wurden vereinigt, das Volumen über Membranfilter (MWCO 10 kDa) eingeengt und der pH auf 6,0 eingestellt. Nach der Chromatographie wurden die Fraktionen dialysiert, umgepuffert und die Proteaseaktivität bei pH 7,8 mit FTC Casein in Gegenwart von 2 mM CaCl 2 gemessen. (n=7) Die Standardabweichungen sind als graue Flächen dargestellt. Diese Messungen wurden im Rahmen einer Diplomarbeit erstellt (Wenzel, 2010).
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I Die mittels AC isolierte Protease Hv Prot 5mM (siehe Abbildung 3 4) wurde über Kationenaustauschchromatographie (KC) im Rahmen einer Diplomarbeit (Wenzel, 2010) fraktioniert. Dabei zeigte diejenige Proteasefraktion, die bei pH 7,8 nicht an das Säulenmaterial der AC gebunden hatte, auch keine Bindungsaffinität zum Säulenmaterial der KC sowohl bei einem pH von 7,8 als auch bei pH 6,5 (Daten werden nicht gezeigt). Erst bei I einem pH Wert von 6,0 wurde diese Hv Prot 5mM in zwei Proteaseformen getrennt. Eine I.A Protease hatte nicht an die KC gebunden (Hv Prot 5mM ) und eine zweite Form eluierte im I.B linearen Salzgradienten bei 100 mM NaCl (Hv Prot 5mM ) (siehe Abbildung 3 5).
c) Fraktionierung der Prot I und Prot II anhand der Hydrophobizität
Mit der Hydrophoben Interaktionschromatographie (HIC) wurde geprüft, ob die Proteasefraktion Prot I und Prot II (siehe Abbildung 3 4) sich aus mehreren Proteaseformen zusammensetzen. Dazu wurden im Anschluss an die AC jeweils die Fraktionen mit der I II Hauptaktivität der Nt Prot 10mM oder der Nt Prot 10mM vereinigt und in Gegenwart von 0,02 % Lubrol mit der HIC analysiert.
A B
I Abbildung 3-6: Elutionsprofile der Hydrophoben Interaktionschromatographie der Nt-Prot 10mM II I und Nt-Prot 10mM . AC Fraktionen mit proteolytischer Aktivität der Nt Prot 10mM (A, n=3) und II Nt Prot 10mM (B, n=1) wurden vereinigt, über Membranfilter konzentriert und die Salzkonzentration der Probe auf 1,5 M Ammoniumsulfat eingestellt. Nach der Chromatographie wurden die Fraktionen entsalzt und anschließend mit FTC Casein in Gegenwart von 5 mM CaCl 2 auf Proteaseaktivität getestet. Die Standardabweichungen sind als graue Flächen dargestellt.
I Nt Prot 10mM (siehe Abbildung 3 4, A) wurde in vier Proteaseformen fraktioniert (siehe I.I Abbildung 3 6, A). Die erste Protease (Nt Prot 10mM ) eluierte in Gegenwart von 1,5 M Ammoniumsulfat ohne an das Säulenmaterial gebunden zu haben. Die zweite Form I.II I.III (Nt Prot 10mM ) wurde bei 1,1 M Ammoniumsulfat eluiert. Die dritte Protease (Nt Prot 10mM ) I.IV eluierte bei 240 mM Ammoniumsulfat und eine vierte Protease (Nt Prot 10mM ) eluierte
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während des Spülens der HIC mit einer 0,02 %igen Lubrollösung. Im Vergleich dazu wurde II die Nt Prot 10mM mittels HIC nicht in weitere Formen aufgetrennt (siehe Abbildung 3 6, B), II.I sondern wurde mit einer 0,02 %igen Lubrollösung eluiert (Nt Prot 10mM ). Eine Variation des Elutionsgradienten (0,5 oder 1 M Ammoniumsulfat) führte nicht zur besseren Auftrennung I der Nt Prot 10mM (siehe Anhang Abbildung 7 4).
d) Fraktionierung der Prot I und Prot II mittels Affinitätschromatographie
Für die weitere Auftrennung der über AC getrennten Proteaseformen erwies sich die Metallchelat Affinitätschromatographie (IMAC) als geeignet. Im Vergleich zur HIC war dieses Chromatographieverfahren reproduzierbar, es gab keine Aktivitätsverluste und die Proteaseformen eluierten bei definierten Imidazolkonzentrationen.
I II Hv Prot 5mM und Hv Prot 5mM (AC, siehe Abbildung 3 4, B) wurden durch die IMAC unter den gewählten Bedingungen in jeweils zwei weitere Proteaseformen aufgetrennt. Eine Proteaseform konnte nicht an das mit Cu 2+ gesättigte Säulenmaterial binden und wurde mit I.a II.a Hv Prot 5mM bzw. Hv Prot 5mM bezeichnet. Die zweite Protease wurde mit 95 mM Imidazol I.b II.b eluiert und als Hv Prot 5mM bzw. Hv Prot 5mM bezeichnet (siehe Abbildung 3 7).
A B
Abbildung 3-7: Elutionsprofile der Metallchelat-Affinitätschromatographie der angereinigten I II I Hv-Prot 5mM und Hv-Prot 5mM . AC Fraktionen mit proteolytischer Aktivität der Hv Prot 5mM (A, n=2) und II Hv Prot 5mM (B, n=29) wurden vereinigt. Die über Membranfilter (MWCO 10 kDa) konzentrierten Proben wurden über die mit Cu 2+ beladene IMAC aufgetrennt, entsalzt und die Fraktionen direkt im Proteasetest mit FTC Casein eingesetzt. Die Standardabweichungen sind als graue Flächen dargestellt.
I II Die über AC getrennten Proteaseformen Hv Prot 5mM und Hv Prot 5mM zeigten sowohl Aminopeptidase (Ala pNA) als auch Carboxypeptidaseaktivitäten (MCA AlaProLys Dnp, II siehe Tabelle 3 3), welche auch nach der IMAC in beiden Formen der Hv Prot 5mM nachgewiesen wurden. Exo und Endoproteaseaktivität wurden folglich weder durch
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Verwendung verschiedener Detergenzien noch durch zweifache chromatographische Anreinigung voneinander getrennt.
Tabelle 3-3: Exopeptidaseaktivität der angereinigten PM-Proteasen von Gerstewurzeln. Für jede Proteaseform wurde die Fraktion mit der höchsten caseinolytischen Aktivität ausgewählt und mit Ala pNA (Aminopeptidase) sowie mit MCA AlaProLys Dnp (Carboxypeptidase) getestet. (n=1) Exopeptidaseaktivität Proteaseform Ala pNA MCA AlaProLys Dnp [ mol Ala pNA min 1 ml Fraktion 1] [RFU min 1 ml Fraktion 1]
I Hv Prot 5mM 11,3 4533 II Hv Prot 5mM 20,0 1049 II .a Hv Prot 5mM 1,3 78 II.b Hv Prot 5mM 1,3 125
3.2.3 Fraktionierung der PM-Proteasen mittels Gelelektrophorese
Verschiedene gelelektrophoretische Methoden wurden in Kombination mit chromatographischen Techniken dazu benutzt, Endo und Exopeptidasen weiter zu charakterisieren.
a) Native PAGE solubilisierter PM-Proteasen
Sol Solubilisierte PM Proteine sowohl von Tabak (Nt Prot 10mM ) als auch von Gerste Sol wurzeln (Hv Prot 5mM ) wurden in einer 10 %igen nativen PAGE aufgetrennt. Die jeweiligen Probenspuren wurden anschließend in 0,25 cm breite Abschnitte geteilt und direkt im Proteasetest eingesetzt. Beide Proben zeigten deutliche Proteaseaktivität im Sammelgel (siehe Abbildung 3 8, A) und in den ersten zwei Gelstücken des Trenngels. Diese Ergebnisse deuteten auf das Vorhandensein von größeren Proteinkomplexen hin. Wie bereits gezeigt, wurde auch mit Hilfe der Größenausschlusschromatographie eine Proteaseform (Prot A) mit hohem Molekulargewicht fraktioniert (siehe Kap. 3.2.2a).
Sol Für Nt Prot 10mM wurden zwei weitere aktive Proteasen nachgewiesen (siehe Abbildung 3 8 A*3, 4), die mit Silbernitrat nicht angefärbt wurden. Die gelelektrophoretische
Sol Auftrennung der Hv Prot 5mM zeigte neben der Aktivität im Sammel und Trenngel übergangsbereich zwei weitere aktive Proteasen (siehe Abbildung 3 8 A*1, 2), die zudem mit Silbernitrat angefärbt wurden (siehe Punktmarkierung in Abbildung 3 8, B). Sowohl Sol Sol Nt Prot 10mM als auch Hv Prot 5mM , die über AC in zwei Proteaseformen getrennt werden
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konnten, wurden unter nativen Bedingungen gelelektrophoretisch in mindestens drei verschiedene Formen getrennt.
A B
Nt Hv
Abbildung 3-8: Native Gelelektrophorese solubilisierter PM-Proteine von Tabak- und Sol Sol Gerstewurzeln. A) Nt Prot 10mM (■) und Hv Prot 5mM (□) wurden über 10 %ige native PAGE aufge trennt. Die Gelspuren wurden in gleichgroße Stücke geschnitten und die Proteaseaktivität mit FTC Casein gemessen. SG = Sammelgel B) Ein Drittel der Tabak (Nt) und Gersteprobe (Hv) wurde in einer separaten Spur aufgetrennt, fixiert und mit Silbernitrat gefärbt. * ausgewählte Gelstücke mit Proteaseaktivität, ● markierte Proteinbanden (n=1)
Messungen der Exopeptidaseaktivitäten der Nt Prot Sol hatten auf eine Korrelation zwischen Nitraternährung und Aminopeptidaseaktivitäten hingewiesen (siehe Kap. 3.2.1 und Anhang Abbildung 7 2). Um zu klären, ob die gemessene Aktivitätserhöhung mit Ala pNA auf Sol eine zusätzliche Proteaseform zurückgeführt werden könnte, wurden Nt Prot 2mM , Sol Sol Nt Prot 10mM und Nt Prot 25mM mittels nativer PAGE aufgetrennt und sowohl mit FTC Casein als auch mit Ala pNA auf Proteaseaktivität getestet. Ein Drittel des Probenvolumens lief in separaten Spuren und wurde nach Fixierung mit Silbernitrat gefärbt (siehe Abbildung 3 9, C).
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A B C
2 10 25
Sol Abbildung 3-9: Native Gelelektrophorese solubilisierter PM-Proteasen von Tabakwurzeln in Abhängigkeit von der Nitraternährung. Nt Prot 2mM (■), Sol Sol Nt Prot 10mM (□) und Nt Prot 25mM (■) wurden über 10 % native PAGE gelelektrophoretisch aufgetrennt. Die Gelspuren wurden halbiert und die Proteaseaktivität wurde sowohl mit FTC Casein (A) als auch mit Ala pNA (B, Exopeptidase /Aminopeptidaseaktivität) als Substrat gemessen. *ausgewählte Gelstücke mit Proteaseaktivität, Der Proteinstandard ( ● ) ist mit angegeben. C) Ein Drittel der Proben wurde jeweils separat im Gel aufgetrennt, fixiert und mit Silbernitrat gefärbt. Beschriftung weist auf Nitratversorgung hin: 2 entspricht 2 mM Nitrat etc. Mit Punkten markierte Proteinbanden liegen im Bereich der 54 Gelsegmente mit Proteaseaktivität. (n=1)
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Unabhängig von der Nitratanzucht und dem getesteten Proteasesubstrat wurden im ersten Sammel und ersten Trenngelstück Proteaseaktivitäten gemessen. Mit FTC Casein wurden vier weitere Proteaseformen im Trenngel nachgewiesen. Deren Aktivität zeigte nur geringfügige Unterschiede innerhalb der verschiedenen Nitratanzuchten (siehe *1 bis *4 Sol Abbildung 3 9, A ). Bei Nt Prot 10mM wurden die ersten drei Proteaseformen mit Silbernitrat angefärbt (siehe Punktmarkierungen in Abbildung 3 9, C 10). Im Vergleich dazu wurde mit dem Substrat Ala pNA im Trenngel neben den bereits erwähnten hoch Sol molekularen Aktivitäten für die Nt Prot 10mM Aminopeptidaseaktivität bei zwei weiteren Gelsegmenten gemessen (siehe Abbildung 3 9, B*5, *6 ). Mit FTC Casein war keine Aktivität gemessen worden. Eine dazugehörige Proteinbande konnte im Bereich der ersten Form *5 nachgewiesen werden (siehe Abbildung 3 9, C 10).
Mit der nativen PAGE war es anders als mit den verwendeten chromatographischen Sol Techniken möglich gewesen, Nt Prot 10mM in zwei Exopeptidasen und wahrscheinlich vier weitere Endopeptidasen aufzutrennen. Die Aktivitäten der Sammel und Trenngel übergangsbereiche deuteten zudem auf Proteinkomplexe hin, die beide Proteasetypen enthielten. Zusätzlich wurde ein Einfluss der Nitraternährung auf die Aminopeptidaseaktivität Sol gemessen. Während für die Normalernährung (Nt Prot 10mM ) eine vergleichsweise hohe Aktivität für eine der Aminopeptidasen (siehe Abbildung 3 9, B *6 ) gemessen wurde, lag die Sol Substratumsetzung bei der Probe der Stickstoffüberversorgung (Nt Prot 25mM ) nur knapp über der Nachweisgrenze des Tests.
II.b b) Untersuchung der angereinigter Hv-Prot 5mM mittels SDS-PAGE
Vortests hatten gezeigt, dass die hier untersuchten Proteasen ihre caseinolytische Aktivität auch unter denaturierenden Bedingungen behalten. Aus diesem Grund wurde II.b mittels SDS PAGE getestet, ob die angereinigte Hv Prot 5mM weitere Proteaseformen enthält. Einzig mit FTC Casein war nach 15 h Inkubationszeit Proteaseaktivität nachweisbar (siehe Abbildung 3 10, A). Mit den Exopeptidasesubstraten Ala pNA und MCA AlaProLys Dnp wurde auch nach 24 h Inkubation keine Aktivität gemessen. Das bedeutet, dass die Exopeptidasen durch SDS oder durch Reduktion mit DTT irreversibel gehemmt wurden und nicht mit Triton X 100 renaturiert werden konnten.
II.b Mit FTC Casein wurde trotz denaturierender Bedingungen für Hv Prot 5mM ähnlich der nativen PAGE am Sammel und Trenngelübergangsbereich proteolytische Aktivität gemessen. Zusätzlich wurde im ersten Trenngelsegment (*1) eine Proteinbande mit einem apparenten Molekulargewicht (app. MW) von 193 kDa gefunden (siehe Abbildung 3 10, B),
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die der Proteaseaktivität entsprechen könnte. Desweiteren wurde Substratumsetzung in Gelbereichen mit app. MW von 94 88 kDa (*2) , 73 69 kDa (*3) , 61 58 kDa (*4) , 55 49 kDa (*5) , 36 34 kDa (*6) , 29 kDa (*7) , 26 25 kDa (*8) und 24 23 kDa (*9) nachgewiesen.
II.b Insgesamt wurde Hv Prot 5mM unter denaturierenden Bedingungen gelelektrophoretisch in zehn Proteaseformen aufgetrennt, die in Gegenwart von Ala pNA oder MCA AlaProLys Dnp keine Aktivität gezeigt hatten. Unter nativen Bedingungen waren Sol es für die weniger angereinigte Proteaseform Hv Prot 5mM im Vergleich nur drei Proteaseformen gewesen (siehe Abbildung 3 8). Zudem wurden sieben dieser proteolytisch aktiven Gelbereiche Proteinbanden zugewiesen, die den Proteasen entsprechen könnten (siehe Abbildung 3 10, B). Acht der beschriebenen Proteaseformen wurden durch II.b wiederholte gelelektrophoretische Trennungen der Hv Prot 5mM reproduzierbar gemessen.
A B
II.b Abbildung 3-10: SDS-PAGE der chromatographisch angereinigten Hv-Prot 5mM . A) Die über AC II.b und IMAC chromatographisch angereinigte PM Protease Hv Prot 5mM wurde über Membranfilter (MWCO 10 kDa) eingeengt und über SDS PAGE aufgetrennt. Anschließend wurde die Gelspur mit Triton X 100 renaturiert, in drei Streifen und diese jeweils in gleichgroße Stücke geschnitten. Ein Teil wurde direkt im Proteaseaktivitätstest mit FTC Casein eingesetzt. Die anderen zwei Teile der Gelspur wurden mit Ala pNA oder mit MCA AlaProLys Dnp gemessen. Es konnte keine Exopeptidaseaktivität gemessen werden. * Markierungen ausgewählter Gelsegmente mit Proteaseaktivität. SG = Sammel II..b gel. B) Ein Drittel der Hv Prot 5mM wurde in einer separaten Spur aufgetrennt, fixiert und mit Silbernitrat angefärbt. Mit Punkten markierte Proteinbanden liegen im Bereich der Gelsegmente mit Proteaseaktivität. Der Proteinstandard ( ● ) ist mit angegeben. (n=1, stellvertretend für 5 Experimente)
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c) Untersuchung der verschiedenen Proteaseformen mittels Zymographie
Die gelelektrophoretische Fraktionierung der unterschiedlich angereinigten Protease formen von Gerstewurzeln erfolgte auch im Zymogramm unter denaturierenden Bedingungen. Ziel war es, aufgrund des im Gel inkorporierten Proteasesubstrates (Gelatine) und dem damit verbundenen direkten Nachweis der Proteaseaktivität im Gel eine bessere Auftrennung der Proteaseformen zu erreichen. Unter Berücksichtigung aller zymographisch fraktionierten Proben zeigte sich ein großes Proteasespektrum mit app. MW von 236 bis 33 kDa (siehe Abbildung 3 11). Zusätzlich zum app. MW wurde die Stärke der Proteaseaktivität visuell in hoch bis nicht vorhanden unterschieden (siehe Tabelle 3 4).
Sol Hv Prot 5mM wurde in insgesamt fünfzehn verschiedene proteolytisch aktive Formen getrennt (einschließlich Aktivität im Sammelgel). Besonders hohe Aktivität (++) zeigte dabei eine Protease mit einem app. MW von 82 kDa (f) . Zwei weitere gut sichtbare Formen (+) wurden mit einem app. MW von 98 und 33 kDa nachgewiesen. Die hoch aktive Proteaseform und sieben weitere Proteasebanden wurden nur in abgereicherter Form oder nicht mehr in den danach folgenden Reinigungsstufen wiedergefunden. Besonders auffällig ist das Ver schwinden der kleinsten PM Proteasen (app. MW von 38 bis 33 kDa). Während der Anreini gung könnte es zum proteolytischen Abbau oder zur Inhibierung dieser Proteaseformen gekommen sein.
I II Die zwei durch AC getrennten Proteaseformen Hv Prot 5mM und Hv Prot 5mM wurden in I jeweils zwölf bzw. elf verschiedene Formen fraktioniert. Dabei wurden für Hv Prot 5mM drei Proteasebanden mit hoher Aktivität (++) und app. MW von 236 (a) , 213 (b) sowie 142 kDa (d) II bestimmt. Hv Prot 5mM wies dagegen nur eine Protease mit hoher Aktivität (++) und einem app. MW von 103 kDa (e) auf. Die hochaktiven Proteasebanden könnten aus größeren Proteinkomplexen freigesetzt worden sein, die bei der gelelektrophoretischen Trennung der Sol Hv Prot 5mM nicht ins Trenngel gelaufen waren oder als inaktive Formen vorgelegen haben. II.b Hv Prot 5mM , die Proteaseform mit der höchsten Reinigungsstufe, zeigte nach gelelektrophoretischer Auftrennung immer noch neun verschiedene proteolytisch aktive Banden, von denen jedoch nur vier Proteasen (einschließlich Aktivität im Sammelgel) mit gut sichtbarer Aktivität (+) detektiert werden konnten.
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Proteaseform Sol I II II.a II.b Hv Prot 5mM Hv Prot 5mM Hv Prot 5mM Hv Prot 5mM Hv Prot 5mM
kDa kDa
220 212 170
118 116
76
66
53
43
29
Abbildung 3-11: Zymographische Fraktionierung der verschiedenen angereinigten PM-Proteasen von Gerstewurzeln. Die Proteaseformen von Gerstewurzeln wurden unter denaturierenden Bedingungen gelelektrophoretisch aufgetrennt und die proteolytische Aktivität zymographisch in Gegenwart von Sol 5 mM CaCl 2 nachgewiesen. Bis auf Hv Prot 5mM wurde immer der gleiche Marker verwendet. Die Sammelgele sind in dieser Abbildung nicht zu sehen. Mit Buchstaben markierte Banden entsprechen einer hohen proteolytischen Aktivität (visuell eingeschätzt). 58
Tabelle 3-4: Apparente Molekulargewichte zymographisch fraktionierter PM-Proteasen von Gerstewurzeln. Die verschiedenen angereinigten PM gebundenen Proteaseformen von Gerstewurzeln (5 mM Nitratanzucht) wurden unter denaturierenden Bedingungen aufgetrennt und die proteolytische Aktivität zymographisch in Gegenwart von 5 mM CaCl 2 nachgewiesen. Die Aktivitätsstärke wurde visuell eingeschätzt als hoch (++), gut sichtbar (+), kaum nachweisbar ( ±) und nicht vorhanden ( ). Zymographisch detektierte Proteaseaktivität Sol I II II.a II.b Proteaseform Hv Prot 5mM Hv Prot 5mM Hv Prot 5mM Hv Prot 5mM Hv Prot 5mM
Bande im Sammelgel ± ± + +
app. MW [kDa]
236 (a) ++ 227 ± - 219 ± - 213 (b) ++ ± 208 + 193 (c) ± ± ++ 158 ± - 147 + 142 (d) ++ + 134 + + + 127 ± ± 121 ± - 113 + + ± 103 (e) ± ++ 96 ± + + 91 ± ± 85 ± 82 (f) ++ ± 79 ± ± ± 76 ± ± + ± 72 ± + 69 ± ± + ± 62 ± ± ± ± 54 ± ± 53 ± ± 38 ± 35 ± 33 +
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Wiederholungen der zymographischen Fraktionierungen mit den verschiedenen PM gebundenen Proteaseformen von Gerstewurzeln zeigten, dass das jeweilige Banden muster variierte (Daten werden nicht gezeigt). Dieses Spektrum an verschiedenen Proteaseformen könnte auf methodische Ursachen zurückgehen. So könnte es zu einer Proteinkomplexbildung während der Volumenreduktion durch Membranfiltration (MWCO 10 kDa) gekommen sein. Desweiteren könnten proteolytische Vorgänge trotz Probenkühlung während der langwierigen Reinigungsprozeduren aufgetreten sein. Diese enzymatischen Abbauprozesse könnten sowohl durch Endo also auch durch Exopeptidasen zustande gekommen sein, denn solange SDS und DTT nicht zur Probe gegeben wurden, waren beide II.b Proteaseaktivitäten auch bei Hv Prot 5mM noch messbar (siehe Tabelle 3 3). Zusätzlich könnten bereits chemische Vorgänge während der Pflanzenernte und Präparation der PM Vesikel einen Einfluss auf die PM Proteaseformen ausgeübt haben. So deutete die Zymographie solubilisierter PM Proben einer Gersteanzucht auf einen Einfluss der Präparationsreihenfolge des Wurzelmaterials hin (siehe Anhang Abbildung 7 5).
I 3.2.4 Deglykosylierung verändert das Proteasespektrum der Hv-Prot 5mM
I Die chromatographische Auftrennung der Hv Prot 5mM zeigte, dass die zuvor bei einem pH von 7,8 nicht an die AC gebundenen Proteine bei gleichem pH ebenfalls nicht an die KC binden (siehe Kap. 3.2.2b). Möglicherweise haben Glykosylreste zu einer Oligomeri sierung und Änderung der Nettooberflächenladung geführt (Regnier 1987; Putnam und Takahashi, 1988). Pflanzliche PM gebundene Proteine können N Glykosylierungen besitzen, die aufgrund der posttranslationalen Modifikation im ER als Viel Mannose Typ vorliegen (Lerouge et al. , 1998). Daher wurde im Rahmen einer Diplomarbeit (Wenzel, 2010) geprüft, I ob die enzymatische Deglykosylierung der Hv Prot 5mM durch die Peptid N Glykosidase F (PNGase F) einen Einfluss auf die gelelektrophoretische Auftrennung dieser Proteaseform hat.
I Ohne PNGase F Behandlung wurden für die Hv Prot 5mM im Zymogramm zwei Aktivitätsbanden im Sammelgel a b und eine weitere Proteaseform mit einem app. MW von 92 kDa c detektiert (siehe Abbildung 3 12, Spur 1). Nach der Deglykosylierung konnten zwei neue Proteaseformen mit app. MW von 42 d und 25 kDa f nachgewiesen werden (siehe Abbildung 3 12, Spur 2). Es konnte jedoch nicht geklärt werden, ob diese zwei Proteasen aus inaktiven Vorstufen entstanden sind oder in glykosylierter Form als Oligomere vorgelegen haben. Die Proteinbande mit einem app. MW von 31 kDa e entspricht vermutlich der PNGase F, die laut Tarentino und Plummer (1994) ein app. MW von 36 kDa besitzt.
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kDa 1 2
SG
212
118
66
43
29
20 I Abbildung 3-12: Zymographische Fraktionierung der Hv-Prot 5mM nach Deglykosylierung. I Proteolytisch aktive Fraktionen der Hv Prot 5mM wurden vereinigt und das Volumen mittels Membranfilter (MWCO 10 kDa) reduziert. Die Probe wurde nicht (Spur 1) bzw. mit PNGase F (Spur 2) behandelt und anschließend im Zymogramm gelelektrophoretisch aufgetrennt. SG = Sammelgel (n=1)
3.3 Verschiedene Proteasetypen sind an die PM von Wurzeln gebunden
Proteasen werden nach ihrer Substratspezifität, aber auch anhand ihrer katalytischen Zentren in verschiedene Klassen eingeteilt, welche mit Hilfe spezifischer Inhibitoren nachweisbar sind. Auch pH Optima und der Einfluss verschiedener Substanzen auf die Proteaseaktivitäten können zur Unterscheidung der Proteasen herangezogen werden. Eine genaue Zuordnung wird schließlich mit Hilfe der Massenspektrometrie erreicht.
3.3.1 Einfluss spezifischer Proteaseinhibitoren
Um die PM assoziierten Proteasen einer der entsprechenden Klassen zuordnen zu können, wurden Endo und Exopeptidaseaktivität in Gegenwart verschiedener spezifischer Inhibitoren sowie eines Proteaseinhibitorcocktails für pflanzliches Gewebe getestet. Die verwendeten Inhibitoren wurden anhand von Vortests ausgewählt.
Keiner der acht verwendeten Inhibitoren konnte die caseinolytische Aktivität an PM Vesikeln vollständig hemmen (siehe Abbildung 3 13, A). Die Aktivitätshemmung der PM PM Nt Prot 10mM bzw. Hv Prot 5mM durch den Inhibitorcocktail (Zusammensetzung siehe Tabelle 2 10) lag zwischen 81 und 94 %. Als einzeln getesteter Inhibitor zeigte PMSF mit PM 62 % Hemmung den größten Effekt auf die endoproteolytische Aktivität von Nt Prot 10mM . AEBSF, ebenfalls ein Inhibitor von Serinproteasen, zeigte mit 38 % eine geringere Hemmung als PMSF. Letzteres kann auch Cysteinproteasen hemmen, wobei die Inhibition in
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Gegenwart von DTT reversibel ist (Beynon und Bond, 2001). Der Hemmstoff E64, ein PM Inhibitor von Cysteinproteasen, zeigte jedoch keine signifikante Hemmung der Nt Prot 10mM .
Neben Serinproteasen konnten Metalloproteasen mittels der Hemmstoffe 1,10 Phenanthrolin und EDTA eindeutig nachgewiesen werden. Wobei EDTA auch als Hemmstoff von Ca 2+ aktivierten oder Ca 2+ stabilisierten Proteasen verwendet wird (Beynon und Bond, 2001). Dabei wurde ein deutlicher Unterschied zwischen Tabak und Gerste PM festgestellt. Während EDTA die caseinolytische Aktivität der Nt Prot 10mM erhöhte, wurde PM die Aktivität der Hv Prot 5mM um 29 % gehemmt (siehe siehe Abbildung 3 13, A). Pepstatin A, ein Hemmstoff von Aspartatproteasen, zeigte keinen Einfluss auf die Protease aktivität. Da Aspartatproteasen häufig ein saures pH Optimum besitzen (Simões und Faro, 2004) war dieser Proteasetyp vermutlich im Test bei einem pH Wert von 7,8 nicht aktiv.
Der Hemmstoff Bestatin, der für Aminopeptidasen spezifisch ist (Umezawa et al. , 1976), zeigte bei beiden Pflanzenarten keinen signifikanten Effekt. Die hydrolytische Spaltung von FTC Casein wurde daher den Endopeptidasen zugeschrieben. Die PM assoziierte Exopeptidaseaktivität wurde deshalb mit dem Substrat Ala pNA aufgrund von Vortests in Gegenwart ausgewählter Inhibitoren gemessen (siehe Abbildung 3 13, B). PM Nt Prot 10mM konnte nur durch 1,10 Phenanthrolin und RB3014, einem spezifischen Inhibitor von Metalloexopeptidasen (Antczak et al. , 2001), signifikant gehemmt werden. Weder der Serin (PMSF) noch der Cysteinproteaseinhibitor (E64) zeigten eine deutliche Hemmung. Die PM Aminopeptidaseaktivität der Hv Prot 10mM konnte mit dem Serin (PMSF) und den Metallo proteaseinhibitoren (1,10 Phenanthrolin und RB3014) gehemmt werden. Jedoch war der Einfluss von RB3014 weniger deutlich messbar gewesen als der von 1,10 Phenanthrolin. Aufgrund der hohen Standardabweichungen konnte keiner der Inhibitoreffekte für PM Hv Prot 5mM statistisch abgesichert werden.
Messungen der Exopeptidaseaktivitäten mit Ala pNA, Leu pNA und Arg pNA hatten bei Tabak auf Nitrateffekte hingedeutet (siehe Abbildung 3 2). Deshalb wurden zusätzlich PM PM PM Nt Prot 2mM , Nt Prot 10mM bzw. Nt Prot 25mM in Gegenwart der ausgewählten Inhibitoren sowohl mit FTC Casen als auch mit Ala pNA getestet. Es wurden Nitrateffekte für die Serin und Metalloendoproteaseaktivitäten gefunden. PMSF hemmte die caseinolytische Aktivität PM PM der Nt Prot 10mM doppelt so stark wie die der Nt Prot 25mM . 1,10 Phenanthrolin inhibierte PM PM dagegen die Nt Prot 25mM fast dreimal stärker als die Nt Prot 10mM (siehe Abbildung 3 14, A). Die Aktivitätsmessung in Gegenwart von EDTA zeigte jedoch den gegenteiligen Effekt. PM So verdoppelte sich die Proteaseaktivität der Nt Prot 2mM in Gegenwart von EDTA, während PM dieser Effekt auf Nt Prot 25mM ausblieb. Der Effekt des Chelators zweiwertiger Kationen könnte auf Ca 2+ aktivierte Endoproteasen hinweisen, deren Aktivität mit zunehmender Nitratversorgung der Tabakpflanzen abnimmt. Die Aminopeptidaseaktivitäten (Ala pNA) der
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PM Nt Prot 10mM wurden einzig in Gegenwart der Metalloproteaseinhibitoren 1,10 Phenanthrolin PM und RB3014 etwa doppelt so stark gehemmt wie die Nt Prot 25mM (siehe Abbildung 3 14, B).
Mit Hilfe der spezifischen Inhibitoren wurde gezeigt, dass neben Endo und Exoproteaseaktivität verschiedene Proteasetypen an der PM sowohl von Tabak als auch von Gerste gebunden sind. Die PM assoziierte Endoproteaseaktivität geht auf Serin und Metalloproteasen zurück und die PM assoziierte Exopeptidaseaktivität konnte größtenteils Metalloproteasen zugeordnet werden. Zusätzlich wurde bei Tabak ein Nitrateffekt für diese drei verschiedenen Proteasetypen gemessen. So war die Metalloendoprotease nach einer Nitratüberversorgung der Tabakpflanzen stärker aktiv, wohingegen die Aktivitäten der anderen Formen bei dieser Nitraternährung abnahmen.
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A
B
Abbildung 3-13: Einfluss von Inhibitoren auf die PM-assoziierte Endo- und Exopeptidase- PM PM aktivität. Die proteolytische Aktivität von Nt Prot 10mM (□) und Hv Prot 5mM (■) wurde mit FTC Casein (A, ohne CaCl 2 Zusatz) und mit Ala pNA (B) gemessen. Kontrollen ohne Inhibitorzusatz wurden als 100 % gesetzt. Es wurden Inhibitoren für Serinproteasen (PMSF, A); Metalloproteasen (PA, EDTA, RB), Cysteinproteasen (E64), Aspartatproteasen (PepA) und Aminopeptidasen (Best) getestet. Der pflanzenspezifische Inhibitorcocktail (Mix, Sigma) enthält sechs verschiedene Protease inhibitoren (A, PA, PepA, Leupeptin, Best und E64). PMSF hemmt neben Serin auch Cystein proteasen und EDTA hemmt neben Metalloproteasen auch Ca 2+ aktivierte Proteasen. (n=3) Asterisk zeigt an, dass sich die Aktivität in Gegenwart eines Inhibitors signifikant von der Kontrolle unterscheidet (p<0,05). A – AEBSF, PA – 1,10 Phenanthrolin, RB – RB3014, PepA – Pepstatin A, Best – Bestatin
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A
B
Abbildung 3-14: Einfluss von Inhibitoren auf die PM-assoziierte Endo- und Exopeptidaseaktivität aus Tabakwurzeln in Abhängigkeit der Stickstoffernährung. Die PM PM PM proteolytische Aktivität von Nt Prot 2mM (□), Nt Prot 10mM (■) und Nt Prot 25mM (■) wurde mit FTC Casein (A, ohne CaCl 2 Zusatz) und mit Ala pNA (B) gemessen. Kontrollen ohne Inhibitorzusatz wurden als 100 % gesetzt. Getestet wurden Inhibitoren für Serinproteasen (PMSF, A); Metallo proteasen (PA, EDTA, RB), Cysteinproteasen (E64), Aspartatproteasen (PepA) und Aminopeptidasen (Best). Der pflanzenspezifische Inhibitorcocktail (Mix, Sigma) enthält sechs verschiedene Protease inhibitoren (A, PA, PepA, Leupeptin, Best und E64). PMSF hemmt neben Serin auch Cystein proteasen und EDTA hemmt neben Metalloproteasen auch Ca 2+ aktivierte Proteasen. (n=3) Asterisk PM PM zeigt an, dass sich die Aktivität der Nt Prot 2mM bzw. Nt Prot 25mM in Gegenwart eines Inhibitors PM signifikant von der Nt Prot 10mM unterscheidet (p<0,05). A – AEBSF, PA – 1,10 Phenanthrolin, RB RB3014, PepA – Pepstatin A, Best – Bestatin
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3.3.2 Einfluss zweiwertiger Kationen
PM Es wurde die Proteaseaktivität der Nt Prot 10mM mit FTC Casein in Gegenwart verschiedener Metallionen getestet. Die spezifische Proteaseaktivität der Kontrolle ohne Zusätze wurde dazu 100 % gesetzt (siehe Tabelle 3 5). Die Metallionen wurden als Sulfatsalze mit Endkonzentrationen von 1 M, 100 M und 2 mM getestet. Um den Einfluss des Sulfates bewerten zu können, wurde Ca 2+ zusätzlich als Chloridsalz getestet.
Keines der getesteten Metallionen erhöhte signifikant die Aktivität der PM assoziierten Proteasen aus Tabakwurzeln. Ca 2+ und Mg 2+ zeigten als einzige auch bei 2 mM keine deutlichen Effekte. Für alle weiteren getesteten Metallionen wurde PM ausschließlich eine hemmende Wirkung auf Nt Prot 10mM gemessen, wobei die Stärke der Hemmung von der eingesetzten Konzentration des jeweiligen Metallions abhing. Zn 2+ , das sich im aktiven Zentrum von Metalloproteasen befindet (Beynon und Bond, 2001), zeigte sogar mit einer Endkonzentration von 1 M die stärkste Inhibition.
Tabelle 3-5 Effekt von Metallionen auf die PM-assoziierte Proteaseaktivität von Tabakwurzeln. PM Nt Prot 10mM wurde mit unterschiedlichen Metallionenkonzentrationen bei pH 7,8 ohne CaCl 2 im Test gemessen. Als Kontrolle diente ein Ansatz ohne Zusätze, dessen Aktivität als 100 % gesetzt wurde. Die spezifische Aktivität der Kontrolle betrug 25,72 ± 3,3 g FTC Casein h 1 mg Protein 1. Ein Ansatz 1 1 mit 5 mM CaCl 2 zeigte eine spezifische Aktivität von 23,11 ± 0,3 g FTC Casein h mg Protein (90,9 ± 12%). (n=3) Spezifische Proteaseaktivität [ g FTC Casein h 1 mg PM Protein 1]
Zusätze 2 mM 100 M 1 M
CaCl 2 27,6 ± 5,7 (107 ± 10 %) 26,9 ± 5,8 (104 ± 12 %) 26,2 ± 6,8 (101 ± 12 %)
CaSO 4 27,8 ± 4,8 (108 ± 6 %) 23,4 ± 4,3 (90 ± 5 %) 24,5 ± 3,8 (95 ± 4 %)
MgSO 4 29,2 ± 5,6 (113 ± 14 %) 24,5 ± 4,3 (95 ± 6 %) 24,5 ± 4,5 (95 ± 5 %)
NiSO 4 6,4 ± 3,1 (29 ± 11 %) 12,5 ± 5,5 (56 ± 14 %) 20,4 ± 5,0 (94 ± 3 %)
MnSO 4 4,1 ± 0,9 (21 ± 7 %) 17,0 ± 6,8 (80 ± 11 %) 20,2 ± 5,3 (97 ± 1 %)
CoSO 4 1,3 ± 0,7 (5 ± 3 %) 18,8 ± 0,5 (74 ± 7 %) 25,8 ± 2,5 (101 ± 5 %)
CuSO 4 7,7 ± 2,2 (30 ± 9 %) 11,0 ± 1,8 (43 ± 5 %) 22,5 ± 3,9 (87 ± 4 %)
ZnSO 4 0,5 ± 0,5 (2 ± 2 %) 6,2 ± 2,0 (24 ± 5 %) 19,9 ± 3,2 (77 ± 5 %)
Fe 2SO 4 0,3 ± 0,2 (1 ± 1 %) 12,0 ± 6,0 (55 ± 12 %) 18,0 ± 5,0 (86 ± 3 %)
Die in Pflanzen nachgewiesenen Ca 2+ abhängigen Proteasen gehören zum Cysteintyp (Margis und Margis Pinheiro, 2003). Anhand der Inhibitortests konnte zwar dieser Proteasetyp nicht an der PM nachgewiesen werden, jedoch hatte EDTA einen PM stimulierenden Einfluss auf die caseinolytische Aktivität der Nt Prot 10mM gezeigt (siehe Abbildung 3 13, A). Weitere Messungen hatten zudem auf einen Zusammenhang zwischen der Nitraternährung der Tabakpflanzen und dieser mit EDTA hemmbaren Aktivität an
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PM Vesikeln hingewiesen (siehe Abbildung 3 14, A). Aus diesem Grund wurde für II II II proteolytisch aktive Fraktionen der Nt Prot 2mM , Nt Prot 10mM bzw. Nt Prot 25mM geprüft, ob der Ca 2+ Effekt einer der angereinigten und über Gelelektrophorese fraktionierten Proteaseformen zugeordnet werden könnte. Dazu wurden die Proteaseaktivitäten zymographisch sowohl in Gegenwart von 5 mM CaCl 2 als auch von 10 mM EDTA getestet (siehe Abbildung 3 15). Mit beiden Zusätzen wurden in Abhängigkeit von der Nitraternährung unterschiedliche Bandenmuster nachgewiesen.
Fraktionierung von Nt Prot II in Abhängigkeit von der Nitraternährung 2 mM 10 mM 25 mM 2 mM 10 mM 25 mM
kDa CaCl 2 EDTA
220
170
116
76
53
Abbildung 3-15: Zymographie der angereinigten PM-gebundenen Nt-Prot II verschiedener Nitratanzuchten in Abhängigkeit von CaCl 2. AC Fraktionen mit proteolytischer Aktivität wurden vereinigt und das Volumen mittels Membranfiltration (MWCO 10 kDa) eingeengt. Die SDS PAGE wurde unter nicht reduzierenden Bedingungen durchgeführt. Die mit Buchstaben markierten Aktivitätsbanden sind im Text erläutert. (n=1)
Vier proteolytisch aktive Polypeptide (app. MW 125 (c) , 118 (d) , 106 (e) und 97 kDa (g) , siehe Tabelle 3 6, kleine Buchstaben verweisen auf Markierungen siehe Abbildung 3 15) II (c) 2+ wurden für Nt Prot 2mM nachgewiesen, wobei die Bande mit 125 kDa durch Ca stimuliert II wurde. Im Vergleich zu den anderen Nitratanzuchten zeigte in Nt Prot 2mM auch eine Proteinbande mit einem app. MW von 102 kDa (f) höhere Aktivität, deren Aktivitätsstärke II II durch EDTA nicht beeinflusst wurde. Sowohl für Nt Prot 10mM als auch für Nt Prot 25mM wurden dagegen zwei Banden mit einem app. MW von 192 (a) und 175 kDa (b) in Gegenwart von EDTA detektiert, die mit Ca 2+ nicht nachgewiesen werden konnten. Zudem wurden für II (h) (i) Nt Prot 10mM proteolytisch hochaktive Polypeptide im Bereich von 90 bis 65 kDa sowohl 2+ II mit Ca als auch mit EDTA gemessen. Diese Polypeptide wurden auch bei Nt Prot 25mM
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gefunden, allerdings mit verminderter Aktivität. Im Vergleich zu den anderen II Nitraternährungen zeigte Nt Prot 25mM speziell nur eine aktive Bande mit einem app. MW von (j) 46 kDa , deren Aktivität sowohl mit CaCl 2 als auch mit EDTA als hoch eingeschätzt wurde.
Ähnlich den Inhibitormessungen deuteten auch diese Resultate auf einen Einfluss der Nitratversorgung der Pflanzen hinsichtlich der Präsenz einzelner Proteaseformen hin.
Tabelle 3-6: Apparentes Molekulargewicht proteolytisch aktiver Polypeptide der Nt-Prot II II unterschiedlicher Nitraternährung in Abhängigkeit von CaCl 2. AC Fraktionen der Nt Prot der unterschiedlichen Nitraternährungen wurden vereinigt und mittels nicht reduzierender SDS PAGE aufgetrennt. Die proteolytische Aktivität wurde zymographisch in Gegenwart von 5 mM CaCl 2 bzw. 10 mM EDTA (siehe Abbildung 3 15) detektiert. Die Aktivitätsstärke wurde visuell eingeschätzt als hoch (++), gut sichtbar (+), kaum nachweisbar (±) und nicht vorhanden ( ). Proteaseaktivität Tabakpflanzen 2 mM Nitrat 10 mM Nitrat 25 mM Nitrat kultiviert mit Testzusatz CaCl 2 EDTA CaCl 2 EDTA CaCl 2 EDTA App. MW [kDa] 192 (a) + + 175 (b) ± + ± + 151 + + + + + + 134 + + + 125 (c) ++ + 118 (d) + 115 + ± 106 (e) + + 102 (f) ++ ++ + + + 97 (g) + 90 (h) ++ ++ + + 83 ++ ++ + + 65 (i) + ++ ++ + + 60 + + + 51 + + + 46 (j) + + + + ++ ++ 44 + + + + 28 + 19 + +
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3.3.3 Massenspektrometrische Analyse verschiedener Proteaseformen von Gerste
II.b Die Anreinigung der PM gebundenen Hv Prot 5mM fand in Gegenwart verschiedener Detergenzien statt. Vortests hatten jedoch gezeigt, dass die verwendeten Detergenzien Lubrol und Triton X 114 trotz spezieller Waschschritte nicht aus der Probe entfernt werden konnten (siehe Kap. 2.2.16b) und die Ionisierung der zu analysierenden Peptidfragmente störten. Alle massenspektrometrisch analysierten Proben wurden deshalb ausschließlich mit Octylglucosid angereinigt.
a) Analyse solubilisierter PM-Proteine von Gerstewurzeln
In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Dr. H.P. Mock (IPK Gatersleben) wurde getestet, ob Elastase im Vergleich zum Standardenzym Trypsin (Fischer und Poetsch, 2006) besser für den Verdau solubilisierter PM Proteine von Gerstewurzeln geeignet sei. Die mit der SwissProt Datenbank (Viridiplantae) verglichenen Ergebnisse lieferten insgesamt 68 Proteine, wovon 21 nur nach dem Trypsinverdau bzw. 30 nur nach dem Elastaseverdau identifiziert wurden (siehe Abbildung 3 16 bzw. Tabelle 3 7). Es gab keinen Hinweis auf eine Protease, jedoch wurden dreizehn P Typ H+ ATPasen, vier V Typ H+ ATPasen und neun weitere Enzyme detektiert. Dazu zählten zwei Aldehydoxidasen, eine Methyltransferase, eine Cellulosesynthase, eine RNA Polymerase, eine Glukosidase, eine Phosphoenolpyruvat carboxylase und zwei Maturasen. Desweiteren wurden vierundzwanzig Aquaporine (PM intrinsische Proteine), ein ABC Transporter und siebzehn weitere Proteine gefunden (siehe Tabelle 3 7). Membrangebundene Proteine 3 wurden sowohl nach Trypsin als auch nach Elastaseverdau detektiert.
21 17 30
Trypsinverdau Elastaseverdau Abbildung 3-16: Vergleich massenspektrometrisch analysierter PM-Proteine nach Trypsin- und Sol Elastaseverdau. Hv Prot 5mM wurde mit Chloroform/Methanol gefällt und entweder mit Trypsin oder Elastase verdaut. Es wurde die Datenbank SwissProt (Viridiplantae) verwendet (siehe Tabelle 3 7) und es wurden die Ergebnisse von 5 Messungen vereinigt.
3 Informationen hinsichtlich der Proteinlokalisierung wurden von UniProt und BRENDA (EC-Nummern) bezogen
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Sol Tabelle 3-7: Massenspektrometrisch identifizierte Proteine der solubilisierten PM-Proteine von Gerstewurzeln. Hv Prot 5mM wurde mit Chloroform/Methanol gefällt und entweder mit Trypsin (T) oder Elastase (E) verdaut. Es wurde die Datenbank Viridiplantae 1 verwendet. Auswahlkriterien: Vorhandensein von mindestens zwei Peptiden eines Proteins innerhalb einer Probe. Membrangebundene Proteine wurden grau markiert.
Proteineintrag (gekürzt) Zugangs ID a DB MW Verdau Uni ID b GRAVY TMD Lokalisierung c Zusatzinformationen laut Eintrag [kDa] C P Mi V O M PM A
Oxidoreduktasen Aldehydoxidase ALDO1_ORYSJ V 145 E Q7XH05 0,020 0/0 EC 1.2.3.1, Oxidase 1, vermutlich ’’ ALDO2_ORYSJ V 145 E Q852M1 0,050 0/0 EC 1.2.3.1, Oxidase 1, vermutlich
Transferasen Histon Lysin N Methyltransferase ASHH2 ARATH V 193 E Q2LAE1 0,774 1/0 X EC 2.1.1.43, ASHH2 Cellulosesynthase ähnliches Protein CSLD3_ARATH V 129 E Q9M9M4 0,209 8/8 X X X EC 2.4.1. , Protein D3
Hydrolasen RNA Polymerase II CPL3_ARATH V 136 E Q8LL04 0,514 1/0 X X X X X EC 3.1.3.16, Phosphatase ähnliche Domäne Beta Glukosidase 1 BGL01 ORYSJ V 58 E Q5QMT0 0,256 1/0 X X X X X EC 3.2.1.21 P Typ H+ ATPase PMA1_ARATH V 104 T, E P20649 0,077 10/10 X X X X EC 3.6.3.6, ATPase 1 ’’ PMA3_ARATH V 104 T P20431 0,052 10/8 X X EC 3.6.3.6, ATPase 3 ’’ PMA4_NICPL V 105 T, E Q03194 0,048 10/9 X X EC 3.6.3.6, ATPase 4 ’’ PMA5_ARATH V 105 T, E Q9SJB3 0,066 10/10 X X EC 3.6.3.6, ATPase 5 ’’ PMA6_ARATH V 105 T, E Q9SH76 0,028 10/9 X X EC 3.6.3.6, ATPase 6 ’’ PMA7_ARATH V 106 T Q9LY32 0,056 10/7 X X EC 3.6.3.6, ATPase 7 ’’ PMA8_ARATH V 104 T, E Q9M2A0 0,077 10/9 X X EC 3.6.3.6, ATPase 8 ’’ PMA9_ARATH V 105 T, E Q42556 0,005 10/8 X X X EC 3.6.3.6, ATPase 9 ’’ PMA10_ARATH V 105 T Q43128 0,139 12/9 X X X X EC 3.6.3.6, ATPase 10 ’’ PMA1_ORYSJ V 105 T, E Q7XPY2 0,084 10/9 X X EC 3.6.3.6 ’’ PMA4_ARATH V 106 T Q9SU58 0,128 10/8 X X EC 3.6.3.6, ATPase ’’ PMA_AVESA V 11 T Q7M290 0,229 0/0 X X EC 3.6.3.6, Fragment ’’ PMAX_ARATH V 90 T Q9T0E0 0,192 9/9 X X EC 3.6.3.6, mutmaßlich
V Typ H+ ATPase VATA_ARATH V 69 T O23654 0,172 0/0 X X X X X EC 3.6.3.14, UE A, Protease bindend ’’ VATA_HORVU V 64 T Q40002 0,198 0/0 X X EC 3.6.3.14, UE A, Fragment ’’ VATB2_GOSHI V 43 T Q43433 0,289 0/0 X X EC 3.6.3.14, UE B2, Fragment ’’ VATB2_ARATH V 54 T Q9SZN1 0,273 0/0 X X X EC 3.6.3.14, UE B2
Lyasen Phosphoenolpyruvatcarboxylase 2 CAPP2_CHLRE V 131 E Q6R2V6 0,285 1/0 X X X X EC 4.1.1.31, Clamydomonas (B)
Weiteres Enzym Maturase K MATK_LABPU V 61 E Q6PSC4 0,085 4/0 X Intron Maturase ’’ MATK_ARCUU V 60 E Q71ML5 0,140 2/0 X Intron Maturase
Transporter / Kanäle ABC Transporter (Familie B) AB9B_ARATH V 145 E Q9M0M2 0,142 12/9 X Protein 9 Aquaporin (PM intrinsisches Protein) PIP11_ARATH V 31 T, E P61837 0,367 6/6 X X X X PIP1;1 ’’ PIP11_ORYSJ V 31 T, E Q6EU94 0,374 6/6 X PIP1;1 ’’ PIP12_ORYSJ V 31 T, E Q7XSQ9 0,350 6/6 X PIP1;2, vermutlich ’’ PIP13_ARATH V 31 E Q08733 0,381 6/6 X X X PIP1;3 ’’ PIP13_ORYSJ V 31 E Q9SXF8 0,398 6/6 X X PIP1;3
70 1Swissprot90_viridaeplantae (http://www.uniprot.org/uniref/?query=uniprot%3a%28viridiplantae%29+identity%3a0.9&format=*, Stand: 07.2010, mit auf 90 % reduzierter Sequenzredundanz
Proteineintrag (gekürzt) Zugangs ID a DB MW Verdau Uni ID b GRAVY TMD Lokalisierung c Zusatzinformationen laut Eintrag [kDa] C P Mi V O M PM A
Transporter / Kanäle (weiter) Aquaporin (PM intrinsisches Protein) PIP14_ARATH V 31 E Q39196 0,378 6/6 X X PIP1;4, vermutlich ’’ PIP16_MAIZE V 31 E Q9ATN0 0,432 6/6 X PIP1;6 ’’ PIP21_ARATH V 30 E P43286 0,506 6/6 X X X X PIP2;1 ’’ PIP22_MAIZE V 30 E Q9ATM8 0,551 6/6 X X PIP2;2 ’’ PIP23_MAIZE V 30 T, E Q9ATM7 0,470 6/6 X X PIP2;3 ’’ PIP24_MAIZE V 30 T, E Q9ATM6 0,476 6/6 X X PIP2;4 ’’ PIP24_ORYSJ V 30 E Q8GRT8 0,580 6/7 X X PIP2;4 ’’ PIP24_ARATH V 31 T, E Q9FF53 0,490 6/6 X X PIP2;4, vermutlich ’’ PIP25_ARATH V 31 T, E Q9SV31 0,506 6/6 X X PIP2;5, vermutlich ’’ PIP26_ARATH V 31 E Q9ZV07 0,462 6/6 X X PIP2;6, vermutlich ’’ PIP26_ORYSJ V 30 E Q7XLR1 0,483 6/6 X X PIP2;6, vermutlich ’’ PIP27_ARATH V 30 T, E P93004 0,451 6/6 X X X X PIP2;7 ’’ PIP27_ORYSJ V 30 E Q651D5 0,602 6/6 X X PIP2;7, vermutlich ’’ PIP27_MAIZE V 31 T, E Q9ATM4 0,324 6/6 X X PIP2;7 ’’ PIP28_ORYSJ V 29 E Q7Y1E6 0,488 6/6 X X PIP2;8, vermutlich ’’ PIP28_ARATH V 30 T, E Q9ZVX8 0,521 6/6 X X PIP2;8, vermutlich ’’ PIP1_ATRCA V 30 E P42767 0,490 6/6 X PIP Typ ’’ PIP2_PEA V 31 E P25794 0,405 6/5 X X PIP Typ 7a, vermutlich ’’ PIP1_SOLLC V 31 E Q08451 0,385 6/6 X X PIP Typ pTOM75, vermutlich
weitere Proteine Glycinreiches Zellwandstrukturprotein GRP1_PETHY V 29 E P09789 0,128 9/1 X Protein 1 Elongationsfaktor 1 alpha EF1A_ARATH V 50 T P13905 0,325 0/0 X X X X X X X EF1A Phytochrom B PHYB_ARATH V 129 T P14713 0,112 1/0 X X X Protein mit B3 Domäne Y7633_ORYSJ V 106 E Q0D5G4 0,823 1/0 X SCAR ähnliches Protein 2 SCRL2_ORYSJ V 144 E Q5QNA6 0,706 0/0 X SEC12 ähnliches Protein 1 PHF1_ARATH V 44 T Q8GYE0 0,143 1/1 X X X Tbc2 Translationfaktor TBC2_CHLRE V 115 E Q8VXP3 0,106 0/0 X Clamydomonas (B) Protein “TIME FOR COFFEE” TIC_ARATH V 164 E Q94KE2 0,819 1/0 X Transsplicingfaktor Raa3 RAA3_CHLRE V 180 E Q9FEC4 0,099 2/0 X Clamydomonas (B) ribosomales Protein RR4_STIHE V 340 T Q06SJ3 0,401 0/0 X Strukturprotein, 30S S4 ’’ RS16_ORYSJ V 17 T Q0IQF7 0,384 0/0 X Strukturprotein, 40S S16 ’’ RS31_ARATH V 28 T Q9SIP7 0,083 0/0 X X X X Strukturprotein, 40S S3 ’’ RLA0_MAIZE V 35 T O24573 0,072 1/0 Strukturprotein, 60S P0 ’’ RLA0_ORYSJ V 34 T P41095 0,056 1/0 Strukturprotein, 60S P0 ’’ RL51_ORYSJ V 35 T Q0JGY1 0,796 2/0 Strukturprotein, 60S L5 ’’ RL51_ARATH V 34 T Q8LBI1 0,748 2/0 X X X X X Strukturprotein, 60S L5 ’’ RL12_PRUAR V 18 T O50003 0,278 0/0 Strukturprotein, 60S L12
a nach verwendeter Datenbank (DB): V – Viridiplantae b nach UniProtKB/SwissProt; Uni ID – Zugangs ID; GRAVY – Hydrophobizitätsindex nach ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/), TMD – transmembrane Domänen wurden nach zwei Algorithmen berechnet (x/y), x = HMMTOP (http://www.tcdb.org/progs/TMS.php) bzw. y = TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM 2.0/) c nach Eintrag bei UniProt oder BRENDA X (EC Nummer, brenda enzymes.org/); C – Cytosol/Cytoplasma; P – Plastid/Chloroplast; Mi – Mitochondrium; V – Vakuole; O – andere Organelle (z.B. Peroxisom, Nukleus, Endoplasmatisches Retikulum, Glyoxysom); M – Membran/Endomembran; PM – Plasmamembran; A – Apoplast inklusive Zellwand weitere Abkürzungen: UE – Untereinheit, B – bakteriell 71
ERGEBNISSE
II b) Analyse der fraktionierten Hv-Prot 5mM
II Die ausschließlich in Gegenwart von Octylglucosid angereinigte Hv Prot 5mM wurde chromatographisch fraktioniert (siehe Anhang Abbildung 7 6). Ausgewählte Fraktionen wurden mit Chloroform/Methanol gefällt und in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Hecker (Universität Greifswald) nach einem tryptischen Verdau II.a massenspektrometrisch analysiert. Für die Hv Prot 5mM wurden fünf Enzyme detektiert, wovon vier zu den V Typ H+ ATPasen gehörten. Das fünfte Enzym war eine Trypsinvorstufe (Serinendoprotease), die vermutlich durch das Verdauungsenzym in die Probe gelangt ist. Zusätzlich wurden Aquaporine, Chaperone, ein Salzstress induziertes Protein, ein blaues kupferbindendes Protein, ein Lipoprotein und ein Porenprotein der äußeren Membran, zuckerbindende periplasmatische Proteine, ribosomale Proteine sowie ein uncharakterisiertes Protein nachgewiesen (siehe Anhang Tabelle 7 1). Im Vergleich zu den Sol + Treffern der Hv Prot 5mM wurden eine V Typ H ATPase (Q40002) und zwei Aquaporine (P93004, Q08733) in dieser Probe wiedergefunden.
II.b In der Hv Prot 5mM wurden fast doppelt so viele Proteine massenspektrometrisch detektiert. Darunter waren zehn Enzyme: drei P Typ H+ ATPasen, drei V Typ H+ ATPasen, eine Phosphoinositol spezifische Phospholipase C, eine Dihydrolipoamiddehydrogenase, eine Proteindisulfidisomerase und eine Trypsinvorstufe. Außerdem wurden fünfzehn Aquaporine gefunden, von denen zwei dem Tonoplast intrinsischen Typ (TIP) angehörten. Unter den weiteren fünfzehn detektierten Proteinen waren neun Treffer, die mit Proteinen aus Bakterien korrespondierten. Dazu zählten das Protein Os08g0102100, Chaperone, Elongationsfaktoren, ein Lipoprotein und ein Porenprotein der äußeren Membran sowie ein ribosomales Protein. Schließlich wurden eine Serumalbuminvorstufe und ein Immunoglobulin sowie vier uncharakterisierte Proteine in dieser Probe nachgewiesen (siehe Tabelle 3 8). Dem vermeintlich uncharakterisierten Protein A2Y3I6 (siehe Tabelle 3 8, hellgrau unterlegt) wird anhand von Sequenzhomologien Aminopeptidaseaktivität vom Metallotyp zuge schrieben (Sequenznachweis: Wang et al. , 2008b). Es wurde in Reis mit einem MW von Sol II.b 43 kDa gefunden. Im Vergleich zur Hv Prot 5mM wurden in der Hv Prot 5mM eine P Typ H+ ATPase (Q9SH76), eine V Typ H+ ATPase (Q40002) und drei Aquaporine (P93004, Q6EU94, Q7XSQ9) wiedergefunden.
Bis auf die Metalloaminopeptidase und die Trypsinvorstufe (Serinendoprotease) wurde in keiner der massenspektrometrisch analysierten Proben eine Serin oder Metallo II.b endoprotease nachgewiesen. Deshalb wurde die Hv Prot 5mM weiter gelelektrophoretisch fraktioniert und proteolytisch aktive Gelsegmente (siehe Abbildung 3 17, A) entweder mit Trypsin (T), Elastase (E) oder Chymotrypsin (C) verdaut. Die zwei dabei gefundenen
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Serinendoproteasen (Chymotrypsinogen A, Trypsinvorstufe) stammen vermutlich wieder aus dem jeweils zugegebenen Testansatz (siehe Tabelle 3 9). Unter den insgesamt zehn detektierten Enzymen befanden sich neben einer Phospholipase D und vier P Typ H+ ATPasen weiterhin die ß UE der respiratorischen Nitratreduktase, eine Dihydrolipoamid dehydrogenase und eine Peroxidase, die mit Proteinen aus Bakterien korrespondierten. Weiterhin wurden in allen Gelsegmenten außer E1 unabhängig vom verwendeten Verdauungsenzym insgesamt siebzehn Aquaporine nachgewiesen sowie ein Phosphat transporter, ein alkalisches Schockprotein, ein Elongationsfaktor, ein Histon sowie eine Serumalbumin und eine Dermcidinvorstufe. Zudem wurden acht Treffer als vermeintlich uncharakterisierte Proteine eingestuft.
A B
Abbildung 3-17: SDS-PAGE der in Gegenwart von Octylglucosid chromatographisch II.b II.b angereinigten PM-gebundenen Hv-Prot 5mM . A) Ausgewählte Fraktionen der Hv Prot 5mM wurden vereinigt und über Membranfilter (MWCO 10 kDa) eingeengt. Drei Viertel der Probe wurden in einer ca. 2 cm breiten Spur über SDS PAGE aufgetrennt, die Gelspur wurde gedrittelt und in gleichgroße Stücke geschnitten. Eine Teilspur wurde direkt im Proteaseaktivitätstest mit FTC Casein eingesetzt. Ausgewählte Fraktionen der restlichen Gelspuren (*) wurden mit Trypsin (T), Elastase (E) oder Chymotrypsin (C) verdaut und massenspektrometrisch analysiert. B) Ein Viertel der Probe wurde in einer separaten Spur aufgetrennt, fixiert und mit Silbernitrat angefärbt. SG = Sammelgel (n=1)
Anhand der Sequenzvergleiche (HAMAP, InterPro und Pfam) wird dem uncharakterisierten Protein A2XAI5 (siehe Tabelle 3 9, hellgrau unterlegt) aus dem Gel segment T3 Aminopeptidaseaktivität zugeordnet. Es sollte sich um ein cytoplasmatisches Protein handeln, das mit Mn 2+ Ionen interagiert und wiederum den Metalloexopeptidasen zugeordnet wird (Sequenznachweis: Wang et al. , 2008b). Dieses Protein wurde auch in Reis
73 ERGEBNISSE
(Oryza sativa subsp. indica , Poaceae ) anhand von Sequenzanalysen nachgewiesen und das berechnete MW beträgt 61,8 kDa. Für das Gelsegment T3 wurde im Vergleich dazu ein app. MW von 52 bis 57 kDa berechnet.
A
B
Abbildung 3-18: Sequenzvergleich der massenspektrometrisch detektierten Metallo- aminopeptidasen aus Reis mit den zu 90 % identischen Gerstenproteinen. Die Proteinsequenzen für A2XAI5 (A) und A2Y3I6 (B) sowie der ermittelten Gerstenproteine (siehe Tabelle 4 2) wurden von UniProt bezogen und mit der Software BioEdit verglichen. Übereinstimmende Aminosäuren sind grau hervorgehoben. Die über Massenspektrometrie detektierten Peptide sowie die mittels HMMTOP vorhergesagte transmembrane Domäne (TMD) wurden jeweils schwarz markiert. Mit TMHMM wurde keine TMD vorhergesagt.
Die detektierten Peptide der zwei Metalloaminopeptidasen aus Reis (A2Y3I6: IVEGVLSHQLK; VVLSVSNADTK bzw. A2XAI5: GIGESVASVAK) wurden mit der
74 ERGEBNISSE
Proteindatenbank 4 von Gerste verglichen. Mit 90 % Sequenzübereinstimmung wurden zwei uncharakterisierte Proteine ähnlich zu A2XAI5 und ein uncharakterisiertes Protein ähnlich zu A2Y3I6 ermittelt (siehe Abbildung 3 18 bzw. Tabelle 4 2). Die detektierten Peptide sind vollständig in den Gerstenproteinen enthalten und das gefundene Peptid von A2XAI5 scheint spezifisch zu sein. Ein Sequenzvergleich des Peptids mit der SwissProt Datenbank (Proteineinträge verschiedener Organismen einschließlich Bakterien) zeigte nur mit den drei Proteinen (A2XAI5 aus Reis, F2E0T2 und F2DC62 aus Gerste) vollständige Sequenz übereinstimmung.
II.b Insgesamt sechzehn Proteine wurden sowohl in der fraktionierten Hv Prot 5mM als auch in einer der weniger angereinigten PM Proben massenspektrometrisch identifiziert. Dazu zählten die Trypsinvorstufe (P00761), zehn Aquaporine (B0I532, O48517, O48518, Q08733, Q08IH3, Q08IH4, Q08IH5, Q4LDT4, Q9SXF8, Q9ZVX8), zwei P Typ H+ ATPasen (Q5PSM6, Q9SH76), eine Dihydrolipoamiddehydrogenase (P31052) sowie eine Serumalbuminvorstufe (P02768) und ein uncharakterisiertes Protein (A2X6L9), dem eine Glycerophosphodiester Phosphodiesteraseaktivität zugeordnet wird.
Für alle detektierten Proteine wurden zusätzlich der Hydrophobizitätsindex (GRAVY 5) sowie die Anzahl transmembraner Domänen (TMD) anhand zwei verschiedener Algorithmen 6 ermittelt. Der GRAVY sollte einen Hinweis auf die Proteinlöslichkeit und damit auf eine mögliche Membranverankerung geben. Je positiver der Wert, desto hydrophober ist das Protein (Kyte und Doolittle, 1982). Der Index ergibt sich aus dem Quotienten der Summe der einzelnen Hydrophobizitätswerte jeder Aminosäure (nach Kyte und Doolittle, 1982) und der Gesamtanzahl der Aminosäuren des entsprechenden Proteins (Gasteiger et al. , 2005). Der Zusammenhang zwischen positivem GRAVY und TMD wurde für die in Gerste detektierten P Typ H+ ATPasen und Aquaporine (PM bzw. Tonoplast intrinsisch) bestätigt (siehe Anhang Abbildung 7 7).
Der GRAVY allein ist nicht akkurat genug, um Membranproteine vorherzusagen (Mitaku und Hirokawa, 1999). Das zeigt auch die Korrelation des Hydrophobizitätsindex mit der Anzahl berechneter TMD (siehe Anhang Abbildung 7 8) sowohl nach TMHMM als auch nach HMMTOP. Vor allem die detektierten Proteine, für die ein oder zwei TMD vorhergesagt werden, haben einen negativen GRAVY. Zudem gab es Unterschiede in der TMD Vorhersage je nach verwendetem Algorithmus. So wurden für die über Sequenzhomologien nachgewiesenen Metalloaminopeptidasen keine TMD (A2Y3I6) oder nach HMMTOP für A2XAI5 eine TMD vorhergesagt (siehe Abbildung 3 18).
4 NCBI Blastp: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome 5 nach ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/) 6 nach HMMTOP (http://www.tcdb.org/progs/TMS.php) und nach TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM 2.0/)
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II.b II.b Tabelle 3-8: Massenspektrometrisch identifizierte Proteine der Hv-Prot 5mM . Proteolytisch aktive Fraktionen der Hv Prot 5mM wurden mit Chloroform/Methanol gefällt und mit Trypsin verdaut. Für die massenspektrometrische Analyse wurden auch einfach geladene Ionen berücksichtigt. Es wurden die Datenbanken Poaceae 1 (252.158 Einträge) und SwissProt 2 (141.396 Einträge) verwendet. Keratintreffer wurden nicht aufgeführt.
Proteineintrag (gekürzt) Zugangs ID a DB MW Uni ID b GRAVY TMD Lokalisierung c Zusatzinformationen laut Eintrag [kDa] C P Mi V O M PM A
Oxidoreduktase Dihydrolipoamiddehydrogenase gi|1706442 SP 50 P31052 0,144 0/0 X X X EC 1.8.1.4, UE E3, Pseudomonas (B)
Hydrolase Phosphoinositol spezifische Phospholipase C1 E5G605_WHEAT P 57 E5G605 0,560 0/0 X X X X EC 3.1.4.11 , Signaltransduktion Trypsinvorstufe gi|136429 SP 24 P00761 0,111 0/0 X EC 3.4.21.4, Serinendoprotease P Typ H+ ATPase gi|12230459 SP 105 Q9LV11 0,121 10/9 X X EC 3.6.3.6, Protonenpumpe 11 ’’ gi|12230478 SP 105 Q9SH76 0,028 10/9 X X EC 3.6.3.6, Protonenpumpe 6 ’’ Q5PSM6_WHEAT P 105 Q5PSM6 0,102 10/8 X X EC 3.6.3.6
V Typ H+ ATPase Q9FS11_HORVU P 68 Q9FS11 0,208 0/0 X X EC 3.6.3.14 ’’ gi|2493123 SP 64 Q40002 0,198 0/0 X X EC 3.6.3.14, UE A ’’ VATB2_HORVU P 54 Q40079 0,265 0/0 X X EC 3.6.3.14, UE B
Isomerase Proteindisulfidisomerase gi|1709617 SP 56 P80284 0,230 0/0 X X X X EC 5.3.4.1, Vorstufe
Transporter / Kanäle Aquaporin (PM intrinsisches Protein) PIP11_ORYSJ P 31 Q6EU94 0,374 6/6 X PIP1;1 ’’ Q08IH5_HORVU P 31 Q08IH5 0,366 6/6 X PIP1;2 ’’ PIP12_ORYSJ P 31 Q7XSQ9 0,350 6/6 X PIP1;2, vermutlich ’’ O48518_HORVU P 31 O48518 0,417 6/6 X PIP1;3 ’’ Q08IH4_HORVU P 31 Q08IH4 0,395 6/6 X PIP1;4 ’’ O48517_HORVU P 30 O48517 0,459 6/6 X PIP2;1 ’’ B0I531_HORVU P 30 B0I531 0,547 6/6 X PIP2;2 ’’ Q08IH3_HORVU P 30 Q08IH3 0,509 6/6 X PIP2;3 ’’ Q4LDT4_HORVU P 30 Q4LDT4 0,511 6/6 X PIP2;4 ’’ PIP25_MAIZE P 30 Q9XF58 0,546 6/6 X X PIP2;5 ’’ B0I532_HORVU P 30 B0I532 0,601 6/6 X PIP2;5 ’’ gi|32363271 SP 30 P93004 0,451 6/6 X X X X PIP2;7, Salzstress induziert ’’ Q40047_HORVU P 31 Q40047 0,403 6/6 X gehört zur MIP/Aquaporin Familie
Aquaporin (Tonoplast intrinsisches Protein) D2KZ38_HORVD P 26 D2KZ38 0,817 6/6 X HvTIP1;1 ’’ D2KZ41_HORVD P 25 D2KZ41 0,873 6/6 X HvTIP2;3
Weitere Proteine Protein Os08g0102100 Q6Z1Y4_ORYSJ P 61 Q6Z1Y4 0,003 3/1 X Chaperon gi|1168973 SP 96 P44403 0,398 1/0 X ClpB, Haemophilus (B) ’’ gi|6225115 SP 57 Q9ZFD8 0,052 0/0 X Cpn60, Burkholderia (B)
Elongationsfaktor Tu gi|1169498 SP 43 P42481 0,149 0/0 X Thiobacillus (B) ’’ gi|24211678 SP 43 P64025 0,122 0/0 X Brucella (B)
Serumalbumin Vorstufe gi|113576 SP 69 P02768 0,354 0/0 X sekretiert, Mensch Immunoglobulin alpha 1 gi|113583 SP 38 P20758 0,239 0/0 X sekretiert, Gorilla
1 http://www.uniprot.org/uniprot/?query=poaceae&sort=score&format=*, Stand: 09.2011 76 2 http://www.uniprot.org/downloads, UniProtKB/Swiss Prot release 12.0, Stand: 07.2007
Proteineintrag (gekürzt) Zugangs ID a DB MW Uni ID b GRAVY TMD Lokalisierung c Zusatzinformationen laut Eintrag [kDa] C P Mi V O M PM A
Weitere Proteine (weiter) Lipoprotein der äußeren Membran gi|127520 SP 8 P69776 0,314 0/0 X X Murein Lipoprotein, Vorstufe, E. coli (B) ’’ gi|127524 SP 9 P11221 0,541 0/0 X X Murein Lipoprotein, Pseudomonas (B)
Porinprotein F der äußeren Membran gi|585710 SP 34 P37726 0,439 1/1 X X X Vorstufe, Pseudomonas (B) ribosomales Protein gi|12229949 SP 15 Q9XHS0 0,003 0/0 40S, S12
Uncharakterisierte Proteine vermeintlich uncharakterisiertes Protein A2Y3I6_ORYSI P 43 A2Y3I6 0,342 0/0 Aminopeptidase Aktivität, Metallotyp ’’ B8AR20_ORYSI P 435 B8AR20 0,174 3/0 2 Oxosäure Dehydrogenasefamilie ’’ B8B007_ORYSI P 101 B8B007 0,336 0/0 Chaperon, clpA/clpB Familie ’’ C5X550_SORBI P 30 C5X550 0,577 6/7 MIP/Aquaporin Familie
a nach verwendeter Datenbank (DB): SP – SwissProt, P Poaceae b nach UniProtKB/SwissProt; Uni ID – Zugangs ID; GRAVY – Hydrophobizitätsindex nach ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/), TMD – transmembrane Domänen wurden nach zwei Algorithmen berechnet (x/y), x = HMMTOP (http://www.tcdb.org/progs/TMS.php) bzw. y = TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM 2.0/) c nach Eintrag bei UniProt oder BRENDA X (EC Nummer, brenda enzymes.org/); C – Cytosol/Cytoplasma; P – Plastid/Chloroplast; Mi – Mitochondrium; V – Vakuole; O – andere Organelle (z.B. Peroxisom, Nukleus, Endoplasmatisches Retikulum, Glyoxysom); M – Membran/Endomembran; PM – Plasmamembran; A – Apoplast inklusive Zellwand weitere Abkürzungen: UE – Untereinheit, B – bakteriell
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II.b Tabelle 3-9: Massenspektrometrisch identifizierte Proteine der über SDS-PAGE fraktionierten Hv-Prot 5mM . Proteolytisch aktive Fraktionen der II.b Hv Prot 5mM wurden über SDS PAGE fraktioniert und Gelsegmente mit Proteaseaktivität (siehe Abbildung 3 17) für die massenspektrometrische Analyse ausgewählt. Die Proben wurden mit Trypsin (T), Chymotrypsin (C) oder Elastase (E) verdaut. Es wurden drei Datenbanken (DB) verwendet. Treffer mit der DB Poaceae 1 (252.116 Einträge) sind vollständig aufgeführt. Ergebnisse mit DB Viridiplantae 2 (887.277 Einträge) und DB SwissProt 3 (141.396 Einträge) wurden nur angegeben, wenn es sich um noch nicht aufgeführte Proteine handelte. Keratintreffer wurden nicht berücksichtigt.
Proteineintrag (gekürzt) Zugangs ID a DB MW Gelsegment Uni ID b GRAVY TMD Lokalisierung c Zusatzinformationen laut Eintrag [kDa] und Verdau C P Mi V O M PM A
Oxidoreduktasen Respiratorische Nitratreduktase 2 gi|2507077 SP 59 T2 P19318 0,434 0/0 X EC 1.7.99.4, beta UE , E. coli (B) Dihydrolipoamiddehydrogenase gi|1706442 SP 50 T3 P31052 0,144 0/0 X EC 1.8.1.4, UE E3, Pseudomonas (B) Peroxidase/Katalase gi|29427888 SP 80 T2 Q8Z303 0,310 0/0 EC 1.11.1.21, HPI, Salmonella (B)
Hydrolasen Phospholipase D B8BE27_ORYSI P 96 T1 B8BE27 0,438 1/0 X X X X EC 3.1.4.4 Chymotrypsinogen A gi|117615 SP 26 C1 P00766 0,051 0/0 X EC 3.4.21.1, Serinendoprotease Trypsinvorstufe gi|136429 SP 24 T2, T3 P00761 0,111 0/0 X EC 3.4.21.4, Serinendoprotease P Typ H+ ATPase PMA1_WHEAT P 105 T1, T2, T3 P83970 0,101 10/8 X X EC 3.6.3.6, ha1 ’’ Q5PSM6_WHEAT P 105 C1 Q5PSM6 0,102 10/8 X X EC 3.6.3.6 ’’ E1UHJ7_MUSBA P 106 C1 E1UHJ7 0,085 10/8 X X EC 3.6.3.6, pma ’’ gi|12230478 SP 105 T1, T2, T3 Q9SH76 0,028 10/9 X X EC 3.6.3.6, ATPase 6
Transporter / Kanäle Phosphattransporter C7C2W8_HORVD P 57 T2 C7C2W8 0,384 12/12 X Pht 1;9 Aquaporin (PM intrinsisches Protein) A0ZV97_HORVU P 31 T2 A0ZV97 0,391 6/6 X PIP1;1 ’’ PIP12_MAIZE P 31 E2 Q9XF59 0,392 6/6 X PIP1;2 ’’ Q08IH5_HORVU P 31 T2, T3 Q08IH5 0,366 6/6 X PIP1;2 ’’ PIP13_ORYSJ P 31 C1 Q9SXF8 0,398 6/6 X PIP1;3 ’’ O48518_HORVU P 31 C1, T2, E2 O48518 0,417 6/6 X PIP1;3 ’’ gi|1175012 SP 31 C1 Q08733 0,381 6/6 X X X PIP1;3 ’’ Q08IH4_HORVU P 31 T1, T2, E2 Q08IH4 0,395 6/6 X PIP1;4 ’’ Q4LDW9_HORVU P 30 C1 Q4LDW9 0,477 6/6 X PIP2;1 ’’ O48517_HORVU P 30 E2, T1, T2, T3 O48517 0,459 6/6 X PIP2;1 ’’ PIP23_ORYSJ P 30 C1 Q7XUA6 0,509 6/6 X X PIP2;3 ’’ Q08IH3_HORVU P 30 T1, E2 Q08IH3 0,509 6/6 X PIP2;3 ’’ Q4LDT4_HORVU P 31 C1, T2, T3, E2 Q4LDT4 0,511 6/6 X PIP2;4 ’’ B0I532_HORVU P 30 T2, T3 B0I532 0,601 6/6 X PIP2;5 ’’ A9UEC4_WHEAT P 22 T2, T3 A9UEC4 0,562 4/4 X PIP2;6, Fragment ’’ D6PY83_HORVU P 30 C1 D6PY83 0,629 6/6 X PIP2;6 ’’ gi|32363440 SP 30 C1 Q9ZVX8 0,521 6/6 X X PIP2;8, vermutlich ’’ Q93XC3_TRIMO P 15 T1, T3 Q93XC3 0,480 3/3 X PIP2, Fragment
weitere Proteine Alkalisches Schockprotein 23 gi|38604718 SP 19 T2 P0A0P6 0,957 0/0 Staphylococcus (B) Elongationsfaktor Tu gi|24211689 SP 43 T2 P64029 0,251 0/0 X GTPase Aktivität, Staphylococcus (B) Histon H2A1_ORYSJ P 14 T2 Q6ZL43 0,201 0/0 X H2A.1, vermutlich Serumalbuminvorstufe gi|113576 SP 69 T1, T2, T3 P02768 0,354 0/0 X sekretiert, Mensch Dermcidinvorstufe gi|20141302 SP 11 T1, T3 P81605 0,225 1/0 X sekretiert, Preproteolysin, Mensch 78 1 http://www.uniprot.org/uniprot/?query=poaceae&sort=score&format=*, Stand: 03.2011; 2 http://www.uniprot.org/uniprot/?query=viridiplantae&sort=score&format=*, Stand: 03.2011 3 http://www.uniprot.org/downloads, UniProtKB/Swiss Prot release 12.0, Stand: 07.2007
Proteineintrag (gekürzt) Zugangs ID a DB MW Gelsegment Uni ID b GRAVY TMD Lokalisierung c Zusatzinformationen laut Eintrag [kDa] und Verdau C P Mi V O M PM A
Uncharakterisierte Proteine vermeintlich uncharakterisiertes Protein A2XAI5_ORYSI P 62 T3 A2XAI5 0,051 1/0 Aminopeptidase Aktivität, Metallotyp ’’ A2XWD5_ORYSI P 31 T1 A2XWD5 0,350 6/6 MIP/Aquaporinfamilie ’’ A2ZH90_ORYSI P 177 T2, T3 A2ZH90 0,153 0/0 Vesikel vermittelter Transport ’’ A3C895_ORYSJ P 57 T2, T3 A3C895 0,196 0/0 α N Arabinofuranosidase Aktivität ’’ B8A840_ORYSI P 75 T3 B8A840 0,183 4/4 Dolichol PP Oligosaccharid Protein Glykotransferase Aktivität ’’ A2X6L9_ORYSI P 77 T3 A2X6L9 0,003 1/0 Glycerophosphodiester Phosphodiesterase Aktivität ’’ B4G1E1_Maize P 42 T2 B4G1E1 0,233 0/0 ATP Bindung, Cytoskelett unbekanntes Protein 1 UP01_VITRO V 1,4 T1, T2 P86104 0,825 0/0 Fragment
a nach verwendeter Datenbank (DB): SP – SwissProt, P Poaceae b nach UniProtKB/SwissProt; Uni ID – Zugangs ID; GRAVY – Hydrophobizitätsindex nach ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/), TMD – transmembrane Domänen wurden nach zwei Algorithmen berechnet (x/y), x = HMMTOP (http://www.tcdb.org/progs/TMS.php) bzw. y = TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM 2.0/) c nach Eintrag bei UniProt oder BRENDA X (EC Nummer, brenda enzymes.org/); C – Cytosol/Cytoplasma; P – Plastid/Chloroplast; Mi – Mitochondrium; V – Vakuole; O – andere Organelle (z.B. Peroxisom, Nukleus, Endoplasmatisches Retikulum, Glyoxysom); M – Membran/Endomembran; PM – Plasmamembran; A – Apoplast inklusive Zellwand weitere Abkürzungen: UE – Untereinheit, B – bakteriell
79 ERGEBNISSE
3.4 Natürliche Substrate PM-gebundener Proteasen
Proteasen sind im pflanzlichen Stoffwechsel an vielen Reaktionen beteiligt. Sie regulieren neben dem Abbau defekter Proteine auch verschiedene spezifische Reaktionen (van der Hoorn, 2008). Die Kenntnis der natürlichen Substrate der PM gebundenen Proteasen sollte Hinweise auf die physiologischen Funktionen dieser Enzyme in den Wurzeln liefern.
3.4.1 Untersuchungen zur Substratspezifität der PM-gebundenen Proteasen
Natürliche Substrate der PM gebundenen Proteasen könnten sowohl membrangebundene als auch lösliche Proteine sein. Um dies zu klären, wurden die durch endogene Proteolyse von den PM Vesikeln abgespaltenen Proteine/Peptide massenspektrometrisch untersucht. Die mit NaCl gewaschenen PM Vesikel beider Pflanzenarten wurden dazu unter den Proteasetestbedingungen (37 °C; pH 7,8) mit sich selbst inkubiert. Als Kontrolle diente ein Ansatz mit Proteaseinhibitoren. Massenspektrometrisch detektierte Proteine wurden nur dann als Proteasesubstrate erfasst, wenn sie nicht zusätzlich in Gegenwart des Proteaseinhibitorcocktails von den PM Vesikeln abgetrennt wurden.
Insgesamt wurden 72 verschiedene Proteine durch endogene Proteolyse von der PM Nt Prot 10mM abgespalten. Jedoch kann anhand der UniProt Einträge (einschl. BRENDA) geschlossen werden, dass ein Teil der detektierten Proteine auf cytosolische Kontamination zurückgeht (siehe Tabelle 3 10). Die Treffer der Solanaceae Datenbank (S) wurden jeweils für Arabidopsis abgeglichen, um Informationen über den Hydrophobizitätsindex (GRAVY), die TMD und die Lokalisierung zu erhalten (siehe Tabelle 3 10, kursive Angaben). Anhand der Einträge (UniProt; BRENDA) wurde für 19 der 31 nachgewiesenen Enzyme bei Pflanzen eine Membranständigkeit ermittelt. Dazu zählten eine Malatdehydrogenase, eine Mono dehydroascorbatreduktase, eine Quinonreduktase, eine Saccharosesynthase, eine Serin/ Threonin und eine Ca 2+ abhängige Proteinkinase, eine Phospholipase D, zwei P Typ und eine V Typ H+ ATPase, eine ATP Synthase, ein eukaryotischer Initiationsfaktor mit hydrolytischer Aktivität, eine Fruktose 1,6 bisphosphat Aldolase, eine Carboanhydrase sowie eine Enolase. Unter den restlichen 41 Proteinen wurden anhand der Datenbänke neunzehn Treffer als membranständig ausgewiesen. Neben drei Aquaporinen zählten ein 14 3 3 ähnliches Protein, ein Calreticulin, drei Hitzeschock ähnliche Proteine, ein Aktin, ein Ras verwandtes Protein, ein HR induziertes Protein, zwei Plasmamembranpolypeptide, ein
80 ERGEBNISSE
Fasciclin ähnliches Arabinogalaktanprotein, ein lipid assoziiertes Protein, ein SEC14 Protein, ein Clathrin sowie zwei Tubuline dazu.
PM Bei Gerste wurden bei der endogenen Proteolyse von der Hv Prot 5mM 44 Proteine detektiert, worunter sich zwei Aspartatproteinasen (Q401N7, P42210, siehe Tabelle 3 11, hellgraue Markierung) befanden. Insgesamt waren es fünfzehn Enzyme, von denen neun als membranständige Proteine ausgewiesen werden. Dazu zählten eine Lipoxygenase, eine 5 Methyltetrahydropteroyl triglutamat Homocystein Methyltransferase, eine P Typ und zwei V Typ H+ ATPasen, zwei ATP Synthasen, ein YLP Protein sowie eine Acyl CoA Synthetase. Unter den restlichen detektierten Proteinen waren es acht, die an pflanzlichen Membranen nachgewiesen wurden. Dazu zählten zwei MDR ähnliche ABC Transporter, drei Aquaporine, ein GTP bindendes Protein, ein Ras verwandtes sowie ein HR induziertes Protein. Anders als bei Tabak wurden zwölf uncharakterisierte Proteine detektiert, wobei es sich bei dem uncharakterisierten Protein B4FVS2 um eine Signalpeptid prozessierende Peptidase handeln könnte (siehe Tabelle 3 11, hellgraue Markierung). Das Transkript des 19 kDa Proteins wurde bei Mais nachgewiesen (Yu et al. , 2008) und aufgrund von Sequenz homologien (InterPro 7) als integrales Membranprotein mit vermutlich einer TMD (nach HMMTOP und TMHMM) annotiert.
Für 77 % (Gerste) bzw. 90 % (Tabak) der detektierten Proteine wurde ein negativer Hydrophobizitätsindex ermittelt (siehe Anhang Abbildung 7 7, D E) und im Vergleich zu den II.b Proteintreffern der fraktionierten Hv Prot 5mM (32 %) wurde ein höherer Anteil nicht membrangebundener Proteine anhand der Algorithmen berechnet (Gerste 45 %, Tabak 60 %). Der Vergleich zwischen der massenspektrometrischen Analyse der proteolytisch abgespaltenen Proteine und der angereinigten Protease bei Gerste zeigte vier Übereinstimmungen: zwei Aquaporine (A0ZV97, D2KZ41), eine V Typ H+ ATPase (Q40079) und ein uncharakterisiertes Protein (B8A840) mit vorhergesagter Dolichol PP Oligosaccharid Protein Glykotransferaseaktivität.
7 http://www.ebi.ac.uk/interpro/
81 ERGEBNISSE
PM Tabelle 3-10: Massenspektrometrisch identifizierte Proteine der durch endogene Proteolyse abgegebenen Polypeptide der Nt-Prot 10mM . Die proteolytisch von den PM Vesikeln abgegebenen Polypeptide wurden mit TCA gefällt und mit Trypsin verdaut. Für die massenspektrometrische Analyse wurden auch einfach geladene Ionen mit gemessen. Es wurden die Datenbanken (DB) SwissProt (141.396 Einträge)1, Arabidopsis thaliana (100.356 Einträge)2, Solanum lycoperiscum (68.100 Einträge)3 und Nicotiana tabacum (5.558 Einträge)4 verwendet. Proteine, die auch in Gegenwart des Proteaseinhibitorcocktails abgegeben wurden, wurden nicht berücksichtigt. Proteineintrag (gekürzt) Zugangs ID a DB MW Uni ID b GRAVY TMD Lokalisierung c Zusatzinformationen laut Eintrag [kDa] C P Mi V O M PM A
Oxidoreduktasen Malatdehydrogenase gi|11133373 SP 36 O48905 0,046 1/0 X X X X X EC 1.1.1.37 Glukose 6 phosphat Dehydrogenase gi|120732 SP 54 P11411 0,357 0/0 X X X X EC 1.1.1.49 Glycerinaldehyd 3 phosphat Dehydrogenase gi|120669 SP 37 P26518 0,052 0/0 X X X EC 1.2.1.12 Monodehydroascorbatreduktase SGN U315877 S 47 Q9LFA3 -0,064 1/0 X X X X X X X EC 1.6.5.4, NADH Quinonreduktase SGN U316715 S 27 Q6NQE2 -0,034 1/0 X trans Zimtsäure 4 Monooxygenase gi|417863 SP 58 Q04468 0,218 1/0 X X X EC 1.14.13.11, Cytochrom P450 73 CYP73A47v1 A1XEL1_TOBAC N 58 A1XEL1 0,218 1/1 gehört zur Cytochrom P450 Familie
Transferasen 5 Methyltetrahydropteroyl triglutamat gi|8134569 SP 85 Q42662 0,139 0/0 X X EC 2.1.1.14; Vitamin B12 unabhängig Homocystein Methyltransferase Saccharosesynthase SGN U312788 S 93 Q9LXL5 -0,300 0/0 X X X X X X EC 2.4.1.13 Fruktokinase gi|585973 SP 34 P37829 0,133 0/0 X X EC 2.7.1.4 Phosphoglyceratkinase gi|38257842 SP 43 Q88YH5 0,106 1/0 X X X EC 2.7.2.3 Nukleosiddiphosphatkinase 1 NDK1_TOBAC N 16 Q56E62 0,029 1/0 X X X X X EC 2.7.4.6 Serin/Threonin Proteinkinase AT1G06700.1 A 40 Q8H1G6 0,325 0/0 X X EC 2.7.10.2 * Calcium abhängige Proteinkinase SGN U316042 S 61 Q38868 -0,457 0/0 X X X X EC 2.7.11.1, CDPK, Isoform 9 ’’ Q84RP9_TOBAC N 32 Q84RP9 0,154 1/0 Fragment, vermeintlich Proteinkinase 1 Q709M1_TOBAC N 39 Q709M1 0,299 0/0
Hydrolasen Phospholipase D gi|3914361 SP 92 P93400 0,421 0/0 X X X X X EC 3.1.4.4, alpha 1 Endochitinase A CHI1_TOBAC N 35 P08252 0,325 1/0 X X EC 3.2.1.14 P Typ H+ ATPase gi|114332 SP 105 P22180 0,140 10/8 X X EC 3.6.3.6, ATPase 1 ’’ AT3G60330.1 A 106 Q9LY32 0,056 10/7 X X EC 3.6.3.6, AHA7
+ V Typ H ATPase gi|137460 SP 69 P09469 0,209 0/0 X X X X EC 3.6.3.14, UE A ATP Synthase gi|114421 SP 60 P17614 0,088 1/0 X X EC 3.6.3.14, beta Kette Eukaryotischer Initiationsfaktor gi|1170503 SP 47 P41376 0,216 0/0 X X X X EC 3.6.4.13, eIF 4A 1 ’’ IF4A8_TOBAC N 47 P41381 0,208 0/0 EC 3.6.4.13, efF 4A 8
Lyasen Fruktose 1,6 bisphosphat Aldolase SGN U314332 S 43 Q9SJQ9 -0,169 1/0 X X X X X EC 4.1.2.13 * Carboanhydrase SGN U313592 S 28 O64595 -0, 178 0/0 X X X X EC 4.2.1.1 Enolase SGN U312378 S 49 P25696 -0,190 0/0 X X X X X X EC 4.2.1.11, Transkriptionsaktivator
Isomerasen Peptidyl Prolyl cis trans Isomerase B2BF99_TOBAC N 22 B2BF99 0,065 1/0 X X X X EC 5.2.1.8 Protein Disulfid Isomerase P93358_TOBAC N 40 P93358 0,340 1/0 X X X X EC 5.3.4.1
Ligasen Glutaminsynthetase gi|121373 SP 39 P12424 0,379 0/0 X X X EC 6.3.1.2, Glutamat Ammonium Ligase GMP Synthase gi|13627131 SP 57 Q9CFJ0 0,134 0/0 EC 6.3.5.2, Glutamin Amidotransferase 82 1 http://www.uniprot.org/downloads, UniProtKB/Swiss Prot release 12.0, Stand: 07.2007; 2 ftp://ftp.arabidopsis.org/home/tair/Sequences/blast_datasets/TAIR9_blastsets/TAIR9_pep_20090619 3 ftp://ftp.sgn.cornell.edu/proteins/tomato_protein_with_hits.fasta, Stand 07.2007; 4 http://www.uniprot.org/uniprot/?query=taxonomy%3a4097&sort=score&format=*, Stand: 18.11.2011
Proteineintrag (gekürzt) Zugangs ID a DB MW Uni ID b GRAVY TMD Lokalisierung c Zusatzinformationen laut Eintrag [kDa] C P Mi V O M PM A
Transporter / Kanäle Aquaporin (PM intrinsisches Protein) AT4G00430.1 A 31 Q39196 0,378 6/6 X X PIP 1;4, TMP C ’’ AT5G60660.1 A 31 Q9FF53 0,490 6/6 X X PIP 2;4, PIP2F
Aquaporin (Tonoplast intrinsisches Protein) gi|126959 SP 25 P21653 0,930 6/6 X X RB7 5A
Weitere Proteine 14 3 3 ähnliches Protein 1433A_TOBAC N 29 P93342 0,487 0/0 ’’ 1433C_TOBAC N 29 P93343 0,543 0/0 ’’ gi|3023190 SP 29 P93784 0,498 0/0 ’’ AT1G35160.1 A 30 P46077 0,531 0/0 X X
10 kDa Chaperonin gi|116190 SP 10 P0A342 0,093 0/0 X Hitzeschock Protein Cpn10 Calreticulin Q40567_TOBAC N 45 Q40567 1,086 0/0 X Chaperon ’’ AT1G56340.1 A 49 O04151 1,009 1/1 X X X X ’’ gi|11131769 SP 47 Q40401 0,989 1/1 X
Hitzeschock Protein AT5G02500.1 A 71 P22953 0,436 0/0 X X X X X X HSP70 1 ’’ AT5G28540.1 A 74 Q9LKR3 0,463 2/1 X X X X X X HSP70 Familie, BIP1, ATP bindend ’’ BIP4_TOBAC N 74 Q03684 0,467 2/1 X HSP70 Familie, BIP4, ATP bindend ’’ BIP5_TOBAC N 74 Q03685 0,467 2/1 X HSP70 Familie, BIP5, ATP bindend ’’ Q14TB1_TOBAC N 80 Q14TB1 0,582 1/0 HSP90, ATP bindend ’’ AT4G24190.1 A 94 Q9STX5 0,705 0/0 X X X X X HSP90.7, Chaperon ’’ gi|462013 SP 93 P35016 0,721 0/0 X Chaperon, GRP94 Homolog
Aktin ACT5_TOBAC N 37 P93371 0,189 0/0 X Aktin 93, Fragment, ATP bindend ’’ AT1G49240.1 A 42 Q96293 0,181 0/0 X X X X Aktin 8, ATP bindend
Ras verwandtes Protein RABA3 AT1G01200.1 A 26 Q9LNK1 0,251 1/0 X X Arabidopsis RAB GTPase Homolog A3 Elongationsfaktor 2 gi|6015065 SP 94 O23755 0,234 0/0 X GTP bindend HR induziertes Protein 3 AT3G01290.1 A 31 Q9SRH6 0,069 0/0 X X X X Lipoprotein Plasmamembran Polypeptid O49910_TOBAC N 24 O49910 0,191 0/0 X ’’ O49911_TOBAC N 23 O49911 0,357 0/0 X * Annexin Q56D09_TOBAC N 36 Q56D09 0,518 0/0 Calciumion bindend, vermeintlich Fasciclin ähnliches Arabinogalaktanprotein SGN U312614 S 44 Q9LZX4 0,086 3/0 X FLA10, GPI -Anker Lipid assoziiertes Protein SGN U325141 S 27 Q9SIE7 -0,016 1/1 X X besitzt PLAT/LH2 -Domäne Glycinreiches RNA bindendes Protein B2YKT9_TOBAC N 16 B2YKT9 0,834 0/0 * SEC14 SGN U315274 S 59 Q56Z59 -0,639 1/0 X X X Cytosol -Faktorproteinfamilie Ubiquitin Verlängerungsprotein O49906_TOBAC N 18 O49906 0,744 0/0 ribosomales Strukturprotein Ribosomales Protein gi|1173201 SP 16 P46295 0,450 0/0 ribosomales Strukturprotein, 40S ’’ Q9FSF6_TOBAC N 21 Q9FSF6 0,461 0/0 ribosomales Strukturprotein, 50S ’’ AT2G44120.2 A 29 F4IT48 0,446 1/0 ribosomales Strukturprotein, 60S
Clathrin AT3G11130.1 A 193 Q0WNJ6 0,156 0/0 X X Protein bindend, schwere Kette Histon Q8H0G7_TOBAC N 15 Q8H0G7 0,279 0/0 X DNA bindend, H2A ’’ AT2G28720.1 A 17 Q9SI96 0,677 0/0 X DNA bindend, H2B ’’ gi|462243 SP 11 P35057 0,550 0/0 X DNA bindend, H4
Tubulin gi|267069 SP 50 P29510 0,195 0/0 X X X X X GTPase Aktivität, alpha 2/alpha 4 Kette ’’ gi|8928421 SP 50 Q43697 0,345 0/0 X GTPase Aktivität, beta 5 Kette ’’ AT5G23860.1 A 51 P29516 0,377 0/0 X X GTPase Aktivität, beta 8 Kette
a nach verwendeter Datenbank (DB): SP – SwissProt, A – Arabidopsis thaliana, S – Solanum lycopersicum ; N – Nicotiana tabacum Asterisk markiert Proteine, die mit exsudierten Polypeptiden verglichen werden (siehe Text bzw. Tabelle 3 12 ) b nach UniProtKB/SwissProt; Uni ID – Zugangs ID; kursive Schrift bezieht sich auf Angaben zum homologem Protein bei Arabidopsis , GRAVY – Hydrophobizitätsindex nach ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/); TMD – transmembrane Domänen wurden nach zwei Algorithmen berechnet (x/y), x = HMMTOP (http://www.tcdb.org/progs/TMS.php) bzw. y = TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM 2.0/) c nach Eintrag bei UniProt oder BRENDA X (EC Nummer, brenda enzymes.org/); C – Cytosol/Cytoplasma; P – Plastid/Chloroplast; Mi – Mitochondrium; V – Vakuole; O – andere Organelle (z.B. Peroxisom, Nukleus, Endoplasmatisches Retikulum, Glyoxysom); M – Membran/Endomembran; PM – Plasmamembran; A – Apoplast inklusive Zellwand (zusätzliche Abkürzungen: UE – Untereinheit, HR – hypersensitive Reaktion) ERGEBNISSE
PM Tabelle 3-11: Massenspektrometrisch identifizierte Proteine der durch endogene Proteolyse abgegebenen Polypeptide der Hv-Prot 5mM . Die proteolytisch von den PM Vesikeln abgegebenen Polypeptide wurden mit TCA gefällt und mit Trypsin verdaut. Für die massenspektrometrische Analyse wurden auch einfach geladene Ionen mit gemessen. Es wurden die Datenbanken (DB) SwissProt (141.396 Einträge)1 und Poaceae (252.116 Einträge)2 verwendet. Proteine, die auch in Gegenwart des Proteaseinhibitorcocktails abgegeben wurden, wurden nicht berücksichtigt. Proteineintrag (gekürzt) Zugangs ID a DB MW Uni ID b GRAVY TMD Lokalisierung c Zusatzinformationen laut Eintrag [kDa] C P Mi V O M PM A
Oxidoreduktasen Glycerinaldehyd 3 phosphat Dehydrogenase gi|120668 SP 33 P08477 0,212 0/0 X X X EC 1.2.1.12, Fragment Lipoxygenase Q42846_HORVU P 99 Q42846 0,383 1/0 X X X X EC 1.13.11.12
Transferasen 5 Methyltetrahydropteroyl triglutamat gi|8134566 SP 84 O50008 0,141 0/0 X X X X X X EC 2.1.1.14, Vitamin B12 unabhängig Homocystein Methyltransferase
Hydrolasen Aspartatproteinase Q401N7_WHEAT P 54 Q401N7 0,037 2/0 EC 3.4.23, Endopeptidase Aktivität Phytepsinvorstufe (Aspartatproteinase) gi|1168536 SP 54 P42210 0,045 0/0 X EC 3.4.23.40, Endopeptidase Aktivität + P Typ H ATPase Q8H1X2_HORVD P 105 Q8H1X2 0,112 10/8 X X EC 3.6.3.6 + V Typ H ATPase VATB2_HORVU P 54 Q40079 0,265 0/0 X X X X EC 3.6.3.14, UE B2 ’’ B2BA44_WHEAT P 51 B2BA44 0,088 0/0 X X X X EC 3.6.3.14, UE H
ATP Synthase ATPAM_ORYSA P 55 P0C520 0,082 0/0 X X EC 3.6.3.14, alpha UE ’’ Q41534_WHEAT P 59 Q41534 0,062 1/0 X X EC 3.6.3.14, beta UE
YLP Q9ZR97_HORVU P 26 Q9ZR97 0,646 0/0 X ATP Synthese gekoppelter H+ Transport Patatin Klasse 1 Protein B6TD55_MAIZE P 47 B6TD55 0,215 1/0 Phospholipase, Glykoprotein Arabinoxylan Arabinofuranose Hydrolase Q9ATV7_HORVU P 72 Q9ATV7 0,108 0/0 Isoenzyme AXAH II Nukleotidpyrophosphatase / Phosphodiesterase NPP_HORVU P 42 Q687E1 0,572 0/0 X EC 3. . . , Fragment, Glykoprotein
Ligasen Acyl CoA Synthetase A1C0L8_HORVD P 71 A1C0L8 0,027 0/0 X X X EC 6.2.1.3, vermeintlich
Transporter / Kanäle MDR ähnlicher ABC Transporter Q7FMW2_ORYSJ P 139 Q7FMW2 0,134 12/9 X ATP bindend ’’ Q6Z6U9_ORYSJ P 138 Q6Z6U9 0,181 12/9 X ATP bindend, vermeintlich Aquaporin (PM intrinsisches Protein) A0ZV97_HORVU P 31 A0ZV97 0,391 6/6 X X PIP 1;1 ’’ A7J2I1_WHEAT P 30 A7J2I1 0,504 6/6 X X AQP2
Aquaporin (Tonoplast intrinsisches Protein) D2KZ41_HORVD P 25 D2KZ41 0,873 6/6 X TIP 2;3
Weitere Proteine Calmodulin CALM_HORVU P 17 P62162 0,602 0/0 Calciumion bindend Calnexin Q41798_MAIZE P 49 Q41798 0,747 1/1 X Chaperon, Fragment Hitzeschock Protein gi|6016150 SP 73 P24067 0,466 2/1 X HSP70 Familie, BIP2, ATP bindend Aktin ACT1_ORYSJ P 42 Q10DV7 0,185 0/0 X Aktin 1, ATP bindend GTP bindendes Protein YPTM2 YPTM2_MAIZE P 22 Q05737 0,278 0/0 X GTP bindend, Lipoprotein Ras verwandtes Protein ARA 3 gi|114088 SP 24 P28186 0,296 2/0 X X GTP bindend HR induziertes Protein 3 B6D9L4_WHEAT P 32 B6D9L4 0,120 0/0 X Temperatur induziertes Lipocalin 2 Q38JE4_HORVU P 21 Q38JE4 0,618 0/0 Transporter Aktivität Ribosomales Protein RS7_ORYSJ P 22 Q8LJU5 0,536 0/0 X ribosomales Strukturprotein, 40S
1 http://www.uniprot.org/downloads, UniProtKB/Swiss Prot release 12.0, Stand: 07.2007 84 2 http://www.uniprot.org/uniprot/?query=poaceae&sort=score&format=*, Stand: 03.2011
Proteineintrag (gekürzt) Zugangs ID a DB MW Uni ID b GRAVY TMD Lokalisierung c Zusatzinformationen laut Eintrag [kDa] C P Mi V O M PM A
Weitere Proteine (weiter) Histon H2A4_ORYSI P 17 A2Y5G8 0,388 0/0 X DNA bindend, H2A.4 ’’ H2B11_ORYSI P 15 A2WWU2 0,740 0/0 X DNA bindend, H2B.11
Tubulin Gi|8928426 SP 50 Q9ZPP0 0,356 0/0 X GTPase Aktivität, beta 1 Kette
Uncharakterisierte Proteine vermeintlich uncharakterisiertes Protein B9G5W2_ORYSJ P 83 B9G5W2 0,476 1/0 FMN bindend, Oxidoreduktase Aktivität ’’ B4FA76_MAIZE P 49 B4FA76 0,094 2/2 Dolichyl Diphosphat Oligosaccharide Proteinglykosyltransferase Akivität ’’ B8A840_ORYSI P 75 B8A840 0,183 4/4 Dolichyl diphosphat Oligosaccharide Proteinglykosyltransferase Aktivität ’’ B4FVS2_MAIZE P 19 B4FVS2 0,142 1/1 Signalpeptide prozessierende Peptidase ’’ B8BIW4_ORYSI P 73 B8BIW4 0,140 1/0 Alpha N Arabinofuranosidase Aktivität ’’ B9F863_ORYSJ P 74 B9F863 0,109 1/1 Alpha N Arabinofuranosidase Aktivität ’’ A2WXH7_ORYSI P 66 A2WXH7 0,464 2/0 besitzt 1 CRAL TRIO Domäne ’’ B8AYI6_ORYSI P 64 B8AYI6 0,469 2/0 besitzt 1 CRAL TRIO Domäne ’’ A2X036_ORYSI P 73 A2X036 0,471 2/1 ATP bindend, gehört zur HSP70 Familie ’’ A3CE45_ORYSJ P 193 A3CE45 0,168 0/0 Vesikel vermittelter Transport ’’ C5XJD6_SORBI P 15 C5XJD6 0,242 1/1 besitzt Cytochrom b5 Häm bindende Domäne ’’ C5Z1E9_SORBI P 28 C5Z1E9 0,016 4/3 Endoplasmatisches Retikulum
a nach verwendeter Datenbank (DB): SP – SwissProt, P Poaceae b nach UniProtKB/SwissProt; Uni ID – Zugangs ID; GRAVY – Hydrophobizitätsindex nach ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/); TMD – transmembrane Domänen wurden nach zwei Algorithmen berechnet (x/y), x = HMMTOP (http://www.tcdb.org/progs/TMS.php) bzw. y = TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM 2.0/) c nach Eintrag bei UniProt oder BRENDA X (EC Nummer, brenda enzymes.org/); C – Cytosol/Cytoplasma; P – Plastid/Chloroplast; Mi – Mitochondrium; V – Vakuole; O – andere Organelle (z.B. Peroxisom, Nukleus, Endoplasmatisches Retikulum); M – Membran/Endomembran; PM – Plasmamembran; A – Apoplast inklusive Zellwand weitere Abkürzungen: UE – Untereinheit, HR – hypersensitive Reaktion)
85 ERGEBNISSE
Neben den Aspartatproteinasen wurde bei Gerste ein weiterer Proteasetyp gefunden, der jedoch auch in Gegenwart des Proteaseinhibitorcocktails abgegeben wurde und deshalb nicht als Substrat der PM gebundenen Proteasen in der Tabelle aufgeführt ist. Es wurde bisher nur das Transkript dieser Papain ähnlichen Cysteinproteinase (B4ESE8, siehe Anhang Tabelle 7 2) bei Gerste nachgewiesen (Matsumoto et al. , 2011). Nach TMHMM und HMMTOP wird eine N terminale TMD für dieses Protein vorhergesagt. Anhand von Sequenzhomologien wird es der Peptidase C1A Familie (nach InterPro: IPR013128) zugeordnet und enthält einen Proteinaseinhibitor (IPR013201), der als N terminale Domäne durch eine andere Protease oder durch Autolyse abgespalten werden kann.
Zusätzlich wurde geprüft, ob die von den PM Vesikeln über endogene Proteolyse abgespaltenen Proteine/Peptide auch von den Tabakpflanzen exsudiert werden. Polypeptide, die ohne bzw. in Gegenwart von Proteaseinhibitoren von den gewaschenen PM PM Vesikeln von Tabakwurzeln (Nt Prot 10mM ) abgetrennt worden waren, wurden gelelektrophoretisch fraktioniert. 29 Polypeptide wurden mit app. MW von 224 bis 12 kDa gefunden (siehe Tabelle 3 12 bzw. Abbildung 3 19, Spur 1), wovon in Gegenwart des Proteaseinhibitorcocktails nur acht im Bereich von 70 bis 23 kDa abgegeben wurden (siehe Tabelle 3 12 bzw. Abbildung 3 19, Spur 2). Es wurde in dieser Arbeit nie eine vollständige Hemmung der Substratumsetzung weder mit FTC Casein noch mit Ala pNA in Gegenwart des Inhibitorcocktails gemessen, deshalb könnte diese Restproteaseaktivität entweder durch unvollständige Hemmung der PM Proteasen durch den Inhibitorcocktail erklärt werden oder aber die Polypeptide könnten bereits vor der Zugabe der Inhibitoren proteolytisch von den PM Vesikeln abgespalten worden sein.
Um nun zu prüfen, ob die über endogene Proteolyse abgespaltenen Polypeptide in die Rhizosphäre abgegeben werden, wurde das Exsudat von hydroponisch kultivierten Tabakpflanzen chromatographisch in zwei Proteingruppen aufgetrennt und separat über SDS PAGE fraktioniert (siehe Abbildung 3 19, Spur 3 und 4). Es wurden insgesamt 24 Proteinbanden mit app. MW von 137 bis 9 kDa (siehe Tabelle 3 12, Exsudat) gefunden, von denen acht Polypeptide dasselbe app. MW zeigten, wie die proteolytisch von den PM Vesikeln abgegebenen Polypeptide (siehe Punktmarkierungen in Abbildung 3 19). Demnach könnten Polypeptide mit einem app. MW von 119, 61, 59, 28, 23, 17, 14 und 12 kDa Produkte endogener Proteolyse sein, die anschließend exsudiert werden. Mittels Massenspektrometrie waren Proteine mit app. MW von 61 kDa (Calcium abhängige Protein kinase), 59 kDa (SEC14 Protein), 28 kDa (Carboanhydrase) und 23 kDa (PM Polypeptid) nach endogener Proteolyse an Tabak PM Vesikeln nachgewiesen worden (siehe Tabelle 3 10, Asterisk), die nach Literatur an der PM gebunden sind und den exsudierten Polypeptiden entsprechen könnten (siehe Tabelle 3 12, Exsudat Asterisk).
86 ERGEBNISSE
PM Vesikel Exsudat Tabelle 3-12: Apparente Molekular- gewichte abgegebener Polypeptide von 1 2 3 4 PM Nt-Prot 10mM sowie exsudierter Poly- peptide. Angaben zu den Proben siehe Abbildung 3 19. PI steht für Inkubation mit Proteaseinhibitorcocktail. Graue Unterlegung weist auf Polypeptide mit demselben app. MW hin, die sowohl von PM Vesikeln abgetrennt als auch von intakten Tabakwurzeln abgegeben wurden. Asterisk verweist auf massenspektro metrisch detektierte Proteine (siehe Tabelle 3 10).
abgegebene Polypeptide apparentes Molekulargewicht [kDa] PM Vesikel Exsudat ohne PI mit PI 224 165 157 137 130 129 121 119 119 109 100 94 91 85 Abbildung 3-19: Polypeptidabgabe von 83 PM 81 Nt-Prot 10mM und von hydroponisch gewachsenen Tabakpflanzen. Gewaschene 71 PM 70 70 PM Vesikel der Nt Prot 10mM wurden ohne (Spur 1) und mit (Spur 2) Proteaseinhibitor 66 66 64 cocktail inkubiert. Die proteolytisch 63 63 abgespaltenen Polypeptide wurden durch 61 61 61* Zentrifugation von den PM Vesikeln getrennt, 59 59* anschließend über SDS PAGE (5 20 %) aufge 53 trennt und mit Silbernitrat gefärbt. Exsudierte 51 Peptide hydroponisch kultivierter Tabakpflanzen 50 (5 mM Nitratversorgung) wurden chromato 46 46 graphisch in zwei Gruppen (Spur 3 und 4) 44 fraktioniert, über SDS PAGE (5 20 %) aufge 43 trennt und mit Silbernitrat gefärbt. Die markierten 37 Banden weisen auf Polypeptide mit demselben 32 32 apparenten Molekulargewicht hin. 30 28 28* 27 27 25 23 23 23* 21 20 19 17 17 14 14 13 12 12 11 10 9
87 ERGEBNISSE
3.4.2 Proteolytisch aktive Proteine werden endogen von den PM-Vesikeln abgespalten
Für Gerste wurden in den durch endogene PM Proteolyse abgegebenen Polypeptiden erstmals Proteasen identifiziert (siehe Tabelle 3 11). Neben zweier Aspartatproteinasen wurde zusätzlich eine Cysteinproteinase nachgewiesen, die jedoch auch in Gegenwart des Proteaseinhibitorcocktails von den PM Vesikeln dissoziierte (siehe Anhang Tabelle 7 2, B) und daher nicht als Substrat der PM gebundenen Proteasen bestätigt werden konnte. Für Tabak wurde keine über endogene Proteolyse abgegebene Protease ermittelt. Eine zymographische Fraktionierung der abgespaltenen Polypeptide sollte zeigen, ob und wie viele Proteaseformen von den PM Vesikeln freigesetzt werden.
PM PM Sowohl von Nt Prot 10mM als auch von Hv Prot 5mM konnten vier bzw. sechs verschiedene Proteaseformen unterschieden werden (siehe Abbildung 3 20, endogene Proteolyse). Beim Tabak (A) wurden Proteaseformen mit app. MW von 163 1, 115 2, 90 3 und 81 kDa 4 detektiert. Bei der Gerste (B) wurden neben einer Proteaseform mit einem app. MW von 121 kDa 5 fünf weitere niedermolekularere Formen mit app. MW von 64 bis 43 kDa 6 10 im Zymogramm aufgetrennt.
Da es bei der massenspektrometrischen Analyse der mit TCA gefällten proteolytisch abgegebenen Proteine für Tabak keine Hinweise auf Proteasen gab, wurden die durch Proteolyse abgegebenen Proteine/Peptide zunächst über eine SDS PAGE fraktioniert und die Gelsegmente mit höchster caseinolytischer Aktivität erneut massenspektrometrisch analysiert (siehe Anhang Abbildung 7 9). In dem Gelsegment der Tabakprobe mit app. MW zwischen 92 bis 79 kDa wurde das Peptid NYLYHGR nachgewiesen, das mit 90 % Wahrscheinlichkeit einer Ubiquitin spezifischen Protease 22 vom Cysteintyp (siehe Anhang Tabelle 7 3, A, hellgrau unterlegt) zugeordnet wurde. Im Vergleich zur zymographisch detektierten Proteaseaktivität mit Gelatine könnte diese Protease der proteolytischen Bande 3 oder 4 entsprechen (siehe Abbildung 3 20, A, Proteolyse). Bei der Gersteprobe wurde in dem caseinolytisch aktivsten Gelsegment mit app. MW von 112 bis 99 kDa das Peptid AFNPMFDPLLQASKDATNTGVK detektiert, das mit 82 % Wahrscheinlichkeit einer Methionin Aminopeptidase vom Metallotyp (siehe Anhang Tabelle 7 3, B, hellgrau unterlegt) entspricht. Diese Protease könnte der zymographisch detektierten Proteaseform 5 entsprechen (Abbildung 3 20, B, Proteolyse). Da jeweils nur ein Peptid detektiert wurde, sind diese Ergebnisse nicht eindeutig. Zudem wurden mit dem Substrat Gelatine mehr Proteaseformen detektiert als mit FTC Casein.
Sowohl für Tabak als auch für Gerste konnte eindeutig gezeigt werden, dass proteolytisch aktive Enzyme von den PM Vesikeln durch endogene Proteolyse abgespalten werden. Mit Hilfe der massenspektrometrischen Analyse konnten jedoch nur für Gerste
88 ERGEBNISSE
Aspartatproteinasen eindeutig identifiziert werden. Um zu prüfen, ob die durch endogene Proteolyse abgespaltenen Proteasen bereits an den PM Vesikeln aktiv waren oder erst nach der Freisetzung von der PM aktiviert wurden, wurden die nach der Selbstinkubation pelletierten PM Vesikel resuspendiert und mit der Standardmethode solubilisiert. Als Kontrolle wurden jeweils unbehandelte PM Vesikel verwendet, die ebenfalls nach entsprechender Methode solubilisiert worden waren (siehe Abbildung 3 20, Solubilisierung mit Octylglucosid). Es zeigte sich, dass bei Tabak von den vier durch endogene Proteolyse abgespaltenen Proteasen ein gewisser Anteil an den PM Vesikeln zurückbleibt und dass diese PM Proteasen bereits an der PM aktiv vorliegen und nicht durch PM Proteolyse aktiviert werden (siehe Abbildung 3 20, A, Vergleich von endogener Proteolyse mit Solubilisierung mit Octylglucosid).
Bei der Gerste zeigte sich ein völlig anderes Bild. Die sechs proteolytisch abgespaltenen Proteaseformen waren nur noch in stark reduzierter Aktivität oder gar nicht mehr nach der Proteolyse in den solubilisierten PM Pellets detektierbar. Zudem zeigte die Kontrolle eine hochaktive Proteaseform mit einem app. MW von 118 kDa a, die der proteolytisch abgespaltenen Proteaseform mit einem app. MW von 121 kDa 5 entsprechen könnte und die nicht mehr im resuspendierten Pellet messbar war (siehe Abbildung 3 20, B, Solubilisierung mit Octylglucosid). Die Proteasen 6 – 9 (64 – 51 kDa) waren in der Kontrolle (unbehandelte PM Vesikel) nicht nachweisbar. Das deutete daraufhin, dass diese Formen erst durch die Proteolyse aktiviert wurden. Für eine genaue Zuordnung müssten diese verschiedenen Formen weiter über Massenspektrometrie analysiert werden.
Zusätzlich wurde geprüft, ob und wie viele Proteaseformen durch die Behandlung mit NaCl von den PM Vesikeln abgetrennt werden können. Dazu wurden diese Fraktionen ebenfalls gelelektrophoretisch aufgetrennt und zeigten für beide Pflanzenarten verschiedene Proteaseformen (siehe Abbildung 3 20; NaCl). Sowohl bei Tabak als auch bei der Gerste wurden Proteasebanden nachgewiesen, die den über endogene Proteolyse abgetrennten Formen 1 – 4 bzw. 6 – 10 entsprechen könnten. Das könnte auf stattfindende Proteolyse während der Inkubation mit NaCl hinweisen. Einzig die Proteaseform 5 aus Gerste wurde nicht durch NaCl von den PM Vesikeln abgetrennt.
Dieses Ergebnis bestätigte, dass die Proteaseaktivität der PM Vesikel sowohl auf membranintegrale als auch auf membranassoziierte bzw. auch auf eine Kontamination löslicher Proteasen zurückzuführen ist.
89 ERGEBNISSE
Fraktionierung PM assoziierter Proteasen in Abhängigkeit von ihrer Freisetzung von den PM Vesikeln
A Abtrennung von NaCl Endogene Solubilisierung mit der PM durch: Proteolyse Octylglucosid kDa + PI K + PI
212
118
66
43
29
B Abtrennung von NaCl Endogene Solubilisierung mit der PM durch: Proteolyse Octylglucosid kDa + PI K + PI
212
118
66
43
29
Abbildung 3-20: Zymographie PM-assoziierter Proteasen in Abhängigkeit von der Art ihrer PM PM Freisetzung von PM-Vesikeln. Nt Prot 10mM (A) und Hv Prot 5mM (B) wurden unter hypotonischen Bedingungen zweimal mit NaCl gewaschen. Nach Zentrifugation (10 5 x g, 1h) befanden sich im Überstand alle löslichen Proteine. Das PM Pellet wurde resuspendiert (Resuspensionspuffer; 4 mM CaCl 2) und ohne bzw. mit Proteaseinhibitorcocktail (+ PI) 2 h bei 37 °C inkubiert. Durch Zentrifugation (25.000 x g, 1 h) wurden die durch endogene Proteolyse abgespaltenen Polypeptide von der Membranfraktion getrennt. Das PM Pellet wurde resuspendiert und zusammen mit einer Kontrolle (K, unbehandelte PM Vesikel) nach der Standardmethode mit Octylglucosid (± NaCl) solubilisiert. Nach Zentrifugation (25.000 x g, 1 h) wurde der Überstand mit den solubilisierten Proteinen und alle anderen gewonnenen Proteinfraktionen im Zymogramm aufgetrennt. (je n=1)
90 DISKUSSION
4. Diskussion
Mit über 800 im Genom von Arabidopsis kodierten Proteasen, die 30 verschiedenen Clans angehören, sind proteolytische Enzyme an unterschiedlichen Regulations mechanismen beteiligt und damit essentiell für den pflanzlichen Organismus (van der Hoorn, 2008). Sie existieren innerhalb und außerhalb der Zelle und wurden sowohl als lösliche als auch als membrangebundene Formen nachgewiesen (Bond und Butler, 1987). Speziell PM gebundene Proteasen wurden jedoch bisher nur als Glykosyl Phosphatidylinositol verankerte Formen vorhergesagt (GPI Anker; Borner et al. , 2003; Eisenhaber et al. , 2003), wovon experimentell bisher zwei Aspartatproteinasen bestätigt wurden (Elortza et al. , 2003; Elortza et al. , 2006). Über weitere Untersuchungen dieser Formen wurde in der Literatur noch nicht berichtet und auch die Funktionen dieser Proteasen sind noch unbekannt.
Da PM gebundene Exopeptidasen des Menschen bereits besser charakterisiert sind, könnten deren Funktionen auch Hinweise auf die Bedeutung der pflanzlichen PM Proteasen liefern. Zu den Funktionen der tierischen PM Proteasen gehören die Abgabe von Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren in den Blutkreislauf sowie die Prozessierung zirkulierender Signalmoleküle, wobei diese Exopeptidasen auch selbst als Rezeptoren fungieren können (Carl McGrath et al. , 2006). Dabei sind die beschriebenen Formen entweder über transmembrane Domänen (TMD) oder über einen GPI Anker an der extrazellulären Seite der PM gebunden (Antczak et al. , 2001).
4.1 Vielfalt der Proteaseformen an der pflanzlichen Plasmamembran
In dieser Arbeit wurden nun erstmals pflanzliche PM gebundene Proteasen in Tabak und Gerstewurzeln experimentell nachgewiesen. Anhand der spezifischen Substrate werden diese Enzyme den Amino (AP) und Carboxypeptidasen (CP) sowie den Endopeptidasen zugeordnet. In der Gerste wurden von diesen verschiedenen aktiven Proteasen nur zwei eindeutig identifiziert, deshalb kann die Frage nach der Anzahl PM gebundener Proteasen anhand der vorliegenden Ergebnisse nicht vollständig beantwortet werden. Zumindest aber eine weitere Einschränkung der beteiligten Proteasetypen ist möglich (siehe Abbildung 4 1). Biochemisch wurden bei beiden Pflanzenarten Metalloaminopeptidasen (Metallo AP) sowie Serin und Metalloendopeptidasen mit Hilfe von spezifischen Inhibitoren nachgewiesen, wovon aber nur die Metallo AP in der Gerste massenspektrometrisch identifiziert werden konnten. Die zwei detektierten bisher uncharakterisierten Proteine gehören zu den Peptidasefamilien M17 und M24. Die CP Aktivität wurde nicht in Gegenwart von spezifischen
91 DISKUSSION
Inhibitoren getestet, deshalb können hier keine Aussagen über den katalytischen Typ getroffen werden.
Zusätzlich wurden Cystein und Aspartatproteinasen (Endopeptidasen) massen spektrometrisch detektiert, die auf peripher assoziierte oder auf endoproteolytisch abgegebene Proteaseformen zurückgeführt werden könnten und höchstwahrscheinlich als inaktive Vorstufen an den PM Vesikeln existieren. Außerdem wurde in dieser Arbeit in Gegenwart des Proteaseinhibitorcocktails nie eine vollständige Hemmung der Substratumsetzung weder mit FTC Casein noch mit Ala pNA gemessen. Es könnte sich bei dieser proteolytischen Restaktivität um eine weitere ganz bestimmte Proteaseform handeln, die auch für die Freisetzung der Papain ähnlichen Cysteinproteinase verantwortlich sein könnte. Darüber hinaus könnte eine der Metallo AP, ausgehend von diskutierten Beispielen aus der Literatur, zusätzlich Endoproteaseaktivität unter den veränderten Testbedingungen besitzen. Die Cysteinproteinase könnte zusätzlich über Carboxypeptidaseaktivität verfügen (siehe Abbildung 4 1 sowie Abschnitt 4.1c).
Abbildung 4-1: Übersicht der nachgewiesenen Proteasetypen an den PM-Vesikeln aus Gerstewurzeln . Es wurden sowohl die anhand der Inhibitortests nachgewiesen Proteasetypen (fett gedruckt) als auch die massenspektrometrisch nachgewiesenen Formen aufgeführt ( ). Zusätzlich sind mögliche Überschneiden aufgrund mehrfacher Funktionen angedeutet ( ). AP Aminopeptidase
92 DISKUSSION
a) Metalloproteasen
Für die Charakterisierung der PM assoziierten Proteaseaktivität wurden sowohl die Aktivitätsmessungen mit verschiedenen Substraten als auch die Messergebnisse in Gegen wart spezifischer Proteaseinhibitoren herangezogen. Der Nachweis PM assoziierter Metalloproteasen wurde mit Hilfe von Chelatoren zweiwertiger Kationen erbracht. Sowohl 1,10 Phenanthrolin als auch EDTA sind in der Lage, das essentielle Metallion, in den meisten Fällen Zink, aus dem aktiven Zentrum der Metalloproteasen zu entfernen (Beynon und Bond, 2001). Dabei könnte die Aktivitätshemmung in Gegenwart von EDTA auch auf Ca 2+ aktivierte oder Ca 2+ stabilisierte Proteasen anderer Klassen hindeuten. Aus diesem Grund wurde 1,10 Phenanthrolin verwendet, das aufgrund seiner höheren Affinität gegenüber Zink als spezifischer Inhibitor von Metalloproteasen gilt (Beynon und Bond, 2001). Bereits mit einer Konzentration von 1 mM werden Zn 2+ abhängige Proteasen gehemmt, wohingegen diese Konzentration nicht ausreicht, um Ca 2+ von Ca 2+ bindenden Proteinen zu entfernen (Beynon und Bond, 2001). In Anbetracht der zusätzlichen zymographischen Ergebnisse existieren daher vermutlich neben Metalloproteasen auch Ca 2+ regulierte Proteasen an den PM Vesikeln.
Tabelle 4-1: Charakteristika der PM-gebundenen menschlichen Aminopeptidasen, die für die getesteten Exopeptidasesubstrate spezifisch sind.
Enzym Substrat Ref. a EC Nr. b Synonyme b Uni ID c Typ c PF c Zellkomp. c MW [kDa] einer UE c
Aminopeptidase: Aminopeptidase N Ala pNA A, F 3.4.11.2 APN, CD13 P15144 Metallo M1 PM und löslich 110 (hemmbar mit (Cytosol, ER) (Homodimer) RB3014)
Insulin regulierte Leu pNA (nicht B, F 3.4.11.3 IRAP, PLAP Q9UIQ6 Metallo M1 PM und löslich 117 Aminopeptidase hemmbar mit (Cytosol, (Homodimer) RB3014) extrazellular)
Aminopeptidase B Arg pNA C 3.4.11.6 APB, Chlorid Q9H4A4 Metallo M1 sekretiert, 73 aktivierte AP Membrananker (keine unbekannt Angabe)
Dipeptidyl Peptidase IV Gly Pro pNA D 3.4.14.5 DPPIV, CD26 P27487 Serin S9 PM und löslich 88 (extrazellular, (Monomer, „lipid rafts“) Homo /Heterodimer)
Carboxypeptidase: Angiotensin konver MCA Ala E 3.4.17.23 ACE2 Q9BYF1 Metallo M2 PM und löslich 93 tierendes Enzym 2 ProLys Dnp (extrazellular, (keine (Spaltung „lipid rafts“ Angabe) zwischen Ala + Pro) a) Referenzen: A Fournie Zaluski et al. , 1992; B – Toda et al. , 2002; C – Foulon et al. , 1999; D – Krepela et al. , 1983; E Vickers et al. , 2002 ; F – nach Aussage von Prof. U. Lendeckel bzw. Patent WO 2009/024348 A1 b) nach der Peptidase Datenbank: MEROPS (http://merops.sanger.ac.uk/) c) nach Eintrag bei UniProt (http://www.uniprot.org/): Uni ID – Zugangs ID; Typ – Einordnung aufgrund des katalytischen Zentrums, PF – Peptidasefamilie, Einordnung aufgrund von Sequenzhomologien (nach InterPro: http://www.ebi.ac.uk/interpro/); Zellkompartiment – Angabe ob PM gebundene oder lösliche Form und Lokalisierung; Molekulargewichtsangabe (MW) einer Untereinheit (UE) und Angabe zur UE Struktur
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Die Auswahl der verwendeten Exopeptidasesubstrate orientierte sich an bereits nachgewiesenen löslichen AP in Pflanzen (Sopanen und Mikola, 1975; Mitsuhashi et al. , 1984; Tazaki und Ishikura, 1985; Mikkonen und Mikola, 1986) sowie an untersuchten tierischen Exopeptidasen (siehe Tabelle 4 1). Bis auf die cytosolische Alanylaminopeptidase (PSA) und die Leucinaminopeptidase (LAP) sind diese tierischen Peptidasen membran gebunden und gehören zum Metallo oder zum Serintyp. Von einigen dieser tierischen membrangebundenen Enzyme, wie von der Aminopeptidase N (APN), wurden auch lösliche Formen nachgewiesen (Riemann et al. , 1999).
Die mit den für die tierischen Exopeptidasen optimierten Aktivitätstests erhobenen spezifischen Enzymaktivitäten lassen auf die Existenz vermutlich ähnlicher proteolytisch aktiver Enzyme an der Blatt und Wurzel PM von Gerste und Tabak schließen (Umsetzung von Leu pNA in Gegenwart von RB3014 wird im Ergebnisteil nicht gezeigt, entspricht IRAP). Aufgrund der mit Ala pNA getesteten spezifischen Proteaseinhibitoren wurde zumindest für dieses Substrat die AP dem Metallotyp zugeordnet. Bei diesen Untersuchungen konnte jedoch zunächst nicht zwischen peripher assoziierten, PM gebundenen oder sogar löslichen, in den PM Vesikeln eingeschlossenen, proteolytisch aktiven Enzymen unterschieden werden. Ein Homolog der löslichen PSA wurde bereits bei Arabidopsis nachgewiesen (Sánchez Morán et al. , 2004) und auch die PM assoziierte Metallo AP aus Arabidopsis (APM1, UniProt ID: Q8VZH2) soll der PSA ähneln (Murphy et al ., 2002). APM1 wurde mittels der Triton X 114 Fraktionierung als peripheres PM Protein identifiziert. Gleichzeitig hatten die Autoren in der Detergenzphase zusätzliche AP Aktivität mit den Substraten Ala Pro AFC 8 und Tyr AFC gemessen, was auf integrale PM AP hinwies. Diese Triton X 114 solubilisierbaren AP Aktivitäten aus Arabidopsis konnten sowohl dem Serintyp (AlaPro AFC) als auch dem Metallotyp (Tyr AFC) zugeordnet werden (Murphy und Taiz, 1999).
Im Vergleich dazu liegen die Alanin abspaltenden AP in Tabak und Gerste als integrale und Triton X 114 resistente Membranproteine an der Wurzel PM vor. Die I AP Aktivität mit Ala pNA wurde in den angereinigten Proteaseformen der Gerste (Hv Prot 5mM II.b bis hin zu Hv Prot 5mM ) nachgewiesen und für Tabak wurden zwei verschiedene membran gebundene AP nach Solubilisierung mit Octylglucosid mittels nativer PAGE fraktioniert. Die von Murphy und Taiz (1999) gemessenen integralen AP aus Arabidopsis entsprechen folglich nicht den hier beschriebenen Formen, denn die AP bei Gerste und Tabak waren nicht mit Triton X 114 solubilisierbar, sondern erst mit dem darauffolgend eingesetzten Octylglucosid.
8 AFC entspricht 7 Amino 4 Trifluoromethylcoumarin
94 DISKUSSION
Leucin-Aminopeptidasen
Von den zwei in dieser Arbeit massenspektrometrisch identifizierten Metallo AP wird die aus einer der gelelektrophoretisch fraktionierten Proteaseformen aus Gerstewurzeln II.b (Hv Prot 5mM ) bestimmte Form (A2XAI5 aus Reis) als Leucin AP der Peptidasefamilie M17 klassifiziert. Über Sequenzvergleiche wurde das detektierte Peptid (GIGESVASVAK) zwei bisher uncharakterisierten Gerstenproteinen zugeordnet (F2E0T2, F2DC62; siehe Tabelle 4 2, grau unterlegt). Leucin AP haben ein breites Substratspektrum und werden bei den Peptidasefamilien M1 und M17 eingeordnet (Matsui et al. , 2006). Die an PM Vesikeln gemessene spezifische AP Aktivität mit Leu pNA war immer niedriger gewesen als mit Ala pNA. Experimente hinsichtlich der Substratspezifität einer Leucin AP aus dem Blattextrakt der Straucherbse ( Cajanus cajan ) zeigten eine höhere Aktivität mit Leu pNA als mit Ala pNA (Lomate und Hivrale, 2011). Deshalb weisen die gemessenen AP Aktivitäten in dieser Arbeit zumindest für Gerstewurzeln auf integrale Leucin AP ähnliche Formen sowie auf APN ähnliche Aminopeptidasen (Ala pNA als Substrat bevorzugt) an der PM hin.
Leucin AP wurden bei Pflanzen sowohl über Genexpressionsexperimente (Chao et al. , 2000) als auch über biochemische Charakterisierungen (z.B. Sopanen und Mikola, 1975) bestätigt. Bei Säugetieren wurden lösliche und auch membrangebundene Leucin AP charakterisiert (Iwase et al. , 2001), jedoch wurden in der Literatur keine Hinweise auf pflanzliche membrangebundene Leucin AP vom Metallotyp gefunden. Lösliche Leucin AP aus der Tomate (auch LAP genannt, Peptidasefamilie M17) gehören dagegen zu den am meisten untersuchten pflanzlichen AP (Chao et al. , 2000; Gu und Walling, 2000; Pautot et al., 2001; Tu et al. , 2003; Walling, 2006; Fowler et al. , 2009). Sie wurden in allen vegeta tiven Geweben der Tomate nachgewiesen (Tu et al. , 2003), wobei eine Form (LapA) bei der Wundreaktion eine Rolle spielt (Fowler et al ., 2009). Neben einem breitem Substratspektrum unterscheiden sich die Leucin AP in ihren Temperatur und pH Optima sowie ihren Cofaktoren, zu denen bivalente Kationen zählen (Matsui et al. , 2006). Der Unterschied zwischen M1 und M17 Leucin AP ist die Abwesenheit des Zinkion koordinierenden Metallo peptidasemotivs HEXXH in der Peptidasefamilie M17 (Rawlings et al. , 2006). Die M17 Leucin AP liegen als Homohexamere vor, deren Monomere ein app. MW von 53 55 kDa besitzen und als Vorstufen mit einem app. MW von 65 kDa gebildet werden (Matsui et al. , 2006). Für die in Gerste ermittelten M17 Metallo AP wurden app. MW von 55 56 kDa bestimmt (siehe Tabelle 4 2, grau unterlegt). Möglicherweise geht die gemessene Leu pNA Umsetzung auf APN ähnliche Formen zurück, weil die Leucin AP aufgrund fehlender Cofaktoren oder ungeeignetem pH Wert im Enzymtest inaktiv vorgelegen haben.
95 DISKUSSION
Tabelle 4-2: Sequenzvergleiche verschiedener Aminopeptidaseformen mit Proteindatenbankeinträgen für Gerste und Tabak. Die über UniProt 1 bezogenen Sequenzen der APN Form von E. coli (PepN des K12 Stammes) und der menschlichen AP Formen wurden über den NCBI Standard Protein Blast 2 mit Datenbankeinträgen (DB) für Hordeum vulgare (taxid:4513, Hv) und Nicotiana tabacum (taxid:4097, Nt) verglichen. Es wurden nur die Treffer mit einem maximalen „score“ von mindestens 200 und einer maximalen Identität von mindestens 30 % aufgeführt. Zusätzlich wurden die massenspektrometrisch detektierten Proteine A2XAI5 und A2Y3I6 aus Reis mit Datenbankeinträgen der Gerste verglichen.
Name Oa UniProt MW PF a Ref. b GRAVY c TMD d DB Hits e Protein e max E GW UniProt MW Informationen a GRAVY c TMD d Ref. b ID a [kDa] Id. e value e ID a [kDa]
PepN Ec P04825 99 M1 A 0,325 0/0 Hv 52 BAJ86306.1 48 % 0.0 S F2CTY5 100 Metallo AP, M1, vg 0,250 0/0 H Nt 26 n.s.
APN Hs P15144 110 M1 B 0,317 1/1 Hv 56 BAJ96421.1 31 % 3e 129 S,W F2DMV0 98 Metallo AP, M1, vg 0,060 0/0 H BAJ93888.1 31 % 3e 120 S,W F2DFL7 98 Metallo AP, M1, vg 0,146 1/0 H BAJ90038.1 37 % 4e 120 S F2D4L7 99 Metallo AP, M1, vg 0,143 1/0 H BAJ96103.1 32 % 7e 120 S,W F2DAT1 98 Metallo AP, M1, vg 0,152 1/0 H BAJ96172.1 31 % 6e 95 S,W F2DM51 78 Metallo AP, M1, vg 0,169 0/0 H Nt 40 n.s.
IRAP Hs Q9UIQ6 117 M1 C 0,194 1/1 Hv 41 BAJ96421.1 32 % 1e 134 s.o. F2DMV0 s.o. BAJ96103.1 31 % 6e 126 s.o. F2DAT1 s.o. BAJ93888.1 32 % 1e 125 s.o. F2DFL7 s.o. BAJ90038.1 30 % 3e 125 s.o. F2D4L7 s.o. BAJ96172.1 32 % 7e 101 s.o. F2DM51 s.o. Nt 40 n.s.
APB Hs Q9H4A4 73 M1 D 0,207 1/0 Hv 50 BAK01914.1 34 % 2e 88 S,W F2E3J2 68 Metallo typ; M1, vg 0,142 0/0 H Nt 19 n.s.
DPPIV Hs P27487 88 S9 E 0,340 1/1 Hv 51 n.s. Nt 52 n.s.
ACE2 Hs Q9BYF1 93 M2 F 0,375 1/1 Hv 44 n.s. Nt 38 n.s.
Protein Os A2XAI5 62 M17 G 0,051 1/0 Hv 44 BAK00954.1 90 % 0,0 S,W F2E0T2 56 Metallo AP, M17, vg, Cyt 0,105 1/0 H BAK00974.1 n.a. BAK04996.1 n.a. BAJ92683.1 90 % 0,0 n.a. F2DC62 56 Metallo AP, M17, vg, Cyt 0,104 1/0 H BAJ85842.1 80 % 0,0 S F2CSM1 55 Metallo AP, M17, vg, Cyt 0,173 1/0 H
Protein Os A2Y3I6 43 M24 G 0,342 0/0 Hv 54 ADK78215.1 90 % 0,0 n.a. E0A9F0 43 Metallo AP, M24, vg, Met AP 0,360 0/0 I BAJ87032.1 40 % 5e 90 B F2CW11 46 Metallo AP, M24, vg 0,294 0/0 H 1 http://www.uniprot.org/; 2 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome a) nach UniProtKB/SwissProt; O – Organismus: Ec – E. coli ; Hs – Homo sapiens ; Os – Oryza sativa; PF – Peptidasefamilie b) Refferenzen: A) Hayashi et al. , 2006; B) Zody et al. , 2006; C) Rogi et al. , 1996; D) Piesse et al. , 1999; E) Misumi et al. , 1992; F) Donoghue et al. , 2000; G) Wang et al. , 2008b; H) Matsumoto et al. , 2011; I) Jeong et al. , 2011 c) GRAVY – Hydrophobizitätsindex nach ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/) d) TMD – Transmembrane Domäne nach zwei Algorithmen berechnet (x/y), x = HMMTOP (http://www.tcdb.org/progs/TMS.php) bzw. y = TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM 2.0/) e) Ergebnisse der Sequenzvergleiche über NCBI Blast; E value (Erwartungswert): Gibt an, wie viele äquivalente Sequenzen in der Datenbank zu erwarten sind. Je kleiner der Wert, desto signifikanter ist die Sequenzhomologie. GW – Gewebe, das für die mRNA Gewinnung genutzt wurde (S – Spross, W – Wurzel, B – Blatt, n.a. – nicht angegeben) Informationsreihenfolge: Proteasetyp (AP – Aminopeptidase); Peptidasefamilie (z.B. M1); Proteinnachweis (vg – vorhergesagt aufgrund von Transkriptnachweis); evt. noch Angabe zur Lokalisierung in der Zelle (Cyt – Cytosol) 96 bzw. weitere zur Verfügung stehende Angaben (Met AP – Methionin Aminopeptidase), weitere Abkürzungen: n.s. – nicht signifikant; s.o. – siehe oben
DISKUSSION
Die 1975 charakterisierte pflanzliche Leucin AP aus dem Extrakt von Gersten keimlingen hat ein pH Optimum von 8 10 und die Autoren berichten von einem stabilisierenden oder aktivierenden Effekt von Mg 2+ und Mn 2+ (Sopanen und Mikola, 1975). Letzteres wurde auch über die wundinduzierte Leucin AP aus Tomatenblättern berichtet (Gu et al. , 1999). Der Einfluss verschiedener Metallionen wurde für die AP aus Gerste und Tabak nicht getestet. Die AP Aktivität wurde bei pH 6,8 in Gegenwart von Zn 2+ bestimmt und für alle angereinigten PM Proteasen wurden die Enzymtests nur mit dem Substrat Ala pNA durchgeführt, weil damit die höchste Aktivität an den PM Vesikeln messbar gewesen war. Massenspektrometrisch wurden in Tabak keine PM Proteasen identifiziert. Die zwei über native PAGE aufgetrennten AP Formen, die aus der solubilisierten PM Fraktion aus Tabakwurzeln stammen, könnten aber auf das Vorhandensein einer PM gebundenen Leucin AP in Tabakwurzeln hinweisen. Die berechneten app. MW lagen bei 90 und 110 kDa. Die größere Proteaseform hatte niedrigere Aktivität gezeigt und könnte aufgrund der nativen Bedingungen als Homodimer vorgelegen haben. Das Monomer würde somit mit 55 kDa den beschriebenen löslichen Leucin AP aus der Tomate und der Erbse ähneln. Das Vorhandensein aktiver Mono und Oligomere würde eine Erklärung für die vielen verschiedenen Proteaseformen sowohl in Tabak als auch in Gerstewurzeln nach zymographischer Fraktionierung darstellen.
Ein Vergleich des in dieser Arbeit detektierten Peptids der Leucin AP sowie der ermittelten uncharakterisierten Gerstenproteine mit der PM gebundenen Leu pNA spaltenden IRAP vom Menschen (Q9UIQ6, siehe Tabelle 4 1) zeigte keine Sequenz übereinstimmung. Gleichzeitig wurden durch Sequenzvergleiche der IRAP mit den Protein datenbanken 9 von Gerste und Tabak fünf verschiedene bisher uncharakterisierte Gersten proteine ermittelt. Anhand der Strukturanalyse bekannter Proteinfamilien und domänen werden sowohl die menschlichen als auch die fünf Gerste AP der Peptidasefamilie M1 (IPR014782 10 ) zugeordnet. Diese Vorhersagen über Metallo AP stammen aus Genexpressionsexperimenten, die vorrangig mit Spross und Wurzelgewebe der Gerste durchgeführt wurden. Sie weisen Sequenzähnlichkeiten zur menschlichen APN auf (P15144, siehe Tabelle 4 2). Beide AP des Menschen sind über eine N terminale TMD an der externen Seite der PM gebunden (Antczak et al. , 2001; Jordens et al. , 2010), während nur für drei der IRAP ähnlichen Gerstenproteine eine TMD vorhergesagt wurde und die Orientierung der PM assoziierten AP Aktivität in Tabak und Gerstewurzeln noch nicht eindeutig bestimmt wurde.
9 NCBI Blastp: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome 10 InterPro ID: http://www.ebi.ac.uk/interpro/
97 DISKUSSION
APN-ähnliche Alanin-Aminopeptidasen
Da die höchste AP Aktivität an den PM Vesikeln mit Ala pNA gemessenen wurde, wurde geprüft, ob weitere Homologe der membrangebundenen menschlichen Peptidasen (siehe Tabelle 4 1) mittels Sequenzvergleiche in den Proteindatenbanken11 von Gerste und Tabak gefunden werden können. Plastidäre Proteasen wie die Clp und FtsH Proteasen weisen Homologien zu bakteriellen Formen auf (Adam et al. , 2006). Deshalb wurde zusätzlich die membrangebundene APN Form von E. coli (P04825, PepN, Bakterien stamm K12) für die Sequenzvergleiche herangezogen. Sowohl die in dieser Arbeit detektierten Peptide als auch die zugordneten Proteine aus Gerste wiesen zunächst keine signifikante Übereinstimmung mit der bakteriellen APN auf. Jedoch konnte für Gerste ein bisher nur vorhergesagtes Protein (F2CTY5) ermittelt werden, das 48 % Identität mit der PepN aufweist (siehe Tabelle 4 2). Die Sequenzvergleiche mit den membrangebundenen menschlichen Exopeptidasen lieferten ebenfalls für Gerste sechs Proteine mit einer Identität von mindestens 30 %, die alle dem Metallotyp zugeordnet werden. Da fünf dieser Gerstenproteine sowohl Sequenzähnlichkeiten zur IRAP (Leu pNA spaltend) als auch zur menschlichen APN (Ala pNA spaltend) zeigen, bleibt also noch zu klären, ob es sich nun bei der an Tabak und Gerste PM Vesikeln gemessenen Ala pNA Aktivität tatsächlich um eine APN ähnliche Form handelt.
Möglicherweise könnte eine APN ähnliche Protease mit Triton X 114 solubilisiert worden sein und wäre somit nicht in den weiter angereinigten Proteaseformen enthalten gewesen. Es ist nicht klar, ob die bekannten tierischen APN Formen Triton X 114 resistent sind. Soweit Angaben in der Literatur dazu gemacht wurden, fand bei der Anreinigung der APN immer eine Kombination von Autolyse oder Inkubation mit proteolytischen Enzymen (Papain, Trypsin oder Bromelain) und einer anschließenden Ammoniumsulfatfällung Anwendung (Sidorowicz et al. , 1980; Sanderink et al. , 1988). Im Gegensatz dazu wurde die APN ähnliche Form aus Dünndarmmikrovilli des Schweins mit 1 % Triton X 100 solubilisiert (Sjöstström et al. , 1978). Ausgehend von den Solubilisierungsexperimenten von Hooper und Bashir (1991), wonach PM Proteine der Niere, die eine einzelne TMD besitzen, hauptsächlich (62 %) in der Triton X 114 Phase akkumulierten, könnte das auch auf eine pflanzliche PM gebundene APN ähnliche Form zutreffen. Die gegenüber Leu pNA höheren Enzymaktivitäten mit Ala pNA unterstützen eher eine APN ähnliche Form. Daher könnte mit verschiedenen AP Substraten geprüft werden, ob durch die zwei Detergenzien Triton X 114 und Octylglucosid eine Alanin AP und eine Leucin AP voneinander getrennt werden. Das würde dann erklären, warum nur eine Leucin AP Form in der angereinigten Triton X 114 resistenten Fraktion identifiziert wurde.
11 NCBI Blastp: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome
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Hinweise auf weitere Aminopeptidasen sowie Metalloproteinasen
II.b Über die massenspektrometrische Analyse der angereinigten Hv Prot 5mM wurde anhand von Sequenzhomologien neben einer Leucin AP (A2XAI5) eine weitere Metallo AP (A2Y3I6) nachgewiesen, die einem bisher uncharakterisierten Gerstenprotein zugeordnet werden konnte (E0A9F0, siehe Tabelle 4 2, grau unterlegt). Die detektierten Peptide (IVEGVLSHQLK; VVLSVSNADTK) und auch das uncharakterisierte Gerstenprotein zeigen keine Sequenzübereinstimmung mit den menschlichen PM gebundenen AP. Diese zweite detektierte Metallo AP wird der Peptidasefamilie M24 (Methionin AP) zugeordnet, allerdings wurde keine TMD für das Gerstenprotein vorhergesagt.
Methionin AP wurden bereits in Pflanzen beschrieben (Giglione et al. , 2004). Ein Merkmal dieser AP ist die Co 2+ Abhängigkeit, die sowohl für die bakterielle Form (Roderick und Matthews, 1993) als auch für eine Form aus Gerste (Jeong et al. , 2011) nachgewiesen wurde. Der Exopeptidaseaktivitätstest in dieser Arbeit fand mit Rücksicht auf die Metallo AP nur in Gegenwart von Zn 2+ statt. Zudem wurde kein spezifisches Substrat einer Methionin AP getestet. Es kann deshalb keine Aussage darüber getroffen werden, ob diese AP in aktiver Form an der PM der Gerstewurzeln gebunden ist und einen Anteil an der jeweiligen Substratumsetzung hatte. Bei Arabidopsis wurden Methionin AP bereits im Cytosol, in Plastiden und in den Mitochondrien nachgewiesen (Walling, 2006).
Neben Ala und Leu abspaltender Enzymaktivität wurde auch eine hohe AP Aktivität mit Arg pNA an den PM Vesikeln von Gerste und Tabakwurzeln gemessen. Es könnte sich dabei um eine weitere Metallo AP mit Sequenzähnlichkeiten zur menschlichen APB (Q9H4A4, siehe Tabelle 4 1) handeln, die basische Aminosäurereste wie Arginin vom N Terminus abspaltet (Foulon et al. , 1999). So wurde über Sequenzvergleiche auch ein bisher nur vorhergesagtes Gerstenprotein ermittelt (siehe Tabelle 4 2). Allerdings wird für dieses Protein wie auch für die menschliche APB keine TMD vorhergesagt. Obwohl das menschliche Enzym an der Membranoberfläche von T Lymphozyten nachgewiesen wurde (Belhacene et al. , 1993), ist noch unklar, wie diese APB an der PM gebunden ist. Da sie auch in trans Golgi Vesikeln und als sekretierte Form beschrieben wird, liegt sie höchstwahrscheinlich als lösliches Monomer mit einem app. MW von 72 kDa vor und interagiert vermutlich mit einem Rezeptor an der Zelloberfläche der PM (Foulon et al. , 1999).
Bei Pflanzen wurde bereits eine APB mit 79 kDa im Stroma der Chloroplasten aus Erbsenkeimlingen nachgewiesen (Cook und Adam, 1997). Das zum Serintyp gehörende Enzym spaltet nur Arg enthaltende Peptide und könnte laut den Autoren erst während des Proteinabbauprozesses in den Chloroplasten aktiv sein. Die Inhibitortests in der vorliegenden Arbeit hatten zwar auf Metallo AP hingewiesen, jedoch wurden die Experimente nur mit
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Ala pNA als Substrat durchgeführt. Zusätzlich könnte also neben einer Arg abspaltenden Metallo AP mit Ähnlichkeiten zur humanen APB auch eine Serin AP an der PM von Tabak und Gerstewurzeln assoziiert vorliegen.
Zusammenfassend wurden folglich zwei verschiedene Metallo AP der Peptidase familien M17 und M24 massenspektrometrisch nachgewiesen, die bisher uncharakterisierten Gersteproteinen entsprechen und von denen die M17 Peptidasen als membrangebunden vorhergesagt werden. Gleichzeitig wiesen die getesteten Exopeptidasesubstrate bei beiden Pflanzenarten auf die Existenz weiterer AP hin. Zumindest in der Gerste werden homologe Proteine vorhergesagt, die Ähnlichkeiten zur menschlichen PM gebundenen APN (Ala pNA Umsetzung) und APB (Arg pNA Umsetzung) besitzen und auch dem Metallotyp angehören. Zudem weisen die Inhibitorversuche mit FTC Casein auf eine weitere endoproteolytisch spaltende Metalloprotease an der PM hin, deren Identität noch nicht geklärt wurde.
b) Serinproteinasen
Als zweiter Proteasetyp wurden Serinproteasen mit dem Hemmstoff PMSF an den PM Vesikeln aus Tabak und Gerstewurzeln nachgewiesen. Pflanzliche Serinproteasen stellen mit über 200 Formen die größte Gruppe der pflanzlichen Proteasen dar (van der Hoorn, 2008) und viele Serinendoproteasen besitzen Trypsin ähnliche Aktivität (Beynon und Bond, 2001). Bis auf die verwendeten Verdauungsenzyme (Trypsin und Chymotrypsin) wurden jedoch keine weiteren Serinproteasen in den angereinigten Proteaseformen der Gerste detektiert. Deshalb wurde geprüft, ob die der Trypsinvorstufe zugeordneten Peptide ( LGEHNIDVLEGNEQFINAAK ; IITHPNFNGNTLDNDIMLIK ; LSSPATLNSR ) auch von einer anderen, bisher unbekannten Serinprotease stammen könnten. Es wurden aber keine kompletten Sequenzübereinstimmungen mit Gerstenproteinen gefunden.
Die gemessene Hemmung der PM assoziierten caseinolytischen Aktivität mit AEBSF war um fast 50 % geringer als jene mit PMSF, welches aufgrund seiner geringen Selektivität häufig als Inhibitor von Serinproteasen verwendet wird (Beynon und Bond, 2001). Die Hemmung läuft relativ langsam ab. Zudem ist PMSF nur schlecht wasserlöslich und besitzt eine kurze Halbwertzeit von 55 Minuten bei 25 °C und pH 7,5 (James, 1978). Deshalb ist AEBSF (Pefabloc) aufgrund seiner besseren Löslichkeit und Stabilität in Wasser im Vergleich zu PMSF als Inhibitor von Serinproteasen geeigneter (Beynon und Bond, 2001). Da jedoch PMSF, welches zusätzlich auch bestimmte Cysteinproteasen inhibiert (Beynon und Bond, 2001), einen stärkeren Effekt auf die caseinolytische Aktivität zeigte, könnten deshalb diese Ergebnisse auch auf Proteasen vom Cysteintyp hinweisen.
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c) Cysteinproteinasen
Die Hemmung der Cysteinproteasen durch PMSF ist in Gegenwart von DTT reversibel (Beynon und Bond, 2001). Obwohl die PM Vesikel ursprünglich in Puffer mit 1 mM DTT resuspendiert worden waren, könnte dieses allerdings nach Lagerung oxidiert worden sein (Getz et al. , 1999). Ein Teil der caseinolytischen Aktivität könnte folglich auch auf Cysteinproteasen zurückgehen. Diese Vermutung wird durch den massenspektrometrischen Nachweis einer Papain ähnlichen Cysteinproteinase (B4ESE8, Peptidasefamilie C1A) in der von den PM Vesikeln abgegebenen Fraktion verstärkt. Da der einzeln getestete spezifische Cysteinproteasehemmstoff E64 kaum eine Wirkung auf die caseinolytische Proteaseaktivität gezeigt hatte, liegt diese Cysteinproteinase vermutlich als inaktive Vorstufe an der PM vor und kann sich nicht selbst durch Autoproteolyse von der PM abgetrennt haben.
Andererseits könnte die Papain ähnliche Cysteinproteinase neben Endoprotease aktivität auch Carboxypeptidaseaktivität wie das tierische Cathepsin B (nach UniProt: P07858, Peptidasefamilie C1A) besitzen (Stachowiak et al. , 2004). Diese lysosomale Papain ähnliche Cysteinprotease besitzt innerhalb eines weiten pH Bereichs (pH 5 8) Endo proteaseaktivität. Unter sauren pH Bedingungen konnte aber eine Dipeptidyl Carboxy peptidaseaktivität gemessen werden (Mort et al. , 1998; Stachowiak et al. , 2004). Für die Untersuchung der pflanzlichen Cathepsin B Form wird der Aktivitätstest nach Literatur angaben bei pH 6,0 durchgeführt (Gilroy et al. , 2007) und deshalb wird dieses Charakteristikum für die pflanzliche Proteaseform nur vermutet.
Ein Vergleich der detektierten Papain ähnlichen Cysteinproteinase aus Gerste mit dem tierischen Cathepsin B zeigte eine 54 %ige Sequenzähnlichkeit. Wäre die Proteinase also über einen Lipidanker am C Terminus an die apoplastische Seite der PM gebunden, könnte sie sich durch die mit Cathepsin B vergleichbare Dipeptidyl Carboxypeptidaseaktivität (Stachowiak et al. , 2004) von diesem Anker befreien. Die pH abhängige Aktivitätsänderung des tierischen Cathepsin B basiert auf Konformationsänderung, wodurch unter sauren pH Bedingungen nur noch zwei Aminosäuren des Substrates an das veränderte katalytische Zentrum der Protease binden können und deshalb nur ein Dipeptid C terminal abgespalten wird (Stachowiak et al. , 2004). Die gemessene Hydrolyse des Substrates MCA AlaProLys Dnp bei pH 6,8 könnte nur dann durch eine Papain ähnliche Cysteinproteinase katalysiert worden sein, wenn deren endoproteolytische Aktivität nur unter sauren oder alkalischen pH Bedingungen mit Casein messbar wäre. Hinweise auf ein solches Enzym wurden jedoch nicht in der Literatur gefunden. Deshalb erscheint die Existenz einer bei pH 7,8 inaktiven Papain ähnlichen Cysteinproteinase an der Wurzel PM wahrscheinlicher.
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Pflanzliche Papain ähnliche Proteasen gehören zu den am besten untersuchten Cysteinproteasen. Allein in Arabidopsis wurden 32 Cysteinproteinasen, die zur C1 Familie gehören, anhand von Genomstudien nachgewiesen (Grudkowska und Zagdańska, 2004). Papain ähnliche Enzyme werden als inaktive Vorstufen mit einem app. MW von 40 50 kDa gebildet. Ein N terminales Propeptid fungiert als Inhibitor, indem es das aktive Zentrum blockiert (Turk et al. , 1996). Die Enzymaktivierung kann durch Autoproteolyse im sauren pH Bereich (Turk et al. , 1996) oder durch intermolekulare Proteolyse erfolgen. Die aktiven Enzyme mit app. MW von 22 35 kDa werden aufgrund des Cysteinrestes im aktiven Zentrum durch die Bindung von Iodacetamid oder E64 gehemmt (Grudkowska und Zagdańska, 2004). Dabei scheint diese schnelle und irreversible Hemmung auf die Proteasen vom Clan CA beschränkt zu sein (Barrett und Rawlings, 2001). Die detektierte Cysteinproteinase und die anderen drei ermittelten Gerstenproteine werden anhand von Sequenzhomologien dem Typ C1A (Clan CA; Familie C1; Unterfamilie C1A) zugeordnet. Demnach scheint es aufgrund der fehlenden Wirkung von E64 noch wahrscheinlicher, dass eine Papain ähnliche Proteinase als inaktive Form an der PM assoziiert vorliegt.
Ein Sequenzvergleich der drei gefundenen Peptide mit der Proteindatenbank von Gerste offenbarte neben der Papain ähnlichen Cysteinproteinase (B4ESE8) ein weiteres Protein, das alle drei Peptide enthält (F2CQM4) sowie zwei weitere Proteine, bei denen allerdings nur die Peptide 1 und 2 vollständig enthalten sind (B7X948, F2DC72). Für die Papain ähnliche Proteinase sowie für die drei gefundenen Proteine wurde eine N terminale TMD, aber keine GPI Verankerung mit entsprechenden Algorithmen vorhergesagt (siehe Abbildung 4 2).
Papain ähnliche Proteasen sind an der posttranslationalen Modifizierung von Speicherproteinen, an intrazellulären katabolischen Reaktionen während der Seneszenz, aber auch an Reaktionen der Stress und Pathogenabwehr beteiligt (Martinez und Diaz, 2008). Die der Familie C1A angehörenden Proteinasen wurden bisher in Transport vesikeln, in der Vakuole oder im Apoplasten nachgewiesen (van der Hoorn, 2008) und haben ein leicht saures pH Optimum von 5 bis 6,5 (Turk et al. , 1997). Die Cysteinproteinase Papain wurde ursprünglich im Latex des Papaya Baumes nachgewiesen, wo sie als Schutz gegen Insektenfraß abgegeben wird (Konno et al. , 2004). Eine ähnliche Funktion in der Pathogenabwehr könnte auch eine PM assoziierte Form besitzen. Die Proteinsequenz von Papain besteht (nach UniProt Eintrag P00784) aus einem Signalpeptid (Aminosäure 1 18), einem Propeptid (19 133) und dem eigentlichen Papain (134 345). Mit TMHMM wird eine TMD am N Terminus (7 26) vorhergesagt. Nach Literaturangaben wird Papain wie auch Papain ähnliche Proteasen von Mais und Tomate (Shindo und van der Hoorn, 2008) durch das N terminale Signalpeptid als inaktive Vorstufe ins Endoplasmatische Retikulum (ER)
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transportiert, wo das Signalpeptid dann abgespalten wird (Emanuelsson et al. , 2000). Ein transmembranes Segment am N Terminus ist daher unwahrscheinlich. Da die verwendeten Algorithmen keine 100 %ige Sicherheit darstellen (Tusnády und Simon, 2010), könnte eine N terminale TMD folglich auch einem Signalpeptid entsprechen. Deshalb müssen diese Vorhersagen in jedem Fall über biochemische Methoden nachgeprüft werden.
Abbildung 4-2: Sequenzvergleich der detektierten Papain-ähnlichen Cysteinproteinase mit ähnlichen Gerstenproteinen. Die von gewaschenen PM Vesikeln (mit/ohne Proteaseinhibitor cocktail) abgetrennte und massenspektrometrisch detektierte Cysteinproteinase aus Gerste (B4ESE8) wurde mit der Proteindatenbank der Gerste verglichen und mit den drei ermittelten Gerstenproteinen, bei denen mindestens zwei Peptide vollständig wieder gefunden werden konnten, über das Programm BioEdit analysiert. Übereinstimmende Aminosäuren wurden grau hervorgehoben und die detektierten Peptide, die vorhergesagten transmembranen Domänen (TMD) und das Papain Motiv sind ebenfalls angegeben.
So wurde für die detektierte Papain ähnliche Form der Gerste auch eine TMD vorhergesagt (Aminosäure 7 bis 29, siehe Abbildung 4 2). Zusätzlich wurde aber mit den Programmen „Predotar“ 12 (Small et al. , 2004) sowie mit „TargetP“ 13 (Emanuelsson et al. , 2000) für diese Proteinase (B4ESE8) sowie für die anderen drei ermittelten Gerstenproteine (F2CQM4, B7X948, F2DC72, siehe Abbildung 4 2) ein N terminales Signalpeptid bestimmt. Dieses Peptid vermittelt einen Transport ins ER und deshalb werden diese Gerstenproteine höchstwahrscheinlich über den Sekretionsweg weiter in die Vakuole oder an die PM transportiert. Eine Papain ähnliche Cysteinproteasevorstufe, die eventuell über Vesikel in den Apoplasten abgegeben wird, kann nur dann im Experiment von den gewaschenen
12 http://urgi.versailles.inra.fr/predotar/predotar.html; Version 1.03, 2005 13 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/; Version 1.1
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PM Vesikeln freigesetzt worden sein, wenn das Protein an einem anderen Membranprotein gebunden oder durch eine zusätzliche Modifikation selbst in der PM verankert gewesen war.
d) Aspartatproteinasen
Der Aspartatproteasehemmstoff Pepstatin A hatte keine signifikanten Effekte auf die PM assoziierte caseinolytische Aktivität. Aspartatproteasen besitzen ein saures pH Optimum (Beynon und Bond, 2001). Für die PM assoziierte caseinolytische Aktivität von Gerste wurde jedoch ein pH Optimum im alkalischen Bereich bei pH 7,5 7,8 ermittelt und wies damit auch nicht auf das Vorhandensein einer Aspartatprotease hin. Überraschenderweise wurden jedoch nach endogener Proteolyse von den gewaschenen PM Vesikeln im Überstand insgesamt drei Peptide detektiert, die je nach verwendeter Datenbank der Phytepsinvorstufe (P42210) von Gerste oder einer Aspartatproteinase aus Weizen (Q401N7_WHEAT, zwei Peptide) zugeordnet wurden. Über einen Sequenzvergleich der Phytepsinvorstufe (P42210) mit Datenbankeinträgen für Gerste wurden fünf Proteine ermittelt, von denen zwei die 32 kDa Untereinheit und das Zymogen von Phytepsin darstellen, während die anderen drei noch uncharakterisierten, bisher nur vorhergesagten Proteinen entsprechen. Im Vergleich der Phytepsinvorstufe mit den zwei ähnlichsten Gerstenproteinen (E value = 0,0) wurden jedoch, anders als bei der Papain ähnlichen Cysteinproteinase, die detektierten Peptide nur in der Phytepsinvorstufe vollständig wiedergefunden (siehe Abbildung 4 3). Sie befinden sich innerhalb der 32 kDa Untereinheit des Phythepsins. Demnach könnte diese Aspartatproteinase durch die endogene Proteolyse in die aktive Form überführt worden sein.
Phytepsin selbst wurde in Gerstewurzeln bisher nur in der Vakuole nachgewiesen (Glathe et al. , 1998). Die Phytepsinvorstufe (54 kDa) wird als Präproprotein am rauen ER synthetisiert und das Signalpeptid aus 22 Aminosäuren beim Transport ins ER abgespalten. Das anschließend N glykosylierte Proprotein (nach UniProt Eintrag: potentiell an Aminosäure 399) wird zum Golgi Apparat transportiert und der Glykosylrest dort weiter modifiziert. Das N terminale Propeptid und die pflanzenspezifische Sequenz von 105 Aminosäuren innerhalb des Proteins (siehe Abbildung 4 3) werden durch Autoproteolyse im sauren pH Bereich oder durch andere Proteasen in der Vakuole gespalten. So entstehen mindestens zwei Proteine mit unterschiedlichen app. MW (31 und 15 kDa; Glathe et al. , 1998; Törmäkangas et al. , 2001). Dabei spielt die interne pflanzenspezifische Sequenz, die als Saposin ähnliche Domäne identifiziert wurde, eine Rolle beim gezielten Transport der Vorstufe in die Vakuole (Kervinen et al. , 1999).
Es gibt zwei Möglichkeiten, weshalb die Phytepsinvorstufe von den gewaschenen PM Vesikeln freigesetzt wurde. Zum einen könnten die PM Vesikel durch prävakuoläre
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Vesikel (Richter et al. , 2009) kontaminiert gewesen sein, welches nicht vollständig ausgeschlossen werden kann (Larsson, 1985). Zum anderen könnte eine Phytepsin ähnliche Form an der PM existieren, die bisher noch nicht in den Datenbanken erfasst wurde.
Abbildung 4-3: Sequenzvergleich der Phytepsinvorstufe mit ähnlichen Gerstenproteinen. Die über endogene Proteolyse von gewaschenen PM Vesikeln abgegebene und massenspektrometrisch identifizierte Phytepsinvorstufe aus Gerste (P42210) wurde mit der Proteindatenbank der Gerste verglichen und mit den so ermittelten Gerstenproteinen (E value = 0,0) über das Programm BioEdit analysiert. Übereinstimmende Aminosäuren sind grau hervorgehoben und die detektierten Peptide sind markiert. Peptid a und b wurden mittels Poaceae Datenbank einer Aspartatproteinase aus Weizen und Peptid 1 und 2 mittels SwissProt Datenbank der Phytepsinvorstufe aus Gerste zugeordnet. Desweiteren sind das Signalpeptid, das Propeptid und die Saposin B Typ Domäne, die bei der Überführung der Phytepsinvorstufe in die aktive Form abgespalten werden, angegeben.
Bei Pflanzen sind Aspartatproteinasen außer in den Vakuolen auch noch im ER (Ge et al. , 2005) sowie im Apoplasten (Xia et al. , 2004; Athauda et al. , 2004) lokalisiert. Darunter befinden sich Formen, deren inaktiven Vorstufen das etwa 100 Aminosäure umfassende interne Sequenzmotiv fehlt (Simões et al. , 2007). Zu diesen atypischen Aspartatproteasen zählt die CDR1 in Arabidopsis , die als extrazelluläres Enzym im Blatt eine Funktion bei der Induktion der Pathogenabwehr besitzt (Xia et al. , 2004). Dabei soll durch Proteolyse eines apoplastisch an der PM gebundenen Proteins oder durch die proteolytische Aktivierung der Aspartatproteinase selbst ein Peptid gebildet werden, das wiederum als extrazelluläres Signal von einem Rezeptor erkannt wird und eine Signalkaskade auslöst (Xia et al., 2004).
Die Aspartatprotease CDR1 besitzt ein app. MW von 47 kDa und eine N terminale Signalsequenz, die für den Transport des Enzyms in den Apoplasten verantwortlich zu sein scheint (Xia et al. , 2004). Sequenzvergleiche der CDR1 (Q6XBF8_ARATH) mit Gersten
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proteinen zeigten zwar acht signifikante, bisher uncharakterisierte, nur vorhergesagte Aspartatproteinasen mit app. MW von 46 bis 52 kDa, die jedoch keines der detektierten Peptide enthielten (Daten werden nicht gezeigt). Das deutet also auf eine Phytepsin ähnliche Form hin, die unter den gewählten Bedingungen (Substrat, pH, Cofaktor) nicht im Aktivitätstest erfasst wurde. Casein könnte kein geeignetes Substrat sein oder das aufgenommene pH Spektrum zwischen 4,0 und 10,0 reichte nicht aus, um eine saure Protease zu erfassen. Nepenthesine, zwei extrazelluläre Aspartatproteinasen aus dem Verdauungssekret der fleischfressenden Pflanze Nepenthes distillatoria , besitzen ein pH Optimum von 2,6 und zeigen bei pH 6 fast keine Aktivität mehr (Athauda et al. , 2004).
Die nach endogener Proteolyse detektierten Peptide der Phytepsinvorstufe liegen nicht innerhalb der Saposin B Typ Domäne. Folglich könnte auch eine pflanzliche Aspartat proteinase existieren, die zwar Sequenzhomologien zu Phytepsin besitzt, die aber nicht in der Vakuole, sondern an der PM lokalisiert ist oder in den Apoplasten sekretiert wird. Es wurde weder eine TMD noch eine GPI Verankerung mit den verwendeten Algorithmen für die Phytepsinvorstufe oder eines der ihr ähnlichen Gerstenproteine vorhergesagt. Andere posttranslationale Modifikationen, wie die Myristoylierung, die ebenfalls eine Membran verankerung ermöglichen (Kamath et al. , 2011), wurden nicht weiter untersucht.
e) Hinweise auf weitere, nicht klassifizierbare PM-gebundene Proteasen
Wurzelspezifische Proteinasen
Unter den gewählten experimentellen Bedingungen (pH 7,8, Temperatur 37 °C, Cofaktor Ca 2+ ) wurde die caseinolytische Aktivität nur an der Wurzel PM beider Pflanzenarten gemessen. Die mit FTC Casein gemessene Proteaseaktivität der Blatt PM aus Gerste und Tabak lag an der Nachweisgrenze. Da die caseinolytische Aktivität nicht durch den AP Inhibitor Bestatin signifikant beeinflusst wurde, könnten fast ausschließlich Endoproteasen das Casein und auch die Gelatine im Zymogramm hydrolytisch gespalten haben. Die Identität einer PM gebundenen Proteinase konnte in dieser Arbeit nicht geklärt werden, jedoch weisen die Inhibitorversuche auf Metallo und Serinendopeptidasen hin. Über Genomanalysen ermittelte GPI verankerte Proteasen in Arabidopsis und Reis (Borner et al. , 2003; Elortza et al. , 2003) werden dem Aspartat , Metallo und Cysteintyp zugeordnet (siehe Tabelle 4 4 in Abschnitt 4.3). Eventuell handelt es sich bei der hier biochemisch nachgewiesenen Metalloprotease um ein Homolog jener GPI verankerten Proteinasen.
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Carboxypeptidasen
Neben den APs wurde in dieser Arbeit Carboxypeptidaseaktivität an den PM Vesikeln beider Pflanzenarten nachgewiesen. Das verwendete Substrat MCA AlaProLys Dnp, das von der menschlichen ACE2 zwischen Ala und Pro gespalten wird (siehe Tabelle 4 1), wurde auch von den getesteten pflanzlichen PM Proteasen hydrolysiert. Da keine weiteren spezifischen CP Substrate eingesetzt worden waren, bleibt die Substratspezifität der PM assoziierten CP unklar. Neben der Peptidbindung zwischen Alanin und Prolin könnte auch eine Hydrolyse zwischen Prolin und Lysin katalysiert worden sein. Der Sequenzvergleich der menschlichen ACE2 zeigte keine Übereinstimmungen mit Gersten und Tabakproteinen (siehe Tabelle 4 2). Weitere Untersuchungen dieser Peptidasegruppe sollten unbedingt folgen, da neben Endo und AP Aktivität in dieser Arbeit auch CP Aktivität in den Gerstewurzeln nachgewiesen wurde, die auf membranintegrale PM Proteine zurückgehen muss.
Pflanzliche CP wurden biochemisch in verschiedenen höheren Pflanzen charakterisiert. Dazu zählen Gerste (Mikola, 1983), Weizen (Waters et al ., 1982), Reis (Mishra und Dubey, 2006), Arabidopsis (Zhou und Li, 2005), Tomate (Mehta et al. , 1996), Bohne (Carey und Wells, 1972), der Orangenbaum (Sprössler et al. , 1971) und die Wasser melone (Matoba und Doi, 1975). Interessanterweise wurden alle untersuchten pflanzlichen CP als Serintyp charakterisiert (EC 3.4.16.5). Sie werden nicht durch chelatierende Substanzen wie EDTA beeinflusst und liegen sowohl als Mono als auch als Oligomere vor (Drzymala und Bielawski, 2009). Charakteristisch scheint für diesen Peptidasetyp eine geringe Substratspezifität und ein saures pH Optimum im Bereich von 4 6 zu sein (Jones et al. , 1996). Die CP Aktivität an den PM Vesikeln von Gerste und Tabak wurde bei einem pH Wert von 6,8 bestimmt. Aufgrund einer fehlenden Eichung können die gemessenen Aktivitäten nicht mit anderen Ergebnissen verglichen werden, nichts desto trotz waren die CP Aktivitäten deutlich messbar gewesen. Möglicherweise wäre diese PM assoziierte CP Aktivität im sauren pH Bereich noch höher. Es könnte aber auch neben einer Serin CP noch ein anderer CP Typ mit einem neutralen oder alkalischen pH Optimum an den untersuchten pflanzlichen PM Vesikeln existieren.
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4.2 Kritische Betrachtung der verwendeten Methoden und Resultate
Es wurden in den verschiedenen angereinigten Proteaseformen der Gerste bis zu fünfzehn verschiedene proteolytisch aktive Proteasen zymographisch fraktioniert. Dabei ist nicht klar, ob es sich tatsächlich um unterschiedliche Proteine handelt. Es wäre natürlich möglich, dass tatsächlich viele verschiedene Proteaseformen mit app. MW im Bereich von 240 bis 30 kDa (siehe Abschnitt 3.2.3c) an der PM assoziiert vorliegen, denn das Molekulargewichtsspektrum von bisher beschriebenen Proteasen ist sehr groß. Eine Carboxypeptidase aus Staphylococcus aureus ist mit 12 kDa (Gupta et al. , 2002) ein vergleichsweise kleines Enzym, wohingegen die menschliche, PM gebundene APN mit 110 kDa (Fournie Zaluski et al. , 1992) ein hohes Molekulargewicht besitzt und zudem noch als Homodimer vorliegt. Die hier untersuchten PM Proteasen wurden in bereits aktivem Zustand aus den Pflanzenwurzeln isoliert und es war notwendig, die Aktivität für den Nachweis dieser bisher uncharakterisierten Enzyme weiter zu erhalten. Deshalb könnte es während der Anreinigung zur Strukturveränderung der gesuchten Proteine aufgrund von Proteolyse oder Aggregatbildung gekommen sein.
Außerdem konnte die Identität der integral an der Plasmamembran gebundenen Endoprotease(n) nicht geklärt werden. Die caseinolytische Proteaseaktivität der chromato graphisch angereinigten Proteaseformen war im Vergleich zur endoproteolytisch spaltenden Serinproteinase Trypsin gut messbar und kann deshalb nicht nur auf die zwei massenspektrometrisch identifizierten Exopeptidasen zurückgehen, die als Metallo AP eingeordnet werden. Da die nach endogener Proteolyse an der Gerste PM im löslichen Überstand gefundenen Endoproteasen vom Aspartat und Cysteintyp (anhand der Inhibitorversuche) in gebundener Form nicht aktiv waren, muss es sich um andere bisher uncharakterisierte oder auch nur vorhergesagte Proteine handeln. Es könnte sich sogar um PM Proteine handeln, die noch gar nicht in den Datenbanken erfasst wurden. Außerdem II.b wurden neben den zwei Metallo AP aus der Hv Prot 5mM zwei Formen der P Typ H+ ATPasen sowie zehn verschiedene Aquaporine in den verschiedenen Reinigungsstufen der PM Protease von Gerste nachgewiesen. Es gibt verschiedene Erklärungen, warum diese abundanten PM Proteine in den massenspektrometrisch untersuchten Fraktionen vorhanden waren und warum die Identität einer PM gebundenen Proteinase nicht geklärt werden konnte.
a) Herausforderungen bei der Anreinigung bisher unbekannter Proteasen
Die Anreinigung eines proteolytisch aktiven Enzyms stellt eine große Heraus forderung dar, denn Proteasen spalten andere Proteine oder Peptide und einige Proteasen,
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wie Trypsin, sind in der Lage sich selbst autoproteolytisch zu spalten (Beynon und Bond, 2001). Normalerweise wird unkontrollierte Proteolyse in vivo verhindert, indem Proteasen als inaktive Vorstufen synthetisiert und dann an ihren Wirkungsort in die entsprechenden Kompartimente transportiert werden (Barrett und Rawlings, 2007). Durch die PM Präparation wurde die Kompartimentierung aufgehoben. Da keine Inhibitoren zugegeben wurden, könnte es zum proteolytischen Abbau der gesuchten PM Proteasen durch die aus der Vakuole oder der anderen Organelle freigesetzten Proteasen gekommen sein.
Proteolytische Prozessierung kann auch an den PM Vesikeln selbst stattgefunden haben. Normalerweise schränkt eine Membranverankerung die Beweglichkeit einer Protease und damit ihre Interaktion mit anderen Proteinen ein (Bond und Buttler, 1987). Zusätzlich zur Kompartimentierung wird die Aktivität von Proteasen durch verschiedene posttranslationale Modifikationen reguliert. Dazu zählen Oxidation von Aminosäuren, Phosphorylierung oder Acetylierung (Callis, 1995). Außerdem beeinflussen enzymeigene Eigenschaften, wie Temperatur und pH Optimum sowie Substratspezifität, aber auch die Interaktion mit spezifischen Proteaseinhibitoren (Habib und Fazili, 2007) die Aktivität einer Protease. Dieser Schutz vor unkontrollierter Proteolyse war jedoch an den PM Vesikeln nicht mehr wirksam. Die PM Proteasen waren bereits bei der PM Präparation aktiv und diese Aktivität wurde zwecks Nachweises weiter erhalten. Es kann folglich zu einem Proteinverlust oder sogar zu einer durch Proteolyse bedingten Veränderung der gesuchten PM Proteasen gekommen sein. Finnie und Svensson (2002) berichten von einer teilweisen Hydrolyse der ß Amylase, die während des Quellens des IPG Streifens mit der Probe vor der isoelektrischen Fokussierung auftrat. Die aus Gerstenkeimlingen extrahierten Proteine waren durch Acetonfällung präzipitiert worden, aber erst durch den Zusatz von Proteaseinhibitoren wurde der Abbau der ß Amylase durch die ebenfalls enthaltenen Proteasen verhindert. Auch andere Gruppen beobachteten an den von ihnen untersuchten Polypeptiden ein terminales Trimmen während der Gelelektrophorese. Jedoch wurde dieser Vorgang zunächst durch die niedrige Auflösung der SDS PAGE nicht entdeckt (Cooksen und Beynon, 1987; Beynon und Bond, 2001).
Die proteolytische Veränderung der gesuchten PM Proteasen kann also nicht nur während der PM Präparation durch freigesetzte Proteasen aus anderen Kompartimenten stattgefunden haben, sondern auch während der weiteren Anreinigung der PM gebundenen Proteasen. Bei dieser konnten mehrere Einfrier und Auftauzyklen aufgrund der verschiedenen zeitaufwendigen Arbeitsschritte nicht verhindert werden Da in der vorliegenden Arbeit proteolytische Reaktionen auch an den PM Vesikeln während einer Inkubation bei 4 °C gemessen wurden (Daten werden nicht gezeigt), werden deshalb sowohl
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Autoproteolyse als auch die Prozessierung der verschiedenen PM assoziierten Proteasen untereinander nicht ausgeschlossen. Die Proteinverkürzungen können sowohl durch endo als auch durch exoproteolytische Reaktionen entstanden sein.
Desweiteren könnten durch die verwendeten Reinigungsmethoden (Salz, Detergenzien, Volumeneinengung) gebundene Inhibitoren von zuvor inaktiven Protease formen entfernt worden sein. Das wäre eine Erklärung für die neu hinzugekommenen I hochaktiven Proteaseformen der Hv Prot 5mM die nach zymographischer Fraktionierung der Sol Hv Prot 5mM zunächst noch nicht zu sehen waren (siehe Abschnitt 3.2.3c). Hinweise auf eine Aktivierung PM assoziierter Proteasen durch endogene Proteolyse wurden bei der Gerste auch für vier Proteaseformen mit app. MW im Bereich von 64 – 51 kDa nachgewiesen. Desweiteren könnten inaktive Proteasen zusätzlich durch eine Konformationsänderung aufgrund einer pH Änderung in die aktive Form überführt worden sein (Khan und James, 1998). Denkbar wäre auch die Variante, bei der eine zuvor aktive Form durch den Verlust eines Aktivators oder Cofaktors ihre Aktivität verloren hat. In diesem Zusammenhang könnten schwache Banden im Zymogramm neben geringen Proteingehalten auf eine sehr enge Substratspezifität, auf Exopeptidaseaktivität oder auf eben diese verringerte Aktivität hinweisen. Diese und weitere Fragen wie der Einfluss der Präparationsmethode sowie der verschiedenen Anzuchtsbedingungen (Sand oder Hydrokultur; Verletzungsstress, Pathogenabwehr) können erst untersucht werden, wenn die eigentliche Proteinstruktur der PM gebundenen Proteasen geklärt wurde.
Die unterschiedlichen Proteasespektren der verschiedenen Proteaseformen Sol II.b (Hv Prot 5mM bis Hv Prot 5mM ) könnten zusätzlich auf das Vorhandensein von proteolytisch aktiven Mono oder Oligomeren hinweisen oder auf Formen, die sich durch posttrans lationale Modifikationen wie Glykosylierungen unterscheiden und deshalb ein unterschied liches Laufverhalten während der Gelelektrophorese besitzen. So gab es auch innerhalb der verschiedenen Anreinigungsformen der PM Proteasen aus Gerstewurzeln immer wieder Hinweise auf größere Proteinaggregate (>300 kDa) mit proteolytischer Aktivität. Zu den pflanzlichen hydrolytisch aktiven Proteinkomplexen zählen das Proteasom und der Clp Proteasekomplex im Stroma der Plastiden (Vierstra, 1996). Neben weiteren Oligomeren wie den Lon , Deg und SPP Proteasen gibt es sogar membrangebundene Protease komplexe (Adam und Clarke, 2002). Diese FtsH Proteasen sind an der inneren Mitochondrienmembran lokalisiert, wobei das aktive Zentrum entweder zum Intermembran raum oder zur Mitochondrienmatrix orientiert ist (Janska, 2005). Solche nicht kovalenten Verknüpfungen von Untereinheiten werden normalerweise in Gegenwart von SDS und DTT zerstört (Rehm und Letzel, 2010).
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Trotzdem wurden Proteaseformen im Zymogramm nachgewiesen, die über 200 kDa groß waren und auch im Sammelgel wurde Aktivität dokumentiert. Die Proben wurden vor der SDS PAGE zwecks Aktivitätserhaltung in Gegenwart von 1 % SDS nicht erhitzt, sondern nur 1 h bei RT inkubiert. Deshalb könnten Proteinkomplexe erhalten geblieben sein oder nur ein Teil der Untereinheiten wurde voneinander getrennt. Unterschiedlich gut getrennte Proteinkomplexe würden somit die unterschiedliche Anzahl an Proteaseformen, die nach jeder Reinigungsstufe fraktioniert wurden, erklären.
Viele Proteasen sind im Vergleich zu anderen Proteinen resistent gegenüber Denaturierung. Unter milden Denaturierungsbedingungen kann es sogar dazu kommen, dass die Substrate verstärkt zugänglich für die noch aktiven Proteasen werden (Beynon und Bond, 2001). So wurden kinetisch stabile Proteasen wie Papain oder Chymopapain erst durch Zufügen von Wärme in Gegenwart von SDS vollständig denaturiert (Manning und Colón, 2004). Ohne vorherige Denaturierung war der proteolytische Verdau dieser stabilen Proteasen durch die unspezifisch spaltende Proteinase K nicht einmal während einer 48 stündigen Inkubation möglich (Manning und Colón, 2004). Unvollständige Denaturierung einer PM Protease könnte folglich auch den Trypsinverdau behindert haben.
Allgemein handelt es sich bei den aus Pflanzen bisher beschriebenen stabilen Proteasen um lösliche und häufig exsudierte Formen wie Papain (Manning und Colón, 2004), Bromelain (Bhattacharya und Bhattacharyya, 2009) und Milin (Yadav et al. , 2009). Sie besitzen eine breite pH und Temperaturstabilität und weisen, soweit es untersucht wurde, Glykosylierungen auf (Ahmed et al. , 2009). Eine oder mehrere der PM Proteasen könnten, genauso wie diese sekretierten Proteasen, kinetisch stabile Proteine darstellen. Die SDS Resistenz dieser Proteingruppe wird auf die Kombination von α Helix und ß Faltblatt strukturen in einem Protein zurückgeführt (Manning und Colón, 2004). Die kinetische Stabilität der PM assoziierten Proteasen und deren Einfluss auf den Trypsinverdau vor der Massenspektrometrie bleiben also noch zu klären.
Die Identifizierung abundanter PM Proteine, wie P Typ H+ ATPasen (Sussman, 1994) und Aquaporine (Qi et al. , 1995), in den ausgewählten proteolytisch aktiven Fraktionen kann durch die Co Reinigung dieser PM Proteine und der zwei Metallo AP sowie der bisher noch unbekannten PM Proteinase erklärt werden. Dabei gibt es verschiedene Möglichkeiten, wie das zustande gekommen ist. So wurden höchstwahrscheinlich PM gebundene Proteasen, ATPasen und Aquaporine aufgrund ihrer Triton X 114 Resistenz und anderer ähnlicher Struktureigenschaften, wie der Nettooberflächenladung und dem app. MW, trotz verschiedener chromatographischer und gelelektrophoretischer Techniken co gereinigt. Für Sol + eine, in der Hv Prot 5mM nachgewiesenen, P Typ H ATPase sowie für ein Aquaporin wurde bereits eine Triton X 100 Resistenz gezeigt (Mongrand et al. , 2004; siehe Tabelle 4 3).
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Deshalb sind diese PM Proteine wahrscheinlich auch nicht mit Triton X 114 solubilisierbar II.b und das trifft vermutlich auch auf die in der Hv Prot 5mM detektierten ATPasen und Aquaporine zu.
Durch die Solubilisierung oder der späteren Volumenreduzierung durch Membran filtration könnte es auch zur Bildung von Proteinaggregaten gekommen sein (Kim et al ., 1993). Die Proben wurden in Gegenwart von SDS und DTT nicht erhitzt, deshalb könnten diese Aggregate genauso wie Proteasekomplexe erhalten geblieben sein. Die detektierten P Typ H+ ATPasen haben ein app. MW von 105 kDa und Aquaporine von 30 kDa. Sie liegen daher mit im app. MW Spektrum der verschiedenen zymographisch detektierten Protease formen der Gerste. Neben Proteasen, die als Oligomere vorliegen, könnte das Protease spektrum folglich auch durch die Bildung von verschiedenen Proteinaggregaten während der Anreinigung erklärt werden.
Auch bereits bei der Präparation der PM Vesikel stattgefundene Reaktionen könnten zu einer kovalenten Verknüpfung dieser verschiedenen PM Proteine geführt haben. Die Verwundung von Pflanzengewebe geht immer mit der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies und dem Abbau von Membranlipiden durch Peroxidation einher (Thompson et al. , 1987). Um Stressreaktionen innerhalb des abgeschnittenen Wurzelmaterials zu verringern, wurde das geerntete Material auf Eis aufbewahrt, jedoch standen die Pflanzenteile auf diese Weise längere Zeit bis zur eigentlichen Homogenisierung im Aufbruchpuffer. Kjellbom und Kollegen (1997) hatten die Arabinogalaktanproteinvernetzung in der Zuckererbse nach einer Inkubation des Blattmaterials von 15 Minuten bei 22 °C nachgewiesen. Bradley und Kollegen (1992) konnten bereits 2 Minuten nach der Verletzung ihrer Pflanzen eine erste Vernetzung von Zellwandproteinen messen. Der Prozess wird durch die Akkumulation von exogenem
H2O2 und einer Peroxidase vermittelt und kann durch DTT blockiert werden (Brisson et al. , 1994). Demnach könnten PM assoziierte Peroxidasen an der apoplastischen Seite der PM (Bhattacharjee, 2012), aber auch an der cytosolischen Seite (Lüthje et al. , 2011), in
Gegenwart von H 2O2 und eines geeigneten oxidierbaren Substrates, wie die SH Gruppe des Cysteins (Thompson et al. , 1987) oder Tyrosinreste (Schnabelrauch et al. , 1996), die Vernetzung nahe beieinander liegender PM Proteine katalysiert haben. Dies setzt jedoch i) eine nahe räumliche Anordnung der Proteasen mit einer P Typ H+ ATPase oder einem Aquaporin und ii) eine durch diese Vernetzung, dem sogenannten „cross linking“, unbeeinflusste Proteaseaktivität voraus.
Zusammenfassend könnten verschiedene methodisch bedingte Ursachen zur Vielfalt der PM Proteasen beigetragen haben und das Vorhandensein von P Typ H+ ATPasen und Aquaporinen in den verschiedenen angereinigten Proteaseformen erklären.
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i. Während der Anreinigung kam es zur unkontrollierten Proteolyse. Die proteolytischen Enzyme wurden durch Inter oder Intraproteolyse verkürzt, wodurch zuvor inaktive Proteasen aktiviert wurden, bereits aktive Formen inhibiert wurden oder aber die Proteaseaktivität trotz Proteinverkürzung erhalten blieb.
ii. Durch die verwendeten Detergenzien oder in Gegenwart von Salz wurden Inhibitoren oder Cofaktoren entfernt, wodurch Proteasen aktiviert oder inhibiert wurden.
iii. Eine oder mehrere PM Proteasen liegen als Proteinkomplex an der PM vor oder es handelt sich um kinetisch stabile Proteasen. Durch das fehlende Erhitzen in Gegenwart von SDS und DTT zwecks Aktivitätserhaltung wurden die PM Proteasen nicht vollständig denaturiert.
iv. Die PM Proteasen wurden zusammen mit abundanten PM Proteinen, wie P Typ H+ ATPasen und Aquaporinen, co gereinigt. Das geschah entweder aufgrund ähnlicher Proteineigenschaften, aufgrund von Proteinaggregatbildungen während der verschiedenen Volumeneinengungen oder es deutet auf eine kovalente Verknüpfung („cross linking“) nahe beieinander liegender PM Proteine während der PM Präparation hin.
b) Massenspektrometrie nicht-abundanter PM-gebundener Proteasen
Bisher wurden bei Pflanzen noch keine Endoproteasen an der PM nachgewiesen und II.b auch die massenspektrometrische Analyse der angereinigten Hv Prot 5mM hat keine Treffer für ein solches Enzym geliefert. Die gut messbare proteolytische Spaltung von Casein in Gegenwart des Gelstücks T2 (siehe Abbildung 3 17) geht aber höchstwahrscheinlich auf eine Endoprotease zurück, denn eine der massenspektrometrisch identifizierten Metallo AP wurde nur in dem Gelstück T3, das vergleichsweise geringe caseinolytische Aktivität zeigte, gefunden. Zusammengenommen weisen alle Indizien auf eine PM gebundene Endoprotease hin, die zwar hohe spezifische Aktivität besitzt, aber nur in geringer Proteinmenge an der Wurzel PM vorliegt. Zu deren Identifizierung müsste noch mehr Material für die Anreinigung eingesetzt werden (Fischer und Poetsch, 2006). Gleichzeitig könnten weitere Reinigungs methoden angewandt werden, um abundante PM Proteine wie die Aquaporine und P Typ H+ ATPasen so gut wie möglich zu entfernen, wobei jedoch der Proteinverlust der gesuchten Protease so gering wie möglich zu halten wäre. Auch die Probenbehandlung vor der Massenspektrometrie könnte Grund für die nicht gelungene Detektion einer PM gebundenen Endoprotease sein.
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Vor mehr als zehn Jahren wurden Membranproteine und die Massenspektrometrie als „un amour impossible“ diskutiert (Santoni et al. , 2000). Viele Forscher haben sich in den letzten Jahren mit dieser Problematik beschäftigt und mittlerweile gibt es viele neue methodische Ansätze (Helbig et al. , 2010; Cordwell und Thingholm, 2010; Barrera und Robinson, 2011). In dieser Arbeit wurden verschiedene Herangehensweisen getestet, angefangen bei der Anreinigung einer PM gebundenen Protease über 2D Gelelektro phorese (Daten werden nicht gezeigt). Da die Enzymaktivität zwecks Nachweises erhalten bleiben musste, wurde diese Methode jedoch nicht weiter verfolgt. Auch der Einsatz von Detergenzien hat großen Einfluss auf die Massenspektrometrie. Im Vergleich zu den verwendeten Detergenzien Lubrol und Triton X 100 produzierte nur Octylglucosid keine Artefakte bei der Massenspektrometrie. Schließlich wurden verschiedene Verdauungs enzyme sowohl im Gel als auch in Lösung getestet. Der fehlende massenspektrometrische Nachweis einer PM gebundenen Endoprotease vom Metallo oder Serintyp deutet aber auf weiteren Optimierungsbedarf hin. So könnte allein die Wahl des Verdauungsenzyms bereits entscheidend sein.
Hydrophobe Domänen enthalten nur selten geladene Aminosäurereste wie Lysin und Arginin und werden deshalb schlecht durch Trypsin oder Lys C gespalten (Helbig et al. , 2010). Aus diesem Grund wurden ausgewählte proteolytisch aktive Proben mit Chymotrypsin oder Elastase verdaut. Chymotrypsin spaltet Peptidbindungen am C Terminus der hydro phoben aromatischen Aminosäuren wie Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin (Appel, 1986). Elastase spaltet bevorzugt am C Terminus der Aminosäurereste mit kleinen hydro phoben Seitenketten wie Glycin, Valin, Leucin, Isoleucin und besonders Alanin (Shotton, 1970). Gegenüber anderen unspezifisch spaltenden Proteasen sollte Elastase am besten geeignet sein, massenspektrometrisch analysierbare Peptide von einer mittleren Masse zwischen 500 und 1500 Da zu generieren (Wang et al. , 2008a). Jedoch müssen aufgrund des großen Substratspektrums enorme Datenmengen verarbeitet werden, die im Fall der solubilisierten PM Fraktion teilweise zu groß für die verwendete Hardware waren und deshalb leider nicht ausgewertet werden konnten. Die auswertbaren Ergebnisse bestätigten aber den Vorteil verschiedener Verdauungsansätze. Durch die Kombination von Sol Trypsin und Elastase wurden fast doppelt so viele Proteine in der Probe Hv Prot 5mM identifiziert als mit Trypsin allein (siehe Abschnitt 3.3.3a).
Auch andere Gruppen waren in der Lage, durch verschiedene Kombinationen von Enzymen oder dem Zusatz bestimmter Chemikalien, wie Detergenzien, die Gesamtanzahl der identifizierten Proteine und speziell den Anteil membrangebundener Proteine zu erhöhen (Fischer und Poetsch, 2006; Wolff et al. , 2008; van Montfort et al. , 2002). In einem Überblick zeigen Speers und Wu (2007), wie gut die jeweiligen Strategien geeignet sind, integrale
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Membranproteine mittels Massenspektrometrie zu analysieren. Dabei erwähnen die Autoren eine Behandlung der Proben mit Bromcyan, das Proteine an der C terminalen Seite des Methionins spaltet. Anders als Arginin und Lysin soll Methionin in fast der Hälfte aller eukaryotischen TMD vorkommen (Eichacker et al. , 2004). Je länger und hydrophober Peptide sind, desto schlechter sind sie allerdings in der Massenspektrometrie detektierbar (Eichacker et al. , 2004). Bromcyan könnte also durch eine Spaltung innerhalb der TMD kürzere Peptide liefern und die Substratzugänglichkeit würde zudem im Vergleich zur enzymatischen Methode nicht abhängig von der Proteinfaltung oder der Anwesenheit von Membranlipiden sein (Speers und Wu, 2007). Diese chemische Verdauungsmethode in Kombination mit einem anschließenden Trypsinverdau wurde bereits erfolgreich bei der Analyse mitochondrialer Membranproteine aus Hefe verwendet (Prinz et al. , 2004). Dabei wurden über 50 % der nachgewiesenen Membranproteine aus den Mitochondrien als gering vorkommend beschrieben. Eine geringe Abundanz einer hochaktiven PM gebundenen Protease könnte durch Peptide anderer häufig vorkommender PM Proteine wie der Aquaporine überlagert worden sein.
Die Protease könnte weiterhin zusätzlich Modifikationen wie Glykosylierungen aufweisen. Die nach dem Verdau entstandenen Glykopeptide hätten dann ein größeres m/z Verhältnis (Masse/Ladung) und der Zuckeranteil könnte die Ionisierungseffizienz und damit die Sensitivität herabgesenkt haben (Ytterberg und Jensen, 2010).
Neben der Probenvorbereitung und dem Verdau spielt bei der Massenspektrometrie aber auch die Wahl der Datenbank eine entscheidende Rolle. Die Verwendung der umfassenden Datenbank SwissProt, die auch bakterielle Proteine enthält, zeigte sich gegenüber den artspezifischen Datenbanken ( Solanaceae, Poaceae ) als geeigneter, um bisher unbekannte Proteine in Pflanzen zu entdecken. So wurden nur mit Hilfe dieser Datenbank zwei Peptide in der angereinigten Proteasefraktion nachgewiesen, die Homo logien zur löslichen ß Untereinheit (NarH) der membrangebundenen Nitratreduktase aus E. coli aufwiesen (Blasco et al. , 1990). Durch diese Information war es schließlich möglich, mittels Sequenzvergleiche homologe Proteine in Populus trichocarpa zu identifizieren, die den löslichen bakteriellen Untereinheiten NarG und NarH ähneln. Die in der Pappel gefundenen Proteine entsprechen daher wahrscheinlich einer PM gebundenen Nitratreduk tase (PM NR), die bereits in Tabak biochemisch charakterisiert wurde (Stöhr, 1999) und deren Identität bisher noch unbekannt war.
Eine pflanzliche PM gebundene Protease könnte möglicherweise auch einer bakteriellen Proteaseform ähneln. Zwar enthält die SwissProt Datenbank bakterielle Proteine, aber die Verwendung einer Datenbank speziell von E. coli wäre eventuell bei der Suche nach einem seltenen PM Protein, wie es für die Endoprotease angenommen wird,
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hilfreich gewesen. Aufgrund der Ähnlichkeit einer pflanzlichen PM gebundenen Nitratreduktase mit einer bakteriellen Form wurde deshalb geprüft, ob die gesuchte Endoprotease bakteriellen Membranproteinasen ähnelt. Zu diesen Formen zählen die ATP abhängigen FtsH Proteasen (Tomoyasu et al. , 1993) und intramembranspaltende Proteasen (RIP Proteasen, Baker et al. , 2007). RIP fähige Proteasen wurden sowohl in Prokaryoten als auch in Eukaryoten nachgewiesen. Diese in drei Superfamilien eingeteilten Endoproteasen gehören zum Aspartat , Metallo und Serintyp (Baker et al. , 2007). Aufgrund der biochemischen Hinweise auf eine Serinproteinase an der pflanzlichen PM wurden die Rhomboidproteasen, die zum Serintyp gehören (Brown et al ., 2000; Baker et al. , 2007), für einen Sequenzvergleich ausgewählt.
Die Struktur der Rhomboidproteinase GlpG in E. coli (P09391, Bakterienstamm K12, Baker et al. , 2007), zeigt mit sechs TMD und einem app. MW von 31 kDa einen Aquaporin ähnlichen Aufbau. Zudem wurden über Genomanalysen dreizehn Rhomboid ähnliche Gene in Arabidopsis und zwölf Gene in Reis nachgewiesen (Freeman, 2008). Durch Sequenz vergleiche der bakteriellen Form wurde auch ein GlpG Homolog in der Gerste (F2DJ58, E value 9e 09) ermittelt. Für dieses uncharakterisierte und bisher nur vorhergesagte Protein werden sechs TMD und ein app. MW von 44 kDa prognostiziert. Aufgrund dieser Informationen wurde geprüft, ob die in der angereinigten Gerstenprobe identifizierten Aquaporine einschließlich der massenspektrometrisch detektierten Peptide mit diesem GlpG Homolog der Gerste sowie mit der bakteriellen Rhomboidform (GlpG) Sequenzähnlichkeiten aufweisen. Es wurden jedoch keine Übereinstimmungen gefunden.
+ II.b Zusätzlich wurde geprüft, ob die identifizierten P Typ H ATPasen in der Hv Prot 5mM auch Hinweise auf PM gebundene ATP abhängige Proteasen oder ATPasen mit proteolytischer Domäne darstellen könnten. Es wurden in der Literatur keine Berichte über ATPasen mit Proteasefunktion gefunden und alle bekannten pflanzlichen ATP abhängigen Proteinasen befinden sich in den Mitochondrien und Chloroplasten (Janska, 2005; Sakamoto, 2006). Deshalb wurde auch hier die bakterielle ATP abhängige Metalloproteinase aus E. coli herangezogen (P0AAI3, K12 Bakterienstamm, EC 3.4.24. ). Sie ist an der cyto plasmatischen Membranseite gebunden und besitzt zwei TMD am N Terminus (Tomoyasu et al. , 1993). Es wurden aber keine Übereinstimmungen zwischen dieser bakteriellen Proteinase und den Peptiden, die den zwei PM gebundenen H + ATPasen (P83970, Q9SH76) aus den proteolytisch aktiven Gelsegmenten (T1 3) zugeordnet wurden, gefunden. Diese Peptide können keinem bestimmten Motiv zugeordnet werden, wie der Mg 2+ Bindungsstelle, die bei den ATP abhängigen Proteinasen bekannt ist.
Neben der massenspektrometrischen Analyse weist auch die caseinolytische Aktivität nicht auf Rhomboid ähnliche oder andere intramembranspaltende Proteinasen an der
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pflanzlichen PM hin. Höchstwahrscheinlich werden diese Formen nicht mit dem verwendeten hydrophilen Substrat erfasst. Die caseinolytische Aktivität wurde wie die proteolytische Aktivität der ATP abhängigen FtsH von E. coli (Tomoyasu et al. , 1995) mit 5 mM 1,10 Phenanthrolin gehemmt. Diese Konzentration reicht aus, um das Zn 2+ aus dem katalytischen Zentrum der bakteriellen Proteinase zu entfernen. Das Mg 2+ , das für die ATPase Aktivität benötigt wird, wird jedoch erst in Gegenwart von 10 mM EDTA chelatiert (Tomoyasu et al. , 1995). Ein Einfluss von ATP und Vanadat auf die caseinolytische Aktivität PM von Hv Prot 5mM , wie er für die bakterielle FtsH gemessen wurde (Gallagher und Leonard, 1982), war allerdings nicht nachweisbar (Daten werden nicht gezeigt).
Damit bleibt die Frage nach der Identität der PM gebundenen Proteinase offen und es kann nicht vollkommen ausgeschlossen werden, dass eine intramembranspaltende oder eine ATP abhängige Proteinase an der Wurzel PM in Gerste existiert. Eventuell wurde diese gesuchte PM Protease bisher nicht in den zur Verfügung stehenden Datenbanken erfasst. Die meisten Einträge bisher uncharakterisierter Proteine basieren auf Genexpressions studien, bei denen das Material aus bestimmten Geweben (Blatt, Spross, Wurzel, Keimling), zu bestimmten Tageszeitpunkten oder nach speziellen Stresseinwirkungen wie Hitze oder Salzstress gewonnen wurde. Die Ernte der Pflanzenwurzeln von Tabak und Gerste fand immer in den ersten zwei bis drei Stunden der Lichtphase statt. Inwieweit die PM gebundene Proteaseaktivität einem diurnalen Rhythmus unterliegt, wurde noch nicht weiter untersucht.
Schließlich gibt es noch eine andere Erklärung, warum keine Endoprotease in den verschiedenen angereinigten PM Fraktionen massenspektrometrisch nachgewiesen wurde. Die Hydrolyse des Proteasesubstrates könnte durch ein Enzym katalysiert worden sein, das unter einer ganz anderen Funktion bekannt ist. Neben der Metallo AP, den vier P Typ H+ ATPasen und den siebzehn Aquaporinen wurden in der angereinigten und über SDS II.b PAGE fraktionierten Hv Prot 5mM siebzehn weitere Proteine identifiziert (ausgenommen die zwei Verdauungsenzyme Trypsin und Chymotrypsin), die vielleicht neben ihrer bekannten Funktion auch proteolytische Aktivität besitzen. Solche Enzyme, die neben ihrer primären katalytischen Funktion zusätzlich eine andere, völlig autonome Funktion ausüben, die regulatorisch oder auch strukturell sein kann, werden als „moonlighting“ Enzyme bezeichnet (Moore, 2004). Sie unterscheiden sich von anderen „multitask“ fähigen Proteinen durch das Fehlen entsprechend funktionaler Domänen, wodurch es keine zuverlässige direkte Methode oder Strukturanalyse gibt, um diese „moonlighting“ Proteine vorherzusagen (Jeffery, 2004a).
Die meisten mittlerweile bekannten “moonlighting” Proteine wie die Phospho glucoisomerase und die Glycerinaldehyd 3 phosphatdehydrogenase scheinen am Kohlen hydratmetabolismus beteiligt zu sein (Moore, 2004). Zu den pflanzlichen „moonlighting“ Enzymen gehört aber auch die Untereinheit A des eukaryotischen Elongationsfaktors 1
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(eEF 1A), der bei Arabidopsis in allen Organen nachgewiesen wurde. Dieses GTP bindende Protein reguliert die Proteinbiosynthese und ist gleichzeitig durch die Interaktion mit den Mikrotubuli über zwei Aktinbindungsstellen in der Lage, die Cytoskelettstruktur zu regulieren (Moore, 2004).
Auch einige Proteinasen werden als „moonlighting“ Proteine diskutiert. So erwähnt Moore (2004) neben weiteren Beispielen die mitochondriale Peptidase, die das Signalpeptid von Proteinen abspaltet, nachdem diese in die Mitochondrien transportiert worden sind. Bereits 1999 wurde nachgewiesen, dass die zwei Untereinheiten dieser Metalloproteinase
zwei Proteinen des Cytochrom bc 1 Komplexes entsprechen und folglich in den Komplex integriert werden können. Dabei laufen der Elektronentransfer und die Proteinprozessierung unabhängig voneinander weiter (Glaser und Dessi, 1999). Neben der regulierten intra membranen Proteolyse ist auch die Aspartatproteinase Presenilin, die katalytische Untereinheit des Multienzymkomplexes γ Sekretase, an der Regulation des Cytoskelett netzwerkes beteiligt (Khandelwal et al. , 2007) und einigen ATP abhängigen Proteinasen wird zusätzlich eine Chaperonaktivität nachgesagt (Suzuki et al. , 1997). Dazu zählen die mitochondriale Lon Protease (Serintyp) und Homologe der bakteriellen FtsH (Metallotyp) in Hefe (Jeffery, 1999), aber auch für die ATP unabhängige Serinprotease DegP aus E. coli wurde ein temperaturabhängiger Wechsel zwischen ihrer Chaperon und Proteaseaktivität gezeigt (Spiess et al. , 1999; Krojer et al. , 2002).
Es könnten folglich PM Proteine existieren, deren sekundäre Funktion die Spaltung von Peptidbindungen darstellt. Möglicherweise ist aber auch von der noch unbekannten PM Proteinase bisher nur die sekundäre Funktion in der Zelle bekannt. Dabei könnte es sich um lösliche Proteine wie Transkriptionsfaktoren oder Chaperone handeln. Generell findet das Umschalten zwischen diesen verschiedenen Funktionen bei „moonlighting“ Proteinen auf verschiedenen Wegen statt (Jeffery, 2004b). Das Protein könnte in ein anderes Zellkompartiment transportiert werden. Gleichzeitig könnten die unterschiedlichen Funktionen mit der Genexpression in verschiedenen Zelltypen zusammenhängen. Daneben könnte sich die Funktion durch die Interaktion mit einem kleinen Molekül, einem anderen Protein oder einem Multiproteinkomplex ändern. Außerdem könnte das Protein verschiedene aktive Zentren oder Lösungsmittel exponierte Oberflächenbereiche besitzen, die für die verschiedenen Funktionen benutzt werden (Jeffery, 2004b).
Zusammenfassend könnte die nicht gelungene Identifizierung einer endoproteolytisch spaltenden PM gebundenen Protease auf folgende Ursachen zurückgeführt werden:
i. Trotz hoher proteolytischer Aktivität war die Proteinmenge der angereinigten II.b PM Protease (Hv Prot 5mM ) für die massenspektrometrische Analyse zu gering und
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nur die anderen abundanten PM Proteine, wie Aquaporine und P Typ H+ ATPasen wurden detektiert.
ii. Die hauptsächlich in dieser Arbeit für den Verdau verwendete Serinprotease Trypsin spaltet zwar spezifisch nach Arginin und Lysin, aber wenn Prolin als Nachbaramino säure (an C terminaler Seite) folgt, findet an dieser Stelle keine Hydrolyse statt (Thiede et al. , 2000). Jeweils eine dieser sogenannten „missed cleavage sites“ wurde bei der Datenanalyse berücksichtigt. Bei der massenspektrometrischen Analyse der potentiellen Proteasesubstrate wurde sogar eingeräumt, dass ein Teil der Schnittstellen nicht auf Trypsin zurückgeht (semitryptischer Verdau angenommen). Trotzdem könnten Peptide entstanden sein, die aufgrund fehlender Ladungen (kein Lysin/Arginin) nicht ionisierbar waren und deshalb nicht detektiert wurden. Da eine vollständige Sequenzabdeckung nur durch eine Kombination verschiedener Verdauungsenzyme erreicht werden kann (Thiede et al. , 2000), sollte bei der Optimierung des Verdaus in weiteren Experimenten eine Kombination der hier bereits getesteten Enzyme Chymotrypsin und Elastase in Betracht gezogen werden.
iii. Die Proteasen könnten glykosyliert sein und die nach Trypsinverdau entstandenen Peptide wurden aufgrund veränderter Masse nicht dem womöglich doch schon in den verwendeten Datenbanken erfasstem Protein zugeordnet.
iv. Die gesuchte PM Protease ist in den ausgewählten Datenbanken nicht enthalten oder das proteolytische Enzym ähnelt bakteriellen Formen, die in der verwendeten SwissProt Datenbank nicht erfasst sind.
v. Die PM Protease könnte zu den „moonlighting“ Proteinen gehören. Sie könnte folglich massenspektrometrisch identifiziert worden sein, ist aber bisher nur unter ihrer nicht proteolytischen Funktion bekannt und wurde deshalb nicht als Protease ausgewiesen.
Anschließende Arbeiten sollten eine Optimierung der Probenvorbereitung und des Verdaus berücksichtigen. Zudem ist wichtig, verschiedene Datenbanken bei der Auswertung zu verwenden, um neben den hier nachgewiesenen Metallo AP die Identität einer PM integralen Endoprotease und anderer PM gebundener Proteine eindeutig klären zu können.
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4.3 Wie sind die PM-Proteasen an die Membran gebunden?
Die Existenz löslicher, peripher assoziierter, Triton X 114 solubilisierbarer sowie Triton X 114 resistenter Proteasen an den PM Vesikeln von Tabakwurzeln wurde bereits mit Hilfe der Triton X 114 Fraktionierung in der Vorarbeit gezeigt. Der Hauptanteil der an PM Vesikeln gemessenen caseinolytischen Proteaseaktivität wurde sowohl bei Tabak als auch bei Gerste nicht mit Triton X 114, sondern mit Octylglucosid solubilisiert. Zudem waren auch die Exopeptidaseaktivitäten (AP und CP Aktivität) in der Triton X 114 resistenten Fraktion sowohl von Tabak als auch von Gerste messbar gewesen. Da die Solubilisierbarkeit eines Proteins einen Hinweis auf die Membranverankerung gibt, könnten eine oder mehrere der solubilisierten Proteasen nicht über TMD, sondern über GPI Anker an der Wurzel PM gebunden sein.
Proteine, die mit Triton X 100 bei 4 °C nicht solubilisiert werden können, sind in Membranbereichen lokalisiert, die in der Literatur als detergenz resistente Membranen (DRM) bezeichnet werden (Pike, 2004). Dazu zählen auch Proteine, die über einen GPI Anker an der extrazellulären Seite der PM gebunden sind (Brown und Rose, 1992). Chemisch betrachtet unterscheiden sich die nicht ionischen Detergenzien Triton X 100
(4 (C 8H17 )C 6H4(OCH 2CH 2)nOH, n~10) und Triton X 114 (t Oct C6H4 (OCH 2CH 2)nOH, n~7 8) in der Länge ihrer hydrophilen Seitenkette. Der größte Unterschied besteht in ihrem Wolkenpunkt, der für Triton X 100 bei 63 69 °C und für Triton X 114 bei 22 28 °C liegt (Sigma, Produktinformationen, 1999). Da sich jedoch die kritische Mizellenkonzentration (CMC) und der Hydrophil Lipophil Balancewert ähnlich sind, könnte die Solubilisierung von Membranproteinen aufgrund dieser Ähnlichkeiten beider Detergenzien vergleichbar sein.
So wurden in Experimenten mit PM Proteinen der Niere GPI verankerte Proteine vorrangig (73 %) in der Triton X 114 resistenten Fraktion gefunden, wohingegen Membran proteine mit einer einzelnen TMD hauptsächlich (62 %) in der Triton X 114 Phase akkumulierten (Hooper und Bashir, 1991). Neben einer Behandlung mit einer Phospholipase C (PLC) wurden die GPI verankerten Proteine nur mit Hilfe von Detergenzien mit hoher CMC, wie Octylglucosid oder CHAPS, von der PM gelöst (Hooper und Bashir, 1991). Dazu zählte auch die tierische Aminopeptidase P (APP oder auch Xaa Pro Aminopeptidase, Simmons und Orawski, 1992), die nach einer Behandlung mit PLC in die wässrige Phase überführt wurde. Proteine mit einer TMD wurden dagegen durch Triton X 114, aber auch durch alle anderen getesteten Detergenzien solubilisiert (Hooper und Turner, 1988). Das galt auch für andere membrangebundene tierische Exopeptidasen, wie APN und DPPIV, die aufgrund ihrer einzelnen TMD in der Triton X 114 Phase angereichert wurden.
120 DISKUSSION
Die hier nachgewiesenen Triton X 114 resistenten PM Proteasen könnten also in DRM Bereichen an der PM lokalisiert sein, wobei dieser Begriff fälschlicherweise häufig mit „lipid rafts“ gleichgesetzt wird (Lichtenberg et al. , 2005; Brown, 2006). Bei „lipid rafts“ handelt es sich um dynamisch verändernde und sehr unterschiedlich große Membrandomänen, deren Funktionen der Membranfluss / transport, Signaltransduktion und Zellpolarisierung sind (Simons und Gerl, 2010). Diese Mikrodomänen unterscheiden sich vom Rest der Membran durch die Anordnung der Lipide aufgrund des erhöhten Anteils an Cholesterin (bei Tieren) oder Sterolen (bei Pflanzen) und Sphingolipiden in einer flüssig geordneten Phase (Brown, 2006; Mongrand et al. , 2004). GPI verankerte Proteine werden zwar in den DRM Fraktionen nachgewiesen, jedoch handelt es sich dabei nur um Aggregate von „lipid raft“ Domänen. Sie entsprechen nicht dem natürlichen Zustand dieser Mikrodomänen in den Zellen (Brown, 2006).
Erste Hinweise für eine Lokalisierung der PM Proteasen in DRM Bereichen zeigen Vergleiche massenspektrometrisch untersuchter angereinigter DRM Proteine mit den eigenen erhobenen Daten. Eine P Typ H+ ATPase (Q03194) und ein Aquaporin (Q08451), die in der solubilisierten Gerstenfraktion nachgewiesen und damit bereits als Triton X 114 resistent eingestuft wurden, befanden sich auch in DRM Fraktionen aus Tabakblättern (siehe Tabelle 4 3; Mongrand et al., 2004). Andere in der Literatur als DRM lokalisiert klassifizierte PM Proteine wurden in der vorliegenden Arbeit nur nach endogener Proteolyse an den PM Vesikeln freigesetzt, wovon acht auch in Gegenwart des Protease inhibitorcocktails von der PM abgetrennt wurden (siehe Tabelle 4 3). Die P Typ H+ ATPase und das Aquaporin aus der solubilisierten PM Fraktion könnten darauf hinweisen, dass die ebenfalls in der angereinigten PM Probe von Gerstewurzeln enthaltenen Proteasen in bestimmten Membranbereichen lokalisiert sind.
Es wäre in diesem Zusammenhang interessant zu prüfen, ob die von der PM abgewaschenen löslichen oder peripher assoziierten Proteasen identisch sind mit den PM gebundenen und Triton X 114 solubilisierbaren Membranproteasen. Beim Menschen gibt es AP, die sowohl als membrangebundene als auch als lösliche Formen existieren. Dazu zählt die über den N Terminus an der extrazellulären Seite der PM gebundene APN (Antczak et al. , 2001). Für diese Form wurden fünf ähnliche Gerstenproteine ermittelt (siehe Tabelle 4 2), die wie die tierische APN, teilweise in den „lipid rafts“ organisiert sein könnten (nach Aussagen von Prof. Dr. S. Ansorge Vortrag: Zelluläre Membranpeptidasen als Targets zur Therapie inflamentöser Erkrankungen, Greifswald 2011).
121 DISKUSSION
Tabelle 4-3: Massenspektrometrisch nachgewiesene Proteine aus Tabak und Gerste, die von anderen Gruppen als detergenz-resistente Membranproteine klassifiziert wurden.
Proteinname Protein ID detektiert bei siehe Tabelle Vergleichsreferenz P Typ H+ ATPase P22180 Tabak PM Proteolyse 3.10 Mongrand et al. , 2004 P Typ H+ ATPase Q03194 Tabak PM Proteolyse (+PI); 7.2 (Anhang) Mongrand et al ., 2004 solubilisierte Gerste PM 3.7 P Typ H+ ATPase At4g30190 Tabak PM Proteolyse (+PI) 7.2 (Anhang) Borner et al. , 2005 V Typ H+ ATPase UE A At1g78900 Tabak PM Proteolyse (+PI) 7.2 (Anhang) Borner et al. , 2005 V Typ H+ ATPase Q9M5Z8 Tabak PM Proteolyse (+PI) 7.2 (Anhang) Morel et al. , 2006 Aquaporin Q08451 Tabak PM Proteolyse (+PI); 7.2 (Anhang) Mongrand et al. , 2004 solubilisierte Gerste PM 3.7 Aquaporin Q8W506 Tabak PM Proteolyse (+PI) 7.2 (Anhang) Morel et al. , 2006 Calreticulin At1g56340 Tabak PM Proteolyse 3.10 Borner et al. , 2005 HR induziertes Protein At3g01290 Tabak PM Proteolyse 3.10 Borner et al. , 2005 Elicitor induziertes Protein Q9FXT1 Tabak PM Proteolyse (+PI) 7.2 (Anhang) Morel et al. , 2006 Elongationsfaktor P43643 Tabak PM Proteolyse (+PI) 7.2 (Anhang) Morel et al. , 2006
Ob nun eine der PM gebundenen Proteasen aus Tabakwurzeln über einen GPI Anker verknüpft ist, wurde bereits in ersten Vorarbeiten geprüft. Es wurde versucht, die Freisetzung einer Protease durch die Phosphatidylinositol spezifische Phospholipase C (PI PLC) zu zeigen und Änderungen der Hydrophobizität des freigesetzten Proteins nachzuweisen. Eine Behandlung der PM Vesikel aus Tabakwurzeln mit der PI PLC hatte zwar keine eindeutigen Ergebnisse erzielt, jedoch wurde mittels HIC eine Verschiebung in I der Hydrophobizität der mit PI PLC behandelten Nt Prot 10mM gezeigt. Möglicherweise war die zweistündige Inkubation der PM Vesikel mit der PI PLC nicht ausreichend gewesen, um den GPI Anker von der Protease I abzuspalten. Simmons und Orawski (1992) konnten 90 % der X Pro Aminopeptidase aus der Rattenlunge erst durch eine acht bis elfstündige Inkubation mit der PLC freisetzen. Des Weiteren könnte der GPI Anker im Vergleich zu der von Low und Kollegen (1986) beschriebenen Zusammensetzung anders aufgebaut sein. Durch eine zusätzliche Acetylierung der Inositolkopfgruppe würde eine zusätzliche Membran verankerung existieren und eine Behandlung mit PI PLC würde das Protein nicht von der PM abtrennen (Elortza et al. , 2006).
Verschiedene GPI verankerte Proteine wurden bereits in Pflanzen nachgewiesen (Takos et al. , 1997; Sherrier et al. , 1999; Oxley und Bacic, 1999; Elortza et al. , 2006). Mittels Massenspektrometrie wurde in dieser Arbeit jedoch nur ein GPI verankertes Protein in Form eines Fasciclin ähnlichen Arabinogalaktanproteins beim Tabak nach endogener Proteolyse gefunden. Für die Vorhersage der GPI verankerten Proteasen in Arabidopsis (Borner et al. , 2003) und Reis (Eisenhaber et al. , 2003) wurden von den Autoren entwickelte Algorithmen verwendet. Dabei wurde nach einer N terminalen Signalsequenz gesucht, die im ER abgespalten wird, sowie nach einem hydrophoben Carboxylende. Letzteres dient als Erkennungssignal für den Transamidase Enzymkomplex (Borner et al. , 2002), der das
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Protein nach Abspaltung des Carboxylendes auf einen GPI Anker überträgt (Takos et al. , 2000). Die in beiden Pflanzenarten vorhergesagten GPI verankerten Proteasen werden dem Aspartat , Metallo und Cysteintyp zugeordnet (siehe Tabelle 4 4), wovon bisher experimentell mit Hilfe einer PI PLC oder Phospholipase D Behandlung und anschließender Triton X 114 Fraktionierung nur zwei Aspartatproteasen bei Arabidopsis identifiziert wurden (Elortza et al. , 2003; Elortza et al. , 2006).
Ein Sequenzvergleich der GPI verankerten Aspartatproteinase aus Arabidopsis (At5g10080, Elortza et al. , 2003; entspricht UniProt ID Q9LX20) mit der nach endogener PM Proteolyse von der Hv Prot 5mM abgegebenen Aspartatproteinase (Phytepsin, P42210) zeigte nur geringe Ähnlichkeit (E value: 3e 07). Deshalb wurden zusätzlich Sequenz vergleiche der vorhergesagten GPI verankerten Proteinasen aus Arabidopsis (Eisenhaber et al. , 2003; Borner et al. , 2003) mit Proteindatenbanken für Tabak und Gerste durchgeführt. Es konnten nur für Gerste anhand der verwendeten Kriterien entsprechende homologe Proteine gefunden werden, die alle bisher nur vorhergesagt wurden und von denen sechs als Aspartat , sechs als Metallo und dreiunddreißig als Cysteinendoproteasen eingestuft werden (siehe Tabelle 4 4). Dabei wurden Sequenzhomologien zwischen der GPI verankerten Cysteinproteinase aus Arabidopsis und der von den PM Vesikeln abgetrennten Papain ähnlichen Cysteinproteinase aus Gerste (B4ESE8) aufgedeckt (siehe Tabelle 4 4, grau unterlegt). Jedoch wird diese anhand der Algorithmen (PredGPI 14 und big PI Predictor 15 ) nicht als GPI verankert eingestuft, was auch auf andere der ermittelten Gerstenproteine zutrifft (siehe Tabelle 4 4).
14 http://gpcr2.biocomp.unibo.it/gpipe/pred.htm (Pierleoni et al. , 2008) 15 http://mendel.imp.ac.at/sat/gpi/gpi_server.html (Eisenhaber et al. , 2000)
123 DISKUSSION
Tabelle 4-4: Sequenzvergleiche GPI-verankerter Proteasen aus Arabidopsis thaliana mit Proteindatenbankeinträgen für Gerste und Tabak. Die über UniProt 1 bezogenen Sequenzen der Proteasen von Arabidopsis thaliana (Borner et al. , 2003; Elortza et al. , 2003 und 2006) wurden über den NCBI Standard Protein Blast 2 mit Datenbankeinträgen (DB) für Hordeum vulgare (taxid:4513, Hv) und Nicotiana tabacum (taxid:4097, Nt) verglichen. Es wurden nur die Treffer mit einem maximalen „Score“ von mindestens 200 und einer maximalen Identität von mehr als 30 % aufgeführt. Protease ID a Ref. a Uni ID b MW PF b Info b GPI c TMDd DB e Hits e Protein e max E GW e UniProt MW Info f GPI c TMDd Ref. a typ [kDa] b Id. e value e ID f [kDa] f
Aspartat At5g10080 A,B, Q9LX20 58 A1 Vorstufe, 497 /503 0/0 Hv 101 BAK05106.1 49% 4e 156 Bl F2ECN4 60 A1, vg 535 /535 1/0 D C PM BAJ95388.1 36 4e 88 S, W F2DJW7 56 A1, vg 503 /505 1/0 D BAJ91083.1 39 2e 86 B F2D7L2 56 A1, vg 509 /510 1/1 D BAK06209.1 37 3e 78 Bl F2EFT7 55 A1, vg 480 /480 2/0 D BAK06090.1 37 3e 78 Sa F2EFG8 55 A1, vg 480 /480 2/0 D At1g65240 B Q9S9K4 52 A1 Vorstufe, 448 /449 1/1 Hv 101 BAJ96014.1 49% 1e 148 S, W F2DLP3 52 A1, vg 460 /460 1/0 D PM At1g05840 C F4IAD5 53 A1 Vg 454 /461 1/0 Hv 100 BAJ96014.1 55% 2e 180 s.o. s.o. At1g08210 C n.b. At2g17760 C Q8VYV9 56 A1 PM 484 /493 2/1 Hv 101 BAJ95388.1 49% 5e 147 s.o. s.o. BAK06209.1 51% 8e 146 s.o. s.o. BAK06090.1 49% 1e 145 s.o. s.o. BAJ91083.1 50% 5e 130 s.o. s.o. BAK05106.1 41% 2e 98 s.o. s.o. At3g02740 C Q9M8R6 53 A1 PM 457 /466 1/0 Hv 100 BAJ96014.1 52% 4e 163 s.o. s.o. At3g51330 C Q84WU7 58 A1 Membran 504 /503 2/0 Hv 86 BAK06209.1 45% 1e 124 s.o. s.o. BAK06090.1 45% 2e 124 s.o. s.o. BAJ95388.1 43% 2e 116 s.o. s.o. BAJ91083.1 41% 3e 111 s.o. s.o. BAK05106.1 40 2e 88 s.o. s.o. At3g51350 C F4J3C0 57 A1 499 /507 1/0 Hv 93 BAK06090.1 42% 1e 111 s.o. s.o. BAK06209.1 42% 1e 111 s.o. s.o. BAJ95388.1 40% 1e 100 s.o. s.o. BAJ91083.1 39% 2e 99 s.o. s.o. BAK05106.1 38 5e 79 s.o. s.o. At4g35880 C B3LF45 58 A1 Membran 499 /498 1/1 Hv 100 BAK06209.1 56% 5e 170 s.o. s.o. BAK06090.1 56% 6e 170 s.o. s.o. BAJ95388.1 44% 5e 148 s.o. s.o. BAJ91083.1 48% 2e 136 s.o. s.o. BAK05106.1 43% 6e 105 s.o. s.o. At5g36260 C Q4V3D2 52 A1 Membran 456 /458 1/2 Hv 100 BAJ96014.1 48% 1e 150 s.o. s.o.
Metallo At1g24140 C Q5XF51 43 M10 Membran 358 /352 2/0 Hv 62 BAJ94792.1 52% 1e 116 S, W F2DC11 38 M10, vg 343 /343 3/1 D BAJ93963.1 47% 4e 101 S, W F2D2W1 38 M10, vg 337 /337 0/0 D BAJ98922.1 47 5e 100 S, W F2DV01 38 M10, vg 337 /337 1/0 D BAJ94176.1 42 3e 75 S, W F2DGF5 40 M10, vg 347 /345 2/1 D At1g59970 C Q9ZUJ5 40 M10 PM 337 /334 1/0 Hv 54 BAJ93963.1 49% 8e 103 s.o. s.o. BAJ98922.1 48% 6e 102 s.o. s.o. BAJ94792.1 45 4e 93 s.o. s.o. BAJ94176.1 42 2e 75 s.o. s.o. At1g70170 C O04529 42 M10 Vg, PM 349 /355 2/1 Hv 61 BAJ93963.1 51% 9e 110 s.o. s.o. BAJ98922.1 51% 9e 109 s.o. s.o. BAJ94792.1 52% 2e 108 s.o. s.o. BAJ94176.1 43 5e 79 s.o. s.o. BAJ90264.1 43 9e 64 B F2D593 38 M10, vg 335 /335 1/0 D 124 BAJ93576.1 43 9e 64 S, W F2DEQ5 38 M10, vg 336 /336 1/1 D 1 http://www.uniprot.org/; 2 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome
Protease ID a Ref. a Uni ID b MW PF b Info b GPI c TMDd DB e Hits e Protein e Max E GW e UniProt MW Info f GPI c TMDd Ref. a typ [kDa] b Id. e value e ID f [kDa] f
Metallo At2g45040 C Q8GWW6 39 M10 Membran 317/317 0/0 Hv 78 BAJ94176.1 50 1e 96 s.o. s.o. (weiter) BAJ93963.1 48 1e 76 s.o. s.o. BAJ98922.1 48 1e 75 s.o. s.o. BAJ94792.1 45 2e 73 s.o. s.o. BAJ90264.1 49 1e 72 s.o. s.o. BAJ93576.1 49 1e 72 s.o. s.o. At4g16640 C O23507 41 M10 Membran 339 /346 3/1 Hv 55 BAJ94176.1 52 8e 107 s.o. s.o. BAJ93963.1 45 2e 86 s.o. s.o. BAJ98922.1 45 4e 85 s.o. s.o. BAJ94792.1 49 3e 83 s.o. s.o. BAJ90264.1 51 2e 78 s.o. s.o. BAJ93576.1 51 2e 78 s.o. s.o.
Cystein At3g43960 C Q9LXW3 42 C1 Membran 351 /349 1/1 Hv 101 BAJ85145.1 49 1e 109 B F2CQM4 47 C1, vg 411/419 1/1 D CAQ00105.1 51 6e 107 W B4ESE8 50 C1, vg 439/432 1/1 D BAH11164.1 51 8e 105 B B7X948 50 C1 442/431 1/1 E BAK03074.1 47 9e 97 S, W F2E6V2 51 C1, vg 451/450 1/1 D ACI00280.1 47 9e 97 .n.a. B5TWK8 51 C1 451/450 1/1 F CAQ00106.1 47 4e 96 S B4ESE9 51 C1, vg 445 /447 2/1 G CAB09697.1 46 3e 87 n.a. O04675 40 C1 342/349 1/1 H CAQ00103.1 43 8e 86 S B4ESE6 39 C1, vg 331/339 0/0 D CAB09699.1 46 8e 85 Sa O04677 40 C1 342/353 1/1 I AAD10337.1 44 1e 84 n.a. Q9T0P3 40 C1, Vorstufe 342/353 1/1 J CAQ00104.1 41 1e 82 B B4ESE7 38 C1, vg 326/334 0/0 G CAQ00109.1 42 2e 79 S B4ESF2 40 C1, vg 347/355 1/1 D BAJ92693.1 52 2e 79 S F2DC72 32 C1, vg 264/271 1/1 D P25250.1 43 2e 78 Sa P25250 41 C1 353/345 1/0 K P25249.1 42 2e 77 Sa P25249 40 C1 348/340 1/0 K BAJ90119.1 44 9e 77 S F2D4U8 48 C1, vg 431/441 1/0 D CAQ00107.1 45 8e 75 Sa B4ESF0 48 C1 431/441 1/0 G CAQ00108.1 38 5e 71 B B4ESF1 40 C1 345/349 1/0 D BAK05870.1 40 4e 69 Bl F2EEU8 37 C1, vg 320/325 1/1 D BAJ99186.1 36 1e 68 S, W F2DVR5 43 C1, vg 366/362 3/1 D CAQ00110.1 35 6e 67 S B4ESF3 44 C1 384/384 1/0 G BAJ85482.1 39 1e 66 B F2CRL1 37 C1, vg 330/336 1/1 D BAK07452.1 38 2e 66 Bl F2EJD0 37 C1, vg 329/334 1/1 D BAJ85314.1 38 2e 66 S F2CR43 40 C1, vg 345/346 1/1 D BAK02675.1 40 5e 66 S, W F2E5Q3 37 C1, vg 313/322 1/0 D 2FO5_A 48 8e 66 n.a. P25250 s.o. Isoform 2 BAJ95283.1 37 1e 65 S, W F2DJL2 37 C1, vg 329/330 1/0 D BAJ99761.1 48 2e 65 S, W F2DXE0 31 C1, vg 271/279 0/0 D CAB09698.1 37 3e 65 n.a. O04676 37 C1 329/330 1/0 H CAD66657.1 38 2e 63 B Q7PCC5 41 C1 357/350 1/0 L BAK04945.1 37 1e 62 Bl F2EC73 39 C1, vg 336/332 1/0 D P05167.1 39 2e 62 Sa P05167 39 C1, Aleurain 337 /348 1/1 M BAJ88051.1 39 5e 62 B F2CYY0 39 C1, vg 337 /348 1/1 D a nach Referenzen: A – Elortza et al. , 2003; B – Elortza et al. , 2006; C – Borner et al. , 2003; D – Matsumoto et al. , 2011; E – Watanabe et al. , 2009; F – Liu, 2008; G – Martinez und Diaz, 2008; H – Sorensen und Lok, 1997; I – Lok und Sorensen, 1997; J – Porali et al. , 1997; K – Mikkonen et al. , 1996; L – Scharrenberg et al. , 2003; M – Rogers et al. , 1985 b nach UniProtKB/SwissProt (http://www.uniprot.org/); ermittelt über Eintrag bei TAIR Datenbank (http://www.arabidopsis.org/index.jsp); Proteininformationen von UniProt: PF – Peptidasefamilie c GPI – Glykosylphosphatidylinositol Anker; angegeben ist die vorhergesagte C terminale Aminosäure, die mit dem GPI Anker verknüpft wird; verwendete Algorithmen (x/y): x – PredGPI (http://gpcr2.biocomp.unibo.it/gpipe/pred.htm) nach Pierleoni et al. , 2008; y – big PI Predictor (http://mendel.imp.ac.at/sat/gpi/gpi_server.html) nach Eisenhaber et al. , 2000; fett signifikant d TMD – transmembrane Domänen wurden nach zwei Algorithmen berechnet (x/y), x = HMMTOP; y = TMHMM (Links siehe Tabelle 4 2) e Ergebnisse der Sequenzvergleiche über NCBI Blast; E value (Erwartungswert): Je kleiner der Wert, desto signifikanter ist die Sequenzhomologie. GW – Gewebe, das für die mRNA Gewinnung genutzt wurde. (S – Spross, W – Wurzel, B – Blatt, Bl – Blüte, Sa – Samen/Keimling
f Sequenzabgleich der Blast Suche mit UniProt Einträgen, Angabe entsprechender Referenzen; Informationsreihenfolge: (Proteasetyp bei allen Endoprotease), Peptidasefamilie (z.B. A1) Proteinnachweis (vg – vorhergesagt aufgrund vom Transkriptnachweis), weitere Abkürzungen: n.b. nicht bestimmbar; s.o. – siehe oben
DISKUSSION
4.4 Physiologische Bedeutung PM-gebundener Proteasen bei Pflanzen
Proteasen sind in allen Pflanzenorganen enthalten und spielen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien der Pflanzen wie bei der Bildung des Suspensors, der Stomatabildung oder während der Blütezeit eine Rolle (van der Hoorn, 2008). Für viele pflanzliche Proteasen gibt es bereits phänotypische Untersuchungen, jedoch sind nur die wenigsten von ihnen funktionell charakterisiert. Obwohl subzellulare Lokalisierung und biochemische Rolle oft innerhalb eines Clans konserviert sind, ist eine Vorhersage der biologischen Funktion einer Protease anhand der Familienzugehörigkeit allein nicht möglich (van der Hoorn, 2008). Deshalb lag in der vorliegenden Arbeit neben der Sequenzanalyse ein weiterer Schwerpunkt auf der Klärung von Funktion und Regulation der PM gebundenen Proteasen.
a) Hinweise zur Regulation der PM-Proteaseaktivität
Proteasen werden sowohl räumlich als auch zeitlich streng reguliert. Sie werden immer als inaktive Vorstufen (Zymogene) gebildet, deren Aktivierung die Proteolyse N terminaler Peptidbindungen beinhaltet (Neurath, 1989; Khan und James, 1998). Einmal aktivierte Enzyme werden zusätzlich durch die Interaktion mit anderen Molekülen wie Inhibitoren und Metallionen (Barrett und Rawlings, 2007) sowie durch posttranslationale Modifikationen (Callis, 1995) beeinflusst. Es gibt folglich zwei grundlegende Optionen für die Regulation der Proteasen: i) proteolytische Abspaltung einer bestimmten Proteinsequenz, die eine in jedem Fall irreversible Konformationsänderung bewirkt sowie ii) Konformations änderungen durch das Binden anderer Moleküle, die reversibel oder irreversibel sein können.
Im Hinblick auf die Charakterisierung der untersuchten PM Proteasen wurde der Einfluss verschiedener Proteaseinhibitoren und zweiwertiger Metallionen geprüft. Dabei fiel bei Tabak besonders der aktivierende Einfluss von EDTA auf die PM assoziierte caseinolytische Proteaseaktivität und der negative Ca 2+ Effekt auf zwei angereinigte und zymographisch fraktionierte Proteaseformen auf. Eine hemmende Wirkung der Ca 2+ Ionen ist so noch nicht in der Literatur beschrieben worden. Ca 2+ gilt allgemein als positiver Effektor der Proteasen (Beynon und Bond, 2001), wie es in der vorliegenden Arbeit auch für drei proteolytisch aktive Polypeptide (134, 115, 102 kDa) aus der solubilisierten PM Fraktion aus Tabakwurzeln gezeigt wurde. Aktivitätserhöhungen durch Ca 2+ wurden für eine membrangebundene Metallo AP aus menschlichem Gewebe (APA, Claperon et al., 2008) und für Ca 2+ abhängige Cysteinproteinasen, den sogenannten Calpainen, nachgewiesen. Pflanzliche Homologe der Calpaine stellen die Phytocalpaine dar, die mittels Vergleich von
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cDNA Datenbanken in elf verschiedenen, mono oder dikotylen Pflanzen, wie Gerste oder Tomate nachgewiesen wurden und zur Peptidasefamilie C2 (Clan CA) gehören (Margis und Margis Pinheiro, 2003).
Der Einfluss von Ca 2+ und EDTA auf die Exopeptidasen wurde nicht gezielt geprüft. Da aber die Aktivitätserhöhung durch EDTA bei Tabak sowohl für die caseinolytische Aktivität an den PM Vesikeln als auch an den angereinigten Formen im Zymogramm gezeigt wurde, scheint es sich dabei um endoproteolytische Formen zu handeln. Der nachgewiesene negative Effekt von Ca 2+ könnte durch eine Konformationsänderung zustande gekommen sein. So wird empfohlen, Trypsin mit Ca 2+ anzusetzen, um den Selbstverdau zu hemmen und so diese Serinproteinase zu stabilisieren (Sipos und Merkel, 1970). Den Autoren zufolge wird die Konformationsänderung von Trypsinogen in die aktive Form Trypsin durch Ca 2+ induziert und ist abhängig vom pH Wert und der Temperatur. Theoretisch wäre eine Inaktivierung in Folge einer Konformationsänderung genauso möglich. Dabei könnte die Interaktion über Calmodulin ähnliche Domänen (Molinari et al. , 1995) oder durch die direkte Interaktion von Ca 2+ mit der Protease (Hamilton et al. , 2003) eine Konformationsänderung bewirken.
Neben Ca 2+ wurden noch weitere Metallionen hinsichtlich ihres Effektes auf die caseinolytische Aktivität getestet, aber keines der gewählten Ionen scheint als Cofaktor für eine PM Protease notwendig zu sein. Es wurden höhere Konzentrationen in dieser Arbeit verwendet, um eventuell Cofaktoren zu ersetzen, die bei der Probenaufarbeitung verloren gegangen sind. So benötigen Metalloproteasen ein bivalentes Kation in ihrem aktiven Zentrum. Viele dieser Proteasen besitzen Zn 2+ , aber es wird auch von Co 2+ oder Mn 2+ im aktiven Zentrum berichtet (Basu et al. , 1994). Aktivitätsmessungen in Gegenwart dieser Kationen zeigten jedoch unabhängig von der jeweiligen Konzentration ausschließlich inhibitorische Effekte auf die PM assoziierten Proteasen. Die Toxizität der Metallionen beruht vor allem auf der Eigenschaft, Bindungen mit den Thiolgruppen von Proteinen einzugehen. Die damit einhergehende Aktivitätshemmung findet bereits bei sehr geringen Konzentrationen der Metallionen statt (Hall, 2002).
b) Einfluss physiologischer Faktoren auf die PM-Proteaseaktivitäten
Die Enzymausstattung einer Pflanze wird durch das Genom definiert und zusätzlich durch abiotische und biotische Faktoren, denen die Pflanze ausgesetzt ist, in unterschiedlichem Maße beeinflusst (Atkinson und Urwin, 2012). Neben der Abhängigkeit von verschiedenen Stressfaktoren wird die Genexpression proteolytischer Enzyme folglich
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vom Alter und dem Ernährungszustand der Pflanze bestimmt und ist zugleich art und gewebespezifisch.
Die in dieser Arbeit charakterisierten caseinolytischen Proteaseaktivitäten an der Wurzel PM von Gerste und Tabak unterschieden sich neben einer fast dreimal höheren spezifischen Enzymaktivität bei der Gerste weiter durch ein geringfügig ins Alkalische verschobenes pH Optimum bei der Gerste. Sowohl die Verteilungen nach einer Detergenzbehandlung als auch nach chromatographischer Fraktionierung waren sehr ähnlich, wohingegen die gelelektrophoretischen Ergebnisse wiederum Unterschiede hinsichtlich der Anzahl und app. MW der fraktionierten Proteaseformen zeigten. Diese Unterschiede können zum einen durch die artspezifische Enzymausstattung und deren Funktionen bedingt sein. Zum anderen befanden sich die beiden Pflanzenarten bei der Ernte in unterschiedlichen Entwicklungsstadien. Während sich der Tabak am Ende der vegetativen Phase befand, wurden die Gerstepflanzen in einem sehr jungen Stadium geerntet. Da die Genexpression vieler Proteasen in Abhängigkeit vom Entwicklungsstadium der Pflanze und dem Gewebe reguliert wird (van der Hoorn, 2008), könnten folgende Schlussfolgerungen aus den hier beschriebenen Gemeinsamkeiten und Unterschieden zwischen PM Proteasen aus Tabak und Gerstewurzeln gezogen werden.
i. Die Gemeinsamkeiten, zu denen die gemessenen AP Aktivitäten mit ähnlichen Substratspezifitäten und auch die Wurzelspezifität der Endoproteaseaktivität gehört, weisen auf eine oder mehrere verschiedene Proteasen hin, die unabhängig von der Pflanzenart (Mono oder Dikotyle) grundlegende Haushaltsfunktionen ausüben könnten. So wurden anhand der endogenen Proteolyse sowohl Aquaporine als auch P Typ H+ ATPasen als potentielle Proteasesubstrate bei Tabak und Gerste identifiziert.
ii. Die Unterschiede könnten sowohl auf pflanzen als auch auf altersspezifische Genexpression einer oder mehrerer PM Proteasen zurückgeführt werden. So wurde der Großteil der potentiellen Proteasesubstrate bei Tabak spezifischen Regulations mechanismen zugeordnet, wohingegen bei der Gerste am Membranfluss und transport beteiligte Proteine, aber auch viele uncharakterisierte Proteine identifiziert wurden.
iii. Die Unterschiede könnten durch die äußeren Bedingungen, also durch die jeweilige Kultivierung der verwendeten Pflanzenarten, zustande gekommen sein. Es wurde keine Sterilanzucht durchgeführt und bei der Gerstehydrokultur wurde trotz der Vorsorgemaßnahmen der Pilzbefall der Samen nicht vollständig verhindert. Diese Problematik könnte mit zu einer erhöhten Proteaseaktivität bei der Gerste geführt haben. Caspasen (Cysteintyp), die an der hypersensitiven Reaktion von Pflanzen
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beteiligt sind und den Zelltod regulieren, wurden in Tabakblättern nach einer Infektion mit dem Tabakmosaikvirus biochemisch nachgewiesen (del Pozo und Lam, 1998). Bei der Tomate wurde eine durch Pathogenbefall induzierte Protease mit Homologien zur Subtilisin Serinproteasefamilie identifiziert (Tornero et al ., 1996). Des Weiteren wurde bei der Gerste eine erhöhte Genexpression von Aleurain (Cysteintyp) sowie einer ATP abhängigen Clp Protease (Serintyp) nach einer Infektion mit dem Echten Mehltau gezeigt (Hein et al., 2004). Eine erhöhte Genexpression wurde ebenfalls für eine Matrix Metalloproteinase (MMP) bei der Sojabohne nicht nur nach Pathogen befall, sondern auch nach Verletzungs und Austrocknungsstress detektiert (Liu et al. , 2001). Lösliche, durch Bakterien oder Pilzbefall induzierte Proteasen könnten folglich bei der PM Präparation der Gerstewurzeln in den PM Vesikeln eingeschlossen worden sein und würden somit einen Anteil an der caseinolytischen Aktivität haben. Vor allem die hohen Standardabweichungen der gemessenen Exopeptidase aktivitäten an Gerste PM Vesikeln könnten durch solch eine Kontamination erklärt werden.
Als externer Faktor wurde in dieser Arbeit Stickstoff untersucht und es wurde ein Zusammenhang zwischen der Nitraternährung und der verschiedenen gemessenen spezifischen Proteaseaktivitäten für Tabak nachgewiesen. Dabei führte eine niedrige externe Nitratkonzentration zu niedrigeren Aminopeptidase und Carboxypeptidaseaktivitäten. Die caseinolytische Gesamtaktivität wurde nicht signifikant durch die Nitraternährung beeinflusst, jedoch wurden zymographisch in Abhängigkeit der Nitraternährung verschiedene Proteaseformen fraktioniert. Das deutet auf verschiedene Formen hin, von denen mindestens eine Protease eine Funktion bei der Anpassung an die äußeren Stickstoff verhältnisse hat. Die Stickstoffverfügbarkeit im Boden stellt einen wichtigen externen Faktor für die Pflanze dar, auf den sie sich über komplexe Signaltransduktionswege an die externen Nitratkonzentrationen anpasst. Neben einer lokalen und systemischen Antwort des Wurzelsystems (Zhang et al. , 2007) kann es unter Stickstoffmangelbedingungen auch zur Abgabe von Proteasen in die Rhizosphäre kommen (Adamczyk et al. , 2009). Durch die Exsudation von Proteasen werden im Boden zugängliche organische Stickstoffquellen geschaffen (Adamczyk et al ., 2009), deren Proteolyseprodukte von der Pflanze in Form von Aminosäuren oder kleinen Peptiden über Transporter aufgenommen werden können (Paungfoo Lonhienne et al. , 2008). So könnten niedrigere Exopeptidaseaktivitäten an den PM Vesikeln der unter Stickstoffmangelbedingungen angezogenen Tabakpflanzen auf die Abgabe dieser Proteaseformen von der PM in den Apoplasten hindeuten.
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Gleichzeitig weist die Aktivitätserhöhung bei einer Stickstoffüberversorgung auf eine andere Funktion an der PM hin. Womöglich werden eine oder mehrere PM Proteasen durch externes Nitrat induziert, wie es bereits für andere Enzyme diskutiert wurde (Wray und Filner, 1970; Stöhr, 1999).
c) Funktionen PM-gebundener Proteasen in Wurzeln
Die Heterogenität der PM wird neben ihrer asymmetrischen Struktur durch einen stetigen Membranfluss bestimmt. Dieser ermöglicht es der Zelle, auf äußere Stimuli zu reagieren und die Zellhomöostase aufrecht zu erhalten (Peer, 2011a). PM Proteine werden über verschiedene Transportwege entweder recycelt und zur PM zurückgebracht oder über Endosomen zum Abbau in die lytische Vakuole transportiert (Peer, 2011a). Für einen PM gebundenen Rezeptor aus Hefe fungiert dabei die Ubiquitinierung des Rezeptors an einer zugänglichen Domäne auf der cytosolischen Seite der PM als Signal für dessen Endocytose (Hicke und Riezman, 1996). Daneben könnten aber auch an der PM gebundene Proteasen am Abbau defekter Proteine beteiligt sein. Endoproteolytisch aktive Proteasen auf der cytosolischen Seite der PM könnten andere PM Proteine als Substrate erkennen und deren cytosolische Reste abspalten, die dann über das Ubiquitin Proteasom System im Cytosol (Ciechanover, 1994) abgebaut werden. Ein derartiges Proteasesubstrat könnten P Typ H+ ATPasen darstellen, von denen sowohl bei Gerste (Q8H1X2) als auch bei Tabak (P22180, Q9LY32) nach endogener Proteolyse massenspektrometrisch Peptide detektiert wurden, die im kleinen oder großen cytosolischen Loop liegen.
Die endogene Proteolyse an PM Vesikeln aus Tabak und Gerstewurzeln sollte mit einen ersten Eindruck über die Vielfältigkeit der potentiellen Substrate an der PM geben. Anhand der verwendeten Informationsquellen sind jedoch nur 36 % (Tabak) oder 20 % (Gerste) der detektierten Proteine bisher an der PM nachgewiesen worden. Die restlichen Proteine stellen folglich peripher assoziierte Proteine oder sogar lösliche Kontaminationen dar, die nicht durch das mehrmalige Waschen mit 150 mM NaCl entfernt wurden. Andere Arbeitsgruppen konnten auch trotz alkalischem pH, Hochsalz und Ultraschallbehandlung die peripher assoziierten Proteine nicht vollständig von den Membranen entfernen (Speers und Wu, 2007). Folglich könnten diese Proteine ebenfalls potentielle Substrate der PM Proteasen darstellen und es könnten sich neben den integralen Proteaseformen zusätzlich peripher assoziierte Proteasen an den PM Vesikeln befinden, deren Substrate andere PM gebundene oder assoziierte Proteine sind. Möglicherweise wurden aber auch die detektierten Peptide der potentiellen Proteasesubstrate aufgrund der Sequenz
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homologien einer löslichen Proteinform zugeordnet, obwohl sie eventuell einer unbekannten membrangebundenen Isoform entsprechen.
Eine unvollständige Entfernung peripher assoziierter Proteine könnte erklären, warum auch in Gegenwart des Proteaseinhibitorcocktails Proteine von den PM Vesikeln abgegeben wurden. Vermutlich handelt es sich dabei um lösliche Proteine, deren nicht kovalente Verknüpfungen mit der PM erst während der Inkubation der PM Vesikel gelöst wurden. Das würde auch die identifizierten Histone erklären, die im Zellkern lokalisiert sind und deshalb nicht von PM gebundenen Proteasen als Substrate verwendet werden. Es konnte zwar an Protoplasten von Petunia hybrida gezeigt werden, dass aus dem Zellkern gewonnene Histone durch die PM hindurch gelangen können und es sich dabei nicht um Endocytose handeln kann (Rosenbluh et al. , 2004). Dies weist jedoch nicht eine Membranständigkeit von Histonen nach, sondern deutet auf eine mögliche Interaktion von PM Proteinen mit Histonen hin.
Aus diesem Grund wird im Folgenden von PM Proteasen gesprochen, womit PM gebundene und –assoziierte Formen gemeint sind, und es wurden zunächst nur die bekannten PM Proteine als putative PM Proteasesubstrate angesehen. Weitere potentielle Kandidaten stellen aber auch die anhand der verwendeten Algorithmen (HMMTOP oder TMHMM) mit TMD vorhergesagten Proteine, wie elf der uncharakterisierten Gersten proteine, dar. Deshalb wurden in Tabelle 4 5 sowohl PM Proteine als auch zusätzlich potentiell membrangebundene Proteine mit berücksichtigt und anhand ihrer bekannten Funktionen in drei große Bereiche eingeordnet. Demnach konnten Proteine detektiert werden, die innerhalb des Pflanzenmetabolismus an Haushaltsfunktionen wie dem Kohlenstoff , Lipid und Nukleotidmetabolismus, der Aminosäurebiosynthese, der Trans kription und Translation beteiligt sind sowie Bestandteile des Cytoskeletts darstellen (siehe Tabelle 4 5, Kategorien I VI). Desweiteren wurden Proteine nachgewiesen, die am Membranfluss oder –transport beteiligt sind oder als PM gebundene Proteine vorliegen (Kategorien VII X), sowie an der Signaltransduktion, am Stressmetabolismus oder an der direkten Proteinregulation beteiligt sind (Kategorien XI XIII). Dabei zeigten sich deutliche Unterschiede zwischen den potentiellen Proteasesubstraten bei Tabak und Gerste. Den größten Anteil mit 44 % stellten bei Tabak Proteine der letzten Gruppe mit spezifischen Funktionen in der Signaltransduktion oder dem Stressmetabolismus dar, wohingegen bei der Gerste mit je 39 % am Membranfluss oder –transport beteiligte PM Proteine sowie uncharakterisierte Proteine mit vorhergesagten TMD dominierten.
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Eine Beteiligung der PM Proteasen sowohl an der Regulation anderer Proteine als auch an spezielleren Mechanismen, wie der Freisetzung der Transkriptionsfaktoren konnte zusätzlich durch den Vergleich der massenspektrometrisch detektierten Peptide mit den dazugehörenden Proteinsequenzen gezeigt werden. So wurden einerseits Proteine von der PM abgegeben, bei denen die detektierten Peptide aufgrund ihrer Lage innerhalb der Sequenz und anhand der detektierten Peptidanzahl auf endogene Proteolyse am N oder C Terminus schließen lassen. Auf diese Weise könnten funktionsfähige Proteine abgegeben worden sein. Zu den Proteinen mit mindestens fünf detektierten Peptiden zählten bei Gerste die Untereinheit B2 der V Typ H+ ATPase (Q40079), die P Typ H+ ATPase (Q8H1X2), ein Aquaporin (A7J2I1) und ein uncharakterisiertes Protein (A2X036). Beim Tabak waren es die Untereinheit A der V Typ H+ ATPase (P09469), zwei P Typ H+ ATPasen (P22180, Q9LY32), SEC14 (Q56Z59), ein Calreticulinprotein (Q40401) sowie fünf Hitzeschockproteine (Q9LKR3, Q03684, Q03685, P22953, Q14TB1). Im Fall der Untereinheiten der V Typ H+ ATPasen decken die detektierten Peptide jeweils fast die gesamte Sequenz ab (siehe Schema A in Abbildung 4 4). Neben dieser hohen Peptidanzahl wurden auch viele Proteine anhand von nur zwei Peptiden identifiziert, die jedoch auch innerhalb der Proteinsequenz weit voneinander entfernt lagen (siehe Schema B in Abbildung 4 4) und ebenfalls auf die Abgabe eines intakten Proteins hinweisen könnten.
Abbildung 4-4: Schema zur Sequenzabdeckung. Es wurden vier Typen der Sequenzabdeckung für die über endogene Proteolyse von PM Vesikeln aus Gerste oder Tabakwurzeln abgegebenen Proteine durch die massenspektrometrisch detektierten Peptide (graue Flächen) festgestellt. Es wurde fast vollständige Sequenzabdeckung ermittelt (A) oder die Peptide lagen innerhalb des Proteins voneinander entfernt (B). Außerdem wurden auch Proteine identifiziert, von denen die detektierten Peptide nur am N terminalen Ende (C) oder nur am C terminalen Ende des Proteins lagen (D) (siehe Tabelle 4 5)
Daneben wurden anderseits N oder C terminale Sequenzabdeckungen beobachtet (siehe Schema C und D in Abbildung 4 4), die nicht auf fehlende Spaltmöglichkeiten durch Trypsin zurückgehen können 16 . Dies deutet auf begrenzte Proteolyse durch eine PM Protease hin. Die Abspaltung eines kleinen Proteinteils könnte zur Aktivierung oder Inhibierung des prozessierten Proteins führen, aber auch die Bildung eines kleineren
16 überprüft mit: http://web.expasy.org/peptide_cutter/
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Peptides mit entsprechender Funktion bewirken. Gerstenproteine, die womöglich durch eine N terminale Proteolyse reguliert werden, sind ein zur Patatin Klasse 1 gehörendes Protein (B6TD55), ein Aquaporin (D2KZ41) und ein Rab ähnliches Protein (Q05737). Bei Tabak könnte es für die Carboanhydrase (O64595) und die Enolase (P25696) zutreffen. Eine womöglich C terminale Regulation durch endogene Proteolyse könnte bei drei uncharakterisierten Gerstenproteine (B4FA76, A2WXH7, B8AYI6) und in Tabak bei der Nukleosiddiphosphatkinase (Q56E62), einer Ca 2+ abhängigen Proteinkinase (Q38868) und einem Aquaporin (Q9FF53) stattfinden. Diese ungleichmäßige Abdeckung könnte natürlich auch durch eine begrenzte Zugänglichkeit der Proteine für die PM Proteasen oder durch methodische Ursachen, wie eine schlechte Zugänglichkeit des abgegebenen Proteins für Trypsin, entstanden sein.
Ausgehend von der Sequenzabdeckung könnte die proteolytisch abgegebene Aspartatproteinase von der Gerste PM aktiv gewesen sein. Die massenspektrometrisch detektierten Peptide, der als inaktiven Vorstufe synthetisierten Proteaseform, lagen jeweils im Sequenzbereich eines der aktiven Polypeptide (siehe Abbildung 4 3). Mit Hilfe der Zymographie konnte auch gezeigt werden, dass Proteasen als aktive Formen abgegeben werden. Ob es sich dabei aber bei der Gerste um die massenspektrometrisch detektierte Aspartatproteinase handelt oder etwa um die Papain ähnliche Cysteinproteinase, die auch in Gegenwart des Proteaseinhibitorcocktails abgegeben wurde (siehe Abbildung 4 2), muss noch geklärt werden. Da die Aktivierung der Vorstufen endoproteolytische Aktivität voraussetzt, könnten die PM gebundenen Endoproteasen dafür verantwortlich sein.
In diesem Zusammenhang wurde in dieser Arbeit die unterschiedliche Abundanz der PM assoziierten Endo und Exopeptidaseaktivitäten innerhalb von Blatt und Wurzelgewebe gezeigt. Dies deutet auf Unterschiede in der Regulation, Funktion und Genexpression innerhalb der getesteten Pflanzenorgane hin. PM gebundene Proteasen könnten also mit an der ersten Reaktion einer Pflanze auf Umweltänderungen in der Wurzel beteiligt sein und könnten als Rezeptoren auf Veränderung der Nährstoffverhältnisse reagieren. So wurde nach unterschiedlicher Nitratversorgung der Tabakpflanzen eine unterschiedliche AP Aktivität an den PM Vesikeln aus Wurzeln gemessen. Ob es sich um eine wurzelspezifische Regulation handelt, die von der Stickstoffverfügbarkeit im Boden beeinflusst wird und zur Exsudation der Protease in die Rhizosphäre führt, ist noch unklar.
Eine wurzelspezifische PM assoziierte oder PM gebundene Protease könnte neben der Proteinregulation auch verschiedene Funktionen in der Abwehr besitzen. Bereits untersuchte Beispiele anderer löslicher Proteasen aus Pflanzen implizieren eine Beteiligung sowohl bei der Wahrnehmung von Elicitoren, bei der Signaltransduktion sowie der eigentlichen Realisierung der Abwehrreaktionen (van der Hoorn und Jones, 2004;
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Tornero et al. , 1996; Pautot et al. , 1993). Die Funktion in der Abwehr könnte die Erkennung und Prozessierung viraler, bakterieller oder anderer organismusfremder Proteine durch eine PM Protease darstellen. Dadurch würden Elicitoren gebildet werden, die von Rezeptoren an der PM erkannt werden und eine Abwehrreaktion einleiten. Elicitoren könnten auch als Cofaktoren oder Inhibitoren einer PM Protease wirken, indem sie durch ihre Bindung eine Konformationsänderung hervorrufen. Eine so aktivierte PM Protease könnte dann durch die Spaltung bestimmter PM Proteine oder durch Autoproteolyse Transkriptionsfaktoren oder andere Signaltransduktionsproteine freisetzen, die dann die eigentliche Abwehrreaktion bewirken.
Beim Tabak wurden nach endogener Proteolyse an der Wurzel PM ein 14 3 3 ähnliches Protein, zwei Chaperon ähnliche Proteine sowie sechs Hitzeschockproteine im löslichen Überstand detektiert (siehe Tabelle 4 5), wobei von fünf Hitzeschockproteinen mehr als vier Peptide massenspektrometrisch detektiert wurden (siehe Tabelle 4 5, Asterisk). Eine Lokalisierung an der PM ist bereits für drei Hitzeschockproteine (P22953, Q9STX5, Q9LKR3) bekannt. Endogene Proteolyse könnte unter Stressbedingungen eine Freisetzung dieser Chaperon ähnlichen Proteine bewirken. Diese könnten dann die Struktur geschädigter PM Proteine wiederherstellen oder soweit denaturieren (Wang et al ., 2004), damit diese Proteine von einer PM Protease als Substrat erkannt und gespalten werden können. Eine Zusammenarbeit zwischen Chaperonen und Proteasen findet man auch bei ATP ab hängigen Clp Proteasen in den Chloroplasten (Gottesman et al. , 1997). Gleichzeitig könnte der Abbau der Hitzeschockproteine durch die PM Proteasen ebenfalls zum Abbau anderer geschädigter Proteine über PM Proteasen oder über das Proteasom im Cytosol führen.
Eine PM Protease könnte auch selbst den Abwehrmechanismus der Zelle darstellen, indem sie zur Freisetzung oder Aktivierung regulierender Enzyme beiträgt. Zu diesen Enzymen könnten die proteolytisch abgespaltene Aspartatproteinase bei Gerste oder die Endochitinase A bei Tabak zählen. Letztere wurde nur als lösliche Form im Apoplasten oder der Vakuole beschrieben (siehe Tabelle 3 10) und wurde deshalb nicht als potentielles Substrat eingeordnet.
Sowohl die Aspartatproteinase als auch die Endochitinase A sollen zwar anhand der N terminalen Signalpeptide und aufgrund bisheriger Experimente in den Vakuolen lokalisiert sein, könnten aber auch über die Vesikel an die PM gelangen. Beide Enzyme werden erst durch Endoproteolyse in die aktive Form überführt. Bei der Aspartatproteinase geschieht dies durch das Entfernen einer internen Sequenz (Glathe et al. , 1998), während bei der Endochitinase A ein C terminales Peptid abgespalten wird. Nach Neuhaus und Kollegen (1991) ist dieses kurze Peptid für den Transport der Chitinase in die Vakuole verantwortlich. Das Fehlen dieser Sequenz führt jedoch bei Tabak zur Anreicherung der Chitinase A im
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Apoplasten. Folglich könnten sowohl die Aspartatproteinase als auch die Endochitinase A als apoplastische oder sogar exsudierte Enzyme gegen bakterielle oder pilzliche Proteine von der Pflanze eingesetzt werden.
Zu den eindeutig PM gebundenen Proteasesubstraten scheinen Aquaporine und ATPasen zu gehören, die bereits auch in den angereinigten Fraktionen mit proteolytischer Aktivität nachgewiesen wurden. Sie stellen entweder aufgrund ihrer Abundanz oder auch aufgrund ihrer räumlichen Nähe zu den PM Proteasen potentielle Substrate dar. Diese PM Proteine üben genauso, wie die bei Gerste detektierten MDR ähnlichen ABC Transporter (Rea, 2007), eine Funktion beim Transport von Stoffen durch die Membran aus und werden daher vermutlich durch endogene Proteolyse abgebaut oder inaktiviert. Dabei könnte durch die Proteolyse der Aquaporine neben dem Transport von Wasser auch indirekt Einfluss auf die Pflanzenernährung und Signaltransduktionsprozesse genommen werden. Zudem wird die Aktivität einiger Aquaporine aufgrund der Phosphorylierung am cytosolischen N oder C Terminus erhöht. Dies geschieht durch eine PM assoziierte Ca 2+ abhängige Proteinkinase (Chaumont et al. , 2005). Da bei Tabak auch eine Ca 2+ abhängige Proteinkinase als potentielles Proteasesubstrat identifiziert wurde, könnten PM Proteasen neben der bereits durch abiotische und biotische Faktoren hochregulierten Genexpression vieler Aquaporine (Bienert und Chaumont, 2011) die Feinregulation der Abundanz und Funktionstüchtigkeit dieser Proteine übernehmen, indem sie den Aktivator und die Aquaporine selbst abbauen. Eine vergleichbare Funktion könnten die PM Proteasen auch gegenüber den P Typ H+ ATPasen ausüben. Bei Tabak wurde nämlich ein 14 3 3 ähnliches Protein als potentielles Substrat eingestuft, das seinerseits neben anderen Funktionen die Aktivitätserhöhung der ATPase durch Binden am C Terminus bewirken könnte (Morsomme und Boutry, 2000).
Zusammenfassend wurden viele verschiedene potentielle Proteasesubstrate identifiziert, die von einer oder mehrerer PM Proteasen gespalten wurden. Dabei kam es nicht nur zu einem Abbau der PM Proteine. Die über SDS PAGE fraktionierten Spalt produkte wiesen app. MW zwischen 12 und 224 kDa auf und mittels Zymographie wurde die Freisetzung proteolytisch aktiver Proteine durch die endogene Proteolyse nachgewiesen. In diesem Zusammenhang wäre es sehr interessant zu testen, welche Proteine unter sauren pH Bedingungen, in Gegenwart spezifischer Proteaseinhibitoren, wie 1,10 Phenanthrolin (Hemmstoff von Metalloproteasen) oder von PM Vesikeln aus Stickstoffmangel ernährten Pflanzen abgespalten werden.
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Tabelle 4-5: Einordnung der putativen PM-Proteasesubstrate von Tabak und Gerste anhand ihrer Funktionen im pflanzlichen Stoffwechsel. Es wurden nur Proteine aufgezählt, die an der PM auftreten (nach UniProt bzw. BRENDA Einträgen). Zusätzlich sind in Klammern Proteine aufgeführt, die nach den verwendeten Algorithmen mit mindestens einer transmembranen Domäne vorhergesagt werden. Proteine, von denen massenspektrometrisch mehr als vier Peptide detektiert wurden, sind mit einem Asterisk gekennzeichnet.
XIV II I IV XIII VII III V XIV VI
XII VII VIII
VIII
XI IX XIII IX X
Kategorie Tabak Gerste I. C -Metabolismus Carboanhydrase (O64595) Enolase (P25696) Fruktose 1,6 bisphosphat Aldolase (Q9SJQ9) Malatdehydrogenase (O48905) Saccharosesynthase (Q9LXL5) (Phosphoglyceratkinase (Q88YH5))
II. Lipidmetabolismus Lipoxygenase (Q42846) (Patatin-Klasse 1 Protein (B6TD55))
III. Nukleotidmetabolismus (Nukleosiddiphosphatkinase 1 (Q56E62) )
IV. Aminosäurebiosynthese 5 Methyltetrahydropteroyl triglutamat Homocystein Methyltransferase (O50008)
Haushaltsfunktionen V. Transkription /Translation (ribosomales Protein (F4IT48) )
VI. Cytoskelett Aktin (Q96293) Tubulin (P29510)
VII. vesikulärer Transport SEC14 (Q56Z59*) kleine GTPase: Rab ähnliches Protein (kleine GTPase (Rab-Protein) RABA3 (Q9LNK1)) YPTM2 (Q05737) und ARA 3 (P28186)
VIII. energie -abhängiger P Typ H+ ATPase (P22180*; Q9LY32*) P Typ H+ ATPase (Q8H1X2*) Membrantransport V Typ H+ ATPase (P09469*) V Typ H+ ATPase (Q40079*; B2BA44) (ATP-Synthase (P17614)) (ATP-Synthase (Q41534)) (MDR ähnlicher ABC-Transporter (Q7FMW2, Q6Z6U9))
IX. transmembraner Transport Aquaporin: Aquaporin: PM intrinsisches Protein (Q39196; Q9FF53) PM intrinsisches Protein (A0ZV97; A7J2I1*) (Tonoplast-intrinsisches Protein (P21653)) (Tonoplast-intrinsisches Protein (D2KZ41))
X. PM -gebundene Proteine Fasciclin ähnliches Arabinogalaktanprotein
Membranfluss /-transport (Q9LZX4) Plasmamembran Polypeptid (O49910; O49911) (Lipid-assoziiertes Protein (Q9SIE7))
XI. Signaltransduktion 14 3 3 ähnliches Protein (P46077) Calcium abhängige Proteinkinase (Q38868) Phospholipase D (P93400) Quinonreduktase (Q6NQE2) Serin/Threonin Proteinkinase (Q8H1G6) (Calcium-abhängige Proteinkinase (Q84RP9))
XII. Stressmetabolismus Hitzeschockprotein (P22953*; Q9STX5) HR induziertes Protein 3 (Q9SRH6) Monodehydroascorbatreduktase (Q9LFA3) (Calreticulin (O04151)) (Hitzeschockprotein (Q14TB1*)) (Trans-Zimtsäure 4-Monooxygenase (Q04468))
XIII. Proteinregulation Hitzeschockprotein (Q9LKR3*) (Aspartatproteinase (Q401N7)) Spezifische Regulation (Protein-Disulfid-Isomerase (P93358)) (Calnexin (Q41798)) (Calreticulin (Q40401*)) (Hitzeschockprotein (P24067)) (Hitzeschockprotein (Q03684*, Q03685*)) (Peptidyl-Prolyl cis-trans Isomerase (B2BF99))
XIV. uncharakterisierte Proteine (CYP73A47v1 (A1XEL1)) (B9G5W2, B4FA76, B8A840, B4FVS2, B8BIW4, B9F863, A2WXH7, B8AYI6, A2X036*, C5XJD6, C5Z1E9)
136 DISKUSSION
d) PM-Proteasen: ein erstes Modell
Aus den Erkenntnissen der Enzymcharakterisierung aber auch aus den ersten Untersuchungen zur Substratspezifität der PM Proteasen lassen sich verschiedene mögliche Funktionen dieser Enzyme ableiten (siehe auch Abbildung 4 5):
i. PM Proteasen sind an der Proteinregulation, aber auch an gezielter Signal transduktion beteiligt.
ii. Die Proteolyse kann an cytosolischer oder apoplastischer PM Seite stattfinden.
iii. Durch endogene Proteolyse (exo oder endoproteolytisch) werden defekte Proteine abgebaut.
iv. Durch begrenzte Proteolyse werden spezifische Enzyme aktiviert oder inhibiert.
v. Die durch endogene Proteolyse gebildeten Peptide können eine Funktion in der Signaltransduktion besitzen und vielleicht werden sogar Peptidhormone gebildet.
vi. Durch endogene Proteolyse werden spezifische Enzyme, wie Proteasen, von der PM abgespalten, die in den Apoplasten abgegeben und vielleicht sogar in die Rhizosphäre abgegeben werden.
Abbildung 4-5: Funktionen PM-ge- bundener Proteasen in Wurzeln. A Ausgehend von den als potentielle Proteasesubstrate identifizierten Proteinen werden die Funktionen der PM gebundenen Proteasen aus Tabak und Gerstewurzeln in zwei große Bereiche eingeordnet. A) Sie sind an der allgemeinen Proteinregulation beteiligt, bei der defekte Proteine erkannt und abgebaut werden. Außerdem werden so Enzyme durch begrenzte Proteolyse aktiviert oder inhibiert.
B) Durch die endogene Proteolyse werden B an der PM kleine Peptide gebildet, die sowohl intra als auch extrazelluläre Funktionen in der Signaltransduktion besitzen können. Gleichzeitig werden auch aktive Proteasen freigesetzt, die im Apoplasten wirksam werden können.
Die vorliegenden Ergebnisse lassen keine Schlussfolgerungen hinsichtlich der Verankerungsform sowie der Orientierung der Proteasen an der PM zu.
137 ZUSAMMENFASSUNG
5. Zusammenfassung
Proteolytische Enzyme sind an unterschiedlichen Regulationsmechanismen des Stoffwechsels beteiligt und damit essentiell für den pflanzlichen Organismus. Neben löslichen Formen existieren auch PM gebundene Proteasen in Mono und Dikotylen. In dieser Arbeit wurden erstmals zwei dieser Proteaseformen in den Wurzeln der Gerste massenspektrometrisch identifiziert und den Metalloaminopeptidasen zugeordnet. Ausgehend von Enzymaktivitätstests mit verschiedenen Substraten und gelelektro phoretischer Fraktionierungen existieren darüber hinaus weitere PM Proteasen des Aminopeptidase , Carboxypeptidase und Endoproteasetyps an der pflanzlichen PM. Dabei werden die Endoproteasen dem Metallo und Serintyp zugeordnet. Obwohl deren Identität nicht geklärt werden konnte, handelt es sich bei mindestens einer der Endoproteaseformen um eine wurzelspezifische Proteinase.
Die untersuchten PM Proteasen stellen Triton X 114 resistente Proteine dar, die erfolgreich mit Octylglucosid solubilisiert wurden und sowohl an der inneren als auch an der apoplastischen Seite der PM lokalisiert sein könnten. Neben vergleichbaren Solubilisierungs eigenschaften zeigen die untersuchten Proteasen in Tabak und Gerstewurzeln ähnliche Substratspezifitäten. Diese Gemeinsamkeiten weisen auf eine oder mehrere verschiedene Proteasen mit grundlegenden Funktionen im Proteinstoffwechsel hin. Solche Proteasen scheinen andere PM Proteine wie Aquaporine und P Typ H+ ATPasen durch endogene Proteolyse zu regulieren. Allgemein können die als potentielle Substrate der PM Proteasen identifizierten membrangebundenen und löslichen Proteine verschiedenen Kategorien zugeordnet werden. Sie sind an Haushaltsfunktionen, am Membranfluss und transport sowie an spezifischen Regulationsmechanismen beteiligt.
Daneben unterscheiden sich die Tabak und Gersteproteasen in ihrer spezifischen Aktivität, Proteaseanzahl und in einigen ihrer potentiellen Substrate. Zudem besteht ein Zusammenhang zwischen der Nitratversorgung der Tabakpflanzen und der verschiedenen gemessenen spezifischen Proteaseaktivitäten, wobei Stickstoffmangelbedingungen zu niedrigeren Aminopeptidase und Carboxypeptidaseaktivitäten führten. Unter verschiedenen Stickstoffversorgungen wurden außerdem verschiedene Proteaseformen zymographisch fraktioniert.
Neben der Regulation von Proteinen sind PM Proteasen weiterhin an der Abgabe verschiedener Polypeptide in den Apoplasten beteiligt. Dabei zeigen einige dieser Proteolyseprodukte Proteaseaktivität, die für vier Proteaseformen der Gerste erst nach der Abtrennung von der PM nachweisbar war.
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152 ANHANG
7. Anhang
7.1 Daten
A B
C D
E F
Abbildung 7-1: Korrelation verschiedener Parameter der Gersteanzucht. Es wurden alle Anzuchten mit 5 mM Nitraternährung berücksichtigt. Betrachtet wurde der Einfluss der Gesamtanzahl Gerstepflanzen pro Anzuchtsschale auf das Sprossfrischgewicht einer einzelnen Pflanze (A, y=0,31353 1,94189E 5x 3,47662E 8x², R²=0,2434), auf das Gesamtwurzelfrischgewicht der jeweiligen Anzuchtsschale (B, y= 141,77496+0,61216x 3,37106E 4x², R²=0,35978) sowie auf die Nitritkonzentration im Kulturmedium einer Anzuchtsschale (C, y=0,0119x 6,26789, R²=0,43899). D) Korrelation der Nitritkonzentration im Kulturmedium mit der spezifischen Proteaseaktivität an PM Vesikeln. E) Korrelation des Anzuchtsmonats mit den mittleren täglichen Sonnenstunden ( ▲) während der Gersteanzucht sowie mit der Nitritkonzentration im Kulturmedium (●). F) Korrelation des Anzuchtsmonats mit der spezifischen Proteaseaktivität an PM Vesikeln von Gerstewurzeln sowie mit den mittleren täglichen Sonnenstunden (▲) während der zweiwöchigen Gersteanzucht. Die täglichen Sonnenstunden wurden von der Wetterstation Greifswald (am St. Georgsfeld 11) bezogen.
153 ANHANG
A B
Abbildung 7-2: Exopeptidaseaktivität solubilisierter PM-Proteine aus Wurzeln in Abhängigkeit von der Nitraternährung. Für die Messung wurden die mit Octylglucosid/NaCl (Tabak) oder nur mit Octylglucosid (Gerste) solubilisierten Fraktionen (siehe Tabelle 3 2) verwendet. A: Aminopeptidase aktivität wurde mit Ala pNA, Leu pNA und Gly Pro pNA gemessen. B: Carboxypeptidaseaktivität wurde mit MCA AlaProLys Dnp nachgewiesen. Die Aktivität wird in RFU (relative Fluoreszenzeinheit) angegeben. (Tabak: 2 mM Nitrat n=1, 10 mM Nitrat n=1, 25 mM Nitrat n=1; Gerste 0 mM Nitrat (nicht bestimmt), 5 mM Nitrat n=1)
14 2,0 14 2,0 2 I II 0 I II
A ] B ]
1 12 1 12
1,5 1,5 10 10 Fraktion Fraktion Fraktion Fraktion 1 1 8 8 1,0 1,0 6 6 Natriumchlorid [M] Natriumchlorid Natriumchlorid [M] Proteaseaktivität Proteaseaktivität [M] [M] Natriumchlorid Natriumchlorid 4 4 0,5 0,5 [ g15FTC Casein h [ g FTC Casein 15[ gh FTC Casein [ g FTC Casein 15h [ g [ g FTC Casein 15[ g h 2 2
0 0,0 0 0,0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Elutionsvolumen [ml] 14 2,0 14 2,0 10 I II 5 I II ] ]
1 12
1 12
1,5 1,5 10 10 Fraktion Fraktion Fraktion 1 1 8 8 1,0 1,0 6 6 Natriumchlorid [M] Proteaseaktivität Proteaseaktivität [M] [M] Natriumchlorid Natriumchlorid 4 4 0,5 0,5 [ gh FTC Casein 15 [ g FTC Casein 15h [ g [ g FTC Casein 15[ g h 2 2
0 0,0 0 0,0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
14 Elutionsvolumen [ml] 2,0 Elutionsvolumen [ml] I II
25 ] 12 1
1,5 10 Fraktion Fraktion 1 8 1,0 6 NatriumchloridNatriumchlorid[M] [M] Proteaseaktivität 4 0,5 [ gFTC Casein 15h [ gh FTC Casein15 2
0 0,0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Elutionsvolumen [ml]
Abbildung 7-3: Elutionsprofile der Anionenaustauschchromatographie solubilisierter PM- Sol Sol Proteasen in Abhängigkeit von der Nitraternährung. A) Nt Prot 2mM (2, n=1); Nt Prot 10mM (10, Sol n=6) und Nt Prot 25mM (25, n=6) wurden über AC fraktioniert. Die Proben wurden nicht dialysiert. B) Sol Sol Hv Prot 0mM (0, n=5) und Hv Prot 5mM (5, n=40) wurden über AC fraktioniert. Von allen AC Fraktionen wurde die Proteaseaktivität mit FTC Casein bestimmt. Die Standardabweichungen sind als graue Flächen dargestellt.
154 ANHANG
A B
I Abbildung 7-4: Elutionsprofile der Hydrophoben Interaktionschromatographie der Nt-Prot 10mM in Abhängigkeit der verwendeten Salzkonzentration. Die Chromatographie wurde mit 1 M (A, n=2) oder mit 0,5 M (B, n=1) Ammoniumsulfat im Laufpuffer A durchgeführt. Die Proteaseaktivität der Fraktionen wurde mit FTC Casein in Gegenwart von 5 mM CaCl 2 getestet.
Anzuchtsschale I II III kDa
212
118
66
43
29
Sol Abbildung 7-5: Zymographie der Hv-Prot 5mM in Abhängigkeit von der Erntereihenfolge der PM Anzuchtsschalen. Wurzelernte und PM Präparationen wurden bei 4 °C durchgeführt. Hv Prot 5mM wurde mittels Standardmethode mit Octylglucosid solubilisiert und nach Zentrifugation (25.000 x g, 1 h) wurde der Überstand im Zymogramm fraktioniert. Die PM Vesikel stammen von Gerstepflanzen der nacheinander geernteten Anzuchtsschalen (entsprechend I bis III) einer Anzucht. (n=1)
Abbildung 7-6: Elutionsprofil der Metallchelat-Affinitätschromatographie der angereinigten II II Hv-Prot 5mM in Gegenwart von Octylglucosid. Proteolytisch aktive AC Fraktionen der Hv Prot 5mM wurden vereinigt, über Membranfilter (MWCO 10 kDa) konzentriert und über die mit Cu 2+ beladene IMAC aufgetrennt. Alle Reinigungs schritte fanden ausschließlich in Gegenwart des Detergenz Octylglucosid (30 mM) statt. Die Fraktionen wurden direkt im Proteasetest mit FTC Casein eingesetzt. Die Standardabweichungen sind als graue Flächen dargestellt. (n=3)
155 ANHANG
Sol A: Hv Prot 5mM (siehe Tabelle 3 7)
II.b B: Hv Prot 5mM (siehe Tabelle 3 8)
II.b C: Hv Prot 5mM , fraktioniert (siehe Tabelle 3 9)
PM D: Proteolyse Hv Prot 5mM (siehe Tabelle 3 11)
PM E: Proteolyse NtProt 10mM (siehe Tabelle 3 10)
Abbildung 7-7: Hydrophobizitätsindex der massenspektrometrisch identifizierten Proteine. Der 1 Sol Hydrophobizitätsindex wurde berechnet (ProtParam ) und für die Treffer der Hv Prot 5mM (A), II.b II.b Hv Prot 5mM (B) und der gelelektrophoretisch fraktionierte Hv Prot 5mM (C, ●) sowie für die Treffer PM der durch endogene Proteolyse abgespaltenen Proteine/Peptide von der Hv Prot 5mM (D, ○) und von PM der Nt Prot 10mM (E, □) dargestellt. Zusätzlich wurden die identifizierten membrangebundenen P Typ H+ ATPasen ( ▲) und PM intrinsischen Proteine/Aquaporine ( ▼) für jede Probe hervorgehoben.
Abbildung 7-8: Korrelation des Hydrophobizitätsindex mit vorhergesagten transmembranen Domänen. Es wurden die Werte aller massenspektrometrisch detektierten Proteine sowohl von Tabak als auch von Gerste dargestellt. Der Hydrophobizitätsindex wurde nach ProtParam 17 und die transmembranen Domänen (TMD) nach HMMTOP 18 (●) bzw. nach TMHMM 19 (○) berechnet.
17 http://web.expasy.org/protparam/ 18 http://www.tcdb.org/progs/TMS.php 19 http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM 2.0/
156 II.a II.a Tabelle 7-1: Massenspektrometrisch identifizierte Proteine der Hv-Prot 5mM . Proteolytisch aktive Fraktionen der Hv Prot 5mM wurden mit Chloroform/Methanol gefällt und mit Trypsin verdaut. Für die massenspektrometrische Analyse wurden auch einfach geladene Ionen berücksichtigt. Es wurden die Datenbanken Poaceae 1 (252.158 Einträge) und SwissProt 2 (141.396 Einträge) verwendet. Keratintreffer wurden nicht aufgeführt.
Proteineintrag (gekürzt) Zugangs ID a DB MW Uni ID b GRAVY TMD Lokalisierung c Zusatzinformationen laut Eintrag [kDa] C P Mi V O M PM A
Hydrolasen Trypsinvorstufe gi|136429 SP 24 P00761 0,111 0/0 X EC 3.4.21.4, Serinendoprotease, Schwein V Typ H+ ATPase gi|2493123 SP 64 Q40002 0,198 0/0 X X EC 3.6.3.14, UE A ’’ gi|2493131 SP 54 Q40078 0,241 0/0 X X EC 3.6.3.14, UE B1 ’’ VATB2_HORVU P 54 Q40079 0,265 0/0 X X EC 3.6.3.14, UE B2 ’’ A2XQ09_ORYSI P 14 A2XQ09 0,070 1/0 EC 3.6.3.14, UE F
Transporter / Kanäle Aquaporin (PM intrinsisches Protein) Q08IH5_HORVU P 31 Q08IH5 0,366 6/6 X PIP1;2 ’’ gi|1175012 SP 31 Q08733 0,381 6/6 X X X PIP1;3 ’’ O48518_HORVU P 31 O48518 0,417 6/6 X PIP1;3 ’’ O48517_HORVU P 30 O48517 0,459 6/6 X PIP2;1 ’’ Q08IH3_HORVU P 30 Q08IH3 0,509 6/6 X PIP2;3 ’’ PIP25_MAIZE P 30 Q9XF58 0,546 6/6 X X PIP2;5 ’’ gi|32363271 SP 30 P93004 0,451 6/6 X X X X PIP2;7, Salzstress induziert ’’ A7J2I1_WHEAT P 30 A7J2I1 0,504 6/6 X AQP2
Weitere Proteine 60 kDa Chaperon gi|6225115 SP 57 Q9ZFD8 0,052 0/0 X HSP60 Familie, Burkholderia (B) ’’ gi|9911060 SP 57 P42385 0,052 0/0 X HSP60 Familie, Neisseria (B)
Salzstress /Kälte induziertes Protein Q4KXD9_LOPEL P 30 Q4KXD9 0,019 3/0 Protein 2 1, Kupferion bindend Blaues kupferbindendes Protein Q70DK2_HORVD P 18 Q70DK2 0,264 2/2 Kupferion bindend Lipoprotein der äußeren Membran gi|127524 SP 9 P11221 0,541 0/0 X X Vorstufe, Pseudomonas (B) Porenprotein 32 der äußeren Membran gi|129102 SP 37 P24305 0,120 1/1 X X X Ionentransport, Vorstufe, Delftia (B) zuckerbindender periplasmatischer Rezeptor Gi|1706206 SP 38 P25548 0,150 1/0 X Chemotaxis, Vorstufe, Agrobakterium (B) zuckerbindendes periplasmatisches Protein Gi|38258638 SP 44 Q98H33 0,055 0/0 X Transporter, Vorstufe, Rhizobium (B) Ribosomales Protein gi|730571 SP 13 P0A468 0,119 0/0 50S, L7/L12, Brucella (B) ’’ B4FI88_MAIZE P 11 B4FI88 0,064 0/0 60S, P2A
Uncharakterisierte Proteine vermeintlich uncharakterisiertes Protein A2X6L9_ORYSI P 77 A2X6L9 0,003 1/0 Glycerophosphoryldiester Phosphodiesterase Aktivität a nach verwendeter Datenbank (DB): SP – SwissProt, P Poaceae b nach UniProtKB/SwissProt; Uni ID – Zugangs ID; GRAVY – Hydrophobizitätsindex nach ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/); TMD – transmembrane Domänen wurden nach zwei Algorithmen berechnet (x/y), x = HMMTOP (http://www.tcdb.org/progs/TMS.php) bzw. y = TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM 2.0/) c nach Eintrag bei UniProt oder BRENDA (EC Nummer, brenda enzymes.org/); C – Cytosol/Cytoplasma; P – Plastid/Chloroplast; Mi – Mitochondrium; V – Vakuole; O – andere Organelle (z.B. Peroxisom, Nukleus, Endoplasmatisches Retikulum, Glyoxysom); M – Membran/Endomembran; PM – Plasmamembran; A – Apoplast inklusive Zellwand weitere Abkürzungen: UE – Untereinheit, B – bakteriell
1 http://www.uniprot.org/uniprot/?query=poaceae&sort=score&format=*, Stand: 09.2011 2 http://www.uniprot.org/downloads, UniProtKB/Swiss Prot release 12.0, Stand: 07.2007
157 ANHANG
Tabelle 7-2: Massenspektrometrisch identifizierte Proteine der nicht durch endogene Proteolyse abgegebenen Polypeptide. Die nach PM PM Selbstinkubation von der Nt Prot 10mM (A) und von der Hv Prot 5mM (B) abgetrennten Polypeptide wurden mit TCA gefällt und mit Trypsin verdaut. Für die massenspektrometrische Analyse wurden auch einfach geladene Ionen mit gemessen. Es wurden die Datenbanken (DB) SwissProt (141.396 Einträge) 1, Arabidopsis thaliana (100.356 Einträge) 2, Solanum lycopersicum (68.100 Einträge) 3 und Nicotiana tabacum (5.558 Einträge) 4 für Tabak sowie SwissProt 1 und Poaceae (252.116 Einträge) 5 für Gerste verwendet. Im Vergleich zu Tabelle 3 10 und Tabelle 3 11 sind hier die Proteine aufgelistet, die sowohl in Gegenwart des Proteaseinhibitorcocktails als auch durch endogene Proteolyse (ohne Inhibitor) abgegeben wurden. Proteineintrag (gekürzt) Zugangs ID a DB MW Uni ID b GRAVY TMD Lokalisierung c Zusatzinformationen laut Eintrag [kDa] C P Mi V O M PM A A Oxidoreduktasen Zell Elongationsprotein (Reduktase) SGN U313562 S 66 Q39085 -0,417 1/1 X X X X EC 1.3.1.72; Delta(24) -sterol Reduktase Mono Kupfer Oxidase ähnliches Protein SGN U314232 S 66 Q9SU40 -0,236 1/0 X X X X EC 1. -.-.-, SKU5, vermeintlich
Transferasen 5 Methyltetrahydropteroyl triglutamat SGN U312927 S 86 O50008 -0,141 0/0 X X X X X X EC 2.1.1.14 , ATMETS Homocystein Methyltransferase Cysteinsynthase Q3LAG5_TOBAC N 34 Q3LAG5 0,014 1/0 X X X EC 2.5.1.47
Hydrolasen Phospholipase D PLDA1_TOBAC N 92 P93400 0,421 0/0 X X X X X EC 3.1.4.4, Protein alpha 1 Glycerophosphodiesterase ähnliches Protein Q2WGN6_TOBAC N 82 Q2WGN6 0,009 1/0 EC 3.1.4. Glucan Endo 1,3 beta glucosidase E13B_TOBAC N 41 P15797 0,158 1/1 X X X EC 3.2.1.39 Trypsinvorstufe gi|136429 SP 24 P00761 0,111 0/0 X EC 3.4.21.4, Serinendoprotease, Schwein P Typ H+ ATPase SGN U315949 S 67 P20649 0,077 10/10 X X X X EC 3.6.3.6, ATPase 1 ’’ AT4G30190.1 A 104 P19456 0,097 10/8 X X X EC 3.6.3.6, ATPase 2 ’’ gi|416664 SP 105 Q03194 0,048 10/9 X X EC 3.6.3.6, ATPase 4 ’’ SGN U313650 S 105 Q9LV11 0,121 10/9 X X EC 3.6.3.6, ATPase 11 ’’ Q6TXM4_TOBAC N 105 Q6TXM4 0,066 10/8 X X EC 3.6.3.6 V Typ H+ ATPase AT1G78900.2 A 69 O23654 0,172 0/0 X X X X X EC 3.6.3.14, UE A ’’ Q9M5Z8_TOBAC N 54 Q9M5Z8 0,268 0/0 X X X X EC 3.6.3.14, UE B ’’ VATG1_TOBAC N 12 O82702 0,775 0/0 X X X X EC 3.6.3.14, UE G1 ATP Synthase SGN U313361 S 60 P83483 -0,155 1/0 X X X X X EC 3.6.3.14, UE beta -1
Lyasen Enolase C5J0G6_TOBAC N 48 C5J0G6 0,235 1/0 X X EC 4.2.1.11
Transporter / Kanäle hochaffiner Nitrattransporter Q84MZ9_TOBAC N 58 Q84MZ9 0,322 11/11 X Aquaporin (PM intrinsisches Protein) Q8W507_TOBAC N 31 Q8W507 0,395 6/6 X PIP1;1 Q8W506_TOBAC N 30 Q8W506 0,467 6/6 X PIP2;1 gi|586102 SP 31 Q08451 0,385 6/6 X PIP pTOM75 Q06BK4_TOBAC N 31 Q06BK4 0,407 6/6 X Aquaporin (Tonoplast intrinsisches Protein) TIP1_TOBAC N 25 P21653 0,930 6/6 X X RB7 5A
Weitere Proteine 14 3 3 ähnliches Protein 1433B_TOBAC N 29 O49995 0,515 0/0 Protein B Calmodulin Q76MF3_TOBAC N 17 Q76MF3 0,619 0/0 NtCaM11 Hitzeschock Protein Q67BD0_TOBAC N 71 Q67BD0 0,405 0/0 70 3 ’’ AT3G12580.1 A 71 Q9LHA8 0,434 0/0 X X X X X X Hsp70 4, ATP bindend HR induziertes Protein SGN U313962 S 37 Q9FM19 -0,101 0/0 X X X Elicitor induziertes Protein Q9FXT1_TOBAC N 20 Q9FXT1 0,148 1/1 Elongationsfaktor EF1A_TOBAC N 49 P43643 0,325 0/0 X 1 alpha 158 1 http://www.uniprot.org/downloads, UniProtKB/Swiss Prot release 12.0, Stand: 07.2007; 2 ftp://ftp.arabidopsis.org/home/tair/Sequences/blast_datasets/TAIR9_blastsets/TAIR9_pep_20090619; 3 ftp://ftp.sgn.cornell.edu/proteins/tomato_protein_with_hits.fasta, Stand 07.2007; 4 http://www.uniprot.org/uniprot/?query=taxonomy%3a4097&sort=score&format=*, Stand: 18.11.2011; 5 http://www.uniprot.org/uniprot/?query=poaceae&sort=score&format=*, Stand: 03.2011
Proteineintrag (gekürzt) Zugangs ID a DB MW Uni ID b GRAVY TMD Lokalisierung c Zusatzinformationen laut Eintrag [kDa] C P Mi V O M PM A A Weitere Proteine (weiter) Fasciclin ähnliches Arabinogalaktanprotein SGN U320398 S 43 Q9FM65 -0,039 2/0 X X GPI -Anker Methyl CpG bindendes Protein SGN U321624 S 48 Q9XI36 -1,384 0/0 X X Polyubiquitin SGN U313136 S 37 Q8H159 -0,438 0/0 X X Protein 10, Vorstufe ADP Ribosylierungsfaktor SGN U312464 S 21 P36397 -0,206 1/0 X Protein 1 Drogen resistentes Protein PDR1_TOBAC N 162 Q76CU2 0,028 13/13 X Protein 1 Ribosomales Protein SGN U313350 S 18 Q9CAX6 -0,501 0/0 X X 40S S14 -2 Serumalbumin gi|1351907 SP 69 P02769 0,429 0/0 X Vorstufe Histon A8J6V0_TOBAC N 15 A8J6V0 0,709 0/0 X H2B Histon A0A9R6_TOBAC N 11 A0A9R6 0,550 0/0 X H4 Aktin ACT1_TOBAC N 42 Q05214 0,190 0/0 X Tubulin Q8VXC9_TOBAC N 50 Q8VXC9 0,208 0/0 X Alpha
B Hydrolasen Papain ähnliche Cysteinproteinase B4ESE8_HORVD P 50 B4ESE8 0,448 1/1 Pap6, Endoprotease, vorhergesagt S222 Q9ZTU6_WHEAT P 50 Q9ZTU6 0,074 0/0 Phosphodiesterase Aktivität Glucan Endo 1,3 beta glucosidase E13E_HORVU P 34 Q02438 0,160 0/0 X X EC 3.2.1.39 P Typ H+ ATPase gi|12644156 SP 104 P20649 0,077 10/10 X X X X EC 3.6.3.6, ATPase 1 ’’ gi|12230478 SP 105 Q9SH76 0,028 10/9 X X EC 3.6.3.6, ATPase 6 ’’ PMA1_WHEAT P 105 P83970 0,101 10/8 X X EC 3.6.3.6 ’’ Q5PSM6_WHEAT P 105 Q5PSM6 0,102 10/8 X X EC 3.6.3.6 V Typ H+ ATPase gi|2493123 SP 64 Q40002 0,198 0/0 X EC 3.6.3.14, UE A ’’ gi|2493131 SP 54 Q40078 0,241 0/0 X EC 3.6.3.14, UE B 1 ’’ B2BA41_WHEAT P 43 B2BA41 0,245 0/0 X EC 3.6.3.14, UE C ’’ Q2XP43_WHEAT P 26 Q2XP43 0,628 0/0 EC 3.6.3.14, UE E ’’ B2B9U2_WHEAT P 12 B2B9U2 0,812 0/0 X EC 3.6.3.14, UE G ’’ Q9FS11_HORVU P 68 Q9FS11 0,208 0/0 X EC 3.6.3.14 ATP Synthase ATPBM_ORYSJ P 59 Q01859 0,085 1/0 X EC 3.6.3.14, UE beta
Transporter / Kanäle Phosphattransporter Q84LH9_HORVD P 57 Q84LH9 0,388 12/12 X ’’ C7C2W9_HORVD P 57 C7C2W9 0,393 12/12 X Aquaporin (PM intrinsisches Protein) Q08IH5_HORVU P 31 Q08IH5 0,366 6/6 X PIP1;2 ’’ O48518_HORVU P 31 O48518 0,417 6/6 X PIP1;3 ’’ O48517_HORVU P 30 O48517 0,459 6/6 X PIP2;1 ’’ B0I531_HORVU P 30 B0I531 0,547 6/6 PIP2;2 ’’ Q08IH3_HORVU P 30 Q08IH3 0,509 6/6 PIP2;3 ’’ Q4LDT4_HORVU P 30 Q4LDT4 0,511 6/6 PIP2;4 ’’ gi|32363271 SP 30 P93004 0,451 6/6 X X X X PIP2;7
Weitere Proteine ADP/ATP Carrierprotein ADT2_MAIZE P 42 P12857 0,122 4/3 X X Protein 2, Transporteraktivität HR induziertes Protein Q8H1V3_HORVD P 31 Q8H1V3 0,151 0/0 X Protein 1 Salz /Kälte induziertes Protein Q4KXD9_LOPEL P 30 Q4KXD9 0,019 3/0 Protein 2 1 Blaues Kupfer bindendes Protein Q70DK2_HORVD P 18 Q70DK2 0,264 2/2
Uncharakterisierte Proteine Vermeintlich uncharakterisiertes Protein B8BCZ1_ORYSI P 35 B8BCZ1 0,488 1/1 SNAP Rezeptoraktivität C5WQW9_SORBI P 93 C5WQW9 0,009 6/6 Transmembrane Transporteraktivität C5Y6D9_SORBI P 45 C5Y6D9 0,151 0/0 Hydrolaseaktivität
a nach verwendeter Datenbank (DB): SP – SwissProt, A – Arabidopsis thaliana , S – Solanum lycopersicum , N – Nicotiana tabacum , P – Poaceae b nach UniProtKB/SwissProt; Uni ID – Zugangs ID; GRAVY – Hydrophobizitätsindex nach ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/); TMD – transmembrane Domänen wurden nach zwei Algorithmen berechnet (x/y), x = HMMTOP (http://www.tcdb.org/progs/TMS.php) bzw. y = TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM 2.0/) c nach Eintrag bei UniProt oder BRENDA X (EC Nummer, brenda enzymes.org/); C – Cytosol/Cytoplasma; P – Plastid/Chloroplast; Mi – Mitochondrium; V – Vakuole; O – andere Organelle (z.B. Peroxisom, Nukleus, Endoplasmatisches Retikulum); M – Membran/Endomembran; PM – Plasmamembran; A – Apoplast inklusive Zellwand; weitere Abkürzungen: UE – Untereinheit, HR – hypersensitive Reaktion
ANHANG
Tabelle 7-3: Massenspektrometrisch identifizierte Proteine der durch endogene Proteolyse abgegebenen Polypeptide. Die proteolytisch von PM PM PM Vesikeln der Nt Prot 10mM (A) bzw. der Hv Prot 5mM (B) abgetrennten Polypeptide wurden über SDS PAGE fraktioniert, die Gelsegmente mit höchster caseinolytischer Proteaseaktivität ausgewählt und mit Trypsin verdaut. Es wurden die Datenbanken Solanum lycopersicum (68.100 Einträge) 1 und Nicotiana tabacum (5.558 Einträge) 2 für Tabak (A) sowie die Datenbank Poaceae (252.158 Einträge) 3 für Gerste (B) verwendet. Es wurden auch Proteine, die nur mit einem Peptid (P) detektiert wurden, berücksichtigt. P Proteineintrag (gekürzt) Zugangs ID a DB MW Uni ID b GRAVY TMD Lokalisierung c Zusatzinformationen laut Eintrag [kDa] C P Mi V O M PM A A Oxidoreduktasen 1 3 Dehydroquinate Dehydratase / Q6PUG0_TOBAC N 57 Q6PUG0 0,085 1/0 X X EC 1.1.1.25 bzw. EC. 4.2.1.10 Shikimatdehydrogenase Isoform 1 NAD Malatdehydrogenase Q9XQP4_TOBAC N 43 Q9XQP4 0,054 0/0 X X X X EC 1.1.1.37 1 Dihydroflavonol 4 Reduktase A3RK77_TOBAC N 42 A3RK77 0,219 3/2 EC 1.1.1.234, löslich 1 Glycerinaldehyd 3 phosphatdehydrogenase SGN U325567 S 26 Q9SAJ6 -0,111 1/0 X X X EC 1.2.1.12 1 Protoporphyrinogen Oxidase PPOM_TOBAC N 55 O24164 0,305 1/0 X X X EC 1.3.3.4 1 Cytochrom P450 SGN U331278 S 27 Q9LVD2 -0,083 2/2 X EC 1.14. -.- 1 Glutaredoxin verwandtes Protein SGN U316126 S 26 Q8LBK6 -0,439 0/0 X EC 1.20.4.1
Transferasen 1 Methioninsynthase SGN U312927 S 86 O50008 -0,141 0/0 X X X X X X X EC 2.1.1.14, Vit B12 -unabh., Isoform 1 UbiA Prenyltransferase SGN U316833 S 50 O64886 0,270 8/9 X X EC 2.5.1. -, COX10
Hydrolasen 1 Proteinphosphatase 2C SGN U333192 S 15 Q5PNS9 -0,253 0/0 X X X X X EC 3.1.3.16, Protein 64 1 ’’ SGN U321966 S 48 Q9LQN6 -0,519 0/0 X X X X X X EC 3.1.3.16, Protein 4 1 Ubiquitin spezifische Protease 22 SGN U346283 S 39 Q9LEW0 -0,289 0/0 EC 3.4.19.12 , UBP 22 1 P Typ H+ ATPase SGN U322211 S 39 P19456 0,097 10/8 X X X EC 3.6.3.6, ATPase 2, vermeintlich 1 RNA Helicase ähnliches Protein SGN U322066 S 46 n.b. n.b. n.b. EC 3. -.-.-
Lyasen 1 Thiaminbiosynthese verwandtes Protein SGN U324201 S 34 O82392 -0,407 0/0 X EC 4.1.99.17, Thi C
Ligasen 1 Tyrosyl tRNA Synthetase P93363_TOBAC N 46 P93363 0,453 0/0 X X EC 6.1.1.1
Transporter / Kanäle 1 Aquaporin (PM intrinsisches Protein) Q8W507_TOBAC N 31 Q8W507 0,395 6/6 X PIP 1;1 1 ’’ Q40595_TOBAC N 31 Q40595 0,399 6/6 X 1 ’’ SGN U312698 S 31 Q08733 0,381 6/6 X X X PIP 1;3
Weitere Proteine 1 Hitzeschock Protein Q40511_TOBAC N 63 Q40511 0,462 0/0 70 kDa, Fragment, ATP bindend 1 ’’ Q9ZT13_TOBAC N 101 Q9ZT13 0,377 0/0 101 kDa, ATP bindend, Chaperon, clp F. 1 ’’ SGN U314101 S 117 Q9LF37 -0,447 0/0 X ClpB3, 100 kDa, vermeintlich, Prot.Akt. 1 Chaperon SGN U333761 S 23 P42825 -0,773 0/ 0 X X X Protein dnaJ2 , ATP -bind end 1 WD40 SGN U316220 S 92 Q94AI7 -0,296 0/0 X X Protein TOPLESS 1 ’’ SGN U319814 S 58 Q8W117 -0,346 0/0 X SMU1 1 Ethylenrezeptor Homolog O22587_TOBAC N 85 O22587 0,039 5/4 X X ATP bindend 1 Eukaryotischer Translationinitiationsfaktor EIF3A_TOBAC N 112 Q40554 0,710 1/0 X UE 3 1 integrales Membranprotein SGN U317269 S 19 Q8L7R5 1,109 ¾ X X Arabidopsis: CASP -ähnliches Protein 1 Uclacyanin SGN U314736 S 22 Q9LY37 0,172 3/1 X Membrananker 160 1 Fasciclin ähnliches Arabinogalactanprotein SGN U316315 S 44 Q9SU13 -0,076 1/0 X X X GPI -Anker 1 ftp://ftp.sgn.cornell.edu/proteins/tomato_protein_with_hits.fasta, Stand 07.2007; 2 http://www.uniprot.org/uniprot/?query=taxonomy%3a4097&sort=score&format=*, Stand: 18.11.2011; 3 http://www.uniprot.org/uniprot/?query=poaceae&sort=score&format=*, Stand: 03.2011
P Proteineintrag (gekürzt) Zugangs ID a DB MW Uni ID b GRAVY TMD Lokalisierung c Zusatzinformationen laut Eintrag [kDa] C P Mi V O M PM A A Weitere Proteine (weiter) 1 ribosomales Protein SGN U317736 S 37 O04527 -0,285 0/0 X L12 Protein 1 ’’ Q5MA34_TOBAC N 14 Q5MA34 0,870 0/0 X S12 1 ’’ SGN U339379 S 17 Q9SUR4 -0,199 0/0 50S, 1 ’’ SGN U312502 S 34 O04603 -0,277 0/0 X X X 50S L5, chloroplasti sch
uncharakterisierte Proteine 1 unbekanntes Protein SGN U316795 S 35 n.b. n.b. n.b. 1 exprimiertes Protein SGN U323760 S 12 n.b. n.b. n.b. 1 hypothetisches Protein SGN U334884 S 29 n.b. n.b. n.b.
B Hydrolasen 1 MAP Kinase Phosphatase Q9ATY4_MAIZE P 72 Q9ATY4 0,331 1/0 EC 3.1.3.48, Fragment 1 Methionin Aminopeptidase A2ZN00_ORYSI P 50 A2ZN00 0,524 1/0 EC 3.4.11.18, Metallotyp + 4 P Typ H ATPase PMA1_WHEAT P 105 P83970 0,101 10/8 X X EC 3.6.3.6 + 1 V Typ H ATPase VATA_MAIZE P 62 P49087 0,167 1/0 X X X X EC 3.6.3.14, UE A
Lyasen 1 Phosphoenolpyruvat Carboxylase CAPP2_MAIZE P 110 P51059 0,336 0/0 X X X EC 4.1.1.31
Transporter / Kanäle 4 Aquaporin (PM intrinsisches Protein) Q08IH3_HORVU P 30 Q08IH3 0,509 6/6 X PIP 2;3 2 ’’ Q08IH4_HORVU P 31 Q08IH4 0,395 6/6 X PIP 1;4 1 ’’ O48517_HORVU P 30 O48517 0,459 6/6 X PIP 2;1
Weitere Proteine 1 Os11g0654000 Protein Q0IRB9_ORYSJ P 20 Q0IRB9 0,195 1/0 vorhergesagtes Protein 1 Fasciclin ähnliches Protein Q2L3E6_BRASY P 27 Q2L3E6 0,246 1/1 evt. GPI Anker, vorhergesagtes Protein 1 Chromosom Kondensationsfaktor Q5EWZ0_WHEAT P 98 Q5EWZ0 0,465 1/0 Vermeintlich 1 Os02g0474000 Protein Q6K6H3_ORYSJ P 8 Q6K6H3 0,215 0/0 vorhergesagtes Protein
uncharakterisierte Proteine 1 vermeintlich uncharakterisiertes Protein A2ZCD5_ORYSI P 70 A2ZCD5 0,055 2/2 1 ’’ B8B1C4_ORYSI P 47 B8B1C4 0,760 0/0 1 ’’ B8AND1_ORYSI P 111 B8AND1 0,106 1/0 1 ’’ C5X8M0_SORBI P 15 C5X8M0 0,435 0/0 ATP bindend 1 ’’ A2Y9Q7_ORYSI P 91 A2Y9Q7 0,257 0/1 Proteinkinase Aktivität 1 ’’ A3C2D5_ORYSJ P 50 A3C2D5 0,250 0/0 1 ’’ C4J1P4_MAIZE P 44 C4J1P4 0,013 0/0 1 ’’ C5WWH4_SORBI P 116 C5WWH4 0,153 1/0 Ubiquitin Ubiquitin Ligase Aktivität 1 ’’ C5YYG4_SORBI P 32 C5YYG4 0,224 0/0 1 ’’ C5Y4Z0_SORBI P 62 C5Y4Z0 0,190 1/1 X Oxidoreduktase Aktivität 1 ’’ B8BCJ8_ORYSI P 51 B8BCJ8 0,603 0/0 a nach verwendeter Datenbank (DB): S – Solanum lycopersicum , N – Nicotiana tabacum , P Poaceae b nach UniProtKB/SwissProt; Uni ID – Zugangs ID; GRAVY – Hydrophobizitätsindex nach ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/); TMD – transmembrane Domänen wurden nach zwei Algorithmen berechnet (x/y), x = HMMTOP (http://www.tcdb.org/progs/TMS.php) bzw. y = TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM 2.0/) c nach Eintrag bei UniProt oder BRENDA X (EC Nummer, brenda enzymes.org/); C – Cytosol/Cytoplasma; P – Plastid/Chloroplast; Mi – Mitochondrium; V – Vakuole; O – andere Organelle (z.B. Peroxisom, Nukleus, Endoplasmatisches Retikulum); M – Membran/Endomembran; PM – Plasmamembran; A – Apoplast inklusive Zellwand weitere Abkürzung: UE – Untereinheit
161 ANHANG
A B
Abbildung 7-9: SDS-PAGE der über endogene Proteolyse von den PM-Vesikeln abgetrennten PM PM Polypeptide. PM Vesikel der Nt Prot 10mM (A) und der Hv Prot 5mM (B) wurden mit NaCl behandelt, pelletiert und die anschließend resuspendierten PM Vesikel über das Zwei Phasensystem aufgetrennt. Die „right side out“ PM Vesikel wurden bei 37 °C inkubiert und die dabei abgegebenen Polypeptide durch Zentrifugation (50.000 x g, 1 h, 4 °C) abgetrennt. Die Proben wurden über SDS PAGE fraktioniert, die Gelspur halbiert und in gleichgroße Stücke geschnitten. Eine Teilspur wurde direkt im Proteaseaktivitätstest mit FTC Casein eingesetzt. Ausgewählte Fraktionen der restlichen Gelspuren (*) wurden mit Trypsin verdaut und massenspektrometrisch analysiert (siehe Tabelle 7 2). SG = Sammelgel (n=1)
162 ANHANG
7.2 Abkürzungsverzeichnis
Chemikalien siehe Kap. 2.1.3; Aminosäuren werden mit 3 bzw. 1 Buchstaben abgekürzt Nomenklatur der Proteaseformen siehe ausklappbare Buchseite AC Anionenaustauschchromatographie app. MW apparentes Molekulargewicht AP Aminopeptidase ATP Adenosintriphosphat bzw. Beziehungsweise CMC kritische Mizellenkonzentration CP Carboxypeptidase DB Datenbank DRM detergenz resistente Membran EC “Enzyme Commission“ Nummer, Klassifikationssystem der Enzyme ER Endoplasmatisches Retikulum EST „expressed sequence tags“ (kurze DNA Sequenzen) etc. et cetera (und im Übrigen) FPLC „fast performance liquid chromatography” GPI Anker Glykosyl Phosphatidylinositol Anker GRAVY Hydrophobizitätsindex („grand average hydrophobicity score“) HIC Hydrophobe Interaktionschromatographie IMAC Metallchelat Affinitätschromatographie KC Kationenaustauschchromatographie mF mikrosomale Fraktion MWCO Ausschlussgrenze, “molecular weight cut out“ n.b. nicht bestimmt p p Wert, Statistik: Signifikanzwert PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese pI isoelektrischer Punkt PLC Phospholipase C (bzw. PI PLC = Phosphatidylinositol spezifische PLC) PM Plasmamembran PM Vesikel Plasmamembranvesikel RFU relative Fluoreszenzeinheit RIP regulierte intramembrane Proteolyse RLF relative Luftfeuchtigkeit RT Raumtemperatur SG Sammelgel TG Trockengewicht TMD Transmembrane Domäne UE Untereinheit UPLC „ultra performance liquid chromatography“ z.B. zum Beispiel
163 ANHANG
7.3 Abbildungsverzeichnis
Abb. 1 1 Einteilung der Proteasen anhand der von ihnen gespaltenen Peptidbindung innerhalb einer Polypeptidkette. 2 Abb. 1 2 Schema spezifischer Substratbindestellen, die die Substratspezifität einer Protease diktieren. 3 Abb. 1 3 Hydrolysereaktion. 4 Abb. 1 4 Aktivierungsmechanismen der vier Hauptklassen von Proteasen. 5 Abb. 1 5 Sequenzstruktur der inaktiven Vorstufe von Papain (Zymogen). 7 Abb. 1 6 Membranproteintypen. 9 Abb. 2 1 pH Abhängigkeit der Proteaseaktivität an PM Vesikeln von Tabak und Gerstewurzeln mit FTC Casein als Substrat. 25 Abb. 2 2 Spaltungsort der PNGase F innerhalb eines Glykoproteins. 34 Abb. 2 3 Einflüsse der bei der Proteaseanreinigung verwendeten Detergenzien auf die massenspektrometrische Analyse. 40 Abb. 3 1 PM assoziierte Exopeptidaseaktivitäten der Blätter und Wurzeln. 44 Abb. 3 2 PM assoziierte Proteaseaktivitäten von Wurzeln in Abhängigkeit von der Nitraternährung. 45 Abb. 3 3 Elutionsprofil der Größenausschlusschromatographie solubilisierter PM Proteasen aus Tabak und Gerstewurzeln. 48 Abb. 3 4 Elutionsprofile der Anionenaustauschchromatographie solubilisierter PM Proteasen in Gegenwart von 0,02 % Lubrol. 49 I Abb. 3 5 Elutionsprofil der Kationenaustauschchromatographie der Hv Prot 5mM . 49 I Abb. 3 6 Elutionsprofile der Hydrophoben Interaktionschromatographie der Nt Prot 10mM II und Nt Prot 10mM . 50 Abb. 3 7 Elutionsprofile der Metallchelat Affinitätschromatographie der angereinigten I II Hv Prot 5mM und Hv Prot 5mM . 51 Abb. 3 8 Native Gelelektrophorese solubilisierter PM Proteine von Tabak und Gerstewurzeln. 53 Abb. 3 9 Native Gelelektrophorese solubilisierter PM Proteasen von Tabakwurzeln in Abhängigkeit von der Nitraternährung. 54 II.b Abb. 3 10 SDS PAGE der chromatographisch angereinigten Hv Prot 5mM . 56 Abb. 3 11 Zymographische Fraktionierung der verschiedenen angereinigten PM Proteasen von Gerstewurzeln. 58 I Abb. 3 12 Zymographische Fraktionierung der Hv Prot 5mM nach Deglykosylierung. 61 Abb. 3 13 Einfluss von Inhibitoren auf die PM assoziierte Endo und Exopeptidaseaktivität. 64 Abb. 3 14 Einfluss von Inhibitoren auf die PM assoziierte Endo und Exopeptidaseaktivität aus Tabakwurzeln in Abhängigkeit der Stickstoffernährung. 65 Abb. 3 15 Zymographie der angereinigten PM gebundenen Nt Prot II verschiedener Nitratanzuchten in Abhängigkeit von CaCl 2. 67 Abb. 3 16 Vergleich massenspektrometrisch analysierter PM Proteine nach Trypsin und Elastaseverdau. 69 Abb. 3 17 SDS PAGE der in Gegenwart von Octylglucosid chromatographisch II.b angereinigten PM gebundenen Hv Prot 5mM . 73
164 ANHANG
Abb. 3 18 Sequenzvergleich der massenspektrometrisch detektierten Metalloaminopeptidasen aus Reis mit den zu 90 % identischen Gerstenproteinen. 74 PM Abb. 3 19 Polypeptidabgabe von Nt Prot 10mM und von hydroponisch gewachsenen Tabakpflanzen. 87 Abb. 3 20 Zymographie PM assoziierter Proteasen in Abhängigkeit von der Art ihrer Freisetzung von PM Vesikeln. 90 Abb. 4 1 Übersicht der nachgewiesenen Proteasetypen an den PM Vesikeln aus Gerstewurzeln. 92 Abb. 4 2 Sequenzvergleich der detektierten Papain ähnlichen Cysteinproteinase mit ähnlichen Gerstenproteinen. 103 Abb. 4 3 Sequenzvergleich der Phytepsinvorstufe mit ähnlichen Gerstenproteinen. 105 Abb. 4 4 Schema zur Sequenzabdeckung. 132 Abb. 4 5 Funktionen PM gebundener Proteasen in Wurzeln. 137 Abb. 7 1 Korrelation verschiedener Parameter der Gersteanzucht. 153 Abb. 7 2 Exopeptidaseaktivität solubilisierter PM Proteine aus Wurzeln in Abhängigkeit von der Nitraternährung. 154 Abb. 7 3 Elutionsprofile der Anionenaustauschchromatographie solubilisierter PM Proteasen in Abhängigkeit von der Nitraternährung. 154 I Abb. 7 4 Elutionsprofile der Hydrophoben Interaktionschromatographie der Nt Prot 10mM in Abhängigkeit der verwendeten Salzkonzentration. 155 Sol Abb. 7 5 Zymographie der Hv Prot 5mM in Abhängigkeit von der Erntereihenfolge der Anzuchtsschalen. 155 Abb. 7 6 Elutionsprofil der Metallchelat Affinitätschromatographie der angereinigten Hv II Prot 5mM in Gegenwart von Octylglucosid. 155 Abb. 7 7 Hydrophobizitätsindex der massenspektrometrisch identifizierten Proteine. 156 Abb. 7 8 Korrelation des Hydrophobizitätsindex mit vorhergesagten transmembranen Domänen. 156 Abb. 7 9 SDS PAGE der über endogene Proteolyse von den PM Vesikeln abgetrennten Polypeptide. 162
7.4 Tabellenverzeichnis
Tab. 1 1 Katalytische Typen von Proteasen. 5 Tab. 2 1 Nährlösung für die Anzucht der Tabak und Gerstepflanzen. 16 Tab. 2 2 Vergleich des Entwicklungsstands der Gerstepflanzen bei der Ernte in Abhängigkeit von der Stickstoffernährung. 18 Tab. 2 3 Zusammensetzung des Aufbruchpuffers. 21 Tab. 2 4 Zusammensetzung des Resuspensionspuffers. 21 Tab. 2 5 Zusammensetzung der 24 g Phasensysteme. 22 Tab. 2 6 Einfluss der Erntebedingungen auf die spezifische Proteaseaktivität an PM Vesikeln von Gerstewurzeln. 23 Tab. 2 7 Zusammensetzung der Puffer für den Proteaseaktivitätstest mit FTC Casein. 25 Tab. 2 8 Spezifikationen der verwendeten Exopeptidasesubstrate. 26 Tab. 2 9 Zusammensetzung des Testpuffers für die Messung der Exopeptidaseaktivitäten. 27
165 ANHANG
Tab. 2 10 Zusammensetzung des Proteaseinhibitorcocktails für pflanzliches Gewebe. 27 Tab. 2 11 Zusammensetzung der Puffer für die Anionenaustauschchromatographie. 31 Tab. 2 12 Zusammensetzung der Puffer für die Kationenaustauschchromatographie. 32 Tab. 2 13 Laufpufferzusammensetzung der Hydrophoben Interaktionschromatographie. 33 Tab. 2 14 Zusammensetzung der Puffer für die Metallchelat Affinitätschromatographie. 34 Tab. 2 15 Zusammensetzung der Puffer zur Herstellung der SDS Polyacrylamidgele. 36 Tab. 2 16 Zusammensetzung der verwendeten Lösungen für die Zymographie. 37 Tab. 2 17 Verwendete Gradienten der UPLC. 39 Tab. 3 1 Membranassoziierte Proteaseaktivität von Blättern und Wurzeln mit FTC Casein als Substrat. 44 Tab. 3 2 Proteaseaktivität solubilisierter PM Proteine aus Wurzeln in Abhängigkeit von der Nitraternährung. 47 Tab. 3 3 Exopeptidaseaktivität der angereinigten PM Proteasen von Gerstewurzeln. 52 Tab. 3 4 Apparente Molekulargewichte zymographisch fraktionierter PM Proteasen von Gerstewurzeln. 59 Tab. 3 5 Effekt von Metallionen auf die PM assoziierte Proteaseaktivität von Tabakwurzeln. 66 Tab. 3 6 Apparentes Molekulargewicht proteolytisch aktiver Polypeptide der Nt Prot II unterschiedlicher Nitraternährung in Abhängigkeit von CaCl 2. 68 Tab. 3 7 Massenspektrometrisch identifizierte Proteine der solubilisierten PM Proteine von Gerstewurzeln. 70 II.b Tab. 3 8 Massenspektrometrisch identifizierte Proteine der Hv Prot 5mM . 76 Tab. 3 9 Massenspektrometrisch identifizierte Proteine der über SDS PAGE fraktionierten II.b Hv Prot 5mM . 78 Tab. 3 10 Massenspektrometrisch identifizierte Proteine der durch endogene Proteolyse PM abgegebenen Polypeptide der Nt Prot 10mM . 82 Tab. 3 11 Massenspektrometrisch identifizierte Proteine der durch endogene Proteolyse PM abgegebenen Polypeptide der Hv Prot 5mM . 84 PM Tab. 3 12 Apparente Molekulargewichte abgegebener Polypeptide von Nt Prot 10mM sowie exsudierter Polypeptide. 87 Tab. 4 1 Charakteristika der PM gebundenen menschlichen Aminopeptidasen, die für die getesteten Exopeptidasesubstrate spezifisch sind. 93 Tab. 4 2 Sequenzvergleiche verschiedener Aminopeptidaseformen mit Proteindatenbankeinträgen für Gerste und Tabak. 96 Tab. 4 3 Massenspektrometrisch nachgewiesene Proteine aus Tabak und Gerste, die von anderen Gruppen als detergenz resistente Membranproteine klassifiziert wurden. 122 Tab. 4 4 Sequenzvergleiche GPI verankerter Proteasen aus Arabidopsis thaliana mit Proteindatenbankeinträgen für Gerste und Tabak. 124 Tab. 4 5 Einordnung der putativen PM Proteasesubstrate von Tabak und Gerste anhand ihrer Funktionen im pflanzlichen Stoffwechsel. 136 II.a Tab. 7 1 Massenspektrometrisch identifizierte Proteine der Hv Prot 5mM . 157 Tab. 7 2 Massenspektrometrisch identifizierte Proteine der nicht durch endogene Proteolyse abgegebenen Polypeptide. 158 Tab. 7 3 Massenspektrometrisch identifizierte Proteine der durch endogene Proteolyse abgegebenen Polypeptide. 160
166 Abkürzungsverzeichnis der Proteaseformen
Pflanze Nt = Nicotiana tabacum Hv = Hordeum vulgare Stickstoffversorgung: Sandkultur hydroponische Kultur Mangelversorgung 2 mM Nitrat 0 mM Nitrat Normalversorgung 10 mM Nitrat 5 mM Nitrat Überversorgung 25 mM Nitrat PM (Beispiel: Nt Prot 10mM Tabak, PM Vesikel, 10 mM Nitraternährung)
Proteaseformen bzw. Reinigungsstufen:
Tabak Nt Prot PM PM Vesikel
Nt Prot Sol mit Octylglucosid/NaCl solubilisierte PM Proteine
Nt Prot I nicht gebundene AC Form
Nt Prot I.I nicht gebundene AC über HIC (entsprechend I.II bis I.IV )
Nt Prot II gebundene AC Form
Nt Prot II.I gebundene AC über HIC
Gerste Hv Prot PM PM Vesikel
Hv Prot Sol mit Octylglucosid solubilisierte PM Proteine
Hv Prot A über Gelfiltration fraktionierte Form (entsprechend B und C)
Hv Prot I nicht gebundene AC Form
Hv Prot I.A nicht gebundene AC über KC: nicht gebundene Form
Hv Prot I.B nicht gebundene AC über KC: gebundene Form
Hv Prot I.a nicht gebundene AC über IMAC: nicht gebundene Form
Hv Prot I.b nicht gebundene AC über IMAC: gebundene Form
Hv Prot II gebundene AC Form
Hv Prot II.a gebundene AC Form über IMAC: nicht gebundene Form
Hv Prot II.b gebundene AC Form über IMAC: gebundene Form
167
Hiermit erkläre ich, dass diese Arbeit bisher von mir weder an der Mathematisch Naturwissenschaftlichen Fakultät der Ernst Moritz Arndt Universität Greifswald noch einer anderen wissenschaftlichen Einrichtung zum Zwecke der Promotion eingereicht wurde. Ferner erkläre ich, dass ich diese Arbeit selbständig verfasst und keine anderen als die darin angegebenen Hilfsmittel und Hilfen benutzt und keine Textabschnitte eines Dritten ohne Kennzeichnung übernommen habe.
Manuela Eick
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Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Prof. Dr. Christine Stöhr für die Bereitstellung des interessanten Themas, die guten Arbeitsbedingungen im Arbeitskreis Pflanzenphysiologie der Ernst Moritz Arndt Universität Greifswald und selbstverständlich für die ausgezeichnete Betreuung während der gesamten Promotion.
Prof. Dr. Uwe Lendeckel und seiner Arbeitsgruppe, allen voran Dr. Carmen Wolke, danke ich für die gute Zusammenarbeit, die Bereitstellung der Exopeptidasesubstrate und die zahl reichen Exopeptidaseaktivitätsmessungen.
Prof. Dr. Hans Peter Mock und seiner Arbeitsgruppe danke ich für die massenspektro metrische Analyse meiner verschiedenen Proben und der Gelegenheit diese selbst mit durchzuführen. Mein besonderer Dank gilt Dr. Andrea Matros für die ausgezeichnete Betreuung.
Bei der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Michael Hecker und Dr. Dörte Becher bedanke ich mich für die massenspektrometrische Analyse weiterer Proben. Ganz besonderer Dank gilt Martin Moche für die experimentelle Durchführung sowie für die unzähligen ausführlich beantworteten Fragen.
Zudem möchte ich mich bei den übrigen Mitarbeitern und ehemaligen Mitgliedern der Arbeitsgruppe Pflanzenphysiologie bedanken: Yvonne, Stephanie, Tim, Diana, Sarah, Dr. Shweta Vandana, Jasmin, Levke, Natalie, Lisa, Steffen, Arvid, Dr. Stephanie Stremlau, Kathleen Loßin, Stephi, Mareike, Sandra, Tonja, Steffen, Martin, Renate Bernhard, Sabine Kell und Jürgen Meyercordt, für die ausgezeichnete Arbeitsatmosphäre und die Bereitschaft, meine Kuchen und ausgefallenen Kreationen zu probieren.
Ein ganz besonderes Dankeschön gilt Yvonne und meiner Schwester Andrea, für die unzähligen Diskussionen und hilfreichen Anmerkungen während der Erstellung und Korrektur dieser Arbeit.
Ein großer Dank gilt auch meinen Eltern, die mich während meiner gesamten Promotion immer unterstützt und ermutigt haben.
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