ﺑﻬﻴﻨﻪ ﺳﺎﺯﻯ ﮐﺸﺖ ﺑﺎﻓﺖ lateriflora ﺑﻪ ﻣﻨﻈﻮﺭ اﻓﺰاﻳﺶ ﺗﻮﻟﻴﺪ ﻣﺘﺎﺑﻮﻟﻴﺖﻫﺎﻯ ﺛﺎﻧﻮﻳﻪ

ﻧﺎﻡ ﺩاﻧﺸﺠﻮ: ﺳﻴﻤﺎ ﺻﺪﻳﻖ ﺟﻮﻗﺎﻥ

اﺳﺘﺎﺩ ﺭاﻫﻨﻤﺎ: ﻋﺬﺭا ﺻﺒﻮﺭا

اﺳﺘﺎﺩ ﻣﺸﺎﻭﺭ: ﻓﺮﺡ ﮐﺮﻳﻤﻰ

ﭼﮑﻴﺪﻩ: ﮔﻴﺎﻩ L. lateriflora Scutellaria ﻣﺘﻌﻠﻖ ﺑﻪ ﺧﺎﻧﻮاﺩﻩ ﻧﻌﻨﺎﺋﻴﺎﻥ ﺑﻪ ﺩﻟﻴﻞ ﻭﺟﻮﺩ ﺗﺮﮐﻴﺒﺎﺕ

ﻓﻨﻮﻟﻰ ﻭ ﻓﻼﻭﻧﻮﺋﻴﺪﻯ ﺩﺭ ﻃﺐ ﺳﻨﺘﻰ ﺑﻪ ﻋﻨﻮاﻥ ﻳﮏ ﮔﻴﺎﻩ ﺩاﺭﻭﻳﻰ ﮐﺎﺭﺑﺮﺩﻫﺎﻯ ﻭﺳﻴﻌﻰ ﺩاﺷﺘﻪ اﺯﺟﻤﻠﻪ ﺩﺭ ﺩﺭﻣﺎﻥ ﺑﻴﻤﺎﺭﻯﻫﺎﻯ ﻋﺼﺒﻰ ﻭ ﮔﻮاﺭﺷﻰ

ﻣﻮﺭﺩ اﺳﺘﻔﺎﺩﻩ ﻗﺮاﺭ ﮔﺮﻓﺘﻪ اﺳﺖ. اﺯ ﺁﻧﺠﺎﻳﻰ ﮐﻪ ﻣﻨﺎﺑﻊ ﻃﺒﻴﻌﻰ ﮔﻴﺎﻫﺎﻥ ﻭﺣﺸﻰ ﻣﺤﺪﻭﺩ اﺳﺖ ﺩﺭ اﻳﻦ ﺗﺤﻘﻴﻖ ﺟﻬﺖ ﺗﮑﺜﻴﺮ ﮔﻴﺎﻩ ﻭ ﺑﻬﺮﻩ ﺑﺮﺩاﺭﻯ

اﺯ ﻣﺘﺎﺑﻮﻟﻴﺖﻫﺎﻯ ﺛﺎﻧﻮﻳﻪ ﺁﻥ اﺯ ﺭﻭﺵﻫﺎﻯ ﺭاﻳﺞ ﮐﺸﺖ ﺑﺎﻓﺖ اﺳﺘﻔﺎﺩﻩ ﺷﺪ. ﺑﻪ ﻣﻨﻈﻮﺭ ﺑﻬﻴﻨﻪ ﺳﺎﺯﻯ ﻣﺤﻴﻂ ﮐﺸﺖ ﮔﻴﺎﻩ اﺑﺘﺪا ﺑﺬﺭ ﺳﺘﺮﻭﻥ ﮔﻴﺎﻩ ﺩﺭ

ﻣﺤﻴﻂ MS ﭘﺎﻳﻪ ﻓﺎﻗﺪ ﻫﻮﺭﻣﻮﻥ ﮐﺸﺖ ﺷﺪ. ﺳﭙﺲ ﺟﺪاﮐﺸﺖﻫﺎﻯ ﻣﻴﺎﻧﮕﺮﻩ ﺣﺎﺻﻞ اﺯ ﮔﻴﺎﻫﭽﻪﻫﺎﻯ ۶۰ ﺭﻭﺯﻩ ﺩﺭ ﻣﺤﻴﻂ MS ﭘﺎﻳﻪ ﺩاﺭاﻯ ۴ ﺗﺮﮐﻴﺐ ﻫﻮﺭﻣﻮﻧﻰ

/KIN NAA/ ۲,۴-D/BAP، NAA، BAP ﻭ D/KIN-۲,۴ ﺩﺭ ﻣﺤﺪﻭﺩﻩ mg/L -۲ ۰ ﮐﺸﺖ ﮔﺮﺩﻳﺪ. ﺗﻤﺎﻡ ﺁﺯﻣﺎﻳﺶﻫﺎ ﺩﺭ ﻗﺎﻟﺐ ﻃﺮﺡ ﺁﺯﻣﺎﻳﺸﻰ ﺑﻠﻮﮎﻫﺎﻯ

ﮐﺎﻣﻞ ﺗﺼﺎﺩﻓﻰ ﺑﺎ ﺣﺪاﻗﻞ ۵ ﺗﮑﺮاﺭ اﻧﺠﺎﻡ ﮔﺮﺩﻳﺪ. ﻧﺘﺎﻳﺞ ﺣﺎﺻﻞ اﺯ ﮐﺸﺖ ﺑﺎﻓﺖ ﮔﻴﺎﻩ .lateriflora S ﻧﺸﺎﻥ ﺩاﺩ ﺑﻬﺘﺮﻳﻦ ﺗﺮﮐﻴﺐ ﻫﻮﺭﻣﻮﻧﻰ

ﺟﻬﺖ اﻟﻘﺎﻯ ﮐﺎﻝﺯاﻳﻰ ﺗﺮﮐﻴﺐ D/KIN-۲,۴ ﺑﻮﺩ. ﺑﻴﺸﺘﺮﻳﻦ ﺗﻌﺪاﺩ ﮐﺎﻟﻮﺱ ﺩﺭ ﻫﺮ ﺟﺪاﮐﺸﺖ ﺑﺎ ﺗﻴﻤﺎﺭ K۲D۰٫۱ ﻭ ﺑﻴﺸﺘﺮﻳﻦ ﻗﻄﺮ ﮐﺎﻟﻮﺱ ﺑﺎ ﺗﻴﻤﺎﺭ

K۰٫۵D۲ ﺣﺎﺻﻞ ﺷﺪ. ﺑﻬﺘﺮﻳﻦ ﭘﺎﺳﺦ ﺷﺎﺧﻪﺯاﻳﻰ ﻭ ﺭﻳﺸﻪﺯاﻳﻰ ﺑﺎ ﺗﺮﮐﻴﺐ ﻫﻮﺭﻣﻮﻧﻰ /BAP NAA اﻟﻘﺎ ﮔﺮﺩﻳﺪ. ﺑﻴﺸﺘﺮﻳﻦ ﺳﻄﺢ ﺑﺮﮒ ﻭ ﺗﻌﺪاﺩ ﻧﻮﺷﺎﺧﻪ

ﺗﺤﺖ ﺗﺎﺛﻴﺮ ﺗﻴﻤﺎﺭ B۰٫۱N۰ ﻭ ﺑﻴﺸﺘﺮﻳﻦ ﺗﻌﺪاﺩ ﺭﻳﺸﻪ ﺑﺎ ﺗﻴﻤﺎﺭ B۰N۲ ﺑﻪ ﺩﺳﺖ ﺁﻣﺪ. ﻣﺤﺘﻮاﻯ ﺗﺮﮐﻴﺒﺎﺕ ﻓﻨﻮﻟﻰ ﻭ ﻓﻼﻭﻧﻮﺋﻴﺪﻯ اﻧﺪاﻡﻫﺎﻯ ﻧﻮﭘﺪﻳﺪ

ﺩﺭ ﻣﺤﻴﻂﻫﺎﻯ ﮐﺸﺖ ﭘﺮ ﺑﺎﺯﺩﻩ ﺑﻪ ﺭﻭﺵ ﺭﻧﮓ ﺳﻨﺠﻰ ﺳﻨﺠﻴﺪﻩ ﺷﺪ. ﻧﺘﺎﻳﺞ ﻧﺸﺎﻥ ﺩاﺩ ﺑﻴﺸﺘﺮﻳﻦ ﻣﺤﺘﻮاﻯ ﺗﺮﮐﻴﺒﺎﺕ ﻓﻨﻮﻟﻰ ﺩﺭ ﺭﻳﺸﻪ ﺗﺤﺖ ﺗﻴﻤﺎﺭK۱D۰٫۱ ﻭ

ﺑﻴﺸﺘﺮﻳﻦ ﻣﻘﺪاﺭ ﺗﺮﮐﻴﺒﺎﺕ ﻓﻼﻭﻧﻮﺋﻴﺪﻯ ﺩﺭ ﻧﻮﺷﺎﺧﻪﻫﺎﻯ اﻟﻘﺎ ﺷﺪﻩ ﺩﺭ ﺗﻴﻤﺎﺭB۱D۰ ﺗﻌﻴﻴﻦ ﺷﺪ. ﺩﺭ ﺑﺨﺶ ﺩﻭﻡ اﻳﻦ ﭘﮋﻭﻫﺶ، ﺑﻪ ﻣﻨﻈﻮﺭ اﻓﺰاﻳﺶ ﺗﻮﻟﻴﺪ

ﻣﺘﺎﺑﻮﻟﻴﺖﻫﺎﻯ ﺛﺎﻧﻮﻳﻪ ﺳﻪ ﺗﺎﺯﻥ ﻋﺼﺎﺭﻩ ﻣﺨﻤﺮ، ﺳﺎﻟﻴﺴﻴﻠﻴﮏ اﺳﻴﺪ ﻭ ﻧﻴﺘﺮاﺕ ﻧﻘﺮﻩ ﺩﺭ ﺳﻪ ﻏﻠﻈﺖ ﻣﺨﺘﻠﻒ ﺑﻪ ﻣﺤﻴﻂ ﮐﺸﺖ MS ﭘﺎﻳﻪ اﻓﺰﻭﺩﻩ ﺷﺪ ﻭ

ﮐﺎﻟﻮﺱﻫﺎﻯ ﺣﺎﺻﻞ اﺯ ﺗﺮﮐﻴﺐ ﻫﻮﺭﻣﻮﻧﻰ NAA/KIN ﺭﻭﻯ ﺁﻥ ﮐﺸﺖ ﺩاﺩﻩ ﺷﺪ. ﺳﻰ ﺭﻭﺯ ﭘﺲ اﺯ ﻧﮕﻬﺪاﺭﻯ ﮐﺎﻟﻮﺱﻫﺎ ﺩﺭ ﺷﺮاﻳﻂ ﺗﺎﺭﻳﮑﻰ، ﻣﺤﺘﻮاﻯ ﺗﺮﮐﻴﺒﺎﺕ

ﻓﻨﻮﻟﻰ ﻭ ﻓﻼﻭﻧﻮﺋﻴﺪﻯ ﻣﻮﺟﻮﺩ ﺩﺭ ﻋﺼﺎﺭﻩ اﺗﺎﻧﻮﻟﻰ اﻳﻦ ﮐﺎﻟﻮﺱﻫﺎ ﺳﻨﺠﻴﺪﻩ ﺷﺪ. ﻧﺘﺎﻳﺞ ﻧﺸﺎﻥ ﺩاﺩ ﮐﻪ ﻣﻘﺪاﺭ ﺗﺮﮐﻴﺒﺎﺕ ﻓﻨﻮﻟﻰ ﻭ ﻓﻼﻭﻧﻮﺋﻴﺪﻯ

ﺑﺎ ﮐﺎﺭﺑﺮﺩ μM ۵۰ ﻭ ۱۰ ﺳﺎﻟﻴﺴﻴﻠﻴﮏ اﺳﻴﺪ اﻓﺰاﻳﺶ ﻳﺎﻓﺖ اﻣﺎ ﻇﺎﻫﺮ ﮐﺎﻟﻮﺱﻫﺎ ﻭ ﺭﺷﺪ ﺁﻥﻫﺎ ﺩﺭ ﻣﺤﻴﻂ ﻭاﺟﺪ ﻋﺼﺎﺭﻩ ﻣﺨﻤﺮ ﺑﻬﺘﺮ اﺯ ﺩﻭ ﺗﺎﺯﻥ

ﺩﻳﮕﺮ ﺑﻮﺩ. ﺩﺭ ﺑﺨﺶ ﺁﺧﺮ اﻳﻦ ﭘﮋﻭﻫﺶ، ﺟﻬﺖ ﺗﺮاﺭﻳﺨﺖ ﻧﻤﻮﺩﻥ ﻗﻄﻌﺎﺕ ﺑﺮﮔﻰ ﻭ ﻣﻴﺎﻧﮕﺮﻩ ﮔﻴﺎﻫﭽﻪﻫﺎﻯ ﺣﺎﺻﻞ اﺯ ﮐﺸﺖ ﺑﺬﺭ .lateriflora S اﺯ ﭼﻨﺪ ﺱ

ﺩاﻧﺸﮑﺪﻩ ﺯﻳﺴﺖ ﺷﻨﺎﺳﻰ

ﺗﺎﺭﻳﺦ ﺩﻓﺎﻉ: ۱۳۹۵

ﺩاﻧﺸﮕﺎﻩ اﻟﺰﻫﺮا

دانشگاه الزهرا )س(

دانشکده علوم زیستی

پایان نامه

جهت اخذ درجه کارشناسی ارشد

رشته علوم گیاهی گرایش فیزیولوژی گیاهی

عنوان

بهینه سازی کشت بافت Scutellaria lateriflora به منظور افزایش تولید متابولیتهای ثانویه

استاد راهنما دکتر عذرا صبورا

استاد مشاور دکتر فرح کریمی

دانشجو سیما صدیق جوقان

بهمن 5931

کلیه دستاوردهای این تحقیق متعلق به دانشگاه الزهرا (س) است.

تقدیم هب

خدایی هک آفرید

و

پدر و ماردم

هک رد سختیاه و دشواریاهی زندگی همواره یاوری دلسوز و فداکار

و ابیتشپنی محکم و مطمئن ربایم بودهاند.

سپاس و ستایش خداوندی را سزاست کسوت هستی را رب اندام موزون آفرینش بپوشانید و تجلیات قدرت الیتزالی را رد مظاره و آاثر طبیعت نمایان گردانید.

أ

با سپاس فراوان از راهنماییاه و زحمات استاد محترم و گرانقدر سرکار خانم دکتر عذرا صبورا هک از ابتدای راه و رد طی انجام این تحقیق مرا رد نگارش این ارث یاری نمودند و بدون راهنماییاه و دلسوزی

ایشان اتمین این پایان انهم ممکن نبود،

سپاس فراوان از سرکار خانم دکتر فرح کریمی استاد محترم مشاور هب دلیل یاری اه و راهنماییاهی بی ردیغ ایشان هک بسیاری از سختیاه را ربایم آااتتر نمودند،

رد پایان از زحمات جناب آاقی دکتر رهنما و ااری کسانی هک رد انجام این تحقیق م را یاری نمودند متشکرم و از خداوند منان االمت و سعادت ایشان را خواستارم.

چکیده

گیاه .Scutellaria lateriflora L متعلق به خانواده نعنائیان به دلیل وجود ترکیبات فنولی و فالونوئیدی در طب سنتی به عنوان یک گیاه دارویی کاربردهای وسیعی داشته ازجمله در درمان بیماریهای عصبی و گوارشی مورد استفاده قرار گرفته است. از آنجایی که منابع طبیعی گیاهان وحشی محدود است در این تحقیق جهت تکثیر گیاه و بهره برداری از متابولیتهای ثانویه آن از روشهای رایج کشت بافت استفاده شد. به منظور بهینه سازی محیط کشت گیاه ابتدا بذر سترون گیاه در محیط MS پایه فاقد هورمون کشت شد. سپس جداکشتهای میانگره حاصل از گیاهچههای 06 روزه در محیط MS پایه دارای 4 ترکیب هورمونی KIN /NAA ،BAP/2,4-D ، NAA /BAP و KIN/2,4-D در محدوده mg/L 2- 6 کشت گردید. تمام آزمایشها در قالب طرح آزمایشی بلوکهای کامل تصادفی با حداقل 1 تکرار انجام گردید. نتایج حاصل از کشت بافت گیاه S. lateriflora نشان داد بهترین ترکیب هورمونی جهت القای کالزایی ترکیب KIN/2,4-D بود. بیشترین تعداد کالوس در هر جداکشت با تیمار K2D0.1 و بیشترین قطر کالوس ب

با تیمار K0.5D2 حاصل شد. بهترین پاسخ شاخهزایی و ریشهزایی با ترکیب هورمونی BAP /NAA القا گردید. بیشترین سطح برگ و تعداد نوشاخه تحت تاثیر تیمار B0.1N0 و بیشترین تعداد ریشه با تیمار B0N2 به دست آمد. محتوای ترکیبات فنولی و فالونوئیدی اندام های نوپدید در محیطهای کشت پر بازده به روش رنگ سنجی سنجیده شد. نتایج نشان داد بیشترین محتوای ترکیبات فنولی در ریشه تحت تیمار K1D0.1 و بیشترین مقدار ترکیبات فالونوئیدی در نوشاخههای القا شده در تیمار B1D0 تعیین شد. در بخش دوم این پژوهش، به منظور افزایش تولید متابولیتهای ثانویه سه تازن عصاره مخمّر، سالیسیلیک اسید و نیترات نقره در سه غلظت مختلف به محیط کشت MS پایه افزوده شد و کالوسهای حاصل از ترکیب هورمونی KIN/NAA روی آن کشت داده شد. سی روز پس از نگهداری کالوس ها در شرایط تاریکی، محتوای ترکیبات فنولی و فالونوئیدی موجود در عصاره اتانولی این کالوسها سنجیده شد. نتایج نشان داد که مقدار ترکیبات فنولی و فالونوئیدی با کاربرد μM 16 و 56 سالیسیلیک اسید افزایش یافت اما ظاهر کالوسها و رشد آنها در محیط واجد عصاره مخمّر بهتر از دو تازن دیگر بود. در بخش آخر این پژوهش، جهت تراریخت نمودن قطعات برگی و میانگره گیاهچههای حاصل از کشت بذر S. lateriflora از چند سویه A. rhizogenes به کمک دو روش غوطهور سازی سوسپانسیون باکتری و اسمیر استفاده شد. پس از تلقیح قطعات برگی و میانگرهها با سویههای R2 ،2656 ،ATCC15831 و A4 و نگهداری آنها در محیط واجد آنتیبیوتیک، نمونههای نکروز شده غیر تراریخت حذف و جداکشتهایی که در محیط دارای آنتیبیوتیک سفوتاکسیم و در شرایط تاریکی به مدت 54 روز زنده مانده بودند تفکیک و به محیط مناسب برای رشد ریشه های مویین منتقل شدند. نتایج حاصل نشان داد که علیرغم تکرار آزمایشات تعداد ریشههای مویین القا شده کم بود و رشد ریشههای مویین با سرعت کم صورت می گرفت و احتمال داده می شود که تراریختی پایدار نبوده یا قطعه T-DNA در جایگاه مناسب وارد نشده است.

کلمات کلیدی: تازن، بشقابی آمریکایی، هورمون گیاهی، کشت بافت، Scutellaria lateriflora ،Agrobacterium rhizogenes

ج

د

فصل اول: مقدمه

5-5- مشخصات گیاهشناسی سرده .Scutellaria lateriflora L ...... 2

2-5- ویژگی های گونه Scutellaria lateriflora...... 9

9-5- پراکنش گیاهان سرده Scutellaria ...... 7

4-5- ترکیبات شیمیایی سرده Scutellaria ...... 3

1-5- ترکیبات شیمیایی گونه Scutellaria lateriflora ...... 52

0-5-کاربردهای گیاهان سرده Scutellaria ...... 50

7-5- کاربردهای دارویی Scutellaria lateriflora ...... 51

1-5- کشت بافت ...... 53

3-5- تراریختی به کمک آگروباکتریوم ...... 96

56-5- هدف پژوهش ...... 90

فصل دوم: مواد و روش ها

5-2-کشت بذر ...... 93

2-2- آماده سازی محیط کشت و اعمال تیمار هورمونی ...... 93

9-2- کاربرد تازن ها در کشت بافت S. lateriflora ...... 45

4-2- استخراج و سنجش ترکیبات فنولی و فالونوئیدی تام ...... 49

1-2- القای ریشه های مویین ...... 41

0-2- آنالیز آماری ...... 47

فصل سوم: نتایج ...... 41

5-9-نتایج حاصل از کشت بافت ...... 43

2-9-نتایج حاصل از سنجش محتوای ترکیبات فنولی و فالونوئیدی در اندام های نوپدید تحت تاثیر تیمارهای مختلف ..... 10

9-9- نتایج حاصل از واکشت کالوس ها در محیط کشت MS واجد تازن ...... 32

4-9- نتایج حاصل از تلقیح برگ و میانگره S. lateriflora با سویه های مختلف A. rhizogenez ...... 566

ه

فصل چهارم: بحث ...... 562

5-4-تفسیر نتایج حاصل از کشت بافت ...... 569

2-4-تفسیر نتایج حاصل از سنجش محتوای ترکیبات فنولی و فالونوئیدی تام اندام های نوپدید تحت تاثیر تیمارهای مختلف...... 529

9-4- تفسیر نتایج حاصل از سنجش محتوای ترکیبات فنولی و فالونوئیدی تحت تاثیر تازن ها ...... 521

منابع 523

و

فصل اول مقدمه

1

1-1- مشخصات گیاهشناسی سرده .Scutellaria lateriflora L

اسکوتالریا )Scutellaria( یکی از جنسهای خانواده نعنائیان است که با بیش از 916 گونه در

جهان، پراکندگی گستردهای دارد. این بوتههای علفی، که اغلب بشقابی )Skullcap( نامیده میشوند، در

آمریکا، اروپا و آسیا پراکنده شدهاند )Grzegorczyk-Karolak et al., 2015(. نام این سرده،

اسکوتالریا، برگرفته از کلمه التین اسکوتال )scutella( به معنی بشقاب کوچک است که به پوشش کاسه

گل اشاره دارد. علت نامگذاری Skullcap نیز شکل کاسه گل در قاعده گل است که شبیه کالههای قرون

وسطایی میباشد )Joshee et al., 2002(.

جدول 5-5- رده بندی گیاه .USDA 2016( Scutellaria lateriflora L(

رده دو لپهای ها )Magnoliopsida( راسته المینالها )( تیره نعنائیان ) ( زیر تیره )Scutellarioideae( سرده بشقابی ). Scutellaria L( گونه بشقابی آمریکایی (.Scutellaria lateriflora L(

گیاهان سرده اسکوتالریا گیاهانی علفی، بلند و باریک، به ندرت درختچهای هستند که در مناطق

معتدل و کوههای گرم و مرطوب سراسر دنیا پراکنده شده اند. ریشه کوتاه و خزنده است، ساقهها کرکدار،

مربعی و منشعب با طول 36-96 سانتیمتری هستند، ساقه در گیاهان کوچک تقریبا ساده است. برگها تخم

مرغی شکل، متقابل با قاعده قلبی شکل هستند که طول آنها 5 تا 0 سانتیمتر است، لبههای برگ دندانه

دار یا کنگرهای است )Joshee et al., 2002(. گلها آبی رنگ منفرد، برگکها هم شکل برگها و یا

اندکی متفاوت با آنها هستند. مجموعه گلها در طول ساقه گل آذین خوشه و یا سنبله مانند را تشکیل 2

میدهند. کاسه گل در جهت پشتی- شکمی فشرده و یا دارای دو بخش کامال عریض با انتهای مدور است.

لبههای کاسه در میوه معموال بسته و به صورت دو کفه ناهمسان هستند و هنگام رسیدن میوه لبه بی دوام

باالیی میافتد و لبه بادوام پایینی باقی میماند. این لبه کم و بیش مقعّر و مدور و غالبا در جلو دارای زائدهای

پولک مانند و سوراخدار است و اسکوتلوم )scutellum( یا اسکوتال )scutella( نام دارد. جام که دارای

لولهای بلند و داخل آن برهنه است، در قاعده باریک و خمیده بوده کامال از کاسه خارج میشود. انتهای

لوله جام وسیع و به دو لبه منتهی میگردد. لبه باالیی آن خمیده یا افراشته، وسیع و کوژ و کالهخود مانند و

سه قسمتی و لب پایینی کامل و مسطح است. پرچمها به تعداد 4 عدد در گودی لب باالیی جام نزدیک هم

قرار گرفته و دارای بساکهای مژکدار هستند. بساک پرچمهایی که در خارج جام قرار دارند دارای یک

خانه و آنهایی که در داخل و جلوی جام قرار دارند دارای دو خانه تقریبا موازی هم هستند. خامه دارای

لبههای برابر، میوه کپسولی تقریبا کروی و سطح آن واجد برجستگیهای غده مانند است )قهرمان، 5979(.

گیاهان این سرده در طبیعت میرویند و از روشهای معمول کشت برای تولید فراوردههای آنها

استفاده میشود. گل دهی عموما از ماه می تا آگوست )مرداد تا آبان(، در نور کامل، غذای محدود و خاکی

با رطوبت مناسب اتفاق میافتد. بخشهای گیاه که باالی سطح زمین قرار دارند در تابستان نزدیک زمان

شکوفه دادن جمع آوری، در سایه خشک و برای مصارف بعدی نگهداری میشود. گیاهان بشقابی به دلیل

تحمل به خشکی و شکوفههای زیبا و چشمگیر محبوب شدهاند. این جنس در نقاط مختلف ایران حدود 26

گونه دارد.

2-1- ویژگی های گونه Scutellaria lateriflora

هر چند گونه Scutellaria lateriflora بومی آمریکای شمالی است اما در نقاط مختلف جهان

از قاره آمریکا تا اروپا و آسیا نیز میروید. S. lateriflora از سابقه ای طوالنی در میان پزشکان گیاهی

3

برخوردار است اما فاقد تحقیقات دارویی و بالینی قوی است از این رو شناخت عملکرد و تمام ظرفیت

دارویی آن محدود شده است. بخشهای هوایی S. lateriflora زمانی که گلدار است برداشت شده و به

صورت تازه یا خشک شده به فروش میرسد. بخشهای خشک به صورت کامل و دست نخورده، قطعه

شده یا پودر شده در دسترس قرار دارد. S. lateriflora ممکن است با سایر گونههای Scutellaria مخلوط

شده و به این شکل در خلوص آن تقلب شود. بخشهای تجاری آن اغلب ساقه، برگ و جام گل )بسته به

زمان برداشت( و به میزان کمتری دانه است )Upton and Dayu 2012(.

برگها: ساده؛ دمبرگ بلند و باریک، 1/2-1/6 سانتی متر ، بدون کرک، تیغه نازک ، تخم

مرغی تا تخم مرغی- نیزهای، سانتی متر طول، 1/1-1/5 سانتیمتر عرض، قاعده گرد، قلبی - نامتقارن، تیز؛

راس تیز؛ لبه دندانهای درشت، سطح رویی سیز رنگ، مات، گاهی کرکدار، سطح زیرین روشن تر، با مو

های پراکنده متمرکز روی رگبرگ ها، غده ای که به صورت نقاط تیره قابل مشاهده است؛ شبکه رگبرگی

شانه ای با رگبرگ های ثانویه مشبک، رگبرگ های اصلی برآمده در سطح زیرین )شکل 5-5، الف(.

گل ها: خوشه ها اغلب جانبی؛ کاسه گل 1/2- 1/5 میلیمتر، زنگوله ای، دارای 2 لبه، لب ها

یکپارچه با اسکوتلوم با تاج پشتی برآمده و موهای سخت کوتاه؛ جام گل پایا و بزرگ شده تا 9 میلیمتر

در میوه؛ جام گل در زمان تازه بودن آبی )شکل 5-5، ب(، به ندرت سفید یا صورتی، 1-1 میلیمتر ، دو

لبه، لب باالیی کالهخود شکل، لب پایینی تخت، دارای 9 لوب ، سطح خارجی پوشیده از کرک، حلقه مو

در کنار لوله گل حضور ندارد؛ دارای 4 پرچم شامل بساک های کرکدار، تخمدان دارای 4 لوب عمیق.

گیاه به طور کلی بی بو یا دارای عطری ضغیف است که استشمام نمیشود و با افزایش سن، رایحه به سرعت

محو میشود.

4

میوه: 4 فندقچه، متصل به قاعده، کاسه گل پایا ؛ تخم مرغی شکل، 1/5-5 میلیمتر طول، با 2

سطح صاف و یک سطح گرد؛ سطح قهوهای متمایل به قرمز و برجستگی های زگیل مانند )شکل 5-5، پ(.

ساقه ها: چهار ضلعی، ضلع ها فرو رفته در گوشه ها، رنگ سبز روشن متمایل به زرد و کمی

بنفش، بدون کرک تا کرک دار، پیوستگاه برگ ها چلیپایی؛ در قطعات مورب، کورتکس و استوانه آوندی

نازک، مغز بزرگ، سفید و توخالی )Awad et al., 2003(.

5

)الف( )ب( )پ(

)ت( )ث( )ث(

شکل 5-5 . برگ )الف(، گل )ب( میوه)پ( )Baxter 2017( و بذر )ت( S. lateriflora )هرباریوم Godfrey دانشگاه ایالت فلوریدا(. ین گیاه معموال در حاشیه تاالبها، باتالقها، سواحل رودخانهها یا دریاچهها و چمنزارها میروید )Shang et al., 2010( )ت( ، توده رویش یافته S. lateriflora در طبیعت.

6

منابع

امامی بیستگانی، ز.، سیادت، ع.، قاسمی پیربلوطی، ع. 5934. تاثیر کودهای شیمیایی، آلی و کیتوزان بر خصوصیات فیزیولوژیکی و میزان ترکیبات فنولی گیاه دارویی آویشن دنایی Thymus deanensis Celak در منطقه شهرکرد. مجله پژوهشهای به زراعی. جلد 7. شماره 5. صفخات 55-20.

تقیپور، ش.، حسن زاده، م.، حسینی سرقین، س. 5936. معرفی فلور، شکل زیستی و پراکنش جغرافیایی منطقه اعالء و رودزرد استان خوزستان. تاکسونومی و بیوسیستماتیک، سال سوم، شماره نهم. زمستان 5936.صفحه 96-51.

چاوال، اچ.اس. 5912. اصول بیوتکنولوژی گیاهی. مشهد: انتشارات دانشگاه فردوسی.

زارع زاده، ع.، میروکیلی، س.، میرحسینی، ع. 5910. معرفی فلور، شکل زیستی و پراکنش جغرافیایی گیاهان دره دامگاهان مهریز )استان یزد( .پژوهش و سازندگی در منابع طبیعی. شماره 74. صفحات 597-523.

زمانی، س.، قاسم نژاد، ع.، علیزاده، م، اعلمی، م. 5934 . بررسی اثر شوری و اسید سالیسیلیک بر فعالیت آنزیم فنیلآالنین آمونیا لیاز و ترکیبات فنیل پروپانوئیدی گیاه دارویی .Cynara scolymus L درون شیشهای

قهرمان، ا. 5902. کورموفیت های ایران ) سیستماتیک گیاهی (. تهران: مرکز نشر دانشگاهی. میرزا حسنلو پناهی، ج. و نظیفی، ا. 5911. معرفی گیاهان دارویی دامنههای جنوبی سبالن. جلد 5. شماره 4. صفحات 27-90. عادل، م.ن.، پو بابایی، ح.، صالحی، ع.، علوی، ج. 5939. بررسی فلور، شکل زیستی و پراکنش جغرافیایی جنگلهای کرانرودی در حاشیه رودخانه صفارود رامسر در دامنه ارتفاعی 916 تا 2466 متر. مجله جنگل ایران. انجمن جنگلبانی ایران. سال ششم. شمارە 4. صفحات 126-433. عبدخانی، س.، سلوکی، م.، شیری، ی. 5939. تاثیر هورمونهای اسید جیبرلیک و اسید سالیسیلیک بر بیان ژن فنیلآالنین آمونیا لیاز در مراحل مختلف رشد.Ocimum basilicum L . مجله علمی- پژوهشی زیست فناوری گیاهان زراعی. جلد 1. صفحات 96-25.

121

Altman, A. and Waisel, Y. (1997). Biology of Root Formation and Development. New York, Springer US.

Awad, R., Arnason, J. T., Trudeau, V., Bergeron, C., Budzinski, J. W., Foster, B. C. and Merali, Z. (2003). "Phytochemical and biological analysis of Skullcap (Scutellaria lateriflora L.): A medicinal with anxiolytic properties." Phytomedicine 10(8): 640- 649.

Baenas, N., García-Viguera, C. and Moreno, D. A. (2014). "Elicitation: a tool for enriching the bioactive composition of foods." Molecules 19(9): 13541-13563.

Baxter, J., Mittelhauser, G., Cameron, D., Kausen, D. (2017). " Scutellaria lateriflora L. mad dog skullcap." from https://gobotany.newenglandwild.org/species/scutellaria/lateriflora/.

Beketov, E., Pakhomov, V. and Nesterova, O. (2005). "Improved method of flavonoid extraction from bird cherry fruits." Pharmaceutical Chemistry Journal 39(6): 316-318.

Bergeron, C., Gafner, S., Clausen, E. and Carrier, D. J. (2005). "Comparison of the chemical composition of extracts from Scutellaria lateriflora using accelerated solvent extraction and supercritical fluid extraction versus standard hot water or 70% ethanol extraction." Journal of agricultural and food chemistry 53(8): 3076-3080.

Bhagwath, S. G. and Hjortso, M. A. (2000). "Statistical analysis of elicitation strategies for thiarubrine A production in hairy root cultures of Ambrosia artemisiifolia." J Biotechnol 80(2): 159-167.

Brearley, T. A., Vaidya, B. N. and Joshee, N. (2014). "Cytokinin, Carbon Source, and Acclimatization Requirements for in Vitro Propagation of Scutellaria barbata D. Don and Scutellaria racemosa Pers." American Journal of Plant Sciences 5(24): 3662.

Bruno, M., Cruciata, M., Bondi, M. L., Piozzi, F., María, C., Rodríguez, B. and Servettaz, O. (1998). "Neo-clerodane diterpenoids from Scutellaria lateriflora." Phytochemistry 48(4): 687-691.

Cai, Z., Kastell, A., Speiser, C. and Smetanska, I. (2013). "Enhanced resveratrol production in Vitis vinifera cell suspension cultures by heavy metals without loss of cell viability." Appl Biochem Biotechnol 171(2): 330-340.

Campanoni, P. and Nick, P. (2005). "Auxin-dependent cell division and cell elongation. 1- Naphthaleneacetic acid and 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid activate different pathways." Plant Physiology 137(3): 939-948. 131

Canter, P. H., Thomas, H. and Ernst, E. (2005). "Bringing medicinal into cultivation: opportunities and challenges for biotechnology." Trends in Biotechnology 23(4): 180- 185.

Chandra, S. (2012). "Natural plant genetic engineer Agrobacterium rhizogenes: role of T-DNA in plant secondary metabolism." Biotechnology Letters 34(3): 407-415.

Chawla, H. S. (2002). Introduction to Plant Biotechnology. Enfield, NH, USA, Science Publisher, Inc.

Cheng, Y., He, G., Mu, X., Zhang, T., Li, X., Hu, J., Xu, B. and Du, G. (2008). "Neuroprotective effect of baicalein against MPTP neurotoxicity: behavioral, biochemical and immunohistochemical profile." Neuroscience letters 441(1): 16-20.

Cole, I. B., Saxena, P. K. and Murch, S. J. (2007). "Medicinal biotechnology in the genus scutellaria." In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant 43(4): 318-327.

Dai, S.-J., Chen, M., Liu, K., Jiang, Y.-T. and Shen, L. (2006a). "Four new neo-clerodane diterpenoid alkaloids from Scutellaria barbata with cytotoxic activities." Chemical and pharmaceutical bulletin 54(6): 869-872.

Dai, S.-J., Tao, J.-Y., Liu, K., Jiang, Y.-T. and Shen, L. (2006b). "neo-Clerodane diterpenoids from Scutellaria barbata with cytotoxic activities." Phytochemistry 67(13): 1326-1330.

Delazar, A., Nazemiyeh, H. and Khodaie, L. (2015). "Biological Activity and Phytochemical Study of Scutellaria platystegia." Iranian journal of pharmaceutical research: IJPR 14(1): 215.

Denancé, N., Sánchez-Vallet, A., Goffner, D. and Molina, A. (2013). "Disease resistance or growth: the role of plant hormones in balancing immune responses and fitness costs." Frontiers in plant science 4: 155.

Dharmasiri, N., Dharmasiri, S., Weijers, D., Lechner, E., Yamada, M., Hobbie, L., Ehrismann, J. S., Jürgens, G. and Estelle, M. (2005). "Plant development is regulated by a family of auxin receptor F box proteins." Developmental cell 9(1): 109-119.

Dhas, B. C., Simon, N. S., Austin, P., Selvan, S., Rajaram, S. K. and Alexander, R. A. (2016). "Comparative effects of plant growth regulators on callus induction in leaf explants of Wedelia chinensis." South Indian Journal of Biological Sciences 2(2): 320-325.

Dode, L. B., Bobrowski, V. L., Braga, E. J. B., Seixas, F. K. and Schuch, M. W. (2003). "In vitro propagation of Ocimum basilicum L.(Lamiaceae)." Acta Scientiarum Biol. Sci 25(2): 435-437. 131

Eiden, M., Leidel, F., Strohmeier, B., Fast, C. and Groschup, M. H. (2012). "A Medicinal Herb Scutellaria lateriflora Inhibits PrP Replication in vitro and Delays the Onset of Prion Disease in Mice." Front Psychiatry 3: 9.

Enders, T. A. and Strader, L. C. (2015). "Auxin activity: Past, present, and future." American journal of botany 102(2): 180-196.

Fett-Neto, A. G., Fett, J. P., Goulart, L. V., Pasquali, G., Termignoni, R. R. and Ferreira, A. G. (2001). "Distinct effects of auxin and light on adventitious root development in Eucalyptus saligna and Eucalyptus globulus." Tree Physiology 21(7): 457-464.

Franzyk, H., Rasmussen, J. H. and Jensen, S. R. (1998). "Ozonolysis of protected iridoid glucosides." European journal of organic chemistry 1998(2): 365-370.

Gafner, S., White, A., Melzig, M. M., Cuendet, M., Pezzuto, J. M. and Bergeron, C. (2004). Evaluation of the anti-inflammatory properties of skullcap (Scutellaria lateriflora L.) extracts in different in vitro models. International Congress on Natural Products Research, Phoenix, AZ.

Gaspar, T., Kevers, C., Penel, C., Greppin, H., Reid, D. M. and Thorpe, T. A. (1996). "Plant hormones and plant growth regulators in plant tissue culture." In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant 32(4): 272-289.

George, E. F., Hall, M. A. and De Klerk, G.-J. (2007a). The Components of Plant Tissue Culture Media II : Organic Additions,Osmotic and pH Effects, and Support Systems. Plant Propagation by Tissue Culture. Springer Netherlands, Springer Science & Business Media: 119-120.

George, E. F., Hall, M. A. and De Klerk, G.-J. (2007b). Plant Growth Regulators I: Introduction; Auxins, their Analogues and Inhibitors. Plant Propagation by Tissue Culture. E. Z. I. Machakova, E.F. George, Springer Science & Business Media 5.

George, E. F., Hall, M. A. and De Klerk, G.-J. (2007c). Plant propagation by tissue culture: volume 1. the background, Springer Science & Business Media.

Gopi, C. and Ponmurugan, P. (2006). "Somatic embryogenesis and plant regeneration from leaf callus of Ocimum basilicum L." J Biotechnol 126(2): 260-264.

Gould, A., Everett, N., Wang, T. and Street, H. (1981). "Studies on the control of the cell cycle in cultured plant cells." Protoplasma 106(1-2): 1-13.

132

Gousiadou, C., Karioti, A., Heilmann, J. and Skaltsa, H. (2007). "Iridoids from Scutellaria albida ssp. albida." Phytochemistry 68(13): 1799-1804.

Grzegorczyk-Karolak, I., Kuźma, Ł. and Wysokińska, H. (2015). "The effect of cytokinins on shoot proliferation, secondary metabolite production and antioxidant potential in shoot cultures of Scutellaria alpina." Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC) 122(3): 699-708.

Grzegorczyk-Karolak, I., Kuźma, Ł. and Wysokińska, H. (2016). "The influence of cytokinins on proliferation and polyphenol accumulation in shoot cultures of Scutellaria altissima L." Phytochemistry Letters.

Hussain, H., Ahmad, V. U., Anwar, S., Miana, G. A. and Krohn, K. (2008). "Chemical constituents of Scutellaria linearis." Biochemical Systematics and Ecology 36(5): 490- 492.

Javier, R. and Mamicpic, N. (1978). "The effect of growth regulators on root and shoot production and on yield of cassava (Manihot esculenta, Crantz)." Philippine Journal of Crop Science 3(2): 90-102.

Jeong, G.-T., Woo, J.-C. and Park, D.-H. (2007). "Effect of plant growth regulators on growth and biosynthesis of phenolic compounds in genetically transformed hairy roots ofPanax ginseng C. A. Meyer." Biotechnology and Bioprocess Engineering 12(2): 86-91.

Joshee, N., Mentreddy, S. and Yadav, A. K. (2007). "Mycorrhizal fungi and growth and development of micropropagated Scutellaria integrifolia plants." Industrial Crops and Products 25(2): 169-177.

Joshee, N., Patrick, T. S., Mentreddy, R. S. and Yadav, A. K. (2002). "Skullcap: Potential medicinal crop." Reprinted from: J. Janick and A. Whipkey (eds.). Trends in New crops and new uses: 580-586.

Kepinski, S. and Leyser, O. (2005). "The Arabidopsis F-box protein TIR1 is an auxin receptor." Nature 435(7041): 446-451.

Kikuchi, Y., Miyaichi, Y., Yamagnchi, Y., Kizu, H. and Tomimori, T. (1991). "Studies on the nepalese crude drugs. XII. On the phenolic compounds from the root of Scutellaria prostrata JAcq. ex Benth." Chemical and pharmaceutical bulletin 39(4): 1047-1050.

Kumar, S., Singh, R., Kalia, S., Sharma, S. and Kalia, A. K. (2016). "Recent Advances in Understanding the Role of Growth Regulators in Plant Growth and Development in Vitro-I. Conventional Growth Regulators." Indian Forester 142(5): 459-470.

133

Leaman, D. J. (2001). Conservation, trade, sustainability and exploitation of medicinal plant species. Development of Plant-Based Medicines: Conservation, Efficacy and Safety, Springer: 1-15.

Lehmann, R., Penman, K., Leach, D. and Waterman, P. (2000). "Identification of the major flavonoid from Scutellaria lateriflora–Part 1." Warwick (AU): MediHerb.

Li-Weber, M. (2009). "New therapeutic aspects of flavones: The anticancer properties of Scutellaria and its main active constituents Wogonin, Baicalein and Baicalin." Cancer Treatment Reviews 35(1): 57-68.

Ma, S.-C., Du, J., But, P. P.-H., Deng, X.-L., Zhang, Y.-W., Ooi, V. E.-C., Xu, H.-X., Lee, S. H.-S. and Lee, S. F. (2002). "Antiviral Chinese medicinal herbs against respiratory syncytial virus." Journal of Ethnopharmacology 79(2): 205-211.

Malik, S., Zia, M. and Chaudhary, M. (2007). "In vitro plant regeneration from direct and indirect organogenesis of Memordica charantia." Pakistan journal of biological sciences: PJBS 10(22): 4118-4122.

Malikov, V. M. and Yuldashev, M. P. (2002). "Phenolic Compounds of Plants of the Scutellaria L. Genus. Distribution, Structure, and Properties." Chemistry of Natural Compounds 38(4): 358-406.

Marinova, D., Ribarova, F. and Atanassova, M. (2005). "Total phenolics and total flavonoids in Bulgarian fruits and vegetables." Journal of the university of chemical technology and metallurgy 40(3): 255-260.

Marsh, Z., Yang, T., Nopo-Olazabal, L., Wu, S., Ingle, T., Joshee, N. and Medina-Bolivar, F. (2014). "Effect of light, methyl jasmonate and cyclodextrin on production of phenolic compounds in hairy root cultures of Scutellaria lateriflora." Phytochemistry 107: 50-60.

Minareci, E. and Pekönür, S. (2016). "An Important Euroasian Genus: Scutellaria L." International Journal of Secondary Metabolite (IJSM) 4(1).

Miyaichi, Y., Kizu, H., Tomimori, T. and Lin, C. C. (1989). "Studies on the constituents of Scutellaria species. XI. On the flavonoid constituents of the aerial parts of Scutellaria indica L." Chemical and pharmaceutical bulletin 37(3): 794-797.

Miyaichi, Y., Morimoto, T., Yaguchi, K. and Kizu, H. (2006). "Studies on the constituents of Scutellaria species (XXI): constituents of the leaves of Scutellaria strigillosa Hemsley." Journal of Natural Medicines 60(2): 157-158.

134

Müller, D., Waldie, T., Miyawaki, K., To, J. P., Melnyk, C. W., Kieber, J. J., Kakimoto, T. and Leyser, O. (2015). "Cytokinin is required for escape but not release from auxin mediated apical dominance." The Plant Journal 82(5): 874-886.

Murch, S. J., Simmons, C. B. and Saxena, P. K. (1997). "Melatonin in feverfew and other medicinal plants." The Lancet 350(9091): 1598-1599.

Namdeo, A. (2007). "Plant cell elicitation for production of secondary metabolites: a review." Pharmacogn Rev 1(1): 69-79.

Ngomuo, M., Mneney, E. and Ndakidemi, P. (2013). "The effects of auxins and cytokinin on growth and development of (Musa sp.) var.“Yangambi” explants in tissue culture." American Journal of Plant Sciences 4(11): 2174.

Nikbin, M., Kazemipour, N., Maghsoodlou, M. T., Valizadeh, J., Sepehrimanesh, M. and Davarimanesh, A. (2014). "Mineral elements and essential oil contents of Scutellaria luteo-caerulea Bornm. & Snit." Avicenna Journal of Phytomedicine 4(3): 182-190.

Nishikawa, K., Furukawa, H., Fujioka, T., Fujii, H., Mihashi, K., Shimomura, K. and Ishimaru, K. (1999). "Phenolics in Tissue Cultures of Scutellaria." Natural medicines 53(4): 209-213.

Nursery, P. M. (2016). "Prairie Moon Nursery." Retrieved October 15, 2016, from https://www.prairiemoon.com/seeds/wildflowers-forbs/scutellaria-laterifolia-mad-dog- skullcap.html.

Osman, N. I., Jaafar Sidik, N. and Awal, A. (2016). "Effects of variations in culture media and hormonal treatments upon callus induction potential in endosperm explant of Barringtonia racemosa L." Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine 6(2): 143-147.

Pacurar, D. I., Perrone, I. and Bellini, C. (2014). "Auxin is a central player in the hormone cross‐ talks that control adventitious rooting." Physiologia Plantarum 151(1): 83-96.

Pantha, P., Ponniah, S. K., Ntamatungiro, S. and Manoharan, M. (2016). "Improved embryogenic callus induction and plant regeneration in big bluestem (Andropogon gerardii Vitman), a potential bioenergy feedstock." African Journal of Biotechnology 15(39): 2166-2171.

Paques, M. and Boxus, P. (1985). " VITRIFICATION": REVIEW OF LITERATURE. Symposium on In Vitro Problems Related to Mass Propagation of Horticultural Plants 212.

Pernisová, M., Klíma, P., Horák, J., Válková, M., Malbeck, J., Souček, P., Reichman, P., Hoyerová, K., Dubová, J. and Friml, J. (2009). "Cytokinins modulate auxin-induced 135

organogenesis in plants via regulation of the auxin efflux." Proceedings of the National Academy of Sciences 106(9): 3609-3614.

Peterson, J. and Dwyer, J. (1998). "Flavonoids: dietary occurrence and biochemical activity." Nutrition Research 18(12): 1995-2018.

Pierik, R. (1997). Factors Controlling Adventitious Root Formation on Stem Explants of Rose (Rosa hybrida “Motrea”) In Vitro. Biology of Root Formation and Development, Springer: 297-307.

Radić, S., Vujčić, V., Glogoški, M. and Radić-Stojković, M. (2016). "Influence of pH and plant growth regulators on secondary metabolite production and antioxidant activity of Stevia rebaudiana (Bert)." PERIODICUM BIOLOGORUM 118(1): 9-19.

Ramirez-Estrada, K., Vidal-Limon, H., Hidalgo, D., Moyano, E., Golenioswki, M., Cusido, R. M. and Palazon, J. (2016). "Elicitation, an Effective Strategy for the Biotechnological Production of Bioactive High-Added Value Compounds in Plant Cell Factories." Molecules 21(2): 182.

Ru, M., An, Y., Wang, K., Peng, L., Li, B., Bai, Z., Wang, B. and Liang, Z. (2016). "Prunella vulgaris L. hairy roots: Culture, growth, and elicitation by ethephon and salicylic acid." Engineering in Life Sciences 16(5): 494-502.

S, A. and A, G. (2017). "Callus culture and in vitro production of anthraquinone in Gynochthodes umbellata (L.) Razafim. & B. Bremer (Rubiaceae)." Industrial Crops and Products 95: 608-614.

Saha, S., Dey, T. and Ghosh, P. (2010). "Micropropagation of Ocimum kilimandscharicum Guerke (labiatae)." Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica 52(2): 50-58.

Shang, X., He, X., He, X., Li, M., Zhang, R., Fan, P., Zhang, Q. and Jia, Z. (2010). "The genus Scutellaria an ethnopharmacological and phytochemical review." Journal of Ethnopharmacology 128(2): 279-313.

Sharma, N. K., Vandana, K. M. and Choudhary, R. (2013). "Effect of 2, 4-D, BAP, KN, IAA and IBA on in vitro Regeneration of Ocimum canum Sims–An Important Hoary Basil Plant." Intl. J. Agri. Env. Biotech 6(3): 389-395.

Siddiqui, Z. H., Mujib, A., Aslam, J., Hakeem, K. R. and Parween, T. (2013). In vitro production of secondary metabolites using elicitor in Catharanthus roseus: A case study. Crop Improvement, Springer: 401-419.

Simão, M. J., Fonseca, E., Garcia, R., Mansur, E. and Pacheco, G. (2016). "Effects of auxins and different culture systems on the adventitious root development of Passiflora pohlii 136

Mast. and their ability to produce antioxidant compounds." Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC) 124(2): 419-430.

Simões, C., Albarello, N., Callado, C. H., Castro, T. C. d. and Mansur, E. (2010). "Somatic embryogenesis and plant regeneration from callus cultures of Cleome rosea Vahl." Brazilian Archives of Biology and Technology 53(3): 679-686.

Sinha, S., Pokhrel, S., Vaidya, B. N. and Joshee, N. (1998). "In vitro micropropagation and callus induction in Scutellaria discolor colebr.–A medicinally important plant of Nepal." Indian Journal of Plant Genetic Resources 12(2): 219-223.

Skoog, F. and Miller, C. O. (1957). "Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro." Symp Soc Exp Biol 11: 118-130.

Song, W. (1981). "Studies on the resource of the Chinese herb Scutellaria baicalensis Georgi." Acta Pharm. Sin 16: 139-145.

Sreedevi, E., Anuradha, M. and Pullaiah, T. (2013). "Plant regeneration from leaf-derived callus in Plectranthus barbatus Andr.[Syn.: Coleus forskohlii (Wild.) Briq.]." African Journal of Biotechnology 12(18).

Stutte, G. W., Eraso, I. and Rimando, A. M. (2008). "Carbon dioxide enrichment enhances growth and flavonoid content of two Scutellaria species." Journal of the American Society for Horticultural Science 133(5): 631-638.

Tascan, A., Adelberg, J., Tascan, M., Joshee, N. and Yadav, A. (2007). "Liquid culture system for Scutellaria species." Acta horticulturae.

Tascan, A., Adelberg, J., Tascan, M., Rimando, A., Joshee, N. and Yadav, A. K. (2010). "Hyperhydricity and flavonoid content of Scutellaria species in vitro on polyester- supported liquid culture systems." HortScience 45(11): 1723-1728.

Tepfer, D. (2016). DNA Transfer to Plants by Agrobacterium rhizogenes: A Model for Genetic Communication Between Species and Biospheres. Transgenesis and Secondary Metabolism. S. Jha. Cham, Springer International Publishing: 1-41.

Thiruvengadam, M., Baskar, V., Kim, S.-H. and Chung, I.-M. (2016). "Effects of abscisic acid, jasmonic acid and salicylic acid on the content of phytochemicals and their gene expression profiles and biological activity in turnip (Brassica rapa ssp. rapa)." Plant Growth Regulation 80(3): 377-390.

Thiruvengadam, M. and Chung, I.-M. (2015). "Phenolic compound production and biological activities from in vitro regenerated plants of gherkin (Cucumis anguria L.)." Electronic Journal of Biotechnology 18(4): 295-301. 137

Tomimori, T., Miyaichi, Y., Imoto, Y., Kizu, H. and Namba, T. (1985). "Studies on nepalese crude drugs. V: On the flavonoid constituents of the root of Scutellaria discolor COLEBR.(1)." Chemical and pharmaceutical bulletin 33(10): 4457-4463.

Trigiano, R. N. and Gray, D. J. (2011). Plant tissue culture, development, and biotechnology, CRC Press.

Upton, R. and Dayu, R. H. (2012). "Skullcap Scutellaria lateriflora L.: An American nervine." Journal of Herbal Medicine 2(3): 76-96.

USDA (2016). "United States Department of Agriculture." from https://plants.usda.gov/core/profile?symbol=SCLA2.

Vaidya, B. N., Jackson, C. L., Perry, Z. D., Dhekney, S. A. and Joshee, N. (2016). "Agrobacterium-mediated transformation of thin cell layer explants of Scutellaria ocmulgee small: a rare plant with anti-tumor properties." Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC) 127(1): 57-69.

Van Acker, S. A., Tromp, M. N., Griffioen, D. H., Van Bennekom, W. P., Van Der Vijgh, W. J. and Bast, A. (1996). "Structural aspects of antioxidant activity of flavonoids." Free Radical Biology and Medicine 20(3): 331-342.

Van Eck, J. and Kitto, S. (1990). "Callus initiation and regeneration in Mentha." HortScience 25(7): 804-806.

Veena, V. and Taylor, C. G. (2007). "Agrobacterium rhizogenes: recent developments and promising applications." In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant 43(5): 383- 403.

Wang, Z. Q., Xu, F. M., Yan, X. Z. and Zhu, Y. (1996). "Scutebarbatine A, a new neoclerodane-type diterpenoid alkaloid from Scutellaria barbata." Chinese Chemical Letters 7(4): 333-334.

War, A. R., Paulraj, M. G., War, M. Y. and Ignacimuthu, S. (2011). "Role of salicylic acid in induction of plant defense system in chickpea (Cicer arietinum L.)." Plant signaling & behavior 6(11): 1787-1792.

Wilczańska-Barska, A., Królicka, A., Głód, D., Majdan, M., Kawiak, A. and Krauze- Baranowska, M. (2012). "Enhanced accumulation of secondary metabolites in hairy root cultures of Scutellaria lateriflora following elicitation." Biotechnology Letters 34(9): 1757-1763.

138

Wills, R. B. H. and Stuart, D. L. (2004). Generation of high quality Australian skullcap products, Citeseer.

Woo, K. J., Lim, J. H., Suh, S.-I., Kwon, Y.-K., Shin, S.-W., Kim, S.-C., Choi, Y. H., Park, J.- W. and Kwon, T. K. (2006). "Differential inhibitory effects of baicalein and baicalin on LPS-induced cyclooxygenase-2 expression through inhibition of C/EBPβ DNA-binding activity." Immunobiology 211(5): 359-368.

Xing, B., Yang, D., Guo, W., Liang, Z., Yan, X., Zhu, Y. and Liu, Y. (2014). "Ag+ as a more effective elicitor for production of tanshinones than phenolic acids in Salvia miltiorrhiza hairy roots." Molecules 20(1): 309-324.

Yaghmai, M. and Benson, G. (1979). "The Wax Hydrocarbons of Scutellaria Lateriflora L." Journal of Natural Products 42(2): 228-230.

Yaghmai, M. S. (1988). "Volatile constituents of Scutellaria lateriflora L." Flavour and fragrance journal 3(1): 27-31.

Yaghmai, S. and Hassanzadeh Khayat, M. (1987). "Epicuticular Wax Alkanes of Scutellaria Lateriflora L. Leaves." Iranian Journal of Chemistry and Chemical Engineering (IJCCE) 6(1): 26-30.

Yan, Q., Shi, M., Ng, J. and Wu, J. Y. (2006). "Elicitor-induced rosmarinic acid accumulation and secondary metabolism enzyme activities in Salvia miltiorrhiza hairy roots." Plant Science 170(4): 853-858.

Zare, K., Movafeghi, A., Nazemiyeh, H. and Mohammadi, S. (2015). "Effect of culture conditions on callus induction in Linum glaucum Boiss. & Noë." Russian Agricultural Sciences 41(5): 311-316.

Zhao, D.-l., Cao, X.-m., Qiu, G.-j., Liu, B.-j., Lu, J. and Pan, Y.-h. (2010a). "Tissue Culture and Plantlets Regeneration of Salvia miltiorrhiza Bunge.[J]." Journal of Beijing University of Agriculture 2: 004.

Zhao, G., Zhao, J., Peng, L., Zou, L., Wang, J., Zhong, L. and Xiang, D. (2012). "Effects of yeast polysaccharide on growth and flavonoid accumulation in Fagopyrum tataricum sprout cultures." Molecules 17(10): 11335-11345.

Zhao, J.-L., Zhou, L.-G. and Wu, J.-Y. (2010b). "Effects of biotic and abiotic elicitors on cell growth and tanshinone accumulation in Salvia miltiorrhiza cell cultures." Applied Microbiology and Biotechnology 87(1): 137-144.

Zhao, J., Davis, L. C. and Verpoorte, R. (2005). "Elicitor signal transduction leading to production of plant secondary metabolites." Biotechnology advances 23(4): 283-333. 131

Zhou, Y., Hirotani, M., Yoshikawa, T. and Furuya, T. (1997). "Flavonoids and phenylethanoids from hairy root cultures of Scutellaria baicalensis." Phytochemistry 44(1): 83-87.

Zürcher, E. and Müller, B. (2016). "Cytokinin Synthesis, Signaling, and Function—Advances and New Insights." International review of cell and molecular biology 324: 1-38.

141

Abstract Scutellaria lateriflora L. Belongs to the family Lamiaceae, known as a medicinal plant. This plant is extensively used in the treatment of neurological and digestive diseases due to its flavonoid compounds. Since the natural sources of wild plants is limited, in this research common plant Tissue culture methods were used for plant propagation and improving secondary metabolites production. In order to optimize the culture medium, initially sterilized seeds of the plant were cultured in hormone-free MS base medium. Then internode explants of 60- days old plantlets cultured in MS medium containing combined hormones BAP/ NAA, 2,4-D/ BAP, NAA/ KIN and 2,4-D / KIN with the range of 0-2 mg/l. All experiments were done in a randomized block experimental design with at least 5 replications. The results of tissue culture of S. Lateriflora showed the best hormone combination for callus induction was 2,4-D / KIN. The highest number of callus per explants and maximum callus diameter obtained with K2D0.1 and K0.5D2 treatment, respectively. The best shoot and root regeneration reached by NAA/ BAP combination. The highest leaf area and number of shoots per explant obtained with B0.1N0. The highest root number per explant reached with B0N2 treatment. In the next step, after determining of total phenolic and flavonoid content by colorimetric method, the results showed the highest content of phenolic compounds produced in roots from K1D0.1 treatment and the highest flavonoid compounds produced in shoots from B1D0 treatment. In the second part of the study, to increase production of secondary metabolites elicitors including yeast extract, salicylic acid and silver nitrate in different concentrations were added to MS medium and callus obtained from NAA/KIN treatment cultured on these medium and contained in dark conditions for 30 days. Results from determination of total phenolic and flavonoid content of mentioned callus by colorimetric method showed that the amount of phenolic and flavonoid compounds increased with application of 10 and 50 μm salicylic acid. Morphology and growth of callus in medium containing yeast extract appeared better than the two other elicitors. In another part of this study, in order to transformation of S. Lateriflora and to improve phenolics production, different strains of A. Rhizogenes were used. Leaf and internode segments of plantlets which obtained by culture of s. Lateriflora seeds on MS medium, inoculated with ATCC15831,2656, R2 and A4 strains with bacterial culture directly and in bacterial suspensions manner, after 48 hours samples transferred on 1/2 MS medium supplemented with cephotaxime. After eliminating Necrotic samples, inoculated explants which continued their growth normally were separated. The results showed that despite several examinations, transformation was not stable, number of induced hairy roots were low and their growth rate weren't desired. Keywords: Agrobacterium rhizogenes, American skullcap, Elicitor, Plant hormones, Tissue culture

141

Alzahra University Faculty of Biological Science

M.Sc. Thesis

Title of the Thesis Optimization of Tissue Culture of Scutellaria lateriflora To Improve Secondary Metabolite Production

Thesis Advisor Dr. Azra Saboora

Thesis Reader Dr. Farah Karimi

By Sima Sedigh Joghan

Feb. 2017

142

143